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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-07-02
(45)【発行日】2025-07-10
(54)【発明の名称】ビスホスホリル架橋スチルベン化合物
(51)【国際特許分類】
C07F 9/6568 20060101AFI20250703BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20250703BHJP
【ＦＩ】
C07F9/6568 CSP
G01N33/48 P
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2020203457
(22)【出願日】2020-12-08
(65)【公開番号】P2022090883
(43)【公開日】2022-06-20
【審査請求日】2023-10-23
(73)【特許権者】
【識別番号】504139662
【氏名又は名称】国立大学法人東海国立大学機構
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】山口 茂弘
(72)【発明者】
【氏名】多喜 正泰
(72)【発明者】
【氏名】王 軍威
【審査官】早乙女 智美
(56)【参考文献】
【文献】特開２００８－０５６６３０（ＪＰ，Ａ）
【文献】WANG, Chenguang et al.，“A photostable fluorescent marker for the superresolution live imaging of the dynamic structure of the mitochondrial cristae”，Proceedings of the National Academy of Sciences，2019年，Vol. 116，No. 32，p. 15817-15822，DOI: https://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1905924116
【文献】WANG, Chenguang et al.，“Water‐Soluble Phospholo[3,2‐b]phosphole‐P,P′‐Dioxide‐Based Fluorescent Dyes with High Photostability”，Chemistry－An Asian Journal，2018年，Vol. 13，No. 12，p. 1616-1624，DOI: 10.1002/asia.201800533
【文献】WANG, Chenguang et al.，“Super-Photostable Phosphole-Based Dye for Multiple-Acquisition Stimulated Emission Depletion Imaging”，Journal of the American Chemical Society，2017年，Vol. 139，No. 30，p. 10374-10381，DOI: http://dx.doi.org/10.1021/jacs.7b04418
【文献】WANG, Chenguang et al.，“A Phosphole Oxide Based Fluorescent Dye with Exceptional Resistance to Photobleaching: A Practical Tool for Continuous Imaging in STED Microscopy”，Angewandte Chemie International Edition，2015年，Vol. 54，No. 50，p. 15213-15217，DOI: http://dx.doi.org/10.1002/anie.201507939
【文献】深澤愛子ら，ビスホスホリル架橋スチルベンを含む拡張π電子系の合成と物性，日本化学会講演予稿集，2009年，89(2)，p.857
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｆ９／６５６８
Ｇ０１Ｎ３３／４８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
一般式（１）：【化1】
Ａｒ１及びＡｒ２は同一又は異なって、置換若しくは非置換芳香族炭化水素環又は置換若しくは非置換複素芳香環を示す。
Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。ただし、Ｒ１及びＲ２は一緒になって隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。Ｒ１及び／又はＲ２はＡｒ２と一緒になって隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。
Ｙ１及びＹ２は同一又は異なって、一般式（２）：
【化2】
Ｒ３は置換若しくは非置換アルキル基、又はポリエチレングリコール基若しくはその誘導体基を示す。
Ｙ３は酸素原子又は硫黄原子を示す。）
で表される基を示す。］
で表される、ビスホスホリル架橋スチルベン化合物。
【請求項2】
前記Ｒ３が置換若しくは非置換アルキル基である、請求項１に記載のビスホスホリル架橋スチルベン化合物。
【請求項3】
Ａｒ１が、置換若しくは非置換多環芳香族炭化水素環である、請求項１又は２に記載のビスホスホリル架橋スチルベン化合物。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載のビスホスホリル架橋スチルベン化合物を含有する、蛍光色素。
【請求項5】
請求項１～３のいずれか１項に記載のビスホスホリル架橋スチルベン化合物を含有する、細胞内小器官染色剤。
【請求項6】
請求項１～３のいずれか１項に記載のビスホスホリル架橋スチルベン化合物、請求項４に記載の蛍光色素又は請求項５に記載の細胞内小器官染色剤を用いる、細胞内小器官の誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）イメージング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ビスホスホリル架橋スチルベン化合物に関する。
【背景技術】
【0002】
高い蛍光量子収率を有する蛍光性有機化合物は、有機ＥＬ素子の発光材料又は生体蛍光イメージングのための蛍光色素として重要であり、これまでに報告された例は、基礎研究及び応用の両面で枚挙に暇がない。
【0003】
しかしながら、従来から知られている蛍光性有機化合物の多くが、光照射を続けると徐々に分解し、退色してしまう。例えば、蛍光プローブとしては、耐光性を高めた色素群として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、ＡＴＴＯ色素等が有名であるが、これらを用いた場合でも、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）イメージング等の超解像顕微鏡で繰り返し観察することは困難である。このため、最先端の蛍光顕微鏡技術の観察対象が限定されているのが現状であり、蛍光色素の耐光性の向上が求められている。
【0004】
このような従来技術のなか、耐光性に優れた蛍光色素としては、特定の構造を有するホスホール化合物「ＭｉｔｏＰＢ Ｙｅｌｌｏｗ」も知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】PNAS 2019, vol. 116, no. 32, 15817-15822.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）イメージング等の超解像顕微鏡では、ＭｉｔｏＰＢ Ｙｅｌｌｏｗの場合は、励起波長として波長６６０ｎｍのＳＴＥＤレーザーを使用していたため、例えばミトコンドリア等の細胞内小器官に対する光毒性が認められていた。このため、励起波長をより長波長化し、細胞内小器官に対する光毒性を低減することが求められている。また、ＭｉｔｏＰＢ Ｙｅｌｌｏｗは、既存の他の蛍光色素を凌駕する圧倒的な耐光性を示していたが、耐光性に対する要求特性はとどまることを知らず、ＭｉｔｏＰＢ Ｙｅｌｌｏｗが光退色するほどの強力な光照射によっても光退色を低減できることが求められている。
【0007】
本発明は、上記のような従来の課題を解決しようとするものであり、細胞内小器官に対する光毒性を低減することができる長波長の励起波長を使用して細胞内小器官を染色することができ、且つ、ＭｉｔｏＰＢ Ｙｅｌｌｏｗと比較してもさらに耐光性に優れた化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、特定のビスホスホリル架橋スチルベン骨格を有する化合物は、細胞内小器官を染色することができ、且つ、耐光性に優れており、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）イメージング等の超解像顕微鏡に使用される強力なレーザー光を照射しても、吸収強度がほとんど低下しないことを見出した。本発明者らは、このような知見に基づき、さらに研究を重ね本発明を完成した。即ち、本発明は、以下の構成を包含する。
【0009】
項１．一般式（１）：
【0010】
【化1】
Ａｒ１及びＡｒ２は同一又は異なって、置換若しくは非置換芳香族炭化水素環又は置換若しくは非置換複素芳香環を示す。
Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。
ただし、Ｒ１及びＲ２は一緒になって隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。Ｒ１及び／又はＲ２はＡｒ２と一緒になって隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。
Ｙ１及びＹ２は同一又は異なって、一般式（２）：
【0011】
【化2】
Ｒ３は水素原子又は有機基を示す。
Ｙ３は酸素原子又は硫黄原子を示す。）
で表される基を示す。］
で表される、ビスホスホリル架橋スチルベン化合物。
【0012】
項２．前記Ｒ３が置換若しくは非置換アルキル基である、項１に記載のビスホスホリル架橋スチルベン化合物。
【0013】
項３．Ａｒ１が、置換若しくは非置換多環芳香族炭化水素環である、項１又は２に記載のビスホスホリル架橋スチルベン化合物。
【0014】
項４．項１～３のいずれか１項に記載のビスホスホリル架橋スチルベン化合物を含有する、蛍光色素。
【0015】
項５．項１～３のいずれか１項に記載のビスホスホリル架橋スチルベン化合物を含有する、細胞内小器官染色剤。
【0016】
項６．項１～３のいずれか１項に記載のビスホスホリル架橋スチルベン化合物、項４に記載の蛍光色素又は項５に記載の細胞内小器官染色剤を用いる、細胞内小器官の誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）イメージング方法。
【発明の効果】
【0017】
本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、吸収ピーク波長がＭｉｔｏＰＢ Ｙｅｌｌｏｗと比較して長波長化しており、例えば７７５ｎｍ等の長波長のＳＴＥＤレーザーを用いて細胞内小器官を染色することができる。このため、細胞内小器官に対する光毒性を低減することができ、且つ、吸収ピーク波長の長波長化が求められている耐光性の電子材料としても有用である。
【0018】
また、本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、耐光性に極めて優れており、ＭｉｔｏＰＢ Ｙｅｌｌｏｗが光退色するほどの強力な光照射によってもほとんど退色しない。
【0019】
このため、本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）イメージング等の超解像顕微鏡で細胞内小器官を繰り返し観察するのに適した蛍光色素である。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】実施例３のシス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ及び実施例８のトランス－ＰＳ－ＢｐｈｏｘＣ４について、各種溶媒中での紫外可視吸光スペクトル、蛍光スペクトル、絶対蛍光量子収率及び外観写真を示す。
【図2】実施例４のランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（１，２）Ｍについて、各種溶媒中での紫外可視吸光スペクトル、蛍光スペクトル、絶対蛍光量子収率及び外観写真を示す。
【図3】実施例１のトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ及び比較例１のＭｉｔｏ－ＰＢ ｙｅｌｌｏｗ Ｍのアセトニトリル（ＭｅＣＮ）中での耐光性を示す。（ａ）比較例１のＭｉｔｏ－ＰＢ ｙｅｌｌｏｗ Ｍの様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトル。（ｂ）比較例１のＭｉｔｏ－ＰＢ ｙｅｌｌｏｗ Ｍの所定時間経過後の吸光度（Ａ）の維持率（Ａ／Ａ０）。（ｃ）実施例１のトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭの様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトル。（ｄ）実施例１のトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭの所定時間経過後の吸光度（Ａ）の維持率（Ａ／Ａ０）。
【図4】実施例３のシス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ及び実施例５のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍのアセトニトリル（ＭｅＣＮ）中での耐光性を示す。（ａ）実施例３のシス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭの様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトル。（ｂ）実施例３のシス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭの所定時間経過後の吸光度（Ａ）の維持率（Ａ／Ａ０）。（ｃ）実施例５のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍの様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトル。（ｄ）実施例５のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍの所定時間経過後の吸光度（Ａ）の維持率（Ａ／Ａ０）。
【図5】実施例４のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（１，２）Ｍのアセトニトリル（ＭｅＣＮ）中での耐光性を示す。（ａ）実施例４のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（１，２）Ｍの様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトル。（ｂ）実施例４のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（１，２）Ｍの所定時間経過後の吸光度（Ａ）の維持率（Ａ／Ａ０）。
【図6】実施例５のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍ及び比較例１のＭｉｔｏ－ＰＢ ｙｅｌｌｏｗ Ｍのジメチルスルホキシド／水混合溶媒（ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ）中での５１５±５ｎｍの光を照射した場合の耐光性を示す。（ａ）比較例１のＭｉｔｏ－ＰＢ ｙｅｌｌｏｗ Ｍの様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトル。（ｂ）比較例１のＭｉｔｏ－ＰＢ ｙｅｌｌｏｗ Ｍの所定時間経過後の吸光度（Ａ）の維持率（Ａ／Ａ０）。（ｃ）実施例５のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍの様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトル。（ｄ）実施例５のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍの所定時間経過後の吸光度（Ａ）の維持率（Ａ／Ａ０）。
【図7】実施例３のシス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭのジメチルスルホキシド／水混合溶媒（ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ）中での４５０±５ｎｍの光を照射した場合の耐光性を示す。（ａ）照射強度２０５０Ｗ／ｍ２の光を照射した場合の様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトル。（ｂ）照射強度２０５０Ｗ／ｍ２の光を照射した場合の所定時間経過後の吸光度（Ａ）の維持率（Ａ／Ａ０）。（ｃ）ＬＥＤライトの最大強度の９７％の強度の光を照射した場合の様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトル。（ｄ）ＬＥＤライトの最大強度の９７％の強度の光を照射した場合の所定時間経過後の吸光度（Ａ）の維持率（Ａ／Ａ０）。
【図8】実施例５のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍのジメチルスルホキシド／水混合溶媒（ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ）中での４５０±５ｎｍの光を照射した場合の耐光性を示す。（ａ）照射強度２０５０Ｗ／ｍ２の光を照射した場合の様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトル。（ｂ）照射強度２０５０Ｗ／ｍ２の光を照射した場合の所定時間経過後の吸光度（Ａ）の維持率（Ａ／Ａ０）。（ｃ）ＬＥＤ光の最大強度の９７％の強度の光を照射した場合の様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトル。（ｄ）ＬＥＤ光の最大強度の９７％の強度の光を照射した場合の所定時間経過後の吸光度（Ａ）の維持率（Ａ／Ａ０）。
【図9】比較例１のＭｉｔｏ－ＰＢ ｙｗｌｌｏｗ Ｍのジメチルスルホキシド／水混合溶媒（ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ）中での４５０±５ｎｍの光を照射した場合の耐光性を示す。（ａ）照射強度２０５０Ｗ／ｍ２の光を照射した場合の様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトル。（ｂ）照射強度２０５０Ｗ／ｍ２の光を照射した場合の所定時間経過後の吸光度（Ａ）の維持率（Ａ／Ａ０）。（ｃ）ＬＥＤライトの最大強度の９７％の強度の光を照射した場合の様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトル。（ｄ）ＬＥＤライトの最大強度の９７％の強度の光を照射した場合の所定時間経過後の吸光度（Ａ）の維持率（Ａ／Ａ０）。
【図10】実施例２のトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＡ１／Ａ２及び比較例２のＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄによる試験例６の細胞の蛍光イメージング写真である。
【図11】実施例６のトランス－ＰＯ－ＮａｐｈｏｘＡ１／Ａ２及び比較例２のＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄによる試験例６の細胞の蛍光イメージング写真である。
【図12】実施例２のトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＡ１／Ａ２による試験例７の細胞の蛍光イメージング写真である。
【図13】実施例６のトランス－ＰＯ－ＮａｐｈｏｘＡ１／Ａ２による試験例７の細胞の蛍光イメージング写真である。
【図14】実施例１のトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ、実施例３のシス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ、実施例４のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（１，２）Ｍ、実施例５のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍ及び実施例７のシス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍによる試験例９の細胞の蛍光イメージング写真である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本明細書において、「含有する（comprise）」は、「実質的にのみからなる（consist essentially of）」、及び「のみからなる（consist of）」も包含する概念である。
【0022】
本明細書において、範囲を「Ａ～Ｂ」で表す場合、特に限定されない限り、Ａ以上Ｂ以下を意味する。
【0023】
１．ビスホスホリル架橋スチルベン化合物
本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、一般式（１）：
本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、一般式（１）：
【0024】
【化3】
Ａｒ１及びＡｒ２は同一又は異なって、置換若しくは非置換芳香族炭化水素環又は置換若しくは非置換複素芳香環を示す。
Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。
ただし、Ｒ１及びＲ２は一緒になって隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。Ｒ１及び／又はＲ２はＡｒ２と一緒になって隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。
Ｙ１及びＹ２は同一又は異なって、一般式（２）：
【0025】
【化4】
Ｒ３は有機基を示す。
Ｙ３は酸素原子又は硫黄原子を示す。）
で表される基を示す。］
で表される化合物である。
【0026】
このビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、リン原子に結合する酸素原子及び環Ａｒ３の位置によって、一般式（１Ａ）及び（１Ｂ）：
【0027】
【化5】
Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３ａ及びＡｒ３ｂは同一又は異なって、置換若しくは非置換芳香族炭化水素環又は置換若しくは非置換複素芳香環を示す。
Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、又は置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。
ただし、Ｒ１及びＲ２は一緒になって隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。Ｒ１及び／又はＲ２はＡｒ２と一緒になって隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。
Ｒ３は有機基を示す。
Ｙ３ａ及びＹ３ｂは同一又は異なって、酸素原子又は硫黄原子を示す。］
で表されるビスホスホリル架橋スチルベン化合物がいずれも包含される。
【0028】
上記の一般式（１Ａ）で表されるトランスビスホスホリル架橋スチルベン化合物と、一般式（１Ｂ）で表されるシスビスホスホリル架橋スチルベン化合物とは、いずれも、吸収ピーク波長がＭｉｔｏＰＢ Ｙｅｌｌｏｗと比較して長波長化しており、例えば７７５ｎｍ等の長波長のＳＴＥＤレーザーを用いて細胞内小器官を染色することができるために細胞内小器官に対する光毒性を低減することができるとともに、吸収ピーク波長の長波長化が求められている耐光性の電子材料としても有用である化合物であり、さらに、耐光性に極めて優れており、ＭｉｔｏＰＢ Ｙｅｌｌｏｗが光退色するほどの強力な光照射によってもほとんど退色しない化合物である。
【0029】
このように、本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、環Ａｒ３に対して官能基である－ＯＲ３基が結合しているため、オルガネラ局在性や分散性を制御することが可能であり、様々な細胞内小器官と結合し、様々な細胞内小器官を染色することが可能である。この際、後述の実施例においても示されるように、ビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、細胞内小器官の所望の部位に選択的に存在するため、細胞内小器官の外観形状を把握するうえで有用である。例えば、Ｒ３がホスホニウム基を含む置換アルキル基の場合は、ミトコンドリア膜の染色剤として使用することが可能であり、また、Ｒ３がメチル基等のアルキル基の場合は、脂肪滴の染色剤として使用することが可能である。このため、細胞内小器官染色剤として使用することが可能であることから、本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、生体内で誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）イメージング等の超解像顕微鏡で繰り返し観察するのに適した化合物である。
【0030】
また、本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、電子供与基であるアミノ基又は置換アミノ基を有することで、環境応答性を付与するとともに、吸収ピーク波長の長波長化も達成することができ、細胞内小器官に対する光毒性を低減することができる。
【0031】
さらに、本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、ビスホスホリル架橋スチルベン骨格を有することにより、ＭｉｔｏＰＢ Ｙｅｌｌｏｗが光退色するほどの強力な光照射によっても、吸収強度がほとんど低下しないほどの耐光性を付与することが可能である。
【0032】
一般式（１）、（１Ａ）及び（１Ｂ）において、Ａｒ１で示される芳香族炭化水素環としては、単環芳香族炭化水素環及び多環芳香族炭化水素環のいずれも採用でき、例えば、単環芳香族炭化水素環としてベンゼン環が挙げられ、多環芳香族炭化水素環としてナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環、フルオレン環、ピレン環、トリフェニレン環等が挙げられる。
【0033】
Ａｒ１で示される芳香族炭化水素環は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、後述のアルキル基、後述のシクロアルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、アルケニル基（ビニル基、プロペニル基等）、アルキニル基（エチニル基、１－プロピニル基等）、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、１～６個が好ましく、１～３個がより好ましい。
【0034】
一般式（１）、（１Ａ）及び（１Ｂ）において、Ａｒ１で示される複素芳香環としては、例えば、単環複素芳香環として、ピリジン環、ピラジン環等が挙げられ、多環複素芳香環として、インドール環、イソインドール環、ベンゾイミダゾール環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環等が挙げられる。
【0035】
Ａｒ１で示される複素芳香環は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、後述のアルキル基、後述のシクロアルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、アルケニル基（ビニル基、プロペニル基等）、アルキニル基（エチニル基、１－プロピニル基等）、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、１～６個が好ましく、１～３個がより好ましい。
【0036】
Ａｒ１としては、構造安定性、吸収ピーク波長、細胞内小器官に対する光毒性、耐光性等の観点から、置換又は非置換芳香族炭化水素環が好ましく、特に耐光性の観点から多環芳香族炭化水素環が好ましい。
【0037】
なお、Ａｒ１が置換又は非置換多環芳香族炭化水素環である場合、本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、一般式（１Ｃ）及び（１Ｄ）：
【0038】
【化6】
Ａｒ４は置換又は非置換芳香族炭化水素環を示す。］
で表されるビスホスホリル架橋スチルベン化合物のいずれも採用できる。
【0039】
一般式（１Ｃ）で表されるビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、リン原子に結合する酸素原子及び環Ａｒ３の位置によって、一般式（１Ｃ１）及び（１Ｃ２）：
【0040】
【化7】
で表されるビスホスホリル架橋スチルベン化合物がいずれも包含される。
【0041】
また、一般式（１Ｄ）で表されるビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、リン原子に結合する酸素原子及び環Ａｒ３の位置によって、一般式（１Ｄ１）及び（１Ｄ２）：
【0042】
【化8】
で表されるビスホスホリル架橋スチルベン化合物がいずれも包含される。
【0043】
一般式（１Ｃ）、（１Ｃ１）、（１Ｃ２）、（１Ｄ）、（１Ｄ１）及び（１Ｄ２）において、Ａｒ４で示される芳香族炭化水素環としては、単環芳香族炭化水素環及び多環芳香族炭化水素環のいずれも採用でき、例えば、単環芳香族炭化水素環としてベンゼン環が挙げられ、多環芳香族炭化水素環としてナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環、フルオレン環、ピレン環、トリフェニレン環等が挙げられる。このうち、構造安定性、吸収ピーク波長、細胞内小器官に対する光毒性、耐光性等の観点から、ベンゼン環が特に好ましい。
【0044】
Ａｒ４で示される芳香族炭化水素環は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、後述のアルキル基、後述のシクロアルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、アルケニル基（ビニル基、プロペニル基等）、アルキニル基（エチニル基、１－プロピニル基等）、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、１～６個が好ましく、１～３個がより好ましい。
【0045】
一般式（１Ｃ）、（１Ｃ１）、（１Ｃ２）、（１Ｄ）、（１Ｄ１）及び（１Ｄ２）において、Ａｒ４で示される複素芳香環としては、例えば、単環複素芳香環として、ピリジン環、ピラジン環等が挙げられ、多環複素芳香環として、インドール環、イソインドール環、ベンゾイミダゾール環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環等が挙げられる。
【0046】
Ａｒ４で示される複素芳香環は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、後述のアルキル基、後述のシクロアルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、アルケニル基（ビニル基、プロペニル基等）、アルキニル基（エチニル基、１－プロピニル基等）、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、１～６個が好ましく、１～３個がより好ましい。
【0047】
なお、Ａｒ１が置換又は非置換単環芳香族炭化水素環である場合と比較すると、一般式（１Ｃ）、（１Ｃ１）又は（１Ｃ２）で表されるビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、吸収におけるε及び蛍光におけるΦＦがさらに優れており、対象となる細胞内小器官をより強く且つより明瞭に発光させることが可能である。
【0048】
また、Ａｒ１が置換又は非置換単環芳香族炭化水素環である場合と比較すると、一般式（１Ｄ）、（１Ｄ１）又は（１Ｄ２）で表されるビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、吸収ピーク波長及び蛍光ピーク波長をより長波長化することが可能である。
【0049】
以上から、Ａｒ１の構造によって、光物性に多様性を持たせることが可能であり、要求物性に応じて、Ａｒ１の構造を適宜調整することが好ましい。
【0050】
一般式（１）、（２）、（１Ａ）、（１Ｂ）、（１Ｃ）、（１Ｃ１）、（１Ｃ２）、（１Ｄ）、（１Ｄ１）及び（１Ｄ２）において、Ａｒ２、Ａｒ３、Ａｒ３ａ及びＡｒ３ｂで示される芳香族炭化水素環としては、単環芳香族炭化水素環及び多環芳香族炭化水素環のいずれも採用でき、例えば、単環芳香族炭化水素環としてベンゼン環が挙げられ、多環芳香族炭化水素環としてナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環、フルオレン環、ピレン環、トリフェニレン環等が挙げられる。このうち、構造安定性、吸収ピーク波長、細胞内小器官に対する光毒性、耐光性等の観点から、ベンゼン環が特に好ましい。
【0051】
Ａｒ２で示される芳香族炭化水素環は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、後述のアルキル基、後述のシクロアルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、アルケニル基（ビニル基、プロペニル基等）、アルキニル基（エチニル基、１－プロピニル基等）、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、１～６個が好ましく、１～３個がより好ましい。
【0052】
一般式（１）、（２）、（１Ａ）、（１Ｂ）、（１Ｃ）、（１Ｃ１）、（１Ｃ２）、（１Ｄ）、（１Ｄ１）及び（１Ｄ２）において、Ａｒ２、Ａｒ３、Ａｒ３ａ及びＡｒ３ｂで示される複素芳香環としては、例えば、単環複素芳香環として、ピリジン環、ピラジン環等が挙げられ、多環複素芳香環として、インドール環、イソインドール環、ベンゾイミダゾール環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環等が挙げられる。
【0053】
Ａｒ３、Ａｒ３ａ及びＡｒ３ｂで示される複素芳香環は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、後述のアルキル基、後述のシクロアルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、アルケニル基（ビニル基、プロペニル基等）、アルキニル基（エチニル基、１－プロピニル基等）、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、１～６個が好ましく、１～３個がより好ましい。
【0054】
Ａｒ３、Ａｒ３ａ及びＡｒ３ｂとしては、構造安定性、吸収ピーク波長、細胞内小器官に対する光毒性、耐光性等の観点から、置換又は非置換芳香族炭化水素環が好ましく、置換又は非置換単環芳香族炭化水素環がより好ましい。
【0055】
一般式（１）、（１Ａ）、（１Ｂ）、（１Ｃ）、（１Ｃ１）、（１Ｃ２）、（１Ｄ）、（１Ｄ１）及び（１Ｄ２）において、Ｒ１及びＲ２で示されるアルキル基としては、直鎖アルキル基及び分岐鎖アルキル基のいずれも採用でき、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等のＣ１－１０アルキル基（特にＣ１－６アルキル基）が挙げられる。
【0056】
Ｒ１及びＲ２で示されるアルキル基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、ハロゲン原子、後述のシクロアルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、１～６個が好ましく、１～３個がより好ましい。
【0057】
一般式（１）、（１Ａ）、（１Ｂ）、（１Ｃ）、（１Ｃ１）、（１Ｃ２）、（１Ｄ）、（１Ｄ１）及び（１Ｄ２）において、Ｒ１及びＲ２で示されるシクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等のＣ３－１０シクロアルキル基（特にＣ４－８シクロアルキル基）が挙げられる。
【0058】
Ｒ１及びＲ２で示されるシクロアルキル基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、ハロゲン原子、上記アルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、１～６個が好ましく、１～３個がより好ましい。
【0059】
一般式（１）、（１Ａ）、（１Ｂ）、（１Ｃ）、（１Ｃ１）、（１Ｃ２）、（１Ｄ）、（１Ｄ１）及び（１Ｄ２）において、Ｒ１及びＲ２で示されるアリール基としては、例えば、単環アリール基、縮環アリール基及び多環アリール基のいずれも採用でき、例えば、単環アリール基としてフェニル基が挙げられ、縮環アリール基としてナフチル基、アントラセニル基、フェナントレニル基、フルオレニル基、ピレニル基、トリフェニレニル基等が挙げられ、多環アリール基としてビフェニル基、ターフェニル基等のＣ６－１８アリール基（特にＣ６－１４アリール基）が挙げられる。
【0060】
Ｒ１及びＲ２で示されるアリール基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、ハロゲン原子、上記アルキル基、上記アリール基、後述のヘテロアリール基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、１～６個が好ましく、１～３個がより好ましい。
【0061】
一般式（１）において、Ｒ１及びＲ２で示されるヘテロアリール基としては、単環ヘテロアリール基及び縮環ヘテロアリール基のいずれも採用でき、例えば、単環ヘテロアリール基としてピロリル基、チエニル基、フラニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、ピペリジル基、ピリジル基、ピラジル基等が挙げられ、縮環ヘテロアリール基としてインドリル基、イソインドリル基、ベンゾイミダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、キノキサリル基等が挙げられる。
【0062】
Ｒ１及びＲ２で示されるヘテロアリール基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、上記ハロゲン原子、上記アルキル基、上記アリール基、上記ヘテロアリール基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、１～６個が好ましく、１～３個がより好ましい。
【0063】
なかでも、Ｒ１及びＲ２としては、環境応答性を付与しやすく、吸収ピーク波長の長波長化しやすい観点から、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基が好ましく、置換若しくは非置換アリール基がより好ましく、非置換アリール基がさらに好ましい。
【0064】
なお、Ｒ１及びＲ２は一緒になって、隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。つまり、－ＮＲ１Ｒ２で表される基が、
【0065】
【化9】
【0066】
また、Ｒ１及び／又はＲ２はＡｒ２と一緒になって、隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。つまり、Ａｒ２－ＮＲ１Ｒ２で表される構造が、
【0067】
【化10】
【0068】
この場合、Ａｒ２において、－ＮＲ１Ｒ２で表される基が結合する置換位置は特に制限されない。
【0069】
一般式（２）において、Ｒ３で示される有機基としては、特に制限はなく、アルキル基、ポリエチレングリコール基若しくはその誘導体基（－（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｍＲ７）等が挙げられる。
【0070】
一般式（２）において、Ｒ３で示されるアルキル基としては、直鎖アルキル基及び分岐鎖アルキル基のいずれも採用できるが、染色対象によって適切な基を選択することが好ましい。
【0071】
Ｒ３で示されるアルキル基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、オルガネラ局在性や分散性を制御しやすくなるように、官能基であることが好ましく、例えば、エポキシ基、リン含有基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基（－ＣＯＯＲ８）、アミド基若しくはその誘導体基（－ＣＯＮＨＲ９）等が挙げられる。
【0072】
Ｒ３で示されるアルキル基の置換基としてのリン含有基としては、特に制限はなく、オルガネラ局在性や分散性を制御しやすい観点からは、一般式（３）：
－Ｐ＋Ｒ４ ｎＸ１ （４－ｎ） － （３）
［式中、Ｒ４は同一又は異なって、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。
Ｘ１は同一又は異なって、ハロゲン原子を示す。
ｎは１～３の整数を示す。］
で表される基が好ましい。
－Ｐ＋Ｒ４ ｎＸ１ （４－ｎ） － （３）
［式中、Ｒ４は同一又は異なって、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。
Ｘ１は同一又は異なって、ハロゲン原子を示す。
ｎは１～３の整数を示す。］
で表される基が好ましい。
【0073】
一般式（３）において、Ｒ４で示されるアリール基としては、例えば、単環アリール基、縮環アリール基及び多環アリール基のいずれも採用でき、例えば、単環アリール基としてフェニル基が挙げられ、縮環アリール基としてナフチル基、アントラセニル基、フェナントレニル基、フルオレニル基、ピレニル基、トリフェニレニル基等が挙げられ、多環アリール基としてビフェニル基、ターフェニル基等のＣ６－１８アリール基（特にＣ６－１４アリール基）が挙げられる。
【0074】
Ｒ４で示されるアリール基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、ハロゲン原子、上記アルキル基、上記アリール基、後述のヘテロアリール基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、１～６個が好ましく、１～３個がより好ましい。
【0075】
一般式（３）において、Ｒ４で示されるヘテロアリール基としては、単環ヘテロアリール基及び縮環ヘテロアリール基のいずれも採用でき、例えば、単環ヘテロアリール基としてピロリル基、チエニル基、フラニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、ピペリジル基、ピリジル基、ピラジル基等が挙げられ、縮環ヘテロアリール基としてインドリル基、イソインドリル基、ベンゾイミダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、キノキサリル基等が挙げられる。
【0076】
Ｒ４で示されるヘテロアリール基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、上記ハロゲン原子、上記アルキル基、上記アリール基、上記ヘテロアリール基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、１～６個が好ましく、１～３個がより好ましい。
【0077】
なかでも、Ｒ４としては、オルガネラ局在性や分散性を制御しやすい観点から、置換若しくは非置換アリール基が好ましく、非置換アリール基がより好ましい。
【0078】
一般式（３）において、Ｘ１で示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられ、オルガネラ局在性や分散性を制御しやすい観点から、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が好ましく、塩素原子、臭素原子等がより好ましく、臭素原子がさらに好ましい。
【0079】
一般式（３）において、ｎは、オルガネラ局在性や分散性を制御しやすい観点から、１～３の整数が好ましく、２又は３がより好ましく、３がさらに好ましい。
【0080】
Ｒ３で示されるアルキル基の置換基としてのアルコキシカルボニル基（－ＣＯＯＲ８）としては、Ｒ８としてアルキル基（メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基等）を含んでいれば特に限定なく使用することができ、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ－プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基等が挙げられる。
【0081】
Ｒ３で示されるアルキル基の置換基としてのアミド基若しくはその誘導体基（－ＣＯＮＨＲ９）としては、Ｒ８として水素原子又はアルキル基（メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基等）を含んでいれば特に限定なく使用することができ、例えば、アミド基、Ｎ－メチルアミド基、Ｎ－エチルアミド基、Ｎ－ｎ－プロピルアミド基、Ｎ－イソプロピルアミド基等が挙げられる。
【0082】
一般式（２）において、Ｒ３で示されるポリエチレングリコール基若しくはその誘導体基（－（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｍＲ７）としては、Ｒ７として水素原子又はアルキル基（メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基等）を含み、ｍとして例えば１～１００の整数を採用していれば特に限定なく使用することができ、例えば、－（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｍＣＨ３を好ましく使用することができる。
【0083】
以上のような条件を満たすＲ３で示される有機基としては、具体的には、
【0084】
【化11】
等が挙げられる。
【0085】
上記のような条件を満たす一般式（１）で表されるビスホスホリル架橋スチルベン化合物としては、例えば、
【0086】
【化12】
【0087】
【化13】
【0088】
【化14】
【0089】
【化15】
【0090】
【化16】
等が挙げられる。特に、後述の実施例において示されるビスホスホリル架橋スチルベン化合物が好ましい。
【0091】
２．ビスホスホリル架橋スチルベン化合物の製造方法
本発明のホスホール化合物の製造方法は特に制限されない。例えば、一般式（４Ａ）又は（４Ｂ）：
本発明のホスホール化合物の製造方法は特に制限されない。例えば、一般式（４Ａ）又は（４Ｂ）：
【0092】
【化17】
で表されるビスホスホリル架橋スチルベン化合物を出発物質として、一般式（５）：
Ｒ３Ｘ２ （５）
［式中、Ｒ３は前記に同じである。Ｘ２はハロゲン原子を示す。］
で表される化合物と反応させることにより、得ることができる。
【0093】
なお、上記の一般式（４Ａ）又は（４Ｂ）で表されるビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、例えば、既報（Chem. Asian J., 13, 1616-1624 (2018)）にしたがって合成することができる。
【0094】
一般式（５）において、Ｘ２で示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられ、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が好ましく、塩素原子、臭素原子等がより好ましく、臭素原子がさらに好ましい。
【0095】
反応は、必要に応じて、塩基を使用することもできる。塩基としては、フッ化カリウム、フッ化セシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸カルシウム等が挙げられ、本工程では、収率及び合成の容易さの観点から、炭酸カリウムが好ましい。塩基を使用する場合の使用量は、合成の容易さ、収率等の観点から、化合物（４Ａ）又は化合物（４Ｂ）１モルに対して、２～３０モルが好ましく、１０～２０モルがより好ましい。
【0096】
反応は、通常反応溶媒の存在下で行うことができる。使用できる反応溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素溶媒；ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等の脂肪族ハロゲン化炭化水素溶媒；アセトニトリル等のニトリル溶媒；ジメチルホルムアミド等のアミド溶媒等が挙げられ、合成の容易さ、収率等の観点から、アミド溶媒が好ましく、ジメチルホルムアミドがより好ましい。これらの反応溶媒は単独で用いることもでき、２種以上を組合せて用いることもできる。
【0097】
反応雰囲気は、通常、不活性ガス雰囲気（アルゴンガス雰囲気、窒素ガス雰囲気等）を採用し得る。反応温度は、加熱下、常温下及び冷却下のいずれでも行うことができ、通常、０～１００℃が好ましく、１０～７０℃がより好ましい。反応時間は特に制限されず、反応が十分に進行する時間とすることが好ましい。
【0098】
反応終了後は、必要に応じて常法にしたがって精製処理をすることにより、本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物を得ることができる。
【0099】
なお、上記では、本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物の一態様の合成方法の一例について記載したが、この製造方法に限定されることはなく、様々な合成方法で合成することができる。
【0100】
３．蛍光色素及び細胞内小器官染色剤
本発明の蛍光色素は、上記の本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物を含有する。
本発明の蛍光色素は、上記の本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物を含有する。
【0101】
本発明の蛍光色素は、ビスホスホリル架橋スチルベン骨格を有するために耐光性に優れるとともに、Ｒ３に種々様々な反応性基を導入することが可能である。このため、細胞内小器官（特に、脂肪滴、ミトコンドリア、リソソーム、小胞体、細胞膜等）を染色する細胞内小器官染色剤（特に脂肪滴染色剤、ミトコンドリア染色剤等）として使用することが可能であり、本発明の蛍光色素は、生体内で誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）イメージング等の超解像顕微鏡（特に誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡）で繰り返し観察するのに適している。
【0102】
本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物を細胞内小器官染色剤（特に脂肪滴染色剤、ミトコンドリア染色剤、リソソーム染色剤、小胞体染色剤、細胞膜染色剤等）に用いる場合は、本発明の細胞内小器官染色剤（特に脂肪滴染色剤、ミトコンドリア染色剤、リソソーム染色剤、小胞体染色剤、細胞膜染色剤等）は、本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物を含有しているが、培養液（Dulbecco’s modified Eagle’s medium；ＤＭＥＭ等）中に溶解させて溶液とすることが好ましく、耐光性をより向上させつつ、より強く細胞内小器官（特に、脂肪滴、ミトコンドリア、リソソーム、小胞体、細胞膜等）を染色する観点から、本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物の含有量は、１～１００００ｎｍｏｌ／Ｌが好ましく、１０～１０００ｎｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
【0103】
本発明の細胞内小器官染色剤（特に脂肪滴染色剤、ミトコンドリア染色剤、リソソーム染色剤、小胞体染色剤、細胞膜染色剤等）は、上記のとおり、溶液の形態が好ましいが、生体内で観測する場合は、ｐＨは５～１１程度が好ましく、６．５～７．５程度がより好ましい。ｐＨを調整するために、緩衝剤（ヘペス緩衝剤、トリス緩衝剤、トリシン－水酸化ナトリウム緩衝剤、リン酸系緩衝剤、リン酸緩衝生理食塩水等）等を併用することもできる。
【実施例】
【0104】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらのみに限定されるものではない。
【0105】
特に制限しない限り、全ての反応は、窒素雰囲気下で行った。特に制限しない限り、市販の溶媒及び試薬は、精製せずに使用した。ただし、無水トルエン、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及び無水ＣＨ２Ｃｌ２は、関東化学（株）から購入し、Glass Contour Solvent Systemsにより精製した。
【0106】
また、クロロ（Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノ）（４－メトキシフェニル）ホスフィンと、以下の化合物（トランス－ＰＯ－Ｂ１、シス－ＰＯ－Ｂ１、トランス－ＰＯ－Ｎａ１及びシス－ＰＯ－Ｎａ１）：
【0107】
【化18】
【0108】
２－ブロモ－３－ヨードナフタレンは、既報（Synthesis, 2005, 5, 798-803）にしたがって合成した。
【0109】
１，２－エポキシ－６－ブロモヘキサンは、既報（Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 1727-1731）にしたがって合成した。
【0110】
（４－ブロモ－ｎ－ブチル）トリフェニルホスホニウムブロミドは、既報（J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 6837-6843）にしたがい合成した。
【0111】
（１０－ブロモ－ｎ－デシル）トリフェニルホスホニウムブロミドは、既報（国際公開第２０１６／１５５６７９号）にしたがい合成した。
【0112】
合成例１：１，２－エポキシ－９－ブロモノナン
【0113】
【化19】
【0114】
９－ブロモノン－１－エン（１．０ｇ，４．８７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（８ｍＬ）中の溶液を攪拌しながら、メタクロロ過安息香酸（純度７０％，１．８ｇ，１０．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（８ｍＬ）中の溶液を滴下した。その後、混合物を２５℃で１６時間攪拌し、メタクロロ過安息香酸を析出させた。反応物を濾過して白色沈殿を除去し、ジクロロメタン（ＤＣＭ；２０ｍＬ×２）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）及びブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／１０）で精製し、無色油として１，２－エポキシ－９－ブロモノナンを得た（９００ｍｇ，収率８３％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.40 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.93-2.87 (m, 1H), 2.77-2.72 (m, 1H), 2.46 (dd, J = 5.0, 2.7 Hz, 1H), 1.91-1.78 (m, 2H), 1.55-1.30 (m, 10H)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.40 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.93-2.87 (m, 1H), 2.77-2.72 (m, 1H), 2.46 (dd, J = 5.0, 2.7 Hz, 1H), 1.91-1.78 (m, 2H), 1.55-1.30 (m, 10H)。
【0115】
合成例２：２－ブロモ－３－（（２－ブロモ－４－クロロフェニル）エチニル）ナフタレン
【0116】
【化20】
【0117】
窒素パージしたフラスコに２－ブロモ－３－ヨードナフタレン（５．４ｇ，１６．２ｍｍｏｌ）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウムジクロリド（ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２；２３１ｍｇ，０．３３ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（６２ｍｇ，０．３３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ；７０ｍＬ）を加え、凍結脱気法で厳密に脱気した。トリメチルシリルアセチレン（２．４７ｍＬ）をシリンジで添加し、室温で一晩撹拌した。混合物を濾過して不溶性化合物を除去し、濾液を減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン）で精製し、黄色液体として２－ブロモ－３－［２－（トリメチルシリル）エチニル］ナフタレンを得た（４．３ｇ，収率８６％）。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.05 (d, J = 19.9 Hz, 2H), 7.77-7.70 (m, 2H), 7.51-7.48 (m, 2H), 0.31 (s, 7H)。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.05 (d, J = 19.9 Hz, 2H), 7.77-7.70 (m, 2H), 7.51-7.48 (m, 2H), 0.31 (s, 7H)。
【0118】
得られた２－ブロモ－３－［２－（トリメチルシリル）エチニル］ナフタレン（４．２ｇ，１４．０ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＯＨ ／テトラヒドロフラン（１／１，ｖ／ｖ，１４０ｍＬ）溶液にＫ２ＣＯ３（５．８ｇ，４２．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で８時間撹拌した。 生成物をＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）で抽出し、１Ｍ ＨＣｌ（１００ｍＬ）で洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧除去し、茶色の固体として２－ブロモ－３－エチニルナフタレンを得た（３．１ｇ，収率９７％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.08 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.80-7.71 (m, 2H), 7.56-7.48 (m, 2H), 3.40 (s, 1H)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.08 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.80-7.71 (m, 2H), 7.56-7.48 (m, 2H), 3.40 (s, 1H)。
【0119】
２－ブロモ－４－クロロ－１－ヨードベンゼン（３．９８ｇ，１２．５ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４；１．４５ｇ，１３．０ｍｍｏｌ）及びＣｕＩ（４７．７ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン（１５０ｍＬ）懸濁液を脱気し、これに、上記で得られた２－ブロモ－３－エチニルナフタレン（２．９ｇ，１２．５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で一晩攪拌した後、混合物をトルエン（１５０ｍＬ）で希釈し、濾過して不溶性化合物を除去した。得られた濾液を減圧下で濃縮した後、エタノールから再結晶して精製し、２－ブロモ－３－（（２－ブロモ－４－クロロフェニル）エチニル）ナフタレン（化合物１）を白色固体（４．４ｇ，収率８５％）として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.12 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 7.84-7.77 (m, 1H), 7.76-7.72 (m, 1H), 7.66 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.54-7.49 (m, 2H), 7.31 (dd, J = 8.3, 2.0 Hz, 1H).
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 134.98, 134.23, 133.97, 133.76, 132.47, 131.75, 131.24, 127.97, 127.80, 127.65, 127.08, 126.99, 126.03, 123.93, 122.17, 121.63, 93.61, 91.03。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.12 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 7.84-7.77 (m, 1H), 7.76-7.72 (m, 1H), 7.66 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.54-7.49 (m, 2H), 7.31 (dd, J = 8.3, 2.0 Hz, 1H).
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 134.98, 134.23, 133.97, 133.76, 132.47, 131.75, 131.24, 127.97, 127.80, 127.65, 127.08, 126.99, 126.03, 123.93, 122.17, 121.63, 93.61, 91.03。
【0120】
合成例３：トランス－ＰＯ－Ｎａ２及びシス－ＰＯ－Ｎａ２
【0121】
【化21】
【0122】
合成例２で得られた２－ブロモ－３－（（２－ブロモ－４－クロロフェニル）エチニル）ナフタレン（化合物１；１．０ｇ，２．３８ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン（無水ＴＨＦ；２０ｍＬ）溶液に、ｔｅｒｔ－ブチルリチウム（ｔＢｕＬｉ）のｎ－ペンタン溶液（１．６Ｍ，６．１ｍＬ，９．７ｍｍｏｌ）を－７８℃で１．５時間かけて滴下した。得られた混合物を－７８℃で０．５時間撹拌した後、０℃で３０分保った。その後、再び－７８℃まで冷却した後、ＰＣｌ３（１．３ｍＬ，１５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温まで昇温させた。そのまま室温で１７時間撹拌した後、混合物に水（１ｍＬ）を加えた。ついで、Ｈ２Ｏ２（３０％，０．８ｍＬ）の水溶液を０℃で添加し、３０分間撹拌した後、Ｎａ２ＳＯ３（１０％，５０ｍＬ）の水溶液を０℃で添加した。反応混合物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ；２００ｍＬ）で抽出し、有機層を食塩水（３０ｍＬ）で洗浄、無水Ｎａ２ＳＯ４による乾燥の後、濾過した。得られた濾液を減圧下で濃縮した後、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン＝１／１０～１／１）で精製し、緑黄色固体としてトランス－ＰＯ－Ｎａ２を４６９ｍｇ（収率３４％）、緑黄色固体としてシス－ＰＯ－Ｎａ２を５４０ｍｇ（３９％）得た。
トランス－ＰＯ－Ｎａ２：
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.11 (dd, J = 11.5, 1.8 Hz, 1H), 7.84-7.72 (m, 7H), 7.60 (dt, J = 11.3, 1.4 Hz, 1H), 7.56-7.45 (m, 2H), 7.42-7.34 (m, 2H), 7.02-6.92 (m, 4H), 3.80 (d, J = 0.8 Hz, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 32.54, 32.32, 31.04, 30.82.
HRMS (ESI): m/z calcd. For C32H24ClO4P2: 569.0833 ([M+H]+); found: 569.0826。
シス－ＰＯ－Ｎａ２：
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.14 (dd, J = 11.5, 1.7 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.80 (t, J = 8.2 Hz, 2H), 7.69-7.59 (m, 5H), 7.59-7.48 (m, 2H), 7.48-7.41 (m, 2H), 6.97-6.91 (m, 4H), 3.82 (d, J = 1.3 Hz, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 31.00 (d, J = 37.0 Hz), 29.78 (d, J = 37.0 Hz).
HRMS (ESI): m/z calcd. For C32H24ClO4P2: 569.0833 ([M+H]+); found: 569.0827。
トランス－ＰＯ－Ｎａ２：
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.11 (dd, J = 11.5, 1.8 Hz, 1H), 7.84-7.72 (m, 7H), 7.60 (dt, J = 11.3, 1.4 Hz, 1H), 7.56-7.45 (m, 2H), 7.42-7.34 (m, 2H), 7.02-6.92 (m, 4H), 3.80 (d, J = 0.8 Hz, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 32.54, 32.32, 31.04, 30.82.
HRMS (ESI): m/z calcd. For C32H24ClO4P2: 569.0833 ([M+H]+); found: 569.0826。
シス－ＰＯ－Ｎａ２：
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.14 (dd, J = 11.5, 1.7 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.80 (t, J = 8.2 Hz, 2H), 7.69-7.59 (m, 5H), 7.59-7.48 (m, 2H), 7.48-7.41 (m, 2H), 6.97-6.91 (m, 4H), 3.82 (d, J = 1.3 Hz, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 31.00 (d, J = 37.0 Hz), 29.78 (d, J = 37.0 Hz).
HRMS (ESI): m/z calcd. For C32H24ClO4P2: 569.0833 ([M+H]+); found: 569.0827。
【0123】
実施例１：トランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ
【0124】
【化22】
【0125】
トランス－ＰＯ－Ｂ１（０．５ｇ，０．９６ｍｍｏｌ）、ジフェニルアミン（０．８２ｇ，４．８６ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（Ｐｄ（ＯＡｃ）２；１３ｍｇ，０．０５８ｍｍｏｌ）、２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２’， ４’，６’－トリイソプロピルビフェニル（Ｘｐｈｏｓ；５０ｍｇ，０．１０５ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（８０１ｍｇ，５．８ｍｍｏｌ）を無水トルエン（６０ｍＬ）に加え、窒素雰囲気下、８０℃で２０時間撹拌した。その後、室温まで冷却し、ろ過により不溶性化合物を除去した。減圧下で溶媒を除去した後、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（アセトン／ＣＨ２Ｃｌ２＝１／１５－１／１０）で精製し、赤色固体としてトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ（５２０ｍｇ，収率８３％） を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.80-7.68 (m, 4H), 7.64-7.57 (m, 1H), 7.45-7.35 (m, 2H), 7.33-7.30 (m, 2H), 7.29-7.21 (m, 5H), 7.09-7.03 (m, 6H), 7.00-6.95 (m, 5H), 3.83 (s, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 32.97.
HRMS (ESI): m/z calcd. For C40H32NO4P2: 652.1801 ([M+H]+); found: 652.1793。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.80-7.68 (m, 4H), 7.64-7.57 (m, 1H), 7.45-7.35 (m, 2H), 7.33-7.30 (m, 2H), 7.29-7.21 (m, 5H), 7.09-7.03 (m, 6H), 7.00-6.95 (m, 5H), 3.83 (s, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 32.97.
HRMS (ESI): m/z calcd. For C40H32NO4P2: 652.1801 ([M+H]+); found: 652.1793。
【0126】
実施例２：トランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＡ１／Ａ２
【0127】
【化23】
【0128】
実施例１で得られたトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ（２７０ｍｇ，０．４０ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（２１ｍＬ）溶液に、ＢＢｒ３（０．８５ｍＬ，８．３ｍｍｏｌ）を－７８℃でゆっくり滴下した。－７８℃で１時間撹拌した後、４時間かけてゆっくりと室温まで昇温した。水（５ｍＬ）を０℃で加え、混合物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ；２０ｍＬ×２）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥後，粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＝１／２０）で精製し、赤色固体としてトランス－ＰＯ－Ｂ２を得た（０．２２ｇ，収率８８％）。
1H NMR (400 MHz, CH3OH-d4) δ 7.71-7.53 (m, 6H), 7.47-7.41 (m, 1H), 7.38 (dd, J = 7.4, 2.3 Hz, 1H), 7.35-7.25 (m, 5H), 7.21-7.04 (m, 8H), 6.96-6.91 (m, 4H).
HRMS (ESI): m/z calcd. For C38H27NNaO4P2: 646.1308 ([M+Na]+); found: 646.1301。
1H NMR (400 MHz, CH3OH-d4) δ 7.71-7.53 (m, 6H), 7.47-7.41 (m, 1H), 7.38 (dd, J = 7.4, 2.3 Hz, 1H), 7.35-7.25 (m, 5H), 7.21-7.04 (m, 8H), 6.96-6.91 (m, 4H).
HRMS (ESI): m/z calcd. For C38H27NNaO4P2: 646.1308 ([M+Na]+); found: 646.1301。
【0129】
【化24】
【0130】
上記で得られたトランス－ＰＯ－Ｂ２（３０ｍｇ，０．０４８ｍｍｏｌ）、（１０－ブロモ－ｎ－デシル）トリフェニルホスホニウムブロミド（２７ｍｇ，０．０４８ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（１３３ｍｇ，０．９６ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（無水ＤＭＦ；３．６ｍＬ）に加え、室温で１２時間撹拌した。その後、エピブロモヒドリン（１３．１ｍｇ，０．０９６ｍｍｏｌ）を室温で添加し、混合物を５０℃で１４時間撹拌した。室温まで冷却後、水（２０ｍＬ）を加え、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で抽出した。有機層を水（２０ｍＬ）で２回洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥後、濾過した。濾液を減圧下で濃縮した後、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＝１／３０－１／２０）で精製し、赤色固体としてトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＡ１／Ａ２を得た（１５ｍｇ，収率２７％）。
HRMS (ESI): m/z calcd. For C69H65NO5P3: 1080.4070 ([M-Br]+); found: 1080.4042。
HRMS (ESI): m/z calcd. For C69H65NO5P3: 1080.4070 ([M-Br]+); found: 1080.4042。
【0131】
実施例３：シス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ
【0132】
【化25】
【0133】
原料化合物として、トランス－ＰＯ－Ｂ１の代わりに、シス－ＰＯ－Ｂ１を使用したこと以外は実施例１と同様に、シス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ（収率７８％） を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.65-7.53 (m, 5H), 7.43 (d, J = 4.9 Hz, 2H), 7.35-7.20 (m, 7H), 7.10-7.02 (m, 6H), 7.00 (dd, J = 8.3, 2.2 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 8.2 Hz, 4H), 3.82 (d, J = 0.6 Hz, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 31.69.
HRMS (ESI): m/z calcd. For C40H31NNaO4P2: 674.1621 ([M+Na]+); found: 674.1615。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.65-7.53 (m, 5H), 7.43 (d, J = 4.9 Hz, 2H), 7.35-7.20 (m, 7H), 7.10-7.02 (m, 6H), 7.00 (dd, J = 8.3, 2.2 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 8.2 Hz, 4H), 3.82 (d, J = 0.6 Hz, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 31.69.
HRMS (ESI): m/z calcd. For C40H31NNaO4P2: 674.1621 ([M+Na]+); found: 674.1615。
【0134】
実施例４：トランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（１，２）Ｍ
【0135】
【化26】
【0136】
トランス－ＰＯ－Ｎａ１（１１０ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）、ジフェニルアミン（１６３ｍｇ，０．９６８ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（Ｐｄ（ＯＡｃ）２；２．６ｍｇ，０．０１１６ｍｍｏｌ）、２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２’， ４’，６’－トリイソプロピルビフェニル（Ｘｐｈｏｓ；１１ｍｇ，０．０２３２ｍｍｏｌ）、及びＫ２ＣＯ３（１６０ｍｇ，１．１６ｍｍｏｌ）を無水トルエン（１２ｍＬ）に加え、窒素雰囲気下、９０℃で２４時間攪拌した。その後、室温まで冷却し、濾過により不溶性化合物を除去した。減圧下で溶媒を除去した後、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（アセトン／ＣＨ２Ｃｌ２＝１／２０－１／１０）で精製し、赤色固体としてトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（１，２）Ｍ（１２０ｍｇ，収率８８％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.96 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.85-7.72 (m, 5H), 7.52 (dd, J = 8.3, 2.8 Hz, 1H), 7.46-7.38 (m, 2H), 7.35-7.27 (m, 2H), 7.27-7.21 (m, 4H), 7.11-7.02 (m, 6H), 7.01-6.98 (m, 1H), 6.98-6.91 (m, 4H), 3.80 (d, J = 5.5 Hz, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 34.14 (d, J = 40.0 Hz), 32.96 (d, J = 39.9 Hz).
HRMS (ESI): m/z calcd. For C44H34NO4P2: 702.1958 ([M+H]+); found: 702.1948。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.96 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.85-7.72 (m, 5H), 7.52 (dd, J = 8.3, 2.8 Hz, 1H), 7.46-7.38 (m, 2H), 7.35-7.27 (m, 2H), 7.27-7.21 (m, 4H), 7.11-7.02 (m, 6H), 7.01-6.98 (m, 1H), 6.98-6.91 (m, 4H), 3.80 (d, J = 5.5 Hz, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 34.14 (d, J = 40.0 Hz), 32.96 (d, J = 39.9 Hz).
HRMS (ESI): m/z calcd. For C44H34NO4P2: 702.1958 ([M+H]+); found: 702.1948。
【0137】
実施例５：トランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍ
【0138】
【化27】
【0139】
合成例３で得られたトランス－ＰＯ－Ｎａ２（９０ｍｇ，０．１５８ｍｍｏｌ）、ジフェニルアミン（１３３ｍｇ，０．７９ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（Ｐｄ（ＯＡｃ）２；２．１ｍｇ，０．００９５ｍｍｏｌ）、２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２’， ４’，６’－トリイソプロピルビフェニル（Ｘｐｈｏｓ；９ｍｇ，０．０１９ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（１３１ｍｇ，０．９４８ｍｍｏｌ）を無水トルエン（１０ｍＬ）に加え、窒素雰囲気下、９０℃で２４時間撹拌した。その後、室温まで冷却し、濾過により不溶性化合物を除去した。減圧下で溶媒を除去した後、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（アセトン／ＣＨ２Ｃｌ２＝１／１５－１／１０）で精製し、赤色固体としてトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍ（１００ｍｇ，収率９０％） を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.08 (dd, J = 11.5, 1.9 Hz, 1H), 7.84-7.73 (m, 7H), 7.48 (dtd, J = 16.1, 7.0, 1.0 Hz, 2H), 7.35 (dt, J = 11.3, 2.0 Hz, 1H), 7.30-7.21 (m, 5H), 7.11-7.03 (m, 6H), 7.02-6.93 (m, 5H), 3.82 (d, J = 2.7 Hz, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 33.21 (d, J = 37.4 Hz), 31.35 (d, J = 37.3 Hz).
HRMS (ESI): m/z calcd. For C44H34NO4P2: 702.1958 ([M+H]+); found: 702.1955。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.08 (dd, J = 11.5, 1.9 Hz, 1H), 7.84-7.73 (m, 7H), 7.48 (dtd, J = 16.1, 7.0, 1.0 Hz, 2H), 7.35 (dt, J = 11.3, 2.0 Hz, 1H), 7.30-7.21 (m, 5H), 7.11-7.03 (m, 6H), 7.02-6.93 (m, 5H), 3.82 (d, J = 2.7 Hz, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 33.21 (d, J = 37.4 Hz), 31.35 (d, J = 37.3 Hz).
HRMS (ESI): m/z calcd. For C44H34NO4P2: 702.1958 ([M+H]+); found: 702.1955。
【0140】
実施例６：トランス－ＰＯ－ＮａｐｈｏｘＡ１／Ａ２
【0141】
【化28】
【0142】
実施例５で得られたトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍ（９０ｍｇ，０．１２８ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）溶液に、ＢＢｒ３（０．２８ｍＬ，２．５６ｍｍｏｌ）を－７８℃でゆっくり滴下した。－７８℃で１時間撹拌した後、４時間かけてゆっくりと室温まで昇温した。水（５ｍＬ）を０℃で加え、混合物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ；２０ｍＬ×２）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥後、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＝１／２０）で精製し、赤色固体としてトランス－ＰＯ－Ｎａ３を得た（８０ｍｇ，収率９２％）。
1H NMR (400 MHz, CH3OH-d4) δ8.19 (dd, J = 11.7, 1.9 Hz, 1H), 7.95-7.84 (m, 2H), 7.78 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 7.73-7.63 (m, 4H), 7.63-7.52 (m, 2H), 7.36-7.26 (m, 5H), 7.20 (dt, J = 11.4, 2.0 Hz, 1H), 7.16-7.03 (m, 7H), 6.98-6.91 (m, 4H).
31P NMR (162 MHz, CH3OH-d4) δ 36.29 (d, J = 38.0 Hz), 34.71 (d, J = 38.4 Hz).
HRMS (ESI): m/z calcd. For C42H30NO4P2: 673.1650 ([M+H]+); found: 674.1641。
1H NMR (400 MHz, CH3OH-d4) δ8.19 (dd, J = 11.7, 1.9 Hz, 1H), 7.95-7.84 (m, 2H), 7.78 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 7.73-7.63 (m, 4H), 7.63-7.52 (m, 2H), 7.36-7.26 (m, 5H), 7.20 (dt, J = 11.4, 2.0 Hz, 1H), 7.16-7.03 (m, 7H), 6.98-6.91 (m, 4H).
31P NMR (162 MHz, CH3OH-d4) δ 36.29 (d, J = 38.0 Hz), 34.71 (d, J = 38.4 Hz).
HRMS (ESI): m/z calcd. For C42H30NO4P2: 673.1650 ([M+H]+); found: 674.1641。
【0143】
【化29】
【0144】
得られたトランス－ＰＯ－Ｎａ３（３０ｍｇ，０．０４４５ｍｍｏｌ）、（１０－ブロモデシル）トリフェニルホスホニウムブロミド（２５ｍｇ，０．０４４５ｍｍｏｌ）、及び Ｋ２ＣＯ３（１２３ｍｇ，０．８９ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（無水ＤＭＦ；３．６ｍＬ）に加え、室温で２４時間撹拌した。その後、エピブロモヒドリン（１２．２ｍｇ，０．０８９ｍｍｏｌ）を室温で添加し、混合物を５０℃で１４時間撹拌した。室温まで冷却後、水（２０ｍＬ）を加え、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で抽出した。有機層を水（２０ｍＬ）で２回洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥後、濾過した。濾液を減圧下で濃縮した後、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＝１／３０－１／１０）で精製し、橙赤色固体としてトランス－ＰＯ－ＮａｐｈｏｘＡ１／Ａ２を得た（１３ｍｇ，収率２４％）。
HRMS (ESI): m/z calcd. For C73H67NO5P3: 1130.4227 ([M-Br]+); found: 1130.4229。
HRMS (ESI): m/z calcd. For C73H67NO5P3: 1130.4227 ([M-Br]+); found: 1130.4229。
【0145】
実施例７：シス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍ
【0146】
【化30】
【0147】
原料化合物として、合成例３で得られたトランス－ＰＯ－Ｎａ２の代わりに、合成例３で得られたシス－ＰＯ－Ｎａ２を使用したこと以外は実施例５と同様に、シス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍ（収率８１％） を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.10 (dd, J = 11.5, 1.8 Hz, 1H), 7.86-7.74 (m, 3H), 7.71-7.60 (m, 4H), 7.57-7.51 (m, 1H), 7.50-7.44 (m, 1H), 7.40-7.31 (m, 2H), 7.28-7.23 (m, 3H), 7.12-7.00 (m, 7H), 6.93 (ddd, J = 9.0, 2.3, 1.1 Hz, 4H), 3.83 (d, J = 3.8 Hz, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 31.72 (d, J = 37.5 Hz), 30.11 (d, J = 37.9 Hz).
HRMS (ESI): m/z calcd. For C44H33NNaO4P2: 724.1777 ([M+Na]+); found: 724.1765。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.10 (dd, J = 11.5, 1.8 Hz, 1H), 7.86-7.74 (m, 3H), 7.71-7.60 (m, 4H), 7.57-7.51 (m, 1H), 7.50-7.44 (m, 1H), 7.40-7.31 (m, 2H), 7.28-7.23 (m, 3H), 7.12-7.00 (m, 7H), 6.93 (ddd, J = 9.0, 2.3, 1.1 Hz, 4H), 3.83 (d, J = 3.8 Hz, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 31.72 (d, J = 37.5 Hz), 30.11 (d, J = 37.9 Hz).
HRMS (ESI): m/z calcd. For C44H33NNaO4P2: 724.1777 ([M+Na]+); found: 724.1765。
【0148】
実施例８：トランス－ＰＳ－ＢｐｈｏｘＡ１／Ａ２
【0149】
【化31】
【0150】
実施例１で得られたトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ（４０．０ｍｇ，０．０６１ｍｍｏｌ）及びＬａｗｅｓｓｏｎ試薬（９９ｍｇ，０．２４６ｍｍｏｌ）の混合物の無水トルエン（５ｍＬ）中の溶液を２０時間還流した。この溶液を室温まで冷却し、溶媒を減圧下で除去した後、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン＝１／２－１／１）で精製し、３４ｇ（収率８１％）のトランス－ＰＳ－ＢｐｈｏｘＭと、８ｍｇ（収率１９％）のシス－ＰＳ－ＢｐｈｏｘＭとを、橙色固体として得た。
トランス－ＰＳ－ＢｐｈｏｘＭ：
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.86-7.74 (m, 4H), 7.60 (dd, J = 12.8, 7.1 Hz, 1H), 7.52-7.46 (m, 1H), 7.44-7.38 (m, 1H), 7.37-7.29 (m, 3H), 7.26-7.21 (m, 4H), 7.11-7.03 (m, 6H), 7.00-6.91 (m, 5H), 3.82 (s, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 37.47.
HRMS (ESI): m/z calcd. For C40H31NNaO2P2S2: 706.1164 ([M+Na]+); found: 706.1151。
シス－ＰＳ－ＢｐｈｏｘＭ：
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.85-7.75 (m, 4H), 7.62-7.57 (m, 1H), 7.49 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.41 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.36-7.30 (m, 3H), 7.26-7.21 (m, 4H), 7.09-7.03 (m, 6H), 6.99-6.91 (m, 5H), 3.82 (s, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 36.91.
HRMS (ESI): m/z calcd. For C40H31NNaO2P2S2: 706.1164 ([M+Na]+); found: 706.1165。
トランス－ＰＳ－ＢｐｈｏｘＭ：
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.86-7.74 (m, 4H), 7.60 (dd, J = 12.8, 7.1 Hz, 1H), 7.52-7.46 (m, 1H), 7.44-7.38 (m, 1H), 7.37-7.29 (m, 3H), 7.26-7.21 (m, 4H), 7.11-7.03 (m, 6H), 7.00-6.91 (m, 5H), 3.82 (s, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 37.47.
HRMS (ESI): m/z calcd. For C40H31NNaO2P2S2: 706.1164 ([M+Na]+); found: 706.1151。
シス－ＰＳ－ＢｐｈｏｘＭ：
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.85-7.75 (m, 4H), 7.62-7.57 (m, 1H), 7.49 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.41 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.36-7.30 (m, 3H), 7.26-7.21 (m, 4H), 7.09-7.03 (m, 6H), 6.99-6.91 (m, 5H), 3.82 (s, 6H).
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 36.91.
HRMS (ESI): m/z calcd. For C40H31NNaO2P2S2: 706.1164 ([M+Na]+); found: 706.1165。
【0151】
【化32】
【0152】
上記で得られたトランス－ＰＳ－ＢｐｈｏｘＭ（２７ｍｇ，０．０３９ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中の溶液に対して、ＢＢｒ３（０．０８ｍＬ，０．７９ｍｍｏｌ）を－７８℃で滴下した。この溶液を－７８℃で１時間攪拌した後、混合物をゆっくりと室温まで４時間で昇温した。０℃において、水（２ｍＬ）で反応をクエンチし、酢酸エチル（２０ｍＬ×２）で抽出した。橙色の層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＝１／２０）で精製し、橙赤色固体としてトランス－ＰＳ－Ｂ１を得た（２０ｍｇ，収率７９％）。
【0153】
【化33】
【0154】
原料化合物として、トランス－ＰＯ－Ｂ２の代わりに、上記で得られたトランス－ＰＳ－Ｂ１を使用したこと以外は実施例２と同様に、トランス－ＰＳ－ＢｐｈｏｘＡ１／Ａ２（収率１７％） を得た。
【0155】
比較例１：Ｍｉｔｏ－ＰＢ ｙｅｌｌｏｗ Ｍ
【0156】
【化34】
【0157】
比較例１のＭｉｔｏ－ＰＢ ｙｅｌｌｏｗ Ｍは、既報（PNAS, 2019, 116, 15817-15822）にしたがって合成した。
【0158】
比較例２：Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ
市販のＭｉｔｏ－Ｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄを、比較例２の化合物として使用した。
市販のＭｉｔｏ－Ｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄを、比較例２の化合物として使用した。
【0159】
試験例１：光物性
実施例３のシス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ、実施例４のランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（１，２）Ｍ及び実施例８のトランス－ＰＳ－ＢｐｈｏｘＣ４について、トルエン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）又はアセトニトリル（ＭｅＣＮ）中に溶解させた場合の紫外可視吸光スペクトル、蛍光スペクトル、絶対蛍光量子収率等の測定を行い。外観写真を撮影した。実施例３及び８の結果を図１に、実施例４の結果を図２に示し、各光物性データを表１に示す。
実施例３のシス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ、実施例４のランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（１，２）Ｍ及び実施例８のトランス－ＰＳ－ＢｐｈｏｘＣ４について、トルエン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）又はアセトニトリル（ＭｅＣＮ）中に溶解させた場合の紫外可視吸光スペクトル、蛍光スペクトル、絶対蛍光量子収率等の測定を行い。外観写真を撮影した。実施例３及び８の結果を図１に、実施例４の結果を図２に示し、各光物性データを表１に示す。
【0160】
【表1】
【0161】
以上から、本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、様々な溶媒中のいずれにおいても、可視光領域（特に４５０～５５０ｎｍ程度）の光を吸収することができ、また、溶媒によって様々な波長の蛍光を発することができた。特に、アセトニトリルのような極性溶媒中では蛍光が極めて小さかったことから、細胞質ではほとんど蛍光しないことが示唆されている。このため、リン脂質膜、脂肪滴等の疎水性組織を高いコントラストで染色することが可能であることが示唆されている。
【0162】
試験例２：耐光性（アセトニトリル中）
実施例１のトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ、実施例３のシス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ、実施例４のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（１，２）Ｍ、実施例５のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍ、及び比較例１のＭｉｔｏ－ＰＢ ｙｅｌｌｏｗ Ｍについて、２５℃でアセトニトリル（ＭｅＣＮ）中に溶解させた。この際の濃度は、５１５ｎｍにおける吸光度が同程度（０．１）になるように調整した。５１５±５ｎｍの光を透過するバンドパスフィルターを備えたＬＥＤライト（２０５０Ｗ／ｍ２）で、波長５１５±５ｎｍの光を照射し、様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトルの測定を行った。実施例１及び比較例１の結果を図３（ａ）及び（ｃ）に、実施例３及び５の結果を図４（ａ）及び（ｃ）に、実施例４の結果を図５（ａ）に示す。
実施例１のトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ、実施例３のシス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ、実施例４のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（１，２）Ｍ、実施例５のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍ、及び比較例１のＭｉｔｏ－ＰＢ ｙｅｌｌｏｗ Ｍについて、２５℃でアセトニトリル（ＭｅＣＮ）中に溶解させた。この際の濃度は、５１５ｎｍにおける吸光度が同程度（０．１）になるように調整した。５１５±５ｎｍの光を透過するバンドパスフィルターを備えたＬＥＤライト（２０５０Ｗ／ｍ２）で、波長５１５±５ｎｍの光を照射し、様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトルの測定を行った。実施例１及び比較例１の結果を図３（ａ）及び（ｃ）に、実施例３及び５の結果を図４（ａ）及び（ｃ）に、実施例４の結果を図５（ａ）に示す。
【0163】
次に、各試料について、極大吸収波長における耐光性を評価した。具体的には、５１５±５ｎｍの光を透過するバンドパスフィルターを備えたＬＥＤライト（２０５０Ｗ／ｍ２）で、波長５１５±５ｎｍの光を照射し、照射直後（０時間後）の極大吸収波長（実施例１は４６０ｎｍ、実施例３は４８７ｎｍ、実施例４は５１３ｎｍ、実施例５は４８２ｎｍ、比較例１は４８７ｎｍ）における吸光度（Ａ０）を１．００として、所定時間経過後の吸光度（Ａ）の維持率（Ａ／Ａ０）を評価した。実施例１及び比較例１の結果を図３（ｂ）及び（ｄ）に、実施例３及び５の結果を図４（ｂ）及び（ｄ）に、実施例４の結果を図５（ｂ）に示す。
【0164】
この結果、本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、Ｍｉｔｏ－ＰＢ ｙｅｌｌｏｗと比較して著しく優れた耐光性を有しており、吸光度はほとんど低下しなかった。
【0165】
試験例３：耐光性（ＤＭＳＯ／Ｈ
２
Ｏ中その１）
実施例５のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍ及び比較例１のＭｉｔｏ－ＰＢ ｙｅｌｌｏｗ Ｍについて、２５℃でジメチルスルホキシド／水混合溶媒（体積比１：１）中に溶解させた。この際の濃度は、５１５ｎｍにおける吸光度が同程度（０．１）になるように調整した。５１５±５ｎｍの光を透過するバンドパスフィルターを備えたＬＥＤライトで、波長５１５±５ｎｍの光を、照射強度２０５０Ｗ／ｍ２で照射し、様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトルの測定を行った。比較例１の結果を６（ａ）に、実施例５の結果を図６（ｃ）に示す。
実施例５のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍ及び比較例１のＭｉｔｏ－ＰＢ ｙｅｌｌｏｗ Ｍについて、２５℃でジメチルスルホキシド／水混合溶媒（体積比１：１）中に溶解させた。この際の濃度は、５１５ｎｍにおける吸光度が同程度（０．１）になるように調整した。５１５±５ｎｍの光を透過するバンドパスフィルターを備えたＬＥＤライトで、波長５１５±５ｎｍの光を、照射強度２０５０Ｗ／ｍ２で照射し、様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトルの測定を行った。比較例１の結果を６（ａ）に、実施例５の結果を図６（ｃ）に示す。
【0166】
次に、極大吸収波長における耐光性を評価した。具体的には、５１５±５ｎｍの光を透過するバンドパスフィルターを備えたＬＥＤライトで、波長５１５±５ｎｍの光を、照射強度２０５０Ｗ／ｍ２で照射し、照射直後（０時間後）の極大吸収波長（実施例５は５０６ｎｍ、比較例１は４７３ｎｍ）における吸光度（Ａ０）を１．００として、所定時間経過後の吸光度（Ａ）の維持率（Ａ／Ａ０）を評価した。比較例１の結果を図６（ｂ）に、実施例５の結果を図６（ｄ）に示す。
【0167】
試験例４：耐光性（ＤＭＳＯ／Ｈ
２
Ｏ中その２）
実施例３のシス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ、実施例５のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍ及び比較例１のＭｉｔｏ－ＰＢ ｙｗｌｌｏｗ Ｍについて、２５℃でジメチルスルホキシド／水混合溶媒（体積比１：１）中に溶解させた。この際の濃度は、４５０ｎｍにおける吸光度が同程度（０．１）になるように調整した。４５０±５ｎｍの光を透過するバンドパスフィルターを備えたＬＥＤライトで、波長４５０±５ｎｍの光を、照射強度２０５０Ｗ／ｍ２又はＬＥＤライトの最大強度の９７％の強度で照射し、様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトルの測定を行った。実施例３の照射強度２０５０Ｗ／ｍ２の結果を図７（ａ）に、実施例３のＬＥＤライトの最大強度の９７％の強度の結果を図７（ｃ）に、実施例５の照射強度２０５０Ｗ／ｍ２の結果を図８（ａ）に、実施例５のＬＥＤ光の最大強度の９７％の強度の結果を図８（ｃ）に、比較例１の照射強度２０５０Ｗ／ｍ２の結果を図９（ａ）に、比較例１のＬＥＤ光の最大強度の９７％の強度の結果を図９（ｃ）に示す。
実施例３のシス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ、実施例５のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍ及び比較例１のＭｉｔｏ－ＰＢ ｙｗｌｌｏｗ Ｍについて、２５℃でジメチルスルホキシド／水混合溶媒（体積比１：１）中に溶解させた。この際の濃度は、４５０ｎｍにおける吸光度が同程度（０．１）になるように調整した。４５０±５ｎｍの光を透過するバンドパスフィルターを備えたＬＥＤライトで、波長４５０±５ｎｍの光を、照射強度２０５０Ｗ／ｍ２又はＬＥＤライトの最大強度の９７％の強度で照射し、様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトルの測定を行った。実施例３の照射強度２０５０Ｗ／ｍ２の結果を図７（ａ）に、実施例３のＬＥＤライトの最大強度の９７％の強度の結果を図７（ｃ）に、実施例５の照射強度２０５０Ｗ／ｍ２の結果を図８（ａ）に、実施例５のＬＥＤ光の最大強度の９７％の強度の結果を図８（ｃ）に、比較例１の照射強度２０５０Ｗ／ｍ２の結果を図９（ａ）に、比較例１のＬＥＤ光の最大強度の９７％の強度の結果を図９（ｃ）に示す。
【0168】
次に、極大吸収波長における耐光性を評価した。具体的には、４５０±５ｎｍの光を透過するバンドパスフィルターを備えたＬＥＤライトで、波長４５０±５ｎｍの光を、照射強度２０５０Ｗ／ｍ２又はＬＥＤ光の最大強度の９７％の強度で照射し、照射直後（０時間後）の極大吸収波長（実施例３は５０９ｎｍ、実施例５は５０４ｎｍ、比較例１は４７３ｎｍ）における吸光度（Ａ０）を１．００として、所定時間経過後の吸光度（Ａ）の維持率（Ａ／Ａ０）を評価した。実施例３の照射強度２０５０Ｗ／ｍ２の結果を図７（ｂ）に、実施例３のＬＥＤ光の最大強度の９７％の強度の結果を図７（ｄ）に、実施例５の照射強度２０５０Ｗ／ｍ２の結果を図８（ｂ）に、実施例５のＬＥＤ光の最大強度の９７％の強度の結果を図８（ｄ）に、比較例１の照射強度２０５０Ｗ／ｍ２の結果を図９（ｂ）に、比較例１のＬＥＤ光の最大強度の９７％の強度の結果を図９（ｄ）に示す。
【0169】
試験例５：細胞の調製（その１）
ＨｅＬａ細胞（ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ，日本）を、３７℃で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）及び１％抗生物質－抗真菌薬（ＡＡ，Ｓｉｇｍａ）を含むDulbecco’s modified Eagle’s medium（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）で、５体積％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養した。イメージングの３日前に、細胞（５×１０４）を、ガラスボトムディッシュに播種した。
ＨｅＬａ細胞（ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ，日本）を、３７℃で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）及び１％抗生物質－抗真菌薬（ＡＡ，Ｓｉｇｍａ）を含むDulbecco’s modified Eagle’s medium（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）で、５体積％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養した。イメージングの３日前に、細胞（５×１０４）を、ガラスボトムディッシュに播種した。
【0170】
試験例６：細胞の蛍光イメージング（その１）
実施例２のトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＡ１／Ａ２の染色実験においては、５００ｎＭのトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＡ１／Ａ２、１％ジメチルスルホキシド及び０．１％ＰｌｕｏｎｉｃＦ－１２７を含むＤＭＥＭ培地中でＨｅＬａ細胞を、５体積％ＣＯ２インキュベーター中で２時間３７℃で培養した。細胞をＤＭＥＭ（－）で３回洗浄後、ＤＭＥＭ（－）で置換し、超解像顕微鏡ＴＣＳ ＳＰ８ ＳＴＥＤ（ライカ製）を用いて観察した。この際、励起波長は４７０～５４０ｎｍが好ましく、４８８～５１５ｎｍが最適であり、５５０～７５０ｎｍの範囲の蛍光シグナルを検出した。結果を図１０に示す。
実施例２のトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＡ１／Ａ２の染色実験においては、５００ｎＭのトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＡ１／Ａ２、１％ジメチルスルホキシド及び０．１％ＰｌｕｏｎｉｃＦ－１２７を含むＤＭＥＭ培地中でＨｅＬａ細胞を、５体積％ＣＯ２インキュベーター中で２時間３７℃で培養した。細胞をＤＭＥＭ（－）で３回洗浄後、ＤＭＥＭ（－）で置換し、超解像顕微鏡ＴＣＳ ＳＰ８ ＳＴＥＤ（ライカ製）を用いて観察した。この際、励起波長は４７０～５４０ｎｍが好ましく、４８８～５１５ｎｍが最適であり、５５０～７５０ｎｍの範囲の蛍光シグナルを検出した。結果を図１０に示す。
【0171】
実施例６のトランス－ＰＯ－ＮａｐｈｏｘＡ１／Ａ２及び比較例２のＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄの染色実験においても、同様に行った。結果を図１０及び１１に示す。
【0172】
試験例７：細胞の蛍光イメージング（その２）
実施例２のトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＡ１／Ａ２の染色実験においては、５００ｎＭのトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＡ１／Ａ２、１％ジメチルスルホキシド及び０．１％ＰｌｕｏｎｉｃＦ－１２７を含むＤＭＥＭ培地中でＨｅＬａ細胞を、５体積％ＣＯ２インキュベーター中で２時間３７℃で培養した。細胞をＤＭＥＭ（－）で３回洗浄後、ＤＭＥＭ（－）で置換し、超解像顕微鏡ＴＣＳ ＳＰ８ ＳＴＥＤ（ライカ製）を用いてイメージングを行った。
実施例２のトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＡ１／Ａ２の染色実験においては、５００ｎＭのトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＡ１／Ａ２、１％ジメチルスルホキシド及び０．１％ＰｌｕｏｎｉｃＦ－１２７を含むＤＭＥＭ培地中でＨｅＬａ細胞を、５体積％ＣＯ２インキュベーター中で２時間３７℃で培養した。細胞をＤＭＥＭ（－）で３回洗浄後、ＤＭＥＭ（－）で置換し、超解像顕微鏡ＴＣＳ ＳＰ８ ＳＴＥＤ（ライカ製）を用いてイメージングを行った。
【0173】
共焦点イメージングは、超解像顕微鏡ＴＣＳ ＳＰ８ ＳＴＥＤを用いて、励起波長は４７０～５４０ｎｍが好ましく、４８８～５１５ｎｍが最適であり、５５０～７５０ｎｍの範囲の蛍光シグナルを検出した。一方、ＳＴＥＤイメージングは、超解像画像を得るために、７７５ｎｍのＳＴＥＤレーザー（パルスレーザー）を使用し、５５０～７５０ｎｍのシグナルを検出した。
【0174】
実施例６のトランス－ＰＯ－ＮａｐｈｏｘＡ１／Ａ２の染色実験においても同様に行った。
【0175】
【0176】
試験例８：細胞の調製（その２）
ＨｅＬａ細胞（ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ，日本）をオレイン酸（４００ｎＭ）で、５体積％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間処理し、培地入れ替えた。ＨｅＬａ細胞（ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ，日本）を、３７℃で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）及び１％抗生物質－抗真菌薬（ＡＡ，Ｓｉｇｍａ）を含むDulbecco’s modified Eagle’s medium（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）で、５体積％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養した。イメージングの３日前に、細胞（５×１０４）を、ガラスボトムディッシュに播種した。
ＨｅＬａ細胞（ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ，日本）をオレイン酸（４００ｎＭ）で、５体積％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間処理し、培地入れ替えた。ＨｅＬａ細胞（ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ，日本）を、３７℃で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）及び１％抗生物質－抗真菌薬（ＡＡ，Ｓｉｇｍａ）を含むDulbecco’s modified Eagle’s medium（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）で、５体積％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養した。イメージングの３日前に、細胞（５×１０４）を、ガラスボトムディッシュに播種した。
【0177】
試験例９：細胞の蛍光イメージング（その３）
実施例１のトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭの染色実験においては、５００ｎＭのトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ、１％ジメチルスルホキシド及び０．１％ＰｌｕｏｎｉｃＦ－１２７を含むＤＭＥＭ培地中でＨｅＬａ細胞を、５体積％ＣＯ２インキュベーター中で２時間３７℃で培養した。細胞をＤＭＥＭ（－）で３回洗浄後、ＤＭＥＭ（－）で置換し、超解像顕微鏡ＴＣＳ ＳＰ８ ＳＴＥＤ及びＦＶ－１０（オリンパス製）を用いて観察した。この際、励起波長は４７０～５４０ｎｍが好ましく、４８８～５１５ｎｍが最適であり、５５０～７５０ｎｍの範囲の蛍光シグナルを検出した。
実施例１のトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭの染色実験においては、５００ｎＭのトランス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ、１％ジメチルスルホキシド及び０．１％ＰｌｕｏｎｉｃＦ－１２７を含むＤＭＥＭ培地中でＨｅＬａ細胞を、５体積％ＣＯ２インキュベーター中で２時間３７℃で培養した。細胞をＤＭＥＭ（－）で３回洗浄後、ＤＭＥＭ（－）で置換し、超解像顕微鏡ＴＣＳ ＳＰ８ ＳＴＥＤ及びＦＶ－１０（オリンパス製）を用いて観察した。この際、励起波長は４７０～５４０ｎｍが好ましく、４８８～５１５ｎｍが最適であり、５５０～７５０ｎｍの範囲の蛍光シグナルを検出した。
【0178】
実施例３のシス－ＰＯ－ＢｐｈｏｘＭ、実施例４のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（１，２）Ｍ、実施例５のトランス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍ及び実施例７のシス－ＰＯ－Ｎａｐｈｏｘ（２，３）Ｍの染色実験においても、同様に行った。
【0179】
結果を図１４に示す。
【0180】
この結果、本発明のビスホスホリル架橋スチルベン化合物は、Ｒ３を改変することにより脂肪滴及びミトコンドリアをそれぞれ選択的に染色することができた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
