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特許7705672核酸多量化を介した多価タンパク質薬物およびワクチンの構築方法と適用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-07-02
(45)【発行日】2025-07-10
(54)【発明の名称】核酸多量化を介した多価タンパク質薬物およびワクチンの構築方法と適用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20250703BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20250703BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20250703BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20250703BHJP
C07K 14/00 20060101ALN20250703BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
A61K47/26
A61P31/00
C40B40/06
C07K14/00
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2023532213
(86)(22)【出願日】2021-11-25
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-13
(86)【国際出願番号】 CN2021133254
(87)【国際公開番号】W WO2022111598
(87)【国際公開日】2022-06-02
【審査請求日】2023-07-25
(31)【優先権主張番号】202011340377.3
(32)【優先日】2020-11-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】519401664
【氏名又は名称】アッセンブリー メディシン，エルエルシー．
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＥＭＢＬＹ ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＬＬＣ．
【住所又は居所原語表記】２－３Ｆ，Ｂｌｄｇ．１，Ｎｏ．８８ Ｄａ‘ｅｒｗｅｎ Ｒｏａｄ．Ｃｈｉｎａ（Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｐｉｌｏｔ Ｆｒｅｅ Ｔｒａｄｅ Ｚｏｎｅ，Ｐｕｄｏｎｇ Ｎｅｗ Ａｒｅａ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110003971
【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，ファン
(72)【発明者】
【氏名】チョウ，ジェイムス ジェイウェン
(72)【発明者】
【氏名】チョウ，リウジュアン
(72)【発明者】
【氏名】ワン，イェンビン
(72)【発明者】
【氏名】ツァオ，チャン
(72)【発明者】
【氏名】ルン，チャンチン
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】特表２０２０－５１９６９６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／１１
Ａ６１Ｋ ４７／２６
Ａ６１Ｐ ３１／００
Ｃ４０Ｂ ４０／０６
Ｃ０７Ｋ １４／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
相補的な核酸骨格ベースの多量体複合体であって、前記複合体は、相補的な核酸骨格を有するｎ個の単量体で複合形成される多量体であり、ここで、各単量体は、核酸一本鎖を有するポリペプチドであり、ｎは、３～６の正の整数であり、前記多量体において、各単量体の核酸一本鎖およびほかの二つの単量体の核酸一本鎖は、塩基相補性により相補的な二本鎖を形成することにより、相補的な核酸骨格構造を形成し、
ここで、前記多量体中の一本鎖核酸配列は、一本鎖核酸配列セットからなり、前記セットは、相補的な核酸骨格ベースの三量体複合体、四量体複合体、または五量体複合体を形成するための、以下のグループ１～グループ４：
（グループ１）相補的な核酸骨格ベースの三量体複合体を形成するための一本鎖核酸配列：
【表1-1】
【表1-2】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【表4】
【請求項2】
前記単量体は、式Ｉの構造を有し、Ｚ１-Ｗ（Ｉ）
式において、
Ｚ１は、ポリペプチド部分（ｍｏｉｅｔｙ）であり、
Ｗは、一本鎖核酸配列であり、
「-」は、リンカーまたは結合であることを特徴とする
請求項１に記載の多量体複合体。
【請求項3】
前記核酸配列Ｗは、式１に示される構造を有し、Ｘ１-Ｒ１-Ｘ２-Ｒ２-Ｘ３（１）
ここで、
Ｒ１は、塩基相補的対合領域１であり、
Ｒ２は、塩基相補的対合領域２であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立して、なしまたは冗長核酸であり、
「-」は、結合であることを特徴とする
請求項２に記載の多量体複合体。
【請求項4】
Ｘ２の配列は、Ａ、ＡＡ、ＡＧＡまたはＡＡＡからなる群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の多量体複合体。
【請求項5】
前記一本鎖核酸配列セットは、相補的な核酸骨格ベースの三量体複合体を形成するためのグループ１中の配列セット３－１～配列セット３－２０のいずれか１つから選択されることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の多量体複合体。
【請求項6】
前記一本鎖核酸配列セットは、相補的な核酸骨格ベースの四量体複合体を形成するためのグループ２中の配列セット４－１～配列セット４－２０のいずれか１つから選択されることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の多量体複合体。
【請求項7】
前記一本鎖核酸配列セットは、相補的な核酸骨格ベースの五量体複合体を形成するためのグループ３中の配列セット５－１～配列セット５－２０のいずれか１つから選択されることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の多量体複合体。
【請求項8】
前記一本鎖核酸配列セットは、相補的な核酸骨格ベースの四量体複合体を形成するための一本鎖核酸配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２７５～２７８からなるグループ４中の配列セットであることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の多量体複合体。
【請求項9】
医薬組成物であって、前記医薬組成物は、
（ａ）請求項１に記載の相補的な核酸骨格ベースの多量体複合体と、および
（ｂ）薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
【請求項10】
核酸配列ライブラリーであって、前記核酸配列ライブラリーは、請求項２に記載の相補的な核酸骨格ベースの多量体複合体を形成するための核酸配列を含むことを特徴とする、前記核酸配列ライブラリー。
【請求項11】
前記核酸配列Ｗは、式１に示される構造を有し、Ｘ１-Ｒ１-Ｘ２-Ｒ２-Ｘ３（１）
ここで、
Ｒ１は、塩基相補的対合領域１であり、
Ｒ２は、塩基相補的対合領域２であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立して、なしまたは冗長核酸であり、
「-」は、結合であることを特徴とする
請求項１０に記載の核酸配列ライブラリー。
【請求項12】
請求項１０に記載の核酸配列ライブラリーの使用であって、請求項１に記載の多量体複合体または請求項１に記載の多量体複合体を含む医薬組成物の調製に用いられることを特徴とする、前記使用。
【請求項13】
相補的な核酸骨格ベースの多量体複合体を形成するための一本鎖核酸配列を決定する方法であって、以下の段階：（ａ）シミュレーテッドアニーリングのパラメーターを設定すること：
アニーリング初期温度、アニーリング終了温度およびアニーリング温度減衰係数ΔＴを設定し、
最適化制約パラメーターを設定し、
（１）核酸一本鎖の数ｎ、ここでｎは３～６の正の整数であり、
（２）対合配列長さＬ、ここでＬは１２～１６塩基であり、
（３）対合領域の解離温度閾値Ｔｍ、
（４）特異的対合領域配列の自由エネルギー閾値ΔＧＳ°、
（５）非特異的対合の自由エネルギー閾値ΔＧＮＳ°、
（６）コネクタＸ２、ここでコネクタＸ２はＡ、ＡＡおよびＡＡＡからなる群から選択され、
（７）二次構造（ヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ））解離温度閾値Ｔｍ-Ｈ、
（８）対合配列内のＣＧ比ＰＣＧ、且つＰＣＧの範囲は、［０．４、０．６）であり、
上記パラメーターに従って、配列セット
【数1】
（ｂ）前段階に記載のセットＳの目的関数値Ｅ０を計算し、即ち、配列間と配列自体との非特異的対合の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）の合計を計算し、同時に、非特異的対合の自由エネルギー行列Cn×nを得、その上三角行列中の最小値に対応するＳｉおよびＳｊ（１≦ｉ≦ｎ、１≦ｊ≦ｎ）を検索し、ＳｉおよびＳｊ非特異的対合の自由エネルギーΔＧＮＳ°（Ｓｉ，Ｓｊ）に従って、ＳｉまたはＳｊをランダムに選択して更新操作を実行して、新しい核酸配列を得、更新された配列セットＳ’を得ること、
（ｃ）前段階に記載のセットＳ’中の配列が段階（ａ）で設定した最適化制約パラメーター条件を満たすかどうかを判断し、特異的対合領域解離温度Ｔｍ、特異的対合領域配列の自由エネルギーΔＧＳ°、二次構造の解離温度Ｔｍ－ＨおよびＣＧ比ＰＣＧを含むパラメーターを検証し、上記パラメーターが制約条件を満たすと、段階（ｄ）を実行し、そうでない場合、段階（ｃ）を繰り返し実行し、特定のアニーリング温度下で、段階（ｂ）を１５回連続して実行しても条件を満たすＳ’が得られないと、無限循環を防止するために、セットＳをセットＳ’とし、次の段階を実行すること、
（ｄ）前段階に記載のセットＳ’の目的関数値Ｅ１を計算し、Ｅ０とＥ１とを比較し、Ｅ１≧Ｅ０の場合、非特異的対合の自由エネルギーが最適化されていることを示し、配列セットＳ’は、配列セットＳになり、Ｅ１＜Ｅ０の場合、非特異的対合の自由エネルギーが最適化されていないことを示し、この場合Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓ基準に従って、Ｓ’をＳにセットするかどうかを判断すること、ならびに
（ｅ）アニーリング温度を段階（ａ）で設定した減衰係数ΔＴに従って減衰させ、前段階に記載のＳについて段階（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を繰り返し実行し、即ち、モンテカルロのシミュレーテッドアニーリングに基づいて、アニーリング温度がアニーリング終了温度に達するまで、前段階に記載の
【数2】
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項14】
（９）ｎ＝４の場合、対称配列を使用し、上記パラメーターに従って、配列セット【数3】
【請求項15】
相補的な核酸骨格ベースの多量体複合体を形成するための一本鎖核酸配列セットからなる核酸のセットであって、
ここで、前記一本鎖核酸配列セットは、相補的な核酸骨格ベースの三量体複合体、四量体複合体、または五量体複合体を形成するための、以下のグループ１～グループ４：
（グループ１）相補的な核酸骨格ベースの三量体複合体を形成するための一本鎖核酸配列：
【表5-1】
【表5-2】
【表6-1】
【表6-2】
【表6-3】
【表7-1】
【表7-2】
【表7-3】
【表7-4】
【表8】
【請求項16】
前記一本鎖核酸配列は、左旋性核酸、ペプチド核酸、ロック核酸、硫黄修飾核酸、２’－フルオロ修飾核酸、５－ヒドロキシメチルシトシン核酸、ホスホロジアミデートモルホリノ核酸、およびその組み合わせからなる群から選択される核酸からなる配列であることを特徴とする請求項１に記載の多量体複合体。
【請求項17】
前記一本鎖核酸配列は、ホスホロジアミデートモルホリノ核酸からなる配列であることを特徴とする請求項１に記載の多量体複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジー医学の分野に関し、具体的には、核酸多量化を介した多価タンパク質薬物およびワクチンの構築方法と適用に関する。
【背景技術】
【0002】
多くの生体高分子の場合、それらの凝集または多価状態は、それらのインビボでの活性および半減期に直接影響する。例えば、ほとんどの免疫受容体の活性化には、細胞膜での受容体の凝集が伴い、それによって、細胞内部の下流シグナル伝達経路を活性化する。従って、これらの受容体の天然リガンドまたは抗体は、多価または高価を形成する場合に、受容体を活性化する能力を大幅に向上させることがよくある。また、サイトカイン、成長ホルモン、合成ポリペプチド等の低分子量（ＭＷ４０ｋＤａ）の一部のタンパク質薬物は、腎クリアランスが高く、生体内での半減期が短く、これらのタンパク質薬物は、高価を形成することで分子量を増加させ、半減期を延長することもできる。
【0003】
従って、タンパク質の多価化は、生物医学の分野で注目を集めているプロセスであり、既存の方法が多く存在するが、多くの化学架橋法の場合、結合特異性が低く、結合多量体が不均一であるという問題がある。現在、最も広く適用されている方法は、タンパク質を多価融合タンパク質の形態で細胞により発現、生産すること、有効機能のタンパク質領域と、オリゴマーを形成できるタンパク質とを融合させて、Ｆｃ二価融合タンパク質およびＧＣＮ４三価融合タンパク質等のキメラ体を形成することである。これらの融合タンパク質は、すべて均一なオリゴマーを形成できるが、融合タンパク質の細胞発現量および活性は、元のタンパク質薬物よりも低く、Ｆｃ領域の存在は、免疫系を活性化し、サイトカインの放出を誘導し、細胞毒性を引き起こすリスクをもたらす。従って、この分野では、検証されたタンパク質薬物から非融合タンパク質の携帯で均一な、特異性の高い多価タンパク質を形成できる、簡単で、柔軟かつ効率的な方法の開発が急務となっている。
【0004】
また、タンパク質の多価化は、ワクチン開発にとっても重要である。まず、Ｂ細胞ベースのワクチン設計では、ウイルスまたは細菌のタンパク質を抗原としてＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を活性化することが重要な段階である。ＢＣＲは、上記に記載の免疫受容体と同じものであり、その効果的に活性化には、細胞膜上に受容体が凝集する必要があるため、単量体抗原に比較して、高価抗原の方が、Ｂ細胞の活性化方面において絶対的に利点を有する。次に、高価抗原は、オリゴマーを形成するための単一の抗原である必要はなく、高価抗原は、あるウイルス内の異なるタンパク質または異なるウイルス株の同じタンパク質の突然変異型およびサブタイプを含むことができ、このように、多様な抗原提示は、理論的に宿主免疫系のポリクローナルＢ細胞応答（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘導して、より広範囲の中和抗体を生成することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の第１の目的は、多価薬物またはワクチンを形成するための核酸カップリングタンパク質薬物の効率的かつ安定な集合に適した、効率的かつ安定的に集合したｎ段階の核酸オリゴマー集合体骨格設計を提供することである。
【0006】
本発明の第２の目的は、タンパク質薬物を多価高分子に形成して、薬物の半減期を延長し、薬物の活性を増加させるための簡単で効率的な方法を提供することである。
【0007】
本発明の第３の目的は、免疫細胞を活性化し、ワクチンの免疫原性を向上させるために、同じまたは異なるタンパク質抗原と多価高分子複合体を形成するための、簡単で柔軟かつ効率的で、モジュール化の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の第１の態様は、相補的な核酸骨格ベースの多量体複合体を提供し、前記複合体は、相補的な核酸骨格を有するｎ個の単量体で複合形成される多量体であり、ここで、各単量体は、前記核酸一本鎖を有するポリペプチドであり、ｎは、３～６の正の整数であり、前記多量体において、各単量体の核酸一本鎖およびほかの二つの単量体の核酸一本鎖は、塩基相補性により相補的な二本鎖を形成することにより、相補的な核酸骨格構造を形成する。
【0009】
別の好ましい例において、ｎは、３、４、５または６である。
別の好ましい例において、前記複合体は、三量体、四量体、または五量体であり、好ましくは前記複合体の構造は、図１に示されたとおりである。
別の好ましい例において、前記複合体は、三量体、四量体、または五量体であり、好ましくは前記複合体の構造は、図１に示されたとおりである。
【0010】
別の好ましい例において、前記単量体は、式Ｉの構造を有し、
Ｚ１-Ｗ（Ｉ）
式において、
Ｚ１は、ポリペプチド部分（ｍｏｉｅｔｙ）であり、
Ｗは、一本鎖核酸配列であり、
「-」は、リンカーまたは結合である。
別の好ましい例において、「-」は、共有結合である。
Ｚ１-Ｗ（Ｉ）
式において、
Ｚ１は、ポリペプチド部分（ｍｏｉｅｔｙ）であり、
Ｗは、一本鎖核酸配列であり、
「-」は、リンカーまたは結合である。
別の好ましい例において、「-」は、共有結合である。
【0011】
別の好ましい例において、前記核酸配列は、左旋性核酸、ペプチド核酸、ロック核酸、硫黄修飾核酸、２’－フルオロ修飾核酸、５－ヒドロキシメチルシトシン核酸、ホスホロジアミデートモルホリノ核酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）核酸、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0012】
別の好ましい例において、前記多量体において、各単量体のＺ１は、同一であるか、または異なっている。
別の好ましい例において、前記多量体において、各単量体のＷは、異なる。
別の好ましい例において、前記多量体において、各単量体のＷは、異なる。
【0013】
別の好ましい例において、前記単量体は、式ＩＩの構造を有し、
Ｄ-［Ｌ-Ｗ］ｍ（ＩＩ）
ここで、
Ｄは、タンパク質の薬物要素部分であり、
Ｗは、核酸配列であり、
Ｌは、なしまたはリンカーであり、
「-」は、共有結合であり、
ｍは、１、２または３である。
別の好ましい例において、ｍは、１である。
Ｄ-［Ｌ-Ｗ］ｍ（ＩＩ）
ここで、
Ｄは、タンパク質の薬物要素部分であり、
Ｗは、核酸配列であり、
Ｌは、なしまたはリンカーであり、
「-」は、共有結合であり、
ｍは、１、２または３である。
別の好ましい例において、ｍは、１である。
【0014】
別の好ましい例において、前記単量体は、式ＩＩＩの構造を有し、
Ａ-［Ｌ-Ｗ］ｍ（ＩＩＩ）
ここで、
Ａは、ポリペプチド抗原要素部分であり、
Ｗは、核酸配列であり、
Ｌは、なしまたはリンカーであり、
「-」は、共有結合であり、
ｍは、１、２または３である。
別の好ましい例において、ｍは、１である。
Ａ-［Ｌ-Ｗ］ｍ（ＩＩＩ）
ここで、
Ａは、ポリペプチド抗原要素部分であり、
Ｗは、核酸配列であり、
Ｌは、なしまたはリンカーであり、
「-」は、共有結合であり、
ｍは、１、２または３である。
別の好ましい例において、ｍは、１である。
【0015】
別の好ましい例において、前記核酸配列Ｗは、式１に示される構造を有し、
Ｘ１-Ｒ１-Ｘ２-Ｒ２-Ｘ３（１）
ここで、
Ｒ１は、塩基相補的対合領域１であり、
Ｒ２は、塩基相補的対合領域２であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立して、なしまたは冗長核酸であり、
「-」は、結合である。
Ｘ１-Ｒ１-Ｘ２-Ｒ２-Ｘ３（１）
ここで、
Ｒ１は、塩基相補的対合領域１であり、
Ｒ２は、塩基相補的対合領域２であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立して、なしまたは冗長核酸であり、
「-」は、結合である。
【0016】
別の好ましい例において、Ｒ１およびＲ２の長さは、それぞれ独立して、１０～２０塩基、好ましくは１４～１６塩基である。
別の好ましい例において、Ｘ１の長さは、０～５塩基である。
別の好ましい例において、Ｘ３の長さは、０～５塩基である。
別の好ましい例において、Ｘ２の長さは、０～３塩基である。
別の好ましい例において、Ｘ２の配列は、Ａ、ＡＡ、ＡＧＡまたはＡＡＡからなる群から選択される。
別の好ましい例において、Ｘ１の長さは、０～５塩基である。
別の好ましい例において、Ｘ３の長さは、０～５塩基である。
別の好ましい例において、Ｘ２の長さは、０～３塩基である。
別の好ましい例において、Ｘ２の配列は、Ａ、ＡＡ、ＡＧＡまたはＡＡＡからなる群から選択される。
【0017】
別の好ましい例において、各単量体のＲ１は、左隣（または左側）の単量体のＲ２と塩基相補的対合構造を形成し、Ｒ２は、右隣（または右側）の単量体のＲ１と塩基相補的対合構造を形成する。
【0018】
別の好ましい例において、前記単量体配列は、相補的な核酸骨格ベースの三量体複合体を形成する一本鎖核酸配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１～６０（表９－１を参照する）のいずれか一つの配列またはその配列セットから選択される。
【0019】
別の好ましい例において、前記単量体配列は、相補的な核酸骨格ベースの四量体複合体を形成する一本鎖核酸配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６１～１４０（表９－２を参照する）のいずれか一つの配列またはその配列セットから選択される。
【0020】
別の好ましい例において、前記単量体配列は、相補的な核酸骨格ベースの五量体複合体を形成する一本鎖核酸配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１４１～２４０（表９－３を参照する）のいずれか一つの配列またはその配列セットから選択される。
【0021】
別の好ましい例において、前記単量体配列は、ホスホロジアミデートモルホリノ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）核酸である。
【0022】
別の好ましい例において、前記単量体配列は、相補的な核酸骨格ベースの四量体複合体を形成する一本鎖核酸配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２７５～２７８のいずれか一つの配列またはその配列セットから選択される。
【0023】
本発明の第２の態様は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、
（ａ）第１の態様に記載の相補的な核酸骨格ベースの多量体複合体と、および
（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、ワクチン組成物を含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、治療用および／または予防用の医薬組成物を含む。
別の好ましい例において、前記多量体複合体は、三量体複合体、四量体複合体および五量体複合体を含む。
（ａ）第１の態様に記載の相補的な核酸骨格ベースの多量体複合体と、および
（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、ワクチン組成物を含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、治療用および／または予防用の医薬組成物を含む。
別の好ましい例において、前記多量体複合体は、三量体複合体、四量体複合体および五量体複合体を含む。
【0024】
本発明の第３の態様は、核酸配列ライブラリーを提供し、前記核酸配列ライブラリーは、第１の態様に記載の相補的な核酸骨格ベースの多量体複合体を形成するための核酸配列を含む。
【0025】
別の好ましい例において、前記核酸配列は、
（ａ）相補的な核酸骨格ベースの三量体複合体を形成するための核酸配列と、
（ｂ）相補的な核酸骨格ベースの四量体複合体を形成するための核酸配列と、および／または
（ｃ）相補的な核酸骨格ベースの五量体複合体を形成するための核酸配列とを含む。
（ａ）相補的な核酸骨格ベースの三量体複合体を形成するための核酸配列と、
（ｂ）相補的な核酸骨格ベースの四量体複合体を形成するための核酸配列と、および／または
（ｃ）相補的な核酸骨格ベースの五量体複合体を形成するための核酸配列とを含む。
【0026】
別の好ましい例において、前記核酸配列Ｗは、式１に示される構造を有し、
Ｘ１-Ｒ１-Ｘ２-Ｒ２-Ｘ３（１）
ここで、
Ｒ１は、塩基相補的対合領域１であり、
Ｒ２は、塩基相補的対合領域２であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立して、なしまたは冗長核酸であり、
「-」は、結合である。
Ｘ１-Ｒ１-Ｘ２-Ｒ２-Ｘ３（１）
ここで、
Ｒ１は、塩基相補的対合領域１であり、
Ｒ２は、塩基相補的対合領域２であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立して、なしまたは冗長核酸であり、
「-」は、結合である。
【0027】
本発明の第４の態様は、第１の態様に記載の多量体複合体または前記多量体複合体を含む医薬組成物の調製に使用される、第３の態様に記載の核酸配列ライブラリーの使用を提供する。
【0028】
本発明の第５の態様は、相補的な核酸骨格ベースの多量体複合体を形成するための一本鎖核酸配列を決定する方法を提供し、以下の段階を含む：
（ａ）シミュレーテッドアニーリングのパラメーターを設定すること：
アニーリング初期温度、アニーリング終了温度およびアニーリング温度減衰係数ΔＴを設定し、
最適化制約パラメーターを設定し、
（１）核酸一本鎖の数ｎ、好ましくは３～６の正の整数であり、
（２）対合配列長さＬ、好ましくはＬは、１２～１６塩基であり、
（３）対合領域の解離温度閾値Ｔｍ、
（４）特異的対合領域配列の自由エネルギー閾値ΔＧＳ°、
（５）非特異的対合の自由エネルギー閾値ΔＧＮＳ°、
（６）コネクタＸ２、好ましくはＡ、ＡＡおよびＡＡＡであり、
（７）二次構造（ヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ））解離温度閾値Ｔｍ－Ｈ、
（８）対合配列内のＣＧ比ＰＣＧ、好ましくは、ＰＣＧの範囲は、［０．４、０．６）であり、
（９）任意選択で、ｎ＝４の場合、対称配列を使用し、上記パラメーターに従って、配列セット
を初期化し、
（ｂ）前段階に記載のセットＳの目的関数値Ｅ０を計算し、即ち、配列間と配列自体との非特異的対合の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）の合計を計算し、同時に、非特異的対合の自由エネルギー行列Ｃｎ×ｎを得、その上三角行列中の最小値に対応するＳｉおよびＳｊ（１≦ｉ≦ｎ、１≦ｊ≦ｎ）を検索し、ＳｉおよびＳｊ非特異的対合の自由エネルギーΔＧＮＳ°（Ｓｉ，Ｓｊ）に従って、ＳｉまたはＳｊをランダムに選択して更新操作を実行して、新しい核酸配列を得、更新された配列セットＳ’を得ること、
（ｃ）前段階に記載のセットＳ’中の配列が段階（ａ）中で設定した最適化制約パラメーター条件を満たすかどうかを判断し、特異的対合領域解離温度Ｔｍ、特異的対合領域配列の自由エネルギーΔＧＳ°、二次構造の解離温度Ｔｍ－ＨおよびＣＧ比ＰＣＧを含む等のパラメーターを検証し、上記パラメーターが制約条件を満たすと、段階（ｄ）を実行し、そうでない場合、段階（ｃ）を繰り返し実行し、特定のアニーリング温度下で、段階（ｂ）を１５回連続して実行しても条件を満たすＳ’が得られないと、無限循環を防止するために、セットＳをセットＳ’とし、次の段階を実行すること、
（ｄ）前段階に記載のセットＳ’の目的関数値Ｅ１を計算し、Ｅ０とＥ１とを比較し、Ｅ１≧Ｅ０の場合、非特異的対合の自由エネルギーが最適化されていることを示し、配列セットＳ’は、配列セットＳになり、Ｅ１＜Ｅ０の場合、非特異的対合の自由エネルギーが最適化されていないことを示し、この場合Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓ基準に従って、Ｓ’をＳにセットするかどうかを判断すること、ならびに
（ｅ）アニーリング温度を段階（ａ）で設定した減衰係数ΔＴに従って減衰させ、前段階に記載のＳについて段階（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を繰り返し実行し、即ち、モンテカルロのシミュレーテッドアニーリングに基づいて、アニーリング温度がアニーリング終了温度に達するまで、前段階に記載の
が相補的な核酸骨格ベースの多量体複合体を形成するための一本鎖核酸配列になること。
（ａ）シミュレーテッドアニーリングのパラメーターを設定すること：
アニーリング初期温度、アニーリング終了温度およびアニーリング温度減衰係数ΔＴを設定し、
最適化制約パラメーターを設定し、
（１）核酸一本鎖の数ｎ、好ましくは３～６の正の整数であり、
（２）対合配列長さＬ、好ましくはＬは、１２～１６塩基であり、
（３）対合領域の解離温度閾値Ｔｍ、
（４）特異的対合領域配列の自由エネルギー閾値ΔＧＳ°、
（５）非特異的対合の自由エネルギー閾値ΔＧＮＳ°、
（６）コネクタＸ２、好ましくはＡ、ＡＡおよびＡＡＡであり、
（７）二次構造（ヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ））解離温度閾値Ｔｍ－Ｈ、
（８）対合配列内のＣＧ比ＰＣＧ、好ましくは、ＰＣＧの範囲は、［０．４、０．６）であり、
（９）任意選択で、ｎ＝４の場合、対称配列を使用し、上記パラメーターに従って、配列セット
【数1】
（ｂ）前段階に記載のセットＳの目的関数値Ｅ０を計算し、即ち、配列間と配列自体との非特異的対合の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）の合計を計算し、同時に、非特異的対合の自由エネルギー行列Ｃｎ×ｎを得、その上三角行列中の最小値に対応するＳｉおよびＳｊ（１≦ｉ≦ｎ、１≦ｊ≦ｎ）を検索し、ＳｉおよびＳｊ非特異的対合の自由エネルギーΔＧＮＳ°（Ｓｉ，Ｓｊ）に従って、ＳｉまたはＳｊをランダムに選択して更新操作を実行して、新しい核酸配列を得、更新された配列セットＳ’を得ること、
（ｃ）前段階に記載のセットＳ’中の配列が段階（ａ）中で設定した最適化制約パラメーター条件を満たすかどうかを判断し、特異的対合領域解離温度Ｔｍ、特異的対合領域配列の自由エネルギーΔＧＳ°、二次構造の解離温度Ｔｍ－ＨおよびＣＧ比ＰＣＧを含む等のパラメーターを検証し、上記パラメーターが制約条件を満たすと、段階（ｄ）を実行し、そうでない場合、段階（ｃ）を繰り返し実行し、特定のアニーリング温度下で、段階（ｂ）を１５回連続して実行しても条件を満たすＳ’が得られないと、無限循環を防止するために、セットＳをセットＳ’とし、次の段階を実行すること、
（ｄ）前段階に記載のセットＳ’の目的関数値Ｅ１を計算し、Ｅ０とＥ１とを比較し、Ｅ１≧Ｅ０の場合、非特異的対合の自由エネルギーが最適化されていることを示し、配列セットＳ’は、配列セットＳになり、Ｅ１＜Ｅ０の場合、非特異的対合の自由エネルギーが最適化されていないことを示し、この場合Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓ基準に従って、Ｓ’をＳにセットするかどうかを判断すること、ならびに
（ｅ）アニーリング温度を段階（ａ）で設定した減衰係数ΔＴに従って減衰させ、前段階に記載のＳについて段階（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を繰り返し実行し、即ち、モンテカルロのシミュレーテッドアニーリングに基づいて、アニーリング温度がアニーリング終了温度に達するまで、前段階に記載の
【数2】
【0029】
別の好ましい例において、段階（ａ）におけるシミュレーテッドアニーリングパラメーターの設定は、
例えば、アニーリング初期温度Ｔｏ＝５０℃±２℃、アニーリング終了温度Ｔｆ＝０．１２℃±０．０２℃に設定し、アニーリング温度減衰係数ΔＴは、状況に応じて、一般に０．９８±０．０１であり、
最適化制約パラメーターを設定し、
（１）核酸一本鎖の数ｎは、３～６的正の整数であり、
（２）対合配列長さＬは、状況に応じて決定し（好ましくは、Ｌは、１２～１６塩基である）、
（３）対合領域の解離温度閾値Ｔｍは、対合配列長さに応じて決定し（例えば、Ｌ＝１４塩基の場合、Ｔｍ＞５０℃であり、Ｌ＝１６塩基の場合、Ｔｍ＞５２℃である）、
（４）特異的対合領域配列の自由エネルギー閾値ΔＧＳ°は、対合配列長さに応じて決定し（好ましくは、Ｌ＝１４塩基の場合、ΔＧＳ°＜－２７ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、Ｌ＝１６塩基の場合、ΔＧＳ°＜－２９ｋｃａｌ／ｍｏｌである）、
（５）非特異的対合の自由エネルギー閾値ΔＧＮＳ°は、配列長さに応じて決定し（好ましくは、ΔＧＮＳ°＞－７ｋｃａｌ／ｍｏｌである）、
（６）コネクタＸ２は、状況に応じて決定し（Ａ、ＡＡおよびＡＡＡ等であり得る）、
（７）二次構造（ヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ））解離温度閾値Ｔｍ－Ｈは、状況に応じて決定し（好ましくは、Ｔｍ－Ｈ＜４０℃±２℃である）、
（８）対合配列中ＣＧ比例ＰＣＧの範囲は、［０．４、０．６）であり、
（９）特に、ｎ＝４の場合、対称配列を使用し、上記パラメーターに従って、配列セット
を初期化することができる。
例えば、アニーリング初期温度Ｔｏ＝５０℃±２℃、アニーリング終了温度Ｔｆ＝０．１２℃±０．０２℃に設定し、アニーリング温度減衰係数ΔＴは、状況に応じて、一般に０．９８±０．０１であり、
最適化制約パラメーターを設定し、
（１）核酸一本鎖の数ｎは、３～６的正の整数であり、
（２）対合配列長さＬは、状況に応じて決定し（好ましくは、Ｌは、１２～１６塩基である）、
（３）対合領域の解離温度閾値Ｔｍは、対合配列長さに応じて決定し（例えば、Ｌ＝１４塩基の場合、Ｔｍ＞５０℃であり、Ｌ＝１６塩基の場合、Ｔｍ＞５２℃である）、
（４）特異的対合領域配列の自由エネルギー閾値ΔＧＳ°は、対合配列長さに応じて決定し（好ましくは、Ｌ＝１４塩基の場合、ΔＧＳ°＜－２７ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、Ｌ＝１６塩基の場合、ΔＧＳ°＜－２９ｋｃａｌ／ｍｏｌである）、
（５）非特異的対合の自由エネルギー閾値ΔＧＮＳ°は、配列長さに応じて決定し（好ましくは、ΔＧＮＳ°＞－７ｋｃａｌ／ｍｏｌである）、
（６）コネクタＸ２は、状況に応じて決定し（Ａ、ＡＡおよびＡＡＡ等であり得る）、
（７）二次構造（ヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ））解離温度閾値Ｔｍ－Ｈは、状況に応じて決定し（好ましくは、Ｔｍ－Ｈ＜４０℃±２℃である）、
（８）対合配列中ＣＧ比例ＰＣＧの範囲は、［０．４、０．６）であり、
（９）特に、ｎ＝４の場合、対称配列を使用し、上記パラメーターに従って、配列セット
【数3】
【0030】
別の好ましい例において、前記各一本鎖核酸配列Ｗは、式１に示される構造を有し、
Ｘ１-Ｒ１-Ｘ２-Ｒ２-Ｘ３（１）
ここで、
Ｒ１は、塩基相補的対合領域１であり、
Ｒ２は、塩基相補的対合領域２であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立して、なしまたは冗長核酸であり、
「-」は、結合である。
Ｘ１-Ｒ１-Ｘ２-Ｒ２-Ｘ３（１）
ここで、
Ｒ１は、塩基相補的対合領域１であり、
Ｒ２は、塩基相補的対合領域２であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立して、なしまたは冗長核酸であり、
「-」は、結合である。
【0031】
別の好ましい例において、段階（ｄ）において、前記最適化セットは、次の条件を満たすセットであり、
（Ｃ１）相補的な核酸骨格構造において、標的対合によって形成されたＤＮＡ二本鎖構造の自由エネルギー（ΔＧＳ°）が小さいか、または最小であり、ならびに
（Ｃ２）相補的な核酸骨格構造において、非標的対合のΔＧＮＳ°は、大きいか、または最大化される。
（Ｃ１）相補的な核酸骨格構造において、標的対合によって形成されたＤＮＡ二本鎖構造の自由エネルギー（ΔＧＳ°）が小さいか、または最小であり、ならびに
（Ｃ２）相補的な核酸骨格構造において、非標的対合のΔＧＮＳ°は、大きいか、または最大化される。
【0032】
別の好ましい例において、段階（ｄ）において、前記利点セットは、次の条件をさらに満たし、
（Ｃ３）Ｒ１およびＲ２領域の対合解離温度Ｔｍ＞５０℃である（Ｌ＝１４塩基の場合）。
（Ｃ３）Ｒ１およびＲ２領域の対合解離温度Ｔｍ＞５０℃である（Ｌ＝１４塩基の場合）。
【0033】
別の好ましい例において、段階（ｃ）において、最近傍法によりＤＮＡオリゴマー（即ち、相補的な核酸骨格構造）の自由エネルギー（ΔＧＳ°）を計算する。
【0034】
別の好ましい例において、段階（ｃ）において、ＤＮＡオリゴマー（即ち、相補的な核酸骨格構造）を１０の異なる最近傍ペア相互作用に分解し、これらのペア相互作用は、ＡＡ／ＴＴ；ＡＴ／ＴＡ；ＴＡ／ＡＴ；ＣＡ／ＧＴ；ＧＴ／ＣＡ；ＣＴ／ＧＡ；ＧＡ／ＣＴ；ＣＧ／ＧＣ；ＧＣ／ＣＧおよび和ＧＧ／ＣＣであり、これらのペア相互作用のエンタルピー（ｅｎｔｈａｌｐｙ、ΔＨ°）およびエントロピー（ｅｎｔｒｏｐｙ、ΔＳ°）に基づいて、対応するそれぞれのΔＧ°値を計算し、次いで相補的な核酸骨格構造に含まれるペア相互作用の自由エネルギーを合併し（または合計する）、相補的な核酸骨格構造の自由エネルギーを取得する。
【0035】
別の好ましい例において、前記方法は、反復プロセスに全体的な最適解を取得するために、段階（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を複数買い繰り返す（即ち、ｎ１回反復を実行する）。
【0036】
別の好ましい例において、前記反復プロセスにおいて、Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓ基準に従って、アルゴリズムが終了時に可能な限り全体的な最適解を見つけることができるように、より悪い解は、限られた範囲で受け入れられ、より劣った解が受け入れられる確率は、徐々に０に近づく傾向がある。
【0037】
別の好ましい例において、次の最適化目的関数を使用してシミュレーテッドアニーリングの反復を模擬することによって、非標的対合領域の自由エネルギーを最適化し、
ΔＧ°（Ｓｉ，Ｓｊ）は、配列Ｓｉおよび配列Ｓｊの非標的対合の自由エネルギーであり、
は、すべての配列間の非標的対合の自由エネルギーの合計であり、その値は、負であり、ここで、この負の値が大きいほど、対象外の非標的対合減少に有利である。
【数4】
【数5】
【0038】
本発明の第６の態様は、相補的な核酸骨格ベースの多量体複合体を形成するための一本鎖核酸配列セットを提供し、前記一本鎖核酸配列セットは、第５の態様に記載の方法によって決定される。
【0039】
別の好ましい例において、前記セットは以下からなる群から選択される。
（Ｓ１）相補的な核酸骨格ベースの三量体複合体を形成するための一本鎖核酸配列：
（Ｓ２）相補的な核酸骨格ベースの四量体複合体を形成するための一本鎖核酸配列：
（Ｓ１）相補的な核酸骨格ベースの三量体複合体を形成するための一本鎖核酸配列：
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【0040】
（Ｓ３）相補的な核酸骨格ベースの五量体複合体を形成するための一本鎖核酸配列：
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【0041】
本発明の第７の態様は、相補的な核酸骨格ベースの多量体複合体を形成するための一本鎖核酸配列を決定するための装置を提供し、前記装置は、
（Ｍ１）シミュレーテッドアニーリングパラメーター、最適化制約パラメーターおよび任意選択の最適化される核酸配列を入力するために使用される、入力モジュールと、
ここで、前記シミュレーテッドアニーリングパラメーターの設定は、アニーリング初期温度、アニーリング終了温度およびアニーリング温度減衰係数ΔＴを含み、
前記最適化制約パラメーターは、
（１）好ましくは３～６の正の整数である、核酸一本鎖の数ｎと、
（２）好ましくは１２～１６塩基である、対合配列長さＬと、
（３）対合領域の解離温度閾値Ｔｍと、
（４）特異的対合領域配列の自由エネルギー閾値ΔＧＳ°と、
（５）非特異的対合の自由エネルギー閾値ΔＧＮＳ°と、
（６）好ましくはＡ、ＡＡおよびＡＡＡである、コネクタＸ２と、
（７）二次構造（ヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ））解離温度閾値Ｔｍ－Ｈと、
（８）好ましくは、ＰＣＧの範囲は、［０．４、０．６）である、対合配列内のＣＧ比ＰＣＧとを含み、
（Ｍ２）以下のサブ段階を実行することにより、最適化された一本鎖核酸配列またはそのセットを取得するように構成される、最適化操作モジュールと、
（ｚ１）初期セットＳの目的関数値Ｅ０を計算し、即ち、配列間と配列自体との非特異的対合の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）の合計を計算し、同時に非特異的対合の自由エネルギー行列Ｃｎ×ｎを得、その上三角行列中の最小値に対応するＳｉおよびＳｊ（１≦ｉ≦ｎ、１≦ｊ≦ｎ）を検索し、ＳｉおよびＳｊ非特異的対合の自由エネルギーΔＧＮＳ°（Ｓｉ，Ｓｊ）に従って、ＳｉまたはＳｊをランダムに選択して更新操作を実行して、新しい核酸配列を得、更新された配列セットＳ’を得、
（ｚ２）前段階に記載のセットＳ’中の配列が設定した最適化制約パラメーター条件を満たすかどうかを判断し、特異的対合領域解離温度Ｔｍ、特異的対合領域配列の自由エネルギーΔＧＳ°、二次構造の解離温度Ｔｍ－ＨおよびＣＧ比ＰＣＧを含むパラメーターを検証し、上記パラメーターが制約条件を満たすと、段階（ｚ３）を実行し、そうでない場合、段階（ｚ２）を繰り返し実行し、特定のアニーリング温度下で、段階を１５回連続して実行しても条件を満たすＳ’が得られないと、無限循環を防止するために、セットＳをセットＳ’とし、次の段階を実行し、
（ｚ３）前段階に記載のセットＳ’の目的関数値Ｅ１を計算し、Ｅ０とＥ１とを比較し、Ｅ１≧Ｅ０の場合、非特異的対合の自由エネルギーが最適化されていることを示し、配列セットＳ’は、配列セットＳになり、Ｅ１＜Ｅ０の場合、非特異的対合の自由エネルギーが最適化されていないことを示し、この場合Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓ基準に従って、Ｓ’をＳにセットするかどうかを判断する必要があり、ならびに
（ｚ４）アニーリング温度を、設定した減衰係数ΔＴに従って減衰させ、前段階に記載のＳについて段階（ｚ１）、（ｚ２）および（ｚ３）を繰り返し実行し、即ち、モンテカルロのシミュレーテッドアニーリングに基づいて、アニーリング温度がアニーリング終了温度に達するまで、前段階に記載の
を相補的な核酸骨格ベースの多量体複合体を形成するための一本鎖核酸配列になり、ならびに
（Ｍ３）最適化された一本鎖核酸配列またはそのセットを出力するために使用される、出力モジュールとを含む。
（Ｍ１）シミュレーテッドアニーリングパラメーター、最適化制約パラメーターおよび任意選択の最適化される核酸配列を入力するために使用される、入力モジュールと、
ここで、前記シミュレーテッドアニーリングパラメーターの設定は、アニーリング初期温度、アニーリング終了温度およびアニーリング温度減衰係数ΔＴを含み、
前記最適化制約パラメーターは、
（１）好ましくは３～６の正の整数である、核酸一本鎖の数ｎと、
（２）好ましくは１２～１６塩基である、対合配列長さＬと、
（３）対合領域の解離温度閾値Ｔｍと、
（４）特異的対合領域配列の自由エネルギー閾値ΔＧＳ°と、
（５）非特異的対合の自由エネルギー閾値ΔＧＮＳ°と、
（６）好ましくはＡ、ＡＡおよびＡＡＡである、コネクタＸ２と、
（７）二次構造（ヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ））解離温度閾値Ｔｍ－Ｈと、
（８）好ましくは、ＰＣＧの範囲は、［０．４、０．６）である、対合配列内のＣＧ比ＰＣＧとを含み、
（Ｍ２）以下のサブ段階を実行することにより、最適化された一本鎖核酸配列またはそのセットを取得するように構成される、最適化操作モジュールと、
（ｚ１）初期セットＳの目的関数値Ｅ０を計算し、即ち、配列間と配列自体との非特異的対合の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）の合計を計算し、同時に非特異的対合の自由エネルギー行列Ｃｎ×ｎを得、その上三角行列中の最小値に対応するＳｉおよびＳｊ（１≦ｉ≦ｎ、１≦ｊ≦ｎ）を検索し、ＳｉおよびＳｊ非特異的対合の自由エネルギーΔＧＮＳ°（Ｓｉ，Ｓｊ）に従って、ＳｉまたはＳｊをランダムに選択して更新操作を実行して、新しい核酸配列を得、更新された配列セットＳ’を得、
（ｚ２）前段階に記載のセットＳ’中の配列が設定した最適化制約パラメーター条件を満たすかどうかを判断し、特異的対合領域解離温度Ｔｍ、特異的対合領域配列の自由エネルギーΔＧＳ°、二次構造の解離温度Ｔｍ－ＨおよびＣＧ比ＰＣＧを含むパラメーターを検証し、上記パラメーターが制約条件を満たすと、段階（ｚ３）を実行し、そうでない場合、段階（ｚ２）を繰り返し実行し、特定のアニーリング温度下で、段階を１５回連続して実行しても条件を満たすＳ’が得られないと、無限循環を防止するために、セットＳをセットＳ’とし、次の段階を実行し、
（ｚ３）前段階に記載のセットＳ’の目的関数値Ｅ１を計算し、Ｅ０とＥ１とを比較し、Ｅ１≧Ｅ０の場合、非特異的対合の自由エネルギーが最適化されていることを示し、配列セットＳ’は、配列セットＳになり、Ｅ１＜Ｅ０の場合、非特異的対合の自由エネルギーが最適化されていないことを示し、この場合Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓ基準に従って、Ｓ’をＳにセットするかどうかを判断する必要があり、ならびに
（ｚ４）アニーリング温度を、設定した減衰係数ΔＴに従って減衰させ、前段階に記載のＳについて段階（ｚ１）、（ｚ２）および（ｚ３）を繰り返し実行し、即ち、モンテカルロのシミュレーテッドアニーリングに基づいて、アニーリング温度がアニーリング終了温度に達するまで、前段階に記載の
【数6】
（Ｍ３）最適化された一本鎖核酸配列またはそのセットを出力するために使用される、出力モジュールとを含む。
【0042】
別の好ましい例において、前記最適化制約パラメーターは、四量体（ｎ＝４）の場合、対称配列を使用し、上記パラメーターに従って、配列セット
を初期化することをさらに含む。
【数7】
【発明の効果】
【0043】
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【0044】
【図1】多量体の模式図を示す。
【図2】当該特許に言及されるシミュレーテッドアニーリングのフローチャートを示す。
【図3】三量体の配列特異的な対の模式図を示す。
【図4】三量体の最適化配列核酸骨格集合のランニング図を示す。
【図5】四量体の最適化後の配列特異的な対の模式図を示す。
【図6】四量体の最適化配列間の非特異的対合領域の自由エネルギーの合計の統計図を示す。
【図7】四量体の最適化配列核酸骨格集合のランニング図を示す。
【図8】四量体から五量体への変換の模式図を示す。
【図9】五量体変換スキーム１の最適化後の配列不対合領域の自由エネルギーの合計の統計図を示す。
【図10】五量体変換スキーム１の最適化後の配列核酸骨格集合のランニング模式図を示す。
【図11】五量体スキーム２の最適化後の配列特異的な対の模式図を示す。
【図12】五量体変換スキーム２の最適化後の配列不対合領域の自由エネルギーの合計の統計図を示す。
【図13】五量体変換スキーム２の最適化後の配列核酸骨格集合のランニング模式図を示す。
【図14】Ｇ－ＣＳＦとＬ－ＤＮＡとのカップリングを示す。
【図15】（Ｌ－ＤＮＡ）－Ｇ－ＣＳＦコンジュゲートの精製効果図を示す。
【図16】一価、二価および三価のＧ－ＣＳＦ複合体集合の効果図を示す。
【図17】Ｇ－ＣＳＦインビトロ活性に対するＬ－ＤＮＡ四量体フレームワークの影響を示す。
【図18】Ｌ－ＤＮＡ四量体集合の二価および三価のＧ－ＣＳＦのインビトロ活性評価を示す。
【図19】ａ．ＨｉＴｒａｐ Ｃａｐｔｏ ＭＭＣを使用したＳＭ（ＰＥＧ）２－ＰＭＯ１の精製、ｂ．ＳＭ（ＰＥＧ）２－ＰＭＯ１と抗ＨＳＡナノボディとのカップリング効率の電気泳動ゲル図を示す。
【図20】陽イオンモードの液体クロマトグラフィー質量分析によるＰＭＯ１（ａ）、ＳＭ（ＰＥＧ）２－ＰＭＯ１（ｂ）、抗ＨＳＡ Ｎｂ（ｃ）、抗ＨＳＡ Ｎｂ－ＰＭＯ１（ｄ）の同定を示す。
【図21】スーパーデックスＴＭ ７５増加 １０／３００ ＧＬを使用したナノボディとＰＭＯ－ナノボディコンジュゲートとの分離を示す。
【図22】ＮＡＰＰＡ－ＰＭＯ集合サンプルの電気泳動ゲル図および模式図を示す。左：ｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１，２，３）、右：ｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）。
【図23】抗ＨＳＡ Ｎｂ、抗ＨＳＡ Ｎｂ－ＰＭＯ１およびｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）とヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）タンパク質との結合活性のＥＬＩＳＡ検出を示す。
【図24】ｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）のヌクレアーゼ分解耐性実験を示す。左：三つのヌクレアーゼで処理したｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動ゲル図、右：三つのヌクレアーゼで処理したＤＤＮＡ－ＮＡＰＰＡ４のアガロースゲルの電気泳動ゲル図を示す。
【発明を実施するための形態】
【0045】
本発明者らは、広範囲かつ詳細な研究の結果、多価タンパク質薬物およびそのライブラリー、ならびにその調製方法および適用を初めて開発した。本発明の薬物ライブラリー、調製方法を使用すると、必要に応じて、短時間作用型タンパク質薬物を、迅速、効率的、低コスト、高収率で多価複合体に形成して薬物半減期を向上させるか、または単量体抗原を高価抗原に形成してその免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を向上させることができる。これに基づいて、本発明を完成させた。
【0046】
具体的には、本発明は、ｎタンパク質薬物ユニットを含む多価タンパク質薬物を提供し、ここで、各薬物ユニットは、同一種の薬物要素部分および前記薬物要素部分と結合された異なる核酸要素部分を含み、ｎは、≧２の正の整数であり、ｎ個の異なる核酸要素部分は、核酸塩基相補性によりｎ量体を形成し、それによって前記多価タンパク質薬物を構成し、本発明の多価タンパク質薬物は、迅速な集合（例えば、１分間）によって安定な相補的核酸塩基対合構造を形成する（複雑なペプチド結合またはほかの化学修飾等ではない）。実験によると、本発明の薬物は、高価化によって分子量を増加させることにより、動物のインビボでの半減期を延長できることを示す。
【0047】
また、同じ実施形態に基づいて、前記薬物要素は、ワクチンの研究開発で使用される抗原でもあり得、違いは、各抗原ユニットが、同じまたは異なる抗原要素部分、および前記抗原要素部分と結合した異なる核酸要素部分を含むことであり、ｎ個の異なる核酸要素部分は、核酸塩基相補性によりｎ量体を形成し、それによって前記多価抗原を構成する。
最後に、本発明は、上記に記載の薬物または抗原ユニットを多価高分子複合体に迅速かつ正確に自己集合させるために使用される効率的、正確に２～５量体に集合した核酸配列群を含む、高度に最適化された核酸配列ライブラリーを提供する。
最後に、本発明は、上記に記載の薬物または抗原ユニットを多価高分子複合体に迅速かつ正確に自己集合させるために使用される効率的、正確に２～５量体に集合した核酸配列群を含む、高度に最適化された核酸配列ライブラリーを提供する。
【0048】
用語
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書に使用されるように、具体的に記載された値に関連して使用される場合、「約」という用語は、当該値が記載された値から１％以下しか変化しない可能性があることを指す。例えば、本明細書に使用されるように、「約１００」という表現は、９９から１０１までの間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４等）を含む。
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書に使用されるように、具体的に記載された値に関連して使用される場合、「約」という用語は、当該値が記載された値から１％以下しか変化しない可能性があることを指す。例えば、本明細書に使用されるように、「約１００」という表現は、９９から１０１までの間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４等）を含む。
【0049】
薬物Ｄ
本発明において、前記薬物要素部分は、タンパク質薬物、ポリペプチド薬物である。
典型的には、前記タンパク質薬物は、サイトカイン、ホルモン（例えば、インスリン、成長ホルモン等）、抗体薬物、ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
本発明の好ましい実施例において、前記タンパク質薬物は、白血球減少症を治療するためのＧ－ＣＳＦである。
本発明において、前記薬物要素部分は、タンパク質薬物、ポリペプチド薬物である。
典型的には、前記タンパク質薬物は、サイトカイン、ホルモン（例えば、インスリン、成長ホルモン等）、抗体薬物、ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
本発明の好ましい実施例において、前記タンパク質薬物は、白血球減少症を治療するためのＧ－ＣＳＦである。
【0050】
抗原ライブラリーＡ
本発明は、抗原ライブラリーを提供し、前記抗原ライブラリーは、Ｎ抗原ユニットを含み、
ここで、前記抗原ユニットは、抗原要素部分、および前記抗原要素部分と結合した核酸要素部分を含み、異なる核酸要素部分は、核酸塩基相補性によりｎ量体を形成し、それによって多価抗原を構成し、
ここで、前記抗原要素部分は、タンパク質抗原、ポリペプチド抗原であり、
典型的には、前記タンパク質抗原、ポリペプチド抗原は、ウイルス，細菌タンパク質、その構造領域、および断片を含むが、これらに限定されない。
本発明は、抗原ライブラリーを提供し、前記抗原ライブラリーは、Ｎ抗原ユニットを含み、
ここで、前記抗原ユニットは、抗原要素部分、および前記抗原要素部分と結合した核酸要素部分を含み、異なる核酸要素部分は、核酸塩基相補性によりｎ量体を形成し、それによって多価抗原を構成し、
ここで、前記抗原要素部分は、タンパク質抗原、ポリペプチド抗原であり、
典型的には、前記タンパク質抗原、ポリペプチド抗原は、ウイルス，細菌タンパク質、その構造領域、および断片を含むが、これらに限定されない。
【0051】
本発明において、前記抗原要素部分は、ライブラリーＭ個の異なる抗原タンパク質から選択され、Ｍ≦Ｎであり、Ｍ個の異なる抗原タンパク質は、特定のウイルスの異なるタンパク質または異なるウイルス株の同じタンパク質の突然変異体を含む。
本発明の好ましい実施例において、前記タンパク質抗原は、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来であり、具体的には、ウイルススパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）によって形成される高価抗原である。
本発明の好ましい実施例において、前記タンパク質抗原は、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来であり、具体的には、ウイルススパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）によって形成される高価抗原である。
【0052】
左旋性核酸
左旋性核酸とは、自然界に存在する右旋性核酸（Ｄ－核酸）に対して、鏡像のような存在を指し、左旋性ＤＮＡ（Ｌ－ＤＮＡ）および左旋性ＲＮＡ（Ｌ－ＲＮＡ）に分けられる。左旋性（キラル中心）は、主に核酸のデオキシリボースまたはリボース部分に存在し、鏡像反転している。従って、左旋性核酸は、血漿中に遍在するヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ）によって分解されない。
左旋性核酸とは、自然界に存在する右旋性核酸（Ｄ－核酸）に対して、鏡像のような存在を指し、左旋性ＤＮＡ（Ｌ－ＤＮＡ）および左旋性ＲＮＡ（Ｌ－ＲＮＡ）に分けられる。左旋性（キラル中心）は、主に核酸のデオキシリボースまたはリボース部分に存在し、鏡像反転している。従って、左旋性核酸は、血漿中に遍在するヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ）によって分解されない。
【0053】
調製方法
１．Ｌ－核酸鎖フレームワークの設計および調製
本発明によれば、Ｌ－核酸鎖フレームワークは、２本およびそれ以上のＬ－核酸一本鎖の塩基対合によって形成される。各Ｌ－核酸一本鎖の５’または３’末端は、すべてその後の修飾のための基（例えば、ＮＨ２等）に活性化成され、次いでリンカー（例えば、ＳＭＣＣ、ＳＢＡＰ等）の一末端がＬ－核酸一本鎖上の活性化基にカップリングされる。リンカーを有するＬ－核酸は、所望のＬ－核酸鎖フレームワークに集合させることができる。別の好ましい例において、Ｌ－核酸一本鎖の５’または３’末端の活性化官能基（例えば、アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅ）、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）等）は、核酸合成にすでに含まれている。リンカーを有するＬ－核酸が成功的にフレームワークに自己集合できることが確認された後、リンカーを有するＬ－核酸一本鎖をそれぞれ抗体にカップリングさせて、その後の集合を行うことができる。本発明のＬ－核酸フレームワークは、基本的に次のような段階によって調製されることができる。
１．Ｌ－核酸鎖フレームワークの設計および調製
本発明によれば、Ｌ－核酸鎖フレームワークは、２本およびそれ以上のＬ－核酸一本鎖の塩基対合によって形成される。各Ｌ－核酸一本鎖の５’または３’末端は、すべてその後の修飾のための基（例えば、ＮＨ２等）に活性化成され、次いでリンカー（例えば、ＳＭＣＣ、ＳＢＡＰ等）の一末端がＬ－核酸一本鎖上の活性化基にカップリングされる。リンカーを有するＬ－核酸は、所望のＬ－核酸鎖フレームワークに集合させることができる。別の好ましい例において、Ｌ－核酸一本鎖の５’または３’末端の活性化官能基（例えば、アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅ）、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）等）は、核酸合成にすでに含まれている。リンカーを有するＬ－核酸が成功的にフレームワークに自己集合できることが確認された後、リンカーを有するＬ－核酸一本鎖をそれぞれ抗体にカップリングさせて、その後の集合を行うことができる。本発明のＬ－核酸フレームワークは、基本的に次のような段階によって調製されることができる。
【0054】
１．１．迅速に自己集合可能なＬ－核酸一本鎖の設計
必要な多価数ｎ（例えば、三量体、四量体）を決定し、多価数ｎに応じて必要なＬ－核酸一本鎖数ｎを決定し、対応する数のＬ－核酸一本鎖配列を設計し、塩基対合を最適化することで標的核酸フレームワークの安定性を調節し、核酸鎖間の非特異的な対の可能性を減少する。核酸配列設計の詳細については、発明の概要および実施例に具体的に記載する。
必要な多価数ｎ（例えば、三量体、四量体）を決定し、多価数ｎに応じて必要なＬ－核酸一本鎖数ｎを決定し、対応する数のＬ－核酸一本鎖配列を設計し、塩基対合を最適化することで標的核酸フレームワークの安定性を調節し、核酸鎖間の非特異的な対の可能性を減少する。核酸配列設計の詳細については、発明の概要および実施例に具体的に記載する。
【0055】
１．２．Ｌ－ＤＮＡまたはＬ－ＲＮＡの活性化
Ｌ－核酸の活性化は、その５’末端（Ｘ１）または３’末端（Ｘ３）の活性基の修飾、およびその後のリンカーカップリングを含む。活性基の修飾は、核酸合成会社によってカスタマイズでき、リンカーは、一般に二機能性基を有し、即ち、一方の末端は、核酸の活性基にカップリングでき、もう一方の末端は、タンパク質上の特異的部位（例えば、ＮＨ３，ＳＨ）に結合できる。
Ｌ－核酸の活性化は、その５’末端（Ｘ１）または３’末端（Ｘ３）の活性基の修飾、およびその後のリンカーカップリングを含む。活性基の修飾は、核酸合成会社によってカスタマイズでき、リンカーは、一般に二機能性基を有し、即ち、一方の末端は、核酸の活性基にカップリングでき、もう一方の末端は、タンパク質上の特異的部位（例えば、ＮＨ３，ＳＨ）に結合できる。
【0056】
本発明の好ましい実施形態によれば、フレームワークを構成するすべてのＬ－核酸は、５’末端でアルデヒド修飾を添加し、Ｌ－核酸の活性化を完了し、その後タンパク質のＮ末端α－アミン（ａｍｉｎｅ）にカップリングすることができる。
【0057】
２．タンパク質－Ｌ－核酸複合体の調製方法
まず、Ｌ－核酸の５’末端または３’末端をアルデヒドで修飾し、次いで低ｐＨ（５－６）条件下で、還元的アミノ化反応（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ａｍｉｎａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通じて、Ｌ－核酸のアルデヒド基をタンパク質のＮ末端ＮＨ３に特異的に結合する。
まず、Ｌ－核酸の５’末端または３’末端をアルデヒドで修飾し、次いで低ｐＨ（５－６）条件下で、還元的アミノ化反応（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ａｍｉｎａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通じて、Ｌ－核酸のアルデヒド基をタンパク質のＮ末端ＮＨ３に特異的に結合する。
【0058】
アルゴリズムおよびアルゴリズムによって最適化された核酸配列
本発明は、相補的な核酸骨格ベースの多量体複合体を形成するための一本鎖核酸配列を決定する方法および装置をさらに提供する。好ましくは、前記方法は、本発明の好ましいアルゴリズムを含む。
本発明は、相補的な核酸骨格ベースの多量体複合体を形成するための一本鎖核酸配列を決定する方法および装置をさらに提供する。好ましくは、前記方法は、本発明の好ましいアルゴリズムを含む。
【0059】
典型的には、本発明のコンピューターアルゴリズムによって最適化された核酸配列ライブラリーは、（ａ）塩基相補的対合の自己集合によって三量体を形成できる核酸配列、（ｂ）塩基相補的対合の自己集合によって四量体を形成できる核酸配列、ならびに（ｃ）塩基相補的対合の自己集合によって五量体を形成できる核酸配列を含むことができる。
代表的な核酸配列によって形成される代表的な複合体は、例えば、図１に示される三量体、四量体、五量体分子である。
代表的な核酸配列によって形成される代表的な複合体は、例えば、図１に示される三量体、四量体、五量体分子である。
【0060】
好ましくは、本発明的に記載の核酸配列Ｗは、式１に示される構造を有し、
Ｗ＝Ｘ１-Ｒ１-Ｘ２-Ｒ２-Ｘ３（１）
ここで、
Ｒ１は、塩基相補的対合領域１であり、
Ｒ２は、塩基相補的対合領域２であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立して、なしまたは冗長核酸であり、
Ｒ１およびＲ２の長さは、１４～１６塩基であり、
Ｘ１およびＸ３の長さは、０～５塩基であり、
Ｘ２の長さは、０～３塩基であり、配列は、Ａ、ＡＡ、ＡＧＡまたはＡＡＡであり、
ここで、核酸配列のＲ１は、異なる核酸配列のＲ２と標的対合を形成し、核酸配列のＲ２は、別の核酸配列のＲ１と標的対合を形成する。
本発明において、前記核酸配列の任意の領域の自己集合は、非標的対合に属し、これは、設計において回避する必要がある。
Ｗ＝Ｘ１-Ｒ１-Ｘ２-Ｒ２-Ｘ３（１）
ここで、
Ｒ１は、塩基相補的対合領域１であり、
Ｒ２は、塩基相補的対合領域２であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立して、なしまたは冗長核酸であり、
Ｒ１およびＲ２の長さは、１４～１６塩基であり、
Ｘ１およびＸ３の長さは、０～５塩基であり、
Ｘ２の長さは、０～３塩基であり、配列は、Ａ、ＡＡ、ＡＧＡまたはＡＡＡであり、
ここで、核酸配列のＲ１は、異なる核酸配列のＲ２と標的対合を形成し、核酸配列のＲ２は、別の核酸配列のＲ１と標的対合を形成する。
本発明において、前記核酸配列の任意の領域の自己集合は、非標的対合に属し、これは、設計において回避する必要がある。
【0061】
好ましくは、本発明に記載の核酸配列は、シミュレーテッドアニーリング（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ａｎｎｅａｌｉｎｇ、ＳＡ）のコンピューターアルゴリズムによって設計または最適化されることができる。
【0062】
前記コンピューターアルゴリズムは、標的対合によって形成されるＤＮＡ二本鎖構造の自由エネルギー（ｆｒｅｅ ｅｎｅｒｇｙ、ΔＧ°）を最小化し、同時に、非標的対合のΔＧ°を最大化し、
具体的には、ＤＮＡ二本鎖構造の安定性は、配列中の各最近傍の塩基対に依存し、任意のワトソンクリックＤＮＡ二本鎖構造には、１０個の異なる最近傍相互作用が存在する可能性があり、これらのペアの相互作用は、ＡＡ／ＴＴ；ＡＴ／ＴＡ；ＴＡ／ＡＴ；ＣＡ／ＧＴ；ＧＴ／ＣＡ；ＣＴ／ＧＡ；ＧＡ／ＣＴ；ＣＧ／ＧＣ；ＧＣ／ＣＧ；ＧＧ／ＣＣである。
具体的には、ＤＮＡ二本鎖構造の安定性は、配列中の各最近傍の塩基対に依存し、任意のワトソンクリックＤＮＡ二本鎖構造には、１０個の異なる最近傍相互作用が存在する可能性があり、これらのペアの相互作用は、ＡＡ／ＴＴ；ＡＴ／ＴＡ；ＴＡ／ＡＴ；ＣＡ／ＧＴ；ＧＴ／ＣＡ；ＣＴ／ＧＡ；ＧＡ／ＣＴ；ＣＧ／ＧＣ；ＧＣ／ＣＧ；ＧＧ／ＣＣである。
【0063】
より具体的には、上記に記載の１０個の塩基対のΔＧ°値は、任意の温度化で、エンタルピー（ｅｎｔｈａｌｐｙ、ΔＨ°）およびエントロピー（ｅｎｔｒｏｐｙ、ΔＳ°）によって計算されることができ、表１は、１０配列のエンタルピー、エントロピーおよび自由エネルギーデータを統計した。
注：ΔＨ°、ΔＳ°およびΔＧ１°は、すべて１Ｍ ＮａＣｌ、２５℃、ｐＨ７の条件下で測定される。ΔＧ２°は、ＩＤＴサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｇ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｃａｌｃ／ａｎａｌｙｚｅｒ）から測定される。
【表4】
【0064】
表１の熱力学値を使用し、ＤＮＡオリゴマーのエンタルピー値ΔＨ°および自由エネルギー値ΔＧ°は、すべて最近傍法によって効果的に予測されることができる。ＧＧＡＡＴＴＣＣ／ＣＣＴＴＡＡＧＧの相補的対合を例として、最近傍法によってΔＧ°＝－１４．６３ｋｃａｌ／ｍｏｌが計算される。
【0065】
前記シミュレーテッドアニーリングは、ΔＧＮＳ°値を最適化することに加えて、核酸配列対の解離温度（Ｔｍ）の制約を実施して、Ｒ１およびＲ２領域のＴｍ＞５０℃（Ｌ＝１４塩基の場合）を確保する。
【0066】
最近傍モデルは、熱力学計算に基づいて、ＤＮＡ二本鎖の安定性を正確に予測し、所定の塩基配列に対する当該モデルの予測は、最近傍の塩基対に基づく。その融解温度の計算は、エンタルピー（ｅｎｔｈａｌｐｙ、ΔＨ°）およびエントロピー（ｅｎｔｒｏｐｙ、ΔＳ°）に関し、その計算方法は、次のとおりであり、
ここで、Ｒは、定数（１．９８７ｃａｌ Ｋ－１ｍｏｌ－１）であり、ＣＴは、０．１μＭとして与えられる鎖濃度であり、ΔＳ°[Na＋]は、所定のナトリウムイオン濃度下でのＤＮＡ二本鎖のエントロピー値であり、ΔＨ°は、所定の条件下でのエンタルピー値である。
【数8】
【0067】
シミュレーテッドアニーリングは、一般的な確率的アルゴリズムであり、それは、モンテカルロの考え方に基づいて設計された最適化問題を近似的に解く手法であり、一定期間内に広い探索空間における近似的な最適解を見つけることを目的とする。シミュレーテッドアニーリングのアイデアは、物理学における固体物質のアニーリングプロセスに由来し：まず固体を十分に加熱してからゆっくりと冷却し、加熱する場合、固体内部の粒子が自由に動き回る内部エネルギーが増大し、その後温度が徐々に低下すると、粒子は整然とし、各温度で平衡状態に達する傾向があり、凝縮点付近の温度低下速度が十分に遅い場合、基底状態に達し、内部エネルギーが最小限に抑えられる。Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓ基準によれば、粒子が温度Ｔの場合に平衡をとる傾向がある確率は、ｅｘｐ(-ΔE／(KT))であり、ここで、Ｅは、温度Ｔの場合の内部エネルギーであり、ΔＥは、その変化量であり、Ｋは、ボルツマン（Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ）定数である。組み合わせ最適化問題にも同様のプロセスがあり、固体微小状態ｉを解Ｘとしてシミュレートされ、目的関数は、状態ｉの場合の内部エネルギーに相当し、制御パラメーターＴで固体温度をシミュレートする。Ｔの値ごとに、「新しい解の生成→目的関数の差の計算→受け入れるかどうかの判断→受け入れる／破棄」という反復プロセスを繰り返し、Ｔ値を徐々に減衰させ、反復プロセスにおいて、Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓ基準に従って、より不適切な解が限界的に受け入れられ、より不適切な解の確率は、徐々に０に近づく傾向があるため、アルゴリズムは、終了時に可能な限り全体的な最適解を見つけることができる。
【0068】
本発明において、多量体核酸の一本鎖間の非標的対合領域の自由エネルギーを内部エネルギーとしてシミュレートし、核酸一本鎖間の標的対合領域の自由エネルギーと解離温度とを確保する状況下で、シミュレーテッドアニーリングの反復により、非標的対合領域の自由エネルギーを最適化し、最後に最適化された一本鎖は、多量体の集合に有利する。使用される最適化目的関数は、次のとおりである。
【数9】
【0069】
ΔＧ°（Ｓｉ，Ｓｊ）は、配列Ｓｉと配列Ｓｊとの非標的対合の自由エネルギーであり、
は、すべての配列間の非標的対合の自由エネルギーの合計であり、その地は、負であり、この値が大きいほど非標的対合の現象に有利する。従って、アニーリングアルゴリズムによるエネルギー最小化を解くという考え方に基づいて目的関数を構築し、ΔＧ°（Ｓｉ，Ｓｊ）の前に負の符号をつけて、それを正の数に変換し、この場合
の値が小さいほど非標的対合の減少に有利する。
【数10】
【数11】
【0070】
代表的な本発明のアルゴリズムのフローチャートは、図２に示されたとおりである。
本発明において、シミュレーテッドアニーリングにランダムな要素を導入し、毎回の反復更新のプロセスでは、現在よりも悪い解が一定の確率で受け入れられるため、局所的な最適解を飛び出して全般的な最適解に達することが可能である。
本発明において、シミュレーテッドアニーリングにランダムな要素を導入し、毎回の反復更新のプロセスでは、現在よりも悪い解が一定の確率で受け入れられるため、局所的な最適解を飛び出して全般的な最適解に達することが可能である。
【0071】
多価高分子複合体
本発明は、上記アルゴリズムで設計した核酸多量体を用いてタンパク質薬物を媒介して形成された多価高分子複合体をさらに提供し、前記複合体は、向上させた薬物の半減期および活性を有する。
本発明は、上記アルゴリズムで設計した核酸多量体を用いてタンパク質薬物を媒介して形成された多価高分子複合体をさらに提供し、前記複合体は、向上させた薬物の半減期および活性を有する。
【0072】
好ましくは、前記核酸配列は、核酸配列ライブラリーにおいてｎ量体に特異的に集合させた核酸配列群である。
好ましくは、本発明において、前記タンパク質薬物は、半減期または活性を向上させるための多価である必要があるタンパク質薬物である。
好ましくは、本発明において、前記タンパク質薬物は、半減期または活性を向上させるための多価である必要があるタンパク質薬物である。
【0073】
典型的には、前記核酸配列群の各核酸鎖は、それぞれ前記タンパク質薬物に結合して、式２に示される構造を有するタンパク質薬物－核酸鎖ユニットを形成し、
Ｄ-［Ｌ-Ｗｉ］、ｉ＝１～ｎ（２）
ここで、
Ｄは、タンパク質薬物要素部分であり、
各Ｗｉは、独立して、核酸配列であり、前記核酸配列は、左旋性核酸、ペプチド核酸、ロック核酸、硫黄修飾核酸、２’－フルオロ修飾核酸、５－ヒドロキシメチルシトシン核酸、またはその組み合わせからなる群から選択され、前記核酸配列は、上記に記載のｎ量体を形成できる核酸配列群から選択される式１に示される構造を有し、
Ｌは、リンカーであり、前記リンカー部分は、Ｗｉの合成または調製にすでに含まれており、ＷｉのＸ１またはＸ３に結合し（式１を参照する）、
「-」は、共有結合である。
Ｄ-［Ｌ-Ｗｉ］、ｉ＝１～ｎ（２）
ここで、
Ｄは、タンパク質薬物要素部分であり、
各Ｗｉは、独立して、核酸配列であり、前記核酸配列は、左旋性核酸、ペプチド核酸、ロック核酸、硫黄修飾核酸、２’－フルオロ修飾核酸、５－ヒドロキシメチルシトシン核酸、またはその組み合わせからなる群から選択され、前記核酸配列は、上記に記載のｎ量体を形成できる核酸配列群から選択される式１に示される構造を有し、
Ｌは、リンカーであり、前記リンカー部分は、Ｗｉの合成または調製にすでに含まれており、ＷｉのＸ１またはＸ３に結合し（式１を参照する）、
「-」は、共有結合である。
【0074】
別の好ましい例において、前記薬物要素部分は、分子量を増加させて半減期を向上させる必要があるタンパク質薬物およびポリペプチド薬物、ならびに多価を形成して活性を向上させる必要があるタンパク質薬物およびポリペプチド薬物からなる群から選択される。
【0075】
別の好ましい例において、Ｌは、Ｄ上のＮ末端のα－アミン（α－ａｍｉｎｅ）またはリジン（ｌｙｓｉｎｅ）e－アミンを結合するために使用される、Ｄ末端付近にアルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅ）、ＮＨＳエステル（ｅｓｔｅｒ）または同様の官能基を有する。
【0076】
別の好ましい例において、Ｌは、Ｄ上の遊離チオール（ｆｒｅｅ ｔｈｉｏｌ）（－ＳＨ）官能基を結合するために使用される、Ｄ末端付近にマレイミド官能基またはハロアセチル（ｈａｌｏａｃｅｔｙｌ）（例えば、ブロモアセチル（ｂｒｏｍｏａｃｅｔｙｌ）、ヨードアセチル（ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）等）の官能基を有する。
【0077】
別の好ましい例において、Ｄは、天然タンパク質、組換えタンパク質、化学修飾タンパク質、合成ポリペプチドからなる群から選択される。
別の好ましい例において、Ｄは、結合式１のＬ-Ｗｉを結合するために、部位特異的修飾またはアミノ酸の部位特異的付加を有することができる。
別の好ましい例において、Ｄは、結合式１のＬ-Ｗｉを結合するために、部位特異的修飾またはアミノ酸の部位特異的付加を有することができる。
【0078】
前記タンパク質薬物は、ｎ量体に集合できるそれぞれ異なるＬ-Ｗｉに結合して、タンパク質薬物の自己集合ユニットであるＤ-［Ｌ-Ｗ１］、Ｄ-［Ｌ-Ｗ２］、…、Ｄ-［Ｌ-Ｗｎ］を形成し、
タンパク質薬物の自己集合ユニットであるＤ-［Ｌ-Ｗ１］、Ｄ-［Ｌ-Ｗ２］、…、Ｄ-［Ｌ-Ｗｎ］は、溶液中で等モル混合することにより、タンパク質薬物の多価分子複合体に集合される。
タンパク質薬物の自己集合ユニットであるＤ-［Ｌ-Ｗ１］、Ｄ-［Ｌ-Ｗ２］、…、Ｄ-［Ｌ-Ｗｎ］は、溶液中で等モル混合することにより、タンパク質薬物の多価分子複合体に集合される。
【0079】
本発明は、上記アルゴリズムによって設計された核酸多量体を用いて一つまたは複数の種の抗原を媒介して多価高分子複合体を形成して、インビボで中和抗体を修道する際のワクチンの効果を向上させ、
ここで、前記核酸配列は、核酸配列ライブラリーにおいてｎ量体に特異的に集合させる核酸配列群であり、
ここで、前記抗原は、抗原または抗原ライブラリーであり、前記抗原ライブラリーは、Ｍ種の異なる抗原タンパク質を含み、１≦Ｍ≦ｎである。
ここで、前記核酸配列は、核酸配列ライブラリーにおいてｎ量体に特異的に集合させる核酸配列群であり、
ここで、前記抗原は、抗原または抗原ライブラリーであり、前記抗原ライブラリーは、Ｍ種の異なる抗原タンパク質を含み、１≦Ｍ≦ｎである。
【0080】
前記核酸配列群の各核酸鎖は、それぞれ前記抗原ライブラリー内の抗原に結合して、式３に示される構造を有する抗原-核酸鎖ユニットを形成し、
Ａｋ-［Ｌ-Ｗｉ］、ｉ＝１－ｎ、ｋ＝１－Ｍ（３）
ここで、
Ａｋは、前記抗原ライブラリーの抗原ｋであり、一つのＡｋは、それぞれ一つまたは複数の種のＬ-Ｗｉ（例えば、：Ａ１-［Ｌ-Ｗ１］、Ａ１-［Ｌ-Ｗ２］、Ａ２-［Ｌ-Ｗ３］、Ａ３-［Ｌ-Ｗ４］）に対応し、
式３の他の態様は、上記の式３と同じであり、
前記抗原タンパク質は、ｎ量体に集合できる異なるＬ-Ｗｉにそれぞれ結合して、Ａ１-［Ｌ-Ｗ１］、Ａ２-［Ｌ-Ｗ２］、…、Ａ３-［Ｌ-Ｗｎ］等の抗原自己集合ユニットを形成する。
抗原自己集合ユニットは、溶液中で等モル混合することにより、多価抗原複合体に集合させる。
Ａｋ-［Ｌ-Ｗｉ］、ｉ＝１－ｎ、ｋ＝１－Ｍ（３）
ここで、
Ａｋは、前記抗原ライブラリーの抗原ｋであり、一つのＡｋは、それぞれ一つまたは複数の種のＬ-Ｗｉ（例えば、：Ａ１-［Ｌ-Ｗ１］、Ａ１-［Ｌ-Ｗ２］、Ａ２-［Ｌ-Ｗ３］、Ａ３-［Ｌ-Ｗ４］）に対応し、
式３の他の態様は、上記の式３と同じであり、
前記抗原タンパク質は、ｎ量体に集合できる異なるＬ-Ｗｉにそれぞれ結合して、Ａ１-［Ｌ-Ｗ１］、Ａ２-［Ｌ-Ｗ２］、…、Ａ３-［Ｌ-Ｗｎ］等の抗原自己集合ユニットを形成する。
抗原自己集合ユニットは、溶液中で等モル混合することにより、多価抗原複合体に集合させる。
【0081】
本発明の主な利点は、次のとおりである。
（１）本発明は、融合タンパク質の再構築、または複雑な化学修飾および架橋を必要とせずに、既製の短時間作用型タンパク質薬物のタンパク質薬物の多価化を完了し、その半減期および活性を向上させることができ、Ｌ－核酸のアルデヒド修飾は、タンパク質のＮ末端アミンに特異的に結合して、オリゴマーに自己集合できるタンパク質薬物ユニットを形成することができる。
（２）本発明のタンパク質薬物ユニット（タンパク質－核酸リンカー）は、左旋性核酸鎖の媒介を利用して、タンパク質薬物の多価化を１分間内に完了することができる。
（３）ワクチン開発については、本発明は、単量体タンパク質抗原を高価に形成刑して、その免疫原性を向上させることができる。
（４）ワクチン開発については、本発明は、異なるウイルスまたは細菌毒株的抗原突然変異型およびサブタイプを多重高価抗原に集合して、より広範囲な中和抗体を誘導することもできる。
（１）本発明は、融合タンパク質の再構築、または複雑な化学修飾および架橋を必要とせずに、既製の短時間作用型タンパク質薬物のタンパク質薬物の多価化を完了し、その半減期および活性を向上させることができ、Ｌ－核酸のアルデヒド修飾は、タンパク質のＮ末端アミンに特異的に結合して、オリゴマーに自己集合できるタンパク質薬物ユニットを形成することができる。
（２）本発明のタンパク質薬物ユニット（タンパク質－核酸リンカー）は、左旋性核酸鎖の媒介を利用して、タンパク質薬物の多価化を１分間内に完了することができる。
（３）ワクチン開発については、本発明は、単量体タンパク質抗原を高価に形成刑して、その免疫原性を向上させることができる。
（４）ワクチン開発については、本発明は、異なるウイルスまたは細菌毒株的抗原突然変異型およびサブタイプを多重高価抗原に集合して、より広範囲な中和抗体を誘導することもできる。
【0082】
以下、本発明は、具体的実施例と併せてさらに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、具体的条件を示さない実験方法は、通常、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載される条件等の従来の条件、またはメーカーによって提案された条件に従う。特に明記しない限り、パーセンテージと部数は、重量のパーセンテージおよび重量の部数である。
【0083】
実施例１：三量体核酸骨格集合体の設計、合成および検証
図１（Ａ）の形状に従って三つの対になることができる核酸を設計する。具体的には、Ｒ１核酸一本鎖は、Ｒ６核酸一本鎖と特異的な相補的対合を行うが、他の核酸一本鎖とは対にならず、同様に、Ｒ３、Ｒ５は、それぞれＲ２、Ｒ４と特異的な相補的対合になるが、他の核酸一本鎖とは対にならず、特異的な相補的対合の自由エネルギー（ΔＧＳ°）は、非特異的対合の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）よりもはるかに小さく、特異的な相補的対合の自由エネルギー（ΔＧＳ°）は、－２９ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満であるが、非特異的対合の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）は、すべて－７ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きく、このように、三量体の形態は、反応系で最も安定する。三量体最適化の具体的な実施段階は、模式図２で説明されたとおりであり、そのアニーリングパラメーターは、アニーリング初期温度Ｔｏ＝５０℃、アニーリング終了温度Ｔｆ＝０．１２℃、アニーリング温度減衰係数ΔＴ＝０．９８（アニーリング初期温度は、毎回現在の０．９８まで減衰する）であり、最適化制約パラメーターは、対合配列の長さＬ＝１６塩基、解離温度閾値Ｔｍ＞５４℃、対合配列の自由エネルギー閾値：ΔＧＳ°＜－２９ｋｃａｌ／ｍｏｌ、非特異的対合の自由エネルギー閾値：ΔＧＮＳ°＞－７ｋｃａｌ／ｍｏｌに制約する。最適化の具体的な実施段階は、次のとおりである。
図１（Ａ）の形状に従って三つの対になることができる核酸を設計する。具体的には、Ｒ１核酸一本鎖は、Ｒ６核酸一本鎖と特異的な相補的対合を行うが、他の核酸一本鎖とは対にならず、同様に、Ｒ３、Ｒ５は、それぞれＲ２、Ｒ４と特異的な相補的対合になるが、他の核酸一本鎖とは対にならず、特異的な相補的対合の自由エネルギー（ΔＧＳ°）は、非特異的対合の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）よりもはるかに小さく、特異的な相補的対合の自由エネルギー（ΔＧＳ°）は、－２９ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満であるが、非特異的対合の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）は、すべて－７ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きく、このように、三量体の形態は、反応系で最も安定する。三量体最適化の具体的な実施段階は、模式図２で説明されたとおりであり、そのアニーリングパラメーターは、アニーリング初期温度Ｔｏ＝５０℃、アニーリング終了温度Ｔｆ＝０．１２℃、アニーリング温度減衰係数ΔＴ＝０．９８（アニーリング初期温度は、毎回現在の０．９８まで減衰する）であり、最適化制約パラメーターは、対合配列の長さＬ＝１６塩基、解離温度閾値Ｔｍ＞５４℃、対合配列の自由エネルギー閾値：ΔＧＳ°＜－２９ｋｃａｌ／ｍｏｌ、非特異的対合の自由エネルギー閾値：ΔＧＮＳ°＞－７ｋｃａｌ／ｍｏｌに制約する。最適化の具体的な実施段階は、次のとおりである。
【0084】
配列初期化：パラメーター初期化対合配列
に基づいて、塩基相補的対合に従って、Ｒ６、Ｒ２およびＲ４を得、六つの配列は、図１（Ａ）に示されるようにスプライスされて、最終的に初期化配列セット
を得る。
【数12】
【数13】
【0085】
新しい解の生成：新しい解Ｓ’は、すべて配列セットＳを更新することによって得られる。まず、
を計算し、これは、セットＳの非特異的な対合で標的対合に最も大きな影響を与える二つの配列ＳｉおよびＳｊを見つけるためであり、次いでΔＧ°（Ｓｉ，Ｓｊ）に従って、非標的対合領域は、ＳｉまたはＳｊをランダムに選択して更新して、新しい核酸配列を得、この核酸配列の対合領域の解離温度（Ｔｍ）が５４℃より高いかどうか、同時に対合領域の自由エネルギー（ΔＧＳ°）が－２９ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満であるかどうかを確認し、解離温度および対合領域の自由エネルギー（ΔＧＳ°）の制約要件が満たされないと、更新を繰り返し、解離温度および対合領域の自由エネルギー（ΔＧＳ°）の制約要件が満たされると、塩基相補的対合の原則に従ってＳを更新して、最終的に新しい配列セットＳ’を得る。１５回更新しても、得られた新しい核酸配列が解離温度および対合領域の自由エネルギー（ΔＧＳ°）の制約要件をずっと満たさないと、無限循環を防止するために、を新しい解Ｓ’にセットする。
【数14】
【0086】
最適化判断：式２に従ってセットＳおよびＳ’の目的関数値ＥｉおよびＥｉ＋１をそれぞれ計算し、Ｅｉ＋１－Ｅｉ≧０の場合、更新により非標的対合の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）が最適化されることを意味すると、Ｓ←Ｓ’となり、新しい解Ｓ’は、Ｓになる。Ｅｉ＋１－Ｅｉ＜０の場合、更新により劣化した解が得られたことを意味し、Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓ基準に従って、確率ｐ＝ｅｘｐ（－ΔＥ／Ｔｏ）を計算し、同時にr、rε［０，１）をランダムに生成し、p＞rの場合、この劣化した解を受け入れ、そうでない場合、劣化した解を拒否する。最後にアニーリング初期温度は、現在の０．９８まで減衰し、次の新しい解を生成し、アニーリング終了温度まで減衰するまで、最適化後の配列セットを得る。
【0087】
表２＿１における最適化後の配列は、上記アルゴリズムの最適化によって得られ、各配列の５’末端Ａの目的は、活性基の修飾およびその後のリンカーカップリングである。非標的対合の自由エネルギー（ΔGNS°）行列表および標的対合領域パラメーター指標表において、いくつかの主要なパラメーター値が統計される。三量体最適化後の配列特異的な対模式図については、図３を参照し、対応する核酸骨格ランニング図（図４）から、レーン（Ｌａｎｅ）９は、人工的に設計された三量体であり、そのバンドは、不明瞭で尾を引いていることがわかり、レーン１０は、最適化後の配列S１、S２およびS３によって形成されたメインバンドであり、三量体が形成されており、非常に高い安定性を示していることがわかる。
【0088】
【表5】
【0089】
【表6】
【0090】
【表7】
【0091】
実施例２：四量体の核酸骨格集合体の設計、合成および検証
図１（Ｂ）の形状に従って対合することができる核酸を設計する。ここで、核酸一本鎖Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ７は、それぞれ核酸一本鎖Ｒ８、Ｒ２、Ｒ４およびＲ６と特異的な相補的対合を行うが、他の核酸一本鎖とは対にならず、特異的な相補的対合の自由エネルギー（ΔＧＳ°）は、非特異的対合の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）よりもはるかに小さく、特異的な相補的対合の自由エネルギー（ΔＧＳ°）は、－２７．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満であるが、非特異的対合の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）は、すべて－７ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きく、このように、四量体の形態は、反応系で最も安定する。四量体最適化の具体的な実施段階は、模式図２で説明されたとおりであり、そのアニーリングパラメーターは、アニーリング初期温度Ｔｏ＝５０℃、アニーリング終了温度Ｔｆ＝０．１２℃、アニーリング温度減衰係数ΔＴ＝０．９８（アニーリング初期温度は、毎回現在の０．９８まで減衰する）であり、最適化制約パラメーターは、対合配列の長さＬ＝１４塩基、解離温度閾値Ｔｍ＞５２℃、対合配列の自由エネルギー閾値：ΔＧＳ°＜－２７．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、非特異的対合の自由エネルギー閾値ΔＧＮＳ°＞－７ｋｃａｌ／ｍｏｌに制約する。
図１（Ｂ）の形状に従って対合することができる核酸を設計する。ここで、核酸一本鎖Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ７は、それぞれ核酸一本鎖Ｒ８、Ｒ２、Ｒ４およびＲ６と特異的な相補的対合を行うが、他の核酸一本鎖とは対にならず、特異的な相補的対合の自由エネルギー（ΔＧＳ°）は、非特異的対合の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）よりもはるかに小さく、特異的な相補的対合の自由エネルギー（ΔＧＳ°）は、－２７．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満であるが、非特異的対合の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）は、すべて－７ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きく、このように、四量体の形態は、反応系で最も安定する。四量体最適化の具体的な実施段階は、模式図２で説明されたとおりであり、そのアニーリングパラメーターは、アニーリング初期温度Ｔｏ＝５０℃、アニーリング終了温度Ｔｆ＝０．１２℃、アニーリング温度減衰係数ΔＴ＝０．９８（アニーリング初期温度は、毎回現在の０．９８まで減衰する）であり、最適化制約パラメーターは、対合配列の長さＬ＝１４塩基、解離温度閾値Ｔｍ＞５２℃、対合配列の自由エネルギー閾値：ΔＧＳ°＜－２７．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、非特異的対合の自由エネルギー閾値ΔＧＮＳ°＞－７ｋｃａｌ／ｍｏｌに制約する。
【0092】
最適化の具体的な実施段階は、次のとおりである。
配列初期化：パラメーター初期化対合配列
に基づいて、塩基相補的対合に従って、Ｒ８、Ｒ２、Ｒ４およびＲ６を得、八つの配列は、図１（Ｂ）に示されるようにスプライスされて、最終的に初期化配列セット
を得る。四量体実験中に、固定コア構造は、核酸配列の集合効率を効果的に向上させることができ、核酸配列式１に基づいて、核酸配列Ｗ２を発展させることができ、Ｗ２は、式４の構造を有し、
Ｗ２＝Ｘ１-Ｑ１-Ｃ１-Ｘ２-Ｃ２-Ｑ２-Ｘ３（４）
ここで、Ｃ１およびＣ２は、固定コア構造部分であり、Ｑ１およびＱ２は、固定コア構造以外の配列である。
配列初期化：パラメーター初期化対合配列
【数15】
【数16】
Ｗ２＝Ｘ１-Ｑ１-Ｃ１-Ｘ２-Ｃ２-Ｑ２-Ｘ３（４）
ここで、Ｃ１およびＣ２は、固定コア構造部分であり、Ｑ１およびＱ２は、固定コア構造以外の配列である。
【0093】
【表8】
【0094】
新しい解生成：実施例１の新しい解の生成と同じ。一方、固定コア構造が使用される場合、更新には、固定コア構造部分を含まず、パラメーター制約を厳密に遵守するには、新しい核酸配列の対合領域の解離温度（Ｔｍ）が５２℃より高く、同時に対合領域の自由エネルギー（ΔＧＳ°）が－２７．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である必要がある。
最適化判断：実施例１の最適化判断と同じ。
最適化判断：実施例１の最適化判断と同じ。
【0095】
表４＿１における最適化後の配列は、上記アルゴリズムの最適化によって得られ、その特異的な対の模式図は、図５に示されたとおりであり、四量体の最適化配列は、最適化中の非対標的の自由エネルギーの破線統計図は、６に示されたとおりであり、本発明は、コネクタを追加する場合、コネクタを追加しない最適化配列の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）に大きな影響を与えないことを追求するため、コネクタの追加の有無に関係なく最適化後の配列の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）行列の合計は可能な限り大きくなるため、最適化中には、コネクタを追加しない最適化配列の目的関数値を統計し、コネクタを追加した最適化配列のみを最終検出し、対応する核酸骨格ランニング図（図７）から、レーン１５は、人工的に設計された四量体のバンドであり、尾を引く現象があり、レーン１６は、アルゴリズム最適化後の配列Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４によって形成された約１００ｂｐのメインバンドであり、四量体が形成されたことを示し、非常に高い安定性を示していることがわかる。
【0096】
上記四量体実施段階で主に最適化するのは、配列間の非特異的対合の自由エネルギーであるが、配列自己折り畳みによって形成される二次構造も、四量体の集合に大きな影響を与える。配列自体が形成する二次構造の解離温度が高すぎると、一度このような安定な二次構造が形成されると、そのような状態を崩すことが難しくなり、四量体集合が困難になる。従って、四量体の集合を制御する必要がある四つの配列に対応する二次構造の解離温度は、高すぎてはならない。四量体の場合、四つの核酸配列の二次構造の解離温度を制御する必要があり、対称構造を使用すると（図１におけるＲ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７は、それぞれＲ４、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ２と対称を保持する）、二つの配列間に類似な二次構造が出現し、両者の二次構造の解離温度に大きな差が生じなくなり、この場合二つの核酸配列の二次構造を制御するだけで前述の効果が得られるため、対称は、四量体最適化において二次構造の制御に有利する。
【0097】
【表9】
【0098】
【表10】
【0099】
【表11】
【0100】
実施例３：五量体核酸骨格集合体の設計、合成および検証
四量体の最適化配列は、四量体の中央部分が対合を形成していないことが主な理由として、非常に良好な集合効果を示し、つまり、固定コア構造により、中央領域に複雑な複合体を形成せず、四量体に十分な自由度が与えられる。従って、五量体配列の最適化において四量体配列および固定コア構造を統合するために、実施例２の四量体配列および固定コア構造を使用する二つのスキームを検討および設計する。
四量体の最適化配列は、四量体の中央部分が対合を形成していないことが主な理由として、非常に良好な集合効果を示し、つまり、固定コア構造により、中央領域に複雑な複合体を形成せず、四量体に十分な自由度が与えられる。従って、五量体配列の最適化において四量体配列および固定コア構造を統合するために、実施例２の四量体配列および固定コア構造を使用する二つのスキームを検討および設計する。
【0101】
第１の変換スキーム：図８（Ｂ）の形状に従って五つの対になることができる核酸を設計し、このスキームは、実施例２の四量体の部分配列および完全な固定コア構造を保持し、コア構造が開いていない。元の四量体のＲ１およびＲ８において、コア構造を除いて四量体を開き、長さが１４である二つの核酸配列Ｒ９およびＲ１０を追加する。ここで、核酸一本鎖Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７およびＲ９は、それぞれ核酸一本鎖Ｒ１０、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６およびＲ８と特異的な相補的対合になるが、他の核酸一本鎖とは対にならない。特異的な相補的対合の自由エネルギー（）は、－２７．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満であるが、非特異的対合の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）は、－７ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きく、このように、五量体の形態は、反応系で最も安定する。五量体の第１の変換スキームを最適化するための具体的な実施段階は、模式図２で説明されたとおりであり、そのアニーリングパラメーターは、アニーリング初期温度Ｔｏ＝５０℃、アニーリング終了温度Ｔｆ＝０．１２℃、アニーリング温度減衰係数ΔＴ＝０．９であり（アニーリング初期温度は、毎回現在の０．９に減衰し、四量体部分配列の使用により更新領域が小さくなり、アニーリング温度の減衰が速くなる）、最適化制約パラメーターは、対合配列の長さＬ＝１４塩基、解離温度閾値Ｔｍ＞５２℃、対合配列の自由エネルギー閾値：ΔＧＳ°＜－２７．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、非特異的対合の自由エネルギー閾値ΔＧＮＳ°＞－７ｋｃａｌ／ｍｏｌに制約する。
【0102】
このようなスキームには、完全な四量体固定コア構造が使用され、核酸配列式４に基づいて核酸配列Ｗ５を発展させ、核酸配列式４に基づいて核酸配列Ｗ６を発展させ、Ｗ５は、式７の構造を有し、Ｗ６は、式８の構造を有し、
Ｗ３＝Ｘ１-Ｒ１-Ｘ２-Ｃ１-Ｘ２-Ｃ２-Ｑ１-Ｘ３（５）
Ｗ４＝Ｘ１-Ｑ１-Ｃ１-Ｘ２-Ｃ２-Ｘ２-Ｒ１-Ｘ３（６）
このようなスキームは、式１、式４、式５および式６等の四つの構造の配列を含む。
Ｗ３＝Ｘ１-Ｒ１-Ｘ２-Ｃ１-Ｘ２-Ｃ２-Ｑ１-Ｘ３（５）
Ｗ４＝Ｘ１-Ｑ１-Ｃ１-Ｘ２-Ｃ２-Ｘ２-Ｒ１-Ｘ３（６）
このようなスキームは、式１、式４、式５および式６等の四つの構造の配列を含む。
【0103】
【表12】
【0104】
最適化の具体的な実施段階は、次のとおりである。
パラメーター初期化対合配列
に基づいて、塩基相補的対合に従って、Ｒ８およびＲ１を得、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、実施例２の四量体最適化後の配列の同じ名称の配列に由来する。Ｒ９およびＲ１０をスプライスしてＳ１を得、Ｒ１およびＲ２を式５に従ってスプライスしてＳ２を得、Ｒ３およびＲ４をスプライスしてＳ３を得、Ｒ５およびＲ６をスプライスしてＳ４を得、Ｒ７およびＲ８を式６に従ってスプライスしてＳ５を得、最終的に初期化配列セット
を得る。
パラメーター初期化対合配列
【数17】
【数18】
【0105】
新しい解の生成：Ｒ１、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０から一つの配列をランダムに選択して更新して、新しい核酸配列を得、この核酸配列の解離温度が５２℃より高いかどうか、同時に対合領域の自由エネルギー（ΔＧＳ°）が－２７．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満であるかどうかを確認し、解離温度および対合領域の自由エネルギー（ΔＧＳ°）の制約要件が満たされないと、更新を繰り返し、解離温度および対合領域の自由エネルギー（ΔＧＳ°）の制約要件が満たされると、塩基相補的対合の原則に従ってＳを更新して、最終的に新しい配列セットＳ’を得る。１５回更新しても、得られた新しい核酸配列が解離温度および対合領域の自由エネルギー（ΔＧＳ°）の制約要件をずっと満たさないと、無限循環を防止するために、Ｓを新しい解Ｓ’にセットする。したがって、このようなスキームは、完全な固定コア構造および四量体配列の一部を使用し、新しい解の生成中に固定コア構造および保持された四量体配列部分が変化しないことを確保する必要がある。
【0106】
最適化判断：実施例１の最適化判断と同じ。一方、アニーリング初期温度は、現在の０．９に減衰する。
表６＿１における五量体の第１の変換スキームの最適化後の配列は、このアルゴリズムの最適化によって得られ、図９は、この最適化中の配列間の非標的対合領域の自由エネルギー値の合計の破線統計図であり（Ｓ３とＳ３、Ｓ３とＳ４、Ｓ４とＳ４の間の非標的対合領域の自由エネルギーは、統計に参加しない）、図１０におけるレーン９は、最適化後の配列集合によって形成されるメインバンドであり、五量体を形成したことを示し、非常に高い安定性を示していることがわかる。
表６＿１における五量体の第１の変換スキームの最適化後の配列は、このアルゴリズムの最適化によって得られ、図９は、この最適化中の配列間の非標的対合領域の自由エネルギー値の合計の破線統計図であり（Ｓ３とＳ３、Ｓ３とＳ４、Ｓ４とＳ４の間の非標的対合領域の自由エネルギーは、統計に参加しない）、図１０におけるレーン９は、最適化後の配列集合によって形成されるメインバンドであり、五量体を形成したことを示し、非常に高い安定性を示していることがわかる。
【0107】
【表13】
【0108】
【表14】
【0109】
【表15】
【0110】
第２の変換スキーム：図８（Ｃ）の形状に従って五つの対になることができる核酸を設計し、このスキームは、四量体の固定コア構造配列のみを保持し、五量体に適応するために、コア構造は、Ｒ１およびＲ２で開かれ、他の部分は、ランダムに生成されてから五量体の最適化を行う必要がある。ここで、核酸一本鎖Ｒ１０、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６およびＲ８は、それぞれ核酸一本鎖Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７およびＲ９と特異的な相補的対合を行うが、他の核酸一本鎖とは対合しない。特異的な相補的対合の自由エネルギー（ΔＧＳ°）は、－２７．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満であるが、非特異的対合の自由エネルギー（ΔＧＮＳ°）は、－７．２ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きく、このように、五量体の形態は、反応系で最も安定する。五量体の第２の変換スキームを最適化するための具体的な実施段階は、模式図２で説明されたとおりであり、そのアニーリングパラメーターは、アニーリング初期温度Ｔｏ＝５０℃、アニーリング終了温度Ｔｆ＝０．１２℃、アニーリング温度減衰係数ΔＴ＝０．９８であり（アニーリング初期温度は、毎回現在の０．９８に減衰する）、最適化制約パラメーターは、対合配列の長さＬ＝１４塩基、解離温度閾値Ｔｍ＞５２℃、対合配列の自由エネルギー閾値：ΔＧＳ°＜－２７．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、非特異的対合の自由エネルギー閾値ΔＧＮＳ°＞－７．２ｋｃａｌ／ｍｏｌに制約する。
【0111】
【表16】
【0112】
最適化の具体的な実施段階は、次のとおりである。
配列初期化：最適化制約パラメーターに従って、対合配列Ｒ９およびコア構造を除く長さが９である配列セット
を初期化し、塩基相補的対合の原則に従って、Ｒ８、Ｑ２、Ｑ４、Ｑ６およびＱ８を得、表７に従ってスプライスして、最終的に初期化配列セット
を得る。
配列初期化：最適化制約パラメーターに従って、対合配列Ｒ９およびコア構造を除く長さが９である配列セット
【数19】
【数20】
【0113】
新しい解の生成：実施例１の新しい解の生成と同じ。一方、このスキームは、四量体の固定コア構造を使用し、新しい解の生成中に固定コア構造部分が変化しないことを確保する必要がある。同時に、パラメーター制約を厳密に遵守し、核酸配列の対合領域を更新するための解離温度は、５２℃を超え、同時に対合領域の自由エネルギー（ΔＧＳ°）は、－２７．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である。
最適化判断：実施例１の最適化判断と同じ。
最適化判断：実施例１の最適化判断と同じ。
【0114】
表８＿１における五量体の第２の変換スキームの最適化後の配列は、このアルゴリズムの最適化によって得られ、その特異的な対合の模式図は、図１１に示されたとおりであり、図１２は、この最適化中の配列間の非標的対合領域の自由エネルギー値の合計の破線統計図であり、図１３におけるレーン３５は、配列Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４およびＳ５によって形成されるメインバンドであり、五量体は若干尾を引くが、集合効果は、良好である。
【0115】
【表17】
【0116】
【表18】
【0117】
【表19】
【0118】
さらに、実施例１、２および３を繰り返すことにより、表９－１、表９－２および表９－３（上記を参照する）に示される、相補的な核酸骨格ベースの三量体、四量体および五量体複合体を形成するために使用される一本鎖核酸配列およびそのセットを得る。
【0119】
実施例４：Ｇ－ＣＳＦとＬ－ＤＮＡとのカップリング
Ｇ－ＣＳＦとＬ－ＤＮＡとのカップリングは、還元的アミノ化反応法を採用して、５’末端のアルデヒド基修飾を有するＬ－ＤＮＡをＧ－ＣＳＦのＮ末端に選択的にカップリングする。希釈法またはゲルろ過クロマトグラフィー等の方法により、Ｇ－ＣＳＦの緩衝液を酢酸塩緩衝液（２０ｍＭの酢酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）に置換し、かつサンプルを３０ｍｇ／ｍＬに濃縮する。５’末端にアルデヒド基修飾を有する１００ＯＤ（１ＯＤ＝３３μｇ）のＬ－ＤＮＡ乾燥粉末を取り、６０μＬの酢酸塩緩衝液に溶解する。３０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを酢酸塩緩衝液に溶解し、濃度を８００ｍＭに調整する。それぞれ５０μＬ、６０μＬ、２０μＬの上記濃度のＧ－ＣＳＦ、Ｌ－ＤＮＡ、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを取り、かつ均一に混合し、室温下で暗所で回転させながら４８時間インキュベートおよび反応させる。反応前後のサンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動によってカップリング反応の効果を検証し、（Ｌ－ＤＮＡ）－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲートは、カップリングしていないＧ－ＣＳＦと比較して、電気泳動ゲル図に明らかな偏移が発生しており、カップリング効率は、約７０％～８０％に達する可能性がある（図１４）。
Ｇ－ＣＳＦとＬ－ＤＮＡとのカップリングは、還元的アミノ化反応法を採用して、５’末端のアルデヒド基修飾を有するＬ－ＤＮＡをＧ－ＣＳＦのＮ末端に選択的にカップリングする。希釈法またはゲルろ過クロマトグラフィー等の方法により、Ｇ－ＣＳＦの緩衝液を酢酸塩緩衝液（２０ｍＭの酢酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）に置換し、かつサンプルを３０ｍｇ／ｍＬに濃縮する。５’末端にアルデヒド基修飾を有する１００ＯＤ（１ＯＤ＝３３μｇ）のＬ－ＤＮＡ乾燥粉末を取り、６０μＬの酢酸塩緩衝液に溶解する。３０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを酢酸塩緩衝液に溶解し、濃度を８００ｍＭに調整する。それぞれ５０μＬ、６０μＬ、２０μＬの上記濃度のＧ－ＣＳＦ、Ｌ－ＤＮＡ、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを取り、かつ均一に混合し、室温下で暗所で回転させながら４８時間インキュベートおよび反応させる。反応前後のサンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動によってカップリング反応の効果を検証し、（Ｌ－ＤＮＡ）－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲートは、カップリングしていないＧ－ＣＳＦと比較して、電気泳動ゲル図に明らかな偏移が発生しており、カップリング効率は、約７０％～８０％に達する可能性がある（図１４）。
【0120】
実施例５：（Ｌ－ＤＮＡ）－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲートの精製
（Ｌ－ＤＮＡ）－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲートの精製は、二つの段階に分けられる。第１段階、Ｈｉｔｒａｐ Ｑ ＨＰを使用して、反応していないＧ－ＣＳＦおよび二つのＬ－ＤＮＡに結合した（Ｌ－ＤＮＡ）２－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲートを除去する（図１５ａ）。実施例５で得られた反応混合液をＱカラムのローディング緩衝液で１０倍希釈してからローディングし、ローディング緩衝液で１０倍のカラム体積を溶出して、反応していないＧ－ＣＳＦを除去し、その後０～１００％線形勾配溶出の方式を使用して、５０倍のカラム体積を溶出して、（Ｌ－ＤＮＡ）－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲートおよび（Ｌ－ＤＮＡ）２－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲートを分離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、各Ａ２８０吸收ピークの成分の種類を同定し（図１５ｂ）、（Ｌ－ＤＮＡ）－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲート（反応していない核酸を含む）を収集する。第２段階では、Ｈｉｓｃｒｅｅｎ Ｃａｐｔｏ ＭＭＣを使用して反応していない核酸を除去し、最終的に分離して高純度の（Ｌ－ＤＮＡ）－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲート（図１５ｃ）を得る。段階１で収集したサンプルをＨｉｓｃｒｅｅｎ Ｃａｐｔｏ ＭＭＣカラムに直接ローディングし、ローディング緩衝液で１０倍のカラム体積を溶出して、反応していない核酸を除去し、その後１００％溶出緩衝液で（Ｌ－ＤＮＡ）－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲートを溶出する。
（Ｌ－ＤＮＡ）－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲートの精製は、二つの段階に分けられる。第１段階、Ｈｉｔｒａｐ Ｑ ＨＰを使用して、反応していないＧ－ＣＳＦおよび二つのＬ－ＤＮＡに結合した（Ｌ－ＤＮＡ）２－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲートを除去する（図１５ａ）。実施例５で得られた反応混合液をＱカラムのローディング緩衝液で１０倍希釈してからローディングし、ローディング緩衝液で１０倍のカラム体積を溶出して、反応していないＧ－ＣＳＦを除去し、その後０～１００％線形勾配溶出の方式を使用して、５０倍のカラム体積を溶出して、（Ｌ－ＤＮＡ）－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲートおよび（Ｌ－ＤＮＡ）２－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲートを分離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、各Ａ２８０吸收ピークの成分の種類を同定し（図１５ｂ）、（Ｌ－ＤＮＡ）－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲート（反応していない核酸を含む）を収集する。第２段階では、Ｈｉｓｃｒｅｅｎ Ｃａｐｔｏ ＭＭＣを使用して反応していない核酸を除去し、最終的に分離して高純度の（Ｌ－ＤＮＡ）－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲート（図１５ｃ）を得る。段階１で収集したサンプルをＨｉｓｃｒｅｅｎ Ｃａｐｔｏ ＭＭＣカラムに直接ローディングし、ローディング緩衝液で１０倍のカラム体積を溶出して、反応していない核酸を除去し、その後１００％溶出緩衝液で（Ｌ－ＤＮＡ）－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲートを溶出する。
【0121】
精製条件は、以下の表に示されたとおりである。
【表20】
【0122】
２段階の精製法で得られた（Ｌ－ＤＮＡ）－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲートサンプルを使用して、２％アガロースゲル電気泳動によってサンプルの純度を同定し（図１５ｄ）、ゲル図は、サンプル中に核酸バンドが一つだけ存在し、（Ｌ－ＤＮＡ）－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲートは、非カップリングＬ－ＤＮＡと比較して、電気泳動ゲル図に明らかな偏移があることを示し、これは、反応していない核酸、および（Ｌ－ＤＮＡ）２－（Ｇ－ＣＳＦ）コンジュゲートがすでに除去されたことがわかる。
【0123】
実施例６：一価、二価および三価のＧ－ＣＳＦ複合体の集合
それぞれＮａｎｏｄｒｏｐにより、Ｓ１－Ｇ－ＣＳＦ、Ｓ３－Ｇ－ＣＳＦ、Ｓ４－Ｇ－ＣＳＦ、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４の核酸濃度を測定する。一価、二価および三価のタンパク質複合体の構造設計に従って、上記の十分を定量と取り、上記成分を定量的に定量し、１：１：１：１のモル比に従って神々し、混合後に各集合ユニットは、塩基相補的対合の原則に従って自動的に集合される。集合前後のサンプルは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、集合効果およびサンプル純度を確認する（図１６）。
それぞれＮａｎｏｄｒｏｐにより、Ｓ１－Ｇ－ＣＳＦ、Ｓ３－Ｇ－ＣＳＦ、Ｓ４－Ｇ－ＣＳＦ、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４の核酸濃度を測定する。一価、二価および三価のタンパク質複合体の構造設計に従って、上記の十分を定量と取り、上記成分を定量的に定量し、１：１：１：１のモル比に従って神々し、混合後に各集合ユニットは、塩基相補的対合の原則に従って自動的に集合される。集合前後のサンプルは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、集合効果およびサンプル純度を確認する（図１６）。
【0124】
実施例７：Ｇ－ＣＳＦのインビトロ活性評価
Ｍ－ＮＦＳ－６０細胞（マウス白血病リンパ球／Ｇ－ＣＳＦ依存性細胞）を蘇生培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１５ｎｇ／ｍＬのＧ－ＣＳＦ＋１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン）に接種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で細胞を蘇生させ、細胞密度が８０％～９０％に達した後継代し、2回～３回継代した後に、９６ウェルには細胞プレーティングする。細胞プレーティング実験は、ｃｏｒｎｉｎｇ ３５９９＃９６ウェルプレートを使用し、細胞プレーティング密度は、６０００細胞／ウェルである。様々なサンプル（ＧＣＳＦ、ＮＡＰＰＡ４－ＧＣＳＦ、ＮＡＰＰＡ４－ＧＣＳＦ２、ＮＡＰＰＡ４－ＧＣＳＦ３）を勾配希釈し、作業濃度は、（０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００ｎｇ／ｍＬ）であり、最終体積は、１００μＬであり、ＰＢＳを対照として使用する。恒温インキュベーターで４８時間培養した後、各ウェルに１０μＬのＣＣＫ８溶液を加え、培養プレートをインキュベーターで１～４時間インキュベートし、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでの吸光度を測定し、様々なサンプルの細胞増殖率を計算する。
Ｍ－ＮＦＳ－６０細胞（マウス白血病リンパ球／Ｇ－ＣＳＦ依存性細胞）を蘇生培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１５ｎｇ／ｍＬのＧ－ＣＳＦ＋１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン）に接種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で細胞を蘇生させ、細胞密度が８０％～９０％に達した後継代し、2回～３回継代した後に、９６ウェルには細胞プレーティングする。細胞プレーティング実験は、ｃｏｒｎｉｎｇ ３５９９＃９６ウェルプレートを使用し、細胞プレーティング密度は、６０００細胞／ウェルである。様々なサンプル（ＧＣＳＦ、ＮＡＰＰＡ４－ＧＣＳＦ、ＮＡＰＰＡ４－ＧＣＳＦ２、ＮＡＰＰＡ４－ＧＣＳＦ３）を勾配希釈し、作業濃度は、（０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００ｎｇ／ｍＬ）であり、最終体積は、１００μＬであり、ＰＢＳを対照として使用する。恒温インキュベーターで４８時間培養した後、各ウェルに１０μＬのＣＣＫ８溶液を加え、培養プレートをインキュベーターで１～４時間インキュベートし、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでの吸光度を測定し、様々なサンプルの細胞増殖率を計算する。
【0125】
細胞増殖率（％）＝［Ａ（薬物添加）－Ａ（０薬物添加）］／［Ａ（０薬物添加）－Ａ（空白）］×１００
Ａ（薬物添加）：細胞、ＣＣＫ溶液および薬物溶液を有するウェルの吸光度
Ａ（空白）：培地およびＣＣＫ８溶液を有するが、細胞を有さないウェルの吸光度
Ａ（０薬物添加）：細胞、ＣＣＫ８溶液を有するが、薬物溶液を有さないウェルの吸光度
Ａ（薬物添加）：細胞、ＣＣＫ溶液および薬物溶液を有するウェルの吸光度
Ａ（空白）：培地およびＣＣＫ８溶液を有するが、細胞を有さないウェルの吸光度
Ａ（０薬物添加）：細胞、ＣＣＫ８溶液を有するが、薬物溶液を有さないウェルの吸光度
【0126】
上記の活性試験方法を用いて、Ｇ－ＣＳＦ結合Ｌ－ＤＮＡ四量体フレームワークに対して活性評価を行い、Ｌ－ＤＮＡ四量体フレームワークがＧ－ＣＳＦの活性に影響がないことを発見した（図１７）。同じ活性試験方法を用いて、Ｌ－ＤＮＡ四量体と集合した二価および三価のＧ－ＣＳＦがＧ－ＣＳＦの活性にも負の影響がないことを発見した（図１８）。
【0127】
実施例８：ＳＭ（ＰＥＧ）２－ＰＭＯコンジュゲートのカップリングおよび精製
本実施例において、ホスホロジアミデートモルホリノ核酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）核酸を使用して実験を実行する。具体的には、次のような四つのＰＭＯ一本鎖配列（５’から３’まで）を選択する。
本実施例において、ホスホロジアミデートモルホリノ核酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）核酸を使用して実験を実行する。具体的には、次のような四つのＰＭＯ一本鎖配列（５’から３’まで）を選択する。
【0128】
鎖１（ＰＭＯ１）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７５
５’－ＡＧＣＡＧＣＣＴＣＧＴＴＧＡＡＴＣＧＣＣＡＡＧＡＣＡＣＣ－３’
鎖２（ＰＭＯ２）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６
５’－ＡＧＧＴＧＴＣＴＴＧＧＣＧＡＡＡＧＴＴＧＣＴＣＣＧＡＣＧ－３’
鎖３（ＰＭＯ３）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７
５’－ＡＣＧＴＣＧＧＡＧＣＡＡＣＴＡＡＧＣＧＧＴＴＣＴＧＴＧＧ－３’
鎖４（ＰＭＯ４）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７８
５’－ＡＣＣＡＣＡＧＡＡＣＣＧＣＴＡＴＣＡＡＣＧＡＧＧＣＴＧＣ－３’
５’－ＡＧＣＡＧＣＣＴＣＧＴＴＧＡＡＴＣＧＣＣＡＡＧＡＣＡＣＣ－３’
鎖２（ＰＭＯ２）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６
５’－ＡＧＧＴＧＴＣＴＴＧＧＣＧＡＡＡＧＴＴＧＣＴＣＣＧＡＣＧ－３’
鎖３（ＰＭＯ３）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７
５’－ＡＣＧＴＣＧＧＡＧＣＡＡＣＴＡＡＧＣＧＧＴＴＣＴＧＴＧＧ－３’
鎖４（ＰＭＯ４）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７８
５’－ＡＣＣＡＣＡＧＡＡＣＣＧＣＴＡＴＣＡＡＣＧＡＧＧＣＴＧＣ－３’
【0129】
５’末端には、ＳＭ（ＰＥＧ）２のＮＨＳ活性基にカップリングするためのＮＨ２基修飾がある。
５’末端ＮＨ２修飾を含むＰＭＯ一本鎖をリン酸緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、最終濃度が１ｍＭであるストック溶液を調製する。ＳＭ（ＰＥＧ）２（リンカー分子）粉末をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、２５０ｍＭのＳＭ（ＰＥＧ）２ストック溶液を新たに調製する。ＰＭＯ一本鎖ストック溶液に１０～５０倍モル量のＳＭ（ＰＥＧ）２ストック溶液を加え、急速に混合した後に室温下で３０分間～２時間反応させる。反応終了後に反応液に１０％体積の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を加えて、混合した後に室温下で２０分間インキュベートして、過剰なＳＭ（ＰＥＧ）２を停止して反応を継続させるために使用する。インキュベーション終了後、Ｈｉｔｒａｐ Ｃａｐｔｏ ＭＭＣを用いてＳＭ（ＰＥＧ）２－ＰＭＯを精製し、反応していないＳＭ（ＰＥＧ）２は、カラムに結合せずにそのまま流れ、カラムに結合したＳＭ（ＰＥＧ）２－ＰＭＯは、溶離液（２５ｍＭのＢＩＣＩＮＥ、２００ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１Ｍの一塩酸アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ｐＨ８．５）で溶出し、溶出結果は、図１９ａに示されたとおりである。
５’末端ＮＨ２修飾を含むＰＭＯ一本鎖をリン酸緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、最終濃度が１ｍＭであるストック溶液を調製する。ＳＭ（ＰＥＧ）２（リンカー分子）粉末をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、２５０ｍＭのＳＭ（ＰＥＧ）２ストック溶液を新たに調製する。ＰＭＯ一本鎖ストック溶液に１０～５０倍モル量のＳＭ（ＰＥＧ）２ストック溶液を加え、急速に混合した後に室温下で３０分間～２時間反応させる。反応終了後に反応液に１０％体積の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を加えて、混合した後に室温下で２０分間インキュベートして、過剰なＳＭ（ＰＥＧ）２を停止して反応を継続させるために使用する。インキュベーション終了後、Ｈｉｔｒａｐ Ｃａｐｔｏ ＭＭＣを用いてＳＭ（ＰＥＧ）２－ＰＭＯを精製し、反応していないＳＭ（ＰＥＧ）２は、カラムに結合せずにそのまま流れ、カラムに結合したＳＭ（ＰＥＧ）２－ＰＭＯは、溶離液（２５ｍＭのＢＩＣＩＮＥ、２００ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１Ｍの一塩酸アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ｐＨ８．５）で溶出し、溶出結果は、図１９ａに示されたとおりである。
【0130】
陽イオンモード液体クロマトグラフィー質量分析によって、カップリング前後のＰＭＯサンプルを分析する。図２０ａおよび図２０ｂに示されるように、結果は、最終的に得られたＳＭ（ＰＥＧ）２－ＰＭＯ分子量が理論値と一致しており、カップリング反応効率が高いことを示す。
【0131】
実施例９：ナノボディ突然変異体の調製
ナノボディのカルボキシ基末端に、核酸カップリングのためにシステイン突然変異を導入する。抗ＨＳＡナノボディの遺伝子配列を酵母が好むコドンに最適化し、次いでｐＰＩＣＺ ａｌｐｈａ Ａプラスミドにサブクローニングする。抗ＨＳＡナノボディのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７９である。精製を容易にするために、ナノボディのＮ末端にＨｉｓタグを添加する。
ナノボディのカルボキシ基末端に、核酸カップリングのためにシステイン突然変異を導入する。抗ＨＳＡナノボディの遺伝子配列を酵母が好むコドンに最適化し、次いでｐＰＩＣＺ ａｌｐｈａ Ａプラスミドにサブクローニングする。抗ＨＳＡナノボディのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７９である。精製を容易にするために、ナノボディのＮ末端にＨｉｓタグを添加する。
【0132】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７９、抗ＨＳＡナノボディ突然変異体のアミノ酸配列：
ＨＨＨＨＨＨＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＮＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＳＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＥＰＥＷＶＳＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＩＧＧＳＬＳＲＳＳＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＳＣ
ＨＨＨＨＨＨＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＮＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＳＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＥＰＥＷＶＳＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＩＧＧＳＬＳＲＳＳＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＳＣ
【0133】
プラスミドを線形化した後にピキアパストリスＸ３３にエレクトロポレーションし、ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）濃度勾配ＹＰＤ観点プレートでスクリーニングして、標的遺伝子のコピー数が多い株を得る。ＧＭＧＹ培地を使用して、３０℃、２５０ｒｐｍ条件下でモノクローナル株を培養し、十分な菌数を得た後にＧＭＭＹ培地を使用して、２０℃、２５０ｒｐｍ条件下で目的ナノボディの分泌および発現を誘導し、２４時間ごとに１％メタノールを追加する。
【0134】
高コピーによってスクリーニングされた株の実験室グレードのガラスフラスコ内でのナノボディ発現収量は、４０～８０ｍｇ／Ｌに達することができる。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ同定および分析によると、誘導７２時間後の培養上清は、大量の標的ナノボディ単量体およびナノボディ二量体を含む。Ｈｉｓタグアフィニティーカラムを使用して、培養上清中のナノボディを精製する。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ同定および分析によると、誘導７２時間後の培養上清は、大量の標的ナノボディ単量体およびナノボディ二量体を含む。Ｈｉｓタグアフィニティーカラムを使用して、培養上清中のナノボディを精製する。
【0135】
実施例１０：ナノボディ－ＰＭＯコンジュゲートのカップリングおよび精製
Ｈｉｓタグアフィニティークロマトグラフィーによって溶出したナノボディサンプル（実施例９）を、還元剤を含む透析緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で透析し、透析中に、Ｃ末端のスルフヒドリル基が還元され、同時に遊離の－ＳＨ基等の不純物小分子を除去する。還元されたナノボディおよびＳＭ（ＰＥＧ）２－ＰＭＯ一本鎖（実施例８で調製）を１：１～２のモル比に従って混合し、均一に混合した後に室温下で２時間反応させる。
Ｈｉｓタグアフィニティークロマトグラフィーによって溶出したナノボディサンプル（実施例９）を、還元剤を含む透析緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で透析し、透析中に、Ｃ末端のスルフヒドリル基が還元され、同時に遊離の－ＳＨ基等の不純物小分子を除去する。還元されたナノボディおよびＳＭ（ＰＥＧ）２－ＰＭＯ一本鎖（実施例８で調製）を１：１～２のモル比に従って混合し、均一に混合した後に室温下で２時間反応させる。
【0136】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ同定により、図１９ｂに示されるように、結果は、カップリング効率が９０％以上に達する可能性があることを示す。
反応していないＳＭ（ＰＥＧ）２－ＰＭＯ一本鎖をＨｉｓタグアフィニティーカラムで除去し、ナノボディおよびナノボディ－ＰＭＯ混合物を収集する。
反応していないＳＭ（ＰＥＧ）２－ＰＭＯ一本鎖をＨｉｓタグアフィニティーカラムで除去し、ナノボディおよびナノボディ－ＰＭＯ混合物を収集する。
【0137】
スーパーデックスＴＭ ７５増加 １０／３００ＧＬ（ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ７５ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ）を使用してナノボディおよびナノボディ－ＰＭＯを分離し、図２１に示されるように、ナノボディおよびナノボディ－ＰＭＯは、効果的に分離された。
核酸カップリング前後のナノボディを陽イオンモード液体クロマトグラフィー知る超分析計で分析し、図２０ｃおよびｄに示されるように、結果は、最終的に得られたナノボディ－ＰＭＯ分子量が理論値と一致していることを示す。
核酸カップリング前後のナノボディを陽イオンモード液体クロマトグラフィー知る超分析計で分析し、図２０ｃおよびｄに示されるように、結果は、最終的に得られたナノボディ－ＰＭＯ分子量が理論値と一致していることを示す。
【0138】
実施例１１：ＮＡＰＰＡ－ＰＭＯ薬物の自己集合
以下、ｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）を例として、ＮＡＰＰＡ－ＰＭＯ薬物の自己集合プロセスを紹介する。
抗ＨＳＡ Ｎｂ－ＰＭＯ１、ＰＭＯ２、ＰＭＯ３およびＰＭＯ４の濃度をそれぞれ測定する。上記成分を定量取り、３７℃で５分間予熱した後、３７℃条件下で１：１のモル比で混合し、１分間インキュベートする。即ち、ｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）の集合が完了する。
以下、ｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）を例として、ＮＡＰＰＡ－ＰＭＯ薬物の自己集合プロセスを紹介する。
抗ＨＳＡ Ｎｂ－ＰＭＯ１、ＰＭＯ２、ＰＭＯ３およびＰＭＯ４の濃度をそれぞれ測定する。上記成分を定量取り、３７℃で５分間予熱した後、３７℃条件下で１：１のモル比で混合し、１分間インキュベートする。即ち、ｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）の集合が完了する。
【0139】
ｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１，２，３）の集合と同様に、必要な集合モジュールは、抗ＨＳＡ Ｎｂ－ＰＭＯ１、抗ＨＳＡ Ｎｂ－ＰＭＯ２、抗ＨＳＡ Ｎｂ－ＰＭＯ３およびＰＭＯ４である。
低温条件下で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用してサンプルの集合状況を同定し、図２２に示されるように、結果は、集合したサンプルのバンドが均一であることを示す。
低温条件下で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用してサンプルの集合状況を同定し、図２２に示されるように、結果は、集合したサンプルのバンドが均一であることを示す。
【0140】
実施例１２：ナノボディ－ＰＭＯ単量体および集合後のＮＡＰＰＡ－ＰＭＯ薬物の結合活性の検証
以下、ｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）を例として、ＥＬＩＳＡ法を使用して、抗ＨＳＡナノボディ、抗ＨＳＡ Ｎｂ－ＰＭＯ１単量体および集合したｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）と、ＨＳＡタンパク質（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＨＳＡ－Ｈ５２２０）との結合能を検出する。
以下、ｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）を例として、ＥＬＩＳＡ法を使用して、抗ＨＳＡナノボディ、抗ＨＳＡ Ｎｂ－ＰＭＯ１単量体および集合したｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）と、ＨＳＡタンパク質（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＨＳＡ－Ｈ５２２０）との結合能を検出する。
【0141】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルを１００ｎｇのＨＳＡタンパク質で４℃で一晩コーティングする。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）で洗浄し、ブロッキング液（３％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）でブロッキングした後に、勾配希釈した抗ＨＳＡナノボディ、ＰＭＯカップリングナノボディ抗ＨＳＡ Ｎｂ－ＰＭＯ１および集合したｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）を加え、室温下で１時間インキュベートする。３回洗浄した後に１：５０００希釈した西洋わさびペルオキシダーゼカップリングウサギ抗キャメリンＶＨＨ抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ａ０２０１６）を加え、室温下で１時間インキュベートする。３回洗浄した後、テトラメチルベンジジン基質溶液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、Ｐ０２０９）を加えて発色させ、停止液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、Ｐ０２１５）を使用して発色を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ）を使用して、各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度を読み取り、対応するＥＣ５０を計算する。
【0142】
図２３に示されるように、計算結果は、抗ＨＳＡナノボディ、抗ＨＳＡ Ｎｂ－ＰＭＯ１および集合したｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）と、ＨＳＡタンパク質との結合のＥＣ５０は、それぞれ０．５７７ｎＭ、０．３９１ｎＭおよび０．５２９ｎＭであることを示し、これは、ＰＭＯカップリングナノボディ方法がナノボディと対応する抗原との結合活性に影響せず、ＰＭＯ集合方法もナノボディと対応する抗原との結合活性に影響しないことを示す。
【0143】
実施例１３：ＮＡＰＰＡ－ＰＭＯ薬物のヌクレアーゼ耐性実験
核酸誘導体としてのＰＭＯが様々なヌクレアーゼの分解に耐性があるかどうか、集合したＮＡＰＰＡ－ＰＭＯ薬物がヌクレアーゼまたは解重合にも耐性があるかどうかを検証するために、以下の実験を設計した。実験では、三つの一般的なヌクレアーゼＤＮａｓｅ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＮ０５２３）、Ｔ７ エンドヌクレアーゼ Ｉ（ＮＥＢ、Ｍ０３０２Ｓ）、Ｓ１ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＮ０３２１）を選択し、ＰＭＯ集合サンプルｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）およびＤ－ＤＮＡ集合サンプルＤＤＮＡ－ＮＡＰＰＡ４（対照）を３７℃で１時間インキュベートする。インキュベートしたｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）およびＤＤＮＡ－ＮＡＰＰＡ４をそれぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび２％アガロース電気泳動で分析する。
核酸誘導体としてのＰＭＯが様々なヌクレアーゼの分解に耐性があるかどうか、集合したＮＡＰＰＡ－ＰＭＯ薬物がヌクレアーゼまたは解重合にも耐性があるかどうかを検証するために、以下の実験を設計した。実験では、三つの一般的なヌクレアーゼＤＮａｓｅ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＮ０５２３）、Ｔ７ エンドヌクレアーゼ Ｉ（ＮＥＢ、Ｍ０３０２Ｓ）、Ｓ１ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＮ０３２１）を選択し、ＰＭＯ集合サンプルｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）およびＤ－ＤＮＡ集合サンプルＤＤＮＡ－ＮＡＰＰＡ４（対照）を３７℃で１時間インキュベートする。インキュベートしたｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）およびＤＤＮＡ－ＮＡＰＰＡ４をそれぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび２％アガロース電気泳動で分析する。
【0144】
図２４に示されるように、ｐｍｏ－ＮＡＰＰＡ４－ＨＳＡ（１）は、三つのヌクレアーゼによって分解されないが（左図）、ＤＤＮＡ－ＮＡＰＰＡ４は、ＤＮａｓｅ ＩおよびＳ１ Ｎｕｃｌｅａｓｅによって完全に分解され、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩによって短い断片に切断される。従って、実験は、ＮＡＰＰＡ－ＰＭＯ薬物が一般的なヌクレアーゼによる分解に耐性があることを示す。
【0145】
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】