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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-07-03
(45)【発行日】2025-07-17
(54)【発明の名称】ギ酸脱水素酵素変異体およびその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 9/02 20060101AFI20250710BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20250710BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250710BHJP
【ＦＩ】
C12N9/02 ZNA
C12N15/53
C12N15/63 Z
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2025063513
(22)【出願日】2025-04-08
【審査請求日】2025-04-08
(31)【優先権主張番号】202410562403.9
(32)【優先日】2024-05-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】510115007
【氏名又は名称】南京大学
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＪＩＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】２２ Ｈａｎｋｏｕ Ｒｏａｄ，Ｎａｎｊｉｎｇ，ｊｉａｎｇｓｕ ２１００９３ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100216471
【弁理士】
【氏名又は名称】瀬戸 麻希
(72)【発明者】
【氏名】任▲しん▼坤
(72)【発明者】
【氏名】範▲しん▼竜
(72)【発明者】
【氏名】曲展
(72)【発明者】
【氏名】蒋宛▲とん▼
(72)【発明者】
【氏名】辛思蕊
(72)【発明者】
【氏名】呉怡菲
(72)【発明者】
【氏名】曹家南
(72)【発明者】
【氏名】呉佳欣
【審査官】西 賢二
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１３／１７６１５７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１２／１６９３４１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００２／０４６４２７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】ロシア国特許第２３１２８９７（ＲＵ，Ｃ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ９／００－ ９／９９
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）；
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ギ酸脱水素酵素変異体であって、前記ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す野生型ギ酸
脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４Ｉ、Ｖ３７７Ｔの少なく
とも１つによる変異によって得られる、ことを特徴とするギ酸脱水素酵素変異体。
【請求項2】
請求項１に記載のギ酸脱水素酵素変異体をコードする核酸。
【請求項3】
請求項２に記載の核酸を含む発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、特にギ酸脱水素酵素変異体およびその用途に
関する。
関する。
【背景技術】
【0002】
従来技術では、ギ酸脱水素酵素（Ｆｏｒｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＦＤＨ
）を用いてＮＡＤＨの再生を介入することが多い。ＦＤＨは、Ｄ-２-ヒドロキシ酸デヒド
ロゲナーゼのクラスに属し、ギ酸の酸化を触媒して二酸化炭素を生成し、同時に酸化型補
酵素I（Ｏｘｄｉｚｅｄ ｆｏｒｍ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ
ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＮＡＤ＋）をＮＡＤＨに還元することができ、ＮＡＤＨ再
生に重要な役割を果たす。また、ＦＤＨ介入のＮＡＤＨの再生過程では、生成した副生成
物は二酸化炭素だけである。二酸化炭素は反応系から逃げやすいため、反応系中の酵素活
性や生成物の単離・精製に影響を与えない。
しかしながら、既存のＦＤＨを介して再生したＮＡＤＨの活性が低く、ＮＡＤＨ再生循環
系に依存する高付加価値化学品の生産効率が低下し、生産コストが高い。
）を用いてＮＡＤＨの再生を介入することが多い。ＦＤＨは、Ｄ-２-ヒドロキシ酸デヒド
ロゲナーゼのクラスに属し、ギ酸の酸化を触媒して二酸化炭素を生成し、同時に酸化型補
酵素I（Ｏｘｄｉｚｅｄ ｆｏｒｍ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ
ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＮＡＤ＋）をＮＡＤＨに還元することができ、ＮＡＤＨ再
生に重要な役割を果たす。また、ＦＤＨ介入のＮＡＤＨの再生過程では、生成した副生成
物は二酸化炭素だけである。二酸化炭素は反応系から逃げやすいため、反応系中の酵素活
性や生成物の単離・精製に影響を与えない。
しかしながら、既存のＦＤＨを介して再生したＮＡＤＨの活性が低く、ＮＡＤＨ再生循環
系に依存する高付加価値化学品の生産効率が低下し、生産コストが高い。
【発明の概要】
【0003】
本発明は以下の技術的解決策を採用する。
第１態様において、本発明は、ギ酸脱水素酵素変異体を提供し、ギ酸脱水素酵素変異体の
アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列か
らＮ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４Ｉ、Ｖ３７７Ｔの少なくとも１つによる変異によって
得られる。
ここで、Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４ＩおよびＶ３７７Ｔはいずれもアミノ酸の標準
的な一文字コードを用いた標準的な置換表記である。
上記Ｎ２４Ｄは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列を
指し、そのＮ末端の第２４位のアスパラギン（Ｎ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換される
。
上記Ｋ１８５Ｓは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列
を指し、そのＮ末端の第１８５位のリジン（Ｋ）がセリン（Ｓ）に置換される。
上記Ｍ３３４Ｉは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列
を指し、そのＮ末端の第３３４位のメチオニン（Ｍ）がイソロイシン（Ｉ）に置換される
。
上記Ｖ３７７Ｔは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列
を指し、そのＮ末端の第３７７位のバリン（Ｖ）がスレオニン（Ｔ）に置換される。
第１態様の実施態様では、Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４Ｉ、Ｖ３７７Ｔの少なくとも
１つによる変異によって得られたギ酸脱水素酵素変異体は、以下のものであり得：
第１ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異によって得られ、第１
ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。
第２ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＫ１８５Ｓ変異によって得られ、第
２ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される。
第３ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＭ３３４Ｉ変異によって得られ、第
３ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。
第４ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第
４ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される。
第５ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異およびＫ１８５Ｓ変異
によって得られ、第５ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に
示される。
第６ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異およびＭ３３４Ｉ変異
によって得られ、第６ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に
示される。
第７ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異およびＶ３７７Ｔ変異
によって得られ、第７ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に
示される。
第８ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＫ１８５Ｓ変異およびＭ３３４Ｉ変
異によって得られ、第８ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９
に示される。
第９ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＫ１８５Ｓ変異およびＶ３７７Ｔ変
異によって得られ、第９ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
０に示される。
第１０ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＭ３３４Ｉ変異およびＶ３７７Ｔ
変異によって得られ、第１０ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１１に示される。
第１１ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異、Ｋ１８５Ｓ変異お
よびＭ３３４Ｉ変異によって得られ、第１１ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１２に示される。
第１２ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異、Ｋ１８５Ｓ変異お
よびＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第１２ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１３に示される。
第１３ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＫ１８５Ｓ変異、Ｍ３３４Ｉ変異
およびＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第１３ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示される。
第１４ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異、Ｍ３３４Ｉ変異お
よびＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第１４ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１５に示される。
第１５ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異、Ｋ１８５Ｓ変異、
Ｍ３３４Ｉ変異およびＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第１５ギ酸脱水素酵素変異体のア
ミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示される。
第２態様において、本発明は、上記ギ酸脱水素酵素変異体をコードする核酸をさらに提供
する。
第３態様において、本発明は、上記核酸を含む発現ベクターをさらに提供する。
第４態様において、本発明は、上記発現ベクターを形質転換またはトランスフェクタント
する宿主細胞をさらに提供する。
第５態様において、本発明は、上記ギ酸脱水素酵素変異体の調製方法をさらに提供する。
第６態様において、本発明は、上記ギ酸脱水素酵素変異体、核酸、発現ベクター、宿主細
胞または上記調製方法により調製された培養物の、酸化型補酵素Iを還元型補酵素Iに還元
する触媒活性の向上における用途をさらに提供する。
第１態様において、本発明は、ギ酸脱水素酵素変異体を提供し、ギ酸脱水素酵素変異体の
アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列か
らＮ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４Ｉ、Ｖ３７７Ｔの少なくとも１つによる変異によって
得られる。
ここで、Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４ＩおよびＶ３７７Ｔはいずれもアミノ酸の標準
的な一文字コードを用いた標準的な置換表記である。
上記Ｎ２４Ｄは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列を
指し、そのＮ末端の第２４位のアスパラギン（Ｎ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換される
。
上記Ｋ１８５Ｓは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列
を指し、そのＮ末端の第１８５位のリジン（Ｋ）がセリン（Ｓ）に置換される。
上記Ｍ３３４Ｉは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列
を指し、そのＮ末端の第３３４位のメチオニン（Ｍ）がイソロイシン（Ｉ）に置換される
。
上記Ｖ３７７Ｔは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列
を指し、そのＮ末端の第３７７位のバリン（Ｖ）がスレオニン（Ｔ）に置換される。
第１態様の実施態様では、Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４Ｉ、Ｖ３７７Ｔの少なくとも
１つによる変異によって得られたギ酸脱水素酵素変異体は、以下のものであり得：
第１ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異によって得られ、第１
ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。
第２ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＫ１８５Ｓ変異によって得られ、第
２ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される。
第３ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＭ３３４Ｉ変異によって得られ、第
３ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。
第４ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第
４ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される。
第５ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異およびＫ１８５Ｓ変異
によって得られ、第５ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に
示される。
第６ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異およびＭ３３４Ｉ変異
によって得られ、第６ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に
示される。
第７ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異およびＶ３７７Ｔ変異
によって得られ、第７ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に
示される。
第８ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＫ１８５Ｓ変異およびＭ３３４Ｉ変
異によって得られ、第８ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９
に示される。
第９ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＫ１８５Ｓ変異およびＶ３７７Ｔ変
異によって得られ、第９ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
０に示される。
第１０ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＭ３３４Ｉ変異およびＶ３７７Ｔ
変異によって得られ、第１０ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１１に示される。
第１１ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異、Ｋ１８５Ｓ変異お
よびＭ３３４Ｉ変異によって得られ、第１１ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１２に示される。
第１２ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異、Ｋ１８５Ｓ変異お
よびＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第１２ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１３に示される。
第１３ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＫ１８５Ｓ変異、Ｍ３３４Ｉ変異
およびＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第１３ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示される。
第１４ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異、Ｍ３３４Ｉ変異お
よびＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第１４ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列はＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１５に示される。
第１５ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異、Ｋ１８５Ｓ変異、
Ｍ３３４Ｉ変異およびＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第１５ギ酸脱水素酵素変異体のア
ミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示される。
第２態様において、本発明は、上記ギ酸脱水素酵素変異体をコードする核酸をさらに提供
する。
第３態様において、本発明は、上記核酸を含む発現ベクターをさらに提供する。
第４態様において、本発明は、上記発現ベクターを形質転換またはトランスフェクタント
する宿主細胞をさらに提供する。
第５態様において、本発明は、上記ギ酸脱水素酵素変異体の調製方法をさらに提供する。
第６態様において、本発明は、上記ギ酸脱水素酵素変異体、核酸、発現ベクター、宿主細
胞または上記調製方法により調製された培養物の、酸化型補酵素Iを還元型補酵素Iに還元
する触媒活性の向上における用途をさらに提供する。
【発明の効果】
【0004】
本発明は以下の有益な効果を有する。
１．本発明は、ＮＡＤＨ再生を効率的に触媒することができる様々なギ酸脱水素酵素変異
体を提供し、このギ酸脱水素酵素変異体は元のギ酸脱水素酵素よりも触媒活性が高く、そ
の結果、ギ酸脱水素酵素変異体のＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの還元触媒効果がより向上し、
ギ酸脱水素酵素再生循環系に依存する高付加価値化学品の生産効率が向上し、生産コスト
が低減する。
２．本発明によって提供される変異体は、還元型補酵素ＮＡＤＨの再生効率を効果的に向
上させることができ、変異体Ｎ２４Ｄ／Ｋ１８４Ｓ／Ｍ３３４Ｉ／Ｖ３７７Ｔの触媒効率
は、野生型ギ酸脱水素酵素の触媒効率の１．５倍である。
３．本発明によって提供されるギ酸脱水素酵素変異体は、反応条件が温和で反応ｐＨ値の
範囲が広く、反応温度が１５～４０℃であり、反応ｐＨ値が４～１０であり、その安定性
が野生型ギ酸脱水素酵素に比べて向上している。
１．本発明は、ＮＡＤＨ再生を効率的に触媒することができる様々なギ酸脱水素酵素変異
体を提供し、このギ酸脱水素酵素変異体は元のギ酸脱水素酵素よりも触媒活性が高く、そ
の結果、ギ酸脱水素酵素変異体のＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの還元触媒効果がより向上し、
ギ酸脱水素酵素再生循環系に依存する高付加価値化学品の生産効率が向上し、生産コスト
が低減する。
２．本発明によって提供される変異体は、還元型補酵素ＮＡＤＨの再生効率を効果的に向
上させることができ、変異体Ｎ２４Ｄ／Ｋ１８４Ｓ／Ｍ３３４Ｉ／Ｖ３７７Ｔの触媒効率
は、野生型ギ酸脱水素酵素の触媒効率の１．５倍である。
３．本発明によって提供されるギ酸脱水素酵素変異体は、反応条件が温和で反応ｐＨ値の
範囲が広く、反応温度が１５～４０℃であり、反応ｐＨ値が４～１０であり、その安定性
が野生型ギ酸脱水素酵素に比べて向上している。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1】本出願の実施例によって提供されるＦＤＨ触媒によるＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの還元の反応図である。
【図2】本出願の実施例によって提供される野生型ギ酸脱水素酵素と、ギ酸脱水素酵素変異体触媒によって再生されたＮＡＤＨの相対活性の効果図である。
【図3】本出願の実施例によって提供される異なる温度下で、野生型ギ酸脱水素酵素と、ギ酸脱水素酵素変異体触媒によって再生されたＮＡＤＨの相対活性の効果図である。
【図4】本出願の実施例によって提供される異なるｐＨ値下で、野生型ギ酸脱水素酵素と、ギ酸脱水素酵素変異体触媒によって再生されたＮＡＤＨの相対活性の効果図である。
【発明を実施するための形態】
【0006】
本出願の実施例によって提供されるギ酸脱水素酵素変異体およびその用途はバイオテクノ
ロジー分野に関し、ギ酸脱水素酵素変異体触媒により、酸化型補酵素I（Ｏｘｄｉｚｅｄ
ｆｏｒｍ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ、ＮＡＤ＋）を還元型補酵素I（Ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｏｒｍ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎ
ａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＮＡＤＨ）に還元することが
できる。
既存のギ酸脱水素酵素（Ｆｏｒｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＦＤＨ）介入に
よるＮＡＤＨ再生活性が低く、その結果、ＮＡＤＨ再生循環系に依存する高付加価値化学
品の生産効率が低下し、生産コストが高いという背景技術の問題を解決するために、本出
願の実施例は、ギ酸脱水素酵素変異体およびその用途を提供し、このギ酸脱水素酵素変異
体は高触媒活性の酵素として、ギ酸塩およびＮＡＤ＋を基質として反応を効率的に触媒し
て二酸化炭素およびＮＡＤＨを生成することができ、ＮＡＤＨ再生循環系に依存する高付
加価値化学品の生産効率の低下を改善し、その生産コストを低減することができる。
本出願の実施例では、用語「野生型」とは、天然に存在する供給源から単離された遺伝子
または遺伝子生成物を指す。野生型遺伝子は、集団において最も一般的に観察される遺伝
子を指し、したがって、遺伝子の「正常型」または「野生型」形態であるように任意に設
計される。逆に、用語「修飾された」、「変異体」または「バリアント」とは、野生型遺
伝子または遺伝子生成物と比較して、配列修飾（例えば、置換、切断または挿入）、翻訳
後修飾および／または機能的特性（例えば、変化した特性）を示す遺伝子または遺伝子生
成物を指す。また、天然に存在する変異体が単離され得ることに留意されたく、それらの
変異体は、野生型遺伝子または遺伝子生成物と比較して変化した特性を有するという事実
によって同定される。天然に存在する、天然に存在しないアミノ酸を導入または置換する
方法は本分野でより知られている。
本出願の実施例では、かかる一般的なアミノ酸の関連情報は表１に示される。なお、本出
願の実施例は、すべてのアミノ酸の関連情報を与えるものではなく、表１以外の他のアミ
ノ酸が存在する場合に、他の既存品を参照して他のアミノ酸の関連情報を得ることができ
ることを理解されたい。
表１：一般的なアミノ酸の名称略号および対応の一文字記号
実施例１：本出願の実施例はギ酸脱水素酵素変異体を提供し、ギ酸脱水素酵素変異体のア
ミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列から
Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４Ｉ、Ｖ３７７Ｔの少なくとも１つによる変異によって得
られる。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は以下に示される。
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＮＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
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Ｇ
ここで、Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４ＩおよびＶ３７７Ｔはいずれもアミノ酸の標準
的な一文字コードの標準的な置換表記を採用する。
上記Ｎ２４Ｄは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列を
指し、そのＮ末端の第２４位のアスパラギン（Ｎ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換される
。
上記Ｋ１８５Ｓは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列
を指し、そのＮ末端の第１８５位のリジン（Ｋ）がセリン（Ｓ）に置換される。
上記Ｍ３３４Ｉは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列
を指し、そのＮ末端の第３３４位のメチオニン（Ｍ）がイソロイシン（Ｉ）に置換される
。
上記Ｖ３７７Ｔは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列
を指し、そのＮ末端の第３７７位のバリン（Ｖ）がスレオニン（Ｔ）に置換される。
第１態様の実施態様において、Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４Ｉ、Ｖ３７７Ｔの少なく
とも１つによる変異によって得られたギ酸脱水素酵素変異体は以下のものであり得：
第１ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異によって得られ、第１
ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＤＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
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第２ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＫ１８５Ｓ変異によって得られ、第
２ギ酸脱水素酵素変異体（Ｋ１８５Ｓ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：３に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＮＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
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Ｇ
第３ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＭ３３４Ｉ変異によって得られ、第
３ギ酸脱水素酵素変異体（Ｍ３３４Ｉ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：４に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＮＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
ＫＡＩＤＦＴＰＧＴＭＬＧＳＶＳＧＥＬＧＬＲＫＹＬＥＳＮＧＨＴＬＶＶＴＳＤＫＤＧＰ
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第４ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第
４ギ酸脱水素酵素変異体（Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：５に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＮＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
ＫＡＩＤＦＴＰＧＴＭＬＧＳＶＳＧＥＬＧＬＲＫＹＬＥＳＮＧＨＴＬＶＶＴＳＤＫＤＧＰ
ＤＳＶＦＥＫＥＬＶＤＡＤＩＶＩＳＱＰＦＷＰＡＹＬＴＰＥＲＦＡＫＡＫＮＬＫＬＡＬＴ
ＡＧＩＧＳＤＨＶＤＬＱＳＡＩＤＲＧＶＴＶＡＥＶＴＹＣＮＳＩＳＶＡＥＨＶＶＭＭＩＬ
ＧＬＶＲＮＹＬＰＡＨＤＷＡＲＫＧＧＷＮＩＡＤＣＶＫＨＳＹＤＬＥＡＭＳＶＧＴＶＡＡ
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ＳＰＴＤＭＹＰＨＣＤＶＶＴＬＮＣＰＬＨＰＥＴＥＨＭＶＮＥＥＴＬＫＬＦＫＲＧＡＹＩ
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Ｇ
第５ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異およびＫ１８５Ｓ変異
によって得られ、第５ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｋ１８５Ｓ変異体とも呼ばれる
）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＤＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
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第６ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異およびＭ３３４Ｉ変異
によって得られ、第６ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｍ３３４Ｉ変異体とも呼ばれる
）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＤＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
ＫＡＩＤＦＴＰＧＴＭＬＧＳＶＳＧＥＬＧＬＲＫＹＬＥＳＮＧＨＴＬＶＶＴＳＤＫＤＧＰ
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第７ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異およびＶ３７７Ｔ変異
によって得られ、第７ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる
）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＤＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
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Ｇ
第８ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＫ１８５Ｓ変異およびＭ３３４Ｉ変
異によって得られ、第８ギ酸脱水素酵素変異体（Ｋ１８５Ｓ／Ｍ３３４Ｉ変異体とも呼ば
れる）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＮＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
ＫＡＩＤＦＴＰＧＴＭＬＧＳＶＳＧＥＬＧＬＲＫＹＬＥＳＮＧＨＴＬＶＶＴＳＤＫＤＧＰ
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ＧＬＶＲＮＹＬＰＡＨＤＷＡＲＫＧＧＷＮＩＡＤＣＶＳＨＳＹＤＬＥＡＭＳＶＧＴＶＡＡ
ＧＲＩＧＬＡＶＬＲＲＬＡＰＦＤＶＫＬＨＹＴＤＲＨＲＬＰＥＳＶＥＫＥＬＮＬＴＷＨＡ
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ＰＩＲＤＥＹＬＩＶＱＧＧＮＬＡＧＶＧＡＨＳＹＳＫＧＮＡＴＧＧＳＥＥＡＧＫＦＫＫＡ
Ｇ
第９ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＫ１８５Ｓ変異およびＶ３７７Ｔ変
異によって得られ、第９ギ酸脱水素酵素変異体（Ｋ１８５Ｓ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ば
れる）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＮＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
ＫＡＩＤＦＴＰＧＴＭＬＧＳＶＳＧＥＬＧＬＲＫＹＬＥＳＮＧＨＴＬＶＶＴＳＤＫＤＧＰ
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ＧＬＶＲＮＹＬＰＡＨＤＷＡＲＫＧＧＷＮＩＡＤＣＶＳＨＳＹＤＬＥＡＭＳＶＧＴＶＡＡ
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Ｇ
第１０ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＭ３３４Ｉ変異およびＶ３７７Ｔ
変異によって得られ、第１０ギ酸脱水素酵素変異体（Ｍ３３４Ｉ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも
呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＮＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
ＫＡＩＤＦＴＰＧＴＭＬＧＳＶＳＧＥＬＧＬＲＫＹＬＥＳＮＧＨＴＬＶＶＴＳＤＫＤＧＰ
ＤＳＶＦＥＫＥＬＶＤＡＤＩＶＩＳＱＰＦＷＰＡＹＬＴＰＥＲＦＡＫＡＫＮＬＫＬＡＬＴ
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ＧＬＶＲＮＹＬＰＡＨＤＷＡＲＫＧＧＷＮＩＡＤＣＶＫＨＳＹＤＬＥＡＭＳＶＧＴＶＡＡ
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ＶＮＴＡＲＧＫＬＣＤＲＤＡＩＡＲＡＬＥＮＧＴＬＡＧＹＡＧＤＶＷＦＰＱＰＡＰＡＤＨ
ＰＷＲＴＭＡＷＮＧＭＴＰＨＩＳＧＴＳＬＴＡＱＴＲＹＡＡＧＴＲＥＩＬＥＣＦＦＥＧＲ
ＰＩＲＤＥＹＬＩＶＱＧＧＮＬＡＧＴＧＡＨＳＹＳＫＧＮＡＴＧＧＳＥＥＡＧＫＦＫＫＡ
Ｇ
第１１ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異、Ｋ１８５Ｓ変異お
よびＭ３３４Ｉ変異によって得られ、第１１ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｋ１８５
Ｓ／Ｍ３３４Ｉ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示さ
れる。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＤＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
ＫＡＩＤＦＴＰＧＴＭＬＧＳＶＳＧＥＬＧＬＲＫＹＬＥＳＮＧＨＴＬＶＶＴＳＤＫＤＧＰ
ＤＳＶＦＥＫＥＬＶＤＡＤＩＶＩＳＱＰＦＷＰＡＹＬＴＰＥＲＦＡＫＡＫＮＬＫＬＡＬＴ
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ＳＰＴＤＭＹＰＨＣＤＶＶＴＬＮＣＰＬＨＰＥＴＥＨＭＶＮＥＥＴＬＫＬＦＫＲＧＡＹＩ
ＶＮＴＡＲＧＫＬＣＤＲＤＡＩＡＲＡＬＥＮＧＴＬＡＧＹＡＧＤＶＷＦＰＱＰＡＰＡＤＨ
ＰＷＲＴＭＡＷＮＧＭＴＰＨＩＳＧＴＳＬＴＡＱＴＲＹＡＡＧＴＲＥＩＬＥＣＦＦＥＧＲ
ＰＩＲＤＥＹＬＩＶＱＧＧＮＬＡＧＶＧＡＨＳＹＳＫＧＮＡＴＧＧＳＥＥＡＧＫＦＫＫＡ
Ｇ
第１２ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異、Ｋ１８５Ｓ変異お
よびＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第１２ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｋ１８５
Ｓ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示さ
れる。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＤＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
ＫＡＩＤＦＴＰＧＴＭＬＧＳＶＳＧＥＬＧＬＲＫＹＬＥＳＮＧＨＴＬＶＶＴＳＤＫＤＧＰ
ＤＳＶＦＥＫＥＬＶＤＡＤＩＶＩＳＱＰＦＷＰＡＹＬＴＰＥＲＦＡＫＡＫＮＬＫＬＡＬＴ
ＡＧＩＧＳＤＨＶＤＬＱＳＡＩＤＲＧＶＴＶＡＥＶＴＹＣＮＳＩＳＶＡＥＨＶＶＭＭＩＬ
ＧＬＶＲＮＹＬＰＡＨＤＷＡＲＫＧＧＷＮＩＡＤＣＶＳＨＳＹＤＬＥＡＭＳＶＧＴＶＡＡ
ＧＲＩＧＬＡＶＬＲＲＬＡＰＦＤＶＫＬＨＹＴＤＲＨＲＬＰＥＳＶＥＫＥＬＮＬＴＷＨＡ
ＳＰＴＤＭＹＰＨＣＤＶＶＴＬＮＣＰＬＨＰＥＴＥＨＭＶＮＥＥＴＬＫＬＦＫＲＧＡＹＩ
ＶＮＴＡＲＧＫＬＣＤＲＤＡＩＡＲＡＬＥＮＧＴＬＡＧＹＡＧＤＶＷＦＰＱＰＡＰＡＤＨ
ＰＷＲＴＭＡＷＮＧＭＴＰＨＭＳＧＴＳＬＴＡＱＴＲＹＡＡＧＴＲＥＩＬＥＣＦＦＥＧＲ
ＰＩＲＤＥＹＬＩＶＱＧＧＮＬＡＧＴＧＡＨＳＹＳＫＧＮＡＴＧＧＳＥＥＡＧＫＦＫＫＡ
Ｇ
第１３ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＫ１８５Ｓ変異、Ｍ３３４Ｉ変異
およびＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第１３ギ酸脱水素酵素変異体（Ｋ１８５Ｓ／Ｍ３
３４Ｉ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に
示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＮＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
ＫＡＩＤＦＴＰＧＴＭＬＧＳＶＳＧＥＬＧＬＲＫＹＬＥＳＮＧＨＴＬＶＶＴＳＤＫＤＧＰ
ＤＳＶＦＥＫＥＬＶＤＡＤＩＶＩＳＱＰＦＷＰＡＹＬＴＰＥＲＦＡＫＡＫＮＬＫＬＡＬＴ
ＡＧＩＧＳＤＨＶＤＬＱＳＡＩＤＲＧＶＴＶＡＥＶＴＹＣＮＳＩＳＶＡＥＨＶＶＭＭＩＬ
ＧＬＶＲＮＹＬＰＡＨＤＷＡＲＫＧＧＷＮＩＡＤＣＶＳＨＳＹＤＬＥＡＭＳＶＧＴＶＡＡ
ＧＲＩＧＬＡＶＬＲＲＬＡＰＦＤＶＫＬＨＹＴＤＲＨＲＬＰＥＳＶＥＫＥＬＮＬＴＷＨＡ
ＳＰＴＤＭＹＰＨＣＤＶＶＴＬＮＣＰＬＨＰＥＴＥＨＭＶＮＥＥＴＬＫＬＦＫＲＧＡＹＩ
ＶＮＴＡＲＧＫＬＣＤＲＤＡＩＡＲＡＬＥＮＧＴＬＡＧＹＡＧＤＶＷＦＰＱＰＡＰＡＤＨ
ＰＷＲＴＭＡＷＮＧＭＴＰＨＩＳＧＴＳＬＴＡＱＴＲＹＡＡＧＴＲＥＩＬＥＣＦＦＥＧＲ
ＰＩＲＤＥＹＬＩＶＱＧＧＮＬＡＧＴＧＡＨＳＹＳＫＧＮＡＴＧＧＳＥＥＡＧＫＦＫＫＡ
Ｇ
第１４ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異、Ｍ３３４Ｉ変異お
よびＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第１４ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｍ３３４
Ｉ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示さ
れる。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＤＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
ＫＡＩＤＦＴＰＧＴＭＬＧＳＶＳＧＥＬＧＬＲＫＹＬＥＳＮＧＨＴＬＶＶＴＳＤＫＤＧＰ
ＤＳＶＦＥＫＥＬＶＤＡＤＩＶＩＳＱＰＦＷＰＡＹＬＴＰＥＲＦＡＫＡＫＮＬＫＬＡＬＴ
ＡＧＩＧＳＤＨＶＤＬＱＳＡＩＤＲＧＶＴＶＡＥＶＴＹＣＮＳＩＳＶＡＥＨＶＶＭＭＩＬ
ＧＬＶＲＮＹＬＰＡＨＤＷＡＲＫＧＧＷＮＩＡＤＣＶＫＨＳＹＤＬＥＡＭＳＶＧＴＶＡＡ
ＧＲＩＧＬＡＶＬＲＲＬＡＰＦＤＶＫＬＨＹＴＤＲＨＲＬＰＥＳＶＥＫＥＬＮＬＴＷＨＡ
ＳＰＴＤＭＹＰＨＣＤＶＶＴＬＮＣＰＬＨＰＥＴＥＨＭＶＮＥＥＴＬＫＬＦＫＲＧＡＹＩ
ＶＮＴＡＲＧＫＬＣＤＲＤＡＩＡＲＡＬＥＮＧＴＬＡＧＹＡＧＤＶＷＦＰＱＰＡＰＡＤＨ
ＰＷＲＴＭＡＷＮＧＭＴＰＨＩＳＧＴＳＬＴＡＱＴＲＹＡＡＧＴＲＥＩＬＥＣＦＦＥＧＲ
ＰＩＲＤＥＹＬＩＶＱＧＧＮＬＡＧＴＧＡＨＳＹＳＫＧＮＡＴＧＧＳＥＥＡＧＫＦＫＫＡ
Ｇ
第１５ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異、Ｋ１８５Ｓ変異、
Ｍ３３４Ｉ変異およびＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第１５ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ
２４Ｄ／Ｋ１８５Ｓ／Ｍ３３４Ｉ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＤＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
ＫＡＩＤＦＴＰＧＴＭＬＧＳＶＳＧＥＬＧＬＲＫＹＬＥＳＮＧＨＴＬＶＶＴＳＤＫＤＧＰ
ＤＳＶＦＥＫＥＬＶＤＡＤＩＶＩＳＱＰＦＷＰＡＹＬＴＰＥＲＦＡＫＡＫＮＬＫＬＡＬＴ
ＡＧＩＧＳＤＨＶＤＬＱＳＡＩＤＲＧＶＴＶＡＥＶＴＹＣＮＳＩＳＶＡＥＨＶＶＭＭＩＬ
ＧＬＶＲＮＹＬＰＡＨＤＷＡＲＫＧＧＷＮＩＡＤＣＶＳＨＳＹＤＬＥＡＭＳＶＧＴＶＡＡ
ＧＲＩＧＬＡＶＬＲＲＬＡＰＦＤＶＫＬＨＹＴＤＲＨＲＬＰＥＳＶＥＫＥＬＮＬＴＷＨＡ
ＳＰＴＤＭＹＰＨＣＤＶＶＴＬＮＣＰＬＨＰＥＴＥＨＭＶＮＥＥＴＬＫＬＦＫＲＧＡＹＩ
ＶＮＴＡＲＧＫＬＣＤＲＤＡＩＡＲＡＬＥＮＧＴＬＡＧＹＡＧＤＶＷＦＰＱＰＡＰＡＤＨ
ＰＷＲＴＭＡＷＮＧＭＴＰＨＩＳＧＴＳＬＴＡＱＴＲＹＡＡＧＴＲＥＩＬＥＣＦＦＥＧＲ
ＰＩＲＤＥＹＬＩＶＱＧＧＮＬＡＧＴＧＡＨＳＹＳＫＧＮＡＴＧＧＳＥＥＡＧＫＦＫＫＡ
Ｇ
実施例２：本出願の実施例は、実施例１中のギ酸脱水素酵素変異体をコードする核酸、上
記核酸をコードする発現ベクター、および上記発現ベクターを形質転換またはトランスフ
ェクタントする宿主細胞を提供する。
なお、本出願の実施例は、既に報告されているギ酸脱水素酵素の配列および構造情報を利
用し、ＮＣＢＩなどのデータベースから非冗長検索を行うことにより、タンパク質構造類
似性、保存部位分析および宿主源の多様性などの原則に基づいて、いくつかの潜在的な酵
素遺伝子をスクリーニングする。これらの遺伝子を大腸菌発現系で機能発現させ、その後
精製して精製ギ酸脱水素酵素変異体を得た。具体的に、上記ギ酸脱水素酵素遺伝子を半合
理的設計を用いた定向進化により形質転換し、ギ酸塩およびＮＡＤ＋を基質として触媒反
応を行いいて二酸化炭素およびＮＡＤＨを生成する高触媒活性のギ酸脱水素酵素変異体を
得、上記反応過程は図１に示される。
本出願の実施例では、上記核酸、上記核酸をコードする発現ベクター、および上記発現ベ
クターを形質転換またはトランスフェクタントする宿主細胞の構築過程は以下の通りであ
る。
ステップ１、実施例１中のギ酸脱水素酵素変異体をコードする核酸および上記核酸をコー
ドする発現ベクターを構築する。
本出願の実施例では、全プラスミドＰＣＲ法により、アンシロバクター・アクアティカス
（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のギ酸脱水素酵素野生型遺伝子（金
唯智（蘇州）公司によって合成されるもの）を遺伝子変異させ、標的変異遺伝子（すなわ
ち実施例１中のギ酸脱水素酵素変異体をコードする核酸）を得、ｐＥＴ２２ｂプラスミド
（すなわち上記核酸をコードする発現ベクター）上に構築した。ここで、アンシロバクタ
ー・アクアティカス（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ギ酸脱水素酵素
遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７
ＡＴＧＧＣＧＡＡＡＧＴＴＣＴＧＴＧＣＧＴＴＣＴＧＴＡＣＧＡＴＧＡＴＣＣＧＡＴＣＧ
ＡＴＧＧＴＴＡＣＣＣＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＣＧＣＧＴＧＡＣＡＡＣＣＴＧＣＣＧＡＡ
ＡＡＴＣＧＡＣＣＡＣＴＡＴＣＣＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＡＣＣＣＣＧ
ＡＡＡＧＣＧＡＴＣＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＣＧＧＧＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＧＴＴＣＴＧ
ＴＴＴＣＴＧＧＴＧＡＡＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＴＡＡＡＴＡＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＡＡ
ＣＧＧＴＣＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＡＣＣＴＣＴＧＡＴＡＡＡＧＡＴＧＧＴＣＣＧ
ＧＡＴＴＣＴＧＴＴＴＴＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＧＧＴＴＧＡＴＧＣＧＧＡＴＡＴＴＧ
ＴＴＡＴＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＴＴＣＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡ
ＡＣＧＣＴＴＣＧＣＴＡＡＡＧＣＴＡＡＡＡＡＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＣ
ＧＣＧＧＧＣＡＴＣＧＧＣＴＣＴＧＡＴＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＣＡＡ
ＴＴＧＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＴＡＣＣＧＴＴＧＣＧＧＡＡＧＴＧＡＣＣＴＡＣＴＧＣＡＡ
ＣＴＣＴＡＴＣＡＧＣＧＴＧＧＣＧＧＡＡＣＡＣＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＧ
ＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＧＴＡＡＣＴＡＣＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＡＣＧＡＣＴＧＧＧＣＧＣ
ＧＴＡＡＡＧＧＴＧＧＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＧＣＡＧＡＴＴＧＣＧＴＧＡＡＡＣＡＣＴＣ
ＴＴＡＣＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＧＴＡＣＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧ
ＧＧＣＣＧＣＡＴＣＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＧＴ
ＴＣＧＡＣＧＴＧＡＡＡＴＴＡＣＡＣＴＡＴＡＣＣＧＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＣＣＴＧＣＣ
ＧＧＡＡＡＧＣＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＧＣＡＣＧＣＴ
ＴＣＴＣＣＧＡＣＣＧＡＴＡＴＧＴＡＣＣＣＧＣＡＣＴＧＣＧＡＣＧＴＧＧＴＴＡＣＣＣ
ＴＧＡＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＣＧＧＡＡＡＣＣＧＡＡＣＡＣＡＴＧＧＴＴＡＡ
ＣＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＧＴＧＧＴＧＣＧＴＡＣＡＴＣ
ＧＴＴＡＡＣＡＣＣＧＣＧＣＧＴＧＧＴＡＡＡＣＴＧＴＧＣＧＡＣＣＧＴＧＡＴＧＣＧＡ
ＴＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＣＣＧＧＴＴＡＴＧＣ
ＧＧＧＣＧＡＴＧＴＴＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＡＴＣＡＣ
ＣＣＧＴＧＧＣＧＴＡＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＣＣＣＧＣＡＣＡ
ＴＧＡＧＣＧＧＣＡＣＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＣＧＣＡＧＡＣＣＣＧＴＴＡＴＧＣＴＧＣ
ＧＧＧＣＡＣＣＣＧＴＧＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＴＣＴＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＴ
ＣＣＧＡＴＣＣＧＴＧＡＴＧＡＡＴＡＣＣＴＧＡＴＣＧＴＴＣＡＧＧＧＣＧＧＴＡＡＣＣ
ＴＧＧＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＣＧＣＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＴＣＴＡＡＡＧＧＣＡＡＣＧＣ
ＴＡＣＣＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＧＴＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＣＧ
ＧＧＣＴＡＡＴＣＴＣＴＣ
上記アンシロバクター・アクアティカス（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓ）ギ酸脱水素酵素遺伝子には、Ａはアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）を表し、Ｔはチミン（
Ｔｈｙｍｉｎｅ）を表し、Ｃはシトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）を表し、Ｇはグアニン（Ｇ
ｕａｎｉｎｅ）を表し、
変異部位Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４ＩおよびＶ３７７Ｔのプライマーは表２に示さ
れる。
表２：Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４ＩおよびＶ３７７Ｔのプライマー表
以下、実施例１中のギ酸脱水素酵素変異体コードする標的変異遺伝子のプライマーを説明
する。
（１）Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４ＩおよびＶ３７７Ｔのいずれか１つによる変異に
よって得られたギ酸脱水素酵素変異体のプライマーは以下の通りである。
第１ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第１ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＮ２４Ｄに対応するプライマー（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）である。
第２ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第２ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＫ１８５Ｓに対応するプライマー（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）である。
第３ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第３ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＭ３３４Ｉに対応するプライマー（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）である。
第４ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第４ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＶ３７７Ｔに対応するプライマー（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）である。
（２）Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４ＩおよびＶ３７７Ｔのいずれか２つによる変異に
よって得られたギ酸脱水素酵素変異体のプライマーは以下の通りである。
第５ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第５ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＮ２４Ｄに対応するプライマーおよびＫ
１８５Ｓに対応するプライマーである。
第６ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第６ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＮ２４Ｄに対応するプライマーおよびＭ
３３４Ｉに対応するプライマーである。
第７ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第７ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＮ２４Ｄに対応するプライマーおよびＶ
３７７Ｔに対応するプライマーである。
第８ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第８ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＫ１８５Ｓに対応するプライマーおよび
Ｍ３３４Ｉに対応するプライマーである。
第９ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第９ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＫ１８５Ｓに対応するプライマーおよび
Ｖ３７７Ｔに対応するプライマーである。
第１０ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第１０ギ酸脱
水素酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＭ３３４Ｉに対応するプライマーお
よびＶ３７７Ｔに対応するプライマーである。
（３）Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４ＩおよびＶ３７７Ｔのいずれか３つによる変異に
よって得られたギ酸脱水素酵素変異体のプライマーは以下の通りである。
第１１ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第１１ギ酸脱
水素酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＮ２４Ｄに対応するプライマー、Ｋ
１８５Ｓに対応するプライマーおよびＭ３３４Ｉに対応するプライマーである。
第１２ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第１２ギ酸脱
水素酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＮ２４Ｄに対応するプライマー、Ｋ
１８５Ｓに対応するプライマーおよびＶ３７７Ｔに対応するプライマーである。
第１３ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第１３ギ酸脱
水素酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＫ１８５Ｓに対応するプライマー、
Ｍ３３４Ｉに対応するプライマーおよびＶ３７７Ｔに対応するプライマーである。
第１４ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第１４ギ酸脱
水素酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＮ２４Ｄに対応するプライマー、Ｍ
３３４Ｉに対応するプライマーおよびＶ３７７Ｔに対応するプライマーである。
（４）Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４ＩおよびＶ３７７Ｔの合計４つの変異によって得
られたギ酸脱水素酵素変異体のプライマー。
第１５ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第１５ギ酸脱
水素酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＮ２４Ｄに対応するプライマー、Ｋ
１８５Ｓに対応するプライマー、Ｍ３３４Ｉに対応するプライマーおよびＶ３７７Ｔに対
応するプライマーである。
上記全プラスミドＰＣＲのＰＣＲ反応系は、表３に示される。
表３：ＰＣＲ反応系表
上記全プラスミドＰＣＲのＰＣＲ反応程序は、表４に示される。
表４：ＰＣＲ反応程序表
標的断片のＰＣＲ増幅後、増幅生成物を０．９％アガロースゲル電気泳動で検出した結果
、増幅生成物はそれぞれ約６０００ｂｐの大きさの単一バンドである。ＤＮＡゲル回収精
製キットで増幅生成物を精製回収した。
最終的にそれぞれ第１ギ酸脱水素酵素変異体のｐＥＴ２２ｂプラスミド～第１５ギ酸脱水
素酵素変異体のｐＥＴ２２ｂプラスミドを得、すなわち、第１ギ酸脱水素酵素変異体の発
現ベクター、第２ギ酸脱水素酵素変異体の発現ベクター、第３ギ酸脱水素酵素変異体の発
現ベクター、第４ギ酸脱水素酵素変異体の発現ベクター、第５ギ酸脱水素酵素変異体の発
現ベクター、第６ギ酸脱水素酵素変異体の発現ベクター、第７ギ酸脱水素酵素変異体の発
現ベクター、第８ギ酸脱水素酵素変異体の発現ベクター、第９ギ酸脱水素酵素変異体の発
現ベクター、第１０ギ酸脱水素酵素変異体の発現ベクター、第１１ギ酸脱水素酵素変異体
の発現ベクター、第１２ギ酸脱水素酵素変異体の発現ベクター、第１３ギ酸脱水素酵素変
異体の発現ベクター、第１４ギ酸脱水素酵素変異体の発現ベクターおよび第１５ギ酸脱水
素酵素変異体の発現ベクターを得る。
ステップ２、上記発現ベクターを形質転換またはトランスフェクタントする宿主細胞を構
築する。
本出願の実施例では、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株（以下、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１
（ＤＥ３）と略称する）を発現宿主（すなわち宿主細胞）とし、塩基配列の解析に成功し
たｐＥＴ２２ｂプラスミドをＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフェクトし
、組換え変異発現菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２２ｂ-ＡｑＦＤＨを
構築する。
具体的に、精製後の遺伝子断片をＥａｓｙＣｕｔエンドヌクレアーゼ-ＤｐｎＩで消化し
てテンプレートを除去し、その後組換え酵素で組換えた。組換え生成物をＥ．ｃｏｌｉＤ
Ｈ５α受容体細胞に形質転換し、１００ ｇ／ｍＬアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ
）を含むＬＢ固体培地表面に塗布し、３７℃で１４ｈ培養し、シングルコロニーをＬＢ液
体培養に摘出し、３７℃、２２０ｒｐｍで１６ｈ振とう培養した。培養後、一部の菌液に
減菌グリセロールをグリセロール最終濃度が２５％になるように加えた後、番号付け、８
０℃で保存して用意し、組換え変異プラスミドクローン菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α／ｐ
ＥＴ２２ｂ-ＡｑＦＤＨを得、一部の菌液を８,０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞
を回収し、高純度プラスミドミニ抽出キットを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α／ｐＥＴ２
２ｂ-ＡｑＦＤＨからプラスミドを抽出し、シークエンスにより変異部位の正しさを確認
した。
最終的に、それぞれ第１ギ酸脱水素酵素変異体の組換え変異プラスミドクローン菌株～第
１５ギ酸脱水素酵素変異体の組換え変異プラスミドクローン菌株および対応の組換え変異
プラスミドを得、すなわち、それぞれ第１ギ酸脱水素酵素変異体をトランスフェクタント
する発現ベクターの宿主細胞、第２ギ酸脱水素酵素変異体をトランスフェクタントする発
現ベクターの宿主細胞、第３ギ酸脱水素酵素変異体をトランスフェクタントする発現ベク
ターの宿主細胞、第４ギ酸脱水素酵素変異体をトランスフェクタントする発現ベクターの
宿主細胞、第５ギ酸脱水素酵素変異体をトランスフェクタントする発現ベクターの宿主細
胞、第６ギ酸脱水素酵素変異体をトランスフェクタントする発現ベクターの宿主細胞、第
７ギ酸脱水素酵素変異体をトランスフェクタントする発現ベクターの宿主細胞、第８ギ酸
脱水素酵素変異体をトランスフェクタントする発現ベクターの宿主細胞、第９ギ酸脱水素
酵素変異体をトランスフェクタントする発現ベクターの宿主細胞、第１０ギ酸脱水素酵素
変異体をトランスフェクタントする発現ベクターの宿主細胞、第１１ギ酸脱水素酵素変異
体をトランスフェクタントする発現ベクターの宿主細胞、第１２ギ酸脱水素酵素変異体を
トランスフェクタントする発現ベクターの宿主細胞、第１３ギ酸脱水素酵素変異体をトラ
ンスフェクタントする発現ベクターの宿主細胞、第１４ギ酸脱水素酵素変異体をトランス
フェクタントする発現ベクターの宿主細胞および第１５ギ酸脱水素酵素変異体をトランス
フェクタントする発現ベクターの宿主細胞を得る。
本出願の実施例は、上記第１５ギ酸脱水素酵素変異体をトランスフェクタントする発現ベ
クターの宿主細胞（以下、エシェリヒア・コリ（大腸菌）ＮＪＵＸＲ-ＦＸ-１と称する）
を保存する。上記エシェリヒア・コリ（大腸菌）ＮＪＵＸＲ-ＦＸ-１は、中国典型培養物
保存センターに保存され、保存地は中国．武漢．武漢大学であり、保存日は２０２５年０
１月１３日であり、保存ユニットから付与された保存番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０
２５１０１であり、上記エシェリヒア・コリ（大腸菌）ＮＪＵＸＲ-ＦＸ-１（生物材料と
も呼ばれる）の分類学的名称はエシェリヒア・コリ（大腸菌）ＮＪＵＸＲ-ＦＸ-１であり
、この分類学的名称のラテン語名称はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＪＵＸＲ-
ＦＸ-１である。
実施例３：本実施例に記載の上記ギ酸脱水素酵素変異体の調製方法は、組換え変異タンパ
ク質発現菌株を構築し、ギ酸脱水素酵素変異体を含む培養物を得ることを含む。
本出願の実施例では、塩基配列の解析に成功したｐＥＴ２２ｂプラスミドをＥ． ｃｏｌ
ｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に発現宿主（すなわち宿主細胞）としてトランスフェクタントし
、組換え変異タンパク質発現菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２２ｂ-Ａ
ｑＦＤＨを構築した。
以下、上記調製方法を詳細に説明する。
構築に成功した組換え変異プラスミドをＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）受容体細胞
に形質転換し、最終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンプレートに塗布し、シングルコ
ロニーを摘出して１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有の５ｍＬのＬＢ液体培地の培養管に
接種し、３７℃、２２０ｒｐｍ条件下で１６ｈ振とう培養し、組換え変異タンパク質発現
菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２２ｂ-ＡｑＦＤＨを得た。３ｍＬの接
種量で１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有の５００ｍＬの抗性ＬＢ培地に移し、ＯＤ６０
０が約０．６に達した時点で１ｍＬの０．５ ＭのＩＰＴＧ（すなわちイソプロピル-β-
Ｄ-チオガラクトピラノシド）を加え、ＩＰＴＧの最終濃度を０．５ｍＭとし、１８℃条
件下で約１６ｈ誘導し、ギ酸脱水素酵素変異体を含む培養物を得た。
最終的にそれぞれ第１ギ酸脱水素酵素変異体を含む培養物～第１５ギ酸脱水素酵素変異体
を含む培養物を得た。
誘導後、遠心分離して菌体を得、緩衝液で再懸濁し、氷浴条件下で細胞を超音波破砕（５
ｓごとに２ｓ動作し、動作時間３０ｍｉｎ）、４℃、１２,０００ｒｐｍ／ｍｉｎで２０
ｍｉｎ遠心分離した。上清を回収し、０．２２μｍ水性フィルターチップで濾過したもの
を検体とし、ニッケルカラムに供して酵素を精製した。ＡｑＦＤＨのアミノ酸配列から、
タンパク質のモル吸光係数を算出し、精製後のタンパク質をＡ２８０法によりタンパク質
の吸光度を測定することにより、タンパク質（野生型ギ酸脱水素酵素とギ酸脱水素酵素変
異体の総称）の濃度を算出することができる。
実施例４：本出願の実施例は、実施例１によって提供されるギ酸脱水素酵素変異体、実施
例２によって提供されるギ酸脱水素酵素変異体の核酸、実施例２によって提供される核酸
の発現ベクター、実施例２によって提供される宿主細胞または実施例３によって提供され
る調製方法により調製された培養物の、酸化型補酵素Iを還元型補酵素Iに還元する触媒活
性の向上における用途を提供する。
一実施態様では、実施例３で得られた第１ギ酸脱水素酵素変異体を含む培養物～第１５ギ
酸脱水素酵素変異体を含む培養物から、ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元触媒する触媒を得、上
記触媒は全細胞または純粋な酵素溶液であってもよい。
一適用シナリオでは、第３ギ酸脱水素酵素変異体（Ｍ３３４Ｉ変異体とも呼ばれる）、第
８ギ酸脱水素酵素変異体（Ｋ１８５Ｓ／Ｍ３３４Ｉ変異体とも呼ばれる）、第６ギ酸脱水
素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｍ３３４Ｉ変異体とも呼ばれる）、第１２ギ酸脱水素酵素変異
体（Ｎ２４Ｄ／Ｋ１８５Ｓ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる）および第１５ギ酸脱水素酵
素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｋ１８５Ｓ／Ｍ３３４Ｉ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる）を例に
取ると、ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元触媒する反応系は以下の通りであり：最終濃度０．０
０５ｍｇ／ｍｌギ酸脱水素酵素変異体またはＯＤ６００＝０．１の組換え変異発現菌株の
全細胞菌液、１ｍＭ ＮＡＤ＋、５ｍＭ ＨＣＯＯＮａ、反応緩衝液は１００ｍＭ、ｐＨ
＝７のリン酸二水素カリウム／リン酸水素二カリウム緩衝液である。１０ｍｉｎ反応後、
酵素マーカーで生成物ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸光値変化を測定し、相対活性を比
較した結果が、図２に示され、野生型ギ酸脱水素酵素（図２中のａｑＦＤＨ（ＷＴ）に対
応）と比較すると、第３ギ酸脱水素酵素変異体、第８ギ酸脱水素酵素変異体、第６ギ酸脱
水素酵素変異体、第１２ギ酸脱水素酵素変異体および第１５ギ酸脱水素酵素変異体では、
ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元触媒する効率が著しく向上した。
ここで、全細胞菌液を介して触媒反応を行った結果が、表５に示される。ギ酸脱水素酵素
変異体の純粋な酵素溶液を介して触媒反応を行った結果が、表６に示される。
表５：全細胞菌液の触媒反応結果表
表６：ギ酸脱水素酵素変異体の触媒反応結果表
表５および表６から分かるように、変異体の触媒形質転換率はいずれも野生型ギ酸脱水素
酵素よりも高かった。特に、第１５ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｋ１８４Ｓ／Ｍ３
３４Ｉ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる）の触媒効率は、野生型ギ酸脱水素酵素触媒効率
の１．５倍であった。以上のことから、本出願の実施例により得られたギ酸脱水素酵素変
異体は、ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元触媒する活性が野生型ギ酸脱水素酵素よりも高いため
、ＮＡＤＨ再生循環系に依存する高付加価値化学品の生産効率を向上させ、上記高付加価
値化学品の生産コストを低減することができる。
さらに、上記触媒反応の触媒条件を議論する。
（１）ギ酸脱水素酵素変異体がＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元触媒する際の好ましい温度を決
定する。
実施例２で得られたギ酸脱水素酵素変異体の全細胞または純粋な酵素溶液を触媒として、
ギ酸脱水素酵素変異体がＮＡＤ＋をＮＡＤＨに触媒還元する触媒反応の好ましい温度を調
べた。
第１５ギ酸脱水素酵素変異体を例に取ると、反応系は以下の通りであり：最終濃度０．０
０５ｍｇ／ｍｌタンパク質またはＯＤ６００＝０．１の全細胞菌液、１ｍＭ ＮＡＤ+、
５ｍＭ ＨＣＯＯＮａ、反応緩衝液は１００ｍＭ、ｐＨ＝７のリン酸二水素カリウム／リ
ン酸水素二カリウム緩衝液である。水浴により反応温度を２０℃、２５℃、３０℃、３５
℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃に制御し、酵素マーカーで生成物ＮＡＤＨの３４０
ｎｍにおける吸光値を検出し、相対活性を比較した結果が図３に示され、５０℃で、最適
な触媒効果が観察され、２５～５５℃の範囲内で酵素活性がいずれも良好であった。実験
によると、温度の違いが異なる変異体の触媒作用に大きな影響を及ぼし、その反応活性は
温度の変化によって正規分布に偏る傾向があることが示された。５０℃で、最適な触媒効
果が観察され、この温度から外れると、酵素活性が相対的に低かった。
（１）ギ酸脱水素酵素変異体がＮＡＤ＋をＮＡＤＨに触媒還元する際の好ましいｐＨ値を
決定する。
実施例２で得られたギ酸脱水素酵素変異体の全細胞または純粋な酵素溶液を触媒として、
ギ酸脱水素酵素変異体がＮＡＤ＋をＮＡＤＨに触媒還元する触媒反応の好ましいｐＨ値を
調べた。
具体的に、第１５ギ酸脱水素酵素変異体を例に取ると、上記触媒反応の反応系は以下の通
りであり：最終濃度ＯＤ６００＝０．１の全細胞菌液、１ｍＭ ＮＡＤ+、５ｍＭ ＨＣ
ＯＯＮａ、反応緩衝液は１００ｍＭ、ｐＨ＝７のリン酸二水素カリウム／リン酸水素二カ
リウム緩衝液である。反応緩衝溶液は異なるｐＨの緩衝液であり、すなわち、ｐＨがそれ
ぞれ６、６．５、７、７．５、８である１００ｍＭリン酸二水素カリウム／リン酸水素二
カリウム緩衝液（ＫＰｉ）であり、ｐＨがそれぞれ８、８．５、９、９．５の１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液であり、ｐＨが１０．２５であるグリシン-水酸化ナトリウム（
Ｇｌｙ-ＮａＯＨ）緩衝液である。反応温度を３０℃に制御し、酵素マーカーで生成物Ｎ
ＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸光値を検出し、相対活性を比較した結果が図４に示され、
異なるｐＨがギ酸脱水素酵素の触媒作用に及ぼす影響が小さい。ｐＨが９．５である場合
、最適な触媒効果が観察された。
実験による、異なる緩衝溶液が酵素の活性に及ぼす影響が異なり、リン酸二水素カリウム
／リン酸水素二カリウム緩衝液を反応系とすると、酵素の活性が高いレベルに保持され、
Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液を反応系とすると、ｐＨ＝９．５の場合、野生型酵素と変異体活
性が最大値になる。
（２）ギ酸脱水素酵素変異体がＮＡＤ＋をＮＡＤＨに触媒還元する際の好ましい速度論的
パラメータを決定する。
上記触媒反応の反応系を基に、野生型ギ酸脱水素酵素およびその変異体のＮＡＤＨ濃度を
変えた場合の反応速度を求め、反応速度と基質濃度の逆数から二重逆グラフ法により速度
論的パラメータを算出し、結果が表７に示され、野生型ギ酸脱水素酵素と比較すると、第
１５ギ酸脱水素酵素変異体Ｋｍが減少し、Ｋｃａｔが増加し、変異体触媒活性が有意に上
昇したことが示された。
表７：速度論的パラメータ表
注：Ｋｍは、ミカエリス定数（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ ｃｏｎｓｔａｎｔ）であり、ｒは反
応速度（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ）であり、Ｋｃａｔは触媒定数である。
＜微生物の寄託の受託証の写し＞
［配列表］
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tttctggtgaactgggcctgcgtaaatacctggaaagcaacggtcacaccctggttgttacctctgataaagatggtccg
gattctgttttcgaaaaagaattggttgatgcggatattgttatcagccagccgttctggccggcttacctgaccccgga
acgcttcgctaaagctaaaaacctgaaactggctctgaccgcgggcatcggctctgatcacgttgacctgcaaagcgcaa
ttgatcgtggtgttaccgttgcggaagtgacctactgcaactctatcagcgtggcggaacacgttgtgatgatgatcctg
ggcctggttcgtaactacctgccggcgcacgactgggcgcgtaaaggtggctggaacatcgcagattgcgtgaaacactc
ttacgatctggaagcgatgtctgttggtactgtggcggcgggccgcatcggtctggcggtgctgcgccgcctggctccgt
tcgacgtgaaattacactataccgaccgtcaccgcctgccggaaagcgttgaaaaagaactgaacctgacctggcacgct
tctccgaccgatatgtacccgcactgcgacgtggttaccctgaactgcccgctgcacccggaaaccgaacacatggttaa
cgaagaaaccctgaaactgttcaaacgtggtgcgtacatcgttaacaccgcgcgtggtaaactgtgcgaccgtgatgcga
tcgcgcgcgcgctggaaaacggcaccctggccggttatgcgggcgatgtttggttcccgcagccggcgccggctgatcac
ccgtggcgtactatggcatggaacggcatgaccccgcacatgagcggcactagcctgaccgcgcagacccgttatgctgc
gggcacccgtgaaatcctggaatgcttctttgaaggccgtccgatccgtgatgaatacctgatcgttcagggcggtaacc
tggcgggtgttggcgcacacagctactctaaaggcaacgctaccggtggttctgaagaagcgggtaaatttaaaaaagcg
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ロジー分野に関し、ギ酸脱水素酵素変異体触媒により、酸化型補酵素I（Ｏｘｄｉｚｅｄ
ｆｏｒｍ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ、ＮＡＤ＋）を還元型補酵素I（Ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｏｒｍ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎ
ａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＮＡＤＨ）に還元することが
できる。
既存のギ酸脱水素酵素（Ｆｏｒｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＦＤＨ）介入に
よるＮＡＤＨ再生活性が低く、その結果、ＮＡＤＨ再生循環系に依存する高付加価値化学
品の生産効率が低下し、生産コストが高いという背景技術の問題を解決するために、本出
願の実施例は、ギ酸脱水素酵素変異体およびその用途を提供し、このギ酸脱水素酵素変異
体は高触媒活性の酵素として、ギ酸塩およびＮＡＤ＋を基質として反応を効率的に触媒し
て二酸化炭素およびＮＡＤＨを生成することができ、ＮＡＤＨ再生循環系に依存する高付
加価値化学品の生産効率の低下を改善し、その生産コストを低減することができる。
本出願の実施例では、用語「野生型」とは、天然に存在する供給源から単離された遺伝子
または遺伝子生成物を指す。野生型遺伝子は、集団において最も一般的に観察される遺伝
子を指し、したがって、遺伝子の「正常型」または「野生型」形態であるように任意に設
計される。逆に、用語「修飾された」、「変異体」または「バリアント」とは、野生型遺
伝子または遺伝子生成物と比較して、配列修飾（例えば、置換、切断または挿入）、翻訳
後修飾および／または機能的特性（例えば、変化した特性）を示す遺伝子または遺伝子生
成物を指す。また、天然に存在する変異体が単離され得ることに留意されたく、それらの
変異体は、野生型遺伝子または遺伝子生成物と比較して変化した特性を有するという事実
によって同定される。天然に存在する、天然に存在しないアミノ酸を導入または置換する
方法は本分野でより知られている。
本出願の実施例では、かかる一般的なアミノ酸の関連情報は表１に示される。なお、本出
願の実施例は、すべてのアミノ酸の関連情報を与えるものではなく、表１以外の他のアミ
ノ酸が存在する場合に、他の既存品を参照して他のアミノ酸の関連情報を得ることができ
ることを理解されたい。
表１：一般的なアミノ酸の名称略号および対応の一文字記号
実施例１：本出願の実施例はギ酸脱水素酵素変異体を提供し、ギ酸脱水素酵素変異体のア
ミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列から
Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４Ｉ、Ｖ３７７Ｔの少なくとも１つによる変異によって得
られる。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は以下に示される。
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＮＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
ＫＡＩＤＦＴＰＧＴＭＬＧＳＶＳＧＥＬＧＬＲＫＹＬＥＳＮＧＨＴＬＶＶＴＳＤＫＤＧＰ
ＤＳＶＦＥＫＥＬＶＤＡＤＩＶＩＳＱＰＦＷＰＡＹＬＴＰＥＲＦＡＫＡＫＮＬＫＬＡＬＴ
ＡＧＩＧＳＤＨＶＤＬＱＳＡＩＤＲＧＶＴＶＡＥＶＴＹＣＮＳＩＳＶＡＥＨＶＶＭＭＩＬ
ＧＬＶＲＮＹＬＰＡＨＤＷＡＲＫＧＧＷＮＩＡＤＣＶＫＨＳＹＤＬＥＡＭＳＶＧＴＶＡＡ
ＧＲＩＧＬＡＶＬＲＲＬＡＰＦＤＶＫＬＨＹＴＤＲＨＲＬＰＥＳＶＥＫＥＬＮＬＴＷＨＡ
ＳＰＴＤＭＹＰＨＣＤＶＶＴＬＮＣＰＬＨＰＥＴＥＨＭＶＮＥＥＴＬＫＬＦＫＲＧＡＹＩ
ＶＮＴＡＲＧＫＬＣＤＲＤＡＩＡＲＡＬＥＮＧＴＬＡＧＹＡＧＤＶＷＦＰＱＰＡＰＡＤＨ
ＰＷＲＴＭＡＷＮＧＭＴＰＨＭＳＧＴＳＬＴＡＱＴＲＹＡＡＧＴＲＥＩＬＥＣＦＦＥＧＲ
ＰＩＲＤＥＹＬＩＶＱＧＧＮＬＡＧＶＧＡＨＳＹＳＫＧＮＡＴＧＧＳＥＥＡＧＫＦＫＫＡ
Ｇ
ここで、Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４ＩおよびＶ３７７Ｔはいずれもアミノ酸の標準
的な一文字コードの標準的な置換表記を採用する。
上記Ｎ２４Ｄは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列を
指し、そのＮ末端の第２４位のアスパラギン（Ｎ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換される
。
上記Ｋ１８５Ｓは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列
を指し、そのＮ末端の第１８５位のリジン（Ｋ）がセリン（Ｓ）に置換される。
上記Ｍ３３４Ｉは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列
を指し、そのＮ末端の第３３４位のメチオニン（Ｍ）がイソロイシン（Ｉ）に置換される
。
上記Ｖ３７７Ｔは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列
を指し、そのＮ末端の第３７７位のバリン（Ｖ）がスレオニン（Ｔ）に置換される。
第１態様の実施態様において、Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４Ｉ、Ｖ３７７Ｔの少なく
とも１つによる変異によって得られたギ酸脱水素酵素変異体は以下のものであり得：
第１ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異によって得られ、第１
ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＤＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
ＫＡＩＤＦＴＰＧＴＭＬＧＳＶＳＧＥＬＧＬＲＫＹＬＥＳＮＧＨＴＬＶＶＴＳＤＫＤＧＰ
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ＡＧＩＧＳＤＨＶＤＬＱＳＡＩＤＲＧＶＴＶＡＥＶＴＹＣＮＳＩＳＶＡＥＨＶＶＭＭＩＬ
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Ｇ
第２ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＫ１８５Ｓ変異によって得られ、第
２ギ酸脱水素酵素変異体（Ｋ１８５Ｓ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：３に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
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第３ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＭ３３４Ｉ変異によって得られ、第
３ギ酸脱水素酵素変異体（Ｍ３３４Ｉ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：４に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
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第４ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第
４ギ酸脱水素酵素変異体（Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：５に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
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第５ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異およびＫ１８５Ｓ変異
によって得られ、第５ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｋ１８５Ｓ変異体とも呼ばれる
）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
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第６ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異およびＭ３３４Ｉ変異
によって得られ、第６ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｍ３３４Ｉ変異体とも呼ばれる
）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
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第７ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異およびＶ３７７Ｔ変異
によって得られ、第７ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる
）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
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第８ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＫ１８５Ｓ変異およびＭ３３４Ｉ変
異によって得られ、第８ギ酸脱水素酵素変異体（Ｋ１８５Ｓ／Ｍ３３４Ｉ変異体とも呼ば
れる）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９
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第９ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＫ１８５Ｓ変異およびＶ３７７Ｔ変
異によって得られ、第９ギ酸脱水素酵素変異体（Ｋ１８５Ｓ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ば
れる）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０
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第１０ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＭ３３４Ｉ変異およびＶ３７７Ｔ
変異によって得られ、第１０ギ酸脱水素酵素変異体（Ｍ３３４Ｉ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも
呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１
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第１１ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異、Ｋ１８５Ｓ変異お
よびＭ３３４Ｉ変異によって得られ、第１１ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｋ１８５
Ｓ／Ｍ３３４Ｉ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示さ
れる。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＤＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
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第１２ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異、Ｋ１８５Ｓ変異お
よびＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第１２ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｋ１８５
Ｓ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示さ
れる。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＤＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
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第１３ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＫ１８５Ｓ変異、Ｍ３３４Ｉ変異
およびＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第１３ギ酸脱水素酵素変異体（Ｋ１８５Ｓ／Ｍ３
３４Ｉ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に
示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＮＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
ＫＡＩＤＦＴＰＧＴＭＬＧＳＶＳＧＥＬＧＬＲＫＹＬＥＳＮＧＨＴＬＶＶＴＳＤＫＤＧＰ
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ＧＬＶＲＮＹＬＰＡＨＤＷＡＲＫＧＧＷＮＩＡＤＣＶＳＨＳＹＤＬＥＡＭＳＶＧＴＶＡＡ
ＧＲＩＧＬＡＶＬＲＲＬＡＰＦＤＶＫＬＨＹＴＤＲＨＲＬＰＥＳＶＥＫＥＬＮＬＴＷＨＡ
ＳＰＴＤＭＹＰＨＣＤＶＶＴＬＮＣＰＬＨＰＥＴＥＨＭＶＮＥＥＴＬＫＬＦＫＲＧＡＹＩ
ＶＮＴＡＲＧＫＬＣＤＲＤＡＩＡＲＡＬＥＮＧＴＬＡＧＹＡＧＤＶＷＦＰＱＰＡＰＡＤＨ
ＰＷＲＴＭＡＷＮＧＭＴＰＨＩＳＧＴＳＬＴＡＱＴＲＹＡＡＧＴＲＥＩＬＥＣＦＦＥＧＲ
ＰＩＲＤＥＹＬＩＶＱＧＧＮＬＡＧＴＧＡＨＳＹＳＫＧＮＡＴＧＧＳＥＥＡＧＫＦＫＫＡ
Ｇ
第１４ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異、Ｍ３３４Ｉ変異お
よびＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第１４ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｍ３３４
Ｉ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示さ
れる。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＤＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
ＫＡＩＤＦＴＰＧＴＭＬＧＳＶＳＧＥＬＧＬＲＫＹＬＥＳＮＧＨＴＬＶＶＴＳＤＫＤＧＰ
ＤＳＶＦＥＫＥＬＶＤＡＤＩＶＩＳＱＰＦＷＰＡＹＬＴＰＥＲＦＡＫＡＫＮＬＫＬＡＬＴ
ＡＧＩＧＳＤＨＶＤＬＱＳＡＩＤＲＧＶＴＶＡＥＶＴＹＣＮＳＩＳＶＡＥＨＶＶＭＭＩＬ
ＧＬＶＲＮＹＬＰＡＨＤＷＡＲＫＧＧＷＮＩＡＤＣＶＫＨＳＹＤＬＥＡＭＳＶＧＴＶＡＡ
ＧＲＩＧＬＡＶＬＲＲＬＡＰＦＤＶＫＬＨＹＴＤＲＨＲＬＰＥＳＶＥＫＥＬＮＬＴＷＨＡ
ＳＰＴＤＭＹＰＨＣＤＶＶＴＬＮＣＰＬＨＰＥＴＥＨＭＶＮＥＥＴＬＫＬＦＫＲＧＡＹＩ
ＶＮＴＡＲＧＫＬＣＤＲＤＡＩＡＲＡＬＥＮＧＴＬＡＧＹＡＧＤＶＷＦＰＱＰＡＰＡＤＨ
ＰＷＲＴＭＡＷＮＧＭＴＰＨＩＳＧＴＳＬＴＡＱＴＲＹＡＡＧＴＲＥＩＬＥＣＦＦＥＧＲ
ＰＩＲＤＥＹＬＩＶＱＧＧＮＬＡＧＴＧＡＨＳＹＳＫＧＮＡＴＧＧＳＥＥＡＧＫＦＫＫＡ
Ｇ
第１５ギ酸脱水素酵素変異体、ギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ変異、Ｋ１８５Ｓ変異、
Ｍ３３４Ｉ変異およびＶ３７７Ｔ変異によって得られ、第１５ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ
２４Ｄ／Ｋ１８５Ｓ／Ｍ３３４Ｉ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる）のアミノ酸配列はＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６
ＭＡＫＶＬＣＶＬＹＤＤＰＩＤＧＹＰＴＴＹＡＲＤＤＬＰＫＩＤＨＹＰＧＧＱＴＬＰＴＰ
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Ｇ
実施例２：本出願の実施例は、実施例１中のギ酸脱水素酵素変異体をコードする核酸、上
記核酸をコードする発現ベクター、および上記発現ベクターを形質転換またはトランスフ
ェクタントする宿主細胞を提供する。
なお、本出願の実施例は、既に報告されているギ酸脱水素酵素の配列および構造情報を利
用し、ＮＣＢＩなどのデータベースから非冗長検索を行うことにより、タンパク質構造類
似性、保存部位分析および宿主源の多様性などの原則に基づいて、いくつかの潜在的な酵
素遺伝子をスクリーニングする。これらの遺伝子を大腸菌発現系で機能発現させ、その後
精製して精製ギ酸脱水素酵素変異体を得た。具体的に、上記ギ酸脱水素酵素遺伝子を半合
理的設計を用いた定向進化により形質転換し、ギ酸塩およびＮＡＤ＋を基質として触媒反
応を行いいて二酸化炭素およびＮＡＤＨを生成する高触媒活性のギ酸脱水素酵素変異体を
得、上記反応過程は図１に示される。
本出願の実施例では、上記核酸、上記核酸をコードする発現ベクター、および上記発現ベ
クターを形質転換またはトランスフェクタントする宿主細胞の構築過程は以下の通りであ
る。
ステップ１、実施例１中のギ酸脱水素酵素変異体をコードする核酸および上記核酸をコー
ドする発現ベクターを構築する。
本出願の実施例では、全プラスミドＰＣＲ法により、アンシロバクター・アクアティカス
（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のギ酸脱水素酵素野生型遺伝子（金
唯智（蘇州）公司によって合成されるもの）を遺伝子変異させ、標的変異遺伝子（すなわ
ち実施例１中のギ酸脱水素酵素変異体をコードする核酸）を得、ｐＥＴ２２ｂプラスミド
（すなわち上記核酸をコードする発現ベクター）上に構築した。ここで、アンシロバクタ
ー・アクアティカス（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ギ酸脱水素酵素
遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７
ＡＴＧＧＣＧＡＡＡＧＴＴＣＴＧＴＧＣＧＴＴＣＴＧＴＡＣＧＡＴＧＡＴＣＣＧＡＴＣＧ
ＡＴＧＧＴＴＡＣＣＣＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＣＧＣＧＴＧＡＣＡＡＣＣＴＧＣＣＧＡＡ
ＡＡＴＣＧＡＣＣＡＣＴＡＴＣＣＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＡＣＣＣＣＧ
ＡＡＡＧＣＧＡＴＣＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＣＧＧＧＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＧＴＴＣＴＧ
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ＧＧＧＣＡＣＣＣＧＴＧＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＴＣＴＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＴ
ＣＣＧＡＴＣＣＧＴＧＡＴＧＡＡＴＡＣＣＴＧＡＴＣＧＴＴＣＡＧＧＧＣＧＧＴＡＡＣＣ
ＴＧＧＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＣＧＣＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＴＣＴＡＡＡＧＧＣＡＡＣＧＣ
ＴＡＣＣＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＧＴＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＣＧ
ＧＧＣＴＡＡＴＣＴＣＴＣ
上記アンシロバクター・アクアティカス（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓ）ギ酸脱水素酵素遺伝子には、Ａはアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）を表し、Ｔはチミン（
Ｔｈｙｍｉｎｅ）を表し、Ｃはシトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）を表し、Ｇはグアニン（Ｇ
ｕａｎｉｎｅ）を表し、
変異部位Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４ＩおよびＶ３７７Ｔのプライマーは表２に示さ
れる。
表２：Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４ＩおよびＶ３７７Ｔのプライマー表
以下、実施例１中のギ酸脱水素酵素変異体コードする標的変異遺伝子のプライマーを説明
する。
（１）Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４ＩおよびＶ３７７Ｔのいずれか１つによる変異に
よって得られたギ酸脱水素酵素変異体のプライマーは以下の通りである。
第１ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第１ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＮ２４Ｄに対応するプライマー（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）である。
第２ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第２ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＫ１８５Ｓに対応するプライマー（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）である。
第３ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第３ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＭ３３４Ｉに対応するプライマー（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）である。
第４ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第４ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＶ３７７Ｔに対応するプライマー（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）である。
（２）Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４ＩおよびＶ３７７Ｔのいずれか２つによる変異に
よって得られたギ酸脱水素酵素変異体のプライマーは以下の通りである。
第５ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第５ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＮ２４Ｄに対応するプライマーおよびＫ
１８５Ｓに対応するプライマーである。
第６ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第６ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＮ２４Ｄに対応するプライマーおよびＭ
３３４Ｉに対応するプライマーである。
第７ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第７ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＮ２４Ｄに対応するプライマーおよびＶ
３７７Ｔに対応するプライマーである。
第８ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第８ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＫ１８５Ｓに対応するプライマーおよび
Ｍ３３４Ｉに対応するプライマーである。
第９ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第９ギ酸脱水素
酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＫ１８５Ｓに対応するプライマーおよび
Ｖ３７７Ｔに対応するプライマーである。
第１０ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第１０ギ酸脱
水素酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＭ３３４Ｉに対応するプライマーお
よびＶ３７７Ｔに対応するプライマーである。
（３）Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４ＩおよびＶ３７７Ｔのいずれか３つによる変異に
よって得られたギ酸脱水素酵素変異体のプライマーは以下の通りである。
第１１ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第１１ギ酸脱
水素酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＮ２４Ｄに対応するプライマー、Ｋ
１８５Ｓに対応するプライマーおよびＭ３３４Ｉに対応するプライマーである。
第１２ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第１２ギ酸脱
水素酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＮ２４Ｄに対応するプライマー、Ｋ
１８５Ｓに対応するプライマーおよびＶ３７７Ｔに対応するプライマーである。
第１３ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第１３ギ酸脱
水素酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＫ１８５Ｓに対応するプライマー、
Ｍ３３４Ｉに対応するプライマーおよびＶ３７７Ｔに対応するプライマーである。
第１４ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第１４ギ酸脱
水素酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＮ２４Ｄに対応するプライマー、Ｍ
３３４Ｉに対応するプライマーおよびＶ３７７Ｔに対応するプライマーである。
（４）Ｎ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４ＩおよびＶ３７７Ｔの合計４つの変異によって得
られたギ酸脱水素酵素変異体のプライマー。
第１５ギ酸脱水素酵素変異体をコードする標的変異遺伝子（すなわちコード第１５ギ酸脱
水素酵素変異体の核酸）について、そのプライマーはＮ２４Ｄに対応するプライマー、Ｋ
１８５Ｓに対応するプライマー、Ｍ３３４Ｉに対応するプライマーおよびＶ３７７Ｔに対
応するプライマーである。
上記全プラスミドＰＣＲのＰＣＲ反応系は、表３に示される。
表３：ＰＣＲ反応系表
上記全プラスミドＰＣＲのＰＣＲ反応程序は、表４に示される。
表４：ＰＣＲ反応程序表
標的断片のＰＣＲ増幅後、増幅生成物を０．９％アガロースゲル電気泳動で検出した結果
、増幅生成物はそれぞれ約６０００ｂｐの大きさの単一バンドである。ＤＮＡゲル回収精
製キットで増幅生成物を精製回収した。
最終的にそれぞれ第１ギ酸脱水素酵素変異体のｐＥＴ２２ｂプラスミド～第１５ギ酸脱水
素酵素変異体のｐＥＴ２２ｂプラスミドを得、すなわち、第１ギ酸脱水素酵素変異体の発
現ベクター、第２ギ酸脱水素酵素変異体の発現ベクター、第３ギ酸脱水素酵素変異体の発
現ベクター、第４ギ酸脱水素酵素変異体の発現ベクター、第５ギ酸脱水素酵素変異体の発
現ベクター、第６ギ酸脱水素酵素変異体の発現ベクター、第７ギ酸脱水素酵素変異体の発
現ベクター、第８ギ酸脱水素酵素変異体の発現ベクター、第９ギ酸脱水素酵素変異体の発
現ベクター、第１０ギ酸脱水素酵素変異体の発現ベクター、第１１ギ酸脱水素酵素変異体
の発現ベクター、第１２ギ酸脱水素酵素変異体の発現ベクター、第１３ギ酸脱水素酵素変
異体の発現ベクター、第１４ギ酸脱水素酵素変異体の発現ベクターおよび第１５ギ酸脱水
素酵素変異体の発現ベクターを得る。
ステップ２、上記発現ベクターを形質転換またはトランスフェクタントする宿主細胞を構
築する。
本出願の実施例では、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株（以下、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１
（ＤＥ３）と略称する）を発現宿主（すなわち宿主細胞）とし、塩基配列の解析に成功し
たｐＥＴ２２ｂプラスミドをＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフェクトし
、組換え変異発現菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２２ｂ-ＡｑＦＤＨを
構築する。
具体的に、精製後の遺伝子断片をＥａｓｙＣｕｔエンドヌクレアーゼ-ＤｐｎＩで消化し
てテンプレートを除去し、その後組換え酵素で組換えた。組換え生成物をＥ．ｃｏｌｉＤ
Ｈ５α受容体細胞に形質転換し、１００ ｇ／ｍＬアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ
）を含むＬＢ固体培地表面に塗布し、３７℃で１４ｈ培養し、シングルコロニーをＬＢ液
体培養に摘出し、３７℃、２２０ｒｐｍで１６ｈ振とう培養した。培養後、一部の菌液に
減菌グリセロールをグリセロール最終濃度が２５％になるように加えた後、番号付け、８
０℃で保存して用意し、組換え変異プラスミドクローン菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α／ｐ
ＥＴ２２ｂ-ＡｑＦＤＨを得、一部の菌液を８,０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞
を回収し、高純度プラスミドミニ抽出キットを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α／ｐＥＴ２
２ｂ-ＡｑＦＤＨからプラスミドを抽出し、シークエンスにより変異部位の正しさを確認
した。
最終的に、それぞれ第１ギ酸脱水素酵素変異体の組換え変異プラスミドクローン菌株～第
１５ギ酸脱水素酵素変異体の組換え変異プラスミドクローン菌株および対応の組換え変異
プラスミドを得、すなわち、それぞれ第１ギ酸脱水素酵素変異体をトランスフェクタント
する発現ベクターの宿主細胞、第２ギ酸脱水素酵素変異体をトランスフェクタントする発
現ベクターの宿主細胞、第３ギ酸脱水素酵素変異体をトランスフェクタントする発現ベク
ターの宿主細胞、第４ギ酸脱水素酵素変異体をトランスフェクタントする発現ベクターの
宿主細胞、第５ギ酸脱水素酵素変異体をトランスフェクタントする発現ベクターの宿主細
胞、第６ギ酸脱水素酵素変異体をトランスフェクタントする発現ベクターの宿主細胞、第
７ギ酸脱水素酵素変異体をトランスフェクタントする発現ベクターの宿主細胞、第８ギ酸
脱水素酵素変異体をトランスフェクタントする発現ベクターの宿主細胞、第９ギ酸脱水素
酵素変異体をトランスフェクタントする発現ベクターの宿主細胞、第１０ギ酸脱水素酵素
変異体をトランスフェクタントする発現ベクターの宿主細胞、第１１ギ酸脱水素酵素変異
体をトランスフェクタントする発現ベクターの宿主細胞、第１２ギ酸脱水素酵素変異体を
トランスフェクタントする発現ベクターの宿主細胞、第１３ギ酸脱水素酵素変異体をトラ
ンスフェクタントする発現ベクターの宿主細胞、第１４ギ酸脱水素酵素変異体をトランス
フェクタントする発現ベクターの宿主細胞および第１５ギ酸脱水素酵素変異体をトランス
フェクタントする発現ベクターの宿主細胞を得る。
本出願の実施例は、上記第１５ギ酸脱水素酵素変異体をトランスフェクタントする発現ベ
クターの宿主細胞（以下、エシェリヒア・コリ（大腸菌）ＮＪＵＸＲ-ＦＸ-１と称する）
を保存する。上記エシェリヒア・コリ（大腸菌）ＮＪＵＸＲ-ＦＸ-１は、中国典型培養物
保存センターに保存され、保存地は中国．武漢．武漢大学であり、保存日は２０２５年０
１月１３日であり、保存ユニットから付与された保存番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０
２５１０１であり、上記エシェリヒア・コリ（大腸菌）ＮＪＵＸＲ-ＦＸ-１（生物材料と
も呼ばれる）の分類学的名称はエシェリヒア・コリ（大腸菌）ＮＪＵＸＲ-ＦＸ-１であり
、この分類学的名称のラテン語名称はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＪＵＸＲ-
ＦＸ-１である。
実施例３：本実施例に記載の上記ギ酸脱水素酵素変異体の調製方法は、組換え変異タンパ
ク質発現菌株を構築し、ギ酸脱水素酵素変異体を含む培養物を得ることを含む。
本出願の実施例では、塩基配列の解析に成功したｐＥＴ２２ｂプラスミドをＥ． ｃｏｌ
ｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に発現宿主（すなわち宿主細胞）としてトランスフェクタントし
、組換え変異タンパク質発現菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２２ｂ-Ａ
ｑＦＤＨを構築した。
以下、上記調製方法を詳細に説明する。
構築に成功した組換え変異プラスミドをＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）受容体細胞
に形質転換し、最終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンプレートに塗布し、シングルコ
ロニーを摘出して１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有の５ｍＬのＬＢ液体培地の培養管に
接種し、３７℃、２２０ｒｐｍ条件下で１６ｈ振とう培養し、組換え変異タンパク質発現
菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２２ｂ-ＡｑＦＤＨを得た。３ｍＬの接
種量で１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有の５００ｍＬの抗性ＬＢ培地に移し、ＯＤ６０
０が約０．６に達した時点で１ｍＬの０．５ ＭのＩＰＴＧ（すなわちイソプロピル-β-
Ｄ-チオガラクトピラノシド）を加え、ＩＰＴＧの最終濃度を０．５ｍＭとし、１８℃条
件下で約１６ｈ誘導し、ギ酸脱水素酵素変異体を含む培養物を得た。
最終的にそれぞれ第１ギ酸脱水素酵素変異体を含む培養物～第１５ギ酸脱水素酵素変異体
を含む培養物を得た。
誘導後、遠心分離して菌体を得、緩衝液で再懸濁し、氷浴条件下で細胞を超音波破砕（５
ｓごとに２ｓ動作し、動作時間３０ｍｉｎ）、４℃、１２,０００ｒｐｍ／ｍｉｎで２０
ｍｉｎ遠心分離した。上清を回収し、０．２２μｍ水性フィルターチップで濾過したもの
を検体とし、ニッケルカラムに供して酵素を精製した。ＡｑＦＤＨのアミノ酸配列から、
タンパク質のモル吸光係数を算出し、精製後のタンパク質をＡ２８０法によりタンパク質
の吸光度を測定することにより、タンパク質（野生型ギ酸脱水素酵素とギ酸脱水素酵素変
異体の総称）の濃度を算出することができる。
実施例４：本出願の実施例は、実施例１によって提供されるギ酸脱水素酵素変異体、実施
例２によって提供されるギ酸脱水素酵素変異体の核酸、実施例２によって提供される核酸
の発現ベクター、実施例２によって提供される宿主細胞または実施例３によって提供され
る調製方法により調製された培養物の、酸化型補酵素Iを還元型補酵素Iに還元する触媒活
性の向上における用途を提供する。
一実施態様では、実施例３で得られた第１ギ酸脱水素酵素変異体を含む培養物～第１５ギ
酸脱水素酵素変異体を含む培養物から、ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元触媒する触媒を得、上
記触媒は全細胞または純粋な酵素溶液であってもよい。
一適用シナリオでは、第３ギ酸脱水素酵素変異体（Ｍ３３４Ｉ変異体とも呼ばれる）、第
８ギ酸脱水素酵素変異体（Ｋ１８５Ｓ／Ｍ３３４Ｉ変異体とも呼ばれる）、第６ギ酸脱水
素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｍ３３４Ｉ変異体とも呼ばれる）、第１２ギ酸脱水素酵素変異
体（Ｎ２４Ｄ／Ｋ１８５Ｓ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる）および第１５ギ酸脱水素酵
素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｋ１８５Ｓ／Ｍ３３４Ｉ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる）を例に
取ると、ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元触媒する反応系は以下の通りであり：最終濃度０．０
０５ｍｇ／ｍｌギ酸脱水素酵素変異体またはＯＤ６００＝０．１の組換え変異発現菌株の
全細胞菌液、１ｍＭ ＮＡＤ＋、５ｍＭ ＨＣＯＯＮａ、反応緩衝液は１００ｍＭ、ｐＨ
＝７のリン酸二水素カリウム／リン酸水素二カリウム緩衝液である。１０ｍｉｎ反応後、
酵素マーカーで生成物ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸光値変化を測定し、相対活性を比
較した結果が、図２に示され、野生型ギ酸脱水素酵素（図２中のａｑＦＤＨ（ＷＴ）に対
応）と比較すると、第３ギ酸脱水素酵素変異体、第８ギ酸脱水素酵素変異体、第６ギ酸脱
水素酵素変異体、第１２ギ酸脱水素酵素変異体および第１５ギ酸脱水素酵素変異体では、
ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元触媒する効率が著しく向上した。
ここで、全細胞菌液を介して触媒反応を行った結果が、表５に示される。ギ酸脱水素酵素
変異体の純粋な酵素溶液を介して触媒反応を行った結果が、表６に示される。
表５：全細胞菌液の触媒反応結果表
表６：ギ酸脱水素酵素変異体の触媒反応結果表
表５および表６から分かるように、変異体の触媒形質転換率はいずれも野生型ギ酸脱水素
酵素よりも高かった。特に、第１５ギ酸脱水素酵素変異体（Ｎ２４Ｄ／Ｋ１８４Ｓ／Ｍ３
３４Ｉ／Ｖ３７７Ｔ変異体とも呼ばれる）の触媒効率は、野生型ギ酸脱水素酵素触媒効率
の１．５倍であった。以上のことから、本出願の実施例により得られたギ酸脱水素酵素変
異体は、ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元触媒する活性が野生型ギ酸脱水素酵素よりも高いため
、ＮＡＤＨ再生循環系に依存する高付加価値化学品の生産効率を向上させ、上記高付加価
値化学品の生産コストを低減することができる。
さらに、上記触媒反応の触媒条件を議論する。
（１）ギ酸脱水素酵素変異体がＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元触媒する際の好ましい温度を決
定する。
実施例２で得られたギ酸脱水素酵素変異体の全細胞または純粋な酵素溶液を触媒として、
ギ酸脱水素酵素変異体がＮＡＤ＋をＮＡＤＨに触媒還元する触媒反応の好ましい温度を調
べた。
第１５ギ酸脱水素酵素変異体を例に取ると、反応系は以下の通りであり：最終濃度０．０
０５ｍｇ／ｍｌタンパク質またはＯＤ６００＝０．１の全細胞菌液、１ｍＭ ＮＡＤ+、
５ｍＭ ＨＣＯＯＮａ、反応緩衝液は１００ｍＭ、ｐＨ＝７のリン酸二水素カリウム／リ
ン酸水素二カリウム緩衝液である。水浴により反応温度を２０℃、２５℃、３０℃、３５
℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃に制御し、酵素マーカーで生成物ＮＡＤＨの３４０
ｎｍにおける吸光値を検出し、相対活性を比較した結果が図３に示され、５０℃で、最適
な触媒効果が観察され、２５～５５℃の範囲内で酵素活性がいずれも良好であった。実験
によると、温度の違いが異なる変異体の触媒作用に大きな影響を及ぼし、その反応活性は
温度の変化によって正規分布に偏る傾向があることが示された。５０℃で、最適な触媒効
果が観察され、この温度から外れると、酵素活性が相対的に低かった。
（１）ギ酸脱水素酵素変異体がＮＡＤ＋をＮＡＤＨに触媒還元する際の好ましいｐＨ値を
決定する。
実施例２で得られたギ酸脱水素酵素変異体の全細胞または純粋な酵素溶液を触媒として、
ギ酸脱水素酵素変異体がＮＡＤ＋をＮＡＤＨに触媒還元する触媒反応の好ましいｐＨ値を
調べた。
具体的に、第１５ギ酸脱水素酵素変異体を例に取ると、上記触媒反応の反応系は以下の通
りであり：最終濃度ＯＤ６００＝０．１の全細胞菌液、１ｍＭ ＮＡＤ+、５ｍＭ ＨＣ
ＯＯＮａ、反応緩衝液は１００ｍＭ、ｐＨ＝７のリン酸二水素カリウム／リン酸水素二カ
リウム緩衝液である。反応緩衝溶液は異なるｐＨの緩衝液であり、すなわち、ｐＨがそれ
ぞれ６、６．５、７、７．５、８である１００ｍＭリン酸二水素カリウム／リン酸水素二
カリウム緩衝液（ＫＰｉ）であり、ｐＨがそれぞれ８、８．５、９、９．５の１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液であり、ｐＨが１０．２５であるグリシン-水酸化ナトリウム（
Ｇｌｙ-ＮａＯＨ）緩衝液である。反応温度を３０℃に制御し、酵素マーカーで生成物Ｎ
ＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸光値を検出し、相対活性を比較した結果が図４に示され、
異なるｐＨがギ酸脱水素酵素の触媒作用に及ぼす影響が小さい。ｐＨが９．５である場合
、最適な触媒効果が観察された。
実験による、異なる緩衝溶液が酵素の活性に及ぼす影響が異なり、リン酸二水素カリウム
／リン酸水素二カリウム緩衝液を反応系とすると、酵素の活性が高いレベルに保持され、
Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液を反応系とすると、ｐＨ＝９．５の場合、野生型酵素と変異体活
性が最大値になる。
（２）ギ酸脱水素酵素変異体がＮＡＤ＋をＮＡＤＨに触媒還元する際の好ましい速度論的
パラメータを決定する。
上記触媒反応の反応系を基に、野生型ギ酸脱水素酵素およびその変異体のＮＡＤＨ濃度を
変えた場合の反応速度を求め、反応速度と基質濃度の逆数から二重逆グラフ法により速度
論的パラメータを算出し、結果が表７に示され、野生型ギ酸脱水素酵素と比較すると、第
１５ギ酸脱水素酵素変異体Ｋｍが減少し、Ｋｃａｔが増加し、変異体触媒活性が有意に上
昇したことが示された。
表７：速度論的パラメータ表
注：Ｋｍは、ミカエリス定数（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ ｃｏｎｓｔａｎｔ）であり、ｒは反
応速度（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ）であり、Ｋｃａｔは触媒定数である。
＜微生物の寄託の受託証の写し＞
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【0007】
【要約】 （修正有）
【課題】ＮＡＤＨを効率的に再生することにより、ＮＡＤＨ再生循環系に依存する高付加価値化学品の生産効率を向上させ、上記高付加価値化学品の生産コストを低減することができるギ酸脱水素酵素変異体およびその用途を提供する。
【解決手段】このギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列は、特定の配列に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４Ｉ、Ｖ３７７Ｔの少なくとも１つによる変異によって得られる。酸化型補酵素Ｉを還元型補酵素Ｉに還元する触媒活性を向上させることを目的とする。
【選択図】なし
【解決手段】このギ酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列は、特定の配列に示す野生型ギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列からＮ２４Ｄ、Ｋ１８５Ｓ、Ｍ３３４Ｉ、Ｖ３７７Ｔの少なくとも１つによる変異によって得られる。酸化型補酵素Ｉを還元型補酵素Ｉに還元する触媒活性を向上させることを目的とする。
【選択図】なし
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】