特許 7706131 血液試料中のリポ蛋白質の分析方法および分析装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-07-03

(45)【発行日】2025-07-11

(54)【発明の名称】血液試料中のリポ蛋白質の分析方法および分析装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 15/12 20240101AFI20250704BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20250704BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20250704BHJP

【ＦＩ】

G01N15/12 H

G01N33/483 E

G01N33/68

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2024102677

(22)【出願日】2024-06-26

【審査請求日】2024-09-18

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】390005175

【氏名又は名称】株式会社アドバンテスト

(73)【特許権者】

【識別番号】504013775

【氏名又は名称】学校法人 埼玉医科大学

(74)【代理人】

【識別番号】100105924

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 賢樹

(74)【代理人】

【識別番号】100109047

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 雄祐

(74)【代理人】

【識別番号】100109081

【弁理士】

【氏名又は名称】三木 友由

(74)【代理人】

【識別番号】100133215

【弁理士】

【氏名又は名称】真家 大樹

(72)【発明者】

【氏名】鷲津 信栄

(72)【発明者】

【氏名】井上 郁夫

(72)【発明者】

【氏名】竹中 康浩

【審査官】外川 敬之

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２００７／０２０２００８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２６０６３１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０２１－１１３７０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－１９８６８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１０－０４８７０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０２１－５０８０３６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ １５／１２

Ｇ０１Ｎ ３３／６８

Ｇ０１Ｎ ３３／４８３

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

血液試料中のリポ蛋白質の分析方法であって、
ポア径ｄが８０ｎｍ～１２０ｎｍであるポアを有するポアデバイスを用いた電気的検知帯法によって、前記血液試料に含まれるＬＤＬ（Low Density Lipoprotein）の粒径分布を測定し、
前記ポアデバイスのメンブレンの膜厚ｔを用いて前記ポアのアスペクト比をｔ／ｄとするとき、
１≦ｔ／ｄ＜２
を満たすことを特徴とする分析方法。

【請求項2】

血液試料中のリポ蛋白質の分析方法であって、
ポア径ｄが２μｍ～３μｍであるポアを有するポアデバイスを用いた電気的検知帯法によって、前記血液試料に含まれるカイロミクロンの粒径分布を測定し、
前記ポアデバイスのメンブレンの膜厚ｔを用いて前記ポアのアスペクト比をｔ／ｄとするとき、
１≦ｔ／ｄ＜２
を満たすことを特徴とする分析方法。

【請求項3】

前記血液試料は、血清を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の分析方法。

【請求項4】

血清をリン酸緩衝生理食塩水中に懸濁させ、前記血液試料を作製することを特徴とする請求項１または２に記載の分析方法。

【請求項5】

前記血液試料は、遠心分離処理後の血液を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の分析方法。

【請求項6】

血液試料の分析装置であって、
ポア径ｄが８０ｎｍ～１２０ｎｍであるポアを介して区画される第１室と第２室と、前記第１室に設けられた第１電極および前記第２室に設けられた第２電極と、を有し、前記血液試料を収容するポアデバイスと、
前記第１電極と前記第２電極の間に流れる電流を測定する計測装置と、
前記計測装置が測定した電流にもとづいて、前記血液試料中に含まれるＬＤＬ（Low Density Lipoprotein）の粒径分布を生成する処理装置と、
を備え、
前記ポアデバイスのメンブレンの膜厚ｔを用いて、前記ポアのアスペクト比をｔ／ｄとするとき、
１≦ｔ／ｄ＜２
を満たすことを特徴とする分析装置。

【請求項7】

血液試料の分析装置であって、
ポア径ｄが２μｍ～３μｍであるポアを介して区画される第１室と第２室と、前記第１室に設けられた第１電極および前記第２室に設けられた第２電極と、を有し、前記血液試料を収容するポアデバイスと、
前記第１電極と前記第２電極の間に流れる電流を測定する計測装置と、
前記計測装置が測定した電流にもとづいて、前記血液試料中に含まれるカイロミクロンの粒径分布を生成する処理装置と、
を備え、
前記ポアデバイスのメンブレンの膜厚ｔを用いて、前記ポアのアスペクト比をｔ／ｄとするとき、
１≦ｔ／ｄ＜２
を満たすことを特徴とする分析装置。

【請求項8】

前記血液試料は、血清を含むことを特徴とする請求項６または７に記載の分析装置。

【請求項9】

前記血液試料は、血清をリン酸緩衝生理食塩水中に懸濁させたものであることを特徴とする請求項６または７に記載の分析装置。

【請求項10】

前記血液試料は、遠心分離処理後の血液を含むことを特徴とする請求項６または７に記載の分析装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、血液試料中のリポ蛋白質の分析に関する。

【背景技術】

【0002】

血中のＬＤＬ（Low Density Lipoprotein）コレステロールは、動脈硬化や心筋梗塞の促進因子とされており、悪玉コレステロールと称される。これに対してＨＤＬ（High Density Lipoprotein）は、動脈硬化を阻止する因子とされており、善玉コレステロールと称される。冠動脈性心疾患などの早期診断のために、血液中のＬＤＬコレステロールが測定されている。

【0003】

ヒトや動物は、食物中の中性脂肪やコレステロール等の脂質を小腸で吸収消化するが、そのままでは血液中に存在することは出来ず、アポ蛋白質を結合したリポ蛋白質として安定的に血液中に存在することができる。そのリポ蛋白質は色々な粒子径が混じり合った微細な脂質運搬体の総称であり、粒子径の大きいものよりカイロミクロン、超低比重リポ蛋白質（ＶＬＤＬ：Very-Low-density Lipoprotein）、中間比重リポ蛋白質（ＩＤＬ：Intermediate-density Lipoprotein）またはミッドバンド、低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ：Low-density Lipoprotein）、小粒子比重リポ蛋白質（small, dense LDL）、高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ：High-density Lipoprotein）と呼ばれている。リポ蛋白質の粒子の直径は赤血球のおよそ１／７０で１０ｎｍから１００ｎｍ程の微小な粒子である。

【0004】

一般的に知られている総コレステロール（ＴＣ）やＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）さらに中性脂肪（ＴＧ）の測定法は、粒子状のリポ蛋白質を壊して中身のコレステロールや中性脂肪を化学的に定量しているものであり、リポ蛋白質粒子そのものを直接測定する測定法ではない。

【0005】

しかし生体内で、血液中の脂質の代謝はリポ蛋白質の分解・異化を中心に行われているから、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ｓｍａｌｌ，ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ、ＨＤＬというリポ蛋白質そのものを見ないと代謝や治療法の選択につながらない。リポ蛋白質そのものは極微小で非常に壊れやすいため、現在も直接測定する方法がなく、コレステロール等の定量に頼るしかなかった。しかしＴＣやＴＧの量だけを観て治療すれば心筋梗塞などを予防できるというものでもなく、リポ蛋白質の性質所謂リポ蛋白の質的検査が必要である事は今も不変である。

【0006】

最近メタボリックシンドロームという言葉に合わせ、超悪玉のリポ蛋白質が動脈硬化等の原因として良く取り上げられている。この超悪玉のリポ蛋白質とはＩＤＬやｓｍａｌｌ，ｄｅｎｓｅ ＬＤＬのことであり、専門の医師の間でも心筋梗塞のリスクファクターと認識されている。そして注目すべきことはこのＩＤＬやｓｍａｌｌ，ｄｅｎｓｅ ＬＤＬは、適切な高脂血症治療薬を使えば消失させることが出来るので、ＩＤＬやｓｍａｌｌ，ｄｅｎｓｅ ＬＤＬの検出が重要といわれている。

【0007】

リポ蛋白質の測定法について、粒子状のリポ蛋白質を壊さないで測定する方法として、ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動法（ＰＡＧＥ法）（特許文献１）が提案されている。ＰＡＧＥ法は、リポ蛋白質の粒子径を測定する測定法ではないが、粒子径の順番にリポ蛋白質を分離・分析する方法である。ＰＡＧＥ法は、リポ蛋白質の染色剤と言われているズダンブラックＢで血清または血漿中のリポ蛋白質を電気泳動前に染色し、その後濃縮ゲル、均一な分離ゲルの分子ふるい効果により粒子径の順番に分離分析され、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ｓｍａｌｌ，ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ、ＨＤＬに分離される。ＰＡＧＥ法の他にリポ蛋白質の荷電の違いを利用して分析するアガロースゲルまたはセルローズアセテート膜電気泳動法がある。

【0008】

この方法はリポ蛋白質を先ず荷電で分離して、リポ蛋白質を固定してから、その後に脂質染色をして、血中蛋白質の分画位置に合わせ陰極側からベータ（β）、プレベータ（ｐｒｅ－β）、アルファ（α）リポ蛋白質と呼ぶ分析法がある。この染色をする色素をコレステロール染色に変えればコレステロール分画測定法に、中性脂肪の染色をすれば中性脂肪分画測定法になる（特許文献３、特許文献４）。ただ、アガロースゲルまたはセルローズアセテート膜電気泳動法は、リポ蛋白質を荷電の順番で分析するので、粒子径の分析とは言えず、粒子の大きいプレβがより小さいβより早く泳動される点や大きな粒子がアガロースゲルの網目構造に留まったりするため分離能が悪いと言う欠点もある。さらに、泳動後に染色するため、染色条件の濃淡のムラにより定量ができない。

【0009】

また密度勾配型のグラジュエントゲル電気泳動（ＧＧＥ）法は、支持体のゲル濃度が徐々に濃くなる形に作られており均一なゲルより正確にリポ蛋白質を粒子径の順に分離できると言われている。しかしながら、使用するゲルの作成が難しく特定の研究室でしか実施されていなかった（非特許文献１）。非特許文献１に示されたゲルの詳細は公開されておらず極めて再現は困難な状態にある。

【0010】

また非特許文献２に示した方法は、血中蛋白質のサイログロブリンやフェリチンをマーカとしてＧＧＥでリポ蛋白質の粒子径を特定しているが、フェリチンを安定的に確保したり、使用するゲル板自体も特定のメーカの製品でその作成法などは公開されておらず再現できなかった。さらに、泳動後蛋白染色をしなければならないなど、誰でも簡単に確認試験できる状態ではなかった。

【0011】

リポ蛋白質を粒子径の順に分析する方法として、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法も知られている（特許文献２）。この方法は、一旦リポ蛋白質を粒子径の順に分離したあと、コレステロールや中性脂肪を測定するものであり、リポ蛋白質の粒子径を測定するわけではない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【文献】特開２００５－１２１６１９号公報

【文献】特開平８－３２０３１３号公報

【文献】特開平１１－２３０９３７号公報

【文献】特開２０００－３５６６４１号公報

【文献】特開２００３－２８７７９号公報

【文献】特開２００４－２５８０１４号公報

【文献】特開２０１３－２０５４１１号公報

【非特許文献】

【0013】

【文献】CLIN. CHEM. 34/8 (B), B78-B83(1988)

【文献】生物物理化学、Vol.44, pp303-307, 2000

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

リポ蛋白質の代謝は、リポ蛋白粒子の分解・異化が主体となっていること考えると、どのリポ蛋白質粒子がどれ程ありそれがどのように代謝されるかを知ることが重要であり、どのくらいの粒子径をもつリポ蛋白質がどのくらいあるかを知ることで、どのリポ蛋白質が動脈硬化や心筋梗塞の発症に関与しているかも解明することが期待される。

【0015】

本願は係る状況においてなされたものであり、そのある態様の例示的な目的は、従来と異なるアプローチによる血液中のリポ蛋白質の分析方法の提供にある。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本開示のある態様は、血液試料中のリポ蛋白質の分析方法に関する。この分析方法では、ポアデバイスを用いる電気的検知帯法によって、血液試料に含まれるリポ蛋白質の粒径分布を測定する。

【0017】

本開示の別の態様は、血液試料中のリポ蛋白質の分析装置である。この分析装置は、ポアデバイスと、計測装置と、処理装置と、を備える。ポアデバイスは、ポアを介して区画される第１室と第２室と、第１室に設けられた第１電極および第２室に設けられた第２電極と、を有し、血液を含む溶液を収容する。計測装置は、第１電極と第２電極の間に流れる電流を測定する。処理装置は、計測装置が測定した電流にもとづいて、血液試料中に含まれるリポ蛋白質の粒径分布を生成する。

【0018】

なお、以上の構成要素を任意に組み合わせたもの、構成要素や表現を、方法、装置、システムなどの間で相互に置換したものもまた、本発明あるいは本開示の態様として有効である。さらに、この項目（課題を解決するための手段）の記載は、本発明の欠くべからざるすべての特徴を説明するものではなく、したがって、記載されるこれらの特徴のサブコンビネーションも、本発明たり得る。

【発明の効果】

【0019】

本開示のある態様によれば、測定精度を改善できる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】実施形態に係る血液分析装置のブロック図である。

【図2】計測装置により測定される例示的な微小電流Ｉｓの波形図である。

【図3】実施形態に係るポアチップの斜視図である。

【図4】図３のポアチップの断面図である。

【図5】実施形態に係るポアチップの電位分布のシミュレーション結果を示す図である。

【図6】ある血液試料内のリポ蛋白質の粒径分布の測定結果を示す図である。

【図7】ＬＤＬ標準サンプルの粒子径分布の測定結果を示す図である。

【図8】ＬＤＬ標準サンプルを透過電子顕微鏡（ＴＥＭ：Transmission Electron Microscope）により水中観察した液中ＴＥＭ画像を示す図である。

【図9】液中ＴＥＭ画像から得られたＬＤＬ標準サンプルの粒子径分布の測定結果を示す図である。

【図10】低アスペクト比を有するポアチップの断面図である。

【図11】低アスペクトのポアチップを利用して標準粒子を測定したときに生成されたヒストグラムを示す図である。

【図12】低アスペクトのポアチップにおけるヒストグラムのスプリットの原因を説明する模式図である。

【図13】カイロミクロンの粒径分布の測定結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

（実施形態の概要）
本開示のいくつかの例示的な実施形態の概要を説明する。この概要は、後述する詳細な説明の前置きとして、実施形態の基本的な理解を目的として、１つまたは複数の実施形態のいくつかの概念を簡略化して説明するものであり、発明あるいは開示の広さを限定するものではない。この概要は、考えられるすべての実施形態の包括的な概要ではなく、すべての実施形態の重要な要素を特定することも、一部またはすべての態様の範囲を線引きすることも意図していない。便宜上、「一実施形態」は、本明細書に開示するひとつの実施形態（実施例や変形例）または複数の実施形態（実施例や変形例）を指すものとして用いる場合がある。

【0022】

一実施形態に係る血液試料中のリポ蛋白質の分析方法は、ポアデバイスを用いる電気的検知帯法によって、血液試料に含まれるリポ蛋白質の粒径分布を測定する。

【0023】

この態様によると、リポ蛋白質を染色せずに測定することができる。これにより、リポ蛋白質を変質させずに、元の径を維持したままで正確に測定することができる。これは、生体の流血中のリポ蛋白質を忠実に反映した分析法である。また、アポＢ濃度、ＴＣを同時に測定することにより、ある血液体積中のＬＤＬ粒子の個数(モル数)やＬＤＬ中のコレステロールも測定できる。

【0024】

一実施形態において、血液試料は、血清を含んでもよい。上記手法によれば、数時間を要する遠心分離処理を行わなくても、数秒で、染色することなく血中のリポ蛋白質の径を測定することができ、従来に比べて検査時間を大幅に短縮できる。

【0025】

一実施形態において、血液試料を、遠心分離処理後の血液を含んでもよい。特定のリポ蛋白質のみに着目して粒径の分布を測定したい場合には、遠心分離処理と組み合わせて測定することが有効である。

【0026】

一実施形態において、ポアデバイスのポア径は８０ｎｍ～１２０ｎｍであり、ＬＤＬ（Low Density Lipoprotein）の粒径分布を測定してもよい。

【0027】

一実施形態において、ポアデバイスのポア径は２μｍ～３μｍであり、カイロミクロンの粒径分布を測定してもよい。

【0028】

一実施形態に係る血液の分析装置は、ポアを介して区画される第１室と第２室と、第１室に設けられた第１電極および第２室に設けられた第２電極と、を有し、血液試料を収容するポアデバイスと、第１電極と第２電極の間に流れる電流を測定する計測装置と、計測装置が測定した電流にもとづいて、血液試料中に含まれるリポ蛋白質の粒径分布を生成する処理装置と、を備える。

【0029】

一実施形態において、分析装置は、血液を、血清の状態で測定してもよい。

【0030】

一実施形態において、分析装置は、血液を、遠心分離後の状態で測定してもよい。

【0031】

一実施形態において、ポアの径は８０ｎｍ～１２０ｎｍであり、ＬＤＬ（Low Density Lipoprotein）の粒径分布を測定してもよい。

【0032】

（実施形態）
以下、好適な実施形態について、図面を参照しながら説明する。各図面に示される同一または同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、実施形態は、開示および発明を限定するものではなく例示であって、実施形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも開示および発明の本質的なものであるとは限らない。

【0033】

また図面に記載される各部材の寸法（厚み、長さ、幅など）は、理解の容易化のために適宜、拡大縮小されている場合がある。さらには複数の部材の寸法は、必ずしもそれらの大小関係を表しているとは限らず、図面上で、ある部材Ａが、別の部材Ｂよりも厚く描かれていても、部材Ａが部材Ｂよりも薄いこともあり得る。

【0034】

本明細書において、「部材Ａが、部材Ｂと接続された状態」とは、部材Ａと部材Ｂが物理的に直接的に接続される場合のほか、部材Ａと部材Ｂが、それらの電気的な接続状態に実質的な影響を及ぼさない、あるいはそれらの結合により奏される機能や効果を損なわせない、その他の部材を介して間接的に接続される場合も含む。

【0035】

同様に、「部材Ｃが、部材Ａと部材Ｂの間に接続された（設けられた）状態」とは、部材Ａと部材Ｃ、あるいは部材Ｂと部材Ｃが直接的に接続される場合のほか、それらの電気的な接続状態に実質的な影響を及ぼさない、あるいはそれらの結合により奏される機能や効果を損なわせない、その他の部材を介して間接的に接続される場合も含む。

【0036】

また本明細書において、電圧信号、電流信号などの電気信号、あるいは抵抗、キャパシタ、インダクタなどの回路素子に付された符号は、必要に応じてそれぞれの電圧値、電流値、あるいは回路定数（抵抗値、容量値、インダクタンス）を表すものとする。

【0037】

図１は、実施形態に係る血液分析装置１のブロック図である。血液分析装置１は、電気的検知帯法（コールター原理）と呼ばれる粒径・粒度分布測定法にもとづいて、血液試料中のリポ蛋白質の粒径分布を測定する。

【0038】

この測定法では、粒子を含む電解液を、ナノポアと称される細孔を通過させる。粒子が細孔を通過するとき、細孔中の電解液は粒子の体積に相当する量だけ減少し、細孔の電気抵抗を増加させる。したがって細孔の電気抵抗を測定することで、粒子の体積（すなわち粒径）を測定することができる。

【0039】

血液分析装置１は、ポアデバイス１００、計測装置２００、データ処理装置３００を備える。ポアデバイス１００は、

【0040】

ポアデバイス１００の内部は、測定対象の粒子であるリポ蛋白質４を含む血液試料２で満たされる。ポアデバイス１００の内部は、ポアチップ１０２によって第１室１０６と第２室１０８に隔てられており、第１室１０６と第２室１０８には電極Ｅ１と電極Ｅ２が設けられる。ポアチップ１０２には、細孔（ポア）１０４が設けられる。電極Ｅ１と電極Ｅ２の間に電位差を発生させると、電極間にイオン電流が流れる。リポ蛋白質４は、電気泳動によって、あるいは図示しないポンプが発生する圧力に応じて、細孔１０４を経由して、第１室１０６と第２室１０８の間を移動する。

【0041】

計測装置２００は、電極対Ｅ１，Ｅ２の間に電位差を発生させるとともに、電極対の間の抵抗値Ｒｐと相関を有する情報を取得する。計測装置２００は、トランスインピーダンスアンプ２１０、電圧源２２０、デジタイザ２３０を含む。電圧源２２０は電極対Ｅ１，Ｅ２の間に電位差Ｖｂを発生させる。この電位差Ｖｂは、電気泳動の駆動源であるとともに、抵抗値Ｒｐを測定するためのバイアス信号となる。

【0042】

電極対Ｅ１，Ｅ２の間には、細孔１０４の抵抗に反比例する微小電流Ｉｓが流れる。
Ｉｓ＝Ｖｂ／Ｒｐ …（１）

【0043】

トランスインピーダンスアンプ２１０は、微小電流Ｉｓを電圧信号Ｖｓに変換する。変換ゲインをｒとするとき、以下の式が成り立つ。
Ｖｓ＝－ｒ×Ｉｓ …（２）
式（１）を式（２）に代入すると、式（３）が得られる。
Ｖｓ＝－Ｖｂ×ｒ／Ｒｐ …（３）
デジタイザ２３０は、電圧信号ＶｓをデジタルデータＤｓに変換する。このように計測装置２００により、細孔１０４の抵抗値Ｒｐに反比例する電圧信号Ｖｓを得ることができる。

【0044】

図２は、計測装置２００により測定される例示的な微小電流Ｉｓの波形図である。なお本明細書において参照する波形図やタイムチャートの縦軸および横軸は、理解を容易とするために適宜拡大、縮小したものであり、また示される各波形も、理解の容易のために簡略化され、あるいは誇張もしくは強調されている。

【0045】

粒子であるリポ蛋白質４が細孔１０４を通過する短い期間、細孔１０４の抵抗値Ｒｐが増大する。したがって、リポ蛋白質４が通過するごとに電流Ｉｓはパルス状に減少する。個々のパルス電流の振幅は、粒径と相関を有する。データ処理装置３００は、デジタルデータＤｓを処理し、血液試料２に含まれるリポ蛋白質４の個数や粒径分布などを解析する。データ処理装置３００の一部は、サーバやクラウドであってもよい。

【0046】

図３は、実施形態に係るポアチップ４００の斜視図である。ポアチップ４００は、図１のポアデバイス１００に組み込まれる。ポアチップ４００は、メンブレン４１０を備える。ポアチップ４００は、メンブレン４１０を支持する支持部材（不図示）をさらに含んでもよい。メンブレン４１０には、貫通するポア（開口）４１２が設けられている。ｄはポア４１２の直径を、ｔはメンブレンの厚さを示す。支持部材は、石英（ＳｉＯ_２）ガラスなどの絶縁基板であり、メンブレン４１０は、ＳｉＮなどの窒化膜あるいはＳｉＯ_２などの酸化膜である。ポアデバイスにおいては、支持部材に形成される寄生容量が大きいと、ノイズが大きくなる。寄生容量は、誘電率に比例するが、たとえばＳｉの誘電率は１１．９であるのに対して、ＳｉＯ_２の誘電率は３．９であり、これにより寄生容量を大きく減らすことができる。本実施形態では、ポアチップ４００が半導体を含まない構成となっており、Ｓｉを支持部材とする技術に比べて、寄生容量が小さくなり、ノイズの影響を抑えることができ、ひいてはＳＮ比を改善できる。

【0047】

図４は、図３のポアチップ４００の断面図である。本実施形態では、ポア４１２のアスペクト比ｔ／ｄが、
１≦ｔ／ｄ＜２
の関係を満たしている。

【0048】

図５は、実施形態に係るポアチップ４００の電位分布のシミュレーション結果を示す図である。濃淡階調は電位を、矢印は電界ベクトルを表す。ｄ＝３００ｎｍ、ｔ＝３００ｎｍとしており、アスペクト比はｔ／ｄ＝１である。メンブレン４１０の材料としては、ＳｉＮを用いている。

【0049】

リポ蛋白の測定に適した、ポアデバイスのポア径について説明する。血中のリポ蛋白粒子の大きさは以下の通りである。
ＨＤＬ ８ｎｍ
ＬＤＬ ２５ｎｍ
ＩＤＬ ３０ｎｍ
ＶＬＤＬ ５０ｎｍ～８０ｎｍ
カイロミクロン ２００ｎｍ以上
したがって、８０ｎｍ以上のポアを計測に用いると、カイロミクロン（２００ｎｍ以上）以外のリポ蛋白、具体的には、ＶＬＤＬ（８０ｎｍ以下）～ＩＤＬ（３０ｎｍ）～ＬＤＬ（２５ｎｍ）～ＨＤＬ（８ｎｍ）を、測定することができる。

【0050】

また、実施形態に係る血液分析装置１のＳＮ比限界は、ポア径の約２０％である。したがって、２５ｎｍのＬＤＬまでを測定対象と考えて、ＳＮ比限界を２４ｎｍとした場合、ポア径の上限を２４ｎｍ／２０％＝１２０ｎｍとすればよい。

【0051】

ポア径の上限を１２０ｎｍとすることで、カイロミクロンがポアを通過することがなく、またポアに詰まる心配もない。

【0052】

このことから、ＬＤＬの測定に適したポア径は、８０～１２０ｎｍであると言える。このようなポア径を有するポアデバイスを用いることを特徴とするで、１ｘＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で希釈後、懸濁するだけで、フィルトレーション無し、試薬不要でダイレクトに簡便、迅速に、粒径分布を計測できる。

【0053】

ｄ＝１００ｎｍ、ｔ＝１００ｎｍのポアデバイスを作製し、実際に血中のＬＤＬの粒径分布を測定した。

【0054】

血液試料の作成手順は以下の通りである。血清１μＬと９９９μＬの１×ＰＢＳを混ぜ、１０００倍に希釈する。その後、懸濁を行い、血液試料とする。血液試料から所定量（たとえば２０μＬ）を抜き取り、ポアデバイスに注入し、測定する。リポ蛋白質は、純水中では変質する可能性があるところ、１×ＰＢＳ（０．１５Ｍ）の等張溶液で希釈することにより、リポ蛋白質を変質させずに測定することができる。

【0055】

図６は、血液試料内のリポ蛋白質の粒径分布の測定結果を示す図である。電極間に印加したバイアス電圧Ｖｂは０．１Ｖである。

【0056】

分布全体にわたる粒径の平均値（Ｍｅａｎ）は２８．３２３ｎｍであり、ＬＤＬコレステロールの典型的な粒径と一致する。最頻値（Ｍｏｄｅ）は２４．０９６ｎｍであった。

【0057】

また全体の中央値（Ｄ５０）は２６．２２８ｎｍ、全体の１０％の値（Ｄ１０）は２３．１１６ｎｍ、全体の９０％の値（Ｄ９０）は、３５．８０２ｎｍであった。Ｄ１０とＤ９０の値がどれだけ離れているかを中央値で正規化した値（Ｄ９０－Ｄ１０）／Ｄ５０は、０．４８４であった。

【0058】

図６には、ガウシアンフィッティングラインが示され、そのピークにおける粒径（平均値Ｍｅａｎ）は２５．１６１ｎｍ、フィッティングラインの標準偏差（Ｓ．Ｄ．）は２．３９４ｎｍ、標準偏差÷平均値である変動係数（Ｃ．Ｖ）は９．５２％であった。

【0059】

図７は、ＬＤＬ標準サンプルの粒径分布の測定結果を示す図である。ＬＤＬ標準サンプルは、Athens Research and Technology社製のものを用いた。この標準サンプルは、超遠心分離処理によって、ＬＤＬを抽出したサンプルである。

【0060】

分布全体にわたる粒径の平均値（Ｍｅａｎ）は３０．３８４ｎｍであり、最頻値（Ｍｏｄｅ）は２６．３４３ｎｍであった。

【0061】

また全体の中央値（Ｄ５０）は２８．８０６ｎｍ、全体の１０％の値（Ｄ１０）は２５．５６１ｎｍ、全体の９０％の値（Ｄ９０）は、３７．７１８ｎｍであった。Ｄ１０とＤ９０の値がどれだけ離れているかを中央値で正規化した値（Ｄ９０－Ｄ１０）／Ｄ５０は、０．４２２であった。

【0062】

図８は、１ｘＰＢＳ溶液中のＬＤＬ標準サンプルを透過電子顕微鏡（ＴＥＭ：Transmission Electron Microscope）により水中観察した液中ＴＥＭ画像を示す図である。

【0063】

図９は、液中ＴＥＭ画像から得られたＬＤＬ標準サンプルの粒子径分布の測定結果を示す図である。通常のＴＥＭ画像は乾燥試料を観察したものであるが、本発明者らは、ＬＤＬ標準サンプルを１×ＰＢＳ（０．１５Ｍ）の等張溶液に懸濁することでリポ蛋白質を変質させていない試料をＴＥＭ観察しており、血液中に存在する状態と等価な測定結果である。

【0064】

超遠心分離処理を行わない血液試料にもとづく測定結果（図６）と、超遠心分離処理により抽出されたＬＤＬ標準サンプルの測定結果（図７、図９）はよく一致している。この実験から、実施形態に係る血液分析装置１によって、超遠心分離を行わない血清から簡便に作製した血液試料によって、粒径を正確に測定できることが裏付けられた。

【0065】

なお、電気的検知帯法によって、ＬＤＬコレステロールの粒径分布を測定することを、技術常識と捉えてはならない。上市されている装置で計測可能としている下限粒径は、スペック上は４０ｎｍとなっており、４０ｎｍ以下の領域において粒径分布を正確に測定できたという報告はこれまでにない。また、実勢値として１００ｎｍ以下の粒径は精度よく計測できていない。したがって、直径が３０ｎｍ程度のＬＤＬコレステロールを、電気的検知帯法によって測定できたことは画期的である。

【0066】

本実施形態によれば、ＬＤＬ～ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬの粒径分布を測定できる。血液試料は、１ｘＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で希釈後、懸濁するだけで作成でき、フィルトレーションや、染色、試薬は不要である。そのため、従来技術に比べて、簡便、迅速に、粒径分布を計測できる。

【0067】

そして、血液試料の作製の工程、あるいは血液分析装置１よる測定中に、リポ蛋白質を変質させるような処理がないため、血液中と同じ条件で、リポ蛋白質の粒径分布を正確に測定することができる。

【0068】

等アスペクト比のポアデバイスが、リポ蛋白質の粒径測定に適している理由を説明する。

【0069】

図１０は、低アスペクト比を有するポアチップ８００の断面図である。ポアチップ８００はメンブレン８１０を備え、メンブレン８１０には、ポア（開口）８１２が形成される。従来のポアチップ８００では、メンブレン８１０の材料はＳｉＮもしくはＳｉＯ_２であり、メンブレン８１０の膜厚ｔは数十ｎｍのものが利用されていた。これは、（i）膜厚ｔを小さくすることで、結晶性の高い膜が形成でき、また成膜時間が短くて済むこと、（ii）調達性が良いこと、すなわち、薄膜の方が低コストであり、納期が短いこと、（iii）膜加工性が良いこと、すなわちドライエッチングなどにより後から加工する際に都合がよいことが理由として挙げられる。

【0070】

一方で、メンブレンの支持部材が半導体（Ｓｉ）であることからノイズに弱いという問題があった。

【0071】

数十ｎｍの膜厚ｔのメンブレン８１０を利用すると、ポア８１２の直径（ポア径という）ｄと、メンブレン８１０の膜厚ｔの間には、
ｄ＞ｔ
の関係が成り立つこととなる。ポアのアスペクト比をｔ／ｄとして定義すると、従来のポアチップ８００は、低アスペクトであったと言える。

【0072】

図１１は、低アスペクトのポアチップ８００を利用して標準粒子を測定したときに生成されたヒストグラムを示す図である。実験に使用したポアチップ８００は、ｄ＝３μｍ、アスペクト比０．０１７（ｔ＝０．０５０μｍ）である。標準粒子の直径は０．９μｍである。ヒストグラムの横軸は、粒子がポアを通過するときに測定された電流から推定される粒径であり、縦軸は粒子の個数を表す。

【0073】

同一径を有する標準粒子を測定しているため、理想的にはヒストグラムは単峰であるべきであるが、測定結果ではヒストグラムは２つにスプリットし、強い二峰性を示している。ヒストグラムが二峰性を有すると、粒子の径を推定することが難しくなり、測定精度が低下する。

【0074】

本発明者らは、従来のポアチップ８００を利用した際に二峰性が発生した理由として、ポア８１２内の電界強度に着目した。

【0075】

図１２は、低アスペクトのポアチップにおけるヒストグラムのスプリットの原因を説明する模式図である。ポアチップ８００は、ケース９００に収容される。ケース９００は、ポアチップ８００によって、２つのチャンバー９０２，９０４に区画される。チャンバー９０２，９０４内は、粒子を含む試料２で満たされている。粒子４は、ポア８１２を通過する際に、異なる経路を取ることができる。図１２には、２つの経路（i）（ii）が代表的に示される。ポア８１２内の電界強度が均一であれば、通過経路によらずに、同じ強度の信号が測定されることとなる。しかしながら、ポア８１２内の電界強度が不均一であると、通過する経路によって、同じ粒径を持つ粒子４が通過したときに、異なる強度の信号が測定されることとなる。これにより、ヒストグラムがスプリットする。

【0076】

血液中のＬＤＬの粒径は、酸化的修飾の有無などによって粒径が変化しうる。そのため、粒径分布自体が複数のピークを有していることも考えられる。このような分布を有するＬＤＬを、低アスペクト比のポアを有するポアデバイスを用いて測定すると、酸化的修飾の有無によって複数のピークが現れているのかどうかが分からない。

【0077】

実施形態に係る等アスペクト比のポアを有するポアデバイスを利用することで、ＬＤＬの粒径の分布を、２ｎｍの分解能で正確に測定することができる。これにより、ＬＤＬ～ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬの区別だけでなく、各粒子の酸化的修飾の有無など、わずかな状態の違いを区別することができる可能性があり、冠動脈性心疾患などの早期診断に有効である。

【0078】

続いて、カイロミクロンを測定した結果を説明する。上述のように、カイロミクロンの粒径は２００ｎｍ以上である。そこで、ポア径３μｍ（３０００ｎｍ）のポアデバイスを測定し、血清中のカイロミクロンの粒径分布を測定した。

【0079】

図１３は、カイロミクロンの粒径分布の測定結果を示す図である。電極間に印加したバイアス電圧Ｖｂは０．１Ｖである。

【0080】

分布全体にわたる粒径の平均値（Mean）は７５０．６５０ｎｍであり、最頻値（Mode）は７４０．５３６ｎｍであった。

【0081】

また全体の中央値（Ｄ５０）は７３６．８９５ｎｍ、全体の１０％の値（Ｄ１０）は６８９．７５３ｎｍ、全体の９０％の値（Ｄ９０）は、８１０．９０６ｎｍであった。Ｄ１０とＤ９０の値がどれだけ離れているかを中央値で正規化した値（Ｄ９０－Ｄ１０）／Ｄ５０は、０．１６４であった。

【0082】

図１３には、ガウシアンフィッティングラインが示され、そのピークにおける粒径（平均値Ｍｅａｎ）は７３２．４６７ｎｍ、フィッティングラインの標準偏差（Ｓ．Ｄ．）は４４．４９７ｎｍ、標準偏差÷平均値である変動係数（Ｃ．Ｖ）は６．０７％であった。

【0083】

このように、ポア径を大きくすることで、カイロミクロンの粒径分布も正確に測定可能である。

【0084】

続いて変形例を説明する。

【0085】

（変形例１）
実施形態では、メンブレンにポアが形成されるタイプのポアデバイスについて説明したが、ポアデバイスの形式はそれに限定されない。たとえば、流路型のポアデバイスを用いても、同様の測定が可能である。

【0086】

（変形例２）
実施形態では、８０～１２０ｎｍのポア径を有するポアデバイスを前提として、フィルトーションを行わずに、粒径分布の測定を行ったが本開示はそれに限定されない。また、ＳＮ比限界を改善した場合、カイロミクロンの影響を受けない範囲で１２０ｎｍより大きなポアを使用しても良い。フィルトーションを行うことを想定した場合、８０ｎｍより小さいポア径のポアデバイスを用いることもできる。

【0087】

たとえば、ＬＤＬのみを対象として粒径分布の測定を行う場合、フィルタによってＬＤＬよりも大きな粒子を除去した血液試料を作製し、５０ｎｍ～７０ｎｍ程度のポア径を有するポアデバイスを利用して測定を行うことで、目詰まりを抑制しつつ、ＬＤＬの粒径分布をより正確に測定できる。

【0088】

あるいは、ＨＤＬを対象として粒径分布の測定を行う場合、４０ｎｍ程度のフィルタによって大きなリポ蛋白を除去した血液試料を作製し、１０ｎｍ～３０ｎｍのポア径を有するポアデバイスによって測定してもよい。

【0089】

（変形例３）
同様に、カイロミクロンを対象とした場合、２０００～３０００ｎｍのポア径を有するポアデバイスを前提として、フィルトーションを行わずに、粒径分布の測定を行ったが本開示はそれに限定されない。また、ＳＮ比限界を改善した場合、３０００ｎｍより大きなポアを使用しても良い。フィルトーションを行うことを想定した場合、カイロミクロンが通過できる、より小さいポア径のポアデバイスを用いることができる。

【0090】

（変形例４）
血液試料の作製プロトコルは、実施形態で説明したものに限定されない。バッファ溶液としては、１×ＰＢＳに替えて、血液と等張のそれ以外の溶液を用いてもよい。また希釈度も、実施形態で説明したものに限定されない。

【0091】

（変形例５）
データ処理装置３００は、粒度分布(ヒストグラム)において、正規分布によるフィッティング以外の統計処理によって、粒径値を求めてもよいし、機械学習を利用したモデルにもとづいて粒径値を求めてもよい。

【0092】

実施の形態にもとづき本発明を説明したが、実施の形態は、本発明の原理、応用を示しているにすぎず、実施の形態には、請求の範囲に規定された本発明の思想を逸脱しない範囲において、多くの変形例や配置の変更が認められる。

【符号の説明】

【0093】

１ 血液分析装置
２ 試料
４ リポ蛋白質
１００ ポアデバイス
１０２ ポアチップ
１０４ 細孔
１０６ 第１室
１０８ 第２室
２００ 計測装置
２１０ トランスインピーダンスアンプ
２２０ 電圧源
２３０ デジタイザ
３００ データ処理装置

【要約】

【課題】従来と異なるアプローチによる血液中のリポ蛋白質の分析方法を提供する。
【解決手段】血液分析装置１は、ポアデバイス１００、計測装置２００、データ処理装置３００を備える。ポアデバイス１００は、ポアを介して区画される第１室１０６と第２室１０８と、第１室１０６に設けられた第１電極Ｅ１および第２室１０８に設けられた第２電極Ｅ２と、を有し、血液試料２を収容する。計測装置２００は、第１電極Ｅ１と第２電極Ｅ２の間に流れる電流を測定する。データ処理装置３００は、計測装置２００が測定した電流にもとづいて、血液試料２中に含まれるリポ蛋白質４の粒径分布を生成する。
【選択図】図１

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】