特許 7706190 ブラウティア属細菌

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-07-03

(45)【発行日】2025-07-11

(54)【発明の名称】ブラウティア属細菌

(51)【国際特許分類】

   A23L 33/135 20160101AFI20250704BHJP

   A61P 1/12 20060101ALI20250704BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20250704BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20250704BHJP

   A61K 35/741 20150101ALI20250704BHJP

   A61K 8/99 20170101ALI20250704BHJP

【ＦＩ】

A23L33/135

A61P1/12

A61P3/04

A61P3/10

A61K35/741

A61K8/99

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2024100438

(22)【出願日】2024-06-21

(65)【公開番号】P2025054169

(43)【公開日】2025-04-07

【審査請求日】2025-05-23

(31)【優先権主張番号】P 2023161739

(32)【優先日】2023-09-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-03954

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】597040784

【氏名又は名称】オルト株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000800

【氏名又は名称】デロイトトーマツ弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】白土 直

(72)【発明者】

【氏名】赤坂 良平

【審査官】田辺 義拓

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０２３／０６８２７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０２２－１８４４２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０２１－５０２９６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１８－２４６３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１２／１５７６９９（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ２３Ｌ ３３／１３５

Ａ６１Ｐ １／１２

Ａ６１Ｐ ３／０４

Ａ６１Ｐ ３／１０

Ａ６１Ｋ ３５／７４１

Ａ６１Ｋ ８／９９

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ブラウティア属細菌としてブラウティア・ＲＤ０１４８９２株（受託番号：ＮＩＴＥＢＰ－０３９５４）をｐＨ３．０～５．０、温度７０～１２１℃の酸性条件下に加熱処理して得られたものであることを特徴とするブラウティア属細菌の死菌体。

【請求項2】

マウス脾臓細胞を用いた方法で測定したＩＬ－１２産生誘導能が、同条件におけるブラウティア属細菌の生菌による前記ＩＬ－１２産生誘導能と比較して１０倍以上である、請求項１記載のブラウティア属細菌の死菌体。

【請求項3】

前記ブラウティア属細菌の死菌体は、更に、マウス脾臓細胞を用いた方法で測定したＩＬ－１０産生誘導能が、同条件におけるブラウティア属細菌の生菌による前記ＩＬ－１０産生誘導能と比較して２倍以上である、請求項２記載のブラウティア属細菌の死菌体。

【請求項4】

ブラウティア属細菌としてブラウティア・ＲＤ０１４８９２株（受託番号：ＮＩＴＥＢＰ－０３９５４）の生菌をｐＨ３．０～５．０、温度７０～１２１℃の酸性条件下に加熱処理することを特徴とするブラウティア属細菌の死菌体の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ブラウティア属細菌の利用に関し、より詳細にはブラウティア属細菌の加熱処理菌体の利用に関する。

【背景技術】

【0002】

乳酸菌サプリメントの利用によって、からだの免疫力を高めて健康維持を図ることが行われている。例えば、特許文献１には、このような乳酸菌として利用され得る、ナノサイズに微粒子化されてなる乳酸菌の調製物が記載されている。

【0003】

一方、近年、ヒトを対象にしたデータ解析を行った結果、腸内細菌の１つであるブラウティア属細菌が ＢＭＩや糖尿病リスクと逆相関するという知見がある（非特許文献１参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特許４６２１２１８号公報

【非特許文献】

【0005】

【文献】Koji Hosomi1 et al.,「Oral administration of Blautia wexlerae meliorates obesity and type 2 diabetes via etabolic remodeling of the gut microbiota」Nature Communications | (2022) 13:4477

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

従来、ブラウティア属細菌の菌体を用いることについては、あまり研究されてこなかった。

【0007】

本発明の目的は、ブラウティア属細菌を利用して、優れた性質を有する微生物菌体素材を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記目的を達成するため種々研究した結果、特定の条件で調製されたブラウティア属細菌の調製物は、免疫賦活因子の産生誘導能や腸内の環境を改善する機能性に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0009】

すなわち、本発明は、その第１の観点にあっては、ブラウティア属細菌を酸性条件下に加熱処理して得られたものであることを特徴とするブラウティア属細菌の死菌体を提供するものである。

【0010】

上記ブラウティア属細菌の死菌体においては、ｐＨ３．０～７．０、温度７０～１２１℃の条件下に加熱処理して得られたものであることが好ましい。

【0011】

また、本発明は、その第２の観点にあっては、ブラウティア属細菌の死菌体であって、マウス脾臓細胞を用いた方法で測定したＩＬ－１２産生誘導能が、同条件におけるブラウティア属細菌の生菌による前記ＩＬ－１２産生誘導能と比較して１０倍以上であることを特徴とするブラウティア属細菌の死菌体を提供するものである。

【0012】

上記ブラウティア属細菌の死菌体においては、前記ブラウティア属細菌の死菌体は、更に、マウス脾臓細胞を用いた方法で測定したＩＬ－１０産生誘導能が、同条件におけるブラウティア属細菌の生菌による前記ＩＬ－１０産生誘導能と比較して２倍以上であることが好ましい。

【0013】

更に、本発明は、その第３の観点にあっては、ブラウティア属細菌の生菌を酸性条件下に加熱処理することを特徴とするブラウティア属細菌の死菌体の製造方法を提供するものである。

【0014】

上記ブラウティア属細菌の死菌体の製造方法においては、ｐＨ３．０～７．０、温度７０～１２１℃の条件下に加熱処理することが好ましい。

【発明の効果】

【0015】

本発明によれば、ブラウティア属細菌を利用して、優れた性質を有する微生物菌体素材を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】試験例１において、マウス脾臓細胞の培養系における培養培地にブラウティア属細菌（生菌又は死菌体）を添加したことによる影響について調べた結果を示す図表であり、図１（ａ）は脾臓細胞のＩＬ－１２産生誘導能について調べた結果を示す図表であり、図１（ｂ）は脾臓細胞のＩＬ－１０産生誘導能について調べた結果を示す図表である。

【図2】試験例１において、マウス脾臓細胞の培養系における培養培地にブラウティア属細菌（ｐＨ６の環境下又はｐＨ４の環境下での死菌体）を添加したことによる影響について調べた結果を示す図表であり、図２（ａ）は脾臓細胞のＩＬ－１２産生誘導能について調べた結果を示す図表であり、図２（ｂ）は脾臓細胞のＩＬ－１０産生誘導能について調べた結果を示す図表である。

【図3】試験例２において、マウス脾臓細胞の培養系における培養培地にブラウティア属細菌（生菌又はｐＨ４．０の環境下での死菌体）を添加したことによる影響について調べた結果を示す図表であり、サイトカインの発現量について調べた結果を示す図表である。

【図4】試験例３において、飼料にブラウティア属細菌（生菌又はｐＨ４．０の環境下での死菌体）を配合してＢＡＬＢ／ｃマウスに自由摂取させたことによる影響について調べた結果を示す図表であり、盲腸内容物中短鎖脂肪酸濃度について調べた結果を示す図表である。

【図5】試験例３において、飼料にブラウティア属細菌（生菌又はｐＨ４．０の環境下での死菌体）を配合してＢＡＬＢ／ｃマウスに自由摂取させたことによる影響について調べた結果を示す図表であり、糞便中ＩｇＡ濃度について調べた結果を示す図表である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本明細書において「ブラウティア属細菌」とは、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門に分類されるブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属に属する細菌をいう。具体的には、ブラウティア・カエシムリス（Ｂｌａｕｔｉａ ｃａｅｃｉｍｕｒｉｓ）、ブラウティア・グルセラセア（Ｂｌａｕｔｉａ ｇｌｕｃｅｒａｓｅａ）、ブラウティア・コッコイデス（Ｂｌａｕｔｉａ ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）、ブラウティア・シンキイ（Ｂｌａｕｔｉａ ｓｃｈｉｎｋｉｉ）、ブラウティア・スターコリス（Ｂｌａｕｔｉａ ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ）、ブラウティア・ヒドロゲノトロフィカ（Ｂｌａｕｔｉａ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、ブラウティア・フェシス（Ｂｌａｕｔｉａ ｆａｅｃｉｓ）、ブラウティア・プロダクタ（Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ）、ブラウティア・ヘンセンニ（Ｂｌａｕｔｉａ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、ブラウティア・ルティ（Ｂｌａｕｔｉａ ｌｕｔｉ）、ブラウティア・ワクスレレ（Ｂｌａｕｔｉａ ｗｅｘｌｅｒａｅ）等が挙げられる。これらは１種を単独に用いてもよく、あるいは２種以上を併用してもよい。このうち、免役賦活効果の観点からは、特にブラウティア・プロダクタが好ましく選択される。

【0018】

ブラウティア・プロダクタとしては、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託されている、ブラウティア・ＲＤ０１４８９２株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３９５４）、又はこれと実質的に同一の細菌などが好ましく例示され得る。ここで「実質的に同一」の細菌とは、当業者に理解される意義と同義であり、例えば、細菌の属種を特定するための１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、ブラウティア・ＲＤ０１４８９２株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９８％以上、好ましくは９９％以上の相同性を有しており、なお且つ、ブラウティア・ＲＤ０１４８９２株と同一の菌学的性質を有するものなどをいう。

【0019】

ブラウティア属細菌の培養、菌体の維持等は、周知の手段によって行うことが可能である。例えば、培地としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸類、塩類、ミネラル類など含む液体培地等が挙げられる。市販培地である「変法ＧＡＭ」（商品名、変法ＧＡＭブイヨン、ニッスイ社）などを用いてもよい。培養は、上記培地に菌体を接種したうえ、例えば２５～４０℃の条件で静置培養したり通気撹拌培養したりすることにより行なうことができる。生きた菌体の保存には、短時間の場合には培地に懸濁させたまま冷蔵したり、あるいは、長期間にわたる場合はグリセロール溶液など不凍液に懸濁させたうえ凍結保存したりすることができる。

【0020】

ブラウティア属細菌の調製の際には、培養後の培養液の状態から、その培養液をそのまま濃縮したり、あるいは、遠心分離やろ過などの手段によって集菌し、この菌体を更に精製水などによって洗浄したうえ、所定の菌体濃度になるように精製水などに懸濁させたりすることによって、菌体濃縮液を調製することができる。菌体濃縮液の１００質量部中のブラウティア属細菌の菌体の含有量は、乾燥菌体換算で０．１～５０質量部の範囲であってよく、０．５～２５質量部の範囲であってよく、１～１０質量部の範囲であってよい。この菌体濃縮液には賦形剤を含有せしめてもよい。これによれば、凍結したり、凍結乾燥したりした後にも、水と再構成した後に菌体の性質が維持されやすくなる。

【0021】

賦形剤としては、特に限定されず、例えば、デキストリン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、キサンタンガム、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、ラクチトール等の糖アルコール類；グルコース、ショ糖、フルクトース、ラクトース、デキストロース、乳糖等の糖類；アジピン酸、クエン酸、グルタル酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、リンゴ酸等の有機酸類等が挙げられる。

【0022】

また、別の態様として、ブラウティア属細菌の調製の際には、粉砕・分散の処理を施してもよい。粉砕・分散の処理は、例えば、上記した菌体濃縮液を、攪拌、ミキサー、ホモゲナイザー、ボールミル、ビーズミル、ジェットミル、ジェネレーター等の手段を用いて粉砕・分散するなどして行うことができる。この場合、場合によってあるいは必要に応じて、上記した賦形剤を添加したうえ粉砕・分散の処理を施すことにより、得られる菌末の再凝集を防止することができる。賦形剤を含有せしめる場合、その含有量としては、乾燥物換算で１～９９質量％の範囲であってよく、１０～９５質量％の範囲であってよく、２０～９０質量％の範囲であってよい。

【0023】

また、更に別の態様として、ブラウティア属細菌の調製の際には、乾燥粉末化の処理を施してもよい、乾燥粉末化方法としては、凍結乾燥、減圧噴霧乾燥、熱風を用いた噴霧乾燥等の手法が挙げられる。なお、熱風を用いた噴霧乾燥（スプレードライ）を行うことで、通常、生きた細菌の活性は滅失し、その死菌体を得ることができる。

【0024】

本発明においては、上記したように調製され得るブラウティア属細菌のうち、特に、酸性条件下に加熱処理して得られた調製物が提供される。そのような処理を経て得られた調製物によれば、通常、生きた細菌の活性は滅失し、ブラウティア属細菌の死菌体となっているため、生菌にともなう品質の変化を抑えることができる。また、後述する実施例に示されるように、ブラウティア属細菌の死菌体には、免疫細胞における免疫賦活因子（ＩＬ－１２、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ等）の産生誘導能や、腸内環境を改善して免疫分子であるＩｇＡの産生を誘導する機能性がある。よって、例えば、からだの免疫力を高めて健康維持を図るための機能性組成物の有効成分として好適に利用され得る。特には、健常者の健康維持を図るための機能性食品などに好適に利用され得る。別の観点では、本発明は、健康増進のための健康食品やサプリメントに利用可能な機能性素材や関与成分を提供するものであるということができる。

【0025】

ブラウティア属細菌の加熱処理は、培養後の培養液をそのまま、あるいは、必要に応じて上記した菌体濃縮液に調製したうえ、例えば、ジャケットタンク、恒温槽、オートクレーブにかけるなどの処理により行うことができる。その際、ｐＨは、限定されないが、例えばｐＨ３．０～７．０であってよく、ｐＨ３．０～６．０であってよく、ｐＨ３．０～５．０であってよい。加熱処理の温度条件としては、限定されないが、例えば７０～１２１℃であってよく、８０～１１０℃であってよく、８０～１００℃であってよい。加熱処理時間としては、限定されないが、例えば３０分間～１２０時間であってよく、３０分間～９０分間であってよく、３０分間～６０分間であってよい。このような環境下での処理が十分でないと、免疫賦活能等の所望の機能性に乏しくなる傾向があるため、好ましくない。

【0026】

本発明により提供されるブラウティア属細菌が、上記のような環境下での十分な処理がなされたものであるかどうか、判別するには、その調製履歴を確認すればよい。あるいは、場合によっては、機能性の観点からの判別を行うことも可能である。例えば、マウス脾臓細胞を用いた方法で測定したＩＬ－１２産生誘導能が、同条件におけるブラウティア属細菌の生菌による前記ＩＬ－１２産生誘導能と比較して１０倍以上であるかどうかや、マウス脾臓細胞を用いた方法で測定したＩＬ－１０産生誘導能が、同条件におけるブラウティア属細菌の生菌による前記ＩＬ－１０産生誘導能と比較して２倍以上であるかどうかなど、そのような機能性の観点からの判別を行うことも可能である。

【0027】

本発明により提供されるブラウティア属細菌の死菌体は、所望により、飲食品、機能性食品、医薬品、化粧品、動物飼料等、各種の製品形態での利用が可能である。

【0028】

飲食品としては、配合される食品の種類に特に制限はなく、例えば、コーヒー、果汁、清涼飲料水、ビール等アルコール飲料、牛乳、味噌汁、スープ、紅茶、茶、粉末飲料、栄養剤、シロップ、マーガリン、ペースト、ジャム等の液状（流動状）食品、米飯、パン、じゃがいも製品、もち、ふりかけ、ハム、ソーセージ、飴、チョコレート、ガム、グミ、スナック菓子、焼き菓子などの固形形状食品等の主食、副食、菓子類ならびに調味料に配合することも可能である。用途に応じて、粉末、顆粒、錠剤等の形に成形してもよい。また、必要に応じて、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料等に配合することも可能である。

【0029】

ヒトの消費に供する食品以外にも、ブラウティア属細菌の死菌体を飼料中に混合して、家畜、ペット等の動物に投与する場合には、予め飼料の原料中に混合して、機能性を付与した飼料として調製することができる。すなわち、ブラウティア属細菌の死菌体を有効成分として、ブタ、ニワトリ、ウシ、ウマ、ヒツジ等の家畜類や、ペット（イヌ、ネコ、鳥類）等や、タイ、ハマチ、マグロ、ウナギ、フグ等の養魚類等の飼料に添加することにより、機能性飼料として用いることができる。

【0030】

機能性食品としては、サプリメント、健康ドリンク、健康食品、栄養補助食品、保健機能食品、栄養機能食品、特定保健用食品、機能性表示食品、食品添加用素材等が挙げられる。これらの製品形態は、特に限定されないが、例えば、錠剤、カプセル、顆粒剤、粉末、飲料として製品化することができる。

【0031】

医薬品としては、適宜、薬学的に許容される基材等と組み合わせて、その医薬品製剤となすことができる。例えば、錠剤、チュアブル、カプセル剤、顆粒剤、粉末、丸剤、シロップ、チンキ、煎剤、液剤等の形態とすることができる。

【0032】

化粧品としては、適宜、薬学的に許容される基材等と組み合わせて、その化粧品製剤となすことができる。例えば、ローション、化粧水、クリーム、乳液、パウダー、ファンデーション、パック剤、ジェル剤、ゼリー剤、エアゾール剤、石鹸、クレンジングフォーム、浴用剤、ボディソープ、サンケア、軟膏、貼付剤、絆創膏等が挙げられる。

【0033】

上述したように、本発明により提供されるブラウティア属細菌の死菌体は、これをプロバイオティクス素材や機能性素材として各種の形態となすことができる。その場合、かかるブラウティア属細菌以外にも、他の成分を含有せしめることができる。他の成分としては、例えば、ラクトバチルス属、ラクチカゼイバチルス属、ラクチプランチバチルス属、ラクトコッカス属、ビフィドバクテリウム属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、アッカーマンシア属、クリステンセネラ属、クロストリジウム属、バクテロイデス属、バチルス属、パラプレボテラ属、フィーカリバクテリウム属、レンチラクトバチルス属、ユウバクテリウム属、ベイロネラ属等の微生物菌体素材、好ましくはその死菌体素材等が挙げられる。

【0034】

上述したように、本発明により提供されるブラウティア属細菌の死菌体は、これをプロバイオティクス素材や機能性素材として各種の形態となすことができる。その場合、かかるブラウティア属細菌の死菌体の含有量としては、各種の形態とした場合に、その形態として使用される量と機能性を発揮させるための有効量との関係を勘案して適宜定めればよい。典型的には、ブラウティア属細菌の死菌体の乾燥物換算の含有量にして、０．００１～１００質量％の範囲であってよく、０．００１～５０質量％の範囲であってよく、０．００１～１０質量％の範囲であってよい。また、菌体数に換算した含有量にして、２．０×１０^７～２．０×１０^１２ｃｅｌｌｓ／ｇの範囲であってよく、２．０×１０^７～１．０×１０^１２ｃｅｌｌｓ／ｇの範囲であってよく、２．０×１０^７～２．０×１０^１１ｃｅｌｌｓ／ｇの範囲であってよい。

【0035】

本発明により提供されるブラウティア属細菌の死菌体をヒトが摂取する場合、その投与量は、対象者の健康状態や年齢あるいはどの程度の機能性を必要としているかなどに応じて、適宜設定すればよい。典型的には、乳酸菌の乾燥物換算での摂取量にして、０．０００５ｍｇ～５００ｍｇ／日／ｋｇ体重の範囲であってよく、０．００５ｍｇ～５０ｍｇ／日／ｋｇ体重の範囲であってよく、０．０５ｍｇ～５ｍｇ／日／ｋｇ体重の範囲であってよい。また、菌体数に換算した含有量にして、１．０×１０^６～１．０×１０^１２ｃｅｌｌｓ／日／ｋｇ体重の範囲であってよく、１．０×１０^７～１．０×１０^１１ｃｅｌｌｓ／日／ｋｇ体重の範囲であってよく、１．０×１０^８～１．０×１０^１０ｃｅｌｌｓ／日／ｋｇ体重の範囲であってよい。

【実施例】

【0036】

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例の範囲に限定されるものではない。

【0037】

〔試料の調製〕
ブラウティア属細菌としてブラウティア・ＲＤ０１４８９２株を使用し、ＭＲＳ培地にて、３７℃、嫌気環境下に２４時間培養した。培養液を８０００×ｇ、１０分間遠心し、上清を除去した後に、蒸留水を加えて菌体を懸濁したものを試料（生菌）とした。一方、同じ培養液について、酢酸を添加することによりｐＨ６．０又はｐＨ４．０に調整したうえ、８０℃、３０分間加熱処理し、あとは同様に菌体を回収して蒸留水で懸濁したものを加熱処理試料（ｐＨ６．０又はｐＨ４．０）とした。

【0038】

［試験例１］
（方法）
常法に従い、ＢＡＬＢ／ｃＡマウス（雌性、１０週齢）から脾臓を採取した。脾臓の採取は、クリーンベンチ内でできる限り無菌状態で行った。採取した脾臓は、セルストレーナー（ポアサイズ：１００μｍ）にて細胞を回収した後、細胞濃度が２．５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう液体培地で調製した。使用した液体培地は、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有、富士フイルム和光純薬）に、終濃度１０％のＦＢＳ（Thermo Fisher Scientific）とPenicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture（Thermo Fisher Scientific）とを適宜配合して調製した。その細胞液にブラウティア属細菌（生菌）、（ｐＨ６．０加熱処理）、及び（ｐＨ４．０加熱処理)のそれぞれを、乾燥菌体換算の終濃度が１．０μｇ／ｍＬとなるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で培養した。そして、ＩＬ－１２については培養開始から２４時間の時点、ＩＬ－１０については培養開始から９６時間の時点、それぞれ培養後の上清に含まれる各サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡにて測定した。なお、ＩＬ－１２については６ウェルから、ＩＬ－１０については５ウェルから、測定の平均値、標準偏差を算出した。また、ブラウティア菌を添加しない脾臓細胞のみのウェルをコントロールとした。

【0039】

（評価）
その結果、図１に示されるように、ブラウティア属細菌の生菌では、ＩＬ－１２についてもＩＬ－１０についても、菌体を添加しないコントロールと同程度の産生量であったのに対して、加熱処理して得られたブラウティア属細菌の死菌体では、それら免疫賦活因子の産生量が顕著に高められた。

【0040】

また、図２に示されるように、ブラウティア属細菌の死菌体による免疫賦活因子の産生誘導能は、ｐＨ４．０の環境下に加熱処理した場合に特に顕著であった。

【0041】

［試験例２］
（方法）
試験例１と同様にして、ＢＡＬＢ／ｃＡマウス（雌性、１０週齢）の脾臓細胞液を調製した。その細胞液に各ブラウティア属細菌（生菌）及び（ｐＨ４．０、８０℃加熱処理）を、乾燥菌体換算の終濃度が１．０μｇ／ｍＬとなるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で培養した。培養開始から６時間後に細胞を回収し、RNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用いてＲＮＡを抽出した。次に、得られたＲＮＡからReverTra Ace qPCR RT Master Mix（TOYOBO）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡとiTaq Universal SYBR Green Supermix（BIO RAD）とを用い、各種サイトカイン（ＴＧＦ－β、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ）のｍＲＮＡ発現量について、リアルタイムＰＣＲにより測定を行い、得られた測定値はβ－アクチンのｍＲＮＡ発現量により規格化した。一方、別途、ブラウティア属細菌を添加しない脾臓細胞を用いて同様リアルタイムＰＣＲを行い、これを基準として、各種サイトカインのｍＲＮＡ発現量の相対値を算出した。

【0042】

（評価）
その結果、図３に示されるように、ブラウティア菌（ｐＨ４．０、８０℃加熱処理）を添加した場合、ブラウティア菌（生菌）を添加した場合と比較すると、免疫賦活因子として知られる各種サイトカイン（ＴＧＦ－β、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ）の遺伝子発現量の増加が認められた。

【0043】

［試験例３］
（方法）
ＢＡＬＢ／ｃマウスを１週間馴化した後、各サンプルを下表に示す投与量になるように配合した精製飼料（ＡＩＮ－９３Ｇ）を１週間自由摂取させた。その後、安楽死させたマウスより結腸中の糞便を回収しＥＬＩＳＡ法にてＩｇＡを測定し、盲腸内容物は短鎖脂肪酸（コハク酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸）濃度を測定した。

【0044】

【表1】

【0045】

（評価）
・盲腸内容物中短鎖脂肪酸濃度
図４に示すように、ブラウティア菌（ｐＨ４．０、８０℃加熱処理）の投与群では、コントロール群やブラウティア菌（生菌）の投与群と比較したとき、腸内環境改善の機能性が知られている酢酸、プロピオン酸、酪酸については、それらの増加が認められた。一方、下痢等を引き起こすことが知られているコハク酸については、その減少が認められた。

【0046】

・糞便中ＩｇＡ濃度
図５に示すように、ブラウティア菌（ｐＨ４．０、８０℃加熱処理）の投与群では、コントロール群やブラウティア菌（生菌）の投与群と比較したとき、免疫分子であるＩｇＡの増加が認められた。

【0047】

以上から、ブラウティア菌を酸性条件下に加熱処理することにより、腸内の環境を改善する機能性が高められることが明らかとなった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】