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特許7730100ＣＤ４０に結合する抗体及びその使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-08-19

(45)【発行日】2025-08-27

(54)【発明の名称】ＣＤ４０に結合する抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

C07K 16/28 20060101AFI20250820BHJP

C12N 15/13 20060101ALI20250820BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20250820BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20250820BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20250820BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20250820BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20250820BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20250820BHJP

A61K 45/00 20060101ALI20250820BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20250820BHJP

A61P 35/02 20060101ALI20250820BHJP

A61P 31/00 20060101ALI20250820BHJP

A61P 37/02 20060101ALI20250820BHJP

C12P 21/08 20060101ALN20250820BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28

C12N15/13 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 T

A61K45/00

A61P35/00

A61P35/02

A61P31/00

A61P37/02

C12P21/08

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2022547785

(86)(22)【出願日】2021-03-30

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-17

(86)【国際出願番号】 CN2021084013

(87)【国際公開番号】W WO2021197335

(87)【国際公開日】2021-10-07

【審査請求日】2024-01-16

(31)【優先権主張番号】63/001,612

(32)【優先日】2020-03-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】522040148

【氏名又は名称】ビオシオンインコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000877

【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】マ、マークジキン

(72)【発明者】

【氏名】リウ、ジンユ

(72)【発明者】

【氏名】ジャン、ジェンピン

(72)【発明者】

【氏名】シュ、ホンジアン

【審査官】山内達人

(56)【参考文献】

【文献】特表２００８－５４１７３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／２２０１００（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＤ４０に結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、（ｉ）ＶＨＣＤＲ１領域、ＶＨＣＤＲ２領域及びＶＨＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域並びに（ｉｉ）ＶＬＣＤＲ１領域、ＶＬＣＤＲ２領域及びＶＬＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を含み、前記ＶＨＣＤＲ１領域、前記ＶＨＣＤＲ２領域、前記ＶＨＣＤＲ３領域、前記ＶＬＣＤＲ１領域、前記ＶＬＣＤＲ２領域及びＶＬＣＤＲ３領域が、配列番号１、４、７、１０、１３及び１６のそれぞれに対するアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。

【請求項2】

前記重鎖可変領域が、配列番号１９、または２０に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２０の４９番目のアミノ酸残基はＡまたはＳである、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。

【請求項3】

前記軽鎖可変領域が、配列番号２３、または２４に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２４の４９番目および８７番目のアミノ酸残基はそれぞれＫおよびＦであるか、またはそれぞれＹおよびＹである、請求項１または２に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。

【請求項4】

前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、（１）配列番号１９及び２３のそれぞれ；または（２）配列番号２０及び２４のそれぞれに対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、
配列番号２０の４９番目のアミノ酸残基はＡであり、配列番号２４の４９番目および８７番目のアミノ酸残基はそれぞれＫおよびＦであるか、
配列番号２０の４９番目のアミノ酸残基はＳであり、配列番号２４の４９番目および８７番目のアミノ酸残基はそれぞれＫおよびＦであるか、
配列番号２０の４９番目のアミノ酸残基はＡであり、配列番号２４の４９番目および８７番目のアミノ酸残基はそれぞれＹおよびＹであるか、または、
配列番号２０の４９番目のアミノ酸残基はＳであり、配列番号２４の４９番目および８７番目のアミノ酸残基はそれぞれＹおよびＹである、
請求項１～３のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。

【請求項5】

前記重鎖可変領域に連結された、配列番号２７又は２８のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、及び前記軽鎖可変領域に連結された配列番号２９のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。

【請求項6】

マウス、キメラ又はヒト化抗体、またはこれらの抗原結合部分である、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド。

【請求項8】

請求項７に記載のヌクレオチドを含有する発現ベクター。

【請求項9】

請求項７に記載のヌクレオチド又は請求項８に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。

【請求項10】

請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体あるいはその抗原結合部分、請求項７に記載のヌクレオチド、請求項８に記載の発現ベクター、又は請求項９に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。

【請求項11】

必要とする対象における癌の治療への使用のための請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記癌が、固形又は非固形腫瘍である、請求項１１に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項13】

前記癌が、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、メラノーマ、結腸腺癌、膵臓癌、結腸癌、胃腸癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、卵巣癌、子宮頸部癌、乳癌、肺癌、及び上咽頭癌からなる群から選択される、請求項１１または１２に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項14】

必要とする対象における感染症の治療への使用のための請求項１０に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願及び援用
本出願は、２０２０年３月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／００１，６１２号に対する優先権を主張するものである。

【0002】

上記の出願、及びその中に又はその審査手続中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）及び本明細書に引用又は参照される全ての文献（本明細書に引用される全ての文献、特許、公開特許出願を含むがこれらに限定されない）（「本明細書に引用される文献」）、及び本明細書に引用される文献に引用又は参照される全ての文献は、本明細書又は参照により本明細書に援用されるあらゆる文献に記載される、あらゆる製品についてのあらゆる製造業者の説明書、記載、製品仕様書、及び製品シートと一緒に、参照により本明細書に援用され、本発明の実施に用いられ得る。より詳細には、全ての参照される文献は、各個々の文献が、具体的に及び個別に、参照により援用されることが示されるのと同程度に、参照により援用される。本開示に記載されるあらゆるＧｅｎｂａｎｋ配列は、本開示の最先の有効出願日のものであるＧｅｎｂａｎｋ配列とともに、参照により援用される。

【0003】

本開示は、一般に、高い親和性及び機能性でヒトＣＤ４０に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体、特に、マウス、キメラ又はヒト化モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分に関する。抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞及び抗体又はその抗原結合部分を発現するための方法も提供される。本開示はさらに、免疫抱合体、二重特異性分子、キメラ抗原受容体、腫瘍溶解性ウイルス、及び抗体又はその抗原結合部分を含む医薬組成物、並びに本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分を用いた治療方法を提供する。

【背景技術】

【0004】

Ｂリンパ球活性化は、抗原受容体媒介性刺激及び共刺激を必要とし、ＣＤ４０は、活性化プロセスに関与する共刺激分子の一つである（ＪｏｄｉＬ．Ｋａｒｎｅｌｌｅｔａｌ．，（２０１９）ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗ１４１：９２－１０３）。

【0005】

ＣＤ４０、Ｉ型膜貫通タンパク質は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。それは、Ｂ細胞活性化及び増殖を促進するように、構成的に発現され、シグナル伝達する場合に、Ｂリンパ球上で最初に特徴付けられた。後に、それは、樹状細胞（ＤＣ）、単球、マクロファージ及び非造血細胞上で見出された。ＣＤ４０の主要なリガンドは、主に活性化Ｔ細胞及び活性化Ｂ細胞及び血小板により発現されるＣＤ４０Ｌであり、さらに、炎症性状態下で、単核球細胞、ナチュラルキラー細胞、及び好塩基球上で見出される（ＪｏｄｉＬ．Ｋａｒｎｅｌｌｅｔａｌ．，（２０１９）、上記）。この共刺激ペアの広範な分布は、それらが免疫プロセス中で果たす中心的役割を示す。例えば、ＤＣ上でのＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの結合は、サイトカイン産生及び共刺激分子の誘導を促進し、Ｔ細胞活性化及び分化をもたらす（ＱｕｅｚａｄａＳＡｅｔａｌ．，（２００４）ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ．２２：３０７－３２８）。

【0006】

ＣＤ４０は、Ｂ細胞悪性腫瘍、肺癌、膀胱癌、胃癌、乳癌及び卵巣癌を含む腫瘍上でも発現され、自己免疫性疾患、アテローム血栓症、癌、及び呼吸器疾患を含むいくつかの炎症性疾患の病理に関与することが報告されている（Ｃｏｓｔｅｌｌｏｅｔａｌ．，（１９９９）ＩｍｍｕｎｏｌＴｏｄａｙ２０（１１）：４８８－４９３；Ｔｏｎｇｅｔａｌ．，（２００３）ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ１０（１）：１－１３；Ｌｅｅｅｔａｌ．，（２０１４）ＣｕｒｒＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＴａｒｇｅｔｓ１４（７）：６１０－６２０；ＡｒａＡｅｔａｌ．，（２０１８）、上記；Ｌｅｅｅｔａｌ．，（１９９９）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９６：９１３６－９１４１；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃｅｔａｌ．，（１９８９）ＥＭＢＯＪ．８：１４０３－１４１０）。一方で、ＣＤ４０媒介性シグナル伝達は、いくつかのＢ細胞由来腫瘍株において、腫瘍細胞増殖阻害及び細胞死を引き起こし（Ｇｒａｆｔｏｎｅｔａｌ．，（１９９７）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２：４５－５６）、他方で、特定の他のＢ細胞悪性腫瘍において、腫瘍細胞をアポトーシスから保護する多数の因子の発現増強を誘導した（Ｌｅｅｅｔａｌ．，（１９９９）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９６：９１３６－９１４１）。

【0007】

疾患治療のため、ＣＤ４０への結合時、ＣＤ４０シグナル伝達を活性化又は誘導するアゴニスト抗ＣＤ４０抗体、及びＣＤ４０Ｌの結合により誘導され得るＣＤ４０シグナル伝達をブロック又は阻害するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体が開発されている。アゴニスト抗ＣＤ４０抗体のセリクレルマブ（Ｐｆｉｚｅｒ及びＶＬＳＴ）は、進行癌を有する患者のいくつかの状況下で臨床的有効性が示されている（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅｅｔａｌ．，（２０１３）ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１９（５）：１０３５－１０４３）。セリクレルマブよりも弱いＣＤ４０アゴニストのダセツズマブ（ＳｅｔｔｔｅＧｅｎｅｔｉｃｓｃｓ）は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫及びＣＬＬにおいて抗腫瘍活性を示し、再発性又は難治性ＤＬＢＣＬの治療において、リツキシマブ及びゲムシタビンと組み合わせて試験されている（ＡｄｖａｎｉＲｅｔａｌ．，（２００９）ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．２７：４３７１－４３７７；ＦｕｒｍａｎＲＲｅｔａｌ．，（２０１０）ＬｅｕｋＬｙｍｐｈｏｍａ．５１：２２８－２３５；Ｆｏｒｅｒｏ－ＴｏｒｒｅｓＡｅｔａｌ．，（２０１２）ＬｅｕｋＬｙｍｐｈｏｍａ５４（２）：２７７－２８３）。アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体のルカツムマブ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）は、多発性骨髄腫及び慢性リンパ性白血病を治療するための臨床試験において試験されている（ＨａｓｓａｎＳＢｅｔａｌ．，（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ３６（２）：９６－１０４）。さらに、ＣＤ４０シグナル伝達を刺激する生物製剤は、ＨＩＶ－１／ＡＩＤＳ、結核及びマラリアを含む感染性及び自己免疫性疾患の治療において有効性を示した（ＥｌｉｚａｂｅｔｈＡＴｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔａｌ．，（２０１５）ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１９５（３）：１０１５－１０２４）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

薬学的特徴が改善されたより優れた抗ＣＤ４０抗体が求められ続けている。

【0009】

任意の文書の本願への引用又は同定は、このような文書が本発明の先行技術として利用可能であることの承認ではない。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本開示は、ＣＤ４０（例えば、ヒトＣＤ４０、及びサルＣＤ４０）に結合し、且つ、先行技術のダセツズマブ及びセリクレルマブなどの抗ＣＤ４０抗体と比較して、より高くないとしても同等のＣＤ４０に対する結合親和性、及びより高くないとしても同等のＣＤ４０シグナル伝達を活性化する活性を有する、単離モノクローナル抗体、例えば、マウス、ヒト、キメラ若しくはヒト化モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。

【0011】

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤ４０タンパク質の検出、並びに癌、感染症及び自己免疫性疾患などのＣＤ４０関連疾患の治療及び予防を含む、種々の用途に使用可能である。

【0012】

したがって、一態様において、本開示は、ｉ）ＶＨＣＤＲ１領域、ＶＨＣＤＲ２領域及びＶＨＣＤＲ３領域を含み得る重鎖可変領域であって、ＶＨＣＤＲ１領域、ＶＨＣＤＲ２領域及びＶＨＣＤＲ３領域が、（１）配列番号１、４及び７のそれぞれ；（２）配列番号２、５及び８のそれぞれ；若しくは（３）配列番号３、６及び９のそれぞれに対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得る、重鎖可変領域；並びに／又は、ｉｉ）ＶＬＣＤＲ１領域、ＶＬＣＤＲ２領域及びＶＬＣＤＲ３領域を含み得る軽鎖可変領域であって、ＶＬＣＤＲ１領域、ＶＬＣＤＲ２領域、及びＶＬＣＤＲ３領域が、（１）配列番号１０、１３及び１６のそれぞれ；（２）配列番号１１、１４及び１７のそれぞれ；若しくは（３）配列番号１２、１５及び１８のそれぞれに対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得る、軽鎖可変領域を有する、ＣＤ４０に結合する単離モノクローナル抗体（例えば、マウス、キメラ又はヒト化抗体）、又はその抗原結合部分に関する。

【0013】

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、ＶＨＣＤＲ１領域、ＶＨＣＤＲ２領域及びＶＨＣＤＲ３領域を含み得る重鎖可変領域、並びにＶＬＣＤＲ１領域、ＶＬＣＤＲ２領域及びＶＬＣＤＲ３領域を含み得る軽鎖可変領域を含み得、ここでＶＨＣＤＲ１領域、ＶＨＣＤＲ２領域、ＶＨＣＤＲ３領域、ＶＬＣＤＲ１領域、ＶＬＣＤＲ２領域、及びＶＬＣＤＲ３領域は、（１）配列番号１、４、７、１０、１３及び１６のそれぞれ；（２）配列番号２、５、８、１１、１４及び１７のそれぞれ；又は（３）配列番号３、６、９、１２、１５及び１８のそれぞれに対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ここで抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤ４０に結合する。

【0014】

本開示の抗体又はその抗原結合部分の重鎖可変領域は、配列番号１９、２０（Ｘ１＝Ａ又はＳ）、２１又は２２に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ここで抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤ４０に結合する。配列番号１９のアミノ酸配列は、配列番号３１又は３２のヌクレオチド配列によってコードされ得、且つ配列番号２０（Ｘ１＝Ｓ）のアミノ酸配列は、配列番号３３のヌクレオチド配列によってコードされ得る。

【0015】

本開示の抗体又はその抗原結合部分の軽鎖可変領域は、配列番号２３、２４（Ｘ１＝Ｋ，Ｘ２＝Ｆ；又はＸ１＝Ｙ，Ｘ２＝Ｙ）、２５又は２６に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ここで抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤ４０に結合する。配列番号２３のアミノ酸配列は、配列番号３４又は３５のヌクレオチド配列によってコードされ得る。配列番号２４（Ｘ１＝Ｋ，Ｘ２＝Ｆ）のアミノ酸配列は、配列番号３６のヌクレオチド配列によってコードされ得る。

【0016】

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、（１）配列番号１９及び２３のそれぞれ；（２）配列番号２０（Ｘ１＝Ａ）及び２４（Ｘ１＝Ｋ，Ｘ２＝Ｆ）のそれぞれ；（３）配列番号２０（Ｘ１＝Ｓ）及び２４（Ｘ１＝Ｋ，Ｘ２＝Ｆ）のそれぞれ；（４）配列番号２０（Ｘ１＝Ａ）及び２４（Ｘ１＝Ｙ，Ｘ２＝Ｙ）のそれぞれ；（５）配列番号２０（Ｘ１＝Ｓ）及び２４（Ｘ１＝Ｙ，Ｘ２＝Ｙ）のそれぞれ；（６）配列番号２１及び２５のそれぞれ；又は（７）配列番号２２及び２６のそれぞれに対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み得、ＣＤ４０に結合する。

【0017】

本開示の単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分は、ジスルフィド結合により連結された重鎖及び軽鎖を含み得、重鎖は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含み得、軽鎖は、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含み得、ここで重鎖可変領域のＣ末端は、重鎖定常領域のＮ末端に連結され、且つ軽鎖可変領域のＣ末端は、軽鎖定常領域のＮ末端に連結され、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、上記のアミノ酸配列を含み得、抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤ４０に結合する。重鎖定常領域は、例えば配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ２定常領域、又は例えば配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１定常領域であり得、軽鎖定常領域は、例えば配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有するヒトκ定常領域であり得る。重鎖定常領域、例えばＦｃフラグメントは、低減又は増強されたＦｃＲ結合親和性を有するように改変され得る。配列番号２７、２８及び２９のアミノ酸配列のそれぞれは、配列番号３７、３８及び３９のヌクレオチド配列によってコードされ得る。

【0018】

特定の実施形態における本開示の抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むか又はそれらからなってもよく、各重鎖は、上記の重鎖定常領域、重鎖可変領域又はＣＤＲ配列を含み得、各軽鎖は、上記の軽鎖定常領域、軽鎖可変領域又はＣＤＲ配列を含み得、ここで抗体は、ＣＤ４０に結合する。本開示の抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプの完全長抗体であり得る。他の実施形態における本開示の抗体又はその抗原結合部分は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体、又は抗体フラグメント、例えばＦａｂ又はＦ（ａｂ'）_２フラグメントであり得る。

【0019】

本開示は、前記抗体、又はその抗原結合部分と異なる結合特異性を有する第２の官能基（例えば二次抗体）に連結された、本開示の抗体、又はその抗原結合部分を含み得る二重特異性分子も提供する。本開示は、治療薬、例えば細胞毒に連結された、本開示の抗体、又はその抗原結合部分を含み得る、免疫抱合体、例えば抗体－薬物コンジュゲートも提供する。別の態様において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部の中に作製され得る。さらに、キメラ抗原受容体を含み得る免疫細胞、例えばＴ細胞及びＮＫ細胞が提供される。さらに、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、腫瘍溶解性ウイルスによってコードされ得る、又はそれと併せて使用され得る。

【0020】

本開示の抗体、又はその抗原結合部分をコードする核酸分子、並びにこのような核酸を含み得る発現ベクター及びこのような発現ベクターを含み得る宿主細胞も本開示によって包含される。宿主細胞を使用し、本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分を調製するための方法であって、（ｉ）宿主細胞内で抗体を発現させる工程と、（ｉｉ）宿主細胞又はその細胞培養物から抗体を単離する工程と、を含み得る方法も提供される。

【0021】

本開示の抗体、又はその抗原結合部分、免疫抱合体、二重特異性分子、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ、ＣＡＲ－Ｔ細胞、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞、及び薬学的に許容できる担体を含み得る組成物も提供される。特定の実施形態において、医薬組成物は、抗癌剤などの治療薬をさらに含有し得る。

【0022】

さらなる別の態様において、本開示は、対象における免疫応答を調節する方法であって、対象における免疫応答が調節されるように、本開示の抗体、又はその抗原結合部分を対象に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、対象における免疫応答を増加させ、刺激し、又は増加させる。いくつかの実施形態において、該方法は、本開示の二重特異性分子、免疫抱合体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、又は抗体をコードする若しくは抗体を担持する腫瘍溶解性ウイルス、又は代替的には対象においてそれらを発現する能力がある核酸分子を投与することを含む。

【0023】

さらなる態様において、本開示は、それを必要とする対象における腫瘍増殖を阻害する方法であって、治療有効量の本開示の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。腫瘍は、限定はされないが、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、メラノーマ、結腸腺癌、膵臓癌、結腸癌、胃腸癌（ｇａｓｔｒｉｃｉｎｔｅｓｔｉｎｅｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、卵巣癌、子宮頸部癌、乳癌、肺癌、及び上咽頭癌を含む、固形又は非固形腫瘍であり得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる抗癌抗体は、本開示の抗体、又はその抗原結合部分とともに投与され得て、例えば、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＳＴＡＴ３抗体、及び／又は抗ＲＯＲ１抗体が挙げられる。さらに別の実施形態において、本開示の抗体、又はその抗原結合部分は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ及び／又はＩＬ－４）、又は共刺激抗体（例えば、抗ＣＤ１３７及び／又は抗ＧＩＴＲ抗体）とともに投与される。別の実施形態において、本開示の抗体、又はその抗原結合部分は、細胞傷害性薬物、例えば、エピルビシン、オキサリプラチン、及び／又は５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）であり得る化学療法剤とともに投与される。本開示の抗体又はその抗原結合部分は、例えば、マウス、ヒト、キメラ又はヒト化であり得る。

【0024】

別の態様において、本開示は、それを必要とする対象における感染症を治療又は軽減する方法であって、治療有効量の本開示の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。感染症は、ウイルス、細菌、真菌又はマイコプラズマ感染に起因する疾患であり得る。特定の実施形態において、感染症は、ＡＩＤＳ、結核又はマラリアである。特定の実施形態において、対象は、少なくとも１つの抗感染症薬、例えば、抗ウイルス薬、抗細菌薬、抗真菌薬、又は抗マイコプラズマ薬がさらに投与され得る。

【0025】

別の態様において、本開示は、それを必要とする対象における自己免疫性疾患を治療又は軽減する方法であって、治療有効量の本開示の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、対象は、少なくとも１つの抗炎症剤がさらに投与され得る。

【0026】

本開示の他の特徴及び利点は、限定であると解釈されるべきではない以下の詳細な説明及び実施例から明らかになるであろう。本出願を通して引用される全ての参照文献、Ｇｅｎｂａｎｋエントリ、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。

【0027】

したがって、本発明の目的は、任意の既に公知の製品、その製品の作製方法、又はその製品の使用方法を本発明に包含することではなく、したがって、本出願人は、その権利を留保し、任意の既に公知の製品、プロセス、又は方法の放棄を本明細書に開示する。本発明は、ＵＳＰＴＯの書面による記載及び実施可能要件（米国特許法第１１２条、第１段落）又はＥＰＯ（欧州特許条約（ＥＰＣ）８３条）を満たさない任意の製品、プロセス、又はその製品の作製方法又はその製品の使用方法を本発明の範囲内に包含することを意図しないことがさらに留意され、したがって、本出願人は、その権利を留保し、任意の既に記載された製品、その製品の作製方法、又はその製品の使用方法の放棄を本明細書に開示する。本発明の実施において、５３条（ｃ）ＥＰＣ及び規則２８（ｂ）及び（ｃ）ＥＰＣに準拠していることが有利であり得る。本出願の系統又は任意の他の系統又は任意の第三者の任意の先行出願における出願人の任意の登録特許の主題である任意の実施形態を明確に放棄する全ての権利が、明確に留保される。本明細書に記載されるいずれも、保証として解釈されるべきではない。

【0028】

本開示、特に、特許請求の範囲及び／又は段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語が、米国特許法による意味を有し得；例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得ること；及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」などの用語が、米国特許法による意味を有し、例えば、それらは、明示されていない要素を許容するが、先行技術において見出されるか又は本発明の基本的又は新規な特徴に影響を与える要素を除外することが留意される。

【0029】

例として示されるが、本発明を記載される特定の実施形態のみに限定することは意図されていない、以下の詳細な説明が、添付の図面と併せて最もよく理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1A】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、マウス抗体１Ａ３及び１Ｄ１のヒトＣＤ４０に対する結合能を示す。

【図1B】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、マウス抗体Ｃ１Ｈ１のヒトＣＤ４０に対する結合能を示す。

【図2A】細胞ベースの結合ＦＡＣＳにおける、マウス抗体１Ａ３及び１Ｄ１のヒトＣＤ４０を発現する２９３Ｔ細胞に対する結合能を示す。

【図2B】細胞ベースの結合ＦＡＣＳにおける、マウス抗体Ｃ１Ｈ１のヒトＣＤ４０を発現する２９３Ｔ細胞に対する結合能を示す。

【図3A】競合ＥＬＩＳＡにおける、マウス抗体１Ａ３及び１Ｄ１のヒトＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ結合に対するブロッキング能力を示す。

【図3B】競合ＥＬＩＳＡにおける、マウス抗体Ｃ１Ｈ１のヒトＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ結合に対するブロッキング能力を示す。

【図4A】競合ＥＬＩＳＡにおける、マウス抗体１Ａ３及び１Ｄ１のベンチマーク－ヒトＣＤ４０結合をブロックする能力を示す。

【図4B】競合ＥＬＩＳＡにおける、マウス抗体Ｃ１Ｈ１のベンチマーク－ヒトＣＤ４０結合をブロックする能力を示す。

【図5A】細胞ベースのレポーターアッセイにおける、マウス抗体１Ａ３及び１Ｄ１のＣＤ４０シグナル伝達を活性化する活性を示す。

【図5B】細胞ベースのレポーターアッセイにおける、マウス抗体Ｃ１Ｈ１のＣＤ４０シグナル伝達を活性化する活性を示す。

【図6A】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、キメラ抗体１Ａ３のヒトＣＤ４０に対する結合能を示す。

【図6B】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、キメラ抗体１Ｄ１のヒトＣＤ４０に対する結合能を示す。

【図6C】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、キメラ抗体Ｃ１Ｈ１のヒトＣＤ４０に対する結合能を示す。

【図7A】細胞ベースのレポーターアッセイにおける、キメラ抗体１Ａ３のＣＤ４０シグナル伝達を活性化する活性を示す。

【図7B】細胞ベースのレポーターアッセイにおける、キメラ抗体１Ｄ１のＣＤ４０シグナル伝達を活性化する活性を示す。

【図7C】細胞ベースのレポーターアッセイにおける、キメラ抗体Ｃ１Ｈ１のＣＤ４０シグナル伝達を活性化する活性を示す。

【図8】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、ヒト化抗体ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ１及びｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２のヒトＣＤ４０に対する結合能を示す。

【図9】細胞ベースの結合ＦＡＣＳにおける、ヒト化抗体ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ１及びｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２のヒトＣＤ４０を発現する２９３Ｔ細胞に対する結合能を示す。

【図10】競合ＥＬＩＳＡにおける、ヒト化抗体ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ１及びｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２のヒトＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ結合に対するブロッキング能力を示す。

【図11】競合ＥＬＩＳＡにおける、ヒト化抗体ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ１及びｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２のベンチマーク－ヒトＣＤ４０結合をブロックする能力を示す。

【図12】細胞ベースのレポーターアッセイにおける、ヒト化抗体ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ１及びｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２のＣＤ４０シグナル伝達を活性化する活性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0031】

本開示がより容易に理解され得ることを確実にするために、いくつかの用語がまず定義される。さらなる定義は、詳細な説明を通して記載される。

【0032】

「ＣＤ４０」という用語は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー５（ＴＮＦＲ５）を指す。「ＣＤ４０」という用語は、変異体、アイソフォーム、ホモログ、オルソログ及びパラログを含む。例えば、ヒトＣＤ４０タンパク質に特異的な抗体は、ある場合において、サルなどの、ヒト以外の種に由来するＣＤ４０タンパク質と交差反応し得る。他の実施形態において、ヒトＣＤ４０タンパク質に特異的な抗体は、ヒトＣＤ４０タンパク質に完全に特異的であり得、他の種に対する又は他のタイプの交差反応性を示さないことがあり、又は全ての他の種ではなく特定の他の種に由来するＣＤ４０と交差反応し得る。

【0033】

「ヒトＣＤ４０」という用語は、ＮＰ＿００１２４１．１のＧｅｎｂａｎｋ受託番号を有するヒトＣＤ４０のアミノ酸配列などの、ヒトに由来するアミノ酸配列を有するＣＤ４０タンパク質を指す（ＡｍｉｎｉＭｅｔａｌ．，（２０２０）ＬｉｆｅＳｃｉ２５４：１１７７７４）。「サル又はアカゲザルＣＤ４０」及び「マウスＣＤ４０」という用語はそれぞれ、サル及びマウスＣＤ４０配列を指し、例えば、それぞれＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２５２７９１．１及びＮＰ＿０３５７４１．２を有するアミノ酸配列を有するものである。

【0034】

「免疫応答」という用語は、侵入病原体、病原体に感染した細胞若しくは組織、癌性細胞、又は自己免疫性若しくは病理学的炎症の場合における正常なヒト細胞若しくは組織に対する選択的損傷、その破壊、又はヒト身体からのその排除をもたらす、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、及び上記細胞又は肝臓によって生成される可溶性高分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の作用を指す。

【0035】

本明細書において使用される際の「抗体」という用語は、少なくとも１つの抗原結合部位を通じて、標的、例えばＣＤ４０を認識し、それに特異的に結合する免疫グロブリン分子を指し、ここで抗原結合部位は通常、免疫グロブリン分子の可変領域内に存在する。本明細書において使用される際の該用語は、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）、軽鎖抗体（ＬＣＡｂ）、多特異性抗体、二重特異性抗体、単一特異性抗体、一価抗体、抗体の抗原結合部位を含む融合タンパク質、及び抗原結合部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子（例えば二重可変ドメイン免疫グロブリン分子）を、抗体が所望の生物学的活性を示す限り、包含する。抗体として、限定はされないが、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体も挙げられる。抗体は、それぞれがアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと称されるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づき、免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、又はそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のいずれかであり得る。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なる周知のサブユニット構造及び三次元立体配置を有する。抗体は、ネイキッドであるか、又は限定はされないが毒素及び放射性同位元素を含む他の分子にコンジュゲートされ得る。特に明示的に示されない限り、「抗体」という用語は、本明細書において使用される際の、インタクトな抗体の「抗原結合部分」を含む。ＩｇＧは、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含み得る糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶ_Ｈと略記される）及び重鎖定常領域から構成され得る。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３から構成され得る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶ_Ｌと略記される）及び軽鎖定常領域から構成され得る。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、Ｃ_Ｌから構成され得る。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分類され得る。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。

【0036】

本明細書において使用される際の、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ＣＤ４０タンパク質）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能が、完全長抗体のフラグメントによって行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ及びＣ_Ｈ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ'）_２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含み得る二価フラグメント；（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ及びＣ_Ｈ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶ_Ｌ及びＶ_ＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）Ｖ_ＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄｅｔａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４－５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；並びに（ｖｉｉｉ）ナノボディ、単一可変ドメイン及び２つの定常ドメインを含有する重鎖可変領域を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、それらをＶ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄｅｔａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎｅｔａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）として作製可能にする合成リンカーによる、組換え方法を用いて結合され得る。このような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、これらのフラグメントは、インタクトな抗体と同じように有用性についてスクリーニングされる。

【0037】

本明細書において使用される際の「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ＣＤ４０タンパク質に特異的に結合する単離抗体は、ＣＤ４０タンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＣＤ４０タンパク質に特異的に結合する単離抗体は、他の種に由来するＣＤ４０タンパク質などの他の抗原に対する交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まなくてもよい。

【0038】

本明細書において使用される際の「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。

【0039】

本明細書において使用される際の「マウス抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がマウス生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図される。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域はまた、マウス生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本開示のマウス抗体は、マウス生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダム若しくは部位特異的変異誘発又はインビボで体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される際の「マウス抗体」という用語は、別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がマウスフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことは意図されていない。

【0040】

「キメラ抗体」という用語は、非ヒト源に由来する遺伝物質を、ヒトに由来する遺伝物質と組み合わせることによって作製される抗体を指す。又はより一般に、キメラ抗体は、特定の種に由来する遺伝物質を、別の種に由来する遺伝物質とともに有する抗体である。

【0041】

本明細書において使用される際の「ヒト化抗体」という用語は、タンパク質配列が、ヒトにおいて天然に産生される抗体形態との類似性を増大するように修飾された、非ヒト種に由来する抗体を指す。

【0042】

「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義的に使用される。

【0043】

本明細書において使用される際、「ヒトＣＤ４０に特異的に結合する」抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＣＤ４０タンパク質（場合により、１つ以上の非ヒトに由来するＣＤ４０タンパク質）に結合するが、非ＣＤ４０タンパク質に実質的に結合しない抗体を指すことが意図される。好ましくは、抗体は、「高い親和性」、すなわち、５．０×１０^－８Ｍ以下、より好ましくは、１．０×１０^－８Ｍ以下のＫ_ＤでヒトＣＤ４０タンパク質に結合する。

【0044】

本明細書において使用される際の、タンパク質又は細胞に「実質的に結合しない」という用語は、タンパク質又は細胞に結合しないか又は高い親和性で結合しない、すなわち、１．０×１０^－６Ｍ以上、より好ましくは、１．０×１０^－５Ｍ以上、より好ましくは、１．０×１０^－４Ｍ以上、より好ましくは、１．０×１０^－３Ｍ以上、さらにより好ましくは、１．０×１０^－２Ｍ以上のＫ_Ｄでタンパク質又は細胞に結合することを意味する。

【0045】

ＩｇＧ抗体に対する「高い親和性」という用語は、標的抗原に対して１．０×１０^－６Ｍ以下、より好ましくは、９．０×１０^－９Ｍ以下、より好ましくは、５．０×１０^－９Ｍ以下、さらにより好ましくは、１．０×１０^－９Ｍ以下、さらにより好ましくは、５．０×１０^－１０Ｍ以下のＫ_Ｄを有する抗体を指す。しかしながら、「高い親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対して変化し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高い親和性」結合は、１０^－６Ｍ以下、より好ましくは、１０^－７Ｍ以下、さらにより好ましくは、１０^－８Ｍ以下のＫ_Ｄを有する抗体を指す。

【0046】

本明細書において使用される際の「Ｋ_{ａｓｓｏｃ}」又は「Ｋ_ａ」という用語が、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度を指すことが意図される一方、本明細書において使用される際の「Ｋ_ｄｉｓ」又は「Ｋ_ｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことが意図される。本明細書において使用される際の「Ｋ_Ｄ」という用語は、解離定数を指すことが意図され、これは、Ｋ_ｄ対Ｋ_ａの比率（すなわち、Ｋ_ｄ／Ｋ_ａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体についてのＫ_Ｄ値は、当該技術分野において十分に確立された方法を用いて決定され得る。抗体のＫ_Ｄを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いる、好ましくは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いることによる。

【0047】

最大半量の有効濃度としても知られている「ＥＣ_５０」という用語は、特定の曝露時間の後の、ベースラインと最大値との間の中間の応答を誘導する抗体の濃度を指す。

【0048】

半数阻害濃度としても知られている「ＩＣ_５０」という用語は、抗体の非存在と比べて５０％だけ特定の生物学的又は生化学的機能を阻害する抗体の濃度を指す。

【0049】

「対象」という用語は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、及びは虫類などの、哺乳動物及び非哺乳動物を含むが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ及びウマなどの哺乳動物が好ましい。

【0050】

「治療有効量」という用語は、疾患若しくは病態（癌など）に関連する症状を予防若しくは改善し、及び／又は疾患若しくは病態の重症度を低下させるのに十分な、本開示の抗体又はその抗原結合部分の量を意味する。治療有効量は、治療される病態に関して理解され、実際の有効量は、当業者によって容易に理解される。

【0051】

「アゴニストＣＤ４０抗体」又は「アゴニスト抗ＣＤ４０抗体」という用語は、ＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０シグナル伝達を活性化又は誘導することで、例えば、免疫細胞の活性化及び増殖、並びにサイトカイン及びケモカインの産生を促進する抗ＣＤ４０抗体を指す。一方で、「アンタゴニストＣＤ４０抗体」という用語は、ＣＤ４０Ｌの結合により誘導され得るＣＤ４０シグナル伝達をブロック又は阻害する抗ＣＤ４０抗体を指す。アゴニストＣＤ４０抗体は、腫瘍に対する腫瘍を担持する対象の自然及び適応免疫応答を、ＡＰＣの増強された抗原提示能、腫瘍特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化、リンパ球及び単球によるサイトカイン及びケモカインの分泌、細胞傷害性リンパ球及びＮＫ細胞による増強された腫瘍細胞死などを介して促進し得る。

【0052】

パーセント「同一性」は、２つ以上の核酸又はポリペプチドと関連して本明細書において使用される際、最大対応について比較及び整列される（必要があれば、ギャップを導入する）とき、保存的アミノ酸置換を配列同一性の一部として考慮しても又は考慮しなくても、同じであるか又は同じであるヌクレオチド若しくはアミノ酸残基の特定の百分率を有する、２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェア又はアルゴリズムを用いて、又は外観検査によって、測定され得る。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用可能である様々なアルゴリズム及びソフトウェアは、当該技術分野で周知である。これらは、限定はされないが、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ、及びそれらの変形（ｖａｒｉａｎｔｓ）を含む。いくつかの実施形態において、本発明の２つの核酸又はポリペプチドは、実質的に同一であり、それは、最大対応について配列比較アルゴリズムを用いて又は外観検査による測定として比較及び整列されるとき、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、いくつかの実施形態において、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性をそれらが有することを意味する。

【0053】

本開示の様々な態様は、以下のサブセクションでさらに詳細に説明される。

【0054】

本開示の抗体、又はその抗原結合部分は、ヒトＣＤ４０に、前述の抗ＣＤ４０抗体、例えばダセツズマブ及びセリクレルマブと比較して、高くなくても同等の結合親和性で特異的に結合する。

【0055】

さらなる機能的特性は、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ結合をブロックし、且つＣＤ４０シグナル伝達を活性化する能力を含む。

【0056】

本開示の好ましい抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。それに加えて又はその代わりに、抗体は、例えばキメラモノクローナル抗体であり得る。

【0057】

【表1】

【0058】

本開示の例示的な抗体又はその抗原結合部分は、下記のように、また以下の実施例において構造的且つ化学的に特徴付けられる。抗体の重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸配列ＩＤ番号は、上記の表１に要約され、一部の抗体は同じＶ_Ｈ又はＶ_Ｌを共有する。抗体における重鎖定常領域は、例えば配列番号２７及び２８で示されるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２重鎖定常領域であり得、また抗体における軽鎖定常領域は、例えば配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有するヒトκ定常領域であり得る。これらの抗体はまた、マウスＩｇＧ１若しくはＩｇＧ２重鎖定常領域、及び／又はマウスκ定常領域を有し得る。

【0059】

表１中の重鎖可変領域ＣＤＲ及び軽鎖可変領域ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって定義されている。しかしながら、当該技術分野において周知であるように、ＣＤＲ領域はまた、重鎖／軽鎖可変領域配列に基づいて、Ｃｈｏｔｈｉａ、及びＩＭＧＴ、ＡｂＭ、又はＣｏｎｔａｃｔ番号付けシステム／方法などの他のシステムによって決定され得る。

【0060】

ヒトＣＤ４０に結合する他の抗ＣＤ４０抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列（又はＣＤＲ配列）は、本開示の抗ＣＤ４０抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列（又はＣＤＲ配列）と「混合及び適合させる」ことができる。好ましくは、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ鎖（又はこのような鎖内のＣＤＲ）が、混合及び適合される場合、特定のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ対合からのＶ_Ｈ配列が、構造的に類似のＶ_Ｈ配列で置き換えられる。同様に、好ましくは、特定のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ対合からのＶ_Ｌ配列が、構造的に類似のＶ_Ｌ配列で置き換えられる。

【0061】

したがって、一実施形態において、本開示の抗体、又はその抗原結合部分は、
（ａ）表１中で上に列挙されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
（ｂ）表１中で上に列挙されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は別の抗ＣＤ４０抗体のＶ_Ｌを含み、ここで、抗体は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する。

【0062】

別の実施形態において、本開示の抗体、又はその抗原結合部分は、
（ａ）表１中で上に列挙される重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域；及び
（ｂ）表１中で上に列挙される軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域又は別の抗ＣＤ４０抗体のＣＤＲを含み、ここで、抗体は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する。

【0063】

さらに別の実施形態において、抗体、又はその抗原結合部分は、ヒトＣＤ４０に結合する他の抗体のＣＤＲ、例えば、重鎖可変領域からのＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ３と組み合わされた抗ＣＤ４０抗体の重鎖可変ＣＤＲ２領域、並びに／或いは異なる抗ＣＤ４０抗体の軽鎖可変領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３を含む。

【0064】

さらに、ＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２ドメインから独立して、ＣＤＲ３ドメインは、単独で、同種抗原に対する抗体の結合特異性を決定することができること、及び複数の抗体が、予想通りに、共通のＣＤＲ３配列に基づいて、同じ結合特異性を有して生成され得ることが当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｌｉｍｋａｅｔａｌ．，ＢｒｉｔｉｓｈＪ．ｏｆＣａｎｃｅｒ８３（２）：２５２－２６０（２０００）；Ｂｅｉｂｏｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３－８４９（２０００）；Ｒａｄｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０－８９１５（１９９８）；Ｂａｒｂａｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１－２１６２（１９９４）；Ｂａｒｂａｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９－２５３３（１９９５）；Ｄｉｔｚｅｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９－７４９（１９９６）；Ｂｅｒｅｚｏｖｅｔａｌ．，ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ８：ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｖｉｅｗ８（２００１）；Ｉｇａｒａｓｈｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１７：４５２－７（１９９５）；Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ７２：８０７－１０（１９９８）；Ｌｅｖｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４３７４－８（１９９３）；ＰｏｌｙｍｅｎｉｓａｎｄＳｔｏｌｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５２１８－５３２９（１９９４）及びＸｕａｎｄＤａｖｉｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３：３７－４５（２０００）を参照されたい。また、米国特許第６，９５１，６４６号明細書；同第６，９１４，１２８号明細書；同第６，０９０，３８２号明細書；同第６，８１８，２１６号明細書；同第６，１５６，３１３号明細書；同第６，８２７，９２５号明細書；同第５，８３３，９４３号明細書；同第５，７６２，９０５号明細書及び同第５，７６０，１８５号明細書を参照されたい。これらの参照文献はそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される。

【0065】

したがって、別の実施形態において、本開示の抗体は、抗ＣＤ４０抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２、並びに抗ＣＤ４０抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３、又は別の抗ＣＤ４０抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含み、ここで、抗体は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合することが可能である。これらの抗体は、好ましくは、（ａ）ＣＤ４０との結合について競合し；（ｂ）機能的特性を保持し；（ｃ）同じエピトープに結合し；及び／又は（ｄ）本開示の抗ＣＤ４０抗体と同様の結合親和性を有する。さらに別の実施形態において、抗体は、抗ＣＤ４０抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、又は別の抗ＣＤ４０抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２をさらに含み得、ここで、抗体は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合することが可能である。別の実施形態において、本開示の抗体は、抗ＣＤ４０抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１、又は別の抗ＣＤ４０抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１をさらに含み得、ここで、抗体は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合することが可能である。

【0066】

別の実施形態において、本開示の抗体は、１つ以上の保存的修飾だけ、本開示の抗ＣＤ４０抗体のものと異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の重鎖及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。特定の保存的配列修飾が、抗原結合を除去せずに作製され得ることが、当該技術分野において理解される。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌｅｔａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ３２：１１８０－８；ｄｅＷｉｌｄｔｅｔａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５－４１；Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖｅｔａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４－２６８７０；Ｈａｌｌｅｔａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５－１２；ＫｅｌｌｅｙａｎｄＯ'Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２－３５；Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙｅｔａｌ．，（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１－６及びＢｅｅｒｓｅｔａｌ．，（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５－４３を参照されたい。

【0067】

したがって、一実施形態において、抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域及び／又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで：
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｂ）重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｃ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｄ）軽鎖可変領域ＣＤＲ１、及び／又はＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列；及び／又はその保存的修飾を含み；
（ｅ）抗体は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する。

【0068】

本開示の抗体は、ヒトＣＤ４０に対する高親和性結合、及びＣＤ４０発現細胞に対するＣＤ４０シグナル伝達を活性化する能力などの、上述される以下の機能特性の１つ以上を有する。

【0069】

様々な実施形態において、抗体は、例えば、マウス、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体であり得る。

【0070】

本明細書において使用される際、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に実質的に影響を与えないか又は変化させないアミノ酸修飾を指すことが意図される。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加及び欠失を含む。修飾は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発などの、当該技術分野において公知の標準的な技術によって、本開示の抗体に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β－分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、本開示の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置換され得、改変された抗体が、本明細書に記載される機能アッセイを用いて、保持された機能（すなわち、上記の機能）について試験され得る。

【0071】

本開示の抗体は、修飾された抗体を操作するように、出発材料として本開示の抗ＣＤ４０抗体のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ配列の１つ以上を有する抗体を用いて調製され得る。抗体は、１つ又は両方の可変領域（すなわち、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ）内、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域内及び／又は１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上の残基を修飾することによって操作され得る。それに加えて又はその代わりに、抗体は、例えば抗体のエフェクター機能を改変するために、定常領域内の残基を修飾することによって操作され得る。

【0072】

特定の実施形態において、ＣＤＲグラフト法は、抗体の可変領域を操作するのに使用され得る。抗体は、主に、６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外部の配列より個々の抗体間でより異なっている。ＣＤＲ配列が、ほとんどの抗体－抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列にグラフトされた特定の天然抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３－３２７；Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２－５２５；Ｑｕｅｅｎｅｔａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．を参照されたい。Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９－１００３３；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書も参照されたい）。

【0073】

したがって、本開示の別の実施形態は、上述される、本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、及び／又は上述される、本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分に関する。これらの抗体が、本開示のモノクローナル抗体のＶ_Ｈ及びＶ_ＬＣＤＲ配列を含む一方、それらは、異なるフレームワーク配列を含み得る。

【0074】

このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベース又は刊行されている参照文献から得られる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列の配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで、インターネットで利用可能）、並びにＫａｂａｔｅｔａｌ．，（１９９１）（上記に引用される）；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８；及びＣｏｘｅｔａｌ．，（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７－８３６（これらのそれぞれの内容が、参照により本明細書に明示的に援用される）において見出され得る。別の例として、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおいて見出され得る。例えば、ＨＣｏ７ＨｕＭＡｂマウスにおいて見出される以下の重鎖生殖細胞系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋ受託番号１－６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７及びＢＣ０７０３３３）、３－３３（ＮＧ－－００１０１０９及びＮＴ－－０２４６３７）並びに３－７（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）において利用可能である。別の例として、ＨＣｏ１２ＨｕＭＡｂマウスにおいて見出される以下の重鎖生殖細胞系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋ受託番号１－６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７及びＢＣ０７０３３３）、５－５１（ＮＧ－－００１０１０９及びＮＴ－－０２４６３７）、４－３４（ＮＧ－－００１０１０９及びＮＴ－－０２４６３７）、３－３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）並びに３－２３（ＡＪ４０６６７８）において利用可能である。

【0075】

抗体タンパク質配列は、当業者に周知の、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，（１９９７）、上記を参照）と呼ばれる配列類似性検索法の１つを用いて、コンパイルされたタンパク質配列データベースに対して比較される。

【0076】

本開示の抗体において使用するための好ましいフレームワーク配列は、本開示の抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に類似のものである。Ｖ_ＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子において見出されるものと同一の配列を有するフレームワーク領域にグラフトされ得、又はＣＤＲ配列は、生殖細胞系列配列と比較して１つ以上の変異を含むフレームワーク領域にグラフトされ得る。例えば、ある場合において、抗体の抗原結合能力を維持又は強化するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが分かっている（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。

【0077】

別のタイプの可変領域修飾は、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_ＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させることであり、それによって、対象とする抗体の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を改善する。部位特異的変異誘発又はＰＣＲ媒介変異誘発は、変異を導入するために行われ得、抗体結合に対する効果、又は対象とする他の機能的特性が、当該技術分野において公知のインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価され得る。好ましくは、保存的修飾（当該技術分野において公知であるように）が導入される。変異は、アミノ酸置換、付加又は欠失であり得るが、好ましくは、置換である。さらに、典型的に、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４又は５つ以下の残基が改変される。

【0078】

したがって、別の実施形態において、本開示は、（ａ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ１領域；（ｂ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ２領域；（ｃ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ３領域；（ｄ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ１領域；（ｅ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ２領域；及び（ｆ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む、単離された抗ＣＤ４０モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。

【0079】

本開示の操作された抗体は、修飾が、例えば、抗体の特性を改善するために、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ内のフレームワーク残基に行われたものを含む。典型的に、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、一手法は、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列配列へと「復帰変異（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」させることである。より詳細には、体細胞変異を起こした抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することによって同定され得る。

【0080】

別のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって、抗体の潜在的な免疫原性を低下させるために、フレームワーク領域内、或いは１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を変異させることを含む。この手法は、「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書にさらに詳細に記載されている。

【0081】

フレームワーク若しくはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えて、又はその代わりに、本開示の抗体は、典型的に、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／又は抗原依存的細胞毒性などの、抗体の１つ以上の機能的特性を改変するために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作され得る。さらに、本開示の抗体は、同様に抗体の１つ以上の機能的特性を改変するために化学修飾され得るか（例えば、１つ以上の化学部分が、抗体に結合され得る）又はそのグリコシル化を改変するために修飾され得る。

【0082】

一実施形態において、ＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変化される、例えば、増加又は減少されるように修飾される。この手法は、米国特許第５，６７７，４２５号明細書にさらに記載されている。ヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖の組み立てを容易にするために、又は抗体の安定性を増大若しくは低下させるために変化される。

【0083】

別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生体半減期を増加させるか又は減少させるように変異される。より詳細には、１つ以上のアミノ酸変異は、抗体が、天然Ｆｃ－ヒンジ領域ＳｐＡ結合と比べて損なわれたブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を有するように、Ｆｃ－ヒンジフラグメントのＣ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメイン境界領域に導入される。この手法は、米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳細に記載されている。

【0084】

さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化は、修飾される。例えば、非グリコシル化抗体が作製され得る（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増大するために改変され得る。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を改変することによって達成され得る。例えば、１つ以上のアミノ酸置換は、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位をなくし、それによって、その部位におけるグリコシル化をなくすように行われ得る。このようなグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増大し得る。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号明細書及び同第６，３５０，８６１号明細書を参照されたい。

【0085】

それに加えて又はその代わりに、改変されたタイプのグリコシル化を有する抗体、例えば、減少した量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体又は増加したバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体が作製され得る。このような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増大することが実証されている。このような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現することによって達成され得る。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当該技術分野において記載されており、本開示の組換え抗体を発現する宿主細胞として使用され、それによって、改変されたグリコシル化を有する抗体を産生することができる。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（α（１，６）－フコシルトランスフェラーゼ）を欠いており、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９細胞株において発現される抗体が、それらの炭水化物においてフコースを欠くようになっている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９ＦＵＴ８－／－細胞株を、２つの置換ベクターを用いて、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的化破壊によって生成した（米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号明細書及びＹａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉｅｔａｌ．，（２００４）ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ８７：６１４－２２を参照されたい）。別の例として、欧州特許第１，１７６，１９５号明細書には、このような細胞株において発現される抗体が、α－１，６結合関連酵素を減少させるか又は除去することによって低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株が記載されている。また、欧州特許第１，１７６，１９５号明細書には、抗体のＦｃ領域に結合するか又は酵素活性を有さない、フコースのＮ－アセチルグルコサミンへの付加に対して低い酵素活性を有する細胞株、例えばラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣＣＲＬ１６６２）が記載されている。国際公開第０３／０３５８３５号には、フコースをＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に結合する能力を低下させ、その宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化ももたらす変異ＣＨＯ細胞株であるＬｅｃ１３細胞が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓｅｔａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０も参照）。修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体はまた、国際公開第０６／０８９２３１号に記載されるように、ニワトリ卵において産生され得る。或いは、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、アオウキクサ属（Ｌｅｍｎａ）などの植物細胞において産生され得る。植物系における抗体の産生のための方法は、２００６年８月１１日に出願されたＡｌｓｔｏｎ＆ＢｉｒｄＬＬＰ代理人整理番号０４０９８９／３１４９１１号に対応する米国特許出願に開示されている。国際公開第９９／５４３４２号には、操作された細胞株において発現される抗体が、抗体の増加したＡＤＣＣ活性をもたらすバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株が記載されている（Ｕｍａｎａｅｔａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０も参照）。或いは、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を用いて切断され得；例えば、フコシダーゼα－Ｌ－フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏｅｔａｌ．，（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６－２３）。

【0086】

本開示によって想定される本明細書の抗体の別の修飾は、ペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生体（例えば、血清）半減期を増加させるために、ペグ化され得る。抗体をペグ化するために、抗体、又はそのフラグメントは、典型的に、１つ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体フラグメントに結合される条件下で、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応される。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応によって行われる。本明細書において使用される際、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ_１～Ｃ_１０）アルコキシ－又はアリールオキシ－ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール－マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するのに使用されているＰＥＧの形態のいずれかを包含することが意図される。特定の実施形態において、ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、当該技術分野において公知であり、本開示の抗体に適用され得る。例えば、欧州特許第１５４３１６号明細書及び欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照されたい。

【0087】

本開示の抗体は、その異なるクラスを検出及び／又は区別するために、それらの様々な物理的特性によって特徴付けられ得る。

【0088】

例えば、抗体は、軽鎖又は重鎖可変領域のいずれかにおける１つ以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗体の増加した免疫原性又は改変された抗原結合による抗体のｐＫの改変をもたらし得る（Ｍａｒｓｈａｌｌｅｔａｌ．，（１９７２）ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ４１：６７３－７０２；ＧａｌａａｎｄＭｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１７２：５４８９－９４；Ｗａｌｌｉｃｋｅｔａｌ．，（１９８８）ＪＥｘｐＭｅｄ１６８：１０９９－１０９；Ｓｐｉｒｏ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１２：４３Ｒ－５６Ｒ；Ｐａｒｅｋｈｅｔａｌ．，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１６：４５２－７；Ｍｉｍｕｒａｅｔａｌ．，（２０００）ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ３７：６９７－７０６）。グリコシル化は、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフにおいて起こることが知られている。ある場合には、可変領域グリコシル化を含まない抗ＣＤ４０抗体を有することが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択することによって、又はグリコシル化領域内の残基を変異させることによって、達成され得る。

【0089】

好ましい実施形態において、抗体は、アスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ－Ｇ又はＤ－Ｇ配列において起こり得、結合をポリペプチド鎖に導入し、その安定性を低下させる（イソアスパラギン酸効果）イソアスパラギン酸残基の生成をもたらし得る。

【0090】

各抗体は、一般に６～９．５のｐＨ範囲内の特有の等電点（ｐＩ）を有する。ＩｇＧ１抗体のｐＩは、典型的に、７～９．５のｐＨ範囲内であり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、典型的に、６～８のｐＨ範囲内である。正常範囲外のｐＩを有する抗体が、インビボ条件下でいくらかのアンフォールディング及び不安定性を有し得ると推測されている。したがって、正常範囲内のｐＩ値を有する抗ＣＤ４０抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲内のｐＩを有する抗体を選択することによって、又は荷電表面残基を変異させることによって達成され得る。

【0091】

別の態様において、本開示は、本開示の抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域、又はＣＤＲをコードする核酸分子を提供する。核酸は、全細胞で、細胞溶解物で、又は部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、標準的な技術によって、他の細胞成分又は他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質から精製されるとき、「単離される」又は「実質的に純粋にされる」。本開示の核酸は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでいても又は含まなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。

【0092】

本開示の核酸は、標準的な分子生物学技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体について、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって得られる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を用いて）得られる抗体について、このような抗体をコードする核酸が、遺伝子ライブラリーから回収され得る。

【0093】

本開示の好ましい核酸分子は、ＣＤ４０モノクローナル抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列又はＣＤＲをコードするものを含む。一旦Ｖ_Ｈ及びＶ_ＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られると、これらのＤＮＡフラグメントは、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するため、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作され得る。これらの操作において、Ｖ_Ｌ又はＶ_ＨをコードするＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域又はフレキシブルリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡフラグメントに作動可能に連結される。この文脈において使用される際の「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がフレーム内に留まるように、２つのＤＮＡフラグメントが結合されることを意味することが意図される。

【0094】

Ｖ_Ｈ領域をコードする単離されたＤＮＡは、Ｖ_ＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において公知であり、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得られる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２定常領域である。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子について、Ｖ_ＨをコードするＤＮＡは、重鎖Ｃ_Ｈ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。

【0095】

Ｖ_Ｌ領域をコードする単離されたＤＮＡは、Ｖ_ＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域、Ｃ_Ｌをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において公知であり、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得られる。好ましい実施形態において、軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域であり得る。

【0096】

ｓｃＦｖ遺伝子を生成するために、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列が、フレキシブルリンカーによって結合されたＶ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域を有する連続一本鎖タンパク質として発現され得るように、Ｖ_Ｈ及びＶ_ＬをコードするＤＮＡフラグメントは、フレキシブルリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３をコードする別のフラグメントに作動可能に連結される（例えば、Ｂｉｒｄｅｔａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６；Ｈｕｓｔｏｎｅｔａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙｅｔａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２－５５４を参照されたい）。

【0097】

本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５の周知の体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）技術を用いて産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための他の実施形態は、Ｂリンパ球のウイルス又は発癌性形質転換及びファージディスプレイ技術を含む。キメラ又はヒト化抗体も、当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；同第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書（これらの内容は、全体が参照により本明細書に具体的に援用される）を参照されたい。

【0098】

本開示の抗体はまた、例えば、当該技術分野において周知であるような、組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション方法の組合せを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマ中で産生され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２）。一実施形態において、標準的な分子生物学技術によって得られる部分的又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳調節配列に作動可能に連結されるように、１つ以上の発現ベクターに挿入される。これに関して、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図された機能を果たすように、抗体遺伝子が、ベクターにライゲートされることを意味することが意図される。

【0099】

「調節配列」という用語は、抗体遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０））に記載されている。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列は、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指向するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルスに由来するプロモーター及び／又はエンハンサー、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）及びポリオーマを含む。或いは、ユビキチンプロモーター又はβ－グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列が使用され得る。さらにまた、調節要素は、ＳＶ４０初期プロモーター及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列からの配列を含む、ＳＲαプロモーター系などの異なる源に由来する配列から構成される（Ｔａｋｅｂｅｅｔａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６－４７２）。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。

【0100】

抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、同じ又は別個の発現ベクターに挿入され得る。好ましい実施形態において、可変領域は、Ｖ_Ｈセグメントが、ベクター内のＣ_Ｈセグメントに作動可能に連結され、Ｖ_Ｌセグメントが、ベクター内のＣ_Ｌセグメントに作動可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常及び軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターに可変領域を挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を生成するために使用される。それに加えて又はその代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質に由来するシグナルペプチド）であり得る。

【0101】

抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択可能マーカー遺伝子を有し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号明細書；同第４，６３４，６６５号明細書及び同第５，１７９，０１７号明細書を参照されたい）。例えば、典型的に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞において、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ－宿主細胞における使用のため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を含む。

【0102】

軽鎖及び重鎖の発現のため、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の様々な形態が、外来性ＤＮＡを原核生物又は真核生物宿主細胞に導入するために一般的に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。原核生物又は真核生物宿主細胞のいずれにおいても本開示の抗体を発現させることが理論上可能であるが、真核細胞、特に哺乳動物細胞が、原核細胞より、適切に折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が高いため、このような真核細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。

【0103】

本開示の組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｒ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎａｎｄＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１に記載されているような、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用される、ＵｒｌａｕｂａｎｄＣｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６－４２２０に記載されている、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞との使用について、別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号、国際公開第８９／０１０３６号及び欧州特許第３３８，８４１号明細書に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞に導入されるとき、抗体は、宿主細胞における抗体の発現又は、より好ましくは、宿主細胞が増殖される培養培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間にわたって、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて、培養培地から回収され得る。

【0104】

本開示の抗体は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などの免疫抱合体を形成するために、治療剤にコンジュゲートされ得る。好適な治療剤としては、細胞毒素、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質、及び抗有糸分裂剤が挙げられる。ＡＤＣにおいて、抗体及び治療剤は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィド、又はヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーを介してコンジュゲートされる。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ、Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｖａｌ、Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ｃｉｔ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、又はＧｌｕなどのペプチジルリンカーである。ＡＤＣは、米国特許第７，０８７，６００号明細書；同第６，９８９，４５２号明細書；及び同第７，１２９，２６１号明細書；国際公開第０２／０９６９１０号；国際公開第０７／０３８，６５８号；国際公開第０７／０５１，０８１号；国際公開第０７／０５９，４０４号；国際公開第０８／０８３，３１２号；及び国際公開第０８／１０３，６９３号；米国特許出願公開第２００６／００２４３１７号明細書；同第２００６／０００４０８１号明細書；及び同第２００６／０２４７２９５号明細書（これらの開示内容は、参照により本明細書に援用される）に記載されているように調製され得る。

【0105】

別の態様において、本開示は、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を生成するために、少なくとも１つの他の機能分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体又はリガンド）に連結された本開示の１つ以上の抗体を含む二重特異性分子を特徴とする。したがって、本明細書において使用される際、「二重特異性分子」は、３つ以上の特異性を有する分子を含む。

【0106】

一実施形態において、二重特異性分子は、抗Ｆｃ結合特異性及び抗ＣＤ４０結合特異性に加えて、第３の特異性を有する。第３の特異性は、抗促進因子（ａｎｔｉ－ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｆａｃｔｏｒ）（ＥＦ）、例えば、細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、それによって標的細胞に対する免疫応答を増加させる分子に関するものであり得る。例えば、抗促進因子は、細胞毒性Ｔ細胞（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、若しくはＩＣＡＭ－１を介して）又は他の免疫細胞に結合して、標的細胞に対する増加した免疫応答をもたらし得る。

【0107】

二重特異性分子は、多くの異なるフォーマット及びサイズであり得る。サイズスペクトルの一方の側では、二重特異性分子は、同一の特異性の２つの結合アームを有する代わりに、それぞれ異なる特異性を有する２つの結合アームを有することを除いて、従来の抗体フォーマットを保持している。他方の側では、ペプチド鎖によって連結される２つの一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ'ｓ）、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）_２構築物からなる二重特異性分子である。中間サイズの二重特異性分子は、ペプチジルリンカーによって連結される２つの異なるＦ（ａｂ）フラグメントを含む。これらの及び他のフォーマットの二重特異性分子は、遺伝子組換え、体細胞ハイブリダイゼーション、又は化学的方法によって調製され得る。例えば、Ｋｕｆｅｒｅｔａｌ．（上記に引用される）；ＣａｏａｎｄＳｕｒｅｓｈ，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，９（６），６３５－６４４（１９９８）；及びｖａｎＳｐｒｉｅｌｅｔａｌ．，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ，２１（８），３９１－３９７（２０００）、並びにそれらの中に引用される参照文献を参照されたい。

【0108】

本明細書には、優先的に、癌細胞を感染させ、死滅させる、腫瘍溶解性ウイルスも提供される。本開示の抗体は、腫瘍溶解性ウイルスとともに使用され得る。或いは、本開示の抗体をコードする腫瘍溶解性ウイルスは、ヒトの身体に導入され得る。

【0109】

キメラ抗原受容体
抗ＣＤ４０ｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も、本明細書において提供され、この抗ＣＤ４０ｓｃＦｖは、本明細書に記載されるＣＤＲ及び重鎖／軽鎖可変領域を含む。

【0110】

抗ＣＤ４０ＣＡＲは、（ａ）抗ＣＤ４０ｓｃＦｖを含む細胞外抗原結合ドメイン；（ｂ）膜貫通ドメイン；及び（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。

【0111】

ＣＡＲは、新生受容体を小胞体に指向する、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端におけるシグナルペプチド、及び受容体を結合のためにより多く利用できるようにする、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端におけるヒンジペプチドを含有し得る。ＣＡＲは、好ましくは、細胞内シグナル伝達ドメインにおいて、主要な細胞内シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。主に使用される、最も有効な主要な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭを含むＣＤ３－ζ細胞質ドメインであり、そのリン酸化が、Ｔ細胞活性化をもたらす。共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７及びＯＸ４０などの共刺激タンパク質に由来し得る。

【0112】

ＣＡＲは、Ｔ細胞増殖、持続性、及び抗腫瘍活性を促進する因子、例えば、サイトカイン、及び共刺激リガンドをさらに追加し得る。

【0113】

本明細書において提供されるＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞も提供される。ある実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、又は胚性幹細胞である。ある実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。

【0114】

別の態様において、本開示は、薬学的に許容できる担体とともに製剤化される、本開示の１つ以上の抗体又はその抗原結合部分、二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体、核酸分子、発現ベクター、又は宿主細胞を含み得る医薬組成物を提供する。抗体又はその抗原結合部分、二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体、核酸分子、発現ベクター、又は宿主細胞は、組成物が２つ以上の抗体（又はその抗原結合部分、二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体、核酸分子、発現ベクター、又は宿主細胞）を含むとき、別々に投与され得る。組成物は、１つ以上のさらなる薬学的に有効な成分、例えば別の抗体又は薬剤、例えば抗腫瘍薬を任意に含有し得る。

【0115】

医薬組成物は、あらゆる賦形剤を含み得る。使用され得る賦形剤は、担体、表面活性剤、増粘剤又は乳化剤、固体結合剤、分散若しくは懸濁補助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング、崩壊剤、滑沢剤、甘味料、防腐剤、等張剤、及びそれらの組合せを含む。好適な賦形剤の選択及び使用が、Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈＥｄ．（ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ２００３）（その開示内容は、参照により本明細書に援用される）に教示されている。

【0116】

好ましくは、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に好適である。投与経路に応じて、有効成分は、酸の作用及びそれを不活性にし得る他の天然条件からそれを保護するための材料でコーティングされ得る。本明細書において使用される際の「非経口投与」という語句は、経腸及び局所投与以外の、通常注射による投与方法を意味し、限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外並びに胸骨内注射及び注入を含む。或いは、本開示の医薬組成物は、経口（ｎｏｎ－ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路によって、例えば、局所、表皮又は粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下又は局所的に投与され得る。

【0117】

医薬組成物は、滅菌水溶液又は分散体の形態であり得る。それらはまた、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は他の高い薬物濃度に好適な規則的な構造で製剤化され得る。

【0118】

単一剤形を製造するために担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、治療される対象及び特定の投与方法に応じて変化し、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、１００％のうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、約０．０１％～約９９％の有効成分の範囲である。

【0119】

投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するために調整される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、経時的に数回の分割投与で投与されてもよく、又は用量は、治療状況の緊急性により示されるとき比例的に減少若しくは増加され得る。投与の容易性及び投与量の均一性のため、非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される際の投与単位形態は、治療される対象に対する単位投与量として適した物理的に分離した単位を指し；各単位は、必要な医薬担体とともに、所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の有効成分を含有する。或いは、抗体は、あまり頻繁でない投与が必要とされる場合、徐放性製剤として投与され得る。

【0120】

抗体の投与においては、用量は、約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。

【0121】

本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分の「治療有効用量」は、好ましくは、疾患の症状の重症度の低下、疾患の無症状期間の頻度及び持続時間の増加、又は疾患の苦痛に起因する障害若しくは身体障害の予防をもたらす。例えば、腫瘍を有する対象の治療について、「治療有効投与量」は、好ましくは、非治療対象と比べて、少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約４０％、さらにより好ましくは、少なくとも約６０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８０％だけ腫瘍増殖を阻害する。治療有効量の治療用抗体は、腫瘍サイズを減少させるか、又は典型的にヒトであるか又は別の哺乳動物であり得る対象において症状を改善することができる。

【0122】

医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤であり得る。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸が使用され得る。例えば、ＳｕｓｔａｉｎｅｄａｎｄＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７８を参照されたい。

【0123】

治療用組成物は、医療デバイス、例えば、（１）無針皮下注射デバイス（例えば、米国特許第５，３９９，１６３号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；及び同第４，５９６，５５６号明細書）；（２）微小注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号明細書）；（３）経皮デバイス（米国特許第４，４８６，１９４号明細書）；（４）注入装置（米国特許第４，４４７，２３３号明細書及び同第４，４４７，２２４号明細書）；並びに（５）浸透デバイス（米国特許第４，４３９，１９６号明細書及び同第４，４７５，１９６号明細書）（これらの開示内容は、参照により本明細書に援用される）によって投与され得る。

【0124】

特定の実施形態において、本開示のモノクローナル抗体は、インビボで適切な分布を確実にするため製剤化され得る。例えば、本開示の治療用抗体が、血液脳関門を通過することを確実にするために、それらは、リポソーム中で製剤化され得、これらは、特定の細胞又は器官への選択的輸送を促進するための標的分子をさらに含み得る。例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書；同第５，３７４，５４８号明細書；同第５，４１６，０１６号明細書；及び同第５，３９９，３３１号明細書；Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５；Ｕｍｅｚａｗａｅｔａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８；Ｂｌｏｅｍａｎｅｔａｌ．，（１９９５）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓｅｔａｌ．，（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０；Ｂｒｉｓｃｏｅｅｔａｌ．，（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４；Ｓｃｈｒｅｉｅｒｅｔａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０；ＫｅｉｎａｎｅｎａｎｄＬａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３４６：１２３；及びＫｉｌｌｉｏｎａｎｄＦｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２７３を参照されたい。

【0125】

本開示の医薬組成物は、例えば癌の治療及び／若しくは予防、又はより一般には癌を有する患者における免疫応答増強を含む、極めて多数のインビトロ及びインビボでの有用性を有する。医薬組成物は、例えばインビボでヒト対象に投与することで、腫瘍増殖を阻害し、又は感染症若しくは自己免疫性疾患を治療若しくは軽減することができる。

【0126】

本開示の医薬組成物が癌細胞の増殖及び生存を阻害する能力を仮定すれば、本開示は、それを必要とする対象における腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法であって、対象において腫瘍の増殖が阻害されるように本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示の医薬組成物により治療可能である腫瘍の非限定的な例としては、限定はされないが、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、メラノーマ、結腸腺癌、膵臓癌、結腸癌、胃腸癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、卵巣癌、子宮頸部癌、乳癌、肺癌、及び上咽頭癌が挙げられる。加えて、本開示の医薬組成物はまた、増殖が本開示の組成物により阻害され得る場合の難治性又は再発性悪性腫瘍に適用され得る。

【0127】

以下に、本開示のこれら及び他の方法が、さらに詳細に考察される。

【0128】

別の態様において、本開示は、本開示の医薬組成物が対象における腫瘍増殖を阻害するのに有効である１つ以上のさらなる抗体又は非抗体薬と共投与される場合の併用療法の方法を提供する。一実施形態において、本開示は、対象における腫瘍増殖を阻害するための方法であって、本開示の医薬組成物、並びに１つ以上のさらなる抗体、例えば抗ＴＩＭ３抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、及び抗ＰＤ－１抗体及び／又は抗ＣＴＬＡ－４抗体を対象に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、対象はヒトである。特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、さらに標準的な癌治療と組み合わされ得る。例えば、本開示の医薬組成物によるＣＤ４０シグナル伝達活性化は、ＣＴＬＡ－４及び／又はＰＤ－１の遮断に加えて、化学療法レジメンと組み合わされ得る。例えば、化学療法剤は、本開示の医薬組成物とともに投与することができ、細胞傷害性薬物であり得る。例えば、エピツビシン（ｅｐｉｔｕｂｉｃｉｎ）、オキサリプラチン、及び５－ＦＵが、抗ＣＤ４０療法を受けている患者に投与される。抗ＣＤ４０療法と組み合わされ得る他の治療法として、限定はされないが、インターロイキン－２（ＩＬ－２）投与、放射線、手術、又はホルモン遮断が挙げられる。

【0129】

本明細書において説明される治療剤の組合せは、薬学的に許容される担体中の単一の組成物と同時に、又は薬学的に許容される担体中の各薬剤を含む別個の組成物として同時に投与され得る。別の実施形態において、治療剤の組合せは、連続して投与され得る。

【0130】

さらに、組合せ治療の２つ以上の用量が、連続して投与される場合、連続投与の順序は、投与の各時点で逆になり得るか又は同じ順序に保持され得、連続投与は、同時投与と組み合わされ得、又はそれらの任意の組合せである。

【0131】

本開示は、以下の実施例によってさらに例示され、これは、さらなる限定として解釈されるべきではない。本出願を通して引用される全ての図及び全ての参照文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。

【実施例】

【0132】

実施例１ハイブリドーマ技術を用いたマウス抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の生成
免疫化
マウスを、ＥＨａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８に記載されている方法にしたがって免疫化した。Ｃ末端にヒトＩｇＧ１Ｆｃタグ（配列番号２７）を有する組換えヒトＣＤ４０タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ２５９４２のＡＡ領域２１～１９３、配列番号３０のアミノ酸残基２１～１９３）を、免疫原として使用した。ヒトＣＤ４０－ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＣＤ０－Ｈ５２２８）を、抗血清力価を決定するため、及び抗原特異的抗体を分泌するハイブリドーマをスクリーニングするために使用した。

【0133】

免疫化投与量は、一次及び追加免疫の両方のために２５μｇのヒトＣＤ４０－Ｆｃタンパク質／マウス／注射を含んでいた。免疫応答を増加させるために、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）を、一次及び追加免疫のためにそれぞれ使用した。簡潔には、まず、ボルテックスを用いてバイアル中でアジュバントを穏やかに混合することによって、アジュバント－抗原混合物を調製した。所望の量のアジュバントを、加圧滅菌された１．５ｍＬの微小遠心分離管に移した。抗原を、０．５～１．０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有するＰＢＳ又は生理食塩水中で調製した。次に、計算された量の抗原を、アジュバントとともに微小遠心分離管に加え、得られた混合物を、２分間にわたって穏やかにボルテックスすることによって混合して、油中水型エマルジョンを生成した。次に、アジュバント－抗原エマルジョンを、動物に注射するための適切なシリンジに吸い込ませた。合計で２５μｇの抗原を、５０～１００μｌの体積で注射した。各動物を免疫化し、次に、抗血清力価に応じて２～３回追加接種した。良好な力価を有する動物に、融合前に腹腔内注射によって最終追加接種を与えた。

【0134】

ハイブリドーマ融合及びスクリーニング
マウス骨髄腫細胞株（ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１５８１）の細胞を培養して、融合直前に対数期段階に到達させた。免疫化マウスに由来する脾臓細胞を、ＫｏｈｌｅｒＧ，ａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎＣ，"Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆｆｕｓｅｄｃｅｌｌｓｓｅｃｒｅｔｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｏｆｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ"，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７（１９７５）に記載される方法にしたがって、滅菌的に調製し、骨髄腫細胞と融合させた。続いて、融合された「ハイブリッド細胞」を、ＤＭＥＭ／２０％のＦＣＳ／ＨＡＴ培地中の９６ウェルプレート中に分配した。生存しているハイブリドーマコロニーが、融合の７～１０日後に顕微鏡で観察された。２週後、各ウェルからの上清を、組換えヒトＣＤ４０－ｈｉｓタンパク質を使用するＥＬＩＳＡに基づくスクリーニング、及びヒトＣＤ４０タンパク質（ｕｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２５９４２－１、配列番号３０）を細胞膜上に発現する２９３Ｔ－ＣＤ４０細胞を使用する細胞ベースの結合ＦＡＣＳにかけた。ヒトＣＤ４０－ｈｉｓタンパク質に結合し、２９３Ｔ－ＣＤ４０細胞に対して高い特異的結合を示すハイブリドーマ分泌抗体、即ちクローン１Ａ３、１Ｄ１及びＣ１Ｈ１を限界希釈によりサブクローニングし、細胞株のクローン性を確認し、次にモノクローナル抗体を精製した。簡潔に述べると、プロテインＡセファロースカラム（ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、Ｃａｔ＃ＡＡ０２７３）を、５～１０カラム体積中でＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄した。細胞上清を、カラムに通過させ、次に、タンパク質の吸光度がベースラインに達するまで、カラムを、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄した。カラムを、溶出緩衝液（０．１Ｍのグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．７）で溶離し、直ちに中和緩衝液（１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）を含む１．５ｍｌ管に収集した。免疫グロブリンを含有する画分を、プールし、４℃で一晩、ＰＢＳ中で透析した。続いて、精製されたモノクローナル抗体のインビトロ機能活性を、以下のように特性決定した。

【0135】

実施例２ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴技術を用いたマウス抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の親和性決定
実施例１で生成された、精製抗ＣＤ４０マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００システム（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）によって、親和性及び結合速度について特性決定した。

【0136】

簡潔に述べると、ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃ＢＲ１００８３８、ＭｏｕｓｅＡｎｔｉｂｏｄｙＣａｐｔｕｒｅＫｉｔ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）によって提供される標準的なアミンカップリングキットを用いて、第一級アミンを介して、ＣＭ５チップ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のカルボキシメチルデキストラン被覆チップ＃ＢＲ１００５３０）に共有結合し、プロテインＧチップ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃２９－１７９３－１５）をベンチマークの親和性決定のために使用した。バイオセンサー表面上の未反応部分を、エタノールアミンでブロックした。次に、本開示の精製された抗ＣＤ４０抗体と、２つのベンチマーク抗体、ＢＭ１（ダセツズマブ、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈＩｎｃ．、ＣＤ４０－ＢＭ１とも称され、配列番号４０及び４１で示される重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をそれぞれ用いて社内で作製された）及びＢＭ２（セリクレルマブ、ＡｂｇｅｎｉｘＩｎｃ．、ＣＤ４０－ＢＭ２とも称され、配列番号４２及び４３で示される重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をそれぞれ用いて社内で作製された）をそれぞれ、６６．７ｎＭの濃度で、１０μＬ／分の流速でチップ上に流した。次に、（Ｂｉａｃｏｒｅにより提供された）ＨＢＳ－ＥＰ^＋緩衝液中の連続希釈された組換えヒトＣＤ４０－ｈｉｓ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＣＤ０－Ｈ５２２８、２倍連続希釈で８０ｎＭから出発する）又はカニクイザルＣＤ４０－ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＣＤ０－Ｃ５２Ｈ６、２倍連続希釈で８０ｎＭから出発する）を、３０μＬ／分の流速でチップ上に流した。抗原－抗体結合速度を２分間にわたって追跡し、解離速度を１０分間にわたって追跡した。結合及び解離曲線を、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させた。Ｋ_Ｄ、Ｋ_ａ及びＫ_ｄ値を決定し、以下の表２に要約した。

【0137】

【表2】

【0138】

本開示のマウス抗体Ｃ１Ｈ１は、ＢＭ１及びＢＭ２より高い結合親和性でヒト及びサルＣＤ４０に特異的に結合した。

【0139】

実施例３マウス抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の結合活性
マウス抗ＣＤ４０抗体の結合活性を、捕捉ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定した。

【0140】

捕捉ＥＬＩＳＡでは、９６ウェルマイクロプレートを、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ'）_２フラグメント特異的（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１１５－００５－０７２）で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０、ＰＢＳＴ）で１回洗浄し、次に３７℃で２時間にわたって２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ中５％ｗ／ｖの無脂肪乳）で、ブロックした。プレートを４回洗浄し、１００μｌ／ウェルの連続希釈された本開示の抗ＣＤ４０抗体のＢＭ１、ＢＭ２及び陰性対照ｈＩｇＧ（静脈注射用のヒト免疫グロブリン（ｐＨ４）、ＨｕａｌａｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＩｎｃ．）（ＰＢＳＴ中２．５％ｗ／ｖの無脂肪乳中の５倍連続希釈、６６．７ｎＭから出発する）とともに３７℃で４０分間にわたってインキュベートし、次に再度４回洗浄した。捕捉抗ＣＤ４０抗体を含有するプレートを、１００μｌのビオチン標識ヒトＣＤ４０－Ｆｃタンパク質（配列番号２８のＮ末端アミノ酸残基９９～３３０に連結された配列番号３０のアミノ酸残基２１～１９３、ＰＢＳＴ中２．５％ｗ／ｖの無脂肪乳中１．１５ｎＭ）とともに３７℃で４０分間にわたってインキュベートし、４回洗浄し、ストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ（ＰＢＳＴ中１：１００００希釈、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃０１６－０３０－０８４、１００μｌ／ウェル）とともに３７℃で４０分間にわたってインキュベートした。最終の洗浄の後、プレートを、１００μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡ基質ＴＭＢ（Ｉｎｎｏｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｃａｔ＃ＴＭＢ－Ｓ－００２）とともに室温でインキュベートした。反応を、５０μｌ／ウェルの１ＭのＨ_２ＳＯ_４で、３～１０分間で停止させ、各ウェルの吸光度を、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで読み取り、次にＯＤ（４５０～６３０）値を抗体濃度に対してプロットした。ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＥＣ_５０値を報告した。

【0141】

フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって試験された２９３Ｔ－ＣＤ４０細胞への抗ＣＤ４０抗体の結合については、細胞膜上で完全長ヒトＣＤ４０（ｕｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２５９４２－１、配列番号３０）を安定に発現する、Ｂｉｏｓｉｏｎの社内で調製された２９３Ｔ－ＣＤ４０細胞を使用した。２９３Ｔ－ＣＤ４０細胞を、リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の説明書にしたがって、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ部位間にＣＤ４０コード配列を挿入したｐＣＭＶ－Ｔ－Ｐプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることによって調製した。具体的には、２９３Ｔ－ＣＤ４０細胞を細胞培養フラスコから収集し、２回洗浄し、２％ｖ／ｖのウシ胎仔血清（ＦＡＣＳ緩衝液）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で再懸濁させた。９６ウェルプレート中のウェル当たり２×１０^５個の細胞を、氷上で４０分間にわたって、ＦＡＣＳ緩衝液中の１００μｌの本開示の抗ＣＤ４０抗体又は様々な濃度の対照（８０ｎＭから出発して、４倍連続希釈）とともにインキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＲ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ'）_２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＦＡＣＳ緩衝液中１：１０００希釈、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１１５－１１６－１４６）を加えた。暗所で、４℃で４０分間にわたるインキュベーションの後、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁させた。蛍光を、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ－ＨＴＳ機器を用いて測定し、抗体濃度に対してプロットした。データを、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＥＣ_５０値を報告した。

【0142】

結果を図１Ａ～１Ｂ及び図２Ａ～２Ｂに示した。

【0143】

結果は、本開示のマウス抗体がヒトＣＤ４０に特異的に結合し、ここで１Ａ３、１Ｄ１、及びＣ１Ｈ１は、ＢＭ１若しくはＢＭ２のいずれか、又は両方よりも低いＥＣ_５０値を有することを示し、それらがヒトＣＤ４０タンパク質により効率的に結合することを示唆した。さらに、図１Ａ～１Ｂ及び図２Ａ～２Ｂから認められ得るように、マウス抗体１Ａ３／Ｃ１Ｈ１の最大結合は、ＢＭ１又はＢＭ２の場合と同等であった。

【0144】

実施例４ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ又はＣＤ４０－ベンチマーク結合に対するマウス抗ＣＤ４０抗体のブロッキング活性
４．１リガンドブロッキングＥＬＩＳＡ
ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ結合をブロックする抗ＣＤ４０抗体の能力を、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した。簡潔に述べると、１００μｌのヒトＣＤ４０－Ｆｃタンパク質（配列番号２８のアミノ酸残基９９～３３０のＮ末端に連結された配列番号３０のアミノ酸残基２１～１９３）を、コーティング緩衝液（炭酸塩／重炭酸塩緩衝液）中２μｇ／ｍＬで、９６ウェルマイクロプレート上に被覆し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０、ＰＢＳＴ）で１回洗浄し、３７℃で２時間にわたって、ＰＢＳＴ中５％ｗ／ｖの無脂肪乳でブロックした。次に、プレートを、洗浄緩衝液を用いて４回洗浄した。

【0145】

２．５％ｗ／ｖの無脂肪乳とともに、ＰＢＳＴ中の連続希釈された本開示の抗ＣＤ４０抗体又は対照（５倍連続希釈で２００ｎＭから出発する）を、ＣＤ４０－Ｆｃ結合プレートに、１００μｌ／ウェルで加え、４０分間にわたって３７℃で、インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液を用いて再度４回洗浄し、次に、１００μｌ／ウェルの９５ｎｇ／ｍＬのビオチン標識ヒトＣＤ４０Ｌ－ｈｉｓタンパク質（ＳｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｃ．，Ｃａｔ＃１０２３９－Ｈ０８Ｅ）を加え、３７℃で４０分間にわたってインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液を用いて再度洗浄した。その後、プレートに、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ（ＰＢＳＴ緩衝液中１：１００００の希釈、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃０１６－０３０－０８４）を加え、３７℃で４０分間にわたってインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液を用いて再度洗浄した。最後に、ＴＭＢを加え、反応を、１ＭのＨ_２ＳＯ_４を用いて停止させ、各ウェルの吸光度を、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで読み取り、次にＯＤ（４５０～６３０）値を、抗体濃度に対してプロットした。データを、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＩＣ_５０値を報告した。

【0146】

４．２ベンチマークブロッキングＥＬＩＳＡ
ベンチマーク－ヒトＣＤ４０結合をブロックする本開示の抗ＣＤ４０抗体の能力を、競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定した。簡潔に述べると、ＢＭ２抗体を、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬで、９６ウェルマイクロプレート上で、１００μｌ／ウェルで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液で１回洗浄し、ブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ中、５％ｗ／ｖの無脂肪乳）で、３７℃で２時間にわたってブロックした。ブロックしながら、本開示の抗ＣＤ４０抗体又は対照を、５倍連続希釈で、６６．７ｎＭから出発してビオチン標識ヒトＣＤ４０－Ｆｃタンパク質（配列番号２８のアミノ酸残基９９～３３０のＮ末端に連結された配列番号３０のアミノ酸残基２１～１９３、２．５％ｖ／ｖの無脂肪乳でＰＢＳＴ中０．２３ｎＭ）で希釈し、室温で４０分間にわたってインキュベートした。プレートを４回洗浄後、抗体／ヒトＣＤ４０－Ｆｃ－ビオチン混合物を、１００μｌ／ウェルで、ＢＭ２被覆プレートに加えた。３７℃で４０分間にわたるインキュベーションの後、プレートを、洗浄緩衝液を用いて再度４回洗浄した。次に、プレートに、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰを加え、３７℃で４０分間にわたってそれとともにインキュベートし、プレートに結合されたビオチン標識ヒトＣＤ４０－Ｆｃを検出した。洗浄緩衝液を使用し、プレートを再度４回洗浄した。最後に、ＴＭＢを加え、反応を、１ＭのＨ_２ＳＯ_４を用いて停止させ、吸光度を、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで読み取り、次に、ＯＤ（４５０～６３０）値を、抗体濃度に対してプロットした。データを、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＩＣ_５０値を報告した。

【0147】

２つのアッセイの結果を図３Ａ～３Ｂ及び図４Ａ～４Ｂに示した。

【0148】

マウス抗体Ｃ１Ｈ１が、ＢＭ１及びＢＭ２と比較して同等の又はさらにより低いＩＣ_５０値で、ヒトＣＤ４０－ヒトＣＤ４０Ｌ結合をブロックすることができたことが図３Ｂからわかる。さらに、図３Ｂに示すとおり、マウス抗体Ｃ１Ｈ１は、ＢＭ１及びＢＭ２よりも高い最大ブロッキングを示した。

【0149】

図４Ａ及び４Ｂは、マウス抗体Ｃ１Ｈ１が、ヒトＣＤ４０－ＢＭ２結合をブロックすることができたことを示し、これは、それが、ＢＭ２が結合したのと同じ又は同等のエピトープに結合したことを示唆している。ブロッキングを示さないマウス抗体１Ａ３及び１Ｄ１は、異なるエピトープに結合し得る。

【0150】

実施例５マウス抗ＣＤ４０抗体の細胞ベースのレポーターアッセイ
本開示の抗ＣＤ４０抗体を、それらのアゴニスト活性について、完全長ヒトＣＤ４０（ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ２５９４２－１、配列番号３０）を安定に発現するＣＤ４０を発現するレポーター細胞株２９３Ｔ－ＮＦ－κＢ－Ｌｕｃ－ＣＤ４０を用いてさらに試験した。２９３Ｔ－ＮＦ－κＢ－Ｌｕｃ－ＣＤ４０細胞は、リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の説明書にしたがって、ｐＧＬ４．３２［ｌｕｃ２ＰＮＦ－κＢ－ＲＥＨｙｇｒｏ］ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受入番号：ＥＵ５８１８６０）とその後の、ＣＤ４０コード配列がＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ部位間に挿入されたｐＣＭＶ－Ｔ－Ｐプラスミドとを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることによって調製した。ＣＤ４０アゴニストをこれらの細胞に加えたとき、ＣＤ４０シグナル伝達が活性化され、ルシフェラーゼ発現が上方制御されたが、それは発光アッセイにおいて測定することができる。

【0151】

簡潔に述べると、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１００９９－１４１）を加えた２０μＬのＤＭＥＭ培地（ＧｉｂｃｏＩｎｃ．，Ｃａｔ＃１０５６６－０１６）中の、対数期段階の５×ｌ０^３個の２９３Ｔ－ＮＦ－κＢ－Ｌｕｃ－ＣＤ４０細胞を、３８４ウェルの細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３７０７）に蒔いた。次に、プレートに、２０μｌ／ウェルの本開示の連続希釈された抗ＣＤ４０抗体又は対照（陰性対照として社内で作製された抗ＣＤ２２抗体を含む）を加え（培地中、３倍連続希釈で２００ｎＭから出発する）、３７℃で６時間インキュベートした。次に、プレートに、ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムの試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｅ６１２０、３０μｌ／ウェル）を加え、室温で５分間にわたってインキュベートした。化学発光を、ＴｅｃａｎＩｎｆｉｎｉｔ（登録商標）２００Ｐｒｏ機器を用いて測定した。データを、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＥＣ_５０値を報告した。

【0152】

結果を図５Ａ～５Ｂに示した。

【0153】

マウス抗体１Ａ３、１Ｄ１及びＣ１Ｈ１が、ＢＭ１と比較して同等のアゴニスト活性を有したが、ＢＭ２の場合ほど良好でなかったことがわかる。

【0154】

実施例６キメラ抗体の生成及び特性決定
抗ＣＤ４０マウスｍＡｂの重鎖及び軽鎖の可変ドメインを、シーケンシングし、表１に要約した。

【0155】

抗ＣＤ４０マウスｍＡｂのＣ１Ｈ１、１Ｄ１及び１Ａ３の重鎖及び軽鎖の可変ドメインをそれぞれ、ヒトＩｇＧ１重鎖（配列番号２７）及びヒトκ軽鎖定常領域（配列番号２９）にインフレームでクローニングし、ここで、可変領域のＣ末端が、それぞれの定常領域のＮ末端に連結された。

【0156】

ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に連結された重鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含むベクター、及びヒトκ軽鎖定常領域に連結された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含むベクターを、１ｍｇ／ｍＬのＰＥＩで、１．１：１の軽鎖対重鎖構築物の比率で、５０ｍｌの２９３Ｆ懸濁細胞培養物中で一過性にトランスフェクトした。

【0157】

細胞上清を、振とうフラスコ中で６日後に収集し、遠心沈殿させて、細胞をペレット化し、次に、上記のように、キメラ抗体を、細胞上清から精製した。精製したキメラ抗体は、若干の修正を加えた上記の実施例におけるプロトコル及び後述されるプロトコルにしたがって、捕捉ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ親和性試験及び細胞ベースのレポーターアッセイにおいて試験した。

【0158】

ＢＩＡｃｏｒｅについて、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃ＢＲ１００８３９、ＨｕｍａｎＡｎｔｉｂｏｄｙＣａｐｔｕｒｅＫｉｔ）をヤギ抗マウスＩｇＧの代わりにＣＭ５チップに共有結合し、ＣＭ５チップをプロテインＧチップの代わりにＢＭ１及びＢＭ２に対して使用した。結果を表３に示した。

【0159】

捕捉ＥＬＩＳＡについて、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ'）_２フラグメント特異的（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１０９－００５－０９７）を、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ'）_２フラグメント特異的の代わりに１００μｌ／ウェルで使用した。

【0160】

結果を表３、図６Ａ～６Ｃ及び図７Ａ～７Ｃに示した。

【0161】

データは、キメラ抗体が、それらの親抗体と同等の結合能及びアゴニスト活性を有することを示した。特に、キメラＣ１Ｈ１抗体は、ヒトＣＤ４０に対するより高い結合親和性及び能力、並びにカニクイザルＣＤ４０に対するＢＭ１より高い結合親和性を示した。

【0162】

【表3】

【0163】

実施例７抗ＣＤ４０マウスモノクローナル抗体Ｃ１Ｈ１のヒト化
ヒト化及びさらなる検討のため、マウス抗ＣＤ４０抗体Ｃ１Ｈ１を選択した。この抗体のヒト化は、以下に詳述されるような十分に確立されたＣＤＲグラフト法を用いて実施した。

【0164】

マウス抗体Ｃ１Ｈ１のヒト化のための受容体フレームワークを選択するために、このマウスＣ１Ｈ１の軽鎖及び重鎖可変領域配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子データベースに対してブラストした。マウスＣ１Ｈ１に対して最も高い相同性を有するヒト生殖細胞系列を、ヒト化のための受容体フレームワークとして選択した。マウス抗体重鎖／軽鎖可変領域ＣＤＲを、選択されたフレームワークに挿入し、フレームワーク中の残基を、より多い候補重鎖／軽鎖可変領域を得るようにさらに変異させた。合計で４つのヒト化Ｃ１Ｈ１抗体（すなわち、ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ１からｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ４）が得られ、その重鎖／軽鎖可変領域配列を表１に示した。

【0165】

ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域（配列番号２８）に連結された重鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含むベクター、及びヒトκ軽鎖定常領域（配列番号２９）に連結されたヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含むベクターを、１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩで、６０％対４０％の軽鎖対重鎖構築物の比率で、５０ｍｌの２９３Ｆ懸濁細胞培養物中で一過性にトランスフェクトした。

【0166】

実施例８ヒト化抗体の特性決定
ヒト化抗体ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ１～ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ４を含有する細胞上清を、振盪フラスコ中で６日後に収集し、後述されるプロトコルにしたがって、Ｏｃｔｅｃｔによって、Ｏｃｔｅｔシステム（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ，ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６）を用いて、ヒトＣＤ４０に対する結合親和性について試験した。簡潔に述べると、ＡＨＣバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ製の抗ヒトＩｇＧＦｃ捕捉）を、３秒間にわたって１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）で予め浸漬させ、次に、３秒間にわたってランニングバッファー（ＰＢＳＴ中０．５％ｗ／ｖのＢＳＡ）で、ウェル中でディッピングし、浸漬及びディッピング工程を、３回繰り返した。次に、センサーを、１２０秒間にわたって、ヒト化抗ＣＤ４０抗体、５μｇ／ｍｌでＨＢＳ－ＥＰ^＋中のキメラＣ１Ｈ１抗体、又は５μｇ／ｍｌでＨＢＳ－ＥＰ^＋中のベンチマークを含有する細胞上清で、ウェル中でディッピングし、次に、５分間にわたってランニングバッファーを含むウェル中に沈めた。新たなベースラインを、ランニングバッファーを含む別のウェル中で１８０秒間試験した。次に、センサーを、１２０秒間にわたってランニングバッファー中で連続希釈されたヒトＣＤ４０－ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＣＤ０－Ｈ５２２８、２倍連続希釈で、４０ｎＭから出発する）で、ウェル中でディッピングし、次に、１０分間にわたってベースラインウェルに沈めた。最後に、センサーを、３秒間にわたって１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）で予め浸漬させ、次に、３秒間にわたってランニングバッファーで、ウェル中でディッピングし、浸漬及びディッピング工程を、３回繰り返した。結合及び解離曲線を、ＦｏｒｔｅＢｉｏＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ８．１を用いて、１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させた。Ｋ_ａ、Ｋ_ｄ及びＫ_Ｄ値を決定し、以下の表４に要約した。

【0167】

結果は、試験されるｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ１及びｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２が、キメラ抗体Ｃ１Ｈ１と比較して、同等のヒトＣＤ４０結合親和性を有し、それがＢＭ２の場合より良好であることを示した。

【0168】

【表4】

【0169】

ヒト化抗体ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ１及びｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２を、上述されるように精製し、若干の修正を加えた上記の実施例におけるプロトコル及び後述されるプロトコルにしたがって、Ｂｉａｃｏｒｅ、捕捉ＥＬＩＳＡ、細胞ベースの結合ＦＡＣＳ、競合ＥＬＩＳＡ、細胞ベースのレポーターアッセイ及びプロテインサーマルシフトアッセイにおいて試験した。

【0170】

捕捉ＥＬＩＳＡでは、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ'）_２フラグメント特異的（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１０９－００５－０９７）を、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ'）_２フラグメント特異的の代わりに、１００μｌ／ウェルで使用した。

【0171】

ＢＩＡｃｏｒｅでは、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃ＢＲ１００８３９、ＨｕｍａｎＡｎｔｉｂｏｄｙＣａｐｔｕｒｅＫｉｔ）を、ヤギ抗マウスＩｇＧの代わりにＣＭ５チップに共有結合し、ＣＭ５チップを、プロテインＧチップの代わりにＢＭ１及びＢＭ２に使用した。

【0172】

細胞ベースの結合ＦＡＣＳでは、Ｒ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγフラグメント特異的（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１０９－１１５－０９８）を、Ｒ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ'）_２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）の代わりに１００μｌ／ウェルで使用した。

【0173】

さらに、ヒト化抗体ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２を熱安定性アッセイについて試験した。プロテインサーマルシフトアッセイを用いて、ＧｌｏＭｅｌｔ（商標）ＴｈｅｒｍａｌＳｈｉｆｔＰｒｏｔｅｉｎＳｔａｂｉｌｉｔｙＫｉｔ（Ｂｉｏｔｉｕｍ、Ｃａｔ＃３３０２２－Ｔ）を用いてＴｍ（融解温度）を決定した。簡潔に述べると、ＧｌｏＭｅｌｔ（商標）色素を解凍し、室温に到達させた。色素を含むバイアルをボルテックスし、遠心分離した。次に、１０倍色素を、５μＬの２００倍色素を９５μＬのＰＢＳに加えることによって調製した。２μＬの１０倍色素及び１０μｇのヒト化抗体を加え、ＰＢＳを、２０μＬの総反応体積になるまで加えた。色素及び抗体を含む管を、短時間にわたって回転させ、表５中のパラメータを有する融解曲線プログラムを用いて設定されたリアルタイムＰＣＲサーモサイクラー（Ｒｏｃｈｅ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＩＩ）に入れた。

【0174】

【表5】

【0175】

アッセイ結果を、表６及び図８～１２に示した。

【0176】

ヒト化抗体ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ１及びｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２が、キメラ抗体Ｃ１Ｈ１と比較して、ヒト及びカニクイザルＣＤ４０に対する同等の結合親和性を示したことが、表６からわかる。換言すれば、ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ１及びｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２のヒト及びカニクイザルＣＤ４０に対する結合親和性は、ＢＭ１及びＢＭ２の場合より高かった。

【0177】

図１０は、本開示のヒト化抗体ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ１及びｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２が、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ結合をブロック可能であり、ＢＭ１及びＢＭ２と比較すると、ブロッキング活性が同等であるか又はややより低いことを示した。

【0178】

図１１によると、本開示のヒト化抗体ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ１及びｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２は、ヒトＣＤ４０－ＢＭ２結合をブロック可能であり、本開示の抗体ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ１及びｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２が、ＢＭ２の場合と類似するエピトープに結合し得ることを示唆した。

【0179】

図１２に示されるように、本開示のヒト化抗体ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ１及びｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２は、細胞ベースのレポーターアッセイにおいて、ＢＭ１及びＢＭ２と比較すると、より高いアゴニスト活性を有した。

【0180】

【表6】

【0181】

実施例９ヒトＢ細胞リンパ腫Ｒａｍｏｓ異種移植片モデルにおけるｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２抗体のインビボでの抗腫瘍有効性
非肥満糖尿病－重症複合免疫不全（ＮＯＤ－ＳＣＩＤ）マウスにおいて、ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２抗体のインビボでの抗腫瘍活性を試験した。簡潔に述べると、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに対し、３×１０^７個のヒトＢ細胞リンパ腫Ｒａｍｏｓ細胞（中国科学院（ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ））を右腋窩に皮下注射した。腫瘍体積を、電子ノギスを用いて測定し、（長さ×幅^２）／２として算出した。腫瘍が約１００～１５０ｍｍ^３の平均体積に達したとき、腫瘍保有マウス４０匹を選択し、４群（マウス１０匹／群）に無作為化し、投与日に、動物グルーピングを０日目と名付けた。動物に、０日目から、表７に示す投与レジメンにしたがって、アイソタイプ対照抗体（抗ＨＥＬ－ヒトＩｇＧ２アイソタイプ対照、ＩｇＧ２とも称される、ＢｉｏｉｎｔｒｏｎＩｎｃ）又はｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２抗体を尾静脈に静脈内注射した。

【0182】

【表7】

【0183】

データを表８に示した。

【0184】

全ての治療が、腫瘍保有動物に十分に許容され、有意な体重減少又は他の症状は認められなかった。５ｍｇ／ｋｇでのｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２抗体治療は、最強の抗腫瘍活性を示し、１４日目、２３０．２ｍｍ^３の平均腫瘍サイズとともに、９６％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）をもたらした。１４日目の群３における平均腫瘍体積は、対照群の場合より統計学的に小さかった。しかし、１５ｍｇ／ｋｇでのｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２抗体治療は、さらに増強された有効性を示さず、即ち、群４の腫瘍体積は、群３の場合と有意には異ならなかった。

【0185】

【表8】

【0186】

実施例１０マウス結腸癌ＭＣ３８異種移植片モデルにおけるｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２抗体のインビボでの抗腫瘍有効性
ｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２抗体のインビボでの抗腫瘍活性を、ＣＤ４０ヒト化トランスジェニックマウス（ｈＣＤ４０マウスとも称される）においてさらに試験した。簡潔に述べると、ｈＣＤ４０マウスに対し、１×１０^６個のマウス結腸癌ＭＣ３８細胞（ＳｈａｎｇｈａｉＬａｎｌｉＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．）を右側腹部に皮下注射した。腫瘍体積を、電子ノギスを用いて測定し、（長さ×幅^２）／２として算出した。腫瘍が約１００ｍｍ^３の平均体積に達したとき、腫瘍保有マウス１８匹を選択し、３群（マウス６匹／群）に無作為化し、投与日に、動物グルーピングを０日目と名付けた。動物に、１日目から、表９に示す投与レジメンにしたがって、媒体（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳとも称される）又はｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２抗体を尾静脈に静脈内注射した。

【0187】

【表9】

【0188】

データを表１０に要約した。

【0189】

全ての治療が、腫瘍保有動物によって十分に許容され、有意な体重減少又は症状は認められなかった。３ｍｇ／ｋｇでのｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２抗体治療は、強力な抗腫瘍活性を示し、１４日目、１１６９ｍｍ^３の平均腫瘍サイズとともに、６４％のＴＧＩをもたらした。１４日目の群２の腫瘍サイズは、媒体群の場合よりも統計学的に小さかった。１０ｍｇ／ｋｇでのｈｕＣ１Ｈ１－Ｖ２抗体治療も強力な抗腫瘍活性を示し、１４日目、１４４６ｍｍ^３の平均腫瘍サイズとともに、５６％のＴＧＩをもたらした。１４日目の群３の平均腫瘍サイズは、媒体群の場合よりも統計学的に小さかった。

【0190】

【表10】

【0191】

本開示は、１つ以上の実施形態とともに上述されているが、本開示が、それらの実施形態に限定されないことが理解されるべきであり、説明は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれ得る際、全ての代替例、修飾、及び均等物を包含することが意図される。本明細書に引用される全ての参照文献は、全体が参照によりさらに援用される。

【0192】

本出願中の配列が、以下に要約される。

【0193】

【表11】