特許 7734654 ワクチンおよび治療ツールとしてのネオ複合糖質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-08-28

(45)【発行日】2025-09-05

(54)【発明の名称】ワクチンおよび治療ツールとしてのネオ複合糖質

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/385 20060101AFI20250829BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20250829BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20250829BHJP

   A61K 39/02 20060101ALI20250829BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250829BHJP

【ＦＩ】

A61K39/385 ZNA

A61K39/00 A

A61K39/00 H

A61K39/12

A61K39/02

A61P35/00

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2022518356

(86)(22)【出願日】2020-09-18

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-24

(86)【国際出願番号】 CA2020051253

(87)【国際公開番号】W WO2021056098

(87)【国際公開日】2021-04-01

【審査請求日】2023-09-11

(31)【優先権主張番号】62/904,312

(32)【優先日】2019-09-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/060,452

(32)【優先日】2020-08-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】520363915

【氏名又は名称】コラネックス・キャピタル

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100126985

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 充利

(72)【発明者】

【氏名】シャオ，ツェ・ジェ

(72)【発明者】

【氏名】モフェット，サージ

(72)【発明者】

【氏名】ミニャーニ，サージ

(72)【発明者】

【氏名】ロイ，ルネ

【審査官】北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】Bioorganic & Medicinal Chemistry，2016年，Vol.24, pp.915-920

【文献】Corbohydrare Research，1980年，Vol.78, C1-C3

【文献】Bioorganic & Medicinal Chemistry，2002年，Vol.10, pp.11-17

【文献】Glycoconj J，2006年，Vol.23, pp.317-327

【文献】J. Mass Spectrom.，2014年，Vol.49, pp.1223-1233

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４

Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８

Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

合成ネオ複合糖質およびアジュバントを含むワクチン組成物であって、
合成ネオ複合糖質は、以下の構造：

【化1】

を有し、担体タンパク質またはペプチドの１またはそれより多くのアミン基（ＣＰ－ＮＨ）にリンカーを介してコンジュゲートした１またはそれより多くの炭水化物抗原（ＣＡ）を含んでなり、ここで、ｐは、１つまたはそれより多くのアミン基で担体タンパク質またはペプチドにコンジュゲートした炭水化物抗原の総数に相当する整数である、上記組成物。

【請求項2】

炭水化物抗原が、腫瘍関連の炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）、ウイルスの多糖抗原または細菌の莢膜多糖体（ＣＰＳ）であるか、またはそれを含む、請求項１に記載のワクチン組成物。

【請求項3】

炭水化物抗原が、Ｔｎ、Ｓ－Ｔｎ、トムゼン－フリーデンライヒ（ＴＦ）、（２，３）－Ｓ－ＴＦ、（２，６）－Ｓ－ＴＦ、グロボＨ、ＰＳＡ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｎ－グリコリル－ＧＭ３、フコシルＧＭ１、Ｌｅ^ａ、ｓＬｅ^ａ、Ｌｅ^ｘ、ｓＬｅ^ｘ、Ｌｅ^ｙ、またはそれらのあらゆる組合せである、請求項１または２に記載のワクチン組成物。

【請求項4】

１またはそれより多くの炭水化物抗原が、シアル化されていないＴＦ抗原、シアル化されていないＴｎ抗原およびこれらの組み合わせを含んでなる、請求項１～３のいずれかに記載のワクチン組成物。

【請求項5】

担体タンパク質またはペプチドが、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、インフルエンザ菌プロテインＤ（ＨｉＤ）、サイトカイン、免疫原性ペプチド、破傷風毒素８３１～８４４（配列番号１または２）、アルブミン、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）またはそれらの免疫原性断片であるか、それ由来であるか、それを含んでなる、請求項１～４のいずれかに記載のワクチン組成物。

【請求項6】

担体タンパク質またはペプチドが、ＴＴまたはＣＲＭ１９７またはそれらの免疫原性断片であるか、それ由来であるか、それを含んでなる、請求項１～５のいずれかに記載のワクチン組成物。

【請求項7】

シアル化されていないＴＦ抗原、シアル化されていないＴｎ抗原、または、シアル化されていないＴＦ抗原とシアル化されていないＴｎ抗原の両方に対する抗体の産生がワクチン組成物の投与によって誘発される、請求項１～６のいずれかに記載のワクチン組成物。

【請求項8】

医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１～７のいずれかに記載のワクチン組成物。

【請求項9】

ＴＡＣＡを発現するがんに対する抗がんワクチンである、請求項８に記載のワクチン組成物。

【請求項10】

前記がんが、Ｂ細胞リンパ腫、乳がん、結腸がん、非小細胞肺がん、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、前立腺がん、肉腫、小細胞肺がんまたは胃がんである、請求項９に記載のワクチン組成物。

【請求項11】

ｐが１～５０である、請求項１～１０のいずれかに記載のワクチン組成物。

【請求項12】

合成ネオ複合糖質およびアジュバントを含むワクチン組成物であって、
合成ネオ複合糖質は、以下の構造：

【化2】

を有し、担体タンパク質またはペプチドの１またはそれより多くのアミン基（ＣＰ－ＮＨ）にリンカーを介してコンジュゲートした１またはそれより多くの炭水化物抗原（ＣＡ）を含んでなり、ここで、ｐは、１つまたはそれより多くのアミン基で担体タンパク質またはペプチドにコンジュゲートした炭水化物抗原の総数に相当する整数で、ｐは１～５０であり、
１またはそれより多くの炭水化物抗原が、シアル化されていないＴＦ抗原を含み、
担体タンパク質またはペプチドが、破傷風トキソイド、交差反応性物質１９７またはそれらの免疫原性断片であるか、それ由来であるか、またはそれを含み、
シアル化されていないＴＦ抗原に対する抗体の産生がワクチン組成物の投与によって誘発される、上記組成物。

【請求項13】

医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１２に記載のワクチン組成物。

【請求項14】

前記担体タンパク質またはペプチドが、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）またはそれらの免疫原性断片であるか、それ由来であるか、またはそれを含む、請求項１２または１３に記載のワクチン組成物。

【請求項15】

腫瘍関連の炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）を発現するがんに対する抗がんワクチンである、請求項１２～１４のいずれかに記載のワクチン組成物。

【請求項16】

前記がんが、Ｂ細胞リンパ腫、乳がん、結腸がん、非小細胞肺がん、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、前立腺がん、肉腫、小細胞肺がんまたは胃がんである、請求項１５に記載のワクチン組成物。

【請求項17】

対象を免疫化すること、対象にワクチン接種をすること、または、対象を処置することに使用するための、請求項１～１６のいずれかに記載のワクチン組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の記載は、免疫原として、および治療／診断ツールとして有用なネオ複合糖質に関する。より詳細には、本発明の記載は、炭水化物抗原と、担体材料（例えば、免疫原性および抗原性の担体ペプチドおよびタンパク質）の遊離アミン基とのコンジュゲーションに関する。本発明の記載はまた、抗原、免疫原、ワクチンとして、および診断法における用途に向けたネオ複合糖質を生産する改善された方法にも関する。さらに、本発明の記載は、がんやウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン候補および他の治療ツールとしての、異常なグリコシル化に関連する複合糖質に関する。

【0002】

本発明の記載は、複数の文書に言及しており、それらの内容は、本明細書において参照によりそれら全体が本明細書に組み入れられる。

【背景技術】

【0003】

免疫療法の最終的な目的は、細菌、ウイルス、およびがん細胞などの外来物質と戦うその能力を改善するために免疫系の自然および適応応答をモジュレートすることによって、感染症またはがんのような疾患を処置することである。自然免疫は、病原体への曝露の初期段階で作動する免疫防御の第１の選択肢と考えられている。関与する細胞としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、単球、γδＴ細胞およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞が挙げられる。適応免疫は、自然免疫系とは異なり、外来抗原への最初の曝露後に遅く発生するが、高度に特異的な応答を生じさせ、長期の防御のための免疫記憶を生じさせる。これは、Ｔ細胞およびＢ細胞のクローン増殖、ならびにそれらの体液性および細胞性のメディエーター、サイトカインおよび抗体を含む。自然免疫応答と適応免疫応答間との主要な境界は、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）；マクロファージ、Ｂ細胞、特定には樹状細胞（ＤＣ）である。ｐＡＰＣは、内因性および外因性の源からの抗原をプロセシングし、Ｔ細胞に提示することができる。これらは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）などのパターン認識受容体（ＰＲＲ）を介して微生物を認識する。微生物の表面決定基または異常な抗原や天然にはない抗原を認識すると、微生物または腫瘍およびそれらの関連する抗原性マーカーは、ｐＡＰＣによりエンドサイトーシス経路を介して取り込まれ、そこで典型的にはペプチド断片に分解され、放出された抗原は、細胞内のＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子（ｐＭＨＣ）上に結合することができる。ｐＡＰＣは、成熟および活性化を経て、細胞内区画から細胞表面へのｐＭＨＣ複合体の再分配、サイトカインおよびケモカインの分泌を引き起こす。ｐＡＰＣに加えて、全ての有核細胞型が、内因性ペプチドのみを細胞膜上に提示する。ｐＡＰＣとは対照的に、これらのペプチドは、ウイルスおよび細胞内病原体などの細胞それ自体の内部を起源とするものであり、ｂ２－ミクログロブリンにカップリングされたＭＨＣクラスＩ分子によって提示される。ＡＰＣは、典型的にはＭＨＣクラスＩＩを発現しない。

【0004】

ＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示されるペプチドは、典型的には、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞上のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）によって認識され、これは順に、共刺激シグナルをｐＡＰＣから受け取ったときに、異なるサブセット、例えばＴｈ１またはＴｈ２細胞への機能的な成熟を経る。Ｔｈ１細胞は、優勢にＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの分泌を伴う炎症促進性応答をもたらし、それに対してＴｈ２細胞は、典型的なサイトカインを分泌する。Ｔｈ１細胞は主として細胞媒介応答に関連するが、タイプの両方のＴｈ細胞がＢ細胞による抗体の生産を維持し、これは順に、抗体のアイソタイプおよび機能に影響を与える。例えば、ＩＬ－１２およびＴＮＦ－αは、Ｔｈ１細胞の分化および１型ＩｇＧサブクラスの生産に関連し、それに対してＩＬ－６および他のＴｈ２サイトカインは、２型ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１）生産に寄与する。

【0005】

ＭＨＣクラスＩ分子上にペプチドを提示するＡＰＣは、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞のＴＣＲによって認識される。２つの細胞型によって発現される共刺激因子分子間の数々の追加の相互作用が、細胞傷害性Ｔ細胞のエフェクター細胞への活性化を引き起こし、同時に、樹状細胞が活性化されたＴヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の両方と相互作用すると、強く長期にわたり存続するメモリーＴ細胞が生成される。Ｔ細胞は、一度活性化されたら、クローン選択およびサイトカインの助けによる増殖を経る。これは、機能不全性の標的抗原に特異的な多数の細胞を増加させ、次いで機能不全性の抗原陽性体細胞のサーチにおいて全身に移動することができる。標的細胞上にドッキングすると、活性化された細胞傷害性Ｔ細胞は、パーフォリンおよびグランザイム（ganzymes）などの細胞毒素のペイロードを放出する。パーフォリンの作用を介して、グランザイムは標的細胞に浸透し、そのプロテアーゼが細胞死を開始させる。細胞傷害性Ｔ細胞はまた、ＦＡＳシグナル伝達経路によって標的の細胞死を開始させることもできる。

【0006】

したがって、ワクチンで誘導された免疫性を、目的の病原体または腫瘍抗原に対処するのに適切な応答に合わせることが可能なことが望ましい。

【0007】

炭水化物は、タンパク質やペプチドとは対照的に、Ｔｈ細胞の参加を開始させるように適切に取り付けられなかったＴ細胞とは無関係の抗原であり、したがって、免疫細胞増殖、抗体クラススイッチ、および親和性／特異性成熟を誘導することができない。主な初期の進歩は、早期に炭水化物ベースのワクチンと出会っており、これは、担体タンパク質に適切にコンジュゲートされると、Ｔ細胞依存性エピトープとして作用し、細菌の莢膜多糖体が、オプソニン食作用性抗体を生産する必要な免疫化学的能力を獲得することが可能になるという発見によって支持されてきた。

【0008】

従来、炭水化物抗原を担体タンパク質にコンジュゲートするための戦略は、リシン残基のε－アミノ基上へのアルデヒド由来の糖の還元的アミノ化、または単なるアミドカップリング反応のいずれかに頼っていた。どちらの場合も、一般的に、部分的でランダムな炭水化物抗原コンジュゲーションが起こる。さらに、炭水化物コンジュゲーションに全てのアミドパートナー（リシンからのアミンまたはグルタミン酸／アスパラギン酸からの酸）が使用される場合、多過ぎる炭水化物抗原が担体タンパク質に付着することになり、結果として、必須の可能性があるＴ細胞ペプチドエピトープのマスキングが起こり、免疫原性の生来の減少／排除が生じる。したがって、調製物が、その炭水化物の分布および再現性に関して必要な均一性を欠くため（すなわち、タンパク質上の糖の付着点がランダムに分布し、バッチ間で密度のばらつきがある）、複合糖質ワクチンを調製するための現在の戦略は不十分であり、著しい規制的および／または商業的な障害に直面している。したがって、より大きい炭水化物抗原の均一性、より正確に特徴付け可能な構造、およびバッチ間の再現性を有する複合糖質ワクチンが大いに望ましいと予想される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０１９年後半に始まったＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの原因因子であり、これは、地球規模の人間の健康に対する現代の脅威の一つであり、世界経済も不健全にする。初期のワクチン開発の努力の大部分が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の細胞への侵入および宿主細胞への膜融合を媒介する、スパイク（Ｓ）糖タンパク質上に存在するタンパク質抗原およびエピトープに集中した。しかしながら、地球規模の健康問題の専門家は、科学者が平行して、単一の戦略で発生する可能性がある起こり得る失敗または合併症を和らげるために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する治療的介入を開発する異なる戦略を調査することを強く推奨している。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質上に存在するタンパク質抗原に焦点を当てたものと平行して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンおよび他の治療ツールを開発する必要が未だある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

第１の形態において、ネオ複合糖質を生産するための方法であって、（ａ）第１の末端および第２の末端を有するリンカーを含むネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体を提供するステップであって、第１の末端は、チオエーテル結合を介して炭水化物抗原にコンジュゲートしており、第２の末端は、遊離アミン基と反応可能な官能基を含み、官能基は、－ＣＯＸ、－ＳＯ_２Ｘ、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｘ、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、または－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであり、式中、Ｘは、脱離基である、ステップ；（ｂ）１つまたはそれより多くの遊離アミン基を有する担体材料（例えば、担体タンパク質またはペプチド）を提供するステップ；および（ｃ）カップリング反応を実行して、精製したネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体の１つまたはそれより多くを、担体材料（例えば、担体タンパク質またはペプチド）に、１つまたはそれより多くの遊離アミン基で、アミド、カルバメート、スルホンアミド、尿素、またはチオ尿素結合を介してコンジュゲートし、それによってネオ複合糖質を生産するステップを含む、上記方法が本明細書に記載される。

【0011】

一部の実施態様において、工程（ａ）の前に、（ａ）におけるネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体は、（ｉ）末端のアルケン（アルケニル炭水化物抗原）に共有結合で連結された炭水化物抗原を提供するステップであって、末端のアルケンは、チオール－エン反応を介して、チオール基に直接コンジュゲート可能である、ステップ；（ｉｉ）第１の末端に第１の官能基および第２の末端に第２の官能基を含むチオリンカーを提供するステップであって、第１の官能基は、遊離チオール基であり、第２の官能基は、カルボキシル基、スルフィン酸基、炭酸基、イソシアネート基、またはチオシアネート基である、ステップ；（ｉｉｉ）光触媒作用によるチオール－エン反応を実行して、アルケニル炭水化物抗原を、チオリンカーに、第１の末端で直接コンジュゲートし、それによって第１の末端に炭水化物抗原および第２の末端に第２の官能基を含むネオ炭水化物抗原を生産するステップ；（ｉｖ）第２の官能基がカルボキシル基、スルフィン酸基、または炭酸基である場合、カルボキシル基の、スルフィン酸基の、または炭酸基の末端ヒドロキシル基を、ポリペプチドの遊離アミン基へのコンジュゲーションに関してより優れた脱離基で置き換えることによって、ネオ炭水化物抗原をネオ炭水化物抗原中間体に変換するステップ；および（ｖ）ネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体を精製するステップを含む方法によって調製される。

【0012】

さらなる形態において、第１の末端および第２の末端を有するリンカーを含むネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体であって、第１の末端は、チオエーテル結合を介して炭水化物抗原にコンジュゲートしており、第２の末端は、遊離アミン基と反応可能な官能基を含み、官能基は、－ＣＯＸ、－ＳＯ_２Ｘ、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｘ、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、または－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであり、式中、Ｘは、脱離基である、上記ネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体が本明細書に記載される。

【0013】

さらなる形態において、第１の末端および第２の末端を有するリンカーを含む合成ネオ複合糖質であって、第１の末端は、チオエーテル結合を介して炭水化物抗原にコンジュゲートしており、第２の末端は、担体タンパク質またはペプチドに、そこの中にある１つまたはそれより多くの遊離アミン基で、アミド、カルバメート、スルホンアミド、尿素、またはチオ尿素結合を介してコンジュゲートしている、上記合成ネオ複合糖質が本明細書に記載される。

【0014】

さらなる形態において、リンカーを介して担体タンパク質またはペプチドの１つまたはそれより多くのアミン基（ＣＰ－ＮＨ）にコンジュゲートした１つまたはそれより多くの炭水化物抗原（ＣＡ）を含む合成ネオ複合糖質であって、以下の構造：

【0015】

【化1】

を有する合成ネオ複合糖質が本明細書に記載されるが、式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_１、またはＣＨ_２であり；Ｒ_１は、Ｈ、ＣＯＨ（ホルムアミド）、ＣＯＭｅ、またはＣＯＥｔであり；ｍは、１、２、３、４、または５であり；Ｙは、－（ＣＨ_２）_ｎ－または－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－であり；ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；ｏは、０、１、２、３、４、または５であり；またはｏは、０であり、Ｚは、－ＣＯ－であり、Ｙは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－であり；またはｏは、０であり、Ｚは、－ＳＯ_２－であり、Ｙは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－であり；Ｚは、－ＣＯ－、－ＮＲ_２ＳＯ_２－、－ＯＣＯ－、－ＮＲ_２ＣＯ－、または－ＮＲ_２ＣＳ－であり、Ｒ_２は、Ｈ、Ｍｅ、またはＥｔであり；ｐは、前記１つまたはそれより多くのアミン基で担体タンパク質またはペプチドにコンジュゲートした炭水化物抗原の総数に相当する整数、例えば、ｐ＝１～５０である。ある実施態様において、合成ネオ複合糖質中の担体タンパク質またはペプチドは、天然の、または変性していないコンフォメーションを有し、炭水化物抗原の担体タンパク質またはペプチドへのコンジュゲーションが、対応するコンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較して、対象に投与されたときの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる。

【0016】

さらなる形態において、ネオ複合糖質ワクチンまたは免疫応答を誘発する組成物を生産するための方法が本明細書に記載される。本方法は、本明細書に記載されるネオ複合糖質または本明細書に記載される方法によって調製されたネオ複合糖質を、医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバントを用いて製剤化することを含んでいてもよい。

【0017】

さらなる形態において、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質ワクチンまたは適応免疫応答を誘発する組成物、および／または本明細書に記載されるネオ複合糖質、ならびに本明細書に記載される医薬的に許容される賦形剤および／またはアジュバントを含むワクチンまたは組成物が本明細書に記載される。

【0018】

一部の形態において、対象を免疫化する、それにワクチン接種をする、またはそれを処置する方法であって、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質、本明細書に記載される合成ネオ複合糖質、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質ワクチンもしくは適応免疫応答を誘発する組成物、または本明細書に記載されるネオ複合糖質ワクチンを対象に投与することを含む、上記方法が本明細書に記載される。

【0019】

一部の実施態様において、疾患を有する対象を免疫化すること、それにワクチン接種をすること、またはそれを処置することにおける使用のための、またはネオ複合糖質に特異的に結合する抗体の存在を検出するための、または前記免疫化、ワクチン接種、または処置を検出するための（例えば、対象からの生物学的サンプルにおいて）、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質、本明細書に記載される合成ネオ複合糖質、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質ワクチンもしくは適応免疫応答を誘発する組成物、または本明細書に記載されるネオ複合糖質ワクチンが本明細書に記載される。

【0020】

一部の実施態様において、疾患を有する対象を免疫化または処置するためのワクチンの製造のための、またはネオ複合糖質に特異的に結合する抗体の存在を検出するための、または前記免疫化または処置を検出するための（例えば、対象からの生物学的サンプルにおいて）、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質、本明細書に記載される合成ネオ複合糖質、または本明細書に記載される方法によって生産された適応免疫応答を誘発する組成物が本明細書に記載される。

【0021】

一部の実施態様において、前記炭水化物抗原の増加した発現に関連する疾患を有する対象の処置における使用のための、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質、本明細書に記載される合成ネオ複合糖質、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質ワクチンもしくは適応免疫応答を誘発する組成物、または本明細書に記載されるネオ複合糖質ワクチンが本明細書に記載される。

【0022】

一部の実施態様において、炭水化物抗原または炭水化物抗原を含む腫瘍を循環する細胞に特異的に結合する抗体の存在を検出するかもしくはそれに関してスクリーニングするための、または炭水化物抗原での免疫化またはワクチン接種によって生じる抗体の存在を検出するための、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質、本明細書に記載される合成ネオ複合糖質、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質ワクチンもしくは適応免疫応答を誘発する組成物、または本明細書に記載されるネオ複合糖質ワクチンが本明細書に記載される。

【0023】

さらなる形態において、対象を処置する方法であって、本明細書において規定された、または本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質またはネオ複合糖質免疫原を投与して、炭水化物抗原に対して前記対象における免疫応答を生じさせること、および任意選択で、前記対象からの生物学的サンプルを、炭水化物抗原に特異的に結合する抗体の存在に関してスクリーニングすることを含む、上記方法が本明細書に記載される。

【0024】

さらなる形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して対象を免疫化することにおける使用のための、対象における抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の生産を誘発することにおける使用のための、または対象からのサンプルにおいて抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の存在を検出することにおける使用のための複合糖質であって、複合糖質は、好適な担体材料（例えば、担体タンパク質またはペプチド）にコンジュゲートした炭水化物抗原を含み、炭水化物抗原が、シアル化されたトムゼン－フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原、シアル化されていないＴＦ抗原、シアル化されたＴｎ抗原、シアル化されていないＴｎ抗原、またはそれらのあらゆる組合せを含むかまたはそれからなる、上記複合糖質が本明細書に記載される。

【0025】

さらなる形態において、本明細書に記載される１種またはそれより多くの複合糖質、ならびに医薬的に許容される賦形剤および／またはアジュバントを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンが本明細書に記載される。

【0026】

さらなる形態において、対象にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン接種をするための方法または対象において抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の生産を誘発するための方法であって、本明細書に記載される複合糖質またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを投与することを含む、上記方法が本明細書に記載される。

【0027】

さらなる形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染から対象を防御するための、またはＣＯＶＩＤ－１９を処置するための組成物であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質上に発現されたＯ結合型グリカンに結合する１種またはそれより多くのリガンド（例えば、抗体、抗体断片、またはレクチン）を含み、Ｏ結合型グリカンは、シアル化されたＴＦ抗原（モノまたはジシアル化されたＴＦ抗原）、シアル化されていないＴＦ抗原、シアル化されたＴｎ抗原、シアル化されていないＴｎ抗原、またはそれらのあらゆる組合せを含む、上記組成物が本明細書に記載される。

【0028】

さらなる形態において、（ａ）シアル化されたＴＦ抗原（モノまたはジシアル化されたＴＦ抗原）、シアル化されていないＴＦ抗原、シアル化されたＴｎ抗原、シアル化されていないＴｎ抗原、またはそれらのあらゆる組合せを含む、Ｏ結合型グリカンを発現するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質またはその断片；および（ｂ）Ｏ結合型グリカンにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質またはその断片に結合する、本明細書に記載されるリガンドを含む複合体が本明細書に記載される。

【0029】

一般的な定義
見出し、および他の識別子、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）、（ｉｉ）などは、単に明細書および請求項を読みやすくするために提示される。明細書または請求項における見出しの使用または他の識別子は、工程または要素がアルファベットまたは数字の順番またはそれらが提示されている順番で実行されることを必ずしも必要としない。

【0030】

「１つの」（aまたはan）という語の使用は、請求項および／または明細書において用語「含む」と共に使用される場合、「１つの」を意味する場合があるが、「１つまたはそれより多くの」、「少なくとも１つの」、および「１つまたは１つより多くの」という意味とも一致する。

【0031】

用語「約」は、値が、値を決定するために採用されるデバイスまたは方法ごとの誤差の標準偏差を含むことを示すのに使用される。一般的に、用語「約」は、最大１０％の可能性のある変動を表示することを意味する。それゆえに、値の１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０％の変動は、用語「約」に含まれる。別段の指定がない限り、範囲の前の用語「約」の使用は、範囲の両末端に適用される。

【0032】

本明細書および請求項で使用される場合、「含む」（および、含むのあらゆる形態、例えば「含む」（comprise）および「含む」（comprises））、「有する」（および、有するのあらゆる形態、例えば「有する」（have）および「有する」（has））、「包含する」（および、包含するのあらゆる形態、例えば「包含する」（includes）および「包含する」（include））または「含有する」（および、含有するのあらゆる形態、例えば「含有する」（contains）および「含有する」（contain））という語は、包括的であるか、またはオープンエンドであり、追加の記載されていない要素または方法工程を排除しない。

【0033】

用語「タンパク質」（例えば、「担体タンパク質」という表現における）は、本明細書で使用される場合、あらゆるペプチド結合したアミノ酸の鎖を意味し、は、修飾が本明細書に記載されるネオ複合糖質免疫原およびネオ複合糖質ワクチンの免疫原性を破壊しない限り、あらゆるタイプの修飾（例えば、化学修飾または翻訳後修飾、例えばアセチル化、リン酸化、グリコシル化、硫酸化、ＳＵＭＯ化（sumoylation）、プレニル化、ユビキチン化など）を含んでいてもよいし、または含んでいなくてもよい。さらにわかりやすくするために、用語「タンパク質」および「担体タンパク質」は、本明細書で使用される場合、両方の実施態様が、例えば表現「担体タンパク質またはペプチド」のように一緒に列挙される場合でも、ペプチドとポリペプチドの両方を包含する。

【0034】

用語「ネオ複合糖質」は、本明細書で使用される場合、目的の対象における炭水化物抗原の免疫原性を強化するために担体タンパク質またはペプチドにカップリングされた炭水化物抗原（例えば、抗原性の単糖、二糖、オリゴ糖、または多糖、好ましくは天然の抗原）を指す。表現「炭水化物抗原」および「糖抗原」は、本明細書で使用されるのと同じ意味を有する。用語「免疫原」は、免疫系の構成要素によって（例えば、抗体および／またはリンパ球によって）特異的に結合して、目的の対象において体液性および／または細胞媒介性免疫応答を発生させることが可能な物質を指す。「ネオ複合糖質免疫原」などの表現における用語「免疫原」は、本明細書で使用される場合、ネオ複合糖質の、これに限定されないが、ネオ複合糖質それ自身の、特定の使用に対する（例えば、対象において免疫応答を発生させるための免疫原としての）能力（すなわち、物理的な特徴または特性）を指す。例えば、一部の実施態様において、本明細書に記載されるネオ複合糖質免疫原は、生物学的サンプル（例えば、対象からの）中のネオ複合糖質免疫原に結合する抗体の存在または非存在を検出するための診断アッセイまたは方法（例えば、インビトロの方法）において採用することができる。一部の実施態様において、本明細書に記載されるネオ複合糖質免疫原は、ネオ複合糖質免疫原に特異的に結合する抗体（例えば、診断的または治療的に適用できるモノクローナル抗体）のスクリーニング、同定、または評価に使用することができる。

【0035】

用語「合成」は、本明細書で使用される場合、人間の介入によって生産される天然の生成物ではない化合物を指す。

【0036】

用語「コンジュゲート可能な」は、本明細書で使用される場合、分子が互いに実際に共有結合で結合しているかどうかに関係なく、少なくとも２つの分子（例えば、炭水化物抗原とチオリンカー；またはネオ炭水化物抗原と担体タンパク質またはペプチド）の、化学反応を介して互いに共有結合で結合する能力または可能性を指す。対照的に、用語「コンジュゲートした」は、少なくとも２つの分子（例えば、炭水化物抗原とチオリンカー、またはネオ炭水化物抗原と担体タンパク質またはペプチド）が互いに共有結合で結合していることを指す。

【0037】

用語「投与」は、本明細書で使用される場合、投与経路が対象において免疫応答の発生をもたらす限り、例えば非経口（例えば、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内）、経口、経皮、鼻腔内など投与経路を含んでいてもよい。

【0038】

用語「対象」は、一般的に、本明細書で使用される場合、本明細書に記載されるネオ複合糖質に対する免疫応答を開始させることができ、好ましくはネオ複合糖質および／またはネオ複合糖質を提示する細胞に特異的に結合する抗体および／またはリンパ球の生産を生じる生物（例えば、動物またはヒト）を指す。一部の実施態様において、本明細書に記載される対象は、治療的に処置しようとする患者（例えば、本明細書に記載されるネオ複合糖質免疫原でのワクチン接種を介して）であってもよいし、または調査、診断、および／または治療目的のためのツール（例えば、抗体）を生じさせるための手段として採用してもよい。

【0039】

本発明の説明の他の目的、利点および特色は、添付の図面を参照しながら、単なる一例として記載された以下のそれらの具体的な実施態様の非制限的な説明を読めばより明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1】図１は、例えばヒトムチン糖タンパク質（ＭＵＣ）からの主要な腫瘍関連の炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）の典型的な化学構造の例を示す。

【図2】図２は、実施例２～６に記載されるアリルＴｎ抗原およびアリルＴＦ抗原中間体の合成のための反応スキームを示す。

【図3A】図３Ａ、図３Ｂは、アリル２－アセトアミド－３，６－ジ－Ｏ－ピバロイル－２－デオキシ－α－Ｄ－グルコピラノシド（化合物２）に関する^１Ｈ－ＮＭＲ（図３Ａ）および^１３Ｃ－ＮＭＲ（図３Ｂ）スペクトルを示す。

【図3B】図３Ａ、図３Ｂは、アリル２－アセトアミド－３，６－ジ－Ｏ－ピバロイル－２－デオキシ－α－Ｄ－グルコピラノシド（化合物２）に関する^１Ｈ－ＮＭＲ（図３Ａ）および^１３Ｃ－ＮＭＲ（図３Ｂ）スペクトルを示す。

【図3C】図３Ｃは、アリル２－アセトアミド－３，６－ジ－Ｏ－ピバロイル－２－デオキシ－α－Ｄ－グルコピラノシド（化合物２）に関する質量分析の結果（図３Ｃおよび３Ｄ）を示す。

【図3D】図３Ｄは、アリル２－アセトアミド－３，６－ジ－Ｏ－ピバロイル－２－デオキシ－α－Ｄ－グルコピラノシド（化合物２）に関する質量分析の結果（図３Ｃおよび３Ｄ）を示す。

【図4A】図４Ａ～４Ｂは、アリル２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（アリルＴｎ）に関する^１Ｈ－ＮＭＲ（図４Ａ）および^１３Ｃ－ＮＭＲ（図４Ｂ）スペクトルを示す。

【図4B】図４Ａ～４Ｂは、アリル２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（アリルＴｎ）に関する^１Ｈ－ＮＭＲ（図４Ａ）および^１３Ｃ－ＮＭＲ（図４Ｂ）スペクトルを示す。

【図4C】図４Ｃは、アリル２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（アリルＴｎ）に関する質量分析の結果（図４Ｃおよび４Ｄ）を示す。

【図4D】図４Ｄは、アリル２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（アリルＴｎ）に関する質量分析の結果（図４Ｃおよび４Ｄ）を示す。

【図5A】図５Ａは、アリル２－アセトアミド－４，６－Ｏ－ベンジリデン－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（化合物４）に関する^１Ｈ－ＮＭＲ（図５Ａ）スペクトルを示す。

【図5B】図５Ｂは、アリル２－アセトアミド－４，６－Ｏ－ベンジリデン－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（化合物４）に関する質量分析の結果（図５Ｂおよび６Ｃ）を示す。

【図5C】図５Ｃは、アリル２－アセトアミド－４，６－Ｏ－ベンジリデン－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（化合物４）に関する質量分析の結果（図５Ｂおよび６Ｃ）を示す。

【図6A】図６Ａ、図６Ｂは、アリル（２，３，４，６－テトラ－Ｏ－ベンゾイル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）－２－アセトアミド－４，６－Ｏ－ベンジリデン－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（化合物６）に関する^１Ｈ－ＮＭＲ（図６Ａ）および^１３Ｃ－ＮＭＲ（図６Ｂ）スペクトルを示す。

【図6B】図６Ａ、図６Ｂは、アリル（２，３，４，６－テトラ－Ｏ－ベンゾイル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）－２－アセトアミド－４，６－Ｏ－ベンジリデン－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（化合物６）に関する^１Ｈ－ＮＭＲ（図６Ａ）および^１３Ｃ－ＮＭＲ（図６Ｂ）スペクトルを示す。

【図6C】図６Ｃは、アリル（２，３，４，６－テトラ－Ｏ－ベンゾイル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）－２－アセトアミド－４，６－Ｏ－ベンジリデン－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（化合物６）に関する質量分析の結果（図６Ｃおよび６Ｄ）を示す。

【図6D】図６Ｄは、アリル（２，３，４，６－テトラ－Ｏ－ベンゾイル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）－２－アセトアミド－４，６－Ｏ－ベンジリデン－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（化合物６）に関する質量分析の結果（図６Ｃおよび６Ｄ）を示す。

【図7A】図７Ａ、図７Ｂは、化合物７に関する^１Ｈ－ＮＭＲ（図７Ａ）および^１３Ｃ－ＮＭＲ（図７Ｂ）スペクトルを示す。

【図7B】図７Ａ、図７Ｂは、化合物７に関する^１Ｈ－ＮＭＲ（図７Ａ）および^１３Ｃ－ＮＭＲ（図７Ｂ）スペクトルを示す。

【図7C】図７Ｃは、化合物７に関する質量分析の結果（図７Ｃおよび７Ｄ）を示す。

【図7D】図７Ｄは、化合物７に関する質量分析の結果（図７Ｃおよび７Ｄ）を示す。

【図8A】図８Ａ、図８Ｂは、アリル（β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）－２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（アリルＴＦ）に関する^１Ｈ－ＮＭＲ（図８Ａ）および^１３Ｃ－ＮＭＲ（図８Ｂ）スペクトルを示す。

【図8B】図８Ａ、図８Ｂは、アリル（β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）－２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（アリルＴＦ）に関する^１Ｈ－ＮＭＲ（図８Ａ）および^１３Ｃ－ＮＭＲ（図８Ｂ）スペクトルを示す。

【図8C】図８Ｃは、アリル（β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）－２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（アリルＴＦ）に関する質量分析の結果（図８Ｃおよび８Ｄ）を示す。

【図8D】図８Ｄは、アリル（β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）－２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（アリルＴＦ）に関する質量分析の結果（図８Ｃおよび８Ｄ）を示す。

【図9】図９は、アリルＴｎからのネオ複合糖質免疫原の生産のための反応スキームを示す。

【図10】図１０は、化合物８に関する^１Ｈ－ＮＭＲおよび^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルの結果を示す。

【図11A】図１１Ａは、化合物９に関する^１Ｈ－ＮＭＲおよび^１３Ｃ－ＮＭＲ（図１１Ａ）スペクトルを示す。

【図11B】図１１Ｂは、化合物９に関する質量分析（ＬＣ－ＭＳ）の結果（図１１Ｂ）を示す。

【図12】図１２は、アリルＴｎからのネオ複合糖質免疫原の生産のための反応スキームを示す。

【図13】図１３は、化合物１２に関する^１Ｈ－ＮＭＲおよび^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す。

【図14】図１４は、化合物１３に関する^１Ｈ－ＮＭＲおよび^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す。

【図15】図１５Ａ～１５Ｅは、Ｔｎを認識するレクチンであるナヨクサフジ（Vicia Villosa）（ＶＶＡ）の、ＢＳＡ－Ｔｎ（図１５Ａ～１５Ｄ）およびＣＲＭ１９７－Ｔｎ（図１５Ｅ）コンジュゲートへの反応性を示す。図１５Ａは、ｐＨ６～１０の範囲の緩衝液中で生産された異なるＢＳＡ－Ｔｎコンジュゲートを示すウェスタンブロットを示す。図１５Ｂに、対応するＥＬＩＳＡ分析を示す。図１５Ｃは、最適なｐＨ８でのＢＳＡへのコンジュゲーションにおけるＰＦＰ－Ｔｎ（化合物９）の滴定を示すウェスタンブロットである。図１５Ｄに、対応するＥＬＩＳＡ分析を示す。図１５Ｅは、ＣＲＭ１９７－Ｔｎのウェスタンブロット分析を示す。ブロットから、試験されたＰＦＰ－Ｔｎの３つのコンジュゲーション比率（すなわち、３．４、９．７、および１５）につきＣＲＭ１９７の分子量（約５８．４ｋＤａ）の範囲内に単一のＶＶＡ反応性バンドがあることが明らかになり、これら３種の最も反応性の種が、１５当量の最も高いＰＦＰ－Ｔｎ比率で生じた。

【図16】図１６Ａおよび１６Ｂは、ＴＦ特異的なレクチンであるピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）へのＢＳＡ－ＴＦコンジュゲートの反応性およびコンジュゲートした二糖ＴＦ抗原からのガラクトース糖の投薬量を示す。図１６Ａは、ウェスタンブロットが、ＴＦのＢＳＡへのカップリングを示すＢＳＡ単量体の期待される分子量の範囲内のＰＮＡに反応性を有する優勢なバンドが明らかになったことを示す。図１６Ｂに、ＰＮＡ－ｈｒｐを使用した対応するＥＬＩＳＡ分析を示す。ＴＦのＢＳＡへのコンジュゲーションはまた、デュボア（Dubois）の方法によりＢＳＡに会合するガラクトースを測定することによっても実証された（図１６Ｂの棒グラフ）。

【図17】図１７Ａ～１７Ｃは、ＣＯＯＨ－ＴｎおよびＣＯＯＨ－ＴＦの担体タンパク質ＣＲＭ１９７およびｄＴＴへのコンジュゲーションを示す。図１７Ａは、クーマシー染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示し、それによれば、コンジュゲートしたタンパク質（「－Ｔｎ」および「－ＴＦ」）が、それらの対応するコンジュゲートしていないタンパク質（「ｃｒｍ」および「ｄＴＴ」）と比べてわずかに増加した分子量を有すると考えられることが示される。図１７Ｂに示される対応するウェスタンブロットは、各－Ｔｎおよび－ＴＦタンパク質コンジュゲートの、それぞれＶＶＡおよびＰＮＡレクチンへの特異的な反応性を示す。レクチンへの特異的な反応性の同じパターンはＥＬＩＳＡによっても観察された（図１７Ｃ）。

【図18】図１８は、ＥＬＩＳＡによる、ｄＴＴ－ＴＦで３回免疫化されたマウスからの血清の、様々なＴＦおよびＴｎスクリーニング抗原への正規化した反応性を示す。

【図19】図１９Ａ～１９Ｂは、ｄＴＴ－ＴＦで５回免疫化されたマウス、加えて５回目の免疫化の６週間後のマウスからの血清の滴定のスクリーニング抗原ＢＳＡ－ＴＦへの反応性を示す。図１９Ａは、マウス「Ａ１」からの結果を示し、図１９Ｂは、マウス「Ａ２」からの結果を示す。

【図20】図２０は、高分解能ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析された７５ｋＤＡを超えるタンパク質におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組換えＳ１タンパク質に対するペプチドＶＱＰＴＥＳＩＶＲ（配列番号３）の全てのＯ－グリコシル化された形態の相対的な存在量を示す。

【図21】図２１は、高分解能ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析された７５～１００ｋＤＡのタンパク質におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組換えＳ１タンパク質に対するペプチドＶＱＰＴＥＳＩＶＲ（配列番号３）の全てのＯ－グリコシル化された形態の相対的な存在量を示す。

【図22】図２２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１タンパク質または全長Ｓタンパク質のいずれかでトランスフェクトされた哺乳類細胞からの培養上清への抗ＴＦ（ＪＡＡ－Ｆ１１ ＩｇＧおよびＳＰＭ３２０ ＩｇＭ）および抗Ｔｎ（Ｔｎ２１８ ＩｇＭ）モノクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡによって示す。結果は、空のベクターでトランスフェクトされた対応する哺乳類細胞からの培養上清に曝露された同じモノクローナル抗体に対する増加倍率として示される。

【図23】図２３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１タンパク質または全長Ｓタンパク質でトランスフェクトされた哺乳類細胞からの培養上清へのレクチンのパネルの反応性を示す。結果は、空のベクターでトランスフェクトされた対応する哺乳類細胞からの培養上清に曝露された同じモノクローナル抗体に対する増加倍率として示される。

【図24】図２４は、シュードタイプ化レンチ－ｌｕｃ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓウイルスの、ヒトアンジオテンシン変換酵素２を発現する宿主細胞への感染力を阻害する、異なる抗炭水化物リガンドの作用を示す。「ＰＮＡ」および「ＡＩＡ（ｊａｃ）」は、異なる炭水化物抗原結合特異性を有するレクチンであり、後者は、そのシアル化されたまたはシアル化されていない形態のいずれかでＴＦおよびＴｎ抗原の両方に結合特異性を有することがわかっている。「ＪＡＡ－Ｆ１１」は、ＴＦ抗原のシアル化されていない形態とのみ結合するモノクローナル抗体である。

【発明を実施するための形態】

【0041】

配列表
本出願は、約１２Ｋｂのサイズを有する２０２０年９月１７日に作成されたコンピューター読取り可能な形態の配列表を含有する。コンピューター読取り可能な形態は、参照により本明細書に組み入れられる。

【0042】

詳細な説明
本発明の説明は、例えば、例えば免疫原、ワクチンのための、診断における、または分析もしくは治療ツールを生成する（例えば、新規の抗ネオ複合糖質抗体を生成する）ための使用に好適なネオ複合糖質、加えてそれらを生産するための改善された方法に関する。

【0043】

末端の酸官能基で終わる炭水化物抗原を担体タンパク質のアミン基にコンジュゲートすることは、従来、スクシンイミドまたはカルボジイミド試薬でのランダムな活性化を介してなされる。このような炭水化物抗原－担体タンパク質コンジュゲーション方法の主な不利益の１つは、担体タンパク質それ自体の中で起こる制御不能な／望ましくない自己架橋形成であり、この場合、担体タンパク質自体のアスパラギン酸／グルタミン酸残基の側鎖は、担体タンパク質自体のリシン残基のε－アミン基にカップリングされることになる。このアプローチは、担体タンパク質の天然構造の変動または破壊を引き起こし、しばしば結果として、喪失されなければ高度に免疫原性であると予想される重要なペプチド配列の実質的な喪失、加えて担体タンパク質の起こり得る望ましくない架橋が生じる。加えて、当業界で説明されている炭水化物抗原－担体タンパク質コンジュゲーション方法は、例えばスクアリン酸などのリンカーを採用することが多く、これは、リンカーがカップリングされる炭水化物抗原に対してだけではなくリンカーそれ自体に対する免疫応答を誘発する可能性がある。さらに、当業界で説明されている炭水化物抗原－担体タンパク質コンジュゲーション方法は、担体タンパク質がグリコシル化される程度への十分な制御が不可能であり、結果として不均一な複合糖質種が生じることが多く、これは、ヒト治療剤生産に対する著しい障壁である。

【0044】

対照的に、本明細書に記載される炭水化物抗原－担体タンパク質コンジュゲーション戦略は、これまでに記載されたものとは異なる。第一に、一部の実施態様において、アルケニル官能基を有する炭水化物抗原は、試薬なしの光分解性チオール－エン反応によって非免疫原性リンカーにカップリングされて、本明細書に記載されるネオ炭水化物抗原を生産し、この上流工程は、担体タンパク質およびペプチドの構造に影響を与えない。第二に、本明細書に記載される一部の実施態様において、ネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体は、活性エステル基などのより優れた脱離基で終わるように作製され、担体タンパク質またはペプチドへのコンジュゲーションの前に精製され、したがってコンジュゲーション効能が改善され、同時に担体タンパク質またはペプチド内の自己架橋形成が回避される。第三に、本明細書に記載される炭水化物抗原－担体タンパク質コンジュゲーション戦略における反応パートナーの効能および化学量論は、担体タンパク質またはペプチドにコンジュゲートした炭水化物抗原の数のより正確な制御を可能にし、したがって主要な免疫原性ペプチド配列の起こり得るマスキングが回避される。

【0045】

第１の形態において、本発明の記載は、ネオ複合糖質を生産するための改善された方法に関する。本方法は、一般的に、末端のアルケン（アルケニル炭水化物抗原）に共有結合で連結された炭水化物抗原を提供するステップであって、末端のアルケンは、チオール－エン反応を介して、チオール基に直接コンジュゲート可能である、ステップを含む。本方法は、第１の末端に第１の官能基および第２の末端に第２の官能基を含むチオリンカーを提供するステップであって、第１の官能基は、遊離チオール基であり、第２の官能基は、カルボキシル基、スルフィン酸基、炭酸基、イソシアネート基、またはチオシアネート基などの基である、ステップをさらに含む。次いで光触媒作用によるチオール－エン反応を実行して、第１の末端でアルケニル炭水化物抗原をチオリンカーに直接コンジュゲートし、それによって第１の末端に炭水化物抗原および第２の末端に第２の官能基を含むネオ炭水化物抗原が生産される。第２の官能基が、カルボキシル基、スルフィン酸基、または炭酸基である場合、本明細書に記載される方法は、カルボキシル基の、スルフィン酸基の、または炭酸基の末端ヒドロキシル基を、ポリペプチドの遊離アミン基へのコンジュゲーションに関してより優れた脱離基で置き換えることによって、ネオ炭水化物抗原をネオ炭水化物抗原中間体に変換するステップをさらに含む。次いでネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体は、精製してもよく、その後、１つまたはそれより多くの遊離アミン基を有する担体材料（例えば、担体タンパク質またはペプチド）とのカップリング反応で採用される。カップリング反応は、精製したネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体の１つまたはそれより多くを、担体材料に、１つまたはそれより多くの遊離アミン基で（例えば、アミド、カルバメート、スルホンアミド、尿素、またはチオ尿素結合を介して）コンジュゲートし、それによってネオ複合糖質が生産される。

【0046】

さらなる形態において、ネオ複合糖質を生産するための方法であって、第１の末端および第２の末端を有するリンカーを含むネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体を提供するステップであって、第１の末端は、チオエーテル結合を介して炭水化物抗原にコンジュゲートしており、第２の末端は、遊離アミン基と反応可能な官能基を含み、官能基は、－ＣＯＸ、－ＳＯ_２Ｘ、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｘ、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、または－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであり、Ｘは、脱離基である、ステップを含む、上記方法が本明細書に記載される。本方法は、１つまたはそれより多くの遊離アミン基を有する担体材料（例えば、担体タンパク質またはペプチド）を提供するステップ；およびカップリング反応を実行して、精製したネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体の１つまたはそれより多くを、担体材料に、１つまたはそれより多くの遊離アミン基で、アミド、カルバメート、スルホンアミド、尿素、またはチオ尿素結合を介してコンジュゲートし、それによって、ネオ複合糖質を生産するステップをさらに含む。

【0047】

さらなる形態において、新規のネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体が本明細書に記載される。一部の実施態様において、ネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体は、第１の末端および第２の末端を有するリンカーを含み、第１の末端は、チオエーテル結合を介して炭水化物抗原にコンジュゲートしており、第２の末端は、遊離アミン基と反応可能な官能基を含み、官能基は、－ＣＯＸ、－ＳＯ_２Ｘ、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｘ、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、または－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであり、Ｘは、脱離基である。

【0048】

さらなる形態において、第１の末端および第２の末端を有するリンカーを含む新規の合成ネオ複合糖質であって、第１の末端は、チオエーテル結合を介して炭水化物抗原にコンジュゲートしており、第２の末端は、担体材料（例えば、担体タンパク質またはペプチド）に、そこの中にある１つまたはそれより多くの遊離アミン基で、アミド、カルバメート、スルホンアミド、尿素、またはチオ尿素結合を介してコンジュゲートしている、合成ネオ複合糖質が本明細書に記載される。

【0049】

さらなる形態において、リンカーを介して担体タンパク質またはペプチドの１つまたはそれより多くのアミン基（ＣＰ－ＮＨ）にコンジュゲートした１つまたはそれより多くの炭水化物抗原（ＣＡ）を含む新規の合成ネオ複合糖質であって、以下の構造：

【0050】

【化2】

を有する合成ネオ複合糖質が本明細書に記載されるが、式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_１、またはＣＨ_２であり；Ｒ_１は、Ｈ、ＣＯＨ（ホルムアミド）、ＣＯＭｅ、またはＣＯＥｔであり；ｍは、１、２、３、４、または５であり；Ｙは、－（ＣＨ_２）_ｎ－または－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－であり；ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；ｏは、０、１、２、３、４、または５であり；またはｏは、０であり、Ｚは、－ＣＯ－であり、Ｙは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－であるまたはｏは、０であり、Ｚは、－ＳＯ_２－であり、Ｙは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－であり；Ｚは、－ＣＯ－、－ＮＲ_２ＳＯ_２－、－ＯＣＯ－、－ＮＲ_２ＣＯ－、または－ＮＲ_２ＣＳ－であり；Ｒ_２は、Ｈ、Ｍｅ、またはＥｔであり；ｐは、前記１つまたはそれより多くのアミン基で担体タンパク質またはペプチドにコンジュゲートした炭水化物抗原の総数に相当する整数である。

【0051】

さらなる形態において、リンカーを介して担体タンパク質またはペプチドの１つまたはそれより多くのアミン基（ＣＰ－ＮＨ）にコンジュゲートした１つまたはそれより多くの炭水化物抗原（ＣＡ）を含む新規の合成ネオ複合糖質であって、以下の構造：

【0052】

【化3】

有する合成ネオ複合糖質が本明細書に記載され、式中、ｐは、前記１つまたはそれより多くのアミン基で担体タンパク質またはペプチドにコンジュゲートした炭水化物抗原の総数に相当する整数である。

【0053】

一部の実施態様において、ｐは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０の整数であり、所与の担体タンパク質またはペプチドにおけるコンジュゲーションに利用可能なアミン基の総数（例えば、リシン残基、例えば溶媒が接近可能なリシン残基の総数）までである。

【0054】

一部の実施態様において、合成ネオ複合糖質中の担体タンパク質またはペプチドは、天然の、または変性していないコンフォメーションを有し、炭水化物抗原の担体タンパク質またはペプチドへのコンジュゲーションが、対応するコンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較して、対象に投与されたときの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる。

【0055】

一部の実施態様において、アルケニル炭水化物抗原をチオリンカーに直接コンジュゲートするための本明細書に記載されるチオール－エン反応は、炭水化物抗原の構造および／または抗原性の破壊または変動（例えば、望ましくない免疫反応および／または変動した構造を有する望ましくない炭水化物抗原に対する抗体の発生を引き起こす可能性がある）を最小化または回避する反応条件下で実行することができる。

【0056】

一部の実施態様において、本明細書に記載されるチオール－エン反応は、紫外光下での放射線照射を含む光触媒作用によるチオール－エン反応であってもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒作用によるチオール－エン反応は、短波長の紫外光下での（例えば、約２５４ｎｍ）、または長波長の紫外光下での（例えば、約３５５ｎｍまたは３６５ｎｍでの）放射線照射を含んでいてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載されるチオール－エンコンジュゲーション反応は、短波長および長波長の紫外光の両方の下でのコンジュゲーションを可能にする多角性を有していてもよい。

【0057】

一部の実施態様において、本明細書に記載されるチオール－エン反応は、触媒の存在下で実行することができる。例えば、一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒作用によるチオール－エン反応は、触媒の存在下で、長波長の紫外光下で実行してもよいし、または触媒の非存在下で、短波長の紫外光下で実行して、さらにプロセスを簡易化してもよい。本明細書で使用される場合、チオール－エン反応の文脈で、用語「触媒」、「光開始剤」、および「活性化剤」は、光触媒作用によるチオール－エン反応を介した遊離チオール基における炭水化物抗原のチオリンカーへのコンジュゲーションを促進する物質を指すのに同義的に使用することができる。一部の実施態様において、触媒は、水溶性触媒、例えば水溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物；２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］ジヒドロクロリド（Ｖａｚｏ ４４またはＶＡ－０４４）；２，２’－アゾビス（２－アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）；リチウムフェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィネート（ＬＡＰ）；光開始剤活性を有する金属または金属イオン；過酸化物；ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド；過酸化ベンゾイル；過硫酸アンモニウム；もしくは光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体であってもよい。一部の実施態様において、触媒は、水不溶性触媒、例えば水不溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物、２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）、４，４’－アゾビス（４－シアノペンタン酸）（ＡＣＶＡ）、１，１’－アゾビス（シアノシクロヘキサン）（ＡＣＨＮ）、ジアゼンジカルボン酸ビス（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミド）（ＴＭＡＤ）；アゾジカルボン酸ジピペリジド（ＡＤＤ）、もしくは光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体であってもよい。

【0058】

一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒作用によるチオール－エン反応は、チオリンカーの遊離チオール基１つ当たり、１～２００または１～１００モル当量のアルケニル炭水化物抗原を反応させることを含んでいてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒作用によるチオール－エン反応は、１０～３００、１０～２７０、１０～２４０、１０～２１０、１０～１８０、１０～１５０、１０～１２０、１０～９０、１０～６０、または１０～３０分実行することができる。

【0059】

一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒作用によるチオール－エン反応は、約３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または４．０から、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０までの範囲のｐＨで実行することができる。一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒作用によるチオール－エン反応は、炭水化物抗原の変動または破壊を最小化または回避するｐＨで実行することができる。

【0060】

一部の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、末端のアルケンに連結されるように（直接に、またはリンカーもしくはスペーサーを介して間接的に）化学修飾されていてもよく（例えば、グリコシド結合または還元的アミノ化により得られた結合を介して、例えばアリルまたはアルケニルアミンと還元糖との間で、好ましくはＮａＢＨ_４および／またはＮａＢＨ_３ＣＮを使用して）、その場合、アルケニル炭水化物抗原の末端のアルケン基は、チオール－エン反応（例えば、光触媒作用によるチオール－エン反応）を介して遊離のチオリンカーにコンジュゲート可能である。アルケニル炭水化物抗原の末端のアルケン基は、一置換されたアルケン、ビニル基、またはアリル基であってもよい。

【0061】

一部の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、例えばアリルアミンと還元糖（細菌のＣＰＳなど）との間で、グリコシド結合、例えばＯ－グリコシド結合、Ｓ－グリコシド結合、Ｎ－グリコシド結合、もしくはＣ－グリコシド結合、または還元的アミノ化により得られた結合を介して、末端のアルケンに共有結合で連結されていてもよい。「グリコシド結合」は、本明細書で使用される場合、Ｓ－グリコシド結合、Ｎ－グリコシド結合、Ｏ－グリコシド結合、もしくはＣ－グリコシド結合、または還元糖の還元的アミノ化により得られた結合（例えば、ＮａＢＨ_４または好ましくはＮａＢＨ_３ＣＮを使用して）の１つまたはそれより多くを含んでいてもよい。一部の実施態様において、グリコシド結合は、投与されることになる対象の内因性酵素（例えば、グリコヒドロラーゼ）によって切断不可能なものであってもよい。このような切断不可能なグリコシド結合は、対象への投与後、より長い半減期を有するネオ複合糖質免疫原をもたらす可能性があり、これは順に、治療および／または抗体を生成する目的にとってより好都合な免疫応答を生じる可能性がある。一部の実施態様において、グリコシド結合は、Ｓ－グリコシド結合、Ｎ－グリコシド結合、もしくはＣ－グリコシド結合、または例えばアリルアミンと還元糖との間における還元的アミノ化により得られた結合であってもよい。

【0062】

一部の実施態様において、本明細書に記載されるチオリンカーは、下記の構造を含んでいてもよい。

【0063】

【化4】

（式中、Ｙは、－（ＣＨ_２）_ｎ－または－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－であり；Ｚは、－ＣＯ_２Ｈ、－ＳＯ_２Ｈ、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｈ、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、または－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであり；Ｏは、０、１、２、３、４、または５であり；Ｏは、０であり、Ｚは、－ＣＯ－であり、Ｙは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－であり；またはＯは、０であり、Ｚは、－ＳＯ_２－であり、Ｙは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－である）
一部の実施態様において、本明細書に記載される方法およびネオ複合糖質は、好ましくは、保護されていない炭水化物抗原を採用し、これは、炭水化物抗原それ自体の水溶性を改善し、加えて後の炭水化物抗原の保護基を除去する工程を回避する。したがって、一部の実施態様において、炭水化物抗原、アルケニル炭水化物抗原、ネオ炭水化物抗原、ネオ炭水化物抗原中間体、および／またはネオ複合糖質の炭水化物部分は、本明細書に記載される方法にわたり保護されていないままである。

【0064】

一部の実施態様において、本明細書に記載されるネオ炭水化物抗原の第２の官能基が、カルボキシル基、スルフィン酸基、または炭酸基などの基である場合、本明細書に記載される方法は、カルボキシル基の、スルフィン酸基の、または炭酸基の末端ヒドロキシル基を、ポリペプチドの遊離アミン基へのコンジュゲーションに関してより優れた脱離基で置き換えることによって、ネオ炭水化物抗原をネオ炭水化物抗原中間体に変換するステップをさらに含んでいてもよい。表現「より優れた脱離基」は、本明細書で使用される場合、脱離基での置き換え前の対応する官能基と比較して、改善された反応効率および／または特異性（すなわち、ポリペプチドの遊離アミン基への改善されたコンジュゲーション）を提供する脱離基を指す。一部の実施態様において、本明細書において採用される脱離基は、活性エステル基（例えば、フルオロフェニル基（例えば、ＯＰｈＦ５、ＯＰｈＦ４（パラＳＯ_３Ｎａ）、またはスクシンイミジル基）であってもよい。次いでネオ炭水化物抗原中間体は、精製してもよいし、その後、１つまたはそれより多くの遊離アミン基を有する担体タンパク質またはペプチドとのカップリング反応で採用してもよい。カップリング反応は、精製したネオ炭水化物抗原中間体の１つまたはそれより多くを、担体タンパク質またはペプチドに、１つまたはそれより多くの遊離アミン基で（例えば、アミド、カルバメート、スルホンアミド、尿素、またはチオ尿素結合を介して）コンジュゲートし、それによって本明細書に記載されるネオ複合糖質が生産される。

【0065】

一部の実施態様において、本明細書に記載されるネオ炭水化物抗原－担体タンパク質カップリング反応は、有利なことに、アスパラギン酸／グルタミン酸残基の側鎖と担体タンパク質またはペプチドそれ自体中に存在するε－リシンアミンとの間の担体タンパク質またはペプチドの自己架橋を最小化または回避することができる。

【0066】

一部の実施態様において、本明細書に記載されるネオ炭水化物抗原－担体タンパク質カップリング反応は、担体タンパク質またはペプチドにコンジュゲートしたネオ炭水化物抗原の数を、反応物の効能および／または化学量論（例えば、担体タンパク質またはペプチドのネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体に対するモル比）によって制御することを可能にする。一部の実施態様において、本明細書に記載されるネオ炭水化物抗原－担体タンパク質カップリング反応は、担体タンパク質またはペプチド１つ当たり、１～５００、１～４００、１～３００、１～２００、５～５００、５～４００、５～３００、または５～２００モル当量のネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体を反応させることを含んでいてもよい。一部の実施態様において、本発明の記載は、炭水化物コンジュゲーション種に関して、約または少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の均一性を有するネオ複合糖質免疫原を含む組成物に関する（例えば、組成物中のネオ複合糖質種／分子の少なくとも９０％が、同じ数の担体タンパク質にコンジュゲートした炭水化物抗原を有する）。

【0067】

一部の実施態様において、本明細書に記載される（ネオ）炭水化物抗原は、Ｂ細胞エピトープを含んでいてもよく、および／または対象において体液性免疫応答を誘導する。一部の実施態様において、本明細書に記載される（ネオ）炭水化物抗原は、Ｔ細胞エピトープを含んでいてもよく、および／または対象において細胞媒介性免疫応答を誘導する。一部の実施態様において、本明細書に記載される（ネオ）炭水化物抗原は、Ｂ細胞エピトープとＴ細胞エピトープの両方を含んでもよく、および／または対象において体液性および細胞媒介性免疫応答の両方を誘導する。一部の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、腫瘍関連の炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）、例えばＴｎ、Ｓ－Ｔｎ、トムゼン－フリーデンライヒ（ＴＦ）、（２，３）－Ｓ－ＴＦ、（２，６）－Ｓ－ＴＦ（図１）、グロボＨ（Globo H）、ＰＳＡ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｎ－グリコリル－ＧＭ３、フコシルＧＭ１、Ｌｅ^ａ、ｓＬｅ^ａ、Ｌｅ^ｘ、ｓＬｅ^ｘ、Ｌｅ^ｙ、またはそれらのあらゆる組合せであってもよいし、またはそれを含んでいてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、ウイルスの多糖抗原、または細菌の莢膜多糖体（ＣＰＳ）（例えば、肺炎球菌および／または連鎖球菌の多糖血清型、髄膜炎菌のＣＰＳ；インフルエンザ（例えばインフルエンザａ型またはｂ型）ＣＰＳ）を含んでいてもよい。

【0068】

一部の実施態様において、本明細書に記載されるネオ炭水化物抗原－担体タンパク質カップリング反応は、同じ炭水化物抗原の少なくとも２つ、または１つより多くのタイプの炭水化物抗原を、担体タンパク質またはペプチドに、１つまたはそれより多くのタイプのチオリンカーを介してコンジュゲートすることによって、多価性のネオ複合糖質を生産することができる。一部の実施態様において、多価性のネオ複合糖質は、担体タンパク質またはペプチドにコンジュゲートした同じまたは異なるタイプの炭水化物抗原のうち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５種、またはそれより多くを含んでいてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載されるネオ複合糖質免疫原は、Ｔｎ、Ｓ－Ｔｎ、トムゼン－フリーデンライヒ（ＴＦ）、（２，３）－Ｓ－ＴＦ、（２，６）－Ｓ－ＴＦ、グロボＨ、ＰＳＡ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｎ－グリコリル－ＧＭ３、フコシルＧＭ１、Ｌｅ^ａ、ｓＬｅ^ａ、Ｌｅ^ｘ、ｓＬｅ^ｘ、およびＬｅ^ｙから選択されるＴＡＣＡのあらゆる組合せを含んでいてもよい。一部の実施態様において、シアル化されたまたはシアル化されていないＴｎおよびＴＦ抗原（ならびにそれらのアナログ）は、本明細書に記載される通りに、または例えばRessら、2005；Wuら、2019；Thompsonら、2015；およびYangら、2010に記載される通りに合成してもよい。

【0069】

一部の実施態様において、各ＴＡＣＡの組合せにおける比率は、標的化された腫瘍に応じて様々であってもよく、１～２０のモル比を含み得る。このようにして、本明細書に記載されるネオ複合糖質免疫原は、例えば以下の表に記載されたように、例えば、複数のＴＡＣＡの特定の組合せの増加した発現に関連するがんの具体的な形態に合わせて調整することができる。

【0070】

【表1】

一部の実施態様において、本明細書に記載される多価性のネオ複合糖質免疫原は、担体タンパク質上の単一の遊離アミン基にコンジュゲートしている（例えば、分岐したリンカーを介して）１種より多くの（ネオ）炭水化物抗原を含んでいてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される多価性のネオ複合糖質免疫原は、デンドリマーとして担体タンパク質またはペプチド上に付着させる前に（例えば、大規模な分岐を有するリンカーを介して）、チオリンカーにコンジュゲートしている複数種（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５種、またはそれより多く）の（ネオ）炭水化物抗原を含んでいてもよい。

【0071】

一部の実施態様において、本明細書に記載される担体タンパク質またはペプチドは、１つまたはそれより多くの遊離アミン基を含む。「遊離アミン」または「遊離アミン基」は、本明細書で使用される場合、担体タンパク質またはペプチドが、化学修飾および／またはコンジュゲーション（例えば、本明細書に記載される炭水化物抗原、例えば、担体タンパク質の外面に露出する傾向がある溶媒接近可能なリシン残基への）に利用可能な１つまたはそれより多くのアミノ基を有することを指す。一部の実施態様において、担体タンパク質上の隣接する位置にコンジュゲートした複数の（ネオ）炭水化物抗原が多くなり過ぎることを回避することが有利な場合がある。一部の実施態様において、担体タンパク質またはペプチドは、好ましくはリシンリッチなドメイン（例えば、リシン残基が少なくとも５０％を構成する少なくとも４、５、６、７、８、９、または１０個の連続したアミノ酸のセグメント）を有してなくてもよい。

【0072】

一部の実施態様において、担体タンパク質は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００個の総リシン残基を含んでいてもよい。一部の実施態様において、担体タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の総遊離アミン残基を含んでいてもよい。

【0073】

一部の実施態様において、担体タンパク質またはペプチドは、１つまたはそれより多くの遊離アミン基を有する１つまたはそれより多くのリシン残基を含み、または任意選択で、例えば担体タンパク質またはペプチドの、アミノ末端、カルボキシ末端、または溶媒が接近可能な位置で、１つまたはそれより多くのさらなるリシン残基を付加するように操作されている。一部の実施態様において、担体タンパク質は、Ｔ細胞エピトープを含み、および／または対象において細胞媒介性免疫応答を誘導する。一部の実施態様において、担体タンパク質またはペプチドは、Ｂ細胞エピトープを含み、および／または対象において体液性免疫応答を誘導する。一部の実施態様において、担体タンパク質は、Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープの両方を含み、および／または対象において体液性および細胞媒介性免疫応答の両方を誘導する。

【0074】

好ましくは、本明細書に記載される担体タンパク質は、ヒト対象への投与（例えば、承認されたワクチンでの）に関してすでに規制当局（例えば、ＦＤＡ）の承認受けたタンパク質であってもよい。一部の実施態様において、担体タンパク質は、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、インフルエンザ菌（H. influenzae）プロテインＤ（ＨｉＤ）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、サイトカイン、免疫原性ペプチド、例えば破傷風毒素８３１～８４４（配列番号１または２）、アルブミン（例えばウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン）、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、またはそれらの免疫原性断片であるか、それ由来であるか、またはそれを含む。

【0075】

一部の実施態様において、担体タンパク質またはペプチドは、投与されることになる対象にとって外因性であり、好ましくは、対象において相同分子種（近い相同分子種）を有さない。ヒトワクチン生産の文脈で、本明細書に記載される担体タンパク質は、「ヒトでの使用に好適な担体タンパク質」または単に「好適な担体タンパク質」を指し、これは、担体タンパク質がヒトにおいて「自己抗原」とみなされないように、抗原的にヒトタンパク質とは異なる担体タンパク質を意味する。抗原的に対応するヒトタンパク質に類似し過ぎている担体タンパク質の使用は、担体タンパク質が「自己抗原」とみなされることが起こる可能性があり、これは、ヒトワクチンにおいて理想的ではない場合がある。例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のリシン残基のε－アミノ基にランダムにコンジュゲートしたＴＦ抗原からなるネオ複合糖質免疫原がこれまでに記載され、特徴付けられている（例えば、Demianら、2014；Rittenhouse-Diakunら、1998；Heimburgら、2006；Tatiら、2017）。しかしながら、ＢＳＡの５９個のリシン残基における炭水化物のレベルはランダムであり非効率的であるだけでなく（ＢＳＡ分子１個当たり４～６個以下のＴＦ抗原がコンジュゲートされた）、ＢＳＡは、抗原的にヒトアルブミンに類似し過ぎているために、ヒトワクチンにおける担体タンパク質として好適ではないと予想される。一部の実施態様において、担体タンパク質は、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン）ではない。

【0076】

一部の実施態様において、本明細書に記載されるネオ複合糖質は、ネオ複合糖質免疫原であって、その場合、担体タンパク質またはペプチドが、対象に投与される場合、免疫原性であり、炭水化物抗原の担体タンパク質またはペプチドへのチオリンカーを介したコンジュゲーションが、対応するコンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較して、対象に投与されたときの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、ネオ複合糖質免疫原であってもよい。

【0077】

一部の実施態様において、対象へのネオ複合糖質免疫原の投与が、ネオ複合糖質免疫原中に含まれるチオリンカーに対する抗体を誘発させないように、本明細書に記載されるチオリンカーは、ネオ複合糖質が投与されることになる対象に対して非免疫原性である。一部の実施態様において、本明細書に記載されるチオリンカーは、合成的な化学基／官能基（すなわち、対象において天然に見出されない化学基／官能基）を有さない。一部の実施態様において、本明細書に記載されるチオリンカーは、天然の化学基／官能基のみ、すなわち、対象において天然に見出される官能基のみを含む。これに関して、当業界で採用される一部の炭水化物抗原－タンパク質リンカー、例えばスクアリン酸などは、リンカーがカップリングされる炭水化物抗原に対してというよりは、リンカーそれ自体に対する免疫応答を誘発する可能性があり、これは、その化学基／官能基の「外来」および／または抗原性の性質に関連する可能性がある。

【0078】

一部の実施態様において、炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原は、担体タンパク質またはペプチドへのカップリングの後、対象の内因性酵素によって担体タンパク質またはペプチドから切断不可能である。

【0079】

一部の実施態様において、本明細書に記載される担体タンパク質またはペプチドは、Ｔ細胞エピトープを含んでいてもよいし、および／または投与されると、対象において細胞媒介性免疫応答を誘導することができる。

【0080】

一部の実施態様において、本明細書に記載される合成ネオ複合糖質免疫原は、対象に投与されると、（ネオ）炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導することができる。

【0081】

さらなる形態において、ネオ複合糖質ワクチンまたは免疫応答を誘発する組成物を生産するための方法が本明細書に記載される。本方法は、本明細書に記載されるネオ複合糖質または本明細書に記載される方法によって調製されたネオ複合糖質を、医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバントを用いて製剤化することを含んでいてもよい。一部の実施態様において、アジュバントは、無機化合物、鉱油、微生物性の誘導体、植物性の誘導体、サイトカイン、スクアレン、アラム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化燐灰石、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、免疫刺激性ポリヌクレオチド（例えば、ＣＰＧ）、免疫刺激性脂質、フロイントアジュバント、ＲＩＢＩアジュバント、ＱＳ－２１、ムラミルジペプチド、ＴｉｔｅｒＭａｘ（商標）、Ｓｔｅｖｉｕｎｅ（商標）、Ｓｔｉｍｕｎｅ（商標）、またはそれらのあらゆる組合せであるか、またはそれを含む。

【0082】

ワクチン組成物は、レシピエント動物の年齢、性別、体重、種および状態、ならびに投与経路のような要因を考慮して、医療または獣医学分野における当業者周知の投薬量および技術によって投与することができる。投与経路は、粘膜投与（例えば、口腔、鼻、眼）を介した、または非経口経路（例えば、皮内、筋肉内、皮下）を介した経皮であってもよい。ワクチン組成物は、単独で投与してもよいし、または他の処置または療法と共に投与してもよいし、もしくはそれと逐次的に投与してもよい。投与剤形としては、非経口、皮下、皮内または筋肉内投与（例えば、注射可能な投与）のための懸濁剤および製剤、例えば滅菌懸濁液または乳剤を挙げることができる。ワクチンは、スプレーとして、または食物および／または水中に混合して投与してもよいし、または好適な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば滅菌水、生理的食塩水、グルコースなどと混和して送達してもよい。組成物は、望ましい投与経路および製剤に応じて、湿潤剤または乳化剤などの補助剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化または粘度を強化する添加剤、保存剤、矯味矯臭剤、色素などを含有していてもよい。余計な実験を行うことなく好適な製剤を調製するために、標準的な製薬の教本、例えば「Remington’s Pharmaceutical Sciences」、1990を参照することができる。

【0083】

さらなる形態において、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質ワクチンまたは適応免疫応答を誘発する組成物、および／または本明細書に記載されるネオ複合糖質、ならびに本明細書に記載される医薬的に許容される賦形剤および／またはアジュバントを含むワクチンまたは組成物が本明細書に記載される。実施態様において、ネオ複合糖質ワクチンは、予防ワクチンまたは治療ワクチンであってもよい。実施態様において、本明細書に記載されるワクチン組成物は、１種またはそれより多くのＴＡＣＡを含んでいてもよく、ワクチン組成物は、ＴＡＣＡを発現するがんに対する抗がんワクチンであってもよい。実施態様において、がんは、Ｂ細胞リンパ腫、乳がん、結腸がん、非小細胞肺がん、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣、前立腺、肉腫、小細胞肺がん、または胃がんであり得る。

【0084】

一部の形態において、対象を免疫化する、それにワクチン接種をする、またはそれを処置する方法であって、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質、本明細書に記載される合成ネオ複合糖質、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質ワクチンもしくは適応免疫応答を誘発する組成物、または本明細書に記載されるネオ複合糖質ワクチンを対象に投与することを含む、上記方法が本明細書に記載される。

【0085】

一部の実施態様において、疾患を有する対象を免疫化すること、それにワクチン接種をすること、またはそれを処置することにおける使用のための、またはネオ複合糖質に特異的に結合する抗体の存在を検出するための、または前記免疫化、ワクチン接種、または処置を検出するための（例えば、対象からの生物学的サンプルにおいて）、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質、本明細書に記載される合成ネオ複合糖質、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質ワクチンもしくは適応免疫応答を誘発する組成物、または本明細書に記載されるネオ複合糖質ワクチンが本明細書に記載される。

【0086】

一部の実施態様において、疾患を有する対象を免疫化または処置するためのワクチンの製造のための、またはネオ複合糖質に特異的に結合する抗体の存在を検出するための、または前記免疫化または処置を検出するための（例えば、対象からの生物学的サンプルにおいて）、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質、本明細書に記載される合成ネオ複合糖質、または本明細書に記載される方法によって生産された適応免疫応答を誘発する組成物が本明細書に記載される。

【0087】

一部の実施態様において、前記炭水化物抗原の増加した発現に関連する疾患を有する対象の処置における使用のための、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質、本明細書に記載される合成ネオ複合糖質、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質ワクチンもしくは適応免疫応答を誘発する組成物、または本明細書に記載されるネオ複合糖質ワクチンが本明細書に記載される。

【0088】

一部の実施態様において、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質、本明細書に記載される合成ネオ複合糖質、本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質ワクチンもしくは適応免疫応答を誘発する組成物、または本明細書に記載されるネオ複合糖質ワクチンが本明細書に記載される。一部の実施態様において、検出またはスクリーニングは、免疫吸着測定法、ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイ、または免疫ブロット分析などのあらゆる好適な検出方法を介して実行することができる。

【0089】

さらなる形態において、対象を処置する方法であって、本明細書において規定された、または本明細書に記載される方法によって生産されたネオ複合糖質またはネオ複合糖質免疫原を投与して、炭水化物抗原に対して前記対象における免疫応答を生じさせること、および任意選択で、前記対象からの生物学的サンプルを、炭水化物抗原に特異的に結合する抗体の存在に関してスクリーニングすることを含む、上記方法が本明細書に記載される。

【0090】

さらなる形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関する治療および／または診断ツールとして使用するための複合糖質が本明細書に記載される。より特定には、対象における抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の生産を誘発することにおける使用のための、対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞媒介性免疫応答を誘導することにおける使用のための、またはそれらのあらゆる組合せのための、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して対象を免疫化することにおける使用のための複合糖質が本明細書に記載される。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関する検出／診断ツールにおける使用のための複合糖質も本明細書に記載される。例えば、対象からのサンプルにおいて抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の存在を検出することにおける使用のための複合糖質が本明細書に記載される。

【0091】

表現「抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体」は、本明細書で使用される場合、その天然のコンフォメーションで、例えば、天然の組換えタンパク質上に発現された、および／または集合したビリオン粒子上に存在する状態で抗原（例えば、炭水化物抗原）に結合することができる抗体を指す。対照的に、変性した抗原とのみ結合するが（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後などの変性条件下で）、その天然のコンフォメーションの同じ抗原には結合しない抗体は、表現「抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体」から排除される。一部の実施態様において、本明細書に記載される複合糖質またはワクチンは、中和活性を有する抗体の生産を誘導することができる。表現「中和活性」は、本明細書で使用される場合、リガンド（例えば、抗体）が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオン粒子に結合し、感受性のある宿主細胞に感染するにその能力を阻害することを指す。

【0092】

一部の実施態様において、本明細書に記載される複合糖質は、好適な担体材料にコンジュゲートした炭水化物抗原（例えば、担体タンパク質またはペプチド、または非タンパク質様のポリマー材料）を含んでいてもよいし、炭水化物抗原が、シアル化されたトムゼン－フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原、シアル化されていないＴＦ抗原、シアル化されたＴｎ抗原、シアル化されていないＴｎ抗原、またはそれらのあらゆる組合せを含むかまたはそれからなる。一部の実施態様において、炭水化物抗原は、モノシアル化されたＴＦ抗原、例えば（２，３）－Ｓ－ＴＦ、および／またはジシアリル化されたＴＦ抗原、例えばジシアリルコア１を含む。これらの炭水化物抗原は、定量的な高分解能質量分析によって、ペプチド断片ＶＱＰＴＥＳＩＶＲ（配列番号３）の４および／または６位に対応する位置で、組換え発現されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質および／またはそのＳ１断片上に検出された（実施例１６；図２０および２１）。さらに、実施例１７ならびに図２２および２３に示される結果は、これらの炭水化物抗原の少なくとも一部は、リガンド結合（例えば、レクチンおよび／または抗体との）に利用可能であることを実証し、実施例１８および図２４に示される結果は、このような炭水化物抗原に結合するリガンドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質を発現するシュードタイプ化ウイルス粒子の、ヒトアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２、Ｓが結合して宿主細胞への侵入を高める受容体）を発現する宿主細胞に感染する能力を阻害することを実証する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質は、大部分はＮ結合型グリカンによって過度に遮蔽されること、およびＯ結合型グリカン（報告が相反するため、検出される場合）は、病原性ビリオン粒子の状態でリガンド結合にとって接近可能ではない場合があるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の全体的なグリコシル化プロファイルにとって重要ではない成分を表す（Watanabeら、2020；Shajahanら、2020；Grantら、2020）という複数の報告を考慮すれば、これらの結果は予測不可能である。

【0093】

一部の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、例えば体液性および細胞媒介性免疫応答を誘発することが望ましいかどうかに応じて、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを含む担体材料にコンジュゲートしていてもよい。一部の実施態様において、炭水化物抗原は、配列番号３または４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質断片に、例えば配列番号３の４および／もしくは６位で、または配列番号４の３２３、３２５、および／もしくは６７８位で、共有結合でコンジュゲートしていてもよい。特定には、配列番号４の６７８位（Ｒ６８２におけるスパイクタンパク質のフューリン切断部位に近い）は、コア－１およびコア－２構造によってＯ－グリコシル化されることが報告されている。

【0094】

一部の実施態様において、担体タンパク質またはペプチドは、配列番号４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質配列の免疫原性断片を含んでいてもよく、この断片は、配列番号４の３２３、３２５、および／または６７８位にコンジュゲートした１つまたはそれより多くの炭水化物抗原を含む。一部の実施態様において、炭水化物抗原は、配列番号３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質断片のバリアントに共有結合でコンジュゲートしていてもよく、このようなバリアントは、例えば、４および／または６位における残基がリシンおよび／またはシステイン残基で置き換えられている可能性があるバリアントであり、それにより炭水化物抗原への化学的コンジュゲーションを容易にすることができる。一部の実施態様において、担体タンパク質またはペプチドは、３２３、３２５、および／または６７８位にリシンまたはシステインを有する配列番号４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質配列のバリアントの免疫原性断片を含んでいてもよく、このような断片は、配列番号４の３２３、３２５、および／または６７８位でリシンまたはシステイン残基にコンジュゲートした１つまたはそれより多くの炭水化物抗原を含む。リシン残基の場合、炭水化物抗原は、本明細書に記載されるコンジュゲーション方法を介して、または当業界で公知の他のコンジュゲーション方法を介して担体タンパク質にコンジュゲートされていてもよい。システイン残基の場合、炭水化物抗原は、例えばＷＯ／２０１９／１７８６９９またはＵＳ１０，６１０，５７６に記載されるコンジュゲーション方法を介して、または当業界で公知の他のコンジュゲーション方法を介して担体タンパク質にコンジュゲートされていてもよい。したがって、一部の実施態様において、本明細書に記載される担体材料は、配列番号３のペプチド、または４および／または６位にシステインまたはリシンを含む配列番号３のペプチドのバリアントを含んでいてもよいし、またはそれからなっていてもよい。一部の実施態様において、配列番号３のペプチドまたはペプチドバリアントは、に含まれていてもよく（例えば、アミノ酸配列に組換えによって組み入れられてもよく）、または担体材料に融合されてもよい（例えば、融合タンパク質として）。

【0095】

一部の実施態様において、担体材料は、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、インフルエンザ菌プロテインＤ（ＨｉＤ）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、サイトカイン、免疫原性ペプチド、例えば破傷風毒素８３１～８４４（配列番号１または２）、アルブミン（例えばウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン）、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、またはそれらの免疫原性断片であるか、それ由来であるか、またはそれを含む。

【0096】

一部の実施態様において、複合糖質は、（ｉ）本明細書に記載される方法によって、またはそこで規定された通りに生産されたネオ複合糖質；（ｉｉ）本明細書に記載されるネオ炭水化物抗原；（ｉｉｉ）本明細書に記載される合成ネオ複合糖質；または（ｉｖ）本明細書に記載されるネオ複合糖質ワクチンまたは適応免疫応答を誘発する組成物であり得る。

【0097】

一部の実施態様において、複合糖質は、ＷＯ／２０１９／１７８６９９またはＵＳ１０，６１０，５７６に記載される方法によって生産してもよい。簡単に言えば、一部の実施態様において、本方法は、（ａ）末端のアルケン（アルケニル炭水化物抗原）に共有結合で連結された水溶性炭水化物抗原を提供するステップであって、末端のアルケンは、チオール－エン反応を介して、チオール基に直接コンジュゲート可能であり、アルケニル炭水化物抗原は、保護されていない水溶性アルケニル炭水化物抗原である、ステップ；（ｂ）１つまたはそれより多くの遊離チオール基を有する担体材料を提供するステップ；および（ｃ）光触媒作用によるチオール－エン反応を実行して、１つまたはそれより多くの遊離チオール基で、炭水化物抗原を材料に直接コンジュゲートし、それによって複合糖質を生産するステップを含んでいてもよい。さらなる実施態様において、本方法は、以下に列挙した項目５１～５３に記載される１つまたはそれより多くの特色を含んでいてもよい。

【0098】

一部の形態において、本明細書において規定された１種またはそれより多くの複合糖質、ならびに医薬的に許容される賦形剤および／またはアジュバントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＣＯＶＩＤ－１９ワクチンまたは適応免疫応答を誘導する組成物が本明細書に記載される。複合糖質は、一般的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオン上に発現される１つまたはそれより多くの炭水化物抗原、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ（またはＳ１）タンパク質上に発現される炭水化物抗原などを含む。本明細書に記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンに好適な炭水化物抗原は、ワクチンが投与されている対象における自己免疫応答を誘発するリスクを低減するために、異常なグリコシル化パターンの炭水化物抗原であり、すなわち、対象の正常または健康な細胞および組織上に発現されないものである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質のＮ結合型およびＯ結合型グリコシル化プロファイルの分析の後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質上に発現される結合型グリカンの大半が、それらがヒト対象における正常または健康な細胞および組織上に存在する炭水化物抗原と類似点を有する可能性があることから、複合糖質ワクチン開発にとって理想的な候補ではない可能性があることが見出された。対照的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質上のＯ結合型グリコシル化プロファイルの分析は、複合糖質ワクチン開発に好適な可能性がある数々の異常なＯ結合型グリカンを解明した。一部の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、実施例１６ならびに図２０および２１で同定されたＯ結合型グリカンの１つまたはそれより多くを含んでいてもよい。

【0099】

一部の実施態様において、本明細書に記載される複合糖質または本明細書に記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオン粒子に結合する抗体の生産を誘導し、好ましくは中和活性を有する（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオン粒子が感受性のある宿主細胞に感染しないようにする）。

【0100】

一部の形態において、対象にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン接種をするための方法または対象において抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の生産を誘発するための方法であって、本明細書に記載される複合糖質またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの１つまたはそれより多くを投与することを含む、上記方法が本明細書に記載される。

【0101】

一部の形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染から対象を防御するための（または重症度を低減させるための）、またはＣＯＶＩＤ－１９を処置するための（またはＣＯＶＩＤ－１９により生じる合併症を低減させるための）組成物であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質上に発現されたＯ結合型グリカンに結合する１つまたはそれより多くのリガンド（例えば、抗体、抗体断片、またはレクチン）を含む、組成物が本明細書に記載される。一部の実施態様において、Ｏ結合型グリカンは、シアル化されたＴＦ抗原（モノまたはジシアル化されたＴＦ抗原）、シアル化されていないＴＦ抗原、シアル化されたＴｎ抗原、シアル化されていないＴｎ抗原、またはそれらのあらゆる組合せを含んでいてもよい。一部の実施態様において、１つまたはそれより多くのリガンドは、組換えモノクローナル抗体（例えば、ＪＡＡ－Ｆ１１またはヒト化ＪＡＡ－Ｆ１１）を含んでいてもよい。一部の実施態様において、リガンドは、シアル化されたＴＦおよび／またはシアル化されていないＴｎへの結合親和性を有していてもよい。一部の実施態様において、リガンドは、シアル化されたおよびシアル化されていないＴＦの両方への結合親和性を有していてもよい。一部の実施態様において、リガンドは、レクチン、例えばジャカリンであってもよいし、またはジャカリン関連のレクチンである。これに関して、実施例１８および図２４は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質を発現するシュードタイプ化ウイルス粒子の宿主細胞に感染する能力に最も強い阻害作用を有するリガンドが、レクチンであるジャカリンであったことを示し、パラミツ（Artocarpus integrifolia）のレクチン（ＡＩＡ）が、ジャックフルーツの種子から単離されている（Sankaranarayananら、1996）。興味深いことに、ジャカリンは、ＴＦおよびＴｎ抗原の両方に、そのシアル化されたまたはシアル化されていない形態のいずれかで結合特異性を有することがわかっている（Jeyaprakashら、2002）。シュードウイルス感染力の阻害も、本明細書においてレクチンＰＮＡなどの非シアリルＴＦ抗原にのみ結合するリガンドおよび抗ＴＦモノクローナル抗体ＪＡＡ－Ｆ１１に関して示される（図２４）。一部の実施態様において、前述の組成物は、鼻腔内用組成物として製剤化されてもよい。

【0102】

一部の形態において、（ａ）シアル化されたＴＦ抗原（モノまたはジシアル化されたＴＦ抗原）、シアル化されていないＴＦ抗原、シアル化されたＴｎ抗原、シアル化されていないＴｎ抗原、またはそれらのあらゆる組合せを含む、Ｏ結合型グリカンを発現するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質またはその断片；および（ｂ）Ｏ結合型グリカンにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質またはその断片に結合する、本明細書において規定されたリガンドを含む複合体が本明細書に記載される。一部の実施態様において、複合体は、無傷のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオン粒子中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質を含んでいてもよい。一部の実施態様において、このような複合体は、インビトロまたはインビボで形成されてもよい。

【0103】

項目
以下の項目の１つまたはそれより多くが本明細書に記載される。

【0104】

１．ネオ複合糖質を生産するための方法であって、（ａ）第１の末端および第２の末端を有するリンカーを含むネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体を提供するステップであって、第１の末端は、チオエーテル結合を介して炭水化物抗原にコンジュゲートしており、第２の末端は、遊離アミン基と反応可能な官能基を含み、官能基は、－ＣＯＸ、－ＳＯ_２Ｘ、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｘ、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、または－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであり、Ｘは、脱離基である、ステップ；（ｂ）１つまたはそれより多くの遊離アミン基を有する担体タンパク質またはペプチドを提供するステップ；および（ｃ）カップリング反応を実行して、精製したネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体の１つまたはそれより多くを、担体タンパク質またはペプチドに、１つまたはそれより多くの遊離アミン基で、アミド、カルバメート、スルホンアミド、尿素、またはチオ尿素結合を介してコンジュゲートし、それによって、ネオ複合糖質を生産するステップを含む、上記方法。

【0105】

２．工程（ａ）の前に、（ａ）におけるネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体が、（ｉ）末端のアルケン（アルケニル炭水化物抗原）に共有結合で連結された炭水化物抗原を提供するステップであって、末端のアルケンは、チオール－エン反応を介して、チオール基に直接コンジュゲート可能であり；（ｉｉ）第１の末端に第１の官能基および第２の末端に第２の官能基を含むチオリンカーを提供するステップであって、第１の官能基は、遊離チオール基であり、第２の官能基は、カルボキシル基、スルフィン酸基、炭酸基、イソシアネート基、またはチオシアネート基である、ステップ；（ｉｉｉ）光触媒作用によるチオール－エン反応を実行して、アルケニル炭水化物抗原を、チオリンカーに、第１の末端で直接コンジュゲートし、それによって、第１の末端に炭水化物抗原および第２の末端に第２の官能基を含むネオ炭水化物抗原を生産するステップ；（ｉｖ）第２の官能基がカルボキシル基、スルフィン酸基、または炭酸基である場合、カルボキシル基の、スルフィン酸基の、または炭酸基の末端ヒドロキシル基を、ポリペプチドの遊離アミン基へのコンジュゲーションに関してより優れた脱離基で置き換えることによって、ネオ炭水化物抗原をネオ炭水化物抗原中間体に変換するステップ；および（ｖ）ネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体を精製するステップを含む方法によって調製される、項目１に記載の方法。

【0106】

３．（ｉｉｉ）における光触媒作用によるチオール－エン反応が、炭水化物抗原の抗原性および／または構造を保持する反応条件下で実行される、項目２に記載の方法。

【0107】

４．前記光触媒作用によるチオール－エン反応が、触媒の存在下で実行され、触媒は、水溶性触媒、例えば水溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物；２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］ジヒドロクロリド（Ｖａｚｏ ４４またはＶＡ－０４４）；２，２’－アゾビス（２－アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）；リチウムフェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィネート（ＬＡＰ）；光開始剤活性を有する金属または金属イオン；過酸化物；ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド；過酸化ベンゾイル；過硫酸アンモニウム；もしくは光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体；または水不溶性触媒、例えば水不溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物、２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）、４，４’－アゾビス（４－シアノペンタン酸）（ＡＣＶＡ）、１，１’－アゾビス（シアノシクロヘキサン）（ＡＣＨＮ）、ジアゼンジカルボン酸ビス（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミド）（ＴＭＡＤ）；アゾジカルボン酸ジピペリジド（ＡＤＤ）、もしくは光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体である、項目２または３に記載の方法。

【0108】

５．前記光触媒作用によるチオール－エン反応が、紫外光（例えば、短波長の紫外光、例えば約２５４ｎｍの紫外光、または長波長の紫外光、例えば約３５５ｎｍもしくは３６５ｎｍの紫外光）下での放射線照射を含む、項目２～４のいずれか一項に記載の方法。

【0109】

６．前記光触媒作用によるチオール－エン反応が、チオリンカーの遊離チオール基１つ当たり、１～２００または１～１００モル当量のアルケニル炭水化物抗原を反応させることを含むか；前記光触媒作用によるチオール－エン反応が、１０～３００、１０～２７０、１０～２４０、１０～２１０、１０～１８０、１０～１５０、１０～１２０、１０～９０、１０～６０、または１０～３０分実行されるか；約３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または４．０から、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０までの範囲のｐＨで実行されるか；またはそれらのあらゆる組合せである、項目２～５のいずれか一項に記載の方法。

【0110】

７．前記炭水化物抗原が、好ましくはリンカーを使用して、例えばアリルアミンと還元糖との間で、グリコシド結合、例えば、Ｏ－グリコシド結合、Ｓ－グリコシド結合、Ｎ－グリコシド結合、もしくはＣ－グリコシド結合を介して、または還元的アミノ化により得られた結合を介して、末端のアルケンに連結されている、項目２～６のいずれか一項に記載の方法。

【0111】

８．（ｉｉ）におけるチオリンカーが、構造：

【0112】

【化5】

（式中、Ｙは、－（ＣＨ_２）_ｎ－または－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－であり；Ｚは、－ＣＯ_２Ｈ、－ＳＯ_２Ｈ、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｈ、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、または－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであり；Ｏは、１、２、３、４、または５であり；Ｏは、０であり、Ｚは、－ＣＯ－であり、Ｙは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－であり；またはＯは、０であり、Ｚは、－ＳＯ_２－であり、Ｙは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－である）
を含む、項目２～７のいずれか一項に記載の方法。

【0113】

９．炭水化物抗原、アルケニル炭水化物抗原、ネオ炭水化物抗原、ネオ炭水化物抗原中間体、および／またはネオ複合糖質の炭水化物部分が、方法にわたり保護されていないままである、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。

【0114】

１０．脱離基が、活性エステル基（例えば、フルオロフェニル基（例えば、ＯＰｈＦ５、ＯＰｈＦ４（パラＳＯ_３Ｎａ）、またはスクシンイミジル基）である、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。

【0115】

１１．担体タンパク質またはペプチドが、同じ担体タンパク質またはペプチド中に存在するアスパラギン酸／グルタミン酸残基とε－リシンアミンとの間で自己架橋することを回避する、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【0116】

１２．担体タンパク質またはペプチドにコンジュゲートしたネオ炭水化物抗原の数が、反応物（例えば、担体タンパク質またはペプチドのネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体に対するモル比）の効能および／または化学量論によって制御される、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【0117】

１３．炭水化物抗原が、腫瘍関連の炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）（例えば、Ｔｎ、Ｓ－Ｔｎ、トムゼン－フリーデンライヒ（ＴＦ）、（２，３）－Ｓ－ＴＦ、（２，６）－Ｓ－ＴＦ、グロボＨ、ＰＳＡ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｎ－グリコリル－ＧＭ３、フコシルＧＭ１、Ｌｅ^ａ、ｓＬｅ^ａ、Ｌｅ^ｘ、ｓＬｅ^ｘ、Ｌｅ^ｙ、またはそれらのあらゆる組合せ）；ウイルスの多糖抗原；または細菌の莢膜多糖体（ＣＰＳ）（例えば、肺炎球菌および／または連鎖球菌の多糖血清型、髄膜炎菌のＣＰＳであるか、それ由来であるか、またはそれを含むＣＰＳ）、もしくはインフルエンザのＣＰＳ（例えばインフルエンザａ型またはｂ型のＣＰＳ）であるか、またはそれを含む、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【0118】

１４．（ｃ）におけるカップリング反応が、同じネオ炭水化物抗原のうち少なくとも２つ、または１つより多くのタイプのネオ炭水化物抗原を、担体タンパク質またはペプチドにコンジュゲートし、それによって、多価性のネオ複合糖質（例えば、担体タンパク質またはペプチドにコンジュゲートした同じまたは異なるタイプのネオ炭水化物抗原のうち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５種、またはそれより多くを含む多価性のネオ複合糖質）を生産する、項目１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【0119】

１５．担体タンパク質またはペプチドが、例えば、担体タンパク質またはペプチドのアミノ末端、カルボキシ末端、または溶媒が接近可能な位置に、１つまたはそれより多くのさらなるリシン残基を付加するように操作されたタンパク質またはペプチドである、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【0120】

１６．担体タンパク質またはペプチドが、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、インフルエンザ菌プロテインＤ（ＨｉＤ）、サイトカイン、免疫原性ペプチド、例えば破傷風毒素８３１～８４４（配列番号１または２）、アルブミン（例えばウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン）、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、またはそれらの免疫原性断片であるか、それ由来であるか、またはそれを含む、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【0121】

１７．ネオ複合糖質が、構造：

【0122】

【化6】

（式中、ＣＡは、炭水化物抗原であるかまたはそれを含み；ＣＰ－ＮＨは、１つまたはそれより多くのアミン基を有する担体タンパク質またはペプチドであり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_１、またはＣＨ_２であり；Ｒ_１は、Ｈ、ＣＯＨ（ホルムアミド）、ＣＯＭｅ、またはＣＯＥｔであり；ｍは、１、２、３、４、または５であり；Ｙは、－（ＣＨ_２）_ｎ－または－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－であり；ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；ｏは、０、１、２、３、４、または５であり；またはｏは、０であり、Ｚは、－ＣＯ－であり、Ｙは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－であり；またはｏは、０であり、Ｚは、－ＳＯ_２－であり、Ｙは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－であり；Ｚは、－ＣＯ－、－ＮＲ_２ＳＯ_２－、－ＯＣＯ－、－ＮＲ_２ＣＯ－、または－ＮＲ_２ＣＳ－であり、Ｒ_２は、Ｈ、Ｍｅ、またはＥｔであり；ｐは、１～５０である）
を有する、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【0123】

１８．ネオ複合糖質が、ネオ複合糖質免疫原であり、担体タンパク質またはペプチドが、対象に投与される場合、免疫原性であり、炭水化物抗原の担体タンパク質またはペプチドへのチオリンカーを介したコンジュゲーションが、対応するコンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較して、対象に投与されたときの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【0124】

１９．対象へのネオ複合糖質免疫原の投与が、ネオ複合糖質免疫原中に含まれるチオリンカーに対する抗体を誘発させないように、チオリンカーが対象に対して非免疫原性である、項目１８に記載の方法。

【0125】

２０．前記ネオ炭水化物抗原が、担体タンパク質またはペプチドへのコンジュゲーションの後、対象の内因性酵素によって担体タンパク質またはペプチドから切断不可能である、項目１８または１９に記載の方法。

【0126】

２１．ネオ炭水化物抗原が、Ｂ細胞エピトープを含み、および／もしくは対象において体液性免疫応答を誘導し；ならびに／またはＴ細胞エピトープを含み、および／もしくは対象において細胞媒介性免疫応答を誘導する、項目１８～２０のいずれか一項に記載の方法。

【0127】

２２．担体タンパク質またはペプチドが、ヒトＴ細胞エピトープを含み、および／または対象において細胞媒介性免疫応答を誘導する、項目１８～２１のいずれか一項に記載の方法。

【0128】

２３．ネオ複合糖質免疫原が、対象に投与されたとき、炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する、項目１８～２２のいずれか一項に記載の方法。

【0129】

２４．第１の末端および第２の末端を有するリンカーを含むネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体であって、第１の末端は、チオエーテル結合を介して炭水化物抗原にコンジュゲートしており、第２の末端は、遊離アミン基と反応可能な官能基を含み、官能基は、－ＣＯＸ、－ＳＯ_２Ｘ、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｘ、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、または－Ｎ＝Ｃ＝Ｓであり、Ｘは、脱離基である、上記ネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体。

【0130】

２５．炭水化物抗原が、保護されていないか；脱離基が、項目１０で規定された通りであるか；炭水化物抗原が、項目１３で規定された通りであるか；またはそれらのあらゆる組合せである、項目２４に記載のネオ炭水化物抗原またはネオ炭水化物抗原中間体。

【0131】

２６．第１の末端および第２の末端を有するリンカーを含む合成ネオ複合糖質であって、第１の末端は、チオエーテル結合を介して炭水化物抗原にコンジュゲートしており、第２の末端は、担体タンパク質またはペプチドに、そこの中にある１つまたはそれより多くの遊離アミン基で、アミド、カルバメート、スルホンアミド、尿素、またはチオ尿素結合を介してコンジュゲートしている、上記合成ネオ複合糖質。

【0132】

２７．リンカーを介して担体タンパク質またはペプチドの１つまたはそれより多くのアミン基（ＣＰ－ＮＨ）にコンジュゲートした１つまたはそれより多くの炭水化物抗原（ＣＡ）を含む合成ネオ複合糖質であって、以下の構造：

【0133】

【化7】

（式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_１、またはＣＨ_２であり；Ｒ_１は、Ｈ、ＣＯＨ（ホルムアミド）、ＣＯＭｅ、またはＣＯＥｔであり；ｍは、１、２、３、４、または５であり；Ｙは、－（ＣＨ_２）_ｎ－または－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－であり；ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；ｏは、０、１、２、３、４、または５であり；またはｏは、０であり、Ｚは、－ＣＯ－であり、Ｙは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－であり；またはｏは、０であり、Ｚは、－ＳＯ_２－であり、Ｙは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－であり；Ｚは、－ＣＯ－、－ＮＲ_２ＳＯ_２－、－ＯＣＯ－、－ＮＲ_２ＣＯ－、または－ＮＲ_２ＣＳ－であり；Ｒ_２は、Ｈ、Ｍｅ、またはＥｔであり；ｐは、１～５０である）
を有する、上記合成ネオ複合糖質。

【0134】

２８．炭水化物抗原が、保護されていないか；炭水化物抗原が、項目１３で規定された通りであるか；ネオ複合糖質が、項目１４で規定された多価のネオ複合糖質であるか；担体タンパク質またはペプチドが、項目１５、１６、１８、または２２で規定された通りであるか；ネオ複合糖質が、項目１７で規定された構造を有するか；リンカーが、項目１９で規定された通りであるか；ネオ炭水化物抗原が、項目２０または２１で規定された通りであるか；合成ネオ炭水化物が、項目１～２５のいずれか一項に記載の方法によって生産されるか；またはそれらのあらゆる組合せである、項目２６または２７に記載の合成ネオ複合糖質。

【0135】

２９．ネオ複合糖質ワクチンまたは適応免疫応答を誘発する組成物を生産するための方法であって、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法または項目２４～２８のいずれか一項に記載の方法によって調製されたネオ複合糖質を、医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバントを用いて製剤化することを含む、上記方法。

【0136】

３０．アジュバントが、無機化合物、鉱油、微生物性の誘導体、植物性の誘導体、サイトカイン、スクアレン、アラム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化燐灰石、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、免疫刺激性ポリヌクレオチド（例えばＣＰＧ）、免疫刺激性脂質、フロイントアジュバント、ＲＩＢＩアジュバント、ＱＳ－２１、ムラミルジペプチド、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｓｔｅｖｉｕｎｅ、Ｓｔｉｍｕｎｅ、またはそれらのあらゆる組合せであるか、またはそれを含む、項目２９に記載の方法。

【0137】

３１．項目２９または３０に記載の方法によって生産された、および／または項目１～２８のいずれか一項に記載のネオ複合糖質、ならびに医薬的に許容される賦形剤および／またはアジュバントを含む、ネオ複合糖質ワクチンまたは適応免疫応答を誘発する組成物。

【0138】

３２．予防ワクチンまたは治療ワクチン（例えば、腫瘍関連の炭水化物抗原を発現するがん、例えば乳がん、前立腺がん、胃がん、Ｂ細胞リンパ腫、結腸がん、肺がん、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、肉腫、小細胞肺がんに対する；または炭水化物抗原を発現するウイルスもしくは細菌に対する）である、項目３１に記載のネオ複合糖質ワクチン。

【0139】

３３．対象を免疫化する、それにワクチン接種をする、またはそれを処置する方法であって、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法によって生産されたネオ複合糖質、項目２６～２８のいずれか一項に記載の合成ネオ複合糖質、項目２９または３０に記載の方法によって生産されたネオ複合糖質ワクチンもしくは適応免疫応答を誘発する組成物、または項目３１または３２に記載のネオ複合糖質ワクチンを対象に投与することを含む、上記方法。

【0140】

３４．疾患（例えば、腫瘍関連の炭水化物抗原を発現するがん、例えば乳がん、前立腺がん、胃がん、Ｂ細胞リンパ腫、結腸がん、肺がん、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、肉腫、小細胞肺がん；または炭水化物抗原を発現するウイルスもしくは細菌）を有する対象を免疫化すること、それにワクチン接種をすること、またはそれを処置することにおける使用のための、またはネオ複合糖質に特異的に結合する抗体の存在を検出するための、または前記免疫化、ワクチン接種、または処置を検出するための（例えば、対象からの生物学的サンプルにおいて）、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法によって生産されたネオ複合糖質、項目２６～２８のいずれか一項に記載の合成ネオ複合糖質、項目２９または３０に記載の方法によって生産されたネオ複合糖質ワクチンもしくは適応免疫応答を誘発する組成物、または項目３１または３２に記載のネオ複合糖質ワクチン。

【0141】

３５．疾患（例えば、腫瘍関連の炭水化物抗原を発現するがん、例えば乳がん、前立腺がん、胃がん、Ｂ細胞リンパ腫、結腸がん、肺がん、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、肉腫、小細胞肺がん；または炭水化物抗原を発現するウイルスもしくは細菌）を有する対象を免疫化する、それにワクチン接種をする、またはそれを処置するための、またはネオ複合糖質に特異的に結合する抗体の存在を検出するための、または前記免疫化、ワクチン接種、または処置を検出するための（例えば、対象からの生物学的サンプルにおいて）、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法によって生産されたネオ複合糖質、項目２６～２８のいずれか一項に記載の合成ネオ複合糖質、項目２９または３０に記載の方法によって生産されたネオ複合糖質ワクチンもしくは適応免疫応答を誘発する組成物、または項目３１または３２に記載のネオ複合糖質ワクチンの使用。

【0142】

３６．疾患（例えば、腫瘍関連の炭水化物抗原を発現するがん、例えば乳がん、前立腺がん、胃がん、Ｂ細胞リンパ腫、結腸がん、肺がん、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、肉腫、小細胞肺がん；または炭水化物抗原を発現するウイルスもしくは細菌）を有する対象を免疫化または処置するための、またはネオ複合糖質に特異的に結合する抗体の存在を検出するための、または前記免疫化または処置を検出するための（例えば、対象からの生物学的サンプルにおいて）ワクチンの製造のための、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法によって生産されたネオ複合糖質、項目２６～２８のいずれか一項に記載の合成ネオ複合糖質、項目２９または３０に記載の方法によって生産された適応免疫応答を誘発する組成物の使用。

【0143】

３７．前記炭水化物抗原の増加した発現に関連する疾患（例えば、乳がん、前立腺がん、胃がん、Ｂ細胞リンパ腫、結腸がん、肺がん、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、肉腫、小細胞肺がんなどのがん；または炭水化物抗原を発現するウイルスもしくは細菌）を有する対象の処置のための、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法によって生産されたネオ複合糖質、項目２６～２８のいずれか一項に記載の合成ネオ複合糖質、項目２９または３０に記載の方法によって生産されたネオ複合糖質ワクチンもしくは適応免疫応答を誘発する組成物、または項目３１または３２に記載のネオ複合糖質ワクチンの使用。

【0144】

３８．ネオ複合糖質に特異的に結合する抗体を生産するための、またはネオ複合糖質免疫原に特異的に結合する抗体を検出するための、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法によって生産されたネオ複合糖質、項目２６～２８のいずれか一項に記載の合成ネオ複合糖質、項目２９または３０に記載の方法によって生産されたネオ複合糖質ワクチンもしくは適応免疫応答を誘発する組成物、または項目３１または３２に記載のネオ複合糖質ワクチンの使用。

【0145】

３９．炭水化物抗原または炭水化物抗原を含む腫瘍を循環する細胞に特異的に結合する抗体の存在を検出するかもしくはそれに関してスクリーニングするための、または炭水化物抗原での免疫化またはワクチン接種によって生じる抗体の存在を検出するための、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法によって生産されたネオ複合糖質、項目２６～２８のいずれか一項に記載の合成ネオ複合糖質、項目２９または３０に記載の方法によって生産されたネオ複合糖質ワクチンもしくは適応免疫応答を誘発する組成物、または項目３１または３２に記載のネオ複合糖質ワクチンの使用。

【0146】

４０．検出またはスクリーニングが、免疫吸着測定法、ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイ、または免疫ブロット分析などのあらゆる好適な検出方法を介して実行される、項目３９に記載の使用。

【0147】

４１．対象を処置する方法であって、いずれかの前記項目で規定された、またはいずれかの前記項目で規定された方法によって生産されたネオ複合糖質またはネオ複合糖質免疫原を投与して、炭水化物抗原に対して前記対象における免疫応答を生じさせること、および任意選択で、前記対象からの生物学的サンプルを、炭水化物抗原に特異的に結合する抗体の存在に関してスクリーニングすることを含む、上記方法。

【0148】

４２．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して対象を免疫化することにおける使用のための、対象における抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の生産を誘発することにおける使用のための、または対象からのサンプルにおいて抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の存在を検出することにおける使用のための複合糖質であって、複合糖質は、好適な担体材料（例えば、担体タンパク質またはペプチド）にコンジュゲートした炭水化物抗原を含み、炭水化物抗原が、シアル化されたトムゼン－フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原、シアル化されていないＴＦ抗原、シアル化されたＴｎ抗原、シアル化されていないＴｎ抗原、またはそれらのあらゆる組合せを含むかまたはそれからなる、上記複合糖質。

【0149】

４３．炭水化物抗原が、シアル化されたＴＦ抗原（例えば、（２，３）－Ｓ－ＴＦおよび／またはジシアリルコア１）を含むかまたはそれからなる、項目４２に記載の使用のための複合糖質。

【0150】

４４．炭水化物抗原が、Ｔｎ（例えば、シアル化されたおよび／またはシアル化されていないＴｎ）を含むかまたはそれからなる、項目４２または４３に記載の使用のための複合糖質。

【0151】

４５．担体材料が、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープであるペプチドを含む、項目４２～４４のいずれか一項に記載の使用のための複合糖質。

【0152】

４６．炭水化物抗原が、配列番号３のペプチドの４および／もしくは６位に、または４および／もしくは６位にシステインまたはリシンを含む配列番号３のペプチドのバリアントに共有結合でコンジュゲートしている、項目４２～４５のいずれか一項に記載の使用のための複合糖質。

【0153】

４７．配列番号３のペプチドまたはペプチドバリアントが、担体材料に含まれるかまたはそれに融合している、項目４６に記載の使用のための複合糖質。

【0154】

４８．担体材料が、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、インフルエンザ菌プロテインＤ（ＨｉＤ）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、サイトカイン、免疫原性ペプチド、例えば破傷風毒素８３１～８４４（配列番号１または２）、アルブミン（例えばウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン）、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、またはそれらの免疫原性断片であるか、それ由来であるか、またはそれを含む、項目４２～４７のいずれか一項に記載の使用のための複合糖質。

【0155】

４９．複合糖質が、（ｉ）項目１～２３のいずれか一項に記載の方法によって、またはそこで規定された通りに生産されたネオ複合糖質；（ｉｉ）項目２４または２５に記載のネオ炭水化物抗原；（ｉｉｉ）項目２７または２８に記載の合成ネオ複合糖質；または（ｉｖ）項目２９または３０に記載の方法で規定された、もしくはそれによって生産された、または項目３１または３２で規定された、ネオ複合糖質ワクチンまたは適応免疫応答を誘発する組成物である、項目４２～４８のいずれか一項に記載の複合糖質。

【0156】

５０．（ａ）末端のアルケンに共有結合で連結された水溶性炭水化物抗原（アルケニル炭水化物抗原）を提供するステップであって、末端のアルケンは、チオール－エン反応を介して、チオール基に直接コンジュゲート可能であり、アルケニル炭水化物抗原は、保護されていない水溶性アルケニル炭水化物抗原である、ステップ；（ｂ）１つまたはそれより多くの遊離チオール基を有する担体材料を提供するステップ；および（ｃ）光触媒作用によるチオール－エン反応を実行して、１つまたはそれより多くの遊離チオール基で、炭水化物抗原を材料に直接コンジュゲートし、それによって複合糖質を生産するステップを含む方法によって生産される、項目４２～４８のいずれか一項に記載の複合糖質。

【0157】

５１．前記光触媒作用によるチオール－エン反応が、担体材料の変性を回避する、および／または担体材料の活性、抗原性、および／または構造を保持する反応条件下で実行され；光触媒作用によるチオール－エン反応が、いずれの有機溶媒の非存在下で実行されるか、または光触媒作用によるチオール－エン反応が、担体材料の変性を回避する程度に低い濃度での有機溶媒の存在下で実行され；前記光触媒作用によるチオール－エン反応が、触媒の存在下で実行され、触媒は、水溶性触媒、例えば水溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物；２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］ジヒドロクロリド（Ｖａｚｏ ４４またはＶＡ－０４４）；２，２’－アゾビス（２－アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）；リチウムフェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィネート（ＬＡＰ）；光開始剤活性を有する金属または金属イオン；過酸化物；ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド；過酸化ベンゾイル；過硫酸アンモニウム；もしくは光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体；または水不溶性触媒、例えば水不溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物、２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）、４，４’－アゾビス（４－シアノペンタン酸）（ＡＣＶＡ）、１，１’－アゾビス（シアノシクロヘキサン）（ＡＣＨＮ）、ジアゼンジカルボン酸ビス（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミド）（ＴＭＡＤ）；アゾジカルボン酸ジピペリジド（ＡＤＤ）、もしくは光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体であり；光触媒作用によるチオール－エン反応が、紫外光下での放射線照射を含み；前記光触媒作用によるチオール－エン反応が、担体材料の遊離チオール基１つ当たり１～２００モル当量のアルケニル炭水化物抗原を反応させることを含み；および／または前記光触媒作用によるチオール－エン反応が、１０～３００、１０～２７０、１０～２４０、１０～２１０、１０～１８０、１０～１５０、１０～１２０、１０～９０、１０～６０、もしくは１０～３０分、および／または担体材料中の総遊離チオール濃度における少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０分の１の低減を達成するのに十分な時間にわたり実行され；光触媒作用によるチオール－エン反応が、担体材料の変性を回避するｐＨで実行され；光触媒作用によるチオール－エン反応が、担体材料へのコンジュゲーションの後、対象の内因性酵素によって担体材料から切断不可能な炭水化物抗原を生産し；アルケニル炭水化物抗原が、末端のアルケンに共有結合で連結されており、および／または炭水化物抗原が、アリルアミンと還元糖との間で、Ｏ－グリコシド結合、Ｓ－グリコシド結合、Ｎ－グリコシド結合、もしくはＣ－グリコシド結合、または還元的アミノ化により得られた結合を介して、担体材料にコンジュゲートされており；光触媒作用によるチオール－エン反応が、１つより多くのタイプの炭水化物抗原を担体材料にコンジュゲートし；（ａ）における炭水化物抗原は、リンカーを介して末端のアルケンに連結されており；および／または工程（ｂ）で提供された担体材料が、である：（ｉ）１つまたはそれより多くの遊離チオール基を有する１つまたはそれより多くのシステイン残基を含む担体材料、（ｉｉ）担体材料の溶媒が接近可能な位置に１つまたはそれより多くのさらなるシステイン残基を付加するように操作された担体材料；（ｉｉｉ）チオール化剤で処理された担体材料；（ｉｖ）還元剤で処理された担体材料；または（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）のあらゆる組合せである、項目５０に記載の複合糖質。

【0158】

５２．（ａ）構造：

【0159】

【化8】

（式中、ＣＡは、炭水化物抗原であり；Ｓ－ＣＭは、コンジュゲーションに利用可能なｚ個の硫黄原子を有する担体材料であり、ｚは、少なくとも１であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_１、またはＣＨ_２であり；Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＣＨ_３、または－ＣＯＥｔであり；ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；Ｒ_２は、ＨまたはＭｅである）
を有する合成複合糖質もしくはその立体異性体；または
（ｂ）構造：

【0160】

【化9】

（式中、ＣＡは、炭水化物抗原であり；Ｓ－ＣＭは、コンジュゲーションに利用可能なｚ個の硫黄原子を有する担体材料であり、ｚは、少なくとも１であり；Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；Ｒ_１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；ｑは、１、２、３、４、または５であり；Ｒ_３およびＲ_４は、それぞれ水素原子であり、ｍは、１、２、３、４または５であるか、またはＲ_３およびＲ_４は一緒に、カルボニルが窒素原子に連結されたラジカル－ＣＯ－ＣＨ_２－またはラジカル－ＣＯ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－を形成し、ｍは、１である）
を有する合成複合糖質もしくはその立体異性体；または
（ｃ）構造：

【0161】

【化10】

（式中、ＣＡは、炭水化物抗原であり；ｙは、少なくとも１であり；ｙが１より大きい場合、ＣＡは、同一であるかまたは異なっており；［Ｓ］_ｚ－ＣＭは、コンジュゲーションに利用可能なｚ個の硫黄原子を有する担体材料であり、ｚは、少なくともｙに等しく；Ｌは、構造：

【0162】

【化11】

を有するリンカーからなる群から選択されるリンカーであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_１、またはＣＨ_２であり；Ｒ_１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＣＨ_３、または－ＣＯＥｔであり；ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるかまたは異なっている）
を有する合成複合糖質もしくはその立体異性体；または
（ｄ）構造：

【0163】

【化12】

（式中、ＣＡは、炭水化物抗原であり；ｙは、少なくとも１であり；ｙが１より大きい場合、ＣＡは、同一であるかまたは異なっており；Ｓ－ＣＭは、コンジュゲーションに利用可能なｚ個の硫黄原子を有する担体材料であり、ｚは、少なくとも１であり、少なくともｙに等しく；Ｌは、構造：

【0164】

【化13】

を有するリンカーからなる群から選択されるリンカーであり、Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；Ｒ_１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；ｑは、１、２、３、４、または５であり；Ｒ_３およびＲ_４は、それぞれ水素原子であり、ｍは、１、２、３、４または５であるか、またはＲ_３およびＲ_４は一緒に、カルボニルが窒素原子に連結されたラジカル－ＣＯ－ＣＨ_２－またはラジカル－ＣＯ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－を形成し、ｍは、１であり；ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるかまたは異なっている）
を有する合成複合糖質もしくはその立体異性体；または
（ｅ）構造：

【0165】

【化14】

（式中、ＣＡは、炭水化物抗原であり；ｙは、少なくとも１であり；ｙが１より大きい場合、ＣＡは、同一であるかまたは異なっており；［Ｓ］_ｚ－ＣＭは、コンジュゲーションに利用可能なｚ個の硫黄原子を有する担体材料であり、ｚは、少なくともｙに等しく；Ｌは、構造：

【0166】

【化15】

を有するリンカーからなる群から選択されるリンカーであり、Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；Ｒ_１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；ｑは、１、２、３、４、または５であり；ｒは、１、２、３、４または５であり；Ｒ_５は、Ｓ－ＣＭ、共有結合、または構造：

【0167】

【化16】

のラジカルであり、Ｒ_３およびＲ_４は、それぞれ水素原子であり、ｍは、１、２、３、４または５であるか、またはＲ_３およびＲ_４は一緒に、カルボニルが窒素原子に連結されたラジカル－ＣＯ－ＣＨ_２－またはラジカル－ＣＯ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－を形成し、ｍは、１であり；ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるかまたは異なっている）
を有する合成複合糖質またはその立体異性体
である、項目４２～４８のいずれか一項に記載の複合糖質。

【0168】

５３．
－ （ｅ）で規定された構造を有し、リンカーが、構造：

【0169】

【化17】

（式中、Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；Ｒ_１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；ｑは、１、２、３、４、または５であり；ｒは、１、２、３、４または５である）
を有するか；
－ （ｅ）で規定された構造を有し、リンカーが、構造：

【0170】

【化18】

（式中、Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；Ｒ_１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；ｑは、１、２、３、４、または５であり；ｒは、１または２である）
を有するか；
－ 担体材料が、光触媒作用によるチオール－エン反応を介した炭水化物抗原へのコンジュゲーションに好適な、ポリマー、ポリペプチド、担体タンパク質、固体支持体、粒子、または少なくとも１つまたはそれより多くの遊離チオール基を有する他のあらゆる材料であるか、またはそれを含むか；
－ コンジュゲート材料が、同じ炭水化物抗原の少なくとも２つに、または１つより多くのタイプの炭水化物抗原にカップリングされ、それによって、多価性の合成複合糖質が生産されるか；
－ 炭水化物抗原が、対象の内因性酵素によって担体タンパク質から切断不可能であるか；または
－ それらのあらゆる組合せである、項目５２に記載の複合糖質。

【0171】

５４．項目４２～５３のいずれか一項に記載の１種またはそれより多くの複合糖質、ならびに医薬的に許容される賦形剤および／またはアジュバントを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン。

【0172】

５５．少なくとも２つの異なる複合糖質を含み、各複合糖質は、シアル化されたＴＦ抗原（モノまたはジシアル化されたＴＦ抗原）、シアル化されていないＴＦ抗原、シアル化されたＴｎ抗原、およびシアル化されていないＴｎ抗原から選択される少なくとも２つの異なる炭水化物抗原にコンジュゲートした担体材料を含む、項目５４に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン。

【0173】

５６．複合糖質またはワクチンが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオン粒子に結合する抗体の生産を誘導し、好ましくは中和活性を有する、項目４２～５３のいずれか一項に記載の複合糖質、または項目５４もしくは５５に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン。

【0174】

５７．対象にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン接種をするための方法または対象において抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の生産を誘発するための方法であって、項目４２～５３または５６のいずれか一項に記載の複合糖質、または項目５４～５６のいずれか一項に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを投与することを含む、上記方法。

【0175】

５８．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染から対象を防御するための、またはＣＯＶＩＤ－１９を処置するための組成物であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質上に発現されたＯ結合型グリカンに結合する１種またはそれより多くのリガンド（例えば、抗体、抗体断片、またはレクチン）を含み、Ｏ結合型グリカンは、シアル化されたＴＦ抗原（モノまたはジシアル化されたＴＦ抗原）、シアル化されていないＴＦ抗原、シアル化されたＴｎ抗原、シアル化されていないＴｎ抗原、またはそれらのあらゆる組合せを含む、上記組成物。

【0176】

５９．１つまたはそれより多くのリガンドが、組換えモノクローナル抗体（例えば、ＪＡＡ－Ｆ１１またはヒト化ＪＡＡ－Ｆ１１）を含む、項目５８に記載の使用のための組成物。

【0177】

６０．１つまたはそれより多くのリガンドが、レクチン（例えば、シアル化されたおよびシアル化されていないＴＦ抗原の形態の両方に結合するもの）を含む、項目５８に記載の使用のための組成物。

【0178】

６１．レクチンが、ジャカリンであるか、またはジャカリン関連のレクチンである、項目５８～６０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【0179】

６２．鼻腔内用組成物として製剤化される、項目５８～６１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【0180】

６３．（ａ）シアル化されたＴＦ抗原（モノまたはジシアル化されたＴＦ抗原）、シアル化されていないＴＦ抗原、シアル化されたＴｎ抗原、シアル化されていないＴｎ抗原、またはそれらのあらゆる組合せを含む、Ｏ結合型グリカンを発現するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質またはその断片；および（ｂ）Ｏ結合型グリカンにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質またはその断片に結合する、項目５８～６１のいずれか一項に記載のリガンドを含む複合体。

【0181】

６４．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質またはその断片が、無傷のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオン粒子に含まれる、項目６３に記載の複合体。

【実施例】

【0182】

実施例１：一般的な方法
反応を、アルゴン雰囲気下で、商業的に入手可能なＨＰＬＣグレードの試薬を使用して行った。商業的に入手可能な試薬（Sigma Aldrich）をそれ以上精製せずに使用した。Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミンおよびＮ－アセチルノイラミン酸は、ローズ・サイエンティフィック社（Rose Scientific Ltd.、アルバータ、カナダ）から提供された。Ｆｍｏｃ－β－Ａｌａ－Ｗａｎｇ樹脂およびＦｍｏｃアミノ酸は、ペプチド・テクノロジー社（Peptide Technologies Ltd、ピエールフォン、ケベック州、カナダ）から商業的に入手可能であった。反応の進行を、シリカゲル６０ Ｆ_２５４でコーティングされたプレート（E. Merck）を使用した薄層クロマトグラフィーによってモニターした。クリックチオール－エン光化学反応によるコンジュゲーションを、２つの手持ち式のＵＶ３６５ｎｍランプ（ＵＶ－ＡＣハンドランプ、二重の２５４／３６５ｎｍのＵＶ；１１５Ｖ－６０Ｈｚ、０．１６ａｍｐ、ＶＷＲカナダ（VWR Canada）、カタログ番号８９１３１－４９２）の間に置いた石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー・サイエンティフィック・カナダ（Fisher Scientific Canada）、カタログ番号１４－９５８－１３０）中で行った。フラッシュクロマトグラフィーを、カナディアンライフサイエンス（Canadian Life Science）からのＺＥＯｐｒｅｐ（商標）シリカゲル６０（４０～６３μｍ）を使用して実行した。検出を、紫外線下で、または２０％硫酸またはモリブデン酸塩またはＫＭｎＯ_４のエタノール溶液を噴霧し、続いて加熱することによって行った。ＮＭＲスペクトルを、ブルカー（Bruker）のＵＬＴＲＡＳＨＩＥＬＤ（商標）３００ＭＨｚおよびブルカーのＡｖａｎｃｅ（商標）ＩＩＩ ＨＤ６００ＭＨｚ分光計で記録した。プロトンおよび炭素化学シフト（δ）は、７．２６ｐｐｍ（^１Ｈ）および７７．１６ｐｐｍ（^１３Ｃ）に設定された残留したＣＨＣｌ_３の化学シフトに対するｐｐｍで報告される。結合定数（Ｊ）は、ヘルツ（Ｈｚ）で報告され、ピーク多重度に関しては以下の略語が使用される：シングレット（ｓ）、ダブレット（ｄ）、ダブレットのダブレット（ｄｄ）、等しい結合定数のダブレットのダブレット（ｔ_ａｐ）、トリプレット（ｔ）、マルチプレット（ｍ）。分析および割り当てを、ＣＯＳＹ（相関分光法）およびＨＳＱＣ（異核単一量子干渉）実験を使用して作製した。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）を、ＵＱＡＭの分析プラットフォームによって、ポジティブおよび／またはネガティブエレクトロスプレーモードで、アジレント・テクノロジーズ（Agilent technologies）からのＬＣ－ＭＳ－ＴＯＦ（液体クロマトグラフィー飛行時間型質量分析）機器を用いて、測定した。実験式の確認のために、プロトン化イオン（Ｍ＋Ｈ）^＋またはナトリウム付加物（Ｍ＋Ｎａ）^＋のいずれかを使用した。天然のＴＴおよびＴＴ－コンジュゲートを、２０００ＫＤａのベンゾイル化された透析管（シグマ－アルドリッチ（Sigma-Aldrich）（オンタリオ州、カナダ）を使用して透析した。天然およびコンジュゲートしたＴＴの両方のチオール含量を、４１２ｎｍでのエルマン試験によって決定した（Ellman, G. L. Arch. Biochem. Biophys.1959、82、70～77）。ＴＴ－コンジュゲートの全糖含量を、ＵＶ／ＶＩＳ分光分析による４９２ｎｍで測定された比色デュボア試験によって決定した（Dubois, M.; Gilles, K. A.; Hamilton, J. K.; Rebers, P. A.; Smith, F. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Anal. Chem.、1956、28、350～356）。動的光散乱法（ＤＬＳ）、粒度分布を、マルバーン（Malvern）からのゼータサイザーナノＳ９０（Zetasizer Nano S90）を使用して、ＰＢＳ中で測定した。マウスモノクローナルＩｇＧ３抗体ＪＡＡ－Ｆ１１を、これまでにRittenhouse-Diakunら、1998に記載されたようにして生産した。

【0183】

一般的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）手順
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）の手順は、文献の手順（Papadopoulosら、2012）に従い、Ｆｍｏｃ－β－Ａｌａ－Ｗａｎｇ樹脂（６５０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、１．０当量；１００～２００メッシュ、ローディング＝０．５２ｍｍｏｌ／ｇ）から開始した。反応を、Ｅｃｏｎｏ－Ｐａｃ使い捨てカラム１．５×１４ｃｍ（２０ｍＬ）（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）、オンタリオ州、カナダ）での回転撹拌によって実行した。樹脂を、１時間の間にＣＨ_２Ｃｌ_２で膨潤させ、次いでろ過し、ｉ１の間にＤＭＦで再び調整した。市販の樹脂またはアミノ酸のＦｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン溶液（５ｍＬ、２×５分、次いで１×１０分）を用いて除去した。溶媒および試薬をろ過によって除去し、樹脂を、ＤＭＦ、ＣＨ_２Ｃｌ_２およびＭｅＯＨで洗浄した（各溶媒で３回）。遊離のアミノ基の存在を、カイザー試験またはＴＮＢＳ試験によって検証した。樹脂上の遊離アミンを、ＤＭＦ中の、予め活性化させたＦｍｏｃアミノ酸：３当量のアミノ酸、３当量のＨＢＴＵ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート）および触媒的な量のＨＯＢｔ（１－ヒドロキシベンゾトリアゾール）の溶液で、４℃で（１０分）処理した。次いでＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルアミン、９当量）を混合物に添加し、室温で１時間３０分撹拌した。カップリングの完了を、カイザーまたはＴＮＢＳ比色試験を使用して決定した。ろ過の後、樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ除去手順を再び繰り返した。合成配列の末端における最後の遊離アミンをアセチル化によってキャッピングした（１：１：８のＡｃ_２Ｏ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ、１時間）。ろ過の後、溶液を流して除去し、樹脂を真空中で乾燥させ、切断を、トリフルオロ酢酸／水／エタンジチオール／トリイソプロピルシラン（triisopropysilane）（９４．０／２．５／２．５／１．０）を３時間使用して行った。得られたペプチドをメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで沈殿させ、遠心分離（２０分、２０００ｒｐｍ、３回）によって樹脂ビーズから単離した。沈殿をエアジェット流を用いて慎重に乾燥させた。粗製ペプチドをＨ_２Ｏ中で可溶化して、それを樹脂から分離した。次いで溶液を凍結乾燥して、望ましいペプチドを得た。

【0184】

破傷風トキソイド単量体の精製
破傷風トキソイド（ＴＴ）単量体を、コンジュゲーションの前にゲルろ過クロマトグラフィーによって得た。４．５ｍｇ／ｍｌタンパク質（改変ローリータンパク質アッセイによって決定した場合）を含有する１ミリリットルの液体調製物を、ＰＢＳ（２０ｍＭのＮａＨＰＯ_４［ｐＨ７．２］、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００Ｐｒｅｐグレード（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス（GE Healthcare Life Sciences）、ウプサラ、スウェーデン）で充填したＸＫ１６－１００カラムにローディングし、同じ緩衝液で溶出させた。タンパク質が２つのピークでカラムから溶出した：先に溶出したピークは、オリゴマー化したトキソイドを含有し、後に溶出した１５０，０００のＭｒに相当するピークは、ＴＴ単量体を含有していた。後の（単量体）ピークに対応する画分をプールし、脱イオン水に対して脱塩し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）プラス－７０遠心フィルターデバイス（３０ＫのＵｌｔｒａｃｅｌ ＰＬメンブレン；ミリポア（Millipore）、マサチューセッツ州ビレリカ）を使用して濃縮し、次いで凍結乾燥した。

【0185】

複合糖質のＨＰＬＣ分析
アリルネオ複合糖質調製物のＨＰＬＣ分析を、サイズ排除クロマトグラフィーによって行った。クロマトグラフ分離を、ＳＢ－８０７Ｇガードカラム（昭和電工）が先行する直列に連結された３つの８ｍｍ×３００ｍｍのＳｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋゲルろ過カラム（２つのＳＢ－８０４および１つのＳＢ－８０３）で実行した。ネオ複合糖質免疫原を、０．４ｍＬ／分の流速で、２８０ｎｍの波長で示差屈折計（ＲＩ）検出器モデル２３００およびＵＶ検出器モデル２６００を備えたクナウアー・スマートライン（Knauer Smartline）システムを使用して、０．１ＭのＮａＮＯ_３で溶出させた。コンジュゲート調製物（移動相中の８ｍｇ／ｍＬ溶液）を、５０－μΛの注入ループを使用して注入した。選択された実験において、空隙容量に溶出した画分は、コンジュゲート画分に相当し、これをプールし、スペクトラ／ポア（Spectra/Por）；分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、１２，０００～１４，０００［スペクトラム・ラボラトリーズ（Spectrum Laboratories）］）を用いて水に対して透析し、凍結乾燥した。これは、２：１の分画されたコンジュゲートに相当する。

【0186】

実施例２：アリル２－アセトアミド－３，６－ジ－Ｏ－ピバロイル－２－デオキシ－α－Ｄ－グルコピラノシド（化合物２）

【0187】

【化19】

図２を参照すると、塩化アセチル（２．７６ｍＬ、３８．８０ｍｍｏｌ、３．４３当量）を、アルゴン雰囲気下で、０℃で、アリルアルコール（２０．８ｍＬ）に一滴ずつ添加した。室温で、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（化合物１）（２．５０ｇ、１１．３ｍｍｏｌ、１．００当量）を添加した。反応混合物を７０℃で３時間撹拌し、次いでｐＨ７まで固体ＮａＨＣＯ_３を添加することによってクエンチした。懸濁液をセライトのパッドに通過させてろ過し、ＭｅＯＨで数回洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、粗製アリル２－アセトアミド－２－デオキシ－Ｄ－グルコサミンをＥｔ_２Ｏ／エタノールでの粉砕によって沈殿させた。次いで粉砕の後に溶媒を減圧下で数回除去した。次いで、乾燥ジクロロメタン－ピリジン（４５ｍＬ、ｖ／ｖ、１：２）の混合物中の粗製アリル２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－グルコピラノシド中間体の懸濁液に、窒素雰囲気下で、－１５℃で、塩化ピバロイル（３．９０ｍＬ、３１．６４ｍｍｏｌ、２．８０当量）をを一滴ずつ添加した。反応混合物を２時間撹拌し、室温に温めて、望ましいα－アノマー（化合物２）（Ｒｆ＝０．３２）を一部のβ－アノマー（Ｒｆ＝０．１８）と共に得た；１：１のヘキサン／ＥｔＯＡｃ）。次いで混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、有機相を、ＨＣｌ（１Ｍ）で数回、飽和ＫＨＳＯ_４水溶液、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液、およびブラインで連続的に洗浄した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で蒸発させた。黄色がかった油状物をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（６：４～１：１のヘキサン－ＥｔＯＡｃ）で精製して、望ましい化合物アリル２－アセトアミド－３，６－ジ－Ｏ－ピバロイル－２－デオキシ－α－Ｄ－グルコピラノシド（化合物２）を白色の固体として得た（４．８５ｇ、６．７８ｍｍｏｌ、６０％）。Ｒｆ＝０．３２；ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １：１；図３Ａおよび３Ｂ：¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz): δ 5.87 (dddd, 1H, J_H,H = 16.8, 10.5, 6.2, 5.3 Hz, OCH₂CH=CH₂), 5.77 (d, 1H, J_NH,H2 = 9.7 Hz, NH), 5.31-5.25 (m, 1H, OCH₂CH=CH₂), 5.22 (dd, 1H, J_H,H = 10.4, 1.3 Hz, OCH₂CH=CH₂), 5.09 (dd, 1H, J_3,4 = 10.7, J_2,3 = 9.3 Hz, H-3), 4.83 (d, 1H, J_1,2 = 3.7 Hz, H-1), 4.39 (m, 1H, H-6a), 4.35-4.25 (m, 2H, H-6bおよびH-2), 4.19 (m, 1H, OCH₂), 4.02-3.93 (m, 1H, OCH₂), 3.85 (m, 1H, H-5), 3.59-3.48 (m, 1H, H-4), 3.03 (d, 1H, J_4,OH = 5.1 Hz, OH-4), 1.93 (s, 3H, NHCOCH₃), 1.23 (s, 9H, tert-ブチル)および1.19 ppm (s, 9H, tert-ブチル); ¹³C NMR (CDCl₃,150 MHz): δ 179.8, 179.1 (tert-BuCO), 169.7 (NHCO), 133.2 (OCH₂CH=CH₂), 118.1 (OCH₂CH=CH₂), 96.4 (C-1), 73.4 (C-3), 70.5 (C-5), 69.1 (C-4). 68.2 (OCH₂), 63.1 (C-6), 51.4 (C-2), 39.0, 38.9 (2×C(CH₃)₃), 27.2, 27.0 (2×C(CH₃)₃)および23.2 ppm (CH₃)。図３Ｃおよび３Ｄ：ESI⁺-HRMS: [M+H]⁺ C₂₁H₃₆O₈Nの計算値、430.2435；実測値、430.2445。β-アノマーを白色の固体として単離した（９７１ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ、２０％）。Ｒｆ＝０．１８；１：１のヘキサン／ＥｔＯＡｃ；¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz): δ 6.00 (d, 1H, J_NH,H2=9.3 Hz, NH), 5.95-5.75 (m, 1H, OCH₂CH=CH₂), 5.35-5.03 (m, 3H, OCH₂CH=CH₂およびH-3), 4.55 (d, 1H, J_1,2=8.4 Hz, H-1), 4.47-425 (m, 3H, H-6a, 6bおよびOCH₂), 4.14-3.90 (m, 2H, OCH₂およびH-2), 3.65-3.43 (m, 2H, H-5およびH-4), 3.23 (sb, 1H, OH-4), 1.92 (s, 3H, NHCOCH₃), 1.23 (s, 9H, tert-ブチル)および1.20 ppm (s, 9H, tert-ブチル)。

【0188】

実施例３：アリル２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（アリルＴｎ）

【0189】

【化20】

図２を参照すると、乾燥ジクロロメタン－ピリジン（１２６ｍＬ、２０：１ｖ／ｖ）の混合物中のジＯ－ピバロイル化合物（化合物２）（５．５０ｇ、１２．８０ｍｍｏｌ、１．０当量）をアルゴン雰囲気下で－３５℃に冷却した。次いでトリフルオロメタンスルホン酸無水物（２．５８ｍＬ、１５．３６ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加し、混合物をこの温度で撹拌した。温度を２時間にわたり室温に温めた。次いでこの溶液に水（１２ｍＬ）を添加した。混合物を加熱し、一晩（１２時間）還流しながら（約５０℃）撹拌した。室温に到達した後、反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１ＭのＨＣｌ水溶液で数回洗浄した。有機層を、Ｈ_２Ｏ、飽和ＮａＨＣＯ_３、およびブラインで洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で蒸発させた。粗生成物をＺｅｍｐｌｅｎ条件下（メタノール中の１Ｍナトリウムメトキシド溶液、４０ｍＬ、ｐＨ９）で処理した。溶液を５０℃で一晩撹拌した。室温に冷却した後、溶液をイオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲ１２０、Ｈ^＋）への添加によって中和し、ろ過し、ＭｅＯＨで洗浄し、溶媒を減圧下で除去した。凍結乾燥の後、アリルＴ_Ｎを、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ／ヘキサン中での沈殿によって白色の固体として単離した（２．３６ｇ、９．１０ｍｍｏｌ、７１％）。Ｒｆ＝０．３２；４：１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ；図４Ａおよび４Ｂ：¹H NMR(CD₃OD, 600 MHz): δ 5.99-5.88 (m, 1H, OCH₂CH=CH₂), 5.31 (dd, 1H, J_trans=17.3, J_gem=1.3 Hz, OCH₂CH=CH₂), 5.17 (dd, 1H, J_cis=10.5 Hz, OCH₂CH=CH₂), 4.86 (d, 1H, J_1,2=3.8 Hz, H-1), 4.27 (dd, 1H, J_2,3=11.0 Hz, H-2), 4.20 (m, 1H, OCH₂), 4.00 (m, 1H, OCH₂), 3.89 (dd, J_3,4=J_4,5=2.6 Hz, H-4), 3.85-3.77 (m, 2H, H-3およびH-5), 3.72 (m, 2H, H-6aおよびH-6b)および1.99 ppm (s, 3H, CH₃); ¹³C NMR(CD₃OD, 150 MHz): δ 172.5 (NHCO), 134.2 (OCH₂CH=CH₂), 116.1 (OCH₂CH=CH₂), 96.6 (C-1), 71.2 (C-3), 69.0 (C-4), 68.3 (C-5)。67.8 (OCH₂), 61.4 (C-6), 50.2 (C-2)および21.2 ppm (CH₃)。図４Ｃおよび４Ｄ：ESI⁺-HRMS：[M+H]⁺ C_１１H_２０O_６Nの計算値、262.1285；実測値、262.1294。

【0190】

手順Ｂ：アリル２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシドは、文献の手順に従ってＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）から直接調製することもできる（Fengら、2004）。アリルアルコール（８ｍＬ）中のＮ－アセチルガラクトサミン（４４２ｍｇ、２ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、ＢＦ_３．Ｅｔ_２Ｏ（２５０μＬ、２ｍｍｏｌ、１．０当量）を室温で添加し、混合物を７０℃で２時間撹拌した。溶液を室温に冷却し、溶媒を減圧下で除去した。乾燥粗生成物を最小限のＥｔＯＨ（５ｍＬ）に溶解させた。望ましいアリルＴ_Ｎ生成物をジイソプロピルエーテル中で沈殿させ、白色の固体として単離した（４１７ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ、８０％）。

【0191】

Ｃ－アリルＧａｌＮＡｃアナログ（図２）［１－（２’－アセトアミド－２’－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシル）－２－プロペン］を、文献の手順に従って調製した（Cipollaら、2000）。３－（２－アセトアミド－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシル）－１－プロペン（Cuiら、1998）（３７１ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ、１．０当量）をＺｅｍｐｌｅｎ条件下で（メタノール中の１Ｍナトリウムメトキシド溶液、５ｍＬ、ｐＨ８～９）処理した。溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物をイオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲ１２０、Ｈ^＋）への添加によって中和し、ろ過し、ＭｅＯＨで洗浄し、溶媒を減圧下で除去した。Ｃ－アリルＴ_Ｎをシリカゲルでのクロマトグラフィー（９：１～４：１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）によって精製し、続いてＥｔＯＨ中で白色の固体として結晶化した（２１３ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ、８７％）。Ｒｆ＝０．２８；ＥｔＯＨ ４：１；ｍｐ ２３０℃（文献値２１５～２１７℃、ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ）；文献のＮＭＲデータに従って:¹H NMR(CD₃OD, 600 MHz): δ 5.81 (m, 1H, ¹CH₂CH=CH₂), 5.08 (dd, 1H, J_trans=17.2, J_gem=1.7 Hz, ¹CH₂CH=CH₂), 5.02 (dd, 1H, J_cis=10.2 Hz, ¹CH₂CH=CH₂), 4.22 (dd, 1H, J=9.3、5.0 Hz, H-2’), 4.14 (dt, 1H, J=10.0、5.0 Hz, H-1’), 3.91 (dd, 1H, J=3.0 Hz, H-4’), 3.82-3.64 (m, 4H, H-3’, H-5’およびH-6’ab), 2.45 (m, 1H, H-1a), 3.17 (m, 1H, H-1b)および1.97 ppm (s, CH₃); ¹³C NMR(CD₃OD, 150 MHz): δ 173.6 (NHCO), 136.2 (¹CH₂CH=CH₂), 117.1 (¹CH₂CH=CH₂), 72.9 (C-1’), 69.7 (C-4’), 69.5 (C-3’およびC-5’), 61.8 (C-6’), 52.0 (C-2’), 32.4 (¹CH₂)および22.5 ppm (CH₃)。ESI⁺-LCMS: [M+H]⁺ C₁₁H₂₀O₅Nの計算値、246.1336;実測値、246.1332; CAN/H₂O 5～95% 1.4分。

【0192】

Ｓ－アリルＧａｌＮＡｃアナログ（図２）を文献に従って調製した：Knappら、2002。

【0193】

実施例４：アリル２－アセトアミド－４，６－Ｏ－ベンジリデン－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（化合物４）

【0194】

【化21】

図２を参照すると、乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のアリルＧａｌＮＡｃ（Ｔｎ）（２．３５ｇ、９．０ｍｍｏｌ、１．０当量）およびベンズアルデヒドジメチルアセタール（６．７５ｍＬ、４５．０ｍｍｏｌ、５．０当量）の溶液に、触媒的な量のｐ－トルエンスルホン酸一水和物を添加した。混合物を室温で撹拌した。５時間後、混合物をＣＨＣｌ_３で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄した。有機層を分離し、水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮して、白色の固体を得た。ベンジリデンアセタール（化合物４）を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン中での沈殿によって白色の固体として単離した（２．６４ｇ、７．５６、８４％）。Ｒｆ＝０．２１；９．０：０．５のＤＣＭ／ＭｅＯＨ；図５Ａ:¹H NMR(CDCl₃, 300 MHz): δ 7.59-7.46 (m, 2H, H-ar), 7.43-7.31 (m, 3H, H-ar), 5.91 (m, 1H, OCH₂CH=CH₂), 5.75 (d, 1H, J_NH,H2=9.0 Hz, NH), 5.58 (s, 1H, PhCH), 5.34-5.17 (m, 2H, OCH₂CH=CH₂), 5.01 (d, 1H, J_1,2=3.5 Hz, H-1), 4.56-4.42 (ddd, 1H, J_2,3=10.9 Hz, J_2,OH=9.1 Hz, H-2), 4.34 (dd, 1H, J_5,6a=1.5 Hz, J_6a,6b=12.5 Hz, H-6a), 4.19 (m, 2H, H-4およびOCH₂), 4.04 (m, 1H, dd, 1H, J_5,6b=1.6 Hz, J_6a,6b=12.5 Hz, H-6b), 4.01 (m, OCH₂), 3.86 (dd, 1H, J_3,4=10.9 Hz, H-3), 3.71 (sb, 1H, H-5), 2.80 (d, 1H, J_3,OH=10.7 Hz, OH-3)および2.05 ppm (s, 3H, CH₃); 図5Bおよび5C: ESI⁺-HRMS: [M+H]⁺C₁₈H₂₄O₆Nの計算値、350.1598;実測値、350.1608 。

【0195】

実施例５：アリル（２，３，４，６－テトラ－Ｏ－ベンゾイル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）－２－アセトアミド－４，６－Ｏ－ベンジリデン－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（化合物６）

【0196】

【化22】

図２を参照すると、化合物４（２．０ｇ、５．７２ｍｍｏｌ、１．０当量）およびシアン化第二水銀（２．１７ｇ、８．６０ｍｍｏｌ、１．５当量）を、アルゴン雰囲気下で４Åの分子篩を含有する無水ニトロメタン－トルエン（１００ｍＬ、３：２、ｖ／ｖ）の混合物中に溶解させた。混合物を室温で３０分撹拌した。２，３，４，６－テトラ－Ｏ－ベンゾイル－α－Ｄ－ガラクトピラノシルブロミド（化合物５）（５．６６ｇ、８．５８ｍｍｏｌ、１．５当量）を混合物に添加した。溶液を７０℃で５時間撹拌し、次いで室温で一晩（８時間）撹拌を維持した。ＴＬＣ（９．０：０．５のＤＣＭ／ＭｅＯＨ）によって示されるように出発材料（化合物４）を全て消費した後、溶媒を減圧下で除去した。残留物をＥｔＯＡｃ中に溶解させ、続いてセライトのパッドを介してろ過した。ろ液を連続して１０％ヨウ化カリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム溶液および水で洗浄し、次いでＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させて、白色の発泡体を得た。粗生成物を、１００％ヘキサンから１：２のヘキサン／ＥｔＯＡｃの勾配を使用したシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、望ましい二糖（化合物６）を白色の固体として得た（４．９８、５．３８ｍｍｏｌ、９４％）。ｍｐ：１１０～１１１℃、Ｒｆ＝０．２０；１：２のヘキサン／ＥｔＯＡｃ；図６Ａおよび６Ｂ：¹H NMR(CDCl₃, 600 MHz): δ 8.06-7.19 (m, 5H, H-ar), 5.98 (dd, 1H, J_3,4’=3.3 Hz, J_4,5’=1.0 Hz, H-4^II), 5.85-5.78 (m, 2H, OCH₂CH=CH₂およびH-2^II), 5.60 (dd, 1H, J_2,3’=10.2 Hz, J_3,4’=3.4 Hz, H-3^II), 5.48 (sb, 1H, NH), 5.23 (m, 3H, OCH₂CH=CH₂およびH-1), 4.68 (dd, 1H, J_5’,6a’=6.9 Hz, J_6a’,6b’=11.4 Hz, H-6a^I), 4.63-4.58 (m, 1H, H-2), 4.46-4.36 (m, 3H, H-4.H-5およびH-6b^II), 4.14-4.07 (m, 3H, H-6a, OCH₂およびH-3), 3.96 (m, 1H, OCH₂), 3.75 (m, 1H, H-6b), 3.51 (m, 1H, H-5)および1.40 ppm (s, 3H, CH₃); ¹³C NMR(CDC₁₃, 150 MHz): δ 170.0 (NHCO), 166.0, 165.5, 165.4, 165.2 (CO), 137.6-126.2 (multi, 30 C-arom), 133.2 (OCH₂CH=CH₂), 117.8 (OCH₂CH=CH₂), 102.0 (C-1^II), 100.9 (CPhCH), 97,3 (C-1^I), 76.1 (C-3), 75.4 (C-4), 71.7 (C-3^IIおよびC-5^II), 70.2 (C-2^II), 69.1 (C-6), 68.6 (OCH₂), 68.1 (C-4^II), 62.9 (C-5), 62.6 (C-6^I), 48.2 (C-2)および22.5 ppm (CH₃)。図６Ｃおよび６Ｄ: ESI⁺-HRMS: [M+H]⁺ C₅₂H₅₀O₁₅Nの計算値、928.3175;実測値、928.3133 。

【0197】

実施例６：アリル（β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）－２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（アリルＴＦ）

【0198】

【化23】

図２を参照すると、メタノール中の１Ｍナトリウムメトキシド（１２ｍＬ、ｐＨ８－９）中の化合物６の溶液（１．１２ｇ、１．２０ｍｍｏｌ、１．０当量）を、出発材料が消費されるまで室温で撹拌した。１時間３０分後、溶液をイオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ１２０、Ｈ^＋）の添加によって中和し、ろ過し、ＭｅＯＨで洗浄し、溶液をシリカゲルと共に懸濁し、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。シリカゲルを、１００％ＥｔＯＡｃで数回洗浄し、続いて第２の溶液（１：１：０．１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ）で洗浄した。合わされたろ液を減圧下で蒸発させて、中間体（化合物７）を白色の固体として得た。Ｒｆ＝０．２０；１１：６：１のＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ；図７Ａおよび７Ｂ：¹H NMR(D₂O, 600 MHz): δ 7.47-7.39 (m, 2H, H-ar), 7.37-7.26 (m, 3H, H-ar), 5.82 (m, 1H, OCH₂CH=CH₂), 5.61 (s, 1H, PhCH), 5.20-5.09 (m, 2H, OCH₂CH=CH₂), 4.88 (d, 1H, J_1,2=3.4 Hz, H-1), 4.47 (dd, H-4), 4.37-4.25 (m, 2H, H-2およびH-1^II), 4.13-3.98 (m, 4H, H-3, H-6a, H-6b, OCH₂), 3.96-3.88 (m, 1H, H-5), 4.56-4.42 (ddd, 1H, J_2,3=10.9 Hz, J_2,OH=9.1 Hz, H-2), 4.34 (dd, 1H, J_5,6a=1.5 Hz, J_6a,6b=12.5 Hz, H-6a), 4.19 (m, 2H, H-4 および OCH₂), 4.04 (m, 1H, dd, 1H, J_5,6b=1.6 Hz, J_6a,6b=12.5 Hz, H-6b), 4.01 (m, OCH₂), 3.86 (dd, 1H, J_3,4=10.9 Hz, H-3), 3.71 (sb, 1H, H-5), 2.80 (d, 1H, J_3,OH=10.7 Hz, OH-3)および2.05 ppm (s, 3H, CH₃); 3.83 (s, 1H, OCH₂), 3.72 (d, 1H, J_3’,4’=J_4’,5’=3.2 Hz, H-4^II), 3.65-3.55 (m, 2H, H-6a,b), 3.49, (m, 1H, H-5^II), 3.43 (dd, 1H, J_2’,3’=10.0 Hz, J_3’,4’=3.3 Hz, H-3^II), 3.33-3.24 (m, 1H, H-2^II)および1.86 ppm (s, 3H, CH₃); ¹³C NMR(D₂O, 150 MHz): δ 174.6 (NHCO), 136.8 (C-arom), 133.6 (OCH₂CH=CH₂), 129.9, 128.7, 126.5 (C-arom), 118.0 (OCH₂CH=CH₂), 104.9 (C-1^II), 101.3 (CHPh), 97.0 (C-1), 76.0 (C-4), 75.0 (C-3), 75.0 (C-5^II), 72.4 (C-3^II), 70.4 (C-2^II), 69.0 (C-6), 68.7 (OCH₂CH=CH₂), 68.6 (C-4^II), 63.0 (C-5), 61.0 (C-6^II), 48.6 (C-2)および22.0 ppm (CH₃)。Rf=0.38;EtOAc/MeOH/H₂O 7:3:0.1;Rf=0.46;ACN/MeOH/H₂O 7:2:1。図７Ｃおよび７Ｄ: ESI⁺-HRMS: [M+H]⁺ C₂₄H₃₄O₁₁Nの計算値、512.2126;実測値、512.2119。

【0199】

次いで白色の固体中間体を、１０ｍＬの６０％酢酸水溶液中に溶解させ、得られた溶液を６０℃で１．５時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物を凍結乾燥して、最終的なアリルＴＦを白色の固体として得た（４２７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、８４％）。ｍｐ＝２３０～２３２℃；Ｒｆ＝０．５３；１１：６：１のＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ；図８Ａおよび８Ｂ：¹H NMR(D₂O, 600 MHz): δ 5.80 (m, 1H, OCH₂CH=CH₂), 5.19 (dd, 1H, J_trans=17.3 Hz, OCH₂CH=CH₂), 5.09 (dd, 1H, J_cis=10.4 Hz, OCH₂CH=CH₂), 4.77 (d, 1H, J_1,2=3.7 Hz, H-1), 4.29 (d, 1H, J_1,2=3.7 Hz, H-1), 4.29 (d, 1H, J_1,2=7.8 Hz, H-1^II), 4.16 (dd, 1H, J_2,3=11.2 Hz, J_1,2=3.7 Hz, H-2), 4.08-4.01 (m, 2H, H-4およびOCH₂), 3.92-3.82 (m, 3H, H-3, H-5およびOCH₂), 3.73 (dd, 1H, H-4^II), 3.63-3.52 (m, 4H, H-6a,bおよびH-6’a,b), 3.47 (m, 2H, H-3^IIおよびH-5^II), 3.39 (dd, 1H, J_2’,3’=10.0 Hz, J_1’,2’=7.7 Hz, H-2^II)および1.85 ppm (s, 3H, CH₃); ¹³C NMR(150 MHz, CDC₁₃): δ 174.6 (NHCO), 133.7 (OCH₂CH=CH₂), 117.9 (OCH₂CH=CH₂), 104.7 (C-1^II), 96.4 (C-1), 77.2 (C-3), 75.0 (C-5^II), 72.5 (C-3^II), 70.7 (C-5), 70.6 (C-2^II), 68.8 (C-4), 68.6 (C-4^II), 68.4 (OCH₂), 61.2 (C-6^II), 61.0 (C-6), 48.6 (C-2)および22.0 ppm (CH₃)。図８Ｃおよび８Ｄ: ESI⁺-HRMS: [M+Na]⁺ C₁₇H₂₉O₁₁NNaの計算値、446.1633;実測値、446.1613。

【0200】

実施例７：３－｛［３－（２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシル）オキシプロピル］チオ｝プロパン酸（化合物８）

【0201】

【化24】

図９を参照すると、脱気したＨ_２Ｏ／ＭｅＯＨ（３ｍＬ、１：１、ｖ／ｖ）中のアリルＴｎ（３９２ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ、１．０当量）および３－メルカプトプロピオン酸（３９２μＬ、４．５０ｍｍｏｌ、３．０当量）の溶液を、２５４ｎｍの放射線照射下で、室温で一晩撹拌するか（Ａ）、または３６５ｎｍの放射線照射下で、ＤＭＰＡＰ（２３ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ、０．０６当量）と共に１５分撹拌した（Ｂ）。次いで混合物を減圧下でシリカゲルを用いて濃縮し、次いで勾配（１００％のＥｔＯＡｃから３：１：０．０１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ）によるシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、望ましい化合物８を白色の発泡体として得た（Ａから：５３６ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ、９７％）；（Ｂから：８２％）。¹H NMR(CD₃OD, 600 MHz): δ 4.82 (d, 1H, J=3.7 Hz, H-1), 4.25 (dd, 1H, J=11.0, 3.7 Hz, H-2), 3.89 (d, 1H, J=3.2 Hz, H-4), 3.85-3.72 (m, 5H, H-3, H-5, H-6a, H-6b, OCH₂), 3.49 (dt, 1H, J=10.0, 6.0 Hz, OCH₂), 2.77 (t, 2H, J=7.1 Hz, CH₂), 2.68 (t, 2H, J=7.2 Hz, CH₂), 2.58 (t, 2H, J=7.1 Hz, CH₂), 2.00 (s, 3H, CH₃), 1.95-1.83 (m, 2H, CH₂); ¹³C NMR(CD₃OD, 150 MHz): δ 174.6 (NHCO), 172.5 (CO), 97.5 (C-1), 71.1 (C-3), 69.0 (C-4), 68.3 (C-5), 66.1 (OCH₂), 61.4 (C-6), 50.3 (C-2), 34.5, 29.1, 28.3, 26.6 (4×CH₂)および21.3 ppm (CH₃)。ESI⁺-HRMS: [M+H]⁺ C₁₄H₂₆O₈NSの計算値、368.1374;実測値、368.1377。（図１０）。

【0202】

実施例８：ペンタフルオロフェニル３－｛［３－（２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシル）オキシプロピルチオ｝プロパノエート（化合物９）

【0203】

【化25】

図９を参照すると、化合物８の粗製反応物（５２２．５４ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ、１．０当量）、３－メルカプトプロピオン酸（５２２μＬ、６．０ｍｍｏｌ、３．０当量）およびＤＭＰＡＰ（３１ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、０．０６当量）から、まったく精製せずに、エステル化物を、ＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ（１０ｍＬ、４：１、ｖ／ｖ）中のペンタフルオロフェノール（２．２１０ｇ、１２．０ｍｍｏｌ、６．０当量）およびＥＤＣ・ＨＣｌ（１．７２５ｇ、９．０ｍｍｏｌ、４．５当量）で、室温で１時間処理した。混合物を減圧下で濃縮した。粗製物をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（９：１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）で精製して、エステル化合物９を白色の固体として得た（３２０ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ、３０％）。

【0204】

水（１．０ｍＬ）中の化合物８の精製した酸（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ＴＨＦ（４ｍＬ）およびＥＤＣ・ＨＣｌ（１０４ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ、２．０当量）中のペンタフルオロフェノール（２００ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ、２．０当量）で、室温で１時間処理した。混合物を減圧下で濃縮した。粗製物をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（９：１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）で精製して、エステル化合物９を白色の固体として得た（４９ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、３４％）。Ｒｆ＝０．１８；９：１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ；¹H NMR(CD₃OD, 600 MHz): δ 4.73 (d, 1H, J=3.7 Hz, H-1), 4.25 (dd, 1H, J=11.0, 3.7 Hz, H-2), 3.79 (d, 1H, J=3.2 Hz, H-4), 3.74-3.54 (m, 5H, H-3, H-5, H-6a, H-6b, OCH₂), 3.41 (dt, 1H, J=10.0, 6.0 Hz, OCH₂), 2.95 (t, 2H, J=6.9 Hz, CH₂), 2.81 (t, 2H, J=6.9 Hz, CH₂), 2.64 (t, 2H, J=7.2 Hz, CH₂), 1.89 (s, 3H, CH₃), 1.80 (q, 2H, J=6.7 Hz, CH₂); ¹³C NMR(CD₃OD, 150 MHz): δ 172.5 (NHCO), 168.1 (CO), 97.5 (C-1), 71.1 (C-3), 69.0 (C-4), 68.3 (C-5), 66.0 (OCH₂), 61.4 (C-6), 50.3 (C-2), 33.6, 29.0, 28.3, 26.0 (4×CH₂)および21.2 ppm (CH₃); ¹⁹F NMR(CD₃OD, 564 MHz): δ -(154.86-156.03, m), -(160.90-161.58, m), -(165.33-166.16, m); ESI⁺-LC-MS: [M+H]⁺ C₂₀H₂₅O₈NSF₅の計算値、534.1216;実測値、534.1222, 6.69分。（図１１Ａおよび１１Ｂ）。

【0205】

実施例９：３－｛［３－（２，３，４，６－テトラ－Ｏ－ベンゾイル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）－２－アセトアミド－４，６－Ｏ－ベンジリデン－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシル）オキシプロピル］チオ｝プロパン酸（化合物１０）

【0206】

【化26】

図１２を参照すると、脱気したＴＨＦ（３ｍＬ）中の保護されたアリルＴＦ（化合物６）（６５９ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ、１．０当量）および３－メルカプトプロピオン酸（１８６μＬ、２．１３ｍｍｏｌ、３．０当量）の溶液を、３６５ｎｍの放射線照射下で、室温で、ＤＭＰＡＰ（１１ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ、０．０６当量）と共に、１５分間撹拌した。次いで混合物を減圧下で濃縮し、次いでシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（９８：２：０．０１のＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ）によって精製して、望ましい化合物１０を白色の発泡体として得た（７１２ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ、９７％）；Ｒｆ＝０．２５；９８：２：０．０１のＭｅＯＨ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ；¹H NMR(CDCl₃, 600 MHz): δ 8.05-7.14 (m, 25H), 5.92 (t, 1H, J=7.2 Hz, 1H), 5.85-5.76 (m, 1H), 5.75-5.65 (m, 1H), 5.53-5.47 (m, 1H), 5.45 (d, 1H, J=9.5 Hz), 5.16 (dd, 1H, J=19.2, 11.5 Hz), 5.10-5.02 (m, 1H), 4.71 (d, 1H, J=3.5 Hz), 4.69-4.65 (m, 1H), 4.65-4.60 (m, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.43-4.29 (m, 1H), 4.12-3.97 (m, 1H), 3.88 (td, 1H, J=10.7, 3.3 Hz), 3.67 (ddd, 1H, J=19.3, 12.1, 5.3 Hz), 3.40-3.38 (m, 1H), 3.25 (td, 1H, J=9.5, 2.7 Hz), 2.91-2.82 (m, 1H), 2.73-2.45 (m, 1H)および1.64 ppm (s, 1H); ¹³C NMR(CDC₁₃, 150 MHz): δ 177.07, 175.59, 170.46, 137.73, 133.51, 133.47, 133.41, 133.21, 133.17, 129.90, 129.64, 129.61, 128.57, 128.50, 128.19, 128.03, 125.99, 102.57, 100.45, 98.87, 76.44, 75.58, 72.02, 71.38, 69.41, 69.01, 68.17, 66.82, 63.15, 62.45, 52.49, 36.62, 31.48, 29.54, 28.68, 25.96, 22.55, 20.05および14.03 ppm; ESI⁺-HRMS: [M+Na]⁺ C₅₅H₅₅O₁₇NSNaの計算値、1056.3083;実測値、1056.3116。

【0207】

実施例１０：３－｛［３－（β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）－２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシル）オキシプロピル］チオ｝プロパン酸（化合物１２）

【0208】

【化27】

図１２を参照すると、脱気したＨ_２Ｏ／ＭｅＯＨ（３ｍＬ、１：２、ｖ／ｖ）中のアリルＴＦ（化合物１１）（８５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、１．０当量）および３－メルカプトプロピオン酸（５２μＬ、０．６ｍｍｏｌ、３．０当量）の溶液を、２５４ｎｍの放射線照射下で、室温で一晩撹拌した。次いで混合物を減圧下でシリカゲルを用いて濃縮し、次いで勾配（１００％のＥｔＯＡｃから７：２：１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ）によるシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、望ましい化合物１２を白色の発泡体として得た（８７ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、８２％）。

【0209】

メタノール中の１Ｍナトリウムメトキシド（６ｍＬ、ｐＨ８－９）中の化合物１０（６７２ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を、出発材料が消費されるまで室温で撹拌した。１時間３０分後、溶液をイオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ１２０、Ｈ^＋）の添加によってｐＨ４まで中和し、メタノールで洗浄し、溶液を減圧下で濃縮した。次いで白色の発泡体である中間粗製物を、６ｍＬの６０％酢酸水溶液中で６０℃で１．５時間処理した。溶媒を減圧下で除去し、残留物を、勾配（１００％のＥｔＯＡｃｔｏから７：２：１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ）によるシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーで精製して、望ましい化合物１３を白色の発泡体として得た（３０６ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ、８９％）。Ｒｆ＝０．３４；３：１：０．０１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ；¹H NMR(CD₃OD, 600 MHz): δ 4.83 (d, 1H, J=3.7 Hz, H-1), 4.43 (d, 1H, J=7.6 Hz, H-1’), 4.41 (dd, 1H, J=11.0, 3.7 Hz, H-2), 4.18 (d, 1H, J=2.0 Hz, H-4’), 3.91 (dd, 1H, J=11.1, 3.1 Hz, H-3), 3.87-3.67および3.58-3.43 (m, 11H, H-2’, H-3’, H-4, H-5, H-5’, H-6a, H-6a’, H-6b, H-6b’, OCH₂), 2.92 (t, 2H, J=7.2 Hz, CH₂), 2.77 (t, 2H, J=7.4 Hz, CH₂), 2.68 (t, 2H, J=7.2 Hz, CH₂), 2.53 (t, 2H, J=7.4 Hz, CH₂), 1.98 (s, 3H, CH₃), 1.89 (m, 2H, CH₂); ¹³C NMR(CD₃OD, 150 MHz): δ 174.0 (CO), 106.2 (C-1’), 98.9 (C-1), 78.9, 76.7, 74.7, 72.49, 72.0 (C-3), 70.2 (C-4), 70.0, 67.4 (C-5), 62.7 (OCH₂), 62.5 (C-6), 50.3 (C-2), 37.4, 35.1, 30.5, 29.5, 28.6 (CH₂)および22.8 ppm (CH₃)。ESI⁺-HRMS： [M+H]⁺ C_２０H_３６O_１３NSの計算値、530.1902；実測値、530.1909。（図１３）。

【0210】

実施例１１：ペンタフルオロフェニル３－｛［３－（β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）－２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシル）オキシプロピル］チオ｝プロパノエート（化合物１３）

【0211】

【化28】

水（１．０ｍＬ）中の精製した酸化合物１２（１５９ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、１．０当量）を、アセトニトリル（４ｍＬ）およびＥＤＣ・ＨＣｌ（２５９ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ、４．５当量）中のペンタフルオロフェノール（３３１ｍｇ、１．８０ｍｍｏｌ、６．０当量）で室温で１時間処理した。混合物を、減圧下で、シリカゲルで濃縮した。粗製物を、勾配（１００％のＥｔＯＡｃから６：４のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）によるシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーで精製して、エステル化合物１３を白色の固体として得た（６２ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、３０％）。Ｒｆ＝０．５０；６：４のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ；¹H NMR(CD₃OD, 600 MHz): δ 4.45 (d, 1H, J=7.5 Hz, H-1’), 4.41 (ddd, 1H, J=12.6, 6.1, 2.8 Hz), 4.19 (d, 1H, J=3.0 Hz), 3.92 (dd, 1H, J=11.0, 3.1 Hz), 3.89-3.77 (m, 3H), 3.74 (m, 4H), 3.68 (s, 1H), 3.52 (m, 4H), 3.06 (t,1H, J=6.9 Hz), 2.91 (t, 1H, J=6.9 Hz), 2.77 (dt, 2H, J=15.0, 7.1 Hz), 2.68 (t, 1H, J=7.1 Hz), 2.63 (t, 1H, J=7.0 Hz), 1.99 (s, 1H)および1.95-1.84 ppm (m, 2H); ¹³C NMR(CD₃OD, 150 MHz): δ 172.7 (NHCO), 168.1 (CO), 104.7 (C-1’), 97.6 (C-1), 77.5, 75.3, 73.3, 71.1, 70.6, 69.0, 68.7, 66.0, 61.4, 61.2, 50.9, 48.9, 34.2, 33.6, 29.0, 28.2, 28.2, 26.4, 26.1, 21.5および21.5 ppm; ¹⁹F NMR(CD₃OD, 564 MHz): δ -155.12 (m), -161.21 (m), -165.63 (m); ESI⁺-HRMS: [M+H]⁺ C₂₆H₃₅O₁₃NSF₅の計算値、696.1744;実測値、696.1739。（図１４）。

【0212】

実施例１２：ＢＳＡおよびＣＲＭ１９７へのＰＦＰ－Ｔｎコンジュゲーション
図９を参照すると、ＰＦＰ－Ｔｎ（化合物９）のタンパク質へのコンジュゲーションをＢＳＡおよびＣＲＭ１９７を用いて実証した。ＢＳＡ（脂肪酸非含有、低エンドトキシン；シグマ（Sigma）を、それぞれｐＨを増加させた５種の緩衝液：（１）０．１ＭのＭＥＳおよび１５０ｍＭのｐＨ６のＮａＣｌ；（２）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７；（３）ｐＨ８のＰＢＳ；（４）１５０ｍＭのｐＨ９のＮａＣｌを含む０．１Ｍの炭酸ナトリウム；および（５）１５０ｍＭのｐＨ１０のＮａＣｌ含む０．１Ｍの炭酸ナトリウムのそれぞれで１ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶化した。ＴｎのＢＳＡへのコンジュゲーションを、４００μＬ（６ｎｍｏｌ）のＢＳＡ溶液を、５、１５、５０、または２００当量のＰＦＰ－Ｔｎ（化合物９）（水中の２０ｍＭ）を含有する６０μＬのそれぞれの緩衝液と合わせ、穏やかなボルテックス混合によって９０分かき混ぜることによって開始させた。次いで得られたＢＳＡ－Ｔｎコンジュゲートを、ｐＨ７．４のＰＢＳで、遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０ＫＤａ、アミコン（Amicon））によって洗浄した。タンパク質の濃度をブラッドフォードアッセイによって測定した。コンジュゲートＣＲＭ１９７－Ｔｎを、類似の条件で、最大１５モル当量のＰＦＰ－Ｔｎ（化合物９）を、ｐＨ７．２の０．４Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液中の４ｍｇ／ｍＬの精製したＣＲＭ１９７と共に２時間インキュベートすることによって得た。

【0213】

タンパク質－Ｔｎコンジュゲートを、ウェスタンブロットおよび／またはＥＬＩＳＡによってＴｎ特異的なレクチンであるナヨクサフジ（ＶＶＡ）への反応性に関して分析した。

【0214】

図１５は、ｐＨ６～１０の緩衝液中で、ＢＳＡに対して５０当量のＰＦＰ－Ｔｎの比率で生じたＢＳＡ－ＴｎコンジュゲートのＶＶＡへの反応性を描写する。図１５Ａのウェスタンブロットは、ＢＳＡの分子量（約６６．５ｋＤａ）の領域における優勢の反応性バンドを示し、これは、ＴｎコンジュゲーションがｐＨ６からの１０の範囲の全ての５種の緩衝液で生じたことを示す。ｐＨ８条件でより高い強度およびよりわずかに遅い移動のバンドが検出されたことから、より高いレベルのＴｎのＢＳＡへのコンジュゲーションが、試験された他のｐＨよりｐＨ８でより有効な反応をもたらしたことが示唆される。ｐＨ８におけるＢＳＡ－ＴＦのＶＶＡへのより高い反応性もＥＬＩＳＡによって確認された（図１５Ｂ）。

【0215】

図１５Ｃは、最適な８のｐＨにおけるＢＳＡへのコンジュゲーションに対するＰＦＰ－Ｔｎ（化合物９）の滴定を示す。ウェスタンブロットによって、ＢＳＡに対して最小限の１５モル当量のＰＦＰ－Ｔｎを用いて生成したＶＶＡ反応性ＢＳＡ－Ｔｎ種を検出した。ＢＳＡに対するＰＦＰ－Ｔｎの比率を５０および２００モル当量に増加させたところ、ＢＳＡにコンジュゲートしたＴｎのより高いレベルのために起こるバンド強度の対応する増加およびゲルにおけるより遅い移動がみられた。ＰＦＰ－Ｔｎの量と得られたＢＳＡ－Ｔｎコンジュゲートの反応性との相関もＥＬＩＳＡによって観察された（図１５Ｄ）。ＥＬＩＳＡはさらに、この相関が、５から２００当量のＰＦＰ－Ｔｎにかけて直線的であることを実証したことから、ＢＳＡ上のＰＦＰ－Ｔｎコンジュゲーション部位が飽和していなかったことが示唆される。

【0216】

図１５Ｅは、 ＣＲＭ１９７－Ｔｎのウェスタンブロット分析を示す。ブロットから、試験されたＰＦＰ－Ｔｎの３つのコンジュゲーション比率（すなわち、３．４、９．７、および１５）につきＣＲＭ１９７の分子量（約５８．４ｋＤａ）の範囲に単一のＶＶＡ反応性バンドがあることが明らかになり、これら３種のうち最も反応性の種が、１５当量の最も高いＰＦＰ－Ｔｎ比率で生じた。

【0217】

１５当量のＰＦＰ－ＴｎとコンジュゲートしたＣＲＭ１９７の質量分析を質量分析によってさらに分析し、コンジュゲーション確認した（データは示されない）。

【0218】

実施例１３：ＢＳＡへのＰＦＰ－ＴＦコンジュゲーション
ＰＦＰ－ＴＦ（化合物１３）のタンパク質へのコンジュゲーションを、ＢＳＡを用いて実証した。ＢＳＡ（脂肪酸非含有、低エンドトキシン；シグマ）を、ｐＨ８のＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶化し、４００μＬ（６ｎｍｏｌ）を、５、１５、５０、または２００当量のＰＦＰ－ＴＦ（水中の２０ｍＭ）を含有する６０μＬのｐＨ８のＰＢＳと混合し、次いで穏やかなボルテックス混合によって９０分かき混ぜた。得られたＢＳＡ－ＴＦコンジュゲートを、ｐＨ７．４のＰＢＳで、遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０ｋＤａ、アミコン）によって洗浄した。タンパク質の濃度をブラッドフォードアッセイによって測定した。

【0219】

図１６は、ＴＦ特異的なレクチンであるピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）に対する得られたＢＳＡ－ＴＦコンジュゲートの反応性およびコンジュゲートした二糖ＴＦ抗原からのガラクトース糖の投薬量を示す。図１６Ａに示されるウェスタンブロットから、ＢＳＡ単量体の期待される分子量の範囲内のＰＮＡに反応性を有する優勢なバンドが明らかになったことから、ＴＦのＢＳＡへのカップリングが示される。ゲルもまた、ＢＳＡに対するＰＦＰ－ＴＦの比率を５０および２００モル当量に増加させたところ、より高いレベルのＴＦのＢＳＡへのコンジュゲートの結果起こる、それに対応するバンド強度における増加およびゲルにおけるより遅い移動をもたらしたことを示した。１５～２００当量のＰＦＰ－ＴＦと得られたＢＳＡ－Ｔｎコンジュゲートの反応性との間の直線状の相関もＥＬＩＳＡによって観察されたことから（図１６Ｂ）、ＢＳＡ上のＰＦＰ－ＴＦコンジュゲーション部位がこれらの条件下で飽和していないことが示唆される。デュボアの方法によりＢＳＡに会合するガラクトースを測定することによって、ＴＦのＢＳＡへのコンジュゲーションも実証された。図１６Ｂの棒グラフは、ＢＳＡ－ＴＦのＰＮＡ反応性に応じてガラクトースの量が増加すること、およびコンジュゲーションが２００当量のＰＦＰ－ＴＦを用いて実行される場合、ＢＳＡに対して４５の比率が達成されることを示す。

【0220】

実施例１４：ＣＯＯＨ－ＴｎおよびＣＯＯＨ－ＴＦのＣＲＭ１９７およびｄＴＴへのコンジュゲーション
ＣＯＯＨ－ＴｎおよびＣＯＯＨ－ＴＦのタンパク質へのコンジュゲーションを、ＣＲＭ１９７およびｄＴＴを用いて実証した。まず、ＣＯＯＨ－Ｔｎ（化合物８）およびＣＯＯＨ－ＴＦ（化合物１２）を、０．１Ｍで水中に溶解した糖抗原を、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチル－カルボジイミド（ＥＤＣ、シグマ－アルドリッチおよびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、シグマ－アルドリッチ）の２当量の０．１Ｍの水溶液のそれぞれと合わせ、室温で最低限３０分ボルテックス混合することによってスクシンイミド化した。次いで得られた化学的に反応性の抗原を、ｐＨ８のＰＢＳで最大４回希釈し、ｐＨ８のＰＢＳ中のタンパク質溶液に５０当量を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で添加することによって、タンパク質へのカップリングを開始させた。この溶液を３０～１２０分ボルテックス混合し、その後、得られたタンパク質－抗原コンジュゲートを、ｐＨ７．４のＰＢＳを用いて膜ろ過（アミコン、ＭＷＣＯ３０，０００Ｄａ）によって洗浄した。タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイによって測定した。

【0221】

図１７は、ゲル電気泳動によるタンパク質単独および得られたコンジュゲートの移動、ならびにウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによるレクチンＶＶＡ（Ｔｎ特異的）およびＰＮＡ（ＴＦ特異的）へのそれらの反応性を示す。コンジュゲートのクーマシー染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（図１７Ａ）は、コンジュゲートしたタンパク質が天然のコンジュゲートしていないタンパク質と同様に移動することを示し、これは、ＴｎまたはＴＦへのタンパク質コンジュゲーションの結果として凝集または分解が存在しないことを示す。ウェスタンブロット（図１７Ｂ）は、タンパク質コンジュゲートのＶＶＡまたはＰＮＡレクチンへの特異的な反応性を示し、これは、ＴｎまたはＴＦのカップリングを示す。レクチンへの特異的な反応性の同じパターンもＥＬＩＳＡによって観察された（図１７Ｃ）。

【0222】

実施例１５：ネオ複合糖質ｄＴＴ－ＴＦで免疫化されたマウスからの血清の免疫反応性の特徴付け
複合糖質ｄＴＴ－ＴＦを実施例１４に記載されたように調製し、ｐＨ７．４のＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに希釈し、等しい体積のＴｉｔｅｒＭａｘ（商標）ゴールド（シグマアルドリッチ）で乳化した。合計１２匹のマウスに、５回の免疫化にわたり２週毎に、８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの左および右大腿部に２５μＬの調合物を筋肉内注射した。マウスから事前に採血して免疫前の血清のサンプルを収集し、次いで各免疫化の１週間後に採血した。

【0223】

血清をＥＬＩＳＡによって試験して、抗ＴＦまたは抗Ｔｎ抗体の力価を評価した。９６－ウェルプレート（ヌンク（Nunc）、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標））を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中１μｇ／１００μＬの濃度で、指定されたスクリーニング抗原：ＢＳＡ－ＴｎおよびＢＳＡ－ＴＦ（実施例１４に記載された通り）、またはポリアクリルアミド［ＰＡＡ］－ＴｎおよびＰＡＡ－ＴＦ（グリコテック（GlycoTech）、米国）でコーティングした。室温で１時間のインキュベーションの後、コーティングされたウェルを、ＰＢＳ－トウィーン（ＰＢＳ－Ｔ）０．０５％で洗浄し、ＰＢＳ－Ｔ０．０５％＋１％ＢＳＡで３０分ブロックした。ＰＢＳ－トウィーン（Tween）０．０５％で洗浄した後、ウェルを、ＰＢＳ－トウィーン０．０５％での血清の１／２００希釈物と共に１時間インキュベートした。次いでウェルを洗浄し、ＰＢＳ－トウィーン０．０５％で１／１０００希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰと共に３０分インキュベートした。マウス抗体の結合を、ＨＲＰ比色基質ウルトラ－ＴＭＢ（サーモ（Thermo））、続いて反応を止めるための等しい体積の０．５Ｍ硫酸を添加することによって測定した。プレートリーダーで、ＯＤ_４５０でプレートを読んだ。ｄＴＴ－ＴＦでの少なくとも５回の免疫化受けた１２匹のマウスのうち、６匹のマウスの血清で著しいレベルの抗ＴＦ抗体がＥＬＩＳＡによって検出された。

【0224】

【表2】

表１および図１８は、ｄＴＴ－ＴＦでの３回の免疫化後の２種のマウス（Ａ１およびＡ２）からの血清のＥＬＩＳＡの結果、加えてそれらそれぞれの免疫前血清に従って正規化したデータを示す。結果は、マウスＡ１からの血清が、ＴＦおよびＴｎスクリーニング抗原の全てと反応したことを示し（対応する免疫前血清に対して６．５倍～３２．５倍の増加の範囲）、最も高い反応性はＢＳＡ－ＴＦで観察された（対応する免疫前血清に対して３２．５倍の増加）。マウスＡ２からの血清は、ＴＦスクリーニング抗原（ＢＳＡ－ＴＦおよびＰＡＡ－ＴＦ）の両方と反応性を示したが、担体タンパク質にコンジュゲートしたＴｎ抗原は一方のみであった（Ｔｎ－ＢＳＡ）。これらの結果は、ネオ複合糖質ｄＴＴ－ＴＦでの免疫化は、担体とは無関係に、ＴＦ炭水化物抗原に対する抗体の生産をうまく誘導したことを示す。さらにこれらの結果は、生産された抗ＴＦ抗体の少なくとも一部は、ＴＦ抗原内の潜在的なエピトープであるＴｎ抗原と交差反応性を有することを示唆する（図１）。

【0225】

図１９Ａおよび１９Ｂは、スクリーニング抗原としてＢＳＡ－ＴＦを使用したｄＴＴ－ＴＦでの５回目の免疫化の後および５回目の免疫化の６週後に採取された２種のマウスからの連続的に希釈した血清（１：１００～１：１，０００，０００）のＥＬＩＳＡを示す。曲線は、最後の免疫化から６週間後に抗体力価が低減しないことを示し、長期の抗体半減期が示される。スクリーニング抗原としてＰＡＡ－ＴＦを使用して類似の結果が観察された（データは示されない）。

【0226】

実施例１６：高分解能質量分析によって特徴付けられたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質サブユニットＳ１の定量的なＯ－グリコシル化プロファイル
Ｓ１タンパク質の調製
還元サンプル緩衝液中のトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（レイバイオテック（RayBiotech）、米国）の無血清細胞培養上清からの、２７μＬのＣ末端にＨｉｓタグを有する組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１サブユニットを、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥでの電気泳動によって分離した。ゲルをクーマシーブルーＧ－２５０で染色した。７５ｋＤａ以上に相当するレーンの区画を清潔なベンチで１０個の断片に切断し、各断片をさらに１ｍｍ^３の断片に切断した。

【0227】

ゲル断片の調製
ゲル断片をまず水で５分洗浄し、脱色緩衝液（１００ｍＭのチオ硫酸ナトリウム、３０ｍＭのフェリシアン化カリウム）で１５分間、２回脱色した。脱色の後、炭酸水素アンモニウム緩衝液（５０ｍＭ）で追加の５分の洗浄を実行した。次いでゲル断片をアセトニトリル（ＡＣＮ）で脱水した。タンパク質のシステインのジスルフィド基を、４０℃で３０分にわたり還元緩衝液（１０ｍＭのジチオスレイトール（Dithiothreiol）（ＤＴＴ）、１００ｍＭの炭酸水素アンモニウム）を添加することによって還元した。次いで生成した遊離スルフヒドリル基を、暗所で、４０℃で２０分にわたりアルキル化緩衝液（５５ｍＭのヨードアセトアミド、１００ｍＭの炭酸水素アンモニウム）を添加することによってアルキル化してＳ－カルボキシアミドメチルにした。次いでゲル断片を脱水し、５分にわたりアセトニトリルを添加することによって４０℃で洗浄し、その後、試薬の全てを捨てた。

【0228】

タンパク質分解消化およびペプチド抽出工程
ゲル断片を４０℃で５分乾燥させ、次いでトリプシン溶液（プロメガ（Promega）からの６ｎｇ／μＬのトリプシン［シーケンシンググレード］、２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム）で、４℃で４０分再水和した。タンパク質消化を５８℃で１時間実行し、１５μＬの１％ギ酸／２％アセトニトリルを添加することによって止めた。次いで上清を９６－ウェルプレートに移し、抽出緩衝液（１％ギ酸／５０％ＡＣＮ）を使用した２回の室温で３０分の抽出工程を用いてペプチド抽出を実行した。全てのペプチド抽出物を真空遠心分離機中で十分に乾燥させた。

【0229】

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの前に、タンパク質消化物を、１０μＬの１％ＡＣＮ／０．５％ギ酸中で１５分かき混ぜながら再可溶化した。長さ１５ｃｍ、内径７５μｍのＳｅｌｆ－Ｐａｃｋ ＰｉｃｏＦｒｉｔ（商標）石英ガラスキャピラリーカラム（ニューオブジェクティブ（New Objective）、マサチューセッツ州ウォバーン）に、Ｃ１８ Ｊｕｐｉｔｅｒ（商標）（５μｍ、３００Å）逆相材料（フェノメネックス（Phenomenex）、カリフォルニア州トランス）を充填した。このカラムをＥａｓｙ－ｎＬＣ（商標）ＩＩシステム（プロキセオン・バイオシステムズ（Proxeon Biosystems）、オーデンセ、デンマーク）に取り付け、Ｎａｎｏｓｐｒａｙ Ｆｌｅｘ（商標）イオンソース（サーモフィッシャー・サイエンティフィック（Thermo-Fisher Scientific））を備えたＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ブレーメン、ドイツ）に連結した。クロマトグラフィーに使用した緩衝液は、０．２％ギ酸（緩衝液Ａ）および１００％アセトニトリル／０．２％ギ酸（緩衝液Ｂ）であった。ペプチドを、２つの傾きの勾配で、２５０ｎＬ／分の流束で溶出させた。まず溶媒Ｂを７５分で１から３５％に増加させ、次いで１５分で３５からの８６％に増加させた。ナノスプレーおよびＳ－レンズ電圧を、それぞれ１．３～１．７ｋＶおよび５０Ｖに設定した。キャピラリー温度を、２２５℃に設定した。プロファイルモードでのフルスキャンＭＳサーベイスペクトル（３６０～１５６０ｍ／ｚ）を、Ｏｒｂｉｔｒａｐで、８ｅ５に設定された標的値を用いて、１２００００の解像度で捕捉した。データ依存性ＭＳ／ＭＳ分析のために３秒のサイクル時間を使用した。この場合、選択された前駆体イオンをＨＣＤ（高エネルギーＣ－トラップ解離）衝突セルで断片化し、３００００に設定された解像度を用いて、７ｅ４における標的値および２８Ｖにおける正規化した衝突エネルギーを用いたＯｒｂｉｔｒａｐで分析した。オキソニウムイオンの検出において、それに続くＣＩＤ（衝突誘導解離）を使用したＭＳ／ＭＳ分析をＯｒｂｉｔｒａｐで実行した。ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のペプチド３２０～３２８の全ての公知の形態に対して組入れリストも使用した。ＳＩＭ（単一イオンモニタリング）および標的化ＭＳ２方法を使用することによって、これらのペプチドに第２系列の分析を実行した。

【0230】

データ分析
タンパク質データベース検索を、Ｕｎｉｐｒｏｔタンパク質データベース（２０１７－０４－１１）に対して、Ｍａｓｃｏｔ２．６（マトリックスサイエンス（Matrix Science））を用いて実行した。前駆体および断片イオンの質量許容差を、それぞれ１０ｐｐｍおよび０．６Ｄａに設定した。指定された酵素はトリプシンであり、切断され損ねたものが許容された。固定された修飾としてシステインのカルバミドメチル化が指定され、可変の修飾としてメチオニン酸化が指定された。Ｍａｓｃｏｔ２．６およびＢｙｏｓ３．８（プロテインメトリクス（Protein Metrics））を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列に対して第２系列の検索を実行した。指定された酵素はセミトリプシンであり、切断され損ねたものが許容された。固定された修飾として、システインのカルバミドメチル化が指定された。可変の修飾として、ペプチド３２０～３２８のメチオニン酸化および全ての公知のＯ－グリコシル化形態を使用した。

【0231】

図２０は、７５ｋＤａを超えるタンパク質の高分解能ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって特徴付けられたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１タンパク質からのペプチドＶＱＰＴＥＳＩＶＲ（配列番号３）の定量的なＯ－グリコシル化プロファイルを示す。図２１は、７５～１００ｋＤａのタンパク質の高分解能ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって行われた同じ分析を示す。個々のグリカンのグラフ表示の記号名称は以下の通りである（Varkiら、2015）：黄色の四角＝ＧａｌＮＡｃ、黄色の丸＝Ｇａｌ、紫色のひし形＝Ｎｅｕ５Ａｃ（シアル酸）。ＴＦは、二糖Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃによって形成される。この図は、グリコシル化されたペプチドの異なるパターンを示し、優勢種はジシアリル－ＴＦであり、２番目の最も豊富な種はＴＦである。

【0232】

実施例１７：ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットによる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１およびＳタンパク質への抗Ｔｎおよび抗ＴＦリガンドの反応性
９６ウェルプレートのウェルを、空のベクター、またはＣ末端Ｈｉｓ－タグを有する組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１（スパイクタンパク質のＳ１サブドメイン；レイバイオテック、米国、カタログ番号２３０－２０４０７）もしくはＳ（全長スパイクタンパク質；ＮＲＣ、カナダ）のいずれかをコードするＤＮＡのいずれかでトランスフェクトされた哺乳類細胞の無血清培養上清１０μＬを含有する１００μＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４で１時間コーティングした。次いでウェルをＰＢＳ－トウィーン０．０５％で洗浄し、ＰＢＳ－Ｔ０．０５％＋１％ＢＳＡで３０分ブロックした。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔ０．０５％で洗浄し、ＰＢＳ－Ｔ０．０１％中の指定された抗ＴＦ（ＪＡＡ－Ｆ１１ ＩｇＧ、１μｇ／ｍＬ；ＳＰＭ３２０ ＩｇＭ、アブノヴァ（Abnova）、カタログ番号ＭＡＢ１３２０７、０．２ｍｇ／ｍＬ、１：１００の希釈物）または抗Ｔｎ（Ｔｎ２１８ ＩｇＭ、アブノヴァ、カタログ番号ＭＡＢ６１９８、１：１００の希釈物）抗体と共にさらに１時間インキュベートし、それに続いて、ＰＢＳ－Ｔ中のそれらの適切なＨＲＰ結合二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰまたはヤギ抗マウスＩｇＭ－ＨＲＰ；ジャクソン・イムノ（Jackson Immuno）、１／１０００）と共に３０分インキュベートした。ＨＲＰ比色基質であるウルトラＴＭＢ（サーモ（Thermo））を用いてリガンドの結合を明らかにした。等しい体積の０．５Ｍ硫酸を添加することによって反応を止め、光学密度を、プレートリーダー（バイオテック（Biotek））において、４５０ｎｍで測定した。図２２に示される結果は、各抗体についての、空のベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞からの上清のＯＤ_４５０に対する、組換えＳ１またはＳタンパク質を発現するＨＥＫ細胞からの上清のＯＤ_４５０の増加倍数である。示される増加倍率は、少なくとも６つの別々の実験の平均を表し、エラーバーは、標準誤差を表す。昆虫（Ｓｆ９）細胞（Ｓ１－Ｈｉｓ、シノバイオロジカル（SinoBiological）、カタログ番号４０５９１－Ｖ０８Ｂ１）から発現された組換えＳ１タンパク質を使用して実験を繰り返し、結果から、ＪＡＡ－Ｆ１１で３．３２±１．３５、ＳＰＭ３２０で５．５０±１．８０、およびＴｎ２１８で１．７７±０．６４の平均増加倍率を得た（３つの実験の平均±ＳＥＭ）。

【0233】

上記のものと類似したＥＬＩＳＡ実験を、空のベクター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１タンパク質をコードするＤＮＡ、または全長Ｓタンパク質をコードするＤＮＡ（上記を参照）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の無血清培養上清を使用したＨＲＰ結合レクチンのパネルを用いて実行した。レクチンパネルは、以下：ラッカセイ（Arachis hypogaea）（ＰＮＡ；カタログ番号：Ｈ－２３０１－１）、ナヨクサフジ（ＶＶＡ；カタログ番号：Ｈ－４６０１－１）、オニサルビア（Salvia sclarea）（ＳＳＡ；カタログ番号：Ｈ－３５０１－１）、イヌエンジュ（Maackia amurensis）（ＭＡＡ；カタログ番号：Ｈ－７８０１－１）、マクルラ・ポミフェラ（Maclura pomifera）（ＭＰＡ；カタログ番号：Ｈ－３９０１－１）からのレクチンを含んでいた。全てのレクチンをＥＹラボラトリーズ（EY Laboratories）（米国カリフォルニア州；１ｍｇ／ｍＬ、ＨＲＰ結合）から購入し、ＰＢＳ－トウィーン０．０１％中の１０μｇ／ｍＬで使用した。図２３に示される結果は、各レクチンについての、空のベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞からの上清のＯＤ_４５０に対する、組換えＳ１またはＳタンパク質を発現するＨＥＫ細胞からの上清のＯＤ_４５０の増加倍数である。示される増加倍率は、少なくとも７つの別々の実験の平均を表し、エラーバーは、標準誤差を表す。昆虫（Ｓｆ９）細胞（Ｓ１－Ｈｉｓ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号４０５９１－Ｖ０８Ｂ１）から発現された組換えＳ１タンパク質を使用して実験を繰り返し、結果から、ＰＮＡで２２．６７±１２．５２、ＶＶＡで２２．５１±９．７１、ＳＳＡで３．９７±１．０９、ＭＡＡで４．３０±１．２３、およびＭＰＡで７．５１±３．６４の平均増加倍率を得た。

【0234】

ウェスタンブロッティングのために、還元サンプル緩衝液中の、Ｃ末端にＨｉｓタグを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１をコードするＤＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の２μＬの無血清培養上清を、１０％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。次いで、抗グリカンレクチン、抗体、および血清を用いたウェスタンブロットによる分析のために、タンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。抗グリカンの反応性を、対照として対応する条件下における抗Ｈｉｓタグ抗体の反応性と比較した。ＰＮＡ、ＶＶＡ、およびＪＡＡ－Ｆ１１ ｍＡｂで検出されたバンドは、対照抗ＨｉｓタグＡｂで検出されたものと類似していたことから、それらが同じＳ１タンパク質を認識することが示唆される（データは示されない）。マウスＡ１免疫血清（実施例１５）も、免疫前の血清のプールと比較してＳ１を強く検出した。

【0235】

まとめると、この実施例における結果は一貫して、炭水化物抗原ＴｎおよびＴＦが、異なる発現系によって生産された組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１およびＳタンパク質上に存在すること、およびこれらの抗原が、抗Ｔｎおよび抗ＴＦリガンドによる結合のために接近可能であることを示す。

【0236】

実施例１８：Ｏ－グリカンリガンドによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓを発現するシュードタイプ化ウイルスの感染力の細胞阻害
図２４は、Ｓが結合する受容体であるヒトアンジオテンシン変換酵素２（２９３Ｔ－ＡＣＥ２）を発現する２９３Ｔ細胞に対するシュードタイプ化レンチ－ｌｕｃ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓウイルスの相対的な感染力を示す。ウイルスをまず、抗グリカンレクチンＰＮＡ、ＡＩＡ（ｊａｃ）［ジャカリンレクチン（パラミツ）、およびモノクローナル抗ＴＦ抗体ＪＡＡ－Ｆ１１を含む連続希釈物と共に３７℃で１時間プレインキュベートした。次いで混合物を、９６－ウェルプレートにシーディングした２９３Ｔ細胞に添加し、２時間インキュベートした。次いで培地を新鮮な培地と交換し、さらに２日インキュベートした。次いでルシフェラーゼ活性を測定した。図２４は、レクチンＰＮＡおよびＡＩＡが、濃度依存性の方式で、シュードタイプ化レンチ－ｌｕｃ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓウイルスの２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞に感染する能力を阻害したことを示す。ＪＡＡ－Ｆ１１の最大濃度のみがある程度の感染力阻害を示した。

【0237】

興味深いことに、ＡＩＡ（ジャカリン）レクチンは、それらのシアル化されたまたはシアル化されていない形態のいずれかでＴＦおよびＴｎ抗原の両方に結合特異性を有することがわかっており、一方でＰＮＡレクチン（末端ベータ－ガラクトースに結合親和性を有する）は、そのシアル化されていない形態でのみＴＦ抗原と結合することがわかっている（Liら、2010）。同様に、ＪＡＡ－Ｆ１１抗体は、ＴＦ抗原のシアル化されていない形態にのみ結合することがわかっている。したがって、図２３に示されるＰＮＡおよびＪＡＡ－Ｆ１１と比較してＡＩＡのより有効な阻害作用は、図２０および図２１に示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１タンパク質上で検出されたＯ－グリコシル化された形態の分布、加えて図２２および図２３に示される異なる抗Ｔｎおよび抗ＴＦリガンドの相対的な反応性と一致する。

【0238】

この実施例における結果は、シュードタイプ化ウイルス粒子の状態で発現されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓタンパク質が、実際に、抗ＴＦおよび／または抗Ｔｎリガンドによる結合に接近可能な表面ＴＦおよびＴｎ炭水化物抗原を含有することを示唆する。この実施例における結果はさらに、生存可能なシュードウイルス粒子の状態で発現されるＳタンパク質の表面上のＯ－グリカンのリガンド結合、さらに特定にはレクチンＰＮＡおよびＡＩＡによる結合が、ＣＯＶＩＤ－１９に対する予防的および／または治療的介入にとって見込みのある戦略であり得ることを示唆する。

【0239】

参考文献
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【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

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