特許 7738390 フローセル

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-09-04

(45)【発行日】2025-09-12

(54)【発明の名称】フローセル

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20250905BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20250905BHJP

   G01N 35/08 20060101ALI20250905BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20250905BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A

C12Q1/68

G01N35/08 A

G01N37/00 101

G01N37/00 102

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2020572464

(86)(22)【出願日】2020-01-23

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-14

(86)【国際出願番号】 US2020014771

(87)【国際公開番号】W WO2020159794

(87)【国際公開日】2020-08-06

【審査請求日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】62/798,348

(32)【優先日】2019-01-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514202402

【氏名又は名称】イラミーナ インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100181847

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 かおり

(72)【発明者】

【氏名】ルイス ジェー クラフト

(72)【発明者】

【氏名】タルン クマール クラナ

(72)【発明者】

【氏名】ヤー－シャン ウー

(72)【発明者】

【氏名】シージュン チェン

(72)【発明者】

【氏名】アーノード ライヴァル

(72)【発明者】

【氏名】ジャスティン フラートン

(72)【発明者】

【氏名】エム シェーン ボーエン

(72)【発明者】

【氏名】フイ ハン

(72)【発明者】

【氏名】ジェフリー エス フィッシャー

(72)【発明者】

【氏名】ヤサマン ファーシチ

(72)【発明者】

【氏名】マシュー レッサール ヴィガー

【審査官】田畑 利幸

(56)【参考文献】

【文献】特表平０９－５０４８６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／１１９１０１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／２０８５６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０３１８０１６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０３１８０１７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２００９－００２９５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－２２７６４６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ １／００－ ３／１０

Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００

Ｇ０１Ｎ ３５／００－３７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

基材と、
該基材上または基材内に画定された複数のチャンバと、
前記基材内および前記複数のチャンバの各々の周囲内に画定される複数の凹部であって、該複数の凹部は間質領域によって分離され、各前記凹部が底面を有する、複数の凹部と、
前記複数の凹部の各々の内部の前記底面に付着された増幅プライマーと、
前記複数のチャンバの各々の内部に配置された捕捉部位と、
を含み、該捕捉部位は、複合体または試料の局在化のために物理的および／または化学的に修飾されたフローセルの一部であり、かつ、
（ｉ）基材内に画定されるウェルであり、該ウェルは、前記複数の凹部の各々の開口部寸法よりも大きい開口部寸法を有する、
（ｉｉ）その表面に化学捕捉剤を有する突起である、または
（ｉｉｉ）前記間質領域の一部に配置された化学捕捉剤を含み、
該化学捕捉剤は、複合体または試料に接着、保持、または結合するための材料、分子または部分である、フローセル。

【請求項2】

前記捕捉部位が基材内に画定されるウェルである場合、前記ウェル内に化学捕捉剤をさらに含む、請求項１に記載のフローセル。

【請求項3】

前記捕捉部位が基材内に画定されるウェルである場合、前記ウェル内に捕捉ビーズをさらに含み、前記捕捉ビーズが化学捕捉剤で被覆されている、請求項１に記載のフローセル。

【請求項4】

前記基材上に配置された疎水性材料をさらに含み、該疎水性材料が前記複数のチャンバの各々を画定する、請求項１、２、または３のいずれかに記載のフローセル。

【請求項5】

前記複数のチャンバの各々は、隣接するチャンバ間の放出されたライブラリフラグメントの横方向拡散を遮断するのに十分な高さを有する、請求項１、２、３、または４のいずれかに記載のフローセル。

【請求項6】

前記各凹部にポリマー層をさらに含み、前記増幅プライマーが前記ポリマー層に付着している、請求項１、２、３、４、または５のいずれかに記載のフローセル。

【請求項7】

前記複数のチャンバの各々は、１μm～１０００μmの範囲の開口部寸法を有し、
前記複数の凹部のそれぞれは、１nm～２μmの範囲の開口部寸法を有し、
前記チャンバの開口部寸法は、前記凹部の開口部寸法よりも大きい、請求項１、２、３、４、５、または６のいずれかに記載のフローセル。

【請求項8】

前記複数のチャンバは、前記基材を横切る第１のパターンで配置され、
前記複数の凹部の各サブセットは、前記チャンバの各内部で第２のパターンで配置される、請求項１、２、３、４、５、６、または７のいずれかに記載のフローセル。

【請求項9】

前記複数のチャンバは、前記基材にパターニングされる、請求項１、２、３、４、５、６、７、または８のいずれかに記載のフローセル。

【請求項10】

複数のチャンバと、
該複数のチャンバの各々の内部の複数の凹部であって、該複数の凹部は間質領域によって分離され、各前記凹部が底面を有する、複数の凹部と、
該複数の凹部の各々の内部の前記底面に付着された増幅プライマーと、
前記複数のチャンバの各々における捕捉部位と、
を含むフローセルに、複数の複合体を導入することであって、
前記捕捉部位は、
（ｉ）前記複数の凹部の各々の開口部寸法よりも大きい開口部寸法を有するウェルである、
（ｉｉ）その表面に化学捕捉剤を有する突起である、または
（ｉｉｉ）前記間質領域の一部に配置された化学捕捉剤を含み、
前記複合体の各々は、
担体と、
該担体に付着した、または該担体内に含有された配列決定可能な核酸フラグメントであって、これにより、前記複合体の１つが、前記複数のチャンバのうちの少なくともいくつかにおいて、前記捕捉部位のうちの各１つに付着する、配列決定可能な核酸フラグメントと、
を含む、複数の複合体の導入することと、
前記複合体の各々の担体に、前記配列決定可能な核酸フラグメントをそこから放出させ、これにより、各チャンバの壁が、前記配列決定可能な核酸フラグメントの輸送および播種を、各チャンバ内の各凹部に制限することと、
を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１月２９日に出願された米国仮出願第６２／７９８，３４８号の利益を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的分子からフラグメント化およびタグ化ＤＮＡ分子のライブラリを作製することが望ましい様々な方法および用途がある。しばしば、目的は、ＤＮＡ配列決定反応における鋳型として使用するために、より大きなｄｓＤＮＡ分子からより小さなＤＮＡ分子（例えば、ＤＮＡフラグメント）を生成することである。テンプレートは、取得される短い読み取り（リード）長であることとしてもよい。データ解析の間、オーバーラップする短い配列読み取りを整列させて、より長い核酸配列を再構成することができる。いくつかの例では、配列決定前のステップ（特定の核酸分子のバーコード化など）を使用して、データ解析を簡略化することができる。

【発明の概要】

【0003】

本明細書に開示される第１の態様は、基材と、基材上または基材内に画定される複数のチャンバと、基材内および複数のチャンバの各々の周囲内に画定される複数の凹部であって、凹部が間質領域（格子間領域）によって分離される複数の凹部と、複数の凹部の各々の内部に付着されるプライマーと、複数のチャンバの各々の内部に位置する捕捉部位とを含むフローセルである。

【0004】

第１の態様の一例では、捕捉部位は、基材内に画定されるウェルであり、ウェルは、複数の凹部の各々の開口部寸法よりも大きい開口部寸法を有する。一実施形態では、フローセルは、ウェル内に化学捕捉剤をさらに含む。別の例では、フローセルは、ウェル内に捕捉ビーズをさらに含み、捕捉ビーズは化学捕捉剤でコーティングされる。

【0005】

第１の態様の一例では、捕捉部位は、表面に化学捕捉剤を有する突出部である。

【0006】

第１の態様の一例では、捕捉部位は、間質領域の一部上に配置された化学捕捉剤を含む。

【0007】

第１の態様の一例では、フローセルは、基材上に配置された疎水性材料をさらに含み、疎水性材料は、複数のチャンバの各々を画定する。

【0008】

第１の態様の一例では、複数のチャンバの各々は、隣接するチャンバ間の放出されたライブラリフラグメントの横方向拡散を遮断するのに十分な高さを有する。

【0009】

第１の態様の一例では、フローセルは、凹部の各々にポリマー層をさらに含み、プライマーはポリマー層に付着される。

【0010】

第１の態様の一例では、複数のチャンバの各々は、約１μｍ～約１０００μｍの範囲の開口部寸法を有し、複数の凹部の各々は、約１ｎｍ～約２μｍの範囲の開口部寸法を有し、チャンバ開口部寸法は、凹部開口部寸法よりも大きい。

【0011】

第１の態様の例では、複数のチャンバは、基材を横切る第１のパターンで配置され、複数の凹部の各のサブセットは、チャンバの各内で第２のパターンで配置される。

【0012】

第１の態様の例では、複数のチャンバは、基材内にパターン化される。

【0013】

本明細書に開示されるフローセルの任意の特徴は、任意の望ましい方法および／または構成で一緒に組み合わされ得ることを理解されたい。

【0014】

本明細書に開示される第２の態様は、複数のチャンバと、複数のチャンバの各々の内部の複数の凹部と、複数の凹部の各々の内部に付着されたプライマーと、複数のチャンバの各々の内部の捕捉部位とを含む、複数の複合体をフローセルに導入することを含む方法であり、ここで、前記複合体の各々は、担体と、前記担体に結合されるか、または前記担体内に含まれる配列決定可能な核酸フラグメントとを含み、前記複合体の１つは、前記複数のチャンバのうちの少なくともいくつかにおいて、前記捕捉部位のそれぞれの１つに結合し、前記複合体の前記担体は、前記配列決定可能な核酸フラグメントをそこから放出させ、それによって、前記それぞれのチャンバの壁は、前記配列決定可能な核酸フラグメントの輸送および播種（シーディング）を、前記それぞれのチャンバ内のそれぞれの凹部に制限する。

【0015】

この方法の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、この方法および／またはフローセルの特徴の任意の組み合わせは、一緒に、および／または本明細書に開示される任意の実施例と組み合わせることができることを理解されたい。

【0016】

本明細書に開示される第３の態様は、複合体の平均直径の少なくとも約５０％である深さをそれぞれ有する複数のチャンバと、前記複数のチャンバのそれぞれ内に付着されたプライマーとを含むフローセルに複数の複合体を導入することを含み、前記複数の複合体のそれぞれは、担体と、前記担体に付着または内包された同じ鋳型核酸からの配列決定可能な核酸フラグメントとを含み、それにより、前記複合体の少なくともいくつかは、前記複数のチャンバの少なくともいくつかに捕捉され；前記フローセルから非捕捉複合体を洗い流し；前記フローセルに外部固定化剤を導入することなく、捕捉された複合体の担体が、各複合体が捕捉された前記各チャンバ内に前記配列決定可能な核酸フラグメントを放出させ、それにより、前記配列決定可能な核酸フラグメントの輸送および播種が、前記深さによって制限される、方法である。

【0017】

第３の態様の一例では、深さは、約１０μｍ以上である。

【0018】

第３の態様の一例では、各チャンバは下面を有し、１つは以下のものである：プライマーは下面を横断するポリマー層に付着されている；またはプライマーはそれぞれ下面に位置する複数の空間的に分離されたポリマーアイランドに付着されている。

【0019】

第３の態様の一例では、各チャンバは、底面と、その中に画定された複数の凹部とを有し、プライマーは、凹部の各々の内部のポリマー層にそれぞれ付着される。

【0020】

第３の態様の一例では、担体は固体保持体であり、放出を生じさせるのは、切断剤をフローセルに導入すること、または配列決定可能な核酸フラグメントの第１の配列のアニーリング温度を超えるフローセルを加熱することを含む。

【0021】

第３の態様の一例では、担体はハイドロゲル保持体であり、放出を生じさせるのは、フローセルの加熱、フローセルへの切断剤の導入、またはそれらの組み合わせを含む。

【0022】

この方法の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、任意の方法および／またはフローセルの特徴の任意の組み合わせを、本明細書に開示される任意の実施例と一緒に、および／または組み合わせて使用することができることを理解されたい。

【0023】

本明細書に開示される第４の態様は、それぞれが約５μｍ以下の深さを有する複数のチャンバと、前記複数のチャンバのそれぞれの内部の捕捉部位と、前記複数のチャンバのそれぞれの内部に付着されたプライマーとを含むフローセルに複数の複合体を導入することを含み、前記複数の複合体のそれぞれは、担体ビーズと、前記担体ビーズに付着された同じ鋳型核酸からの配列決定可能な核酸フラグメントとを含み、それにより、前記複合体の少なくともいくつかは、それぞれの捕捉部位に固定化され；前記フローセルから非固定化複合体を洗い流し；前記複数のチャンバに外部固定化剤を導入し；前記捕捉された複合体の前記担体ビーズに、配列決定可能な核酸フラグメントを、それぞれの複合体が捕捉される前記それぞれのチャンバ内に放出させ、それにより、前記配列決定可能な核酸フラグメントの輸送および播種が、前記外部固定化剤によって制限される、方法である。

【0024】

第４の態様の一例では、外部固定化剤は、気体拡散バリア；鉱油およびシリコーンオイルからなる群から選択される液体拡散バリア；グリセロールおよびスクロースからなる群から選択される粘性媒体拡散バリア；またはそれらの組合せである。

【0025】

第４の態様の一例では、捕捉部位は捕捉部位プライマーであり、複合体の各々は、捕捉部位プライマーにハイブリダイズし得る相補的プライマーを含む。

【0026】

第４の態様の一例では、捕捉部位は、結合対の第１のメンバーを含み、複合体の各々は、結合対の第２のメンバーを含む。

【0027】

第４の態様の一例では、各チャンバには下面があり、次のうちの１つが挙げられる：プライマーは下面を横断するポリマー層に付着されている；またはプライマーはそれぞれ下面に位置する複数の空間的に分離されたポリマーアイランドに付着されている。

【0028】

第４の態様の一例では、各チャンバは、その中に画定された底面および複数の凹部を有し、プライマーは、凹部の各々の内部のポリマー層にそれぞれ付着される。

【0029】

第４の態様の一例では、放出を生じさせるのは、フローセルに切断剤を導入することを含む。

【0030】

この方法の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、この方法および／またはフローセルの特徴の任意の組み合わせは、一緒に使用され、および／または本明細書に開示される任意の実施例と組み合わせることができることを理解されたい。

【0031】

さらに、任意の方法および／または任意のフローセルの任意の特徴を、任意の望ましい方法で一緒に組み合わせることができ、および／または少なくとも本明細書に記載されるような利益を達成するために本明細書に開示される任意の実施例と組み合わせることができることを理解されたい。

【0032】

本開示の実施例の特徴は、以下の詳細な説明および図面を参照することによって明らかになり、ここでは、発明の同様に参照番号は、おそらく同一ではないが、同様の発明の構成要素に対応する。簡潔にするために、先に記載した機能を有する符号または特徴は、それらが現れる他の図面に関連して記載されてもなくてもよい。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】図１は、フローセルの一例の一部の斜視図である。

【図2】図２Ａおよび２Ｂは、フローセルのチャンバアーキテクチャ（構造）の異なる例を示す、それぞれ図１の線２Ａ～２Ａおよび２Ｂ～２Ｂに沿った断面図である。

【図3】図３Ａ～３Ｃは、フローセルにおいて使用され得る捕捉部位の異なる例を示す断面図である。

【図4】図４Ａ～４Ｃは、本明細書に開示される複合体の異なる例の概略図である。

【図5】図５は、（ｉ）から（ｉｉｉ）を含む概略的なフロー図であり、フローセルのチャンバ内にハイドロゲルマトリックスが形成される方法の一例を示す。

【図6】図６Ａ～６Ｃは、それぞれ、図６Ａ）マイクロチャンバ内の複合体の顕微鏡写真、図６Ｂ）図６Ａのマイクロチャンバ内の複合体からシードされたライブラリから生成されたクラスタの顕微鏡写真、および図６Ｃ）第１の塩基配列決定走行中の図６Ｂのマイクロチャンバのリアルタイム分析の蛍光顕微鏡写真を示す。図６Ｄ）図６Ｃに示すマイクロチャンバからの読み取りから得られたアイランドを示す図である。

【図7】図７Ａおよび７Ｂは、複合体導入後のフローセルａ）（図７Ａ）、およびｂ）第１の塩基配列決定走行（図７Ｂ）のリアルタイム分析中の５つの異なるセクションおよび２つの異なるレーンの部分の顕微鏡写真を示し、ここで、レーン１のセクション１－５内の部分は、それぞれ、（ｉ）－（ｖ）とラベル付けされ、レーン２のセクション１－５内の部分は、それぞれ、（ｖｉ）－（ｘ）とラベル付けされる。

【図8】図８は、１）ハイドロゲル形成によるフローセルサンプルカプセル化、２）フローセルサンプル溶解、３）フローセルＤＮＡ抽出、および４）フローセルライブラリ調製を示すいくつかの顕微鏡写真を示す。

【図9】図９は、配列決定走行を行った後のフローセル上の異なるマイクロチャンバの元々はカラーの蛍光顕微鏡画像の白黒版である。

【図10】図１０Ａおよび１０Ｂは、ａ）カプセル化マトリックス前駆体のカプセル化後（図１０Ａ）、およびｂ）ハイドロゲル形成後（図１０Ｂ）、の５つの異なるセクションおよび２つの異なるレーンのフローセルの顕微鏡写真を示し、ここで、レーン１のセクション１－５内の部分はそれぞれ（ｉ）－（ｖ）と標識され、レーン２のセクション１－５内の部分はそれぞれ（ｖｉ）－（ｘ）と標識される。

【図11】図１１Ａおよび１１Ｂは、異なるビーズ濃度および同じ空気流量を有する流体で調製されたフローセル表面の明視野画像を示す。

【図12】図１２Ａ～１２Ｅは、異なるビーズ濃度を有し、同じ空気流量を有する流体で調製されたフローセル表面の明視野画像を示す。

【図13】図１３は、水ドメインの直径（例えば、液滴、パドルアイランド、液層）（μｍ単位）対ビーズ密度（ビーズ／ｍｍ^２）のグラフであり、ここで、データは、図１２Ａから１２Ｅから外挿されたものである。

【図14】図１４Ａおよび１４Ｂは、同じビーズ濃度および異なる空気流量を有する流体で調製されたフローセル表面の明視野像を描写する。

【図15】図１５Ａ～１５Ｄは、同じビーズ濃度および異なる塩濃度を有し、同じ空気流量を有する流体で調製されたフローセル表面の明視野画像を示す。

【図16】図１６は、水ドメインの直径（例えば、液滴、パドルアイランド、液層）（μｍ単位）対塩濃度（ｍＭ Ｎａ^＋）のグラフであり、ここで、データは、図１５Ａから１５Ｄから外挿されたものである。

【発明を実施するための形態】

【0034】

本明細書に開示されるフローセルは、フローセル上の個々のライブラリの空間的分離を可能にする特定のアーキテクチャ（構造）を有する。個々のライブラリは、より大きな核酸試料の同じ大きさ（例えば、＜１０００ｂｐ）のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）フラグメントを含み、フラグメントはそれぞれの端部に結合したアダプタを有する。本明細書中に開示されるいくつかの例において、ライブラリは、フローセルに導入される担体上または担体中に含まれる。本明細書に開示された例のいくつかの他の例では、試料がフローセルに導入された後、ライブラリはフローセル上にその場で形成される。いくつかの例では、フローセルアーキテクチャは、個々のキャリアまたは試料を捕捉することができる個々の捕捉部位を含む。これらの捕捉部位は、個々のチャンバ内に位置し、したがって、個々のチャンバ内のフローセルを横切って担体（したがって、担体内または担体上のライブラリ）または試料を空間的に分離することができる。他の例では、フローセルアーキテクチャは、捕捉部位のないチャンバを含む。これらの他の例では、チャンバ自体は、１つ以上の担体または試料を物理的に閉じ込めることができる。

【0035】

キャリアの空間的分離および閉じ込めは、キャリア内またはキャリア上に含まれるライブラリの空間的分離および閉じ込めを達成するのに役立ち得る。試料の空間的分離および閉じ込めは、試料からフローセル上に生成されるライブラリの空間的分離および閉じ込めを達成するのに役立つ。これらの実施例のいずれにおいても、個々のキャリアから放出されるか、または個々の試料からフローセル上に形成されるライブラリは、特定のチャンバ内に含まれ得る。このように、チャンバ構造は、フローセル表面を横切るライブラリフラグメントのランダムな結合を減少させる。さらに、ライブラリフラグメントの輸送および播種、並びにその後のクラスタ生成も、各チャンバ内に閉じ込められ得る。このように、閉じ込めは、ライブラリフラグメントの実質的に均一な播種、および、したがって実質的に均質化されたクラスタ密度さえももたらし得る。配列決定の間、個々のクラスタは、ヌクレオチドがクラスタのそれぞれの鋳型鎖に組み込まれるときに、蛍光シグナルの「空間濁り（cloud）」を生成する。クラスタのチャンバへの閉じ込めは、少なくとも、空間的な濁りクロストークおよび／または重複を低減することができ、空間的な濁りの同定を改善することもできる。さらに、任意の個々のチャンバから得られた読み取りは、同じサンプルから生成され得るので、これらは、短い読み取りを一緒にバイオインフォマティクス的に縫合（stitch）することによってサンプルを再構成するために使用され得る。

【0036】

本明細書に開示されるフローセルアーキテクチャは、表面積の全体的な利用を改善することもできる。
定義

【0037】

本明細書中で使用される用語は、特に明記しない限り、関連技術におけるそれらの通常の意味をとるものと理解されるであろう。本明細書で使用されるいくつかの用語およびその意味は、以下に記載される。

【0038】

本明細書で使用されるように、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「前記（the）」は、文脈が別段の明確な指示をしない限り、単数形および複数形の両方を指し、本明細書で使用される「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」、「含む（containing）」または「によって特徴付けられる」と同義であり、包括的またはオープンエンドであり、追加の、引用されていない要素または方法ステップを除外しない。

【0039】

「１つの例」、「別の例」、「実施例」などへの明細書全体にわたる言及は、例に関連して記載される特定の要素（例えば、特徴、構造、組成物、構成、および／または特性）が本明細書で記載される少なくとも１つの例に含まれ、他の例では存在してもしなくてもよい。また、任意の実施例について記載された要素は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、様々な実施例において任意の適切な方法で組み合わせることができることを理解されたい。

【0040】

特許請求の範囲を含め、本開示全体を通して使用される「実質的に」および「約」という用語は、処理の変動などによる小さな変動を説明し、説明するために使用される。例えば、これらの用語は、指定された値から±２％以下、例えば、指定された値から±１％以下、例えば、指定された値から±０．５％以下、例えば、指定された値から±０．２％以下、例えば、指定された値から±０．１％以下、例えば、指定された値から±０．０５％以下などの、指定された値から±５％以下、を指すことができる。

【0041】

アダプタ：線状オリゴヌクレオチドシークエンスで、例えばライゲーションやタグメンテーションによって核酸分子に融合できるもの。いくつかの実施例では、アダプタは、フローセルに導入される任意の標的配列の３’末端または５’末端に対して実質的に非相補的である。適切なアダプタ長は、約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、または約１２ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、または約１５ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドの範囲であり得る。アダプタは、ヌクレオチドおよび／または核酸の任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの例では、アダプタは、１つ以上の位置に１つ以上の切断可能な基を含む。いくつかの例では、アダプタは、プライマーの少なくとも一部分に相補的な配列、例えば、ユニバーサルヌクレオチド配列（例えば、Ｐ５またはＰ７配列）を含むプライマーを含むことができる。いくつかの例では、アダプタは、下流側の誤り訂正、識別、または配列決定を支援するインデックスまたはバーコード配列を含むことができる。インデックスは、核酸分子の試料またはソース（例えば、フラグメント）に固有であってもよい。いくつかの例では、アダプタは、配列決定プライマー配列または配列決定結合部位を含むことができる。異なるアダプタの組み合わせは、ＤＮＡフラグメントのような核酸分子に組み込まれてもよい。

【0042】

捕捉部位：複合体または試料のいずれかの局在を可能にする物理的に修飾および／または化学的特性で修飾されたフローセル表面の一部。一実施例では、捕捉部位は化学捕捉剤を含むことができる。

【0043】

担体：その中に含まれる配列決定ライブラリを有することができるハイドロゲル保持体、またはその表面に結合された配列決定可能な核酸フラグメントを有することができる固形保持体。

【0044】

化学捕捉剤：標的分子（すなわち、複合体または試料）に接着、保持、または結合することができる材料、分子または部分。一実施例の化学捕捉剤は、標的分子の標的核酸の少なくとも一部に相補的であるか、または標的分子に結合した捕捉核酸（例えば、捕捉オリゴヌクレオチド）を含む。もう一つの例として、化学的捕捉剤はリンカーである。天然のＤＮＡまたはＲＮＡ試料の場合、リンカーは、電荷または疎水性相互作用を介して結合するインターカレーターなどの、一方の末端上の核酸結合部分を含み得る。細胞試料の場合、リンカーは、細胞膜結合部分（例えば、表面タンパク質に対する抗原）または膜貫通部分（例えば、一方の末端のリン脂質）を含み得る。さらに別の例の化学捕捉剤は、標的分子（または標的分子に結合した連結部分）に結合することができるレセプター－リガンド結合対（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、レクチン、炭水化物、核酸結合タンパク質、エピトープ、抗体など）のメンバーを含む。化学捕集剤のもう一つの例は、標的分子と静電相互作用、水素結合、または同価結合を形成することができる化学試薬（例えば、チオール‐ジスルフィド交換、クリック化学、ディール‐アルダー等）である。

【0045】

複合体：ハイドロゲル保持体または固形保持体のような担体、および担体に結合した、または担体内に含まれる配列決定可能な核酸フラグメント。担体はまた、結合対の一方のメンバーを含み得、他方のメンバーは捕捉部位の一部である。

【0046】

外部固定化剤：フローセルチャンバに導入された複合体または試料と混和しない気体、液体または粘性媒体。ガス状の外部固定化剤を使用して、複合体または試料の周囲に液滴を生成することができる。ガス状の外部固定化剤の例は、フローセルを通る適切な流量に向けられる空気である。例えば、空気を用いて、複合体または試料を含有する液体の液滴を形成する複合体または試料を含有する流体をフローセルから吸引することができる。形成された液滴は拡散障壁として作用する。液体または粘性媒体は、複合体から放出されるか、または例えばフローセル表面上のチャンバ内で形成される配列決定ライブラリの拡散を防止するために使用される。外部固定化剤は、配列決定ライブラリまたは任意の他のポリヌクレオチドが外部固定化剤中にほとんど～まったく溶媒和しないので、拡散バリアを形成することができる。液体形態の外部固定化剤の例には、鉱油、シリコン油、ペルフルオロ化油、フッ素化炭素油（例えば、３ＭからのＦＬＵＯＲＩＮＥＲＴ（商標）ＦＣ４０）、またはそれらの組み合わせのような疎水性油が含まれる。粘性媒体形成の外部固定化剤の例としては、重合体（例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンなど）、デキストラン、スクロース、グリセリンなどを含有する緩衝剤が挙げられる。いくつかの例では、粘性媒体は温度応答性ゲルである。温度応答性ゲルは、不播種温度では非粘性であり、播種温度では粘性媒体となる。温度応答性ゲルの例としては、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）およびポリエチレンオキシド－ポリプロピレンオキシド－ポリエチレンオキシド（PEO－PPO－PEO）／ラポナイトナノ粒子複合体が挙げられる。

【0047】

フラグメント：遺伝物質の一部またはフラグメント（例：ＤＮＡ、ＲＮＡなど）。

【0048】

ハイドロゲルまたはハイドロゲルマトリックス：共有結合、イオン結合、または水素結合を介して架橋され、水分子を取り込んでゲルを形成する三次元の開放格子構造を形成する有機高分子（天然または合成）を含むコロイド物質。一実施例では、ハイドロゲルは、水などの約６０％～約９０％の流体、および約１０％～約３０％の重合体を含む。ハイドロゲルは、多孔質、すなわち、開放／空隙を含むことができる。気孔率は、ハイドロゲルの体積分率（無次元）であり、すなわち、材料の空隙スペースを測定し、０から１００％の間のパーセンテージとして、総体積に対する空隙の体積の分率（または０～１の分率）である。一実施例では、ハイドロゲルの気孔率は、約５０％（０．５）～約９９％（０．９９）の範囲であり得る。気孔率は、試薬（例えば、酵素、化学物質、およびより小さなサイズのオリゴヌクレオチド（５０塩基対未満、例えば、プライマー）の拡散を可能にするのに十分であり得るが、より大きなサイズの核酸分子（例えば、試料、フラグメントなど）の拡散を防止する

【0049】

ハイドロゲル保持体：その中に配列決定ライブラリを含むことができる少なくとも実質的に球形（例えば、ハイドロゲルビーズ）を有するハイドロゲル。

【0050】

核酸分子：任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態であって、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、またはそれらの混合物を含むことができる。用語は、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドを意味することができる。

【0051】

「標的」または「鋳型」核酸分子は、分析されるべき配列を指し得る。

【0052】

核酸分子中のヌクレオチドは、天然に存在する核酸およびその機能的アナログを含み得る。機能的アナログの例は、配列特異的様式で核酸にハイブリダイズすることができ、または特定のヌクレオチド配列の複製のための鋳型として使用することができる。天然に存在するヌクレオチドは、一般にホスホジエステル結合を含む主鎖を有する。アナログ構造は、当該技術分野で公知の種々のいずれかを含む代替主鎖結合を有することができる。天然に存在するヌクレオチドは、一般に、デオキシリボース糖（例えば、ＤＮＡ中に見出される）またはリボース糖（例えば、ＲＮＡ中に見出される）を有する。アナログ構造は、当該技術分野で公知の種々のいずれかを含む代替の糖部分を有することができる。ヌクレオチドは、天然または非天然の塩基を含むことができる。天然ＤＮＳは、アデニン、チミン、シトシンおよび／またはグアニンの１つ以上を含むことができ、天然ＲＮＡは、アデニン、ウラシル、シトシンおよび／またはグアニンの１つ以上を含むことができる。ロックド核酸（ＬＮＡ）およびブリッジ核酸（ＢＮＡ）などの任意の非天然塩基を使用することができる。

【0053】

プライマー：目的の標的配列とハイブリダイズすることができる核酸分子。一例として、プライマーは、ヌクレオチドがポリメラーゼによって重合され得る基質として機能する。例えば、増幅プライマーは、テンプレート増幅およびクラスタ生成の出発点として機能する。さらに別の例では、プライマーはＤＮＡまたはＲＮＡ合成の出発点として働くことができる。例えば、配列決定プライマーは、合成された核酸鋳型鎖に相補的な新しい鎖の合成を開始するために、合成された核酸鋳型鎖にハイブリダイズすることができる。プライマーは、ヌクレオチドまたはその類似体の任意の組合せを含むことができる。いくつかの例では、プライマーは一本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。

【0054】

試料：細胞、ミクロビオーム、核酸などの遺伝物質の源。いくつかの例において、細胞は、原核細胞または真核細胞を含む単一の細胞である。いくつかの例において、細胞は、哺乳動物細胞、ヒト細胞、または細菌細胞である。いくつかの例において、核酸は、ウイルス核酸、細菌核酸、または哺乳動物核酸を含む長鎖ＤＮＡ分子である。いくつかの例では、試料は、固形保持体（例えば、ビーズ）の表面に結合したトランスポゾンの挿入を介して（フラグメントとして）結合される。

【0055】

配列決定可能な核酸フラグメント：３’および５’末端にアダプタを有する遺伝物質の一部（フラグメント）。配列決定可能な核酸フラグメントにおいて、各アダプタは、既知のユニバーサル配列（例えば、フローセル上のプライマーの少なくとも一部に相補的である）および配列決定プライマー配列を含む。両方のアダプタにインデックス（バーコードまたはタグ）配列を含めることもできる。一例では、Ｐ５側はビーズインデックスを含み得、Ｐ７側はサンプルインデックスを含み得る。配列決定可能な核酸フラグメントは、例えば、固形保持体（例えば、ビーズ）の表面に結合されたトランスポゾンに挿入を介して結合されてもよく、または結合対または他の切断可能なリンカーを介して直接的に固定されてもよい。配列決定可能な核酸フラグメントはまた、ハイドロゲル保持体内に含有されてもよい。

【0056】

播種（シーディング）：本明細書中に開示されるフローセルの一例のチャンバにおける、適合されたフラグメント（例えば、配列決定可能な核酸フラグメント）の固定化。

【0057】

配列決定ライブラリ：１つ以上の標的核酸分子の核酸フラグメント、またはフラグメントのアンプリコンの集まり。いくつかの例では、そのフラグメントは、その３’および５’末端で１つ以上のアダプタに連結されている。いくつかの例において、配列決定ライブラリは、１つ以上の標的核酸分子から調製され、複合体の一部である。他の例では、配列決定ライブラリは、試料を用いてフローセル表面上に調製される。

【0058】

固体保持体：形状を有する剛体または半剛体でできた小体で、例えば、球体、楕円体、微小球体、または規則的または凹凸寸法を有するかにかかわらず、他の認識された微粒子形状として特徴づけられる。固形保持体は、それに結合された配列決定ライブラリを有することができる。固体保持体に有用な例示材料としては、限定されるものではないが、ガラス；プラスチック、例えばアクリル、ポリスチレンまたはスチレンと他の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタンまたはポリテトラフルオロエチレン（Chemours社製のTeflon（登録商標））；多糖類または架橋多糖類、例えばアガロースまたはセファロース；ナイロン；ニトロセルロース；樹脂；シリカまたはシリカ系材料、例えばシリコンおよび変性シリコンを含む；炭素繊維、金属；無機ガラス；光ファイバー束、または様々な他の重合体が挙げられる。例示的な固形保持体は、制御された細孔ガラスビーズ、常磁性または他の磁気ビーズ、トリアゾル、セファロースビーズ、ナノ結晶、および、例えば、Bangs Laboratories, Fishers Indからのミクロスフェア検出ガイドに記載されている当該技術分野で公知の他のものを含む。

【0059】

タグメンテーション：核酸分子をフラグメント化するためのトランスポソームによる核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料）の修飾、および一段階でフラグメントの５’末端および３’末端にアダプタを連結する。タグメンテーション反応を用いて、配列決定ライブラリ、特に、固形保持体を含む複合体を調製することができる。タグメンテーション反応は、無作為なサンプルフラグメント化とアダプタ連結を組み合わせて単一工程とし、これにより配列決定ライブラリ調製プロセスの効率が高まる。

【0060】

トランスポソーム：積分酵素（例えば、インテグラーゼまたはトランスポザーゼ）と積分認識部位（例えば、トランスポザーゼ認識部位）を含む核酸との間で形成される複合体。

【0061】

ユニバーサルヌクレオチド配列：２つ以上の核酸分子に共通する配列の領域であって、分子が互いに異なる領域をも有する領域。分子のコレクションの異なるメンバーに存在するユニバーサル配列は、ユニバーサル捕捉核酸の集団（すなわち、プライマーの少なくとも一部に相補的な配列を有するアダプタ）を用いて、いくつかの異なる核酸の捕捉を可能にすることができる。同様に、分子のコレクションの異なるメンバーに存在するユニバーサル配列は、ユニバーサル配列決定結合部位（sequencing primer sequence）の集団を用いて、いくつかの異なる核酸の増幅または複製を可能にすることができる。
フローセルアーキテクチャ

【0062】

フローセル１０の例の一部を図１に示す。フローセル１０は、基材１２、基材１２上または基材１２内に画定された複数のチャンバ１４、基材１２内および複数のチャンバ１４の各々の周辺内に画定された複数の凹部１６、凹部１６の各々の内部に付着されたプライマー２０、および複数のチャンバ１４の各々の内部に位置する捕獲部位２２を含む。

【0063】

基材１２は、一般に剛性であり、水性液体に不溶性である。基材１２は、単層または多層構造であってもよい。適切な基材１２の例としては、エポキシシロキサン、多面体オリゴマーシルセキオキサン（ＰＯＳＳ）またはその誘導体、ガラス、変性ガラス、変性ガラス、プラスチック、ナイロン、セラミックス／セラミック酸化物、シリカ（酸化ケイ素（ＳｉＯ_２））、溶融シリカ、シリカ系材料、ケイ酸ＡＬ、ケイ素、変性ケイ素（例えば、ホウ素ドープｐ＋ケイ素）、窒化珪素（Ｓｉ_３Ｎ_４）、五酸化タンタル（ＴａＯ_５）または他の酸化タンタル（ＴａＯ_Ｘ）、酸化ハフニウム（ＨａＯ_２）、無機ガラスなどが挙げられる。基材１２に好適なプラスチックのいくつかの例には、アクリル、ポリスチレン、スチレンと他の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、Chemours Co.からのTEFLON（登録商標））、環状オレフィン／シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）（例えば、ZeonからのZEONOR（登録商標））、ポリイミドなどが含まれる。基材１２はまた、表面に酸化タンタルまたは別のセラミック酸化物のコーティング層を有するガラスまたはシリコンまたはＰＯＳＳであってもよい。基材１２はまた、表面にＰＯＳＳのコーティング層を有するガラスまたはシリコンであってもよい。適切な基材１２の別の例は、絶縁体上シリコン基材である。

【0064】

基材１２の形態は、ウェハ、パネル、矩形シート、ダイ、または任意の他の好適な構成であってもよい。一実施形態では、基材１２は、約２ｍｍ～約３００ｍｍの範囲の直径を有する円形のウェハまたはパネルであってもよい。より具体的な例として、基材１２は、約２００ｍｍから約３００ｍｍの範囲の直径を有するウェハである。別の例では、基体１２は、約１０フィート（～３メートル）までの最大寸法を有する長方形の薄板またはパネルであってもよい。具体例として、基材１２は、約０．１ｍｍから約１０ｍｍの範囲の幅を有するダイである。例示的な寸法が提供されているが、任意の適切な寸法を有する基材１２を使用することができることを理解されたい。

【0065】

複数のチャンバ１４は、基材１２上または基材１２内に画定されてもよい。

【0066】

基材１２上に画定されたチャンバ１４の一例を図２Ａに示す。本明細書に開示される実施例では、チャンバ１４は、ｉ）基材表面Ｓ_１２がチャンバ１４の底面を画定し、ｉｉ）セパレート材１８が基材１２上に配置され、チャンバ１４の壁Ｗ_１８を画定するとき、基材１２上に「画定される」と考えられる。絶縁体上シリコン基材がセパレート材１８と共に使用される場合、チャンバ１４の壁Ｗ_１８は、基材の最も外側のシリコン層とセパレート材１８とによって部分的に画定されてもよい。

【0067】

セパレート材１８は、フッ素化重合体、パーフルオロ化ポリマー、シリコンポリマー、またはこれらの混合物などの疎水性材料であってもよい。疎水性物質の重合体主鎖は、カーボンもしくはケイ素、またはそれらの組み合わせであってもよい。いくつかの例では、フッ素化ポリマーは、非晶質フルオロポリマー（市販されているものの中には、以下の末端官能基：Ａタイプ：－ＣＯＯＨ、Ｍタイプ：－ＣＯＮＨ－Ｓｉ（ＯＲ）_ｎまたはＳタイプ：－ＣＦ_３におけるものが含まれる）、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、テフロン（登録商標）Chemours社製）、パリレン（例えばグレードA、F、HT）、フッ素化炭化水素、フルオロアクリルコポリマー（例えば、Fluoropel（商標）、Cytonix製）、（トリデカフルオロ－１，１，２，２－テトラヒドロオクチル）トリクロロシラン（FOTS）、フルオロシラン、もしくはプラズマ蒸着フルオロカーボン、またはこれらの混合物の１つを有する、AGC Chemicals社製のCYTOP（登録商標）シリーズであってもよい。別の例として、疎水性ポリマーまたは疎水性ポリマー層は、１－ヘプタデシンなどの疎水性炭化水素を含むことができる。いくつかの例では、シリコン重合体は、ポリジメチルシロキサンまたは別のシロキサンである。凹部１６内の材料が親水性である／である場合、セパレート材１８のために疎水性材料を利用することが特に望ましい場合がある。得られた構造が、構造を横切って移動する液体の真珠化を誘発することができる限り、セパレート材１８として他の重合体を使用することができる。あるいは、凹部１６内の材料が疎水性である／である場合、セパレート材１８のために親水性材料を使用することが望ましい。セパレート材１８の疎水性または親水性特性は、試薬を凹部１６に向かって案内するのに役立つ。

【0068】

一例では、セパレート材１８は、基材１２上に堆積され、次いで、フォトリソグラフィを使用してパターニングされてもよい。基材１２がシリコンオンインシュレータ基材である例では、フォトリソグラフィを用いてセパレート材１８と最も外側のシリコン層をパターンすることができる。一例として、マスク（例えば、フォトレジスト）を使用して、セパレート材１８が堆積される空間／位置を画定することができる。次いで、セパレート材１８を堆積し、マスクを除去することができる（例えば、リフトオフ、溶解、または別の適切な技術を介して）。別の例として、セパレート材１８を堆積させ、次いでマスクをセパレート材１８上に堆積させてもよい。マスクは、フォトリソグラフィを用いてパターニングすることができ、セパレート材１８の任意の露出部分は、プラズマエッチングまたは酸素ガスによるドライエッチングを介して除去することができる。次いで、マスクを除去して、残りのセパレート材１８を明らかにすることができる。さらに別の例では、セパレート材１８は、基材１２に積層されてもよく、または金型または犠牲層から基材１２に転写されてもよい。さらに別の例では、セパレート材１８は、マイクロ接触印刷（スタンプを使用）、エアロゾル印刷、またはインクジェット印刷を使用して印刷することができる。

【0069】

基材１２に画定されたチャンバ１４の一例を図２Ｂに示す。ここに開示される実施例では、チャンバ１４は、ｉ）基材表面Ｓ_１２がチャンバ１４の周りの間隙領域を画定し、ｉｉ）別の基材表面Ｓ’_１２がチャンバ１４の底面を画定し、ｉｉｉ）基材１２がチャンバ１４の壁Ｗ_１２も画定する場合、基材１２に「画定される」と考えられる。

【0070】

この実施例では、チャンバ１４は、基材内にパターニングされてもよい。パターン形成は、チャンバ１４を基材１２内にエッチングすること、および／またはインプリントリソグラフィを使用することを含んでもよい。

【0071】

基材１２上に形成されるか、あるいは基材内に形成されるかにかかわらず、チャンバ１４は、任意の適当なパターンまたはレイアウトで基材１２全体に分布され得る。規則的、反復的、非規則的なパターンを含む、チャンバ１４の多くの異なるレイアウトを想定することができる。一例では、チャンバ１４は、密充填および密度向上のために、六角形グリッド内に配置される。他のレイアウトは、例えば、平行四辺形レイアウト（すなわち、矩形、正方形など）、三角形レイアウト、円形レイアウトなどを含むことができる。いくつかの例では、レイアウトまたはパターンは、（図１に示されるように）行および列にあるチャンバ１４のｘ－ｙフォーマットであり得る。

【0072】

チャンバ１４は、円（図１に示されるようである）、楕円、多角形（例えば、三角形、四角形、五角形など）などの任意の適切な形状を有することができる。

【0073】

それぞれのチャンバ１４の大きさは、その開口部面積、直径、および／または長さおよび幅によって特徴付けられてもよい。図１に示されるように、フローセル１０は、チャンバ１４のそれぞれの内部に位置する複数の凹部１６を有する。このように、チャンバ１４のサイズは、各凹部１６のサイズよりも大きい。言い換えると、チャンバ１４の寸法（単数または複数を含む）は、各凹部１６の寸法よりも大きい。本実施例では、「寸法」は、各チャンバ開口部または凹部が占める面積、および／またはチャンバ１４または凹部１６の直径、および／または各チャンバ１４または凹部１６の長さおよび幅を指す。図１に示す例では、チャンバ１４の各開口部面積および直径は、凹部１６の各開口部面積および直径よりも大きい。開口部領域、および各チャンバ１４の直径または長さおよび幅は、チャンバ１４内に配置される凹部１６の数、およびチャンバ１４内に配置される捕捉部位２２のサイズに依存する。

【0074】

各々のチャンバ開口部が占める面積は、複合体（その例が図４Ａ～４Ｃに示されている）がチャンバ１４に入り、チャンバ１４内の捕獲部位２２に付着されるように選択することができる。例えば、各チャンバ開口部の面積は、少なくとも約１μｍ^２、少なくとも約１０μｍ^２、少なくとも約１００μｍ^２、あるいはそれ以上とすることができる。各チャンバ開口部の占有面積は、上記で指定された数値より大きくても、またはその間であってもよい。

【0075】

いくつかの例では、各チャンバ１４の直径または長さおよび幅は、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約２０μｍ、少なくとも約３０μｍ、少なくとも約４０μｍ、少なくとも約５０μｍ、少なくとも約１００μｍ、またはそれ以上であり得る。チャンバ直径の一例は、約１μｍ～約１０００μｍの範囲である。チャンバ直径の別の例は、約１０μｍ～約５０μｍの範囲である。チャンバ１４が長さおよび幅を有する場合、長さおよび幅は同じであっても異なっていてもよいことを理解されたい。

【0076】

チャンバ１４はまた、チャンバ１４を形成するために使用される技術に依存する深さを有してもよい。例えば、各チャンバ１４の深さは、マイクロ接触、エアロゾル、またはインクジェットプリントがチャンバ壁Ｗ１８を形成するために使用される場合、単層厚さとすることができる。他の例では、各チャンバ１４の深さは、約１μｍ、約１０μｍ、約５０μｍ、またはそれ以上であり得る。別の例では、深さは、チャンバ１４に導入される複合体の平均直径の少なくとも約５０％である。一例では、この深さは、約１０μｍ～約３０μｍの範囲であり得る。この深さは、隣接するチャンバ１４間の放出されたライブラリフラグメントの側方拡散を遮断するのに十分であり、したがって、放出されたライブラリフラグメントを外部固定化剤なしでチャンバ１４内に維持する。他の例では、深さは５μｍ以下である。各チャンバ１４の深さは、上記で指定された値よりも大きくてもよく、より小さくてもよく、またはその間であってもよいことを理解されたい。

【0077】

隣接するチャンバ１４は、追加材料１８の表面Ｓ_１８（図２Ａに示される）によって、または基材１２の表面Ｓ_１２（図２Ｂに示される）によって分離されてもよい。平均チャンバピッチは、１つのチャンバ１４の中心から隣接するチャンバ１４の中心まで（中心から中心までの間隔）または１つのチャンバ１４の縁から隣接するチャンバ１４の縁までの間隔（縁から縁までの間隔）を表す。チャンバ１４のレイアウトまたはパターンは、平均ピッチの周囲の変動係数が小さいように、規則的であってもよく、またはレイアウトまたはパターンは、非規則的であってもよく、その場合、変動係数は比較的大きくなり得る。いずれの場合も、平均ピッチは、例えば、少なくとも約１μｍ、少なくとも約５μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、またはそれ以上であり得る。一例では、平均ピッチは、チャンバ１４の直径の２倍である。チャンバ１４の特定のパターンの平均ピッチは、下側値の１つと、上の範囲から選択された上側値の１つとの間であり得る。平均チャンバピッチ値の例が提供されているが、他の平均チャンバピッチ値を使用してもよいことを理解されたい。

【0078】

複数の凹部１６は、基材１２内に画定されてもよい。ここに開示される実施例では、凹部１６は、ｉ）基材表面Ｓ_１２またはＳ’_１２が、凹部１６を分離する間隙領域２４を画定し、ｉｉ）別の基材表面Ｓ’’_１２が凹部１６の底面を画定し、ｉｉｉ）基材１２が凹部１６の壁も画定する場合に、基材１２内に’’画定される’’と見なされる。

【0079】

凹部１６は、基材１２にパターン化されてもよい。パターン形成は、凹部１６を基材１２内にエッチングすること、および／またはインプリントリソグラフィを使用することを含み得る。

【0080】

凹部１６の各サブセットは、任意の適切なパターンまたはレイアウトでチャンバ１４の各々にわたって分配されてもよい。各チャンバ１４内の凹部１６のパターンは、同じであってもよく、または、異なるパターンの凹部１６が異なるチャンバ１４内で使用されてもよい。凹部１６の多くの異なるパターン／レイアウトが、規則的、反復的、および非規則的パターンを含めて、想定され得る。一例では、凹部１６は、密集して密度を向上させるために、六角形の格子状に配置されている。他のレイアウトは、例えば、平行四辺形レイアウト（すなわち、矩形、正方形など）、三角形レイアウト、円形レイアウトなどを含むことができる。図１に図示例では、各チャンバ１４内の凹部１６は、捕捉部位２２の周囲に円形パターンで配置されている。図１に示されるように、複数のチャンバ１４は、基材１２を横切る第１のパターン（例えば、２ｘ２）で配置されてもよく、各サブセットの凹部は、チャンバ１４の各内部で第２のパターン（例えば、円形）で配置される。

【0081】

各凹部１６は、円（図１に示される）、楕円、多角形（例えば、三角形、四角形、五角形など）などの任意の適切な形状（および該当する３次元形状）を有することができる。

【0082】

各々の凹部１６の大きさは、その開口部面積、直径、並びに／または長さおよび幅によって特徴付けられ得る。図１に示されるように、フローセル１０は、チャンバ１４のそれぞれの内部に位置する複数の凹部１６を有する。このように、各凹部１６のサイズは、それが配置されているチャンバ１４のサイズよりも小さい。

【0083】

それぞれの凹部開口部が占める面積は、複合体が凹部１６に入ることができないように選択することができる。例えば、それぞれの凹部開口部の面積は、少なくとも約１×１０^－４μｍ^２、少なくとも１×１０^－３μｍ^２、少なくとも約１×１０^－２μｍ^２、少なくとも約０．１μｍ^２、少なくとも約０．５μｍ^２、少なくとも約１μｍ^２、または少なくとも約４μｍ^２とすることができる。それぞれの凹部開口部が占める面積は、上記の数値よりも小さくてもよいし、または上記の数値の間であってもよい。

【0084】

いくつかの例では、各凹部１６の直径または長さおよび幅は、寸法がチャンバの直径または長さおよび幅より小さい限り、少なくとも約１ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約５００ｎｍ、またはそれ以上であり得る。凹部直径の一例は、約１ｎｍ～約５００ｎｍの範囲である。凹部直径の別の例は、約３００ｎｍ～約２μｍの範囲である。

【0085】

凹部１６はまた、深さを有してもよい。例として、各凹部１６の深さは、少なくとも約１０ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約１μｍ、最大約２μｍであり得る。いくつかの例では、深さは約０．４μｍである。各凹部１６の深さは、上記で指定された値よりも大きくてもよく、より小さくてもよく、またはその間であってもよいことを理解されたい。

【0086】

一実施形態では、凹部１６のアスペクト比（直径：深さ）は、約１：１～約１：２、または約１：１．２５～約１：１．７５の範囲であってよい。

【0087】

隣接する凹部１６は、所与のチャンバ１４内の間質領域２４によって分離されてもよい。平均凹部ピッチは、１つの凹部１６の中心から隣接する凹部１６の中心までの間隔（中央から中央までの間隔）、または１つの凹部１６の縁から隣接する凹部１６の縁までの間隔（縁から縁までの間隔）を表す。凹部１６のレイアウトまたはパターンは、平均ピッチの周りの変動係数が小さくなるように規則的なものとすることができ、またはレイアウトまたはパターンを非規則的なものとすることができ、その場合、変動係数を比較的大きくすることができる。いずれの場合も、平均ピッチは、チャンバ１４の寸法に応じて、例えば、少なくとも約１０ｎｍ、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．５μｍ、またはそれ以上とすることができる。これに代えて、またはこれに加えて、平均ピッチは、例えば、最大約０．５μｍ、または最大約０．１μｍ以下とすることができる。凹部１６の特定のパターンの平均ピッチは、上の範囲から選択された、下側値の１つと、上側値の１つとの間にあり得る。

【0088】

また、各凹部１６内にプライマー２０が付着されている。プライマー２０は、各々の凹部１６の少なくとも底部（すなわち、表面Ｓ’’_１２）に存在する層２６に結合することができる官能基を含む、任意の順方向増幅プライマーまたは逆方向増幅プライマーであってもよい。プライマー２０は、各凹部１６内に、配列決定可能な核酸フラグメントのアダプタに結合することができる捕捉オリゴヌクレオチドの芝生を形成することができる。

【0089】

一実施形態では、プライマー２０は、プライマー２０の５’末端またはその近傍での一点共有結合によって層２６に固定化され得る。この結合により、ｉ）プライマー２０のアダプタ特異的部分は、その同族配列決定可能な核酸フラグメントにアニーリングすることができ、ｉｉ）プライマー伸長のための３’水酸基がない。任意の適切な共有結合をこの目的のために使用することができる。使用され得る末端プライマーの例としては、アルキン末端プライマー、テトラジン末端プライマー、アジド末端プライマー、アミノ末端プライマー、エポキシまたはグリシジル末端プライマー、チオリン酸末端プライマー、チオール末端プライマー、アルデヒド末端プライマー、ヒドラジン末端プライマー、ホスホラミダイト末端プライマー、およびトリアゾリンジオン末端プライマーが挙げられる。別の例では、プライマー２０は、非共有結合相互作用を介して層２６に固定化され得る。一実施形態では、各プライマー２０は、層２６に非共有結合することができる連結分子（例えば、ビオチン）を含むことができる。いくつかの例では、２つの異なるプライマー２０が使用される。好適なプライマー２０の具体例としては、Illumina Inc.がHISEQ（商標）、HISEQX（商標）、MISEQ（商標）、MISEQDX（商標）、MINISEQ（商標）、NEXTSEQ（商標）、NEXTSEQDX（商標）、NOVASEQ（商標）、GENOME ANALYZER（商標）、ISEQ（商標）、および他の装置プラットホーム上の配列決定のために販売する市販のフローセルの表面に使用するＰ５およびＰ７プライマーが挙げられる。

【0090】

一実施形態では、層２６は、プライマー２０に結合された連結分子に非共有結合的に結合することができる物質である。一例として、連結分子はビオチンであり、層２６はアビジン、ストレプトアビジンなどである。本実施例では、層２６は、マイクロ接触プリンティングまたはエアロゾルプリンティング、堆積および研磨、または別の適切な選択的堆積技術によって適用することができる。

【0091】

別の例では、層２６は、プライマー２０に共有結合することができる重合体である。凹部１６の底面（例えば、Ｓ’’_１２）が活性化され、次いで、重合体が層２６を形成するために適用されてもよい。

【0092】

いくつかの例において、活性化は、シランまたはシラン誘導体（例えば、ノルボルネンシラン）を適用することを含み得る。他の例では、活性化は、層２６を形成するために使用されるポリマーに付着し得る表面活性化剤（例えば、－ＯＨ基）を生成するためのプラズマアッシングを含むことができる。

【0093】

層２６を形成するために使用され得るポリマーの例は、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド、PAZAM）などのアクリルアミドコポリマーを含む。PAZAMおよびアクリルアミドコポリマーのいくつかの他の形態は、以下の構造（Ｉ）：

【化1】

によって表され、
ここで、
Ｒ^Ａは、アジド、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいヒドラジン、置換されていてもよいヒドラジン、カルボキシル、水酸基、置換されていてもよいテトラゾール、置換されていてもよいテトラジン、酸化物ニトリル、ニトロン、およびチオールからなる群から選択され、
Ｒ^Ｂは、Ｈまたは置換されていてもよいアルキルであり、
Ｒ^Ｃ、Ｒ^Ｄ、およびＲ^Ｅは、それぞれ、Ｈおよび置換されていてもよいアルキルからなる群から独立して選択され、
－（ＣＨ_２）_ｐ－のそれぞれは、置換されていてもよく、
ｐは１～５０の範囲の整数であり、
ｎは１～５０，０００の範囲の整数であり、
ｍは１～１００，０００の範囲の整数である。
当業者は、構造（Ｉ）における繰り返しの「ｎ」および「ｍ」特徴の配列が代表的であり、モノマーサブユニットがポリマー構造中の任意の順序（例えば、ランダム、ブロック、パターン化、またはそれらの組み合わせ）で存在し得ることを認識するであろう。

【0094】

いくつかの例では、PAZAMは直鎖状重合体である。他のいくつかの例では、PAZAMは軽架橋高分子である。

【0095】

他の例では、層２６を形成するために使用され得るポリマーは、構造（Ｉ）の変形であり得る。
一例において、アクリルアミド単位は、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド

【化2】

で置換されてもよい。本実施例では、構造（Ｉ）のアクリルアミド単位は、

【化3】

で置換することができ、ここで、Ｒ^Ｄ、Ｒ^Ｅ、およびＲ^ＦがそれぞれＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり、Ｒ^ＧおよびＲ^Ｈは、それぞれＣ１－Ｃ６アルキルである（アクリルアミドの場合のようにHの代わりに）。本実施例では、ｑは１～１００，０００の範囲の整数であることとしてもよい。別の例では、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミドは、アクリルアミド単位に加えて使用されてもよい。本実施例では、構造（Ｉ）は、繰り返し発生する「ｎ」および「ｍ」の特徴に加えて、

【化4】

を含むことができ、ここで、Ｒ^Ｄ、Ｒ^Ｅ、およびＲ^ＦがそれぞれＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｒ^ＧおよびＲ^ＨがそれぞれＣ１～Ｃ６アルキルである。本実施例では、ｑは１～１００，０００の範囲の整数あることとしてもよい。

【0096】

他の重合体または分子が、それらが表面Ｓ’’_１２およびその後適用されるプライマー２０と相互作用するように官能化されている限り、層２６を形成するために使用されてもよいことを理解されたい。層２６のための好適な重合体の他の例としては、アガロースのようなコロイド構造を有する重合体；またはゼラチンのような重合体メッシュ構造；またはポリアクリルアミド重合体および共重合体、シランフリーアクリルアミド（ＳＦＡ）、もしくはアジドリザイド型のＳＦＡのような架橋高分子構造が挙げられる。適切なポリアクリルアミドポリマーの例は、アクリルアミドおよびアクリル酸またはビニル基を含有するアクリル酸から、または［２＋２］光－環状付加反応を形成するモノマーから合成することができる。層２６に好適なポリマーのさらに他の例としては、アクリルアミドとアクリレートとの混合共重合体が挙げられる。

【0097】

層２６を形成するポリマーと共に凹部１６を機能化するために使用される方法は、チャンバ１４が基材１２上または中に画定されるか否かに依存し得る。

【0098】

例えば、チャンバ１４がセパレート材１８によって基材１２上に画定される場合、基材表面Ｓ_１２およびＳ’’_１２は、凹部１６を機能化するように処理され得、次いで、セパレート材１８は、チャンバ１４を画定するために、表面Ｓ_１２に付着され得ることを理解されたい。一実施例では、シランまたはシラン誘導体は、蒸着、スピンコーティング、または他の蒸着方法を使用して、基材表面Ｓ_１２およびＳ’’_１２上に堆積され得る。別の実施形態では、基材表面Ｓ_１２およびＳ’’_１２は、プラズマアッシングに曝されてもよい。次いで、重合体（層２６を形成する）は、スピンコーティング、浸漬もしくは浸漬コーティング、または正圧もしくは負圧下での物質の流動、または別の好適な技術を用いて、活性化された基材表面Ｓ_１２およびＳ’’_１２に塗布されてもよい。１つの例において、ポリマーは混合物（例えば、水またはエタノールと水）中に存在してもよい。ポリマーに応じて、塗布された混合物を硬化工程に曝して、表面Ｓ_１２およびＳ’’_１２を横切って（共有結合した）層２６を形成することができる。一実施形態では、硬化は、約１ミリ秒～約数日の範囲の時間、室温（例えば、約２５℃）～約９５℃の範囲の温度で起こることができる。次いで、表面Ｓ_１２から層２６を除去するために研磨を行い、一方、層２６を表面Ｓ’’_１２に少なくとも実質的に無傷のままにすることができる。これらの実施例では、セパレート材１８は、次に、本明細書に記載されるように、表面Ｓ_１２上に形成されてもよい（例えば、フォトリソグラフィ、プリンティング、フィルム転写または積層など）。

【0099】

別の例について、チャンバ１４が基材１２内に画定される場合、選択的堆積技術が凹部１６を機能化するために使用され得ることを理解されたい。本実施例では、シランまたはシラン誘導体、次いでポリマー混合物をマイクロ接触プリンティング、エアロゾルプリンティング、またはインクジェットプリンティングによって堆積させることができる。

【0100】

グラフティング処理は、凹部１６内の層２６にプライマー２０をグラフトするために実行されてもよい。一実施例では、グラフト化は、フロースルー堆積（例えば、一時的に結合された蓋を使用）、ダンクコーティング、スプレーコーティング、パドルティスペンシング、または凹部１６内の層２６にプライマー２０を付着させる別の適切な方法を含むことができる。これらの実施例技術の各々は、プライマー溶液または混合物を使用することができ、これは、プライマー、水、緩衝液、および触媒を含むことができる。いずれのグラフト法でも、プライマー２０は、凹部１６内のポリマー層２６の反応性基と反応し、間質領域２４、他の基質面Ｓ_１２もしくはＳ’_１２、またはセパレート材１８に対して親和性を有さない。したがって、プライマー２０は、凹部１６内のポリマー層２６に選択的にグラフトする。

【0101】

本明細書に開示されるフローセル１０の実施例は、複数のチャンバ１４の各々の内部に位置する捕捉部位２２を含む。捕捉部位２２の一例を図１、２Ａおよび２Ｂに示し、捕捉部位２２の他の例を図３Ａ～３Ｃに示す。

【0102】

捕捉部位２２は、複合体または試料を特定のチャンバ１６内に固定化することができる物理的および／または化学的に可能である。図３Ａに示す例では、物理的固定化が可能である。化学的固定化は、本明細書に定義される化学的捕捉剤２８を含む。捕捉部位２２は、化学的固定化が可能である場合、使用される化学捕捉剤２８は、部分的には、フローセル１０に導入される複合体または試料に依存し得る。

【0103】

本明細書に開示される例のいくつかでは、捕捉部位２２は、フローセル１０に導入される複合体を捕捉することができる。本明細書に開示される他の例では、捕捉部位２２は、次いで、ライブラリを生成するためにフローセル表面上でさらなる処理を受ける試料を捕捉することができる。

【0104】

図１、図２Ａおよび図２Ｂにおいて、捕獲部位２２は、チャンバ１４の中心に形成される。捕捉部位２２は、チャンバ１４内の任意の望ましい位置に配置することができ、これは、凹部１６の配置に依存することができることを理解されたい。基材１２を横切る捕捉部位２２の位置は、均一であってもよく（例えば、各捕捉部位２２は、各チャンバ１４内の実質的に同じ位置（例えば、中心、遠い左など）にあってもよく）、または不均一であってもよい（例えば、捕捉部位２２は、異なるチャンバ２４内の異なる位置にあってもよい）。

【0105】

捕捉部位２２は、捕捉部位２２の構造（例えば、パッチ、ウェル、突起など）、捕捉部位２２が形成されるチャンバ１４の寸法、および捕捉部位２２によって捕捉される複合体または試料の種類に少なくとも部分的に依存し得る、任意の適切な形状、幾何学的形状および寸法を有し得る。

【0106】

図１、図２Ａおよび図２Ｂに示される例では、捕捉部位２２は、間質領域２４の一部に適用される化学捕捉剤２８である。本明細書中に開示される化学捕捉剤２８の任意の例が使用され得る。一実施形態では、化学捕捉剤２８は、マイクロ接触プリンティング、エアロゾルプリンティングなどを使用して、望ましい位置に堆積されてもよい。別の例では、マスク（例えば、フォトレジスト）を使用して、化学捕捉剤２８が堆積される空間／位置を画定することができる。次いで、化学捕捉剤２８を堆積し、マスクを除去することができる（例えば、リフトオフ、溶解、または別の適切な技術を介して）。この実施形態では、化学捕捉剤２８は、化学捕捉剤２８の単層または薄層を形成することができ、これをパッチと呼ぶことができる。

【0107】

捕捉部位２２の他の例を図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃに示す。捕捉部位２２のいずれかは、基材１２上に画定されたチャンバ１４（および追加の材料１８を含む）を有するもの、または基材１２内に画定されたチャンバ１４を有するものを含む、フローセル１０の任意の例において使用され得ることを理解されたい。

【0108】

図３Ａおよび図３Ｂでは、捕獲部位２２は、基材１２内に画定されたウェル３０を含む。ウェルは、凹部１６と同じ方法で基材１２内に「画定」されてもよい。ウェル３０は、使用される基材１２に応じて、エッチング、フォトリソグラフィ、および／またはインプリントを用いて形成されてもよい。一実施例では、ウェル３０は、凹部１６と同時に形成されてもよい。

【0109】

ウェル３０は、凹部１６について本明細書に記載されるもののいずれかを含む、任意の適切な形状および幾何学的形状を有することができる。

【0110】

図３Ａに図示例では、ウェル３０は、複数の凹部１６の各々の開口部寸法よりも大きい開口部寸法を有する。この実施例では、「開口部寸法」は、各ウェル開口部および各凹部開口部によって占有される面積、および／または各ウェル開口部および各凹部開口部の直径、および／または各ウェル開口部および各凹部開口部の長さおよび幅を指す。ウェル３０の開口部寸法は、導入される複合体または試料の寸法に依存し得る。図３Ａに図示例では、凹部１６は、部分的には、複合体または試料を物理的に収容することができないように、ウェル３０よりも小さい。図３Ａでは、凹部１６の深さは、ウェル３０の深さよりも小さいが、直径または長さおよび幅も、より小さくてもよいことが理解されるべきである。他の例では、ウェル３０は、凹部１６と同様の大きさまたは同じ大きさであってもよい。一例では、化学捕捉剤２８はプライマー２０を含み、したがって、凹部１６のいずれかは、複合体または試料を捕捉するウェル３０として機能し得る。

【0111】

いくつかの例では、ウェル３０は、そこに添加される付加的な化学捕捉剤２８を有していない。これらの実施例では、開口部寸法は、複合体または試料が、サイズ排除により凹部１６ではなく、ウェル３０に自己集合することを可能にする。

【0112】

他の例では、ウェル３０は、（図３Ａにファントムで示されるように）添加される追加の化学捕捉剤２８を有する。本明細書中に開示される化学捕捉剤２８の任意の例が使用され得る。一実施例では、化学捕捉剤２８は、マイクロ接触プリンティングを使用してウェル３０内に堆積されてもよい。別の例では、マスク（例えば、フォトレジスト）を使用して、ウェル３０内に化学捕捉剤２８を堆積させることができる。これらの実施例では、開口部寸法は、サイズ排除によって、および化学捕捉剤２８とフローセル１０に導入された複合体または試料との間の結合親和性によって、凹部１６ではなく、複合体または試料がウェル３０に自己集合することを可能にする。

【0113】

図３Ｂの捕捉部位２２は、ウェル３０と、その表面に化学捕捉剤２８を有する捕捉ビーズ３２とを含む。捕捉ビーズ３２は、凹部１６内にではなく、ウェル３０内に適合するようなサイズにすることができる。いくつかの例では、捕捉ビーズ３２は、隣接する間質領域２４と同一平面であってもよく、またはそれよりわずかに上方に延在してもよく、それにより、それに最終的に付着する複合体または試料がウェル３０内に閉じ込められないようにする。一実施例では、捕捉ビーズ３２は、二酸化ケイ素、超常磁性材料、ポリスチレン、およびアクリレートからなる群から選択される。本明細書中に開示される化学捕捉剤２８の任意の例は、捕捉ビーズ３２の表面上で使用されてもよく、ウェル３０に導入される前に捕捉ビーズ３２上にコーティングされてもよい。

【0114】

ウェル３０の深さ（図３Ａまたは３Ｂ）は、化学捕捉剤２８がそこに導入されるかどうか、および捕捉ビーズ３２がそこに導入されるかどうかに応じて変化し得る。深さは、これらの材料を収容するために少なくとも選択され得る（すなわち、材料はウェル３０内に収容される）。一実例では、ウェル３０の深さは、約１ｎｍ～約５μｍの範囲である。他の実施例では、ウェル３０の深さは、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、または約１μｍ～約５μｍの範囲である。他の深さも可能である。

【0115】

図３Ｃにおいて、捕捉部位２２は、基材１２または基材１２の表面Ｓ_１２に画定される突起３４を含む。突出部３４は、隣接する表面から外側（上方）に延在する三次元構造である。突出部３４が基材１２内に形成されると、基材１２は、隣接する周囲の間質領域２４の上方に延びるように（例えば、ビアエッチング、フォトリソグラフィ、インプリントなどによって）パターン化される。基材１２上に突起部３４が形成されると、追加の材料１８は、隣り合う周囲の基材表面Ｓ_１２の上方に延在するようにパターニングされる（例えば、エッチング、フォトリソグラフィ、インプリンティング等を介して）。

【0116】

突出部３４には、任意の適切な三次元形状を使用することができるが、少なくとも実質的に平坦な上面を有する形状が望ましい。例示的な凸形状は、球体、円柱、立方体、多角形プリズム（例えば、長方形プリズム、六角形プリズムなど）などを含む。

【0117】

図３Ｃに示すように、突出部３４の上面に化学捕捉剤２８が塗布される。本明細書に開示される化学捕捉剤２８の任意の例を使用することができ、任意の堆積技術を使用して、化学捕捉剤２８を突出部３４の上面に適用することができる。

【0118】

いくつかの例では、チャンバ１４ごとに１つの捕捉部位２２を有することが望ましい場合がある。他の例では、チャンバ１４ごとに複数の分離された捕捉部位２２を有することが望ましい場合がある。個々のチャンバ１４内の捕捉部位２２の数は、所与のチャンバ１４内に捕捉される複合体の数を制御するのに役立ち得る。

【0119】

図２Ａおよび２Ｂを再び参照すると、フローセル１０は、セパレート材１８または基材１２に接合された蓋３６を含むこともできる。蓋３６は、単一の流路（複数のチャンバ１４と流体連通する）または複数の流体分離流路（それぞれが複数のチャンバ１４のサブセットと流体連通する）を画定するように配置されてもよい。

【0120】

蓋３６は、凹部１６に向かう励起光に対して透明な任意の材料であってもよい。例として、蓋は、ガラス（例えば、ホウケイ酸塩、溶融シリカなど）、プラスチックなどであってもよい。好適なホウケイ酸ガラスの市販の例は、Schott North America, Inc．から入手可能なD２６３（登録商標）である。適切なプラスチック材料、すなわちシクロオレフィンポリマーの商業的に入手可能な例は、Zeon Chemicals L.P.から入手可能なZEONOR（登録商標）製品である。

【0121】

蓋３６は、レーザー結合、拡散接合、陽極結合、共晶結合、プラズマ活性化結合、ガラスフリット結合、または当技術分野で公知の他の方法のような任意の適切な技術を用いて結合することができる。一実施形態では、スペーサ層を使用して、蓋３６をセパレート材１８または基材１２の部分に結合することができる。スペーサ層は、セパレート材１８または基材１２および蓋３６の少なくとも一部を互いにシールする任意の材料とすることができる。

【0122】

図示されていないが、基材１２と蓋３６との間、または基材１２と凹部１６との間に、１つ以上の追加の層を組み込むことができることを理解されたい。これらの追加層は、エバネッセントフィールドを有する凹部１６の励起のための平面導波路として機能するように選択され得る。

【0123】

他のフローセルアーキテクチャもまた、本明細書において企図されることを理解されたい。一例として、フローセル１０は、チャンバ１４および捕捉部位２２を含むことができるが、凹部１６は含まないこととしてもよい。これらの例では、プライマー２０は、個別の凹部１６ではなく、チャンバ１４の底面に付着することができる。チャンバ１４の底面は、層２６およびプライマー２０で機能化されてもよい。いくつかの例では、層２６は、（捕捉部位２２が形成される場合を除いて）底面全体に適用されてもよい。これらの実施例では、少なくとも実質的に均一なプライマー２０がチャンバ１４の底面を横切って形成されてもよい。他の例では、層２６は、チャンバ１４内で互いに空間的に分離されたアイランド（例えば、形状が円形、三角形、長方形など）として適用されてもよい。フローセル１０上に捕捉された特定の複合体から放出されたライブラリフラグメント、またはフローセル１０上にその場で形成されたライブラリフラグメントは、（チャンバ１４内の凹部１６内に制限される（閉じ込め）のとは対照的に）チャンバ１４内にランダムに分布し得る。このフローセルアーキテクチャの例を図５（ｉ）～５（ｉｉｉ）に示す。

【0124】

別の例として、フローセル１０は、チャンバ１４または凹部１６のない捕捉部位２２を含むことができる。これらの例において、捕捉部位２２は、基材を横切る望ましい幾何学的形状に配置され得、プライマー２０は、捕捉部位２２の周囲の基材１２の表面に付着され得る。フローセル１０上に捕捉された特定の複合体から放出されたライブラリフラグメント、またはフローセル１０上にin situ（その場）で形成されたライブラリフラグメントは、基材１２上にランダムに分布し得、放出されたライブラリフラグメントの閉じ込めは、反応－拡散を制御することによって達成され得る。

【0125】

さらに別の例として、フローセル１０は、凹部１６および捕捉部位２２を含むことができるが、チャンバ１４は含まない。これらの例では、捕捉部位２２は、基材１２を横切る望ましい幾可学的形状に配置することができ、プライマー２０は、本明細書に記載されるように、凹部１６の各々の内部に付着させることができる。フローセル１０上に捕捉された特定の複合体から放出されたライブラリフラグメント、またはフローセル１０上にin situで形成されたライブラリフラグメントは、複合体近傍の凹部１６にランダムに分布し得、放出されたライブラリフラグメントの制限（閉じ込め）は、反応－拡散を制御することによって達成され得る。

【0126】

さらに他の例では、チャンバ１４の壁は、フローセル１０に導入された複合体または試料の１つ以上を捕捉するのに十分な高さを有するので、捕捉部位２２は含まれない。複合体または試料の１つ以上を捕捉するのに十分な高さは、フローセル１０に導入される複合体または試料の平均直径の少なくとも約５０％であるチャンバ深さに対応する。一実施例では、チャンバ１４の壁の高さまたは深さは、１０μｍ以上である。本実施例では、所与のチャンバ１４内の複合体または試料の数／量はランダムであり、ポアソン分布によって決定される。

【0127】

本明細書に開示される実施例のいずれにおいても、プライマー２０は、部分的には層２６が側壁上に位置していない可能性があるため、凹部１６および／またはチャンバ１４側壁上に位置していなくてもよいことを理解されたい。これは、ライブラリフラグメントが側壁に播種するのを防ぐのに役立つ。

【0128】

本明細書に開示されるフローセルアーキテクチャは、配列決定技術、例えば、リンクロングリード配列決定用途、ハイスループットタンパク質バイオマーカー検討、マイクロビオーム検討、または単一細胞オミクスを含む、様々な用途において使用され得る。例えば、本明細書に開示されるフローセルアーキテクチャおよび方法は、ＤＮＡで標識された抗体の結合を分析するために使用され得る。本実施例では、抗体標識は、フローセルアーキテクチャに導入される、Ｐ５／Ｐ７アダプタを有するユニークＤＮＡ配列に結合される。抗体を切断することができ、放出されたＰ５／Ｐ７プライマーをフローセル上に播種する。シードされたプライマーは、どの抗体が結合されたかの識別を可能にする。
フローセルアーキテクチャで使用する複合体

【0129】

フローセルアーキテクチャは、本明細書に開示される複合体の例と共に使用するのに特に好適であり得る。本明細書に記載されるように、複合体は、担体（例えば、ハイドロゲル保持体または固形保持体）と、担体に結合するかまたは担体内に含まれる配列決定可能な核酸フラグメントとを含む。適当な複合体の例を図４Ａ～４Ｃに示す。複合体を作製するためのいくつかの例示的な方法が記載されているが、担体に付着した、または担体内に含まれる、配列決定可能な核酸フラグメントである限り、他の方法を使用してもよいことが理解されるべきである。

【0130】

図４Ａは、固形保持体４２と、固形保持体４２に結合された配列決定可能な核酸フラグメント４４とを含む複合体４０Ａを示す。

【0131】

一例では、この複合体４０Ａを形成するために、アダプタ配列（５２、５２’）が、結合対の１つのメンバー４６を介して固体保持体４２に結合される。一実施形態では、このアダプタ配列は、フローセル１０Ａ～１０Ｉ上のプライマー２０のうちの１つの少なくとも一部に相補的な第１の配列（例えば、Ｐ５’配列）、第１の配列決定プライマー配列（例えば、読み取り１配列決定プライマー配列）を含む。前述のように、このアダプタ配列は、結合対の一方のメンバー４６（例えば、ビオチン）に結合され、それにより、（結合対の他方のメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジンなど）を含む）固形保持体４２の表面に結合され得る。このアダプタシーケンスには、インデックスシーケンスも含まれる場合がある。

【0132】

Ｙアダプタをトランスポザーゼ酵素（例えば、２つのＴｎ５分子）と混合して、トランスポソームを形成してもよい。Ｙ－アダプタは、互いにハイブリダイズする２つのモザイク末端配列を含むことができる。モザイク末端配列のうちの１つは、フローセル１０Ａ～１０Ｉ上のプライマー３６のうちの１つの少なくとも一部に相補的な第２の配列（例えば、Ｐ５’配列）、第２の配列決定プライマー配列（例えば、読み取り２配列決定プライマー配列）、および任意選択的にインデックス／バーコード配列に結合され得る。第２の配列決定プライマー配列と第２の配列は合わせて、アダプタ配列４８、４８’を構成する。

【0133】

次いで、タグ付け（標識化）処理を実施することができる。試料（例えば、ＤＮＡ）を含む液体（例えば、標識緩衝液）を、トランスポソームおよびそれに結合したアダプタ配列を有する固形保持体４２に添加することができる。試料がトランスポソームに接触すると、ＤＮＡにタグが付けられ（固形保持体４２上のアダプタ配列５２、５２’でフラグメント化され、タグが付けられ）、Ｙアダプタに結合され（例えば、遊離モザイク末端配列のライゲーションによって）、試料を連続的にタグ付けすると、トランスポソーム間に複数の架橋分子が生じる。配列決定可能なフラグメントを完成させるために、さらなる伸長およびライゲーションが行われ、フラグメント５０、５０’が配列４８および４８’に確実に結合される。次いで、トランスポザーゼ酵素は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処理または加熱またはプロテイナーゼＫ消化によって除去され得る。

【0134】

得られた複合体４０Ａを図４Ａに示す。架橋された分子は、配列決定可能な核酸フラグメント４４であり、その各々は、フラグメント５０、５０’およびいずれかの端部に結合したアダプタ配列４８、５２または４８’および５０’を含む。アダプタ配列５２、５２’は、最初に固体支持体４２に結合されたものであり、第１の配列決定プライマー配列、フローセルプライマーに相補的な第１の配列、および結合複合体の１つのメンバー４６を含む。アダプタ配列４８、４８’はＹ－アダプタ由来であり、別のフローセルプライマーおよび第２の配列決定プライマー配列に相補的な第２の配列を含む。それぞれの配列決定可能な核酸フラグメント４４は、増幅（例えば、ブリッジ増幅）および配列決定のための適当なアダプタを含むので、ＰＣＲ増幅は行われない。このように、これらのフラグメント４４は配列決定可能である。さらに、ライブラリフラグメント４４は同じサンプルからのものであるため、フラグメント４４はリンクされた長い読み取りアプリケーションに適している可能性がある。

【0135】

図４Ｂは、固形保持体４２と、固形保持体４２に結合された配列決定可能な核酸フラグメント４４’とを含む別の複合体４０Ｂを示す。一実施形態では、ＰＣＲを含まないヌクレオチドライブラリが管内に作成され、次いでライブラリが管内の固形保持体４２にハイブリダイズされる。図４Ｂに図示例では、結合対の１つのメンバーを有するプライマーが、管中のライブラリフラグメントに添加され、次いで、配列決定可能な核酸フラグメント４４’が、固形保持体４２に結合される。別の実施形態では、固形保持体４２は、結合対（例えば、保持体４２上のアビジンおよびプライマーに結合されたビオチン）を介してそれらに結合されたプライマーを有してもよい。これらのプライマーはライブラリフラグメントにハイブリダイズする（したがって、プライマーと結合対のメンバーはフラグメントの一方の端部にあり、もう一方の端部にはない）。別の例では、伸長は、鎖置換酵素を用いて行うことができる。これは、完全に二本鎖ライブラリ（例えば、図４Ｂに示すように、フォークまたはＹアダプタなし）をもたらす。配列決定可能な核酸フラグメント４４’は、変性を介してフローセル上に放出され得る。ライブラリフラグメント４４’は、中実保持体４２に付着される前に作成されるので、フラグメント４４’は、同じ試料からでなくてもよく、したがって、リンクされた長い読み取りアプリケーションには適さない場合がある。

【0136】

図４Ｃは、ハイドロゲル保持体７０およびハイドロゲル保持体７０内に含まれる配列決定可能な核酸フラグメント４４’’を含む複合体４０Ｃの一例を示す。

【0137】

この複合体４０Ｃを形成するために、ハイドロゲルモノマーおよび／または重合体および／または架橋剤を含有する流体を、試料（例えば、遺伝物質）の存在下で混合する。この流体は、鉱油または別の適切な疎水性流体に装填され、乳化されて液滴を生成することができる。ハイドロゲルモノマーおよび／またはポリマーを重合および／または架橋し、ハイドロゲル保持体７０を形成するために、ラジカル開始剤を添加してもよい。適切なモノマー、ポリマー、架橋剤、および開始剤の例は、図５（ｉ）～（ｉｉｉ）を参照して記載される。

【0138】

試料は、その大きさがハイドロゲルビーズの細孔を通過することができないほど十分であるので、ハイドロゲル保持体内に封入されるようになる。いくつかの例において、試料はＤＮＡまたはＲＮＡであり、少なくとも約１００ヌクレオチド長（例えば、１０００ヌクレオチド以上、１０，０００ヌクレオチド以上、５００，０００ヌクレオチド以上など）である。いくつかの例では、ハイドロゲル保持体７０の細孔サイズは、複数の細孔の測定に基づいて、平均直径または細孔の断面の平均有効直径を指す。円形でない断面の有効直径は、非円形断面の同一の断面積を有する円形断面の直径に等しい。一実施例では、細孔径は、約１０ｎｍ～約１００ｎｍの範囲である。

【0139】

次いで、ライブラリ調製は、ハイドロゲル保持体７０内で行うことができる。多数の試薬交換は、ハイドロゲル保持体７０の細孔を通って行われてもよい。試料およびそこから生成された任意のライブラリフラグメントは、ハイドロゲルマトリックス内に維持される。ライブラリ調製は、試料をフラグメント化し、配列決定可能なフラグメント４４’’をもたらすアダプタを加えることを含むことができる。

【0140】

一実施例では、ライブラリ調製は、ハイドロゲル保持体７０内で行われるタグ付けを介して行われ得る。得られた複合体４０Ｃを図４Ｃに示す。アダプタ配列は、ブリッジ増幅および配列決定のための適当なアダプタを含み、したがって、得られたフラグメント４４’’は配列決定可能である。別の例では、ポリメラーゼ伸長を用いてライブラリ調製を行ってもよく、これにより二本鎖ライブラリが生じる。この実施例のライブラリは、ハイドロゲル保持体７０を形成して播種する前に変性される必要がある。
複合体を含む方法

【0141】

本明細書に開示される方法のいくつかの例は、本明細書に開示されるフローセル１０の例、および複合体４０A、４０B、または４０Cのいずれか１つを利用する。上述のように、複合体４０A、４０B、または４０Cの各々は、遺伝物質の同じ試料から得られた配列決定可能なフラグメントを含む。１つまたは数個の複合体がそれぞれのチャンバ内で単離されると、同じ試料からのライブラリの空間的共局在化が達成される。

【0142】

第１の例の方法では、フローセル１０は、複数のチャンバ１４を含むが、捕捉部位２２は含まない。むしろ、チャンバ１４自体は、フローセルに導入される複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃの捕捉部位として機能する。各チャンバ１４は、例えば、その深さが、導入される複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃの平均直径の少なくとも約５０％である場合、捕捉部位として機能することができる。一実施例では、深さは、少なくとも約１０μｍ（約１０μｍ以上）である。本実施例では、フローセル１０は、チャンバ１４の底面に付着されたプライマー２０を有してもよく、またはプライマー２０が内部に含まれた凹部１６を含んでもよい。これらの実施例では、任意の所与のチャンバ１４内にトラップされる複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃの数は、ランダムであってよく、ポアソン分布によって決定されてよい。

【0143】

この第１の例の方法では、複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃは、例えば、１つ以上の入力ポートを介してフローセル１０に導入される。複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃは、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液または０．５ｘ生理食塩水クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液などの流体に導入され得る。流体からの少なくともいくつかの複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃは、チャンバ１４の少なくともいくつかに沈降する。いくつかの複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃは沈降せず、これらの複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃは、さらなるプロセスが実行される前にフローセルから除去されることを理解されたい。いくつかのチャンバ１４は、複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃのうちの１つまたは複数を受け入れてもよく、一方、チャンバ１４の他のものは、複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃを受け入れなくてもよいことも理解されたい。この例における複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃの分布は、部分的には、捕捉部位２２の欠如のために、ランダムである。

【0144】

次いで、この第１の例の方法は、非捕捉複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃをフローセルから洗い流すことを含む。洗浄は、流体をフローセル１０に導入することを含むことができる。フローは、フローセルの出口ポートを通って沈降していない任意の複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃを押し出すことができる。深いチャンバ１４は、沈降した複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃが出口流の一部になることを防止することができる。

【0145】

次いで、この方法の例は、捕捉された複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃの担体（例えば、固形保持体４２またはハイドロゲル保持体７０）に、それぞれの複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃが捕捉されているそれぞれのチャンバ１４内に配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’を放出させることを含み、本実施例では、配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’の運搬および播種は、それぞれのチャンバ１４の深さによって制限され、したがって、外部固定化剤はフローセルに導入されない。

【0146】

使用される複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃに応じて、配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’を放出させる担体（すなわち、保持体４２または７０）を、変化させることができる。一実施例では、担体は、固形保持体４２であり、その原因は、フローセルに開裂剤を導入することを含む。切断剤は、固形保持体４２からの配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’の化学的、酵素的、または光化学的放出を開始することができる。これらの例示では、別の刺激、例えば、熱または光線は、開裂剤をトリガ（誘発）して、ライブラリフラグメント４４または４４’を固形保持体４２から放出することができる。一例として、遊離ビオチンを切断剤として導入し、約９２℃に加熱して、固形保持体４２からのビオチン－オリゴ放出を誘導することに使用することができる。

【0147】

他の例では、複合体４０Ｃが使用され、したがって担体はハイドロゲル保持体７０である。これらの他の例では、ライブラリ放出を引き起こすことは、フローセル１０を加熱すること、フローセル１０に開裂剤を導入すること、またはそれらの組み合わせを含むことができる。ハイドロゲル保持体７０からライブラリフラグメント４４’’を放出するための加熱は、約９０℃の温度までの加熱を含むことができる。フローセル１０全体を加熱することができ、複合体４０Cが加熱されると、ハイドロゲル保持体７０は分解してフラグメント４４’’を放出することができる。いくつかの例において、切断剤は、ハイドロゲル保持体７０を解重合し、そこから配列決定可能なフラグメント４４’’を放出することができる１つ以上の成分を含むことができる。例として、切断剤には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス－（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、またはトリス－（３－ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）が含まれる。他の例では、切断剤は光である。これらの例において、ハイドロゲル保持体７０を形成するために使用される架橋剤は、光開裂可能部分を含むことができ、適切な波長の光へのチャンバ１４中の複合体４０Ｃの曝露は、この部分を開裂し、ハイドロゲル保持体７０を分解することができる。

【0148】

前述のように、配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’の輸送および播種は、それぞれのチャンバ１４の深さによって制限され、したがって、任意の特定の複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃのフラグメント４４、４４’、または４４’’は、特定の複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃが閉じ込められているチャンバ１４に限定される。

【0149】

本明細書中に開示されるフローセル構造を用いて、フローセル１０の表面上のプライマー２０は、放出された配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’を播種することができる。一例において、播種は、フラグメント４４、４４’、または４４’’の第１または第２の配列と、プライマー２０の相補的なものと、チャンバ１４との間のハイブリダイゼーションを介して達成される。播種は、フラグメント４４、４４’、または４４’’およびプライマー２０に対して適切なハイブリダイゼーション温度で行うことができる。

【0150】

各チャンバ１４内の配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’シードの位置は、プライマー２０がチャンバ１４内でどのように付着されるかに部分的に依存する。フローセル１０のいくつかの例では、各チャンバ１４は底面を有し、プライマー２０は底面を横切ってポリマー層２６に付着されるか、またはプライマー２０は底面上に配置された複数の空間的に分離されたポリマーアイランドにそれぞれ付着される。これらの例では、配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’は、チャンバ１４の底面にわたって、またはアイランドの各々にわたって播種される。他の例では、各チャンバ１４は、底面と、その中に画定された複数の凹部１６とを有し、プライマー２０は、凹部１６の各々の内部のポリマー層２６にそれぞれ付着されている。これらの実施例では、配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’は、凹部１６の各々の内部のポリマー層２６にわたって播種される。

【0151】

別の例示的な方法（第２の例示的な方法）では、フローセル１０は、複数のチャンバ１４と、複数のチャンバ１４の各々の内部の捕捉部位２２と、複数のチャンバ１４の各々の内部に付着されたプライマー２０とを含む。本実施例では、フローセル１０は、凹部１６を含んでも含まなくてもよい。

【0152】

この第２の例示的な方法では、各チャンバ１４の深さは５μｍ以下である。このような浅い深さでは、捕捉部位２２は、単一のチャンバ１４内に単一の複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃを固定化するために含まれてもよい。各チャンバ１４は捕捉部位２２を有するが、チャンバ１４のいくつかは、本方法の所与の走行中に複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃを受け入れないことができることを理解されたい。

【0153】

この第２の例示的な方法では、複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃは、例えば、１つ以上の入力ポートを介してフローセル１０に導入される。複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃは、本明細書に開示される緩衝液のような流体に導入され得る。本実施例では、各の捕捉部位２２および複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃは結合対のメンバーであり、したがって、１つの複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃは、チャンバ１４の各内の１つの捕捉部位２２に結合する。より具体的には、捕捉部位２２は、結合対の第１のメンバーを含み得、複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃの各々は、結合対の第２のメンバーを含み得る。１つの具体的な例として、捕捉部位２２は、捕捉部位プライマー（例えば、捕捉オリゴヌクレオチド）であり、複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃの各々は、捕捉部位プライマーにハイブリダイズし得る相補的プライマーを含む。別の具体例として、捕捉部位２２は、アビジンを含むことができ、ビオチンは、複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃの表面に付着することができる。

【0154】

次いで、この第２の例示的な方法は、フローセル１０から非固定化複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃを洗い流すことを含む。洗浄は、フローセル１０に任意の適切な緩衝液を導入することを含むことができる。流れは、捕捉部位２２に付着していない任意の複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃを、フローセル１０の出口ポートを通って押し出すことができる。

【0155】

次いで、この第２の例示的な方法は、フローセル１０、具体的には複数のチャンバ１４に外部固定化剤を導入することを含む。一実例では、外部固定化剤は、空気、またはフローセルチャンバ１４に導入された流体の複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃと混和しない液状媒体もしくは粘性媒体である。

【0156】

空気を使用してフローセル１０から洗浄流体を吸引することにより、複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃを取り囲み、拡散バリアを形成する液滴を生成することができる。液体または粘性の外部固定化剤は、チャンバ１４内に付着された複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃを少なくとも部分的に取り囲んでいる。複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃを少なくとも部分的に取り囲むことによって、外部固定化剤は、フラグメント４４、４４’、または４４’’が放出されるときに、チャンバ１４の外側の配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’の拡散を阻害する。外部固定化剤が温度応答性材料である場合、播種温度まで温度を上昇させると、薬剤がより粘性になり、ライブラリ拡散を防止することができる形態となり得る。

【0157】

ここに開示される外部固定化剤のいずれを使用してもよいが、一例では、外部固定化剤は、鉱油およびシリコーンオイル、グリセロールおよびスクロースからなる群から選択される粘性媒体拡散バリア、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される液体拡散バリアであることを理解されたい。

【0158】

次いで、この例示的な方法は、捕捉された複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃの担体（例えば、固形保持体４２またはハイドロゲル保持体７０）に、配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’を、それぞれ固定化された４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃが捕捉されたそれぞれのチャンバ１４内に放出させることを含み、本実施例では、配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’の運搬および播種は、外部固定化剤によって制限される。

【0159】

担体（すなわち、保持体４２または７０）を配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’を放出させることは、使用される複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃに応じて変化し得る。一実施形態では、担体は固体保持体４２であり、その原因は（第１の実施形態で説明したように）切断剤をフローセル１０に導入し、別の刺激を用いて切断剤をトリガし、固体保持体４２からライブラリフラグメント４４または４４’を放出することを含む。他の例では、複合体４０Ｃが使用され、したがって担体はハイドロゲル保持体７０である。これらの他の例では、ライブラリ放出を引き起こすことは、フローセルを加熱すること、フローセルに切断剤を導入すること、またはそれらの組み合わせ（第１の例の方法に記載されるように）を含み得る。

【0160】

前述のように、この第２の例示的な方法における配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、４４’’の輸送および播種は、外部固定化剤によって制限される。したがって、任意の特定の複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃのフラグメント４４、４４’、または４４’’は、外部固定化剤が複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃを少なくとも部分的に取り囲んでいるため、特定の複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃが閉じ込められているチャンバ１４に限定される。

【0161】

本明細書に開示されるフローセルアーキテクチャを用いて、フローセル１０の表面上のプライマー２０は、放出された配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’を播種することができ、播種は、フラグメント４４、４４’、または４４’’の第１または第２の配列と、チャンバ１４との相補的なプライマー２０の１つとの間のハイブリダイゼーションを介して達成される。播種は、フラグメント４４、４４’、または４４’’およびプライマー２０に対して適切なハイブリダイゼーション温度で行うことができる。

【0162】

各チャンバ１４内の配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’播種（シード）の位置は、プライマー２０がチャンバ１４内でどのように付着されるかに部分的に依存する。フローセルのいくつかの例では、各チャンバ１４は底面を有し、プライマー２０は底面を横切ってポリマー層２６に付着されるか、またはプライマー２０は底面上に配置された複数の空間的に分離されたポリマーアイランドにそれぞれ付着される。これらの例では、配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’播種は、チャンバ１４の底面にわたる（横切る）か、またはアイランドの各々にわたる。他の例では、各チャンバ１４は、底面と、その中に画定された複数の凹部とを有し、各凹部１６内のポリマー層２６にプライマーがそれぞれ付着されている。これらの実施例では、配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’シードは、凹部１６の各々の内部のポリマー層２６にわたる。

【0163】

本方法のさらに別の例（第３の例として参照される方法）では、図１、２Ａ、２Ｂ、および３Ａ～３Ｃに示されるフローセル１０の任意の例を使用することができる。この第３の例示的な方法では、捕捉部位２２は、単一の複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃを単一のチャンバ１４内に固定化するために含まれ得、各チャンバ１４の深さは、配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’の、それぞれのチャンバ１４内のそれぞれの凹部１６への輸送および播種を制限するのに十分であり得る。

【0164】

この第３の例示的な方法では、複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃは、例えば、１つ以上の入力ポートを介してフローセル１０内に導入される。複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃは、本明細書に開示される緩衝液のような流体に導入され得る。本実施例では、それぞれの捕捉部位２２および複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃは結合対のメンバーであり、したがって、１つの複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃは、少なくともいくつかのチャンバ１４内の１つの捕捉部位２２に結合する。各チャンバ１４は、捕捉部位２２を有するが、チャンバ１４のいくつかは、本方法の任意の所与の走行中、複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃを受け入れないことがあることを理解されたい。

【0165】

この第３の例示的な方法は、次いで、フローセル１０から非捕捉複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃを洗い流すことを含む。洗浄は、フローセルに緩衝液を導入することを含むことができる。流れは、捕捉部位２２に固定化されていない任意の複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃを、フローセル１０の出口ポートを通って押し出すことができる。

【0166】

次いで、この例示的な方法は、捕捉された複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃの担体（例えば、固形保持体４２またはハイドロゲル保持体７０）に、それぞれの複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃが捕捉されているそれぞれのチャンバ１４内に配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’を放出させることを含み、本実施例では、配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’の運搬および播種は、それぞれのチャンバ１４の深さによって制限され、したがって、外部固定化剤はフローセル１０に導入されない。

【0167】

使用される複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃに応じて、配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’を担体（すなわち、保持体４２または７０）に放出させることは、変化し得る。一実施例では、担体は固体保持体４２であり、その原因は、（第１の例示的な方法で説明したように）開裂剤をフローセル１０に導入させ、フローセル１０を外部刺激に曝すことを含む。他の例では、複合体４０Ｃが使用され、したがって担体はハイドロゲル保持体７０である。これらの他の例では、ライブラリ放出を引き起こすことは、フローセルを加熱すること、フローセルに切断剤を導入すること、またはそれらの組み合わせ（第１の例示的な方法に記載されるように）を含み得る。

【0168】

前述のように、配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’の輸送および播種は、それぞれのチャンバ１４の深さによって制限され、したがって、任意の特定の複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃのフラグメント４４、４４’、または４４’’は、特定の複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃが閉じ込められているチャンバ１４に制限される。この特定の例では、フローセル１０は、凹部１６内にプライマー２０を含むので、フラグメント４４、４４’、または４４’’の播種は、凹部１６内で行われ、間質領域２４上では行われない。

【0169】

別の例示的な方法（第４の例示的な方法）では、フローセル１０は、本明細書に開示されるアーキテクチャのいずれであってもよく、少なくとも捕捉部位２２およびプライマー２０を含む。

【0170】

本明細書に開示される他の方法と同様に、複合体４０Ａまたは４０Ｂ（中実保持体４２を含む）は、例えば、１つ以上の投入口を介してフローセル１０に導入される。複合体４０Ａまたは４０Ｂは、本明細書に開示される緩衝液のような流体に導入されてもよい。本実施例では、それぞれの捕捉部位２２および複合体４０Ａまたは４０Ｂは結合対のメンバーであり、その結果、１つの複合体４０Ａまたは４０Ｂが１つの捕捉部位２２に結合する。より具体的には、捕捉部位２２は、結合対の第１のメンバーを含み得、複合体４０Ａまたは４０Ｂの各々は、結合対の第２のメンバーを含み得る。１つの具体的な例として、捕捉部位２２は、捕捉部位プライマー（例えば、捕捉オリゴヌクレオチド）であり、複合体４０Ａまたは４０Ｂの各々は、捕捉部位プライマーにハイブリダイズし得る相補的プライマーを含む。別の具体例として、捕捉部位２２は、アビジンを含むことができ、ビオチンは、複合体４０Ａまたは４０Ｂの表面に付着することができる。

【0171】

次いで、この第４の例示的な方法は、フローセル１０に外部固定化剤を導入することを含む。

【0172】

一例では、外部固定化剤は空気である。フローセル１０に空気を導入することは、（複合体４０Ａまたは４０Ｂが導入された）流体の大部分を吸引し、また、非固定化複合体４０Ａまたは４０Ｂをフローセル１０から押し出す。固定化複合体４０Ａまたは４０Ｂは、流体ピン止め中心として働き、したがって、流体からの液体の一部をそれぞれの表面に保持する。保持された流体は、各複合体４０Ａまたは４０Ｂを取り囲む液滴を形成する。いくつかの例では、液滴は、テントに似た形状（例えば、その高さが播種粒子によって設定される中心にあり、メニスカスプロファイルが液体の強い表面張力によって設定される）を有する液体フィルムである。この液滴は、複合体４０Ａまたは４０Ｂから放出されるライブラリフラグメント４４、４４’に対する拡散バリアを作り出す。

【0173】

いくつかの例では、複合体４０Ａまたは４０Ｂの周囲に形成される液滴は、隣接していてもよく、したがって、フローセル表面を横切る浅い液層を形成していてもよい。他の例では、複合体４０Ａまたは４０Ｂの周囲に形成される液滴は、互いに空間的に隔離されてもよい。さらに他の例では、液滴のいくつかは隣接しており、隣接する液滴の他のアイランドから空間的に隔離された液体アイランドを形成する。フローセル表面の複合体４０Ａまたは４０Ｂの密度が増加すると、浅い液体層が形成されやすくなる。

【0174】

液滴の構成は、望ましい直径を有する中実保持体４２を選択し、複合体４０Ａまたは４０Ｂを特定の表面密度で適用し、フローセル１０を通る空気の流量および／または速度を調整し、所望の物理的特性（例えば、粘性、表面張力など）を有するように流体を選択することによって制御することができる。例えば、フローセル１０内に固定化されたより多くの複合体４０Ａまたは４０Ｂ（例えば、より高い表面密度）は、より均一な厚さを有する浅い液体層をもたらす。対照的に、フローセル１０内に固定化される複合体４０Ａまたは４０Ｂがより少ない場合、液滴は、互いに単離されるか、または液体のアイランド（例えば、複合体１０Ａまたは１０Ｂのそれぞれのグループを取り囲む小さな分離されたパドル）を形成する傾向がある。

【0175】

空気は、所定の流量でフローセル１０に導入されてもよい。一実施形態では、流量は、約１００μＬ／分～約２０００μＬ／分の範囲である。前述のように、液滴の構成を変えるために空気流を調節することができる。例えば、空気流量は、複合体４０Ａまたは４０Ｂの周りの液体のサイズおよび／または直径に影響を与え得る。一例として、より高い空気流量は、連続的な浅い液体層をもたらし得るが、一方、より低い空気流量は、互いに隔離されるか、または液体のいくつかのアイランドを形成する液体液滴をもたらし得る。

【0176】

流体の物理的性質はまた、液滴の構成を変えることができる。例えば、より高い表面張力流体は、複合体４０Ａまたは４０Ｂの表面に付着する親和性がより高く、これは、より大きな濡れおよびより大きなメニスカスをもたらす。いくつかの例では、複合体４０Ａまたは４０Ｂを導入するために使用される液体は、約２０ｍＮ・ｍ^－１～約９０ｍＮ・ｍ^－１の範囲の表面張力を有するように選択され得る。例えば、６ＭのＮａＣｌ溶液は約８３ｍＮ・ｍ^－１の表面張力を有し、５５％のショ糖水溶液は約７６ｍＮ・ｍ^－１の表面張力を有し、水は７２．８６ｍＮ・ｍ^－１の表面張力を有し、界面活性剤を添加した水は２０ｍＮ・ｍ^－１から約７２ｍＮ・ｍ^－１の範囲の表面張力を有し、エタノールは２２．３９ｍＮ・ｍ^－１の表面張力を有する。しかしながら、表面張力は、複合体４０Ａまたは４０Ｂを導入するために使用される流体に応じて変化し得る。

【0177】

（孤立した液滴、パドルアイランド、または液体層の形態の）いずれかの液滴のピーク高さは、複合体４０Ａまたは４０Ｂの高さ未満である。一実施形態では、いずれかの液滴のピーク高さ（孤立した液滴、パドルアイランド、または液体層の形態）は、約３μｍ以下である。液滴の浅い高さは、放出されたライブラリフラグメントを、フローセル１０のＸ－Ｙ平面に沿って拡散させるが、むしろそれは、表面プライマー２０によって捕捉されるようになる流路全体にわたってではない。これにより、複合体４０Ａ、４０Ｂ近傍のライブラリフラグメントの局在性が改善され、そこから遊離される。

【0178】

別の例では、外部固定化剤は、フローセル１０に導入された複合体４０Ａまたは４０Ｂと混和しない液体媒体または粘性媒体である。本実施例では、液体または粘性媒体を導入する前に、非固定化複合体１０Ａまたは１０Ｂをフローセル１０から洗い流すことができる。洗浄は、フローセル１０に任意の適切な緩衝液を導入することを含むことができる。流れは、捕捉部位２２に付着していない任意の複合体４０Ａまたは４０Ｂを、フローセル１０の出口ポートを通って押し出すことができる。

【0179】

液体または粘性の外部固定化剤は、フローセル１０内に付着された複合体４０Ａまたは４０Ｂを少なくとも部分的に取り囲む浅い層（例えば、約３μｍ以下）を形成する量で導入することができる。複合体４０Ａまたは４０Ｂを少なくとも部分的に取り囲むことによって、外部固定化剤は、配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’の浅い層の外側への拡散を阻害する。外部固定化剤が温度応答性材料である場合、播種温度まで温度を上昇させると、薬剤がより粘性になり、ライブラリ拡散を防止することができる形態になる可能性がある。

【0180】

次いで、この例示的な方法は、固定化された複合体４０Ａまたは４０Ｂの担体（例えば、固形保持体４２）に、配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’を放出させることを含む。一例として、切断剤をフローセル１０に導入して（第１の例示的な方法に記載されるように）、別の刺激を加えて、切断剤をトリガして、ライブラリフラグメント４４または４４’を固形保持体４２から放出させることができ、本実施例では、配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’の運搬および播種は、複合体４０Ａまたは４０Ｂの周囲に形成された液滴によって制限される。

【0181】

本明細書中に開示されるフローセルアーキテクチャを用いて、フローセル１０の表面上のプライマー２０は、本明細書中に記載されるように、放出された配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’を播種することができる。

【0182】

複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃ（例えば、本明細書に記載の第１、第２、第３または第４の方法）を含む方法の実施例のいずれにおいても、シード配列決定ライブラリを、クラスタ生成を用いて増幅することができる。

【0183】

クラスタ発電の一例では、配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’は、ハイブリダイズしたプライマー２０から、高忠実度（ハイファイ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて３’伸長によりコピーされ、元の配列決定可能な核酸フラグメント４４、４４’、または４４’’は変性され、そのコピーはチャンバ１４内に固定化されたままである。等温ブリッジ増幅またはいくつかの他の形態の増幅を用いて、固定化コピーを増幅することができる。例えば、コピーされた鋳型は、隣り合う相補的プライマー２０にハイブリダイズするようにループオーバーし、ポリメラーゼは、コピーされた鋳型をコピーして二本鎖ブリッジを形成し、これは変性されて二本鎖の鎖を形成する。これらの２つの鎖は、隣接する相補的なプライマー２０上をループし、ハイブリダイズし、再び伸長されて２つの新しい二本鎖ループを形成する。このプロセスは、等温変性および増幅のサイクルによって各テンプレートコピー上で繰り返され、密なクローンクラスタを作り出す。二本鎖ブリッジのそれぞれのクラスタは変性している。一実施形態では、リバース鎖は、特定の塩基切断によって除去され、前方鋳型ポリヌクレオチドトランドを残す。クラスタ化は、例えば、各チャンバ１４内、いくつかの例では、各チャンバ１４内の各凹部１６内で、いくつかの鋳型配列決定可能な核酸フラグメントの形成をもたらすことを理解されたい。このクラスタ化の例は、ブリッジ増幅であり、実施され得る増幅の１つの例である。除外増幅（ExAmp）ワークフロー（Illumina Inc.）など、他の増幅技術を使用してもよいことを理解されたい。

【0184】

クラスタ生成後、配列決定を実施することができる。本明細書に開示されるフローセル１０の任意の例は、合成による配列決定（SBS）、サイクリックアレイ配列決定、ライゲーションによる配列決定、ピロ配列決定などとしばしば呼ばれる技術を含む、様々なシークエンスアプローチまたは技術で使用されてもよい。

【0185】

一つの例として、合成による配列決定（SBS）反応は、HISEQ（商標）、HISEQX（商標）、MISEQ（商標）、MISEQDX（商標）、MINISEQ（商標）、NOVASEQ（商標）、NEXTSEQDX（商標）、ISEQ（商標）、NEXTSEQ（商標）、またはIllumina（CA、San Diego)からのその他の配列決定システムのようなシステム上で実行することができる。

【0186】

鋳型ポリヌクレオチド鎖上の相補的配列にハイブリダイズする配列決定プライマーを導入することができる。この配列決定プライマーは、鋳型ポリヌクレオチド鎖を配列決定の準備をする。SBSでは、鋳型配列決定可能な核酸フラグメント（鋳型ポリヌクレオチド鎖）に沿った配列決定プライマーの伸長をモニターして、鋳型中のヌクレオチドの配列を決定する。テンプレートの３’末端および任意のフローセル結合プライマー２０（コピーに結合していない）は、シーケンシング反応との干渉を防ぎ、特に望ましくないプライミングを防ぐためにブロックされ得る。基礎となる化学的処理は、重合（例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒される）またはライゲーション（例えば、リガーゼ酵素によって触媒される）であり得る。

【0187】

特定のポリメラーゼベースのSBSプロセスにおいて、蛍光標識ヌクレオチドが、配列決定プライマーに添加されるヌクレオチドの順序およびタイプの検出が、テンプレートの配列を決定するために使用され得るように、テンプレート依存的な様式で、配列決定プライマーに添加される（それによって、配列決定プライマーを延長する）。より詳細には、ヌクレオチドの１つは、それぞれのポリメラーゼによって、配列決定プライマーを伸長し、鋳型ポリヌクレオチド鎖に相補的な新生鎖に組み込まれる。例えば、第１のSBSサイクルを開始するために、１つ以上の標識ヌクレオチド、DNAポリメラーゼなどをフローセル１０等内に／フローセル１０等を通して送達することができ、ここで、配列決定プライマー伸長は標識ヌクレオチドを取り込ませる。この取り込みは、イメージングイベントを通して検出することができる。イメージングイベントの間、照明システム（図示せず）は、フローセル１０に励起光を提供してもよい。

【0188】

いくつかの例において、蛍光標識されたヌクレオチドは、ヌクレオチドがテンプレートに付加されると、さらなるプライマー伸長を終結させる可逆的終結特性をさらに含むことができる。例えば、可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチドアナログは、残基（部分）を除去するためにデブロッキング剤が送達されるまでその後の伸長が起こり得ないように、鋳型に添加することができる。したがって、可逆的ターミネーションを使用する例では、デブロッキング試薬をフローセル等に送達することができる（検出が起こった後）。

【0189】

洗浄は、種々の流体送達工程の間で行われ得る。次いで、SBSサイクルをｎ倍繰り返すことにより、テンプレートをｎ個のヌクレオチドだけ伸長させ、それによって長さｎの配列を検出することができる。

【0190】

SBSは、詳細な説明に記載されているが、本明細書に記載されるフローセル１０は、遺伝子型決定のために、または他の化学的および／または生物学的用途において、他の配列決定プロトコルと共に利用され得ることを理解されたい。
フローセル構造上の複合体形成を含む方法

【0191】

本明細書に開示される方法の他の例は、図４Ａ～４Ｃに示される複合体４０Ａ、４０Ｂ、または４０Ｃを利用しない。むしろ、ハイドロゲルマトリックスは、フローセルのチャンバ１４内にその場で形成される。この例は、図５（ｉ）～５（ｉｉｉ）を参照して説明する。

【0192】

本実施例では、フローセル１０’は、フローセル１０’と、フローセル１０’のチャンバ１４内にハイドロゲルマトリックス７４を形成するための種々の試薬とを含む配列決定キットの一部であってもよい。配列決定キットの一例は、複数のチャンバ１４（例えば、図１、２Ａおよび２Ｂに参照されるように基材１２内またはその上に形成される）と、複数のチャンバ１４の各々の内部に付着されたプライマー２０とを含むフローセル１０’を含む。図５（ｉ）～５（ｉｉｉ）に図示例では、各チャンバは底面を有し、プライマー２０は底面を横切ってポリマー層２６に付着される。図示されていないが、ポリマー層２６（底部チャンバ表面上）は、代替的に、複数の空間的に分離されたポリマーアイランドの形態であってもよく、プライマー２０は、それぞれ、アイランドの各々に付着されてもよい。フローセル１０’のさらに別の例では、複数の凹部１６（フローセル１０について本明細書で定義される）がチャンバの底面内に画定されてもよく、プライマー２０は凹部１６のそれぞれにおいてポリマー層２６に付着されてもよい。

【0193】

図５（ｉ）に示すように、フローセル１０’はまた、捕捉部位２２’の一例を含み、ここで、捕捉部位２２’は、試料７２を捕捉するように構成される。

【0194】

捕捉部位２２’は、フローセル１０’に導入される試料７２に付着することができる、本明細書に開示される化学捕捉剤の任意の例であり得る。天然ＤＮＡまたはＲＮＡ試料７２の場合、捕捉部位２２’は、電荷または疎水性相互作用を介して結合するインターカレーター、または結合対の１つのメンバー（試料７２が他のメンバーを含む場合）、または試料７２にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドなどの、一方の末端に核酸結合部分を有するリンカーを含み得る。細胞試料７２の場合、リンカーは、細胞膜結合部分（例えば、表面タンパク質に対する抗原）または膜貫通部分（例えば、一方の末端のリン脂質）を含み得る。

【0195】

図５（ｉ）～５（ｉｉｉ）には示されていないが、フローセル１０’は、チャンバ１４の各々の内部に凹部１６を含むことができ、プライマー２０は、凹部１６の各々の内部に取り付けることができる。

【0196】

また、配列決定キットは、流体、ラジカル生成および鎖伸長官能基を含むモノマーまたはポリマー、ラジカル源、および架橋剤からなるカプセル化（ハイドロゲル）マトリックス前駆体組成物を含む。カプセル化（ハイドロゲル）マトリックス前駆体組成物は、試料７２を含まない。一例において、カプセル化（ハイドロゲル）マトリックス前駆体組成物は、モノマーまたは重合体の約２％（ｗ／ｖ）～約２０％（ｗ／ｖ）、架橋剤の約１ｗｔ％～約１０ｗｔ％、およびラジカル源の約０．１％（ｗ／ｖ）～約１０％（ｗ／ｖ）を含む。組成物中に含まれる場合、ラジカル開始剤は、約０．１％（ｗ／ｖ）～約１０％（ｗ／ｖ）の量で存在し得る。

【0197】

カプセル化（ハイドロゲル）マトリックス前駆体組成物の流体は、水（例えば、イオン交換水）であってもよい。

【0198】

モノマーがカプセル化（ハイドロゲル）マトリックス前駆体組成物に使用される場合、モノマーは、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン、ビスアクリルアミド、ジアクリレート、ジアリルアミン、トリアリルアミン、ジビニルスルホン、エチレングリコールジアリルエーテル、エチレングリコールジアクリレート、トリメタクリル酸トリメチロールプロパン、エトキシル化トリメチロールジアクリレート、エトキシル化ペンタエリスリトールテトラクリレート、コラーゲンモノマー、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。ポリマーがカプセル化（ハイドロゲル）マトリックス前駆体組成物に使用される場合、ポリマーは、ポリエチレングリコール－チオール、ポリエチレングリコール－アクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコール（例えば、約１００～約２００，０００の範囲の重量平均分子量を有する）、ポリプロピレンオキサイド、ポリアクリル酸、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリ（ビニルスルホン酸）、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）、ポリ（Ｌ－アスグルタミン酸）、ポリリジン、寒天、アガロース、アルギン酸、ヘパリン、硫酸アルギン、硫酸デキストラン、ヒアルロン酸、ペクチン、カラギーナン、ゼラチン、キトサン、セルロース、コラーゲンポリマー、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。モノマーおよび重合体のいずれもまた、カプセル化（ハイドロゲル）マトリックス前駆体組成物内で組み合わせて使用され得る。

【0199】

ラジカル源は、分解されるとラジカルを生成する分子である。一例では、ラジカル源は、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）、１，１’－アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、アゾビスイソブチロニトリル、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）、過酸化物、リボフラビン、３－（ジメチルアミノ）プロピオニトリル、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0200】

架橋剤は、ハイドロゲルマトリックスの重合体中に結合、例えばジスルフィド結合を形成する。架橋剤は、それが曝露される化学物質に応じて、架橋および未架橋であり得るという点で、可逆的であり得る。例えば、可逆的架橋剤は、ジスルフィド結合を含有するビスアクリルアミド架橋剤であり、これは、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはＴＨＰ（ホスフィン）などの還元剤で分解することができる。一実施形態では、架橋剤は、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン、ビスアクリルアミド、１，４－ジアロイルピペラジン、Ｎ－Ｎ’－ジアリルＬ－タルジアミド、およびＮ－Ｎ’－（１，２－ジヒドロキシエチレン）－ビス－アクリルアミドからなる群から選択される。

【0201】

配列決定キットはまた、カプセル化（封入）マトリックス前駆体組成物の一部として、または別個の構成要素として、ラジカル開始剤を含む。一実施形態では、ラジカル開始剤は光重合開始剤であってもよい。光重合開始剤の例としては、アゾビスイソブチロニトリル、ベンゾイルパーオキサイド、エオシン－５－イソチオシアネートが挙げられる。このタイプのラジカル開始剤は、適切な波長の光にさらされるまで架橋を開始しないので、カプセル化（ハイドロゲル）マトリックス前駆体組成物に含まれ得る。別の例では、ラジカル開始剤は、カプセル化（ハイドロゲル）マトリックス前駆体組成物中のラジカル源に曝露されると、架橋を開始し得る。これらの例では、ラジカル開始剤は、フローセル１０’上にハイドロゲルマトリックスを形成することが望ましいまで、カプセル化（ハイドロゲル）マトリックス前駆体組成物から分離して維持される。このタイプのラジカル開始剤の例は、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）である。

【0202】

一実施形態では、配列決定キットは、水および試料７２（例えば、遺伝物質）を含む試料流体をさらに含むことができる。

【0203】

一実施形態では、配列決定キットは、アダプタ配列およびトランスポソームを含むライブラリ調製溶液をさらに含むことができる。

【0204】

配列決定キットを使用する方法の例では、試料流体（遺伝物質の試料７２を含む）は、例えば、入力ポートを介してフローセル１０’に導入される（図５（ｉ））。それぞれのチャンバ１４内の捕捉部位２２’を通して、遺伝物質（試料７２）の少なくともいくつかは、複数のチャンバ１４の少なくともいくつかに入る。試料７２は捕捉部位２２’に固定化される。

【0205】

次いで、任意の未結合試料７２を含む試料流体の液体を除去することができる。除去は、フローセル１０’に洗浄緩衝液（例えば、ＴＲＩＳ ＨＣｌ）を導入することを含むことができる。フローは、フローセル１０’の出口ポートを通って、任意の未結合試料７２を押し出すことができる。

【0206】

この方法の例は、カプセル化マトリックス前駆体組成物７６をフローセル１０’に導入することを含む（図５（ｉｉ））。カプセル化マトリックス前駆体組成物７６の少なくともいくつかは、試料７２を含むチャンバ１４の少なくともいくつかに入る。

【0207】

次いで、この方法は、少なくともいくつかのチャンバ１４内に含まれるカプセル化マトリックス前駆体組成物７６の架橋または架橋および重合を開始することによって、試料７２（すなわち、遺伝物質）をハイドロゲルマトリックス７４内に少なくともいくつかのチャンバ１４内にカプセル化することを含む（図５（ｉｉｉ））。

【0208】

カプセル化の前に、外部固定化剤をフローセル１０’に導入することができる。この薬剤は、チャンバに入った組成物７６を除いて、フローセル１０’からカプセル化マトリックス前駆体組成物７６を除去することができる。これにより、ハイドロゲルマトリックス形成中にバリアが形成される。本明細書に開示される外部固定化剤の任意の例を使用することができる。

【0209】

カプセル化マトリックス前駆体組成物７６が光開始剤（例えば、紫外線照射ラジカル開始剤）を含む場合、カプセル化は、フローセル１０’を紫外線照射に暴露することを含む。この露光は、ラジカル生成を開始し、次いで、チャンバ１４内に残るカプセル化マトリックス前駆体組成物７６内の成分の架橋または架橋および重合を開始する。架橋または架橋および重合は、チャンバ１４内にハイドロゲルマトリックス７４を形成する。これは、チャンバ１４内のハイドロゲルマトリックス７４内に試料７２を封入する。

【0210】

ラジカル源に曝されたときに架橋を開始するラジカル開始剤が使用される場合、ラジカル開始剤は、カプセル化マトリックス前駆体組成物７６とは別に導入される。これらの例では、カプセル化は、フローセル１０’をラジカル開始剤に曝露することを含む。本実施例では、ラジカル開始剤は、外部固定化剤と共に導入されてもよい。外部固定化剤中のラジカル開始剤は、カプセル化マトリックス前駆体組成物７６中のラジカル生成を開始し、これは、次に、チャンバ１４内に残るカプセル化マトリックス前駆体組成物７６中の成分の架橋または架橋および重合を開始する。架橋、または架橋および重合は、チャンバ１４内でハイドロゲルマトリックス７４を形成する。これは、チャンバ１４内のハイドロゲルマトリックス７４内に試料７２を封入する。

【0211】

ライブラリ調製は、フローセル１０’表面上で行われ得る。外部固定化剤を除去し、緩衝液をライブラリ調製溶液と共にフローセル１０’に導入することができる。図４Ｃを参照して説明したように、ライブラリの調製を行うことができる。

【0212】

次いで、播種およびクラスタ並びに配列決定を、本明細書に開示される実施例に従って実施することができる。

【0213】

本開示をさらに説明するために、実施例を本明細書に示す。これらの実施例は、説明のために提供され、本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことを理解されたい。
非限定的実施例
実施例１

【0214】

疎水性層（CYTOP（登録商標）S）をシリコンオンインシュレータ基材の最外側シリコン層上に堆積させ、疎水性層上にポジ型フォトレジストを堆積させた。フォトリソグラフィを用いて、直径５０μｍのマイクロチャンバをフォトレジスト中にパターン化した。次に、フォトレジストパターンに続いて、疎水性層および最も外側のシリコン層をエッチングした。次いで、フォトレジストをリフトオフした。

【0215】

基質中の微小チャンバをシリル化し、その上にPAZAMを沈着させた。非付着PAZAMを洗い流し、次いでＰ５およびＰ７プライマーをマイクロチャンバ中のPAZAMに移植した。基材に蓋を取り付けた。

【0216】

図４Ａに示されるものと同様の複合体を、平均直径３μｍを有するように調製した。特定のビーズ上のフラグメントは、同じ長いＤＮＡ分子（ＰｈｉＸゲノム由来）由来であった。ライブラリフラグメントは、ビーズ表面上のストレプトアビジンに対するビオチンよりも弱い親和性を有するデシオビオチンオリゴを介して固形保持体に結合した。ライブラリフラグメントは、インデックス配列と共にＰ５およびＰ７’配列、読み取り１および読み取り２配列を含む。この複合体はマイクロチャンバにロードされた。

【0217】

図６Ａは、１つのマイクロチャンバ内の複合体の１つを示す顕微鏡写真である。

【0218】

播種は、複合体からライブラリフラグメントを放出することによって開始され、クラスタ化はブリッジ増幅を用いて行われた。図６Ｂは、図６Ａの複合体からのシードされたライブラリに由来するクラスタの蛍光顕微鏡写真である。

【0219】

第１の塩基配列決定を行い、図６Ｂのマイクロチャンバのリアルタイム分析（ＲＴＡ）を図６Ｃに示す。図６Ｄは、図６Ｃのマイクロチャンバ内部の読み取り値から得られたアイランドの一例を示す図である。図６Ｄの結果は、すべての読み取りが同じ長鎖ＤＮＡフラグメントから生じたことを示す。
実施例２

【0220】

２レーンのガラス基材を用いてフローセルを作製した。疎水性材料をガラス基材上に堆積した。疎水性材料にポジ型フォトレジストを塗布した。ポジ型フォトレジストは、２つのレーンそれぞれの異なるマイクロチャンバの輪郭を描く円形パターンを定義するために露出され、現像された。現像されていないレジストの下の疎水性材料をエッチング除去した。これにより、各マイクロチャンバの表面が露出した。現像したフォトレジストを所定の位置に置いて、マイクロチャンバをシリル化し、その上にPAZAMを堆積した。非付着PAZAMをリフトオフ技術を用いてフォトレジストで除去した。次いで、Ｐ５およびＰ７プライマーをマイクロチャンバ内のPAZAMにグラフトした。ＵＶ硬化型接着剤を用いて蓋を基材に接着した。

【0221】

この実施例のマイクロチャンバは、異なる直径およびピッチを有し、フローセルの長さに沿って２つの異なるレーンで調製された。表１に各レーンの直径とピッチを示す。

【0222】

【表1】

【0223】

本実施例で使用した複合体は、固形保持体と、アビジン－ビオチンリンカーを介して固形保持体に結合した配列決定可能な核酸フラグメントとを含んでいた。複合体のライブラリフラグメントは図４Ｂに示したものと類似していた。ＰＣＲフリーライブラリは、ＴｒｕＳｅｑ（商標）プラットホーム（Illumina、Inc．）プロトコルに従ってチューブ内で調製した。ライブラリを、Ｐ７プライマーへのハイブリダイゼーションを介してビーズに結合し、これをビオチンを介してビーズに結合した。

【0224】

複合体（ハイブリダイゼーション緩衝液中で２００μＬ）を含むハイブリダイゼーション緩衝液をフローセルチャネルに流すことにより、複合体をフローセルに導入した。図７Ａは、複合導入後のフローセルレーンの各セクションの拡大部分を示す顕微鏡写真である。レーンとセクションの識別は、表１に対応している。図示されるように、１つ以上の複合体が、少なくともいくつかのマイクロウェル内で単離された。

【0225】

播種は、複合体からライブラリフラグメントを放出することによって開始された。ライブラリ放出は、フローセルをＰ７プライマーの融解温度以上に加熱することによって開始した。フラグメントをハイブリダイズし、第１の鎖伸長を行った。固形保持体および非ハイブリダイズフラグメントを０．２Ｍナトリウム水溶液で除去した。次いで、ブリッジ増幅法を用いてクラスタ化を行った。第１の塩基配列決定を行い、マイクロチャンバのリアルタイム分析（ＲＴＡ）を図７Ｂに示す。これらの結果は、複合体を受け取ったマイクロチャンバと複合体を受け取らなかったマイクロチャンバとの間にクロストークがないことを示している。
実施例３

【0226】

フローセルは、実施例２に記載されるのと同様の方法で形成された。

【0227】

Ｅ．Ｓｙｔｏｘグリーンで染色し、ＴＲＩＳ ＨＣｌ洗浄緩衝液（ｐＨ８．１）中に分散した大腸菌をカプセル化マトリックス前駆体と混合し、フローセルに導入した。次いで、フローセルを洗浄した。カプセル化マトリックス前駆体組成物は、アクリルアミド単量体、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）、およびビスアクリルアルミドを含んでいた。ラジカル開始剤（ＴＥＭＥＤ）を含む鉱油を導入した。オイルはカプセル化マトリックスを少なくともいくつかのマイクロチャンバに押し込み、架橋を開始した。図８の１）は、ハイドロゲルが形成された後のいくつかのマイクロチャンバの顕微鏡写真である。図に示されているように、ハイドロジェルはほとんどのマイクロチャンバで形成されていた。

【0228】

ハイドロゲルマトリックスは、試薬がマトリックスから自由に交換することを可能にしたが、その中にバクテリアを保持した。これを実証するために、洗浄を行い、その後、フローセルにリゾチームを導入して細胞溶解を行った。フローセルを約３７℃に約３０分間加熱し、リゾチームを活性化した。図８の２）は、細胞溶解後の（図８の１）の）顕微鏡チャンバの顕微鏡写真である。

【0229】

ＤＮＡ抽出は、汚染タンパク質を消化するプロテイナーゼＫ（ＰｒｏＫ）の存在下で行った。図８の３）は、ＤＮＡ抽出後の（図８の２）の）顕微鏡チャンバの顕微鏡写真である。

【0230】

ライブラリ調製は、Ｐ７－ＭＥ（モザイク端部）／ＭＥ’およびＰ５－ＭＥ／ＭＥ’アダプタ混合物を用いたトランスポゾン（Illumina社製NEXTERA（商標）ＤＮＡライブラリプレップキット）を用いて行った。標識後、ＳＤＳを用いてタンパク質を除去し、ＰＣＲ酵素を用いて伸長反応を行い、二本鎖ライブラリを作製した。

【0231】

図８の４）は、ライブラリ調製後の（図８の３）の）顕微鏡チャンバの顕微鏡写真である。これらの結果は、ｉｎ ｓｉｔｕ試料カプセル化とハイドロゲル形成がフローセル表面で行われることを示す。
実施例４

【0232】

ガラス基材を利用し、その中に円形ナノ凹部をエッチングした。ＣＹＴＯＰ（登録商標）Ｓを疎水性ポリマー（セパレート材１８）として使用し、ナノ凹部内を含めてガラス基材を横切って堆積させた。疎水性高分子にフォトレジスト（Shipley S‐１８０５）を適用し、疎水性高分子の円形パターンを決定するために開発した。疎水性高分子をフォトレジストで覆われていないナノ凹部からプラズマエッチングにより除去した。次いで、露出したナノ凹部をシリル化し、ゲル材料で被覆した。ゲル材料はPAZAMであった。次いで、リフトオフプロセスを用いて、フォトレジストおよびフォトレジスト上の任意のゲル材料を除去した。これにより下層の疎水性高分子を露出させた。疎水性高分子は間質領域の上のＺ方向に約１μｍから約２μｍまで伸びた。Ｚ方向とは、３次元空間のデカルト座標系のＺ軸を指す。本実施例では、疎水性ポリマーは、直径５０μｍの円形のチャンバを画定した。プライマーグラフトを行い、Ｐ５およびＰ７プライマーをPAZAMにナノ凹部で付着させた。

【0233】

図４Ａに示すものと同様の複合体を調製した。特定のビーズ上のフラグメントは、同じ長さのＤＮＡ分子由来のものであった。ライブラリフラグメントは、ビーズ表面上のストレプトアビジンに対するビオチンよりも弱い親和性を有するデシオビオチンオリゴを介して固形保持体に結合した。この複合体はマイクロチャンバにロードされた。マイクロチャンバ表面への複合体の結合は、アンカーで達成された（例えば、ゲル材料に結合したＰ５プライマーにハイブリダイズしたビオチンを有する相補的プライマーまたはアルキン－ＰＥＧ－ビオチンリンカーを、クリック化学を用いてゲル材料上の遊離アジドに共有結合させた）。ドデシル硫酸ナトリウムを含む生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液中の遊離ビオチンを導入し、フローセルを約８０℃に加熱して、それぞれの複合体からライブラリを放出させた。フローセルを通して空気を吸引し、遊離ビオチン溶液を押し出した。疎水性／親水性表面構造により、液体が空気により押し出されたときに、液滴がマイクロチャンバ内に形成された。液滴は、ライブラリフラグメントが隣接するマイクロチャンバに拡散するのを防止した。

【0234】

次いで、放出されたライブラリフラグメントをマイクロチャンバ内の表面プライマーにハイブリダイズさせ、伸長工程を行って相補的コピーを作製した。クラスタ生成はブリッジ増幅により行った。次いで、フローセル上で配列決定を行った。

【0235】

図９は、配列決定走行のデータ解析後のフローセルの一部を示す。オリジナルの色は、参照ゲノム上のそれらの近接性に基づいてグループ化されたアイランドまたは短い読み取りを表していた。それぞれの色は特定のマイクロチャンバに単離されたので、所与のマイクロチャンバにおける短い読み取りは、同じゲノムＤＮＡフラグメントから、したがって同じ複合体からであると結論付けられた。これらの結果は、マイクロチャンバが複合体と放出されたライブラリフラグメントをそれぞれのチャンバ内に閉じ込めることができることを示している。
実施例５

【0236】

本日例は、ハイドロゲルのフローセル形成を示す。

【0237】

２レーンのガラス基材を利用した。異なるサイズのマイクロチャンバをスライドガラスにエッチングした。各レーンのマイクロチャンバの直径およびピッチは、表１に示すものと同じであった。疎水性材料をガラス基材上に堆積した。疎水性材料にポジ型フォトレジストを塗布した。ポジ型フォトレジストを露光し、現像して、マイクロチャンバ間の間質（格子間）上の疎水性材料を被覆することを定義づけた。現像されていないレジストの下（したがってマイクロチャンバ内）の疎水性材料は、エッチング除去された。これにより、各マイクロチャンバの表面が露出した。現像したフォトレジストを所定の位置に置いて、マイクロチャンバをシリル化し、その上にPAZAMを堆積した。非付着PAZAMをリフトオフ技術を用いてフォトレジストで除去した。次いで、Ｐ５およびＰ７プライマーをマイクロチャンバ内のPAZAMにグラフトした。ＵＶ硬化型接着剤を用いて蓋を基材に接着した。

【0238】

カプセル化マトリックス前駆体をフローセルに導入した。次いで、フローセルを洗浄した。カプセル化マトリックス前駆体組成は、Ｎ，Ｎ’‐ビス（アクリロイル）シスタミン、アクリルアミド、および２，２’‐アゾビス（２‐メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩を含んだ。次にエヴァンチェンオイルをフローセルに導入した。オイルは、カプセル化マトリックスを少なくとも一部のマイクロチャンバに押し込んだ。図１０Ａは、封入（カプセル化）後の２つのレーンの異なるセクション（１～５）における、異なるサイズのマイクロチャンバ（直径およびピッチについては表１を参照）の顕微鏡写真である。各画像１０Ａ（ｉ）～１０Ａ（ｘ）のより明るい領域は、マイクロチャンバを示し、より暗い領域は、間質を示す。図１０Ａ（ｉ）～１０Ａ（ｘ）は、間質がマイクロチャンバのサイズにかかわらず、カプセル化マトリックスから比較的（相対的に）透明であることを示している。次いで、フローセルを紫外線に曝露し、ハイドロゲル形成を開始した。次いで、フローセルをＴＲＩＳＨＣｌ洗浄緩衝液（ｐＨ８．１）で洗浄した。図１０Ｂは、ハイドロゲル形成後の２つのレーンの異なるセクション（１～５）における、異なるサイズのマイクロチャンバの顕微鏡写真である。各画像１０Ｂ（ｉ）～１０Ｂ（ｘ）のより明るい領域は、マイクロチャンバを示し、より暗い領域は、間質を示す。図１０Ｂ（ｉ）～１０Ｂ（ｘ）は、マイクロチャンバのサイズにかかわらず、少なくともいくつかのマイクロチャンバ中にハイドロゲルが形成されたことを示す。
実施例６

【0239】

この実施例では、２つの単一レーンガラス基材フローセルを使用した。PAZAMとＰ５とＰ７プライマーは基材表面に存在した。

【0240】

図４Ａに示すものと同様の複合体を調製した。特定のビーズ上のフラグメントは、同じ長いＤＮＡ分子由来のものであった。ライブラリフラグメントを、デスチオビオチンオリゴを介して固形保持体に結合させた。複合体をフローセルレーンに装填した。レーン表面への複合体の結合は、アンカーで達成された（例えば、ゲル材料に結合したＰ５プライマーにハイブリダイズしたビオチンを有する相補的プライマーまたはアルキン－ＰＥＧ－ビオチンリンカーを、クリック化学を用いてゲル材料上の遊離アジドに共有結合させた）。

【0241】

ドデシル硫酸ナトリウムを含む生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液中の遊離ビオチンを各フローセルに導入した。比較フローセルにおいて、緩衝液は流路を満たした。フローセルの例では、流量１００μＬ／分の空気を流路に導入して、緩衝液を吸引し、複合体の周りに浅い液体層を形成した。フローセルを約７２℃～約７７℃の範囲の温度に加熱して、それぞれの複合体からライブラリを放出させた。

【0242】

ライブラリリリースおよび播種後に、クラウドプロファイルのイメージを取得した。本明細書では再現しないが、これらの画像は、ライブラリ放出および播種がバルク液中で起こったとき（比較例）、ライブラリの一部が放出された固形保持体から離れ、流路内で上方に移動することを示した。これらのライブラリフラグメントは、嵩体積中で失われたか、またはそれらが放出されたチャネルの反対面に播種されたかのいずれかであり、したがって、クラスタの濁り（クラウド）当たりのライブラリフラグメント数、および播種された全体の数（総数＝１２２９）を減少させた。対照的に、浅い液体層では、固体表面から離れたすべてのライブラリフラグメントは浅い液体層によって閉じ込められ、より多くの２Ｄ局在播種および播種されたライブラリフラグメントのより多くの数（総数＝２０１７）をもたらした。

【0243】

本実施例のフローセルはまた、フローセルの一方の表面からフローセルの反対側の表面へのライブラリフラグメントの顕著に減少した断面表面コンタミネーションを示した。

【0244】

液滴／パドルアイランド／浅い液層形成に及ぼす複合体の表面密度の効果を試験するために、ビオチンで被覆した単一レーンガラス基材フローセルに３μｍ直径ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを導入した。２つの異なるビーズ濃度を有する流体（ドデシル硫酸ナトリウムを有する生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液）をフローセルに導入した。一方の流体は約３０，０００ビーズ／μＬというより高いビーズ濃度を有し、他方の流体は約６０００ビーズ／μＬというより低いビーズ濃度を有した。

【0245】

流量１００μＬ／分の空気を各流路に導入し、緩衝液を吸引し、磁気ビーズの周りに液滴を形成した。明視野画像は、各フローセルについて撮影され、図１１Ａおよび１１Ｂに示されている。図１１Ａは、より高いビーズ濃度を有する流体の吸引後のフローセル表面を示し、図１１Ｂは、より低いビーズ濃度を有する流体の吸引後のフローセル表面を示す。

【0246】

図１１Ａは、固定化されたビーズのより密な集団、および隣接する液滴から形成されるいくつかのパドルアイランドを示す。図１１Ｂは、固定化されたビーズのより密度の低い集団、およびより少ないパドルアイランドおよびいくつかの単離液滴を示す。図１１Ａおよび図１１Ｂを比較すると、フローセル表面上のより多数のビーズ（または複合体）が、液体液滴が合流（マージ）し、フローセル表面にわたってより均一な液体層を形成することを可能にすることが明らかである。

【0247】

同様の実験を、異なるビーズ濃度を有する５つの流体で行った。５つの流体は、同じ初期流体、すなわち、１０ｍｇ／ｍＬ（約７００，０００ビーズ／μＬ）のビーズ濃度を有するドデシル硫酸ナトリウムを有する生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液から調製した。当初の液体はそれぞれ異なって希薄化され、例えば流体１＝２５０ｘ希薄化、流体２＝５００ｘ希薄化、流体３＝２，０００ｘ希薄化、流体４＝８，０００ｘ希薄化、流体５＝３２，０００ｘ希薄化の５つの流体のそれぞれを生成した。流量１００μＬ／分の空気を各流路に導入し、緩衝液を吸引し、磁気ビーズの周りに液滴を形成した。各フローセルに光場画像をとり、図１２Ａ（流体１＝２５０ｘ希薄化）、図１２Ｂ（流体２＝５００ｘ希薄化）、図１２Ｃ（流体３＝２，０００ｘ希薄化）、図１２Ｄ（流体４＝８，０００ｘ希薄化）、図１２Ｅ（流体５＝３２，０００ｘ希薄化）に示す。図に示すように、ビーズの表面密度の増加は、流体中のビーズの濃度の増加と相関していた。図１３に示すように、個々のビーズの周りの流体（液体）ドメインの平均直径は、ビーズの表面密度が減少するにつれて、徐々に増加した。

【0248】

液滴／パドルアイランド／浅い液層形成に及ぼす空気流速の影響を試験するために、ビオチンで被覆した単一レーンガラス基材フローセルに３μｍ直径ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを導入した。異なるビーズ濃度を有する流体（ドデシル硫酸ナトリウムを有する生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液）をフローセルに導入した。流体の一方は、約７２００ビーズ／μＬというより低いビーズ濃度を有し、他方、流体の他方は、約１４，１００ビーズ／μＬというより高いビーズ濃度を有した。

【0249】

２つの異なる空気流速、すなわち２，０００μＬ／ｍｉｎの流速と２００μＬ／ｍｉｎの流速を用いた。明視野画像は、各フローセルについて撮影され、図１４Ａおよび１４Ｂに示されている。図１４Ａは、より高い空気流量で流体を吸引した後のフローセル表面を示し、図１４Ｂは、より低い空気流量で流体を吸引した後のフローセル表面を示す。流速が高いとき（２０００μＬ／ｍｉｎ）は、図１４Ａに示すように液体層はより連続的であったが、流速が低いとき（２００μＬ／ｍｉｎ）は、より分離されたパドルアイランドを形成した。

【0250】

同じビーズ濃度と異なる塩濃度を有する４つの流体を用いて、別の実験を行った。各流体は、１０ｍｇ／ｍＬ（約７００，０００ビーズ／μＬ）のビーズ濃度を有するドデシル硫酸ナトリウムを有する生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液であった。それぞれの溶液中のナトリウム濃度は異なっており、例えば、流体６＝７５０ｍＭ Ｎａ^＋、流体７＝３７５ｍＭ Ｎａ^＋、流体８＝１２７．５ｍＭ Ｎａ^＋、および流体９＝９３．８ｍＭＮａ^＋であった。流量１００μＬ／分の空気を各流路に導入し、緩衝液を吸引し、磁気ビーズの周りに液滴を形成した。各フローセルについて明視野画像を撮影し、図１５Ａ（流体６＝７５０ｍＭ Ｎａ^＋）、図１５Ｂ（流体７＝３７５ｍＭ Ｎａ^＋）、図１５Ｃ（流体８＝１２７．５ｍＭ Ｎａ^＋）、および図１５Ｄ（流体９＝９３．８ｍＭＮａ^＋）に示す。図示したように、塩濃度の増加は、形成された液滴に影響を及ぼさないようであった。個々のビーズの周りの流体ドメインの平均直径は、図１６に示されるように、異なる塩濃度にわたって実質的に一致したままであった（例えば、１０μＭ以内）。
注記事項

【0251】

さらに、本明細書に提供される範囲は、明示的に記載されたかのように、記載された範囲と、記載された範囲内の任意の値またはサブ範囲とを含むことを理解されたい。例えば、約２ｍｍ～約３００ｍｍで表される範囲は、約２ｍｍ～約３００ｍｍの明示的に列挙された範囲だけでなく、約１５ｍｍ、２２．５ｍｍ、２４５ｍｍなどの個々の値、および約２０ｍｍ～約２２５ｍｍなどのサブ範囲を含むと解釈されるべきである。

【0252】

前述の概念のすべての組合せおよび以下に詳述する追加の概念（そのような概念が相互に矛盾しない場合）は、本明細書に開示される発明の主題の一部として考えられることを理解されたい。特に、本開示の最後に記載されるクレームに係る主題のすべての組合せは、本明細書に開示される発明の主題の一部であると考えられる。同様に当然のことながら、本明細書に明示的に用いられ、参照として組み込まれている任意の開示にも現れるであろう専門用語は、本明細書に開示された特定の概念と最も整合する意味を有するものとする。

【0253】

いくつかの実施例が詳細に記載されているが、開示された実施例は変更されてもよいことを理解されたい。したがって、上記の説明は、非限定的であるとみなされるべきである。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図12E】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16】