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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-09-04
(45)【発行日】2025-09-12
(54)【発明の名称】ＣＹＰ２Ａ６遺伝子多型の判定方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6827 20180101AFI20250905BHJP
C12Q 1/6837 20180101ALI20250905BHJP
C12Q 1/6883 20180101ALI20250905BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6827 Z ZNA
C12Q1/6837 Z
C12Q1/6883 Z
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2021123953
(22)【出願日】2021-07-29
(65)【公開番号】P2023019317
(43)【公開日】2023-02-09
【審査請求日】2024-04-30
(73)【特許権者】
【識別番号】523261322
【氏名又は名称】メディフォード株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 玄樹
【審査官】中根 知大
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０７０９０５１７（ＣＮ，Ａ）
【文献】国際公開第００／０６６７７５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００９／０３０５２４９（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＹＰ２Ａ６のアリルであるＣＹＰ２Ａ６＊４又はＣＹＰ２Ａ６＊７の少なくとも一方の判定方法であって、
ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定を行う場合には、
（１）ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないプライマーセットにより予備的増幅を行う工程；
（２）（ａ）前記工程（１）で得られた増幅産物を希釈した鋳型ＤＮＡと、
（ｂ）ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を含む２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーセットと、
（ｃ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識し、第１の蛍光色素で標識した第１のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと、
（ｄ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識し、前記第１蛍光色素と異なる第２の蛍光色素で標識した第２のＴａｑＭａｎプローブと
を用いて、ＴａｑＭａｎ法による増幅を行う工程；
（３）前記工程（２）の終了後に、及び／又は、前記工程（２）を実施しながら、第１蛍光色素に起因する蛍光強度と、第２蛍光色素に起因する蛍光強度とを測定する工程；
を含み、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１２の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１３の塩基配列における連続する１４塩基から２０塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号１４の塩基配列における連続する２１塩基から２７塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１５の塩基配列における連続する２１塩基から２７塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号１６の塩基配列における連続する１２塩基から１８塩基からなる配列で表されるプローブと、配列番号１７の塩基配列における連続する１２塩基から１８塩基からなる配列で表されるプローブとの組合せを；
それぞれ、使用し、
ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定を行う場合には、
（１）ＣＹＰ２Ａ６＊１及び＊７を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないプライマーセットにより予備的増幅を行う工程；
（２）（ａ）前記工程（１）で得られた増幅産物を希釈した鋳型ＤＮＡと、
（ｂ）ＣＹＰ２Ａ６＊１及び＊７を特徴づける配列を含む２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーセットと、
（ｃ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識し、第１の蛍光色素で標識した第１のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと、
（ｄ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を認識し、前記第１蛍光色素と異なる第２の蛍光色素で標識した第２のＴａｑＭａｎプローブと
を用いて、ＴａｑＭａｎ法による増幅を行う工程；
（３）前記工程（２）の終了後に、及び／又は、前記工程（２）を実施しながら、第１蛍光色素に起因する蛍光強度と、第２蛍光色素に起因する蛍光強度とを測定する工程；
を含み、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１２又は配列番号１８の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１３の塩基配列における連続する１４塩基から２０塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号１９の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号２０の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号２１の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるプローブと、配列番号２２の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるプローブとの組合せを；
それぞれ、使用する、前記方法。
【請求項2】
ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定を行う場合には、前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号５の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブと、配列番号６の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブとの組合せを；
それぞれ、使用し、
ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定を行う場合には、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１又は配列番号７の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号８の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号１０の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブと、配列番号１１の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブとの組合せを；
それぞれ、使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＣＹＰ２Ａ６＊４及びＣＹＰ２Ａ６＊７を判定する、請求項１又は２に記載の方法であって、ＣＹＰ２Ａ６＊４に関する前記工程（２）～工程（３）と、ＣＹＰ２Ａ６＊７に関する前記工程（２）～工程（３）を、それぞれ、異なる反応容器で実施する、前記方法。
【請求項4】
配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマー、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマー、配列番号５の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブ、配列番号６の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブを含む、ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定用キット。
【請求項5】
配列番号１又は配列番号７の塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマー、配列番号８の塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号９の塩基配列からなるリバースプライマー、配列番号１０の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブ、配列番号１１の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブを含む、ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子多型の判定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＹＰ２Ａ６は体内のニコチン代謝に関与する酵素であり、またレトロゾール（アロマターゼ阻害剤／閉経後乳がん治療剤）の代謝にも関与している。
ＣＹＰ２Ａ６には多くのアリルが存在するが、日本人では遺伝子欠損型であるＣＹＰ２Ａ６＊４や、アミノ酸変異を伴う一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism；ＳＮＰ）を有するＣＹＰ２Ａ６＊７やＣＹＰ２Ａ６＊１０、またプロモータ領域にＳＮＰを有するＣＹＰ２Ａ６＊９の変異型の遺伝子頻度が高く（２～２０％）、これらの遺伝子型を組み合わせて２つ持つ時、ニコチン代謝の低代謝群（Poor Metabolizer；ＰＭ）となる（非特許文献１）。
日本人において、ＰＭとなる遺伝子型を同定することは重要であるが、ヒトゲノムにはＣＹＰ２Ａ６遺伝子座の近傍に、ＣＹＰ２Ａ６と塩基配列が酷似している別遺伝子（ＣＹＰ２Ａ７）が存在し、遺伝子型の判定を困難にしている。
なお、ＣＹＰ２Ａ６の遺伝子多型をメルティングカーブ解析により判定する方法が報告されている（特許文献１）。この方法では、目的遺伝子部位の増幅と変異部位の検出を一本のキャピラリー内で一度に行うことができる。
ＣＹＰ２Ａ６には多くのアリルが存在するが、日本人では遺伝子欠損型であるＣＹＰ２Ａ６＊４や、アミノ酸変異を伴う一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism；ＳＮＰ）を有するＣＹＰ２Ａ６＊７やＣＹＰ２Ａ６＊１０、またプロモータ領域にＳＮＰを有するＣＹＰ２Ａ６＊９の変異型の遺伝子頻度が高く（２～２０％）、これらの遺伝子型を組み合わせて２つ持つ時、ニコチン代謝の低代謝群（Poor Metabolizer；ＰＭ）となる（非特許文献１）。
日本人において、ＰＭとなる遺伝子型を同定することは重要であるが、ヒトゲノムにはＣＹＰ２Ａ６遺伝子座の近傍に、ＣＹＰ２Ａ６と塩基配列が酷似している別遺伝子（ＣＹＰ２Ａ７）が存在し、遺伝子型の判定を困難にしている。
なお、ＣＹＰ２Ａ６の遺伝子多型をメルティングカーブ解析により判定する方法が報告されている（特許文献１）。この方法では、目的遺伝子部位の増幅と変異部位の検出を一本のキャピラリー内で一度に行うことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特開２００４－１９４５９８号公報
【非特許文献】
【0004】
【文献】中島美紀. (2006). ニコチン代謝とCYP2A6の遺伝子多型. JPN.J.ELECTROCARDIOLOGY Vol.26 No.3, 26(3), 217‐222.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の課題は、ＣＹＰ２Ａ６＊４及び／又はＣＹＰ２Ａ６＊７について、従来の方法よりも精度よく遺伝子型を判定する方法を開発し、測定系を確立することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、新規に設計したＰＣＲプライマー及び加水分解プローブを用い、別遺伝子であるＣＹＰ２Ａ７を増幅せず、ＣＹＰ２Ａ６＊１（野生型）、ＣＹＰ２Ａ６＊４、ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける領域のみを増幅する前処理を行うことにより、高い精度でＣＹＰ２Ａ６＊４及び／又はＣＹＰ２Ａ６＊７を判定できることを見出し、本発明に至った。
【0007】
すなわち、本発明は、以下の発明に関する：
［１］ＣＹＰ２Ａ６のアリルであるＣＹＰ２Ａ６＊４又はＣＹＰ２Ａ６＊７の少なくとも一方の判定方法であって、
ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定を行う場合には、
（１）ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないプライマーセットにより予備的増幅を行う工程；
（２）（ａ）前記工程（１）で得られた増幅産物を希釈した鋳型ＤＮＡと、
（ｂ）ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を含む２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーセットと、
（ｃ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識し、第１の蛍光色素で標識した第１のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと、
（ｄ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識し、前記第１蛍光色素と異なる第２の蛍光色素で標識した第２のＴａｑＭａｎプローブと
を用いて、ＴａｑＭａｎ法による増幅を行う工程；
（３）前記工程（２）の終了後に、及び／又は、前記工程（２）を実施しながら、第１蛍光色素に起因する蛍光強度と、第２蛍光色素に起因する蛍光強度とを測定する工程；
を含み、
前記工程（１）で用いるフォワードプライマーとして、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを、前記工程（１）で用いるリバースプライマーとして、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より３’側である下流に位置するＣＹＰ２Ａ６特異的な配列にハイブリダイズするプライマーを；
前記工程（２）で用いるフォワードプライマーとして、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを、前記工程（２）で用いるリバースプライマーとして、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より３’側である下流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）として、主増幅で増幅された領域の中の、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流において、ＣＹＰ２Ａ７にはないＣＹＰ２Ａ６特異的な遺伝子配列にハイブリダイズするプローブを、第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、主増幅で増幅された領域の中の、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流において、ＣＹＰ２Ａ７に特異的でありＣＹＰ２Ａ６にはない遺伝子配列にハイブリダイズするプローブを；
それぞれ、使用し、
ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定を行う場合には、
（１）ＣＹＰ２Ａ６＊１及び＊７を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないプライマーセットにより予備的増幅を行う工程；
（２）（ａ）前記工程（１）で得られた増幅産物を希釈した鋳型ＤＮＡと、
（ｂ）ＣＹＰ２Ａ６＊１及び＊７を特徴づける配列を含む２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーセットと、
（ｃ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識し、第１の蛍光色素で標識した第１のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと、
（ｄ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を認識し、前記第１蛍光色素と異なる第２の蛍光色素で標識した第２のＴａｑＭａｎプローブと
を用いて、ＴａｑＭａｎ法による増幅を行う工程；
（３）前記工程（２）の終了後に、及び／又は、前記工程（２）を実施しながら、第１蛍光色素に起因する蛍光強度と、第２蛍光色素に起因する蛍光強度とを測定する工程；
を含み、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、且つＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることのできるプライマーセットを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセットとして、ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、且つＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることのできるプライマーセットを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）として、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がイソロイシンである配列を含む領域にハイブリダイズするプローブを、第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がスレオニンである配列を含む領域（典型的には１０塩基から５０塩基からなる領域であり、好ましくは１０塩基から２０塩基からなる領域）にハイブリダイズするプローブを；
それぞれ、使用する、前記方法。
［２］ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定を行う場合には、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１２の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１３の塩基配列における連続する１４塩基から２０塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号１４の塩基配列における連続する２１塩基から２７塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１５の塩基配列における連続する２１塩基から２７塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号１６の塩基配列における連続する１２塩基から１８塩基からなる配列で表されるプローブと、配列番号１７の塩基配列における連続する１２塩基から１８塩基からなる配列で表されるプローブとの組合せを；
それぞれ、使用し、
ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定を行う場合には、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１２又は配列番号１８の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１３の塩基配列における連続する１４塩基から２０塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号１９の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号２０の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号２１の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるプローブと、配列番号２２の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるプローブとの組合せを；
それぞれ、使用する、［１］の方法。
［３］ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定を行う場合には、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号５の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブと、配列番号６の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブとの組合せを；
それぞれ、使用し、
ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定を行う場合には、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１又は配列番号７の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号８の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号１０の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブと、配列番号１１の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブとの組合せを；
それぞれ、使用する、［１］又は［２］の方法。
［４］ＣＹＰ２Ａ６＊４及びＣＹＰ２Ａ６＊７を判定する、［１］～［３］のいずれかの方法であって、ＣＹＰ２Ａ６＊４に関する前記工程（２）～工程（３）と、ＣＹＰ２Ａ６＊７に関する前記工程（２）～工程（３）を、それぞれ、異なる反応容器で実施する、前記方法。
［５］配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマー、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマー、配列番号５の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブ、配列番号６の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブを含む、ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定用キット。
［６］配列番号１又は配列番号７の塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマー、配列番号８の塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号９の塩基配列からなるリバースプライマー、配列番号１０の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブ、配列番号１１の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブを含む、ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定用キット。
［１］ＣＹＰ２Ａ６のアリルであるＣＹＰ２Ａ６＊４又はＣＹＰ２Ａ６＊７の少なくとも一方の判定方法であって、
ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定を行う場合には、
（１）ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないプライマーセットにより予備的増幅を行う工程；
（２）（ａ）前記工程（１）で得られた増幅産物を希釈した鋳型ＤＮＡと、
（ｂ）ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を含む２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーセットと、
（ｃ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識し、第１の蛍光色素で標識した第１のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと、
（ｄ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識し、前記第１蛍光色素と異なる第２の蛍光色素で標識した第２のＴａｑＭａｎプローブと
を用いて、ＴａｑＭａｎ法による増幅を行う工程；
（３）前記工程（２）の終了後に、及び／又は、前記工程（２）を実施しながら、第１蛍光色素に起因する蛍光強度と、第２蛍光色素に起因する蛍光強度とを測定する工程；
を含み、
前記工程（１）で用いるフォワードプライマーとして、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを、前記工程（１）で用いるリバースプライマーとして、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より３’側である下流に位置するＣＹＰ２Ａ６特異的な配列にハイブリダイズするプライマーを；
前記工程（２）で用いるフォワードプライマーとして、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを、前記工程（２）で用いるリバースプライマーとして、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より３’側である下流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）として、主増幅で増幅された領域の中の、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流において、ＣＹＰ２Ａ７にはないＣＹＰ２Ａ６特異的な遺伝子配列にハイブリダイズするプローブを、第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、主増幅で増幅された領域の中の、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流において、ＣＹＰ２Ａ７に特異的でありＣＹＰ２Ａ６にはない遺伝子配列にハイブリダイズするプローブを；
それぞれ、使用し、
ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定を行う場合には、
（１）ＣＹＰ２Ａ６＊１及び＊７を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないプライマーセットにより予備的増幅を行う工程；
（２）（ａ）前記工程（１）で得られた増幅産物を希釈した鋳型ＤＮＡと、
（ｂ）ＣＹＰ２Ａ６＊１及び＊７を特徴づける配列を含む２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーセットと、
（ｃ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識し、第１の蛍光色素で標識した第１のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと、
（ｄ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を認識し、前記第１蛍光色素と異なる第２の蛍光色素で標識した第２のＴａｑＭａｎプローブと
を用いて、ＴａｑＭａｎ法による増幅を行う工程；
（３）前記工程（２）の終了後に、及び／又は、前記工程（２）を実施しながら、第１蛍光色素に起因する蛍光強度と、第２蛍光色素に起因する蛍光強度とを測定する工程；
を含み、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、且つＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることのできるプライマーセットを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセットとして、ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、且つＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることのできるプライマーセットを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）として、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がイソロイシンである配列を含む領域にハイブリダイズするプローブを、第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がスレオニンである配列を含む領域（典型的には１０塩基から５０塩基からなる領域であり、好ましくは１０塩基から２０塩基からなる領域）にハイブリダイズするプローブを；
それぞれ、使用する、前記方法。
［２］ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定を行う場合には、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１２の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１３の塩基配列における連続する１４塩基から２０塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号１４の塩基配列における連続する２１塩基から２７塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１５の塩基配列における連続する２１塩基から２７塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号１６の塩基配列における連続する１２塩基から１８塩基からなる配列で表されるプローブと、配列番号１７の塩基配列における連続する１２塩基から１８塩基からなる配列で表されるプローブとの組合せを；
それぞれ、使用し、
ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定を行う場合には、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１２又は配列番号１８の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１３の塩基配列における連続する１４塩基から２０塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号１９の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号２０の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号２１の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるプローブと、配列番号２２の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるプローブとの組合せを；
それぞれ、使用する、［１］の方法。
［３］ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定を行う場合には、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号５の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブと、配列番号６の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブとの組合せを；
それぞれ、使用し、
ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定を行う場合には、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１又は配列番号７の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号８の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号１０の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブと、配列番号１１の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブとの組合せを；
それぞれ、使用する、［１］又は［２］の方法。
［４］ＣＹＰ２Ａ６＊４及びＣＹＰ２Ａ６＊７を判定する、［１］～［３］のいずれかの方法であって、ＣＹＰ２Ａ６＊４に関する前記工程（２）～工程（３）と、ＣＹＰ２Ａ６＊７に関する前記工程（２）～工程（３）を、それぞれ、異なる反応容器で実施する、前記方法。
［５］配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマー、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマー、配列番号５の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブ、配列番号６の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブを含む、ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定用キット。
［６］配列番号１又は配列番号７の塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマー、配列番号８の塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号９の塩基配列からなるリバースプライマー、配列番号１０の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブ、配列番号１１の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブを含む、ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定用キット。
【発明の効果】
【0008】
本発明の判定方法を用いることにより、高い精度でＣＹＰ２Ａ６＊４及び／又はＣＹＰ２Ａ６＊７（好ましくはＣＹＰ２Ａ６＊４及びＣＹＰ２Ａ６＊７）を測定することができる。また、蛍光強度をリアルタイムで検出する必要がないので、使用装置やアッセイスケジュールを柔軟に変更することが可能となる。本発明により、日本人を含むアジア人集団において、ＣＹＰ２Ａ６のＰＭとなる大半の遺伝子型を容易に判定できることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】本発明方法によるＣＹＰ２Ａ６＊４のクラスタリングの結果を示すグラフである。
【図2】本発明方法によるＣＹＰ２Ａ６＊７のクラスタリングの結果を示すグラフである。
【図3】比較例であるＣＹＰ２Ａ６＊４（前処理なし）のクラスタリングの結果を示すグラフである。
【図4】比較例であるＣＹＰ２Ａ６＊７（前処理なし）のクラスタリングの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明方法では、予備的増幅（プレ増幅、プレＰＣＲ）を行った後、その増幅産物の一部を使用して主増幅（加水分解プローブ法、ＴａｑＭａｎＰＣＲ）を行う。本発明方法における判定対象は、チトクロームＰ４５０（cytochrome P450: CYP）の一種であり、ニコチン代謝反応を触媒するＣＹＰ２Ａ６の遺伝子多型であるＣＹＰ２Ａ６＊１（野生型）、ＣＹＰ２Ａ６＊４、ＣＹＰ２Ａ６＊７である（非特許文献１）。ヒトゲノムでは、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子座の近傍に、ＣＹＰ２Ａ６（配列番号２３；翻訳開始位置は２２番塩基）と塩基配列が酷似している別遺伝子（ＣＹＰ２Ａ７：配列番号２４；翻訳開始位置は３８番塩基）が存在し、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子多型の判定を困難にしている。
【0011】
ＣＹＰ２Ａ６＊１は野生型であり、正常なニコチン代謝活性を示す。ＣＹＰ２Ａ６＊４は、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との間の非相同組み換えの結果、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の大部分を欠損しており、酵素活性も欠損している。ＣＹＰ２Ａ６＊７は、４７１位のイソロイシンがスレオニンに変異している一塩基多型（ＳＮＰ）であり、酵素活性が低下している（以上、非特許文献１）。
本発明方法では、別遺伝子ＣＹＰ２Ａ７を増幅せず、ＣＹＰ２Ａ６＊１、ＣＹＰ２Ａ６＊４、ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける領域のみを増幅し、かつそれらを明確に区別できる測定系が必要である。
本発明方法では、別遺伝子ＣＹＰ２Ａ７を増幅せず、ＣＹＰ２Ａ６＊１、ＣＹＰ２Ａ６＊４、ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける領域のみを増幅し、かつそれらを明確に区別できる測定系が必要である。
【0012】
本発明方法に供する試料は、ゲノムＤＮＡを含むものであれば特に限定されない。例としては、全血や細胞等を挙げることができる。これらの試料から、ＤＮＡの調製のための通常の方法によりＤＮＡを得ることができる。
【0013】
（１）ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定
ＣＹＰ２Ａ６＊４は、先述のとおり、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えに拠り、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の大部分を欠損し、機能を欠失しているアリルであり、ＣＹＰ２Ａ７の５’領域と、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の３’非翻訳領域の融合部分を有する。これを利用し、遺伝子の大部分を欠損したＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける領域、及びＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける領域を同時に増幅し、かつ別遺伝子ＣＹＰ２Ａ７を増幅しないプライマー配列を用いてプレ増幅する。
ＣＹＰ２Ａ６＊４は、先述のとおり、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えに拠り、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の大部分を欠損し、機能を欠失しているアリルであり、ＣＹＰ２Ａ７の５’領域と、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の３’非翻訳領域の融合部分を有する。これを利用し、遺伝子の大部分を欠損したＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける領域、及びＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける領域を同時に増幅し、かつ別遺伝子ＣＹＰ２Ａ７を増幅しないプライマー配列を用いてプレ増幅する。
【0014】
更に、増幅された領域を鋳型として、ＣＹＰ２Ａ６＊１、ＣＹＰ２Ａ６＊４をそれぞれ特徴づける各領域に結合する加水分解プローブを設計し、ＴａｑＭａｎＰＣＲにて、ＣＹＰ２Ａ６＊１の存在の有無、及びＣＹＰ２Ａ６＊４の存在の有無を、別々の蛍光値に変換する。これにより、ＣＹＰ２Ａ６の遺伝子型（＊１／＊１、＊１／＊４、＊４／＊４）がそれぞれ判定可能となる。
【0015】
本発明において「ＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける領域」とは、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位を含み、且つ、その３’側の下流にＣＹＰ２Ａ６特異配列を含み、その５’側である上流にＣＹＰ２Ａ７特異配列を含む領域のことを指す。
【0016】
本発明において「ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける領域」とは、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位を含み、且つ、その５’側である上流にＣＹＰ２Ａ６特異配列を含む領域のことを指す。
【0017】
ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位としては、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子配列の翻訳開始位置から数えて６６５７ｂｐ～６８３１ｂｐとＣＹＰ２Ａ７遺伝子配列の翻訳開始位置から数えて７０４９ｂｐ～７２２２ｂｐとの間、もしくは、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子配列の６７５０ｂｐ～６８３１ｂｐとＣＹＰ２Ａ７遺伝子配列の７１４１ｂｐ～７２２２ｂｐとの間において、高頻度に非相同組換えが生じることが報告されている（FEBS Letters 448(1999)105-110）。
【0018】
本発明において「ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないプライマーセット」とは、組み換えが生じていないＣＹＰ２Ａ６、およびＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じたＣＹＰ２Ａ６＊４を同時に増幅することができ、且つ、組み換えが生じていないＣＹＰ２Ａ７を増幅しないプライマーセットである。
【0019】
フォワードプライマーには、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを用い、リバースプライマーには、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より３’側である下流に位置するＣＹＰ２Ａ６特異的な配列にハイブリダイズするプライマーを用いることにより、ＣＹＰ２Ａ７を増幅せずに、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を同時に増幅することができる。好ましくは、ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける領域とＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける領域の増幅産物が、ほぼ同じサイズになるようにプライマーを設計するとよい。
【0020】
なお、ＣＹＰ２Ａ６＊１には、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の３’非翻訳領域の一部がＣＹＰ２Ａ７遺伝子に置換したアリルＣＹＰ２Ａ６＊１Ｂが含まれている。ＣＹＰ２Ａ６＊１Ａ（野生型）とＣＹＰ２Ａ６＊１Ｂとは酵素活性が変わらないため、本発明方法ではＣＹＰ２Ａ６＊１ＢとＣＹＰ２Ａ６＊４を区別できるよう、リバースプライマーは、置換が生じるＣＹＰ２Ａ６遺伝子配列の翻訳開始位置から６６７９ｂｐ～６７３７ｂｐや７０７３ｂｐ～７０９９ｂｐの領域を避けて設定する必要がある。なお、ＣＹＰ２Ａ６＊１ＡとＣＹＰ２Ａ６＊１Ｂは、表現型（酵素活性）が変わらないため、本明細書ではまとめてＣＹＰ２Ａ６＊１と記載する。
【0021】
それぞれのプライマーの長さは、ヒトゲノム中で標的とした配列を特異的に認識する長さを有していれば特に問わないが、一般的には１０塩基から４０塩基の範囲であり、好ましくは１５塩基から３０塩基であり、特に好ましくは１６塩基から２５塩基である。プライマー間の距離、すなわち増幅領域は、１００塩基から５０００塩基の範囲であれば特に問わないが、好ましくは１００塩基から２０００塩基である。主増幅に用いるプライマーおよびプローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように設定する。
【0022】
本発明方法における予備的増幅は、前記プライマーを用いること以外は、常法に従って実施することができるが、増幅領域の長さに合わせて適切な伸長時間を設定することにより、組み換えが生じていないＣＹＰ２Ａ７を増幅せずに、各アリルを特徴づける領域のみを増幅することができる。
【0023】
本発明方法では、プレ増幅反応で得られた増幅産物を適宜希釈し上で、主増幅反応の鋳型として用いる。一般的には、二段階ＰＣＲを実施する場合、得られたプレ増幅産物を、主検出工程の増幅を阻害しないヌクレアーゼフリーの溶媒、例えば滅菌処理された超純水にて１００～１０，０００倍に希釈して、鋳型として使用する。
【0024】
本発明方法におけるＴａｑＭａｎ法による主増幅では、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を含む２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーセットと、当該増幅領域においてＣＹＰ２Ａ６＊１またはＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識する、異なる蛍光色素で標識された２種類のプローブを用いて、ＴａｑＭａｎ法による増幅を行う。ＴａｑＭａｎＰＣＲでは、一般に、増幅される領域の塩基配列の一部とアニールする、標識を付したプローブが使用され、ＰＣＲの伸長反応の際にポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性により遊離する標識を検出することにより、目的の増幅産物が検出される。
【0025】
主増幅に用いるプライマーセットは、プライマー間の距離が、ＴａｑＭａｎプローブ使用時に一般的とされる約２００ｂｐ以下となるように設定し、かつ、プローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように設定すること以外は、プレ増幅に用いるプライマーセットと同様に設定することができる。
【0026】
主増幅用プライマーの配列は、プレ増幅用プライマーの配列と一部配列が重複していてもよいし、同一であってもよい。
例えば、後述する実施例に示すように、ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーセットを使用することにより、非相同組換えが生じる部位の５’側上流が、ＣＹＰ２Ａ６由来の配列（すなわち、ＣＹＰ２Ａ６＊１）であっても、ＣＹＰ２Ａ７由来の配列（すなわち、ＣＹＰ２Ａ６＊４）であっても、１セットのプライマーセットで増幅することができる。より具体的には、フォワードプライマーには、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを用い、リバースプライマーには、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より３’側である下流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを用いることができる。
例えば、後述する実施例に示すように、ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーセットを使用することにより、非相同組換えが生じる部位の５’側上流が、ＣＹＰ２Ａ６由来の配列（すなわち、ＣＹＰ２Ａ６＊１）であっても、ＣＹＰ２Ａ７由来の配列（すなわち、ＣＹＰ２Ａ６＊４）であっても、１セットのプライマーセットで増幅することができる。より具体的には、フォワードプライマーには、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを用い、リバースプライマーには、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より３’側である下流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを用いることができる。
【0027】
「ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識するプローブ」とは、主増幅で増幅された領域の中の、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流において、ＣＹＰ２Ａ７にはないＣＹＰ２Ａ６特異的な遺伝子配列にハイブリダイズするプローブのことを指す。
【0028】
「ＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識するプローブ」とは、主増幅で増幅された領域の中の、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流において、ＣＹＰ２Ａ７に特異的でありＣＹＰ２Ａ６にはない遺伝子配列にハイブリダイズするプローブを指す。
【0029】
プローブの長さは、１０塩基から５０塩基であり、好ましくは１０塩基から２０塩基である。
【0030】
本発明方法におけるＴａｑＭａｎ法による主増幅に用いるプローブは、一の末端が蛍光色素により標識され、他の末端が前記蛍光色素を抑制するクエンチャーにより標識されている。
【0031】
本発明において蛍光色素とは、特定波長の励起光を吸収することで励起状態となり、元の基底状態に戻る際に蛍光を発する性質を有する物質を指す。標識に用いる蛍光物質は、プローブの末端に標識可能なものであれば、特に問わない。例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＴＡＭＲＡ、ＦＩＴＣ等いずれであってもよい。好ましくは、ＨＥＸ（５５３ｎｍ）やＦＡＭ（５２０ｎｍ）が挙げられる。
本発明方法においては、ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識するプローブとＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識するプローブとで、異なる蛍光色素を組み合わせて用いる。使用する解析装置に合わせて、検出波長の異なる蛍光色素を選択することができる。
本発明方法においては、ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識するプローブとＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識するプローブとで、異なる蛍光色素を組み合わせて用いる。使用する解析装置に合わせて、検出波長の異なる蛍光色素を選択することができる。
【0032】
本発明においてクエンチャーとは、蛍光色素の励起エネルギー吸収物質等をいう。使用する種類はＢＨＱ１、ＢＨＱ２、Ｄａｂｃｙｌ等いずれであってもよい。ただし、当該抑制する色素の種類によって蛍光の抑制範囲が異なるため、一のプローブ上で組となる蛍光色素の発光を抑制できるクエンチャーの種類を選択する必要がある。発光を抑制できる選択範囲内では特に問わない。例えば、蛍光色素がＦＡＭやＴＥＴの場合には、抑制範囲の波長がやや短波寄り（４８０ｎｍ～５８０ｎｍ）のＢＨＱ１を、また蛍光物質がＣｙ３やＴｅｘａｓ ｒｅｄの場合には、抑制範囲の波長がやや長波寄り（５５０ｎｍ～６５０ｎｍ）のＢＨＱ２を、選択してもよい。
【0033】
本発明において「標識され」とは、前記蛍光色素と前記クエンチャーのうち、いずれか一方は５’末端に、また他方は３’末端に化学的に結合されていることを意味する。通常５’末端に蛍光物質が結合していることが多いが、同様の効果が得られるのであれば３’末端に蛍光物質が結合していても、特に問わない。
【0034】
本発明方法における主増幅は、特定のプローブ及びプライマー対を使用する他は、通常のＴａｑＭａｎＰＣＲの方法に従って行うことができる。ＰＣＲの条件は、当業者であれば適宜最適化することができる。
【0035】
本発明における判定方法は、前記蛍光色素から発する蛍光を利用する。例えば、５’末端が蛍光物質で標識されているプローブにおいて、当該プローブの上流にハイブリダイゼーションするプライマーと、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとを遺伝子増幅用反応液に加え、ＰＣＲ法によって遺伝子増幅反応を行うことで、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解され、蛍光色素がプローブから遊離することでクエンチャーによる抑制が解除される。
【0036】
本発明の方法では、ＣＹＰ２Ａ６＊１およびＣＹＰ２Ａ６＊４が、２色の蛍光強度にそれぞれ対応して検出される。これにより、一般的な加水分解プローブによるＳＮＰ判定ソフトウェアが使用可能となる。目視による判定が不要となり、制限酵素処理や電気泳動など、従来法における誤判定や作業時間の問題が解消され、臨床の現場で遺伝子多型判定を短時間で行い、個人ごとの薬物処方設計を支援することが可能となる。また、Ｔｍ値の解析よりも、結果を容易に視覚的に確認することができる。
【0037】
蛍光色素に起因する蛍光強度の測定は、遺伝子増幅反応中にリアルタイムに行ってもよいし、反応終了後に行ってもよい。増幅反応中に測定する場合は、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムＰＣＲの専用装置が必要となる。増幅反応終了後に測定する場合は、遺伝子増幅反応はサーマルサイクラーで行うことができ、解析規模に応じて柔軟に使用する装置を選択することが可能となる。
【0038】
本発明方法において、プレ増幅及び主増幅に用いるプライマーセット、及びプローブの設定は、融解温度（Ｔｍ値）が均一で、分子内相互作用を有さず、且つプライマー、プローブ間で分子間二量体を形成し得る相補的配列を避けるように留意するなど、ＰＣＲに用いる条件を考慮して当業者に公知の方法に従って行えばよい。プローブ及びプライマー対の設定は、適当なプライマー・プローブデザイン用のソフトウェアを用いてもよい。
【0039】
（２）ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定
ＣＹＰ２Ａ６＊７は１塩基置換のアリル（SNP ID:rs5031016）であるが、当該ＳＮＰはＣＹＰ２Ａ７と非常に相同性が高い領域（ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の翻訳開始位置から６５５８番目）にあり、直接ＴａｑＭａｎプローブで遺伝子型を決定することは困難である。そこで、ＣＹＰ２Ａ６＊７については、ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける領域、及びＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける領域を同時に増幅し、かつ別遺伝子ＣＹＰ２Ａ７を増幅しないプライマー配列をもちいてプレ増幅する。これは、ＣＹＰ２Ａ６のみ特異的に増幅させることになる。
ＣＹＰ２Ａ６＊７は１塩基置換のアリル（SNP ID:rs5031016）であるが、当該ＳＮＰはＣＹＰ２Ａ７と非常に相同性が高い領域（ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の翻訳開始位置から６５５８番目）にあり、直接ＴａｑＭａｎプローブで遺伝子型を決定することは困難である。そこで、ＣＹＰ２Ａ６＊７については、ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける領域、及びＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける領域を同時に増幅し、かつ別遺伝子ＣＹＰ２Ａ７を増幅しないプライマー配列をもちいてプレ増幅する。これは、ＣＹＰ２Ａ６のみ特異的に増幅させることになる。
【0040】
更に、増幅された領域を鋳型として、ＣＹＰ２Ａ６＊１、ＣＹＰ２Ａ６＊７をそれぞれ特徴づける同一領域に結合する加水分解プローブを設計し、ＴａｑＭａｎＰＣＲにて、ＣＹＰ２Ａ６＊１の存在の有無、ＣＹＰ２Ａ６＊７の存在の有無を別々の蛍光値に変換する。これにより、ＣＹＰ２Ａ６の遺伝子型（＊１／＊１、＊１／＊７、＊７／＊７）がそれぞれ判定可能となる。
【0041】
本発明において「ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける領域」及び「ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける領域」とは、いずれも、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域のことを指す。
本発明において、「ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないプライマーセット」とは、ＣＹＰ２Ａ６特異的配列にハイブリダイズし、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させるプライマーセットである。「ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列」とは、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がイソロイシンである配列であり、「ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列」とは、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がスレオニンである配列のことを指す。
本発明において、「ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないプライマーセット」とは、ＣＹＰ２Ａ６特異的配列にハイブリダイズし、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させるプライマーセットである。「ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列」とは、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がイソロイシンである配列であり、「ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列」とは、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がスレオニンである配列のことを指す。
【0042】
ＣＹＰ２Ａ６＊７のプレ増幅に用いるプライマーセットは、ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、且つＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることのできるプライマーセットである。ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることができるものであれば、ＣＹＰ２Ａ６＊４のプレ増幅に用いるプライマーセットと、フォワードプライマーまたはリバースプライマーの一方、もしくは双方が同一であってもよい。同一のプライマーセットを用いることにより、ＣＹＰ２Ａ６＊４及びＣＹＰ２Ａ６＊７判定のためのプレ増幅を、一つの反応容器で実施することができる。
【0043】
ＣＹＰ２Ａ６＊７のＴａｑＭａｎ法による主増幅では、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を含む２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーセットと、当該増幅領域においてＣＹＰ２Ａ６＊１またはＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を認識する、異なる蛍光色素で標識された２種類のプローブを用いて、ＴａｑＭａｎ法による増幅を行う。
【0044】
主増幅に用いるプライマーセットは、ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、且つＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることのできるプライマーセットである。主増幅用プライマーの配列は、プレ増幅用プライマーの配列と一部配列が重複していてもよいし、同一であってもよい。
【0045】
「ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識するプローブ」とは、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がイソロイシンである配列を含む領域（典型的には１０塩基から５０塩基からなる領域であり、好ましくは１０塩基から２０塩基からなる領域）にハイブリダイズするプローブのことを指す。
【0046】
「ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を認識するプローブ」とは、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がスレオニンである配列を含む領域（典型的には１０塩基から５０塩基からなる領域であり、好ましくは１０塩基から２０塩基からなる領域）にハイブリダイズするプローブのことを指す。
【0047】
使用するプライマーおよびプローブ以外の要件や原理に関しては、ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定方法と同じである。
【0048】
本発明方法では、ＣＹＰ２Ａ６＊１、ＣＹＰ２Ａ６＊４、ＣＹＰ２Ａ６＊７をそれぞれ特異的に検出するため、ＣＹＰ２Ａ６＊４（及びＣＹＰ２Ａ６＊１）判定のために以下のプライマー、プローブ（１）～（３）を、ＣＹＰ２Ａ６＊７（及びＣＹＰ２Ａ６＊１）判定のために以下のプライマー、プローブ（４）～（６）を設計し、用いることができる。また、その相補的塩基配列を有するプライマー、プローブでもよい。
【0049】
（１）プレ増幅用プライマー配列：後述する表１に記載のＰＣＲ－２Ａ６ｓｔ４－ＦＷ１（配列番号１）及びＰＣＲ－２Ａ６－ＲＷ１（配列番号２）に代表される、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないＰＣＲプライマーペア。フォワードプライマーは、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーであり、リバースプライマーは、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より３’側である下流に位置するＣＹＰ２Ａ６特異的な配列にハイブリダイズするプライマーである。このようなプライマーセットとしては、配列番号１２の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１３の塩基配列における連続する１４塩基から２０塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せが挙げられる。
【0050】
（２）主増幅用プライマー配列：表１に記載のＰｒｉｍｅｒ－２Ａ６ｓｔ４－ＦＷ１（配列番号３）及びＰｒｉｍｅｒ－２Ａ６ｓｔ４－ＲＶ１（配列番号４）に代表される、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーペア。フォワードプライマーは、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーであり、リバースプライマーは、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より３’側である下流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーである。このようなプライマーセットとしては、配列番号１４の塩基配列における連続する２１塩基から２７塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１５の塩基配列における連続する２１塩基から２７塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せが挙げられる。
【0051】
（３）加水分解プローブ配列：表１に記載のＰｒｏｂｅ－２Ａ６ｓｔ４（ＨＥＸ）（配列番号５）及びＰｒｏｂｅ－２Ａ７ｓｔ４（ＦＡＭ）（配列番号６）に代表される、（２）のプライマーペアで増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける各配列を認識し、それぞれ別の蛍光として検出可能な加水分解プローブ。ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識するプローブは、主増幅で増幅された領域の中で、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流において、ＣＹＰ２Ａ７にはないＣＹＰ２Ａ６特異的な遺伝子配列にハイブリダイズするプローブであり、ＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識するプローブは、主増幅で増幅された領域の中で、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流において、ＣＹＰ２Ａ７に特異的でありＣＹＰ２Ａ６にはない遺伝子配列にハイブリダイズするプローブである。ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識するプローブとしては、配列番号１６の塩基配列における連続する１２塩基から１８塩基からなる配列で表されるプローブが挙げられる。ＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識するプローブとしては、配列番号１７の塩基配列における連続する１２塩基から１８塩基からなる配列で表されるプローブが挙げられる。
【0052】
（４）プレ増幅用プライマー配列：後述する表３に記載のＰＣＲ－２Ａ６ｓｔ７－ＦＷ１（配列番号７）〔又はＰＣＲ－２Ａ６ｓｔ４－ＦＷ１（配列番号１）〕及びＰＣＲ－２Ａ６－ＲＷ１（配列番号２）に代表される、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないＰＣＲプライマーペア。ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、且つＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることのできるプライマーセットである。このようなプライマーセットとしては、配列番号１２又は配列番号１８の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１３の塩基配列における連続する１４塩基から２０塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せが挙げられる。
【0053】
（５）主増幅用プライマー配列：表３に記載のＰｒｉｍｅｒ－２Ａ６ｓｔ７－ＦＷ１（配列番号８）及びＰｒｉｍｅｒ－２Ａ６ｓｔ７－ＲＶ１（配列番号９）に代表される、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーペア。ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、且つＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることのできるプライマーセットである。このようなプライマーセットとしては、配列番号１９の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号２０の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せが挙げられる。
【0054】
（６）加水分解プローブ配列：表３に記載のＰｒｏｂｅ－２Ａ６ｓｔ１（ＨＥＸ）（配列番号１０）及びＰｒｏｂｅ－２Ａ６ｓｔ７（ＦＡＭ）（配列番号１１）に代表される、（５）のプライマーペアで増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を認識し、それぞれ別の蛍光として検出可能な加水分解プローブ。ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識するプローブは、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がイソロイシンである配列を含む領域（典型的には１０塩基から５０塩基からなる領域であり、好ましくは１０塩基から２０塩基からなる領域）にハイブリダイズするプローブであり、ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を認識するプローブは、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がスレオニンである配列を含む領域（典型的には１０塩基から５０塩基からなる領域であり、好ましくは１０塩基から２０塩基からなる領域）にハイブリダイズするプローブである。ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識するプローブとしては、配列番号２１の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるプローブが挙げられる。ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を認識するプローブとしては、配列番号２２の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるプローブが挙げられる。
【0055】
本発明の判定用キットは、本発明方法に用いることのできるキットであり、プレ増幅用プライマーセット、及び、主増幅用プライマーセットと２種のプローブを含むことを特徴とする。プローブ及びプライマーセットについては、本発明方法に関し、上記に説明した通りである。
本判定用キットにおいてプローブ及びプライマー対は、混合物とされていてもよいし、別個に収容されていてもよい。本発明キットは、プローブ及びプライマーセットの他に、ＰＣＲを行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。
本判定用キットにおいてプローブ及びプライマー対は、混合物とされていてもよいし、別個に収容されていてもよい。本発明キットは、プローブ及びプライマーセットの他に、ＰＣＲを行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。
【0056】
本発明方法におけるプレ増幅および主増幅は、前記プローブ及びプライマーを用いること以外は、常法に従って実施することができ、より具体的には、例えば、後述の実施例に記載の手順に従って実施することができる。
【実施例】
【0057】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【0058】
《実施例１：測定試料並びにプライマー及びプローブの調製》
測定試料となるゲノムＤＮＡは、コリエル研究所（Coriell Institute）から購入したＨａｐＭａｐ ＤＮＡ（HAPMAP PT02）を市販のジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水（DEPC-Treated Water；ライフテクノロジーズジャパン株式会社）でゲノムＤＮＡ濃度として２ｎｇ／μＬに希釈したものを使用した。測定に使用したＨａｐＭａｐ ＤＮＡを表１１に示す。
測定試料となるゲノムＤＮＡは、コリエル研究所（Coriell Institute）から購入したＨａｐＭａｐ ＤＮＡ（HAPMAP PT02）を市販のジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水（DEPC-Treated Water；ライフテクノロジーズジャパン株式会社）でゲノムＤＮＡ濃度として２ｎｇ／μＬに希釈したものを使用した。測定に使用したＨａｐＭａｐ ＤＮＡを表１１に示す。
【0059】
ＣＹＰ２Ａ６＊４測定のために、表１に記載のプレＰＣＲ用プライマー、並びにＴａｑＭａｎＰＣＲ用プライマー及びプローブを調製した。ＦＷプライマー（ＰＣＲ－２Ａ６ｓｔ４－ＦＷ１；配列番号１）はＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズし、ＲＶプライマー（ＰＣＲ－２Ａ６－ＲＷ１；配列番号２）はＣＹＰ２Ａ６特異的配列にハイブリダイズする。これにより、ＣＹＰ２Ａ７は増幅せずにＣＹＰ２Ａ６＊１及びアリルＣＹＰ２Ａ６＊４を特異的に増幅することができる。ＴａｑＭａｎＰＣＲ用プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ－２Ａ６ｓｔ４－ＦＷ１；配列番号３、Ｐｒｉｍｅｒ－２Ａ６ｓｔ４－ＲＶ１；配列番号４）は、ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズすることから、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４の双方を増幅することができる。Ａｌｌｅｌｅ Ｘ用プローブ（Ｐｒｏｂｅ－２Ａ６ｓｔ４（ＨＥＸ）；配列番号５）はＴａｑＭａｎＰＣＲ増幅産物中でＣＹＰ２Ａ６特異的配列、すなわちＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識する加水分解プローブであり、Ａｌｌｅｌｅ Ｙ用プローブ（Ｐｒｏｂｅ－２Ａ７ｓｔ４（ＦＡＭ）；配列番号６）は増幅産物中でＣＹＰ２Ａ７、すなわちＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識する加水分解プローブである。
なお、各配列の説明（由来）を表２に示す。
なお、各配列の説明（由来）を表２に示す。
【0060】
また、ＣＹＰ２Ａ６＊７測定のために、表３に記載のプレＰＣＲ用プライマー、並びにＴａｑＭａｎＰＣＲ用プライマー及びプローブを調製した。Ｐｒｅ－ＰＣＲ及びＴａｑＭａｎＰＣＲ用プライマーは、いずれもＣＹＰ２Ａ６を特異的に増幅することができる。Ａｌｌｅｌｅ Ｘ用プローブは増幅産物中でＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識する加水分解プローブであり、Ａｌｌｅｌｅ Ｙ用プローブは増幅産物中でＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を認識する加水分解プローブである。なお、ＴａｑＭａｎＰＣＲ用プローブの各塩基配列において小文字で示す塩基は、ＣＹＰ２Ａ６＊１又はＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴付ける一塩基置換の位置を示す。
なお、各配列の説明（由来）を表４に示す。
なお、各配列の説明（由来）を表４に示す。
【0061】
【表1】
【0062】
【表2】
【0063】
【表3】
【0064】
【表4】
【0065】
《実施例２：プレＰＣＲ》
プレＰＣＲ用のフォワードプライマー（１００μｍｏｌ／Ｌ）及びリバースプライマー（１００μｍｏｌ／Ｌ）を２．５μＬずつ、並びにDEPC-Treated Waterを９５μＬ混和し、ＣＹＰ２Ａ６＊４測定用及びＣＹＰ２Ａ６＊７測定用の各Pre-PCR Primer Mix (2.5 μmol/L)を調製した。次に、表５に記載の組成（１反応分）に従って、市販のＰＣＲ試薬（TaKaRa LA Taq with GC Buffer；タカラバイオ株式会社）に添付の各試薬、前記Pre-PCR Primer Mix (2.5 μmol/L)、及びDEPC-Treated Waterを混和・撹拌した後、スピンダウンしてpre-PCR Mixtureとした。
９６ウェルプレートの各ウェルにpre-PCR Mixtureを１２μＬずつ分注した。続いて、各HapMap DNA溶液及び陰性対照としてDEPC-Treated Waterを３μＬずつ添加した。９６ウェルプレートにシールした後、タッピングにより混和した。
スピンダウンした後、９６ウェルプレートをPCR System（GeneAmp PCR System 9700；ライフテクノロジーズジャパン株式会社）にセットして、表６に示す条件で反応させ、プレＰＣＲ反応産物とした。
プレＰＣＲ用のフォワードプライマー（１００μｍｏｌ／Ｌ）及びリバースプライマー（１００μｍｏｌ／Ｌ）を２．５μＬずつ、並びにDEPC-Treated Waterを９５μＬ混和し、ＣＹＰ２Ａ６＊４測定用及びＣＹＰ２Ａ６＊７測定用の各Pre-PCR Primer Mix (2.5 μmol/L)を調製した。次に、表５に記載の組成（１反応分）に従って、市販のＰＣＲ試薬（TaKaRa LA Taq with GC Buffer；タカラバイオ株式会社）に添付の各試薬、前記Pre-PCR Primer Mix (2.5 μmol/L)、及びDEPC-Treated Waterを混和・撹拌した後、スピンダウンしてpre-PCR Mixtureとした。
９６ウェルプレートの各ウェルにpre-PCR Mixtureを１２μＬずつ分注した。続いて、各HapMap DNA溶液及び陰性対照としてDEPC-Treated Waterを３μＬずつ添加した。９６ウェルプレートにシールした後、タッピングにより混和した。
スピンダウンした後、９６ウェルプレートをPCR System（GeneAmp PCR System 9700；ライフテクノロジーズジャパン株式会社）にセットして、表６に示す条件で反応させ、プレＰＣＲ反応産物とした。
【0066】
【表5】
【0067】
【表6】
【0068】
《実施例３：ＴａｑＭａｎＰＣＲ》
表７に記載の組成に従って、TaqMan MGB Probe&Primer Mix (10×)を調製した。次に、表８に記載の組成（１反応分）に従って、試験管ミキサーにより混合した後、スピンダウンして、PCR Reaction Mixを調製した。
３８４ウェルプレートの各ウェルに各PCR Reaction Mixを６．０μＬずつ添加した。続いて、前記実施例２で得られたプレＰＣＲ反応産物をDEPC-Treated Waterで１０２４倍希釈したプレＰＣＲ反応産物希釈液、陰性対照としてDEPC-Treated Waterを４．０μＬずつ添加した。なお、各試料に対して反応はデュープリケート（duplicate、２ウェルずつ）で実施した。３８４ウェルプレートにシールを貼り、スピンダウンした後、リアルタイムＰＣＲ装置（LightCycler 480 II；ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）にセットした。
表７に記載の組成に従って、TaqMan MGB Probe&Primer Mix (10×)を調製した。次に、表８に記載の組成（１反応分）に従って、試験管ミキサーにより混合した後、スピンダウンして、PCR Reaction Mixを調製した。
３８４ウェルプレートの各ウェルに各PCR Reaction Mixを６．０μＬずつ添加した。続いて、前記実施例２で得られたプレＰＣＲ反応産物をDEPC-Treated Waterで１０２４倍希釈したプレＰＣＲ反応産物希釈液、陰性対照としてDEPC-Treated Waterを４．０μＬずつ添加した。なお、各試料に対して反応はデュープリケート（duplicate、２ウェルずつ）で実施した。３８４ウェルプレートにシールを貼り、スピンダウンした後、リアルタイムＰＣＲ装置（LightCycler 480 II；ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）にセットした。
【0069】
【表7】
【0070】
【表8】
【0071】
リアルタイムＰＣＲは、表９に示す条件で実施した。反応終了後、エンドポイントでの蛍光量を測定した。得られた測定データを表１０に従って変換し、ＳＮＰ判定とした。なお、測定不能の場合はＮ／Ａと表記した。
【0072】
【表9】
【0073】
【表10】
【0074】
《実施例４：結果と考察》
ＣＹＰ２Ａ６＊４の結果を表１１に示す。また、ＣＹＰ２Ａ６＊４のクラスタリングの結果を図１に示す。図１において、横軸はＨＥＸ（Allele X）の蛍光強度であり、縦軸はＦＡＭ（Allele Y）の蛍光強度である。
すべての測定試料において、デュープリケートの結果は同一であり、また、事前情報と一致した結果が得られた。なお、陰性対照（ゲノムDNAなし）は、ＨＥＸ及びＦＡＭ共に非検出であり、Negativeであった。またクラスタリングは、Allele X & Allele Yのヘテロ接合体（Both Alleles；図１のグラフの右上ゾーン）、Allele Xのホモ接合体（Allele X；図１のグラフの右下ゾーン）、Allele Yのホモ接合体（Allele Y；図１のグラフの左上ゾーン）、陰性対照（Negative；図１のグラフの左下ゾーン）が明瞭に区別され、自動判定可能であった。＊４／＊４（０コピー）と判定された検体は２検体（NA18952、NA18973）であった。
ＣＹＰ２Ａ６＊４の結果を表１１に示す。また、ＣＹＰ２Ａ６＊４のクラスタリングの結果を図１に示す。図１において、横軸はＨＥＸ（Allele X）の蛍光強度であり、縦軸はＦＡＭ（Allele Y）の蛍光強度である。
すべての測定試料において、デュープリケートの結果は同一であり、また、事前情報と一致した結果が得られた。なお、陰性対照（ゲノムDNAなし）は、ＨＥＸ及びＦＡＭ共に非検出であり、Negativeであった。またクラスタリングは、Allele X & Allele Yのヘテロ接合体（Both Alleles；図１のグラフの右上ゾーン）、Allele Xのホモ接合体（Allele X；図１のグラフの右下ゾーン）、Allele Yのホモ接合体（Allele Y；図１のグラフの左上ゾーン）、陰性対照（Negative；図１のグラフの左下ゾーン）が明瞭に区別され、自動判定可能であった。＊４／＊４（０コピー）と判定された検体は２検体（NA18952、NA18973）であった。
【0075】
【表11】
【0076】
ＣＹＰ２Ａ６＊７の結果を表１２に示す。また、ＣＹＰ２Ａ６＊７のクラスタリングの結果を図２に示す。表１２における「*Allele X」は、低シグナル値での判定であることを示す。図２において、横軸はＨＥＸ（Allele X）の蛍光強度であり、縦軸はＦＡＭ（Allele Y）の蛍光強度である。
NA18952及びNA18973の結果の考察は後述するとして、これらを除くすべての測定試料において、デュープリケートの結果は同一であった。なお、陰性対照（ゲノムDNAなし）は、ＨＥＸ及びＦＡＭ共に非検出であり、Negativeであった。またクラスタリングは、Allele X & Allele Yのヘテロ接合体（Both Alleles；図２のグラフの右上ゾーン）、Allele Xのホモ接合体（Allele X；図２のグラフの右下ゾーン）、Allele Yのホモ接合体（Allele Y；図２のグラフの左上ゾーン）、陰性対照（Negative；図２のグラフの左下ゾーン）が明瞭に区別され、自動判定可能であった。なお、プレＰＣＲ反応産物をシークエンスした結果、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のみが増幅されていたこと（すなわち、ＣＹＰ２Ａ７遺伝子が増幅されていないこと）を確認した。
NA18952及びNA18973の結果は低シグナルであり、NA18952及びNA18973が＊４／＊４（０コピー）であることを考慮すると、この結果は妥当であると判断された。
NA18952及びNA18973の結果の考察は後述するとして、これらを除くすべての測定試料において、デュープリケートの結果は同一であった。なお、陰性対照（ゲノムDNAなし）は、ＨＥＸ及びＦＡＭ共に非検出であり、Negativeであった。またクラスタリングは、Allele X & Allele Yのヘテロ接合体（Both Alleles；図２のグラフの右上ゾーン）、Allele Xのホモ接合体（Allele X；図２のグラフの右下ゾーン）、Allele Yのホモ接合体（Allele Y；図２のグラフの左上ゾーン）、陰性対照（Negative；図２のグラフの左下ゾーン）が明瞭に区別され、自動判定可能であった。なお、プレＰＣＲ反応産物をシークエンスした結果、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のみが増幅されていたこと（すなわち、ＣＹＰ２Ａ７遺伝子が増幅されていないこと）を確認した。
NA18952及びNA18973の結果は低シグナルであり、NA18952及びNA18973が＊４／＊４（０コピー）であることを考慮すると、この結果は妥当であると判断された。
【0077】
【表12】
【0078】
《比較例：ＴａｑＭａｎＰＣＲ（プレＰＣＲ不実施）》
実施例３と同様にして、PCR Reaction Mixを調製し、３８４ウェルプレートの各ウェルに各PCR Reaction Mixを６．０μＬずつ添加した。続いて、プレＰＣＲ反応産物希釈液の代わりに各HapMap DNA溶液、及び陰性対照としてDEPC-Treated Waterを４．０μＬずつ添加した。なお、各試料に対して反応はデュープリケート（duplicate、２ウェルずつ）で実施した。３８４ウェルプレートにシールを貼り、スピンダウンした後、リアルタイムＰＣＲ装置（LightCycler 480 II；ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）にセットし、表９に示す条件でリアルタイムＰＣＲを実施した。
実施例３と同様にして、PCR Reaction Mixを調製し、３８４ウェルプレートの各ウェルに各PCR Reaction Mixを６．０μＬずつ添加した。続いて、プレＰＣＲ反応産物希釈液の代わりに各HapMap DNA溶液、及び陰性対照としてDEPC-Treated Waterを４．０μＬずつ添加した。なお、各試料に対して反応はデュープリケート（duplicate、２ウェルずつ）で実施した。３８４ウェルプレートにシールを貼り、スピンダウンした後、リアルタイムＰＣＲ装置（LightCycler 480 II；ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）にセットし、表９に示す条件でリアルタイムＰＣＲを実施した。
【0079】
ＣＹＰ２Ａ６＊４及びＣＹＰ２Ａ６＊７のクラスタリングの結果を、それぞれ図３及び図４に示す。横軸はＨＥＸ（Allele X）の蛍光強度であり、縦軸はＦＡＭ（Allele Y）の蛍光強度である。どちらの図も、Allele X & Allele Yのヘテロ接合体、Allele Xのホモ接合体、Allele Yのホモ接合体、陰性対照が区別できなかった。一般的に、胚細胞由来の遺伝子多型検査では、末梢血から容易に高品質なゲノムＤＮＡを得られるため、プレＰＣＲを実施する必要はない。しかし、ＣＹＰ２Ａ６＊４及びＣＹＰ２Ａ６＊７の測定では、前処理としてプレＰＣＲを実施する必要があることが判明した。
【0080】
《調製例：プライマー及びプローブの設計》
本発明方法で用いることのできるプライマー及びプローブを表１３、表１４に示す。
本発明方法で用いることのできるプライマー及びプローブを表１３、表１４に示す。
【0081】
【表13】
【0082】
【表14】
【産業上の利用可能性】
【0083】
本発明は、ＣＹＰ２Ａ６の遺伝子多型の判定に使用することができ、例えば、ニコチン代謝や、それが関与する疾患の診断、治療、予防などの用途に利用できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】