特許 7739181 クロマトグラフィー樹脂の再生方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-09-05

(45)【発行日】2025-09-16

(54)【発明の名称】クロマトグラフィー樹脂の再生方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/50 20060101AFI20250908BHJP

   C07K 1/22 20060101ALI20250908BHJP

   C07K 1/16 20060101ALI20250908BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20250908BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20250908BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20250908BHJP

   C07K 14/52 20060101ALI20250908BHJP

   C07K 14/54 20060101ALI20250908BHJP

   C07K 14/575 20060101ALI20250908BHJP

   B01D 15/20 20060101ALI20250908BHJP

   B01D 15/38 20060101ALI20250908BHJP

   B01J 20/281 20060101ALI20250908BHJP

   B01J 20/24 20060101ALI20250908BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20250908BHJP

【ＦＩ】

G01N30/50

C07K1/22

C07K1/16

C07K16/00

C07K16/46

C07K19/00

C07K14/52

C07K14/54

C07K14/575

B01D15/20

B01D15/38

B01J20/22 D

B01J20/24 C

G01N30/26 A

B01J20/281 R

【請求項の数】 29

(21)【出願番号】P 2021561637

(86)(22)【出願日】2020-04-16

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-04

(86)【国際出願番号】 US2020028480

(87)【国際公開番号】W WO2020214792

(87)【国際公開日】2020-10-22

【審査請求日】2023-04-13

(31)【優先権主張番号】62/835,049

(32)【優先日】2019-04-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】391015708

【氏名又は名称】ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＳＴＯＬ－ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ ＣＯＭＰＡＮＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100126778

【弁理士】

【氏名又は名称】品川 永敏

(74)【代理人】

【識別番号】100156155

【弁理士】

【氏名又は名称】水原 正弘

(74)【代理人】

【識別番号】100162684

【弁理士】

【氏名又は名称】呉 英燦

(72)【発明者】

【氏名】アンジェロ，ジェイムズ

(72)【発明者】

【氏名】シュー，シュアンクオ

【審査官】高田 亜希

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１２／０３０１４２９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／００９３８００（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／０３４５６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５３０５３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１８／０２１４５８７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０１２－２４４９９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５３８３２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平１０－２２１３２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】Tianyi Zhou et al ，An enhanced regeneration strategy to improve microbial control and prolong resin lifetime for Protein A resin in large-scale monoclonal antibody (mAb) purification，Journal of Biotechnology，2019年01月10日，289，P118-125

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３０／００ － ３０／９６

Ｃ０７Ｋ １／１６ － １９／００

Ｂ０１Ｄ １５／２０ － １５／３８

Ｂ０１Ｊ ２０／２４ － ２０／２８１

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

クロマトグラフィー樹脂を、第１の緩衝液と第２の緩衝液をその順で接触させる工程を含むクロマトグラフィー樹脂を洗浄する方法であって、第１の緩衝液が酢酸およびベンジルアルコールを含み、リン酸を含まず、第２の緩衝液が水酸化ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよびベンジルアルコールを含み、クロマトグラフィー樹脂が動的なフロー条件下で第１の緩衝液中に約１５分以下の間保持され、クロマトグラフィー樹脂が動的なフロー条件下で第２の緩衝液中に約１５分以下の間保持され、第１の緩衝液の後と第２の緩衝液の前に、中和緩衝液をクロマトグラフィー樹脂に通すことを特徴とする、方法。

【請求項2】

第１の緩衝液が、約１５０～２００ｍＭ酢酸および約１～３％(ｖ／ｖ)ベンジルアルコールを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

第２の緩衝液が、約１００～３００ｍＭ水酸化ナトリウム、約１００～３００ｍＭクエン酸ナトリウムおよび約０.５～１.５％(ｖ／ｖ)ベンジルアルコールを含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

第１の緩衝液が、約１６７ｍＭの酢酸を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

第１の緩衝液が、約２％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

第２の緩衝液が、約２００ｍＭ水酸化ナトリウムを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

第２の緩衝液が、約２００ｍＭクエン酸ナトリウムを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

第２の緩衝液が、約１％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

第１の緩衝液が、約１６７ｍＭの酢酸および約２％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを含み、第２の緩衝液が、約２００ｍＭの水酸化ナトリウム、約２００ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび約１％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

第１の緩衝液が、約１６７ｍＭの酢酸および約２％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを含み、第２の緩衝液が、約１００ｍＭの水酸化ナトリウム、約２００ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび約１％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

洗浄した日に再使用できる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

クロマトグラフィー樹脂が、クロマトグラフィーカラム内に存在する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

クロマトグラフィー樹脂が、アフィニティー樹脂である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

クロマトグラフィー樹脂が、支持体に結合したアフィニティーリガンドを含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

アフィニティーリガンドが、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＡ、あるいはその一部または誘導体である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

アフィニティーリガンドが、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＧ、あるいはその一部または誘導体である、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

樹脂または支持体が、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

ポリペプチドをクロマトグラフィー樹脂に適用する工程、および請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法を使用してクロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含む、ポリペプチドの精製方法。

【請求項19】

クロマトグラフィー樹脂の結合容量が、５０回以上、１００回以上、１５０回以上または２００回以上クロマトグラフィー樹脂を洗浄した後も保持されている、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

クロマトグラフィー樹脂の圧力が、５０回以上、１００回以上、１５０回以上または２００回以上クロマトグラフィー樹脂を洗浄している間に上昇しない、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

ポリペプチドが、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリンである、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

抗体が、ＩｇＧモノクローナル抗体である、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

ＩｇＧモノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

ポリペプチドが、酵素、ホルモン、融合タンパク質、免疫コンジュゲート、サイトカインまたはインターロイキンである、請求項１８に記載の方法。

【請求項26】

１回以上の洗浄サイクルによりクロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を特徴とする、クロマトグラフィー樹脂を含むアフィニティークロマトグラフィーカラムを洗浄する方法であって、各洗浄サイクルが、クロマトグラフィー樹脂を、酢酸およびベンジルアルコールを含む第１の溶液に動的なフロー条件下で約１５分以下の間接触させ、続いてクロマトグラフィー樹脂を、水酸化ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよびベンジルアルコールを含む第２の溶液に動的なフロー条件下で約１５分以下の間接触させる工程を含み、第１の溶液がリン酸を含まず、第１の緩衝液の後と第２の緩衝液の前に、中和緩衝液をクロマトグラフィー樹脂に通すことを特徴とする、方法。

【請求項27】

微生物殺菌力が増大する、請求項１～２６のいずれかに記載の方法。

【請求項28】

宿主細胞タンパク質のファウリングを低下させる、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

収率低下を減らす、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【関連出願】

【0001】

本出願は、２０１９年４月１７日に提出した米国仮出願番号第６２/８３５,０４９号の優先権の利益を求めるものであり、出典明示によりその全てが本明細書に組み込まれる。

【技術分野】

【0002】

本発明の目的は、広義に、クロマトグラフィーおよびクロマトグラフィー樹脂の洗浄に関する。

【背景技術】

【0003】

クロマトグラフィー樹脂は、試料溶液中のその他の不純物質から目的のタンパク質を精製する際に使用される。クロマトグラフィー樹脂は、バイオ医薬品、例えば、モノクローナル抗体(Ｍａｂ)およびその他のＦｃ含有タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーにより精製するために頻繁に使用される。アフィニティークロマトグラフィーは、目的のタンパク質に特異的に結合するリガンドを樹脂に結合させることで、タンパク質とリガンドの相互作用を利用するものであり、例えば、抗体のＦｃ領域と結合できるリガンドであるプロテインＡが挙げられる。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、非常に有効なタンパク質精製方法であるが、プロテインＡ樹脂のコストは高く、ＭＡｂ製造における原料樹脂コストのかなりの部分を占める(Fahrner, R. L., et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 30, 121-128; Kelley, B., Biotechnol. Prog. 2007, 23:995-1008)。プロテインＡ樹脂のコストの問題は、わずか数回の精製サイクルの後に全体的な性能および結合容量が急速に低下するために、一般的に樹脂のライフサイクルが短いことが問題をさらに悪化させている。このため、大規模なタンパク質の精製事業では、新しいプロテインＡを、かなり頻繁に購入して使用する必要があり、タンパク質精製の全体的なコストがさらに高額となる。樹脂の性能および結合容量の低下は、生成物および処理の両方による不純物が樹脂に付着堆積することによる樹脂のファウリングが原因であることが多い。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

従って、クロマトグラフィー樹脂の全体的な性能および結合容量を長期間維持することにより、例えば、樹脂の完全性を維持しながらクロマトグラフィー樹脂を再生および／または洗浄することにより、クロマトグラフィー樹脂のライフサイクルを延ばす方法が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は、クロマトグラフィー樹脂を洗浄および／または再生する方法を提供する。クロマトグラフィー樹脂は、同一生成物に使用するために、または異なる生成物に使用するために、洗浄および／または再生されてもよい。

【発明を実施するための形態】

【0006】

一実施形態では、本発明は、クロマトグラフィー樹脂を、酢酸およびベンジルアルコールを含む第１の緩衝液、ならびに水酸化ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよびベンジルアルコールを含む第２の緩衝液と接触させることを特徴とする、クロマトグラフィー樹脂を洗浄する方法を提供する。一実施形態では、第１の緩衝液は、リン酸を含まない。一実施形態では、第１の緩衝液は、約１５０～２００ｍＭの酢酸および約１～３％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを含む。一実施形態では、第２の緩衝液は、約１００～３００ｍＭの水酸化ナトリウム、約１００～３００ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび約０.５～１.５％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを含む。一実施形態では、第１の緩衝液は、約１６７ｍＭの酢酸を含む。一実施形態では、第１の緩衝液は、約２％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを含む。一実施形態では、第２の緩衝液は、約２００ｍＭの水酸化ナトリウムを含む。一実施形態では、第２の緩衝液は、約２００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。一実施形態では、第２の緩衝液は、約１％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを含む。一実施形態では、第１の緩衝液は、約１６７ｍＭの酢酸および約２％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを含み、第２の緩衝液は、約２００ｍＭの水酸化ナトリウム、約２００ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび約１％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを含む。

【0007】

一実施形態では、第１の緩衝液は、約１６７ｍＭの酢酸および約２％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを含み、第２の緩衝液は、約１００ｍＭの水酸化ナトリウム、約２００ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび約１％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを含む。

【0008】

一実施形態では、中和緩衝液は、第１緩衝液の後と第２緩衝液の前にクロマトグラフィー樹脂に通される。

【0009】

一実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、第１の緩衝液中で約１５分以下の間保持される。一実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、第２の緩衝液中で約１５分以下の間保持される。一実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、第２の緩衝液中で約４５分以下の間保持される。一実施形態では、再使用は、洗浄と同日に行われる。

【0010】

一実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、クロマトグラフィーカラムに存在している。

【0011】

一実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、アフィニティー樹脂である。一実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、支持体に結合したアフィニティーリガンドを含む。一実施形態では、アフィニティーリガンドは、スタフィロコッカスのプロテインＡまたはその一部もしくは誘導体である。一実施形態では、アフィニティーリガンドは、スタフィロコッカスのプロテインＧまたはその一部もしくは誘導体である。一実施形態では、樹脂または支持体は、多糖類、アガロース、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリカーボネートまたはそれらの混合物からなる群から選択されるポリマーを含む。

【0012】

本発明は、ポリペプチドをクロマトグラフィー樹脂に適用する工程、および本明細書に記載の方法を用いてクロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を特徴とする、ポリペプチドを精製する方法も提供する。

【0013】

一実施形態では、洗浄済のクロマトグラフィー樹脂の結合容量は、本明細書に記載の方法を用いてクロマトグラフィー樹脂を洗浄した後に保持されている。一実施形態では、結合容量は、５０回以上、１００回以上、１５０回以上または２００回以上の洗浄後でも維持されている。

【0014】

一実施形態では、本明細書に記載の方法を用いるクロマトグラフィー樹脂を洗浄している過程で、クロマトグラフィー樹脂の圧力は上昇しない。一実施形態では、クロマトグラフィー樹脂の圧力は、５０回以上、１００回以上、１５０回以上または２００回以上の洗浄の後も上昇しない。

【0015】

一実施形態では、ポリペプチドとは、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むイムノグロブリンである。一実施形態では、ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントである。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧモノクローナル抗体である。一実施形態では、ＩｇＧモノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。一実施形態では、ポリペプチドは、酵素、ホルモン、融合タンパク質、免疫コンジュゲート、サイトカインまたはインターロイキンである。

【0016】

本発明はまた、クロマトグラフィー樹脂を含むアフィニティークロマトグラフィーカラムを洗浄する方法を提供するものであって、前記方法は、クロマトグラフィー樹脂を、１つ以上の洗浄サイクルで洗浄する工程を特徴とし、各洗浄サイクルは、クロマトグラフィー樹脂を、酢酸およびベンジルアルコールを含む第１の溶液と約１５分以下の間接触させる工程、ならびに水酸化ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよびベンジルアルコールを含む第２の溶液と約１５分以下または約４５分以下の間接触させる工程を特徴とする。一実施形態では、第１の溶液は、リン酸を含まない。一実施形態では、本方法は、微生物殺菌力を向上させる。一実施形態では、本方法は、宿主細胞タンパク質のファウリングを低下させる。一実施形態では、本方法は、収率低下を減らす。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、洗浄プロトコール１(－１－)、洗浄プロトコール２(－２－)、洗浄プロトコール３(－３－)および洗浄プロトコール６(－４－)についての精製サイクル数増加時のプロテインＡの工程収率を示す。

【図2】図２は、洗浄プロトコル９(－１－)、洗浄プロトコル１０(－２－)および洗浄プロトコル１１(－３－)についての精製サイクル数増加時のプロテインＡの工程収率を示す。

【図3】図３は、洗浄プロトコル２(－１－)、洗浄プロトコル４(－２－)、洗浄プロトコル５(－３－)および洗浄プロトコル７(－４－)についての精製サイクル数増加時のプロテインＡの工程収率を示す。

【図4】図４は、洗浄プロトコル１(－１－)、洗浄プロトコル７(－２－)および洗浄プロトコル８(－３－)についての精製サイクル数増加時の、デルタカラム圧を示す。

【図5】図５は、洗浄プロトコル１０(－１－)および洗浄プロトコル１１(－２－)についての精製サイクル数増加時の溶出画分中の残留プロテインＡ(ｐｐｍ)を示す。

【図6】図６は、洗浄プロトコル９および洗浄プロトコル１１についての、サイクル１７１における洗浄液(洗液１、洗液２および洗液３)、溶出液、ＣＩＰおよび中和画分中の残留プロテインＡ(ｎｇ／ｍＬ)を示す。

【図7】図７は、様々な時点で適用された様々な洗浄液の微生物殺菌力を示す。

【図8】図８は、洗浄プロトコル１２について、ＣＩＰ２接触時間が２０分の場合およびＣＩＰ２接触時間が４５分の場合におけるプロテインＡの工程収率を示す。

【図9】図９は、洗浄プロトコル１２について、ＣＩＰ２接触時間が２０分の場合(左)およびＣＩＰ２接触時間が４５分の場合(右)の、１００サイクル全体のプロテインＡのＤＢＣ曲線を示す。

【発明の詳細な説明】

【0018】

本明細書では、クロマトグラフィー樹脂を洗浄または再生するための方法を提供する。本発明の方法は、小規模および大規模(例えば、製造規模)のクロマトグラフィー樹脂の再生に使用することができる。現在、認識されているクロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程には、リン酸を用いた酸性ストリップス工程が含まれる。本発明は、リン酸のような強い剤(harsh agent)を使用せずにクロマトグラフィー樹脂を洗浄することができるという驚くべき予想外の発見に基づいている。リン酸は、シリカ系固定相またはメタクリル系固定相の系内の付着汚れを洗浄することはできる(アガロース系固定相はできない)が、リン酸を使用すると、流路閉塞による圧力上昇を招き、収率低下に至る可能性が有る。

【0019】

(定義)
本明細書において使用される「クロマトグラフィー」とは、目的タンパク質(例えば、イムノグロブリンまたは別のＦｃ含有タンパク質など)の標的分子を、混合物中のその他の分子から分けて、標的分子を単離することができる動的分離技術を意味する。一般的に、クロマトグラフィー法では、液体移動相が、目的とする標的分子を含む試料を移動させて、固定相(通常は固体)に通すか、または通過させる。固定相への分配係数または親和性の違いにより、選択された分子が固定相に一時的に結合する一方で、移動相は、様々な分子を異なるタイミングで移動させる。

【0020】

本明細書において使用される「アフィニティークロマトグラフィー」とは、分離したい標的分子(例えば、Ｆｃ含有タンパク質などのタンパク質分子)が、クロマトグラフィー樹脂に固定された分子(プロテインＡ系のリガンドなど)と、「鍵と鍵穴」作用により相互作用することにより分離されるクロマトグラフィー様式のことである。この特異的な相互作用により、目的の分子は結合し、望ましくない分子は流れ出る。その後、移動相の温度、ｐＨまたはイオン強度を変えることで、標的分子が高純度で溶出される。本明細書に記載されている様々な実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーは、標的分子(例えば、イムノグロブリンまたは他のＦｃ含有タンパク質)を含む試料を、プロテインＡのＣドメイン(または、場合により、改変Ｂドメイン)を基にしたリガンドを担持する固体支持体(プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー媒体または樹脂という)に加えることを含む。アフィニティークロマトグラフィーに使用されるその他のリガンドには、イムノグロブリンのＦｃ領域に結合するレンサ球菌属(Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｉ)由来のプロテインＧがある。

【0021】

本明細書において使用される「プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー」とは、細菌である黄色ブドウ球菌(Staphylococcous aureus)の細胞壁に存在しているタンパク質であり、イムノグロブリンのＦｃ領域に結合可能なタンパク質であるプロテインＡを用いて、物質を分離または単離することをいう。プロテインＡは、固体支持体に固定されており、目的のタンパク質と接触される。

【0022】

「固体支持体」という用語は、一般に、リガンドが結合しているあらゆる樹脂(多孔質または非多孔質)を指す。リガンドの固体支持体への結合は、グラフト化の場合のような共有結合(エーテル、チオエーテル、炭素－炭素結合または他の結合を介して)またはコーティング、接着、吸着および同様のメカニズムのいずれかである。本明細書に記載の方法で使用される例示的な固体支持体には、多糖類、アガロース、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリカーボネートなどがある。

【0023】

当分野で知られているプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂の例としては、プロテインＡを制御された孔のあるガラス骨格に固定化したもの、例えばＰＲＯＳＥＰ^ＴＭ媒体／樹脂(EMD MILLIPORE社製)；プロテインＡを、ポリスチレン固体支持体に固定したもの、例えばＰＯＲＯＳ^ＴＭ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ^ＴＭＡ媒体／樹脂(APPLIED BIOSYSTEMS INC, POROS^TM MabCapture^TM media/resin (APPLIED BIOSYSTEMS.INC.)；およびアガロース固体支持体にプロテインＡを固定したもの、例えばｒＰＲＯＴＥＩＮ Ａ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ^ＴＭまたはＭＡＢＳＥＬＥＣＴ^ＴＭ媒体または樹脂(GE HEALTHCARE)が挙げられる。

【0024】

本明細書で互換的に使用される「アフィニティー樹脂」または「アフィニティークロマトグラフィー樹脂」または「アフィニティー媒体」という用語は、例えば、本明細書に記載されているような固体支持体に結合したアフィニティークロマトグラフィーリガンド(例えば、プロテインＡをベースとする)をいう(例えば、プロテインＡアフィニティー樹脂またはプロテインＡ樹脂が得られる)。一般的に、「アフィニティー樹脂」および「アフィニティー媒体」という用語は、本明細書において互換的に使用される。アフィニティークロマトグラフィー樹脂のその他の例には、イムノグロブリンのＦｃ領域に結合することができる連鎖球菌(Streptococci)由来のプロテインＧを有する樹脂が含まれる。また、カッパ軽鎖を介してイムノグロブリンと結合するプロテインＬを有するアフィニティー樹脂も含まれる。これらのタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーに使用することで、これらのアフィニティー樹脂に特異的に結合するイムノグロブリンまたは他のタンパク質を精製することができる。

【0025】

本明細書において使用される「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸重合体を指す。重合体は、直鎖状でも分岐していてもよく、修飾されたアミノ酸を含んでいても、アミノ酸では無いものが介在していてもよい。また、この用語には、天然に修飾されたか、または介在によって修飾されたアミノ酸の重合体も含まれる。例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または標識成分とのコンジュゲーションなどのその他の操作または修飾が挙げられる。また、この定義には、例えば、１つ以上のアミノ酸のアナログ(例えば、非天然アミノ酸)を含むポリペプチドに加えて、当技術分野においては既知の別の修飾も含まれる。本明細書で使用される「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、特に、抗体およびＦｃドメイン含有ポリペプチド(例えば、イムノアドヘシン類)を包含する。

【0026】

本明細書で互換的に使用される「標的タンパク質」または「目的タンパク質」という用語は、アフィニティー樹脂を使用して精製することができるあらゆるタンパク質、例えばプロテインＡのＦｃ含有分子を意味する。様々な実施形態において、標的タンパク質は、Ｆｃ含有タンパク質、例えばイムノグロブリンまたはＦｃ融合タンパク質である。

【0027】

「イムノグロブリン」、「Ｉｇ」または「抗体」(本明細書では、互換的に使用される)とは、ジスルフィド結合で相互に連結された少なくとも２本の重鎖(Ｈ)と２本の軽鎖(Ｌ)を含んでいるタンパク質をいう。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではＶＨと略す)と重鎖定常領域(本明細書ではＣＨと略す)を含む。特定の抗体、例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体では、重鎖定常領域は、ヒンジと、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインから構成されている。特定の抗体、例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体では、各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではＶＬと略す)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン(本明細書ではＣＬと略す)を含んでいる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる超可変領域と、フレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる保存性の高い領域(ＦＲ)にさらに分けられ得る。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含んでおり、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含んでいる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的な補体系の第一成分(Ｃ１ｑ)を含む宿主組織または因子へのイムノグロブリンの結合を媒介することができる。重鎖は、Ｃ末端のリジンを有していても、有していなくてもよい。本明細書では、別段の記載が無い限り、可変領域のアミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムを用いて番号が付けられ、定常領域のアミノ酸は、ＥＵ体系を用いて番号付けされる。「抗体」には、例えば、天然由来の抗体および非天然由来の抗体の両方、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、ヒト抗体および非ヒト抗体ならびに全合成抗体が含まれる。

【0028】

イムノグロブリンまたは抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよく、また、例えば、単量体または重合体の形態(例えば、５量体で存在するＩｇＭ抗体および／または単量体、２量体または多量体で存在するＩｇＡ抗体)で存在してもよい。本明細書では、「抗体」と組み合わせて使用される用語「フラグメント」は、無傷または完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含んでいる抗体または抗体鎖の一部または部分を意味する。フラグメントは、無傷または完全な抗体または抗体鎖を、化学的または酵素的に処理して得ることができる。フラグメントは、組換え手段により得ることもできる。フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')_２、Ｆｃおよび／またはＦｖフラグメントが挙げられる。精製される抗体またはフラグメントは、ヒト、ヒト化またはキメラであり得る。

【0029】

本明細書に記載の方法を用いて精製される標的タンパク質は、Ｆｃ領域を含んでいるため、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｉ由来のプロテインＡまたはプロテインＧにより精製できることが理解される。本明細書で使用される用語「Ｆｃ領域」または「Ｆｃ」は、プロテインＡと相互作用するイムノグロブリン分子のアミノ酸残基をいう。Ｆｃ領域は、抗体の結晶化可能な尾部領域であり、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体と相互作用する。

【0030】

本明細書では「Ｆｃ-結合」、「Ｆｃ部分に結合する」または「Ｆｃ部分に結合すること」という用語は、抗体の定常ドメイン(Ｆｃ)に結合する本明細書に記載のアフィニティーリガンドの能力をいう。ある実施形態では、本発明のリガンドは、少なくとも１０^－７Ｍまたは少なくとも１０^－８Ｍまたは少なくとも１０^－９Ｍの親和性を有する抗体(例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４)のＦｃ部分である。

【0031】

本明細書では「フラグメント」という用語は、例えばイムノグロブリンなどの全長のＦｃ含有タンパク質の一部分を指すこともある。フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体分子、ダイアボディ、線形抗体および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。

【0032】

本明細書において値またはパラメータに「約」を引用することは、その値またはパラメータ自体に関するバリエーションを含む(および記述するものである)。また「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。

【0033】

本明細書および添付の特許請求の範囲に使用されている通り、単数形の冠詞「ａ」、「ｏｒ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のものを指示しない限り、複数の関連語を含む。本明細書に記載された本発明の態様および変形には、態様および変形を「含む」、「含有する」および／または「主にから構成する」ことを含むと理解される。

【0034】

(本発明の方法)
クロマトグラフィー樹脂の洗浄
本発明は、アフィニティークロマトグラフィー樹脂を効率的に再生または洗浄する方法を提供するものである。本発明の方法を使用すると、より効率的な洗浄工程が得られ、その結果、樹脂材料のライフサイクルが延びる。本発明のより効率的な洗浄方法は、タンパク質生成物の大規模生産に使用されるアフィニティー樹脂の性能を長期化させることができる。

【0035】

本明細書では、「洗浄」という用語は、標的タンパク質(例えば、イムノグロブリンまたは他のＦｃ含有タンパク質)の精製方法において、アフィニティークロマトグラフィー樹脂(例えば、プロテインＡカラム)に残留する不純物および夾雑物を除去し、樹脂の性能を維持するための工程を意味する。洗浄することにより、樹脂から不純物が取り除かれるが、理想的には、結合容量(樹脂が、純度を保つことができる標的タンパク質の量)および分離能(樹脂が、標的タンパク質と望ましくない物質を分離する能力)を用いて測定される樹脂の完全性への影響は最小限でなければならない。多くの場合、市販のアフィニティークロマトグラフィー樹脂、例えばスタフィロコッカスプロテインＡまたはその誘導体を用いた樹脂は、リン酸を含む溶液またはＮａＯＨを用いたアルカリ溶液、例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ^ＴＭを用いて洗浄される。プロテインＡカラムは、希釈したＮａＯＨで洗浄する。一方で、Ｐｒｏｓｅｐ^ＴＭ プロテインＡカラムは、一般的にリン酸を用いて洗浄される。

【0036】

「結合容量」とは、所定の条件下において、カラムのラン中(分析処理中)に、充填した樹脂または媒体の規定容量と結合する分子の量を意味する。結合容量は、静的結合容量または動的結合容量として測定できる。静的結合容量の場合は、分子と樹脂を制限なく接触させたときに、規定された容量の樹脂に結合する分子の量を実測する。静的結合容量とは、樹脂が結合できる標的分子の最大量を実測した値である。実際には、この値は、過剰量の標的分子を樹脂と、最小の流速またはフロー無しで４時間以上接触させることにより得られることが多い。一方で、動的結合容量は、設定した流速で樹脂の体積あたりに樹脂が結合できる標的分子の量である。いかなる樹脂であっても、動的結合容量は、実施条件によって大きく変化する。一般的には、流速が低いほど動的結合容量は大きくなる。流速がゼロに近づくと、結合容量は利用可能な最大容量である静的結合容量に近似する。適切な洗浄および殺菌を行わなければ、アフィニティー樹脂の結合容量は、結合および溶出を何度も繰り返している間に、通常、初期値よりも低下する。このように結合容量が、ある一定の値を下回ると、不純物を含むフロースルー画分と共に溶出し、生成物の損失につながる可能性がある。適切な化学物質を用いて適切に洗浄を行うことで、樹脂の結合容量を長期間維持することができる。

【0037】

プロテインＡアフィニティー樹脂の洗浄は、樹脂のライフサイクルを通じて安定した精製を行うために、言い換えれば樹脂の結合容量を維持するために、各サイクルの後に行われるのが一般的である。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂の洗浄は、以下の２つ：(１)プロテインＡ樹脂は、イオン交換樹脂または疎水性相互作用(ＨＩＣ)樹脂に比べて初期コストが高いこと；および(２)プロテインＡクロマトグラフィー樹脂は、不純物を多く含む清浄化細胞培養培地に供されることが多いという理由から、特に重要である。そのため、一部の残留不純物がプロテインＡ樹脂に結合することにより、樹脂の再使用時に、結合容量の低下または溶出プールの不純物の増加をもたらす。これは、生産性の低下または生成物純度の低下(結合容量の低下を理由とする)につながるため、製造現場では非常に好ましくない。従って、プロテインＡの結合と溶出の各サイクル後に定期的に洗浄を行うことは、樹脂の性能を一定に保つためには非常に重要であり、これにより生成物の純度および工程のスループットを一定に保つことができる。

【0038】

本明細書で使用される「サイクル」、「アフィニティーサイクル」または「プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製サイクル」という用語は、アフィニティー樹脂を用いたクロマトグラフィーカラムを中性緩衝液で平衡化することから始まり、その後、清澄化した細胞培養供給物(清澄化した細胞培養培地には、精製すべき標的タンパク質が含まれている)をカラムにロードすることによる多段階工程を意味する。プロテインＡアフィニティー樹脂の場合、標的タンパク質は、精製すべきＦｃ含有タンパク質(例えば、モノクローナル抗体)であって、１つ以上(多くの場合３つ)の異なる緩衝液でカラムを洗浄した後、標的タンパク質とリガンド(または、例えばＦｃ含有タンパク質とプロテインＡ樹脂)との結合には干渉しない緩く結合した不純物を除去する；続いて、溶出緩衝液(例えば、ｐＨ２.５～４.５)を用いて、標的タンパク質をアフィニティー樹脂から、例えばプロテインＡ樹脂からＦｃ含有タンパク質を溶出する。この平衡化、ロード、洗浄および溶出という多段階工程は、１サイクルまたは結合および溶出のサイクルを構成する。１サイクルの後には、通常、カラムにある微量レベルの不純物を除去するための洗浄工程の後に、次のサイクルに進める。

【0039】

本明細書に記載のいくつかの実施形態では、樹脂の洗浄は、酢酸およびベンジルアルコールを含む第１の洗浄緩衝液、ならびに水酸化ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよびベンジルアルコールを含む第２の洗浄緩衝液を用いて行われる。本明細書で洗浄に関連して使用される「洗浄緩衝液」という用語は、標的タンパク質の溶出後に固体支持体(例えば、固定されたプロテインＡを含む)を通過させる緩衝液をいう。

【0040】

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、各サイクルの後に第１の緩衝液および第２の緩衝液の両方と接触させる。他の実施形態では、クロマトグラフィー樹脂を、１サイクル後に第１の緩衝液または第２の緩衝液のいずれかと接触させ、第１の緩衝液および第２の緩衝液は、精製処理を通じて交互に使用するようにする。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、第２の緩衝液と接触させた後、第１の緩衝液と接触させる。

【0041】

本発明は、本発明の方法で使用するための緩衝液を提供するものである。本発明の第１の緩衝液は、リン酸を含まない。一実施形態では、第１の緩衝液は、例えば、約１００～３００ｍＭの酢酸または約１２５～２５０ｍＭの酢酸または約１５０～２００ｍＭの酢酸または約１６７ｍＭの酢酸を含んでいてもよい。また、第１の緩衝液は、約２～４％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールまたは約２.５～３.５％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールまたは約２～３％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールまたは約１.５～２.５％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールまたは約１～２％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールまたは約２％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを含んでいてもよい。一実施形態では、第１の緩衝液は、１６７ｍＭの酢酸と約２％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを含む。

【0042】

別の実施形態では、本発明は、微生物汚染の負担を軽減し、また適宜樹脂を保存するために使用できる第２の緩衝液を提供する。本発明の第２の緩衝液は、例えば、約５０～４００ｍＭまたは約１００～３５０ｍＭまたは約１５０～３００ｍＭまたは約１００～３００ｍＭまたは約２００ｍＭの水酸化ナトリウムを含んでもよい。また、第２の緩衝液は、約５０～４００ｍＭまたは約１００～３５０ｍＭまたは約１５０～３００ｍＭまたは約１００～３００ｍＭまたは約２００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含んでいてもよい。また、第２の緩衝液は、約０.５～３％(ｖ／ｖ)または約０.５～１.５％(ｖ／ｖ)または約１～２％(ｖ／ｖ)または約１.５～２.５％(ｖ／ｖ)または約１％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを含んでいてもよい。第２の緩衝剤の非限定的な例は、約２００ｍＭの水酸化ナトリウム、約２００ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび１％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールである。

【0043】

ある実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、クロマトグラフィーカラム内に存在している。いくつかの実施形態では、カラムは、少なくとも２、３、４または５カラム容量にて洗浄される。いくつかの実施形態では、カラムは、不純物がカラムからさらに溶出しないか、または実質的に溶出しなくなるまで、第１の緩衝液および第２の緩衝液で洗浄される。

【0044】

本明細書に記載のいずれかの方法に関するいくつかの実施形態では、流速は、約５０材料容積(material volumes)／ｈｒ、約４０材料容積／ｈｒまたは約３０材料容積／ｈｒのいずれかよりも少ない。流速は、５材料容積／時間～５０材料容積／時間、１０材料容積／時間～４０材料容積／時間または１８材料容積／時間～３６材料容積／時間のいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、流速は、約９材料容積／時間、約１８材料容積／時間、約２５材料容積／時間、約３０材料容積／時間、約３６材料容積／時間または約４０材料容積／時間のいずれかである。

【0045】

いくつかの実施形態では、流速は、約９０カラム容量(ＣＶ)／時間、約８０ＣＶ／時間、約７０ＣＶ／時間、約６０ＣＶ／時間、約５０ＣＶ／時間、約４０ＣＶ／時間または約３０ＣＶ／時間未満のいずれかである。流速は、約５ＣＶ／ｈｒ～約５０ＣＶ／ｈｒ、約１０ＣＶ／ｈｒ～約４０ＣＶ／ｈｒまたは約１８ＣＶ／ｈｒ～約３６ＣＶ／ｈｒのいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、流速は、約９ＣＶ／ｈｒ、約１８ＣＶ／ｈｒ、約２５ＣＶ／ｈｒ、約３０ＣＶ／ｈｒ、約３６ＣＶ／ｈｒまたは約４０ＣＶ／ｈｒのいずれかである。本明細書に記載のいずれかの方法に関するいくつかの実施形態では、流速は、１００ｃｍ／ｈｒ未満、７５ｃｍ／ｈｒ未満または５０ｃｍ／ｈｒ未満のいずれかである。流速は、約２５ｃｍ／ｈｒ～約１５０ｃｍ／ｈｒ、約２５ｃｍ／ｈｒ～約１００ｃｍ／ｈｒ、約５０ｃｍ／ｈｒ～約１００ｃｍ／ｈｒまたは約６５ｃｍ／ｈｒ～約８５ｃｍ／ｈｒのいずれかであってもよい。

【0046】

さらに、本発明の方法では、カラムの再生に必要な時間が短縮される。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液との接触時間は、通常、７５分～３０分、さらには約９分に短縮され、短時間で同一樹脂を使用する複数の追加精製が可能となる。

【0047】

夾雑物
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの夾雑物質とは、宿主細胞材料、溶出したプロテインＡ、核酸、目的のポリペプチドのバリアント、フラグメント、凝集物または誘導体、別のポリペプチド、エンドトキシン、ウイルス汚染物質、細胞培養培地成分、カルボキシペプチダーゼＢ、ゲンタマイシンなどのいずれか１以上のものであり得る。いくつかの例では、夾雑物質とは、例えば、大腸菌細胞などの細菌細胞、昆虫細胞、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞、真菌細胞由来の宿主細胞タンパク質(ＨＣＰ)であり得るが、これらに限定されない。

【0048】

溶出したプロテインＡとは、プロテインＡが結合している固相から脱離または洗浄されたものである。例えば、溶出したプロテインＡは、プロテインＡのクロマトグラフィー材料から溶出され得る。プロテインＡの量は、例えば、酵素結合免疫吸着法(ＥＬＩＳＡ)を用いて測定することができる。本明細書に記載の方法のいずれかに関するいくつかの実施形態では、溶出したプロテインＡの量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％または約９０％のうちのいずれかの値よりも大きく減少する。溶出したプロテインＡの量は、約１０％～９９％、約３０％～９５％、約３０％～９９％、約５０％～９５％、約５０％～９９％、約７５％～９９％または約８５％～９９％のうちのいずれかの程度減少され得る。いくつかの実施形態では、溶出したタンパク質Ａの量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％のうちのいずれかにまで減少する。いくつかの実施形態では、この減少は、精製工程(複数可)から回収された組成物中の溶出したプロテインＡの量を、精製工程(複数可)前の組成物中の溶出したプロテインＡの量と比較することにより決定される。

【0049】

宿主細胞タンパク質(ＨＣＰ)は、ポリペプチドを産生した細胞に由来するタンパク質である。ＨＣＰの量は、ＥＬＩＳＡまたはＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ(「ＭＳＯ」)により測定することができる。本明細書に記載の方法いずれかのいくつかの実施形態では、溶出液中のＨＣＰの量は、モック溶出において最小である。いくつかの実施形態では、モック溶出から得た溶出液中の宿主細胞タンパク質のレベルを、洗浄方法の有無または洗浄方法の前後で比較する。

【0050】

ＤＮＡ、例えば宿主細胞ＤＮＡを測定する方法は、当業者には既知である。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＡの量は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％のうちのいずれかよりも大きく減少する。ＤＮＡの量は、約１０％～９９％、約３０％～９５％、約３０％～９９％、約５０％～９５％、約５０％～９９％、約７５％～９９％または約８５％～９９％のうちのいずれかの値まで減少され得る。ＤＮＡの量は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％のいずれかの値まで減少され得る。いくつかの実施形態では、この減少は、精製工程(複数可)から回収された組成物中のＤＮＡの量を、精製工程(複数可)前の組成物中のＤＮＡの量と比較することにより決定される。

【0051】

フラグメントポリペプチドは、低分子量(ＬＭＷ)タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、フラグメント化ポリペプチドは、目的のポリペプチドのフラグメントである。ＬＭＷタンパク質の例としては、Ｆａｂ(フラグメント抗原結合)領域、Ｆｃ(フラグメント、結晶化可能)領域またはその両方の組み合わせ、または目的の抗体の任意のランダムなフラグメント化された部分が挙げられるが、これらに限定されない。フラグメント化されたタンパク質(例えば、ＬＭＷタンパク質)を測定する方法は、当技術分野では知られており、実施例の欄に記載されている。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＬＭＷタンパク質の量は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％のうちのいずれかよりも大きく減少する。ＬＭＷタンパク質の量は、約１０％～９９％、約３０％～９５％、約３０％～９９％、約５０％～９５％、約５０％～９９％、約７５％～９９％または約８５％～９９％のうちのいずれかの程度減少され得る。ＬＭＷタンパク質の量は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％のいずれかの値まで減少され得る。いくつかの実施形態では、この減少は、精製工程(複数可)から回収された組成物中のフラグメント化タンパク質(例えば、ＬＭＷタンパク質)の量を、精製工程(複数可)前の組成物中のフラグメント化タンパク質(例えば、ＬＭＷタンパク質)の量と比較することにより決定される。

【0052】

凝集ポリペプチドは、高分子量(ＨＭＷ)のタンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、凝集ポリペプチドとは、目的のポリペプチドの多量体である。ＨＭＷタンパク質は、目的のポリペプチドの２量体、８倍までの単量体、またはそれ以上の単量体であってもよい。凝集タンパク質(例えば、ＨＭＷタンパク質)を測定する方法は、当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、モック溶出液中のＨＭＷのレベルは最小であり、例えば、約５ｐｐｍ未満、約４ｐｐｍ未満、約３ｐｐｍ未満、約２ｐｐｍ未満または約１ｐｐｍ未満である。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、凝集タンパク質の量は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％のうちのいずれかの値よりも大きく減少する。凝集タンパク質の量は、約１０％～９９％、約３０％～９５％、約３０％～９９％、約５０％～９５％、約５０％～９９％、約７５％～９９％または約８５％～９９％のうちのいずれかの程度減少され得る。凝集タンパク質の量は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％のうちのいずれかの値まで減少され得る。いくつかの実施形態では、この減少は、精製工程(複数可)から回収された組成物中の凝集タンパク質(例えば、ＨＭＷタンパク質)の量を、精製工程(複数可)前の組成物中の凝集タンパク質(例えば、ＨＭＷタンパク質)の量と比較することにより決定される。

【0053】

細胞培養培地成分とは、細胞培養培地中に存在する成分をいう。細胞培養培地とは、細胞を収集する際の細胞培養培地であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養培地成分はゲンタマイシンである。ゲンタマイシンの量は、ＥＬＩＳＡによって測定されてもよい。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞培養培地成分の量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％または約９０％のうちのいずれかの値よりも大きく減少する。細胞培養培地成分の量は、約１０％～９９％、約３０％～９５％、約３０％～９９％、約５０％～９５％、約５０％～９９％、約７５％～９９％または約８５％～９９％のいずれかの程度減少され得る。いくつかの実施形態では、細胞培養培地成分の量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９８％のうちのいずれかの値まで減少する。いくつかの実施形態では、この減少は、精製工程(複数可)から回収された組成物中の細胞培養培地成分の量を、精製工程(複数可)前の組成物中の細胞培養培地成分の量と比較することにより決定される。

【0054】

ポリペプチド
本発明の方法は、複数のポリペプチド調製物の精製に使用されるクロマトグラフィー材料を洗浄するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料は、抗体またはそのフラグメントなどのポリペプチドの大規模生産；例えば、製造規模の生産に使用される。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料は、第１のポリペプチド(例えば、第１の抗体)の精製に使用され、次いで、材料は、本発明の方法により洗浄され、クロマトグラフィー材料は、第２のポリペプチド(例えば、第２の抗体)の精製に使用することができる。いくつかの実施形態では、この洗浄は、第２の精製ポリペプチドを含む調製物が、第１のポリペプチドを実質的に含まないようにするために有効である。いくつかの実施形態では、第２の精製ポリペプチド(例えば、第２の抗体)を含む調製物は、１ｐｐｍ未満の第１のポリペプチド(例えば、第１の抗体)を含む。いくつかの実施形態では、第２の精製ポリペプチドは、１ｐｐｍ未満、２ｐｐｍ未満、３ｐｐｍ未満、４ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、４０ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満または１００ｐｐｍ未満のいずれかの第１のポリペプチドを含む。

【0055】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、治療用ポリペプチドを精製するために使用されるクロマトグラフィー材料を再利用するために使用される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、アゴニストである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、エピトープタグである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、生物学的および／または免疫学的活性を保持している。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、補体依存性の細胞毒性を開始させる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体またはイムノアドヘシンである。

【0056】

本明細書に記載の方法により洗浄された再生済クロマトグラフィー材料を用いて精製されるポリペプチドは、一般に、組換え技術を用いて製造される。組換えタンパク質を製造する方法は、例えば、米国特許第５,５３４,６１５号および第４,８１６,５６７号に記載されており、特に参照により本明細書に組み込まれる。

【0057】

ポリペプチドは、真核細胞または原核細胞において、組換え的に産生することができる。タンパク質は、遺伝子操作された植物、トランスジェニック動物から得ることができるか、または細胞培養中で増殖するように適合された産生細胞によって分泌され得る。産生細胞は、細菌(例えば、大腸菌、ストレプトミセス属およびバチルス属)、真菌(例えば、アスペルギルス属)、無脊椎動物由来のもの(例えば、昆虫)または哺乳類が可能である。当技術分野において一般的に使用されている哺乳類細胞の例としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１(Ｃｏｓを含む)、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫細胞株(特に、マウス)、ＰＣ１２およびＷ１３８細胞が挙げられる。特に好ましい宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞であり、これは、いくつかの複雑な組換えタンパク質(例えば、サイトカイン類、凝固因子および抗体)を産生するために広く使用されている(Brasel et al, 1996, Blood 88:2004-2012; Kaufman et al., 1988, J. Biol Chem 263: 6352-6362; McKinnon et al., 1991, J Mol Endocrinol 6: 231-239; Wood et al., 1990, J. Immunol 145: 3011-3016)。ジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)欠損変異細胞株(Urlaub et al., 1980, Proc Natl Acad Sci USA 77：4216-4220)であるＤＸＢ１１およびＤＧ－４４は、好まれるＣＨＯ宿主細胞株である。これは、効率的なＤＨＦＲ選択可能な遺伝子発現系および増幅可能な遺伝子発現系により、この細胞において組換えタンパク質が高レベルで発現され得るためである(Kaufman R. J., 1990, Meth Enzymol 185:527-566)。さらに、これらの細胞は、接着培養または懸濁培養として操作することが容易であり、比較的良好な遺伝的安定性を示す。ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ細胞で発現させた組換えタンパク質は、広範な特性が明らかにされており、規制当局により臨床的製造に使用することが承認されている。

【0058】

本明細書に記載の方法で洗浄した再生済クロマトグラフィー材料を用いて精製されるポリペプチドは、培養液または宿主細胞溶解物から回収することができる。ポリペプチドの発現に用いた細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤などの様々な物理的または化学的手段により破砕することができる。ポリペプチドが細胞内で産生される場合、最初の工程として、宿主細胞または溶解したフラグメントのいずれかである粒子状の破砕物が、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Carter et. al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)には、大腸菌のペリプラスム空間に分泌されるポリペプチドを単離する方法が記載されている。要するに、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(ｐＨ３.５)、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)の存在下で、約３０分かけて解凍する。細胞破砕物は、遠心分離により除去することができる。ポリペプチドが培地中に分泌される場合、そのような発現系から得た上清は、一般的に、市販のポリペプチド濃縮フィルター(例えば、Ａｍｉｃｏｎ またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置)を用いて先ずは濃縮される。前記のいずれかの工程に、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて、外来の夾雑物質の増殖を防止してもよい。

【0059】

本明細書に記載の方法で洗浄した再利用可能なクロマトグラフィー材料を用いて精製することができるポリペプチドの例としては、免疫グロブリン、イムノアドヘシン、抗体、融合タンパク質、Ｆｅ含有タンパク質および免疫コンジュゲートが挙げられるが、これらに限定されない。

【0060】

その後、得られた発現ポリペプチドは、本発明の方法と公知の方法を組み合わせて用いて、そのような培養物または成分(例えば、培養培地または細胞抽出物または体液)から精製するか、または部分精製することができる。「部分精製された」とは、何らかの分画方法または手順を実施したが、目的のタンパク質よりも多くのポリペプチド種(少なくとも１０％)が存在することを意味する。「精製された」とは、タンパク質が実質的に均質であること、すなわち、夾雑タンパク質の存在が１％未満であることを意味する。分画方法には、ろ過、遠心分離、沈殿、相分離、アフィニティー精製、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ：フェニルエーテル、ブチルエーテル、プロピルエーテルなどの樹脂を使用する)またはＨＰＬＣの１以上の工程、あるいはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。上記のクロマトグラフィー樹脂のいずれも、本発明の方法を用いて洗浄および再生することができる。

【0061】

最終的にどの程度の純度を目的とするかは、ポリペプチドの使用目的により異なる。例えば、ポリペプチドをインビボで投与する場合には、比較的高い純度が望まれる。このような場合、ポリペプチドは、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ－ＰＡＧＥ)による分析時に、別のポリペプチドに対応するポリペプチドバンドが検出されないように精製される。関連分野の当業者であれば、そのポリペプチドに対応する複数のバンドが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって認められ得る場合、これらは、異なるグリコシル化、異なる翻訳後プロセスなどに起因することが理解されるであろう。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析時に、単一のポリペプチドバンドにより示されるように、実質的に均質物にまで精製される。このポリペプチドバンドは、銀染色、クーマシーブルー染色または(ポリペプチドが放射性標識されている場合は)オートラジオグラフィーによって可視化することができる。

【0062】

本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、限定的に解釈されるべきではない。本出願中に引用された全ての文献の内容は、参照により本明細書に出典明示により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0063】

ｍＡｂ精製用のプロテインＡカラムのライフサイクルを適切に長く保持するためには、樹脂洗浄が重要な要素である。またプロテインＡ樹脂は、下流工程で使用される最も高価な消耗品の一つであるため、効率的な樹脂洗浄は、持続可能な材料コストを維持するためにも重要である。

【0064】

ファウリングの影響は、空間的な制限により結合容量が低下すること、および全体的な粒子間空隙率が低下することにより、カラムのライフサイクルに影響を与え、ファウリングの濃度増加に伴い、ｍＡｂが更に吸着しにくくなる。水酸化ナトリウム溶液の濃度を高くすると、付着堆積したファウリング物質が除去されることは判ったが、リガンドの加水分解が増加するために容量が損なわれる。水酸化ナトリウム溶液中の添加物質は、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどは、リガンドの加水分解速度を低下させるのに僅かながら効果があることが判った。

【0065】

次世代型水酸化ナトリウム安定性プロテインＡ樹脂を用いて、全体的な生産性と有効性を向上させるような洗浄液の新規処方が求められている。

【0066】

材料および方法

【表1】

【0067】

樹脂およびロード材料
実験に使用したプロテインＡカラムは、内径０.８ｃｍ×ベッド高５.０ｃｍで、ＭｉｎｉＣｈｒｏｍハードウェア(Repligen, Waltham, MA)にＭａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ LＸ樹脂(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)を充填したものである。洗浄試験の実験は、ロード物質として４.１～４.６ｇ／Ｌ力価の清澄化した細胞培養物の収集物を用いて、ＡＥＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０ Ｓｙｓｔｅｍ(GE Healthcare)で行った。別の実験は、同じ樹脂を、内径１ｃｍ×ベッド高１０ｃｍのＯｍｎｉｆｉｔガラスカラム(Ｋｉｎｅｓｉｓ社)に充填して行い、ロード物質として４.１～４.６ｇ／Ｌ力価の清澄化した細胞培養物を用いて、同じくＡＥＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０ Ｓｙｓｔｅｍ(GE Healthcare社)で行った。

【0068】

分析
捕捉ランのための生成物の濃度は、ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ９６ ＵＶ－Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ(Trinean, Gentbrugge, Belgium)を用いて２８０ｎｍのＵＶ吸光度で決定した。残留ＣＨＯ－ＨＣＰおよびｒＰｒｏＡを定量化するためにＥＬＩＳＡを、Ｔｅｃａｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｈａｎｄｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ(Morrisville, NC)を用いてハイスループットで行った。製造者のプロトコルに従って、ＨＣＰレベルは、ＣＨＯ ＨＣＰ ３ｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(Cygnus Technologies, Southport, NC)を用いて定量化し、ｒＰｒｏＡは、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ(Repligen Corporation, Waltham, MA)を用いて定量化した。サンプル中の残留ＣＨＯ ＤＮＡ(ｒＤＮＡ)は、リアルタイム定量ＰＣＲ(ＲＴ－ｑＰＣＲ)を用いて測定した。Ｗａｔｅｒｓ社のＡｃｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏ ＵＰＬＣを用いてサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)を行い、生成物プール中のモノマーおよび凝集体の含有量を測定した。モノマー、低分子種および高分子種の定量化は、Ｅｍｐｏｗｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ(Waters Corp.)を用いて行った。

【0069】

クロマトグラフィー法
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ プロテインＡカラムは、結合－溶出モード(bind-and-elute mode)を選択した。各洗浄プロトコルにおいて、終了の基準を満たすまでプロテインＡのサイクルを複数回実施した。終了の基準とは、収率(８０％未満)およびデルタカラム圧力(３.００ＭＰａ以上)である。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸのプロテインＡ のクロマトグラフィー操作に必要な工程、滞留時間、緩衝液のカラム容量(ＣＶ)の概要を表２に示す。

【表2】

【0070】

プロテインＡカラムを、３ＣＶの２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムの緩衝液(ｐＨ７.２)で平衡化した。その後、１Ｍ塩化ナトリウムをカラムに入れて、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムの緩衝液(ｐＨ７.２)を用いて平衡化を２ＣＶにて続けた。平衡化後、清澄化したバルクを、４５ｇ／Ｌ樹脂のローディングターゲットを用いて２℃～８℃でカラムにロードした。その後、カラムを、２ＣＶの２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムの緩衝液(ｐＨ７.２)で洗浄し、その後５ＣＶの５０ｍＭ炭酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび０.５％ポリソルベート－８０の緩衝液(ｐＨ１０.０)を用いて洗浄し、次いで５ＣＶの２０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液(ｐＨ５.１)を用いて洗浄した。このカラムを、２０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液(ｐＨ３.４)で溶出した。５ＣＶ全ての溶出液を回収し、各サイクルの溶出液を、別々の容器に回収した。溶出後に、プロテインＡカラムを３ＣＶのＣＩＰ１緩衝液を用いてその場で洗浄し、２ＣＶの２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.２)で中和した後、３ＣＶのＣＩＰ２緩衝液で殺菌(sanitize)した。所定の洗浄プロトコルにＣＩＰ１が無い場合、そのクロマトグラフィー法ではＣＩＰ１と中和１を行なわなかった。同様に、所定の洗浄プロトコルにＣＩＰ２がない場合、そのクロマトグラフィー法ではＣＩＰ２および中和２の両方を省いている。プロテインＡカラムを、再度サイクルに供するため、３ＣＶの２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムの緩衝液(ｐＨ７.２)を使用して２回目の再平衡化を行った後に、ローディング、溶出までに至るその後の工程、定置洗浄および殺菌を行った。最終サイクルのＣＩＰ工程の後、３ＣＶの２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムの緩衝液(ｐＨ７.２)を用いて平衡化工程を行い、その後３ＣＶの２％(ｖ／ｖ)ベンジルアルコールを用いてカラムを保存した。

【0071】

プロテインＡの工程の収量を計算するための式：

【数1】

【0072】

デルタカラム圧または示差カラム圧とは、カラムの充填層を通過する圧力損失のことで、即ちカラム入口の圧力[ＭＰａ]－カラム出口の圧力[ＭＰａ]のことである。

【0073】

【表3】

内径１ｃｍ×ベッド高１０ｃｍのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸカラムを用いて、表３の洗浄プロトコル１２を用いる追加の反復試験を行った。この洗浄方法では、各ＣＩＰ工程(ＣＩＰ１およびＣＩＰ２)の滞留時間を、３分ではなく５分として、動的なフロー条件下で、各ＣＩＰ溶液の接触時間を１５分とした。ＣＩＰ２工程の後に５分または３０分の静止時間を設け、ＣＩＰ２溶液の累積接触時間を各々２０分および４５分とし、２つの反復試験を並行して行った。

【0074】

結果および考察
本試験の結果、ファウリング物質の除去が不十分であることに加え、リン酸などの不適切な溶液成分が、収量およびデルタカラム圧に影響を与えて、ファウリングの程度を悪化させ、デルタカラム圧に影響を与えることが判明した。この相互作用のメカニズムは完全には解明されていない。図１は、洗浄プロトコル１、２、３および６について、表示された精製サイクル中の工程収率を示している。コントロールケースを示す洗浄プロトコル１では、緩やかな収率低下を示しながら、サイクル６５付近で急激に収率が低下している。このケースでは、ＣＩＰ１工程でリン酸を使用し、ＣＩＰ２工程では低濃度の水酸化ナトリウムを使用しているため、ファウリング物質の除去が不十分であり、カラムの劣化に至ることが推察される。このケースは、カラムの過加圧のために終了したが、これはおそらくＣＩＰ１条件において与えられた低いｐＨ環境が理由であろう。ＣＩＰ２工程を省略した場合(洗浄プロトコル２)は、ＣＩＰ２洗浄が完全に省かれて、またＣＩＰ１のリン酸／酢酸の条件以外にカラム洗浄が行われないため、処理性能が悪化し、同様にサイクル６０付近で収率の急激な低下が見られる。洗浄プロトコル３では、洗浄プロトコル１で使用したＣＩＰ溶液にはベンジルアルコールが除かれているため、サイクル１２０付近で収率が大幅に低下するまでは、より持続的な処理性能を示している。このことから、ベンジルアルコールもまた、カラムの洗浄効率および全体的な収率に悪影響を及ぼす可能性があると考えられる。有機溶液は、ペプチド、タンパク質および核酸などを沈殿させる作用があることが知られており、除去が不十分なためにタンパク質を含むファウリング物質が残留しているカラムには、この作用が影響していると考えられる。洗浄プロトコル６では、収率が徐々に低下しているが、１７０サイクルを実施しても急激な低下は見られない。ここで使用したＣＩＰ溶液にはベンジルアルコールが残っていたが、リン酸を除去し、水酸化ナトリウムの含有量を２０ｍＭから２００ｍＭに増加させたことで、工程収率により大きな効果があることが判った。高濃度の水酸化物によるファウリング物質の洗浄は、処理性能を維持する上で重要である。

【0075】

ＣＩＰ１工程として、１６７ｍＭの酢酸、２％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコール、ＣＩＰ２工程として１００ｍＭの水酸化ナトリウム、２００ｍＭのクエン酸ナトリウム、１％(ｖ／ｖ)のベンジルアルコールを用いる別の洗浄プロトコル(表３の洗浄プロトコル１２)も、内径１ｃｍ×ベッド高１０ｃｍのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸカラムを用いて評価した。この処方では、リガンド分解の影響を抑えつつ、固定相の十分な洗浄を行うために、中濃度の水酸化ナトリウム(１００ｍＭ)を使用した。この洗浄手法による樹脂洗浄とリガンド分解の程度を評価するために、ＣＩＰ２溶液の累積接触時間を２０分と４５分に設定したサイクル試験を実施した。

【0076】

図８は、プロテインＡの９１サイクルで実施したクリーニングプロトコル１２の収率の傾向を示している。全体的な傾向としては、接触時間が２０分の場合と４５分の場合の両方で、ほぼ直線的に減少している。これらのケースは、ＣＩＰ２溶液と全体的な接触時間が、各ＣＩＰ溶液との全体的な接触時間が９分しかないクリーニングプロトコル１～１１(すなわち、３つのカラム容量に対して３分の滞留時間＝９分)よりも、長いことに留意すべきである。この直線的な減少は、過酷な洗浄液への曝露による固定相上のリガンドの分解に関連があると考えられる。しかし、１００ｍＭの水酸化ナトリウムを使用することで、十分な洗浄が可能となり、タンパク質を含むファウリング物質を除去することができる。

【0077】

図９は、洗浄プロトコル１２の試験に使用したカラムで別途実施した動的結合容量(ＤＢＣ)曲線を示す。これらの曲線は、処理工程の中間体から事前に精製したｍＡｂを使用し、カラムへの重層が１００ｇ／Ｌ樹脂を超えるようにロードした。これら通過液の曲線の一般的な左へのシフトは、結合容量の減少を示しており、これはリガンドの分解と関連している可能性があり、そのためｍＡｂ生成物への親和性が低下していることを示している。接触時間２０分の場合の曲線の特徴的な形態は、このカラムでより多くのファウリングが発生していることを示すが、観察された収率への影響は、接触時間が２０分と４５分両方の場合について、全体の工程収率と比較すると無視できる程度である。

【0078】

洗浄プロトコル６では、９分間の接触時間で十分処理されるという事実を示したが、製造現場では、洗浄試薬の殺菌および防カビ効果を十分に発揮させるために、より長時間の接触時間を必要とするのが一般的である。洗浄プロトコル１２のケースで検討された長い接触時間は、この点でより現実的であり、プロテインＡのリガンドを分解する水酸化ナトリウム溶液の影響を軽減するために、中間値として１００ｍＭ水酸化ナトリウムが選択された理由である。

【0079】

様々な時間(接触時間)で適用した異なる溶液の微生物殺菌力(ＬＲＶ)を、実測した(図７)。１６７ｍＭ酢酸、２％(ｖ／ｖ)ベンジルアルコール(ＣＩＰ１緩衝液)および２００ｍＭ水酸化ナトリウム、２００ｍＭクエン酸ナトリウム、１％(ｖ／ｖ)ベンジルアルコール(ＣＩＰ２緩衝液)が、好ましい接触時間である１５分で試験した溶液の中で最も有効であることが判った。

【0080】

(結論)
評価した全ての洗浄プロトコルの中で、洗浄プロトコル６の条件が、最も良好であると判断された。洗浄プロトコル６では、１７０サイクルに達しながらも、高い収率(９２.９％)を維持することができた(図１)。これは、大きな圧力上昇がなく、有意なファウリングやプロテインＡの溶出がなく、十分な洗浄が行われたことを示している。一方、洗浄プロトコル１では、重大な問題が発生する前に６９サイクルしか達成できなかった。６９サイクルの時点で、収率は８４.１％に低下し(図１)、デルタカラム圧は、０.３ＭＰａに上昇し、洗浄が不十分であることが示された(図４)。洗浄条件の一つとしてリン酸を用いたその他の洗浄プロトコルでは、ＣＩＰ２に高濃度の水酸化ナトリウムが存在する場合(洗浄プロトコル８；図４)を除いて、いずれも収率の大幅な低下またはデルタカラム圧の大幅な上昇が見られた(図１および４)。また、ＣＩＰ２(水酸化ナトリウム溶液)条件を設定しなかったランは、ＣＩＰ２条件を設定したランよりも早くファウリングする傾向が見られた(図３)。これらのランは、いずれも１００サイクルに達しなかったのに対し、ＣＩＰ２条件を用いた７つのランの内の６つは１００サイクルに達することができた(図１、２、４)。洗浄プロトコル１０および１１は、溶出プールについて１０サイクルごとにリガンドの加水分解を試験した(図５)。洗浄プロトコル９および１１の最終サイクルでは、回収および再生工程の全てについて、リガンドの加水分解の試験を行った(図６)。溶出プール中の残留プロテインＡレベルは、両方のランにおいて通常の範囲内であった(図５)。しかし、両方のランの最終サイクルのＣＩＰおよび中和工程では、残留プロテインＡのレベルが明らかに高かった(図６)。残留プロテインＡのレベルが高く、収量が大幅に低下したことから、リガンドの加水分解はＣＩＰ２条件における高い水酸化ナトリウム濃度が原因であることが判った。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】