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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-09-24
(45)【発行日】2025-10-02
(54)【発明の名称】抗ＡＸＬ抗体及び組成物
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20250925BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250925BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20250925BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250925BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250925BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250925BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20250925BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20250925BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250925BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20250925BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250925BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20250925BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250925BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250925BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
C07K16/46
A61K39/395 N
A61K45/00
A61P35/00
A61P35/02
A61P43/00 121
C12N15/13 ZNA
【請求項の数】
27
(21)【出願番号】P 2022551247
(86)(22)【出願日】2021-02-26
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-14
(86)【国際出願番号】 IB2021051636
(87)【国際公開番号】W WO2021171257
(87)【国際公開日】2021-09-02
【審査請求日】2024-02-21
(31)【優先権主張番号】62/982,852
(32)【優先日】2020-02-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】522084245
【氏名又は名称】シンフォジェン・アクシェセルスケープ
【氏名又は名称原語表記】ＳＹＭＰＨＯＧＥＮ Ａ／Ｓ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ジェッティング，トーベン
(72)【発明者】
【氏名】リンドステット，トリーネ
(72)【発明者】
【氏名】ウィラー，アントン
(72)【発明者】
【氏名】ウォルソー，アンネ
(72)【発明者】
【氏名】メランデル，エヴァ・マリア・カールセン
(72)【発明者】
【氏名】ヤコブセン，ヤヌス・スコウ
(72)【発明者】
【氏名】ハンセン，ランディ・ウェスト
【審査官】澤田 浩平
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５２８６７７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／１９７５０６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１８－５２５３５４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５３８５５３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００９／０６３９６５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１９－５１９１９９（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ，Ａ６１Ｐ，Ｃ０７Ｋ，Ｃ１２Ｎ
ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分であって、前記抗体が、ａ）それぞれ配列番号４５～５０；
ｂ）それぞれ配列番号１５～２０；
ｃ）それぞれ配列番号５～１０；
ｄ）それぞれ配列番号２５～３０；
ｅ）それぞれ配列番号３５～４０；又は
ｆ）それぞれ配列番号５５～６０
のＨ－ＣＤＲ１～３及びＬ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列を含む、抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分。
【請求項2】
請求項１に記載の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分であって、前記抗体が、ａ）それぞれ配列番号４３及び４４；
ｂ）それぞれ配列番号１３及び１４；
ｃ）それぞれ配列番号３及び４；
ｄ）それぞれ配列番号２３及び２４；
ｅ）それぞれ配列番号３３及び３４；又は
ｆ）それぞれ配列番号５３及び５４
のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一である重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分。
【請求項3】
請求項１に記載の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分であって、前記抗体が、ａ）それぞれ配列番号４３及び４４；
ｂ）それぞれ配列番号１３及び１４；
ｃ）それぞれ配列番号３及び４；
ｄ）それぞれ配列番号２３及び２４；
ｅ）それぞれ配列番号３３及び３４；又は
ｆ）それぞれ配列番号５３及び５４
のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分。
【請求項4】
前記抗体が、ＩｇＧである、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分。
【請求項5】
前記抗体が、ＩｇＧ１である、請求項４に記載の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分。
【請求項6】
前記抗体が、ＦＣ領域中に少なくとも１つの変異を含む、請求項１～５のいずれか一項記載の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分。
【請求項7】
前記抗体が、ＩｇＧ１であり、IMGTナンバリングスキームに従って番号付けされた重鎖アミノ酸２３４位及び２３５位のいずれか又は両方において変異を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分。
【請求項8】
２３４位及び２３５位のアミノ酸残基のいずれか又は両方が、ＬｅｕからＡｌａに変異している、請求項７に記載の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分。
【請求項9】
ａ）配列番号４３及び６１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）ならびに配列番号４４及び６２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）；ｂ）配列番号１３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｄ）配列番号２３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｅ）配列番号３３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号３４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；又は
ｆ）配列番号５３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号５４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ
を含む、抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分であって、前記抗体又はその抗原結合部分が、ａ）３×１０－８M以下のＫＤでヒトＡＸＬに結合する；
ｂ）８×１０－８M以下のＫＤでカニクイザルＡＸＬに結合する；
ｃ）マウスＡＸＬに結合しない；
ｄ）ヒトＡＸＬのＩｇ１又はＩｇ２ドメインに結合する；
ｅ）ヒトＡＸＬへのＧＡＳ６の結合を阻害する；
ｆ）Ｈ１２９９細胞の増殖をインビトロでＧＡＳ６の存在下において阻害する；
ｇ）ＧＡＳ６の非存在下においてアゴニスト活性を示さない；
ｈ）外因性ＡＸＬを安定的に発現するＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＡＸＬ細胞においてホスファチジルセリン含有リポソームのＧＡＳ６誘導性取り込みを阻害する；及び
ｉ）インビボでの腫瘍成長を阻害する
より選択される少なくとも１つの特性を有する、抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分。
【請求項11】
前記特性の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、又は全てを有する、請求項１０に記載の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分を含む、医薬組成物。
【請求項13】
免疫刺激剤、ワクチン、化学療法剤、抗悪性腫瘍剤、抗血管形成剤、又はチロシンキナーゼ阻害剤をさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
免疫刺激剤、ワクチン、化学療法剤、抗悪性腫瘍剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、又は放射線治療と組み合わせて使用するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項15】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗ＡＸＬ抗体の重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列と軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列とを含む、単離された核酸分子。
【請求項16】
配列番号４１、４２、１１、１２、１、２、２１、２２、３１、３２、５１、及び５２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の単離された核酸分子。
【請求項17】
請求項１５又は１６に記載の単離された核酸分子を含むベクターであって、ヌクレオチド配列に操作可能に連結された発現制御配列をさらに含む、ベクター。
【請求項18】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗ＡＸＬ抗体の重鎖又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチドと軽鎖又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチドとを含む、宿主細胞。
【請求項19】
抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分を産生するための方法であって、請求項１８に記載の宿主細胞を提供すること、前記抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分の発現のために適切な条件下で前記宿主細胞を培養すること、及び、得られた前記抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分を単離することを含む、方法。
【請求項20】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の１つ又は２つの別の抗ＡＸＬ抗体の抗原結合部分を含む、二重特異性結合分子。
【請求項21】
がんを処置するための医薬を製造するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗ＡＸＬ抗体もしくはその抗原結合部分又は請求項２０に記載の二重特異性結合分子の使用。
【請求項22】
がんが、皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頸部、肝臓、骨、膀胱、乳房、胃、子宮、子宮頸部、及び膵臓からなる群より選択される組織中にある、請求項２１に記載の使用。
【請求項23】
がんが、黒色腫、頭頸部がん、神経膠芽腫、甲状腺がん、非小細胞肺がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、卵管がん、原発性腹膜がん、子宮内膜がん、尿路上皮がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、直腸がん、前立腺がん、中皮腫、扁平上皮がん、肉腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、小リンパ球性白血病、骨髄異形成症候群、又はホジキンリンパ腫である、請求項２１に記載の使用。
【請求項24】
前記医薬が、免疫刺激剤、ワクチン、化学療法剤、抗悪性腫瘍剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、又は放射線治療と組み合わされるものである、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項25】
がんを処置するための、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項26】
がんが、皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頸部、肝臓、骨、膀胱、乳房、胃、子宮、子宮頸部、及び膵臓からなる群より選択される組織中にある、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項27】
がんが、黒色腫、頭頸部がん、神経膠芽腫、甲状腺がん、非小細胞肺がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、卵管がん、原発性腹膜がん、子宮内膜がん、尿路上皮がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、直腸がん、前立腺がん、中皮腫、扁平上皮がん、肉腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、小リンパ球性白血病、骨髄異形成症候群、又はホジキンリンパ腫である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０２０年２月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／９８２，８５２号からの優先権を主張する。その優先権出願の開示は、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
本願は、２０２０年２月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／９８２，８５２号からの優先権を主張する。その優先権出願の開示は、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
【0002】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて電子的に提出された配列表を含み、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。配列表の電子コピーは、２０２１年２月２６日に作成されており、０２２６７５＿ＷＯ０６２＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられており、サイズは４２，４９９バイトである。
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて電子的に提出された配列表を含み、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。配列表の電子コピーは、２０２１年２月２６日に作成されており、０２２６７５＿ＷＯ０６２＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられており、サイズは４２，４９９バイトである。
【0003】
発明の背景
ＡＸＬは、ＵＦＯ、ＪＴＫ１１、Ｔｙｒｏ７、又はＡＲＫとしても公知であり、マクロファージ及び樹状細胞を含む骨髄細胞のサブセットで発現され、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のＴＡＭ（Ｔｙｒｏ３－Ａｘｌ－Ｍｅｒ）ファミリーのメンバーである。ＴＡＭ ＲＴＫは、貪食細胞によるアポトーシス細胞の取り込みに関与するホスファチジルセリン感知受容体である。これらのキナーゼは、継続的な攻撃及び細胞ターンオーバーを受ける組織及び器官の恒常性を維持するために重要である。ＡＸＬについてのリガンドはＧｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ６（ＧＡＳ６）であり、それはアポトーシス細胞上のホスファチジルセリンとＡＸＬの間のリンカーとして機能し、エフェロサイトーシスとして公知である過程において細胞デブリの取り込みを促進する。
ＡＸＬは、ＵＦＯ、ＪＴＫ１１、Ｔｙｒｏ７、又はＡＲＫとしても公知であり、マクロファージ及び樹状細胞を含む骨髄細胞のサブセットで発現され、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のＴＡＭ（Ｔｙｒｏ３－Ａｘｌ－Ｍｅｒ）ファミリーのメンバーである。ＴＡＭ ＲＴＫは、貪食細胞によるアポトーシス細胞の取り込みに関与するホスファチジルセリン感知受容体である。これらのキナーゼは、継続的な攻撃及び細胞ターンオーバーを受ける組織及び器官の恒常性を維持するために重要である。ＡＸＬについてのリガンドはＧｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ６（ＧＡＳ６）であり、それはアポトーシス細胞上のホスファチジルセリンとＡＸＬの間のリンカーとして機能し、エフェロサイトーシスとして公知である過程において細胞デブリの取り込みを促進する。
【0004】
異常に上昇したＴＡＭ活性は、腫瘍進行、上皮から間葉への移行、転移、及び標的治療への耐性と強く関連付けられる。ＡＸＬ媒介性のエフェロサイトーシスによって、ＡＸＬ発現細胞が、抗原をＴ細胞に提示する能力及び炎症誘発性サイトカインを産生する能力の減少を伴い免疫抑制状態に入ることが示されている。ＧＡＳ６誘導性の活性化時に、ＡＸＬによって、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路を通じて腫瘍細胞に強い生存シグナルが提供される。ＧＡＳ６及びＡＸＬの発現の上昇は、がん患者における不良な予後と相関している。
【0005】
がん進行におけるＡＸＬの重大な役割の観点において、ＡＸＬを標的化する新たな改善された抗がん治療についての必要性がある。
【0006】
発明の概要
本発明は、ＡＸＬを標的化する新規組換え抗体、ならびにこれらの抗体の１つ以上を含む医薬的組成物、ならびにがんの処置のための抗体及び医薬的組成物の使用に関する。本明細書中に記載する抗体及び組成物は、患者においてがんを処置するための方法において使用されうる；患者においてがんを処置するための医薬品の製造のために使用されうる；又は患者においてがんを処置することにおいて使用されうる。抗体処置を含む、そのようながんのために現在利用可能な処置と比較し、本明細書中に記載する抗体及び組成物は、単独で、又は別のがん治療との組み合わせにおいて、優れた臨床応答を提供しうることが企図される。
本発明は、ＡＸＬを標的化する新規組換え抗体、ならびにこれらの抗体の１つ以上を含む医薬的組成物、ならびにがんの処置のための抗体及び医薬的組成物の使用に関する。本明細書中に記載する抗体及び組成物は、患者においてがんを処置するための方法において使用されうる；患者においてがんを処置するための医薬品の製造のために使用されうる；又は患者においてがんを処置することにおいて使用されうる。抗体処置を含む、そのようながんのために現在利用可能な処置と比較し、本明細書中に記載する抗体及び組成物は、単独で、又は別のがん治療との組み合わせにおいて、優れた臨床応答を提供しうることが企図される。
【0007】
一部の実施形態では、本開示は、抗体２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、２３２０３＿４、２２９９５、又は２２８８３と結合について競合する、又は交差競合する、あるいはそれら抗体と同じＡＸＬのエピトープに結合する抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分を提供する。特定の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、前記抗体の６つのＣＤＲ、重鎖及び軽鎖可変ドメイン、又は重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列により定義される。
【0008】
一部の実施形態では、本開示は、抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分を提供し、それにおいて
ａ）前記抗体の重鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号５～７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（Ｈ－ＣＤＲ）－１～３；
ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号３及び６１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）；ならびに
ｂ）前記抗体の軽鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号８～１０のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（Ｌ－ＣＤＲ）－１～３；
ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号４及び６２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）。
ａ）前記抗体の重鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号５～７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（Ｈ－ＣＤＲ）－１～３；
ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号３及び６１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）；ならびに
ｂ）前記抗体の軽鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号８～１０のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（Ｌ－ＣＤＲ）－１～３；
ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号４及び６２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）。
【0009】
一部の実施形態では、本開示は、抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分を提供し、それにおいて
ａ）前記抗体の重鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号１５～１７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＨ；
ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号１３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣ；ならびに
ｂ）前記抗体の軽鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号１８～２０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号１４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ。
ａ）前記抗体の重鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号１５～１７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＨ；
ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号１３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣ；ならびに
ｂ）前記抗体の軽鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号１８～２０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号１４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ。
【0010】
一部の実施形態では、本開示は、抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分を提供し、それにおいて
ａ）前記抗体の重鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号２５～２７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＨ；
ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号２３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣ；ならびに
ｂ）前記抗体の軽鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号２８～３０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号２４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ。
ａ）前記抗体の重鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号２５～２７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＨ；
ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号２３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣ；ならびに
ｂ）前記抗体の軽鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号２８～３０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号２４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ。
【0011】
一部の実施形態では、本開示は、抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分を提供し、それにおいて
ａ）前記抗体の重鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号３５～３７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＨ；
ｉｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号３３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣ；ならびに
ｂ）前記抗体の軽鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号３８～４０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｉｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号３４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ。
ａ）前記抗体の重鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号３５～３７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＨ；
ｉｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号３３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣ；ならびに
ｂ）前記抗体の軽鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号３８～４０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｉｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号３４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ。
【0012】
一部の実施形態では、本開示は、抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分を提供し、それにおいて
ａ）前記抗体の重鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号４５～４７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＨ；
ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号４３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣ；ならびに
ｂ）前記抗体の軽鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号４８～５０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｉｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号４４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ。
ａ）前記抗体の重鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号４５～４７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＨ；
ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号４３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣ；ならびに
ｂ）前記抗体の軽鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号４８～５０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｉｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号４４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ。
【0013】
一部の実施形態では、本開示は、抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分を提供し、それにおいて
ａ）前記抗体の重鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号５５～５７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＨ；
ｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号５３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣ；ならびに
ｂ）前記抗体の軽鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号５８～６０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｉｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号５４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ。
ａ）前記抗体の重鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号５５～５７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＨ；
ｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号５３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣ；ならびに
ｂ）前記抗体の軽鎖は以下を含む：
ｉ）それぞれ配列番号５８～６０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ－１～３；
ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｉｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号５４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ。
【0014】
本開示はまた、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分の重鎖又はその抗原結合部分、軽鎖又はその抗原結合部分、あるいはその両方をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子、ベクター、及び宿主細胞を提供する。さらに、本開示は、前記宿主細胞を培養することによる本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分を産生するための方法、ならびに本明細書中に記載する抗体又は抗原結合部分を混合することによる抗体組成物を産生するための方法を提供する。
【0015】
本発明の他の特色、目的、及び利点は、続く詳細な説明において明らかである。しかし、詳細な説明は、本発明の実施形態及び態様を示している一方で、限定ではなく例示としてだけ与えられていることを理解すべきである。本発明の範囲内での種々の変化及び改変が、詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1A】図１Ａ～１Ｃは、ＣＨＯ－Ｓ細胞上で一過性に発現されたヒト（図１Ａ）及びカニクイザル（図１Ｂ）ＡＸＬ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への、示した抗ヒトＡＸＬ抗体の結合プロファイルを示す一連のグラフである。モックトランスフェクトＣＨＯ－Ｓ細胞を陰性対照として使用した（図１Ｃ）。データを平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）として提示する。
【図1B】図１Ａ～１Ｃは、ＣＨＯ－Ｓ細胞上で一過性に発現されたヒト（図１Ａ）及びカニクイザル（図１Ｂ）ＡＸＬ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への、示した抗ヒトＡＸＬ抗体の結合プロファイルを示す一連のグラフである。モックトランスフェクトＣＨＯ－Ｓ細胞を陰性対照として使用した（図１Ｃ）。データを平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）として提示する。
【図1C】図１Ａ～１Ｃは、ＣＨＯ－Ｓ細胞上で一過性に発現されたヒト（図１Ａ）及びカニクイザル（図１Ｂ）ＡＸＬ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への、示した抗ヒトＡＸＬ抗体の結合プロファイルを示す一連のグラフである。モックトランスフェクトＣＨＯ－Ｓ細胞を陰性対照として使用した（図１Ｃ）。データを平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）として提示する。
【図2】図２は、抗ＡＸＬ抗体での処置後のＨ１２９９細胞の増殖を示すグラフである。四角で囲んだ抗体をさらなる特徴付けのために選択した。データは、未処理対照（ＧＡＳ６なし）に対して標準化され、Ｘ軸上のＧＡＳ６の存在における増殖応答及びＹ軸上のＧＡＳ６の非存在における増殖応答を伴う。点で描いた水平線及び垂直線は、ＧＡＳ６を伴わない対照と比較した、ＧＡＳ６添加時の増殖レベルを示し、各々の設定（＋又は－ＧＡＳ６）について別々に標準化されている。各々のデータポイントは、各々の軸についての３つの技術的反復の平均値を表す。
【図3】図３は、リガンドＧＡＳ６の存在（上パネル）又は非存在（下パネル）における、示した抗体で処理されたＨ１２９９細胞の増殖を示す一対のグラフである。データを未処理対照に対して標準化し、曲線上の各々のデータポイントは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。
【図4】図４は、示した抗体で処理されたＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＡＸＬ細胞によるリポソームのＧＡＳ６誘導性取込みを示すグラフである。データをＧＡＳ６処理対照（点線）に対して標準化し、平均値±ＳＥＭとして提示する。各々のデータポイントは、３つの技術的反復の平均値を表す。
【図5A】図５Ａ及び５Ｂは、ヒト乳がんＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を移植したＮＯＤ．Ｓｃｉｄマウスにおける腫瘍成長に対する２つのＡＸＬ抗体（２２９９５及び２３２０３＿２）又はビヒクル処置の効果を示す一対のグラフである。灰色領域が処置期間である。データを平均値±ＳＥＭとして提示する。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図5B】図５Ａ及び５Ｂは、ヒト乳がんＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を移植したＮＯＤ．Ｓｃｉｄマウスにおける腫瘍成長に対する２つのＡＸＬ抗体（２２９９５及び２３２０３＿２）又はビヒクル処置の効果を示す一対のグラフである。灰色領域が処置期間である。データを平均値±ＳＥＭとして提示する。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【0017】
発明の詳細な説明
本開示は、患者、例えばがん患者などにおいてＡＸＬ活性を阻害するために使用することができる新たな抗ヒトＡＸＬ抗体を提供する。他に記載しない限り、本明細書中で使用するように、「ＡＸＬ」はヒトＡＸＬを指す。ヒトＡＸＬポリペプチド配列は、下に示すように、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３０５３０（ＵＦＯ＿ＨＵＭＡＮ）（配列番号６３）の下で入手可能である：
本開示は、患者、例えばがん患者などにおいてＡＸＬ活性を阻害するために使用することができる新たな抗ヒトＡＸＬ抗体を提供する。他に記載しない限り、本明細書中で使用するように、「ＡＸＬ」はヒトＡＸＬを指す。ヒトＡＸＬポリペプチド配列は、下に示すように、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３０５３０（ＵＦＯ＿ＨＵＭＡＮ）（配列番号６３）の下で入手可能である：
【表1】
【0018】
用語「抗体」（Ａｂ）又は「イムノグロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書中で使用するように、ジスルフィド結合により相互接続されている２つの重（Ｈ）鎖（約５０～７０kDa）及び２つの軽（Ｌ）鎖（約２５kDa）を含む四量体を指す。各々の重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。各々の軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に散在する、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変の領域にさらに細分化することができる。各々のＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ（本明細書中のＨ－ＣＤＲは重鎖からのＣＤＲを命名する；及び本明細書中のＬ－ＣＤＲは軽鎖からのＣＤＲを命名する）及び４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシル末端まで以下の順序において配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖又は軽鎖におけるアミノ酸番号の、ならびにＦＲ領域及びＣＤＲ領域の割り当ては、IMGT（登録商標）定義（Ｅｕナンバリング；Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27(1):55-77 (2003 )）；又はＫａｂａｔの定義、Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health、メリーランド州ベセスダ（１９８７及び１９９１））；Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)；Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)；MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)；又はHonegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-70 (2001)に従いうる。
【0019】
用語「組換え抗体」は、抗体をコードするヌクレオチド配列を含む細胞又は細胞株から発現される抗体を指し、それにおいて、前記ヌクレオチド配列は細胞と天然には関連付けられない。
【0020】
用語「単離されたタンパク質」、「単離されたポリペプチド」、又は「単離された抗体」は、その起源又は派生源の理由で、（１）その天然状態においてそれに付随する、天然に関連付けられる成分と関連付けられない、（２）同種からの他のタンパク質を含まない、（３）異なる種からの細胞により発現される、及び／又は（４）天然では生じないタンパク質、ポリペプチド、又は抗体を指す。このように、化学的に合成される、又はそれが天然に由来する細胞とは異なる細胞系において合成されるポリペプチドは、その天然に関連付けられる成分から「単離」される。タンパク質はまた、当技術分野において周知のタンパク質精製技術を使用し、単離により、天然に関連付けられる成分を実質的に含まないようにしてもよい。
【0021】
用語「親和性」は、抗原と抗体の間での引力の尺度を指す。抗原についての抗体の固有の引力は、典型的には、特定の抗体－抗原相互作用の結合親和性平衡定数（ＫＤ）として表現される。抗体は、ＫＤが≦１mM、例えば、≦１μM、≦１００nM、又は≦１０nMである場合、抗原に特異的に結合すると言われる。ＫＤ結合親和性定数は、例えば、IBIS TechnologiesからのIBIS MX96SPRシステム又はCarterra LSA SPRプラットフォームを使用した表面プラズモン共鳴（例、BIAcore（商標））により、又は例えばForteBioからのOctet（商標）システムを使用した、バイオレイヤー干渉法により測定することができる。
【0022】
本明細書中で使用する用語「エピトープ」は、抗体又は関連分子、例えば二重特異性結合分子などに特異的に結合する抗原の部分（決定基）を指す。エピトープ決定基は、一般的に、分子の化学的に活性な表面グルーピング、例えばアミノ酸又は糖質又は糖側鎖などからなり、一般的に、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する。エピトープは「線状」又は「立体構造的」でありうる。線状エピトープにおいては、タンパク質（例、抗原）と相互作用分子（例えば抗体など）の間での相互作用点の全てが、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に生じる。立体構造的エピトープにおいては、相互作用点が、一次アミノ酸配列中で互いに分離されている、タンパク質上のアミノ酸残基にわたり生じる。一度、抗原上の所望のエピトープが決定されると、当技術分野において周知の技術を使用し、そのエピトープに対する抗体を生成することが可能である。例えば、線状エピトープに対する抗体は、例えば、線状エピトープのアミノ酸残基を有するペプチドで動物を免疫化することにより生成されうる。立体構造的エピトープに対する抗体は、例えば、立体構造的エピトープの関連アミノ酸残基を含むミニドメインで動物を免疫化することにより生成されうる。特定のエピトープに対する抗体はまた、例えば、目的の標的分子（例、ＡＸＬ）又はその関連部分で動物を免疫化し、次にエピトープへの結合についてスクリーニングすることにより生成することができる。
【0023】
抗体が、当技術分野において公知の方法（限定しないが、競合アッセイ、エピトープビニング、及びアラニンスキャニングを含む）を使用することにより、本開示の抗ＡＸＬ抗体と同じエピトープに結合する、又はそれとの結合について競合するか否かを決定することができる。一部の実施形態では、本開示の抗ＡＸＬ抗体を飽和条件下でＡＸＬに結合させ、次にＡＸＬに結合するテスト抗体の能力を測定することを可能にする。テスト抗体が参照抗ＡＸＬ抗体と同時にＡＸＬに結合できる場合、テスト抗体は、参照抗ＡＸＬ抗体とは異なるエピトープに結合する。しかし、テスト抗体がＡＸＬに同時に結合できない場合、テスト抗体は、同じエピトープ、重複するエピトープ、又は本開示の抗ＡＸＬ抗体により結合されるエピトープに近接しているエピトープに結合する。この実験は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、BIACORE（商標）、ＳＰＲ、バイオレイヤー干渉法、又はフローサイトメトリーを使用して実施することができる。抗ＡＸＬ抗体が別の抗ＡＸＬ抗体と交差競合するか否かをテストするために、上に記載する競合方法を２方向において使用してもよく、即ち、公知の抗体がテスト抗体をブロックするか否か、及びその逆を決定してもよい。そのような交差競合実験は、例えば、IBIS MX96又はCarterra LSA SPR機器又はOctet（商標）システムを使用して実施してもよい。
【0024】
用語「ヒト抗体」は、可変ドメイン配列及び定常領域配列がヒト配列から由来する抗体を指す。この用語は、ヒト遺伝子から由来するが、しかし、例えば、免疫原性を減少させ、親和性を増加させ、及び／又は安定性を増加させるように改変された配列を伴う抗体を包含する。さらに、この用語は、非ヒト細胞中で組換え的に産生された抗体を包含し、それによって、ヒト細胞に典型的ではないグリコシル化が付与されうる。この用語はまた、ヒト抗体遺伝子を伴うトランスジェニック非ヒト生物（例、OmniRat（登録商標）ラット）において産生された抗体を包含する。
【0025】
用語 抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）は、本明細書中で使用するように、抗原（例、ヒトＡＸＬ、又はその一部）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の部分又はフラグメントを指す。全長抗体の特定のフラグメントによって、抗体の抗原結合機能を実施することができることが示されている。用語「抗原結合部分」内に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント：ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント：ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；及び（ｖｉ）抗原に特異的に結合することが可能な単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされているが、それらは、組換え方法を使用し、ＶＬドメイン及びＶＨドメインが対合して一価分子（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である）を形成する、単一のタンパク質鎖としてそれらを作成することを可能にする合成リンカーにより結合することができる。また、本開示内には、ＶＨ及び／又はＶＬを含む抗原結合分子がある。ＶＨの場合において、分子はまた、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、又はＣＨ３領域の１つ以上を含みうる。そのような単一鎖抗体がまた、用語 抗体の「抗原結合部分」内に包含されることが意図される。単一鎖抗体の他の形態、例えばダイアボディなども包含される。ダイアボディは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現される二価の、二重特異性抗体であるが、しかし、同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用しており、それにより、それらのドメインを別の鎖の相補的なドメインと対合することを強制し、２つの抗原結合部位を作る。
【0026】
抗体部分、例えばＦａｂフラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントなどは、従来の技術、例えば全抗体のパパイン消化又はペプシン消化などを使用し、全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分、及びイムノアドヘシン分子は、例えば、本明細書中に記載するように、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる。
【0027】
抗ＡＸＬ抗体のクラス（アイソタイプ）及びサブクラスは、当技術分野において公知の任意の方法により決定されうる。一般的に、抗体のクラス及びサブクラスは、抗体の特定のクラス及びサブクラスについて特異的である抗体を使用して決定されうる。そのような抗体は商業的に入手可能である。それらのクラス及びサブクラスは、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットならびに他の技術により決定されうる。あるいは、それらのクラス及びサブクラスは、抗体の重鎖及び／又は軽鎖の定常領域の全部又は一部を配列決定し、それらのアミノ酸配列を、イムノグロブリンの種々のクラス及びサブクラスの公知のアミノ酸配列と比較し、ならびに抗体のクラス及びサブクラスを決定することにより決定されうる。
【0028】
他に示さない限り、本開示において言及する全ての抗体アミノ酸残基番号は、IMGT（登録商標）ナンバリングスキーム（ＥＵナンバリング）に基づくものである。
【0029】
抗ＡＸＬ抗体
本開示は、ＡＸＬに対して向けられた抗体、及びその抗原結合部分を提供する。特定の態様において、本明細書中に開示する抗体は、再編成されたヒト抗体遺伝子によりコードされる抗体を産生することができるトランスジェニック動物（例、ラット）から生成されたヒト抗体である。特定の実施形態では、ヒト抗体は、例えば、プライマー由来の変異を生殖系列配列に戻すように変化させるために、特定の変異を含みうる（例、表１中の「シンプレックス修正」バリアント配列を参照のこと）。
本開示は、ＡＸＬに対して向けられた抗体、及びその抗原結合部分を提供する。特定の態様において、本明細書中に開示する抗体は、再編成されたヒト抗体遺伝子によりコードされる抗体を産生することができるトランスジェニック動物（例、ラット）から生成されたヒト抗体である。特定の実施形態では、ヒト抗体は、例えば、プライマー由来の変異を生殖系列配列に戻すように変化させるために、特定の変異を含みうる（例、表１中の「シンプレックス修正」バリアント配列を参照のこと）。
【0030】
一部の実施形態では、本開示の抗ＡＸＬ抗体は、Ｆｃ領域中に「ＬＡＬＡ」変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）を有する。これらの変異は、ヒトＦｃγＲ（Ｆｃガンマ受容体）への抗体の結合を妨げる。そのような抗体は有利である。なぜなら、それらが、低いレベルの二次エフェクター機能を有し、故に、エフェクターＴ細胞を枯渇させない、又は他の非悪性細胞を標的化しないためである。
【0031】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、以下を含む抗体と、ヒトＡＸＬへの結合について競合する、又は交差競合する、あるいはその抗体と同じヒトＡＸＬのエピトープに結合する：
ａ）配列番号３及び６１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）ならびに配列番号４及び６２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）；
ｂ）配列番号１３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号２３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｄ）配列番号３３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号３４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｅ）配列番号４３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号４４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；又は
ｆ）配列番号５３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号５４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ。
ａ）配列番号３及び６１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）ならびに配列番号４及び６２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）；
ｂ）配列番号１３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号２３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｄ）配列番号３３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号３４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｅ）配列番号４３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号４４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；又は
ｆ）配列番号５３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号５４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ。
【0032】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、配列番号７、１７、２７、３７、４７、又は５７の重鎖ＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ３）アミノ酸配列を有する。
【0033】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、それぞれ配列番号５～７、１５～１７、２５～２７、３５～３７、４５～４７、又は５５～５７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３（Ｈ－ＣＤＲ１～３）を有する。
【0034】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、配列番号３、１３、２３、３３、４３、又は５３のアミノ酸配列と少なくとも８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を有する。
【0035】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、配列番号３、１３、２３、３３、４３、又は５３のアミノ酸配列を含むＶＨを有する。
【0036】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体は、配列番号３、１３、２３、３３、４３、又は５３のアミノ酸配列と少なくとも８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一であるＶＨアミノ酸配列；及び配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一である重鎖定常領域アミノ酸配列を有する。
【0037】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体は、配列番号３、１３、２３、３３、４３、又は５３のＶＨアミノ酸配列及び配列番号６１の重鎖定常領域アミノ酸配列を含む。
【0038】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、配列番号１０、２０、３０、４０、５０、又は６０の軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ－ＣＤＲ３）アミノ酸配列を有する。
【0039】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、それぞれ配列番号８～１０、１８～２０、２８～３０、３８～４０、４８～５０、又は５８～６０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３（Ｌ－ＣＤＲ１～３）を有する。
【0040】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、配列番号４、１４、２４、３４、４４、又は５４のアミノ酸配列と少なくとも８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列を有する。
【0041】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、配列番号４、１４、２４、３４、４４、又は５４のアミノ酸配列を含むＶＬを有する。
【0042】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体は、配列番号４、１４、２４、３４、４４、又は５４のアミノ酸配列と少なくとも８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一であるＶＬアミノ酸配列；及び配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一である軽鎖定常領域アミノ酸配列を有する。
【0043】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体は、配列番号４、１４、２４、３４、４４、又は５４のＶＬアミノ酸配列及び配列番号６２の軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む。
【0044】
特定の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体は、上に記載する重鎖の任意の１つ及び上に記載する軽鎖の任意の１つを含む。
【0045】
一部の実施形態では、本開示の抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、以下のＨ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列及びＬ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列を含む：
ａ）それぞれ配列番号５～１０；
ｂ）それぞれ配列番号１５～２０；
ｃ）それぞれ配列番号２５～３０；
ｄ）それぞれ配列番号３５～４０；
ｅ）それぞれ配列番号４５～５０；又は
ｆ）それぞれ配列番号５５～６０。
ａ）それぞれ配列番号５～１０；
ｂ）それぞれ配列番号１５～２０；
ｃ）それぞれ配列番号２５～３０；
ｄ）それぞれ配列番号３５～４０；
ｅ）それぞれ配列番号４５～５０；又は
ｆ）それぞれ配列番号５５～６０。
【0046】
一部の実施形態では、本開示の抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、以下のアミノ酸配列と８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一である（例、９０%同一である）ＶＨ及びＶＬを含む：
ａ）それぞれ配列番号３及び４；
ｂ）それぞれ配列番号１３及び１４；
ｃ）それぞれ配列番号２３及び２４；
ｄ）それぞれ配列番号３３及び３４；
ｅ）それぞれ配列番号４３及び４４；又は
ｆ）それぞれ配列番号５３及び５４。
ａ）それぞれ配列番号３及び４；
ｂ）それぞれ配列番号１３及び１４；
ｃ）それぞれ配列番号２３及び２４；
ｄ）それぞれ配列番号３３及び３４；
ｅ）それぞれ配列番号４３及び４４；又は
ｆ）それぞれ配列番号５３及び５４。
【0047】
一部の実施形態では、本開示の抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、以下のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む：
ａ）それぞれ配列番号３及び４；
ｂ）それぞれ配列番号１３及び１４；
ｃ）それぞれ配列番号２３及び２４；
ｄ）それぞれ配列番号３３及び３４；
ｅ）それぞれ配列番号４３及び４４；又は
ｆ）それぞれ配列番号５３及び５４。
ａ）それぞれ配列番号３及び４；
ｂ）それぞれ配列番号１３及び１４；
ｃ）それぞれ配列番号２３及び２４；
ｄ）それぞれ配列番号３３及び３４；
ｅ）それぞれ配列番号４３及び４４；又は
ｆ）それぞれ配列番号５３及び５４。
【0048】
一部の実施形態では、本開示の抗ＡＸＬ抗体は以下を含む：
ａ）配列番号３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｂ）配列番号１３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号２３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｄ）配列番号３３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号３４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｅ）配列番号４３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号４４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；又は
ｆ）配列番号５３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号５４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ。
ａ）配列番号３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｂ）配列番号１３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号２３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｄ）配列番号３３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号３４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｅ）配列番号４３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号４４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ；又は
ｆ）配列番号５３及び６１のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号５４及び６２のアミノ酸配列を含むＬＣ。
【0049】
本開示はまた、抗体２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、２３２０３＿４、２２９９５、又は２２８８３と結合について競合する、又は交差競合する、あるいはそれら抗体と同じエピトープに結合する、抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【0050】
一部の実施形態では、本開示の抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、抗体２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、２３２０３＿４、２２９９５、又は２２８８３のＨ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列及びＬ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列を含む。
【0051】
一部の実施形態では、本開示の抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、抗体２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、２３２０３＿４、２２９９５、又は２２８８３のそれぞれのＶＨ及びＶＬと、アミノ酸配列において少なくとも８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一であるＶＨ及びＶＬを含む。
【0052】
一部の実施形態では、本開示の抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、抗体２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、２３２０３＿４、２２９９５、又は２２８８３のそれぞれのＶＨ及びＶＬであるＶＨ及びＶＬを含む。
【0053】
一部の実施形態では、本開示の抗ＡＸＬ抗体は、抗体２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、２３２０３＿４、２２９９５、又は２２８８３、あるいは前記抗体と同じアミノ酸配列を伴う抗体である。
【0054】
抗体２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、又は２３２０３＿４のＨ－ＣＤＲ３を含む配列に言及する本明細書中に記載する実施形態のいずれかにおいて、前記Ｈ－ＣＤＲ３が、バリアントＨ－ＣＤＲ３により置換されてもよく、そこでは、配列ＣＳＳＲＥＹＳＳＲＷＨＦＤＹＷ（配列番号７）における２位のセリン（Ｓ）残基が、Ｈ－ＣＤＲ３配列がＣＡＳＲＥＹＳＳＲＷＨＦＤＹＷ（配列番号６５）であるように、アラニン（Ａ）により置換されている。バリアント残基を太字／下線で示す。
【0055】
抗体２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、又は２３２０３＿４のＨ－ＦＲ３を含む配列に言及する本明細書中に記載する実施形態のいずれかにおいて、前記Ｈ－ＦＲ３が、バリアントＨ－ＦＲ３により置換されてもよく、そこでは、配列ＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹ（配列番号６６）における３２位のアスパラギン酸（Ｄ）残基が、Ｈ－ＦＲ３配列がＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＧＴＡＶＹＹ（配列番号６７）であるように、グリシン（Ｇ）残基により置換される。バリアント残基を太字／下線で示す。
【0056】
２２９９５のＶＬ（配列番号４４）に言及する本明細書中に記載する実施形態のいずれかにおいて、前記配列は、任意のヒトＩＧＫＶ／ＩＧＫＪ生殖系列配列により置換されてもよい。特定の実施形態では、置換配列は、それぞれ配列番号４８、４９、及び５０のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、及びＬ－ＣＤＲ３を有してもよく、それらは任意のヒトＩＧＫＶ／ＩＧＫＪ配列中に移植され、それにより、元の生殖系列配列を置換する。
【0057】
本明細書中に記載する方法により得られる抗ＡＸＬ抗体のクラスは、別のクラス又はサブクラスに変化又は交換されてもよい。本開示の一部の実施形態では、ＶＬ又はＶＨをコードする核酸分子は、それがＣＬ又はＣＨをそれぞれコードする核酸配列を含まないように、当技術分野において周知の方法を使用して単離される。ＶＬ又はＶＨをコードする核酸分子は、次に、異なるクラスのイムノグロブリン分子からのＣＬ又はＣＨをそれぞれコードする核酸配列に操作可能に連結される。これは、上に記載するように、ＣＬ配列又はＣＨ配列を含むベクター又は核酸分子を使用して達成されうる。例えば、元はＩｇＭであった抗ＡＸＬ抗体がＩｇＧにクラススイッチされうる。さらに、クラススイッチングを使用し、１つのＩｇＧサブクラスを別のものに、例えばＩｇＧ１からＩｇＧ２に変換してもよい。κ軽鎖定常領域は、例えば、λ軽鎖定常領域に、又はその逆に変化させることができる。所望のＩｇアイソタイプを伴う、本開示の抗体を産生するための例示的な方法は、抗ＡＸＬ抗体の重鎖をコードする核酸分子及び抗ＡＸＬ抗体の軽鎖をコードする核酸分子を単離する工程、重鎖の可変ドメインを得る工程、重鎖の可変ドメインについてのコード配列を、所望のアイソタイプの重鎖の定常領域についてのコード配列と連結する工程、連結された配列によりコードされる軽鎖及び重鎖を細胞において発現させる工程、ならびに所望のアイソタイプを伴う抗ＡＸＬ抗体を収集する工程を含む。
【0058】
本開示の抗ＡＸＬ抗体は、ＩｇＧ分子、ＩｇＭ分子、ＩｇＥ分子、ＩｇＡ分子、又はＩｇＤ分子でありうるが、典型的には、例えば、ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＩｇＧアイソタイプである。一部の実施形態では、抗体はアイソタイプサブクラスＩｇＧ１のものである。
【0059】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体は、Ｆｃ領域中に少なくとも１つの変異を含みうる。多数の異なるＦｃ変異が公知であり、そこで、これらの変異は抗体のエフェクター機能を変化させる。例えば、一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体は、エフェクター機能を低下させるＦｃ領域中の少なくとも１つの変異、例えば、２２８位、２３３位、２３４位、及び２３５位の１つ以上での変異を含み、そこで、アミノ酸位置は、IMGT（登録商標）ナンバリングスキームに従って番号付けられる。
【0060】
一部の実施形態では、例えば、抗体がＩｇＧ１サブクラスのものである場合、２３４位及び２３５位でのアミノ酸残基の１つ又は両方が、例えば、ＬｅｕからＡｌａ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）に変異されうる。これらの変異は、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のエフェクター機能を低下させる。アミノ酸位置は、IMGT（登録商標）ナンバリングスキームに従って番号付けられる。
【0061】
一部の実施形態では、例えば、抗体がＩｇＧ４サブクラスのものである場合、それは変異Ｓ２２８Ｐを含んでもよく、そこで、アミノ酸位置はIMGT（登録商標）ナンバリングスキームに従って番号付けられる。この変異は、望ましくないＦａｂアーム交換を低下させることが公知である。
【0062】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、約５×１０－８、４×１０－８、３×１０－８、２×１０－８、１×１０－８、９×１０－９、８×１０－９、７×１０－９、６×１０－９、５×１０－９、４×１０－９、３×１０－９、２×１０－９、１×１０－９、９×１０－１０、８×１０－１０、７×１０－１０、６×１０－１０、あるいは５×１０－１０Ｍ又はそれ以下のＫＤでヒトＡＸＬに結合する。
【0063】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、カニクイザルＡＸＬに、約９×１０－８、８×１０－８、７×１０－８、６×１０－８、５×１０－８、４×１０－８、３×１０－８、２×１０－８、１×１０－８、９×１０－９、８×１０－９、７×１０－９、６×１０－９、あるいは５×１０－９又はそれ以下のＫＤで結合する。
【0064】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、ＧＡＳ６（例、ＧＡＳ６は約１μg/mLの濃度である）の存在において、Ｈ１２９９細胞の増殖をインビトロで、約１、５、１０、１５、２０、あるいは２５μg/mL又はそれ以下の濃度で阻害する。
【0065】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、ＧＡＳ６の非存在において、例えば、約１、５、１０、１５、２０、又は２５μg/mLまでの濃度で、アゴニスト活性を示さない。
【0066】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、外因性ＡＸＬを安定的に発現するＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＡＸＬ細胞において、例えば、約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、４、あるいは６μg/mL又はそれ以下の濃度で、ホスファチジルセリン含有リポソームのＧＡＳ６誘導性取り込みを阻害する。
【0067】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、例えば、約１０mg/kg又は５０mg/kgの濃度で、インビボで腫瘍成長を阻害する。
【0068】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、ヒトＡＸＬへのＧＡＳ６の結合を阻害する。
【0069】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、１０Ｇ５及び／又はＹＷ３２７．６Ｓ２とは異なるヒトＡＸＬのエピトープを認識する。
【0070】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、マウスＡＸＬに結合しない。
【0071】
一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、ヒトＡＸＬのＩｇ１ドメインに結合する。一部の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、ヒトＡＸＬのＩｇ２ドメインに結合する。
【0072】
本開示はまた、上の特性の任意の組み合わせを伴う、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分を企図する。
【0073】
一部の実施形態では、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、以下の特性の少なくとも１つ（例、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９つ全て）を有する：
ａ）３×１０－８M以下のＫＤでヒトＡＸＬに結合する；
ｂ）８×１０－８M以下のＫＤでカニクイザルＡＸＬに結合する；
ｃ）マウスＡＸＬに結合しない；
ｄ）ヒトＡＸＬのＩｇ１又はＩｇ２ドメインに結合する；
ｅ）ヒトＡＸＬへのＧＡＳ６の結合を阻害する；
ｆ）ＧＡＳ６の存在においてインビトロでＨ１２９９細胞の増殖を阻害する（例、それにおいて、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分が２５μg/mL以下の濃度であり、ＧＡＳ６が１μg/mLの濃度である）；
ｇ）ＧＡＳ６の非存在において（例、２５μg/mLまでの濃度で）アゴニスト活性を示さない；
ｈ）外因性ＡＸＬを安定的に発現するＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＡＸＬ細胞において、（例、６μg/mL以下の濃度で）ホスファチジルセリン含有リポソームのＧＡＳ６誘導性取り込みを阻害する；及び
ｉ）インビボで（例、１０mg/kg又は５０mg/kgの濃度で）腫瘍成長を阻害する。
特定の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、少なくとも特性ａ）～ｉ）を有する。特定の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、少なくとも特性ａ）～ｅ）及びｇ）～ｉ）を有する。特定の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、少なくとも特性ａ）、ｂ）、ｅ）、ｇ）、及びｈ）を有する。特定の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、少なくとも特性ａ）～ｅ）、ｇ）、及びｈ）を有する。特定の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、少なくとも特性ａ）～ｅ）、ｇ）、及びｉ）を有する。
ａ）３×１０－８M以下のＫＤでヒトＡＸＬに結合する；
ｂ）８×１０－８M以下のＫＤでカニクイザルＡＸＬに結合する；
ｃ）マウスＡＸＬに結合しない；
ｄ）ヒトＡＸＬのＩｇ１又はＩｇ２ドメインに結合する；
ｅ）ヒトＡＸＬへのＧＡＳ６の結合を阻害する；
ｆ）ＧＡＳ６の存在においてインビトロでＨ１２９９細胞の増殖を阻害する（例、それにおいて、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分が２５μg/mL以下の濃度であり、ＧＡＳ６が１μg/mLの濃度である）；
ｇ）ＧＡＳ６の非存在において（例、２５μg/mLまでの濃度で）アゴニスト活性を示さない；
ｈ）外因性ＡＸＬを安定的に発現するＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＡＸＬ細胞において、（例、６μg/mL以下の濃度で）ホスファチジルセリン含有リポソームのＧＡＳ６誘導性取り込みを阻害する；及び
ｉ）インビボで（例、１０mg/kg又は５０mg/kgの濃度で）腫瘍成長を阻害する。
特定の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、少なくとも特性ａ）～ｉ）を有する。特定の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、少なくとも特性ａ）～ｅ）及びｇ）～ｉ）を有する。特定の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、少なくとも特性ａ）、ｂ）、ｅ）、ｇ）、及びｈ）を有する。特定の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、少なくとも特性ａ）～ｅ）、ｇ）、及びｈ）を有する。特定の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、少なくとも特性ａ）～ｅ）、ｇ）、及びｉ）を有する。
【0074】
一部の実施形態では、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、インビボで腫瘍成長を阻害しうる、及び／又は腫瘍成長退行を誘導しうる。一部の実施形態では、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、がん患者における転移を遅らせる又は逆転させうる。一部の実施形態では、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、がん患者の生存を延長しうる。上の特性の任意の組み合わせも企図する。
【0075】
特定の実施形態では、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、抗体又は抗体部分と１つ以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合又は非共有結合により形成される、より大きなイムノアドヘシン分子の一部でありうる。そのようなイムノアドヘシン分子の例は、四量体ｓｃＦｖ分子を作成するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Kipriyanov et al., Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 (1995)）及び二価のビオチン化ｓｃＦｖ分子を作成するためのシステイン残基、マーカーペプチド、及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Kipriyanov et al., Mol. Immunol. 31:1047-1058 (1994)）を含む。他の例は、抗体からの１つ以上のＣＤＲが、共有結合又は非共有結合のいずれかで分子中に組み込まれて、目的の抗原に特異的に結合するイムノアドヘシンを作成する場合が含まれる。そのような実施形態では、ＣＤＲは、より大きなポリペプチド鎖の一部として組み込まれうる、別のポリペプチド鎖に共有結合的に連結されうる、又は非共有結合的に組み込まれうる。
【0076】
別の態様では、融合抗体又はイムノアドヘシンを作成してもよく、それらは、別のポリペプチドに連結された本開示の抗ＡＸＬ抗体の全部又は一部を含む。特定の実施形態では、抗ＡＸＬ抗体の可変ドメインだけがポリペプチドに連結される。特定の実施形態では、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが互いに相互作用し、抗原結合部位を形成することができるような様式において、抗ＡＸＬ抗体のＶＨドメインが、第１のポリペプチドに連結される一方で、抗ＡＸＬ抗体のＶＬドメインが、第１のポリペプチドと会合する第２のポリペプチドに連結される。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが互いに相互作用できるように、リンカーによりＶＬドメインから分離される（例、単鎖抗体）。ＶＨ－リンカー－ＶＬ抗体を次に、目的のポリペプチドに連結する。また、融合抗体を作ることができ、それにおいて、２つ（又はそれ以上）の単鎖抗体が互いに連結される。これは、単一のポリペプチド鎖上で二価又は多価抗体を作りたい場合、又は二重特異性抗体を作りたい場合に有用である。
【0077】
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を作るために、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡフラグメントを、柔軟なリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３（配列番号６４）をコードする別のフラグメントに操作可能に連結し、ＶＨ配列及びＶＬ配列を、柔軟なリンカーにより結合されたＶＬドメイン及びＶＨドメインを用いて、連続的な単鎖タンパク質として発現することができるようにする。例えば、Bird et al., Science 242:423-426(1988)；Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)；及びMcCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)を参照のこと。単鎖抗体は、単一のＶＨ及びＶＬだけが使用される場合は一価でありうる；２つのＶＨ及びＶＬが使用される場合は二価でありうる；又は、２を上回るＶＨ及びＶＬが使用される場合は多価でありうる。二重特異性抗体又は多価抗体を生成しうるが、それは、例えば、ヒトＡＸＬ及び別の分子に特異的に結合する。
【0078】
他の実施形態では、他の改変抗体を、抗ＡＸＬ抗体をコードする核酸分子を使用して調製してもよい。例えば、「カッパボディ」（Ill et al., Protein Eng. 10:949-57 (1997)）、「ミニボディ」（Martin et al., EMBO J. 13:5303-9 (1994)）、「ダイアボディ」」（Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)）、又は「ヤヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎｓ）」（Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991)及びTraunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)）を、本明細書の教示に従って標準的な分子生物学的技術を使用して調製してもよい。
【0079】
本開示の抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分は、誘導体化する、又は別の分子（例、別のペプチド又はタンパク質）に連結することができる。一般的に、抗体又はその一部は、ＡＸＬ結合が誘導体化又は標識化により悪影響を受けないように誘導体化される。したがって、本開示の抗体及び抗体部分は、本明細書中に記載するヒト抗ＡＸＬ抗体のインタクトな形態及び改変された形態の両方を含むことが意図される。例えば、本開示の抗体又は抗体部分は、１つ以上の他の分子実体、例えば別の抗体（例、二重特異性抗体又はダイアボディ）、検出薬剤、医薬的薬剤、及び／又は抗体もしくは抗体部分と別の分子（例えばストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグなど）との会合を媒介することができるタンパク質又はペプチドなどに（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合又はその他により）機能的に連結することができる。
【0080】
誘導体化抗体の１つの型は、（例えば、二重特異性抗体を作るために、同じ型又は異なる型の）２つ又はそれ以上の抗体を架橋することにより産生される。適切な架橋剤は、ヘテロ二官能性（適当なスペーサーにより分離された２つの明確な反応性の基を有する）（例、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）又はホモ二官能性（例、スベリン酸ジスクシンイミジル）であるものを含む。そのようなリンカーは、例えば、Pierce Chemical Company（イリノイ州ロックフォード）から入手可能である。
【0081】
抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分はまた、化学基、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基又はエチル基、又は糖質基などで誘導体化することができる。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善するために、例えば、血清半減期を増加させるために有用でありうる。
【0082】
本開示による抗体又は抗原結合部分も標識してもよい。本明細書中で使用するように、用語「標識」又は「標識された」は、抗体中での別の分子の組み込みを指す。一部の実施形態では、標識は、検出可能なマーカー、例えば、放射性標識アミノ酸の組み込み、又は標識されたアビジン（例、蛍光マーカー又は光学的方法もしくは比色方法により検出することができる酵素活性を含むストレプトアビジン）により検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの付加である。一部の実施形態では、標識又はマーカーは、治療用、例えば、薬物コンジュゲート又は毒素であることができる。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する種々の方法が当技術分野において公知であり、使用してもよい。ポリペプチドのための標識の例は、以下を含むが、それらに限定されない：放射性同位体又は放射性核種（例、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例、ロイシンジッパー対合配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、磁性薬剤（例えばガドリニウムキレートなど）、毒素（例えば百日咳毒素など）、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、ならびにそれらの類似体又はホモログ。一部の実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を低下させるために、種々の長さのスペーサーアームにより付加される。
【0083】
特定の実施形態では、本開示の抗体は、中性形態（両性イオン形態を含む）で、又は正もしくは負に荷電した種として存在しうる。一部の実施形態では、抗体は、対イオンと複合体化し、医薬的に許容可能な塩を形成しうる。
【0084】
抗ＡＸＬ抗体組成物
本開示はまた、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分の１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を含む併用治療（例、組成物）を提供する。特定の実施形態では、併用治療（例、組成物）は、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分の２つを含む。併用治療は、例えば、前記抗体又は抗原結合部分を使用する処置の方法、あるいは前記抗体又は抗原結合部分を含む医薬的組成物の形態を取りうる。
本開示はまた、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分の１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を含む併用治療（例、組成物）を提供する。特定の実施形態では、併用治療（例、組成物）は、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分の２つを含む。併用治療は、例えば、前記抗体又は抗原結合部分を使用する処置の方法、あるいは前記抗体又は抗原結合部分を含む医薬的組成物の形態を取りうる。
【0085】
一部の実施形態では、本開示は、第１の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分及び第２の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分を含む組成物を提供し、それにおいて、第１及び第２の抗体は：
－ それぞれ抗体２３２０３＿１及び２３２０３＿２；
－ それぞれ抗体２３２０３＿１及び２３２０３＿３；
－ それぞれ抗体２３２０３＿１及び２３２０３＿４；
－ それぞれ抗体２３２０３＿１及び２２９９５；
－ それぞれ抗体２３２０３＿１及び２２８８３；
－ それぞれ抗体２３２０３＿２及び２３２０３＿３；
－ それぞれ抗体２３２０３＿２及び２３２０３＿４；
－ それぞれ抗体２３２０３＿２及び２２９９５；
－ それぞれ抗体２３２０３＿２及び２２８８３；
－ それぞれ抗体２３２０３＿３及び２３２０３＿４；
－ それぞれ抗体２３２０３＿３及び２２９９５；
－ それぞれ抗体２３２０３＿３及び２２８８３；
－ それぞれ抗体２３２０３＿４及び２２９９５；
－ それぞれ抗体２３２０３＿４及び２２８８３；又は
－ それぞれ抗体２２９９５及び２２８８３である。
－ それぞれ抗体２３２０３＿１及び２３２０３＿２；
－ それぞれ抗体２３２０３＿１及び２３２０３＿３；
－ それぞれ抗体２３２０３＿１及び２３２０３＿４；
－ それぞれ抗体２３２０３＿１及び２２９９５；
－ それぞれ抗体２３２０３＿１及び２２８８３；
－ それぞれ抗体２３２０３＿２及び２３２０３＿３；
－ それぞれ抗体２３２０３＿２及び２３２０３＿４；
－ それぞれ抗体２３２０３＿２及び２２９９５；
－ それぞれ抗体２３２０３＿２及び２２８８３；
－ それぞれ抗体２３２０３＿３及び２３２０３＿４；
－ それぞれ抗体２３２０３＿３及び２２９９５；
－ それぞれ抗体２３２０３＿３及び２２８８３；
－ それぞれ抗体２３２０３＿４及び２２９９５；
－ それぞれ抗体２３２０３＿４及び２２８８３；又は
－ それぞれ抗体２２９９５及び２２８８３である。
【0086】
一部の実施形態では、組成物は、前記第１及び第２の抗体と同じエピトープに結合する、又はそれらとの結合について競合する、抗体又はその抗原結合部分を含む。
【0087】
一部の実施形態では、組成物は、前記第１の抗体のＨ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列及びＬ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合部分、ならびに前記第２の抗体のＨ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列及びＬ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合部分を含む。
【0088】
一部の実施形態では、組成物は、前記第１の抗体のそれぞれＶＨアミノ酸配列及びＶＬアミノ酸配列と少なくとも８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一であるアミノ酸配列を伴うＶＨ及びＶＬ、ならびに前記第２の抗体のそれぞれＶＨアミノ酸配列及びＶＬアミノ酸配列と少なくとも８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一であるアミノ酸配列を伴うＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合部分を含む。
【0089】
一部の実施形態では、組成物は、前記第１の抗体のＶＨアミノ酸配列及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合部分、ならびに前記第２の抗体のＶＨアミノ酸配列及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合部分を含む。
【0090】
一部の実施形態では、組成物は、前記第１の抗体のＨＣアミノ酸配列及びＬＣアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合部分、ならびに前記第２の抗体のＨＣアミノ酸配列及びＬＣアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合部分を含む。
【0091】
特定の実施形態では、前記組成物は、以下からなる群より選択される１、２、又はそれ以上の抗体又はその抗原結合部分を含みうる：
ａ）それぞれ配列番号５～７、１５～１７、２５～２７、３５～３７、４５～４７、又は５５～５７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１～３を含む抗体；
ｂ）そのＶＨが配列番号３、１３、２３、３３、４３、又は５３のアミノ酸配列と配列において少なくとも９０%同一である抗体；
ｃ）そのＶＨが配列番号３、１３、２３、３３、４３、又は５３のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）そのＨＣが配列番号３及び６１、１３及び６１、２３及び６１、３３及び６１、４３及び６１、又は５３及び６１のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）それぞれ配列番号８～１０、１８～２０、２８～３０、３８～４０、４８～５０、又は５８～６０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１～３を含む抗体；
ｆ）そのＶＬが配列番号４、１４、２４、３４、４４、又は５４のアミノ酸配列と配列において少なくとも９０%同一である抗体；
ｇ）そのＶＬが配列番号４、１４、２４、３４、４４、又は５４のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）そのＬＣが配列番号４及び６２、１４及び６２、２４及び６２、３４及び６２、４４及び６２、又は５４及び６２のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）そのＨ－ＣＤＲ１～３及びＬ－ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号５～１０、１５～２０、２５～３０、３５～４０、４５～５０、又は５５～６０のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）それぞれ配列番号３及び４、１３及び１４、２３及び２４、３３及び３４、４３及び４４、又は５３及び５４のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む抗体；
ｋ）それぞれ配列番号３及び４、１３及び１４、２３及び２４、３３及び３４、４３及び４４、又は５３及び５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む抗体；ならびに
ｌ）それぞれ配列番号３及び６１、ならびに配列番号４及び６２；配列番号１３及び６１、ならびに配列番号１４及び６２；配列番号２３及び６１、ならびに配列番号２４及び６２；配列番号３３及び６１、ならびに配列番号３４及び６２；配列番号４３及び６１、ならびに配列番号４４及び６２；又は配列番号５３及び６１、ならびに配列番号５４及び６２；のアミノ酸配列を含むＨＣ及びＬＣを含む抗体。
ａ）それぞれ配列番号５～７、１５～１７、２５～２７、３５～３７、４５～４７、又は５５～５７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１～３を含む抗体；
ｂ）そのＶＨが配列番号３、１３、２３、３３、４３、又は５３のアミノ酸配列と配列において少なくとも９０%同一である抗体；
ｃ）そのＶＨが配列番号３、１３、２３、３３、４３、又は５３のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）そのＨＣが配列番号３及び６１、１３及び６１、２３及び６１、３３及び６１、４３及び６１、又は５３及び６１のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）それぞれ配列番号８～１０、１８～２０、２８～３０、３８～４０、４８～５０、又は５８～６０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１～３を含む抗体；
ｆ）そのＶＬが配列番号４、１４、２４、３４、４４、又は５４のアミノ酸配列と配列において少なくとも９０%同一である抗体；
ｇ）そのＶＬが配列番号４、１４、２４、３４、４４、又は５４のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）そのＬＣが配列番号４及び６２、１４及び６２、２４及び６２、３４及び６２、４４及び６２、又は５４及び６２のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）そのＨ－ＣＤＲ１～３及びＬ－ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号５～１０、１５～２０、２５～３０、３５～４０、４５～５０、又は５５～６０のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）それぞれ配列番号３及び４、１３及び１４、２３及び２４、３３及び３４、４３及び４４、又は５３及び５４のアミノ酸配列と少なくとも９０%同一のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む抗体；
ｋ）それぞれ配列番号３及び４、１３及び１４、２３及び２４、３３及び３４、４３及び４４、又は５３及び５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む抗体；ならびに
ｌ）それぞれ配列番号３及び６１、ならびに配列番号４及び６２；配列番号１３及び６１、ならびに配列番号１４及び６２；配列番号２３及び６１、ならびに配列番号２４及び６２；配列番号３３及び６１、ならびに配列番号３４及び６２；配列番号４３及び６１、ならびに配列番号４４及び６２；又は配列番号５３及び６１、ならびに配列番号５４及び６２；のアミノ酸配列を含むＨＣ及びＬＣを含む抗体。
【0092】
一部の実施形態では、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体組成物は、インビボで腫瘍成長を阻害しうる、及び／又は腫瘍成長退行を誘導しうる。一部の実施形態では、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体組成物は、がん患者の生存を延長しうる。
【0093】
本開示はまた、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体組成物を産生するための方法を提供し、第１の抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分及び第２の抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分を提供すること、ならびに２つの抗体又は部分を混合することを含む。
【0094】
二重特異性結合分子
本開示はまた、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体の結合特異性を有する（例、抗原結合部分、例えば６つのＣＤＲ又はＶＨ及びＶＬなどを含む）二重特異性結合分子を提供する。一部の実施形態では、二重特異性結合分子は、加えて、もう一つ別の抗ＡＸＬ抗体（例、本明細書中に記載する別の抗ＡＸＬ抗体）、又は異なるタンパク質（例えばがん抗原など）もしくはその活性が疾患状態（例えばがんなど）を媒介する別の細胞表面分子などを標的化する抗体の結合特異性をさらに有する。そのような二重特異性結合分子は当技術分野において公知であり、異なる型の二重特異性結合分子の例を、本明細書中の別の場所に与えている。
本開示はまた、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体の結合特異性を有する（例、抗原結合部分、例えば６つのＣＤＲ又はＶＨ及びＶＬなどを含む）二重特異性結合分子を提供する。一部の実施形態では、二重特異性結合分子は、加えて、もう一つ別の抗ＡＸＬ抗体（例、本明細書中に記載する別の抗ＡＸＬ抗体）、又は異なるタンパク質（例えばがん抗原など）もしくはその活性が疾患状態（例えばがんなど）を媒介する別の細胞表面分子などを標的化する抗体の結合特異性をさらに有する。そのような二重特異性結合分子は当技術分野において公知であり、異なる型の二重特異性結合分子の例を、本明細書中の別の場所に与えている。
【0095】
核酸分子及びベクター
本開示はまた、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子及び配列を提供する。一部の実施形態では、異なる核酸分子が、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードする。他の実施形態では、同じ核酸分子が、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードする。
本開示はまた、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子及び配列を提供する。一部の実施形態では、異なる核酸分子が、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードする。他の実施形態では、同じ核酸分子が、抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードする。
【0096】
ヌクレオチド配列への言及は、他に特定しない限り、その相補体を包含する。このように、特定の配列を有する核酸への言及は、その相補配列を伴う、その相補鎖を包含すると理解すべきである。本明細書中で言及する用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、又はヌクレオチドのいずれかの型の改変形態の、少なくとも１０塩基の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味する。この用語は一本鎖及び二本鎖の形態を含む。
【0097】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、又は軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、あるいはその両方を含む核酸分子を提供する。
【0098】
本開示はまた、本明細書中に列挙する１つ以上のヌクレオチド配列と、例えば、配列番号１、２、１１、１２、２１、２２、３１、３２、４１、４２、５１、及び５２からなる群より選択されるヌクレオチド配列と、又は配列番号３、４、１３、１４、２３、２４、３３、３４、４３、４４、５３、及び５４からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%同一であるヌクレオチド配列を提供する。核酸配列の文脈における用語「パーセント配列同一性」は、最大の対応のために整列された場合に同じである２つの配列中の残基に言及する。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約１８ヌクレオチド、より通常は少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、及び好ましくは少なくとも約３６、４８又はそれ以上のヌクレオチドの長さに及びうる。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる、当技術分野において公知の多数の異なるアルゴリズムがある。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、又はＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較することができ、それらはWisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG)（ウィスコンシン州マジソン）中のプログラムである。ＦＡＳＴＡ（例えばプログラムＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３を含む）は、問い合わせ配列と検索配列の間での最良の重複の領域のアラインメント及びパーセント配列同一性を提供する（例、Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990)；Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)；Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996)；及びPearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998)を参照のこと；参照により本明細書中に組み込まれる）。他に特定しない限り、特定のプログラム又はアルゴリズムについてのデフォルトパラメータを使用する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性を、ＦＡＳＴＡをそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６及びスコアリングマトリックス用のＮＯＰＡＭ係数）で使用して、又は、ＧａｐをＧＣＧバージョン６．１において提供されるデフォルトパラメータで使用して決定することができる（参照により本明細書中に組み込まれる）。
【0099】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１、２、１１、１２、２１、２２、３１、３２、４１、４２、５１、及び５２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１及び２、１１及び１２、２１及び２２、３１及び３２、４１及び４２、又は５１及び５２のヌクレオチド配列を含む。
【0100】
上記の実施形態のいずれにおいて、核酸分子は単離されうる。本明細書中で「単離された」又は「精製された」として言及される核酸分子は、それらが、（１）それらの供給源のゲノムＤＮＡもしくは細胞ＲＮＡの核酸から分離された、及び／又は（２）自然において生じない核酸である。
【0101】
さらなる態様において、本開示は、本明細書中に記載する抗体又はその抗原結合部分の鎖の一方又は両方を発現するために適切なベクターを提供する。用語「ベクター」は、本明細書中で使用するように、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を意味する。一部の実施形態では、ベクターはプラスミド、即ち、追加のＤＮＡセグメントが連結されうるＤＮＡの環状二本鎖片である。さらに、特定のベクターは、それらが操作可能に連結された遺伝子の発現を指示することが可能である。そのようなベクターは、本明細書中で「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）として言及される。
【0102】
本開示は、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分の重鎖、軽鎖、又は重鎖及び軽鎖の両方をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。特定の実施形態では、本開示のベクターは、本明細書中に記載する核酸分子を含む。本開示はさらに、融合タンパク質、改変抗体、抗体フラグメント、及びそれらのプローブをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターはさらに、発現制御配列を含んでもよい。
【0103】
本明細書中で使用する用語「発現制御配列」は、それらが連結されるコード配列の発現及びプロセシングをもたらすために必要であるポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、適当な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列、及びエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナルなど；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（即ち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；ならびに、所望の場合、タンパク質分泌を増強する配列を含む。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なり；原核生物では、そのような制御配列には、一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含み；真核生物では、一般的に、そのような制御配列はプロモーター及び転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、最小限で、その存在が発現及びプロセシングのために必須である全ての成分を含むことを意図しており、また、その存在が有利である追加の成分、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列を含むことができる。
【0104】
一部の実施形態では、本明細書中に記載する核酸分子は、任意の供給源からの重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列にインフレームで連結された、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分からのＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。同様に、本明細書中に記載する核酸分子は、任意の供給源からの軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列にインフレームで連結された、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分からのＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
【0105】
本開示のさらなる態様では、ＶＨ及び／又はＶＬをコードする核酸分子は、全長抗体遺伝子に「変換」されうる。一部の実施形態では、ＶＨドメイン又はＶＬドメインをコードする核酸分子は、ＶＨセグメントが、ベクター内のＣＨセグメントに操作可能に連結されるように、及び／又はＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントに操作可能に連結されるように、それぞれ重鎖定常（ＣＨ）領域又は軽鎖定常（ＣＬ）領域を既にコードしている発現ベクター中への挿入により、全長抗体遺伝子に変換される。別の態様では、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインをコードする核酸分子は、標準的な分子生物学的技術を使用し、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインをコードする核酸分子を、ＣＨ及び／又はＣＬ領域をコードする核酸分子に連結させる、例えば、ライゲーションさせることにより、全長抗体遺伝子中に変換される。全長重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸分子を次に、それらが導入された細胞から発現させ、抗ＡＸＬ抗体を単離してもよい。
【0106】
一部の実施形態では、フレームワーク領域は、結果として得られるフレームワーク領域が、対応する生殖系遺伝子のアミノ酸配列を有するように変異される。変異を、例えば、抗ＡＸＬ抗体の半減期を増加させるために、フレームワーク領域又は定常領域中に作成してもよい。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ００／０９５６０を参照のこと。フレームワーク領域又は定常領域中の変異はまた、抗体の免疫原性を変化させるために、及び／又は別の分子への共有結合的又は非共有結合的な結合のための部位を提供するために作成することができる。本開示によれば、抗体は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域の任意の１つ以上において、あるいは定常領域において変異を有しうる。
【0107】
宿主細胞ならびに抗体及び抗体組成物の産生方法。
本開示はまた、本明細書中に記載する抗体組成物ならびに抗体及びその抗原結合部分を産生するための方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分を産生するための方法に関し、本明細書中に記載するＡＸＬ抗体又は抗原結合部分の、重鎖又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、及び軽鎖又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞（例、組換え宿主細胞）を提供すること；抗体又は抗原結合部分の発現のために適切な条件下で前記宿主細胞を培養すること；ならびに結果として得られた抗体又は抗原結合部分を単離することを含む。そのような組換え宿主細胞におけるそのような発現により産生される抗体又は抗原結合部分は、本明細書中で「組換え」抗体又は抗原結合部分として言及される。本開示はまた、そのような宿主細胞の子孫細胞、及び同により産生される抗体又は抗原結合部分を提供する。
本開示はまた、本明細書中に記載する抗体組成物ならびに抗体及びその抗原結合部分を産生するための方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分を産生するための方法に関し、本明細書中に記載するＡＸＬ抗体又は抗原結合部分の、重鎖又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、及び軽鎖又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞（例、組換え宿主細胞）を提供すること；抗体又は抗原結合部分の発現のために適切な条件下で前記宿主細胞を培養すること；ならびに結果として得られた抗体又は抗原結合部分を単離することを含む。そのような組換え宿主細胞におけるそのような発現により産生される抗体又は抗原結合部分は、本明細書中で「組換え」抗体又は抗原結合部分として言及される。本開示はまた、そのような宿主細胞の子孫細胞、及び同により産生される抗体又は抗原結合部分を提供する。
【0108】
用語「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）は、本明細書中で使用するように、組換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。定義により、組換え宿主細胞は自然において生じない。本開示は、例えば、本明細書中に記載するベクターを含みうる宿主細胞を提供する。本開示はまた、例えば、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分の、重鎖又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、あるいはそれらの両方を含む宿主細胞を提供する。「組換え宿主細胞」及び「宿主細胞」は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も意味することを理解すべきである。特定の改変が、変異又は環境影響のいずれかに起因して、続く世代において生じうるため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないことがあるが、しかし、本明細書中で使用する用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。
【0109】
抗ＡＸＬ抗体及びその抗原結合部分をコードする核酸分子ならびにこれらの核酸分子を含むベクターは、適切な哺乳動物細胞、植物細胞、細菌細胞、又は酵母宿主細胞のトランスフェクションのために使用することができる。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するための任意の公知の方法によることができる。哺乳動物細胞中への異種ポリヌクレオチドの導入のための方法は、当技術分野において周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中でのポリヌクレオチドのカプセル化、及び核中へのＤＮＡのマイクロインジェクションを含む。また、核酸分子を、ウイルスベクターにより哺乳動物細胞中に導入してもよい。
【0110】
異なる細胞株により、又はトランスジェニック動物において発現される抗体は、互いに異なるグリコシル化パターンを有する可能性が高い。しかし、本明細書中で提供する核酸分子によりコードされる、又は本明細書中で提供するアミノ酸配列を含む全ての抗体が、抗体のグリコシル化状態に関係なく、より一般的には、翻訳後修飾の存在又は非存在に関係なく、本開示の一部である。
【0111】
医薬的組成物
本開示の別の態様は、本開示の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分、抗体組成物、あるいは二重特異性結合分子を有効成分として（又は唯一の有効成分として）含む医薬的組成物である。医薬的組成物は、加えて、医薬的に許容可能な賦形剤を含みうる。一部の実施形態では、医薬的組成物は、がん、例えば、本明細書中に記載するがんの寛解、予防、及び／又は処置のためを意図する。特定の実施形態では、がんは、組織、例えば皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頸部、肝臓、骨、膀胱、乳房、胃、子宮、子宮頸部、及び膵臓などの中にある。特定の実施形態では、がんは、黒色腫、頭頸部がん、神経膠芽腫、甲状腺がん、非小細胞肺がん、乳がん（例、トリプルネガティブ乳がん）、膵臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、卵管がん、原発性腹膜がん、子宮内膜がん、尿路上皮がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、直腸がん、前立腺がん、中皮腫、扁平上皮がん、肉腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、小リンパ球性白血病、骨髄異形成症候群、又はホジキンリンパ腫である。
本開示の別の態様は、本開示の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分、抗体組成物、あるいは二重特異性結合分子を有効成分として（又は唯一の有効成分として）含む医薬的組成物である。医薬的組成物は、加えて、医薬的に許容可能な賦形剤を含みうる。一部の実施形態では、医薬的組成物は、がん、例えば、本明細書中に記載するがんの寛解、予防、及び／又は処置のためを意図する。特定の実施形態では、がんは、組織、例えば皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頸部、肝臓、骨、膀胱、乳房、胃、子宮、子宮頸部、及び膵臓などの中にある。特定の実施形態では、がんは、黒色腫、頭頸部がん、神経膠芽腫、甲状腺がん、非小細胞肺がん、乳がん（例、トリプルネガティブ乳がん）、膵臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、卵管がん、原発性腹膜がん、子宮内膜がん、尿路上皮がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、直腸がん、前立腺がん、中皮腫、扁平上皮がん、肉腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、小リンパ球性白血病、骨髄異形成症候群、又はホジキンリンパ腫である。
【0112】
本開示の医薬的組成物は、本開示の１つ以上の抗ＡＸＬ抗体、抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異性結合分子、例えば、１つ又は２つの抗ＡＸＬ抗体、抗原結合部分、又は二重特異性結合分子を含みうる。一部の実施形態では、組成物は、本開示の単一の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分を含む。別の態様では、組成物は、本開示の２つの別の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分を含む。
【0113】
一部の実施形態では、医薬的組成物は、本開示の少なくとも１つの抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分、例えば、１つの抗ＡＸＬ抗体又は部分、ならびに１つ以上の関連する細胞表面受容体、例えば、１つ以上のがん関連受容体を標的化する１つ以上の追加の抗体を含みうる。
【0114】
一般的に、本開示の抗体、抗原結合部分、及び二重特異性結合分子は、例えば、以下に記載するように、１つ以上の医薬的に許容可能な賦形剤との関連において、製剤として投与するために適切である。
【0115】
用語「賦形剤」を本明細書中で使用し、本開示の化合物以外の任意の成分を記載する。賦形剤の選択は、要因、例えば特定の投与様式、溶解性及び安定性に対する賦形剤の効果、ならびに投与形態の性質などに大幅に依存しうる。本明細書中で使用するように、「医薬的に許容可能な賦形剤」は、生理学的に適合する任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。医薬的に許容可能な賦形剤の一部の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせである。多くの場合では、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトールなど、又は塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましいであろう。医薬的に許容可能な物質の追加の例は、湿潤剤又は少量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、保存剤、又は緩衝剤などであり、それらによって、抗体の有効期間又は有効性が増強される。
【0116】
本開示の医薬的組成物及びそれらの調製のための方法は、当業者に容易に明らかであろう。そのような組成物及びそれらの調製のための方法は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition（Mack Publishing Company, 1995）において見出されうる。医薬的組成物は、好ましくは、ＧＭＰ（適正製造規範）条件下で製造される。
【0117】
本開示の医薬的組成物は、バルクで、単一の単位用量として、又は複数の単一の単位用量として、調製、包装、又は販売されうる。本明細書中で使用するように、「単位用量」は、所定量の有効成分を含む医薬的組成物の個別の量である。有効成分の量は、一般的に、対象に投与されうる有効成分の投与量、又はそのような投与量の便利な分画、例えば、そのような投与量の半分又は３分の１に等しい。
【0118】
非経口投与のために適切な医薬的組成物の製剤は、典型的には、医薬的に許容可能な担体、例えば滅菌水又は滅菌等張生理食塩水などと組み合わされた有効成分を含む。そのような製剤は、ボーラス投与のために又は連続投与のために適切な形態において調製、包装、又は販売されうる。注射用製剤は、単位投与形態で、例えばアンプル、又は保存剤を含む複数用量容器などで調製、包装、又は販売されうる。非経口投与用の製剤は、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクル中のエマルジョン、ペーストなどを含むが、それらに限定されない。そのような製剤は、限定されないが、懸濁剤、安定剤、又は分散剤を含む１つ以上の追加の成分をさらに含みうる。非経口投与用の製剤の一部の実施形態では、有効成分は、再構成された組成物の非経口投与の前に、適切なビヒクル（例、無菌のパイロジェンフリー水）での再構成のための乾燥（即ち、粉末又は顆粒）形態において提供される。非経口製剤はまた、賦形剤、例えば塩、糖質、緩衝剤（好ましくは３から９のｐＨ）などを含みうる水溶液を含むが、一部の適用については、それらは、無菌の非水性溶液として、又は適切なビヒクル、例えば無菌のパイロジェンフリー水などとの組み合わせにおいて使用される乾燥形態としてより適切に製剤化されうる。例示的な非経口投与形態は、無菌水溶液、例えば、水性プロピレングリコール溶液又はデキストロース溶液中の溶液又は懸濁液を含む。そのような投与形態は、所望の場合、適切に緩衝化することができる。有用である他の非経口投与可能な製剤は、有効成分を微結晶形態で、又はリポソーム調製物で含む製剤を含む。
【0119】
本開示の抗体及び組成物の治療的使用
一部の実施形態では、本開示の抗ＡＸＬ抗体及びその抗原結合部分、抗ＡＸＬ抗体組成物、ならびに二重特異性結合分子は、がん、例えば、ＡＸＬ陽性がんの処置における使用のためである。がんは、１つ以上の組織、例えば皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頸部、肝臓、骨、膀胱、乳房、胃、子宮、子宮頸部、及び膵臓などにありうる。
一部の実施形態では、本開示の抗ＡＸＬ抗体及びその抗原結合部分、抗ＡＸＬ抗体組成物、ならびに二重特異性結合分子は、がん、例えば、ＡＸＬ陽性がんの処置における使用のためである。がんは、１つ以上の組織、例えば皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頸部、肝臓、骨、膀胱、乳房、胃、子宮、子宮頸部、及び膵臓などにありうる。
【0120】
一部の実施形態では、本開示の抗ＡＸＬ抗体、抗原結合部分、組成物、及び二重特異性結合分子により処置されるがんは、例えば、黒色腫（例、進行性又は転移性黒色腫）、皮膚基底細胞がん、神経膠芽腫、神経膠腫、神経膠肉腫、星細胞腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、副腎皮質がん、頭頸部扁平上皮がん、口腔がん、唾液腺がん、鼻咽頭がん、乳がん、肺がん（例、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん、及び肺扁平上皮がん）、食道がん、胃食道接合部がん、胃がん、胃腸がん、原発性腹膜がん、肝臓がん、肝細胞がん、胆道がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、卵巣がん、卵管がん、膀胱がん、上部尿路がん、尿路上皮がん、腎細胞がん、腎臓がん、泌尿生殖器がん、子宮頸がん、前立腺がん、線維肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、組織球腫、膵臓がん、子宮内膜がん、虫垂がん、進行メルケル細胞がん、多発性骨髄腫、肉腫、絨毛がん、赤白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、肥満細胞性白血病、小リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、単球性リンパ腫、ＨＴＬＶ関連Ｔ細胞性白血病／リンパ腫、中皮腫、及び固形腫瘍を含みうる。がんは、例えば、早期段階、中間段階、後期段階、局所進行段階、又は転移段階でありうるが、再発しうる、又は他の治療（例、他の抗ＡＸＬ治療）に対して難治性でありうる、あるいは利用可能な標準治療がないことがある。
【0121】
一部の実施形態では、本開示の抗ＡＸＬ抗体、抗原結合部分、組成物、及び／又は二重特異性結合分子により処置されるがんは、例えば、黒色腫、頭頸部がん、神経膠芽腫、甲状腺がん、非小細胞肺がん、乳がん（例、トリプルネガティブ乳がん）、膵臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、卵管がん、原発性腹膜がん、子宮内膜がん、尿路上皮がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、前立腺がん、中皮腫、扁平上皮がん、肉腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、小リンパ球性白血病、骨髄異形成症候群、及び／又はホジキンリンパ腫を含みうる。
【0122】
「処置する」、「処置すること」、及び「処置」は、生物学的障害及び／又はそれに付随する症状の少なくとも１つを軽減又は抑止する方法を指す。本明細書中で使用するように、疾患、障害、又は状態を「軽減する」は、疾患、障害、又は状態の症状の重症度及び／又は発生頻度を低下させることを意味する。さらに、本明細書中での「処置」への言及は、治癒的、緩和的、及び予防的処置への言及を含む。
【0123】
「治療有効量」は、処置されている障害の症状の１つ以上をある程度緩和しうる、投与されている治療薬剤の量を指す。治療有効量の抗がん治療薬によって、例えば、腫瘍成長の遅延、腫瘍縮小、生存率の増加、がん細胞の排除、疾患進行の遅れ又は減少、転移の逆転、又は医療専門家により望まれる他の臨床的エンドポイントがもたらされうる。
【0124】
本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分、抗体組成物、あるいは二重特異性結合分子は、単独で、あるいは１つ以上の他の薬物又は抗体との組み合わせにおいて（又はそれらの任意の組み合わせとして）投与されうる。本明細書中に記載する医薬的組成物、方法、及び使用は、このように、また、以下に詳述するように、他の活性薬剤との組み合わせ（同時投与）の実施形態を包含する。
【0125】
本明細書中で使用するように、用語「同時投与」、「同時投与された」、及び「との組み合わせにおいて」は、１つ以上の他の治療薬剤を伴う、本開示の抗ＡＸＬ抗体及びその抗原結合部分、抗体組成物、ならびに二重特異性結合分子を指し、以下を意味することを意図し、及びそれに言及し、及び以下を含む：
ａ）本開示の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異性結合分子と治療薬剤とのそのような組み合わせの、処置を必要とする患者への同時投与であって、そのような成分が、実質的に同時に前記患者に前記成分を放出する単一の投与形態中に一緒に製剤化される場合の投与、
ｂ）本開示の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異性結合分子と治療薬剤とのそのような組み合わせの、処置を必要とする患者への実質的な同時投与であって、そのような成分が、前記患者により実質的に同時に服用される別々の投与形態中に互いに別個に製剤化され、前記成分は実質的に同時に前記患者に放出される場合の投与、
ｃ）本開示の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異性結合分子と治療薬剤とのそのような組み合わせの、処置を必要とする患者への連続投与であって、そのような成分が、各々の投与の間に有意な時間間隔を伴い、前記患者により連続時間で服用される別々の投与形態中に互いに別個に製剤化され、前記成分が実質的に異なる時間に前記患者に放出される場合の投与；ならびに
ｄ）本開示の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異性結合分子と治療薬剤とのそのような組み合わせの、処置を必要とする患者への連続投与であって、そのような成分が、制御された様式において前記成分を放出する単一の投与形態中に一緒に製剤化され、それらは、同時に、連続的に、及び／又は重複して、同じ及び／又は異なる時間に前記患者に放出される（そこで、各々の部分は同じ又は異なる経路により投与されうる）場合の投与。
ａ）本開示の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異性結合分子と治療薬剤とのそのような組み合わせの、処置を必要とする患者への同時投与であって、そのような成分が、実質的に同時に前記患者に前記成分を放出する単一の投与形態中に一緒に製剤化される場合の投与、
ｂ）本開示の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異性結合分子と治療薬剤とのそのような組み合わせの、処置を必要とする患者への実質的な同時投与であって、そのような成分が、前記患者により実質的に同時に服用される別々の投与形態中に互いに別個に製剤化され、前記成分は実質的に同時に前記患者に放出される場合の投与、
ｃ）本開示の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異性結合分子と治療薬剤とのそのような組み合わせの、処置を必要とする患者への連続投与であって、そのような成分が、各々の投与の間に有意な時間間隔を伴い、前記患者により連続時間で服用される別々の投与形態中に互いに別個に製剤化され、前記成分が実質的に異なる時間に前記患者に放出される場合の投与；ならびに
ｄ）本開示の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異性結合分子と治療薬剤とのそのような組み合わせの、処置を必要とする患者への連続投与であって、そのような成分が、制御された様式において前記成分を放出する単一の投与形態中に一緒に製剤化され、それらは、同時に、連続的に、及び／又は重複して、同じ及び／又は異なる時間に前記患者に放出される（そこで、各々の部分は同じ又は異なる経路により投与されうる）場合の投与。
【0126】
本開示の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分、抗体組成物、あるいは二重特異性結合分子は、追加の治療的処置を伴うことなく、即ち、独立型の治療（単剤治療）として投与してもよい。あるいは、本開示の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分、抗体組成物、あるいは二重特異性結合分子での処置は、少なくとも１つの追加の治療的処置（併用治療）、例えば、免疫刺激剤、抗がん剤（例、化学療法剤、抗悪性腫瘍剤、抗血管新生剤、又はチロシンキナーゼ阻害剤）、又はワクチン（例、腫瘍ワクチン）を含みうる。
【0127】
一部の態様では、抗体又はその抗原結合部分、抗体組成物、あるいは二重特異性結合分子は、がんの処置のための別の医薬／薬物と同時投与又は製剤化されうる。追加の治療的処置は、例えば、免疫刺激剤、ワクチン、化学療法剤、抗悪性腫瘍剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、及び／又は放射線治療を含みうる。一部の実施形態では、追加の治療用処置は異なる抗がん抗体を含みうる。
【0128】
本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分、抗体組成物、あるいは二重特異性結合分子、及び少なくとも１つの他の薬剤（例、化学療法剤、抗悪性腫瘍剤、又は抗血管新生剤）を含む医薬的物品は、がん治療における同時、別々、又は連続投与のための併用処置として使用されうる。他の薬剤は、問題となっている特定のがんの処置のために適切な任意の薬剤、例えば、アルキル化剤、例えば、白金誘導体、例えばシスプラチン、カルボプラチン、及び／又はオキサリプラチンなど；植物アルコイド、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、及び／又はイリノテカン；抗腫瘍抗生物質、例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシンミトキサントロン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、ルテオマイシン、及び／又はマイトマイシン；トポイソメラーゼ阻害剤、例えばトポテカンなど；代謝拮抗剤、例えば、フルオロウラシル及び／又は他のフルオロピリミジン；ＦＯＬＦＯＸ；オシメルチニブ；シクロホスファミド；アントラサイクリン；ダカルバジン；ゲムシタビン；又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される薬剤でありうる。一部の実施形態では、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分、抗体組成物、あるいは二重特異性結合分子によって、他の薬剤に対する応答性が再確立される。
【0129】
本開示の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分、抗体組成物、あるいは二重特異性結合分子はまた、他の抗がん治療、例えばワクチン、サイトカイン、酵素阻害剤、免疫刺激化合物、及びＴ細胞治療などとの組み合わせにおいて使用されうる。ワクチンの場合では、それは、例えば、処置されているがんについて関連する１つ以上の抗原を含むタンパク質、ペプチド、又はＤＮＡワクチン、あるいは抗原とともに樹状細胞を含むワクチンでありうる。適切なサイトカインは、例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮ－ガンマ、及びＧＭ－ＣＳＦを含む。抗がん活性を有する酵素阻害剤の型の例は、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、例えば、１－メチル－Ｄ－トリプトファン（１－Ｄ－ＭＴ）である。また、養子Ｔ細胞治療が企図され、それは、患者自身のＴ細胞を増殖又は操作し、それらの腫瘍を認識及び攻撃することを含む、種々の免疫療法技術を指す。
【0130】
また、本開示の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分、抗体組成物、あるいは二重特異性結合分子は、チロシンキナーゼ阻害剤との関連において補助治療において使用されうることが企図される。これらは、受容体の細胞内チロシンキナーゼドメインと相互作用し、例えば、細胞内Ｍｇ－ＡＴＰ結合部位について競合することにより、リガンド誘導性の受容体リン酸化を阻害する、合成的な、主にキナゾリン由来の低分子量分子である。一部の実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤はＡＸＬ阻害剤である。
【0131】
一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合部分、抗体組成物、あるいは二重特異性結合分子は、限定されないが、Ａ２ＡＲ、Ａ１ＡＲ、Ａ２ＢＲ、Ａ３ＡＲ、ＡＤＡ、ＡＬＰ、ＢＴＬＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＣＤ７３、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＣＴＬＡ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例、ＣＥＡＣＡＭ－１及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＡＬ９、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＬＡＧ－３、ＬＩＬＲＢ１、ＬＹ１０８、ＬＡＩＲ１、ＩＣＯＳ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＩＲ１、ＭＥＴ、ＮＫＧ２Ａ、ＰＡＰ、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２、ＯＸ４０、ＳＴＩＮＧ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＧＦＲ－ｂｅｔａ、ＴＬＲ、ＴＮＦＲ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＩＳＴＡ、ＬＩＬＲＢ２、ＣＭＴＭ６及び／又は２Ｂ４の発現又は活性を調節する薬剤を含む、免疫系の活性化を媒介する医薬／薬物との組み合わせにおいて使用されうる。特定の実施形態では、薬剤は小分子阻害剤である。特定の実施形態では、薬剤は、上記の分子の１つに結合する抗体又はその抗原結合フラグメントである。また、本開示の抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分、抗体組成物、あるいは二重特異性結合分子をサイトカイン（例、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、又はＩＬ－２１）、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤などとの組み合わせにおいて使用してもよいことが企図される。
【0132】
本開示はまた、ＣＡＲ－Ｔ技術における使用のためでありうる、キメラ抗原受容体の調製における、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又は抗原結合部分の配列（例、６つのＣＤＲ配列ならびにＶＨ配列及びＶＬ配列）の使用を企図する。
【0133】
本開示の抗体及びその抗原結合部分、抗体組成物、ならびに二重特異性結合分子は、本明細書中に記載する処置の方法において使用されうる、本明細書中に記載する処置における使用のためでありうる、及び／又は本明細書中に記載する処置のための薬物の製造における使用のためでありうることが理解される。
【0134】
用量及び投与経路
本開示の抗体又はその抗原結合部分、抗体組成物、あるいは二重特異性結合分子は、問題となっている状態の処置のために有効な量で、即ち、望ましい結果を達成するために必要な投与量で及び期間にわたり投与されうる。治療有効量は、要因、例えば処置されている特定の状態、患者の年齢、性別、及び体重、ならびに抗体が独立型の処置として、あるいは１つ以上の追加の抗がん処置との組み合わせにおいて投与されているのか、などにより変動しうる。
本開示の抗体又はその抗原結合部分、抗体組成物、あるいは二重特異性結合分子は、問題となっている状態の処置のために有効な量で、即ち、望ましい結果を達成するために必要な投与量で及び期間にわたり投与されうる。治療有効量は、要因、例えば処置されている特定の状態、患者の年齢、性別、及び体重、ならびに抗体が独立型の処置として、あるいは１つ以上の追加の抗がん処置との組み合わせにおいて投与されているのか、などにより変動しうる。
【0135】
投薬計画は、最適な所望の応答を提供するように調整してもよい。例えば、単一ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、又は用量を、治療状況の緊急性により示されるように、比例的に低下又は増加させてもよい。投与の容易さ及び投与量の均一のために、非経口組成物を投与単位形態に製剤化することが特に有利である。投与単位形態は、本明細書中で使用するように、処置される患者／対象のための単位投与量として適切な物理的に別個の単位を指す；各々の単位は、要求される医薬的担体との関連において所望の治療効果を産生するように算出された所定量の活性化合物を含む。本開示の投与単位形態についての仕様は、一般的に、（ａ）治療薬剤の特有の特徴及び達成されるべき特定の治療効果又は予防効果、ならびに（ｂ）個人における感受性の処置のためにそのような活性化合物を調合することの当技術分野において固有の制限により決定され、それに直接的に依存している。
【0136】
このように、当業者は、本明細書中に提供する開示に基づいて、用量及び投薬計画が、治療分野において周知の方法に従って調整されることを理解するであろう。すなわち、最大耐用量を容易に確立することができ、検出可能な治療的な利益を患者に提供するために各々の薬剤を投与するための時間的要件と同様に、患者に検出可能な治療的な利益を提供する有効量も決定されうる。したがって、特定の用量及び投与計画が本明細書中に例証されている一方で、これらの例は、本開示を実行する際に患者に提供されうる用量及び投与計画を決して限定しない。
【0137】
用量値は、軽減される状態の型及び重症度で変動し、単一又は複数の用量を含みうることに注意すべきである。任意の特定の対象について、特定の投与計画を、個々の必要性及び組成物を投与する者又はそれを監督する者の専門的判断に従って経時的に調整すべきであること、ならびに本明細書中に示す投与量の範囲は例示的であるだけであり、具体化された構成の範囲又は実行を限定することを意図しないことをさらに理解すべきである。さらに、本開示の組成物を用いた投与計画は、多様な要因（疾患の型、患者の年齢、体重、性別、病状、状態の重症度、投与経路、及び用いられる特定の抗体を含む）に基づきうる。このように、投与計画は広く変動しうるが、しかし、標準的な方法を使用してルーチン的に決定されうる。例えば、用量は、薬物動態学的又は薬力学的パラメーターに基づいて調整されうるが、それは、臨床効果、例えば毒性効果及び／又は検査値などを含みうる。このように、本開示は、当業者により決定される患者内の用量漸増を包含する。適当な投与量及び計画の決定は、関連する技術分野において周知であり、一度、本明細書中に開示する教示が提供されると、当業者により包含されることが理解されるであろう。
【0138】
腫瘍治療のための有効量は、患者における疾患進行を安定化する及び／又は症状を寛解させる、ならびに好ましくは、例えば、腫瘍サイズを低下させることにより疾患進行を逆転させるその能力により測定されうる。がんを阻害するための、本開示の抗体、抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異性結合分子の能力は、例えば、実施例において記載するようにインビトロアッセイにより、ならびにヒト腫瘍における効力を予測する適切な動物モデルにおいて評価されうる。適切な投与計画が、各々の特定の状況において最適な治療応答を提供するために選択され、例えば、単一ボーラスとして又は連続注入として投与され、各々の場合の緊急事態により示されるように、投与量の可能な調整を伴う。
【0139】
本開示の抗体又はその抗原結合部分、抗体組成物、あるいは二重特異性結合分子は、当技術分野において受け入れられているペプチド、タンパク質、又は抗体を投与するための任意の方法により投与されうるが、典型的には非経口投与のために適切である。本明細書中で使用するように、「非経口投与」は、対象の組織の物理的な破裂及び組織中の破裂を通じた投与により特徴付けられる任意の投与経路を含み、このように、一般的に、血流中、筋肉中、又は内臓中への直接投与をもたらす。非経口投与は、このように、注射による、外科的切開を通じた適用による、組織を貫通する非外科的創傷を通じた適用などによる投与を含むが、それらに限定されない。特に、非経口投与は、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、大槽内、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、尿道内、頭蓋内、腫瘍内、及び滑膜内の注射又は注入を含むが、それらに限定されないことを企図する。特定の実施形態は、静脈内経路及び皮下経路を含む。
【0140】
診断用途及び組成物
本開示の抗体及び抗原結合部分はまた、診断過程（例、インビトロ、エクスビボ）において有用である。例えば、抗体及び抗原結合部分を使用し、患者からのサンプル（例、組織サンプル、又は体液サンプル、例えば炎症性滲出液、血液、血清、腸液、唾液、又は尿など）中のＡＸＬのレベルを検出及び／又は測定することができる。適切な検出方法及び測定方法は、免疫学的方法、例えばフローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、及び免疫組織学などを含む。本開示は、本明細書中に記載する抗体及び抗原結合部分を含むキット（例、診断キット）をさらに包含する。
本開示の抗体及び抗原結合部分はまた、診断過程（例、インビトロ、エクスビボ）において有用である。例えば、抗体及び抗原結合部分を使用し、患者からのサンプル（例、組織サンプル、又は体液サンプル、例えば炎症性滲出液、血液、血清、腸液、唾液、又は尿など）中のＡＸＬのレベルを検出及び／又は測定することができる。適切な検出方法及び測定方法は、免疫学的方法、例えばフローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、及び免疫組織学などを含む。本開示は、本明細書中に記載する抗体及び抗原結合部分を含むキット（例、診断キット）をさらに包含する。
【0141】
製造品及びキット
本開示はまた、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分の医薬的組成物、組成物、あるいは二重特異性結合分子を含む１つ以上の容器（例、使い捨て又は複数回使用の容器）、場合により、追加の生物学的に活性な分子（例、別の治療薬剤）、及び使用説明書を含む製造品、例えば、キットを提供する。抗体又は抗原結合部分、組成物、あるいは二重特異性結合分子、及び任意の追加の生物学的に活性な分子は、適切な包装、例えば非反応性ガラス又はプラスチックから作製されたバイアル又はアンプルなどの中に別々に包装することができる。特定の実施形態では、バイアル又はアンプルは、抗体又は抗原結合部分、組成物、あるいは二重特異性結合分子、及び、場合により、生物学的に活性な分子の濃縮ストック（例、２×、５×、１０×又はそれ以上）を保持する。特定の実施形態では、製造品、例えばキットなどは、抗体又は抗原結合部分、組成物、あるいは二重特異性結合分子及び／又は生物学的に活性な分子を投与するための医療デバイス（例、注射器及び針）；ならびに／あるいは適当な希釈剤（例、滅菌水及び生理食塩水）を含む。本開示はまた、前記物品を製造するための方法を含む。
本開示はまた、本明細書中に記載する抗ＡＸＬ抗体又はその抗原結合部分の医薬的組成物、組成物、あるいは二重特異性結合分子を含む１つ以上の容器（例、使い捨て又は複数回使用の容器）、場合により、追加の生物学的に活性な分子（例、別の治療薬剤）、及び使用説明書を含む製造品、例えば、キットを提供する。抗体又は抗原結合部分、組成物、あるいは二重特異性結合分子、及び任意の追加の生物学的に活性な分子は、適切な包装、例えば非反応性ガラス又はプラスチックから作製されたバイアル又はアンプルなどの中に別々に包装することができる。特定の実施形態では、バイアル又はアンプルは、抗体又は抗原結合部分、組成物、あるいは二重特異性結合分子、及び、場合により、生物学的に活性な分子の濃縮ストック（例、２×、５×、１０×又はそれ以上）を保持する。特定の実施形態では、製造品、例えばキットなどは、抗体又は抗原結合部分、組成物、あるいは二重特異性結合分子及び／又は生物学的に活性な分子を投与するための医療デバイス（例、注射器及び針）；ならびに／あるいは適当な希釈剤（例、滅菌水及び生理食塩水）を含む。本開示はまた、前記物品を製造するための方法を含む。
【0142】
本明細書中で他に定義しない限り、本開示との関連において使用される科学用語及び技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有するものとする。例示的な方法及び材料を以下に記載するが、本明細書中に記載するものと同様又は等価の方法及び材料も、本開示の実行又はテストにおいて使用することができる。矛盾する場合では、本明細書（定義を含む）によって定められる。
【0143】
一般的に、本明細書中に記載する細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、医薬品及び薬学化学、ならびにタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションとの関連において使用される命名法及びそれらの技術は、当技術分野において周知であり、一般に使用されているものである。酵素反応及び精製技術は、当技術分野において一般に達成されるように、又は本明細書中に記載するように、製造業者の仕様に従って実施される。
【0144】
さらに、文脈により他に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、及び複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書及び実施形態を通じて、単語「ｈａｖｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、あるいは変形、例えば「ｈａｓ」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、又は「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などは、記載された整数又は整数のグループの包含を意味するが、しかし、任意の他の整数又は整数のグループの除外を意味しないと理解される。
【0145】
本明細書中で言及する全ての刊行物及び他の参考文献が、参照によりそれらの全体において組み込まれる。多数の文書が本明細書中に引用されているが、この引用は、これらの文書のいずれかが、当技術分野における共通の一般知識の一部を形成することの承認を成さない。
【0146】
本開示がより良く理解されうるために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、例証だけを目的とし、本開示の範囲を任意の様式で限定するものとして解釈すべきではない。
【0147】
実施例
実施例１：ラットＢ細胞からの抗ＡＸＬ抗体のクローニング
材料及び方法
ヒトＡＸＬに対する抗体は、OmniRat（登録商標）ラット（Osborn et al., J Immunol. 190(4):1481-90 (2013)）（完全なヒトのイディオタイプを伴う抗体を産生するLigand Pharmaceuticals Inc.からのトランスジェニックラット系統）から由来する抗体レパートリーから単離された。単一細胞選別抗体分泌Ｂ細胞（ＡＳＣ）からのラット由来抗体遺伝子のクローニングを、Symplex（商標）抗体発見技術（Meijer et al., J Mol Biol 358(3):764-72 (2006)）を用いて実施した。
実施例１：ラットＢ細胞からの抗ＡＸＬ抗体のクローニング
材料及び方法
ヒトＡＸＬに対する抗体は、OmniRat（登録商標）ラット（Osborn et al., J Immunol. 190(4):1481-90 (2013)）（完全なヒトのイディオタイプを伴う抗体を産生するLigand Pharmaceuticals Inc.からのトランスジェニックラット系統）から由来する抗体レパートリーから単離された。単一細胞選別抗体分泌Ｂ細胞（ＡＳＣ）からのラット由来抗体遺伝子のクローニングを、Symplex（商標）抗体発見技術（Meijer et al., J Mol Biol 358(3):764-72 (2006)）を用いて実施した。
【0148】
ＩｇＧ１－ＬＡＬＡフォーマット（下記を参照のこと）において完全なヒトイムノグロブリンをコードする抗体レパートリーコンストラクトを、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトした。細胞上清を、ハイスループットフォーマットのフローサイトメトリーを使用し、ＣＨＯ細胞の表面上に発現したＡＸＬへの結合についてスクリーニングした。ＡＸＬ反応性クローンをＤＮＡ配列決定により分析し、抗体をコードするＤＮＡ配列を抽出した。選択した抗体クローンを、以下に記載するように発現させ、機能的にテストした。
【0149】
抗体をコードするｃＤＮＡフラグメントのSymplex（商標）クローニングにおける縮重プライマーの使用により導入された、重鎖及び軽鎖のアミノ末端におけるミスセンス変異を、生殖系列配列に戻して修正した。表１は、２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、２３２０３＿４、２２９９５、及び２２８８３と指定された生殖系列抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインヌクレオチド配列を示す。修正過程は、生殖系へのアミノ末端配列の修正ならびにコドン使用の最適化を含んだ。ヒト生殖系列配列に一致するための標的を、重鎖及び軽鎖可変領域についてのｂｌａｓｔホモロジー検索により同定した。
【0150】
抗体２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、及び２３２０３＿４は、生殖系列ＩＧＨＶ４－３４配列（即ち、ＨＦＲ１のＡＶＹモチーフ及びＨＣＤＲ２におけるＮｇｌｙｃ部位）に関連付けられた潜在的なリスクを軽減するように操作された単一の親重鎖可変ドメインの４つのバリアントを表す。
【0151】
抗体２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、２３２０３＿４、２２９９５、及び２２８８３の可変ドメイン、定常領域、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）のタンパク質配列を、それぞれ表２、表３、及び表４において示す。
【0152】
結果
表１は、抗体２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、２３２０３＿４、２２９９５、及び２２８８３の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を示す。
表１は、抗体２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、２３２０３＿４、２２９９５、及び２２８８３の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を示す。
【表2】
【0153】
表２は、抗体２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、２３２０３＿４、２２９９５、２２８８３の推定アミノ酸配列を示す。ＣＤＲに太字で下線を引いている。
【表3】
【0154】
表３は、重鎖及び軽鎖定常領域のアミノ酸配列（それぞれＣＨ及びＣＬ）を示す。「ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ」は、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のエフェクター機能を低下させることが公知である重鎖における「ＬＡＬＡ」変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｋａｂａｔナンバリングスキームに従って番号付けされた）の存在を指す（Hezareh et al., J Virol. 75(24):12161-68 (2001)；Hessell et al., Nature 449(7158):101-04 (2007)）。
【表4】
【0155】
表４は、抗体２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、２３２０３＿４、２２９９５、及び２２８８３の重鎖及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を示し、ＣＤＲはＩＭＧＴ（登録商標）システムに従って定義される。配列の配列番号を括弧中に示す。
【表5】
【0156】
表５は、抗体２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、２３２０３＿４、２２９９５、及び２２８８３についての配列番号情報を示す。他に記載しない限り、配列はアミノ酸配列である。
【表6】
【0157】
実施例２：ヒト及びカニクイザルＡＸＬに対する抗体親和性の測定
この実施例は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される、組換えヒト及びカニクイザルのＡＸＬ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への抗ＡＸＬ抗体の結合を実証する。
この実施例は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される、組換えヒト及びカニクイザルのＡＸＬ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への抗ＡＸＬ抗体の結合を実証する。
【0158】
材料及び方法
動的結合分析を、IBIS MX96SPR機器（IBIS Technologies、オランダ）と組み合わせたContinuous Flow Microspotter（ＣＦＭ、Wasatch Microfluidics、米国、ソルトレイクシティ）を使用し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により実施した。
動的結合分析を、IBIS MX96SPR機器（IBIS Technologies、オランダ）と組み合わせたContinuous Flow Microspotter（ＣＦＭ、Wasatch Microfluidics、米国、ソルトレイクシティ）を使用し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により実施した。
【0159】
Ｈｉｓタグ付きヒト及びカニクイザルＡＸＬ ＥＣＤをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞中で発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーにより精製した。結合動力学を、抗ＡＸＬ抗体を固定化し、一価ＡＸＬ抗原を溶液中に保持することにより、一価抗原条件下で測定した。抗体を、Continuous Flow Microspotter（ＣＦＭ、Wasatch Microfluidics、米国、ソルトレイクシティ）を使用し、G-a-hu-IgG Fc SensEye（登録商標）（Ssens BV、オランダ）上に１５分間にわたり捕捉した。スポッティング後、SensEye（登録商標）をIBIS MX96バイオセンサー中に位置付け、捕捉したタンパク質を、FixITキット（Ssens BV、オランダ）を使用して表面に固定した。動的分析を、０．１４nMから１００nMまでの増加濃度での抗原インジェクションを伴って、動的滴定シリーズ（Karlsson et al., Anal Biochem. 349(1):136-47 (2006)）を適用することにより実施した。抗原の会合及び解離を１５分間にわたり実施した。各々の抗原インジェクションシリーズの後、表面を１００mM Ｈ３ＰＯ４、ｐＨ３再生緩衝液により再生した。記録された結合応答を、オンレート（ｋｏｎ又はｋａ）定数、オフレート（ｋｏｆｆ又はｋｄ）定数、及び親和性（ＫＤ）定数の算出のために、Scrubber 2ソフトウェアを用いて単純なラングミュア１：１結合モデルに適合した。
【0160】
結果
親和性測定の結果は、抗体２２９９５、２２８８３、及び２３２０３ならびにそれらのバージョンの全てが、異なる親和性を伴ってヒト及びカニクイザルのＡＸＬ ＥＣＤに結合することを実証する。詳細な結合動力学を以下の表６中に作表する。
親和性測定の結果は、抗体２２９９５、２２８８３、及び２３２０３ならびにそれらのバージョンの全てが、異なる親和性を伴ってヒト及びカニクイザルのＡＸＬ ＥＣＤに結合することを実証する。詳細な結合動力学を以下の表６中に作表する。
【表7】
【0161】
実施例３：抗ＡＸＬ参照抗体類似体のクローニング
表７は、実施例において参照として使用される３つの抗ＡＸＬ抗体に関する情報を示す。１０Ｇ５類似体（BerGenBio）は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ１－ＬＡＬＡの両方において産生され、表中の２行において列挙されている。
表７は、実施例において参照として使用される３つの抗ＡＸＬ抗体に関する情報を示す。１０Ｇ５類似体（BerGenBio）は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ１－ＬＡＬＡの両方において産生され、表中の２行において列挙されている。
【0162】
材料及び方法
表６中の抗体類似体の重鎖及び軽鎖可変ドメインをコードするアミノ酸配列を、列挙された特許又は特許出願から得た。タンパク質配列を、ヒトコドン使用を伴うＤＮＡ配列に逆翻訳した。対応するＤＮＡ配列を遺伝子合成し、ヒト重鎖又は軽鎖の定常領域を含む発現ベクター中にクローニングし、全長抗体鎖の発現をもたらした。発現用に選択されたヒト抗体アイソタイプを抗体フォーマット列中に列挙している。ＣＨＯ細胞を、標準的なタンパク質発現系を使用し、結果として得られた発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。対応する抗体上清を、標準的なプロテインＡ精製カラムクロマトグラフィーを使用して精製した。
表６中の抗体類似体の重鎖及び軽鎖可変ドメインをコードするアミノ酸配列を、列挙された特許又は特許出願から得た。タンパク質配列を、ヒトコドン使用を伴うＤＮＡ配列に逆翻訳した。対応するＤＮＡ配列を遺伝子合成し、ヒト重鎖又は軽鎖の定常領域を含む発現ベクター中にクローニングし、全長抗体鎖の発現をもたらした。発現用に選択されたヒト抗体アイソタイプを抗体フォーマット列中に列挙している。ＣＨＯ細胞を、標準的なタンパク質発現系を使用し、結果として得られた発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。対応する抗体上清を、標準的なプロテインＡ精製カラムクロマトグラフィーを使用して精製した。
【表8】
【0163】
実施例４：ヒト又はカニクイザルＡＸＬで一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｓ細胞への抗ヒトＡＸＬ抗体のインビトロ結合
材料及び方法
６つの抗ヒトＡＸＬ抗体及び参照抗体類似体を、ＣＨＯ－Ｓ細胞上で一過性に発現されたヒト又はカニクイザルＡＸＬ細胞外ドメインへのインビトロ結合について、フローサイトメトリーにより評価した。比較のために、参照抗体類似体を評価において含めた。全ての抗体を、一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｓ細胞と一緒に４℃で３０分間にわたる連続希釈においてインキュベートした。２回の洗浄工程後、細胞を、ＡＦ６４７コンジュゲート二次抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体と４℃で３０分間にわたりインキュベートした。最終洗浄工程を、iQue Plusスクリーナーでの細胞の取得前に行った。結果を、GrafPad Prismソフトウェアにより算出した。
材料及び方法
６つの抗ヒトＡＸＬ抗体及び参照抗体類似体を、ＣＨＯ－Ｓ細胞上で一過性に発現されたヒト又はカニクイザルＡＸＬ細胞外ドメインへのインビトロ結合について、フローサイトメトリーにより評価した。比較のために、参照抗体類似体を評価において含めた。全ての抗体を、一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｓ細胞と一緒に４℃で３０分間にわたる連続希釈においてインキュベートした。２回の洗浄工程後、細胞を、ＡＦ６４７コンジュゲート二次抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体と４℃で３０分間にわたりインキュベートした。最終洗浄工程を、iQue Plusスクリーナーでの細胞の取得前に行った。結果を、GrafPad Prismソフトウェアにより算出した。
【0164】
結果
一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｓ細胞上で発現されたヒト又はカニクイザルのＡＸＬ ＥＣＤに結合する抗体の用量反応曲線を図１Ａ～１Ｃにおいて示す。全ての６つの抗ヒトＡＸＬ抗体が、変動する効力及び有効性を伴って、ヒト（図１Ａ）及びカニクイザル（図１Ｂ）の両方のＡＸＬに結合する。２つの参照抗体を比較のために示す。いずれの抗体もモックトランスフェクト細胞に結合しない（図１Ｃ）。
一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｓ細胞上で発現されたヒト又はカニクイザルのＡＸＬ ＥＣＤに結合する抗体の用量反応曲線を図１Ａ～１Ｃにおいて示す。全ての６つの抗ヒトＡＸＬ抗体が、変動する効力及び有効性を伴って、ヒト（図１Ａ）及びカニクイザル（図１Ｂ）の両方のＡＸＬに結合する。２つの参照抗体を比較のために示す。いずれの抗体もモックトランスフェクト細胞に結合しない（図１Ｃ）。
【0165】
実施例５：Ｈ１２９９増殖アッセイにおける抗ＡＸＬ抗体のインビトロ機能活性スクリーニング
この実施例には、抗ＡＸＬモノクローナル抗体のパネルのインビトロ機能スクリーニングが、ＧＡＳ６リガンドの非存在又は存在におけるそれらの機能性を特徴付ける目的で、記載されている。抗体を、ＡＸＬ発現Ｈ１２９９がん細胞株において、ＧＡＳ６誘導性増殖を阻害するそれらの能力について、ならびにＧＡＳ６の非存在におけるそれらのアゴニスト活性について評価した。参照抗体類似体を比較のために含めた。
この実施例には、抗ＡＸＬモノクローナル抗体のパネルのインビトロ機能スクリーニングが、ＧＡＳ６リガンドの非存在又は存在におけるそれらの機能性を特徴付ける目的で、記載されている。抗体を、ＡＸＬ発現Ｈ１２９９がん細胞株において、ＧＡＳ６誘導性増殖を阻害するそれらの能力について、ならびにＧＡＳ６の非存在におけるそれらのアゴニスト活性について評価した。参照抗体類似体を比較のために含めた。
【0166】
材料及び方法
選択された抗ＡＸＬ抗体を、ＡＸＬ発現がん細胞株Ｈ１２９９の増殖を阻害するそれらの能力についてインビトロで評価した。Ｈ１２９９細胞を、３８４ウェルプレートにおいて、２%ＦＢＳ及び１%Ｐ／Ｓを添加したRPMI 1640 GlutamaX培地中に２５００個細胞／ウェルで播種し、３７℃の加湿インキュベーター中で６日間にわたり、２５μg/mLまでの濃度の抗体とともに、ＧＡＳ６を伴わずに、又は１μg/mLのＧＡＳ６（RnD Systems）の存在においてインキュベートした。細胞増殖を、製造元の指示に従って、ＷＳＴ－１細胞増殖試薬（Roche）を使用して定量化した。いくつかの競合類似体（Ａｘ２２５ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ類似体（Chugai）、ＹＷ３２７．６Ｓ２ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ類似体（Genentech）、及び１０Ｇ５ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ類似体（BerGenBio））を比較のために含めた。
選択された抗ＡＸＬ抗体を、ＡＸＬ発現がん細胞株Ｈ１２９９の増殖を阻害するそれらの能力についてインビトロで評価した。Ｈ１２９９細胞を、３８４ウェルプレートにおいて、２%ＦＢＳ及び１%Ｐ／Ｓを添加したRPMI 1640 GlutamaX培地中に２５００個細胞／ウェルで播種し、３７℃の加湿インキュベーター中で６日間にわたり、２５μg/mLまでの濃度の抗体とともに、ＧＡＳ６を伴わずに、又は１μg/mLのＧＡＳ６（RnD Systems）の存在においてインキュベートした。細胞増殖を、製造元の指示に従って、ＷＳＴ－１細胞増殖試薬（Roche）を使用して定量化した。いくつかの競合類似体（Ａｘ２２５ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ類似体（Chugai）、ＹＷ３２７．６Ｓ２ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ類似体（Genentech）、及び１０Ｇ５ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ類似体（BerGenBio））を比較のために含めた。
【0167】
結果
増殖スクリーニングからの結果を図２において示す。抗体を、機能的な読み出しに基づいて分離できることは明らかである。検証した競合類似体のうち、１０Ｇ５ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（BerGenBio）及びＹＷ３２７．６Ｓ２ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Genentech）が明確なアゴニスト活性を呈した一方で、Ａｘ２２５ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Chugai）はＧＡＳ６の非存在又は存在において活性を呈さなかった。
増殖スクリーニングからの結果を図２において示す。抗体を、機能的な読み出しに基づいて分離できることは明らかである。検証した競合類似体のうち、１０Ｇ５ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（BerGenBio）及びＹＷ３２７．６Ｓ２ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Genentech）が明確なアゴニスト活性を呈した一方で、Ａｘ２２５ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Chugai）はＧＡＳ６の非存在又は存在において活性を呈さなかった。
【0168】
ＧＡＳ６の非存在においてアゴニズムを示さない抗体を、ＧＡＳ６誘導性増殖の顕著な反作用又は増強のいずれかを伴う希少な抗体に重点を置いて、さらなる機能的特徴付けのために選択した（図中で、点線ボックスで示す）。
【0169】
実施例６：Ｈ１２９９増殖アッセイにおける抗ＡＸＬ抗体のインビトロ機能活性
この実施例によって、用量依存的アンタゴニスト活性を実証する目的で、６つの抗ＡＸＬモノクローナル抗体のインビトロ機能評価が記載される。抗体を、ＡＸＬ発現Ｈ１２９９細胞株において、ＧＡＳ６誘導性増殖を阻害するそれらの能力について、ならびにＧＡＳ６の非存在におけるそれらのアゴニスト活性について評価した。参照抗体類似体を比較のために含めた。
この実施例によって、用量依存的アンタゴニスト活性を実証する目的で、６つの抗ＡＸＬモノクローナル抗体のインビトロ機能評価が記載される。抗体を、ＡＸＬ発現Ｈ１２９９細胞株において、ＧＡＳ６誘導性増殖を阻害するそれらの能力について、ならびにＧＡＳ６の非存在におけるそれらのアゴニスト活性について評価した。参照抗体類似体を比較のために含めた。
【0170】
材料及び方法
選択された抗ＡＸＬ抗体を、ＡＸＬ発現がん細胞株Ｈ１２９９の増殖を誘導するそれらの能力についてインビトロでさらに詳細に評価した。Ｈ１２９９細胞を、２%ＦＢＳ及び１%Ｐ／Ｓを添加したRPMI 1640 Glutamax培地中に播種し、ＧＡＳ６を伴わずに又は１μg/mLのＧＡＳ６（RnD Systems）の存在において、２５μg/mLから開始する、示した抗体の２倍滴定で６日間にわたりインキュベートした。細胞増殖を、製造元の指示に従って、ＷＳＴ－１細胞増殖試薬（Roche）を使用して定量化した。
選択された抗ＡＸＬ抗体を、ＡＸＬ発現がん細胞株Ｈ１２９９の増殖を誘導するそれらの能力についてインビトロでさらに詳細に評価した。Ｈ１２９９細胞を、２%ＦＢＳ及び１%Ｐ／Ｓを添加したRPMI 1640 Glutamax培地中に播種し、ＧＡＳ６を伴わずに又は１μg/mLのＧＡＳ６（RnD Systems）の存在において、２５μg/mLから開始する、示した抗体の２倍滴定で６日間にわたりインキュベートした。細胞増殖を、製造元の指示に従って、ＷＳＴ－１細胞増殖試薬（Roche）を使用して定量化した。
【0171】
結果
６つの抗ＡＸＬ抗体を、ＡＸＬ発現Ｈ１２９９細胞株のＧＡＳ６誘導性増殖を阻害するそれらの能力について、ならびにＧＡＳ６の非存在におけるそれらのアゴニスト活性について評価した（図３）。抗体の４つ（２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、及び２３２０３＿４）が、Ｈ１２９９細胞のＧＡＳ６誘導性増殖を効率的にブロックするそれらの能力（上パネル）により、及びＧＡＳ６の非存在におけるアゴニスト活性のそれらの欠如（下パネル）により示されるように、用量依存的なアンタゴニスト活性を示した。他のテストされた抗体のいずれも、ＧＡＳ６誘導性増殖をブロックすることはできなかった（上パネル）。ＹＷ３２７．６Ｓ２ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ類似体及びＡｘ２２５ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ類似体は、増殖の強い誘導により示されるように（下パネル）、ＧＡＳ６の非存在においてアゴニストであった。
６つの抗ＡＸＬ抗体を、ＡＸＬ発現Ｈ１２９９細胞株のＧＡＳ６誘導性増殖を阻害するそれらの能力について、ならびにＧＡＳ６の非存在におけるそれらのアゴニスト活性について評価した（図３）。抗体の４つ（２３２０３＿１、２３２０３＿２、２３２０３＿３、及び２３２０３＿４）が、Ｈ１２９９細胞のＧＡＳ６誘導性増殖を効率的にブロックするそれらの能力（上パネル）により、及びＧＡＳ６の非存在におけるアゴニスト活性のそれらの欠如（下パネル）により示されるように、用量依存的なアンタゴニスト活性を示した。他のテストされた抗体のいずれも、ＧＡＳ６誘導性増殖をブロックすることはできなかった（上パネル）。ＹＷ３２７．６Ｓ２ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ類似体及びＡｘ２２５ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ類似体は、増殖の強い誘導により示されるように（下パネル）、ＧＡＳ６の非存在においてアゴニストであった。
【0172】
実施例７：リポソーム取り込みアッセイにおける抗ＡＸＬ抗体のインビトロ機能活性
この実施例では、用量依存的なアンタゴニスト活性を実証する目的で、６つの抗ＡＸＬモノクローナル抗体のインビトロ機能評価が記載されている。
この実施例では、用量依存的なアンタゴニスト活性を実証する目的で、６つの抗ＡＸＬモノクローナル抗体のインビトロ機能評価が記載されている。
【0173】
材料及び方法
選択された抗ＡＸＬ抗体及び参照抗体類似体を、外因性ＡＸＬを安定的に発現するＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＡＸＬ細胞におけるホスファチジルセリン含有リポソームのＧＡＳ６誘導性取り込みを阻害するそれらの能力について、インビトロでさらに詳細に評価した。リポソームを、脂質 ＰＯＰＣ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン；４３%）、ＤＯＰＳ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）；１１%）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン；５%）、コレステロール（４０%）、ＤＯＰＥ－ＮＢＤ（１，２－ジオレオイル－－｛１２－［（７－ニトロ－２－１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル）アミノ］ドデカノイル｝－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン；１%）（Avanti Polar Lipids）のモル比で混合及び水和させること、それに続く凍結／解凍サイクル及びヌクレオポアフィルター（４００nm、Millipore）を通じた押出により、（Ishimoto, Biochem. 127(3):411-7 (2000)）に本質的に記載されている通りに調整した。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＡＸＬ細胞を、アッセイの１日前に、２%ＦＢＳ及び１%Ｐ／Ｓを伴うＤＭＥＭ中に播種した。翌日、ＧＡＳ６（R&D Systems、１μg/mL）、リポソーム（２５μM）、抗ＡＸＬ抗体、及び参照抗体、ならびにコントロール抗体を細胞に加えた。抗体を６μg/mLから４倍に滴定した。取り込みを、IncuCyte自動顕微鏡プラットフォームを使用して測定及び分析した。
選択された抗ＡＸＬ抗体及び参照抗体類似体を、外因性ＡＸＬを安定的に発現するＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＡＸＬ細胞におけるホスファチジルセリン含有リポソームのＧＡＳ６誘導性取り込みを阻害するそれらの能力について、インビトロでさらに詳細に評価した。リポソームを、脂質 ＰＯＰＣ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン；４３%）、ＤＯＰＳ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）；１１%）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン；５%）、コレステロール（４０%）、ＤＯＰＥ－ＮＢＤ（１，２－ジオレオイル－－｛１２－［（７－ニトロ－２－１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル）アミノ］ドデカノイル｝－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン；１%）（Avanti Polar Lipids）のモル比で混合及び水和させること、それに続く凍結／解凍サイクル及びヌクレオポアフィルター（４００nm、Millipore）を通じた押出により、（Ishimoto, Biochem. 127(3):411-7 (2000)）に本質的に記載されている通りに調整した。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＡＸＬ細胞を、アッセイの１日前に、２%ＦＢＳ及び１%Ｐ／Ｓを伴うＤＭＥＭ中に播種した。翌日、ＧＡＳ６（R&D Systems、１μg/mL）、リポソーム（２５μM）、抗ＡＸＬ抗体、及び参照抗体、ならびにコントロール抗体を細胞に加えた。抗体を６μg/mLから４倍に滴定した。取り込みを、IncuCyte自動顕微鏡プラットフォームを使用して測定及び分析した。
【0174】
結果
リポソーム取り込みアッセイからの結果を図４中に示す。抗ＡＸＬ抗体の阻害機能が濃度依存的であること、及び全ての抗体が、効力及び有効性は変動するものの、ホスファチジルセリン含有リポソームのＧＡＳ６誘導性取り込みを阻害していることは明らかである。ＹＷ３２７．６Ｓ２ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Genentech）類似体がアンタゴニスト活性を示す一方で、Ａｘ２２５ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Chugai）類似体及び１０Ｇ５ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（BerGenBio）類似体は機能性を示さない。
リポソーム取り込みアッセイからの結果を図４中に示す。抗ＡＸＬ抗体の阻害機能が濃度依存的であること、及び全ての抗体が、効力及び有効性は変動するものの、ホスファチジルセリン含有リポソームのＧＡＳ６誘導性取り込みを阻害していることは明らかである。ＹＷ３２７．６Ｓ２ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Genentech）類似体がアンタゴニスト活性を示す一方で、Ａｘ２２５ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Chugai）類似体及び１０Ｇ５ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（BerGenBio）類似体は機能性を示さない。
【0175】
実施例８：異種腫瘍モデルにおける抗ＡＸＬ抗体のインビボ有効性
この実施例では、異種腫瘍モデルにおける抗体２２９９５及び２３２０３＿２のインビボ有効性を実証する。
この実施例では、異種腫瘍モデルにおける抗体２２９９５及び２３２０３＿２のインビボ有効性を実証する。
【0176】
材料及び方法
１×１０７個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳がん細胞を、マトリゲルと一緒に６～８週齢の雌ＮＯＤ．Ｓｃｉｄマウスの側腹部中に皮下接種した。腫瘍を週３回キャリパーにより２次元で測定し、腫瘍容積（mm3）を式：（幅）２×長さ×０．５に従って算出した。４０mm3の平均腫瘍サイズで、マウスを無作為化し、処置を開始した。マウスを、ビヒクル緩衝液あるいは２つのモノクローナル抗体２２９９５又は２３２０３＿２のいずれか１つの腹腔内注射による合計６回の処置を週３回処置し、その後に観察期間が続いた。抗体処置は１０mg/kg又は５０mg/kgで投薬した。ボンフェローニの多重比較検定を用いた二元ＡＮＯＶＡを適用し、処置群間の各々の時間点での腫瘍容積を比較した。統計分析を、GraphPad Prismバージョン５．０（GraphPad Software, Inc.）を使用して実施した。
１×１０７個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳がん細胞を、マトリゲルと一緒に６～８週齢の雌ＮＯＤ．Ｓｃｉｄマウスの側腹部中に皮下接種した。腫瘍を週３回キャリパーにより２次元で測定し、腫瘍容積（mm3）を式：（幅）２×長さ×０．５に従って算出した。４０mm3の平均腫瘍サイズで、マウスを無作為化し、処置を開始した。マウスを、ビヒクル緩衝液あるいは２つのモノクローナル抗体２２９９５又は２３２０３＿２のいずれか１つの腹腔内注射による合計６回の処置を週３回処置し、その後に観察期間が続いた。抗体処置は１０mg/kg又は５０mg/kgで投薬した。ボンフェローニの多重比較検定を用いた二元ＡＮＯＶＡを適用し、処置群間の各々の時間点での腫瘍容積を比較した。統計分析を、GraphPad Prismバージョン５．０（GraphPad Software, Inc.）を使用して実施した。
【0177】
結果
接種後２０日目に、４０mm3の平均腫瘍サイズで、マウスを１０匹の動物の５つの群に無作為化し、処置を開始した。結果では、テストした腫瘍モデルにおいて、ＡＸＬに対する両方のモノクローナル抗体（２２９９５及び２３２０３＿２）の顕著な腫瘍阻害効果が示された（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）（図５Ａ及び５Ｂ）。
接種後２０日目に、４０mm3の平均腫瘍サイズで、マウスを１０匹の動物の５つの群に無作為化し、処置を開始した。結果では、テストした腫瘍モデルにおいて、ＡＸＬに対する両方のモノクローナル抗体（２２９９５及び２３２０３＿２）の顕著な腫瘍阻害効果が示された（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）（図５Ａ及び５Ｂ）。
【0178】
実施例９：抗ＡＸＬ抗体のエピトープビニング
この実施例では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された、抗ＡＸＬ抗体２３２０３－１、２２９９５、及び２２８８３、ならびに１０Ｇ５及びＹＷ３２７．６Ｓ２ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ類似体の交差競合分析が記載されている。抗体間の非ブロッキング関係は、それらがＡＸＬの異なるエピトープを認識することを示す。
この実施例では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された、抗ＡＸＬ抗体２３２０３－１、２２９９５、及び２２８８３、ならびに１０Ｇ５及びＹＷ３２７．６Ｓ２ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ類似体の交差競合分析が記載されている。抗体間の非ブロッキング関係は、それらがＡＸＬの異なるエピトープを認識することを示す。
【0179】
材料及び方法
対合抗体競合の研究を、IBIS-MX96機器（IBIS、オランダ）を使用し、ＳＰＲにより実施した。抗ＡＸＬ抗体を、連続フローマイクロスポッターを使用して１５分間にわたり捕捉することにより、G-a-hu-IgGFcSensEye（登録商標）上にスポットし、その後にハーセプチン（トラスツズマブ）による残留結合部位のブロッキング及びSensEye FixItキット（ＩＢＩＳ、オランダ）による化学的架橋が続いた。センサー調製後、抗体競合分析を、古典的なサンドイッチアッセイを使用して実施した。組換えＡＸＬ－Ｈｉｓ ＥＣＤ抗原を１００nM濃度でインジェクションし、抗ＡＸＬ抗体のコンジュゲートアレイにより捕捉した。次に、泳動緩衝液中で１００nMに希釈したＡＸＬ抗体の各々の個別のインジェクションを実施し、抗体競合パターンを確立した。組換えＡＸＬリガンド、ＧＡＳ６（１００nM）を分析物として含めて、リガンドブロッキング抗体を特徴付けた。データを、エピトープビニング２．０（Wasatch、米国）により分析した。
対合抗体競合の研究を、IBIS-MX96機器（IBIS、オランダ）を使用し、ＳＰＲにより実施した。抗ＡＸＬ抗体を、連続フローマイクロスポッターを使用して１５分間にわたり捕捉することにより、G-a-hu-IgGFcSensEye（登録商標）上にスポットし、その後にハーセプチン（トラスツズマブ）による残留結合部位のブロッキング及びSensEye FixItキット（ＩＢＩＳ、オランダ）による化学的架橋が続いた。センサー調製後、抗体競合分析を、古典的なサンドイッチアッセイを使用して実施した。組換えＡＸＬ－Ｈｉｓ ＥＣＤ抗原を１００nM濃度でインジェクションし、抗ＡＸＬ抗体のコンジュゲートアレイにより捕捉した。次に、泳動緩衝液中で１００nMに希釈したＡＸＬ抗体の各々の個別のインジェクションを実施し、抗体競合パターンを確立した。組換えＡＸＬリガンド、ＧＡＳ６（１００nM）を分析物として含めて、リガンドブロッキング抗体を特徴付けた。データを、エピトープビニング２．０（Wasatch、米国）により分析した。
【0180】
結果
図６は、バイオセンサー表面上の固定化抗ＡＸＬ抗体のアレイに予め結合されたＡＸＬ ＥＣＤへの、示した抗体又はＡＸＬリガンド、ＧＡＳ６の結合についての標準化された値を示す。固定化された抗体を行として、溶液中の抗体を列として表す。非ブロッキング（サンドイッチ）抗体を白色として示し、及びブロッキング抗体を灰色として示す。
図６は、バイオセンサー表面上の固定化抗ＡＸＬ抗体のアレイに予め結合されたＡＸＬ ＥＣＤへの、示した抗体又はＡＸＬリガンド、ＧＡＳ６の結合についての標準化された値を示す。固定化された抗体を行として、溶液中の抗体を列として表す。非ブロッキング（サンドイッチ）抗体を白色として示し、及びブロッキング抗体を灰色として示す。
【0181】
１０Ｇ５及びＹＷ３２７．６Ｓ２類似体が、両方向においてテストされ、自己ブロックした。テストした抗体の全てがＧＡＳ６をブロックした（リガンドをブロックしないことが公知であるコントロール抗体を除く）。テストした抗体２２９９５、２３２０３－１、及び２２８８３のいずれも、ＹＷ３２７．６Ｓ２ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ類似体と競合せず、１つの抗体２２８８３だけが１０Ｇ５類似体と競合した。
【0182】
結論として、データによって、抗体２２９９５及び２３２０３－１が、１０Ｇ５及びＹＷ３２７．６Ｓ２ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ類似体とは異なるＡＸＬ ＥＣＤ上のエピトープを認識することが示されている。
【0183】
実施例１０：キメラＡＸＬドメイン変異体に結合する抗ＡＸＬ抗体
この実施例では、マウスＡＸＬ配列のドメインがヒトＡＸＬ配列と交換された組換えキメラＡＸＬ ＥＣＤへの抗ＡＸＬ抗体の結合が記載されている。キメラタンパク質への抗ＡＸＬ抗体の結合をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により測定し、抗体２３２０３－１、２２９９５、１０Ｇ５類似体、及びＹＷ３２７．６Ｓ２ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ類似体により結合されたＡＸＬドメインを決定した。
この実施例では、マウスＡＸＬ配列のドメインがヒトＡＸＬ配列と交換された組換えキメラＡＸＬ ＥＣＤへの抗ＡＸＬ抗体の結合が記載されている。キメラタンパク質への抗ＡＸＬ抗体の結合をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により測定し、抗体２３２０３－１、２２９９５、１０Ｇ５類似体、及びＹＷ３２７．６Ｓ２ ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ類似体により結合されたＡＸＬドメインを決定した。
【0184】
材料及び方法
ヒト及びマウスＡＸＬのタンパク質配列を、UniProtからダウンロードした（それぞれ受入番号Ｐ３０５３０及びＱ８０ＹＱ３）。キメラタンパク質を、マウスＡＸＬ ＥＣＤ中のＩｇ１～２及びＦｎ－１～２を、図７において示すようにヒト対応物で置換することにより生成した。Ｈｉｓタグ付き野生型及び変異型ヒトＡＸＬコンストラクトを標準的な遺伝子合成技術により生成し、タンパク質を、ExpiCHO（商標）発現システムを使用して一過性に発現させた。捕捉されたキメラタンパク質への抗体結合を、Octet QK384機器を使用して、ＢＬＩにより測定した。Ｈｉｓタグ付きキメラタンパク質は、事前に平衡化されたAnti-Penta-HIS（ＨＩＳ１Ｋ）バイオセンサー（Sartorius）により１０分間にわたり上清から捕捉された。抗ＡＸＬ抗体の会合を、飽和条件で１０分間にわたり測定した。センサーを、５秒間×３にわたる１０mMグリシンｐＨ１．５中で再生した。データを、参照表面レベルを差し引くことによりForteBio Data Analysis 8.2において分析し、及び応答を抗体会合の最後に定量化した。
ヒト及びマウスＡＸＬのタンパク質配列を、UniProtからダウンロードした（それぞれ受入番号Ｐ３０５３０及びＱ８０ＹＱ３）。キメラタンパク質を、マウスＡＸＬ ＥＣＤ中のＩｇ１～２及びＦｎ－１～２を、図７において示すようにヒト対応物で置換することにより生成した。Ｈｉｓタグ付き野生型及び変異型ヒトＡＸＬコンストラクトを標準的な遺伝子合成技術により生成し、タンパク質を、ExpiCHO（商標）発現システムを使用して一過性に発現させた。捕捉されたキメラタンパク質への抗体結合を、Octet QK384機器を使用して、ＢＬＩにより測定した。Ｈｉｓタグ付きキメラタンパク質は、事前に平衡化されたAnti-Penta-HIS（ＨＩＳ１Ｋ）バイオセンサー（Sartorius）により１０分間にわたり上清から捕捉された。抗ＡＸＬ抗体の会合を、飽和条件で１０分間にわたり測定した。センサーを、５秒間×３にわたる１０mMグリシンｐＨ１．５中で再生した。データを、参照表面レベルを差し引くことによりForteBio Data Analysis 8.2において分析し、及び応答を抗体会合の最後に定量化した。
【0185】
結果
図７は、捕捉されたキメラヒト／マウスＡＸＬ ＥＣＤタンパク質への、示した抗体の結合の標準化された応答（nm）を示す。
図７は、捕捉されたキメラヒト／マウスＡＸＬ ＥＣＤタンパク質への、示した抗体の結合の標準化された応答（nm）を示す。
【0186】
全ての抗体が、２つのイムノグロブリン様（Ｉｇ１及びＩｇ２）ドメイン、それに続く２つのフィブロネクチン３型様ドメイン（Ｆｎ１及びＦｎ２）からなる全長ヒトＡＸＬ ＥＣＤ（ＨｕＡｘｌ＿ＥＣＤ）に結合した。ＹＷ３２７．６Ｓ２類似体はマウスＡＸＬと交差反応性であり、全てのキメラタンパク質に結合し、タンパク質コンストラクトが一般的に機能的であることを実証する（Ye et al., Oncogene 29:5254-5264 (2010)）。抗体２２９９５及び１０Ｇ５類似体の両方が、ＡＸＬのＩｇ１ドメインに結合した一方で、抗体２３２０３－１はＩｇ２ドメインに結合した。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【配列表】