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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-11-17
(45)【発行日】2025-11-26
(54)【発明の名称】化学修飾核酸を導入した安定型標的編集ガイドＲＮＡ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20251118BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20251118BHJP
C07H 21/02 20060101ALI20251118BHJP
A61K 31/7115 20060101ALI20251118BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20251118BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20251118BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20251118BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
C12N15/11 Z ZNA
C07H21/02
A61K31/7115
A61K31/7125
A61K48/00
A61P43/00 111
【請求項の数】
26
(21)【出願番号】P 2021524908
(86)(22)【出願日】2020-06-04
(86)【国際出願番号】 JP2020022200
(87)【国際公開番号】W WO2020246560
(87)【国際公開日】2020-12-10
【審査請求日】2023-05-09
(31)【優先権主張番号】P 2019105532
(32)【優先日】2019-06-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2019148463
(32)【優先日】2019-08-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】598015084
【氏名又は名称】学校法人福岡大学
(73)【特許権者】
【識別番号】307010166
【氏名又は名称】第一三共株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100145104
【弁理士】
【氏名又は名称】膝舘 祥治
(72)【発明者】
【氏名】福田 将虎
(72)【発明者】
【氏名】小泉 誠
(72)【発明者】
【氏名】岩下 真三
【審査官】渡邉 潤也
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／０１０５５６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５３７６１８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５３４９４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５２０６８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５１７４２９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／２３７２４５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００５／００８０２４６（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、前記第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、
前記第二オリゴヌクレオチドと相補対を形成し得る第三オリゴヌクレオチドと、
前記第二オリゴヌクレオチドと第三オリゴヌクレオチドとを連結する第一連結部とを含み、
前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、
前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１２から３０残基のオリゴヌクレオチドと、
前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、すべてのヌクレオチド残基がホスホロチオエート結合で連結されて構成され、
前記第二オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、
前記第三オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、
前記標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域から選択される少なくとも１残基は、天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基であり、
前記第一連結部は、１から８のアルキレンオキシ単位からなるポリアルキレンオキシ基のみからなり、
前記第一オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基及び架橋型ヌクレオチド残基からなる群から選択される２種の修飾オリゴヌクレオチド残基が交互に連結する塩基配列を有し、
前記第二オリゴヌクレオチドおよび第三オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連結する塩基配列を有し、
前記第三オリゴヌクレオチドは、すべてのヌクレオチド残基がホスホロチオエート結合で連結されてなる、
前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項2】
前記第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの間に、アルキレンオキシ単位を含む第二連結部を含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項3】
前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側及び５’側の各１残基のうち少なくとも１残基は、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、及び２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基からなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基である請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項4】
前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する請求項１から３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項5】
前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチドから５’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基である請求項４に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項6】
前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、架橋型ヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する請求項１から３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項7】
前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチドから５’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が架橋型ヌクレオチド残基である請求項６に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項8】
前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する請求項１から３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項9】
前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチドから５’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基である請求項８に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項10】
前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連結する塩基配列を有する請求項１から９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項11】
前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する請求項１から９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項12】
前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、４から６残基からなる請求項１から１１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項13】
前記第二オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド残基がホスホロチオエート結合で連結されてなる請求項１から１２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項14】
前記部位特異的編集は、アデノシンデアミナーゼによる酵素反応に起因する請求項１から１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項15】
請求項１から１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を含有する医薬。
【請求項16】
請求項１から１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を含有する遺伝性疾患治療剤。
【請求項17】
請求項１から１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を活性成分として含有する医薬組成物。
【請求項18】
遺伝性疾患の予防、又は治療のための請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項19】
遺伝性疾患が、標的ＲＮＡにおけるアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより治療されうる疾患である請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項20】
遺伝性疾患が、遺伝子におけるグアノシン残基からアデノシン残基への変異を原因とする遺伝性疾患である請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項21】
疾患の予防、又は治療のための医薬を製造するための請求項１から１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項22】
疾患の予防、又は治療における使用のための請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項23】
請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬理上許容される塩の薬理学的有効量を温血動物（ヒトを除く）に投与することによる疾患の予防、又は治療のための方法。
【請求項24】
疾患が遺伝性疾患である請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
遺伝性疾患が、標的ＲＮＡにおけるアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより治療されうる疾患である請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
遺伝性疾患が、遺伝子におけるグアノシン残基からアデノシン残基への変異を原因とする遺伝性疾患である請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、化学修飾核酸を導入した安定型標的編集ガイドＲＮＡに関する。
【背景技術】
【0002】
ゲノム編集技術の開発を契機として、生物の設計図である遺伝情報、つまりは細胞内のＤＮＡ情報を改変することで生命現象をコントロールする方法が、疾患治療アプローチとして医療及び創薬分野で用いられ始めている。ＤＮＡは細胞内で恒常的且つ不変的な分子であるため、ＤＮＡ改変効果は対象細胞又は対象生物に永続的に残り続ける。一方、ＲＮＡはＤＮＡ情報が写し取られた核酸分子であり、ＤＮＡとは異なり、合成・分解が繰り返される一過的な遺伝情報分子である。従ってＲＮＡ情報の改変は対象生物に永続的ではない一時的な遺伝情報改変効果を与えることができる。つまり、ＲＮＡ改変技術はＤＮＡ改変と同じく遺伝子改変技術ではあるものの、その性質は大きく異なる。
【0003】
ＲＮＡ改変技術として、例えば、特許文献１には、標的ＲＮＡの一部に相補的なアンチセンス配列を含む標的指向性部分と、細胞に存在し、ヌクレオチドの編集を行うことができるＲＮＡ編集実体に結合してリクルートすることができるリクルート部分とを含む、標的ＲＮＡ配列中のヌクレオチドの部位特異的編集のためのオリゴヌクレオチド構築物が記載されている。また例えば、特許文献２には、標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡとの複合体に二本鎖特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を作用させる部位特異的ＲＮＡ変異導入方法が記載されている。また非特許文献１には、ＡＤＡＲをリクルートするアンチセンスオリゴヌクレオチドに修飾核酸を導入することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】国際公開第２０１６／０９７２１２号
【文献】国際公開第２０１７／０１０５５６号
【非特許文献】
【0005】
【文献】Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３７，１３３-１３８（２０１９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
特許文献１に記載のオリゴヌクレオチド構築物は、標的指向性部位に加えて、リクルート部分として特定の反復配列を有するステムループ構造を有しており、リクルート部分には１６以上のオリゴヌクレオチドを必要とする。また特許文献２に記載の標的編集ガイドＲＮＡは、アンチセンス領域に加えて、４０又は４９残基の特定配列からなるステムループ構造を有するＡＤＡＲ結合領域を必要とする。特許文献１又は２に記載のＲＮＡ改変技術に適用されるオリゴヌクレオチドは、いずれも標的ＲＮＡと二重鎖を形成する部位に加えて、ＡＤＡＲと結合するためのある程度の長さを有する分子内二本鎖領域が必須であり、必然的にオリゴヌクレオチドとしての全長が長くなる傾向があった。
【0007】
本発明の一態様は、標的認識部位に付加されるヌクレオチド数が少なく、生体内における安定性に優れ、細胞内において部位特異的編集を誘導可能な標的編集ガイドＲＮＡを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りであり、本発明は以下の態様を包含する。
（１－１）標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、前記第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、前記第二オリゴヌクレオチドと相補対を形成し得る第三オリゴヌクレオチドと、前記第二オリゴヌクレオチドと第三オリゴヌクレオチドとを連結する第一連結部とを含み、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から３０残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記第三オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域から選択される少なくとも１残基は、天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基であり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
（１－１）標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、前記第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、前記第二オリゴヌクレオチドと相補対を形成し得る第三オリゴヌクレオチドと、前記第二オリゴヌクレオチドと第三オリゴヌクレオチドとを連結する第一連結部とを含み、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から３０残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記第三オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域から選択される少なくとも１残基は、天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基であり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0009】
（１－２）前記第一連結部は、４又は５残基のオリゴヌクレオチド、及び１から８のアルキレンオキシ単位からなるポリアルキレンオキシ基からなる群から選択される少なくとも１種を含む（１－１）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0010】
（１－３） 前記第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの間に、アルキレンオキシ単位を含む第二連結部を含む（１－１）又は（１－２）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0011】
（１－４） 前記第一オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含む（１－１）から（１－３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0012】
（１－５） 前記第一オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、架橋型ヌクレオチド残基、及び２’－デオキシリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基を含む（１－１）から（１－４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0013】
（１－６） 前記カウンタ領域は、ホスホロチオエート結合を含む（１－１）から（１－５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0014】
（１－７） 前記標的対応ヌクレオチド残基が、ホスホロチオエート結合を含む（１－１）から（１－６）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0015】
（１－８） 前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側及び５’側の各１残基のうち少なくとも１残基は、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、及び２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基からなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基である（１－１）から（１－７）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0016】
（１－９） 前記第二オリゴヌクレオチド及び第三オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’－デオキシリボヌクレオチド残基からなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基を含む（１－１）から（１－８）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0017】
（１－１０） 前記部位特異的編集は、アデノシンデアミナーゼによる酵素反応に起因する（１－１）から（１－９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0018】
（１－１１） （１－１）から（１－１０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を含有する医薬。
【0019】
（１－１２） （１－１）から（１－１０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を含有する遺伝性疾患治療剤。
【0020】
（１－１３） （１－１）から（１－１０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を活性成分として含有する医薬組成物。
【0021】
（１－１４） 遺伝性疾患の予防、又は治療のための（１－１３）に記載の医薬組成物。
【0022】
（１－１５） 遺伝性疾患が、標的ＲＮＡにおけるアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより治療されうる疾患である（１－１４）に記載の医薬組成物。
【0023】
（１－１６） 遺伝性疾患が、遺伝子におけるグアノシン残基からアデノシン残基への変異を原因とする遺伝性疾患である（１－１４）に記載の医薬組成物。
【0024】
（１－１７） 疾患の予防、又は治療のための医薬を製造するための（１－１）から（１－１０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩の使用。
【0025】
（１－１８） 疾患の予防、又は治療における使用のための（１－１）から（１－１０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0026】
（２－１） 標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、前記第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、前記第二オリゴヌクレオチドと相補対を形成し得る第三オリゴヌクレオチドと、前記第二オリゴヌクレオチドと第三オリゴヌクレオチドとを連結する第一連結部とを含み、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から３０残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記第三オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域から選択される少なくとも１残基は、天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基であり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0027】
（２－２） 前記第一連結部は、４又は５残基のオリゴヌクレオチド、及び１から８のアルキレンオキシ単位からなるポリアルキレンオキシ基からなる群から選択される少なくとも１種を含む（２－１）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0028】
（２－３） 前記第一連結部が、ＧＣＵＡＡ、ＵＵＣＧ、ＵＡＣＧ、ＵＧＣＧ、ＵＣＣＧ、ＧＡＡＡ、ＧＵＡＡ、ＧＣＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＡＧＡ、ＧＵＧＡ、ＧＣＧＡ、及びＧＧＧＡからなる群から選択される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む（２－２）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0029】
（２－４） 前記第一連結部が、１から８のエチレンオキシ単位からなるポリエチレンオキシ基を含む（２－１）又は（２－３）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0030】
（２－５） 前記第一連結部が、ヘキサエチレンオキシ基を含む（２－４）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0031】
（２－６） 前記第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの間に、アルキレンオキシ単位を含む第二連結部を含む（２－１）から（２－５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0032】
（２－７） 第二連結部が、炭素数３から６のアルキレンオキシ基を含む（２－６）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0033】
（２－８） 第二連結部が、６のエチレンオキシ単位からなるヘキサエチレンオキシ基を含む（２－６）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0034】
（２－９） 前記第一オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含む（２－１）から（２－８）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0035】
（２－１０） 前記第一オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、架橋型ヌクレオチド残基、及び２’－デオキシリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチドを含む（２－１）から（２－９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0036】
（２－１１） 前記第一オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、架橋型ヌクレオチド残基、及び２’－デオキシリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチドを含む（２－１）から（２－９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0037】
（２－１２） 前記カウンタ領域は、ホスホロチオエート結合を含む（２－１）から（２－１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0038】
（２－１３） 前記標的対応ヌクレオチド残基が、ホスホロチオエート結合を含む（２－１）から（２－１２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0039】
（２－１４） 前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側及び５’側の各１残基のうち少なくとも１残基は、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、及び２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基からなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基である（２－１）から（２－１３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0040】
（２－１５） 前記第二オリゴヌクレオチド及び第三オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’－デオキシリボヌクレオチド残基からなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基を含む（２－１）から（２－１４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0041】
（２－１６） 前記第二オリゴヌクレオチド及び第三オリゴヌクレオチドが、全て２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドからなる（２－１５）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0042】
（２－１７） 前記第二オリゴヌクレオチドがＧＧＧＵＧＧの塩基配列を有し、前記第三オリゴヌクレオチドがＣＣＡＣＣＵの塩基配列を有する（２－１５）又は（２－１６）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0043】
（２－１８） 標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、
前記第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、
前記第二オリゴヌクレオチドと相補対を形成し得る第三オリゴヌクレオチドと、
前記第二オリゴヌクレオチドと第三オリゴヌクレオチドとを連結する第一連結部とを含み、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から３０残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記第三オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記第二オリゴヌクレオチド及び第三オリゴヌクレオチドは、全て２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチドからなり、前記標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域から選択される少なくとも１残基は、天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基であり、全てのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合であり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
前記第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、
前記第二オリゴヌクレオチドと相補対を形成し得る第三オリゴヌクレオチドと、
前記第二オリゴヌクレオチドと第三オリゴヌクレオチドとを連結する第一連結部とを含み、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から３０残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記第三オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記第二オリゴヌクレオチド及び第三オリゴヌクレオチドは、全て２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチドからなり、前記標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域から選択される少なくとも１残基は、天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基であり、全てのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合であり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0044】
（２－１９） 前記第一連結部は、４又は５残基のオリゴヌクレオチド、及び２から８のアルキレンオキシ単位からなるポリアルキレンオキシ基からなる群から選択される少なくとも１種を含む（２－１８）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0045】
（２－２０） 前記第一連結部が、ＧＣＵＡＡ、ＵＵＣＧ、ＵＡＣＧ、ＵＧＣＧ、ＵＣＣＧ、ＧＡＡＡ、ＧＵＡＡ、ＧＣＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＡＧＡ、ＧＵＧＡ、ＧＣＧＡ、及びＧＧＧＡからなる群から選択される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む（２－１９）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0046】
（２－２１） 前記第一連結部が、１から８のエチレンオキシ単位からなるポリエチレンオキシ基を含む（２－１９）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0047】
（２－２２） 前記第一連結部が、ヘキサエチレンオキシ基を含む（２－２１）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0048】
（２－２３） 前記第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの間に、アルキレンオキシ単位を含む第二連結部を含む（２－１８）から（２－２２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0049】
（２－２４） 第二連結部が、炭素数３から６のアルキレンオキシ基を含む（２－２３）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0050】
（２－２５） 第二連結部が、ヘキサエチレンオキシ基を含む（２－２３）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0051】
（２－２６） 前記標的対応ヌクレオチド残基が、シチジン残基、ウリジン残基、アデノシン残基、又はそれらの誘導体である（２－１８）から（２－２５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0052】
（２－２７） 前記標的対応ヌクレオチド残基が、シチジン残基、又はその誘導体である（２－２６）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0053】
（２－２８） 前記第一オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、架橋型ヌクレオチド残基、及び２’－デオキシリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチドを含む（２－１８）から（２－２７）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0054】
（２－２９） 前記第一オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、架橋型ヌクレオチド残基、及び２’－デオキシリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチドを含む（２－１８）から（２－２７）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0055】
（２－３０） 前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側及び５’側の各１残基のうち少なくとも１残基は、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、及び２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基からなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基である（２－１８）から（２－２９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0056】
（２－３１） 前記第二オリゴヌクレオチドがＧＧＧＵＧＧの塩基配列を有し、前記第三オリゴヌクレオチドがＣＣＡＣＣＵの塩基配列を有する（２－１８）から（２－３０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0057】
（２－３２） 前記部位特異的編集は、アデノシンデアミナーゼによる酵素反応に起因する（２－１）から（２－３１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0058】
（２－３３） （２－１）から（２－３２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を含有する医薬。
【0059】
（２－３４） （２－１）から（２－３２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を含有する遺伝性疾患治療剤。
【0060】
（２－３５） （２－１）から（２－３２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を活性成分として含有する医薬組成物。
【0061】
（２－３６） 疾患の予防、又は治療のための医薬を製造するための（２－１）から（２－３２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩の使用。
【0062】
（２－３７） 疾患の予防、又は治療における使用のための（２－１）から（２－３２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0063】
（２－３８） （２－１）から（２－３２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩の薬理学的有効量を温血動物に投与することによる疾患の予防、又は治療のための方法。
【0064】
（２－３９） 温血動物がヒトである（２－３８）に記載の方法。
【0065】
（３－１） 標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、前記第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、前記第二オリゴヌクレオチドと相補対を形成し得る第三オリゴヌクレオチドと、前記第二オリゴヌクレオチドと第三オリゴヌクレオチドとを連結する第一連結部とを含み、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から３０残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記第三オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域から選択される少なくとも１残基は、天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基であり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0066】
（３－２） 前記第一連結部は、４又は５残基のオリゴヌクレオチド、及び１から８のアルキレンオキシ単位からなるポリアルキレンオキシ基からなる群から選択される少なくとも１種を含む（３－１）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0067】
（３－３） 前記第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの間に、アルキレンオキシ単位を含む第二連結部を含む（３－１）又は（３－２）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0068】
（３－４） 前記第一オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含む（３－１）から（３－３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0069】
（３－５） 前記第一オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、架橋型ヌクレオチド残基、及び２’－デオキシリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基を含む（３－１）から（３－４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0070】
（３－６） 前記カウンタ領域は、ホスホロチオエート結合を含む（３－１）から（３－５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0071】
（３－７） 前記標的対応ヌクレオチド残基が、ホスホロチオエート結合を含む（３－１）から（３－６）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0072】
（３－８） 前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側及び５’側の各１残基のうち少なくとも１残基は、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、及び２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基からなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基である（３－１）から（３－７）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0073】
（３－９） 前記第二オリゴヌクレオチド及び第三オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’－デオキシリボヌクレオチド残基からなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基を含む（３－１）から（３－８）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0074】
（３－１０） 前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（３－１）から（３－９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0075】
（３－１１） 前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基から５’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基である（３－１０）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0076】
（３－１２） 前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、架橋型ヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（３－１）から（３－９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0077】
（３－１３） 前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基から５’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が架橋型ヌクレオチド残基である（３－１２）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0078】
（３－１４） 前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（３－１）から（３－９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0079】
（３－１５） 前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチドから５’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基である（３－１４）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0080】
（３－１６） 前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連結する塩基配列を有する（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0081】
（３－１７） 前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（３－１）から（３－１５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0082】
（３－１８） 前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、４から６残基からなる（３－１）から（３－１７）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩
【0083】
（３－１９） 前記第二オリゴヌクレオチド及び第三オリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連結する塩基配列を有する（３－１）から（３－１８）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0084】
（３－２０） 前記第一オリゴヌクレオチド、第二オリゴヌクレオチド及び第三オリゴヌクレオチドのそれぞれは、ヌクレオチド残基がホスホロチオエート結合で連結されてなる（３－１）から（３－１９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0085】
（３－２１） 前記部位特異的編集は、アデノシンデアミナーゼによる酵素反応に起因する（３－１）から（３－２０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0086】
（３－２２） （３－１）から（３－２１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を含有する医薬。
【0087】
（３－２３） （３－１）から（３－２１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を含有する遺伝性疾患治療剤。
【0088】
（３－２４） （３－１）から（３－２１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を活性成分として含有する医薬組成物。
【0089】
（３－２５） 遺伝性疾患の予防、又は治療のための（３－２４）に記載の医薬組成物。
【0090】
（３－２６） 遺伝性疾患が、標的ＲＮＡにおけるアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより治療されうる疾患である（３－２５）に記載の医薬組成物。
【0091】
（３－２７） 遺伝性疾患が、遺伝子におけるグアノシン残基からアデノシン残基への変異を原因とする遺伝性疾患である（３－２５）に記載の医薬組成物。
【0092】
（３－２８） 疾患の予防、又は治療のための医薬を製造するための（３－１）から（３－２１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩の使用。
【0093】
（３－２９） 疾患の予防、又は治療における使用のための（３－１）から（３－２１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0094】
（３－３０） （３－１）から（３－２９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬理上許容される塩の薬理学的有効量を温血動物に投与することによる疾患の予防、又は治療のための方法。
【0095】
（３－３１） 疾患が遺伝性疾患である（３－３０）に記載の方法。
【0096】
（３－３２） 遺伝性疾患が、標的ＲＮＡにおけるアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより治療されうる疾患である（３－３１）に記載の方法。
【0097】
（３－３３） 遺伝性疾患が、遺伝子におけるグアノシン残基からアデノシン残基への変異を原因とする遺伝性疾患である（３－３１）に記載の方法。
【0098】
（３－３４） 温血動物がヒトである（３－３０）から（３－３３）のいずれかに記載の方法。
【0099】
（４－１） 標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、前記第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、前記第二オリゴヌクレオチドと相補対を形成し得る第三オリゴヌクレオチドと、前記第二オリゴヌクレオチドと第三オリゴヌクレオチドとを連結する第一連結部とを含み、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から３０残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記第三オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域から選択される少なくとも１残基は、天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基であり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0100】
（４－２） 前記第一連結部は、４又は５残基のオリゴヌクレオチド、及び１から８のアルキレンオキシ単位からなるポリアルキレンオキシ基からなる群から選択される少なくとも１種を含む（４－１）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0101】
（４－３） 前記第一連結部が、ＧＣＵＡＡ、ＵＵＣＧ、ＵＡＣＧ、ＵＧＣＧ、ＵＣＣＧ、ＧＡＡＡ、ＧＵＡＡ、ＧＣＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＡＧＡ、ＧＵＧＡ、ＧＣＧＡ、及びＧＧＧＡからなる群から選択される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む（４－２）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0102】
（４－４） 前記第一連結部が、１から８のエチレンオキシ単位からなるポリエチレンオキシ基を含む（４－１）又は（４－３）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0103】
（４－５） 前記第一連結部が、ヘキサエチレンオキシ基を含む（４－４）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0104】
（４－６） 前記第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの間に、アルキレンオキシ単位を含む第二連結部を含む（４－１）から（４－５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0105】
（４－７） 第二連結部が、炭素数３から６のアルキレンオキシ基を含む（４－６）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0106】
（４－８） 第二連結部が、６のエチレンオキシ単位からなるヘキサエチレンオキシ基を含む（４－６）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0107】
（４－９） 前記第一オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含む（４－１）から（４－８）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0108】
（４－１０） 前記第一オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、架橋型ヌクレオチド残基、及び２’－デオキシリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチドを含む（４－１）から（４－９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0109】
（４－１１） 前記第一オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、架橋型ヌクレオチド残基、及び２’－デオキシリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチドを含む（４－１）から（４－９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0110】
（４－１２） 前記カウンタ領域は、ホスホロチオエート結合を含む（４－１）から（４－１１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0111】
（４－１３） 前記標的対応ヌクレオチド残基が、ホスホロチオエート結合を含む（４－１）から（４－１２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0112】
（４－１４） 前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側及び５’側の各１残基のうち少なくとも１残基は、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、及び２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基からなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基である（４－１）から（４－１３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0113】
（４－１５） 前記第二オリゴヌクレオチド及び第三オリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’－デオキシリボヌクレオチド残基からなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基を含む（４－１）から（４－１４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0114】
（４－１６） 前記第二オリゴヌクレオチド及び第三オリゴヌクレオチドが、全て２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドからなる（４－１５）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0115】
（４－１７） 前記第二オリゴヌクレオチドがＧＧＧＵＧＧの塩基配列を有し、前記第三オリゴヌクレオチドがＣＣＡＣＣＵの塩基配列を有する（４－１５）又は（４－１６）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0116】
（４－１８） 標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、
前記第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、
前記第二オリゴヌクレオチドと相補対を形成し得る第三オリゴヌクレオチドと、
前記第二オリゴヌクレオチドと第三オリゴヌクレオチドとを連結する第一連結部とを含み、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から３０残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記第三オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記第二オリゴヌクレオチド及び第三オリゴヌクレオチドは、全て２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチドからなり、前記標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域から選択される少なくとも１残基は、天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基であり、全てのリン酸ジエステル結合の修飾がホスホロチオエート結合であり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
前記第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、
前記第二オリゴヌクレオチドと相補対を形成し得る第三オリゴヌクレオチドと、
前記第二オリゴヌクレオチドと第三オリゴヌクレオチドとを連結する第一連結部とを含み、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から３０残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記第三オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、前記第二オリゴヌクレオチド及び第三オリゴヌクレオチドは、全て２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチドからなり、前記標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域から選択される少なくとも１残基は、天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基であり、全てのリン酸ジエステル結合の修飾がホスホロチオエート結合であり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0117】
（４－１９） 前記第一連結部は、４又は５残基のオリゴヌクレオチド、及び２から８のアルキレンオキシ単位からなるポリアルキレンオキシ基からなる群から選択される少なくとも１種を含む（４－１８）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0118】
（４－２０） 前記第一連結部が、ＧＣＵＡＡ、ＵＵＣＧ、ＵＡＣＧ、ＵＧＣＧ、ＵＣＣＧ、ＧＡＡＡ、ＧＵＡＡ、ＧＣＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＡＧＡ、ＧＵＧＡ、ＧＣＧＡ、及びＧＧＧＡからなる群から選択される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む（４－１９）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0119】
（４－２１） 前記第一連結部が、１から８のエチレンオキシ単位からなるポリエチレンオキシ基を含む（４－１９）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0120】
（４－２２） 前記第一連結部が、ヘキサエチレンオキシ基を含む（４－２１）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0121】
（４－２３） 前記第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの間に、アルキレンオキシ単位を含む第二連結部を含む（４－１８）から（４－２２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0122】
（４－２４） 第二連結部が、炭素数３から６のアルキレンオキシ基を含む（４－２３）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0123】
（４－２５） 第二連結部が、ヘキサエチレンオキシ基を含む（４－２３）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0124】
（４－２６） 前記標的対応ヌクレオチド残基が、シチジン残基、ウリジン残基、アデノシン残基、又はそれらの誘導体である（４－１８）から（４－２５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0125】
（４－２７） 前記標的対応ヌクレオチド残基が、シチジン残基、又はその誘導体である（４－２６）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0126】
（４－２８） 前記第一オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、架橋型ヌクレオチド残基、及び２’－デオキシリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチドを含む（４－１８）から（４－２７）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0127】
（４－２９） 前記第一オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド残基、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基、架橋型ヌクレオチド残基、及び２’－デオキシリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチドを含む（４－１８）から（４－２７）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0128】
（４－３０） 前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側及び５’側の各１残基のうち少なくとも１残基は、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基、及び２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド残基からなる群から選択される少なくとも１種の修飾ヌクレオチド残基である（４－１８）から（４－２９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0129】
（４－３１） 前記第二オリゴヌクレオチドがＧＧＧＵＧＧの塩基配列を有し、前記第三オリゴヌクレオチドがＣＣＡＣＣＵの塩基配列を有する（４－１８）から（４－３０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0130】
（４－３２） 前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（４－１）から（４－３１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0131】
（４－３３） 前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基から５’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基である（４－３２）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0132】
（４－３４） 前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、架橋型ヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（４－１）から（４－３１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0133】
（４－３５） 前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基から５’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が架橋型ヌクレオチド残基である（４－３４）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0134】
（４－３６） 前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（４－１）から（４－３１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0135】
（４－３７） 前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基から５’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基である（４－３６）に記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0136】
（４－３８） 前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連結する塩基配列を有する（４－１）から（４－３７）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0137】
（４－３９） 前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有する（４－１）から（４－３７）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0138】
（４－４０） 前記第一オリゴヌクレオチドにおいて、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、４から６残基からなる（４－１）から（４－３９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩
【0139】
（４－４１） 前記第二オリゴヌクレオチド及び第三オリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連結する塩基配列を有する（４－１）から（４－４０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0140】
（４－４２） 前記第一オリゴヌクレオチド、第二オリゴヌクレオチド及び第三オリゴヌクレオチドのそれぞれは、ヌクレオチド残基がホスホロチオエート結合で連結されてなる（４－１）から（４－４１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0141】
（４－４３） 前記部位特異的編集は、アデノシンデアミナーゼによる酵素反応に起因する（２－１）から（４－４２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0142】
（４－４５） （４－１）から（４－４４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を含有する医薬。
【0143】
（４－４６） （４－１）から（４－４４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を含有する遺伝性疾患治療剤。
【0144】
（４－４７） （４－１）から（４－４４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を活性成分として含有する医薬組成物。
【0145】
（４－４８） 疾患の予防、又は治療のための医薬を製造するための（４－１）から（４－４４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩の使用。
【0146】
（４－４９） 疾患の予防、又は治療における使用のための（４－１）から（４－４４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【0147】
（４－５０） （４－１）から（４－４４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩の薬理学的有効量を温血動物に投与することによる疾患の予防、又は治療のための方法。
（４－５１） 疾患が遺伝性疾患である（４－５０）に記載の方法。
（４－５２） 遺伝性疾患が、標的ＲＮＡにおけるアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより治療されうる疾患である（４－５１）に記載の方法。
（４－５３） 遺伝性疾患が、遺伝子におけるグアノシン残基からアデノシン残基への変異を原因とする遺伝性疾患である（４－５１）に記載の方法。
（４－５４） 温血動物がヒトである（４－５０）から（４－５３）のいずれかに記載の方法。
（４－５１） 疾患が遺伝性疾患である（４－５０）に記載の方法。
（４－５２） 遺伝性疾患が、標的ＲＮＡにおけるアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより治療されうる疾患である（４－５１）に記載の方法。
（４－５３） 遺伝性疾患が、遺伝子におけるグアノシン残基からアデノシン残基への変異を原因とする遺伝性疾患である（４－５１）に記載の方法。
（４－５４） 温血動物がヒトである（４－５０）から（４－５３）のいずれかに記載の方法。
【0148】
（４－５１） 温血動物がヒトである（４－５０）に記載の方法。
【発明の効果】
【0149】
本発明の一態様によれば、標的認識部位に付加するヌクレオチド数が少なく、生体内における安定性に優れ、部位特異的編集を誘導可能な標的編集ガイドＲＮＡを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0150】
【図1A】オリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すクロマトグラフである。
【図1B】オリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図2】オリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図3A】オリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すクロマトグラフである。
【図3B】オリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図4A】オリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すクロマトグラフである。
【図4B】オリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図5A】オリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すクロマトグラフである。
【図5B】オリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図6A】細胞におけるオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図6B】細胞におけるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ編集による発光強度変化を示すグラフである。
【図6C】細胞におけるオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図6D】細胞におけるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ編集による発光強度変化を示すグラフである。
【図7A】細胞におけるオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図7B】細胞におけるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ編集による発光強度変化を示すグラフである。
【図8A】細胞におけるオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図8B】細胞におけるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ編集による発光強度変化を示すグラフである。
【図9A】オリゴヌクレオチドによるＡＴＣＢ及びＧＡＰＤＨのＲＮＡに対する編集割合を示すクロマトグラフである。
【図9B】オリゴヌクレオチドによるＡＴＣＢ及びＧＡＰＤＨのＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図10】ｈＡＤＡＲ１存在下でのオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図11A】ＡＤＡＲ２存在下でのオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図11B】ＡＤＡＲ１存在下でのオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図12A】ＡＤＡＲ２存在下でのオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図12B】ＡＤＡＲ１存在下でのオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図13A】細胞におけるオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図13B】細胞におけるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ編集による発光強度変化を示すグラフである。
【図14A】細胞におけるオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図14B】細胞におけるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ編集による発光強度変化を示すグラフである。
【図15A】細胞におけるオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図15B】細胞におけるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ編集による発光強度変化を示すグラフである。
【図16A】ＡＤＡＲ２存在下でのオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図16B】ＡＤＡＲ１存在下でのオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図16C】細胞におけるオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図17A】ＡＤＡＲ２存在下でのオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図17B】ＡＤＡＲ１存在下でのオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【図18】細胞におけるオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡに対する編集割合を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0151】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、オリゴヌクレオチドを例示するものであって、本発明は、以下に示すオリゴヌクレオチドに限定されない。
【0152】
標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド（以下、標的編集ガイドＲＮＡともいう）は、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、第二オリゴヌクレオチドと相補対を形成し得る第三オリゴヌクレオチドと、第二オリゴヌクレオチドと第三オリゴヌクレオチドとを連結する第一連結部とを含む。第一オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から３０残基のオリゴヌクレオチドと、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなる。第二オリゴヌクレオチドの残基数は５から８であり、第三オリゴヌクレオチドの残基数は５から８である。標的対応ヌクレオチド残基、並びにその３’側及び５’側の各１残基からなるカウンタ領域から選択される少なくとも１残基は、天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基である。
【0153】
標的編集ガイドＲＮＡが、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドの３’側に、第二オリゴヌクレオチド、第一連結部及び第三オリゴヌクレオチドを有し、カウンタ領域に天然型リボヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基を有することで、細胞内での安定性に優れ、優れた部位特異的編集を誘導することができる。これは例えば、標的編集を触媒するＡＤＡＲが、標的ＲＮＡと第一オリゴヌクレオチドとからなる二本鎖領域を認識した上で、標的ＲＮＡと二本鎖を形成せず、標的ＲＮＡから遊離した状態で存在し得る第二オリゴヌクレオチド、第一連結部及び第三オリゴヌクレオチドの少なくとも一部によって、その編集活性が増進されるためと考えられる。すなわち、標的編集ガイドＲＮＡにおいては、第一オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡに対する相補領域（アンチセンス領域；ＡＳＲ）として機能し、第二オリゴヌクレオチド、第一連結部及び第三オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が編集増進領域、ＡＤＡＲ結合領域（ＡＤＡＲリクルーティング領域；ＡＲＲ）等として機能すると考えられる。
【0154】
標的編集ガイドＲＮＡは、例えば、標的編集を触媒するＡＤＡＲを標的ＲＮＡにリクルートすることで、標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導する。ＡＤＡＲは二本鎖ＲＮＡ中のアデノシン残基を加水分解的脱アミノ化反応によりイノシン残基に変換する酵素であり、哺乳動物の細胞に広く存在する。イノシン残基は構造がグアノシン残基と類似しているため、ＲＮＡ情報の翻訳時にはグアノシン残基として翻訳され、その結果としてＲＮＡ情報が編集される。アミノ酸をコードしている部分にこのようなＲＮＡ編集が生じると、ゲノム上にＤＮＡ変異がないにも関わらずアミノ酸置換等が生じることになる。なお、哺乳類におけるＡＤＡＲには、遺伝子の異なるＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２及びＡＤＡＲ３が知られている。標的編集ガイドＲＮＡは、これらのうち少なくともＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２の標的編集活性を増進する。
【0155】
標的編集ガイドＲＮＡは、哺乳動物の細胞に導入されると、細胞中に存在するＡＤＡＲを標的ＲＮＡにリクルートして、標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導することができる。
【0156】
標的編集ガイドＲＮＡを構成するヌクレオチドは、天然型リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、天然型デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、ＲＮＡ／ＤＮＡのキメラ、これらの修飾体である修飾ヌクレオチドのいずれから構成されていてもよい。標的編集ガイドＲＮＡを構成するヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分の水酸基に結合するリン酸ジエステル結合によって互いに連結されうる。前記リン酸ジエステル結合は糖部分の２’位水酸基、３’位水酸基、又は５’位水酸基を利用して形成されうる。標的編集ガイドＲＮＡを構成するヌクレオチドは、天然型である３’－５’リン酸ジエステル結合を形成しうる。標的編集ガイドＲＮＡを構成するヌクレオチドの少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであってよい。修飾ヌクレオチドとしては、糖部分が修飾されたもの、リン酸ジエステル結合が修飾されたもの、塩基が修飾されたもの、及びこれらの組合せが例示できる。
【0157】
糖部分が修飾されたものとしては、例えば、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ－アルキル化リボヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチル化、２’－Ｏ－アミノエチル化、２’－Ｏ－プロピル化、２’－Ｏ－アリル化、２’－Ｏ－メトキシエチル化、２’－Ｏ－ブチル化、２’－Ｏ－ペンチル化、２’－Ｏ－プロパルギル化等）；
Ｄ－リボフラノースの２’位と４’位間が架橋された架橋型リボヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン化、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン化、２’－Ｏ，４’－Ｃ－プロピレン化、２’－Ｏ，４’－Ｃ－テトラメチレン化、２’－Ｏ，４’－Ｃ－ペンタメチレン化、２’－Ｓ，４’－Ｃ－メチレン化、Ｄ－リボフラノースの２’－デオキシ－２’－Ｃ，４’－Ｃ－メチレンオキシメチレン化体、Ｓ－ｃＥｔ（２’，４’－ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ エチル）、ＡｍＮＡ等）；
３’－デオキシ－３’－アミノ－２’－デオキシ－Ｄ－リボフラノース；３’－デオキシ－３’－アミノ－２’－デオキシ－２’－フルオロ－Ｄ－リボフラノース；２’－デオキシ－２’－フルオロ－Ｄ－リボフラノースなどを挙げることができる。
Ｄ－リボフラノースの２’位と４’位間が架橋された架橋型リボヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン化、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン化、２’－Ｏ，４’－Ｃ－プロピレン化、２’－Ｏ，４’－Ｃ－テトラメチレン化、２’－Ｏ，４’－Ｃ－ペンタメチレン化、２’－Ｓ，４’－Ｃ－メチレン化、Ｄ－リボフラノースの２’－デオキシ－２’－Ｃ，４’－Ｃ－メチレンオキシメチレン化体、Ｓ－ｃＥｔ（２’，４’－ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ エチル）、ＡｍＮＡ等）；
３’－デオキシ－３’－アミノ－２’－デオキシ－Ｄ－リボフラノース；３’－デオキシ－３’－アミノ－２’－デオキシ－２’－フルオロ－Ｄ－リボフラノース；２’－デオキシ－２’－フルオロ－Ｄ－リボフラノースなどを挙げることができる。
【0158】
リン酸ジエステル結合が修飾されたものとしては、ホスホロチオエート結合（リン原子の不斉に由来する光学活性体を含む）、メチルホスホネート結合、メチルチオホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロアミデート結合などを挙げることができる。
【0159】
塩基が修飾されたものとしては、ハロゲン化；メチル化、エチル化、プロピル化、イソプロピル化、シクロプロピル化、ブチル化、イソブチル化、ｓ－ブチル化、ｔ－ブチル化、シクロブチル化等の炭素数１から６又は１から４のアルキル化；水酸化；アミノ化；脱アミノ化；デメチル化などが挙げられる。具体的には、シトシンの５－メチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、Ｎ４－メチル化等；チミンの５－デメチル化（ウラシル）、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化等；アデニンのＮ６－メチル化、８－ブロモ化等；グアニンのＮ２－メチル化、８－ブロモ化等；を挙げることができる。
【0160】
標的編集ガイドＲＮＡが含む第一オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを特定する。標的ＲＮＡは、編集対象となるアデノシン残基を含むものであれば、特に制限はなく、細胞性ＲＮＡ、ウイルス性ＲＮＡのいずれもよく、通常はタンパク質をコードするｍＲＮＡ前駆体又はｍＲＮＡである。標的ＲＮＡにおける編集部位は、非翻訳領域、スプライス領域、エクソン、イントロン、又はＲＮＡの安定性、構造もしくは機能に影響するいずれの領域に存在してもよい。また標的ＲＮＡは、修正又は変更すべき変異を含むものであってもよい。あるいは標的ＲＮＡはその配列が、天然型とは異なる表現型をコードするように変異されたものであってもよい。
【0161】
標的ＲＮＡは、タンパク質をコードするＲＮＡであることが好ましく、コードされるタンパク質として具体的には、セロトニン受容体、グルタミン酸受容体、膜電位依存型カリウムチャネル、ＳＴＡＴ３、ＮＦｋＢＩＡ、ＭＡＰＫ１４等のシグナル伝達に関わるリン酸化タンパク質などを挙げることができる。
【0162】
標的編集ガイドＲＮＡは、例えば遺伝性疾患の治療に適用することができる。遺伝性疾患は、例えば、標的ＲＮＡにおけるアデノシン残基をイノシン残基に変換することにより治療されうる疾患であってよい。また遺伝性疾患は、例えば、遺伝子におけるグアノシン残基からアデノシン残基への変異を原因とする遺伝性疾患であってよい。遺伝性疾患としては、例えば、嚢胞性線維症、白皮症、α－１アンチトリプシン欠損症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺（ＣＯＰＤ）、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、ジストロフィー表皮水疱症、Ｅｐｉｄｅｒｍｙｌｏｓｉｓ水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連する障害、家族性腺腫、ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素欠損症、血友病、遺伝性ヘマクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュニャン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張型ジストロフィー型Ｉ及びＩＩ、神経線維腫症、ニーマン－ピック病Ａ、Ｂ及びＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連膵臓癌、パーキンソン病、ポイツ－ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性毛様体病、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ突然変異のようなプロトロンビン変異関連疾患、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホッフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、癌の様々な形態（例えばＢＲＣＡ１及び２関連乳癌、卵巣癌等）などが挙げられる。
【0163】
遺伝性疾患の具体例としては、Ｉ型シトルリン血症（ＡＳＳ１）、ＩＩ型シトルリン血症（ＳＬＣ２５Ａ１３）、血友病（Ｆａｃｔｏｒ Ｖ Ｌｅｉｄｅｎ）、原発性高シュウ酸尿症（ＡＧＸＴ）、遠位型ミオパチー（ＧＮＥ）、嚢胞性線維症：ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ（ＣＦＣＦＴＲ）、ホモシスチン尿症（ＣＢＳ）、Ｈｕｒｌｅｒ症候群：ムコ多糖症（ＩＤＵＡ（ＳＬＣ２６Ａ１））、アレキサンダー病（ＧＦＡＰ）、網膜色素変性症（ＥＹＳ）、フェニルケトン尿症（ＰＡＨ）、ヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）、ギルバート症候群（ＵＧＴ１Ａ１）などを挙げることができる。なお、括弧内は標的遺伝子名である。
【0164】
第一オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ中の編集標的となるアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する１０から３０残基の５’側オリゴヌクレオチドと、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する３から６残基の３’側オリゴヌクレオチドとからなる。標的対応ヌクレオチド残基の５’側と３’側にそれぞれ連結するオリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡと二本鎖を形成することで、標的ＲＮＡ、及び標的ＲＮＡにおける編集標的部位が特定される。以下、標的対応ヌクレオチド残基と、その３’側の１残基と、５’側の１残基の３残基からなる領域を便宜上、カウンタ領域と称し、第一オリゴヌクレオチドのカウンタ領域以外を非カウンタ領域と称することがある。
【0165】
標的対応ヌクレオチド残基は、編集標的となるアデノシン残基に対応するヌクレオチド残基であり、例えばシチジン残基、ウリジン残基、アデノシン残基又はそれらの誘導体である。標的対応ヌクレオチド残基は、好ましくは編集標的となるアデノシン残基と塩基対を形成しない塩基であり、より好ましくはシチジン残基又はその誘導体であり、さらに好ましくはシチジン残基である。
【0166】
標的対応ヌクレオチド残基の５’側又は３’側に連結するオリゴヌクレオチドの塩基配列は、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に相補的な塩基配列である。標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドの残基数は、標的ＲＮＡに対する特異性の観点から、例えば１０以上、１２以上、１４以上又は１５以上であり、２６以下、２０以下又は１６以下である。標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドの残基数は、標的ＲＮＡに対する特異性の観点から、１０以上２０以下であってよく、１３以上２０以下、又は１３以上１５以下であってよい。また標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドの残基数は、編集活性の観点から、３であってよく、３又は４であってよい。標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドの残基数は、ＡＤＡＲ特異性の観点から、４から６であってよく、４もしくは５、又は５もしくは６であってよい。
【0167】
標的編集ガイドＲＮＡでは、カウンタ領域から選択される少なくとも１残基、少なくとも２残基、又は３残基すべてが、天然型リボヌクレオチド（ＲＮＡ）残基以外のヌクレオチド残基であってよく、好ましくは、少なくとも１残基、少なくとも２残基、又は３残基すべてが修飾ヌクレオチド残基である。カウンタ領域における修飾ヌクレオチド残基は、糖部分及びリン酸ジエステル結合の少なくとも一方が修飾されていてよく、少なくとも糖部分が修飾されていてよく、少なくともリン酸ジエステル結合が修飾されていてよく、又は糖部分及びリン酸ジエステル結合が修飾されていてよい。例えば、標的対応ヌクレオチド残基は、ホスホロチオエート結合を有するシチジン残基であってよい。また例えば、標的対応ヌクレオチド残基の５’側又は３’側の各１残基は、糖部分及びリン酸ジエステル結合の少なくとも一方が修飾されていてよく、少なくとも糖部分が修飾されていてよく、少なくともリン酸ジエステル結合が修飾されていてよく、又は糖部分及びリン酸ジエステル結合が修飾されていてもよい。カウンタ領域における糖部分の修飾は、例えば、２’－Ｏ－アルキル化、２’－デオキシ－２’－フルオロ化等であってよい。
【0168】
第一オリゴヌクレオチドのカウンタ領域以外のオリゴヌクレオチド残基（非カウンタ領域）の内、少なくとも１残基、少なくとも３残基、又は全残基において、糖部分及びリン酸ジエステル結合の少なくとも一方が修飾されていてよく、少なくとも糖部分が修飾されていてよく、少なくともリン酸ジエステル結合が修飾されていてよく、又は糖部分及びリン酸ジエステル結合が修飾されていてもよい。非カウンタ領域における糖部分の修飾は、例えば、２’－Ｏ－アルキル化、２’－デオキシ－２’－フルオロ化、２’位と４’位間の架橋化、２’－デオキシ化（ＤＮＡ化）等であってよい。第一オリゴヌクレオチドが複数の修飾ヌクレオチドを有する場合、複数の修飾ヌクレオチドは連続して配置されてよく、離隔されて配置されていてもよい。また、第一オリゴヌクレオチドは、すべてのヌクレオチド残基がホスホロチオエート結合で連結されて構成されていてもよい。
【0169】
第一オリゴヌクレオチドの標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基及び架橋型ヌクレオチド残基からなる群から選択される２種の修飾ヌクレオチド残基が交互に連結する塩基配列を有していてもよい。すなわち、標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有していてよく、架橋型ヌクレオチド残基と２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有していてよく、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有していてよい。ここで使用される２種の修飾ヌクレオチド残基が交互に連結する塩基配列を有するとは、対象となるオリゴヌクレオチドが（ここでは、第一オリゴヌクレオチドの標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドが該当する）、２種の修飾ヌクレオチド残基が部分的に交互に連結した塩基配列を有していること、又は対象となるオリゴヌクレオチドの全体が２種の修飾ヌクレオチド残基が交互に連結した塩基配列を有していることの両方を意味し、本明細書の以下の説明でも同様の意味で使用される。
【0170】
第一オリゴヌクレオチドの標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいては、標的対応ヌクレオチド残基から５’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基及び架橋型ヌクレオチド残基からなる群から選択される修飾ヌクレオチド残基であってもよい。さらに標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドにおいては、標的対応ヌクレオチド残基から５’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基が、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基及び架橋型ヌクレオチド残基からなる群から選択される修飾ヌクレオチド残基であって、４番目のヌクレオチド残基が３番目のヌクレオチド残基とは異なる修飾ヌクレオチド残基であってもよい。ここで標的対応ヌクレオチド残基から５’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基とは、標的対応ヌクレオチド残基自身を含まず、標的対応オリゴヌクレオチド残基の５’方向に隣接するヌクレオチド残基を１番目として５’方向に数えて３番目のヌクレオチド残基を示す。
【0171】
第一オリゴヌクレオチドにおいては、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連結する塩基配列を有していてもよい。また、第一オリゴヌクレオチドにおいては、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドが、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基及び架橋型ヌクレオチド残基からなる群から選択される２種が交互に連結する塩基配列を有していてもよく、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有していてよく、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基と架橋型ヌクレオチド残基とが交互に連結する塩基配列を有しいてよい。さらに、第一オリゴヌクレオチドは、ＡＤＡＲ特異性の観点から、標的対応ヌクレオチド残基から３’方向に数えて２番目のヌクレオチド残基が２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド残基、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基及び架橋型ヌクレオチド残基からなる群から選択される１種であってよく、架橋型ヌクレオチド残基であってよい。ここで標的対応ヌクレオチド残基から３’方向に数えて２番目のヌクレオチド残基とは標的対応ヌクレオチド残基自身を含まず、標的対応オリゴヌクレオチド残基の３’方向に隣接するヌクレオチド残基を１番目として３’方向に数えて２番目のヌクレオチド残基を示す。
【0172】
第二オリゴヌクレオチド及び第三オリゴヌクレオチドは、それぞれ５から８残基、５から７残基、又は６残基からなり、互いに相補対を形成し得る塩基配列を有している。第二オリゴヌクレオチド及び第三オリゴヌクレオチドの残基数は同一であっても、異なっていてもよい。第二オリゴヌクレオチドの塩基配列としては、ＧＧＧＵＧＧ、ＧＧＧＵＧ、ＧＧＵＧＧ、ＧＧＧＵ、ＧＧＵＧ、ＧＵＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＵ、ＧＵＧ、ＵＧＧ、ＧＧ、ＧＣ、ＧＡ、ＧＵ、ＵＣ、ＵＧ、ＵＡ、ＵＵ、ＣＧ、ＣＡ、ＣＵ、ＣＣ、ＡＧ、ＡＡ、ＡＣ、ＡＵ等を含む塩基配列を挙げることができる。また第二オリゴヌクレオチドは、連続する２又は３のグアニンからなる配列（ＧＧ又はＧＧＧ）、連続するウラシル及びグアニンからなる配列（ＵＧ）及び連続するグアニン、ウラシル及びグアニンからなる配列（ＧＵＧ）からなる群から選択される少なくとも１種を含む塩基配列を有していてよく、この群から選択される少なくとも２種、又は３種を含む塩基配列を有していてよい。また第二オリゴヌクレオチドは、第一連結部と結合する、連続するグアニン、ウラシル及びグアニンからなる配列（ＧＵＧ）、又は連続するウラシル、グアニン及びグアニンからなる配列（ＵＧＧ）を有していてもよい。第三オリゴヌクレオチドの塩基配列は、第二オリゴヌクレオチドの塩基配列と相補対を形成し得るように選択されればよい。ここで第二オリゴヌクレオチドと第三オリゴヌクレオチドとが相補対を形成し得るとは、第二オリゴヌクレオチドの全残基が、対応する第三オリゴヌクレオチドの全残基とワトソン－クリック型の塩基対を形成することのみならず、第二オリゴヌクレオチドと第三オリゴヌクレオチドとが１又は２のミスマッチ塩基対を含むこと、及び１又は２のゆらぎ塩基対を含むことを意味する。なお、ミスマッチ塩基対とは、熱力学的に不安定な塩基対を意味し、ゆらぎ塩基対とは、例えば、Ｇ－Ｕ塩基対等の熱力学的に安定な非ワトソン－クリック型の塩基対を意味する。ゆらぎ塩基対は、例えば、第三オリゴヌクレオチドの３’末端に形成されてもよい。
【0173】
第二及び第三オリゴヌクレオチドは、それぞれ、少なくとも１残基、少なくとも３残基、又は全残基において、糖部分及びリン酸ジエステル結合の少なくとも一方が修飾されていてよく、少なくとも糖部分が修飾されていてよく、少なくともリン酸ジエステル結合が修飾されていてよく、又は糖部分及びリン酸ジエステル結合が修飾されていてもよい。第二及び第三オリゴヌクレオチドにおける糖部分の修飾は、例えば、２’－Ｏ－アルキル化、２’－デオキシ－２’－フルオロ化、２’－デオキシ化（ＤＮＡ化）等であってよい。第二又は第三オリゴヌクレオチドが複数の修飾ヌクレオチドを有する場合、複数の修飾ヌクレオチドは連続して配置されてよく、離隔されて配置されていてもよい。
【0174】
第二及び第三オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキルリボヌクレオチド残基が連結する塩基配列を有していてもよい。また、第二及び第三オリゴヌクレオチドのそれぞれのヌクレオチド残基は、すべてホスホロチオエート結合で連結されていてもよい。
【0175】
第一連結部は、４又は５残基のオリゴヌクレオチド、及び１から８のアルキレンオキシ単位からなるポリアルキレンオキシ基からなる群から選択される少なくとも１種を含んでいてよい。第一連結部は、第二オリゴヌクレオチドの３’側、及び第三オリゴヌクレオチドの５’側にそれぞれリン酸ジエステル結合、又は修飾されたリン酸ジエステル結合する。すなわち、第一連結部は、第二オリゴヌクレオチドの３’末端の糖部分の水酸基と、第三オリゴヌクレオチドの５’末端の糖部分の水酸基とそれぞれリン酸ジエステル結合、又は修飾されたリン酸ジエステル結合してよい。これにより、第二及び第三オリゴヌクレオチドが相補対を形成してステム構造を形成し、第一連結部がループ構造を形成するように構成されてよい。
【0176】
第一連結部が４又は５残基のオリゴヌクレオチドを含む場合、その塩基配列として具体的には、例えば、ＧＣＵＡＡ；ＵＵＣＧ、ＵＡＣＧ、ＵＧＣＧ、ＵＣＣＧ等のＵＮＣＧフォールド型；ＧＡＡＡ、ＧＵＡＡ、ＧＣＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＡＧＡ、ＧＵＧＡ、ＧＣＧＡ、ＧＧＧＡ等のＧＮＲＡフォールド型；ＧＵＣＡ、ＧＣＣＡ、ＧＧＣＡ、ＧＡＣＡ、ＡＵＣＡ、ＡＣＣＡ、ＡＧＣＡ、ＡＡＣＡ、ＧＵＵＡ、ＧＣＵＡ、ＧＧＵＡ、ＧＡＵＡ、ＡＵＵＡ、ＡＣＵＡ、ＡＧＵＡ、ＡＡＵＡ等のＲＮＹＡフォールド型；ＧＧＵＧフォールド型；ＣＵＵＧフォールド型；ＡＧＵＵ、ＡＧＵＣ、ＡＧＵＧ、ＡＧＵＡ、ＡＧＣＵ、ＡＧＣＣ、ＡＧＣＧ、ＡＧＣＡ等のＡＧＮＮフォールド型などが挙げられる。これらのループ構造の詳細については、例えば、Biophys. J.,113, 257-267, 2017を参照することができる。第一連結部の塩基配列は、ＧＣＵＡＡ、ＵＮＣＧフォールド型の塩基配列、又はＧＮＲＡフォールド型の塩基配列を有していてよく、ＵＵＣＧの塩基配列を有していてよい。
【0177】
第一連結部が４又は５残基のオリゴヌクレオチドを含む場合、第一連結部を構成するヌクレオチド残基は、少なくとも１残基、又は少なくとも３残基が修飾ヌクレオチド残基であってよい。第一連結部における修飾ヌクレオチドは、糖部分及びリン酸ジエステル結合の少なくとも一方が修飾されていてよく、少なくとも糖部分が修飾されていてよく、少なくともリン酸ジエステル結合が修飾されていてよく、又は糖部分及びリン酸ジエステル結合が修飾されていてもよい。
【0178】
第一連結部がポリアルキレンオキシ基を含む場合、アルキレンオキシ単位の炭素数は、例えば、２から４、２から３、又は２であってよい。すなわち、アルキレンオキシ単位は、エチレンオキシ単位、プロピレンオキシ単位、又はブチレンオキシ単位であってよい。ポリアルキレンオキシ基を構成するアルキレンオキシ単位の数は、例えば１から８、５から７、又は６であってよい。ポリアルキレンオキシ基を構成する各アルキレンオキシ単位は同一であっても、又は異なっていてもよい。更に第一連結部は、単位数が１から８のポリエチレンオキシ基を含んでいてよく、ヘキサエチレンオキシ基を含んでいてよい。第一連結部がポリアルキレンオキシ基を含む場合、ポリアルキレンオキシ基は、リン酸ジエステル結合、又は修飾されたリン酸ジエステル結合を介して、第二オリゴヌクレオチドの３’末端の糖部分の水酸基と第三オリゴヌクレオチドの５’末端の糖部分の水酸基とを連結していてよい。
【0179】
第一連結部は、オリゴヌクレオチドのみから構成されていてよく、ヌクレオチドとアルキレンオキシ単位とを含んで構成されていてよく、アルキレンオキシ単位のみを含んで構成されていてよい。標的編集ガイドＲＮＡは、第一連結部がアルキレンオキシ単位を含むループ構造を有している場合であっても、優れた標的編集活性を示すことができる。
【0180】
標的編集ガイドＲＮＡは、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドとの間に第二連結部を有していてよい。すなわち、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドとが、第二連結部で連結されていてよい。第二連結部は、例えば、アルキレンオキシ単位を含んで構成される。アルキレンオキシ単位のアルキレン部分の炭素数は、２から８、又は２から６であってよい。第二連結部は、炭素数２又は３のアルキレンオキシ単位を１から８単位、又は１から６単位含んでいてよく、炭素数２又は３のアルキレンオキシ単位を１から８単位又は１から６単位連続して含むポリアルキレンオキシ基を含んでいてよく、ヘキサエチレンオキシ基を含んでいてよい。また、第二連結部は、炭素数が３から６のアルキレンオキシ基を含んでいてもよい。第二連結部を構成するポリアルキレンオキシ基は、リン酸ジエステル結合、又は修飾されたリン酸ジエステル結合を介して、第一オリゴヌクレオチドの３’末端の糖部分の水酸基と第二オリゴヌクレオチドの５’末端の糖部分の水酸基とを連結していてよい。
【0181】
標的編集ガイドＲＮＡは、市販の合成機（例えば、パーキンエルマー社のホスホロアミダイト法によるモデル３９２）などを用いて、公知の文献（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅｒｃｈ，１２，４５３９（１９８４））参照）に記載の方法に準じて合成することができる。用いられるホスホロアミダイト試薬は、市販の試薬を用いてもよく、公知の文献に記載の方法に準じて適宜合成した試薬を用いてもよい。ホスホロアミダイト試薬をカップリング後、イオウ、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ、アプライドバイオシステム社）、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、キサンタンヒドリドなどの試薬を反応させることにより、ホスホロチオエート結合を導入することができる（例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３２，３００５（１９９１），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１２，１２５３（１９９０）、ＰＣＴ／ＷＯ９８／５４１９８参照）。
【0182】
オリゴヌクレオチド（標的編集ガイドＲＮＡ）は、医薬的に許容できる塩の形態で用いてもよい。「医薬的に許容される塩」とは、オリゴヌクレオチドの塩である。そのような塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩などのアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩などの無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、りんご酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などを挙げることができる。オリゴヌクレオチドの医薬的に許容できる塩の形態は、好ましくは、オリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩、より好ましくは、ナトリウム塩である。これらの塩は、公知の方法で製造することができる。
【0183】
また、オリゴヌクレオチド及びその医薬的に許容される塩は、溶媒和物（例えば、水和物）としても存在することがあり、そのような溶媒和物であってもよい。
【0184】
オリゴヌクレオチド及びその医薬的に許容される塩には、リン原子の不斉に由来する光学活性体が存在することがあり、本発明のオリゴヌクレオチドには、そのような光学活性体も含まれる。そのような光学活性体は、公知の方法で合成することができる（例えば、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ.,１１４,９６７（２００９）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，８，２３５９（１９９８）など）。
【0185】
オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容される塩又は溶媒和物を、疾患の治療に使用する場合には、それ自体あるいは適宜の医薬的に許容される賦形剤、希釈剤などと混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤などにより経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、貼付剤若しくは外用剤などにより非経口的に投与することができる。
【0186】
これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バイレショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩などの無機系賦形剤など）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩：無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；上記澱粉誘導体など）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、前記賦形剤と同様の化合物など）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類など）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤など）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；ソルビン酸など）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される甘味料、酸味料、香料など）、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【0187】
オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容される塩又は溶媒和物を含む治療剤は、０．１から２５０μｍｏｌｅｓ／ｍｌのオリゴヌクレオチドを含有するとよく、好ましくは、１から５０μｍｏｌｅｓ／ｍｌ含有するとよい。また、所定量のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容される塩又は溶媒和物、０．０２から１０％ｗ／ｖの炭水化物又は多価アルコール、及び０．０１から０．４％ｗ／ｖの医薬的に許容できる界面活性剤を含有させて治療剤を構成してもよい。
【0188】
上記炭水化物としては、単糖類及び２糖類の少なくとも１種が特に好ましい。これら炭水化物及び多価アルコールの例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、ラクトース、マルトース、マンニトール及びソルビトールが挙げられる。これらは、単独で用いても、併用してもよい。
【0189】
また、界面活性剤の好ましい例としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノからトリ－エステル、アルキルフェニルポリオキシエチレン、ナトリウムタウロコラート、ナトリウムコラート、及び多価アルコールエステルが挙げられる。このうち特に好ましいのは、ポリオキシエチレンソルビタンモノからトリ－エステルであり、ここにおいてエステルとして特に好ましいのは、オレエート、ラウレート、ステアレート及びパルミテートである。これらは単独で用いても、併用してもよい。
【0190】
オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容される塩又は溶媒和物を含む治療剤は、更に好ましくは、０．０３Ｍから０．０９Ｍの医薬的に許容できる中性塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び／又は塩化カルシウムを含有させておいてもよい。
【0191】
オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容される塩又は溶媒和物を含む治療剤は、更に好ましくは、０．００２から０．０５Ｍの医薬的に許容できる緩衝剤を含有することができる。好ましい緩衝剤の例としては、クエン酸ナトリウム、ナトリウムグリシネート、リン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが挙げられる。これらの緩衝剤は、単独で用いても、併用してもよい。
【0192】
さらに、上記の治療薬は、溶液状態で供給してもよい。しかし、ある期間保存する必要がある場合等のために、オリゴヌクレオチドを安定化して治療効果の低下を防止する目的で通常は凍結乾燥しておくことが好ましく、その場合は用時に溶解液（注射用蒸留水など）で再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）して、即ち投与される液体状態にして用いればよい。従って、本発明の治療薬は、各成分が所定の濃度範囲になるよう溶解液で再構成して使用するための、凍結乾燥された状態のものも包含する。凍結乾燥物の溶解性を促進する目的で、アルブミン、グリシン等のアミノ酸を更に含有させておいてもよい。
【0193】
オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容される塩又は溶媒和物をヒトに投与する場合には、例えば、成人１日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、１回又は数回に分けて皮下注射、点滴静脈注射、又は、静脈注射するとよいが、その投与量や投与回数は、疾患の種類、症状、年齢、投与方法などにより適宜変更しうる。
【0194】
疾患の処置方法
疾患の処置方法は、上記治療剤を対象に投与する工程を含む。明細書において用いられる「処置」とは、疾患について施される何らかの処置であればよく、例えば、疾患の治療、改善、進行の抑制（悪化の防止）、予防等（好適には、治療又は予防）が挙げられる。処置の対象は、ヒトを含む温血動物であってよく、非ヒト温血動物であってもよい。
疾患の処置方法は、上記治療剤を対象に投与する工程を含む。明細書において用いられる「処置」とは、疾患について施される何らかの処置であればよく、例えば、疾患の治療、改善、進行の抑制（悪化の防止）、予防等（好適には、治療又は予防）が挙げられる。処置の対象は、ヒトを含む温血動物であってよく、非ヒト温血動物であってもよい。
【0195】
標的ＲＮＡの部位特異的編集方法
標的ＲＮＡの部位特異的編集方法は、標的ＲＮＡと、標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチドである標的編集ガイドＲＮＡとを、アデノシンデアミナーゼの存在下に、接触させる工程を含む。標的編集ガイドＲＮＡが標的ＲＮＡと部分的に二本鎖を形成し、アデノシンデアミナーゼをリクルートすることで、標的ＲＮＡが含むアデノシン残基を部位特異的にイノシン残基に変換することができる。標的ＲＮＡの部位特異的編集方法は、標的編集ガイドＲＮＡを準備する工程を更に含んでいてもよい。
標的ＲＮＡの部位特異的編集方法は、標的ＲＮＡと、標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチドである標的編集ガイドＲＮＡとを、アデノシンデアミナーゼの存在下に、接触させる工程を含む。標的編集ガイドＲＮＡが標的ＲＮＡと部分的に二本鎖を形成し、アデノシンデアミナーゼをリクルートすることで、標的ＲＮＡが含むアデノシン残基を部位特異的にイノシン残基に変換することができる。標的ＲＮＡの部位特異的編集方法は、標的編集ガイドＲＮＡを準備する工程を更に含んでいてもよい。
【0196】
標的ＲＮＡの部位特異的編集方法は、例えば、標的ＲＮＡを有する真核細胞に、上述した標的編集ガイドＲＮＡを導入することで行うことができる。標的編集ガイドＲＮＡの真核細胞への導入方法には、核酸医薬で用いられる種々の手法から適宜選択して適用することができる。標的ＲＮＡの部位特異的編集方法は、インビトロで実施されてよく、インビボで実施されてもよい。
【0197】
本発明は、別の態様として、疾患（例えば、遺伝性疾患）の処置に用いられる医薬組成物の製造における標的編集ガイドＲＮＡの使用、疾患（例えば、遺伝性疾患）の処置における標的編集ガイドＲＮＡの使用、疾患（例えば、遺伝性疾患）の処置に使用される標的編集ガイドＲＮＡをも包含する。
【実施例】
【0198】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0199】
（参考例１）
表１に示す配列を有し、すべてが天然型ＲＮＡ残基からなるオリゴヌクレオチド（以下、ｄｅｌ０３＿０１ともいう）を、ホスホロアミダイト法（例えば、Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)、Nature Communications 6, Article number: 6317 (2015)参照）を用いて合成を行った。得られた化合物は、負イオンＥＳＩ質量分析により同定した（実測値：１１１９４．４０）。
表１に示す配列を有し、すべてが天然型ＲＮＡ残基からなるオリゴヌクレオチド（以下、ｄｅｌ０３＿０１ともいう）を、ホスホロアミダイト法（例えば、Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)、Nature Communications 6, Article number: 6317 (2015)参照）を用いて合成を行った。得られた化合物は、負イオンＥＳＩ質量分析により同定した（実測値：１１１９４．４０）。
【0200】
表１中、下線部は第一オリゴヌクレオチド（ＡＳＲ）に該当し、標的となるＲＮＡは後述するＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡである。参考例１のオリゴヌクレオチドは、例えば、以下のようなステムループ構造を取り得ると考えられる。
【0201】
【表1】
【0202】
【化1】
【0203】
（実施例１から５０）
実施例１から４６のオリゴヌクレオチド化合物は参考例１のオリゴヌクレオチドの配列を元にして、以下に示すように修飾ヌクレオチドを導入して得られたものである。また実施例４７から５０のオリゴヌクレオチド化合物は、以下に示す配列の第一オリゴヌクレオチド（ＡＳＲ）を有し、以下に示すように修飾ヌクレオチドを導入して得られたものである。これらのオリゴヌクレオチド化合物は参考例１と同様にホスホロアミダイト法で合成した。なお、配列中、「１８」の部分を合成する際には、ＤＭＴ Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅ、カタログ番号：ＣＬＰ－９７６５）を用いた。「９」の部分を合成する際には、ＤＭＴ－Ｔｒｉｅｔｈｏｘｙ－ｇｌｙｃｏｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅ、カタログ番号：ＣＬＰ－１１１３）を用いた。「６」の部分を合成する際には、ＤＭＴ－ｈｅｘａｎｅ－Ｄｉｏｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅ、カタログ番号：ＣＬＰ－１１２０）を用いた。「３」の部分を合成する際には、ＤＭＴ－ｐｒｏｐａｎｅ－Ｄｉｏｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅ、カタログ番号：ＣＬＰ－９９０８）を用いた。「２’－Ｏ－メチルヌクレオシド」の部分は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７， ３３７３ （１９８９）に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「ＤＮＡ」の部分は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１， ４５３９ （１９８４）に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレンヌクレオシド」の部分は、国際公開第９９／１４２２６号に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシド」の部分は、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３６，８３１（１９９３）に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。
実施例１から４６のオリゴヌクレオチド化合物は参考例１のオリゴヌクレオチドの配列を元にして、以下に示すように修飾ヌクレオチドを導入して得られたものである。また実施例４７から５０のオリゴヌクレオチド化合物は、以下に示す配列の第一オリゴヌクレオチド（ＡＳＲ）を有し、以下に示すように修飾ヌクレオチドを導入して得られたものである。これらのオリゴヌクレオチド化合物は参考例１と同様にホスホロアミダイト法で合成した。なお、配列中、「１８」の部分を合成する際には、ＤＭＴ Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅ、カタログ番号：ＣＬＰ－９７６５）を用いた。「９」の部分を合成する際には、ＤＭＴ－Ｔｒｉｅｔｈｏｘｙ－ｇｌｙｃｏｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅ、カタログ番号：ＣＬＰ－１１１３）を用いた。「６」の部分を合成する際には、ＤＭＴ－ｈｅｘａｎｅ－Ｄｉｏｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅ、カタログ番号：ＣＬＰ－１１２０）を用いた。「３」の部分を合成する際には、ＤＭＴ－ｐｒｏｐａｎｅ－Ｄｉｏｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅ、カタログ番号：ＣＬＰ－９９０８）を用いた。「２’－Ｏ－メチルヌクレオシド」の部分は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７， ３３７３ （１９８９）に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「ＤＮＡ」の部分は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１， ４５３９ （１９８４）に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレンヌクレオシド」の部分は、国際公開第９９／１４２２６号に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシド」の部分は、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３６，８３１（１９９３）に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。
【0204】
【表2】
【表3】
【表4】
【0205】
表中の「分子量」は、負イオンＥＳＩ質量分析による実測値を示す。表中の「配列」において大文字はＲＮＡ、小文字はＤＮＡ、Ｎ（Ｍ）はＤ－リボフラノースの２’－Ｏ－メチル化、Ｎ（Ｆ）はＤ－リボフラノースの２’－デオキシ－２’－フルオロ化、Ｎ（Ｌ）は、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン化、Ｎ（Ｅ）は、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン化を示す。「３」は－Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ－、「６」は－Ｏ（ＣＨ２）６Ｏ－、「９」は－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３－、「１８」は－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）６－で表されるリンカーを示す。「＾」はヌクレオシドユニット間が－Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）－で結合したものを示す。特に記載のない場合は、ヌクレオシドユニット間、又はヌクレオシドユニットとリンカーが－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－で結合したものを示す。オリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端は、水素原子が化学式中の酸素原子と結合した水酸基となっている。以下にヌクレオシドユニットの構造を示す。なお、化学式中の破線部は結合部位を示す。
【0206】
【化2】
【0207】
【化3】
【0208】
【化4】
【0209】
【化5】
【0210】
【化6】
【0211】
【化7】
【0212】
【化8】
【0213】
（参考例２）
表５に、塩基配列と化学修飾の状態を示すオリゴヌクレオチド化合物を、参考例１と同様にホスホロアミダイト法で合成した。表中の記号は上記と同様である。
表５に、塩基配列と化学修飾の状態を示すオリゴヌクレオチド化合物を、参考例１と同様にホスホロアミダイト法で合成した。表中の記号は上記と同様である。
【0214】
【表5】
【0215】
（試験例１）Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡの合成
ｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社）から、常法により転写して調製したＲｌｕｃ＿ＷＴ ＲＮＡ（配列番号７）を０．２ｎＭになるように調製した。組み換えｈＡＤＡＲ２（酵母発現系を用いて合成・精製 Macbeth, MR. and Bass, BL. Methods Enzymol. 424, 319-331 (2007), Fukuda, M. et al. Sci. Rep. srep41478 (2017)）を終濃度１μＭとなるように加え、ｅｄｉｔｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５），２ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＤＴＴ，０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）中において３７℃で２時間インキュベートすることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ編集反応を行なった。
（Ａ）Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡの合成
ｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社）から、常法により転写して調製したＲｌｕｃ＿ＷＴ ＲＮＡ（配列番号７）を０．２ｎＭになるように調製した。組み換えｈＡＤＡＲ２（酵母発現系を用いて合成・精製 Macbeth, MR. and Bass, BL. Methods Enzymol. 424, 319-331 (2007), Fukuda, M. et al. Sci. Rep. srep41478 (2017)）を終濃度１μＭとなるように加え、ｅｄｉｔｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５），２ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＤＴＴ，０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）中において３７℃で２時間インキュベートすることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ編集反応を行なった。
【0216】
編集反応後のＲｌｕｃ＿ＷＴ ＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。次いで、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて、Ｒｌｕｃ＿ＷＴ＿ＢａｍＲ０１プライマー（配列番号８）によりｃＤＮＡを合成した。その後、Ｒｌｕｃ＿ＷＴ＿ＥｃｏＦ０１プライマー（配列番号９）及びＲｌｕｃ＿ＷＴ＿ＢａｍＲ０１プライマー（配列番号８）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（３０サイクル、変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，６０秒）によりｃＤＮＡを増幅した。次いで、得られたｃＤＮＡをインサートＤＮＡとして、以下のようにしてｐＵＣ１９プラスミドにクローニングした。インサートＤＮＡ及びｐＵＣ１９プラスミドをＥｃｏＲＩ（ＴａＫａＲａ）及びＢａｍＨＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて３７℃で１時間の制限酵素消化を行なった後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により、それぞれのＤＮＡを精製した。制限酵素消化後のｐＵＣ１９プラスミドとインサートＤＮＡが１：３のモル比となるように混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ）を用いてライゲーション反応を行なった。得られたライゲーションサンプルをＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ寒天プレートを用いて３７℃で一晩培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列解析を行い、Ｒｌｕｃ＿ＷＴのＡ１２２がＧに変異した配列（Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ）及びＲｌｕｃ＿Ｋ４１ＲがクローニングされたプラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ１９－Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ）を得た。
【0217】
ｐＵＣ１９－Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒを鋳型にして、５’側断片をＲｌｕｃ＿ＮｈｅＦ０１プライマー（配列番号１０）とＲＬ＿Ｗ１０４Ｘ＿ＲＶプライマー（配列番号１１）、３’側断片をＲｌｕｃ＿ＸｈｏＲ０１プライマー（配列番号１２）と ＲＬ＿Ｗ１０４Ｘ＿ＦＷプライマー（配列番号１３）を用いてＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）により１ｓｔ ＰＣＲ（３０サイクル、変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，４０秒）を行なった。次に、それぞれのＰＣＲ産物を１００倍希釈し、Ｒｌｕｃ＿ＮｈｅＦ０１プライマー及びＲｌｕｃ＿ＸｈｏＲ０１プライマーを用いてＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）により２ｎｄ ＰＣＲ（３０サイクル、変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，６０秒）を行ない、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製し、Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１ＲのＧ３１１をＡに変異させた配列を有するＤＮＡ（Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘ）（配列番号１６）を得た。
【0218】
得られたＤＮＡ（Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘ）及びｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２ Ｖｅｃｔｏｒ（ｐｒｏｍｅｇａ）について、ＮｈｅＩ（ＴａＫａＲａ）及びＸｈｏＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて３７℃で１時間の制限酵素消化を行なった後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により、それぞれのＤＮＡを精製した。制限酵素消化後のＲｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４ＸとｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２ Ｖｅｃｔｏｒを３：１のモル比となるように混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ）を用いてライゲーション反応を行なった。得られたライゲーションサンプルをＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ寒天プレートを用いて３７℃で一晩培養した。選別したコロニーをＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。その後、塩基配列解析により得られたプラスミドの配列を確認した。
【0219】
配列を確認したプラスミドを鋳型に、Ｔ７＿Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号１４）及びＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｒ０１プライマー（配列番号１５）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（３０サイクル（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，２０秒））により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応用の鋳型ＤＮＡを増幅し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行なってＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ（配列番号１７）を得た。合成後のＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡについて、８Ｍ尿素を含む５％ポリアクリルアミドゲルを用いて切り出し精製を行ない、以降の試験に用いた。
【0220】
以下に、Ｒｌｕｃ＿ＷＴ＿ＲＮＡ、Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘ及びＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡの配列、並びに上記で用いたプライマーの配列を示す。なお、表中の下線は、編集標的のアデノシン残基を示す。
【0221】
【表6】
【0222】
【表7】
【0223】
【表8】
【0224】
（Ｂ）アニーリング反応
０．３μＭのＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡと、０．９μＭの実施例及び参考例の化合物（以下、ｇＲＮＡと表記することがある）とをアニーリングｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で、８０℃，３ｍｉｎ加熱し、１５ｍｉｎかけて２５℃まで冷却した。
０．３μＭのＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡと、０．９μＭの実施例及び参考例の化合物（以下、ｇＲＮＡと表記することがある）とをアニーリングｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で、８０℃，３ｍｉｎ加熱し、１５ｍｉｎかけて２５℃まで冷却した。
【0225】
（Ｃ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ編集反応
アニーリング反応によりＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡがｇＲＮＡと完全に複合体を形成したと仮定し、以下のＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体濃度を計算した。編集反応は、ｅｄｉｔｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５），２ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＤＴＴ，０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）中、５ｎＭＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体に対して、組み換えｈＡＤＡＲ２を１２．５ｎＭ又は６．２５ｎＭ加え、３７℃で１時間インキュベートすることで行なった。
アニーリング反応によりＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡがｇＲＮＡと完全に複合体を形成したと仮定し、以下のＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体濃度を計算した。編集反応は、ｅｄｉｔｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５），２ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＤＴＴ，０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）中、５ｎＭＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体に対して、組み換えｈＡＤＡＲ２を１２．５ｎＭ又は６．２５ｎＭ加え、３７℃で１時間インキュベートすることで行なった。
【0226】
（Ｄ）編集解析方法
編集反応後のＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製し、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて、Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｒ０１プライマー（配列番号１８）によりｃＤＮＡを合成した。その後、Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号１８）及びＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｒ０１プライマー（配列番号１５）、並びにＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，２０秒）により、ｃＤＮＡを増幅した。得られたｃＤＮＡの配列解析はＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号１８）、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｋｉｔを用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により解析した。シーケンシングにより得られたクロマトチャートより、標的部位（Ａ３１１）のピーク高比（Ｇ／（Ｇ＋Ａ））から編集割合（％）を算出した。
編集反応後のＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製し、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて、Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｒ０１プライマー（配列番号１８）によりｃＤＮＡを合成した。その後、Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号１８）及びＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｒ０１プライマー（配列番号１５）、並びにＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，２０秒）により、ｃＤＮＡを増幅した。得られたｃＤＮＡの配列解析はＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号１８）、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｋｉｔを用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により解析した。シーケンシングにより得られたクロマトチャートより、標的部位（Ａ３１１）のピーク高比（Ｇ／（Ｇ＋Ａ））から編集割合（％）を算出した。
【0227】
【表9】
【0228】
（Ｅ）編集解析の結果
参考例１の化合物及び実施例の化合物を用いた場合の編集割合（％）を図１Ａ及び図１Ｂに示した。参考例１の化合物では、９０％を超える編集割合を示した。実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿０２からｄｅｌ０３＿０７）のように修飾核酸を導入した場合でも参考例１の化合物と同様に編集誘導活性を示した。また、標的編集部位と対になるＣにホスホロチオエート結合を導入した化合物（ｄｅｌ０３＿０８）、ＡＤＡＲ誘導領域のループをヘキサエチエングルコールからなるリンカーに置換した化合物（ｄｅｌ０３＿０９）も、参考例１の化合物と同程度の編集誘導活性を示した。
参考例１の化合物及び実施例の化合物を用いた場合の編集割合（％）を図１Ａ及び図１Ｂに示した。参考例１の化合物では、９０％を超える編集割合を示した。実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿０２からｄｅｌ０３＿０７）のように修飾核酸を導入した場合でも参考例１の化合物と同様に編集誘導活性を示した。また、標的編集部位と対になるＣにホスホロチオエート結合を導入した化合物（ｄｅｌ０３＿０８）、ＡＤＡＲ誘導領域のループをヘキサエチエングルコールからなるリンカーに置換した化合物（ｄｅｌ０３＿０９）も、参考例１の化合物と同程度の編集誘導活性を示した。
【0229】
図２に示すように、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿１０からｄｅｌ０３＿２１）のように修飾核酸を導入した場合でも参考例１の化合物と同様に編集誘導活性を示した。
また、参考例２の化合物（ｄｅｌ０３＿２２）は、Ｚ型ＤＮＡのステムループ配列を持つものであってＷＯ２０１６／０９７２１２に記載されているｇＲＮＡの設計方法をＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ配列に合わせて適応したものである。ｄｅｌ０３＿２２は、同じＺ型ＤＮＡのステム配列を持つ実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２１）と比較して編集誘導活性が弱いことがわかる。一方、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿Ａｍ１からｄｅｌ０３＿Ａｍ７）のように修飾核酸を導入した場合でも参考例１の化合物と同程度の編集誘導活性を示した。
また、参考例２の化合物（ｄｅｌ０３＿２２）は、Ｚ型ＤＮＡのステムループ配列を持つものであってＷＯ２０１６／０９７２１２に記載されているｇＲＮＡの設計方法をＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ配列に合わせて適応したものである。ｄｅｌ０３＿２２は、同じＺ型ＤＮＡのステム配列を持つ実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２１）と比較して編集誘導活性が弱いことがわかる。一方、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿Ａｍ１からｄｅｌ０３＿Ａｍ７）のように修飾核酸を導入した場合でも参考例１の化合物と同程度の編集誘導活性を示した。
【0230】
【0231】
【0232】
【0233】
（試験例２）培養細胞内における編集誘導能評価
（Ａ）細胞培養
ＨｅＬａ細胞を２４－ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅに５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように継代し、４８時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて５０ｎｇのｐｓｉＣＨＥＣＫ２ＴＭ＿Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘ、３５０ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ２、１０ｎＭの実施例又は参考例の化合物であるｇＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。コントロールとして、ｇＲＮＡを発現するプラスミド（特願２０１７－２３４３４１号の参考例２に記載）の１００ｎｇをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎして用いた。
（Ａ）細胞培養
ＨｅＬａ細胞を２４－ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅに５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように継代し、４８時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて５０ｎｇのｐｓｉＣＨＥＣＫ２ＴＭ＿Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘ、３５０ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ２、１０ｎＭの実施例又は参考例の化合物であるｇＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。コントロールとして、ｇＲＮＡを発現するプラスミド（特願２０１７－２３４３４１号の参考例２に記載）の１００ｎｇをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎして用いた。
【0234】
（Ｂ）編集解析方法
２４－ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅで培養した細胞から、セパゾール ＲＮＡ Ｉ Ｓｕｐｅｒ Ｇ（ナカライ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮａｓｅ Ｉ（ＴａＫａＲａ）を用いてＤＮａｓｅ処理を行った後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ０．５μｇ、０．２５μＭ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１７（配列番号１９）を用いた逆転写反応を行ない、ｃＤＮＡを増幅した。ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、Ｒｌｕｃ＿Ｆ０１プライマー（配列番号２０）、３’－Ａｄｐプライマー（配列番号２１）を用いて１ｓｔＰＣＲ（３０サイクル（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，６０秒））を行った。１ｓｔＰＣＲ産物を２００倍希釈したｃＤＮＡを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、Ｒｌｕｃ＿Ｆ０１プライマー（配列番号２０）、Ｒｌｕｃ＿Ｒ０１プライマー（配列番号２２）を用いて２ｎｄＰＣＲ（３０サイクル（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃ ６０秒））を行い、Ｒｌｕｃフラグメントを増幅した。Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１６５μＭ Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号１８）を用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により解析した。シーケンシングにより得られたクロマトチャートより、標的部位（Ａ３１１）のピーク高比（Ｇ／（Ｇ＋Ａ））から編集割合（％）を算出した。
２４－ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅで培養した細胞から、セパゾール ＲＮＡ Ｉ Ｓｕｐｅｒ Ｇ（ナカライ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮａｓｅ Ｉ（ＴａＫａＲａ）を用いてＤＮａｓｅ処理を行った後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ０．５μｇ、０．２５μＭ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１７（配列番号１９）を用いた逆転写反応を行ない、ｃＤＮＡを増幅した。ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、Ｒｌｕｃ＿Ｆ０１プライマー（配列番号２０）、３’－Ａｄｐプライマー（配列番号２１）を用いて１ｓｔＰＣＲ（３０サイクル（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，６０秒））を行った。１ｓｔＰＣＲ産物を２００倍希釈したｃＤＮＡを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、Ｒｌｕｃ＿Ｆ０１プライマー（配列番号２０）、Ｒｌｕｃ＿Ｒ０１プライマー（配列番号２２）を用いて２ｎｄＰＣＲ（３０サイクル（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃ ６０秒））を行い、Ｒｌｕｃフラグメントを増幅した。Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１６５μＭ Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号１８）を用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により解析した。シーケンシングにより得られたクロマトチャートより、標的部位（Ａ３１１）のピーク高比（Ｇ／（Ｇ＋Ａ））から編集割合（％）を算出した。
【0235】
【表10】
【0236】
（Ｃ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ方法
Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。２４－ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅで培養した細胞に１００ μＬのＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞抽出液を得た。得られた細胞抽出液２０μＬにＬＡＲＩＩ １００μＬを添加し、６０秒後、ＧｌｏＭａｘ（Ｒ）２０／２０ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりＦｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｆｌｕｃ）の発光強度を測定した。その後すぐに、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔを１００μＬ添加し、６０秒後にＲｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｒｌｕｃ）の発光強度を測定した。発光強度は、Ｆｌｕｃによりノーマライズした。
Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。２４－ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅで培養した細胞に１００ μＬのＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞抽出液を得た。得られた細胞抽出液２０μＬにＬＡＲＩＩ １００μＬを添加し、６０秒後、ＧｌｏＭａｘ（Ｒ）２０／２０ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりＦｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｆｌｕｃ）の発光強度を測定した。その後すぐに、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔを１００μＬ添加し、６０秒後にＲｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｒｌｕｃ）の発光強度を測定した。発光強度は、Ｆｌｕｃによりノーマライズした。
【0237】
（Ｄ）編集解析、及びルシフェラーゼレポーターアッセイの結果
実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２４からｄｅｌ０３＿２６）を用いた場合の編集割合（％）を図６Ａに示した。プラスミドをトランスフェクトした場合では、１０から２０％程度の編集割合を示す。実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２５及びｄｅｌ０３＿２６）のようなホスホロチオエート結合の数を増加した修飾核酸をトランスフェクトした場合は、編集誘導活性が認められ、その割合は、プラスミドをトランスフェクトした場合よりも高かった。
実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２４からｄｅｌ０３＿２６）を用いた場合の編集割合（％）を図６Ａに示した。プラスミドをトランスフェクトした場合では、１０から２０％程度の編集割合を示す。実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２５及びｄｅｌ０３＿２６）のようなホスホロチオエート結合の数を増加した修飾核酸をトランスフェクトした場合は、編集誘導活性が認められ、その割合は、プラスミドをトランスフェクトした場合よりも高かった。
【0238】
実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２４からｄｅｌ０３＿２６）を用いた場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を図６Ｂに示す。実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２５及びｄｅｌ０３＿２６）を用いた場合、プラスミドをトランスフェクトした場合と同等以上の高いルシフェラーゼ活性が認められた。
【0239】
参考例１の化合物（ｄｅｌ０３＿０１）及び実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６）を用いた場合の編集割合（％）を図６Ｃに示す。プラスミドをトランスフェクトした場合では、２０％程度の編集割合を示した。参考例１の化合物（ｄｅｌ０３＿０１）をトランスフェクトした場合は、編集誘導活性が認められなかった。しかし、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６）をトランスフェクトした場合は、高い編集誘導活性が認められた。参考例１の化合物（ｄｅｌ０３＿０１）及び実施例の化合物(ｄｅｌ０３＿２６）を用いた場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を図６Ｄに示す。参考例の化合物（ｄｅｌ０３＿０１）を用いた場合、ルシフェラーゼ活性は認められなかったが、実施例の化合物(ｄｅｌ０３＿２６）を用いた場合、プラスミドをトランスフェクトした場合よりも非常に高いルシフェラーゼ活性が認められた。
【0240】
実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６、ｄｅｌ０３＿３０からｄｅｌ０３＿３３）を用いた場合の編集割合（％）を図７Ａに示す。実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿３０からｄｅｌ０３＿３２）をトランスフェクトした場合、前述の実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６）をトランスフェクトした場合と同程度の編集誘導活性が認められた。また、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６、ｄｅｌ０３＿３０からｄｅｌ０３＿３３）を用いた場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を図７Ｂに示す。実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿３０乃至ｄｅｌ０３＿３２）をトランスフェクトした場合、前述の実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６）をトランスフェクトした場合と同程度の高いルシフェラーゼ活性が認められた。
【0241】
実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６、ｄｅｌ０３＿３４からｄｅｌ０３＿４１）を用いた場合の編集割合（％）を図８Ａに示す。実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿３４からｄｅｌ０３＿４１）をトランスフェクトした場合、前述の実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６）をトランスフェクトした場合と同等以上の編集誘導活性が認められた。また、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６、ｄｅｌ０３＿３０からｄｅｌ０３＿３３）を用いた場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を図８Ｂに示す。実施例の化合物（（ｄｅｌ０３＿３４からｄｅｌ０３＿４１）をトランスフェクトした場合、前述の実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６）をトランスフェクトした場合と同程度の高いルシフェラーゼ活性が認められた。
【0242】
（試験例３）β―アクチン遺伝子配列を有するＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）ＲＮＡの合成
ＡＣＴＢ＿ＦＷ（配列番号２３）、ＡＣＴＢ＿ＲＶ（配列番号２４）のオリゴＤＮＡ、及びＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（ＮＥＢ）を用いてアニーリング反応（８０℃，３ｍｉｎ加熱し、１５ｍｉｎかけて２５℃まで冷却）を行ない、インサートを作製した。ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩ（ＴａＫａＲａ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて３７℃で１時間反応を行なった後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。インサート：プラスミドが３：１のモル比となるように加え、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ）を用いてライゲーション反応を行なった。得られたライゲーションサンプルをＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ寒天プレートを用いて３７℃で一晩培養した。選別したコロニーを、ＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミド１００ｎｇをＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１６５μＭのｐＵＣ１９＿ｓｅｑＦＷプライマー（配列番号２５）及び０．１６５μＭのｐＵＣ１９＿ｓｅｑＲＶプライマー（配列番号２６）を用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により配列解析を行なった。正しく作製できたプラスミドを鋳型に、Ｔ７＿ｐＵＣ１９＿ＦＷ（配列番号２７）及びＭ１３＿ＲＶプライマー（配列番号２８）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，２０秒）により、鋳型ＤＮＡを作製し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行ない、８Ｍ尿素を含む５％ポリアクリルアミドゲルを用いて切り出し精製を行なった。
（Ａ）ＲＮＡの合成
ＡＣＴＢ＿ＦＷ（配列番号２３）、ＡＣＴＢ＿ＲＶ（配列番号２４）のオリゴＤＮＡ、及びＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（ＮＥＢ）を用いてアニーリング反応（８０℃，３ｍｉｎ加熱し、１５ｍｉｎかけて２５℃まで冷却）を行ない、インサートを作製した。ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩ（ＴａＫａＲａ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて３７℃で１時間反応を行なった後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。インサート：プラスミドが３：１のモル比となるように加え、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ）を用いてライゲーション反応を行なった。得られたライゲーションサンプルをＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ寒天プレートを用いて３７℃で一晩培養した。選別したコロニーを、ＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミド１００ｎｇをＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１６５μＭのｐＵＣ１９＿ｓｅｑＦＷプライマー（配列番号２５）及び０．１６５μＭのｐＵＣ１９＿ｓｅｑＲＶプライマー（配列番号２６）を用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により配列解析を行なった。正しく作製できたプラスミドを鋳型に、Ｔ７＿ｐＵＣ１９＿ＦＷ（配列番号２７）及びＭ１３＿ＲＶプライマー（配列番号２８）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，２０秒）により、鋳型ＤＮＡを作製し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行ない、８Ｍ尿素を含む５％ポリアクリルアミドゲルを用いて切り出し精製を行なった。
【0243】
【表11】
【0244】
【表12】
【0245】
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
実施例化合物（ＡＣＴＢ＿２６）の編集誘導能評価の方法は、試験例１の（Ｂ）－（Ｄ）と同様の方法を用いた。但し、プライマーは、以下に記載したものを用いた。実施例の化合物（ＡＣＴＢ＿２６）を用いた場合の編集割合（％）を図９Ａ及び図９Ｂに示した。その結果、実施例の化合物（ＡＣＴＢ＿２６）は、５０％程度の編集割合を示した。
実施例化合物（ＡＣＴＢ＿２６）の編集誘導能評価の方法は、試験例１の（Ｂ）－（Ｄ）と同様の方法を用いた。但し、プライマーは、以下に記載したものを用いた。実施例の化合物（ＡＣＴＢ＿２６）を用いた場合の編集割合（％）を図９Ａ及び図９Ｂに示した。その結果、実施例の化合物（ＡＣＴＢ＿２６）は、５０％程度の編集割合を示した。
【0246】
【表13】
【0247】
（試験例４）ＧＡＰＤＨ遺伝子配列を有するＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）ＲＮＡの合成
操作は、試験例３の（Ａ）ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行った。但し、オリゴＤＮＡは、以下に記載したものを用いた。
（Ａ）ＲＮＡの合成
操作は、試験例３の（Ａ）ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行った。但し、オリゴＤＮＡは、以下に記載したものを用いた。
【0248】
【表14】
【0249】
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
実施例化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６）の編集誘導能評価の方法は、試験例３の「（Ｂ）編集誘導能評価とその結果」と同様の方法を用いた。実施例の化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６）を用いた場合の編集割合（％）を図９Ａ及び図９Ｂに示した。その結果、実施例の化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６）は、９０％程度の編集割合を示した。
実施例化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６）の編集誘導能評価の方法は、試験例３の「（Ｂ）編集誘導能評価とその結果」と同様の方法を用いた。実施例の化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６）を用いた場合の編集割合（％）を図９Ａ及び図９Ｂに示した。その結果、実施例の化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６）は、９０％程度の編集割合を示した。
【0250】
（試験例５）ＧＦＡＰ遺伝子配列を有するＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）標的ＲＮＡの合成
操作は、試験例３の（Ａ）ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行った。但し、オリゴＤＮＡは、以下に記載したものを用いた。
（Ａ）標的ＲＮＡの合成
操作は、試験例３の（Ａ）ＲＮＡの合成に記載した方法と同様に行った。但し、オリゴＤＮＡは、以下に記載したものを用いた。
【0251】
【表15】
【0252】
（Ｂ）標的編集ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の合成
ＧＦＡＰ＿ｄｅｌ０３（配列番号３８）は、ＧＦＡＰ＿ｄｅｌ０３＿ＲＶ（配列番号３４）とＴ７ｐｒｏＧＧＧ（配列番号２９）のオリゴＤＮＡを用いてアニーリング反応（アニーリングｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で、８０℃，３ｍｉｎ加熱し、１５ｍｉｎかけて２５℃まで冷却）を行なうことでｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の鋳型ＤＮＡを作製した。５’ＡＳ＿ＧＦＡＰ＿ｇＲＮＡ（配列番号３７）は、５’ＡＳ＿ＧＦＡＰ＿ＦＷ（配列番号３５）、５’ＡＳ＿ＡＤｇ＿ＲＶオリゴＤＮＡ（配列番号３６）及びＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ，Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＢ）を用いて２５℃で３０分反応を行ない、鋳型ＤＮＡを作製した。その後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。それぞれの鋳型ＤＮＡ １．０μｇとＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行ない、８Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミドゲルを用いて切り出し精製を行った。
ＧＦＡＰ＿ｄｅｌ０３（配列番号３８）は、ＧＦＡＰ＿ｄｅｌ０３＿ＲＶ（配列番号３４）とＴ７ｐｒｏＧＧＧ（配列番号２９）のオリゴＤＮＡを用いてアニーリング反応（アニーリングｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で、８０℃，３ｍｉｎ加熱し、１５ｍｉｎかけて２５℃まで冷却）を行なうことでｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の鋳型ＤＮＡを作製した。５’ＡＳ＿ＧＦＡＰ＿ｇＲＮＡ（配列番号３７）は、５’ＡＳ＿ＧＦＡＰ＿ＦＷ（配列番号３５）、５’ＡＳ＿ＡＤｇ＿ＲＶオリゴＤＮＡ（配列番号３６）及びＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ，Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＢ）を用いて２５℃で３０分反応を行ない、鋳型ＤＮＡを作製した。その後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。それぞれの鋳型ＤＮＡ １．０μｇとＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行ない、８Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミドゲルを用いて切り出し精製を行った。
【0253】
【表16】
【0254】
【表17】
【0255】
（Ｃ）編集誘導能評価
実施例化合物（ＧＦＡＰ＿２６）の編集誘導能評価の方法は、試験例３の「（Ｂ）編集誘導能評価とその結果」と同様の方法を用いて行った。
実施例化合物（ＧＦＡＰ＿２６）の編集誘導能評価の方法は、試験例３の「（Ｂ）編集誘導能評価とその結果」と同様の方法を用いて行った。
【0256】
（試験例６）ｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０によるＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）アニーリング反応
０．３μＭのＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡと０．９μＭの実施例及び参考例の化合物（ｇＲＮＡ）とをアニーリングｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で、８０℃、３ｍｉｎ加熱し、１５ｍｉｎかけて２５℃まで冷却した。
（Ａ）アニーリング反応
０．３μＭのＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡと０．９μＭの実施例及び参考例の化合物（ｇＲＮＡ）とをアニーリングｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で、８０℃、３ｍｉｎ加熱し、１５ｍｉｎかけて２５℃まで冷却した。
【0257】
（Ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ編集反応
アニーリング反応によりＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡがｇＲＮＡと完全に複合体を形成したと仮定し、以下のＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体濃度を計算した。編集反応は、ｅｄｉｔｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５），２ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＤＴＴ，０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）中、５ｎＭ Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体に対して、組み換えｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０（酵母発現系を用いて合成・精製した。Ｍacbeth,MR.and Bass,BL. Methods Enzymol. 424, 319-331 (2007), Fukuda, M. et al. Sci. Rep. srep41478 (2017)を参照）を終濃度２５０ｎＭとなるように加え、３７℃で３０分インキュベートすることで行なった。
アニーリング反応によりＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡがｇＲＮＡと完全に複合体を形成したと仮定し、以下のＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体濃度を計算した。編集反応は、ｅｄｉｔｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５），２ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＤＴＴ，０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）中、５ｎＭ Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体に対して、組み換えｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０（酵母発現系を用いて合成・精製した。Ｍacbeth,MR.and Bass,BL. Methods Enzymol. 424, 319-331 (2007), Fukuda, M. et al. Sci. Rep. srep41478 (2017)を参照）を終濃度２５０ｎＭとなるように加え、３７℃で３０分インキュベートすることで行なった。
【0258】
（Ｃ）編集解析方法
編集反応後のＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製し、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて、Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｒ０１プライマーによりｃＤＮＡを合成した。その後、Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号１８）およびＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｒ０１プライマー（配列番号１５）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（変性：９８℃、１０秒、アニーリング：５５℃、１５秒、伸長：６８℃、２０秒）により、ｃＤＮＡを増幅した。得られたｃＤＮＡの配列解析はＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号１８）、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｋｉｔを用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒにより解析した。シーケンシングにより得られたクロマトチャートより、標的部位（Ａ３１１）のピーク高比（Ｇ／（Ｇ＋Ａ））から編集割合（％）を算出した。
編集反応後のＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製し、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて、Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｒ０１プライマーによりｃＤＮＡを合成した。その後、Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号１８）およびＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｒ０１プライマー（配列番号１５）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（変性：９８℃、１０秒、アニーリング：５５℃、１５秒、伸長：６８℃、２０秒）により、ｃＤＮＡを増幅した。得られたｃＤＮＡの配列解析はＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号１８）、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｋｉｔを用いてシーケンシング反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒにより解析した。シーケンシングにより得られたクロマトチャートより、標的部位（Ａ３１１）のピーク高比（Ｇ／（Ｇ＋Ａ））から編集割合（％）を算出した。
【0259】
（Ｄ）編集解析の結果
実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２１、ｄｅｌ０３＿２６及びｄｅｌ０３＿３２）を用いた場合の編集割合（％）を図１０に示した。図中、ＡＤｇ（－）は、ｇＲＮＡを加えない場合を示す。実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２１）は、参考例１（ｄｅｌ０３＿０１）の化合物及び参考例２の化合物（ｄｅｌ０３＿２２）と同程度のｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０による編集誘導活性を示した。また、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６及びｄｅｌ０３＿３２）のように修飾核酸を導入した場合でもｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０による編集誘導活性を示した。
実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２１、ｄｅｌ０３＿２６及びｄｅｌ０３＿３２）を用いた場合の編集割合（％）を図１０に示した。図中、ＡＤｇ（－）は、ｇＲＮＡを加えない場合を示す。実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２１）は、参考例１（ｄｅｌ０３＿０１）の化合物及び参考例２の化合物（ｄｅｌ０３＿２２）と同程度のｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０による編集誘導活性を示した。また、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６及びｄｅｌ０３＿３２）のように修飾核酸を導入した場合でもｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０による編集誘導活性を示した。
【0260】
（実施例５１から６６）
実施例５１から５７のオリゴヌクレオチド化合物は参考例１のオリゴヌクレオチドの配列を元にして、以下に示すように修飾ヌクレオチドを導入して得られたものである。また実施例５８から６３のオリゴヌクレオチド化合物は、ｈＧＡＰＤＨに対応する種々の長さの第一オリゴヌクレオチド（ＡＳＲ）を有し、以下に示すように修飾ヌクレオチドを導入して得られたものである。実施例６４から６６のオリゴヌクレオチド化合物は、以下に示す配列の第一オリゴヌクレオチド（ＡＳＲ）を有し、以下に示すように修飾ヌクレオチドを導入して得られたものである。これらのオリゴヌクレオチド化合物は実施例１から５０と同様にホスホロアミダイト法で合成した。
実施例５１から５７のオリゴヌクレオチド化合物は参考例１のオリゴヌクレオチドの配列を元にして、以下に示すように修飾ヌクレオチドを導入して得られたものである。また実施例５８から６３のオリゴヌクレオチド化合物は、ｈＧＡＰＤＨに対応する種々の長さの第一オリゴヌクレオチド（ＡＳＲ）を有し、以下に示すように修飾ヌクレオチドを導入して得られたものである。実施例６４から６６のオリゴヌクレオチド化合物は、以下に示す配列の第一オリゴヌクレオチド（ＡＳＲ）を有し、以下に示すように修飾ヌクレオチドを導入して得られたものである。これらのオリゴヌクレオチド化合物は実施例１から５０と同様にホスホロアミダイト法で合成した。
【0261】
【表18】
【0262】
表中の「分子量」は、負イオンＥＳＩ質量分析による実測値を示す。表中の「配列」において大文字はＲＮＡ、小文字はＤＮＡ、Ｎ（Ｍ）はＤ－リボフラノースの２’－Ｏ－メチル化、Ｎ（Ｆ）はＤ－リボフラノースの２’－デオキシ－２’－フルオロ化、Ｎ（Ｌ）は、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン化、Ｎ（Ｅ）は、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン化を示す。「９」は－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３－、「１８」は－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）６－で表されるリンカーを示す。「＾」はヌクレオシドユニット間が－Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）－で結合したものを示す。特に記載のない場合は、ヌクレオシドユニット間、又はヌクレオシドユニットとリンカーが－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－で結合したものを示す。オリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端は、水素原子が化学式中の酸素原子と結合した水酸基となっている。
【0263】
（試験例７）Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡに対する編集誘導能評価（２）
（Ａ）アニーリング反応、ｉｎ ｖｉｔｒｏ編集反応、及び編集解析方法
試験例１又は試験例６と同様に行った。ここで、ｈＡＤＡＲ２の場合は、５ｎＭのＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体に対して、組み換えｈＡＤＡＲ２を１２．５ｎＭになるように加え、３７℃で１時間インキュベートすることで行なった。また、ｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０の場合は、５ｎＭのＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体に対して、組み換えｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０を２５０ｎＭになるように加え、３７℃で３０分インキュベートすることで行なった。
（Ａ）アニーリング反応、ｉｎ ｖｉｔｒｏ編集反応、及び編集解析方法
試験例１又は試験例６と同様に行った。ここで、ｈＡＤＡＲ２の場合は、５ｎＭのＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体に対して、組み換えｈＡＤＡＲ２を１２．５ｎＭになるように加え、３７℃で１時間インキュベートすることで行なった。また、ｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０の場合は、５ｎＭのＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体に対して、組み換えｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０を２５０ｎＭになるように加え、３７℃で３０分インキュベートすることで行なった。
【0264】
（Ｂ）編集解析の結果
図１１Ａ及び図１２ＡにｈＡＤＡＲ２の結果を、図１１Ｂ及び図１２ＢにｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０の結果を示す。図１１Ａに示すように、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿３２、３９、４２、４３、４４及び４５）のように修飾核酸を導入した場合でも参考例１の化合物と同様にＡＤＡＲ２による編集誘導活性を示した。また、図１１Ｂに示すように、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿３２、３９、４３及び４５）のように修飾核酸を導入した場合でも参考例１の化合物と同様にＡＤＡＲ１ ｐ１１０による編集誘導活性を示した。一方、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿４２及び４４）のような修飾核酸を導入した場合は、参考例１の化合物と比較して、ＡＤＡＲ１ ｐ１１０による編集誘導活性は、著しく低下した。上記のことから、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿４２及び４４）は、ＡＤＡＲ２に選択的に作用することが明らかとなった。
図１１Ａ及び図１２ＡにｈＡＤＡＲ２の結果を、図１１Ｂ及び図１２ＢにｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０の結果を示す。図１１Ａに示すように、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿３２、３９、４２、４３、４４及び４５）のように修飾核酸を導入した場合でも参考例１の化合物と同様にＡＤＡＲ２による編集誘導活性を示した。また、図１１Ｂに示すように、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿３２、３９、４３及び４５）のように修飾核酸を導入した場合でも参考例１の化合物と同様にＡＤＡＲ１ ｐ１１０による編集誘導活性を示した。一方、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿４２及び４４）のような修飾核酸を導入した場合は、参考例１の化合物と比較して、ＡＤＡＲ１ ｐ１１０による編集誘導活性は、著しく低下した。上記のことから、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿４２及び４４）は、ＡＤＡＲ２に選択的に作用することが明らかとなった。
【0265】
図１２Ａに示すように、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６、及びｄｅｌ０３＿４６からｄｅｌ０３＿４８）のように修飾核酸を導入した場合でも参考例１の化合物と同様にＡＤＡＲ２による編集誘導活性を示した。また、図１２Ｂに示すように、実施例の化合物ｄｅｌ０３＿２６、ｄｅｌ０３＿４６及びｄｅｌ０３＿４７）のように修飾核酸を導入した場合でも参考例１の化合物と同様にＡＤＡＲ１ ｐ１１０による編集誘導活性を示した。一方、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿４８）のような修飾核酸を導入した場合は、参考例１の化合物と比較して、ＡＤＡＲ１ ｐ１１０による編集誘導活性は、著しく低下した。上記のことから、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの間にリンカーを有する実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿４８）は、ＡＤＡＲ２に選択的に作用することが明らかとなった。
【0266】
（試験例８）培養細胞内における編集誘導能評価（２）
（Ａ）細胞培養
ＨｅＬａ細胞を２４－ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅに５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように継代し、４８時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて５０ｎｇのｐｓｉＣＨＥＣＫ２ＴＭ＿Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘ、３５０ｎｇのＡＤＡＲを発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ２、ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、または、ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ ｐ１５０）、２０ｎＭの実施例又は参考例の化合物であるｇＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。コントロールとして、実施例又は参考例の化合物であるｇＲＮＡの代わりにｐＳｕｐｅｒ＿ｎｅｏをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎしたものを用いた 。
（Ａ）細胞培養
ＨｅＬａ細胞を２４－ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅに５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように継代し、４８時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて５０ｎｇのｐｓｉＣＨＥＣＫ２ＴＭ＿Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘ、３５０ｎｇのＡＤＡＲを発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ２、ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、または、ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ ｐ１５０）、２０ｎＭの実施例又は参考例の化合物であるｇＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。コントロールとして、実施例又は参考例の化合物であるｇＲＮＡの代わりにｐＳｕｐｅｒ＿ｎｅｏをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎしたものを用いた 。
【0267】
（Ｂ）編集解析方法、及びルシフェラーゼレポーターアッセイ方法
試験例２と同様に行った。
試験例２と同様に行った。
【0268】
（Ｃ）編集解析、及びルシフェラーゼレポーターアッセイの結果
実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６、及びｄｅｌ０３＿３４からｄｅｌ０３＿４０）を用いた場合の編集割合（％）を図１３Ａに示した。ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、またはＡＤＡＲ１ ｐ１５０を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合では、１０％から４０％程度の編集割合を示し、その割合は、ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、または、ＡＤＡＲ１ ｐ１５０プラスミドのみをトランスフェクトした場合よりも明らかに高かった。
実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６、及びｄｅｌ０３＿３４からｄｅｌ０３＿４０）を用いた場合の編集割合（％）を図１３Ａに示した。ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、またはＡＤＡＲ１ ｐ１５０を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合では、１０％から４０％程度の編集割合を示し、その割合は、ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、または、ＡＤＡＲ１ ｐ１５０プラスミドのみをトランスフェクトした場合よりも明らかに高かった。
【0269】
実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６、及びｄｅｌ０３＿３４からｄｅｌ０３＿４０）を用いた場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を図１３Ｂに示す。実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６、及びｄｅｌ０３＿３８からｄｅｌ０３＿４０）を用いた場合、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、またはＡＤＡＲ１ ｐ１５０プラスミドのみをトランスフェクトした場合よりも明らかに高いルシフェラーゼ活性が認められた。また、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿３４からｄｅｌ０３＿３７）を用いた場合、ＡＤＡＲ２プラスミドのみをトランスフェクトした場合よりも明らかに高いルシフェラーゼ活性が認められた。しかし、ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、またはＡＤＡＲ１ ｐ１５０プラスミドをトランスフェクトした場合のルシフェラーゼ活性は、非常に弱かった。以上のことから、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの間にリンカーを有する実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿３４からｄｅｌ０３＿３７）は、ＡＤＡＲ２に特異的であることが明らかとなった。
【0270】
実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６、並びにｄｅｌ０３＿３２、３９、４３及び４５）を用いた場合の編集割合（％）を図１４Ａに示した。ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合では、６０％程度の編集割合を示し、その割合は、ＡＤＡＲ２プラスミドのみをトランスフェクトした場合よりも明らかに高かった。ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、またはＡＤＡＲ１ ｐ１５０を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合では、１０％から４０％程度の編集割合を示し、その割合は、ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、またはＡＤＡＲ１ ｐ１５０プラスミドのみをトランスフェクトした場合よりも明らかに高かった。
【0271】
実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６、並びにｄｅｌ０３＿３２、３９、４３及び４５）を用いた場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を図１４Ｂに示す。実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６、並びにｄｅｌ０３＿３２、３９、４３及び４５）を用いた場合、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、または、ＡＤＡＲ１ ｐ１５０プラスミドのみをトランスフェクトした場合よりも明らかに高いルシフェラーゼ活性が認められた。
【0272】
実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６、並びにｄｅｌ０３＿４２、４４、４６、４７及び４８）を用いた場合の編集割合（％）を図１５Ａに示した。ＡＤＡＲ２を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合では、３０％から６０％程度の編集割合を示し、その割合は、ＡＤＡＲ２プラスミドのみをトランスフェクトした場合よりも明らかに高かった。実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６、４６、及び、４７）を用いて、ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、またはＡＤＡＲ１ ｐ１５０を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合では、１０％から３０％程度の編集割合を示し、その割合は、ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、またはｐ１５０プラスミドのみをトランスフェクトした場合よりも明らかに高かった。一方、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿４２、４４、及び、４８）を用いて、ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、またはＡＤＡＲ１ ｐ１５０を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合では、その割合は、ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、またはＡＤＡＲ１ｐ１５０プラスミドのみをトランスフェクトした場合と同程度で、編集活性がほとんど認められなかった。
【0273】
実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６、並びにｄｅｌ０３＿４２、４４、４６、４７及び４８）を用いた場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を図１５Ｂに示す。実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿２６、並びにｄｅｌ０３＿４６及び４７）を用いた場合、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、またはｐ１５０プラスミドのみをトランスフェクトした場合よりも明らかに高いルシフェラーゼ活性が認められた。一方、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿４２、４４及び４８）を用いて、ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、またはＡＤＡＲ１ ｐ１５０を発現するプラスミドをトランスフェクトした場合では、その割合は、ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、またはＡＤＡＲ１ ｐ１５０プラスミドのみをトランスフェクトした場合と同程度で、ルシフェラーゼ活性がほとんど認められなかった。上記のことから、実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿４２、４４）、及び第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの間にリンカーを有する実施例の化合物（ｄｅｌ０３＿４８）は、ＡＤＡＲ２に選択的に作用することが明らかとなった。
【0274】
（試験例９）ＧＡＰＤＨ遺伝子配列を有するＲＮＡに対する編集誘導能評価（２）
（Ａ）ＲＮＡの合成、及び編集誘導能評価
ｈＡＤＡＲ２に加えて、試験例６に記載のｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０を用いたこと以外は試験例４と同様に行った。ここで、ｈＡＤＡＲ２の場合は、５ｎＭのＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体に対して、組み換えｈＡＤＡＲ２を１２．５ｎＭになるように加え、３７℃で１時間インキュベートすることで行なった。また、ｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０の場合は、５ｎＭ Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体に対して、組み換えｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０を２５０ｎＭになるように加え、３７℃で３０分インキュベートすることで行なった。
（Ａ）ＲＮＡの合成、及び編集誘導能評価
ｈＡＤＡＲ２に加えて、試験例６に記載のｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０を用いたこと以外は試験例４と同様に行った。ここで、ｈＡＤＡＲ２の場合は、５ｎＭのＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体に対して、組み換えｈＡＤＡＲ２を１２．５ｎＭになるように加え、３７℃で１時間インキュベートすることで行なった。また、ｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０の場合は、５ｎＭ Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体に対して、組み換えｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０を２５０ｎＭになるように加え、３７℃で３０分インキュベートすることで行なった。
【0275】
（Ｂ）編集誘導能評価の結果
実施例化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、及びＧＡＰＤＨ＿４９から５１）の編集誘導能評価の方法は、試験例４記載の（Ｂ）編集誘導能評価とその結果と同様の方法を用いた。実施例の化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、及びＧＡＰＤＨ＿４９から５１）を用いた場合の編集割合（％）を図１６Ａ及び図１６Ｂに示した。その結果、実施例の化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、及び、ＧＡＰＤＨ＿４９から５１）は、ｈＡＤＡＲ２、及び、ｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０を用いた場合において、高い編集割合を示した。
実施例化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、及びＧＡＰＤＨ＿４９から５１）の編集誘導能評価の方法は、試験例４記載の（Ｂ）編集誘導能評価とその結果と同様の方法を用いた。実施例の化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、及びＧＡＰＤＨ＿４９から５１）を用いた場合の編集割合（％）を図１６Ａ及び図１６Ｂに示した。その結果、実施例の化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、及び、ＧＡＰＤＨ＿４９から５１）は、ｈＡＤＡＲ２、及び、ｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０を用いた場合において、高い編集割合を示した。
【0276】
実施例化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、並びにＧＡＰＤＨ＿３９、５２及び５３）の編集誘導能評価の方法は、試験例４記載の（Ｂ）編集誘導能評価とその結果と同様の方法を用いた。実施例の化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、並びにＧＡＰＤＨ＿３９、５２及び５３）を用いた場合の編集割合（％）を図１７Ａ及び図１７Ｂに示した。その結果、実施例の化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、並びにＧＡＰＤＨ＿３９、５２及び５３）は、ｈＡＤＡＲ２、及びｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０を用いた場合において、ｇＲＮＡを添加しない場合と比べ、高い編集割合を示した。
【0277】
（試験例１０）培養細胞内におけるＧＡＰＤＨ遺伝子配列を有するＲＮＡに対する編集誘導能評価
（Ａ）細胞培養
ＨＥＫ２９３細胞を２４－ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅに５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように継代し、４８時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて５００ｎｇのＡＤＡＲを発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ２、ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、またはｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ ｐ１５０）、５０ｎＭの実施例又は参考例の化合物であるｇＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。コントロールとして、実施例又は参考例の化合物であるｇＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎしていない培養細胞を用いた。
（Ａ）細胞培養
ＨＥＫ２９３細胞を２４－ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅに５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように継代し、４８時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて５００ｎｇのＡＤＡＲを発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ２、ｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ ｐ１１０、またはｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ ｐ１５０）、５０ｎＭの実施例又は参考例の化合物であるｇＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。コントロールとして、実施例又は参考例の化合物であるｇＲＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎしていない培養細胞を用いた。
【0278】
（Ｂ）編集誘導能評価とその結果
実施例化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、及びＧＡＰＤＨ＿４９から５１）の編集誘導能評価の方法は、試験例４の（Ｂ）編集誘導能評価とその結果と同様の方法を用いた。実施例の化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、及びＧＡＰＤＨ＿４９から５１）を用いた場合の編集割合（％）を図１６Ｃに示した。その結果、実施例の化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、及び、ＧＡＰＤＨ＿４９から５１）は、ｈＡＤＡＲ２、ｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０、及びｈＡＤＡＲ１ ｐ１５０を用いた場合において、高い編集割合を示した。
実施例化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、及びＧＡＰＤＨ＿４９から５１）の編集誘導能評価の方法は、試験例４の（Ｂ）編集誘導能評価とその結果と同様の方法を用いた。実施例の化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、及びＧＡＰＤＨ＿４９から５１）を用いた場合の編集割合（％）を図１６Ｃに示した。その結果、実施例の化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、及び、ＧＡＰＤＨ＿４９から５１）は、ｈＡＤＡＲ２、ｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０、及びｈＡＤＡＲ１ ｐ１５０を用いた場合において、高い編集割合を示した。
【0279】
実施例化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、並びにＧＡＰＤＨ＿３９、５２及び５３）の編集誘導能評価の方法は、試験例４の（Ｂ）編集誘導能評価とその結果と同様の方法を用いた。実施例の化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、並びにＧＡＰＤＨ＿３９、５２及び５３）を用いた場合の編集割合（％）を図１８に示した。その結果、実施例の化合物（ＧＡＰＤＨ＿２６、並びにＧＡＰＤＨ＿３９、５２及び５３）は、ｈＡＤＡＲ２、ｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０、及びｈＡＤＡＲ１ ｐ１５０を用いた場合において、ｇＲＮＡを添加しない場合と比べ、高い編集割合を示した。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図17A】
【図17B】
【図18】
【配列表】