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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-11-19
(45)【発行日】2025-11-28
(54)【発明の名称】卵巣悪性腫瘍の検出方法及び検出試薬
(51)【国際特許分類】
G01N 33/574 20060101AFI20251120BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20251120BHJP
【ＦＩ】
G01N33/574 A ZNA
G01N33/53 D
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2022503238
(86)(22)【出願日】2021-02-09
(86)【国際出願番号】 JP2021004736
(87)【国際公開番号】W WO2021172000
(87)【国際公開日】2021-09-02
【審査請求日】2024-01-15
(31)【優先権主張番号】P 2020030210
(32)【優先日】2020-02-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】505155528
【氏名又は名称】公立大学法人横浜市立大学
(73)【特許権者】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】宮城 悦子
(72)【発明者】
【氏名】荒川 憲昭
(72)【発明者】
【氏名】大竹 則久
(72)【発明者】
【氏名】明庭 昇平
【審査官】倉持 俊輔
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／０８４９１２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１２－１４５５００（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１３－０６１３２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００７－５０６９６５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００５／００３７３８９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００５／００９５５９２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】INABA N. et al.，Immunohistochemical detection of pregnancy-specific protein (SP1) and placenta-specific tissue protein (PP5, PP10, PP11, and PP12) in ovarian adenocarcinomas，Oncodevelopmental Biology and Medicine，1982年，Vol.3，pp.379-389
【文献】BOLTENBERG Anette and FURGYIK Stefan，Placental Proteins (PP5, PP12 and PP14) in ovarian tumors，Acta Obstet Gynecol Scand，1987年，Vol.66，pp.213-215
【文献】ZHANG Qing et al.，A multiplex methylation-specific PCR assay for the detection of early-stage ovarian cancer using cell-free serum DNA，Gynecologic Oncology，2013年，Vol.130，pp.132-139
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／５７４，
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ），
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
検体において、ＴＦＰＩ２量を測定することを含む、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法であって、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別することは、卵巣腫瘍が悪性であるか良性であるかのみを鑑別し、
前記ＴＦＰＩ２量の測定値が、予め設定した基準値を超えた場合に、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）が検出されたとする、方法。
【請求項2】
前記ＴＦＰＩ２量が、ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド量及びインタクトＴＦＰＩ２量の合計である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＴＦＰＩ２量の測定が、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を用いた抗原抗体反応により行われるものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記抗体が、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を認識する抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
質量分析法を用いて測定を行う、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項6】
さらにＴＦＰＩ２以外の卵巣癌マーカーを検出する方法を組み合わせて行うものである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
配列番号１に示すアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を含む、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するための試薬であって、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別することは、卵巣腫瘍が悪性であるか良性であるかのみを鑑別する、試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、組織因子経路インヒビター２（Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ Ｐａｔｈｗａｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２；ＴＦＰＩ２）を測定対象とする卵巣悪性腫瘍の検出方法及び検出試薬に関する。
【背景技術】
【0002】
卵巣がんは全世界約２８万人、日本約１万人の新規罹患者とされており（ＧＬＯＢＯＣＡＮ２０１８）、婦人科悪性腫瘍の中で最も死亡数が多いがんである。現状の卵巣がん診断は画像診断とＣＡ１２５を主としＣＡ１９－９等の複数マーカーによる血液検査で悪性・良性を推測し、悪性疑いの場合、手術による卵巣摘出、摘出病片の病理検査による確定診断を実施している。しかし、代表的な卵巣癌マーカーであるＣＡ１２５は卵巣がんの検出においては優れた感度を有するが、月経や腹膜炎、子宮内膜症を含む良性腫瘍などでも大幅に変動する場合がある。その結果、卵巣がん症例に対する治療対応の遅れや疾患の偽陽性判定による良性疾患の過剰治療、それに伴う患者のＱＯＬの低下が問題となっている。従って、ＣＡ１２５を補完する新規卵巣がんマーカーの開発が進められている。
【0003】
ヒト精巣上体蛋白４（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ４：ＨＥ４）は２０１７年に本邦で保険適用された新規卵巣がんマーカーである。ＨＥ４はＣＡ１２５に比べて感度は劣るものの、子宮内膜症やその他良性疾患における陽性率が低く高い特異度を有するマーカーとされている。更に、ＨＥ４とＣＡ１２５は相関が低いことから、両マーカーの測定値と閉経情報等から卵巣悪性腫瘍推定値（Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｏｖａｒｉａｎ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：ＲＯＭＡ）を求めることで、卵巣腫瘍における良性と悪性の鑑別精度がさらに向上するとされている（非特許文献１）。しかしながら、様々な体外診断用医薬品企業から製品化されているＣＡ１２５はその測定値が企業毎に差異が生じることが指摘されている。その一因として各企業が測定試薬に採用する抗体や濃度算出に用いる標準品の差異が挙げられており、正確なＲＯＭＡを算出するためにはＣＡ１２５測定値の試薬間差を考慮しなければならないことが課題とされている。したがって、患者負担の少ない血液検査による簡便かつ正確な卵巣悪性腫瘍の検出方法が切望されている。
【0004】
組織因子経路インヒビター２（ＴＦＰＩ２）は、胎盤タンパク質５（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ５；ＰＰ５）と同一のタンパク質であり、３つのクニッツ型プロテアーゼインヒビタードメインを含む胎盤由来セリンプロテアーゼインヒビターである。ＴＦＰＩ２は卵巣癌細胞株において明細胞癌細胞株から特異的に産生され、卵巣癌患者組織における遺伝子発現は明細胞癌患者のみで特異的に向上することが明らかにされ（特許文献１）、血中ＴＦＰＩ２の測定により卵巣明細胞癌を検出する方法が開示された（特許文献２および３、非特許文献２および３）。
一方、別の研究グループから卵巣悪性腫瘍の１つである高異型度漿液性がん（ＨＧＳＣ）と卵巣良性腫瘍の血漿のプロテオーム解析の結果、ＨＧＳＣ群で測定中央値が上昇するタンパク質群の一つとしてＴＦＰＩ２が報告されている（非特許文献４）。しかし今日まで、ＴＦＰＩ２が境界悪性腫瘍を含む多様な組織型を有する卵巣悪性腫瘍と卵巣良性腫瘍の鑑別に適用できるかは不明であった。
一方、別の研究グループから卵巣悪性腫瘍の１つである高異型度漿液性がん（ＨＧＳＣ）と卵巣良性腫瘍の血漿のプロテオーム解析の結果、ＨＧＳＣ群で測定中央値が上昇するタンパク質群の一つとしてＴＦＰＩ２が報告されている（非特許文献４）。しかし今日まで、ＴＦＰＩ２が境界悪性腫瘍を含む多様な組織型を有する卵巣悪性腫瘍と卵巣良性腫瘍の鑑別に適用できるかは不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特許第５２２４３０９号
【文献】特許第６０７４６７６号
【文献】国際公開第２０１６／０８４９１２号
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, ３６．２（２０１５）,１０４５－１０５３
【文献】Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．， ２０１３，１２（１０），４３４０－４３５０
【文献】ＰｌｏＳ ｏｎｅ １１．１０ （２０１６）: ｅ０１６５６０９.
【文献】Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ９（２０１９）： １１５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、卵巣悪性腫瘍を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法、及び前記方法に利用できる試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは鋭意検討し、血中ＴＦＰＩ２値は卵巣良性腫瘍患者と比較して卵巣悪性腫瘍患者で有意に向上することを見出し、ＴＦＰＩ２が高い特異度をもって卵巣悪性腫瘍を検出しうることに想到し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。
［１］検体において、ＴＦＰＩ２量を測定することを含む、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法。
［２］前記ＴＦＰＩ２量の測定値が、予め設定した基準値を超えた場合に、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）が検出されたとする、［１］に記載の方法。
［３］前記ＴＦＰＩ２量が、ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド量及びインタクトＴＦＰＩ２量の合計である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記ＴＦＰＩ２量の測定が、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を用いた抗原抗体反応により行われるものである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記抗体が、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を認識する抗体である、［４］に記載の方法。
［６］質量分析法を用いて測定を行う、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［７］さらにＴＦＰＩ２以外の卵巣癌マーカーを検出する方法を組み合わせて行うものである、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］配列番号１に示すアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を含む、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するための試薬。
すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。
［１］検体において、ＴＦＰＩ２量を測定することを含む、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法。
［２］前記ＴＦＰＩ２量の測定値が、予め設定した基準値を超えた場合に、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）が検出されたとする、［１］に記載の方法。
［３］前記ＴＦＰＩ２量が、ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド量及びインタクトＴＦＰＩ２量の合計である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記ＴＦＰＩ２量の測定が、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を用いた抗原抗体反応により行われるものである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記抗体が、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を認識する抗体である、［４］に記載の方法。
［６］質量分析法を用いて測定を行う、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［７］さらにＴＦＰＩ２以外の卵巣癌マーカーを検出する方法を組み合わせて行うものである、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］配列番号１に示すアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を含む、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するための試薬。
【発明の効果】
【0009】
本発明により、卵巣悪性腫瘍を卵巣良性腫瘍と鑑別して、簡便かつ高い精度で検出する方法、及び前記方法に利用できる試薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】卵巣良性腫瘍群と卵巣悪性腫瘍患者群におけるＴＦＰＩ２又はＣＡ１２５測定値のボックスプロット（Ｂｏｘ Ｐｌｏｔ）を示した図。縦軸は血中ＴＦＰＩ２又はＣＡ１２５量を表す。
【図2】卵巣良性腫瘍群と卵巣悪性腫瘍群の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示した図。
【図3】卵巣良性腫瘍群と卵巣悪性腫瘍患者群におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１２５との測定値の相関を示した図。縦軸はＣＡ１２５測定値、横軸はＴＦＰＩ２測定値を表す。
【図4】卵巣良性腫瘍群と卵巣悪性腫瘍患者群におけるＴＦＰＩ２又はＣＡ１２５測定値のボックスプロットを示した図。縦軸は血中ＴＦＰＩ２又はＣＡ１２５量を表す。
【図5】卵巣良性腫瘍群と卵巣悪性腫瘍群のＲＯＣ曲線を示した図。
【図6】卵巣良性腫瘍群と卵巣悪性腫瘍患者群におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１２５との測定値の相関を示した図。縦軸はＣＡ１２５測定値、横軸はＴＦＰＩ２測定値を表す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
＜１＞本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法
本発明の第一の態様は、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法であり、検体においてＴＦＰＩ２量を測定することを含む。これは、卵巣良性腫瘍と比べて、卵巣悪性腫瘍の血液等の生体試料中においてＴＦＰＩ２の存在が上昇することに基づく方法である。検体におけるＴＦＰＩ２量の測定は、通常インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で行われる。この方法により、後述する実施例が示す通り、高い特異度で卵巣悪性腫瘍を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出することができる。
なお、本発明の方法は、卵巣悪性腫瘍を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する段階までを含むものであり、卵巣悪性腫瘍の診断に関する最終的な判断行為は含まれない。医師は、本発明の方法による検出結果等を参照して、卵巣悪性腫瘍を診断したり治療方針を立てたりする。
本発明の第一の態様は、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法であり、検体においてＴＦＰＩ２量を測定することを含む。これは、卵巣良性腫瘍と比べて、卵巣悪性腫瘍の血液等の生体試料中においてＴＦＰＩ２の存在が上昇することに基づく方法である。検体におけるＴＦＰＩ２量の測定は、通常インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で行われる。この方法により、後述する実施例が示す通り、高い特異度で卵巣悪性腫瘍を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出することができる。
なお、本発明の方法は、卵巣悪性腫瘍を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する段階までを含むものであり、卵巣悪性腫瘍の診断に関する最終的な判断行為は含まれない。医師は、本発明の方法による検出結果等を参照して、卵巣悪性腫瘍を診断したり治療方針を立てたりする。
【0012】
本発明において検出される卵巣悪性腫瘍は、悪性腫瘍と境界悪性腫瘍を指し、これらにそれぞれ含まれる種々の腫瘍が対象となり、高異型度漿液性がんを除くほかは特に限定されない。
悪性腫瘍としては、非浸潤性低異型度漿液性癌、低異型度漿液性癌、粘液性癌、類内膜癌、明細胞癌、悪性ブレンナー腫瘍、漿液粘液性癌、未分化癌（低異型度類内膜間質肉腫、高異型度類内膜間質肉腫）、混合型上皮性間葉系腫瘍（線肉腫・癌肉腫）などの上皮性；純粋型間質性腫瘍（富細胞性線維腫・線維肉腫・悪性ステロイド細胞腫瘍）、純粋型性索腫瘍（成人型顆粒膜細胞腫・若年型顆粒膜細胞腫・セルトリ細胞腫・輪状細管を伴う性索腫瘍）などの性索間質性腫瘍；セルトリ・ライディッヒ細胞腫瘍、その他の性索間質性腫瘍などの混在型性索間質性腫瘍；未分化胚細胞腫瘍／ディスジャーミノーマ・卵黄嚢腫瘍、体芽性癌（胎児性癌）・多胎芽腫・未熟奇形腫（Ｇ３）・悪性添加を伴う成熟奇形腫線維肉腫・絨毛癌・混在型胚細胞腫瘍などの胚細胞腫瘍；癌種、肉腫；悪性リンパ腫；二次性（転移性）腫瘍等が挙げられる。これらの中でも、明細胞癌、低異型度漿液性癌、類内膜癌及び粘液性癌が好ましい例示としてあげられる。また、明細胞癌、類内膜癌及び粘液性癌が更に好ましい例示としてあげられる。
境界悪性腫瘍としては、漿液性・微少乳頭状パターンを伴う漿液性、粘液性、類内膜、明細胞、腺線維種、表在性乳頭状、ブレンナー腫瘍、漿液粘液性などの上皮性；顆粒膜細胞、セルトリ・間質細胞腫瘍（中分化型）、ステロイド細胞腫瘍（分類不能型）、ギナンドブラストーマなどの性策間質性腫瘍；未熟奇形腫（Ｇ１、Ｇ２）、カルチノイド、甲状腺腫性カルチノイドなどの胚細胞腫瘍；性腺芽腫（純粋型）；等が挙げられる。
悪性腫瘍としては、非浸潤性低異型度漿液性癌、低異型度漿液性癌、粘液性癌、類内膜癌、明細胞癌、悪性ブレンナー腫瘍、漿液粘液性癌、未分化癌（低異型度類内膜間質肉腫、高異型度類内膜間質肉腫）、混合型上皮性間葉系腫瘍（線肉腫・癌肉腫）などの上皮性；純粋型間質性腫瘍（富細胞性線維腫・線維肉腫・悪性ステロイド細胞腫瘍）、純粋型性索腫瘍（成人型顆粒膜細胞腫・若年型顆粒膜細胞腫・セルトリ細胞腫・輪状細管を伴う性索腫瘍）などの性索間質性腫瘍；セルトリ・ライディッヒ細胞腫瘍、その他の性索間質性腫瘍などの混在型性索間質性腫瘍；未分化胚細胞腫瘍／ディスジャーミノーマ・卵黄嚢腫瘍、体芽性癌（胎児性癌）・多胎芽腫・未熟奇形腫（Ｇ３）・悪性添加を伴う成熟奇形腫線維肉腫・絨毛癌・混在型胚細胞腫瘍などの胚細胞腫瘍；癌種、肉腫；悪性リンパ腫；二次性（転移性）腫瘍等が挙げられる。これらの中でも、明細胞癌、低異型度漿液性癌、類内膜癌及び粘液性癌が好ましい例示としてあげられる。また、明細胞癌、類内膜癌及び粘液性癌が更に好ましい例示としてあげられる。
境界悪性腫瘍としては、漿液性・微少乳頭状パターンを伴う漿液性、粘液性、類内膜、明細胞、腺線維種、表在性乳頭状、ブレンナー腫瘍、漿液粘液性などの上皮性；顆粒膜細胞、セルトリ・間質細胞腫瘍（中分化型）、ステロイド細胞腫瘍（分類不能型）、ギナンドブラストーマなどの性策間質性腫瘍；未熟奇形腫（Ｇ１、Ｇ２）、カルチノイド、甲状腺腫性カルチノイドなどの胚細胞腫瘍；性腺芽腫（純粋型）；等が挙げられる。
【0013】
本発明において測定されるＴＦＰＩ２は、特に限定はなく、例えばインタクトＴＦＰＩ２（以降、「Ｉ－ＴＦＰＩ２」とも記す）、ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド（以降、「ＮＴ－ＴＦＰＩ２」とも記す）、又はそれらの両方であってもよい。
配列番号１に、ヒトＴＦＰＩ２のｃＤＮＡに基づくアミノ酸配列を示す。配列番号１において、開始メチオニンから２２残基目のグリシンまではシグナルペプチドである。
「インタクトＴＦＰＩ２」とは、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目から２３５残基目で表されるペプチドをいう。
配列番号１に、ヒトＴＦＰＩ２のｃＤＮＡに基づくアミノ酸配列を示す。配列番号１において、開始メチオニンから２２残基目のグリシンまではシグナルペプチドである。
「インタクトＴＦＰＩ２」とは、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目から２３５残基目で表されるペプチドをいう。
【0014】
また、「ＮＴ－ＴＦＰＩ２」は、特許文献３に記載されるように、インタクトＴＦＰＩ２のＮ末端側に位置するクニッツドメイン１を含むペプチド断片をいう。より具体的には、ＮＴ－ＴＦＰＩ２は、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの配列を少なくとも含むペプチド、または、前記配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドである。前記同一性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。また、このポリペプチドは、前記配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。なお、数個とは、好ましくは２～２０個、より好ましくは２～１０個、さらに好ましくは２～５個をいう。また、前記配列の両側に他のペプチドフラグメントを有していてもよいが、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン３を認識する抗体の抗原決定基（エピトープ）を有しないことが好ましい。
【0015】
本発明における患者由来の検体（被検試料）は、全血、血球、血清、血漿などの血液成分、細胞または組織の抽出液、尿、脳脊髄液、腹腔洗浄液、腹水などが挙げられる。また、卵巣組織生検サンプルを検査対象としてもよいが、その場合は生検試料の抽出液または培養上清を測定する。血液成分や尿などの体液を検体として用いると、簡便かつ非侵襲的に行うことができるため好ましく、検体採取の容易性、他の検査項目への汎用性を考慮すると、血液成分を検体として用いるのが特に好ましい。検体の希釈倍率は無希釈から１００倍希釈の中から使用する検体の種類や状態に応じて適宜選択すればよい。
【0016】
本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法において、ＴＦＰＩ２を検出する方法と卵巣癌の他の腫瘍マーカー（ＴＦＰＩ２以外の卵巣癌マーカー、「他の卵巣癌マーカー」とも記す）を検出する方法とを組み合わせて用いてもよい。その組み合わせ方は、特に制限されない。本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法における、ＴＦＰＩ２を検出する方法と他の卵巣癌マーカーを検出する方法との組み合わせ方の一例として、
（Ａ）測定対象検体に対し、ＴＦＰＩ２を検出する方法と他の卵巣癌マーカーを検出する方法とを、同時にまたは別個に行ない、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法、
（Ｂ）測定対象検体に対し、まずＴＦＰＩ２を検出する方法を適用し、その結果陰性と判定された検体に対して、他の卵巣癌マーカーを検出する方法で、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法、
（Ｃ）測定対象検体に対し、まず他の卵巣癌マーカーを検出する方法を適用し、その結果陰性と判定された検体に対して、ＴＦＰＩ２を検出する方法で、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法、
があげられるが、（Ｂ）または（Ｃ）の方法が、検出の際用いる試薬に無駄が生じなくなる点で好ましい。
（Ａ）測定対象検体に対し、ＴＦＰＩ２を検出する方法と他の卵巣癌マーカーを検出する方法とを、同時にまたは別個に行ない、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法、
（Ｂ）測定対象検体に対し、まずＴＦＰＩ２を検出する方法を適用し、その結果陰性と判定された検体に対して、他の卵巣癌マーカーを検出する方法で、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法、
（Ｃ）測定対象検体に対し、まず他の卵巣癌マーカーを検出する方法を適用し、その結果陰性と判定された検体に対して、ＴＦＰＩ２を検出する方法で、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法、
があげられるが、（Ｂ）または（Ｃ）の方法が、検出の際用いる試薬に無駄が生じなくなる点で好ましい。
【0017】
本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法で検出する、他の卵巣癌マーカーは、従来知られているマーカーから適宜選択すればよく、一例として、癌抗原１２５（Ｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｇｅｎ １２５、ＣＡ１２５）、癌抗原５４６（ＣＡ５４６）、癌抗原７２－４（ＣＡ７２－４）、癌抗原１３０（ＣＡ１３０）、癌抗原６０２（ＣＡ６０２）、シアリルＴｎ抗原（Ｓｉａｌｙｌ Ｔｎ ａｎｔｉｇｅｎ、ＳＬＮ）、癌関連ガラクトース転移酵素（Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｕｍｏｒ、ＧＡＴ）、リゾホスファチジン酸（ＬｙｓｏＰｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ Ａｃｉｄ、ＬＰＡ）、ヒト精巣上体タンパク質４（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＨＥ４）が挙げられる。このうち、特に他の卵巣癌マーカーとして最も汎用されているＣＡ１２５は臨床的有用性が確立している点で、本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法で使用する他の卵巣癌マーカーとして好ましい。また、本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法において検出される他の卵巣癌マーカーは、１種のみであってもよく、２種またはそれ以上であってもよい。
【0018】
また、本発明における検体の採取時期は、特に限定されない。例えば、画像診断等で骨盤内腫瘤が確認され卵巣悪性腫瘍疑いとなって精密検査が施行される術前時から、術後の病理検査により卵巣悪性腫瘍と確定診断後の経過観察時にかけていつでもよく、確定診断前後、治療開始前後など、いずれの段階で採取した検体であっても、本発明の方法に供することができる。
【0019】
本発明の検出方法では、測定により得たＴＦＰＩ２量が、予め設定した基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）を超えた場合に、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）が卵巣良性腫瘍と鑑別して検出されたと判定することが好ましい。ここで、ＴＦＰＩ２量は、インタクトＴＦＰＩ２量、ＮＴ－ＴＦＰＩ２量、又はインタクトＴＦＰＩ２量及びＮＴ－ＴＦＰＩ２量の合計のいずれでもよいが、インタクトＴＦＰＩ２量及びＮＴ－ＴＦＰＩ２量の合計が測定のしやすさと十分な感度・特異度との両立の観点からより好ましい。
【0020】
判定に用いる基準値は、測定値もしくは換算濃度値のいずれでもよい。なお、換算濃度値は、ＴＦＰＩ２を標準試料として作成された検量線に基づいて測定値から換算される値をいう。
卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して判定する基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）は、卵巣良性腫瘍と卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）をそれぞれ測定し、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析により最適な感度と特異度を示す測定値に適宜設定することができる。
卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して判定する基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）は、卵巣良性腫瘍と卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）をそれぞれ測定し、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析により最適な感度と特異度を示す測定値に適宜設定することができる。
【0021】
以下、ＴＦＰＩ２の測定方法について説明する。
本発明において、検体中のＮＴ－ＴＦＰＩ２量又はインタクトＴＦＰＩ２量を個別に測定してもよく、またその値を合計して合計量としてもよい。また、検体中のＮＴ－ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の合計量を一度に測定できる測定系で測定してもよい。あるいは、後述するように、両方の測定による合計量とインタクトＴＦＰＩ２単独の測定量とから間接的にＮＴ－ＴＦＰＩ２量を測定してもよい。
本発明の方法において、ＮＴ－ＴＦＰＩ２量及び／又はインタクトＴＦＰＩ２量を測定する方法は特に制限されない。例えば、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いる抗原抗体反応を利用した方法や、質量分析法を利用した方法が例示できる。
本発明において、検体中のＮＴ－ＴＦＰＩ２量又はインタクトＴＦＰＩ２量を個別に測定してもよく、またその値を合計して合計量としてもよい。また、検体中のＮＴ－ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の合計量を一度に測定できる測定系で測定してもよい。あるいは、後述するように、両方の測定による合計量とインタクトＴＦＰＩ２単独の測定量とから間接的にＮＴ－ＴＦＰＩ２量を測定してもよい。
本発明の方法において、ＮＴ－ＴＦＰＩ２量及び／又はインタクトＴＦＰＩ２量を測定する方法は特に制限されない。例えば、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いる抗原抗体反応を利用した方法や、質量分析法を利用した方法が例示できる。
【0022】
（ａ）標識した測定対象及び測定対象を認識する抗体を用い、標識した測定対象及び検体に含まれる測定対象が、前記抗体に競合的に結合することを利用した競合法。
（ｂ）測定対象を認識する抗体を固定化したチップに検体を接触させ、当該抗体と測定対象との結合に依存したシグナルを検出する表面プラズモン共鳴を用いた方法。
（ｃ）蛍光標識した測定対象を認識する抗体を用い、当該抗体と測定対象とが結合することで蛍光偏光度が上昇することを利用した蛍光偏光免疫測定法。
（ｄ）エピトープの異なる２種類の、測定対象を認識する抗体（うち１つは標識した抗体）を用い、当該２つの抗体と測定対象との３者の複合体を形成させるサンドイッチ法。
（ｅ）前処理として測定対象を認識する抗体により検体中の測定対象を濃縮後、その測定対象を抗体より分離し、質量分析装置等により検出する方法。
（ｄ）、（ｅ）の方法が簡便かつ汎用性が高いが、多検体を処理する上では（ｄ）の方法が試薬及び装置に関する技術が十分確立されている点でより好ましい。
（ｂ）測定対象を認識する抗体を固定化したチップに検体を接触させ、当該抗体と測定対象との結合に依存したシグナルを検出する表面プラズモン共鳴を用いた方法。
（ｃ）蛍光標識した測定対象を認識する抗体を用い、当該抗体と測定対象とが結合することで蛍光偏光度が上昇することを利用した蛍光偏光免疫測定法。
（ｄ）エピトープの異なる２種類の、測定対象を認識する抗体（うち１つは標識した抗体）を用い、当該２つの抗体と測定対象との３者の複合体を形成させるサンドイッチ法。
（ｅ）前処理として測定対象を認識する抗体により検体中の測定対象を濃縮後、その測定対象を抗体より分離し、質量分析装置等により検出する方法。
（ｄ）、（ｅ）の方法が簡便かつ汎用性が高いが、多検体を処理する上では（ｄ）の方法が試薬及び装置に関する技術が十分確立されている点でより好ましい。
【0023】
抗原抗体反応を利用してＮＴ－ＴＦＰＩ２量及び／又はインタクトＴＦＰＩ２量を測定する方法は、具体的に以下のものが挙げられる。
（Ａ）ＮＴ－ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体を用いて、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量を測定する方法（ＮＴ＋Ｉ－ＴＦＰＩ２測定系）。なお、前記ＮＴ－ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体は、配列番号１で表されるＴＦＰＩ２アミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体であることが好ましく、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を抗原決定基として認識する抗体であることがさらに好ましい。また、この方法で前述したサンドイッチ法を用いる場合は、通常、前記抗体はエピトープの異なる２種類を用いる。
（Ａ）ＮＴ－ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体を用いて、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量を測定する方法（ＮＴ＋Ｉ－ＴＦＰＩ２測定系）。なお、前記ＮＴ－ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体は、配列番号１で表されるＴＦＰＩ２アミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体であることが好ましく、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を抗原決定基として認識する抗体であることがさらに好ましい。また、この方法で前述したサンドイッチ法を用いる場合は、通常、前記抗体はエピトープの異なる２種類を用いる。
【0024】
（Ｂ）ＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いて、インタクトＴＦＰＩ２単独の量を測定する方法（Ｉ－ＴＦＰＩ２測定系）。なお、前記ＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体は、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン３を抗原決定基として認識する抗体であること好ましい。また、この方法で前述したサンドイッチ法を用いる場合は、通常、前記抗体はエピトープの異なる２種類を用い、うち少なくとも１種類はＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用い、もう１種類はＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体であってもＮＴ－ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体であってもよい。
【0025】
（Ｃ）（Ａ）のＮＴ＋Ｉ－ＴＦＰＩ２測定系で測定したＮＴ－ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量から、（Ｂ）のＩ－ＴＦＰＩ２測定系で測定したインタクトＴＦＰＩ２単独量を減じることにより、ＮＴ－ＴＦＰＩ２単独の量を算出する方法。
（Ｄ）インタクトＴＦＰＩ２を認識せずＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いて、ＮＴ－ＴＦＰＩ２単独の量を測定する方法。なお、前記インタクトＴＦＰＩ２を認識せずＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識する抗体は、例えば、ＮＴ－ＴＦＰＩ２のＣ末端部分のペプチド配列を特異的に認識する抗体が挙げられる。前述したサンドイッチ法を用いる場合は、例えば、当該抗体を固相抗体とし、クニッツドメイン１を抗原決定基として認識する抗体を検出抗体とする。
（Ｄ）インタクトＴＦＰＩ２を認識せずＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いて、ＮＴ－ＴＦＰＩ２単独の量を測定する方法。なお、前記インタクトＴＦＰＩ２を認識せずＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識する抗体は、例えば、ＮＴ－ＴＦＰＩ２のＣ末端部分のペプチド配列を特異的に認識する抗体が挙げられる。前述したサンドイッチ法を用いる場合は、例えば、当該抗体を固相抗体とし、クニッツドメイン１を抗原決定基として認識する抗体を検出抗体とする。
【0026】
本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法においては、前述した（Ｃ）や（Ｄ）の方法で測定したＮＴ－ＴＦＰＩ２単独の量を判定の基準に用いてもよいが、（Ａ）の方法で測定したＮＴ－ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量を判定の基準に用いても十分な感度と特異度が得られるうえ、抗体の取得しやすさや測定が一段階で簡便なことから、後者がより好ましい。
【0027】
ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２ポリペプチドまたはタンパク質、インタクトＴＦＰＩ２ポリペプチド又はＴＦＰＩ２タンパク質の部分領域からなるオリゴペプチド、ＮＴ－ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はＴＦＰＩ２タンパク質のインタクトまたは部分領域をコードするポリヌクレオチドなどを免疫原として、動物に免疫することで得ることができる。前記タンパク質または前記オリゴペプチドやポリペプチドは生体内のＴＦＰＩ２の立体構造を反映していない、あるいは調製する過程でその構造が変化する可能性がある。そのため、得られた抗体が、所望の生体内のＴＦＰＩ２に対して高い特異性や結合力を有さない可能性があり、本抗体を用いて測定系を構築しても結果として検体中に含まれるＴＦＰＩ２濃度を正確に定量できなくなる可能性がある。
【0028】
一方、免疫原としてＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質のインタクトまたは部分領域をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いることで、免疫動物の体内でＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質のインタクトまたは部分領域が発現され免疫応答が惹起されるため、検体中のＴＦＰＩ２に対して高い特異性及び結合力（すなわち高親和性）を有した抗体が得られるためより好ましい。
免疫に用いる動物は、抗体産生能を有するものであれば特に限定はなく、マウス、ラット、ウサギなど通常免疫に用いる哺乳動物でもよいし、ニワトリなど鳥類を用いてもよい。
免疫に用いる動物は、抗体産生能を有するものであれば特に限定はなく、マウス、ラット、ウサギなど通常免疫に用いる哺乳動物でもよいし、ニワトリなど鳥類を用いてもよい。
【0029】
さらに、血中にはＴＦＰＩ２の相同体として知られるＴＦＰＩ１も存在する。したがって、ＴＦＰＩ１と交叉せずＴＦＰＩ２のみを特異的に認識する抗体を用いることが望ましい。
【0030】
ＴＦＰＩ２を認識する抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であるのが好ましい。
ＴＦＰＩ２を認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の樹立は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で免疫した動物からＢ細胞を採取し、前記Ｂ細胞とミエローマ細胞とを電気的にまたはポリエチレングリコール存在下で融合させ、ＨＡＴ培地により所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択を行ない、選択したハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりモノクローン化を行なうことで、ＴＦＰＩ２を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を樹立することができる。
ＴＦＰＩ２を認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の樹立は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で免疫した動物からＢ細胞を採取し、前記Ｂ細胞とミエローマ細胞とを電気的にまたはポリエチレングリコール存在下で融合させ、ＨＡＴ培地により所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択を行ない、選択したハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりモノクローン化を行なうことで、ＴＦＰＩ２を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を樹立することができる。
【0031】
本発明で用いるＴＦＰＩ２を認識するモノクローナル抗体の選定は、宿主発現系に由来する、ＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカー型ＴＦＰＩ２または分泌型ＴＦＰＩ２に対する親和性に基づいて行えばよい。
なお、前記宿主としては特に限定はなく、当業者がタンパク質の発現に通常用いる、大腸菌や酵母などの微生物細胞、昆虫細胞、動物細胞の中から適宜選択すればよいが、ジスルフィド結合もしくは糖鎖付加といった翻訳後修飾により、天然型のＴＦＰＩ２に近い構造を有するタンパク質の発現が可能な、哺乳細胞を宿主として用いると好ましい。哺乳細胞の一例としては、従来用いられている、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞株、サル腎臓細胞ＣＯＳ７株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはヒトから単離された癌細胞などが挙げられる。
なお、前記宿主としては特に限定はなく、当業者がタンパク質の発現に通常用いる、大腸菌や酵母などの微生物細胞、昆虫細胞、動物細胞の中から適宜選択すればよいが、ジスルフィド結合もしくは糖鎖付加といった翻訳後修飾により、天然型のＴＦＰＩ２に近い構造を有するタンパク質の発現が可能な、哺乳細胞を宿主として用いると好ましい。哺乳細胞の一例としては、従来用いられている、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞株、サル腎臓細胞ＣＯＳ７株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはヒトから単離された癌細胞などが挙げられる。
【0032】
本発明で用いられる抗体の精製は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で樹立した、抗体を産生するハイブリドーマ細胞を培養後、その培養上清を回収し、必要に応じ硫酸アンモニウム沈殿による抗体濃縮後、プロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＬなどを固定化した担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー及び／またはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体の精製が可能である。
なお、前述したサンドイッチ法で抗原抗体反応を行なう際に用いる標識した抗体は、前述した方法で精製した抗体をペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼなどの酵素で標識すればよく、その標識も技術が十分確立された方法を用いて行なえばよい。
なお、前述したサンドイッチ法で抗原抗体反応を行なう際に用いる標識した抗体は、前述した方法で精製した抗体をペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼなどの酵素で標識すればよく、その標識も技術が十分確立された方法を用いて行なえばよい。
【0033】
本発明の方法において、質量分析法を利用してＴＦＰＩ２量を測定する方法について、以下に具体的に説明する。
検体が血液である場合は、前処理工程として血液に多く含まれるアルブミン、イムノグロブリン、トランスフェリン等の主要タンパク質をＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎ １４等で除去した後、イオン交換、ゲル濾過または逆相ＨＰＬＣ等でさらに分画することが好ましい。または、抗ＴＦＰＩ２抗体を用いた免疫的手法によりＴＦＰＩ２のみを特異的に回収することも可能である。
検体が血液である場合は、前処理工程として血液に多く含まれるアルブミン、イムノグロブリン、トランスフェリン等の主要タンパク質をＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎ １４等で除去した後、イオン交換、ゲル濾過または逆相ＨＰＬＣ等でさらに分画することが好ましい。または、抗ＴＦＰＩ２抗体を用いた免疫的手法によりＴＦＰＩ２のみを特異的に回収することも可能である。
【0034】
測定は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィ・タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ）、表面増強レーザーイオン化質量分析（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＳＥＬＤＩ－ＭＳ）等により行うことができる。
【0035】
本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法は、卵巣悪性腫瘍を治療する方法に適用することができる。すなわち、本発明により、患者における卵巣悪性腫瘍を治療する方法であって、
（ｉ）ＴＦＰＩ２量の測定値が予め設定した基準値を超えるものとして患者を同定する工程、及び
（ｉｉ）前記同定された患者に対して治療を施す工程、を含む方法が提供される。
前記工程（ｉ）の同定において、ＴＦＰＩ２量の測定は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を特異的に認識する抗体を用いて行われてもよいし、質量分析法を用いて行われてもよい。
前記工程（ｉｉ）の治療としては、外科的治療、薬物療法、放射線療法等が挙げられるが特に限定されない。
（ｉ）ＴＦＰＩ２量の測定値が予め設定した基準値を超えるものとして患者を同定する工程、及び
（ｉｉ）前記同定された患者に対して治療を施す工程、を含む方法が提供される。
前記工程（ｉ）の同定において、ＴＦＰＩ２量の測定は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を特異的に認識する抗体を用いて行われてもよいし、質量分析法を用いて行われてもよい。
前記工程（ｉｉ）の治療としては、外科的治療、薬物療法、放射線療法等が挙げられるが特に限定されない。
【0036】
＜２＞本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するための試薬
本発明の第二の態様は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を含む、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するための試薬である。係る抗体としては、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体がより好ましい。より具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体がさらに好ましい。
本発明の試薬を前述したサンドイッチ法に利用する場合は、前記抗体としてエピトープの異なる２種類の抗体を含むことが好ましい。
本発明の試薬に含まれる抗体は、抗体そのものであってもよく、標識されていてもよく、固相に固定化されていてもよい。
本発明の第二の態様は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を含む、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するための試薬である。係る抗体としては、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体がより好ましい。より具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体がさらに好ましい。
本発明の試薬を前述したサンドイッチ法に利用する場合は、前記抗体としてエピトープの異なる２種類の抗体を含むことが好ましい。
本発明の試薬に含まれる抗体は、抗体そのものであってもよく、標識されていてもよく、固相に固定化されていてもよい。
【0037】
本発明の試薬のうち、前述したサンドイッチ法の一態様である２ステップサンドイッチ法に利用する場合について、以下に具体的に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
まず、本発明の試薬は、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）に示す方法で作製することができる。
（Ｉ）まず、サンドイッチ法で用いる、ＴＦＰＩ２を認識する、エピトープの異なる２種類の抗体（以下、「抗体１」及び「抗体２」とする）のうち、抗体１をイムノプレートや磁性粒子等のＢ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離可能な担体に結合させる。結合方法は、疎水結合を利用した物理的結合であってもよいし、２物質間を架橋可能なリンカー試薬などを用いた化学的結合であってもよい。
まず、本発明の試薬は、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）に示す方法で作製することができる。
（Ｉ）まず、サンドイッチ法で用いる、ＴＦＰＩ２を認識する、エピトープの異なる２種類の抗体（以下、「抗体１」及び「抗体２」とする）のうち、抗体１をイムノプレートや磁性粒子等のＢ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離可能な担体に結合させる。結合方法は、疎水結合を利用した物理的結合であってもよいし、２物質間を架橋可能なリンカー試薬などを用いた化学的結合であってもよい。
【0038】
（ＩＩ）担体に前記抗体１を結合させた後、非特異的結合を避けるため、担体表面を牛血清アルブミン、スキムミルク、市販のイムノアッセイ用ブロッキング剤、タンパク質吸着抑制用化学合成ポリマーなどでブロッキング処理を行ない１次試薬とする。
【0039】
（ＩＩＩ）他方の抗体２を標識し、得られた標識抗体を含む溶液を２次試薬として準備する。抗体２に標識する物質としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼといった酵素、蛍光物質、化学発光物質、ラジオアイソトープなどの検出装置で検出可能な物質、又はビオチンに対するアビジンなど特異的に結合する相手が存在する物質等が好ましい。また、２次試薬の溶液としては、抗原抗体反応が良好に行える緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液などが好ましい。このようにして作製した本発明の試薬は必要に応じ凍結乾燥させてもよい。
なお、１ステップサンドイッチ法の場合は、前述した（Ｉ）～（ＩＩ）同様に担体に抗体１を結合させブロッキング処理を行なったものを作製し、前記抗体固定化担体に、標識した抗体２を含む緩衝液をさらに添加して試薬を作製すればよい。
なお、１ステップサンドイッチ法の場合は、前述した（Ｉ）～（ＩＩ）同様に担体に抗体１を結合させブロッキング処理を行なったものを作製し、前記抗体固定化担体に、標識した抗体２を含む緩衝液をさらに添加して試薬を作製すればよい。
【0040】
次に、前述した方法で得られた試薬を用いて、２ステップサンドイッチ法でＴＦＰＩ２を検出し測定するには、以下の（ＩＶ）から（ＶＩ）に示す方法で行なえばよい。
（ＩＶ）（ＩＩ）で作製した１次試薬と検体とを一定時間、一定温度のもと接触させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（Ｖ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、続いて（ＩＩＩ）で作製した２次試薬と一定時間、一定温度のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（ＶＩ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、標識抗体の標識物質を定量し、既知濃度のＴＦＰＩ２溶液を標準とし作成した検量線により、検体中のヒトＴＦＰＩ２を定量する。
（ＩＶ）（ＩＩ）で作製した１次試薬と検体とを一定時間、一定温度のもと接触させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（Ｖ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、続いて（ＩＩＩ）で作製した２次試薬と一定時間、一定温度のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（ＶＩ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、標識抗体の標識物質を定量し、既知濃度のＴＦＰＩ２溶液を標準とし作成した検量線により、検体中のヒトＴＦＰＩ２を定量する。
【0041】
本発明の試薬に含まれる抗体等の試薬成分の量は、検体量、検体の種類、試薬の種類、測定の手法等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。具体的には、例えば、後述するように検体として血清や血漿を２０μＬ使用して、サンドイッチ法によりＴＦＰＩ２量の測定を行う場合、当該検体２０μＬを抗体と反応させる反応系当たり、担体へ結合させる抗体量が１００ｎｇから１０００μｇであってよく、標識抗体量が２ｎｇから２０μｇであってよい。
【0042】
本発明の試薬は、用手法での測定にも利用可能であり、自動免疫診断装置を用いた測定にも利用可能である。特に自動免疫診断装置を用いた測定は、検体中に含まれる内在性の測定妨害因子や競合酵素の影響を受けることなく測定が可能で、かつ短時間に検体中のＴＦＰＩ２が定量可能であるため、好ましい。
【0043】
本発明の別の側面は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２の、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するための試薬の製造における使用である。
本発明の別の側面は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２の、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出することにおける使用である。
本発明の別の側面は、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するために使用される、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２である。
本発明の別の側面は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２の、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出することにおける使用である。
本発明の別の側面は、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するために使用される、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２である。
【0044】
本発明の別の側面は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体の、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するための試薬の製造における使用である。
本発明の別の側面は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体の、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出することにおける使用である。
本発明の別の側面は、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するために使用される、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体である。
これらの側面における前記抗体としては、配列番号１に示すアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体が好ましい。
本発明の別の側面は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体の、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出することにおける使用である。
本発明の別の側面は、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するために使用される、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体である。
これらの側面における前記抗体としては、配列番号１に示すアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体が好ましい。
【実施例】
【0045】
以下に本発明を具体的に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。
【0046】
＜実施例１＞ ＴＦＰＩ２測定試薬の調製
特許文献３の方法に従い、ＤＮＡ免疫法により得られたＴＦＰＩ２抗体を用いてＴＦＰＩ２測定試薬を以下の通り調製した。
（１）水不溶性フェライト含有担体に抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体（ＴＳ－ＴＦ０４）を１００ｎｇ／担体になるように室温にて一昼夜物理的に吸着させ、その後１％ＢＳＡを含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて５３℃・４時間ブロッキングを行なうことで、抗ＴＦＰＩ２抗体固定化担体を調製した。
（２）抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体（ＴＳ－ＴＦ０１）をアルカリフォスファターゼ標識キット（同仁化学社製）にて、アルカリフォスファターゼ標識抗ＴＦＰＩ２抗体を調製した。
（３）磁力透過性の容器（容量１．２ｍＬ）に、（１）で調製した１２個の抗体固定化担体を入れた後、（２）で調製したアルカリフォスファターゼ標識抗体を１μｇ／ｍＬ含む緩衝液（３％ＢＳＡを含むトリス緩衝液、ｐＨ８．０）１００μＬを添加し、凍結乾燥を実施することで、ＴＦＰＩ２測定試薬を作製した。なお、作製したＴＦＰＩ２測定試薬は窒素充填下にて密閉封印シールを施し、測定まで４℃で保管した。
特許文献３の方法に従い、ＤＮＡ免疫法により得られたＴＦＰＩ２抗体を用いてＴＦＰＩ２測定試薬を以下の通り調製した。
（１）水不溶性フェライト含有担体に抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体（ＴＳ－ＴＦ０４）を１００ｎｇ／担体になるように室温にて一昼夜物理的に吸着させ、その後１％ＢＳＡを含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて５３℃・４時間ブロッキングを行なうことで、抗ＴＦＰＩ２抗体固定化担体を調製した。
（２）抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体（ＴＳ－ＴＦ０１）をアルカリフォスファターゼ標識キット（同仁化学社製）にて、アルカリフォスファターゼ標識抗ＴＦＰＩ２抗体を調製した。
（３）磁力透過性の容器（容量１．２ｍＬ）に、（１）で調製した１２個の抗体固定化担体を入れた後、（２）で調製したアルカリフォスファターゼ標識抗体を１μｇ／ｍＬ含む緩衝液（３％ＢＳＡを含むトリス緩衝液、ｐＨ８．０）１００μＬを添加し、凍結乾燥を実施することで、ＴＦＰＩ２測定試薬を作製した。なお、作製したＴＦＰＩ２測定試薬は窒素充填下にて密閉封印シールを施し、測定まで４℃で保管した。
【0047】
＜実施例２＞ 臨床検体の評価
本実施例で使用した臨床検体の内訳を表１に示す。卵巣良性腫瘍血清３３例と卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）血清３８例は横浜市立大学産婦人科にて同一プロトコルにて収集された検体であり、インフォームドコンセントの承諾及び横浜市立大学倫理委員会の承認を受けて提供された。
本実施例で使用した臨床検体の内訳を表１に示す。卵巣良性腫瘍血清３３例と卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）血清３８例は横浜市立大学産婦人科にて同一プロトコルにて収集された検体であり、インフォームドコンセントの承諾及び横浜市立大学倫理委員会の承認を受けて提供された。
【0048】
【表1】
【0049】
評価用装置は全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－２０００（東ソー社製：製造販売届出番号１３Ｂ３Ｘ９０００２０００００９）を用いた。全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－２０００によるＴＦＰＩ２の測定は、以下の手順で行った。
（１）サンプル２０μＬと界面活性剤を含む希釈液８０μＬを、実施例１で作製したＴＦＰＩ２測定試薬を収容した容器に自動で分注し、
（２）３７℃恒温下で１０分間の抗原抗体反応を行ない、
（３）Ｂ／Ｆ分離後、界面活性剤を含む緩衝液にて８回の洗浄を行ない、
（４）４－メチルウンベリフェリルリン酸塩を添加し、単位時間当たりのアルカリフォスファターゼによる４－メチルウンベリフェロン生成濃度をもって測定値（ＴＦＰＩ２ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ））とした。
（１）サンプル２０μＬと界面活性剤を含む希釈液８０μＬを、実施例１で作製したＴＦＰＩ２測定試薬を収容した容器に自動で分注し、
（２）３７℃恒温下で１０分間の抗原抗体反応を行ない、
（３）Ｂ／Ｆ分離後、界面活性剤を含む緩衝液にて８回の洗浄を行ない、
（４）４－メチルウンベリフェリルリン酸塩を添加し、単位時間当たりのアルカリフォスファターゼによる４－メチルウンベリフェロン生成濃度をもって測定値（ＴＦＰＩ２ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ））とした。
【0050】
市販ＴＦＰＩ２組み換えタンパク（Ｒ＆Ｄ社）を標準品として検量線を作成し、検体中のＴＦＰＩ２濃度を算出した。ＣＡ１２５の測定はＥテストＴＯＳＯＨＩＩ ＣＡ１２５測定試薬（東ソー社製、承認番号２０７００ＡＭＺ００５０４０００）を用いて測定した。
【0051】
血中ＴＦＰＩ２値および血中ＣＡ１２５測定値のＢｏｘＰｌｏｔを図１に示す。ＴＦＰＩ２およびＣＡ１２５はいずれも卵巣良性腫瘍と比較して卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）では統計的有意差を持って高値を示すことが明らかとなった（マン＝ホイットニーのＵ検定、ｐ＜０．０００１）。
ＲＯＣ解析結果を図２に示す。ＴＦＰＩ２の曲線下面積（ＡＵＣ）は０．７６４４、ＣＡ１２５のＡＵＣは０．７６９９となり、ＴＦＰＩ２はＣＡ１２５に匹敵する良好な卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）検出性能（卵巣良性腫瘍と卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）の鑑別性能）を有することが示された。
ＲＯＣ解析結果を図２に示す。ＴＦＰＩ２の曲線下面積（ＡＵＣ）は０．７６４４、ＣＡ１２５のＡＵＣは０．７６９９となり、ＴＦＰＩ２はＣＡ１２５に匹敵する良好な卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）検出性能（卵巣良性腫瘍と卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）の鑑別性能）を有することが示された。
【0052】
＜実施例３＞ＴＦＰＩ２とＣＡ１２５の良性悪性鑑別性能の比較
ＴＦＰＩ２のカットオフ値（１９１ｐｇ／ｍＬ）は実施例２のＲＯＣ解析結果よりＹｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ（特異度＋感度－１）が最大値となる濃度とした。ＣＡ１２５は臨床現場で使用されているカットオフ値（３５Ｕ／ｍＬ）を用いた。２×２分割表を用いて算出した各マーカーの鑑別性能（感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、陽性尤度比、陰性尤度比）を表２に示す。ＴＦＰＩ２はＣＡ１２５に比べて特異度、陽性的中率および陽性尤度比に優れることが示された、一方、ＣＡ１２５はＴＦＰＩ２に比べて感度に優れることが示された。
ＴＦＰＩ２のカットオフ値（１９１ｐｇ／ｍＬ）は実施例２のＲＯＣ解析結果よりＹｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ（特異度＋感度－１）が最大値となる濃度とした。ＣＡ１２５は臨床現場で使用されているカットオフ値（３５Ｕ／ｍＬ）を用いた。２×２分割表を用いて算出した各マーカーの鑑別性能（感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、陽性尤度比、陰性尤度比）を表２に示す。ＴＦＰＩ２はＣＡ１２５に比べて特異度、陽性的中率および陽性尤度比に優れることが示された、一方、ＣＡ１２５はＴＦＰＩ２に比べて感度に優れることが示された。
【0053】
【表2】
【0054】
＜実施例４＞ ＴＦＰＩ２とＣＡ１２５の相関解析
実施例２の結果を基に、卵巣良性腫瘍または卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１２５の相関を解析した結果を図３に示す。ＴＦＰＩ２とＣＡ１２５は卵巣良性腫瘍または卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）のいずれにおいても有意な相関は認められず、独立した指標となることが示唆された。
実施例２の結果を基に、卵巣良性腫瘍または卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１２５の相関を解析した結果を図３に示す。ＴＦＰＩ２とＣＡ１２５は卵巣良性腫瘍または卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）のいずれにおいても有意な相関は認められず、独立した指標となることが示唆された。
【0055】
＜実施例５＞ 追加臨床検体の評価
本実施例で使用した臨床検体の内訳を表３に示す。卵巣良性腫瘍血清７７例と卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）血清２７４例は横浜市立大学産婦人科にて同一プロトコルにて収集された検体であり、インフォームドコンセントの承諾及び横浜市立大学倫理委員会の承認を受けて提供された。
本実施例で使用した臨床検体の内訳を表３に示す。卵巣良性腫瘍血清７７例と卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）血清２７４例は横浜市立大学産婦人科にて同一プロトコルにて収集された検体であり、インフォームドコンセントの承諾及び横浜市立大学倫理委員会の承認を受けて提供された。
【0056】
【表3】
【0057】
評価用装置は全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－９００（東ソー社製、製造販売届出番号：１３Ｂ３Ｘ９０００２００００１２）を用いた。全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－９００によるＴＦＰＩ２の測定は、以下の手順で行った。
（１）サンプル２０μＬと界面活性剤を含む希釈液８０μＬを、実施例１で作製したＴＦＰＩ２測定試薬を収容した容器に自動で分注し、
（２）３７℃恒温下で１０分間の抗原抗体反応を行ない、
（３）Ｂ／Ｆ分離後、界面活性剤を含む緩衝液にて８回の洗浄を行ない、
（４）４－メチルウンベリフェリルリン酸塩を添加し、単位時間当たりのアルカリフォスファターゼによる４－メチルウンベリフェロン生成濃度をもって測定値（ＴＦＰＩ２ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ））とした。
市販ＴＦＰＩ２組み換えタンパク（Ｒ＆Ｄ社）を標準品として検量線を作成し、検体中のＴＦＰＩ２濃度を算出した。ＣＡ１２５の測定は、Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ（ＣＡ１２５）測定試薬（東ソー社製、承認番号：２０７００ＡＭＺ００５０４０００）を用いて測定した。
血中ＴＦＰＩ２値および血中ＣＡ１２５測定値のＢｏｘＰｌｏｔを図４に示す。ＴＦＰＩ２およびＣＡ１２５はいずれも卵巣良性腫瘍と比較して卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）では統計的有意差を持って高値を示すことが明らかとなった（マン＝ホイットニーのＵ検定、ｐ＜０．０００１）。
（１）サンプル２０μＬと界面活性剤を含む希釈液８０μＬを、実施例１で作製したＴＦＰＩ２測定試薬を収容した容器に自動で分注し、
（２）３７℃恒温下で１０分間の抗原抗体反応を行ない、
（３）Ｂ／Ｆ分離後、界面活性剤を含む緩衝液にて８回の洗浄を行ない、
（４）４－メチルウンベリフェリルリン酸塩を添加し、単位時間当たりのアルカリフォスファターゼによる４－メチルウンベリフェロン生成濃度をもって測定値（ＴＦＰＩ２ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ））とした。
市販ＴＦＰＩ２組み換えタンパク（Ｒ＆Ｄ社）を標準品として検量線を作成し、検体中のＴＦＰＩ２濃度を算出した。ＣＡ１２５の測定は、Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ（ＣＡ１２５）測定試薬（東ソー社製、承認番号：２０７００ＡＭＺ００５０４０００）を用いて測定した。
血中ＴＦＰＩ２値および血中ＣＡ１２５測定値のＢｏｘＰｌｏｔを図４に示す。ＴＦＰＩ２およびＣＡ１２５はいずれも卵巣良性腫瘍と比較して卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）では統計的有意差を持って高値を示すことが明らかとなった（マン＝ホイットニーのＵ検定、ｐ＜０．０００１）。
【0058】
ＲＯＣ解析結果を図５に示す。ＴＦＰＩ２の曲線下面積（ＡＵＣ）は０．７４９、ＣＡ１２５のＡＵＣは０．７６１となり、ＴＦＰＩ２はＣＡ１２５に匹敵する良好な卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）検出性能（卵巣良性腫瘍と卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）の鑑別性能）を有することが示された。
【0059】
＜実施例６＞ 追加検体におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１２５の良性悪性鑑別性能の比較
ＴＦＰＩ２およびＣＡ１２５のカットオフ値は、実施例３と同じ値（ＴＦＰＩ２：１９１ｐｇ／ｍＬ、ＣＡ１２５：３５Ｕ／ｍＬ）を用いた。２×２分割表を用いて算出した各マーカーの鑑別性能（感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、陽性尤度比、陰性尤度比）を表４に示す。実施例３と同様に、ＴＦＰＩ２はＣＡ１２５に比べて特異度、陽性的中率および陽性尤度比に優れることが示された、一方、ＣＡ１２５はＴＦＰＩ２に比べて感度に優れることが示された。
ＴＦＰＩ２およびＣＡ１２５のカットオフ値は、実施例３と同じ値（ＴＦＰＩ２：１９１ｐｇ／ｍＬ、ＣＡ１２５：３５Ｕ／ｍＬ）を用いた。２×２分割表を用いて算出した各マーカーの鑑別性能（感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、陽性尤度比、陰性尤度比）を表４に示す。実施例３と同様に、ＴＦＰＩ２はＣＡ１２５に比べて特異度、陽性的中率および陽性尤度比に優れることが示された、一方、ＣＡ１２５はＴＦＰＩ２に比べて感度に優れることが示された。
【0060】
【表4】
【0061】
＜実施例７＞ 追加検体におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１２５の相関解析
実施例５の結果を基に、卵巣良性腫瘍または卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１２５の相関を解析した結果を図６に示す。ＴＦＰＩ２とＣＡ１２５は卵巣良性腫瘍または卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）のいずれにおいても有意な相関は認められず、独立した指標となることが示唆された。
実施例５の結果を基に、卵巣良性腫瘍または卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１２５の相関を解析した結果を図６に示す。ＴＦＰＩ２とＣＡ１２５は卵巣良性腫瘍または卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）のいずれにおいても有意な相関は認められず、独立した指標となることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【0062】
本発明により、簡便かつ患者負担が比較的少ない血液検査で卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法が提供される。これは、有効な腫瘍マーカーが存在せず画像診断に依存している卵巣悪性腫瘍診療への貢献が期待され、産業上非常に有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】