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7833152新規微生物、新規微生物の培養物または抽出物、およびエルゴチオネインの生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2026-03-11
(45)【発行日】2026-03-19
(54)【発明の名称】新規微生物、新規微生物の培養物または抽出物、およびエルゴチオネインの生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/165 20260101AFI20260312BHJP
C12P 11/00 20060101ALI20260312BHJP
C12P 13/04 20060101ALI20260312BHJP
【ＦＩ】
C12N1/165
C12P11/00
C12P13/04
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2024558835
(86)(22)【出願日】2023-11-10
(86)【国際出願番号】 JP2023040594
(87)【国際公開番号】W WO2024106341
(87)【国際公開日】2024-05-23
【審査請求日】2025-02-05
(31)【優先権主張番号】P 2022185256
(32)【優先日】2022-11-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【微生物の受託番号】NPMD NITE BP-03706
【微生物の受託番号】NPMD NITE BP-03707
【微生物の受託番号】NPMD NITE BP-03708
【微生物の受託番号】NPMD NITE BP-03709
【微生物の受託番号】NPMD NITE BP-03710
【微生物の受託番号】NPMD NITE BP-03711
【微生物の受託番号】NPMD NITE BP-03712
(73)【特許権者】
【識別番号】000001100
【氏名又は名称】株式会社クレハ
(73)【特許権者】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】越山 竜行
(72)【発明者】
【氏名】東山 幸弘
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 俊
(72)【発明者】
【氏名】森田 友岳
(72)【発明者】
【氏名】雜賀 あずさ
(72)【発明者】
【氏名】和田 圭介
(72)【発明者】
【氏名】牛丸 和乗
【審査官】高山 敏充
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２１／１４０６９３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０２２／１４９５９３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０２１－１４１８２６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－２２５３６８（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ１２Ｐ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
Ｇｏｏｇｌｅ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ディルクメイア・チュラシマエンシスに属する微生物（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０７、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０８、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０９、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１１、もしくは受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１２）、アウレオバシジウム・メラノゲヌム（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０６）、または、ウスチラゴ・スポロボリ-インディシに近縁な種（ウスチラゴ・エスピー）に属する微生物（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１０）。
【請求項2】
請求項１に記載の微生物の培養物。
【請求項3】
請求項１に記載の微生物を培養し、エルゴチオネインを含む培養物を得る工程を含む、エルゴチオネインの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規微生物、新規微生物の培養物または抽出物、および、エルゴチオネインの生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
エルゴチオネインは含硫アミノ酸の一種である。エルゴチオネインは、ビタミンＥの抗酸化作用よりも優れた抗酸化作用を有し、健康および美容等の分野において、利用価値の高い化合物として注目されている。
【0003】
例えば、特許文献１および非特許文献１には、エルゴチオネイン生産能が増強された形質転換糸状菌が記載されている。
【0004】
非特許文献２には、エルゴチオネイン生産能が増強された、形質転換したMethylobacrium属の微生物が記載されている。非特許文献２には、Aureobasidium属およびRhodotorula属の微生物がエルゴチオネイン生産能を有することが記載されている。
【0005】
非特許文献３には、Pleurotus属の微生物がエルゴチオネイン生産能を有することが記載されている。
【0006】
特許文献２には、Methylobactrium属およびRhodotorula属の微生物がエルゴチオネイン生産能を有することが記載されている。特許文献３には、Moniliella属の微生物がエルゴチオネイン生産能を有することが記載されている。特許文献４には、Dirkmeia属、Papiliotrema属およびApiotrichum属の微生物がエルゴチオネイン生産能を有することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】国際公開第２０１６／１２１２８５号
【文献】国際公開第２０１６／１２１２８５号
【文献】国際公開第２０１９／００４２３４号
【文献】国際公開第２０２１／１４０６９３号
【非特許文献】
【0008】
【文献】S. Takusagawa, Biosci. Biotechnol. Biochem., 83, 181-184 (2019)
【文献】Y. Fujitani et al., J. Biosci. Bioeng., 126, 715-722 (2018)
【文献】SY. Lin, Int. J. Med. Mushrooms, 17, 749-761 (2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
エルゴチオネインは、ヒトの体内では生合成されず、一部の微生物で生合成されることが知られている。よって、上述の先行技術文献に記載されるように、エルゴチオネインを産生する微生物の探索、および、エルゴチオネインの生産が増強させるための微生物の改変等の研究開発が進められている。
【0010】
遺伝子組換え技術により、エルゴチオネインの生産を増強させるように微生物を改変することができる。しかしながら、当該微生物により生産されたエルゴチオネインは食品産業等では利用できない。したがって、遺伝子組換えが行われておらず未改変である、エルゴチオネイン生産量が高い微生物の探索が強く望まれている。
【0011】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、エルゴチオネインの生産量が高い新規微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、スクリーニングの結果、エルゴチオネインの生産量が高い新規微生物を見出し、本発明を完成するに至った。
【0013】
本発明の一態様に係る微生物は、ディルクメイア・チュラシマエンシスに属する微生物（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０７、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０８、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０９、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１１、もしくは受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１２）、アウレオバシジウム・メラノゲヌム（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０６）、または、ウスチラゴ・スポロボリ-インディシに近縁な種（ウスチラゴ・エスピー）に属する微生物（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１０）である。
【発明の効果】
【0014】
本発明の一態様によれば、エルゴチオネインの生産量が高い微生物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】ＥＢ６８２株の26S rDNA D1/D2領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す図である。
【図2】ＥＢ６８２株のrDNAのITS領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す図である。
【図3】ＥＣ４３１株の26S rDNA D1/D2領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す図である。
【図4】ＥＣ４３１株のrDNAのITS領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す図である。
【図5】ＥＣ１７１株の26S rDNA D1/D2領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す図である。
【図6】ＥＣ１７１株のrDNAのITS領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す図である。
【図7】ＥＣ５８１株の26S rDNA D1/D2領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す図である。
【図8】ＥＣ５８１株のrDNAのITS領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す図である。
【図9】ＥＣ５９２株の26S rDNA D1/D2領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す図である。
【図10】ＥＣ５９２株のrDNAのITS領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す図である。
【図11】ＥＢ７６１株の26S rDNA D1/D2領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す図である。
【図12】ＥＢ７６１株のrDNAのITS領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す図である。
【図13】ＥＣ０２１株の26S rDNA D1/D2領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す図である。
【図14】ＥＣ０２１株のrDNAのITS領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意図する。
【0017】
〔新規微生物〕
本発明の一態様に係る微生物は、エルゴチオネインを生産する能力を有するディルクメイア・チュラシマエンシスに属する微生物もしくはアウレオバシジウム・メラノゲヌムに属する微生物、または、エルゴチオネインを生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物である。
本発明の一態様に係る微生物は、エルゴチオネインを生産する能力を有するディルクメイア・チュラシマエンシスに属する微生物もしくはアウレオバシジウム・メラノゲヌムに属する微生物、または、エルゴチオネインを生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物である。
【0018】
本発明の一態様に係る微生物は、エルゴチオネインの生産量が高い。エルゴチオネインは、含硫アミノ酸の一種であり、優れた抗酸化作用を有する。また、本発明の一態様に係る微生物は遺伝子組換え技術等による改変が行われていないため、食品産業でも使用することができる。
【0019】
（１．アウレオバシジウム・メラノゲヌムＥＢ６８２）
アウレオバシジウム・メラノゲヌム（Aureobasidium melanogenum）ＥＢ６８２（以下、「酵母ＥＢ６８２」と略記する場合がある）は、ハイビスカスの葉を分離源として初めて分離された微生物である。
アウレオバシジウム・メラノゲヌム（Aureobasidium melanogenum）ＥＢ６８２（以下、「酵母ＥＢ６８２」と略記する場合がある）は、ハイビスカスの葉を分離源として初めて分離された微生物である。
【0020】
リボソームＲＮＡ遺伝子の２６ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域およびＩＴＳ領域の塩基配列を決定した。そして、テクノスルガラボ微生物同定システム（TechnoSuruga Laboratory, Japan）データベースDB-FU13.0および国際塩基配列データベース（DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank）に対するBLAST相同検索を行った。その結果、ＥＢ６８２はアウレオバシジウム・メラノゲヌムに帰属された。
【0021】
酵母ＥＢ６８２は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（National Institute of Technology and Evaluation；以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託した（原寄託日：２０２２年８月５日、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０６）。
【0022】
酵母ＥＢ１５２の培養方法は、アウレオバシジウム属の微生物に対して行われる一般的な培養方法に準じて行えばよい。培養形態は液体培地を用いた回分培養あるいは培養系に炭素源および／または有機窒素源を連続添加する流加培養であり、通気撹拌することが望ましい。培地としては、アウレオバシジウム属に属する微生物が資化可能な炭素源、窒素源、または無機塩類等の必要な栄養源を含有する培地を使用してもよい。培養ｐＨは３～８が好ましく、培養温度は２０℃～３０℃が好ましく、培養時間は２～１４日が好ましい。
【0023】
（２．ウスチラゴ・エスピーＥＣ４３１）
ウスチラゴ・エスピー（Ustilago sp.）ＥＣ４３１（以下、「酵母ＥＣ４３１」と略記する場合がある）は、スダチの果皮を分離源として初めて分離された微生物である。
ウスチラゴ・エスピー（Ustilago sp.）ＥＣ４３１（以下、「酵母ＥＣ４３１」と略記する場合がある）は、スダチの果皮を分離源として初めて分離された微生物である。
【0024】
リボソームＲＮＡ遺伝子の２６ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域およびＩＴＳ領域の塩基配列を決定した。そして、テクノスルガラボ微生物同定システム（TechnoSuruga Laboratory, Japan）データベースDB-FU13.0および国際塩基配列データベース（DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank）に対するBLAST相同検索を行った。その結果、ＥＣ４３１はウスチラゴ・スポロボリ-インディシ（Ustilago sporoboli-indici）に近縁であることが示された。
【0025】
酵母ＥＣ４３１は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（National Institute of Technology and Evaluation；以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託した（原寄託日：２０２２年８月５日、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１０）。
【0026】
酵母ＥＣ４３１の培養方法は、ウスチラゴ属の微生物に対して行われる一般的な培養方法に準じて行えばよい。培養形態は液体培地を用いた回分培養あるいは培養系に炭素源および／または有機窒素源を連続添加する流加培養であり、通気撹拌することが望ましい。培地としては、ウスチラゴ属に属する微生物が資化可能な炭素源、窒素源、または無機塩類等の必要な栄養源を含有する培地を使用してもよい。培養ｐＨは３～８が好ましく、培養温度は２０℃～３０℃が好ましく、培養時間は２～１４日が好ましい。
【0027】
（３．ディルクメイア・チュラシマエンシスＥＣ１７１）
ディルクメイア・チュラシマエンシス（Dirkmeia churashimaensis）ＥＣ１７１（以下、「酵母ＥＣ１７１」と略記する場合がある）は、コマツナの葉を分離源として初めて分離された微生物である。
ディルクメイア・チュラシマエンシス（Dirkmeia churashimaensis）ＥＣ１７１（以下、「酵母ＥＣ１７１」と略記する場合がある）は、コマツナの葉を分離源として初めて分離された微生物である。
【0028】
リボソームＲＮＡ遺伝子の２６ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域およびＩＴＳ領域の塩基配列を決定した。そして、テクノスルガラボ微生物同定システム（TechnoSuruga Laboratory, Japan）データベースDB-FU13.0および国際塩基配列データベース（DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank）に対するBLAST相同検索を行った。その結果、ＥＣ１７１はディルクメイア・チュラシマエンシスに帰属された。
【0029】
酵母ＥＣ１７１は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（National Institute of Technology and Evaluation；以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託した（原寄託日：２０２２年８月５日、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０９）。
【0030】
酵母ＥＣ１７１の培養方法は、ディルクメイア属の微生物に対して行われる一般的な培養方法に準じて行えばよい。培養形態は液体培地を用いた回分培養あるいは培養系に炭素源および／または有機窒素源を連続添加する流加培養であり、通気撹拌することが望ましい。培地としては、ディルクメイア属に属する微生物が資化可能な炭素源、窒素源、または無機塩類等の必要な栄養源を含有する培地を使用してもよい。培養ｐＨは３～８が好ましく、培養温度は２０℃～３０℃が好ましく、培養時間は２～１４日が好ましい。
【0031】
（４．ディルクメイア・チュラシマエンシスＥＣ５８１）
ディルクメイア・チュラシマエンシス（Dirkmeia churashimaensis）ＥＣ５８１（以下、「酵母ＥＣ５８１」と略記する場合がある）は、ケールの葉を分離源として初めて分離された微生物である。
ディルクメイア・チュラシマエンシス（Dirkmeia churashimaensis）ＥＣ５８１（以下、「酵母ＥＣ５８１」と略記する場合がある）は、ケールの葉を分離源として初めて分離された微生物である。
【0032】
リボソームＲＮＡ遺伝子の２６ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域およびＩＴＳ領域の塩基配列を決定した。そして、テクノスルガラボ微生物同定システム（TechnoSuruga Laboratory, Japan）データベースDB-FU13.0および国際塩基配列データベース（DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank）に対するBLAST相同検索を行った。その結果、ＥＣ５８１はディルクメイア・チュラシマエンシスに帰属された。
【0033】
酵母ＥＣ５８１は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（National Institute of Technology and Evaluation；以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託した（原寄託日：２０２２年８月５日、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１１）。
【0034】
酵母ＥＣ５８１の培養方法は、酵母ＥＣ１７１の培養方法と同様に行えばよい。
【0035】
（５．ディルクメイア・チュラシマエンシスＥＣ５９２）
ディルクメイア・チュラシマエンシス（Dirkmeia churashimaensis）ＥＣ５９２（以下、「酵母ＥＣ５９２」と略記する場合がある）は、ケールの葉を分離源として初めて分離された微生物である。
ディルクメイア・チュラシマエンシス（Dirkmeia churashimaensis）ＥＣ５９２（以下、「酵母ＥＣ５９２」と略記する場合がある）は、ケールの葉を分離源として初めて分離された微生物である。
【0036】
リボソームＲＮＡ遺伝子の２６ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域およびＩＴＳ領域の塩基配列を決定した。そして、テクノスルガラボ微生物同定システム（TechnoSuruga Laboratory, Japan）データベースDB-FU13.0および国際塩基配列データベース（DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank）に対するBLAST相同検索を行った。その結果、ＥＣ５９２はディルクメイア・チュラシマエンシスに帰属された。
【0037】
酵母ＥＣ５９２は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（National Institute of Technology and Evaluation；以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託した（原寄託日：２０２２年８月５日、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１２）。
【0038】
酵母ＥＣ５９２の培養方法は、酵母ＥＣ１７１の培養方法と同様に行えばよい。
【0039】
（６．ディルクメイア・チュラシマエンシスＥＢ７６１）
ディルクメイア・チュラシマエンシス（Dirkmeia churashimaensis）ＥＢ７６１（以下、「酵母ＥＢ７６１」と略記する場合がある）は、草本の葉を分離源として初めて分離された微生物である。
ディルクメイア・チュラシマエンシス（Dirkmeia churashimaensis）ＥＢ７６１（以下、「酵母ＥＢ７６１」と略記する場合がある）は、草本の葉を分離源として初めて分離された微生物である。
【0040】
リボソームＲＮＡ遺伝子の２６ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域およびＩＴＳ領域の塩基配列を決定した。そして、テクノスルガラボ微生物同定システム（TechnoSuruga Laboratory, Japan）データベースDB-FU13.0および国際塩基配列データベース（DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank）に対するBLAST相同検索を行った。その結果、ＥＢ７６１はディルクメイア・チュラシマエンシスに帰属された。
【0041】
酵母ＥＢ７６１は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（National Institute of Technology and Evaluation；以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託した（原寄託日：２０２２年８月５日、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０７）。
【0042】
酵母ＥＢ７６１の培養方法は、酵母ＥＣ１７１の培養方法と同様に行えばよい。
【0043】
（７．ディルクメイア・チュラシマエンシスＥＣ０２１）
ディルクメイア・チュラシマエンシス（Dirkmeia churashimaensis）ＥＣ０２１（以下、「酵母ＥＣ０２１」と略記する場合がある）は、モロヘイヤの花芽を分離源として初めて分離された微生物である。
ディルクメイア・チュラシマエンシス（Dirkmeia churashimaensis）ＥＣ０２１（以下、「酵母ＥＣ０２１」と略記する場合がある）は、モロヘイヤの花芽を分離源として初めて分離された微生物である。
【0044】
リボソームＲＮＡ遺伝子の２６ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域およびＩＴＳ領域の塩基配列を決定した。そして、テクノスルガラボ微生物同定システム（TechnoSuruga Laboratory, Japan）データベースDB-FU13.0および国際塩基配列データベース（DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank）に対するBLAST相同検索を行った。その結果、ＥＣ０２１はディルクメイア・チュラシマエンシスに帰属された。
【0045】
酵母ＥＣ０２１は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（National Institute of Technology and Evaluation；以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託した（原寄託日：２０２２年８月５日、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０８）。
【0046】
酵母ＥＣ０２１の培養方法は、酵母ＥＣ１７１の培養方法と同様に行えばよい。
【0047】
〔培養物〕
本発明の一態様に係る培養物は、酵母ＥＢ６８２、ＥＣ４３１、ＥＣ１７１、ＥＣ５８１、ＥＣ５９２、ＥＢ７６１またはＥＣ０２１の培養物である。本発明の一態様に係る培養物には、培養上清、培養沈殿物、培地、培養菌体、培養菌体破砕物、培養菌体の凍結乾燥物等の培養菌体処理物等が含まれる。本発明の一態様に係る培養物にはエルゴチオネインが含まれる。
本発明の一態様に係る培養物は、酵母ＥＢ６８２、ＥＣ４３１、ＥＣ１７１、ＥＣ５８１、ＥＣ５９２、ＥＢ７６１またはＥＣ０２１の培養物である。本発明の一態様に係る培養物には、培養上清、培養沈殿物、培地、培養菌体、培養菌体破砕物、培養菌体の凍結乾燥物等の培養菌体処理物等が含まれる。本発明の一態様に係る培養物にはエルゴチオネインが含まれる。
【0048】
〔抽出物〕
本発明の一態様に係る抽出物は、酵母ＥＢ６８２、ＥＣ４３１、ＥＣ１７１、ＥＣ５８１、ＥＣ５９２、ＥＢ７６１またはＥＣ０２１の抽出物である。本明細書において「微生物の抽出物」とは、微生物に対して抽出処理を行うことにより得られるもの、および微生物の培養物に対して抽出処理を行うことにより得られるものを指す。したがって、本発明の一態様に係る抽出物は、例えば、酵母ＥＢ６８２、ＥＣ４３１、ＥＣ１７１、ＥＣ５８１、ＥＣ５９２、ＥＢ７６１もしくはＥＣ０２１の抽出処理、または、酵母ＥＢ６８２、ＥＣ４３１、ＥＣ１７１、ＥＣ５８１、ＥＣ５９２、ＥＢ７６１もしくはＥＣ０２１の培養物を抽出処理することによって得られる。本発明の一態様に係る抽出物にはエルゴチオネインが含まれる。
本発明の一態様に係る抽出物は、酵母ＥＢ６８２、ＥＣ４３１、ＥＣ１７１、ＥＣ５８１、ＥＣ５９２、ＥＢ７６１またはＥＣ０２１の抽出物である。本明細書において「微生物の抽出物」とは、微生物に対して抽出処理を行うことにより得られるもの、および微生物の培養物に対して抽出処理を行うことにより得られるものを指す。したがって、本発明の一態様に係る抽出物は、例えば、酵母ＥＢ６８２、ＥＣ４３１、ＥＣ１７１、ＥＣ５８１、ＥＣ５９２、ＥＢ７６１もしくはＥＣ０２１の抽出処理、または、酵母ＥＢ６８２、ＥＣ４３１、ＥＣ１７１、ＥＣ５８１、ＥＣ５９２、ＥＢ７６１もしくはＥＣ０２１の培養物を抽出処理することによって得られる。本発明の一態様に係る抽出物にはエルゴチオネインが含まれる。
【0049】
抽出処理として、熱水抽出；有機溶媒等による溶媒抽出；加圧抽出；酵素および界面活性剤等による化学的抽出；超音波抽出；アルカリ抽出；酸抽出；浸透圧による抽出；粉砕による抽出；すり潰しによる抽出；凍結融解による抽出；液体窒素による抽出；高速撹拌による抽出；等が挙げられる。優れた植物生長効果を発揮する点等で、抽出処理は熱水抽出であることが好ましい。抽出処理は１種類であってもよいし、２種類以上の抽出処理を行ってもよい。
【0050】
熱水抽出は、熱水に抽出対象物を一定時間接触または浸漬させる抽出である。熱水抽出に用いる水の温度は、４０℃以上が好ましく、６０℃以上がより好ましい。
【0051】
本発明の一態様に係る抽出物は、酵母ＥＢ６８２、ＥＣ４３１、ＥＣ１７１、ＥＣ５８１、ＥＣ５９２、ＥＢ７６１もしくはＥＣ０２１である微生物の、熱水抽出物、有機溶媒等による溶媒抽出物；加圧抽出物；酵素および界面活性剤等による化学的抽出物；超音波抽出物；アルカリ抽出物；酸抽出物；浸透圧による抽出物；粉砕による抽出物；すり潰しによる抽出物；凍結融解による抽出物；液体窒素による抽出物；または、高速撹拌による抽出物；であってもよい。
【0052】
本発明の一態様に係る培養物または抽出物の用途として、当該培養物または抽出物を有効成分として含む植物生長調整剤等が挙げられる。
【0053】
〔エルゴチオネインの生産方法〕
本発明の一態様に係るエルゴチオネインの生産方法は、上記微生物を培養し、エルゴチオネインを含む培養物を得る工程を含む。当該生産方法は、１種類の微生物を培養してもよいし、複数種類の微生物を培養してもよい。
本発明の一態様に係るエルゴチオネインの生産方法は、上記微生物を培養し、エルゴチオネインを含む培養物を得る工程を含む。当該生産方法は、１種類の微生物を培養してもよいし、複数種類の微生物を培養してもよい。
【0054】
エルゴチオネインを含む培養物からのエルゴチオネインの回収は、例えば、通常の微生物培養物からエルゴチオネインを回収し精製する方法で行えばよい。例えば、培養物を遠心分離等して菌体を回収する。次に、回収した菌体を熱水抽出に供する等により、エルゴチオネインを含む抽出液を得る。そして、当該抽出液を精製することによって、エルゴチオネインを回収することができる。微生物のエルゴチオネインの生産量は、例えば、得られた抽出液を、高速液体クロマトグラフィー装置およびＬＣＭＳ等の質量分析装置によって測定することによって、定量することができる。
【0055】
〔まとめ〕
本発明の一態様に係る微生物は、ディルクメイア・チュラシマエンシスに属する微生物（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０７、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０８、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０９、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１１、もしくは受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１２）、アウレオバシジウム・メラノゲヌム（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０６）、または、ウスチラゴ・スポロボリ-インディシに近縁な種（ウスチラゴ・エスピー）に属する微生物（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１０）である。
本発明の一態様に係る微生物は、ディルクメイア・チュラシマエンシスに属する微生物（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０７、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０８、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０９、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１１、もしくは受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１２）、アウレオバシジウム・メラノゲヌム（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０６）、または、ウスチラゴ・スポロボリ-インディシに近縁な種（ウスチラゴ・エスピー）に属する微生物（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１０）である。
【0056】
本発明の一態様に係る培養物は、上記微生物の培養物である。
【0057】
本発明の一態様に係る抽出物は、上記微生物の抽出物である。
【0058】
本発明の一態様に係るエルゴチオネインの生産方法は、上記微生物を培養し、エルゴチオネインを含む培養物を得る工程を含む。
【0059】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明の以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【0060】
以下の実施例中、特に記載がない限り、％は質量％を表す。
【0061】
〔評価例１〕エルゴチオネイン産生微生物のスクリーニング
（１）環境から採取した分離源での集積培養
まず、植物等の環境からの微生物サンプル採取を２回に分けて行った。その結果、合計１５０個のサンプル（１回目９０個、２回目６０個）を採取した。
（１）環境から採取した分離源での集積培養
まず、植物等の環境からの微生物サンプル採取を２回に分けて行った。その結果、合計１５０個のサンプル（１回目９０個、２回目６０個）を採取した。
【0062】
次に、スクリーニング培地２ｍＬを含む１５ｍＬのプラスチックチューブに採取したサンプルをそれぞれ浸漬し、２００ｒｐｍにおいて、３～７日間２５℃にて培養した。スクリーニング培地は抗生物質を含むＹＭ培地を使用した。具体的には、１％グルコース、０．５％ペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス、０．０１％ストレプトマイシン硫酸塩、０．００５％クロラムフェニコールを含む培地を使用した。
【0063】
そして、目視により培地が濁った（微生物が増殖した）、１２６個のサンプル（１回目７０個、２回目５６個）を選抜した。
【0064】
（２）酸化ストレス負荷によるサンプルの選抜
上記（１）で選抜した１２６個のサンプルの培養液を、ＹＭ培地で１００倍または１００００倍に希釈した。そして、ＹＭ寒天培地、および、３ｍＭのＨ２Ｏ２が添加されたＹＭ寒天培地（以下、Ｈ２Ｏ２含有ＹＭ寒天培地と略記する。）に希釈した培養液を塗布し、２５℃において２～７日間培養した。
上記（１）で選抜した１２６個のサンプルの培養液を、ＹＭ培地で１００倍または１００００倍に希釈した。そして、ＹＭ寒天培地、および、３ｍＭのＨ２Ｏ２が添加されたＹＭ寒天培地（以下、Ｈ２Ｏ２含有ＹＭ寒天培地と略記する。）に希釈した培養液を塗布し、２５℃において２～７日間培養した。
【0065】
ＹＭ寒天培地上に生育したコロニーの数と、Ｈ２Ｏ２含有ＹＭ寒天培地上に生育したコロニーの数をカウントした。そして、ＹＭ寒天培地およびＨ２Ｏ２含有ＹＭ寒天培地の両方においてコロニーが生育した１１２個（１回目６９個、２回目４３個）のサンプルを選抜した。
【0066】
さらに、選抜した１１２個のサンプルの寒天培地上で生育したコロニーについて、目視で形態および色を観察し、種類が異なる酵母様のコロニー１８１個（１回目１０６個、２回目７５個）を選抜した。
【0067】
（３）選抜コロニーの９６ウェルにおける培養
上記（２）で選抜したコロニー１８１個を、１ｍＬのＹＭ培地を含む９６ウェルプレートに植菌し、１６００ｒｐｍにおいて、３～４日間２５℃にて培養した。培養後、回収した培養液を２０００ｒｐｍにおいて、１０分間４℃にて遠心分離させた。遠心分離により得られた菌体ペレットを純粋１ｍＬで洗浄し、再度遠心分離に供した。
上記（２）で選抜したコロニー１８１個を、１ｍＬのＹＭ培地を含む９６ウェルプレートに植菌し、１６００ｒｐｍにおいて、３～４日間２５℃にて培養した。培養後、回収した培養液を２０００ｒｐｍにおいて、１０分間４℃にて遠心分離させた。遠心分離により得られた菌体ペレットを純粋１ｍＬで洗浄し、再度遠心分離に供した。
【0068】
遠心分離により得られた菌体ペレットに０．１ｍＬの純水を加えて懸濁した。得られた懸濁液を９６℃において１０分間加熱して、菌体内成分を抽出した。そして、抽出した菌体内成分を遠心分離に供して菌体残渣を取り除き、抽出液が得られた。
【0069】
（４）ＬＣＭＳによる抽出液中のエルゴチオネインの定量分析
上記（３）で得られた抽出液０．１５ｍＬとアセトニトリル０．３５ｍＬとを混合した溶液を０．４５μｍのＰＶＤＦフィルターで濾過した。得られた濾液をＬＣＭＳ測定のサンプルとして使用した。
上記（３）で得られた抽出液０．１５ｍＬとアセトニトリル０．３５ｍＬとを混合した溶液を０．４５μｍのＰＶＤＦフィルターで濾過した。得られた濾液をＬＣＭＳ測定のサンプルとして使用した。
【0070】
ＬＣＭＳ分析には、島津製作所社製ＬＣＭＳ－２０２０を用いた。また、ＬＣのカラムには、ＳＨＯＤＥＸ社製Asahipak NH2P-40 2D+ガードカラムを使用した。ＬＣの移動相として、１０ｍＭギ酸アンモニウムとアセトニトリルとの混合液（１０ｍＭギ酸アンモニウム／アセトニトリル＝３０／７０（ｖ／ｖ））を使用した。また、流速は０．１ｍＬ／ｍｉｎとし、２５℃において分析を行った。
【0071】
ＭＳ検出においては、ＥＳＩイオン化とＡＰＣＩイオン化とを同時に行うＤＵＩＳモードでイオン化させた。また、エルゴチオネインを検出可能なｍ／ｚ＝２３０（＋）のＳＩＭモードで検出を行った。
【0072】
上記（２）で選抜したコロニー１８１個の抽出液を分析した結果、エルゴチオネインの生産量が高かった２２個のコロニー（１回目７個、２回目１５個）を選抜した。
【0073】
（５）エルゴチオネイン生産微生物のフラスコにおけるスケールアップ培養
上記（４）で選抜した２２個のコロニーを、５０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬフラスコに植菌し、２００ｒｐｍにおいて、７日間２５℃にて培養した（ｎ＝１）。
上記（４）で選抜した２２個のコロニーを、５０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬフラスコに植菌し、２００ｒｐｍにおいて、７日間２５℃にて培養した（ｎ＝１）。
【0074】
培養３～７日目の培養液を適宜採取した。上記（３）と同様に、菌体を遠心分離および洗浄後、熱水抽出により抽出液を回収した。
【0075】
得られた抽出液を、上記（４）と同様に、ＬＣＭＳにより分析を行い、エルゴチオネインの生産量が高かった７株（ＥＢ６８２、ＥＣ４３１、ＥＣ１７１、ＥＣ５８１、ＥＣ５９２、ＥＢ７６１およびＥＣ０２１）を選抜した。
【0076】
〔評価例２〕エルゴチオネイン生産量の測定
ＥＢ６８２、ＥＣ４３１、ＥＣ１７１、ＥＣ５８１およびＥＣ５９２について、５０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬフラスコに植菌し、２００ｒｐｍにおいて、５日間２５℃にて培養した（ｎ＝３）。そして、５日目のエルゴチオネイン（ＥＧＴ）の生産量を、ＬＣＭＳにより測定した。
ＥＢ６８２、ＥＣ４３１、ＥＣ１７１、ＥＣ５８１およびＥＣ５９２について、５０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬフラスコに植菌し、２００ｒｐｍにおいて、５日間２５℃にて培養した（ｎ＝３）。そして、５日目のエルゴチオネイン（ＥＧＴ）の生産量を、ＬＣＭＳにより測定した。
【0077】
また、各微生物の抽出物は、ＹＭ培地２Ｌを入れた５Ｌジャーファーメンターを用いて、各微生物を５日間２５℃にて好気的に培養し、培養後の乾燥菌体から熱水抽出することによって得た。そして、ＬＣＭＳによって抽出物中のＥＧＴ量（ｍｇ／Ｌ）を測定した。
【0078】
各株のエルゴチオネインの生産量、生産速度および抽出物中のＥＧＴ量を表１および２に示す。表１のＥＧＴ生産量（ｍｇ／Ｌ－培養液）は、培養液１Ｌ当たりの培養５日目のＥＧＴ生産量である。ＥＧＴの生産速度（ｍｇ／Ｌ／ｄ）は１日当たりのＥＧＴ生産量（ｍｇ／Ｌ）である。表２のＥＧＴ生産量（ｍｇ／ｇ－乾燥菌体）は、乾燥菌体１ｇ当たりのＥＧＴ生産量である。
【0079】
表３および４は、公知の微生物の生産量と生産速度を示す。表３中、Aspergillus oryzae NSAR1のＥＧＴ生産量は培養液１ｋｇ当たりのＥＧＴ生産量、ＥＧＴ生産速度は１日当たりのＥＧＴ生産量（ｍｇ／ｋｇ）である。表３および４中の－は、未測定であることを示す。
【0080】
【表1】
【0081】
【表2】
【0082】
【表3】
【0083】
【表4】
【0084】
表１および２に示すとおり、Aureobasidium melanogenum EB682は、Aureobasidium pullulans kz25と比較して、ＥＧＴ生産量が高いことが分かった。Ustilago sp. EC431は、Ustilago maydis UM521と比較して、ＥＧＴ生産量が高いことが分かった。Dirkmeia churashimaensis EC171、Dirkmeia churashimaensis EC581およびDirkmeia churashimaensis EC592はそれぞれ、Dirkmeia churashimaensis S111と比較して、ＥＧＴ生産量が高いことが分かった。また、評価例２で評価した５株の抽出物いずれも、ＥＧＴが豊富に含まれていることを確認した。
【0085】
〔評価例３〕エルゴチオネイン生産量の測定
ＥＢ７６１およびＥＣ０２１について、評価例２と同様に、５日目のＥＧＴの生産量をＬＣＭＳにより測定した。また、各微生物の抽出物中のＥＧＴ量も評価例２と同様に測定した。測定結果を表５に示す。
ＥＢ７６１およびＥＣ０２１について、評価例２と同様に、５日目のＥＧＴの生産量をＬＣＭＳにより測定した。また、各微生物の抽出物中のＥＧＴ量も評価例２と同様に測定した。測定結果を表５に示す。
【0086】
【表5】
【0087】
表４～５に示すように、Dirkmeia churashimaensis EB761およびDirkmeia churashimaensis EC021はそれぞれ、Dirkmeia churashimaensis S111と比較して、ＥＧＴ生産量が高いことが分かった。また、評価例３で評価した２株の抽出物いずれも、ＥＧＴが豊富に含まれていることを確認した。
【0088】
〔評価例４〕微生物の同定
選抜した７株の帰属分類群の推定は、リボソームＲＮＡ遺伝子の２６Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域およびＩＴＳ領域の塩基配列の解析により行った。
選抜した７株の帰属分類群の推定は、リボソームＲＮＡ遺伝子の２６Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域およびＩＴＳ領域の塩基配列の解析により行った。
【0089】
（ＥＢ６８２株の分子系統学的位置および形態学的性質）
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＢ６８２株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列（配列番号１）は子嚢菌系酵母の一種であるAureobasidium melanogenumの複数の塩基配列に対し100%の同一性を示した（表６、７）。DB-FUに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図１）において、ＥＢ６８２株はAureobasidium melanogenum CBS105.22T（アクセッション番号FJ150926）と同一の分子系統学的位置を示した。
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＢ６８２株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列（配列番号１）は子嚢菌系酵母の一種であるAureobasidium melanogenumの複数の塩基配列に対し100%の同一性を示した（表６、７）。DB-FUに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図１）において、ＥＢ６８２株はAureobasidium melanogenum CBS105.22T（アクセッション番号FJ150926）と同一の分子系統学的位置を示した。
【0090】
表６は、DB-FUに対するBLAST検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索された26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0091】
表７は、国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索された26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。Aureobasidium pullulans var. melanigenumは現行名であるAureobasidium melanogenumに相当すると考えられる。
【0092】
図１は、ＥＢ６８２株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す。左上の線はスケールバーを示す。系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。株名の末尾の「Ｔ」はその種の基準株、「ＮＴ」はその種の新基準株を示す。
【0093】
【表6】
【0094】
【表7】
【0095】
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＢ６８２株のrDNAのITS領域の塩基配列（配列番号２）は子嚢菌系酵母の一種であるAureobasidium melanogenumの複数の塩基配列に対し99.8～100%の同一性を示した（表８、９）。DB-FUに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図２）において、ＥＢ６８２株はAureobasidium melanogenumの複数の塩基配列とクラスターを形成した。
【0096】
表８は、DB-FUに対するBLAST検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索されたrDNAのITS領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0097】
表９は、国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索されたrDNAのITS領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。Aureobasidium pullulans var. melanigenumは現行名であるAureobasidium melanogenumに相当すると考えられる。
【0098】
図２は、ＥＢ６８２株のrDNAのITS領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す。左上の線はスケールバーを示す。系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。株名の末尾の「Ｔ」はその種の基準株、「ＮＴ」はその種の新基準株を示す。
【0099】
【表8】
【0100】
【表9】
【0101】
以上のことから、26S rDNAのD1/D2領域およびrDNAのITS領域の塩基配列解析結果において、ＥＢ６８２株をAureobasidium melanogenum と同定した。
【0102】
ＥＢ６８２株の形態学的性質を、コロニーの性状および形態観察により調べた。ＹＭ平板培地上で２日間培養した結果、クリーム色～明褐色、表面が湿性で菌糸状のコロニー性状を示した。培養開始３日目に、無色で薄壁、広楕円形～レモン形の酵母状の出芽細胞の形成が確認された。また、栄養菌糸上の短い突起状構造から広楕円形～レモン形、１細胞で無職、平滑の出芽型分生子が形成される様子が観察された。
【0103】
分子系統学的位置および形態学的性質ならびにエルゴチオネインの生産量の測定より、ＥＢ６８２株はAureobasidium melanogenumに帰属される新規微生物と判断した。
【0104】
（ＥＣ４３１株の分子系統学的位置および形態学的性質）
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＣ４３１株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列（配列番号３）は担子菌類（担子菌系酵母）の一種であるUstilago shanxiensis、Ustilago calamagrostidisおよびUstilago sporoboli-indiciの複数の塩基配列に対し99.7%の同一性を示した（表１０、１１）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図３）において、ＥＣ４３１株はUstilago属で構成される系統群の中で単独の系統枝を形成した。
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＣ４３１株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列（配列番号３）は担子菌類（担子菌系酵母）の一種であるUstilago shanxiensis、Ustilago calamagrostidisおよびUstilago sporoboli-indiciの複数の塩基配列に対し99.7%の同一性を示した（表１０、１１）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図３）において、ＥＣ４３１株はUstilago属で構成される系統群の中で単独の系統枝を形成した。
【0105】
表１０は、DB-FUに対するBLAST検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索された26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0106】
表１１は、国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索された26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0107】
図３は、ＥＣ４３１株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す。左上の線はスケールバーを示す。系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。株名の末尾の「Ｔ」はその種の基準株を示す。
【0108】
【表10】
【0109】
【表11】
【0110】
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＣ４３１株のrDNAのITS領域の塩基配列（配列番号４）は担子菌類（担子菌系酵母）の一種であるUstilago sporoboli-indiciの複数の塩基配列に対し95.5～97.9%の同一性を示した（表１２、１３）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図４）において、ＥＣ４３１株はUstilago属で構成される系統群に含まれ、Ustilago sporoboli-indiciの複数の塩基配列とブートストラップ値99%で支持されるクラスターを形成した。しかし、SIID35092-03とUstilago sporoboli-indiciのrDNAのITS領域の塩基配列には13塩基以上の相違が認められることから、種レベルの帰属を決定することは難しく、Ustilago sporoboli-indiciに近縁なUstilago sp.としておくのが妥当と考えられた。
【0111】
表１２は、DB-FUに対するBLAST検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索されたrDNAのITS領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0112】
表１３は、国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索されたrDNAのITS領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0113】
図４は、ＥＣ４３１株のrDNAのITS領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す。左上の線はスケールバーを示す。系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。株名の末尾の「Ｔ」はその種の基準株を示す。
【0114】
【表12】
【0115】
【表13】
【0116】
以上のことから、26S rDNAのD1/D2領域およびrDNAのITS領域の塩基配列解析結果において、ＥＣ４３１株をUstilago sporoboli-indiciに近縁なUstilago sp.と同定した。
【0117】
ＥＣ４３１株の形態学的性質を、コロニーの性状および形態観察により調べた。ＹＭ平板培地上で４日間培養した結果、クリーム色～黄橙色、表面が平滑～しわ状でバター様、湿性のコロニー性状を示した。栄養細胞は楕円形～円筒形であり、増殖は細胞極部の短柄上からの出芽によることが確認された。また、培養開始約３週間経過した平板での有性生殖器官の形成は認められなかった。
【0118】
分子系統学的位置および形態学的性質ならびにエルゴチオネインの生産量の測定より、ＥＣ４３１株はUstilago sporoboli-indiciに近縁なUstilago sp.に帰属される新規微生物と判断した。
【0119】
（ＥＣ１７１株の分子系統学的位置および形態学的性質）
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＣ１７１株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列（配列番号５）は担子菌系酵母の一種であるDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列に対し99.7～100%の同一性を示した（表１４、１５）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図５）において、ＥＣ１７１株はDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列と同一の分子系統学的位置を示した。
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＣ１７１株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列（配列番号５）は担子菌系酵母の一種であるDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列に対し99.7～100%の同一性を示した（表１４、１５）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図５）において、ＥＣ１７１株はDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列と同一の分子系統学的位置を示した。
【0120】
表１４は、DB-FUに対するBLAST検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索された26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0121】
表１５は、国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索された26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。表１５中の「ａ」は基準株由来の塩基配列ではなく、登録情報に誤りがある可能性が示唆されたため解析対象外とした。
【0122】
図５は、ＥＣ１７１株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す。左上の線はスケールバーを示す。系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。株名の末尾の「Ｔ」はその種の基準株を示す。
【0123】
【表14】
【0124】
【表15】
【0125】
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＣ１７１株のrDNAのITS領域の塩基配列（配列番号６）は担子菌系酵母の一種であるDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列に対し98.4～100%の同一性を示した（表１６、１７）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図６）において、ＥＣ１７１株はDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列と100%の高いブートストラップ値で支持されるクラスターを形成した。
【0126】
表１６は、DB-FUに対するBLAST検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索されたrDNAのITS領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0127】
表１７は、国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索されたrDNAのITS領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0128】
図６は、ＥＣ１７１株のrDNAのITS領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す。左上の線はスケールバーを示す。系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。株名の末尾の「Ｔ」はその種の基準株を示す。
【0129】
【表16】
【0130】
【表17】
【0131】
以上のことから、26S rDNAのD1/D2領域およびrDNAのITS領域の塩基配列解析結果において、ＥＣ１７１株をDirkmeia churashimaensisと同定した。
【0132】
ＥＣ１７１株の形態学的性質を、コロニーの性状および形態観察により調べた。ＹＭ平板培地上で４日間培養した結果、黄橙色～クリーム色、表面が平滑でバター様、湿性、粘稠性のコロニー性状を示した。栄養細胞は楕円形～卵形であり、増殖は細胞極部の短柄上からの出芽によることが確認された。また、培養開始約３週間経過した平板での有性生殖器官の形成は認められなかった。
【0133】
分子系統学的位置および形態学的性質ならびにエルゴチオネインの生産量の測定より、ＥＣ１７１株はDirkmeia churashimaensisに帰属される新規微生物と判断した。
【0134】
（ＥＣ５８１株の分子系統学的位置および形態学的性質）
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＣ５８１株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列（配列番号７）は担子菌系酵母の一種であるDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列に対し99.7～100%の同一性を示した（表１８、１９）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図７）において、ＥＣ５８１株はDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列と同一の分子系統学的位置を示した。
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＣ５８１株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列（配列番号７）は担子菌系酵母の一種であるDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列に対し99.7～100%の同一性を示した（表１８、１９）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図７）において、ＥＣ５８１株はDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列と同一の分子系統学的位置を示した。
【0135】
表１８は、DB-FUに対するBLAST検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索された26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0136】
表１９は、国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索された26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。表１９中の「ａ」は基準株由来の塩基配列ではなく、登録情報に誤りがある可能性が示唆されたため解析対象外とした。
【0137】
図７は、ＥＣ５８１株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す。左上の線はスケールバーを示す。系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。株名の末尾の「Ｔ」はその種の基準株を示す。
【0138】
【表18】
【0139】
【表19】
【0140】
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＣ５８１株のrDNAのITS領域の塩基配列（配列番号８）は担子菌系酵母の一種であるDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列に対し98.4～100%の同一性を示した（表２０、２１）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図８）において、ＥＣ５８１株はDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列と100%の高いブートストラップ値で支持されるクラスターを形成した。
【0141】
表２０は、DB-FUに対するBLAST検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索されたrDNAのITS領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0142】
表２１は、国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索されたrDNAのITS領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0143】
図８は、ＥＣ５８１株のrDNAのITS領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す。左上の線はスケールバーを示す。系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。株名の末尾の「Ｔ」はその種の基準株を示す。
【0144】
【表20】
【0145】
【表21】
【0146】
以上のことから、26S rDNAのD1/D2領域およびrDNAのITS領域の塩基配列解析結果において、ＥＣ５８１株をDirkmeia churashimaensisと同定した。
【0147】
ＥＣ５８１株の形態学的性質を、コロニーの性状および形態観察により調べた。ＹＭ平板培地上で４日間培養した結果、黄橙色～クリーム色、表面が平滑でバター様、湿性、粘稠性のコロニー性状を示した。栄養細胞は楕円形～卵形であり、増殖は細胞局部の短柄上からの出芽によることが確認された。また、培養開始約３週間経過した平板での有性生殖器官の形成は認められなかった。
【0148】
分子系統学的位置および形態学的性質ならびにエルゴチオネインの生産量の測定より、ＥＣ５８１株はDirkmeia churashimaensisに帰属される新規微生物と判断した。
【0149】
（ＥＣ５９２株の分子系統学的位置および形態学的性質）
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＣ５９２株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列（配列番号９）は担子菌系酵母の一種であるDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列に対し99.7～100%の同一性を示した（表２２、２３）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図９）において、ＥＣ５９２株はDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列と同一の分子系統学的位置を示した。
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＣ５９２株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列（配列番号９）は担子菌系酵母の一種であるDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列に対し99.7～100%の同一性を示した（表２２、２３）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図９）において、ＥＣ５９２株はDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列と同一の分子系統学的位置を示した。
【0150】
表２２は、DB-FUに対するBLAST検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索された26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0151】
表２３は、国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索された26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。表２３中の「ａ」は基準株由来の塩基配列ではなく、登録情報に誤りがある可能性が示唆されたため解析対象外とした。
【0152】
図９は、ＥＣ５９２株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す。左上の線はスケールバーを示す。系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。株名の末尾の「Ｔ」はその種の基準株を示す。
【0153】
【表22】
【0154】
【表23】
【0155】
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＣ５９２株のrDNAのITS領域の塩基配列（配列番号１０）は担子菌系酵母の一種であるDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列に対し98.4～100%の同一性を示した（表２４、２５）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図１０）において、ＥＣ５９２株はDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列と100%の高いブートストラップ値で支持されるクラスターを形成した。
【0156】
表２４は、DB-FUに対するBLAST検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索されたrDNAのITS領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0157】
表２５は、国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索されたrDNAのITS領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0158】
図１０は、ＥＣ５９２株のrDNAのITS領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す。左上の線はスケールバーを示す。系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。株名の末尾の「Ｔ」はその種の基準株を示す。
【0159】
【表24】
【0160】
【表25】
【0161】
以上のことから、26S rDNAのD1/D2領域およびrDNAのITS領域の塩基配列解析結果において、ＥＣ５９２株をDirkmeia churashimaensisと同定した。
【0162】
ＥＣ５９２株の形態学的性質を、コロニーの性状および形態観察により調べた。ＹＭ平板培地上で４日間培養した結果、黄橙色～クリーム色、表面が平滑でバター様、湿性、粘稠性のコロニー性状を示した。栄養細胞は楕円形～卵形であり、増殖は細胞極部の短柄上からの出芽によることが確認された。また、培養開始約３週間経過した平板での有性生殖器官の形成は認められなかった。
【0163】
分子系統学的位置および形態学的性質ならびにエルゴチオネインの生産量の測定より、ＥＣ５９２株はDirkmeia churashimaensisに帰属される新規微生物と判断した。
【0164】
（ＥＢ７６１株の分子系統学的位置および形態学的性質）
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＢ７６１株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列（配列番号１１）は担子菌系酵母の一種であるDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列に対し99.7～100%の同一性を示した（表２６、２７）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図１１）において、ＥＢ７６１株はDirkmeia churashimaensis の複数の塩基配列と同一の分子系統学的位置を示した。
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＢ７６１株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列（配列番号１１）は担子菌系酵母の一種であるDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列に対し99.7～100%の同一性を示した（表２６、２７）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図１１）において、ＥＢ７６１株はDirkmeia churashimaensis の複数の塩基配列と同一の分子系統学的位置を示した。
【0165】
表２６は、DB-FUに対するBLAST検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索された26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0166】
表２７は、国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索された26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。表２７中の「ａ」は基準株由来の塩基配列ではなく、登録情報に誤りがある可能性が示唆されたため解析対象外とした。
【0167】
図１１は、ＥＢ７６１株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す。左上の線はスケールバーを示す。系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。株名の末尾の「Ｔ」はその種の基準株を示す。
【0168】
【表26】
【0169】
【表27】
【0170】
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＢ７６１株のrDNAのITS領域の塩基配列（配列番号１２）は担子菌系酵母の一種であるDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列に対し98.3～100%の同一性を示した（表２８、２９）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図１２）において、ＥＢ７６１株はDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列と100%の高いブートストラップ値で支持されるクラスターを形成した。
【0171】
表２８は、DB-FUに対するBLAST検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索されたrDNAのITS領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0172】
表２９は、国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索されたrDNAのITS領域の塩基配列解析データである。＊は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0173】
図１２は、ＥＢ７６１株のrDNAのITS領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す。左上の線はスケールバーを示す。系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。株名の末尾の「Ｔ」はその種の基準株を示す。
【0174】
【表28】
【0175】
【表29】
【0176】
以上のことから、26S rDNAのD1/D2領域およびrDNAのITS領域の塩基配列解析結果において、ＥＢ７６１株をDirkmeia churashimaensisと同定した。
【0177】
ＥＢ７６１株の形態学的性質を、コロニーの性状および形態観察により調べた。ＹＭ平板培地上で２日間培養した結果、黄橙色～クリーム色、表面が平滑でバター様、湿性のコロニー性状を示した。培養開始３日目の栄養細胞は楕円形～卵形であり、増殖は細胞極部の短柄上からの出芽によることが確認された。また、培養開始約５週間経過した平板での有性生殖器官の形成は認められなかった。
【0178】
分子系統学的位置および形態学的性質ならびにエルゴチオネインの生産量の測定より、ＥＢ７６１株はDirkmeia churashimaensisに帰属される新規微生物と判断した。
【0179】
（ＥＣ０２１株の分子系統学的位置および形態学的性質）
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＣ０２１株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列（配列番号１３）は担子菌系酵母の一種であるDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列に対し99.7～100%の同一性を示した（表３０、３１）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図１３）において、ＥＣ０２１株はDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列と同一の分子系統学的位置を示した。
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＣ０２１株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列（配列番号１３）は担子菌系酵母の一種であるDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列に対し99.7～100%の同一性を示した（表３０、３１）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図１３）において、ＥＣ０２１株はDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列と同一の分子系統学的位置を示した。
【0180】
表３０は、DB-FUに対するBLAST検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索された26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列解析データである。*は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0181】
表３１は、国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索された26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列解析データである。*は簡易分子系統解析に供した配列データである。表３１中の「ａ」は基準株由来の塩基配列ではなく、登録情報に誤りがある可能性が示唆されたため解析対象外とした。
【0182】
図１３は、ＥＣ０２１株の26S rDNAのD1/D2領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す。左上の線はスケールバーを示す。系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。株名の末尾の「Ｔ」はその種の基準株を示す。
【0183】
【表30】
【0184】
【表31】
【0185】
微生物同定システム「ENKI」を用いたDB-FUおよび国際塩基配列データベースに対するBLAST相同性検索の結果、ＥＣ０２１株のrDNAのITS領域の塩基配列（配列番号１４）は担子菌系酵母の一種であるDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列に対し98.4～100%の同一性を示した（表３２、３３）。DB-FUおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹（図１４）において、ＥＣ０２１株はDirkmeia churashimaensisの複数の塩基配列と100%の高いブートストラップ値で支持されるクラスターを形成した。
【0186】
表３２は、DB-FUに対するBLAST検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索されたrDNAのITS領域の塩基配列解析データである。*は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0187】
表３３は、国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索結果であり、相同性スコアで上位３０に検索されたrDNAのITS領域の塩基配列解析データである。*は簡易分子系統解析に供した配列データである。
【0188】
図１４は、ＥＣ０２１株のrDNAのITS領域の塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す。左上の線はスケールバーを示す。系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。株名の末尾の「Ｔ」はその種の基準株を示す。
【0189】
【表32】
【0190】
【表33】
【0191】
以上のことから、26S rDNAのD1/D2領域およびrDNAのITS領域の塩基配列解析結果において、ＥＣ０２１株をDirkmeia churashimaensisと同定した。
【0192】
ＥＣ０２１株の形態学的性質を、コロニーの性状および形態観察により調べた。ＹＭ平板培地上で３日間培養した結果、黄橙色～クリーム色、表面が平滑でバター様、湿性、粘稠性のコロニー性状を示した。栄養細胞は楕円形～卵形であり、増殖は細胞局部からの短柄上からの出芽によることが確認された。また、培養開始約３週間経過した平板での有性生殖器官の形成は認められなかった。
【0193】
分子系統学的位置および形態学的性質ならびにエルゴチオネインの生産量の測定より、ＥＣ０２１株はDirkmeia churashimaensisに帰属される新規微生物と判断した。
【産業上の利用可能性】
【0194】
本発明の微生物は、エルゴチオネインの生産量が高く、健康および美容等の分野において利用可能である。
【受託番号】
【0195】
ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０６
ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０７
ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０８
ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０９
ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１０
ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１１
ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１２
ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０７
ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０８
ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７０９
ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１０
ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１１
ＮＩＴＥ ＢＰ－０３７１２
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】