特許7870919IP Force 特許公報全文掲載

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技術分野

新規な人工ＲＮＡ分子に関し、とりわけｍＲＮＡのスプライシングを調節する人工ＲＮＡ分子、

発明が解決しようとする課題[発明の詳細な説明]から抜粋

しかしながら、アンチセンス核酸医薬品は、一般的にその長さが１４～２５塩基程度であるため、標的遺伝子の中からｍＲＮＡスプライシング調節に効果的な箇所を探索するスクリーニングが必要であり、開発に時間と費用がかかる。また、半減期が短いために数週間から数か月おきに繰り返し投与しなければ薬効が保たれず、医療経済的に大きな負担となる。

課題を解決するための手段[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明者らは、鋭意検討した結果、齧歯目ネズミ亜目動物特異的な非コードＲＮＡがｍＲＮＡスプライシングに関与することを見出した。そしてさらに検討を重ねて、齧歯目ネズミ亜目動物特異的な非コードＲＮＡの特定の配列の特徴的な二次構造が、スプライシング制御因子を呼び込む役割およびＲＮＡ分子を安定化する役割を果たし、この二次構造を、標的とするｍＲＮＡ前駆体に相補的な配列と組み合わせた人工ＲＮＡ分子を用・・・　続きを知財ポータルサイト IP Force にログインして見る

発明の効果[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明によれば、特徴的な二次構造と標的とするｍＲＮＡ前駆体に相補的な配列とを組み合わせた人工ＲＮＡ分子、およびその人工ＲＮＡ分子を用いた方法により、従来技術とは異なるｍＲＮＡスプライシングを調節する新たな技術が提供される。

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1】 二次構造予測プログラムＲＮＡｆоｌｄにより予測された４．５ＳＨ ＲＮＡの二次構造の一部を示す模式図である。
【図2】 野生型および４．５ＳＨノックアウトマウスにおいてａｓＳＩＮＥＢ１をもつ３つの遺伝子をそれぞれ特異的に増幅するプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した際の泳動図である。左から順にＳｍｃｈｄ１、Ｓｌｃ２５ａ４０、Ｓｍｇ６の結果である。左の模式図で示すマーカーは、上段が灰色の新規エクソンを含むｍＲＮＡを示し、下段が新規エクソンを含まないｍＲＮＡを示す。問題とするエクソンを灰色に、その両側を黒色および白色で表したものである。
【図3】 Ｕ６プロモーターおよびマウス４．５ＳＨの配列を搭載したレポーターの模式図である。レポーターの５´側から順にＵ６プロモーター配列、４．５ＳＨ配列が配置されている。
【図4】 図３に図示したプロモーターを導入・発現したことにより、ヒト細胞において４．５ＳＨ ＲＮＡが発現していることをノザンブロッティング法により確認した結果を示す泳動図である。
【図5】 ヒト４．５ＳＨ発現細胞に、ａｓＳＩＮＥＢ１をもつ２つの遺伝子をそれぞれ組み込んだミニジーンを導入し、それぞれを特異的に増幅するプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した際の泳動図である。左から順にＳｌｃ２５ａ４０、Ｓｍｇ６の結果である。左の模式図で示すマーカーは、上段が灰色の新規エクソンを含むｍＲＮＡを示し、下段が新規エクソンを含まないｍＲＮＡを示す。
【図6】 図５の泳動図から求めたスキッピング効率を示す棒グラフである。左にＳｌｃ２５ａ４０、右にＳｍｇ６の結果を表す。
【図7】 上から順に、Ｓｌｃ２５ａ４０の野生型（ＷＴ）、４．５ＳＨの野生型（ＷＴ）、Ｓｌｃ２５ａ４０の変異型（ＭＵＴ）、４．５ＳＨの変異型（ＭＵＴ）を発現するプラスミドのＤＮＡ塩基配列の一部である。ＷＴとＭＵＴで塩基が異なる部分を灰色で示す。
【図8】 変異型プラスミドおよび野生型プラスミドをヒト細胞に導入し、それぞれを特異的に増幅するプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した際の泳動図である。
【図9】 図８の泳動図から求めたスキッピング効率を示す棒グラフである。左から順にＳｌｃ２５ａ４０野生型のみ、野生型同士、Ｓｌｃ２５ａ４０変異型と４．５ＳＨ野生型、Ｓｌｃ２５ａ４０野生型と４．５ＳＨ変異型、変異型同士、を示す。
【図10】 Ｂ１改変４．５ＳＨ（ＳＬ－Ｂ１－４．５ＳＨ）のエクソンスキッピング効率を示す図である。上から順に、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによる泳動図、ノザンブロッティング法によりＲＮＡの発現を確認した結果を示す泳動図、エクソンスキッピング効率を示す棒グラフである。ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによる泳動図の左の模式図で示すマーカーは、上段がＳｌｃ２５ａ４０新規エクソン（エクソン８．５）を含むｍＲＮＡを示し、下段がＳｌｃ２５ａ４０エクソン８．５を含まないｍＲＮＡを示す。
【図11】 ＦＡＳ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンと野生型４．５ＳＨまたはＦＡＳ改変４．５ＳＨを共発現させた際の泳動図である。
【図12】 Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８．５を含むミニジーンと野生型４．５ＳＨまたはＦＡＳ改変４．５ＳＨを共発現させた際の泳動図である。
【図13】 図１１および図１２の泳動図から求めたスキッピング効率を示す棒グラフである。
【図14】 ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨの標的配列の模式図である。
【図15】 ＤＭＤ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンとＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨを共発現させた際の泳動図である。左の模式図で示すマーカーは、上段が灰色のＤＭＤエクソン５３を含むｍＲＮＡを示し、下段がＤＭＤエクソン５３を含まないｍＲＮＡを示す。
【図16】 ＤＭＤ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンとＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨを共発現させた際のＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによる泳動図である。上の模式図は、ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨのＤＭＤエクソン５３への標的化を説明する模式図である。左の模式図で示すマーカーは、上段がＤＭＤエクソン５３を含むｍＲＮＡを示し、下段がＤＭＤエクソン５３を含まないｍＲＮＡを示す。
【図17】 ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨの標的配列の模式図である。
【図18】 ＤＭＤ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンとＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨを共発現させた際の結果を示す図である。上から、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによる泳動図、ノザンブロッティング法によりＲＮＡの発現を確認した結果を示す泳動図、エクソンスキッピング効率を示す棒グラフである。ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによる泳動図の左の模式図で示すマーカーは、上段がＤＭＤエクソン５３を含むｍＲＮＡを示し、下段がＤＭＤエクソン５３を含まないｍＲＮＡを示す。
【図19】 ＭＡＰＴ遺伝子改変４．５ＳＨのエクソンスキッピング効率を示す図である。上から順にＭＡＰＴ遺伝子改変４．５ＳＨのＭＡＰＴエクソン１０への標的化を説明する模式図、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによる泳動図、ノザンブロッティング法によりＲＮＡの発現を確認した結果を示す泳動図、エクソンスキッピング効率を示す棒グラフである。ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによる泳動図の左の模式図で示すマーカーは、上段がＭＡＰＴエクソン１０を含むｍＲＮＡを示し、下段がＭＡＰＴエクソン１０を含まないｍＲＮＡを示す。

代表図 図1本件の代表的な図

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