特許7905336IP Force 特許公報全文掲載

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技術分野

関連出願の相互参照 本特許出願は、２０２０年１２月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１２１，３３８号に対する優先権を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

発明が解決しようとする課題[発明の詳細な説明]から抜粋

マラリアを検出するための信頼性が高く、迅速で、安価で、高感度の手段がないため、献血の安全性が脅かされている。したがって、血液などの生物学的サンプル中のマラリアの存在を検出および定量化するための迅速で信頼性が高く、特異的かつ高感度の方法が当技術分野で必要とされている。血液サンプルおよび提供物中のマラリア原虫種（熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、サルマラリア原虫（Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉ）、および四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ））を検出およびスクリーニングするためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイ

課題を解決するための手段[発明の詳細な説明]から抜粋

生物学的サンプルまたは非生物学的サンプル中のマラリア原虫（プラスモジウムなど）の有無の迅速な検出、例えば、単一の試験管または容器内でのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるマラリア原虫（プラスモジウムなど）の多重検出および定量のための方法に関する。本明細書では、増幅工程およびハイブリダイズ工程を含み得る少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含む、マラリア原虫（プ・・・　続きを知財ポータルサイト IP Force にログインして見る

この特許の権利範囲[特許請求の範囲]

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1】 図１は、蚊における有性生殖とヒト宿主における無性生殖との間で寄生生物が交互に繰り返される、複雑な生活環プラスモジウムの図を示す（ＣＤＣウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｍａｌａｒｉａから改変））。
【図2A】 図２Ａは、１８Ｓ－１標的（配列番号１および２の核酸配列を有するプライマー、ならびに配列番号３の核酸配列を有するプローブによる）のデータを示す。
【図2B】 図２Ｂは、１８Ｓ－３標的（配列番号５および６の核酸配列を有するプライマー、ならびに配列番号７の核酸配列を有するプローブによる）のデータを示す。
【図2C】 図２Ｃは、１８Ｓ－４標的（配列番号８および９の核酸配列を有するプライマー、ならびに配列番号１０の核酸配列を有するプローブによる）のデータを示す。
【図2D】 図２Ｄは、ＭＴ－１標的（配列番号１６および１７の核酸配列を有するプライマー、ならびに配列番号１８の核酸配列を有するプローブによる）のデータを示す。
【図2E】 図２Ｅは、ＭＴ－２標的（配列番号１１および１２の核酸配列を有するプライマー、ならびに配列番号１５の核酸配列を有するプローブによる）のデータを示す。
【図2F】 図２Ｆは、Ｒ１２５標的（配列番号２１および２２の核酸配列を有するプライマー、ならびに配列番号２３の核酸配列を有するプローブによる）のデータを示す。
【図3】 図３は、１：１０５希釈レベルでの溶出液についての実施例１からのデータを示す。
【図4】 図４は、実施例１に記載されているように、再設計されたプローブ（配列番号４）を使用した１８Ｓ－１標的に対する熱帯熱マラリア原虫培養物から熱帯熱マラリア原虫を使用したプラスモジウムアッセイのリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。元の１８Ｓ－１プローブ（配列番号３）を使用した曲線を青色で示し、再設計された１８Ｓ－１プローブ（配列番号４）を使用した曲線を赤色で示す。使用される全てのプライマーは、配列番号１および２の核酸配列を有する。
【図5】 図５は、熱帯熱マラリア原虫培養物のｄｄＰＣＲの結果を示す。結果は、熱帯熱マラリア原虫培養物の１：１０５培養希釈物のコピー数（μｌあたり）を示す。１８Ｓ－１標的に対する試験では、配列番号１および２の核酸配列を有するプライマーと、配列番号３７の核酸配列を有するプローブとを用いた。１８Ｓ－３標的に対する試験では、配列番号５および６の核酸配列を有するプライマーと、配列番号３８の核酸配列を有するプローブとを用いた。１８Ｓ－４標的に対する試験では、配列番号８および９の核酸配列を有するプライマーと、配列番号３９の核酸配列を有するプローブとを用いた。ＭＴ－１標的に対する試験では、配列番号１６および１７の核酸配列を有するプライマーと、配列番号４２の核酸配列を有するプローブとを用いた。ＭＴ－２標的に対する試験では、配列番号１１および１２の核酸配列を有するプライマーと、配列番号４１の核酸配列を有するプローブとを用いた。Ｒ１２５標的に対する試験では、配列番号２１および２２の核酸配列を有するプライマーと、配列番号４０の核酸配列を有するプローブとを用いた。
【図6A】 図６Ａは、１８Ｓ－１および１８Ｓ－４標的に対するプライマーおよびプローブを用いたマルチプレックスアッセイからのデータを示す。
【図6B】 図６Ｂは、１８Ｓ－１および１８Ｓ－４標的に対するプライマーおよびプローブを用いたマルチプレックスアッセイからのリアルタイムＰＣＲ増増幅曲線を示す。１８Ｓ－１標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号１および２の核酸配列を有するプライマーと、配列番号４の核酸配列を有するプローブとを用いた。１８Ｓ－４標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号８および９の核酸配列を有するプライマーと、配列番号１０の核酸配列を有するプローブとを用いた。
【図7A】 図７Ａは、５００ｎｇの全血ゲノムＤＮＡのバックグラウンドにおいて、４つの異なる希釈レベル（１：１０４、１：１０５、１：１０６、１：１０７）で熱帯熱マラリア原虫培養物からの熱帯熱マラリア原虫を使用した、１８Ｓ－１およびＲ１２５標的に対するプライマーおよびプローブを用いたマルチプレックスアッセイからのデータを示す。
【図7B】 図７Ｂは、１８Ｓ－１およびＲ１２５標的に対するプライマーおよびプローブを用いたマルチプレックスアッセイからのリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。１８Ｓ－１標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号１および２の核酸配列を有するプライマーと、配列番号４の核酸配列を有するプローブとを用いた。Ｒ１２５標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号２１および２２の核酸配列を有するプライマーと、配列番号２５の核酸配列を有するプローブとを用いた。
【図8】 図８は、５００ｎｇの全血ゲノムＤＮＡのバックグラウンドにおいて、５つの異なるレベル：１０５，１０４，１０３，１０２および１０コピー）の１８Ｓ－１およびＲ１２５標的のインビトロ転写物を使用した、１８Ｓ－１およびＲ１２５標的に対するプライマーおよびプローブを用いたマルチプレックスアッセイからのデータを示す。１８Ｓ－１標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号１および２の核酸配列を有するプライマーと、配列番号４の核酸配列を有するプローブとを用いた。Ｒ１２５標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号２１および２２の核酸配列を有するプライマーと、配列番号２５の核酸配列を有するプローブとを用いた。
【図9】 図９は、５００ｎｇの全血ゲノムＤＮＡ／ＲＮＡのバックグラウンドにおいて、Ｒ１２５標的のインビトロ転写物（１０３コピー）を増幅および検出するためのプライマー（配列番号２２および２６）およびプローブ（配列番号２５）を使用したシングルプレックスアッセイからのリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。フォワードプライマーは配列番号２６の核酸配列を有し、リバースプライマーは配列番号２２の核酸配列を有し、プローブは配列番号２５の核酸配列を有する。
【図10A】 図１０Ａは、ｃｏｂａｓ６８００装置で抽出された全血核酸のバックグラウンドにおいて、４つの異なる希釈レベル（１：１０４、１：１０５、１：１０６、１：１０７）で熱帯熱マラリア原虫培養物からの熱帯熱マラリア原虫を使用した、１８Ｓ－１およびＲ１２５標的に対するプライマーおよびプローブを用いたマルチプレックスアッセイからのデータを示す。
【図10B】 図１０Ｂは、１８Ｓ－１およびＲ１２５標的に対するプライマーおよびプローブを用いたマルチプレックスアッセイからのリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。１８Ｓ－１標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号３４および３６の核酸配列を有するプライマーと、配列番号４の核酸配列を有するプローブとを用いた。Ｒ１２５標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号２７および２２の核酸配列を有するプライマーと、配列番号２５の核酸配列を有するプローブとを用いた。
【図11】 図１１は、ｃｏｂａｓ６８００機器で抽出された全血核酸のバックグラウンドにおいて、２つの異なる希釈レベル（１：１０４および１：１０５）で熱帯熱マラリア原虫培養物からの熱帯熱マラリア原虫を使用した、１８Ｓ－１および１８Ｓ－３標的に対するプライマーおよびプローブを用いたマルチプレックスアッセイからのリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。１８Ｓ－１標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号３４～３６の核酸配列を有するプライマーと、配列番号４の核酸配列を有するプローブとを用いた。１８Ｓ－３標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号５６および５７の核酸配列を有するプライマーと、配列番号５８の核酸配列を有するプローブとを用いた。
【図12】 図１２は、ｃｏｂａｓ６８００機器で抽出された全血核酸のバックグラウンドにおいて、２つの異なる希釈レベル（１：１０３および１：１０４）で三日熱マラリア原虫培養物からの三日熱マラリア原虫を使用した、１８Ｓ－１および１８Ｓ－３標的に対するプライマーおよびプローブを用いたマルチプレックスアッセイからのリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。１８Ｓ－１標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号３４～３６の核酸配列を有するプライマーと、配列番号４の核酸配列を有するプローブとを用いた。１８Ｓ－３標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号５６および５７の核酸配列を有するプライマーと、配列番号５８の核酸配列を有するプローブとを用いた。
【図13】 図１３は、ＰＣＲ反応レベル当たり１０００コピーのサルマラリア原虫１８Ｓ ｒＲＮＡ配列を含有するＤＮＡプラスミドを使用した、１８Ｓ－１および１８Ｓ－３標的に対するプライマーおよびプローブを用いたマルチプレックスアッセイからのリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。１８Ｓ－１標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号３４～３６の核酸配列を有するプライマーと、配列番号４の核酸配列を有するプローブとを用いた。１８Ｓ－３標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号５６および５７の核酸配列を有するプライマーと、配列番号５８の核酸配列を有するプローブとを用いた。
【図14】 図１４は、ＰＣＲ反応レベル当たり１０００コピーの四日熱マラリア原虫１８Ｓ ｒＲＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドを使用した、１８Ｓ－１および１８Ｓ－３標的に対するプライマーおよびプローブを用いたマルチプレックスアッセイからのリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。１８Ｓ－１標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号３４～３６の核酸配列を有するプライマーと、配列番号４の核酸配列を有するプローブとを用いた。１８Ｓ－３標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号５６および５７の核酸配列を有するプライマーと、配列番号５８の核酸配列を有するプローブとを用いた。
【図15】 図１５は、ＰＣＲ反応レベル当たり１０００コピーの卵形マラリア原虫１８Ｓ ｒＲＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドを使用した、１８Ｓ－１および１８Ｓ－３標的に対するプライマーおよびプローブを使用したマルチプレックスアッセイからのリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。１８Ｓ－１標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号３４～３６の核酸配列を有するプライマーと、配列番号４の核酸配列を有するプローブとを用いた。１８Ｓ－３標的について、このマルチプレックスアッセイでは、配列番号５６および５７の核酸配列を有するプライマーと、配列番号５８の核酸配列を有するプローブとを用いた。

代表図 図1本件の代表的な図

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