特許7914004IP Force 特許公報全文掲載

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（関連出願の相互参照） 本出願は、２０２０年２月２７日に出願された米国特許出願第６２／９８２，４９２号、２０２０年２月２７日に出願された同第６２／９８２，５０５号、２０２０年２月２７日に出願された同第６２／９８２，３７４号、２０２０年２月２７日に出願された同第６２／９８２，４６２号、２０２０年２月２７日に出願された同第６２／９８２，４７８号、２０２０年２月２７日に出願された同第６２／９８２，４６９号、２０２０年２月２７日に出願された同第６２／９８２，５２５号、２０２０年２月２７日に出願された同第６２／９８２，５３５号、２０２０年２月２７日に出願された同第６２／９８２，５７４号、２０２０年２月２７日に出願された同第６２／９８２，５９１号、２０２０年２月２７日に出願された同第６２／９８２，６６４号、２０２０年２月２７日に出願された同第６２／９８２，６６９号、２０２０年２月２７日に出願された同第６２／９８２，６０２号、２０２０年２月２７日に出願された同第６２／９８２，５４８号、２０２０年３月１３日に出願された同第６２／９８８，９９６号、２０２０年３月１３日に出願された同第６２／９８９，００２号、２０２０年３月１３日に出願された同第６２／９８９，００６号、２０２０年３月１３日に出願された同第６２／９８９，０１０号、２０２０年３月１３日に出願された同第６２／９８９，０１８号、２０２０年３月１３日に出願された同第６２／９８９，０２４号、２０２０年３月１３日に出願された同第６２／９８９，０２７号、２０２０年３月１３日に出願された同第６２／９８９，０３６号、２０２０年３月１３日に出願された同第６２／９８９，０４２号、２０２０年３月１３日に出願された同第６２／９８９，０４５号、２０２０年３月１３日に出願された同第６２／９８９，０５２号、２０２０年３月１３日に出願された同第６２／９８９，０５７号、２０２０年３月１３日に出願された同第６２／９８９，０６８号、２０２０年３月１３日に出願された同第６２／９８９，０７５号、２０２０年５月７日に出願された国際出願第ＵＳ２０／３１７４９号、２０２０年９月４日に出願された米国特許出願第６３／０７４，６５５号、２０２０年９月４日に出願された同第６３／０７４，６７６号、２０２０年９月４日に出願された同第６３／０７４，８５４号、２０２０年９月４日に出願された同第６３／０７４，７００号、２０２０年９月４日に出願された同第６３／０７４，７４９号、２０２０年９月４日に出願された同第６３／０７４，７３５号、２０２０年９月４日に出願された同第６３／０７４，８３９号、２０２０年９月４日に出願された同第６３／０７４，７５９号、２０２０年９月４日に出願された同第６３／０７４，９０３号、２０２０年９月４日に出願された同第６３／０７４，８９３号、２０２０年９月４日に出願された同第６３／０７４，９２５号、２０２０年９月４日に出願された同第６３／０７４，９３７号、２０２０年９月４日に出願された同第６３／０７４，９６２号、２０２０年９月４日に出願された同第６３／０７４，９４６号、２０２０年１１月１１日に出願された同第６３／１１２，４６２号、及び２０２０年１１月１１日に出願された同第６３／１１２，４７５号の利益を主張する。

課題を解決するための手段[発明の詳細な説明]から抜粋

例えば、ＴＲＧＶ９抗体及び多重特異性抗体などのＴＲＧＶ９分子、並びに抗体をコードする核酸及び発現ベクター、ベクターを含有する組換え細胞、並びに抗体を含む組成物などを含むＴ細胞受容体再指向技術が提供される。

この特許の権利範囲[特許請求の範囲]

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

前述の概要、並びに本出願の特定の実施形態の以下の詳細な説明は、添付される図面とともに読まれることで、よりよく理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
【図1】 ＴＲＧＶ９に結合する第１の結合ドメインを含む例示的な多重特異性ＴＲＧＶ９抗体と、標的細胞上の第２の標的抗原に結合して、標的細胞にγδ Ｔ細胞を動員し、標的細胞死を誘導する第２の結合ドメインとの結合を示す概略図を示す。第２の標的抗原は、腫瘍関連抗原（tumor associated antigen、ＴＡＡ）であり得、標的細胞は腫瘍細胞であり得、抗ＴＲＧＶ９／抗ＴＡＡ二重特異性抗体は、癌細胞にγδ Ｔ細胞を動員し、癌細胞死を誘導することができる。
【図2】 ゾレドロン酸が全末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）からＶγ９Ｖδ２細胞を選択的に増大させることを示すグラフを示す。
【図3A】 Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞の表現型の特性評価を示す。図３Ａは、γδ Ｔ細胞の分化を説明するために使用されるゲートの概略図を示す（左）。代表的なＦＡＣＳドットプロットは、新鮮なＰＢＭＣ（左）及びゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でエクスビボにおいて１４日間培養されたＰＢＭＣ（右）からのＶγ９＋γδ Ｔ細胞の分化プロファイルを示す。象限の数字は、新鮮かつ活性化されたＶγ９＋γδ Ｔ細胞のうちのそれぞれの集団の頻度（平均±ＳＥＭ）を反映している。表されたデータは、単一の実験からの５人のドナー（ｎ＝５）の平均（±ＳＥＭ）である。図３Ｂは、新鮮なＰＢＭＣ（上段）又はゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５で１４日間培養されたＰＢＭＣ（下段）のいずれかからの、それぞれの活性化マーカーに対して陽性のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を反映する代表的なドットプロットの数を示す。表されたデータは、２つの独立した実験からのＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ４４発現データについての、７人のドナー（ｎ＝７）の平均（±ＳＥＭ）である。ｎは、単一の実験から、ＮＫＧ２Ｄ発現データについて５人のドナーであり、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ７１発現データのそれぞれについて２人のドナーである。図３Ｃは、新鮮なＰＢＭＣ（上段）又はゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５で１４日間培養されたＰＢＭＣ（下段）のいずれかからの、それぞれの阻害受容体表面発現に対して陽性のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を示すドットプロットにおけるゲートを超える数を示す。本明細書に示されるデータは、２つの独立した実験からの、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、及びＬＡＧ３表面発現についての５人のドナー（ｎ＝５）、並びに２Ｂ４及びＴＩＭ３表面発現データについての７人のドナー（ｎ＝７）の平均（±ＳＥＭ）である。図３Ｄは、新鮮なＰＢＭＣ（上段）及びゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でエクスビボにおいて１４日間培養されたＰＢＭＣ（下段）からの、細胞内グランザイムＢ（左列）及びパーフォリン（右列）を発現するＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を実証する代表的なＦＡＣＳドットプロットを示す。示されたデータは、２つの独立した実験からの、グランザイムＢ及びパーフォリンデータのそれぞれについての、４人（ｎ＝４）及び７人（ｎ＝７）のドナーの平均（±ＳＥＭ）である。図３Ｅは、ゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でのＰＢＭＣ培養の０日目及び１４日目の、細胞培養上清中のサイトカインの平均（±ＳＥＭ）濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す棒グラフを示す。表されたデータは、単一ドナーからの４つのウェル（ｎ＝４）の平均（±ＳＥＭ）である。
【図3B】 Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞の表現型の特性評価を示す。図３Ａは、γδ Ｔ細胞の分化を説明するために使用されるゲートの概略図を示す（左）。代表的なＦＡＣＳドットプロットは、新鮮なＰＢＭＣ（左）及びゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でエクスビボにおいて１４日間培養されたＰＢＭＣ（右）からのＶγ９＋γδ Ｔ細胞の分化プロファイルを示す。象限の数字は、新鮮かつ活性化されたＶγ９＋γδ Ｔ細胞のうちのそれぞれの集団の頻度（平均±ＳＥＭ）を反映している。表されたデータは、単一の実験からの５人のドナー（ｎ＝５）の平均（±ＳＥＭ）である。図３Ｂは、新鮮なＰＢＭＣ（上段）又はゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５で１４日間培養されたＰＢＭＣ（下段）のいずれかからの、それぞれの活性化マーカーに対して陽性のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を反映する代表的なドットプロットの数を示す。表されたデータは、２つの独立した実験からのＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ４４発現データについての、７人のドナー（ｎ＝７）の平均（±ＳＥＭ）である。ｎは、単一の実験から、ＮＫＧ２Ｄ発現データについて５人のドナーであり、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ７１発現データのそれぞれについて２人のドナーである。図３Ｃは、新鮮なＰＢＭＣ（上段）又はゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５で１４日間培養されたＰＢＭＣ（下段）のいずれかからの、それぞれの阻害受容体表面発現に対して陽性のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を示すドットプロットにおけるゲートを超える数を示す。本明細書に示されるデータは、２つの独立した実験からの、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、及びＬＡＧ３表面発現についての５人のドナー（ｎ＝５）、並びに２Ｂ４及びＴＩＭ３表面発現データについての７人のドナー（ｎ＝７）の平均（±ＳＥＭ）である。図３Ｄは、新鮮なＰＢＭＣ（上段）及びゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でエクスビボにおいて１４日間培養されたＰＢＭＣ（下段）からの、細胞内グランザイムＢ（左列）及びパーフォリン（右列）を発現するＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を実証する代表的なＦＡＣＳドットプロットを示す。示されたデータは、２つの独立した実験からの、グランザイムＢ及びパーフォリンデータのそれぞれについての、４人（ｎ＝４）及び７人（ｎ＝７）のドナーの平均（±ＳＥＭ）である。図３Ｅは、ゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でのＰＢＭＣ培養の０日目及び１４日目の、細胞培養上清中のサイトカインの平均（±ＳＥＭ）濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す棒グラフを示す。表されたデータは、単一ドナーからの４つのウェル（ｎ＝４）の平均（±ＳＥＭ）である。
【図3C】 Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞の表現型の特性評価を示す。図３Ａは、γδ Ｔ細胞の分化を説明するために使用されるゲートの概略図を示す（左）。代表的なＦＡＣＳドットプロットは、新鮮なＰＢＭＣ（左）及びゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でエクスビボにおいて１４日間培養されたＰＢＭＣ（右）からのＶγ９＋γδ Ｔ細胞の分化プロファイルを示す。象限の数字は、新鮮かつ活性化されたＶγ９＋γδ Ｔ細胞のうちのそれぞれの集団の頻度（平均±ＳＥＭ）を反映している。表されたデータは、単一の実験からの５人のドナー（ｎ＝５）の平均（±ＳＥＭ）である。図３Ｂは、新鮮なＰＢＭＣ（上段）又はゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５で１４日間培養されたＰＢＭＣ（下段）のいずれかからの、それぞれの活性化マーカーに対して陽性のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を反映する代表的なドットプロットの数を示す。表されたデータは、２つの独立した実験からのＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ４４発現データについての、７人のドナー（ｎ＝７）の平均（±ＳＥＭ）である。ｎは、単一の実験から、ＮＫＧ２Ｄ発現データについて５人のドナーであり、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ７１発現データのそれぞれについて２人のドナーである。図３Ｃは、新鮮なＰＢＭＣ（上段）又はゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５で１４日間培養されたＰＢＭＣ（下段）のいずれかからの、それぞれの阻害受容体表面発現に対して陽性のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を示すドットプロットにおけるゲートを超える数を示す。本明細書に示されるデータは、２つの独立した実験からの、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、及びＬＡＧ３表面発現についての５人のドナー（ｎ＝５）、並びに２Ｂ４及びＴＩＭ３表面発現データについての７人のドナー（ｎ＝７）の平均（±ＳＥＭ）である。図３Ｄは、新鮮なＰＢＭＣ（上段）及びゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でエクスビボにおいて１４日間培養されたＰＢＭＣ（下段）からの、細胞内グランザイムＢ（左列）及びパーフォリン（右列）を発現するＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を実証する代表的なＦＡＣＳドットプロットを示す。示されたデータは、２つの独立した実験からの、グランザイムＢ及びパーフォリンデータのそれぞれについての、４人（ｎ＝４）及び７人（ｎ＝７）のドナーの平均（±ＳＥＭ）である。図３Ｅは、ゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でのＰＢＭＣ培養の０日目及び１４日目の、細胞培養上清中のサイトカインの平均（±ＳＥＭ）濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す棒グラフを示す。表されたデータは、単一ドナーからの４つのウェル（ｎ＝４）の平均（±ＳＥＭ）である。
【図3D】 Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞の表現型の特性評価を示す。図３Ａは、γδ Ｔ細胞の分化を説明するために使用されるゲートの概略図を示す（左）。代表的なＦＡＣＳドットプロットは、新鮮なＰＢＭＣ（左）及びゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でエクスビボにおいて１４日間培養されたＰＢＭＣ（右）からのＶγ９＋γδ Ｔ細胞の分化プロファイルを示す。象限の数字は、新鮮かつ活性化されたＶγ９＋γδ Ｔ細胞のうちのそれぞれの集団の頻度（平均±ＳＥＭ）を反映している。表されたデータは、単一の実験からの５人のドナー（ｎ＝５）の平均（±ＳＥＭ）である。図３Ｂは、新鮮なＰＢＭＣ（上段）又はゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５で１４日間培養されたＰＢＭＣ（下段）のいずれかからの、それぞれの活性化マーカーに対して陽性のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を反映する代表的なドットプロットの数を示す。表されたデータは、２つの独立した実験からのＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ４４発現データについての、７人のドナー（ｎ＝７）の平均（±ＳＥＭ）である。ｎは、単一の実験から、ＮＫＧ２Ｄ発現データについて５人のドナーであり、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ７１発現データのそれぞれについて２人のドナーである。図３Ｃは、新鮮なＰＢＭＣ（上段）又はゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５で１４日間培養されたＰＢＭＣ（下段）のいずれかからの、それぞれの阻害受容体表面発現に対して陽性のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を示すドットプロットにおけるゲートを超える数を示す。本明細書に示されるデータは、２つの独立した実験からの、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、及びＬＡＧ３表面発現についての５人のドナー（ｎ＝５）、並びに２Ｂ４及びＴＩＭ３表面発現データについての７人のドナー（ｎ＝７）の平均（±ＳＥＭ）である。図３Ｄは、新鮮なＰＢＭＣ（上段）及びゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でエクスビボにおいて１４日間培養されたＰＢＭＣ（下段）からの、細胞内グランザイムＢ（左列）及びパーフォリン（右列）を発現するＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を実証する代表的なＦＡＣＳドットプロットを示す。示されたデータは、２つの独立した実験からの、グランザイムＢ及びパーフォリンデータのそれぞれについての、４人（ｎ＝４）及び７人（ｎ＝７）のドナーの平均（±ＳＥＭ）である。図３Ｅは、ゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でのＰＢＭＣ培養の０日目及び１４日目の、細胞培養上清中のサイトカインの平均（±ＳＥＭ）濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す棒グラフを示す。表されたデータは、単一ドナーからの４つのウェル（ｎ＝４）の平均（±ＳＥＭ）である。
【図3E】 Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞の表現型の特性評価を示す。図３Ａは、γδ Ｔ細胞の分化を説明するために使用されるゲートの概略図を示す（左）。代表的なＦＡＣＳドットプロットは、新鮮なＰＢＭＣ（左）及びゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でエクスビボにおいて１４日間培養されたＰＢＭＣ（右）からのＶγ９＋γδ Ｔ細胞の分化プロファイルを示す。象限の数字は、新鮮かつ活性化されたＶγ９＋γδ Ｔ細胞のうちのそれぞれの集団の頻度（平均±ＳＥＭ）を反映している。表されたデータは、単一の実験からの５人のドナー（ｎ＝５）の平均（±ＳＥＭ）である。図３Ｂは、新鮮なＰＢＭＣ（上段）又はゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５で１４日間培養されたＰＢＭＣ（下段）のいずれかからの、それぞれの活性化マーカーに対して陽性のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を反映する代表的なドットプロットの数を示す。表されたデータは、２つの独立した実験からのＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ４４発現データについての、７人のドナー（ｎ＝７）の平均（±ＳＥＭ）である。ｎは、単一の実験から、ＮＫＧ２Ｄ発現データについて５人のドナーであり、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ７１発現データのそれぞれについて２人のドナーである。図３Ｃは、新鮮なＰＢＭＣ（上段）又はゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５で１４日間培養されたＰＢＭＣ（下段）のいずれかからの、それぞれの阻害受容体表面発現に対して陽性のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を示すドットプロットにおけるゲートを超える数を示す。本明細書に示されるデータは、２つの独立した実験からの、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、及びＬＡＧ３表面発現についての５人のドナー（ｎ＝５）、並びに２Ｂ４及びＴＩＭ３表面発現データについての７人のドナー（ｎ＝７）の平均（±ＳＥＭ）である。図３Ｄは、新鮮なＰＢＭＣ（上段）及びゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でエクスビボにおいて１４日間培養されたＰＢＭＣ（下段）からの、細胞内グランザイムＢ（左列）及びパーフォリン（右列）を発現するＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を実証する代表的なＦＡＣＳドットプロットを示す。示されたデータは、２つの独立した実験からの、グランザイムＢ及びパーフォリンデータのそれぞれについての、４人（ｎ＝４）及び７人（ｎ＝７）のドナーの平均（±ＳＥＭ）である。図３Ｅは、ゾレドロン酸＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でのＰＢＭＣ培養の０日目及び１４日目の、細胞培養上清中のサイトカインの平均（±ＳＥＭ）濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す棒グラフを示す。表されたデータは、単一ドナーからの４つのウェル（ｎ＝４）の平均（±ＳＥＭ）である。
【図4】 ＶＧ１（抗ＴＲＧＶ９／抗ＣＤ１２３二重特異性抗体）が、γδ Ｔ細胞とＫａｓｕｍｉ－３細胞との間のコンジュゲート形成によって実証されるように、Ｖγ９＋Ｔ細胞を動員することを実証するヒストグラムを示す。
【図5A】 異なるエフェクター対標的細胞の比（図５Ａについては１：１、図５Ｂについては５：１、及び図５Ｃについては１０：１）で、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞に対するＶＧ１（抗ＴＲＧＶ９／抗ＣＤ１２３二重特異性抗体）二重特異性媒介性γδ Ｔ細胞の細胞傷害を実証するグラフを示す。
【図5B】 異なるエフェクター対標的細胞の比（図５Ａについては１：１、図５Ｂについては５：１、及び図５Ｃについては１０：１）で、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞に対するＶＧ１（抗ＴＲＧＶ９／抗ＣＤ１２３二重特異性抗体）二重特異性媒介性γδ Ｔ細胞の細胞傷害を実証するグラフを示す。
【図5C】 異なるエフェクター対標的細胞の比（図５Ａについては１：１、図５Ｂについては５：１、及び図５Ｃについては１０：１）で、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞に対するＶＧ１（抗ＴＲＧＶ９／抗ＣＤ１２３二重特異性抗体）二重特異性媒介性γδ Ｔ細胞の細胞傷害を実証するグラフを示す。
【図6A】 Ｋａｓｕｍｉ－３細胞及びＶＧ１、ＶＧ３と共培養した、又は二重特異性抗体を含まないＶγ９＋γδ Ｔ細胞、非Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞、及びＰａｎ－Ｔ細胞（非γδ Ｔ細胞）上のＣＤ６９（図６Ａ）、ＣＤ２５（図６Ｂ）、又はグランザイムＢ（図６Ｃ）発現を実証するグラフを示す。
【図6B】 Ｋａｓｕｍｉ－３細胞及びＶＧ１、ＶＧ３と共培養した、又は二重特異性抗体を含まないＶγ９＋γδ Ｔ細胞、非Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞、及びＰａｎ－Ｔ細胞（非γδ Ｔ細胞）上のＣＤ６９（図６Ａ）、ＣＤ２５（図６Ｂ）、又はグランザイムＢ（図６Ｃ）発現を実証するグラフを示す。
【図6C】 Ｋａｓｕｍｉ－３細胞及びＶＧ１、ＶＧ３と共培養した、又は二重特異性抗体を含まないＶγ９＋γδ Ｔ細胞、非Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞、及びＰａｎ－Ｔ細胞（非γδ Ｔ細胞）上のＣＤ６９（図６Ａ）、ＣＤ２５（図６Ｂ）、又はグランザイムＢ（図６Ｃ）発現を実証するグラフを示す。
【図7】 γδ Ｔ細胞をＣＤ３３＋である癌細胞に動員し、癌細胞死を誘導する抗ＴＲＧＶ９／抗ＣＤ３３二重特異性抗体の結合を実証する概略図を示す。
【図8】 ＶＧ４二重特異性抗体の完全性を実証するＳＤＳ－ＰＡＧＥ（非還元）ゲルを示す。
【図9】 ＦＡＣＳによって測定された、抗ＣＤ３３抗体（クローンＣ３３Ｂ９０４）のＭＯＬＭ－１３腫瘍細胞株への結合を実証するグラフを示す。
【図10】 ＦＡＣＳによって測定された、抗ＣＤ３３抗体（クローンＣ３３Ｂ９０４）のＫａｓｕｍｉ－１腫瘍細胞株への結合を実証するグラフを示す。
【図11】 ＦＡＣＳによって測定された、抗ＣＤ３３抗体（クローンＣ３３Ｂ９０４）のＯＣＩ－ＡＭＬ－３腫瘍細胞株への結合を実証するグラフを示す。
【図12】 抗ＴＲＧＶ９／抗ＣＤ３３二重特異性抗体が、１：１のエフェクター対標的細胞の比で、ＣＤ３３発現Ｋａｓｕｍｉ－３細胞に対してγδ Ｔ細胞の細胞傷害を媒介したことを実証するグラフを示す。エフェクター細胞は、ＰＢＭＣから単離されたγδ Ｔ細胞を濃縮した。
【図13】 抗ＴＲＧＶ９／抗ＣＤ３３二重特異性抗体が、５：１のエフェクター対標的細胞の比で、ＣＤ３３発現Ｋａｓｕｍｉ－３細胞に対してγδ Ｔ細胞の細胞傷害を媒介したことを実証するグラフを示す。エフェクター細胞は、ＰＢＭＣから単離されたγδ Ｔ細胞を濃縮した。
【図14】 抗ＴＲＧＶ９／抗ＣＤ３３二重特異性抗体が、１：１のエフェクター対標的細胞の比で、ＣＤ３３発現Ｋａｓｕｍｉ－３細胞に対してγδ Ｔ細胞の細胞傷害を媒介したことを実証するグラフを示す。エフェクター細胞は、健康なドナー由来のＰＢＭＣであった。
【図15】 γδ Ｔ細胞をＴＲＢＣ１＋である癌細胞に動員し、癌細胞死を誘導する抗ＴＲＧＶ９／抗ＴＲＢＣ１二重特異性抗体の結合を実証する概略図を示す。
【図16】 トランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞に対する抗ＴＲＢＣ１（ＪＯＶＩ－１ ｍＩｇＧ２ａ、ＴＲＢ１Ｂ１）の選択的細胞結合を示す。結合のＥＣ５０は、～１～２ｎＭであった。ＴＲＢ１Ｂ１は、ＴＲＢＣ２ ＴＣＲを内因的に発現するＨＰＢ－ＡＬＬ細胞株に対する有意な結合を示さなかった。
【図17】 ＴＲＢＣ１定常ドメイン（ＴＲＢ１Ｗ１６）を含む組換えＴＣＲに対する抗ＴＲＢＣ１（ＪＯＶＩ－１ ｍＩｇＧ２ａ、ＴＲＢ１Ｂ１）の選択的タンパク質結合を示す。ＴＲＢ１Ｂ１は、ＴＲＢＣ２定常ドメイン（ＴＲＢ２Ｗ１６）を用いた組換えＴＣＲに対する有意な結合を示さなかった。
【図18】 健康なドナーからＪＯＶＩ－１×Ｖｇ９二重特異性（ＴＲＢ１Ｂ５０）の細胞傷害試験に使用されるＶγ９＋細胞の表現型を示す。
【図19】 抗ＴＲＧＶ９／抗ＴＲＢＣ１二重特異性抗体が、インビトロでのＴＲＢＣ１発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するγδ Ｔ細胞の細胞傷害を媒介することを示す。ここで表される細胞傷害値は、二重特異性抗体の非存在下で観察された基礎細胞傷害値を引いたものである。ＥＣ５０値を、方法で記載されるように計算した。本明細書に示される代表的なデータは、単一の実験からのものである。
【図20】 二重特異性抗体媒介性細胞傷害を示す。様々なドナーからの増大し、かつ濃縮したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を使用して、示される濃度で、Ｖγ９ｘＪｏｖｉの存在下において、細胞傷害をＪｕｒｋａｔ細胞株に誘導した（Ｅ：Ｔ比１：１）。アッセイを１６時間行った。様々な条件についての死標的細胞パーセントが図面に示される。
【図21】 抗ＴＲＧＶ９／抗ＢＣＭＡ二重特異性抗体（ＢＣＶ９Ｂ１０６（Ｂ３））が、γδ Ｔ細胞に結合し（左パネル）、インビトロでのＢＣＭＡ発現Ｈ９２９細胞に対するγδ Ｔ細胞の細胞傷害を媒介する（右パネル）ことを示す。ＥＣ５０値を、方法で記載されるように計算した。本明細書に示される代表的なデータは、単一の実験からのものである。
【図22】 抗ＴＲＧＶ９／抗ＢＣＭＡ二重特異性抗体（ＨＣ１：ＶＧ９Ｂ４２０－ＬＨ－ｓｃＦｖ；ＨＣ２：ＢＣＭＡ－Ｆａｂ（ＢＣＭＢ５１９－Ｆａｂ）（ＢＣＶ９Ｂ７１．００１））が、γδ Ｔ細胞に結合し（左パネル）、インビトロでのＢＣＭＡ発現Ｈ９２９細胞に対するγδ Ｔ細胞の細胞傷害を媒介する（右パネル）ことを示す。ＥＣ５０値を、方法で記載されるように計算した。本明細書に示される代表的なデータは、単一の実験からのものである。
【図23】 抗ＴＲＧＶ９／抗ＢＣＭＡ二重特異性抗体（ＶＧ９ＳＢ１０ＳＣ１０８７＿Ｐ１８＿Ｄ０８－Ｆａｂ ＲＦ、ＢＣＭＡ－ｓｃＦｖ（ＢＣＭＢ５１９－ｓｃＦｖ）（ＢＣＶ９Ｂ１００．００１））が、γδ Ｔ細胞に結合し（左パネル）、インビトロでのＢＣＭＡ発現Ｈ９２９細胞に対するγδ Ｔ細胞の細胞傷害を媒介する（右パネル）ことを示す。ＥＣ５０値を、方法で記載されるように計算した。本明細書に示される代表的なデータは、単一の実験からのものである。
【図24】 抗ＴＲＧＶ９／抗ＢＣＭＡ二重特異性抗体（ＶＧ９ＳＢ１０ＳＣ１０８７＿Ｐ１８＿Ｃ１２－Ｆａｂ ＲＦ、ＢＣＭＡ－ｓｃＦｖ（ＢＣＭＢ５１９－ｓｃＦｖ）（ＢＣＶ９Ｂ１０１．００１））が、γδ Ｔ細胞に結合し（左パネル）、インビトロでのＢＣＭＡ発現Ｈ９２９細胞に対するγδ Ｔ細胞の細胞傷害を媒介する（右パネル）ことを示す。ＥＣ５０値を、方法で記載されるように計算した。本明細書に示される代表的なデータは、単一の実験からのものである。
【図25】 抗ＴＲＧＶ９／抗ＢＣＭＡ二重特異性抗体（ＶＧ９ＳＢ１０ＳＣ１０８７＿Ｐ１９＿Ｃ０３－Ｆａｂ ＲＦ、ＢＣＭＡ－ｓｃＦｖ（ＢＣＭＢ５１９－ｓｃＦｖ）（ＢＣＶ９Ｂ１０３．００１））が、γδ Ｔ細胞に結合し（左パネル）、インビトロでのＢＣＭＡ発現Ｈ９２９細胞に対するγδ Ｔ細胞の細胞傷害を媒介する（右パネル）ことを示す。ＥＣ５０値を、方法で記載されるように計算した。本明細書に示される代表的なデータは、単一の実験からのものである。
【図26】 マウス抗Ｖγ９抗体のヒト化を示す。Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｂｓ．２０１５．７：７７８－７９１によって概説されるプロセスに従って、マウスクローン７Ａ５のヒト化を実施した。配列相同性に基づいて、生殖系列ＩＧＨＶ１－８＊０１及びＩＧＫＶ４－１＊０１をフレームワーク適応のために選択した。潜在的なイソ－Ａｓｐ異性化部位（ＤＧモチーフ）も設計に含まれた。
【図27A】 エピトープ及びパラトープマッピングを示す。図２７Ａは、ヒトＦｃに融合したマウス抗ヒトＴＣＲＶγ９［クローン７Ａ５］ｍＡｂ及びＶγ９／Ｖδ２のＨＸ－ＭＳエピトープマッピングを示す。ＶＧ９の配列（配列番号７８９（配列番号１５６のアミノ酸２０～２６１））及びＶＤ２（配列番号７９０（配列番号１５７のアミノ酸２０～２４８））を下部に示す。配列番号７８９のアミノ酸４９～６８（Ｌ４９ＶＳＩＳＹＤＧＴＶＲＫＥＳＧＩＰＳＧＫ６８（配列番号７７４）（イタリック体））を含むペプチド領域を、ｍＡｂ ７Ａ５によって保護した。ＴＣＲ Ｖγ９－Ｖδ２の分子モデル（結晶構造ＰＢＤ：１ＨＸＭを使用、Ａｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００１．４１１：８２０－８２４を参照）及びエピトープ中の残基が球体表現で強調表示されている。図２７Ｂは、マウスクローン７Ａ５（Ｖｇ９＿７Ａ５＿ＶＨ配列番号７、Ｖｇ９＿７Ａ５＿ＶＬ配列番号８）におけるＨＤＸパラトープマッピングを示す。パラトープ中の残基を有するＦａｂの分子モデルが強調表示されている。
【図27B】 エピトープ及びパラトープマッピングを示す。図２７Ａは、ヒトＦｃに融合したマウス抗ヒトＴＣＲＶγ９［クローン７Ａ５］ｍＡｂ及びＶγ９／Ｖδ２のＨＸ－ＭＳエピトープマッピングを示す。ＶＧ９の配列（配列番号７８９（配列番号１５６のアミノ酸２０～２６１））及びＶＤ２（配列番号７９０（配列番号１５７のアミノ酸２０～２４８））を下部に示す。配列番号７８９のアミノ酸４９～６８（Ｌ４９ＶＳＩＳＹＤＧＴＶＲＫＥＳＧＩＰＳＧＫ６８（配列番号７７４）（イタリック体））を含むペプチド領域を、ｍＡｂ ７Ａ５によって保護した。ＴＣＲ Ｖγ９－Ｖδ２の分子モデル（結晶構造ＰＢＤ：１ＨＸＭを使用、Ａｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００１．４１１：８２０－８２４を参照）及びエピトープ中の残基が球体表現で強調表示されている。図２７Ｂは、マウスクローン７Ａ５（Ｖｇ９＿７Ａ５＿ＶＨ配列番号７、Ｖｇ９＿７Ａ５＿ＶＬ配列番号８）におけるＨＤＸパラトープマッピングを示す。パラトープ中の残基を有するＦａｂの分子モデルが強調表示されている。
【図28A】 健康な個体が、全ＰＢＭＣ中に広範囲のＶγ９＋γδ Ｔ細胞を含むことを示す。図２８Ａは、全ＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞（ＴＣＲＶγ９＋ＣＤ３＋）細胞の頻度を示す。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を表す。図２８Ｂは、健康な個体の全ＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を要約する散布ドットプロットグラフを示す。各ドットは、健康な個体からのデータを表す。
【図28B】 健康な個体が、全ＰＢＭＣ中に広範囲のＶγ９＋γδ Ｔ細胞を含むことを示す。図２８Ａは、全ＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞（ＴＣＲＶγ９＋ＣＤ３＋）細胞の頻度を示す。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を表す。図２８Ｂは、健康な個体の全ＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を要約する散布ドットプロットグラフを示す。各ドットは、健康な個体からのデータを表す。
【図29A】 Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞の特性評価を示す。図２９Ａの左側及び中央のパネルは、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞を選択的に活性化及び増大させるゾレドロン酸を含有する培養物の０日目及び１４日目の全ＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度を要約するグラフを示す。図２９Ａの右側のパネルは、６個の独立した実験からのｎ＝１５人のドナーの代表的なデータをグラフに示す。活性化の０日目及び１４日目における総ＣＤ３＋Ｔ細胞の中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の割合で、各ドットがドナーからのデータを表す。図２９Ｂの左の２つのパネルは、代表的なＦＡＣＳプロットの数字がゾレドロン酸を含有する培養物の０日目及び１４日目のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の分化プロファイルを示すことを示す。図２９Ｂの右の２つのパネルは、ゾレドロン酸を含有する培養物の０日目及び１４日目における、ナイーブ（ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー（ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ－）、エフェクターメモリー（ＣＤ２７－ＣＤ４５ＲＡ－）、及びＣＤ４５ＲＡ（ＥＭＲＡ、ＣＤ２７－ＣＤ４５ＲＡ＋）表現型を再発現するエフェクターメモリー細胞について陽性のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度を要約する散布図グラフを示す。各ドットは、健康なドナーからのデータを表す。４つの独立した実験からのｎ＝１３人のドナーの代表的なデータをプロットに示す。図２９Ｃは、グランザイムＢ及びパーフォリンの細胞内発現が陽性の０日目（上の行）及び１４日目（下の行）におけるＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を示す代表的なＦＡＣＳプロットの数を示す。グランザイムＢ及びパーフォリンの細胞内発現についての、新鮮なＶγ９＋γδ Ｔ細胞（０日目）からのｎ＝１２人及びｎ＝７人のドナーのデータ、並びに活性化したＶγ９＋γδ Ｔ細胞（１４日目）からのｎ＝１４人及びｎ＝９人のドナーのデータが図に示されている。
【図29B】 Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞の特性評価を示す。図２９Ａの左側及び中央のパネルは、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞を選択的に活性化及び増大させるゾレドロン酸を含有する培養物の０日目及び１４日目の全ＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度を要約するグラフを示す。図２９Ａの右側のパネルは、６個の独立した実験からのｎ＝１５人のドナーの代表的なデータをグラフに示す。活性化の０日目及び１４日目における総ＣＤ３＋Ｔ細胞の中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の割合で、各ドットがドナーからのデータを表す。図２９Ｂの左の２つのパネルは、代表的なＦＡＣＳプロットの数字がゾレドロン酸を含有する培養物の０日目及び１４日目のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の分化プロファイルを示すことを示す。図２９Ｂの右の２つのパネルは、ゾレドロン酸を含有する培養物の０日目及び１４日目における、ナイーブ（ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー（ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ－）、エフェクターメモリー（ＣＤ２７－ＣＤ４５ＲＡ－）、及びＣＤ４５ＲＡ（ＥＭＲＡ、ＣＤ２７－ＣＤ４５ＲＡ＋）表現型を再発現するエフェクターメモリー細胞について陽性のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度を要約する散布図グラフを示す。各ドットは、健康なドナーからのデータを表す。４つの独立した実験からのｎ＝１３人のドナーの代表的なデータをプロットに示す。図２９Ｃは、グランザイムＢ及びパーフォリンの細胞内発現が陽性の０日目（上の行）及び１４日目（下の行）におけるＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を示す代表的なＦＡＣＳプロットの数を示す。グランザイムＢ及びパーフォリンの細胞内発現についての、新鮮なＶγ９＋γδ Ｔ細胞（０日目）からのｎ＝１２人及びｎ＝７人のドナーのデータ、並びに活性化したＶγ９＋γδ Ｔ細胞（１４日目）からのｎ＝１４人及びｎ＝９人のドナーのデータが図に示されている。
【図29C】 Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞の特性評価を示す。図２９Ａの左側及び中央のパネルは、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞を選択的に活性化及び増大させるゾレドロン酸を含有する培養物の０日目及び１４日目の全ＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度を要約するグラフを示す。図２９Ａの右側のパネルは、６個の独立した実験からのｎ＝１５人のドナーの代表的なデータをグラフに示す。活性化の０日目及び１４日目における総ＣＤ３＋Ｔ細胞の中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の割合で、各ドットがドナーからのデータを表す。図２９Ｂの左の２つのパネルは、代表的なＦＡＣＳプロットの数字がゾレドロン酸を含有する培養物の０日目及び１４日目のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の分化プロファイルを示すことを示す。図２９Ｂの右の２つのパネルは、ゾレドロン酸を含有する培養物の０日目及び１４日目における、ナイーブ（ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー（ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ－）、エフェクターメモリー（ＣＤ２７－ＣＤ４５ＲＡ－）、及びＣＤ４５ＲＡ（ＥＭＲＡ、ＣＤ２７－ＣＤ４５ＲＡ＋）表現型を再発現するエフェクターメモリー細胞について陽性のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度を要約する散布図グラフを示す。各ドットは、健康なドナーからのデータを表す。４つの独立した実験からのｎ＝１３人のドナーの代表的なデータをプロットに示す。図２９Ｃは、グランザイムＢ及びパーフォリンの細胞内発現が陽性の０日目（上の行）及び１４日目（下の行）におけるＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を示す代表的なＦＡＣＳプロットの数を示す。グランザイムＢ及びパーフォリンの細胞内発現についての、新鮮なＶγ９＋γδ Ｔ細胞（０日目）からのｎ＝１２人及びｎ＝７人のドナーのデータ、並びに活性化したＶγ９＋γδ Ｔ細胞（１４日目）からのｎ＝１４人及びｎ＝９人のドナーのデータが図に示されている。
【図30A】 抗ＴＲＧＶ９／抗ＣＤ１２３二重特異性抗体が、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞及びＣＤ１２３発現腫瘍細胞に結合することを示す。１４日目のゾレドロン酸で活性化及び増大したＣＤ１２３発現標的細胞及びＰＢＭＣを、示されたＶγ９二重特異性及びＮＵＬＬアーム対照二重特異性抗体の存在下又は非存在下でインキュベートした。結合した二重特異性抗体染色をフローサイトメトリーによって評価した。図３０Ａは、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞株についての３つの独立した実験におけるＶγ９二重特異性結合Ｋａｓｕｍｉ－３細胞の頻度を示す。グラフに示されているＥＣ５０値は、３つの独立した実験の平均を指す。図３０Ｂは、８人の健康なドナーを用いた２回の独立した実験における様々な濃度でのＶγ９＋γδ Ｔ細胞を示す。グラフに示されているＥＣ５０値は、２人の健康なドナーを指す。右及び左の線は、示されたＶγ９二重特異性抗体及びその対応するＶγ９ ＮＵＬＬアーム二重特異性対照抗体をそれぞれ反映する。グラフに示されるＥＣ５０値は、ｘ軸上の示された二重特異性抗体の濃度（対数スケール）及びｙ軸上の特異的結合（線形スケール）で４パラメータ用量応答曲線を使用して導出された。図３０Ｃは、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞が、全ＰＢＭＣ中のＰａｎ－Ｔ細胞からＦＡＣＳ選別により除去されたことを示す。総Ｐａｎ－Ｔ細胞及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したＰａｎ－Ｔ細胞を、様々な濃度で示された二重特異性抗体の存在下及び非存在下でインキュベートした。代表的なＦＡＣＳプロットは、Ｐａｎ－Ｔ細胞の中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の除去効果を示す。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を表す。示された濃度でのＰａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９未除去Ｐａｎ－Ｔ細胞）及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９除去Ｐａｎ－Ｔ細胞）に対する、Ｖγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体の結合が示される。図３０Ｄは、ＣＤ１２３発現Ｋａｓｕｍｉ－３及び非発現２２Ｒｖ１細胞株が抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体で染色されたことを示す。オーバーレイした代表的なヒストグラムは、Ｋａｓｕｍｉ－３（左）及び２２Ｒｖ１（右）細胞株（上部パネル）に対するＣＤ１２３、アイソタイプ対照、及びＦＭＯ対照の染色を示す。下部では、代表的なグラフは、示された濃度でのＫａｓｕｍｉ－３（左）細胞株に対するＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体の結合を示す。グラフに示されるＥＣ５０値は、ｘ軸上の示された二重特異性抗体の濃度（対数スケール）及びｙ軸上の特異的結合（線形スケール）で４パラメータ用量応答曲線を使用して導出された。
【図30B】 抗ＴＲＧＶ９／抗ＣＤ１２３二重特異性抗体が、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞及びＣＤ１２３発現腫瘍細胞に結合することを示す。１４日目のゾレドロン酸で活性化及び増大したＣＤ１２３発現標的細胞及びＰＢＭＣを、示されたＶγ９二重特異性及びＮＵＬＬアーム対照二重特異性抗体の存在下又は非存在下でインキュベートした。結合した二重特異性抗体染色をフローサイトメトリーによって評価した。図３０Ａは、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞株についての３つの独立した実験におけるＶγ９二重特異性結合Ｋａｓｕｍｉ－３細胞の頻度を示す。グラフに示されているＥＣ５０値は、３つの独立した実験の平均を指す。図３０Ｂは、８人の健康なドナーを用いた２回の独立した実験における様々な濃度でのＶγ９＋γδ Ｔ細胞を示す。グラフに示されているＥＣ５０値は、２人の健康なドナーを指す。右及び左の線は、示されたＶγ９二重特異性抗体及びその対応するＶγ９ ＮＵＬＬアーム二重特異性対照抗体をそれぞれ反映する。グラフに示されるＥＣ５０値は、ｘ軸上の示された二重特異性抗体の濃度（対数スケール）及びｙ軸上の特異的結合（線形スケール）で４パラメータ用量応答曲線を使用して導出された。図３０Ｃは、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞が、全ＰＢＭＣ中のＰａｎ－Ｔ細胞からＦＡＣＳ選別により除去されたことを示す。総Ｐａｎ－Ｔ細胞及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したＰａｎ－Ｔ細胞を、様々な濃度で示された二重特異性抗体の存在下及び非存在下でインキュベートした。代表的なＦＡＣＳプロットは、Ｐａｎ－Ｔ細胞の中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の除去効果を示す。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を表す。示された濃度でのＰａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９未除去Ｐａｎ－Ｔ細胞）及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９除去Ｐａｎ－Ｔ細胞）に対する、Ｖγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体の結合が示される。図３０Ｄは、ＣＤ１２３発現Ｋａｓｕｍｉ－３及び非発現２２Ｒｖ１細胞株が抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体で染色されたことを示す。オーバーレイした代表的なヒストグラムは、Ｋａｓｕｍｉ－３（左）及び２２Ｒｖ１（右）細胞株（上部パネル）に対するＣＤ１２３、アイソタイプ対照、及びＦＭＯ対照の染色を示す。下部では、代表的なグラフは、示された濃度でのＫａｓｕｍｉ－３（左）細胞株に対するＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体の結合を示す。グラフに示されるＥＣ５０値は、ｘ軸上の示された二重特異性抗体の濃度（対数スケール）及びｙ軸上の特異的結合（線形スケール）で４パラメータ用量応答曲線を使用して導出された。
【図30C】 抗ＴＲＧＶ９／抗ＣＤ１２３二重特異性抗体が、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞及びＣＤ１２３発現腫瘍細胞に結合することを示す。１４日目のゾレドロン酸で活性化及び増大したＣＤ１２３発現標的細胞及びＰＢＭＣを、示されたＶγ９二重特異性及びＮＵＬＬアーム対照二重特異性抗体の存在下又は非存在下でインキュベートした。結合した二重特異性抗体染色をフローサイトメトリーによって評価した。図３０Ａは、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞株についての３つの独立した実験におけるＶγ９二重特異性結合Ｋａｓｕｍｉ－３細胞の頻度を示す。グラフに示されているＥＣ５０値は、３つの独立した実験の平均を指す。図３０Ｂは、８人の健康なドナーを用いた２回の独立した実験における様々な濃度でのＶγ９＋γδ Ｔ細胞を示す。グラフに示されているＥＣ５０値は、２人の健康なドナーを指す。右及び左の線は、示されたＶγ９二重特異性抗体及びその対応するＶγ９ ＮＵＬＬアーム二重特異性対照抗体をそれぞれ反映する。グラフに示されるＥＣ５０値は、ｘ軸上の示された二重特異性抗体の濃度（対数スケール）及びｙ軸上の特異的結合（線形スケール）で４パラメータ用量応答曲線を使用して導出された。図３０Ｃは、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞が、全ＰＢＭＣ中のＰａｎ－Ｔ細胞からＦＡＣＳ選別により除去されたことを示す。総Ｐａｎ－Ｔ細胞及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したＰａｎ－Ｔ細胞を、様々な濃度で示された二重特異性抗体の存在下及び非存在下でインキュベートした。代表的なＦＡＣＳプロットは、Ｐａｎ－Ｔ細胞の中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の除去効果を示す。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を表す。示された濃度でのＰａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９未除去Ｐａｎ－Ｔ細胞）及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９除去Ｐａｎ－Ｔ細胞）に対する、Ｖγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体の結合が示される。図３０Ｄは、ＣＤ１２３発現Ｋａｓｕｍｉ－３及び非発現２２Ｒｖ１細胞株が抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体で染色されたことを示す。オーバーレイした代表的なヒストグラムは、Ｋａｓｕｍｉ－３（左）及び２２Ｒｖ１（右）細胞株（上部パネル）に対するＣＤ１２３、アイソタイプ対照、及びＦＭＯ対照の染色を示す。下部では、代表的なグラフは、示された濃度でのＫａｓｕｍｉ－３（左）細胞株に対するＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体の結合を示す。グラフに示されるＥＣ５０値は、ｘ軸上の示された二重特異性抗体の濃度（対数スケール）及びｙ軸上の特異的結合（線形スケール）で４パラメータ用量応答曲線を使用して導出された。
【図30D】 抗ＴＲＧＶ９／抗ＣＤ１２３二重特異性抗体が、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞及びＣＤ１２３発現腫瘍細胞に結合することを示す。１４日目のゾレドロン酸で活性化及び増大したＣＤ１２３発現標的細胞及びＰＢＭＣを、示されたＶγ９二重特異性及びＮＵＬＬアーム対照二重特異性抗体の存在下又は非存在下でインキュベートした。結合した二重特異性抗体染色をフローサイトメトリーによって評価した。図３０Ａは、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞株についての３つの独立した実験におけるＶγ９二重特異性結合Ｋａｓｕｍｉ－３細胞の頻度を示す。グラフに示されているＥＣ５０値は、３つの独立した実験の平均を指す。図３０Ｂは、８人の健康なドナーを用いた２回の独立した実験における様々な濃度でのＶγ９＋γδ Ｔ細胞を示す。グラフに示されているＥＣ５０値は、２人の健康なドナーを指す。右及び左の線は、示されたＶγ９二重特異性抗体及びその対応するＶγ９ ＮＵＬＬアーム二重特異性対照抗体をそれぞれ反映する。グラフに示されるＥＣ５０値は、ｘ軸上の示された二重特異性抗体の濃度（対数スケール）及びｙ軸上の特異的結合（線形スケール）で４パラメータ用量応答曲線を使用して導出された。図３０Ｃは、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞が、全ＰＢＭＣ中のＰａｎ－Ｔ細胞からＦＡＣＳ選別により除去されたことを示す。総Ｐａｎ－Ｔ細胞及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したＰａｎ－Ｔ細胞を、様々な濃度で示された二重特異性抗体の存在下及び非存在下でインキュベートした。代表的なＦＡＣＳプロットは、Ｐａｎ－Ｔ細胞の中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の除去効果を示す。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を表す。示された濃度でのＰａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９未除去Ｐａｎ－Ｔ細胞）及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９除去Ｐａｎ－Ｔ細胞）に対する、Ｖγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体の結合が示される。図３０Ｄは、ＣＤ１２３発現Ｋａｓｕｍｉ－３及び非発現２２Ｒｖ１細胞株が抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体で染色されたことを示す。オーバーレイした代表的なヒストグラムは、Ｋａｓｕｍｉ－３（左）及び２２Ｒｖ１（右）細胞株（上部パネル）に対するＣＤ１２３、アイソタイプ対照、及びＦＭＯ対照の染色を示す。下部では、代表的なグラフは、示された濃度でのＫａｓｕｍｉ－３（左）細胞株に対するＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体の結合を示す。グラフに示されるＥＣ５０値は、ｘ軸上の示された二重特異性抗体の濃度（対数スケール）及びｙ軸上の特異的結合（線形スケール）で４パラメータ用量応答曲線を使用して導出された。
【図31A】 Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性抗体が選択的に動員し、活性化し、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞によって媒介される細胞傷害を誘導することを示す。図３１Ａは、１μｇ／ｍＬの示された二重特異性抗体の存在下で、３７℃で１時間、１：１のＥＴ比で細胞トレースの黄色に標識付けされたｋａｓｕｍｉ－３細胞と共培養された細胞トレースの標識付けされた濃縮γδ Ｔ細胞を示す。細胞間の結合を、フローサイトメトリーを使用して決定し、ＦＡＣＳプロットの右上象限の細胞を二重陽性として定量化した。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を示す。図３１Ｂ及び図３１Ｃは、示された二重特異性抗体の存在下又は非存在下で、３７℃で７２時間、１：１のＥＴ比でＫａｓｕｍｉ－３細胞（標的）と共培養された新鮮なＰＢＭＣからのＰａｎＴ細胞（エフェクター）を示す。ＣＤ６９（左）、ＣＤ２５（右）表面発現、及び細胞内グランザイムＢ発現について陽性であったＶγ９＋γδ Ｔ細胞、Ｖγ９－γδ Ｔ細胞、及び非γδ Ｔ細胞を示す。図３１Ｄは、ＣＤ１２３細胞に対するＶγ９／ＣＤ１２３二重特異性媒介性γδ Ｔ細胞の細胞傷害を示す。（エフェクター）の１４のゾレドロン酸で培養されたＰＢＭＣを、１６時間にわたって、示された濃度のＶγ９二重特異性及びＶγ９ＮＵＬＬアーム対照抗体の存在下で、（増大させたＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞頻度に対してＥＴ比を正規化することにより）ＥＴ比１：１でＣＦＳＥ標識標的（Ｋａｓｕｍｉ－３）細胞と共培養した。標的細胞溶解を、７－ＡＡＤ染色及びフローサイトメトリーによって判定した。グラフは、Ｖγ９二重特異性抗体及びそれぞれのＶγ９／ＮＵＬＬアーム対照の示された濃度における特異的標的細胞溶解の頻度を表す。代表的なグラフに示されるＥＣ５０値は、３回の独立した実験からのＶγ９／ＣＤ１２３についての８人の健康なドナーの平均である。図３１Ｅは、Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性が、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞に対するＡＭＬγδ Ｔ細胞の細胞傷害を効果的に媒介することを示す。代表的なグラフにおける上部及び下部ラインは、１４日目のＺｏｌＡＭＬ患者ＰＢＭＣと標的細胞との１６時間の共培養に際し、それぞれＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／Ｎｕｌｌ二重特異性抗体によって媒介される標的（ｋａｓｕｍｉ－３）細胞溶解の頻度（％７－ＡＡＤ＋細胞）を示す。図３１Ｆは、ｐａｎ－Ｔ細胞の中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の除去効果を示す。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を表す。グラフは、ｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９非除去）及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９除去）と標的（Ｋａｓｕｍｉ－３）細胞との共培養に際し、それぞれ示された濃度でのＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体によって媒介される標的細胞溶解の頻度（％７－ＡＡＤ＋細胞）を示す（中央グラフ）。下のグラフは、それぞれ、示された濃度でＣＤ３／ＣＤ１２３及びＣＤ３／ＮＵＬＬ二重特異性抗体によって媒介される標的細胞溶解を示す。
【図31B】 Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性抗体が選択的に動員し、活性化し、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞によって媒介される細胞傷害を誘導することを示す。図３１Ａは、１μｇ／ｍＬの示された二重特異性抗体の存在下で、３７℃で１時間、１：１のＥＴ比で細胞トレースの黄色に標識付けされたｋａｓｕｍｉ－３細胞と共培養された細胞トレースの標識付けされた濃縮γδ Ｔ細胞を示す。細胞間の結合を、フローサイトメトリーを使用して決定し、ＦＡＣＳプロットの右上象限の細胞を二重陽性として定量化した。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を示す。図３１Ｂ及び図３１Ｃは、示された二重特異性抗体の存在下又は非存在下で、３７℃で７２時間、１：１のＥＴ比でＫａｓｕｍｉ－３細胞（標的）と共培養された新鮮なＰＢＭＣからのＰａｎＴ細胞（エフェクター）を示す。ＣＤ６９（左）、ＣＤ２５（右）表面発現、及び細胞内グランザイムＢ発現について陽性であったＶγ９＋γδ Ｔ細胞、Ｖγ９－γδ Ｔ細胞、及び非γδ Ｔ細胞を示す。図３１Ｄは、ＣＤ１２３細胞に対するＶγ９／ＣＤ１２３二重特異性媒介性γδ Ｔ細胞の細胞傷害を示す。（エフェクター）の１４のゾレドロン酸で培養されたＰＢＭＣを、１６時間にわたって、示された濃度のＶγ９二重特異性及びＶγ９ＮＵＬＬアーム対照抗体の存在下で、（増大させたＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞頻度に対してＥＴ比を正規化することにより）ＥＴ比１：１でＣＦＳＥ標識標的（Ｋａｓｕｍｉ－３）細胞と共培養した。標的細胞溶解を、７－ＡＡＤ染色及びフローサイトメトリーによって判定した。グラフは、Ｖγ９二重特異性抗体及びそれぞれのＶγ９／ＮＵＬＬアーム対照の示された濃度における特異的標的細胞溶解の頻度を表す。代表的なグラフに示されるＥＣ５０値は、３回の独立した実験からのＶγ９／ＣＤ１２３についての８人の健康なドナーの平均である。図３１Ｅは、Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性が、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞に対するＡＭＬγδ Ｔ細胞の細胞傷害を効果的に媒介することを示す。代表的なグラフにおける上部及び下部ラインは、１４日目のＺｏｌＡＭＬ患者ＰＢＭＣと標的細胞との１６時間の共培養に際し、それぞれＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／Ｎｕｌｌ二重特異性抗体によって媒介される標的（ｋａｓｕｍｉ－３）細胞溶解の頻度（％７－ＡＡＤ＋細胞）を示す。図３１Ｆは、ｐａｎ－Ｔ細胞の中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の除去効果を示す。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を表す。グラフは、ｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９非除去）及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９除去）と標的（Ｋａｓｕｍｉ－３）細胞との共培養に際し、それぞれ示された濃度でのＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体によって媒介される標的細胞溶解の頻度（％７－ＡＡＤ＋細胞）を示す（中央グラフ）。下のグラフは、それぞれ、示された濃度でＣＤ３／ＣＤ１２３及びＣＤ３／ＮＵＬＬ二重特異性抗体によって媒介される標的細胞溶解を示す。
【図31C】 Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性抗体が選択的に動員し、活性化し、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞によって媒介される細胞傷害を誘導することを示す。図３１Ａは、１μｇ／ｍＬの示された二重特異性抗体の存在下で、３７℃で１時間、１：１のＥＴ比で細胞トレースの黄色に標識付けされたｋａｓｕｍｉ－３細胞と共培養された細胞トレースの標識付けされた濃縮γδ Ｔ細胞を示す。細胞間の結合を、フローサイトメトリーを使用して決定し、ＦＡＣＳプロットの右上象限の細胞を二重陽性として定量化した。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を示す。図３１Ｂ及び図３１Ｃは、示された二重特異性抗体の存在下又は非存在下で、３７℃で７２時間、１：１のＥＴ比でＫａｓｕｍｉ－３細胞（標的）と共培養された新鮮なＰＢＭＣからのＰａｎＴ細胞（エフェクター）を示す。ＣＤ６９（左）、ＣＤ２５（右）表面発現、及び細胞内グランザイムＢ発現について陽性であったＶγ９＋γδ Ｔ細胞、Ｖγ９－γδ Ｔ細胞、及び非γδ Ｔ細胞を示す。図３１Ｄは、ＣＤ１２３細胞に対するＶγ９／ＣＤ１２３二重特異性媒介性γδ Ｔ細胞の細胞傷害を示す。（エフェクター）の１４のゾレドロン酸で培養されたＰＢＭＣを、１６時間にわたって、示された濃度のＶγ９二重特異性及びＶγ９ＮＵＬＬアーム対照抗体の存在下で、（増大させたＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞頻度に対してＥＴ比を正規化することにより）ＥＴ比１：１でＣＦＳＥ標識標的（Ｋａｓｕｍｉ－３）細胞と共培養した。標的細胞溶解を、７－ＡＡＤ染色及びフローサイトメトリーによって判定した。グラフは、Ｖγ９二重特異性抗体及びそれぞれのＶγ９／ＮＵＬＬアーム対照の示された濃度における特異的標的細胞溶解の頻度を表す。代表的なグラフに示されるＥＣ５０値は、３回の独立した実験からのＶγ９／ＣＤ１２３についての８人の健康なドナーの平均である。図３１Ｅは、Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性が、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞に対するＡＭＬγδ Ｔ細胞の細胞傷害を効果的に媒介することを示す。代表的なグラフにおける上部及び下部ラインは、１４日目のＺｏｌＡＭＬ患者ＰＢＭＣと標的細胞との１６時間の共培養に際し、それぞれＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／Ｎｕｌｌ二重特異性抗体によって媒介される標的（ｋａｓｕｍｉ－３）細胞溶解の頻度（％７－ＡＡＤ＋細胞）を示す。図３１Ｆは、ｐａｎ－Ｔ細胞の中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の除去効果を示す。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を表す。グラフは、ｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９非除去）及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９除去）と標的（Ｋａｓｕｍｉ－３）細胞との共培養に際し、それぞれ示された濃度でのＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体によって媒介される標的細胞溶解の頻度（％７－ＡＡＤ＋細胞）を示す（中央グラフ）。下のグラフは、それぞれ、示された濃度でＣＤ３／ＣＤ１２３及びＣＤ３／ＮＵＬＬ二重特異性抗体によって媒介される標的細胞溶解を示す。
【図31D】 Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性抗体が選択的に動員し、活性化し、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞によって媒介される細胞傷害を誘導することを示す。図３１Ａは、１μｇ／ｍＬの示された二重特異性抗体の存在下で、３７℃で１時間、１：１のＥＴ比で細胞トレースの黄色に標識付けされたｋａｓｕｍｉ－３細胞と共培養された細胞トレースの標識付けされた濃縮γδ Ｔ細胞を示す。細胞間の結合を、フローサイトメトリーを使用して決定し、ＦＡＣＳプロットの右上象限の細胞を二重陽性として定量化した。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を示す。図３１Ｂ及び図３１Ｃは、示された二重特異性抗体の存在下又は非存在下で、３７℃で７２時間、１：１のＥＴ比でＫａｓｕｍｉ－３細胞（標的）と共培養された新鮮なＰＢＭＣからのＰａｎＴ細胞（エフェクター）を示す。ＣＤ６９（左）、ＣＤ２５（右）表面発現、及び細胞内グランザイムＢ発現について陽性であったＶγ９＋γδ Ｔ細胞、Ｖγ９－γδ Ｔ細胞、及び非γδ Ｔ細胞を示す。図３１Ｄは、ＣＤ１２３細胞に対するＶγ９／ＣＤ１２３二重特異性媒介性γδ Ｔ細胞の細胞傷害を示す。（エフェクター）の１４のゾレドロン酸で培養されたＰＢＭＣを、１６時間にわたって、示された濃度のＶγ９二重特異性及びＶγ９ＮＵＬＬアーム対照抗体の存在下で、（増大させたＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞頻度に対してＥＴ比を正規化することにより）ＥＴ比１：１でＣＦＳＥ標識標的（Ｋａｓｕｍｉ－３）細胞と共培養した。標的細胞溶解を、７－ＡＡＤ染色及びフローサイトメトリーによって判定した。グラフは、Ｖγ９二重特異性抗体及びそれぞれのＶγ９／ＮＵＬＬアーム対照の示された濃度における特異的標的細胞溶解の頻度を表す。代表的なグラフに示されるＥＣ５０値は、３回の独立した実験からのＶγ９／ＣＤ１２３についての８人の健康なドナーの平均である。図３１Ｅは、Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性が、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞に対するＡＭＬγδ Ｔ細胞の細胞傷害を効果的に媒介することを示す。代表的なグラフにおける上部及び下部ラインは、１４日目のＺｏｌＡＭＬ患者ＰＢＭＣと標的細胞との１６時間の共培養に際し、それぞれＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／Ｎｕｌｌ二重特異性抗体によって媒介される標的（ｋａｓｕｍｉ－３）細胞溶解の頻度（％７－ＡＡＤ＋細胞）を示す。図３１Ｆは、ｐａｎ－Ｔ細胞の中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の除去効果を示す。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を表す。グラフは、ｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９非除去）及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９除去）と標的（Ｋａｓｕｍｉ－３）細胞との共培養に際し、それぞれ示された濃度でのＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体によって媒介される標的細胞溶解の頻度（％７－ＡＡＤ＋細胞）を示す（中央グラフ）。下のグラフは、それぞれ、示された濃度でＣＤ３／ＣＤ１２３及びＣＤ３／ＮＵＬＬ二重特異性抗体によって媒介される標的細胞溶解を示す。
【図31E】 Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性抗体が選択的に動員し、活性化し、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞によって媒介される細胞傷害を誘導することを示す。図３１Ａは、１μｇ／ｍＬの示された二重特異性抗体の存在下で、３７℃で１時間、１：１のＥＴ比で細胞トレースの黄色に標識付けされたｋａｓｕｍｉ－３細胞と共培養された細胞トレースの標識付けされた濃縮γδ Ｔ細胞を示す。細胞間の結合を、フローサイトメトリーを使用して決定し、ＦＡＣＳプロットの右上象限の細胞を二重陽性として定量化した。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を示す。図３１Ｂ及び図３１Ｃは、示された二重特異性抗体の存在下又は非存在下で、３７℃で７２時間、１：１のＥＴ比でＫａｓｕｍｉ－３細胞（標的）と共培養された新鮮なＰＢＭＣからのＰａｎＴ細胞（エフェクター）を示す。ＣＤ６９（左）、ＣＤ２５（右）表面発現、及び細胞内グランザイムＢ発現について陽性であったＶγ９＋γδ Ｔ細胞、Ｖγ９－γδ Ｔ細胞、及び非γδ Ｔ細胞を示す。図３１Ｄは、ＣＤ１２３細胞に対するＶγ９／ＣＤ１２３二重特異性媒介性γδ Ｔ細胞の細胞傷害を示す。（エフェクター）の１４のゾレドロン酸で培養されたＰＢＭＣを、１６時間にわたって、示された濃度のＶγ９二重特異性及びＶγ９ＮＵＬＬアーム対照抗体の存在下で、（増大させたＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞頻度に対してＥＴ比を正規化することにより）ＥＴ比１：１でＣＦＳＥ標識標的（Ｋａｓｕｍｉ－３）細胞と共培養した。標的細胞溶解を、７－ＡＡＤ染色及びフローサイトメトリーによって判定した。グラフは、Ｖγ９二重特異性抗体及びそれぞれのＶγ９／ＮＵＬＬアーム対照の示された濃度における特異的標的細胞溶解の頻度を表す。代表的なグラフに示されるＥＣ５０値は、３回の独立した実験からのＶγ９／ＣＤ１２３についての８人の健康なドナーの平均である。図３１Ｅは、Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性が、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞に対するＡＭＬγδ Ｔ細胞の細胞傷害を効果的に媒介することを示す。代表的なグラフにおける上部及び下部ラインは、１４日目のＺｏｌＡＭＬ患者ＰＢＭＣと標的細胞との１６時間の共培養に際し、それぞれＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／Ｎｕｌｌ二重特異性抗体によって媒介される標的（ｋａｓｕｍｉ－３）細胞溶解の頻度（％７－ＡＡＤ＋細胞）を示す。図３１Ｆは、ｐａｎ－Ｔ細胞の中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の除去効果を示す。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を表す。グラフは、ｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９非除去）及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９除去）と標的（Ｋａｓｕｍｉ－３）細胞との共培養に際し、それぞれ示された濃度でのＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体によって媒介される標的細胞溶解の頻度（％７－ＡＡＤ＋細胞）を示す（中央グラフ）。下のグラフは、それぞれ、示された濃度でＣＤ３／ＣＤ１２３及びＣＤ３／ＮＵＬＬ二重特異性抗体によって媒介される標的細胞溶解を示す。
【図31F】 Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性抗体が選択的に動員し、活性化し、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞によって媒介される細胞傷害を誘導することを示す。図３１Ａは、１μｇ／ｍＬの示された二重特異性抗体の存在下で、３７℃で１時間、１：１のＥＴ比で細胞トレースの黄色に標識付けされたｋａｓｕｍｉ－３細胞と共培養された細胞トレースの標識付けされた濃縮γδ Ｔ細胞を示す。細胞間の結合を、フローサイトメトリーを使用して決定し、ＦＡＣＳプロットの右上象限の細胞を二重陽性として定量化した。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を示す。図３１Ｂ及び図３１Ｃは、示された二重特異性抗体の存在下又は非存在下で、３７℃で７２時間、１：１のＥＴ比でＫａｓｕｍｉ－３細胞（標的）と共培養された新鮮なＰＢＭＣからのＰａｎＴ細胞（エフェクター）を示す。ＣＤ６９（左）、ＣＤ２５（右）表面発現、及び細胞内グランザイムＢ発現について陽性であったＶγ９＋γδ Ｔ細胞、Ｖγ９－γδ Ｔ細胞、及び非γδ Ｔ細胞を示す。図３１Ｄは、ＣＤ１２３細胞に対するＶγ９／ＣＤ１２３二重特異性媒介性γδ Ｔ細胞の細胞傷害を示す。（エフェクター）の１４のゾレドロン酸で培養されたＰＢＭＣを、１６時間にわたって、示された濃度のＶγ９二重特異性及びＶγ９ＮＵＬＬアーム対照抗体の存在下で、（増大させたＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞頻度に対してＥＴ比を正規化することにより）ＥＴ比１：１でＣＦＳＥ標識標的（Ｋａｓｕｍｉ－３）細胞と共培養した。標的細胞溶解を、７－ＡＡＤ染色及びフローサイトメトリーによって判定した。グラフは、Ｖγ９二重特異性抗体及びそれぞれのＶγ９／ＮＵＬＬアーム対照の示された濃度における特異的標的細胞溶解の頻度を表す。代表的なグラフに示されるＥＣ５０値は、３回の独立した実験からのＶγ９／ＣＤ１２３についての８人の健康なドナーの平均である。図３１Ｅは、Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性が、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞に対するＡＭＬγδ Ｔ細胞の細胞傷害を効果的に媒介することを示す。代表的なグラフにおける上部及び下部ラインは、１４日目のＺｏｌＡＭＬ患者ＰＢＭＣと標的細胞との１６時間の共培養に際し、それぞれＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／Ｎｕｌｌ二重特異性抗体によって媒介される標的（ｋａｓｕｍｉ－３）細胞溶解の頻度（％７－ＡＡＤ＋細胞）を示す。図３１Ｆは、ｐａｎ－Ｔ細胞の中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の除去効果を示す。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を表す。グラフは、ｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９非除去）及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９除去）と標的（Ｋａｓｕｍｉ－３）細胞との共培養に際し、それぞれ示された濃度でのＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体によって媒介される標的細胞溶解の頻度（％７－ＡＡＤ＋細胞）を示す（中央グラフ）。下のグラフは、それぞれ、示された濃度でＣＤ３／ＣＤ１２３及びＣＤ３／ＮＵＬＬ二重特異性抗体によって媒介される標的細胞溶解を示す。
【図32A】 Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性抗体が、全ＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の活性化、増殖及びエフェクター機能を強力に媒介することを示す。ＣＦＳＥ標識された全ＰＢＭＣを、ｋａｓｕｍｉ－３細胞の存在又は非存在下で、更に示された二重特異性抗体の存在下で、３ｎｇ／ｍＬの濃度で培養した。図３２Ａは、ＣＤ６９及びＣＤ２５の表面発現について陽性のＶγ９＋細胞の頻度を示す。図３２Ｂは、ＣＦＳＥ希釈（増殖プロファイル）を示す。図３２Ｃは、外因的に添加されたＫａｓｕｍｉ－３細胞を排除する能力を示す。各ドットは、個々のドナーからのデータを表す。２つの独立した実験からのｎ＝５人のドナーの代表的なデータをここに示す。
【図32B】 Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性抗体が、全ＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の活性化、増殖及びエフェクター機能を強力に媒介することを示す。ＣＦＳＥ標識された全ＰＢＭＣを、ｋａｓｕｍｉ－３細胞の存在又は非存在下で、更に示された二重特異性抗体の存在下で、３ｎｇ／ｍＬの濃度で培養した。図３２Ａは、ＣＤ６９及びＣＤ２５の表面発現について陽性のＶγ９＋細胞の頻度を示す。図３２Ｂは、ＣＦＳＥ希釈（増殖プロファイル）を示す。図３２Ｃは、外因的に添加されたＫａｓｕｍｉ－３細胞を排除する能力を示す。各ドットは、個々のドナーからのデータを表す。２つの独立した実験からのｎ＝５人のドナーの代表的なデータをここに示す。
【図32C】 Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性抗体が、全ＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の活性化、増殖及びエフェクター機能を強力に媒介することを示す。ＣＦＳＥ標識された全ＰＢＭＣを、ｋａｓｕｍｉ－３細胞の存在又は非存在下で、更に示された二重特異性抗体の存在下で、３ｎｇ／ｍＬの濃度で培養した。図３２Ａは、ＣＤ６９及びＣＤ２５の表面発現について陽性のＶγ９＋細胞の頻度を示す。図３２Ｂは、ＣＦＳＥ希釈（増殖プロファイル）を示す。図３２Ｃは、外因的に添加されたＫａｓｕｍｉ－３細胞を排除する能力を示す。各ドットは、個々のドナーからのデータを表す。２つの独立した実験からのｎ＝５人のドナーの代表的なデータをここに示す。
【図33】 Ｐａｎ－Ｔ細胞再指向と比較して、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞選択的再指向がサイトカインストームを誘発しないことを示す。図３０に記載されるように、全ＰＢＭＣを、スパイクされたｋａｓｕｍｉ－３細胞の存在下又は非存在下、示された二重特異性抗体の存在下又は非存在下で培養した（３ｎｇ／ｍＬ）。培養３日目から、細胞を乱すことなく、１００μＬの培養培地をウェルから毎日除去し、培養物８日目まで新鮮な培地を補充した。サイトカインを３日目～８日目の細胞培養上清から評価した。図３３は、示された二重特異性抗体で刺激された全ＰＢＭＣの培養上清中の様々なサイトカイン又はエフェクター分子の濃度を示す。円及び四角は、それぞれ、示された二重特異性抗体又はＮＵＬＬアーム対照二重特異性抗体で刺激された４人の個々のドナーからのＰＢＭＣを表す。１つの独立した実験からのｎ＝４人のドナーの代表的なデータをここに示す。
【図34】 皮下ＫＧ－１腫瘍異種移植片を有するＮＯＤ ＳＣＩＤマウスの平均腫瘍成長動態を示す。１．５×１０６個のＫＧ－１細胞を皮下接種した雌ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスを、ＰＢＳ又はＶγ９Ｖδ２ γδ Ｔ細胞で毎週皮下処理した。全てのマウスは、１５μｇ／ｋｇのＩＬ－２、及び、示されるように１．５ｍｇ／ｋｇの（Ｖβ１７ｘＤＬＬ３）を受けた。各マウスの腫瘍体積（左）を実験期間中３日に１回測定した。値は、各群の６匹の動物の平均±ＳＥＭとして表される。統計分析は、二元配置分散分析、続いてＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．３．０）を使用したＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｐｏｓｔ試験によって実行される。＊ｐ＜０．０５＆＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である（それぞれの試験群を群１－腫瘍＋ＰＢＳ（対照）群と比較した場合）。
【図35】 ２５℃でＳＰＲによるマウス抗ヒトＴＣＲ Ｖγ９［クローン７Ａ５］及び組換えＶγ９－Ｖδ２－Ｆｃ抗原の結合動態を示す。異なる濃度の抗原（プロット内の上部から下部までの１００ｎＭ）を、表面で捕捉された抗Ｖγ９ ｍＡｂを通して流した。実験データ（黒色点線）及び１：１ラングミュア結合フィッティング（平滑線）が示されている。会合段階（最初～２５０秒）の次に解離段階が続く。１：１の単純なラングミュア結合モデルへのグローバルフィッティングにより、ｋｏｎ＝１．３±０．２ｘ１０５Ｍ－１Ｓ－１及びｋｏｆｆ＝２．４３±０．３×１０－４Ｓ－１となり、ＫＤ＝１．９ｎＭという結果になる。
【図36A】 γδ Ｔ細胞のＶγ９＋サブセットが、腫瘍排除のための再指向に適していることを示す。図３６Ａは、活性化マーカーに対して陽性の０日目（上の行）及び１４日目（下の行）の
TIFF 0007914004000001.tif 6 128 Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を示す。図３６Ｂは、抗原提示細胞の特性を示す。図３６Ｃは、疲弊マーカーを示す。図３６Ｄは、ＮＫマーカー／特性を示す。０日目のＶγ９＋γδ Ｔ細胞上の表面発現に関しＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ４４についてｎ＝７人のドナー、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ７１について２人のドナー、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ１６について３人のドナー、ＮＫＧ２Ｄについて５人のドナー、ＣＤ９５（Ｆａｓ）について３人のドナー、活性化Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞（１４日目上の表面発現に関しＣＤ６２Ｌについて８人のドナー、ＣＤ６９及びＣＤ４４について９人のドナー、ＣＤ４５Ｒｏ及びＣＤ７１について５人のドナー、Ｄ８６、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１６について３人のドナー、ＮＫＧ２Ｄについて１４人のドナー、ＣＤ９５（Ｆａｓ）について６人のドナー、新鮮なＶγ９＋γδ Ｔ細胞（０日目）上の表面発現に関しＰＤ１及びＬａｇ３について１３人のドナー、ＣＴＬＡ４及び２Ｂ４について５人のドナー、ＴＩＧＩＴ及びＴｉｍ３についてそれぞれ４人及び７人のドナー、活性化Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞（１４日目）上の表面発現に関しＰＤ１についてｎ＝１６人のドナー、ＣＴＬＡ４及び２Ｂ４について５人のドナー、Ｌａｇ３について１３人のドナー、ＴＩＧＩＴについて１４人のドナーの代表的なデータ。＞５の個々の実験を行った。
【図36B】 γδ Ｔ細胞のＶγ９＋サブセットが、腫瘍排除のための再指向に適していることを示す。図３６Ａは、活性化マーカーに対して陽性の０日目（上の行）及び１４日目（下の行）の
TIFF 0007914004000002.tif 6 128 Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を示す。図３６Ｂは、抗原提示細胞の特性を示す。図３６Ｃは、疲弊マーカーを示す。図３６Ｄは、ＮＫマーカー／特性を示す。０日目のＶγ９＋γδ Ｔ細胞上の表面発現に関しＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ４４についてｎ＝７人のドナー、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ７１について２人のドナー、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ１６について３人のドナー、ＮＫＧ２Ｄについて５人のドナー、ＣＤ９５（Ｆａｓ）について３人のドナー、活性化Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞（１４日目上の表面発現に関しＣＤ６２Ｌについて８人のドナー、ＣＤ６９及びＣＤ４４について９人のドナー、ＣＤ４５Ｒｏ及びＣＤ７１について５人のドナー、Ｄ８６、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１６について３人のドナー、ＮＫＧ２Ｄについて１４人のドナー、ＣＤ９５（Ｆａｓ）について６人のドナー、新鮮なＶγ９＋γδ Ｔ細胞（０日目）上の表面発現に関しＰＤ１及びＬａｇ３について１３人のドナー、ＣＴＬＡ４及び２Ｂ４について５人のドナー、ＴＩＧＩＴ及びＴｉｍ３についてそれぞれ４人及び７人のドナー、活性化Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞（１４日目）上の表面発現に関しＰＤ１についてｎ＝１６人のドナー、ＣＴＬＡ４及び２Ｂ４について５人のドナー、Ｌａｇ３について１３人のドナー、ＴＩＧＩＴについて１４人のドナーの代表的なデータ。＞５の個々の実験を行った。
【図36C】 γδ Ｔ細胞のＶγ９＋サブセットが、腫瘍排除のための再指向に適していることを示す。図３６Ａは、活性化マーカーに対して陽性の０日目（上の行）及び１４日目（下の行）の
TIFF 0007914004000003.tif 6 128 Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を示す。図３６Ｂは、抗原提示細胞の特性を示す。図３６Ｃは、疲弊マーカーを示す。図３６Ｄは、ＮＫマーカー／特性を示す。０日目のＶγ９＋γδ Ｔ細胞上の表面発現に関しＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ４４についてｎ＝７人のドナー、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ７１について２人のドナー、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ１６について３人のドナー、ＮＫＧ２Ｄについて５人のドナー、ＣＤ９５（Ｆａｓ）について３人のドナー、活性化Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞（１４日目上の表面発現に関しＣＤ６２Ｌについて８人のドナー、ＣＤ６９及びＣＤ４４について９人のドナー、ＣＤ４５Ｒｏ及びＣＤ７１について５人のドナー、Ｄ８６、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１６について３人のドナー、ＮＫＧ２Ｄについて１４人のドナー、ＣＤ９５（Ｆａｓ）について６人のドナー、新鮮なＶγ９＋γδ Ｔ細胞（０日目）上の表面発現に関しＰＤ１及びＬａｇ３について１３人のドナー、ＣＴＬＡ４及び２Ｂ４について５人のドナー、ＴＩＧＩＴ及びＴｉｍ３についてそれぞれ４人及び７人のドナー、活性化Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞（１４日目）上の表面発現に関しＰＤ１についてｎ＝１６人のドナー、ＣＴＬＡ４及び２Ｂ４について５人のドナー、Ｌａｇ３について１３人のドナー、ＴＩＧＩＴについて１４人のドナーの代表的なデータ。＞５の個々の実験を行った。
【図36D】 γδ Ｔ細胞のＶγ９＋サブセットが、腫瘍排除のための再指向に適していることを示す。図３６Ａは、活性化マーカーに対して陽性の０日目（上の行）及び１４日目（下の行）の
TIFF 0007914004000004.tif 6 128 Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ）を示す。図３６Ｂは、抗原提示細胞の特性を示す。図３６Ｃは、疲弊マーカーを示す。図３６Ｄは、ＮＫマーカー／特性を示す。０日目のＶγ９＋γδ Ｔ細胞上の表面発現に関しＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ４４についてｎ＝７人のドナー、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ７１について２人のドナー、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ１６について３人のドナー、ＮＫＧ２Ｄについて５人のドナー、ＣＤ９５（Ｆａｓ）について３人のドナー、活性化Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞（１４日目上の表面発現に関しＣＤ６２Ｌについて８人のドナー、ＣＤ６９及びＣＤ４４について９人のドナー、ＣＤ４５Ｒｏ及びＣＤ７１について５人のドナー、Ｄ８６、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１６について３人のドナー、ＮＫＧ２Ｄについて１４人のドナー、ＣＤ９５（Ｆａｓ）について６人のドナー、新鮮なＶγ９＋γδ Ｔ細胞（０日目）上の表面発現に関しＰＤ１及びＬａｇ３について１３人のドナー、ＣＴＬＡ４及び２Ｂ４について５人のドナー、ＴＩＧＩＴ及びＴｉｍ３についてそれぞれ４人及び７人のドナー、活性化Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞（１４日目）上の表面発現に関しＰＤ１についてｎ＝１６人のドナー、ＣＴＬＡ４及び２Ｂ４について５人のドナー、Ｌａｇ３について１３人のドナー、ＴＩＧＩＴについて１４人のドナーの代表的なデータ。＞５の個々の実験を行った。
【図37A】 Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞及びＴＡＡ発現腫瘍細胞に結合するＶγ９二重特異性抗体を示す。標的細胞を発現する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び１４日目のＺｏｌ増殖ＰＢＭＣを、示されたＶγ９二重特異性（Ｖγ９／ＣＤ１２３又はＶγ９／ＰＳＭＡ）及びＮＵＬＬアーム対照二重特異性抗体の存在下又は非存在下でインキュベートした。結合した二重特異性抗体染色をフローサイトメトリーによって評価した。代表的なグラフは、様々な濃度でのＶγ９二重特異性結合細胞の頻度を示す。Ｖγ９二重特異性抗体及びその対応するＶγ９ＮＵＬＬアーム二重特異性対照抗体を示す。グラフに示されるＥＣ５０値は、ｘ軸上の示された二重特異性抗体の濃度（対数スケール）及びｙ軸上の特異的結合（線形スケール）で４パラメータ用量応答曲線を使用して導出された。図３７Ａは、Ｋａｓｕｍｉ－３、２２Ｒｖ１細胞株についてのｎ＝３の独立した実験の代表的なデータを示し、図３７Ｂは、２回の独立した実験からのｎ＝８及び２人の健康なドナーの代表的なデータを示しており、Ｖγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＰＳＭＡ二重特異性抗体についてそれぞれ示されている。グラフに示されているＥＣ５０値は、３つの独立した実験（図３７Ａの場合）並びに９人及び２人の健康なドナー（図３７Ｂの場合）の平均を指す。
【図37B】 Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞及びＴＡＡ発現腫瘍細胞に結合するＶγ９二重特異性抗体を示す。標的細胞を発現する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び１４日目のＺｏｌ増殖ＰＢＭＣを、示されたＶγ９二重特異性（Ｖγ９／ＣＤ１２３又はＶγ９／ＰＳＭＡ）及びＮＵＬＬアーム対照二重特異性抗体の存在下又は非存在下でインキュベートした。結合した二重特異性抗体染色をフローサイトメトリーによって評価した。代表的なグラフは、様々な濃度でのＶγ９二重特異性結合細胞の頻度を示す。Ｖγ９二重特異性抗体及びその対応するＶγ９ＮＵＬＬアーム二重特異性対照抗体を示す。グラフに示されるＥＣ５０値は、ｘ軸上の示された二重特異性抗体の濃度（対数スケール）及びｙ軸上の特異的結合（線形スケール）で４パラメータ用量応答曲線を使用して導出された。図３７Ａは、Ｋａｓｕｍｉ－３、２２Ｒｖ１細胞株についてのｎ＝３の独立した実験の代表的なデータを示し、図３７Ｂは、２回の独立した実験からのｎ＝８及び２人の健康なドナーの代表的なデータを示しており、Ｖγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＰＳＭＡ二重特異性抗体についてそれぞれ示されている。グラフに示されているＥＣ５０値は、３つの独立した実験（図３７Ａの場合）並びに９人及び２人の健康なドナー（図３７Ｂの場合）の平均を指す。
【図38A】 Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性抗体が、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞及びＣＤ１２３発現細胞株に選択的に結合することを示す。Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞は、健康な個体からの全ＰＢＭＣの濃縮されたＰａｎ－Ｔ細胞からＦＡＣＳ選別により除去された。総Ｐａｎ－Ｔ細胞及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したＰａｎ－Ｔ細胞を、様々な濃度で示された二重特異性抗体の存在下及び非存在下でインキュベートした。図３８Ａは、ｐａｎ－Ｔ細胞中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の除去効果を示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を表す。図３８Ａは、示された濃度でのｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９未除去Ｐａｎ－Ｔ細胞）及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９除去Ｐａｎ－Ｔ細胞）に対するＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体の結合を反映する。ＣＤ１２３ ＴＡＡ発現Ｋａｓｕｍｉ－３及び非発現２２Ｒｖ１細胞株を、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体で染色した。図３８Ｂの上部パネルは、Ｋａｓｕｍｉ－３（左）及び２２Ｒｖ１（右）細胞株に対するＣＤ１２３、アイソタイプ対照、及びＦＭＯ対照の染色をそれぞれ示す。図３８Ｂの下部パネルは、示された濃度でのＫａｓｕｍｉ－３（左）及び２２Ｒｖ１（右）細胞株それぞれに対する、Ｖγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体の結合を示す。グラフに示されるＥＣ５０値は、ｘ軸上の示された二重特異性抗体の濃度（対数スケール）及びｙ軸上の特異的結合（線形スケール）で４パラメータ用量応答曲線を使用して導出された。
【図38B】 Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性抗体が、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞及びＣＤ１２３発現細胞株に選択的に結合することを示す。Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞は、健康な個体からの全ＰＢＭＣの濃縮されたＰａｎ－Ｔ細胞からＦＡＣＳ選別により除去された。総Ｐａｎ－Ｔ細胞及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したＰａｎ－Ｔ細胞を、様々な濃度で示された二重特異性抗体の存在下及び非存在下でインキュベートした。図３８Ａは、ｐａｎ－Ｔ細胞中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の除去効果を示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。象限の数字は、それぞれの集団の頻度を表す。図３８Ａは、示された濃度でのｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９未除去Ｐａｎ－Ｔ細胞）及びＶγ９＋γδ Ｔ細胞を除去したｐａｎ－Ｔ細胞（Ｖγ９除去Ｐａｎ－Ｔ細胞）に対するＶγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体の結合を反映する。ＣＤ１２３ ＴＡＡ発現Ｋａｓｕｍｉ－３及び非発現２２Ｒｖ１細胞株を、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体で染色した。図３８Ｂの上部パネルは、Ｋａｓｕｍｉ－３（左）及び２２Ｒｖ１（右）細胞株に対するＣＤ１２３、アイソタイプ対照、及びＦＭＯ対照の染色をそれぞれ示す。図３８Ｂの下部パネルは、示された濃度でのＫａｓｕｍｉ－３（左）及び２２Ｒｖ１（右）細胞株それぞれに対する、Ｖγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／ＮＵＬＬ二重特異性抗体の結合を示す。グラフに示されるＥＣ５０値は、ｘ軸上の示された二重特異性抗体の濃度（対数スケール）及びｙ軸上の特異的結合（線形スケール）で４パラメータ用量応答曲線を使用して導出された。
【図39A】 γδ Ｔ細胞のＶγ９二重特異性媒介性再指向が、液性及び固形腫瘍を効果的に排除することを示す。全ＰＢＭＣを、Ｚｏｌ＋ＩＬ－２＋Ｉｌ－１５の存在下で１４日間培養した。フローサイトトメトリーによって、全ＰＢＭＣ中の、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度を評価した。１４日目のＺｏｌ培養ＰＢＭＣ（エフェクター）を、加湿されたＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で、１６時間（Ｋａｓｕｍｉ－３標的について）及び７２時間（２２Ｒｖ１について）、示された濃度のＶγ９二重特異性抗体及びＶγ９ＮＵＬＬアーム対照抗体の存在下で、ＥＴ比１：１（Ｋａｓｕｍｉ－３細胞について）及び５：１（２２Ｒｖ１について）のＥＴ比（Ｚｏｌ増大ＰＢＭＣ中のＶγ９頻度に対するＥＴ比を正規化することによる）で、ＣＦＳＥ標識標的（Ｋａｓｕｍｉ－３）細胞と共培養した。標的細胞溶解を、７－ＡＡＤ染色及びフローサイトメトリーによって判定した。図３９Ａ及び図３９Ｂに示すグラフは、示された濃度のＶγ９二重特異性抗体及びそれぞれのＶγ９／ＮＵＬＬアーム対照における特異的標的細胞溶解の頻度を表す。代表的なグラフに示されるＥＣ５０値は、Ｖγ９／ＣＤ１２３（図３９Ａ）及びＶγ９／ＰＳＭＡ（図３９Ｂ）二重特異性抗体について、８及び２人の健康なドナーの、それぞれ３つ（図３９Ａの場合）及び１つ（図３９Ｂの場合）の独立した実験からの平均である。
【図39B】 γδ Ｔ細胞のＶγ９二重特異性媒介性再指向が、液性及び固形腫瘍を効果的に排除することを示す。全ＰＢＭＣを、Ｚｏｌ＋ＩＬ－２＋Ｉｌ－１５の存在下で１４日間培養した。フローサイトトメトリーによって、全ＰＢＭＣ中の、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度を評価した。１４日目のＺｏｌ培養ＰＢＭＣ（エフェクター）を、加湿されたＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で、１６時間（Ｋａｓｕｍｉ－３標的について）及び７２時間（２２Ｒｖ１について）、示された濃度のＶγ９二重特異性抗体及びＶγ９ＮＵＬＬアーム対照抗体の存在下で、ＥＴ比１：１（Ｋａｓｕｍｉ－３細胞について）及び５：１（２２Ｒｖ１について）のＥＴ比（Ｚｏｌ増大ＰＢＭＣ中のＶγ９頻度に対するＥＴ比を正規化することによる）で、ＣＦＳＥ標識標的（Ｋａｓｕｍｉ－３）細胞と共培養した。標的細胞溶解を、７－ＡＡＤ染色及びフローサイトメトリーによって判定した。図３９Ａ及び図３９Ｂに示すグラフは、示された濃度のＶγ９二重特異性抗体及びそれぞれのＶγ９／ＮＵＬＬアーム対照における特異的標的細胞溶解の頻度を表す。代表的なグラフに示されるＥＣ５０値は、Ｖγ９／ＣＤ１２３（図３９Ａ）及びＶγ９／ＰＳＭＡ（図３９Ｂ）二重特異性抗体について、８及び２人の健康なドナーの、それぞれ３つ（図３９Ａの場合）及び１つ（図３９Ｂの場合）の独立した実験からの平均である。
【図40A】 Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性抗体が、全ＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の活性化、増殖、及びエフェクター機能を強力に媒介することを示す。図４０Ａは、ＣＦＳＥ標識された全ＰＢＭＣを、スパイクされたｋａｓｕｍｉ－３細胞の存在下又は非存在下、示された二重特異性抗体の存在下で、３ｎｇ／ｍＬの濃度でどのように培養されたかを示す。対照として、ＣＦＳＥ標識された全ＰＢＭＣ（スパイクされたＫａｓｕｍｉ－３細胞を添加した又は添加しない）を、任意の二重特異性抗体の非存在下で培養した。図４０Ｂは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＣＤ７１（活性化マーカー）の表面発現について陽性のＶγ９＋細胞の平均（±ＳＥＭ）頻度を表すグラフを示す。示された二重特異性抗体の非存在下又は存在下での培養時（図４０Ｃ～図４０Ｅ）の、ＣＦＳＥ希釈（増殖プロファイル）を図４０Ｃが示し、全ＰＢＭＣ（エフェクタープロファイル）の中の、外因的に添加されたＫａｓｕｍｉ－３細胞を排除する能力を図４０Ｄが示し、又は内因性ＣＤ１２３＋細胞を排除する能力（図４０Ｅに示すように）を示す。各ドットは、個々の健康なドナーからのデータを表す。２つの独立した実験からのｎ＝５人のドナーの代表的なデータをここに示す。
【図40B】 Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性抗体が、全ＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の活性化、増殖、及びエフェクター機能を強力に媒介することを示す。図４０Ａは、ＣＦＳＥ標識された全ＰＢＭＣを、スパイクされたｋａｓｕｍｉ－３細胞の存在下又は非存在下、示された二重特異性抗体の存在下で、３ｎｇ／ｍＬの濃度でどのように培養されたかを示す。対照として、ＣＦＳＥ標識された全ＰＢＭＣ（スパイクされたＫａｓｕｍｉ－３細胞を添加した又は添加しない）を、任意の二重特異性抗体の非存在下で培養した。図４０Ｂは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＣＤ７１（活性化マーカー）の表面発現について陽性のＶγ９＋細胞の平均（±ＳＥＭ）頻度を表すグラフを示す。示された二重特異性抗体の非存在下又は存在下での培養時（図４０Ｃ～図４０Ｅ）の、ＣＦＳＥ希釈（増殖プロファイル）を図４０Ｃが示し、全ＰＢＭＣ（エフェクタープロファイル）の中の、外因的に添加されたＫａｓｕｍｉ－３細胞を排除する能力を図４０Ｄが示し、又は内因性ＣＤ１２３＋細胞を排除する能力（図４０Ｅに示すように）を示す。各ドットは、個々の健康なドナーからのデータを表す。２つの独立した実験からのｎ＝５人のドナーの代表的なデータをここに示す。
【図40C】 Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性抗体が、全ＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の活性化、増殖、及びエフェクター機能を強力に媒介することを示す。図４０Ａは、ＣＦＳＥ標識された全ＰＢＭＣを、スパイクされたｋａｓｕｍｉ－３細胞の存在下又は非存在下、示された二重特異性抗体の存在下で、３ｎｇ／ｍＬの濃度でどのように培養されたかを示す。対照として、ＣＦＳＥ標識された全ＰＢＭＣ（スパイクされたＫａｓｕｍｉ－３細胞を添加した又は添加しない）を、任意の二重特異性抗体の非存在下で培養した。図４０Ｂは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＣＤ７１（活性化マーカー）の表面発現について陽性のＶγ９＋細胞の平均（±ＳＥＭ）頻度を表すグラフを示す。示された二重特異性抗体の非存在下又は存在下での培養時（図４０Ｃ～図４０Ｅ）の、ＣＦＳＥ希釈（増殖プロファイル）を図４０Ｃが示し、全ＰＢＭＣ（エフェクタープロファイル）の中の、外因的に添加されたＫａｓｕｍｉ－３細胞を排除する能力を図４０Ｄが示し、又は内因性ＣＤ１２３＋細胞を排除する能力（図４０Ｅに示すように）を示す。各ドットは、個々の健康なドナーからのデータを表す。２つの独立した実験からのｎ＝５人のドナーの代表的なデータをここに示す。
【図40D】 Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性抗体が、全ＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の活性化、増殖、及びエフェクター機能を強力に媒介することを示す。図４０Ａは、ＣＦＳＥ標識された全ＰＢＭＣを、スパイクされたｋａｓｕｍｉ－３細胞の存在下又は非存在下、示された二重特異性抗体の存在下で、３ｎｇ／ｍＬの濃度でどのように培養されたかを示す。対照として、ＣＦＳＥ標識された全ＰＢＭＣ（スパイクされたＫａｓｕｍｉ－３細胞を添加した又は添加しない）を、任意の二重特異性抗体の非存在下で培養した。図４０Ｂは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＣＤ７１（活性化マーカー）の表面発現について陽性のＶγ９＋細胞の平均（±ＳＥＭ）頻度を表すグラフを示す。示された二重特異性抗体の非存在下又は存在下での培養時（図４０Ｃ～図４０Ｅ）の、ＣＦＳＥ希釈（増殖プロファイル）を図４０Ｃが示し、全ＰＢＭＣ（エフェクタープロファイル）の中の、外因的に添加されたＫａｓｕｍｉ－３細胞を排除する能力を図４０Ｄが示し、又は内因性ＣＤ１２３＋細胞を排除する能力（図４０Ｅに示すように）を示す。各ドットは、個々の健康なドナーからのデータを表す。２つの独立した実験からのｎ＝５人のドナーの代表的なデータをここに示す。
【図40E】 Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性抗体が、全ＰＢＭＣ中のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の活性化、増殖、及びエフェクター機能を強力に媒介することを示す。図４０Ａは、ＣＦＳＥ標識された全ＰＢＭＣを、スパイクされたｋａｓｕｍｉ－３細胞の存在下又は非存在下、示された二重特異性抗体の存在下で、３ｎｇ／ｍＬの濃度でどのように培養されたかを示す。対照として、ＣＦＳＥ標識された全ＰＢＭＣ（スパイクされたＫａｓｕｍｉ－３細胞を添加した又は添加しない）を、任意の二重特異性抗体の非存在下で培養した。図４０Ｂは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＣＤ７１（活性化マーカー）の表面発現について陽性のＶγ９＋細胞の平均（±ＳＥＭ）頻度を表すグラフを示す。示された二重特異性抗体の非存在下又は存在下での培養時（図４０Ｃ～図４０Ｅ）の、ＣＦＳＥ希釈（増殖プロファイル）を図４０Ｃが示し、全ＰＢＭＣ（エフェクタープロファイル）の中の、外因的に添加されたＫａｓｕｍｉ－３細胞を排除する能力を図４０Ｄが示し、又は内因性ＣＤ１２３＋細胞を排除する能力（図４０Ｅに示すように）を示す。各ドットは、個々の健康なドナーからのデータを表す。２つの独立した実験からのｎ＝５人のドナーの代表的なデータをここに示す。
【図41A】 Ｐａｎ－Ｔ細胞再指向と比較して、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞選択的再指向がサイトカインストームを誘発しないことを示す。図４０に記載されるように、全ＰＢＭＣを、スパイクされたｋａｓｕｍｉ－３細胞の存在下又は非存在下、示された二重特異性抗体の存在下又は非存在下で培養した（３ｎｇ／ｍＬ）。培養３日目から、細胞を乱すことなく、１００μＬの培養培地をウェルから毎日除去し、培養物８日目まで新鮮な培地を補充した。サイトカインを３日目～８日目の細胞培養上清から評価した。図４１Ａ、図４１Ｂ、及び図４１Ｃは、示された二重特異性抗体で刺激された全ＰＢＭＣの培養上清中の様々なサイトカイン又はエフェクター分子の濃度を示す。円及び四角は、それぞれ、示された二重特異性抗体又はＮＵＬＬアーム対照二重特異性抗体で刺激された４人の個々のドナーからのＰＢＭＣを表す。１つの独立した実験からのｎ＝４人のドナーの代表的なデータをここに示す。
【図41B】 Ｐａｎ－Ｔ細胞再指向と比較して、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞選択的再指向がサイトカインストームを誘発しないことを示す。図４０に記載されるように、全ＰＢＭＣを、スパイクされたｋａｓｕｍｉ－３細胞の存在下又は非存在下、示された二重特異性抗体の存在下又は非存在下で培養した（３ｎｇ／ｍＬ）。培養３日目から、細胞を乱すことなく、１００μＬの培養培地をウェルから毎日除去し、培養物８日目まで新鮮な培地を補充した。サイトカインを３日目～８日目の細胞培養上清から評価した。図４１Ａ、図４１Ｂ、及び図４１Ｃは、示された二重特異性抗体で刺激された全ＰＢＭＣの培養上清中の様々なサイトカイン又はエフェクター分子の濃度を示す。円及び四角は、それぞれ、示された二重特異性抗体又はＮＵＬＬアーム対照二重特異性抗体で刺激された４人の個々のドナーからのＰＢＭＣを表す。１つの独立した実験からのｎ＝４人のドナーの代表的なデータをここに示す。
【図41C】 Ｐａｎ－Ｔ細胞再指向と比較して、Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞選択的再指向がサイトカインストームを誘発しないことを示す。図４０に記載されるように、全ＰＢＭＣを、スパイクされたｋａｓｕｍｉ－３細胞の存在下又は非存在下、示された二重特異性抗体の存在下又は非存在下で培養した（３ｎｇ／ｍＬ）。培養３日目から、細胞を乱すことなく、１００μＬの培養培地をウェルから毎日除去し、培養物８日目まで新鮮な培地を補充した。サイトカインを３日目～８日目の細胞培養上清から評価した。図４１Ａ、図４１Ｂ、及び図４１Ｃは、示された二重特異性抗体で刺激された全ＰＢＭＣの培養上清中の様々なサイトカイン又はエフェクター分子の濃度を示す。円及び四角は、それぞれ、示された二重特異性抗体又はＮＵＬＬアーム対照二重特異性抗体で刺激された４人の個々のドナーからのＰＢＭＣを表す。１つの独立した実験からのｎ＝４人のドナーの代表的なデータをここに示す。
【図42A】 ＡＭＬ患者ＰＢＭＣにおけるＶγ９／ＣＤ１２３二重特異性媒介性γδ Ｔ細胞再指向を示す。図４２Ａは、ＡＭＬ患者由来のＴＣＲ Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞を、ＺｏＬを介して増大させることができることを示す。代表的なＦＡＣＳプロットの数字は、Ｚｏｌ＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でのＡＭＬ患者ＰＢＭＣ培養の０日目（左）及び１４日目（右）におけるＶγ９＋及びＶγ９－のγδ Ｔ細胞の頻度を示す。図４２Ｂは、４人のＡＭＬ患者ＰＢＭＣ由来のＴＣＲＶγ９＋γδ Ｔ細胞の増大の倍率を示す。図４２Ｃは、ＬＣ患者ＰＢＭＣ由来のＴＣＲ Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞がより活性化した表現型を示すことを示す。散布ドットプロットグラフは、新鮮なＰＢＭＣからの、ナイーブ（ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー（ＴＣＭ：ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ－）、エフェクターメモリー（ＴＥＭ：ＣＤ２７－ＣＤ４５ＲＡ－）、及びＣＤ４５ＲＡ（ＥＭＲＡ：ＣＤ２７－ ＣＤ４５ＲＡ＋）表現型を再発現するエフェクターメモリー細胞について陽性のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度を示す。各ドットは、肺癌患者試料からのデータを表した。図４２Ｄは、Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性が、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞に対するＡＭＬδγ Ｔ細胞の細胞傷害を効果的に媒介することを示す。これは、１４日目のＺｏｌ培養された健康なＰＢＭＣ（左）又はＡＭＬ患者ＰＢＭＣ（中央及び右）の標的細胞との１６時間の共培養に際し、Ｖγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／Ｎｕｌｌ二重特異性抗体によって媒介される標的（ｋａｓｕｍｉ－３）細胞溶解の頻度（％７－ＡＡＤ＋細胞）を示す。二重特異性ウェルから非二重特異性対照ウェル値を差し引いた。
【図42B】 ＡＭＬ患者ＰＢＭＣにおけるＶγ９／ＣＤ１２３二重特異性媒介性γδ Ｔ細胞再指向を示す。図４２Ａは、ＡＭＬ患者由来のＴＣＲ Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞を、ＺｏＬを介して増大させることができることを示す。代表的なＦＡＣＳプロットの数字は、Ｚｏｌ＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でのＡＭＬ患者ＰＢＭＣ培養の０日目（左）及び１４日目（右）におけるＶγ９＋及びＶγ９－のγδ Ｔ細胞の頻度を示す。図４２Ｂは、４人のＡＭＬ患者ＰＢＭＣ由来のＴＣＲＶγ９＋γδ Ｔ細胞の増大の倍率を示す。図４２Ｃは、ＬＣ患者ＰＢＭＣ由来のＴＣＲ Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞がより活性化した表現型を示すことを示す。散布ドットプロットグラフは、新鮮なＰＢＭＣからの、ナイーブ（ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー（ＴＣＭ：ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ－）、エフェクターメモリー（ＴＥＭ：ＣＤ２７－ＣＤ４５ＲＡ－）、及びＣＤ４５ＲＡ（ＥＭＲＡ：ＣＤ２７－ ＣＤ４５ＲＡ＋）表現型を再発現するエフェクターメモリー細胞について陽性のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度を示す。各ドットは、肺癌患者試料からのデータを表した。図４２Ｄは、Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性が、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞に対するＡＭＬδγ Ｔ細胞の細胞傷害を効果的に媒介することを示す。これは、１４日目のＺｏｌ培養された健康なＰＢＭＣ（左）又はＡＭＬ患者ＰＢＭＣ（中央及び右）の標的細胞との１６時間の共培養に際し、Ｖγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／Ｎｕｌｌ二重特異性抗体によって媒介される標的（ｋａｓｕｍｉ－３）細胞溶解の頻度（％７－ＡＡＤ＋細胞）を示す。二重特異性ウェルから非二重特異性対照ウェル値を差し引いた。
【図42C】 ＡＭＬ患者ＰＢＭＣにおけるＶγ９／ＣＤ１２３二重特異性媒介性γδ Ｔ細胞再指向を示す。図４２Ａは、ＡＭＬ患者由来のＴＣＲ Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞を、ＺｏＬを介して増大させることができることを示す。代表的なＦＡＣＳプロットの数字は、Ｚｏｌ＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でのＡＭＬ患者ＰＢＭＣ培養の０日目（左）及び１４日目（右）におけるＶγ９＋及びＶγ９－のγδ Ｔ細胞の頻度を示す。図４２Ｂは、４人のＡＭＬ患者ＰＢＭＣ由来のＴＣＲＶγ９＋γδ Ｔ細胞の増大の倍率を示す。図４２Ｃは、ＬＣ患者ＰＢＭＣ由来のＴＣＲ Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞がより活性化した表現型を示すことを示す。散布ドットプロットグラフは、新鮮なＰＢＭＣからの、ナイーブ（ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー（ＴＣＭ：ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ－）、エフェクターメモリー（ＴＥＭ：ＣＤ２７－ＣＤ４５ＲＡ－）、及びＣＤ４５ＲＡ（ＥＭＲＡ：ＣＤ２７－ ＣＤ４５ＲＡ＋）表現型を再発現するエフェクターメモリー細胞について陽性のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度を示す。各ドットは、肺癌患者試料からのデータを表した。図４２Ｄは、Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性が、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞に対するＡＭＬδγ Ｔ細胞の細胞傷害を効果的に媒介することを示す。これは、１４日目のＺｏｌ培養された健康なＰＢＭＣ（左）又はＡＭＬ患者ＰＢＭＣ（中央及び右）の標的細胞との１６時間の共培養に際し、Ｖγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／Ｎｕｌｌ二重特異性抗体によって媒介される標的（ｋａｓｕｍｉ－３）細胞溶解の頻度（％７－ＡＡＤ＋細胞）を示す。二重特異性ウェルから非二重特異性対照ウェル値を差し引いた。
【図42D】 ＡＭＬ患者ＰＢＭＣにおけるＶγ９／ＣＤ１２３二重特異性媒介性γδ Ｔ細胞再指向を示す。図４２Ａは、ＡＭＬ患者由来のＴＣＲ Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞を、ＺｏＬを介して増大させることができることを示す。代表的なＦＡＣＳプロットの数字は、Ｚｏｌ＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５でのＡＭＬ患者ＰＢＭＣ培養の０日目（左）及び１４日目（右）におけるＶγ９＋及びＶγ９－のγδ Ｔ細胞の頻度を示す。図４２Ｂは、４人のＡＭＬ患者ＰＢＭＣ由来のＴＣＲＶγ９＋γδ Ｔ細胞の増大の倍率を示す。図４２Ｃは、ＬＣ患者ＰＢＭＣ由来のＴＣＲ Ｖγ９＋γδ Ｔ細胞がより活性化した表現型を示すことを示す。散布ドットプロットグラフは、新鮮なＰＢＭＣからの、ナイーブ（ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー（ＴＣＭ：ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ－）、エフェクターメモリー（ＴＥＭ：ＣＤ２７－ＣＤ４５ＲＡ－）、及びＣＤ４５ＲＡ（ＥＭＲＡ：ＣＤ２７－ ＣＤ４５ＲＡ＋）表現型を再発現するエフェクターメモリー細胞について陽性のＶγ９＋γδ Ｔ細胞の頻度を示す。各ドットは、肺癌患者試料からのデータを表した。図４２Ｄは、Ｖγ９／ＣＤ１２３二重特異性が、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞に対するＡＭＬδγ Ｔ細胞の細胞傷害を効果的に媒介することを示す。これは、１４日目のＺｏｌ培養された健康なＰＢＭＣ（左）又はＡＭＬ患者ＰＢＭＣ（中央及び右）の標的細胞との１６時間の共培養に際し、Ｖγ９／ＣＤ１２３及びＶγ９／Ｎｕｌｌ二重特異性抗体によって媒介される標的（ｋａｓｕｍｉ－３）細胞溶解の頻度（％７－ＡＡＤ＋細胞）を示す。二重特異性ウェルから非二重特異性対照ウェル値を差し引いた。

代表図 図1本件の代表的な図

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