【図1】 ６色ＰＣＲ機器のためのチャネル割り当てマトリックス。励起フィルタと発光フィルタの新しい組み合わせによって、６色ＰＣＲ機器の従来の光チャネルをどのように拡張して２１の可能な検出チャネルをもたらすことができるかについての概念図。励起フィルタ及び発光フィルタの中心波長は、ナノメートルで示されている。励起及び発光の記述子は、ＵＶ（ｕ）、青色（ｂ）、緑色（ｇ）、琥珀色（ａ）、赤色（ｒ）、ＩＲ、（ｉ）である。１つの励起フィルタと１つの発光フィルタとを組み合わせることによって光チャネルが形成される。例えば、ＵＶにおける励起及び緑色における発光についての２文字チャネル記述子は「ｕｇ」である。明るい灰色で強調表示されたチャネルは、標準的な短ストークシフト（ＳＳＳ）フルオロフォアでアクセス可能な従来のチャネルに対応する。白色フィールドは、現在入手可能なＬＳＳ色素でアクセス可能なチャネルに対応する。濃い灰色で強調表示されたチャネルは、共鳴電子移動（ＲＥＴ）プローブによってアクセス可能である。

【図2】 ６色ＰＣＲ機器（ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析器）に関する吸収（左）及び発光スペクトル（右）。４つの標準ＳＳＳ蛍光色素及び１つのＬＳＳ色素（Ｃｈｒｏｍｅｏ ４９４）のスペクトルを示す。スペクトルを任意の吸収及び蛍光単位（ＡＵ／ＦＵ）に対して正規化した。光学フィルタによってカバーされる波長領域は、水平線として示されている。４９４ｎｍ／６２８ｎｍに励起／発光最大値を有するＣｈｒｏｍｅｏ ４９４（破線）は、青色光で励起され、琥珀色及び／又は赤色発光フィルタ（ｂａ及び／又はｂｒチャネル）で検出することができる。

【図3】 ６色ＰＣＲ機器（ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析器）の吸収（左）及び発光スペクトル（右）。４つの標準ＳＳＳ蛍光色素及び１つのＬＳＳ色素（Ｄｙ３９６ＸＬ）のスペクトルを示す。スペクトルを任意の吸収及び蛍光単位（ＡＵ／ＦＵ）に対して正規化した。光学フィルタによってカバーされる波長領域は、水平線として示されている。３９２ｎｍ／５７２ｎｍに励起／発光最大値を有するＤｙ３９６ＸＬ（破線）は、ＵＶ光で励起され、緑色発光フィルタ（ｕｇチャネル）で検出することができる。

【図4】 ３×ＬｏＤレベルでの標的投入によるｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）ＣＴ／ＮＧ／ＴＶ／ＭＧ試験における６つのＴａｑＭａｎプローブのリアルタイムＰＣＲ成長曲線。ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析器における多重化は、４つのＳＳＳ色素を２つのＬＳＳ色素（Ｃｈｒｏｍｅｏ４９４、Ｄｙ３９５ＸＬ）と組み合わせることによって達成された。成長曲線のベースラインを比較のために０に正規化した。

【図5】 ５チャネルｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）ＣＴ／ＮＧ／ＭＧ試験におけるＤｙ３９５ＸＬ又はＤｙ３９６ＸＬで標識されたＭＧＰＢプローブの統計分析。ＭＧ－Ｄｙ３９５ＸＬプローブとＭＧ－Ｄｙ３９６ＸＬプローブとのベースラインの違いにより、ベースライン比に従って、より高いベースラインを有するプローブの性能（Ｃｔ、振幅、及びＫｅｘｐ）を正規化した。

【図6】 ５チャネルｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）ＣＴ／ＮＧ／ＭＧ試験におけるＤｙ３９５ＸＬ又はＤｙ３９６ＸＬで標識されたＭＧＰＣプローブの統計分析。ＭＧ－Ｄｙ３９５ＸＬプローブとＭＧ－Ｄｙ３９６ＸＬプローブとのベースラインの違いにより、ベースライン比に従って、より高いベースラインを有するプローブの性能（Ｃｔ、振幅、及びＫｅｘｐ）を正規化した。

【図7A】 ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析器用の細管を含む試料管の例示的な実施形態。図７Ａは、正面図である。

【図7B】 ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析器用の細管を含む試料管の例示的な実施形態。図７Ｂは、分析器の内部に配置された試料管の断面図である。

【図8A】 ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析器用の細管を含む試料管の別の例示的な実施形態。図８Ａは、断面図である。

【図8B】 ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｌｉａｔ（登録商標）分析器用の細管を含む試料管の別の例示的な実施形態。図８Ｂは、試料管の斜視図である。

【図9】 ５色ＰＣＲ機器のための光チャネル割り当てマトリックス。励起フィルタと発光フィルタの新しい組み合わせによって、５色ＰＣＲ機器の従来の光チャネルをどのように拡張することができるかについての概念図。励起フィルタ及び発光フィルタの中心波長は、ナノメートルで示されている。対角フィールド（明灰色）上の光チャネルは、標準的な短ストークシフト（ＳＳＳ）フルオロフォアでアクセス可能である。暗灰色のフィールドは、ＬＳＳ色素でアクセスされた光チャネルに対応する。一実施形態では、標的を、４９５ｎｍでの励起及び６４５ｎｍでの検出によってＬＳＳ色素で検出した（ＡＴＴＯ ４９０ＬＳ色素）。別の実施形態では、標的を、４３５ｎｍでの励起及び５８０ｎｍでの検出によってＬＳＳ色素で検出した（ＲＬＳ色素）。白色フィールドは、ＬＳＳ色素又は共鳴電子移動（ＲＥＴ）プローブで概念的にアクセス可能なさらなるチャネルに対応する。

【図10】 ５色ＰＣＲ機器（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）及びｃｏｂａｓ（登録商標）ｘ８００分析器）に関する吸収（左）及び発光スペクトル（右）。４９５ｎｍでの励起及び６４５ｎｍでの検出によって検出することができる５つの標準ＳＳＳ蛍光色素及び１つのＬＳＳ色素ＡＴＴＯ ４９０ＬＳのスペクトルが示されている。スペクトルを任意の吸収及び蛍光単位（ＡＵ／ＦＵ）に対して正規化した。光学フィルタによってカバーされる波長領域は、水平線として示されている。

【図11】 ５色ＰＣＲ機器（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）及びｃｏｂａｓ（登録商標）ｘ８００分析器）に関する吸収（左）及び発光スペクトル（右）。４３５ｎｍでの励起及び５８０ｎｍでの検出によって検出することができる５つの標準蛍光色素及び１つのＬＳＳ色素（ＲＬＳ）のスペクトルが示されている。スペクトルを任意の吸収及び蛍光単位（ＡＵ／ＦＵ）に対して正規化した。光学フィルタによってカバーされる波長領域は、水平線として示されている。

【図12】 ＬＳＳ色素に基づく拡張された光多重化と温度ベースの多重化との適合性を実証するリアルタイムＰＣＲ成長曲線。注目すべき例は、３つの熱チャネル（ＴＣ）にわたるＡＴＴＯ ４９０ＬＳ光チャネル（４９５ｎｍ／６４５ｎｍ）における３つの標的の個々の検出を示す。ＴＣ１は、ＡＴＴＯ ４９０ＬＳ及び５８℃での蛍光読み取り値を有する標準的なＴａｑＭａｎプローブに基づく。ＴＣ２及びＴＣ２は、それぞれ８０℃及び９１℃で標的蛍光シグナルを生成するＡＴＴＯ ４９０ＬＳによるタグ付きプローブ設計に基づく。標的濃度は１０００ｃｐ／反応であり、標的とされた全ての試料が存在した。陽性ＰＣＲシグナルが予想される各熱チャネルのＰＣＲ成長曲線にアスタリスクを付けた。より高い熱チャネルでは、標的が存在しない場合のわずかな上向き又は下向きの傾きは、蛍光色素の最適化されていない熱補正係数によって引き起こされる。データは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０分析器で生成した。

【図13】 ＬＳＳ色素に基づく拡張された光多重化と温度ベースの多重化との適合性を実証するリアルタイムＰＣＲ成長曲線。注目すべき例は、３つの熱チャネル（ＴＣ）にわたるＲＬＳ光チャネル（４３５ｎｍ／５８０ｎｍ）における３つの標的の個々の検出を示す。ＴＣ１は、ＲＬＳ色素及び５８℃での蛍光読み取り値を有する標準的なＴａｑＭａｎプローブに基づく。ＴＣ２及びＴＣ２は、それぞれ８０℃及び９１℃で標的蛍光シグナルを生成するＲＬＳ色素によるタグ付きプローブ設計に基づく。各標的の濃度は、テンプレートなし対照（ＮＴＣ）を除いて、１０００ｃｐ／反応であった。より高い熱チャネルでは、標的が存在しない場合のわずかな上向き又は下向きの傾きは、蛍光色素の最適化されていない熱補正係数によって引き起こされる。データは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０分析器で生成した。