ホーム > 特許ランキング > セレクトリコン アーベー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-13
(54)【発明の名称】大容量用途で使用するための区画化された細胞培養
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20220105BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220105BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 D
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021518624
(86)(22)【出願日】2019-10-09
(85)【翻訳文提出日】2021-03-30
(86)【国際出願番号】 EP2019077380
(87)【国際公開番号】W WO2020074592
(87)【国際公開日】2020-04-16
(31)【優先権主張番号】62/743,028
(32)【優先日】2018-10-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521135038
【氏名又は名称】セレクトリコン アーベー
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ピール、ヨハン
(72)【発明者】
【氏名】カールソン、マティアス
(72)【発明者】
【氏名】カリラ、パウル
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA01
4B029AA07
4B029AA08
4B029BB11
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4B063QX02
4B063QX04
(57)【要約】
本開示は、細胞培養基板を生成するのに有用であり、米国国家規格協会の実験室自動化及びスクリーニング学会（ＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ）マイクロプレート規格に準拠する隣接ウェル間の流体接続を有するマルチウェルプレートに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウェルを含むマルチウェルプレートであって、プレートの少なくとも２つの隣接するウェルは、少なくとも２つの隣接するウェルを分離する壁に少なくとも１つの流体接続を有する、上記マルチウェルプレート。
【請求項2】
前記マルチウェルプレートが、米国国家規格協会の実験室自動化及びスクリーニング学会（ＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ）マイクロプレート規格に準拠している、請求項１に記載のマルチウェルプレート。
【請求項3】
前記マルチウェルプレートが、熱可塑性材料から製造された基板を含む、請求項１から２のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項4】
前記熱可塑性材料が、ポリスチレン（ＰＳ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリ（メチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアミド（Ｎｙｌｏｎ(登録商標））、ポリプロピレン又はポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、テフロン(登録商標）、ＰＤＭＳ、及び／又は熱可塑性ポリエステル（ＴＰＥ）を含む、請求項３に記載のマルチウェルプレート。
【請求項5】
前記マルチウェルプレートが、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＰ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＣ）、又はポリスチレン（ＰＳ）から製造された基板を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項6】
前記マルチウェルプレートが、シリコン、ガラス、セラミック材料、又はアルミナから製造された基板を含む、請求項１又は２に記載のマルチウェルプレート。
【請求項7】
前記プレートが２つ以上の層を含む基板を含み、任意選択で、これらの層が超音波溶接、熱圧縮結合、プラズマ結合、溶媒を利用した結合、レーザーを利用した結合、又は接着剤又は二重粘着テープを使用した接着結合によって結合される、請求項１から６のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項8】
プレートが、タンパク質又はポリマーでコーティングされた基板を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項9】
前記プレートが、ポリ‐１‐リジン、ポリ‐Ｌ‐オルニチン、コラーゲン、ラミニン、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）、又はウシ血清アルブミンのうちの１つ又は複数でコーティングされた基板を含む、請求項８に記載のマルチウェルプレート。
【請求項10】
プレートが、ポリ［カルボキシベタインメタクリレート］（ＰＣＢＭＡ）、ポリ［［２‐メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド］（ＰＭＥＴＡＣ）、ポリ［ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート］（ＰＰＥＧＭＡ）、ポリ［２‐ヒドロキシエチルメタクリレート］（ＰＨＥＭＡ）、ポリ［３‐スルホプロピルメタクリレート］（ＰＳＰＭＡ）、及びポリ［２‐（メタクリロイルオキシ）エチルジメチル‐（３‐スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド］（ＰＭＥＤＳＡＨ）のうちの１つ又は複数で化学的に修飾された表面を含む基板を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項11】
前記プレートが、少なくとも１つの金属電極、少なくとも１つの金属酸化物電極、少なくとも１つの炭素電極、及び／又は流体接続に隣接するウェルにおける少なくとも１つの電界効果トランジスタ検出器をさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項12】
前記プレートは、潜在的な記録、インピーダンス分光法、ボルタンメトリー及びアンペロメトリーのうちの１つ又は複数を含む電気的読み出しが可能である、請求項１１に記載のマルチウェルプレート。
【請求項13】
前記プレートが、３つの流体接続されたウェルの少なくとも２つ、少なくとも４つ、少なくとも８つ、少なくとも１６、少なくとも３２、又は少なくとも９６のグループを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項14】
前記少なくとも１つの流体接続は、少なくとも０．５×０．２ｍｍ及び最大で１．０×３．０ｍｍの断面寸法を含み、任意選択でアスペクト比が１：５～２：１（高さ：幅）の範囲である、請求項１から１３のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項15】
前記少なくとも１つの流体接続が、０．１ｍｍ以上、０．５ｍｍ以上、１ｍｍ以上、２ｍｍ以上の断面寸法（Ｈ及び／又はＷ）、たとえば、０．１×０．１ｍｍから１．０×２．０ｍｍ（Ｈ×Ｗ）までの範囲の寸法、たとえば、０．１×０．１ｍｍ、０．１×０．２ｍｍ、０．２×０．２ｍｍ、０．３×０．３ｍｍ、０．４×０．４ｍｍ、０．５×０．５ｍｍ、０．５×１ｍｍ、０．６×０．６ｍｍ、０．７×０．７ｍｍ、０．８×０．８ｍｍ、０．９×０．９ｍｍ、１×１ｍｍ、１×１．５ｍｍ、１×２ｍｍ、又は２×２ｍｍ（Ｈ×Ｗ）の寸法、又は上記の２つの寸法のいずれかで囲まれた範囲の寸法を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項16】
前記少なくとも１つの流体接続は、０．１×０．１ｍｍから２×２ｍｍまでの断面寸法（Ｈ×Ｗ）、たとえば０．５×０．５ｍｍから１×１ｍｍまでの、又は０．１×０．１ｍｍから１×１ｍｍまでの、又は０．１×０．１ｍｍから０．５×０．５ｍｍまでの、又は０．５×０．５ｍｍから２×２ｍｍまでの、又は０．５×０．５ｍｍから１×２ｍｍまでの断面寸法を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項17】
前記少なくとも１つの流体接続は、１～２０μｍの間の断面寸法（Ｈ及び／又はＷ）、たとえば、１～５μｍ、１～１０μｍ、５～１０μｍ、１０～２０μｍ、１０～１５μｍ、１５～２０μｍ、５～１５μｍの寸法を含み、又は１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、１６μｍ、１７μｍ、１８μｍ、１９μｍ、又は２０μｍの断面寸法（Ｈ及び／又はＷ）を含み、任意選択で１：５～２：１の範囲のアスペクト比（Ｈ×Ｗ）をも有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項18】
流体接続が、０．５×０．２ｍｍ以下、又は１００×１００μｍから０．５×０．２ｍｍ（Ｈ：Ｗ）までの断面寸法を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項19】
前記流体接続は、５×５μｍ以下、又は３×３μｍから５×５μｍまでの断面寸法を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項20】
前記流体接続の寸法、形状、及び数は、神経突起の浸透及び生産性を改善するために、少なくとも１つの流体接続の長さにわたって変化する、請求項１７又は１９に記載のマルチウェルプレート。
【請求項21】
前記少なくとも１つの流体接続の長さが少なくとも０．２５ｍｍ、最大で２．０ｍｍである、請求項１～１３又は１８のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項22】
少なくとも１つの流体接続の寸法のアスペクト比が２０：１（Ｗ：Ｈ）から１：５（Ｗ：Ｈ）の範囲である、請求項１から２１のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項23】
マルチウェルプレートが、６、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６、又は３４５６ウェルフォーマットを含み、任意選択で２：３長方形のマトリックスに編成される、請求項１から２２のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項24】
マルチウェルプレートが、３つの隣接する流体的に相互接続されたウェルの少なくとも２つのグループを含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項25】
マルチウェルプレートが、２つの隣接する流体的に相互接続されたウェルの少なくとも３つのグループを含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項26】
前記マルチウェルプレートが、４つの隣接する流体的に相互接続されたウェルの少なくとも１つのグループを含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載のマルチウェルプレート。
【請求項27】
請求項１から２６のいずれか一項に記載のマルチウェルプレートを使用して目的の材料をスクリーニングすることを含む、目的の材料のハイスループットスクリーニングのための方法。
【請求項28】
目的の材料が２Ｄ細胞培養物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
目的の材料が３Ｄ細胞培養物である、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、大容量用途で使用するための区画化された細胞培養物を生成するための新規の基板に関する。具体的には、いくつかの実施形態では、本開示は、実験室自動化及びスクリーニング学会（ＡＮＳＩ／ＳＬＡ）マイクロプレート規格に準拠したマルチウェルプレートに関するものであり、ウェルのグループが流体的に接続されて、神経生物学研究及び創薬における細胞アッセイの開発の広範囲に使用できる細胞培養基板を生成する。
【背景技術】
【0002】
１９７０年代半ばのその構想以来、区画化された細胞培養（ＣＣＣ）は、神経生物学研究における重要な方法論として注目を集めてきた。Campenot, R.B., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74: 4516-9 (1977)。たとえば、ＣＣＣは、ニューロンの個別の集団間のネットワーク通信を研究してシナプス通信（Vikman et al., J. Neurosci. Methods 105:175-184 (2001)）、タンパク質及び細胞小器官の軸索輸送（Bousset et al., Ann. Neurol. 72:517-524 (2013)）などのメカニズムを研究するために、又は細胞ネットワーク形成（Taylor et al., J. Neurosci. 33:5584-5589 (2013)）を研究する目的で、使用することができる。さらに、ＣＣＣは、異なる細胞タイプ間の細胞シグナル伝達、たとえば、ニューロン‐筋細胞シグナル伝達（Zahavi et al., J. Cell Sci. 128:1241-1252 (2015)）、又はさまざまな脳領域からのニューロン間のコミュニケーション（Berdichevsky, Y., Staley, K. J. & Yarmush, M. L. Lab Chip 10, 999-1004 (2010)）を研究するための実験に使用されている。
【0003】
従来、ＣＣＣは主に、実験の高スループット又は並列化の必要性が限られていた基礎研究用途に使用されてきた。しかし、製薬業界から、より高度で翻訳に関連する細胞ベースのアッセイに対する需要が高まっているため、薬物スクリーニング用途でＣＣＣを使用できるようにする必要がある。たとえば、今日、関連する方法でプリオン及びプリオン様メカニズムをモデル化し、比較的短い時間枠で数千の化合物のスクリーニングを可能にするアッセイプラットフォームにアクセスすることに大きな関心が寄せられている（Zhang, M., Luo, G., Zhou, Y., Wang, S. & Zhong, Z. Phenotypic screens targeting neurodegenerative diseases. J. Biomol. Screen. 19, 1-16 (2014)（神経変性疾患を標的とする表現型スクリーニング。））。しかし、現在の最先端の製品では、このような要求を満たすのに十分な堅牢性やスループットを提供できない。
【0004】
ＣＣＣを確立するために、個別の細胞培養領域（ウェル）が、ウェル間の流体接続を確立するのに十分大きいが、細胞が異なる細胞-培養領域の間を移動するのを防ぐのに十分小さい直径を有する非常に小さいチューブを介して流体的に相互接続される細胞培養基板が使用される。従来、ＣＣＣは手動で非常に大雑把な方法で実現されていた。メスを使用して、細胞培養皿の底に溝や引っかき傷を手動で作成していたのである。その引っかき傷を次に真空グリースを使用してシールし、シールされた引っかき傷の上にガラス又はポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）リングなどの物理的バリアを注意深く配置することにより、個別の領域を形成したのである。この方法の説明については、Campenot, R.B., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74: 4516-9 (1977)）を参照されたい。この方法は、ＣＣＣの形成に適した基板を製造するために使用できるが、非常に面倒で、高い故障率に悩まされている。近年、マイクロマシニング法がＣＣＣ形成用の基板の製造に使用されている。たとえば、ソフトリソグラフィーとポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ、つまりシリコーンゴム）の鋳造が採用され、元の手作りの基板よりも非常に均一で取り扱いがはるかに簡単なマイクロ流体基板が製造されている。Taylor et al., Nat. Methods 2:599-605 (2005);及び Neto et al., J. Neurosci. 36:11573-11584 (2016)参照。しかし、ＣＣＣの形成を可能にするために必要なかなり複雑なマイクロチャネルネットワークのために、これらのマイクロ流体基板にもいくつかの欠点があり、効率的な実験に使用することを妨げているができない。たとえば、これらの基板は液体で満たすのが難しく、気泡が形成されやすく、表面改質が難しく、時間の経過とともに層間剥離が発生しやすくなる。さらに、これらの基板に必要な複雑なマイクロチャネルレイアウトのため、これらの設計を大容量のスクリーニングに必要な高密度フォーマットにスケールアップすることは困難である。
【発明の概要】
【0005】
ここでは、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）などの大容量実験用途を可能にするＣＣＣの生産のための新規の基板を提示する。基板は、標準の３８４ウェルプレートフォーマットに基づいており、隣接するウェルは、細胞の移動を防ぎ、ウェル間の化学的完全性を維持するために十分に小さくすることができる流体接続によって相互接続されているが、それに限定されるものではない。流体接続は、実験で高い成功率を確保するために堅牢な液体処理を可能にするように注意深く設計されている。さらに、基板は、湿式化学的アプローチを使用して簡単に表面改質することができる。ＨＴＳ用途での使用を可能にするために、基板はすべてのＡＮＳＩ／ＳＬＡＳマイクロプレート規格に準拠するように設計されているため、市場で入手可能なほとんどの市販の液体処理ロボット及び光学読み出しシステムと互換性がある。
【0006】
説明によれば、本開示は、たとえば、ウェルを含むマルチウェルプレートを包含し、プレートの少なくとも２つの隣接するウェルは、その少なくとも２つの隣接するウェルを分離する壁に少なくとも１つの流体接続を有する。いくつかの実施形態では、マルチウェルプレートは、米国国家規格協会の実験室自動化及びスクリーニング学会（ＡＮＳＩ／ＳＬＡ）マイクロプレート規格に準拠している。いくつかの実施形態では、マルチウェルプレートは、熱可塑性材料から製造された基板を含む。いくつかの実施形態では、熱可塑性材料は、ポリスチレン（ＰＳ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリ（メチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアミド（ナイロン(登録商標））、ポリプロピレン又はポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、テフロン(登録商標）、ＰＤＭＳ、及び／又は熱硬化性ポリエステル（ＴＰＥ）を含む。いくつかの実施形態では、マルチウェルプレートは、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＰ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＣ）又はポリスチレン（ＰＳ）から製造された基板を含む。他の実施形態では、マルチウェルプレートは、シリコン、ガラス、セラミック材料、又はアルミナから製造された基板を含む。いくつかの実施形態では、プレートは、複数の層を含み、任意選択で、層が超音波溶接、熱圧縮結合、プラズマ結合、溶媒を利用した結合、レーザーを利用した結合、又は接着剤又は二重接着テープを使用する接着結合によって結合される基板を含む。いくつかの実施形態では、プレートは、タンパク質又はポリマーでコーティングされた基板を含む。場合によっては、プレートは、ポリ‐Ｌ‐リジン、ポリ‐Ｌ‐オルニチン、コラーゲン、ラミニン、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）(登録商標）、又はウシ血清アルブミンの１つ又は複数でコーティングされた基板を含む。場合によっては、プレートは、ポリ［カルボキシベタインメタクリレート］（ＰＣＢＭＡ）、ポリ［［２‐メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド］（ＰＭＥＴＡＣ）、ポリ［ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート］（ＰＰＥＧＭＡ）、ポリ［２‐ヒドロキシエチルメタクリレート］（ＰＨＥＭＡ）、ポリ［３‐スルホプロピルメタクリレート］（ＰＳＰＭＡ）、及びポリ［２‐（メタクリロイルオキシ）エチルジメチル‐（３‐スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド］（ＰＭＥＤＳＡＨ）の１つ又は複数で化学的に修飾された表面を含む基板を含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、プレートは、流体接続に隣接するウェル内に、少なくとも１つの金属電極、少なくとも１つの金属酸化物電極、少なくとも１つの炭素電極、及び／又は少なくとも１つの電界効果トランジスタ検出器をさらに含む。いくつかの実施形態では、プレートは、潜在的な記録、インピーダンス分光法、ボルタンメトリー、及びアンペロメトリーのうちの１つまたは複数を含む電気的読み出しが可能である。
【0008】
いくつかの実施形態において、プレートは、３つの流体的に接続されたウェルの少なくとも２つ、少なくとも４つ、少なくとも８つ、少なくとも１６、少なくとも３２、又は少なくとも９６のグループを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの流体接続は、少なくとも０．５×０．２ｍｍ及び最大で１．０×３．０ｍｍの断面寸法を含み、任意選択で、１：５から２：１（高さ：幅）の範囲のアスペクト比を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの流体接続は、０．１ｍｍ以上、０．５ｍｍ以上、１ｍｍ以上、２ｍｍ以上の断面寸法（Ｈ及び／又はＷ）、たとえば０．１×０．１ｍｍから１．０×２．０ｍｍ（Ｈ×Ｗ）までの範囲の寸法、たとえば０．１×０．１ｍｍ、０．１×０．２ｍｍ、０．２×０．２ｍｍ、０．３×０．３ｍｍ、０．４×０．４ｍｍ、０．５×０．５ｍｍ、０．５×１ｍｍ、０．６×０．６ｍｍ、０．７×０．７ｍｍ、０．８×０．８ｍｍ、０．９×０．９ｍｍ、１×１ｍｍ、１×１．５ｍｍ、１×２ｍｍ、又は２×２ｍｍ（Ｈ×Ｗ）の寸法、又は上記の２つの寸法のいずれかで囲まれた範囲の寸法を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの流体接続は、０．１×０．１ｍｍから２×２ｍｍ、たとえば、０．５×０．５ｍｍから１×１ｍｍ又は０．１×０．１ｍｍから１×１ｍｍ又は０．１×０．１ｍｍから０．５×０．５ｍｍ又は０．５×０．５ｍｍから２×２ｍｍ又は０．５×０．５ｍｍから１×２ｍｍの断面寸法（Ｈ×Ｗ）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの流体接続は、１～２０μｍの間の断面寸法（Ｈ及び／又はＷ）、たとえば、１～５μｍ、１～１０μｍ、５～１０μｍ、１０～２０μｍ、１０～１５μｍ、１５～２０μｍ、５～１５μｍを含むか、又は１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、１６μｍ、１７μｍ、１８μｍ、１９μｍ、又は２０μｍの断面寸法（Ｈ及び／又はＷ）を含み、任意選択で１：５～２：１の範囲のアスペクト比（Ｈ×Ｗ）をも有する。いくつかの実施形態では、流体接続は、０．５×０．２ｍｍ以下、又は１００×１００μｍから０．５×０．２ｍｍ（Ｈ：Ｗ）の断面寸法を含む。いくつかの実施形態では、流体接続は、５×５μｍ以下、又は３×３μｍから５×５μｍの断面寸法を含む。いくつかの実施形態では、流体接続の寸法、形状、及び数は、神経突起の浸透及び生産性を改善するために、少なくとも１つの流体接続の長さにわたって変化する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの流体接続の長さは、少なくとも０．２５ｍｍ、最大で２．０ｍｍである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの流体接続の寸法のアスペクト比は、２０：１（Ｗ：Ｈ）から１：５（Ｗ：Ｈ）の範囲である。
【0009】
いくつかの実施形態において、マルチウェルプレートは、６、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６又は３４５６ウェルフォーマットを含み、そして任意選択で２：３長方形マトリックスに組織化される。いくつかの実施形態では、マルチウェルプレートは、３つの隣接する流体的に相互接続されたウェルの少なくとも２つのグループを含む。いくつかの実施形態では、マルチウェルプレートは、２つの隣接する流体的に相互接続されたウェルの少なくとも３つのグループを含む。いくつかの実施形態では、マルチウェルプレートは、４つの隣接する流体的に相互接続されたウェルの少なくとも１つのグループを含む。
【0010】
本開示はまた、本明細書の実施形態のいずれか１つのマルチウェルプレートを使用して目的の材料をスクリーニングすることを含む、目的の材料のハイスループットスクリーニングのための方法を包含する。いくつかの実施形態では、目的の材料は２Ｄ細胞培養物である。他の実施形態では、目的の材料は３Ｄ細胞培養物である。
【0011】
追加の目的及び利点は、一部は以下の説明に記載され、一部は説明から明らかであるか、又は実践によって学習され得る。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘された要素及び組み合わせによって実現及び達成されるであろう。
【0012】
前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【0013】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、１つの（いくつかの）実施形態を示し、説明とともに、本明細書に記載された原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【図5】図５は、基板におけるシナプス機能アッセイ、及びシナプス伝達及び興奮性の概念を示しており、基板において調節されアッセイされる。以下を図５に示す。Ｉ：Ｃａ５色素とインキュベートしたＥ‐１８マウス皮質ニューロンを含むＣＣＣの顕微鏡写真。青い四角は刺激ゾーン（ゾーン１）で、赤い四角は読み出しゾーン（ゾーン２）である。ＩＩ：電気的又は化学的刺激の前は、培養物（culutes）は非蛍光性である。ＩＩＩ：電気的又は化学的刺激により、ゾーン１の細胞は活動電位を発火し、カルシウム蛍光を増加させる。ＩＶ：ゾーン１で誘発された活動電位がシナプス結合細胞を介して培養全体に広がると、対応するカルシウム蛍光がゾーン２に移動し、そこで記録される。図５の注釈は次のとおりである。＊ Ｄ‐ＡＰ５（ＮＭＤＡＲ拮抗薬；１００μＭ）及びＬＹ３４１４９５（ｍＧｌｕＲ拮抗薬；５０μＭ）；＊＊ テトラカイン（１０μＭ）；化合物のインキュベーション：３０分。
【0019】
【0020】
【0021】
【発明を実施するための形態】
【0022】
本開示は、ＨＴＳなどの大容量用途で使用するための区画化された細胞培養物（以下、ＣＣＣと呼ぶ）を生成するための新規の基板に関する。具体的には、本開示は、ＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ規格準拠のマルチウェルプレートに関するものであり、いくつかの実施形態では、これは３８４ウェルプレートであり得、これはウェルのグループが、細胞又は細胞のクラスターの移動を防ぐために、及び／又はウェル間の化学的完全性を維持するために十分に小さい微細加工された流体接続を介して流体接続されている。
【0023】
定義
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、明示的に示されているかどうかにかかわらず、たとえば、整数、分数、及びパーセンテージを含む数値を指す。約の用語は、一般に、当業者が記載された値と均等であると見なす（たとえば、同じ機能又は結果を有する）数値の範囲（たとえば、記載された範囲の＋／－５～１０％）を指す。少なくとも及び約などの用語が数値又は範囲のリストの前にある場合、その用語はリストで提供される値又は範囲のすべてを修飾する。場合によっては、約という用語には、最も近い有効数字に丸められた数値が含まれることがある。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、明示的に示されているかどうかにかかわらず、たとえば、整数、分数、及びパーセンテージを含む数値を指す。約の用語は、一般に、当業者が記載された値と均等であると見なす（たとえば、同じ機能又は結果を有する）数値の範囲（たとえば、記載された範囲の＋／－５～１０％）を指す。少なくとも及び約などの用語が数値又は範囲のリストの前にある場合、その用語はリストで提供される値又は範囲のすべてを修飾する。場合によっては、約という用語には、最も近い有効数字に丸められた数値が含まれることがある。
【0024】
本明細書で使用される「又は」という用語は、代替案のみが意図されているという文脈から別段のことが明らかにされない限り、「及び／又は」として解釈されるべきである。
【0025】
「マルチウェルプレート」は、小さな試験管として利用することができるウェル又はコンパートメント（区画）を有する平板を指す。マルチウェルプレートは、いくつかの実施形態では、２：３長方形マトリックスに編成された、いくつかの例では、６、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６、又は３４５６ウェルを有することができる。プレートの「基板」とは、プレート構造及びプレートのウェルを形成する一般的な材料を指す。基板は、１つ又は複数の層並びに１つ又は複数のコーティングを含むことができる。
【0026】
「３８４ウェルフォーマット」は、２：３の長方形マトリックスに編成された３８４ウェル、すなわち、１６×２４ウェルを有するマルチウェルプレートを指す。この文脈では、「フォーマット」という用語は、ウェルの列が編成される方法を単に指す（たとえば、２：２、２：３、及びウェルの総数を提供する各行のウェルの数）。たとえば、３２×４８ウェルを有するより高いマルチウェルプレートフォーマット（１５３６ウェル）又は８×１２ウェルを有するより低いマルチウェルプレートフォーマット（９６ウェル）も使用することができる。想定されるプレートフォーマットは、たとえば、６、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６又は３４５６ウェルであり得る。
【0027】
「接続されたウェル」、「相互接続されたウェル」、又は「流体的に接続されたウェル」という用語は、それらの間に直接流体接続を有するウェルを指す。「隣接するウェル」とは、近接（隣接）するウェルを指し、１つ又は複数の流体接続によって相互接続され、いわゆるウェルの「グループ」を形成する場合がある。本明細書で使用されるウェルの「グループ」は、流体接続によって直接的又は間接的に接続されたウェルを指す。いくつかの実施形態では、そのようなウェルのグループは、「アッセイ可能な構造」又は「アッセイ可能な実体」又は「アッセイ可能なグループ」、すなわち、意図されたアッセイに使用される構造又は実体を形成し得る。たとえば、少なくとも３つの相互接続されたウェルのグループは、アッセイ可能なエンティティを形成する場合がある。このようなウェルのグループは、３８４ウェルプレート上で個別に、又は複数のグループで並行して、又は順番に処理できる。
【0028】
ウェル間などの「流体接続」という用語は、１つ又は複数の接続又は導管を有するウェルを指し、目的に応じて、制御された輸送又は材料の輸送の防止を可能にすることができる。一実施形態では、流体接続は、軸索及び／又は樹状突起の輸送を可能にするが、細胞又はミトコンドリアなどの細胞体の輸送を妨げる。この実施形態では、小分子、ポリマー、タンパク質、及びナノ粒子は、流体接続を介して輸送することができるが、細胞又はミトコンドリアなどのより大きな材料は、輸送するには大きすぎ、前記輸送は、静水圧を操作することによって調節することができる。別の実施形態では、流体接続は、細胞、細胞のクラスター、並びに軸索及び樹状突起の輸送を可能にする。「断面寸法」という用語は、２つのウェル間の流体接続の幅と高さを指す。
【0029】
「実験室自動化及びスクリーニング学会（Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）（ＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ）マイクロプレート規格」とは、フットプリント寸法、高さ寸法、外側下部フランジ寸法、ウェル位置、及びウェル下部高さの物理的寸法と公差を概説する一連の規格を指す。たとえば、いくつかの実施形態では、マルチウェルプレートは、有効なＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ規格、すなわちＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ １‐２００４（Ｒ２０１２）：フットプリント寸法、ＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ ２‐２００４（Ｒ２０１２）：高さ寸法、ＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ ３‐２００４（Ｒ２０１２）：下部外側フランジ寸法、ＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ ４‐２００４（Ｒ２０１２）：ウェル位置、及び／又はＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ ６‐２０１２：ウェル下部高さに準拠している。
【0030】
「熱可塑性材料」という用語は、特定の温度を超えると成形可能又は柔軟になり、冷却すると固化するプラスチック材料、最も一般的にはポリマー材料を指す。
【0031】
組成と方法
ａ．基板の特性
商業的ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）システムの現在の要件を満たすために、本開示の基板は、いくつかの実施形態では、ＡＮＳＩ／ＳＬＡマイクロプレート規格で指定されているような物理的フットプリント及び外形を有し得る。これらの基準に従うことにより、本開示の実施形態は、確立されたロボットプレート処理システム、液体処理システム、及びＨＴＳで利用される光学読み出しシステムと互換性があり得る。しかしながら、マイクロプレートの規格は、形状又は設計の将来の変更の対象となるため、本発明はまた、マルチウェルプレートの様々な形状及びサイズとも互換性がある。
ａ．基板の特性
商業的ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）システムの現在の要件を満たすために、本開示の基板は、いくつかの実施形態では、ＡＮＳＩ／ＳＬＡマイクロプレート規格で指定されているような物理的フットプリント及び外形を有し得る。これらの基準に従うことにより、本開示の実施形態は、確立されたロボットプレート処理システム、液体処理システム、及びＨＴＳで利用される光学読み出しシステムと互換性があり得る。しかしながら、マイクロプレートの規格は、形状又は設計の将来の変更の対象となるため、本発明はまた、マルチウェルプレートの様々な形状及びサイズとも互換性がある。
【0032】
本開示の一実施形態では、基板は３つの部分から構成される：
【0033】
第１に、基板は、基板の外形寸法及び形状を規定する上部で構成される。また、第１の部分は、ウェル又は細胞培養領域の巨視的な部分を規定する。これらのウェルのサイズと形状は、液体の取り扱いと細胞培養プロセスを容易にするように設計する必要がある。本開示の一実施形態では、３８４ウェルフォーマットが使用される。しかしながら、本開示の他の実施形態では、６、１２、２４、４８、９６、１５３６又は３４５６ウェルを有するマルチウェルプレートを使用することができる（図１）。たとえば、３８４ウェルプレートを使用する実施形態では、プレートは、３つの隣接する流体的に相互接続されたウェルの少なくとも９６グループ、２つの隣接する流体的に相互接続されるウェルの少なくとも１９２グループ、又は４つの隣接する流体的に相互接続されるウェルの少なくとも９６グループを含む。２つ又は３つの相互接続されたウェルのグループを有する６、１２、２４、４８、９６、１５３６又は３４５６ウェルを備えたマルチウェルプレートも使用することができた。
【0034】
基板の第２の及び中間の部分は、隣接するウェル間の流体接続を規定する。（図１）用途に応じて、これらの流体接続のサイズと長さは変化する可能性があり、基板が使用される細胞ベースのアッセイのタイプに依存する。たとえば、シナプス有効性アッセイの場合、細胞培養における局所的な化学的刺激の誘導を可能にするために局所的な化学的完全性を維持することができる細胞培養の作成に焦点が当てられる。本開示のこの実施形態では、０．１ｍｍ以上、０．５ｍｍ以上、１ｍｍ以上、２ｍｍ以上の断面直径、たとえば、０．１×０．１ｍｍから１．０×２．０ｍｍ（Ｈ×Ｗ）までの寸法、たとえば０．１×０．１ｍｍ、０．１×０．２ｍｍ、０．２×０．２ｍｍ、０．３×０．３ｍｍ、０．４×０．４ｍｍ、０．５×０．５ｍｍ、０．５×１ｍｍ、０．６×０．６ｍｍ、０．７×０．７ｍｍ、０．８×０．８ｍｍ、０．９×０．９ｍｍ、１×１ｍｍ、１×１．５ｍｍ、１×２ｍｍ、又は２×２ｍｍ（Ｈ×Ｗ）、又は上記の２つの寸法のいずれかで囲まれた範囲を有する流体接続を使用することができる。いくつかの実施形態では、寸法は、０．１×０．１ｍｍから２×２ｍｍ、たとえば、０．５×０．５ｍｍから１×１ｍｍ又は０．１×０．１ｍｍから１×１ｍｍ又は０．１×０．１ｍｍから０．５×０．５ｍｍ又は０．５×０．５ｍｍから２×２ｍｍ又は０．５×０．５ｍｍから１×２ｍｍの範囲であり得、たとえば、アスペクト比（Ｈ×Ｗ）が１：５～２である。
【0035】
プリオン様メカニズムをアッセイするために、例えば、異なる細胞培養ゾーン（ウェル）間での細胞の移動を防ぐために、はるかに小さい接続を使用することができる。（図２）。流体接続の断面寸法は、この場合、１～２０μｍ、たとえば１～５μｍ、１～１０μｍ、５～１０μｍ、１０～２０μｍ、１０～１５μｍ、１５～２０μｍ、５～１５μｍの寸法を有する、又は１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、１６μｍ、１７μｍ、１８μｍ、１９μｍ、又は２０μｍの寸法（Ｈ又はＷ）を有する、及び任意選択で、１：５～２：１の範囲のアスペクト比（Ｈ×Ｗ）をも有する１つ又は複数の接続を含み得る。いくつかの実施形態では、流体接続の断面寸法は、少なくとも１×０．５ｍｍを含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、流体接続の断面寸法は、１×０．５ｍｍ未満を含む。一実施形態では、流体接続は、３×３μｍという小さな寸法を有する１つ又は複数の接続から構成される。接続は、最大１００×１００μｍのより大きな寸法にすることもできる。アスペクト比、すなわち、断面寸法の幅と高さの比は、２０：１（Ｗ：Ｈ）から１：５（Ｗ：Ｈ）、たとえば２０：１から１０：１、１０：１から５：１、５：１から１：１、２：１から１：２、１：１から１：２、１：１から１：５、又は１：２から１：５（すべてＷ：Ｈ）のアスペクト比の範囲であり得る。。
【0037】
流体接続の形状及びサイズは、生産性、流体の湿潤及び充填、並びに流体コネクタへの細胞プロセスの入口などのパラメータを最適化するために、接続の長さ軸全体にわたって変化し得る。たとえば、流体接続の入口に漏斗状構造を組み込むことにより、神経突起の誘導及び浸透を改善することができ、流体接続の高さを変えることにより、機械的安定性、したがって生産性を改善することができる。一実施形態では、６×８μｍ（Ｗ×Ｈ）寸法を有するチャネルは、２００μｍの距離にわたって２０×８μｍ（Ｗ×Ｈ）に拡張され、それにより、流体接続への軸索及び樹状突起の誘導を改善する。別の実施形態では、これらの漏斗状構造は、入口で１つの大きな流体接続を形成するために一緒に結合され、神経突起の誘導及び浸透をさらに改善する。一実施形態では、入口でのこの大きな流体接続はまた、マルチウェルプレートの生産収率をより高く、大幅に改善する。一実施形態では、流体接続の高さは、８μｍから５０μｍに増加するが、他の高さも想定することができる。
【0038】
また、アッセイ用途に応じて、接続されたウェルの数は変動し得る。本開示の一実施形態では、基板は、ペア結合ウェル（すなわち、２つの接続されたウェル）のいくつかのユニットを含み、本開示の第２の実施形態では、基板は、３つの接続されたウェルのいくつかのユニットを含み、本開示の第３の実施形態では、基板は、４つ以上の接続されたウェルのいくつかのユニットを含む。（図３）。本開示の一実施形態では、流体接続は、基板の第１の層に直接形成され、したがって、基板に第２の層を含める必要性を完全に省く（図４）。
【0039】
基板の第３の部分は、基板の底部を規定する。高解像度のイメージング読み出しを可能にするために、いくつかの実施形態では、基板のこの底部は、可視及び遠紫外線スペクトル範囲内で光学的に透明であり、高開口数顕微鏡対物レンズを使用するイメージングを可能にするのに十分に薄い。したがって、いくつかの実施形態では、第３の底部の厚さは、２００μｍ未満、たとえば、１０～５０μｍ、５０～１００μｍ、又は１００～２００μｍである。高解像度イメージングが利用されない本開示の他の実施形態では、基板の最下層をより厚くして、基板の機械的堅牢性を高めることができる。（図１）。したがって、いくつかの実施形態では、第３の底部の厚さは、２００～１０００μｍの範囲、たとえば、２００～５００μｍ、又は３００～７００μｍ、又は５００～１０００μｍ、又は２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、又は１０００μｍである。
【0040】
いくつかの実施形態では、基板は、流体コネクタに隣接するウェル内に、金属電極、金属酸化物電極、炭素電極、又は電界効果トランジスタ検出器などの追加の部品を備えて、電気的読み出しを可能にすることができ、これは提出された電位記録、インピーダンス分光法、又はボルタンメトリーとアンペロメトリーを含むが、これらに限定されない。
【0041】
Ｂ．基板生産の方法
本開示の基板は、熱可塑性プラスチックなどの広範囲の材料から製造することができる。例示的な熱可塑性材料には、たとえば、ポリスチレン（ＰＳ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）又はシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリ（メチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアミド（ナイロン(登録商標））、ポリプロピレン又はポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）が挙げられ得る。追加の材料グループには、Ｔｅｆｌｏｎ(登録商標）などの過フッ素化材料、ＰＤＭＳなどのシリコーンポリマー、熱硬化性ポリエステル（ＴＰＥ）などの熱硬化性ポリマー、又はシリコン、ガラスなどの硬い結晶性又はアモルファス材料、又はアルミナなどのセラミックなどが挙げられ得る。しかし、使い捨て基板が好まれ、大量の基板が消費される可能性があるハイスループットスクリーニングのコスト基準を満たすために、基板はＰＳ、ＣＯＣ、又はＣＯＰから製造できる。これらの材料は、射出成形、熱エンボス加工、又はコンピューター支援製造（ＣＡＭ）マイクロマシニングなどの費用効果の高い大量生産方法に適している場合があるからである。いくつかの実施形態では、基板で使用される材料は、細胞の培養を可能にする表面コーティングに適している。たとえば、いくつかの実施形態では、物理的表面処理、たとえばプラズマ処理又はコロナ放電を実施すること、並びにポリ‐Ｌ‐リジン、ポリ‐Ｌ‐オルニチン、コラーゲン、ラミニン、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）(登録商標）、ウシ血清アルブミン又は他のタンパク質溶液などの材料タンパク質又は高分子材料で基板をコーティングすることが望ましい場合がある。さらに、化学修飾、たとえばポリ［カルボキシベタインメタクリレート］（ＰＣＢＭＡ）、ポリ［［２‐メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド］（ＰＭＥＴＡＣ）、ポリ［ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート］（ＰＰＥＧＭＡ）、ポリ［２‐ヒドロキシエチルメタクリレート］（ＰＨＥＭＡ）、ポリ［３‐スルホプロピルメタクリレート］（ＰＳＰＭＡ）、及びポリ［２‐（メタクリロイルオキシ）エチルジメチル‐（３‐スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド］（ＰＭＥＤＳＡＨ）も表面にグラフトすることができる。
本開示の基板は、熱可塑性プラスチックなどの広範囲の材料から製造することができる。例示的な熱可塑性材料には、たとえば、ポリスチレン（ＰＳ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）又はシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリ（メチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアミド（ナイロン(登録商標））、ポリプロピレン又はポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）が挙げられ得る。追加の材料グループには、Ｔｅｆｌｏｎ(登録商標）などの過フッ素化材料、ＰＤＭＳなどのシリコーンポリマー、熱硬化性ポリエステル（ＴＰＥ）などの熱硬化性ポリマー、又はシリコン、ガラスなどの硬い結晶性又はアモルファス材料、又はアルミナなどのセラミックなどが挙げられ得る。しかし、使い捨て基板が好まれ、大量の基板が消費される可能性があるハイスループットスクリーニングのコスト基準を満たすために、基板はＰＳ、ＣＯＣ、又はＣＯＰから製造できる。これらの材料は、射出成形、熱エンボス加工、又はコンピューター支援製造（ＣＡＭ）マイクロマシニングなどの費用効果の高い大量生産方法に適している場合があるからである。いくつかの実施形態では、基板で使用される材料は、細胞の培養を可能にする表面コーティングに適している。たとえば、いくつかの実施形態では、物理的表面処理、たとえばプラズマ処理又はコロナ放電を実施すること、並びにポリ‐Ｌ‐リジン、ポリ‐Ｌ‐オルニチン、コラーゲン、ラミニン、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）(登録商標）、ウシ血清アルブミン又は他のタンパク質溶液などの材料タンパク質又は高分子材料で基板をコーティングすることが望ましい場合がある。さらに、化学修飾、たとえばポリ［カルボキシベタインメタクリレート］（ＰＣＢＭＡ）、ポリ［［２‐メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド］（ＰＭＥＴＡＣ）、ポリ［ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート］（ＰＰＥＧＭＡ）、ポリ［２‐ヒドロキシエチルメタクリレート］（ＰＨＥＭＡ）、ポリ［３‐スルホプロピルメタクリレート］（ＰＳＰＭＡ）、及びポリ［２‐（メタクリロイルオキシ）エチルジメチル‐（３‐スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド］（ＰＭＥＤＳＡＨ）も表面にグラフトすることができる。
【0042】
基板の異なる層を組み立てるために、様々な結合方法を利用することができる。たとえば、超音波溶接、熱圧着、プラズマ接合、溶剤を利用した結合、レーザーを利用した結合、又は接着剤又は二重接着テープを使用した接着結合などの方法を使用することができる。製造の観点からは好ましくないが、基板は異なる材料で構成されていてもよい。本開示の一実施形態では、最下層はガラスで構成され、他の層は熱可塑性プラスチック又はシリコーンポリマー材料で構成される。
【実施例】
【0043】
例１‐シナプスの有効性を研究するためのアッセイ
複雑な神経回路網の環境における微妙な変化は、シナプス接続の破壊又は形成のいずれかを引き起こし得る。したがって、神経疾患及び精神疾患の創薬スクリーニングは、神経機能の変化を監視する堅牢で自動化された定量的なインビトロアッセイの恩恵を受けるであろう。シナプス機能アッセイは、特に神経変性疾患に関連する治療領域に関連するデータを生成するはずであり、また、目的の化合物がネイティブターゲットと結合して神経機能に変化をもたらすという証拠も提供するはずである。従来の電気生理学的手法のスループットが低いということは、創薬プロジェクトの現実的な時間枠でテストできる化合物の数が極めて少ないことを意味する。
複雑な神経回路網の環境における微妙な変化は、シナプス接続の破壊又は形成のいずれかを引き起こし得る。したがって、神経疾患及び精神疾患の創薬スクリーニングは、神経機能の変化を監視する堅牢で自動化された定量的なインビトロアッセイの恩恵を受けるであろう。シナプス機能アッセイは、特に神経変性疾患に関連する治療領域に関連するデータを生成するはずであり、また、目的の化合物がネイティブターゲットと結合して神経機能に変化をもたらすという証拠も提供するはずである。従来の電気生理学的手法のスループットが低いということは、創薬プロジェクトの現実的な時間枠でテストできる化合物の数が極めて少ないことを意味する。
【0044】
この例では、本開示の細胞培養基板を光電気生理学プラットフォームと組み合わせて使用して、より大きな化合物セットのスクリーニングを可能にし、研究者が無傷の神経組織における標準的な電気生理学的技術の利用に進む前に正しい化合物及び濃度を選択していることをより確信できるようにする方法を示す。
【0045】
シナプス機能アッセイを確立するために、ＣＣＣを利用する主な目的は、細胞培養において少なくとも２つの化学的及び電気的に別個のゾーンを形成することである。第１のゾーンは細胞活動電位の誘導に使用され、第２のゾーンはシナプス接続された細胞を介してゾーン１からの活動電位がゾーン２に伝播したかどうかを監視するための読み出しゾーンとして利用される。したがって、ＣＣＣ基板の目的は、細胞培養でゾーン１とゾーン２を形成し、これらのゾーンが化学的及び電気的完全性を維持できるようにすることである。
【0046】
これを達成するために、胚の１８日目（Ｅ‐１８）のマウス皮質組織を機械的に解離し、単一細胞溶液を、流体接続が０．２×２．０ｍｍの断面寸法を有する１つの大きな接続で構成された１９２対の結合ウェルを含む３８４ウェルプレートフォーマットを有する細胞培養基板にプレーティングした。細胞を播種する前に、まず基板を０．０１％ポリ‐Ｌ‐オルニチン溶液で３７℃で一晩コーティングした。その後、ウェルをＣａ２＋／Ｍｇ２＋を含むＰＢＳで洗浄した後、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含むＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したラミニンを添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ラミニンは細胞播種の直前に除去された。培養１４日後及び実験当日に、基板中の細胞にカルシウム指示薬をロードし、続いて濃度応答形式で目的の化合物との急性インキュベーション（１時間）を行った。
【0047】
基板のゾーン１に活動電位を誘導するために、プレート内のすべてのウェルのカルシウム蛍光を並行して監視することができる動的蛍光イメージングプレートリーダー（Ｃｅｌｌａｘｅｓｓ Ｅｌｅｋｔｒａ（登録商標）、Ｃｅｌｌｅｃｔｒｉｃｏｎ ＡＢ、Ｍｏｅｌｎｄａｌ、スウェーデン）にプレートを配置した。この例では、キャピラリー電極アレイ（Ｃｅｌｌａｘｅｓｓ Ｅｌｅｋｔｒａ(登録商標）電気刺激モジュール、Ｃｅｌｌｅｃｔｒｉｃｏｎ ＡＢ、Ｍｏｅｌｎｄａｌ、スウェーデン）を使用して、プレート内のすべてのゾーン１に平行で均一な外部電界を提供した。あるいは、高濃度のカリウム（通常、浸透圧調整溶液で供給される２５～１００ｍＭ）、又はベラトリジンなどの他の活動電位活性化剤をゾーン１に追加して、活動電位を誘導した。シナプス伝達は、プレートのゾーン２のカルシウム蛍光トランジェントを分析することによって評価された。上記の実験プロトコルを使用して、ゾーン１で電気的又は化学的に誘発されたカルシウムトランジェントを研究することにより、細胞培養におけるニューロンの興奮性を監視することも可能であった。アッセイの概念を図５に詳細に示す。
【0048】
方法
簡単に言えば、マウス皮質の解剖は、無菌条件下で行われた。解剖後、エッペンドルフチューブを氷で満たされた断熱容器に入れ、準備と細胞播種まで解剖中ずっと維持した。マウス皮質の準備は、無菌条件下で、出願人であるＣｅｌｌｅｃｔｒｉｃｏｎ（セレクトリコン社）の細胞実験室で行われた。組織を、最小量の培地（Ｈｉｂｅｒｎａｔｅ ＥマイナスＣａ２＋ＢｒａｉｎＢｉｔｓ ＬＬＣ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を含む元のバイアルから、火仕上げした大口径パスツールピペットを使用して、Ｈｉｂｅｒｎａｔｅ Ｅにトリプシン０．０５％＋ＥＤＴＡを事前に充填したチューブに移した。組織を３７℃のウォーターバスで１５分間インキュベートした。その後、トリプシン＋ＥＤＴＡ溶液を除去し、１０％ウシ胎児血清を添加したＨｉｂｅｒｎａｔｅ Ｅを添加した。組織を滅菌９”シラン処理ガラスパスツールピペットで穏やかに粉砕して組織を解離させた。解離していない組織を沈殿させるために、溶液を１分間放置した。次に、各チューブの上清を移し、チューブにプールした。残りの各ペレットに、新鮮なＨｉｂｅｒｎａｔｅ ＥからＣａ２＋を差し引いたものを加えた。上記の粉砕手順を繰り返し、細胞懸濁液を細胞懸濁液チューブに移した。最後の粉砕後、細胞懸濁液を２つの別々のチューブに分け、室温で２５０×ｇで５分間遠心分離した。各チューブの上清を除去し、ＮｂＡｃｔｉｖ４（ＢｒａｉｎＢｉｔｓ ＬＬＣ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、Ｉｌ、ＵＳＡ）を１つのチューブに、ＤＭＥＭを１つのチューブに順次添加することにより、ペレットを注意深く再懸濁した。細胞懸濁液を各添加の間に注意深く粉砕して、細胞凝集体を解離させた。細胞懸濁液を孔径４０μｍのセルストレーナーで濾して、大きな細胞の塊の量を減らした。適切な培地を各細胞懸濁液に加えて合計３ｍｌにし、Ｓｃｅｐｔｅｒセルカウンター（Ｓｃｅｐｔｅｒ(登録商標）Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ ２．０、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、製造元のマニュアルによる）を使用して細胞をカウントした。細胞懸濁液を１，０００，０００細胞／ｍｌに希釈し、ウェルあたり５０μｌの細胞懸濁液を３８４ウェルプレートに添加した。すべての実験において、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、９５％湿度で１３～１５日間インキュベートした。細胞の生存率と栄養供給をサポートするために、３日目に５０％培地を交換し、その後の半分の培地交換を３～４日ごとの間隔で実行した。
簡単に言えば、マウス皮質の解剖は、無菌条件下で行われた。解剖後、エッペンドルフチューブを氷で満たされた断熱容器に入れ、準備と細胞播種まで解剖中ずっと維持した。マウス皮質の準備は、無菌条件下で、出願人であるＣｅｌｌｅｃｔｒｉｃｏｎ（セレクトリコン社）の細胞実験室で行われた。組織を、最小量の培地（Ｈｉｂｅｒｎａｔｅ ＥマイナスＣａ２＋ＢｒａｉｎＢｉｔｓ ＬＬＣ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を含む元のバイアルから、火仕上げした大口径パスツールピペットを使用して、Ｈｉｂｅｒｎａｔｅ Ｅにトリプシン０．０５％＋ＥＤＴＡを事前に充填したチューブに移した。組織を３７℃のウォーターバスで１５分間インキュベートした。その後、トリプシン＋ＥＤＴＡ溶液を除去し、１０％ウシ胎児血清を添加したＨｉｂｅｒｎａｔｅ Ｅを添加した。組織を滅菌９”シラン処理ガラスパスツールピペットで穏やかに粉砕して組織を解離させた。解離していない組織を沈殿させるために、溶液を１分間放置した。次に、各チューブの上清を移し、チューブにプールした。残りの各ペレットに、新鮮なＨｉｂｅｒｎａｔｅ ＥからＣａ２＋を差し引いたものを加えた。上記の粉砕手順を繰り返し、細胞懸濁液を細胞懸濁液チューブに移した。最後の粉砕後、細胞懸濁液を２つの別々のチューブに分け、室温で２５０×ｇで５分間遠心分離した。各チューブの上清を除去し、ＮｂＡｃｔｉｖ４（ＢｒａｉｎＢｉｔｓ ＬＬＣ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、Ｉｌ、ＵＳＡ）を１つのチューブに、ＤＭＥＭを１つのチューブに順次添加することにより、ペレットを注意深く再懸濁した。細胞懸濁液を各添加の間に注意深く粉砕して、細胞凝集体を解離させた。細胞懸濁液を孔径４０μｍのセルストレーナーで濾して、大きな細胞の塊の量を減らした。適切な培地を各細胞懸濁液に加えて合計３ｍｌにし、Ｓｃｅｐｔｅｒセルカウンター（Ｓｃｅｐｔｅｒ(登録商標）Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ ２．０、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、製造元のマニュアルによる）を使用して細胞をカウントした。細胞懸濁液を１，０００，０００細胞／ｍｌに希釈し、ウェルあたり５０μｌの細胞懸濁液を３８４ウェルプレートに添加した。すべての実験において、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、９５％湿度で１３～１５日間インキュベートした。細胞の生存率と栄養供給をサポートするために、３日目に５０％培地を交換し、その後の半分の培地交換を３～４日ごとの間隔で実行した。
【0049】
ＥＦＳ及びカルシウムイメージング実験は、１４ＤＩＶの後に実施された。これらの実験は、イメージングモジュールを備えたＣｅｌｌａｘｅｓｓ Ｅｌｅｋｔｒａ(登録商標）プラットフォーム（Ｃｅｌｌｅｃｔｒｉｃｏｎ ＡＢ、Ｍｏｅｌｎｄａｌ、スウェーデン）で実施された。実験中、機器内の温度は３１～３２℃に保たれた。実験の日に、カルシウム指示薬Ｃａｌｃｉｕｍ５をＮｂＡｃｔｉｖ４（マウス皮質ニューロン）又は完全培地（ヒトｉＰＳＣニューロン）のいずれかに溶解した。細胞培養物をＣａｌｃｉｕｍ５で染色した（１０％の培地交換をもたらした）。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。Ｃａｌｃｉｕｍ５を添加してから約１時間後、細胞プレートをＣｅｌｌａｘｅｓｓ Ｅｌｅｋｔｒａ(登録商標）に挿入し、カルシウムシグナルの経時変化として自発的な神経活動を測定した。その後、一連の電界刺激をマルチウェルプレートのゾーン１に適用した。刺激に対する応答は、カルシウム強度の変化として同時に監視された（カメラ画像取得周波数は２０Ｈｚに設定され、カメラは４×４にビニングされた３９ｍｓの露出／画像であった。次いで、カルシウム応答比（ピーク反応／ベースラインレベル）の違いを使用して、％効果を決定した。このアッセイを使用して、シナプス機能を調節して薬理学的データを生成するさまざまな化学物質の特性を明らかにした。たとえば、さまざまなメカニズムを標的とする化合物の濃度応答データが実行された。例として、ＮＭＤＲ受容体拮抗薬とＧＡＢＡＡＲ受容体モジュレーターが挙げられる。ほとんどの場合、シナプス機能アッセイのデータは文献データとよく一致している。図６の上の２つのグラフは、ＮＭＤＡ受容体、シナプス内のシグナルの伝播に最も重要な受容体の阻害を通じてシナプス伝達をブロックする化合物の濃度応答データの概要を示す。図６の下の２つのグラフは、シナプスの主要な抑制性受容体であるＧＡＢＡＡ受容体の正の調節によってシナプス伝達をブロックする方法の概要を示す。どちらの場合も、結果は既存の文献データとよく相関している。さらに、アッセイは、中レベルのスループット（たとえば、２０，０００未満の化合物）を維持するフォーマットに簡単にスケーリングできるため、たとえば、フォーカスされたＨＴＳライブラリーのスクリーニングに役立つ。これは、たとえば、１９２のグループを有する３８４ウェルフォーマットのマルチウェルプレートを利用することによって達成することができた。このフォーマットを使用すると、１５％が実験対照を追加し、１０％がプレートを再スクリーニングし、１０プレート／日のスクリーニングペースであると仮定すると、２０，０００の化合物のライブラリーを３営業週未満で重複してスクリーニングできる。
【0050】
複雑で多因子の精神障害及び神経障害の疾患メカニズムに対処するための革新的で機能的なスクリーニングアプローチが必要である。この点に関して、ＣＮＳ疾患の細胞モデルと組み合わせた本開示の適用は、異常なシナプス機能を回復し、新しいメカニズムに基づく治療の基礎として役立つ新規の化合物又は標的の発見につながる可能性がある。
【0051】
例２-神経回路における神経変性疾患関連ペプチド（ＮＤＡＰ）の拡散を研究するためのアッセイ。
脳内での神経変性疾患関連ペプチド（ＮＤＡＰ）の拡散は、アルツハイマー病及びパーキンソン病などの進行性神経変性疾患における主要な病理学的メカニズムの１つと見なされている。この概念では、アミロイドベータ、α‐シヌクレイン、タウタンパク質などの病理学的に可溶な形態のＮＤＡＰがニューロンに組み込まれ、タンパク質の誤った折り畳み、シナプスの除去、神経細胞の喪失を引き起こす。さらに、多数の文献が、細胞内ＮＤＡＰのプリオン様メカニズム、つまりＮＤＡＰの細胞内輸送と、あるニューロンから別のニューロンへの拡散を報告している。神経変性疾患は依然として事実上治療不可能であるため、これらすべての複雑な神経病理学的特徴をインビトロで反映し、この神経変性カスケードを防ぐためのより大きな化合物セットのスクリーニングとプロファイリングを可能にするハイスループットアッセイプラットフォームは、緊急の満たされていない臨床ニーズを表す。
脳内での神経変性疾患関連ペプチド（ＮＤＡＰ）の拡散は、アルツハイマー病及びパーキンソン病などの進行性神経変性疾患における主要な病理学的メカニズムの１つと見なされている。この概念では、アミロイドベータ、α‐シヌクレイン、タウタンパク質などの病理学的に可溶な形態のＮＤＡＰがニューロンに組み込まれ、タンパク質の誤った折り畳み、シナプスの除去、神経細胞の喪失を引き起こす。さらに、多数の文献が、細胞内ＮＤＡＰのプリオン様メカニズム、つまりＮＤＡＰの細胞内輸送と、あるニューロンから別のニューロンへの拡散を報告している。神経変性疾患は依然として事実上治療不可能であるため、これらすべての複雑な神経病理学的特徴をインビトロで反映し、この神経変性カスケードを防ぐためのより大きな化合物セットのスクリーニングとプロファイリングを可能にするハイスループットアッセイプラットフォームは、緊急の満たされていない臨床ニーズを表す。
【0052】
本開示の基板を使用して、我々は、ＣＮＳ神経回路内の神経変性疾患カスケードのすべての特徴を反映する、独特のハイスループットインビトロアッセイを作成することができた。マウス大脳皮質ニューロン培養は、これらの培養のニューロンが広範なプロセスを発達させ、インビトロで機能的なシナプス結合を形成するために使用されている。
【0053】
詳細には、マウス皮質Ｅ１８ニューロンは、流体的に接続された３つの隣接するウェルから構成される９６の実験ユニットを含む３８４ウェルプレートフォーマットを有するカスタマイズされたＣＣＣ基板にプレーティングされた。この用途では、細胞が隣接するウェル間を移動できないことが最も重要であるため、流体接続は神経細胞体よりも小さくなった。したがって、各流体接続は、断面直径が６×８μｍの１０～３０個の穴で構成されていた。細胞を播種する前に、まず基板を０．０１％ポリ－Ｌ－オルニチン溶液で３７℃で一晩コーティングした。その後、ウェルをＣａ２＋／Ｍｇ２＋を含むＰＢＳで洗浄した後、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含むＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したラミニンを添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ラミニンは細胞播種の直前に除去された。次に、実施例１に記載のように細胞を調製し、培養した。培養７日後、プレート内のすべての実験ユニットのゾーン１の細胞を、ＮＤＡＰポリマーの５０ｎＭ溶液、たとえばアルツハイマー病患者のＣＳＦから抽出された病原性タウタンパク質オリゴマーなどの患者由来の材料で処理した。その後、プレートをインキュベーターに戻し、細胞をさらに７日間培養した。１４ＤＩＶ後、プレート内の細胞を固定し、免疫細胞化学的プロトコルを使用してニューロン及びアッセイ固有のマーカーを染色し、ハイコンテントイメージングを使用して、ＮＤＡＰの取り込み、ニューロン内の拡散、及びＮＤＡＰを介したシナプスの変化とニューロンの生存を記載する。簡単に説明すると、ＰＢＳ又はメタノール中の４％ＰＦＡを使用して細胞を固定した。ニューロンは、マウスＭＡＰ‐２ＡＢ（１：１０００）、ニワトリＭＡＰ‐２ＡＢ（１：１００００）、又はｂＴｕｂＩＩＩ（１：１０００）に結合する抗体を使用して評価された。ヘキスト（核）染色も含まれた。抗ｂＴｕｂＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ、ストックホルム、スウェーデン）（１：１０００）、‐ＰＳＤ‐９５（１：１０００）、‐シナプトフィシン（Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）（１：１０００）、‐タウ（１：１０００）をそれぞれＭＡＰ‐２ＡＢ抗体（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ、ストックホルム、スウェーデン）と組み合わせた。ハイコンテントイメージング（ＨＣＡ）分析は、Ｏｐｅｒｅｔｔａ（登録商標）ハイコンテントイメージャーを１０倍、２０倍、又は４０倍の倍率で使用して実行された（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。
【0054】
シナプス結合ニューロンを横切るＮＤＡＰの拡散のモジュレーターをスクリーニングするために、化学的、生物学的又は遺伝的介入を実験ユニットのウェル２で実施して、ＮＤＡＰを拡散する細胞培養能力を調節することができ、ユニットのウェル３はウェル１から細胞培養を介して広がった細胞内のＮＤＡＰの存在を測定するために使用される。アッセイの概念の図を画像７に示す。このアッセイの概念を使用して、ＮＤＡＰの取り込みと調節を示した。７ＤＩＶの後、ヒトＡＤ患者のＣＳＦから抽出された病理学的タウが、すべての実験ユニットのゾーン１の細胞に上記のように追加された。実験ユニットのウェル間で液面のバランスをとることにより、実験ユニットのウェル間でタウ物質の物質移動が起こらないことが保証された。病理学的タウは培養物によって急速に取り込まれ、９ＤＩＶの後、培養物におけるタウ病理学の伝播を調節することを目的として、すべての実験ユニットのゾーン２に調節抗体が追加された。この場合も、実験ユニットのウェル間で抗体物質の物質移動が起こらないように、液面のバランスを取った。１４～１６ＤＩＶで、カルシウム蛍光トランジェントを分析することにより、プレート内のすべての実験ユニットのゾーン３でシナプス機能を評価した。これに続いて、培養物を固定し、ベータチューブリンタイプ３及び内因性タウ（ＭＡＰＴ）について染色し、高解像度画像を高含有量イメージャーを使用して取得した。自動画像分析によって分析されたネットワークの完全性及び内因性タウレベルへの影響とともに、培養物のシナプス機能への影響は、タウオパチー進行のモジュレーターの大容量スクリーニングを可能にした。
【0055】
我々の知る限り、このアプローチは、シナプス結合ニューロンを横切るＮＤＡＰの拡散を防止する分子の探索において、より大きな化合物セットのスクリーニング及びプロファイリングを可能にするのに十分な能力及び堅牢性を示すであろう。
参照
１．Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 4516-9 (1977).（神経成長因子による神経突起発達の局所制御。）
２．Vikman, K. S., Backstrom, E., Kristensson, K. & Hill, R. H. A two-compartment in vitro model for studies of modulation of nociceptive transmission. J. Neurosci. Methods 105, 175-184 (2001).（侵害受容伝達の調節の研究のための２コンパートメントインビトロモデル。）
３．Bousset, L., Sourigues, Y., Covert, M. & Melki, R. Neuron‐to‐neuron transmission of α‐synuclein fibrils through axonal transport. Ann. Neurol. 72, 517-524 (2013).（軸索輸送を介したα‐シヌクレインフィブリルのニューロンからニューロンへの伝達。）
４．Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H.-C. & Schuman, E. M. Axonal Translation of Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. J. Neurosci. 33, 5584-5589 (2013).（カテニンの軸索翻訳はシナプス小胞のダイナミクスを調節する。）
５．Zahavi, E. E. et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. J. Cell Sci. 128, 1241-1252 (2015).（区画化されたマイクロ流体神経筋共培養システムは、GDNF機能の空間的側面を明らかにする。）
６．Berdichevsky, Y., Staley, K. J. & Yarmush, M. L. Lab Chip 10, 999-1004 (2010).). - Communication between different brain regions（‐異なる脳領域間のコミュニケーション）
７．Zhang, M., Luo, G., Zhou, Y., Wang, S. & Zhong, Z. J. Biomol. Screen. 19, 1-16 (2014 - Need for HTS prion-like mechanism platform（‐ＨＴＳプリオン様メカニズムプラットフォームの必要性）
８．Anne M Taylor, Mathew Blurton-Jones, Seog Woo Rhee, David H Cribbs, Carl W Cotman, and N. L. J. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods 2, 599-605 (2005).（ＣＮＳ軸索損傷、再生及び輸送のためのマイクロ流体培養プラットフォーム。）
９．Neto, E. et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. J. Neurosci. 36, 11573-11584 (2016).（コンパートメント化されたマイクロ流体プラットフォーム：神経生物学研究のためのインビトロツールの比類のないブレークスルー。）
１０．ANSI/SLAS 1-2004 (R2012): Footprint Dimensions（フットプリント寸法）
１１．ANSI/SLAS 2-2004 (R2012): Height Dimensions(高さ寸法)
１２．ANSI/SLAS 3-2004 (R2012): Bottom Outside Flange Dimensions（下部外側フランジ寸法）
１３．ANSI/SLAS 4-2004 (R2012): Well Positions(ウェル位置)
１４．ANSI/SLAS 6-2012: Well Bottom Elevation（ウェル下部高さ）
参照
１．Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 4516-9 (1977).（神経成長因子による神経突起発達の局所制御。）
２．Vikman, K. S., Backstrom, E., Kristensson, K. & Hill, R. H. A two-compartment in vitro model for studies of modulation of nociceptive transmission. J. Neurosci. Methods 105, 175-184 (2001).（侵害受容伝達の調節の研究のための２コンパートメントインビトロモデル。）
３．Bousset, L., Sourigues, Y., Covert, M. & Melki, R. Neuron‐to‐neuron transmission of α‐synuclein fibrils through axonal transport. Ann. Neurol. 72, 517-524 (2013).（軸索輸送を介したα‐シヌクレインフィブリルのニューロンからニューロンへの伝達。）
４．Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H.-C. & Schuman, E. M. Axonal Translation of Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. J. Neurosci. 33, 5584-5589 (2013).（カテニンの軸索翻訳はシナプス小胞のダイナミクスを調節する。）
５．Zahavi, E. E. et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. J. Cell Sci. 128, 1241-1252 (2015).（区画化されたマイクロ流体神経筋共培養システムは、GDNF機能の空間的側面を明らかにする。）
６．Berdichevsky, Y., Staley, K. J. & Yarmush, M. L. Lab Chip 10, 999-1004 (2010).). - Communication between different brain regions（‐異なる脳領域間のコミュニケーション）
７．Zhang, M., Luo, G., Zhou, Y., Wang, S. & Zhong, Z. J. Biomol. Screen. 19, 1-16 (2014 - Need for HTS prion-like mechanism platform（‐ＨＴＳプリオン様メカニズムプラットフォームの必要性）
８．Anne M Taylor, Mathew Blurton-Jones, Seog Woo Rhee, David H Cribbs, Carl W Cotman, and N. L. J. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods 2, 599-605 (2005).（ＣＮＳ軸索損傷、再生及び輸送のためのマイクロ流体培養プラットフォーム。）
９．Neto, E. et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. J. Neurosci. 36, 11573-11584 (2016).（コンパートメント化されたマイクロ流体プラットフォーム：神経生物学研究のためのインビトロツールの比類のないブレークスルー。）
１０．ANSI/SLAS 1-2004 (R2012): Footprint Dimensions（フットプリント寸法）
１１．ANSI/SLAS 2-2004 (R2012): Height Dimensions(高さ寸法)
１２．ANSI/SLAS 3-2004 (R2012): Bottom Outside Flange Dimensions（下部外側フランジ寸法）
１３．ANSI/SLAS 4-2004 (R2012): Well Positions(ウェル位置)
１４．ANSI/SLAS 6-2012: Well Bottom Elevation（ウェル下部高さ）
【0056】
前述の書面による明細書は、当業者が実施形態を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び例は、特定の実施形態を詳述している。しかしながら、前述のものがテキストにどれほど詳細に現れても、実施形態は多くの方法で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその均等物に従って解釈されるべきであることが理解されよう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【国際調査報告】