ホーム > 特許ランキング > モナッシュ ユニバーシティ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-13
(54)【発明の名称】炎症を治療する方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20220105BHJP
C07K 16/24 20060101ALI20220105BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220105BHJP
A61P 25/32 20060101ALI20220105BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220105BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220105BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20220105BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20220105BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220105BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220105BHJP
A61K 47/55 20170101ALI20220105BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20220105BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 N
C07K16/24 ZNA
A61P1/16
A61P25/32
A61P29/00
A61P43/00 105
A61P3/06
A61P37/06
A61P43/00 121
A61K45/00
A61P43/00 111
A61P37/04
A61K47/55
A61K47/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021519646
(86)(22)【出願日】2019-05-31
(85)【翻訳文提出日】2021-05-12
(86)【国際出願番号】 AU2019050561
(87)【国際公開番号】W WO2020073073
(87)【国際公開日】2020-04-16
(31)【優先権主張番号】2018903814
(32)【優先日】2018-10-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 掲載年月日 平成３０年６月４日 掲載アドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｏｎａｓｈ．ｅｄｕ／＿ｄａｔａ／ａｓｓｅｔｓ／ｐｄｆ＿ｆｉｌｅ／０００４
(71)【出願人】
【識別番号】501249191
【氏名又は名称】モナッシュ ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ロバート，レミー
(72)【発明者】
【氏名】マッケイ，チャールズ レイ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC41
4C076FF68
4C084AA19
4C084NA05
4C084ZA751
4C084ZB072
4C084ZB081
4C084ZB082
4C084ZB111
4C084ZB211
4C084ZB262
4C084ZC331
4C084ZC391
4C084ZC751
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB41
4C085BB42
4C085BB43
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA72
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA28
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本出願は、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位、並びに自己免疫性及び炎症性疾患、特に、脂肪肝疾患、肝臓における脂質沈着の蓄積、脂肪性肝炎、移植片拒絶及びエフェクター及び／又はメモリーＴ細胞に関連する疾患を治療するために、これらの抗原結合部位を使用する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象におけるエフェクター及び／又はメモリーＴ細胞に関連する疾患を治療するための方法であって、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位を前記対象に投与し、それによって、前記対象におけるエフェクター及び／又はメモリーＴ細胞に関連する疾患を治療することを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、方法。
【請求項2】
対象における脂肪肝疾患を治療するか、又はその進行を遅らせるための方法であって、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位を前記対象に投与し、それによって、前記対象における脂肪肝疾患を治療するか、又はその進行を遅らせることを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、方法。
【請求項3】
対象における脂肪肝疾患の発症を予防するか又は遅らせるための方法であって、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位を前記対象に投与し、それによって、前記対象における脂肪肝疾患の発症を予防するか又は遅らせることを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、方法。
【請求項4】
前記脂肪肝疾患が、アルコール依存症に関連するか、それによって引き起こされるか、又はその結果である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項5】
前記脂肪肝疾患が、アルコール以外の食事原因に関連するか、それによって引き起こされるか、又はその結果である（非アルコール性脂肪肝疾患、ＮＡＦＬＤ）、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項6】
前記ＮＡＦＬＤが、単純性脂肪肝又は炎症及び線維症の１つ以上の兆候を含む単純性脂肪肝である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記脂肪肝疾患が、肝臓脂肪症、上昇した循環若しくは肝臓トリグリセリドレベル及び／又は上昇した循環若しくは肝臓コレステロールレベルによって特徴付けられる、請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記脂肪肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項３～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
自己免疫疾患のリスクがあるか又はそれに罹患している対象における炎症を軽減又は治療する方法であって、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位、それによって、前記対象における炎症を軽減又は治療することを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、方法。
【請求項10】
炎症を軽減又は治療することが、個体における１つ以上の炎症性サイトカインの割合を減少させることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
炎症を軽減又は治療することが、前記対象における１つ以上の抗炎症性サイトカインの割合を増加させることを含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項12】
対象における炎症部位へのＣＸＣＲ３＋細胞の動員又は遊走を阻害するための方法であって、有効量の、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位を前記対象に投与し、それによって、前記対象における炎症部位へのＣＸＣＲ３＋細胞の動員又は遊走を阻害することを含む、方法。
【請求項13】
前記対象が、移植片若しくは移植を受けたか、受けているか又は受ける予定である、請求項１、又は９～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
対象の肝臓における脂質沈着の蓄積を治療又は予防する方法であって、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位を前記対象に投与し、それによって、対象の肝臓における脂質沈着の蓄積を治療又は予防することを含む、方法。
【請求項15】
対象における脂肪肝疾患を治療又は予防する方法であって、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位を前記対象に投与し、それによって、前記対象における脂肪肝疾患を治療又は予防することを含む、方法。
【請求項16】
前記脂肪肝疾患が、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
対象における脂肪性肝炎を治療又は予防する方法であって、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位を前記対象に投与し、それによって、脂肪性肝炎を治療又は予防することを含む、方法。
【請求項18】
前記脂肪性肝炎が、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）であり、好ましくは、前記脂肪性肝炎がＮＡＳＨである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
移植片若しくは移植を受けたか、受けているか又は受ける予定である対象における移植片又は移植拒絶反応を阻害するための方法であって、有効量の、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位を前記対象に投与し、それによって、前記対象における移植片又は移植拒絶反応を阻害することを含む、方法。
【請求項20】
前記移植片が、同種移植片若しくは異種移植片であるか、又は前記移植が、同種移植若しくは異種移植である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記移植片又は移植が、心臓、腎臓、肺、肝臓、膵臓、膵島、脳組織、胃、大腸、小腸、角膜、皮膚、気管、骨、骨髄、筋肉及び膀胱移植片又は移植から選択される、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項22】
前記抗原結合部位は、前記対象が、移植片又は移植を受ける前、受けると同時に、及び／又は受けた後、前記対象に投与される、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記抗原結合部位が、前記対象に２回以上投与される、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記方法が、サイトカイン（例えばインターロイキン２）、ケモカイン又は抗体などの１つ以上の他の治療剤を前記対象に投与することをさらに含み、任意選択的に、前記治療剤が、免疫抑制剤、例えば、グルココルチコイド、シクロスポリン、ラパマイシン、ボクロスポリン、シロリムス、エベロリムス、タクロリムス、ミコフェノレート、モフェチル、ミコフェノール酸、ミゾリビン、Ｓ１Ｐ－Ｒアゴニスト、マロノニトリルアミド、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ２０抗体又は抗腫瘍壊死因子抗体である、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
ＣＸＣＲ３＋細胞を枯渇させるための薬剤の調製；炎症部位へのＣＸＣＲ３＋細胞の動員若しくは遊走の阻害；ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨを含む、対象における脂肪肝疾患の治療若しくは予防；及び／又は移植片を受けたか、受けているか又は受ける予定である対象における移植片拒絶反応を阻害するための薬剤の調製のための、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位の使用。
【請求項26】
ＣＸＣＲ３＋細胞を枯渇させるのに使用するため；炎症部位へのＣＸＣＲ３＋細胞の動員若しくは遊走の阻害に使用するため；ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨを含む、対象における脂肪肝疾患の治療若しくは予防に使用するため；及び／又は移植片を受けたか、受けているか又は受ける予定である対象における移植片拒絶の阻害に使用するための、ＣＸＣＲ３に結合する抗原結合部位。
【請求項27】
前記抗原結合部位が、ＣＸＣＲ３に結合するか又は特異的に結合し、ＣＸＣＲ３活性を阻害する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法又は請求項２５に記載の使用、又は請求項２６に記載の使用のための抗原結合部位。
【請求項28】
ＣＸＣＲ３に結合する前記抗原結合部位が、枯渇性抗体である、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法又は使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項29】
前記枯渇性抗体が、ＣＸＣＲ３を発現する細胞の活性又は生存率の低下を引き起こすか又は媒介する能力を有する、請求項２８に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項30】
前記枯渇性抗体が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する能力を有する、請求項２８又は２９に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項31】
前記抗原結合部位が、細胞を枯渇させる能力を提供するように修飾されているか、又は細胞を枯渇させる前記抗原結合部位の既存の能力を高めるように修飾されている、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項32】
前記細胞が、ＣＸＣＲ３＋／ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＸＣＲ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞及び／又はＣＸＣＲ３＋／ＣＤ１９＋ Ｂ細胞である、請求項３１に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項33】
前記抗原結合部位によって阻害される前記ＣＸＣＲ３活性が、ＣＸＣＲ３へのリガンドの結合；リガンドに誘導されるＣＸＣＲ３の立体配座変化；ＣＸＣＲ３活性化；Ｇタンパク質活性化；ＣＸＣＲ３に媒介される細胞シグナル伝達；ＣＸＣＲ３に媒介される細胞遊走、炎症、腫瘍増殖、インビトロ若しくはインビボにおける血管形成若しくは転移応答；ＣＸＣＲ３に媒介される腫瘍細胞増殖；及び／又はＣＸＣＲ３に媒介される炎症細胞の動員、白血球（例えば好中球、好酸球、肥満細胞又はＴ細胞）遊走、インテグリン活性化、走化性遊走及びＴｈ１細胞成熟から選択される、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項34】
前記抗原結合部位が、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）及びＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ）からなる群から選択される１つ以上のリガンドによって誘導される前記ＣＸＣＲ３活性を阻害するか又は低下させる、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項35】
前記抗原結合部位が、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、及び／又はＣ５ａＲに検出可能に結合せず、又はそれらに実質的に結合しない、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項36】
前記抗原結合部位が、ＣＸＣＲ３に結合し、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満又は０．５ｎＭ未満のＥＣ５０を示し、好ましくは、前記抗原結合部位のＥＣ５０が、約０．２ｎＭ以下である、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項37】
前記抗原結合部位が、ＭＩＧ、ＩＴＡＣ及び／又はＩＰ１０との競合結合アッセイにおいて、約２０、１５、１２、１０、８、６、５、４、３、２、又は１ｎＭ未満のＩＣ５０を示す、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項38】
前記抗原結合部位が、ＣＸＣＲ３における第１及び／又は第２のＮ末端ループに結合する、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項39】
前記抗原結合部位が、（ｉ）一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ジ－ｓｃＦｖ）；
（ｉｉｉ）抗体の定常領域、Ｆｃ若しくは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／又はＣＨ３に連結された（ｉ）若しくは（ｉｉ）の１つ；又は
（ｉｖ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に連結された（ｉ）若しくは（ｉｉ）の１つ
の形態である、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項40】
前記抗原結合部位が、（ｉ）ダイアボディ；
（ｉｉ）トリアボディ；
（ｉｉｉ）テトラボディ；
（ｉｖ）Ｆａｂ；
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２；
（ｖｉ）Ｆｖ；
（ｖｉｉ）抗体の定常領域、Ｆｃ若しくは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／又はＣＨ３に連結された（ｉ）～（ｖｉ）の１つ；又は
（ｖｉｉｉ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に連結された（ｉ）～（ｖｉ）の１つ
の形態である、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項41】
前記抗原結合部位が、抗体又はその抗原結合断片であり、好ましくは、前記抗原結合部位が、モノクローナル抗体である、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項42】
前記抗原結合部位が、裸の抗体である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項43】
前記抗原結合部位が、抗体－薬物コンジュゲートの形態である、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項44】
前記抗原結合部位が、ヒト定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、若しくはＩｇＧ３又はそれらの混合物などのＩｇＧ定常領域を含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項45】
前記抗原結合部位が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する強化された能力を有するように改変されたＦｃ領域を含み、ここで、好ましくは、ＡＤＣＣを誘導する前記強化された能力が、Ｆｃ受容体と相互作用する前記Ｆｃ領域におけるアミノ酸の突然変異、欠失又は修飾によって与えられる、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項46】
突然変異、欠失又は修飾される前記アミノ酸が、配列番号１（ここで、アラニンが１１８位である）の２３９、３３０、及び／又は３３２位に、又は２３９、３３０及び／又は３３２と同等の位置にある、請求項４５に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【請求項47】
前記アミノ酸が、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅへと突然変異される、請求項４６に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合部位。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、ＣＸＣＲ３発現に関連する疾患、特に、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を治療又は予防するための方法及び組成物に関する。
本発明は、ＣＸＣＲ３発現に関連する疾患、特に、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を治療又は予防するための方法及び組成物に関する。
【0002】
関連出願
本出願は、オーストラリア仮特許出願ＡＵ ２０１８９０３８１４号の優先権を主張するものであり、その内容及び開示は、全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、オーストラリア仮特許出願ＡＵ ２０１８９０３８１４号の優先権を主張するものであり、その内容及び開示は、全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
ケモカイン又は化学誘引物質サイトカインは、小分子量（約８～１０ＫＤａ）の誘導可能な分泌される分子のファミリーを含み、これは、典型的に、白血球に対する活性化因子及び化学誘引物質として機能し、血管新生、創傷治癒、及び腫瘍形成を調節し得る。ケモカイン機能に関する知見のほとんどは、それらが免疫調整及び炎症の制御に関与するため、免疫系に関する研究から得られたものである。多くの他の生体系に関与する役割は、解明が遅れている。
ケモカイン又は化学誘引物質サイトカインは、小分子量（約８～１０ＫＤａ）の誘導可能な分泌される分子のファミリーを含み、これは、典型的に、白血球に対する活性化因子及び化学誘引物質として機能し、血管新生、創傷治癒、及び腫瘍形成を調節し得る。ケモカイン機能に関する知見のほとんどは、それらが免疫調整及び炎症の制御に関与するため、免疫系に関する研究から得られたものである。多くの他の生体系に関与する役割は、解明が遅れている。
【0004】
ケモカインは、典型的に、それらのアミノ末端における保存されたシステイン残基の数に応じて４つのサブファミリーに分類される。ほとんどのケモカインは、４つのシステイン残基を有する２つのメインサブファミリーに属する。これらのサブファミリーは、典型的に、２つのアミノ末端システイン残基の間のアミノ酸の有無に応じて分類され、それによってＣＣ及びＣＸＣケモカインと呼ばれる。ＣＸＣケモカイン（典型的に、高等脊椎動物に限定される）は、通常、第１のシステイン残基に隣接するそれらのアミノ末端におけるグルタミン酸－リジン－アルギニン（ＥＬＲ）モチーフの有無に応じてさらに分類される。
【0005】
ＣＸＣＲ３などのケモカイン受容体は、典型的に、百日咳毒素（ＰＴＸ）感受性Ｇｉタンパク質に連結されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。ＣＸＣＲのＮ末端ドメインは、リガンド結合特異性を決定するために重要であると考えられる。
【0006】
ＣＸＣＲ３は、Ｇタンパク質共役受容体９（ＧＰＲ９）、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＫＲ－Ｌ２、ＣＭＫＡＲ３、ＧＰＲ９、ＩＰ１０－Ｒ、Ｍｉｇ－Ｒ、ＭｉｇＲ、及びＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体３としても知られており、３８ｋＤａの７回膜貫通型タンパク質である。ＣＸＣＲ３は、主に、活性化Ｔリンパ球及びＮＫ細胞、及び一部の上皮細胞において発現される。ＣＸＣＲ３は、優先的に、Ｔｈ１細胞において発現される（一方、Ｔｈ２細胞は、ＣＣＲ３及びＣＣＲ４の発現に有利に働く）。Ｔｈ１細胞を誘引するＣＸＣＲ３リガンドは、付随的に、ＣＣＲ３リガンドに応答してＴｈ２細胞の遊走を阻止し、それによってエフェクターＴ細胞動員の偏り（polarization）を促し得る。ＣＸＣＲ３は、白血球トラフィッキングを制御することができる。ＣＸＣＲ３へのケモカインの結合は、様々な細胞応答、最も特に、インテグリン活性化、細胞骨格変化及び走化性遊走を誘導する。ＣＸＣＲ３－リガンド相互作用は、Ｔｈ１細胞を誘引し、Ｔｈ１細胞成熟を促進する。
【0007】
ＣＸＣＲ３は、インビトロで培養されたエフェクター／メモリーＴ細胞、及び多くのタイプの炎症組織中に存在するＴ細胞において発現される。さらに、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１は、炎症性病変における局所細胞によって一般的に産生され、これは、ＣＸＣＲ３及びそのケモカインが、炎症細胞の動員に関与することを示唆している。ＣＸＣＲ３は、癌、創傷治癒、感染症及び組織移植に対する応答、並びにアテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、肺線維症、１型糖尿病、自己免疫性重症筋無力症、腎毒性腎炎、急性心臓同種移植拒絶反応及びセリアック病を含む自己免疫疾患に関与しているとされている。
【0008】
ＣＸＣＲ３活性化に関連する疾患を治療するための新規な及び／又は改良された方法に対する必要性がある。
【0009】
本明細書におけるいかなる先行技術への言及も、この先行技術が、いかなる法的管轄においても、一般的な常識の一部を成すこと、又はこの先行技術が、当業者によって先行技術の他の部分により、合理的に理解されるものと予想され、関連すると考えられ、及び／又は組み合わされ得ることを承認又は示唆するものではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
発明の概要
一態様において、本発明は、対象におけるエフェクター及び／又はメモリーＴ細胞に関連する疾患を治療するための方法であって、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性（depleting）抗原結合部位を対象に投与し、それによって、対象におけるエフェクター及び／又はメモリーＴ細胞に関連する疾患を治療することを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、方法を提供する。
一態様において、本発明は、対象におけるエフェクター及び／又はメモリーＴ細胞に関連する疾患を治療するための方法であって、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性（depleting）抗原結合部位を対象に投与し、それによって、対象におけるエフェクター及び／又はメモリーＴ細胞に関連する疾患を治療することを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、方法を提供する。
【0011】
別の態様において、本発明はまた、対象における脂肪肝疾患を治療するための方法であって、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位を対象に投与し、それによって、対象における脂肪肝疾患を治療することを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、方法を提供する。
【0012】
さらなる態様において、本発明は、対象における脂肪肝疾患の発症を予防するか又は遅らせるための方法であって、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位を対象に投与し、それによって、対象における脂肪肝疾患の発症を予防するか又は遅らせることを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、方法を提供する。
【0013】
脂肪肝疾患は、アルコール依存症に関連するか、それによって引き起こされるか、又はその結果であり得る。或いは、脂肪肝疾患は、アルコール以外の食事原因に関連するか、それによって引き起こされるか、又はその結果であり得る（非アルコール性脂肪肝疾患、ＮＡＦＬＤ）。ＮＡＦＬＤは、単純性脂肪肝であり得、又は炎症及び線維症の１つ以上の兆候を含む単純性脂肪肝であり得る。
【0014】
脂肪肝疾患は、肝臓脂肪症、上昇した循環若しくは肝臓トリグリセリドレベル及び／又は上昇した循環若しくは肝臓コレステロールレベルによって特徴付けられ得る。
【0015】
さらなる態様において、本発明は、対象における非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を治療するための方法であって、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位、それによって、対象におけるＮＡＳＨを治療することを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、方法を提供する。
【0016】
別の態様において、本発明はまた、対象における非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の発症を予防するか又は遅らせるための方法であって、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位、それによって、ＮＡＳＨの発症を予防するか又は遅らせることを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、方法を提供する。
【0017】
別の態様において、本発明はまた、自己免疫疾患のリスクがあるか又はそれに罹患している対象における炎症を軽減又は治療する方法であって、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位、それによって、対象における炎症を軽減又は治療することを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、方法を提供する。
【0018】
炎症を軽減又は治療することは、個体における１つ以上の炎症性サイトカインの割合を減少させることを含み得る。さらに、炎症を軽減又は治療することは、対象における１つ以上の抗炎症性サイトカインの割合を増加させることを含み得る。
【0019】
一態様において、本発明は、対象における炎症部位へのＣＸＣＲ３＋細胞の動員又は遊走を阻害するための方法であって、有効量の、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位を対象に投与し、それによって、対象における炎症部位へのＣＸＣＲ３＋細胞の動員又は遊走を阻害することを含む、方法を提供する。
【0020】
本発明のいずれかの態様において、ＣＸＣＲ３に結合する抗原結合部位は、枯渇性抗体である。枯渇性抗体は、ＣＸＣＲ３を発現する細胞の活性又は生存率の低下を引き起こすか又は媒介する能力を有する。典型的に、枯渇性抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する能力を有する。
【0021】
抗原結合部位は、細胞を枯渇させる能力を提供するように修飾されていてもよく、又は細胞を枯渇させる抗原結合部位の既存の能力を高めるように修飾されていてもよい。
【0022】
ある実施形態において、細胞は、ＣＸＣＲ３＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＸＣＲ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞及び／又はＣＸＣＲ３＋／ＣＤ１９＋ Ｂ細胞である。さらなる実施形態において、対象は、移植片若しくは移植を受けたか、受けているか又は受ける予定である。
【0023】
別の態様において、本発明は、対象の肝臓における脂質沈着の蓄積を治療又は予防する方法であって、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位を対象に投与し、それによって、対象の肝臓における脂質沈着の蓄積を治療又は予防することを含む、方法を提供する。
【0024】
別の態様において、本発明は、対象における脂肪肝疾患を治療又は予防する方法であって、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位を対象に投与し、それによって、対象における脂肪肝疾患を治療又は予防することを含む、方法を提供する。脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）であり得るか、又はアルコール依存症によって引き起こされ得るか若しくはアルコール依存症の結果である。
【0025】
別の態様において、本発明は、対象における脂肪性肝炎を治療又は予防する方法であって、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位を対象に投与し、それによって、脂肪性肝炎を治療又は予防することを含む、方法を提供する。脂肪性肝炎は、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）であり得る。好ましくは、脂肪性肝炎は、ＮＡＳＨである。
【0026】
別の態様において、本発明は、移植片若しくは移植を受けたか、受けているか又は受ける予定である対象における移植片又は移植拒絶反応を阻害するための方法であって、有効量の、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位を対象に投与し、それによって、対象における移植片又は移植拒絶反応を阻害することを含む、方法を提供する。
【0027】
本発明の方法のある実施形態において、移植片は、同種移植片若しくは異種移植片であり、又は移植は、同種移植若しくは異種移植である。特定の例において、移植片又は移植は、心臓、腎臓、肺、肝臓、膵臓、膵島、脳組織、胃、大腸、小腸、角膜、皮膚、気管、骨、骨髄、筋肉及び膀胱移植片又は移植の中から選択される。ある場合には、抗体又は抗原結合断片は、対象が、移植片又は移植を受ける前、受けると同時に、及び／又は受けた後、対象に投与される。
【0028】
本発明の方法の一実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、対象に２回以上投与される。いくつかの例において、本方法は、サイトカイン（例えばインターロイキン２）、ケモカイン又は抗体などの１つ以上の他の治療剤を対象に投与することをさらに含む。特定の実施形態において、治療剤は、免疫抑制剤、例えば、グルココルチコイド、シクロスポリン、ラパマイシン、ボクロスポリン、シロリムス、エベロリムス、タクロリムス、ミコフェノレート、モフェチル、ミコフェノール酸、ミゾリビン、Ｓ１Ｐ－Ｒアゴニスト、マロノニトリルアミド、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ２０抗体又は抗腫瘍壊死因子抗体である。
【0029】
ＣＸＣ３＋細胞を枯渇させるための薬剤の調製；炎症部位へのＣＸＣＲ３＋細胞の動員若しくは遊走の阻害；及び／又は移植片を受けたか、受けているか又は受ける予定である対象における移植片拒絶反応を阻害するための薬剤の調製のための、ＣＸＣＲ３に結合する枯渇性抗原結合部位の使用も提供される。
【0030】
別の態様において、本発明は、対象における線維症を治療する方法であって、本明細書に記載される抗原結合部位を対象に投与し、それによって、線維症を治療することを含む、方法を提供する。
【0031】
本発明のいずれかの態様において、抗原結合部位は、ＣＸＣＲ３に結合するか又は特異的に結合し、ＣＸＣＲ３活性を阻害する。
【0032】
好ましくは、抗原結合部位は、抗体の抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、ＣＸＣＲ３に結合するか又は特異的に結合し、ＣＸＣＲ３活性を阻害する。
【0033】
本発明のいずれかの抗原結合部位によって阻害され得るＣＸＣＲ３活性としては、ＣＸＣＲ３へのリガンドの結合；リガンドに誘導されるＣＸＣＲ３の立体配座変化；ＣＸＣＲ３活性化；Ｇタンパク質活性化；ＣＸＣＲ３に媒介される細胞シグナル伝達；ＣＸＣＲ３に媒介される細胞遊走、炎症、腫瘍増殖、インビトロ若しくはインビボにおける血管形成若しくは転移応答；ＣＸＣＲ３に媒介される腫瘍細胞増殖；及び／又はＣＸＣＲ３に媒介される炎症細胞の動員、白血球（例えば好中球、好酸球、肥満細胞又はＴ細胞）遊走、インテグリン活性化、走化性遊走及びＴｈ１細胞成熟が挙げられる。
【0034】
好ましくは、本明細書に記載される抗原結合部位は、ヒトＣＸＣＲ３に結合するか又は特異的に結合する。好ましくは、抗原結合部位は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなるヒトＣＸＣＲ３分子に結合するか又は特異的に結合する。
【0035】
好ましくは、抗原結合部位は、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）及びＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ）からなる群から選択される１つ以上のリガンドによって誘導されるＣＸＣＲ３活性を阻害するか又は低下させる。例えば、抗原結合部位は、ＣＸＣＲ３リガンドによって刺激される、細胞、好ましくは、免疫細胞の遊走を阻害し得る。ＣＸＣＲ３活性の低下又は阻害は、本明細書、特に実施例４に記載されるいずれかの方法によって決定され得る。
【0036】
本明細書に記載される抗原結合部位は、ＣＸＣＲ３に結合し得、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、及び／又はＣ５ａＲに検出可能に結合し得ず、又はそれらに実質的に結合し得ない。ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、及び／又はＣ５ａＲへの抗原結合部位の結合は、本明細書に記載されるいずれかの方法、特に実施例２に記載されるフローサイトメトリーによって決定され得る。
【0037】
本明細書に記載される抗原結合部位は、ＣＸＣＲ３に結合し得、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満又は０．５ｎＭ未満のＥＣ５０を示し得る。好ましくは、抗原結合部位のＥＣ５０は、約０．２ｎＭ以下である。好ましくは、ＥＣ５０は、本明細書、特に実施例２に記載されるフローサイトメトリー又はＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定される。
【0038】
本明細書に記載される抗原結合部位は、ＭＩＧ、ＩＴＡＣ及び／又はＩＰ１０との競合結合アッセイにおいて、約２０、１５、１２、１０、８、６、５、４、３、２、又は１ｎＭのＩＣ５０を示し得る。
【0039】
本明細書に記載される抗原結合部位は、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ以下の濃度で、ＣＸＣＲ３を発現する免疫細胞の遊走を阻害し得る。好ましくは、遊走アッセイは、本明細書に記載されるいずれかの方法、特に実施例４によって行われる。
【0040】
本明細書に記載される抗原結合部位は、ＣＸＣＲ３における第１及び／又は第２のＮ末端ループに結合し得る。例えば、抗原結合部位は、ＣＸＣＲ３タンパク質の残基１～２３（ヒトＣＸＣＲ３に従う番号付け）内のＣＸＣＲ３に結合し得る。好ましくは、本発明の抗原結合部位は、配列：ＭＶＬＥＶＳＤＨＱＶＬＮＤＡＥＶＡＡＬＬＥＮＦ（配列番号８）、又はその断片を含むペプチドに結合する。好ましくは、本発明の抗原結合部位は、残基２３に対してＣ末端であるＣＸＣＲ３の配列に結合しない。或いは、抗原結合部位は、ＣＸＣＲ３タンパク質の残基２３～４４（ヒトＣＸＣＲ３に従う番号付け）内のＣＸＣＲ３に結合し得る。好ましくは、本発明の抗原結合部位は、配列：ＦＳＳＳＹＤＹＧＥＮＥＳＤＳＣＣＴＳＰＰＣＰ（配列番号１０）、又はその断片を含むペプチドに結合する。
【0041】
本発明はまた、ＣＸＣＲ３のＮ末端領域に結合する抗原結合部位であって、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）及び／又はＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ）の、ＣＸＣＲ３への結合、又はＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）及び／又はＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ）に媒介される、ＣＸＣＲ３の活性を阻害する抗原結合部位を提供する。好ましくは、Ｎ末端領域は、残基１～２３（ヒトＣＸＣＲ３に従う番号付け）を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。好ましくは、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）及び／又はＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ）に媒介される活性は、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）及び／又はＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ）に媒介される、免疫細胞（例えば好中球）の走化性である。
【0042】
本明細書に記載されるように、抗原結合部位は、
（ｉ）一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ジ－ｓｃＦｖ）；
（ｉｉｉ）抗体の定常領域、Ｆｃ若しくは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／又はＣＨ３に連結された（ｉ）若しくは（ｉｉ）の１つ；又は
（ｉｖ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に連結された（ｉ）若しくは（ｉｉ）の１つ
の形態であり得る。
（ｉ）一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ジ－ｓｃＦｖ）；
（ｉｉｉ）抗体の定常領域、Ｆｃ若しくは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／又はＣＨ３に連結された（ｉ）若しくは（ｉｉ）の１つ；又は
（ｉｖ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に連結された（ｉ）若しくは（ｉｉ）の１つ
の形態であり得る。
【0043】
さらに、本明細書に記載されるように、抗原結合部位は、
（ｉ）ダイアボディ；
（ｉｉ）トリアボディ；
（ｉｉｉ）テトラボディ；
（ｉｖ）Ｆａｂ；
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２；
（ｖｉ）Ｆｖ；
（ｖｉｉ）抗体の定常領域、Ｆｃ若しくは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／又はＣＨ３に連結された（ｉ）～（ｖｉ）の１つ；又は
（ｖｉｉｉ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に連結された（ｉ）～（ｖｉ）の１つ
の形態であり得る。
（ｉ）ダイアボディ；
（ｉｉ）トリアボディ；
（ｉｉｉ）テトラボディ；
（ｉｖ）Ｆａｂ；
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２；
（ｖｉ）Ｆｖ；
（ｖｉｉ）抗体の定常領域、Ｆｃ若しくは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／又はＣＨ３に連結された（ｉ）～（ｖｉ）の１つ；又は
（ｖｉｉｉ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に連結された（ｉ）～（ｖｉ）の１つ
の形態であり得る。
【0044】
上記の抗原結合部位は、抗体の抗原結合ドメインと呼ばれることもある。
【0045】
好ましくは、本明細書に記載される抗原結合部位は、抗体又はその抗原結合断片である。典型的に、抗原結合部位は、抗体、例えば、モノクローナル抗体である。
【0046】
本明細書において使用される際、抗原結合部位は、可変ドメインであり得る。
【0047】
いずれかの態様又は実施形態において、抗体は、裸の抗体である。具体的には、抗体は、非コンジュゲート形態であり、コンジュゲートを形成するように構成されていない。
【0048】
ＣＸＣＲ３「に結合する」タンパク質又は抗体への本明細書における言及は、ＣＸＣＲ３「に特異的に結合する」又は「特異的に～に結合する」タンパク質又は抗体に文字通りの裏付け（literal support）を与える。
【0049】
本発明はまた、上記の抗体の抗原結合ドメイン又は抗原結合断片を提供する。
【0050】
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合部位、免疫グロブリン可変ドメイン、抗体、ｄａｂ（単一ドメイン抗体）、ジ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、又は多重特異性抗体を含む融合タンパク質を提供する。
【0051】
本発明はまた、標識又は細胞毒性剤にコンジュゲートされた、本明細書に記載される抗原結合部位、免疫グロブリン可変ドメイン、抗体、ｄａｂ、ジ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、又は多重特異性抗体又は融合タンパク質の形態のコンジュゲートを提供する。
【0052】
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合部位、免疫グロブリン可変ドメイン、抗体、ｄａｂ、ジ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、又は多重特異性抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートに結合するための抗体を提供する。
【0053】
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合部位、免疫グロブリン可変ドメイン、抗体、ｄａｂ、ジ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、又は多重特異性抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートをコードする核酸を提供する。
【0054】
一例において、このような核酸は、核酸がプロモーターに作動可能に連結された発現構築物に含まれる。このような発現構築物は、ベクター、例えば、プラスミドであり得る。
【0055】
単一ポリペプチド鎖抗原結合部位に関する本発明の例において、発現構築物は、ポリペプチド鎖をコードする核酸に連結されたプロモーターを含み得る。
【0056】
抗原結合部位を形成する複数のポリペプチド鎖に関する例において、発現構築物は、プロモーターに作動可能に連結された、例えば、ＶＨを含むポリペプチドをコードする核酸、及びプロモーターに作動可能に連結された、例えば、ＶＬを含むポリペプチドをコードする核酸を含む。
【0057】
別の例において、発現構築物は、例えば、５’－３’の順序で作動可能に連結された以下の構成要素：
（ｉ）プロモーター
（ｉｉ）第１のポリペプチドをコードする核酸；
（ｉｉｉ）内部リボソーム進入部位；及び
（ｉｖ）第２のポリペプチドをコードする核酸
を含む２シストロン性発現構築物であり、
ここで、第１のポリペプチドが、ＶＨを含み、第２のポリペプチドが、ＶＬを含み、又はその逆である。
（ｉ）プロモーター
（ｉｉ）第１のポリペプチドをコードする核酸；
（ｉｉｉ）内部リボソーム進入部位；及び
（ｉｖ）第２のポリペプチドをコードする核酸
を含む２シストロン性発現構築物であり、
ここで、第１のポリペプチドが、ＶＨを含み、第２のポリペプチドが、ＶＬを含み、又はその逆である。
【0058】
本発明はまた、一方がＶＨを含む第１のポリペプチドをコードし、他方がＶＬを含む第２のポリペプチドをコードする、別個の発現構築物を想定している。例えば、本発明はまた、
（ｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ＶＨを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第１の発現構築物；及び
（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ＶＬを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第２の発現構築物
を含む組成物を提供する。
（ｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ＶＨを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第１の発現構築物；及び
（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ＶＬを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第２の発現構築物
を含む組成物を提供する。
【0059】
本発明は、本明細書に記載されるベクター又は核酸を含む細胞を提供する。好ましくは、細胞は、単離されるか、実質的に精製されるか又は組み換え型である。一例において、細胞は、本発明の発現構築物又は：
（ｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ＶＨを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第１の発現構築物；及び
（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ＶＬを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第２の発現構築物
を含み、
ここで、第１及び第２のポリペプチドは会合して、本明細書に記載される抗原結合部位を形成する。
（ｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ＶＨを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第１の発現構築物；及び
（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ＶＬを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第２の発現構築物
を含み、
ここで、第１及び第２のポリペプチドは会合して、本明細書に記載される抗原結合部位を形成する。
【0060】
本発明の細胞の例としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞が挙げられる。
【0061】
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合部位を含むか、又はＣＤＲ及び／又はＦＲ配列、又は本明細書に記載される免疫グロブリン可変ドメイン、抗体、ｄａｂ（単一ドメイン抗体）、ジ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、又は多重特異性抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートと、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【0062】
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合部位を含むか、又はＣＤＲ及び／又はＦＲ配列、又は本明細書に記載される抗原結合部位、免疫グロブリン可変ドメイン、抗体、ｄａｂ、ジ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、又は多重特異性抗体、融合タンパク質又はコンジュゲート、希釈剤及び任意選択的に標識を含む診断用組成物を提供する。
【0063】
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合部位を含むか、又はＣＤＲ及び／又はＦＲ配列又は本明細書に記載される免疫グロブリン可変ドメイン、抗体、ｄａｂ、ジ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、又は多重特異性抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートを含むキット又は製品を提供する。
【0064】
本明細書に記載される抗原結合部位、タンパク質又は抗体は、ヒト定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、若しくはＩｇＧ３又はそれらの混合物などのＩｇＧ定常領域を含み得る。ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はタンパク質の場合、ＶＨは、重鎖定常領域に連結され得、ＶＬは、軽鎖定常領域に連結され得る。
【0065】
本発明のいずれかの態様において、抗原結合部位は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する強化された能力を有するように改変されたＦｃ領域を含む。好ましくは、ＡＤＣＣを誘導する強化された能力は、Ｆｃ受容体と相互作用するＦｃ領域におけるアミノ酸の突然変異、欠失又は修飾によって与えられる。好ましくは、突然変異、欠失又は修飾されるアミノ酸は、配列番号１（ここで、アラニンが１１８位である）に従い２３９、３３０、及び／又は３３２位に、又は２３９、３３０及び／又は３３２と同等の位置にある。好ましくは、アミノ酸は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅへと突然変異される。典型的に、Ｆｃは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。
【0066】
本発明のいずれかの態様において、抗原結合部位は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する低下した能力を有するように改変されていないＦｃ領域を含む。好ましくは、ここで、配列番号１（ここで、アラニンが１１８位である）に従い２３４、２３５、及び／又は３３１位に、又は２３４、２３５及び／又は３３１と同等の位置にあるアミノ酸はそれぞれ、Ｆ、Ｅ及び／又はＳではない。言い換えると、２３４位におけるアミノ酸はＦではなく、２３５位におけるアミノ酸はＥではなく、及び／又は３３１位におけるアミノ酸はＳではない。
【0067】
本発明のいずれかの態様において、抗原結合部位は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなるＦｃ領域を含まない。
【0068】
本明細書に記載される抗原結合部位の機能特性は、本発明の抗体に対して準用されるものと理解される。
【0069】
本明細書に記載される抗原結合部位は、精製されるか、実質的に精製されるか、単離されるか、及び／又は組み換え型であり得る。
【0070】
本明細書に記載される抗原結合部位は、本明細書に記載される抗原結合部位を発現するハイブリドーマを増殖させた培地から採取された上清の一部であり得る。
【0071】
別の態様において、本発明はまた、対象におけるＣＸＣＲ３＋細胞を枯渇させるための方法であって、有効量の、本明細書に記載される抗原結合部位を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0072】
本発明はまた、本明細書に記載されるベクター又は核酸分子を含む細胞を提供する。
【0073】
本発明はまた、本明細書に記載される細胞に由来する動物又は組織を提供する。
【0074】
本明細書において使用される際、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」という用語及びこの用語の活用形（例えば、「含む（comprising）」、「含む（comprises）」及び「含んでいた（comprised）」は、さらなる添加剤、構成要素、整数又は工程を除外するものではない。
【0075】
本発明のさらなる態様及び前の段落に記載される態様のさらなる実施形態は、例として及び添付の図面を参照して示される以下の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0076】
図面の簡単な説明
【図1】単回静脈内（ＩＶ）注射後のＣＸＣＲ３枯渇の長く持続する効果。枯渇性抗ＣＸＣＲ３抗体を、マウスに注射した。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＢ細胞を、注射の２４及び３６日後に定量した。結果は、枯渇性抗ＣＸＣＲ３抗体を用いた細胞の枯渇が長く持続することを示す。
【図2】抗ＣＸＣＲ３枯渇は、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋；ＦｏｘＰ３＋）数に大きく影響しない。枯渇性抗ＣＸＣＲ３ ｍＡｂ ｍＩｇＧ１（５ｍｇ／ｋｇ）又はｍ ＩｇＧ１アイソタイプ対照（５ｍｇ／ｋｇ）を、ＦｏｘＰ３－ＧＦＰレポーターマウスに静脈内（ＩＶ）注射した。４日後、ＣＤ４＋脾臓リンパ球集団を、Biolegend製の抗ｍＣＸＣＲ３を用いて分析した。それらのデータは、ＣＸＣＲｒ３＋ Ｔｒｅｇサブセットのみが枯渇されたが、比率ＣＤ４＋ ＦｏｘＰ３－／ＣＤ４＋ ＦｏｘＰ３＋は変化されないことを確認する。
【図3】皮膚移植片モデル。枯渇性抗ＣＸＣＲ３抗体Ｂａｌｂ／ｃからＣ５７ＢＬ／６への皮膚移植実験。枯渇性抗ＣＸＣＲ３抗体を投与されたマウスは、移植の２００日後に、寛容された同種移植皮膚のエビデンスを示す。
【図4】ＮＡＳＨにおけるＣＸＣＲ３＋細胞の標的化は、脂肪性肝炎及び線維症を改善する。枯渇性抗ＣＸＣＲ３ ｍＡｂは、マウスにおけるＮＡＳＨ発生を防ぎ、コラーゲン沈着（線維症）を減少させることが示された。
【図5】ＣＸＣＲ３＋細胞の枯渇は、ＮＡＳＨ発生を防ぐ。ＮＡＳＨを誘導するために、マウスをＭＣＤ食で飼育した。マウスにはまた、アイソタイプ対照；枯渇性抗ＣＸＣＲ３ ｍＡｂ又は非枯渇性抗ＣＸＣＲ３ ｍＡｂのいずれかを与えた。枯渇性抗体を与えたマウスのみが、ＮＡＳＨの発生を防がれた。
【図6】抗ＣＸＣＲ３ ｍＡｂは、ＮＫＴ細胞及び活性化肝内ＣＤ８ Ｔ細胞を枯渇させる。ＭＣＤ食は、ＣＤ８＋ ＣＸＣＲ３＋ Ｔ細胞の頻度を増加させ；ＭＣＤ食は、ＮＫＴ細胞の頻度を増加させ；ＮＫＴ細胞は、ＣＸＣＲ３＋であり、Ｆｃ改変抗ＣＸＣＲ３ ｍＡＢによる処理後に枯渇される。
【図7】抗ＣＸＣＲ３処理は、血清中のＡＬＴの放出及び肝臓中の単球の浸潤を減少させる。
【発明を実施するための形態】
【0077】
実施形態の詳細な説明
本明細書において開示され、定義される本発明は、記載されるか又は本文若しくは図面から明らかである個々の特徴の２つ以上の全ての代替的な組合せに及ぶことが理解されよう。これらの異なる組合せは全て、本発明の様々な代替的な態様を構成する。
本明細書において開示され、定義される本発明は、記載されるか又は本文若しくは図面から明らかである個々の特徴の２つ以上の全ての代替的な組合せに及ぶことが理解されよう。これらの異なる組合せは全て、本発明の様々な代替的な態様を構成する。
【0078】
本発明のさらなる態様及び前の段落に記載される態様のさらなる実施形態は、例として及び添付の図面を参照して示される以下の説明から明らかになるであろう。
【0079】
これより、本発明の特定の実施形態が詳細に言及される。本発明は、実施形態とともに記載されるが、本発明は、本発明をそれらの実施形態に限定しないことが意図されることが理解されよう。むしろ、本発明は、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替例、変更、及び均等物を包含することが意図される。
【0080】
本発明者らは、様々な疾患が、ＣＸＣＲ３に結合し、ＣＸＣＲ３を発現する細胞の枯渇を引き起こすか又は媒介する抗原結合部位を用いて治療され得ることを示した。結果として、本明細書に記載される方法は、限定はされないが、ＮＡＳＨを含む、ＣＸＣＲ３発現に関連する様々な疾患の予防又は治療に特に利用される。
【0081】
総論
本明細書全体を通して、特に記載されない限り、又は文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単一の工程、組成物、工程群又は組成物群への言及は、それらの工程、組成物、工程群又は組成物群の１つ及び複数（すなわち１つ以上）を包含すると理解されるものとする。したがって、本明細書において使用される際、単数形（「a」、「an」及び「the」）は、文脈上特に明記されない限り、複数の態様を含み、逆もまた同様である。例えば、「a」への言及は、１つ並びに２つ以上を含み；「an」への言及は、１つ並びに２つ以上を含み；「the」への言及は、１つ並びに２つ以上を含むなどである。
本明細書全体を通して、特に記載されない限り、又は文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単一の工程、組成物、工程群又は組成物群への言及は、それらの工程、組成物、工程群又は組成物群の１つ及び複数（すなわち１つ以上）を包含すると理解されるものとする。したがって、本明細書において使用される際、単数形（「a」、「an」及び「the」）は、文脈上特に明記されない限り、複数の態様を含み、逆もまた同様である。例えば、「a」への言及は、１つ並びに２つ以上を含み；「an」への言及は、１つ並びに２つ以上を含み；「the」への言及は、１つ並びに２つ以上を含むなどである。
【0082】
当業者は、本発明が、具体的に記載されるもの以外の変形及び変更を行うことが可能であることを理解するであろう。本発明が、全てのこのような変形及び変更を含むことが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書において言及されるか又は示される工程、特徴、組成物及び化合物の全てを、個々に又は集合的に含み、また、前記工程又は特徴のあらゆる組合せ又はいずれか２つ以上を含む。
【0083】
当業者は、本発明の実施において使用され得る、本明細書に記載されるものと類似の又は同等の多くの方法及び材料を認識するであろう。本発明は、記載される方法及び材料に決して限定されるものではない。
【0084】
本明細書において参照される特許及び刊行物は全て、全体が参照により援用される。
【0085】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施例によって範囲が限定されるものではなく、これらの実施例は、例示を意図したものに過ぎない。機能的に均等な生成物、組成物及び方法は、明らかに本発明の範囲内である。
【0086】
本明細書における本発明のいかなる実施例又は実施形態も、特に記載されない限り、本発明の他のいかなる実施例又は実施形態に対しても準用されると理解されるものとする。
【0087】
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学における）当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有すると理解されるものとする。
【0088】
特に示されない限り、本開示において用いられる組み換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的技術は、当業者に周知の標準的な手順である。このような技術は、J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984)、J.Sambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)、T.A.Brown（編），Essential Molecular Biology:A Practical Approach,Volumes 1 and 2,IRL Press(1991)、D.M.Glover and B.D.Hames（編）,DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes 1-4,IRL Press(1995 and 1996)、及びF.M.Ausubel et al.（編）,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience（1988、現在までの全ての改訂を含む）、Ed Harlow and David Lane（編）Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)、及びJ.E.coligan et al.（編）Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons（現在までの全ての改訂を含む）などの出典における文献全体を通して記載され、説明されている。
【0089】
本明細書における可変領域及びその部分、免疫グロブリン、抗体及びその断片の説明及び定義は、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987 and 1991、Bork et al.,J Mol.Biol.242,309-320,1994、Chothia and Lesk J.Mol Biol.196:901-917,1987、Chothia et al.Nature 342,877-883,1989及び／又はAl-Lazikani et al.,J Mol Biol 273,927-948,1997における説明によってさらに明らかになり得る。
【0090】
「及び／又は」、例えば、「Ｘ及び／又はＹ」という用語は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味するものと理解されるものとし、両方の意味又はいずれかの意味に対して明確な裏付けを与えると理解されるものとする。
【0091】
本明細書において使用される際、「に由来する」という用語は、指定された整数が特定の起源から得られ得るが、必ずしもその起源から直接得られるとは限らないことを示すと理解されるものとする。
【0092】
例えば、残基の範囲への本明細書における言及は、その端点を含むものと理解される。例えば、「アミノ酸５６～６５を含む領域」への言及は、その端点を含む方式で理解され、すなわち、この領域は、指定された配列中で５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４及び６５と番号付けされたアミノ酸の配列を含む。
【0093】
選択される定義
Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞を殺滅する細胞傷害性Ｔ細胞、並びに、他の免疫細胞の活性を調節するように作用する、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）及びサプレッサーＴ細胞と呼ばれる２つのクラスの制御性細胞を含むいくつかの主要なサブクラスに分類される。慢性感染の際、Ｔｈ細胞は、少なくとも３つの表現型的に及び機能的に異なるエフェクター集団、Ｔｈ１、Ｔｈ２及びＴｈ１７ Ｔ細胞になる。Ｔｈ１細胞は、一般的に、様々な細胞内病原体に対する細胞媒介性免疫応答に関連しているＩＦＮ－γ及びＩＬ－２を産生する一方、Ｔｈ２細胞は、細胞外蠕虫感染を制御するために重要な、ＩＬ－４、ＩＬ－５、及びＩＬ－１３などのサイトカインを産生する。Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ－１７のアイソフォームを産生し、Ｔｈ１７細胞は、粘膜関門を維持し、粘膜表面における病原体除去に寄与するのに重要な役割を果たす。
Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞を殺滅する細胞傷害性Ｔ細胞、並びに、他の免疫細胞の活性を調節するように作用する、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）及びサプレッサーＴ細胞と呼ばれる２つのクラスの制御性細胞を含むいくつかの主要なサブクラスに分類される。慢性感染の際、Ｔｈ細胞は、少なくとも３つの表現型的に及び機能的に異なるエフェクター集団、Ｔｈ１、Ｔｈ２及びＴｈ１７ Ｔ細胞になる。Ｔｈ１細胞は、一般的に、様々な細胞内病原体に対する細胞媒介性免疫応答に関連しているＩＦＮ－γ及びＩＬ－２を産生する一方、Ｔｈ２細胞は、細胞外蠕虫感染を制御するために重要な、ＩＬ－４、ＩＬ－５、及びＩＬ－１３などのサイトカインを産生する。Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ－１７のアイソフォームを産生し、Ｔｈ１７細胞は、粘膜関門を維持し、粘膜表面における病原体除去に寄与するのに重要な役割を果たす。
【0094】
Ｔｈ１細胞は、臓器特異的自己免疫疾患、遅延型過敏反応、及び移植拒絶反応に関連付けられている。さらに、ＩＬ－１２及びＩＬ－４などのサイトカインは、Ｔｈ１及びＴｈ２サブセットのそれぞれへのＴｈの分化の結果を決定するのに主要な役割を果たす。例えば、Ｔｈ１細胞において、ＩＬ－１２の、その同種受容体への結合の後、ＳＴＡＴ４が活性化され、それによって、ＩＦＮ－γの産生をもたらす。したがって、ＳＴＡＴ４欠損マウスは、Ｔｈ１分化に欠陥があり、リステリア菌（Listeria monocytogenes）などの細胞内病原体に応答しない。
【0095】
Ｔｈ１細胞は、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ１、及びＣＣＲ５などの様々なケモカイン受容体を発現する。一般に、ＣＸＣＲ３は、Ｔｈ１細胞の最良のマーカーの１つであると考えられるが、ＣＸＣＲ３は、ＮＫＴ細胞及び一部のＢ細胞、特に、炎症に関連している細胞によっても発現される（Qin et al J.Clin.Invest.1997）。
【0096】
ＣＸＣＲ３は、Ｇタンパク質共役受容体９（ＧＰＲ９）、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＫＲ－Ｌ２、ＣＭＫＡＲ３、ＧＰＲ９、ＩＰ１０－Ｒ、Ｍｉｇ－Ｒ、ＭｉｇＲ）としても知られている。ＣＸＣＲ３は、発現がＣＤｒ＋ １型ヘルパー（Ｔｈ１）及びＣＤ８＋細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）に関連している炎症性ケモカイン受容体である。エフェクターＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＣＸＣＲ３発現に加えて、ＣＸＣＲ３はまた、自然リンパ球、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＮＴ細胞、並びに形質細胞様ＤＣ及びＢ細胞のサブセットにおいて高度に発現される。
【0097】
ＣＸＣＲ３は、３つのケモカイン：ＣＸＣＬ９（ガンマインターフェロンによって誘導されるモノカイン、又はＭＩＧとしても知られている）、ＣＸＣＬ１０（１０ｋＤａのインターフェロン誘導性タンパク質、又はＩＰ－１０）及びＣＸＣＬ１１ Ｉ（インターフェロン誘導性Ｔ細胞α化学誘引物質、又はｌ－ＴＡＣ）に結合する。これらのリガンドへのＣＸＣＲ３の結合は、それ自体が炎症性サイトカインによって誘導され、細胞遊走を媒介し、それによって、末梢における炎症を調整する。
【0098】
エフェクター細胞におけるＣＸＣＲ３の発現、並びに細胞遊走及び炎症におけるその役割のため、細胞遊走及び／又は炎症を阻害するための改良された治療に対する必要性がある。例えば、移植後の移植片への活性化Ｔ細胞の遊走は、ドナーの臓器障害をもたらし、急性及び慢性拒絶反応の特徴である。多種多様な免疫抑制剤が利用可能であり、拒絶反応の発現を低減し、短期間及び長期間移植片生存の両方を改善するために、臨床において日常的に使用されている。しかしながら、それらの作用機序は、免疫系の完全な停止をもたらすことが多く、それらの使用は、曖昧な理解に依拠する。したがって、それらは、典型的に、日和見感染症、リンパ増殖性疾患又は心血管疾患などの副作用に関連している。したがって、移植寛容を誘導し、したがって高用量の連続的な免疫抑制剤の制限をなくすことが可能なより具体的な薬物の開発は、移植分野における大きな目標である。
【0099】
ＩＰ－１０及びＭＩＧは両方とも、ＣＸＣサブファミリーに属するが、好中球に対する強力な化学誘引物質であるＩＬ－８及び他のＣＸＣケモカインと対照的に、ＩＰ－１０及びＭＩＧの主要な標的は、リンパ球、特にエフェクター細胞、例えば活性化又は刺激されたＴリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一貫して、ＩＰ－１０及びＭＩＧは、好中球走化性を効率的に誘導するそれらのＣＸＣケモカインにおける不可欠な結合エピトープであるＥＬＲモチーフを欠いている。さらに、組み換えヒトＭＩＧ及び組み換えヒトＩＰ－１０は両方とも、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるカルシウム流出を誘導することが報告されている。ＩＰ－１０は、インビトロで単球の走化性を誘導することが報告されているが、関与している受容体は、同定されておらず、ヒトＭＩＧが、高度に選択的であるようであり、このような効果を示さない。ＩＰ－１０発現は、炎症性疾患、例えば乾癬、固定薬疹、皮膚の遅延型過敏反応、結核型らい、並びに実験糸球体腎炎、及び実験アレルギー性脳脊髄炎において、様々な組織中で誘導される。ＩＰ－１０はまた、Ｔ細胞依存性である強力なインビボ抗腫瘍効果を有し、インビボでの血管新生の阻害剤であることが報告されており、インビトロでのＮＫ細胞の走化性及び脱顆粒を誘導することができ、これは、ＮＫ細胞の動員及び脱顆粒（例えば腫瘍細胞の破壊における）のメディエーターとしての役割を示唆している。ＩＰ－１０及びＭＩＧの発現パターンはまた、それぞれの発現がインターフェロン－γ（ＩＦＮγ）によって誘導される一方、ＩＬ－８の発現がＩＦＮγによって下方制御される点で異なる。
【0100】
ケモカインは、リンパ球の動員のための長く探求されてきたメディエーターとして最近認識されている。いくつかのＣＸＣケモカインは、リンパ球走化性を引き起こすことが判明したが、それらは、顆粒球及び単球においても活性である。状況は、ＩＰ－１０及びＭＩＧについて異なり、これらは、活性化Ｔリンパ球及びＮＫ細胞を含むリンパ球に対するそれらの作用において選択的であり、多くの他のケモカインを認識せず、且つ発現の選択的なパターンを示す受容体であるＣＸＣＲ３に結合する。
【0101】
本明細書において使用される際、ＣＸＣＲ３への言及は、本明細書に記載されるＣＸＣＲ３の少なくとも１つの生化学的又は生物物理学的活性を有する分子を指す。本明細書において提供される「ＣＸＣＲ３」という用語は、ＣＸＣＲ３の活性（例えば、天然タンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以内の活性）を維持するＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）タンパク質の天然形態、ホモログ又は変異体のいずれかを含む。ある実施形態において、変異体又はホモログは、天然形態と比較して、配列全体又は配列の一部（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続するアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【0102】
単に命名のために過ぎず、限定はされないが、ヒトＣＸＣＲ３の例示的なアミノ酸配列は、配列番号７、並びに突然変異Ｒ２９２Ｑ及びＡ３６３Ｔをそれぞれ含む配列番号１０８及び１０９に記載される天然変異体を含む、少なくとも又は約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するその変異体である。例示的な非ヒトＣＸＣＲ３ポリペプチドとしては、限定はされないが、マウス（例えば配列番号５）、ラット（例えば配列番号８）、ブタ（例えば配列番号９）、ウシ（例えば配列番号１０）、アカゲザル（例えば配列番号１１）、及びイヌ（例えば配列番号１２）ＣＸＣＲ３、並びにそれに対する少なくとも又は約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ ９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するその変異体が挙げられる。
【0103】
「ＣＸＣＲ３活性を阻害する」という語句は、本発明の抗原結合部位が、限定はされないが、ＣＸＣＲ３へのリガンドの結合；リガンドに誘導されるＣＸＣＲ３の立体配座変化；ＣＸＣＲ３活性化；Ｇタンパク質活性化；ＣＸＣＲ３に媒介される細胞シグナル伝達；ＣＸＣＲ３に媒介される細胞遊走、炎症、腫瘍増殖、インビトロ若しくはインビボにおける血管形成若しくは転移応答；ＣＸＣＲ３に媒介される腫瘍細胞増殖；及び／又はＣＸＣＲ３に媒介されるリンパ球の動員を含む、ＣＸＣＲ３のいずれか１つ以上の活性を阻害又は低減することを意味すると理解される。
【0104】
「ＭＩＧ、ＩＰ－１０又はＩ－ＴＡＣに媒介されるＣＸＣＲ３活性を阻害する」は、本発明の抗原結合部位が、ＭＩＧ、ＩＰ－１０及び／又はＩ－ＴＡＣによって媒介又は誘導される上述される１つ以上の活性を阻害又は低減することを意味すると理解される。さらに、活性は、好適なインビトロ、細胞内又はインビボアッセイを用いて測定され、活性は、抗原結合部位がないことを除いて同じ条件下における同じアッセイにおけるＣＸＣＲ３活性と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２５％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％又はそれ以上、ブロック又は低減される。好ましくは、ＣＸＣＲ３活性は、いずれか１つ以上のリガンド、例えば、ＭＩＧ、ＩＰ－１０及びＩ－ＴＡＣによって媒介又は誘導される。
【0105】
本明細書において使用される際、ＣＸＣＲ３＋細胞（すなわち、ＣＸＣＲ３を発現する細胞、好ましくは細胞表面ＣＸＣＲ３を提示する細胞）に関する「枯渇」は、これらの細胞の活性の低下又は細胞の集団からのこれらの細胞の除去を指す。好ましくは、ＣＸＣＲ３＋細胞に関する枯渇は、細胞の集団からのこれらの細胞の除去又はこれらの細胞の生存率の低下を指す。枯渇への言及は、完全な又は部分的な枯渇を含む。さらに、枯渇は、永続的又は一時的であり得、大きさ及び／又は空間的に様々な程度であり得る。枯渇は、アポトーシス又は壊死などによる、細胞死の結果であり得る。好ましくは、細胞死は、ＡＤＣＣによって媒介される。或いは、本明細書に記載される抗原結合部位自体は、ＣＸＣＲ３＋細胞の活性又は生存率を低下させる能力をほとんど又は全く有さないことがあるが、それは、細胞の活性又は生存率を低下させる能力を有する化合物にコンジュゲート又は会合され得る。典型的に、ＣＸＣＲ３＋細胞の活性又は生存率を低下させる能力をほとんど又は全く有さない抗原結合部位は、細胞毒性化合物にコンジュゲート又は会合される。
【0106】
本発明の抗原結合部位、若しくは抗原結合断片への曝露の前及び後に、又は本発明の抗原結合部位若しくは抗原結合断片の非存在下及び存在下で、当該技術分野において公知の任意の方法（例えばフローサイトメトリー免疫組織化学など）を用いて集団中のＣＸＣＲ３＋細胞の数を測定することによって、枯渇を評価することができる。本発明の抗体又は抗原結合断片への曝露の後、ＣＸＣＲ３＋細胞は、少なくとも又は約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上枯渇され得る。ＣＸＣＲ３＋細胞に対する枯渇のための能力を有する抗原結合部位は、枯渇性抗原結合部位と呼ばれ得る。
【0107】
「単離されたタンパク質」又は「単離されたポリペプチド」という用語は、由来するその起源又は供給源のため、その天然状態でそれに伴う天然に会合している構成要素と会合しておらず；同じ供給源からの他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質又はポリペプチドである。タンパク質は、当該技術分野において公知のタンパク質精製技術を用いた単離によって、天然に会合している構成要素を実質的に含まない状態にされ、又はそのような単離によって実質的に精製され得る。「実質的に精製された」とは、タンパク質が、汚染物質を実質的に含まず、例えば、少なくとも約７０％又は７５％又は８０％又は８５％又は９０％又は９５％又は９６％又は９７％又は９８％又は９９％、汚染物質が除去されていることを意味する。
【0108】
「組み換え」という用語は、人工的な遺伝子組み換えの産物を意味すると理解されるものとする。したがって、抗体抗原結合ドメインを含む組み換えタンパク質に関して、この用語は、Ｂ細胞成熟中に生じる天然の組み換えの産物である対象の身体内に天然に存在する抗体を包含しない。しかしながら、このような抗体が単離される場合、それは、抗体抗原結合ドメインを含む単離されたタンパク質であると考えられる。同様に、タンパク質をコードする核酸が、組み換え手段を用いて、単離され、発現される場合、得られるタンパク質は、抗体抗原結合ドメインを含む組み換えタンパク質である。組み換えタンパク質はまた、それが細胞、組織又は対象内にあり、例えば、そこでそれが発現される場合、人工的な組み換え手段によって発現されるタンパク質を包含する。
【0109】
「タンパク質」という用語は、単一のポリペプチド鎖、すなわち、ペプチド結合によって連結された一連の連続するアミノ酸、又は互いに共有結合若しくは非共有結合された一連のポリペプチド鎖（すなわち、ポリペプチド複合体）を含むと理解されるものとする。例えば、一連のポリペプチド鎖は、好適な化学結合又はジスルフィド結合を用いて共有結合され得る。非共有結合の例としては、水素結合、イオン結合、ファン・デル・ワールス力、及び疎水性相互作用が挙げられる。
【0110】
「ポリペプチド」又は「ポリペプチド鎖」という用語は、ペプチド結合によって連結された一連の連続するアミノ酸を意味することが前の段落から理解されるであろう。
【0111】
本明細書において使用される際、「抗原結合部位」という用語は、「抗原結合ドメイン」と同義的に使用され、抗原、すなわち、ＶＨ若しくはＶＬ又はＶＨ及びＶＬの両方を含むＦｖに特異的に結合することが可能な抗体の領域を意味すると理解されるものとする。抗原結合ドメインは、完全抗体の文脈にある必要はなく、例えば、それは、単離されていても（例えば、ドメイン抗体）又は、例えば本明細書に記載されるようにｓｃＦｖなどの別の形態であってもよい。
【0112】
本開示の趣旨では、「抗体」という用語は、Ｆｖ中に含まれる抗原結合ドメインによって１つ又はいくつかの密接に関連する抗原（例えば、ＣＸＣＲ３）に特異的に結合することが可能なタンパク質を含む。この用語は、４鎖抗体（例えば、２つの軽鎖及び２つの重鎖）、組み換え又は修飾抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化（de-immunized）抗体、合成ヒト化（synhumanized）抗体、半抗体、二重特異性抗体）を含む。抗体は、一般に、定常領域又は定常断片又は結晶化可能断片（Ｆｃ）へと構成され得る定常ドメインを含む。抗体の例示的な形態は、それらの基本単位として４鎖構造を含む。完全長抗体は、共有結合された２つの重鎖（約５０～７０ｋＤ）及び２つの軽鎖（それぞれ約２３ｋＤａ）を含む。軽鎖は、一般に、可変領域（存在する場合）及び定常ドメインを含み、哺乳動物においては、κ軽鎖又はλ軽鎖のいずれかである。重鎖は、一般に、可変領域、及びさらなる定常ドメインにヒンジ領域によって連結された１つ又は２つの定常ドメインを含む。哺乳動物の重鎖は、以下のタイプα、δ、ε、γ、又はμのうちの１つのものである。各軽鎖はまた、重鎖の１つに共有結合される。例えば、２つの重鎖並びに重鎖及び軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合及び非共有相互作用によって結合される。鎖間ジスルフィド結合の数は、抗体のタイプの違いによって変化し得る。各鎖は、Ｎ末端可変領域（それぞれ約１１０アミノ酸長であるＶＨ又はＶＬ）、及びＣ末端に１つ以上の定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメイン（約１１０アミノ酸長であるＣＬ）は、重鎖の第１の定常ドメイン（３３０～４４０アミノ酸長であるＣＨ１）と整列され、ジスルフィド結合される。軽鎖可変領域は、重鎖の可変領域と整列される。抗体重鎖は、２つ以上のさらなるＣＨドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３など）を含むことができ、ＣＨ１及びＣＨ２定常ドメインの間にヒンジ領域を含み得る。抗体は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであり得る。一例において、抗体は、ネズミ科（マウス又はラット）抗体又は霊長類（ヒトなど）抗体である。一例において、抗体重鎖は、Ｃ末端リジン残基が欠落している。一例において、抗体は、ヒト化、合成ヒト化、キメラ、ＣＤＲグラフト化又は脱免疫化抗体である。
【0113】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」又は「完全抗体」という用語は、抗体の抗原結合断片と対照的に、その実質的にインタクトな形態の抗体を指すために、同義的に使用される。具体的には、完全抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものを含む。定常ドメインは、野生型配列定常ドメイン（例えば、ヒト野生型配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であり得る。
【0114】
本明細書において使用される際、「可変領域」は、抗原に特異的に結合することが可能な、本明細書において定義される抗体の軽鎖及び／又は重鎖の部分を指し、相補性決定領域（ＣＤＲ）；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む。例えば、可変領域は、３つのＣＤＲと一緒に３つ又は４つのＦＲ（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び任意選択的にＦＲ４）を含む。ＶＨは、重鎖の可変領域を指す。ＶＬは、軽鎖の可変領域を指す。
【0115】
本明細書において使用される際、「相補性決定領域」という用語（同義語はＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、その存在が特異的な抗原結合の主な原因になる、抗体可変領域のアミノ酸残基を指す。各可変領域ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）は、典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として同定される３つのＣＤＲを有する。ＶＨのＣＤＲはそれぞれ、本明細書において、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ３とも呼ばれ、ここで、ＣＤＲ Ｈ１が、ＶＨのＣＤＲ １に対応し、ＣＤＲ Ｈ２が、ＶＨのＣＤＲ ２に対応し、ＣＤＲ Ｈ３が、ＶＨのＣＤＲ ３に対応する。同様に、ＶＬのＣＤＲはそれぞれ、本明細書において、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２及びＣＤＲ Ｌ３と呼ばれ、ここで、ＣＤＲ Ｌ１が、ＶＬのＣＤＲ １に対応し、ＣＤＲ Ｌ２が、ＶＬのＣＤＲ ２に対応し、ＣＤＲ Ｌ３が、ＶＬのＣＤＲ ３に対応する。一例において、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987 and 1991（本明細書において「Kabat番号付け方式」とも呼ばれる）に従って定義される。別の例において、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、Enhanced Chothia Numbering Scheme（http://www.bioinfo.org.uk/mdex.html）に従って定義される。本発明は、Kabat番号付け方式によって定義されるＦＲ及びＣＤＲに限定されず、標準的な番号付け方式、又はChothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917,1987;Chothia et al.,Nature 342:877-883,1989;及び／又はAl-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.273:927-948,1997;Honnegher and Pluekthun J.Mol.Biol.309:657-670,2001の番号付け方式；又はGiudicelli et al.,Nucleic Acids Res.25:206-211 1997において説明されるＩＭＧＴ方式を含む、全ての番号付け方式を含む。一例において、ＣＤＲは、Kabat番号付け方式に従って定義される。任意選択的に、Kabat番号付け方式に従う重鎖ＣＤＲ２は、本明細書に列挙される５つのＣ末端アミノ酸を含まないか、又はそれらのアミノ酸のいずれか１つ以上が、別の天然アミノ酸で置換される。これに関して、Padlan et al.,FASEB J.,9:133-139,1995では、重鎖ＣＤＲ２の５つのＣ末端アミノ酸が一般に抗原結合に関与しないことが確立されている。
【0116】
「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変領域残基である。ＶＨのＦＲはそれぞれ、本明細書において、ＦＲ Ｈ１、ＦＲ Ｈ２、ＦＲ Ｈ３及びＦＲ Ｈ４とも呼ばれ、ここで、ＦＲ Ｈ１が、ＶＨのＦＲ １に対応し、ＦＲ Ｈ２が、ＶＨのＦＲ ２に対応し、ＦＲ Ｈ３が、ＶＨのＦＲ ３に対応し、ＦＲ Ｈ４が、ＶＨのＦＲ ４に対応する。同様に、ＶＬのＦＲはそれぞれ、本明細書において、ＦＲ Ｌ１、ＦＲ Ｌ２、ＦＲ Ｌ３及びＦＲ Ｌ４と呼ばれ、ここで、ＦＲ Ｌ１が、ＶＬのＦＲ １に対応し、ＦＲ Ｌ２が、ＶＬのＦＲ ２に対応し、ＦＲ Ｌ３が、ＶＬのＦＲ ３に対応し、ＦＲ Ｌ４が、ＶＬのＦＲ ４に対応する。
【0117】
本明細書において使用される際、「Ｆｖ」という用語は、複数のポリペプチドから構成されるか又は単一のポリペプチドから構成されるかにかかわらず、任意のタンパク質を意味すると理解されるものとし、ここで、ＶＬ及びＶＨが会合し、抗原結合ドメインを有する、すなわち、抗原に特異的に結合することが可能な複合体を形成する。抗原結合ドメインを形成するＶＨ及びＶＬは、単一のポリペプチド鎖又は異なるポリペプチド鎖中にあり得る。さらに、本発明のＦｖ（並びに本発明の任意のタンパク質）は、同じ抗原に結合し得るか又は結合し得ない複数の抗原結合ドメインを有し得る。この用語は、抗体に直接由来する断片並びに組み換え手段を用いて産生されるこのような断片に対応するタンパク質を包含すると理解されるものとする。いくつかの例において、ＶＨは、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）１に連結されず、及び／又はＶＬは、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に連結されない。例示的なＦｖを含むポリペプチド又はタンパク質としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ若しくはより高次の複合体、又は定常領域若しくはそのドメイン、例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインに連結された上記のもののいずれか、例えば、ミニボディが挙げられる。「Ｆａｂ断片」は、免疫グロブリンの一価の抗原結合断片からなり、酵素パパインにより完全抗体を消化して、インタクトな軽鎖及び重鎖の一部からなる断片を生じることによって産生され得、又は組み換え手段を用いて産生され得る。抗体の「Ｆａｂ’断片」は、完全抗体をペプシンで処理し、続いて還元して、インタクトな軽鎖及びＶＨを含む重鎖の一部及び単一の定常ドメインからなる分子を生じることによって得ることができる。２つのＦａｂ’断片は、このように処理される抗体ごとに得られる。Ｆａｂ’断片はまた、組み換え手段によって産生され得る。抗体の「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つのジスルフィド結合によって結合される２つのＦａｂ’断片の二量体からなり、その後の還元を伴わずに、完全抗体分子を酵素ペプシンで処理することによって得られる。「Ｆａｂ２」断片は、例えばロイシンジッパー又はＣＨ３ドメインを用いて連結された２つのＦａｂ断片を含む組み換え断片である。「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域が好適な可撓性のポリペプチドリンカーによって共有結合された、抗体の可変領域断片（Ｆｖ）を含む組み換え分子である。
【0118】
本明細書において使用される際、抗原結合部位又はその抗原結合ドメインと、抗原との相互作用に関する「結合する」という用語は、この相互作用が抗原における特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、抗体は、タンパク質一般ではなく、特定のタンパク質構造を認識し、それに結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に結合する場合、エピトープ「Ａ」（又は遊離した、非標識の「Ａ」）を含む分子の存在は、標識「Ａ」及びタンパク質を含む反応において、抗体に結合される標識「Ａ」の量を減少させる。
【0119】
本明細書において使用される際、「特異的に結合する（specifically binds）」又は「特異的に結合する（binds specifically）」という用語は、本明細書に記載される抗原結合部位が、特定の抗原又はそれを発現する細胞と、別の抗原又は細胞より、高い頻度で、より急速に、より長い期間及び／又はより高い親和性で反応又は会合することを意味すると理解されるものとする。例えば、抗原結合部位は、他のＣＸＣＲより実質的に高い親和性（例えば、１．５倍又は２倍又は５倍又は１０倍又は２０倍又は４０倍又は６０倍又は８０倍～１００倍又は１５０倍又は２００倍）でＣＸＣＲ３（例えば、ｈＣＸＣＲ３）に結合する。本発明の一例において、抗原結合部位は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２及び／又はＣ５ａＲなどの別のケモカイン受容体より、少なくとも１．５倍又は２倍以上高い親和性（例えば、５倍又は１０倍又は２０倍又は５０倍又は１００倍又は２００倍）でＣＸＣＲ３（好ましくはヒト）に「特異的に結合する」。一般に、必ずしもではないが、結合への言及は、特異的結合を意味し、各用語は、他の用語に対する明確な裏付けを与えると理解されるものとする。
【0120】
本明細書において使用される際、「検出可能に結合しない」という用語は、抗原結合部位、例えば、抗体が、バックグラウンドより１０％、又は８％又は６％又は５％未満高いレベルで候補抗原に結合することを意味すると理解されるものとする。バックグラウンドは、タンパク質の非存在下、及び／又は陰性対照タンパク質（例えば、アイソタイプ対照抗体）の存在下で検出される結合シグナルのレベル、及び／又は陰性対照抗原の存在下で検出される結合のレベルであり得る。結合のレベルは、抗原結合部位が固定され、抗原と接触されるバイオセンサー分析（例えばBiacore）を用いて検出される。
【0121】
本明細書において使用される際、「有意に結合しない」という用語は、ポリペプチドへの本明細書に記載される抗原結合部位の結合のレベルが、バックグラウンド、例えば、抗原結合部位の非存在下、及び／又は陰性対照タンパク質（例えば、アイソタイプ対照抗体）の存在下で検出される結合シグナルのレベル、及び／又は陰性対照ポリペプチドの存在下で検出される結合のレベルより統計的に有意に高くないことを意味すると理解されるものとする。結合のレベルは、抗原結合部位が固定され、抗原と接触されるバイオセンサー分析（例えばBiacore）を用いて検出される。
【0122】
本明細書において使用される際、「エピトープ」という用語（同義語は「抗原決定基」）は、抗体の抗原結合ドメインを含む抗原結合部位が結合する、ＣＸＣＲ３の領域を意味すると理解されるものとする。特に定義されない限り、この用語は、抗原結合部位が接触する特定の残基又は構造に必ずしも限定されるわけではない。例えば、この用語は、抗原結合部位によって接触されるアミノ酸にわたる領域、及びこの領域の外側の５～１０（若しくはそれ以上）又は２～５又は１～３アミノ酸を含む。いくつかの例において、エピトープは、抗原結合部位が折り畳まれるときに互いに近くに配置される一連の不連続なアミノ酸、すなわち、「立体配座エピトープ」を含む。当業者はまた、「エピトープ」という用語が、ペプチド又はポリペプチドに限定されないことを認識するであろう。例えば、「エピトープ」という用語は、糖側鎖、ホスホリル側鎖、又はスルホニル側鎖などの化学的に活性な表面基を含み、及び、特定の例において、特異的な三次元構造的特徴、及び／又は特異的な電荷特性を有し得る。
【0123】
本明細書において使用される際、「疾患」という用語は、正常な機能に対する破壊又は干渉を指し、何らかの特定の疾患に限定されず、疾病又は障害を含む。
【0124】
本明細書において使用される際、「予防すること」、「予防する」又は「予防」という用語は、本明細書に記載される抗原結合部位を投与し、それによって、疾患の少なくとも１つの症状の発生を停止するか又は妨げることを含む。この用語は、再発を予防するか又は妨げるための、寛解している対象の処置も包含する。
【0125】
本明細書において使用される際、「治療すること」、「治療する」又は「治療」という用語は、本明細書に記載される抗原結合部位を投与し、それによって、特定の疾病又は疾患の少なくとも１つの症状を低減又は除去することを含む。
【0126】
本明細書において使用される際、「対象」という用語は、ヒト、例えば哺乳動物を含む任意の動物を意味すると理解されるものとする。例示的な対象としては、限定はされないが、ヒト及び非ヒト霊長類が挙げられる。例えば、対象はヒトである。
【0127】
抗体
一例において、いずれかの実施例に従う本明細書に記載される抗原結合部位又はＣＸＣＲ３結合タンパク質は、抗体である。
一例において、いずれかの実施例に従う本明細書に記載される抗原結合部位又はＣＸＣＲ３結合タンパク質は、抗体である。
【0128】
抗ＣＸＣＲ３抗体：限定はされないが：１Ｃ６（抗ヒトＣＸＣＲ３）又はクローン１７３（抗マウスＣＸＣＲ３）を含む様々な抗ＣＸＣＲ３抗体が市販されており、これらの両方は、Biolegend、BDBiosciences、AbCam又は他の供給源から入手可能である。或いは、抗体は、国際公開第２０１８／１１９２９９号に記載される抗体であり得る。
【0129】
抗体を産生するための方法は、当該技術分野において公知であり、及び／又はHarlow and Lane（編）Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1988)に記載されている。一般に、このような方法において、ＣＸＣＲ３（例えば、ｈＣＸＣＲ３）若しくはその領域（例えば、細胞外領域）又は免疫原性断片若しくはそのエピトープ又はそれ（すなわち、免疫原）を発現及び提示する細胞は、任意選択的に、任意の好適な又は所望の担体、アジュバント、又は薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化され、非ヒト動物、例えば、マウス、ニワトリ、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギ又はブタに投与される。免疫原は、鼻腔内、筋肉内、皮下、静脈内、皮内、腹膜内、又は他の公知の経路によって投与され得る。
【0130】
ポリクローナル抗体の産生は、免疫後の様々な時点で免疫された動物の血液をサンプリングすることによってモニターされ得る。所望の抗体力価を得る必要がある場合、１つ以上のさらなる免疫化が行われ得る。追加免疫及び力価測定のプロセスは、好適な力価が得られるまで繰り返される。所望のレベルの免疫原性が得られたとき、免疫された動物から採血し、血清を単離及び貯蔵し、及び／又は動物を用いて、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生する。
【0131】
モノクローナル抗体は、本発明によって想定される抗体の１つの例示的な形態である。「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」という用語は、同じ抗原、例えば、抗原内の同じエピトープに結合することが可能な均一な抗体集団を指す。この用語は、抗体の起源又はそれが作製される方法に関して限定されるものではない。
【0132】
ｍＡｂの産生のために、例えば、上記の米国特許第４１９６２６５号又はHarlow and Lane(1988)において例示される手順などのいくつかの公知の技術のいずれか１つが使用され得る。
【0133】
例えば、好適な動物が、抗体産生細胞を刺激するのに十分な条件下で免疫原により免疫化される。ウサギ、マウス及びラットなどのげっ歯類が、例示的な動物である。例えば、ネズミ科の抗体を発現しない、ヒト抗体を発現するように遺伝子組み換えされたマウスを用いて、本発明の抗体を産生することもできる（例えば、国際公開第２００２／０６６６３０号に記載されるように）。
【0134】
免疫化の後、抗体を産生する能力を有する体細胞、特にＢリンパ球（Ｂ細胞）が、ｍＡｂ産生プロトコルに使用するために選択される。これらの細胞は、脾臓、へんとう腺若しくはリンパ節の生検から、又は末梢血試料から得られる。次に、免疫された動物からのＢ細胞は、一般に免疫原により免疫された動物と同じ種に由来する不死化骨髄腫細胞と融合される。
【0135】
組織培養培地中でヌクレオチドのデノボ合成を阻止する薬剤を含む選択的培地中での培養によって、ハイブリッドが増幅される。例示的な薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサート及びアザセリンである。
【0136】
増幅されたハイブリドーマは、例えば、フローサイトメトリー及び／又は免疫組織化学及び／又はイムノアッセイ（例えばラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドットイムノアッセイなど）によって、抗体特異性及び／又は力価についての機能的選択に供される。
【0137】
或いは、ＭＡｂを分泌する細胞株を産生するため、ABL-MYC技術（NeoClone,Madison WI 53713,USA）が使用される（例えば、Largaespada et al,J.Immunol.Methods.197:85-95,1996に記載されるように）。
【0138】
抗体はまた、例えば、米国特許第６３０００６４号及び／又は米国特許第５８８５７９３号に記載されるように、ディスプレイライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって産生又は単離され得る。例えば、本発明者らは、ファージディスプレイライブラリーから完全ヒト抗体を単離した。
【0139】
本発明の抗体は、合成抗体であり得る。例えば、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、合成ヒト化抗体、霊長類化抗体又は脱免疫化抗体である。
【0140】
抗体結合ドメインを含むタンパク質
単一ドメイン抗体
いくつかの例において、本発明のタンパク質は、単一ドメイン抗体（「ドメイン抗体」又は「ｄＡｂ」という用語と同義的に使用される）であるか又はそれを含む。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変領域の全て又は一部を含む単一のポリペプチド鎖である。特定の例において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis,Inc.,Waltham,MA；例えば、米国特許第６２４８５１６号を参照）。
単一ドメイン抗体
いくつかの例において、本発明のタンパク質は、単一ドメイン抗体（「ドメイン抗体」又は「ｄＡｂ」という用語と同義的に使用される）であるか又はそれを含む。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変領域の全て又は一部を含む単一のポリペプチド鎖である。特定の例において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis,Inc.,Waltham,MA；例えば、米国特許第６２４８５１６号を参照）。
【0141】
ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ
いくつかの例において、本発明のタンパク質は、国際公開第９８／０４４００１号及び／又は国際公開第９４／００７９２１号に記載されるものなどのダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又はより高次のタンパク質複合体であるか又はそれを含む。
いくつかの例において、本発明のタンパク質は、国際公開第９８／０４４００１号及び／又は国際公開第９４／００７９２１号に記載されるものなどのダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又はより高次のタンパク質複合体であるか又はそれを含む。
【0142】
例えば、ダイアボディは、２つの会合するポリペプチド鎖を含むタンパク質であり、各ポリペプチド鎖が構造ＶＬ－Ｘ－ＶＨ又はＶＨ－Ｘ－ＶＬを含み、ここで、ＶＬが、抗体軽鎖可変領域であり、ＶＨが、抗体重鎖可変領域であり、Ｘが、単一のポリペプチド鎖中のＶＨ及びＶＬを会合させる（又はＦｖを形成させる）のに不十分な残基を含むリンカーであるか、又は存在せず、１つのポリペプチド鎖のＶＨが他のポリペプチド鎖のＶＬに結合して、抗原結合ドメインを形成する、すなわち、１つ以上の抗原に特異的に結合することが可能なＦｖ分子を形成する。ＶＬ及びＶＨは、各ポリペプチド鎖中で同じであり得、又はＶＬ及びＶＨは、各ポリペプチド鎖中で異なり得、それによって、二重特異性ダイアボディ（すなわち、異なる特異性を有する２つのＦｖを含む）を形成し得る。
【0143】
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）
当業者は、ｓｃＦｖが、単一のポリペプチド鎖におけるＶＨ及びＶＬ領域、並びにｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成する（すなわち、単一のポリペプチド鎖のＶＨ及びＶＬが互いに会合して、Ｆｖを形成する）のを可能にするＶＨ及びＶＬの間のポリペプチドリンカーを含むことを認識するであろう。例えば、リンカーは、１２を超えるアミノ酸残基を含み、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３が、ｓｃＦｖのためのより好ましいリンカーの１つである。
当業者は、ｓｃＦｖが、単一のポリペプチド鎖におけるＶＨ及びＶＬ領域、並びにｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成する（すなわち、単一のポリペプチド鎖のＶＨ及びＶＬが互いに会合して、Ｆｖを形成する）のを可能にするＶＨ及びＶＬの間のポリペプチドリンカーを含むことを認識するであろう。例えば、リンカーは、１２を超えるアミノ酸残基を含み、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３が、ｓｃＦｖのためのより好ましいリンカーの１つである。
【0144】
本発明はまた、ジスルフィド安定化Ｆｖ（又はｄｉＦｖ若しくはｄｓＦｖ）を想定しており、ここで、単一のシステイン残基が、ＶＨのＦＲ及びＶＬのＦＲに導入され、このシステイン残基はジスルフィド結合によって連結されて、安定なＦｖが生じる。
【0145】
或いは、又はそれに加えて、本発明は、二量体ｓｃＦｖ、すなわち、例えば、ロイシンジッパードメイン（例えば、Ｆｏｓ又はＪｕｎに由来する）によって、非共有結合又は共有結合によって連結された２つのｓｃＦｖ分子を含むタンパク質を包含する。或いは、例えば、米国特許出願公開第２００６０２６３３６７号に記載されるように、２つのｓｃＦｖは、両方のｓｃＦｖが抗原を形成し、抗原に結合することを可能にするのに十分な長さのペプチドリンカーによって連結される。
【0146】
重鎖抗体
重鎖抗体は、それらが重鎖を含むが軽鎖を含まない限り、多くの他の形態の抗体と構造的に異なる。したがって、これらの抗体は、「重鎖のみの抗体」とも呼ばれる。重鎖抗体は、例えば、ラクダ科動物及び軟骨魚類（ＩｇＮＡＲとも呼ばれる）中に見られる。
重鎖抗体は、それらが重鎖を含むが軽鎖を含まない限り、多くの他の形態の抗体と構造的に異なる。したがって、これらの抗体は、「重鎖のみの抗体」とも呼ばれる。重鎖抗体は、例えば、ラクダ科動物及び軟骨魚類（ＩｇＮＡＲとも呼ばれる）中に見られる。
【0147】
従来の４鎖抗体中に存在する重鎖可変領域（「ＶＨドメイン」と呼ばれる）及び従来の４鎖抗体中に存在する軽鎖可変領域（「ＶＬドメイン」と呼ばれる）と区別するために、天然重鎖抗体中に存在する可変領域は、一般に、ラクダ科動物抗体において「ＶＨＨドメイン」及びＩｇＮＡＲにおいてＶ－ＮＡＲと呼ばれる。
【0148】
ラクダ科動物由来の重鎖抗体及びその可変領域、並びにそれらの産生及び／又は単離及び／又は使用のための方法の一般的な説明は、特に、以下の参照文献、国際公開第９４／０４６７８号、国際公開第９７／４９８０５号及び国際公開第９７／４９８０５号に見出される。
【0149】
軟骨魚類由来の重鎖抗体及びその可変領域、並びにそれらの産生及び／又は単離及び／又は使用のための方法の一般的な説明は、特に、国際公開第２００５／１１８６２９号に見出される。
【0150】
他の抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質
本発明はまた、
（ｉ）米国特許第５７３１１６８号に記載される「キー・アンド・ホール（key and hole）」二重特異性タンパク質；
（ｉｉ）ヘテロコンジュゲートタンパク質（例えば、米国特許第４６７６９８０号に記載される）；
（ｉｉｉ）化学架橋剤を用いて産生されるヘテロコンジュゲートタンパク質（例えば、米国特許第４６７６９８０号に記載される）；及び
（ｉｖ）Ｆａｂ３（例えば、ＥＰ１９９３０３０２８９４号に記載される）
などの、他の抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質を想定している。
本発明はまた、
（ｉ）米国特許第５７３１１６８号に記載される「キー・アンド・ホール（key and hole）」二重特異性タンパク質；
（ｉｉ）ヘテロコンジュゲートタンパク質（例えば、米国特許第４６７６９８０号に記載される）；
（ｉｉｉ）化学架橋剤を用いて産生されるヘテロコンジュゲートタンパク質（例えば、米国特許第４６７６９８０号に記載される）；及び
（ｉｖ）Ｆａｂ３（例えば、ＥＰ１９９３０３０２８９４号に記載される）
などの、他の抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質を想定している。
【0151】
タンパク質に対する突然変異
核酸又はポリペプチドの同一性％は、ギャップ作成ペナルティ＝５、及びギャップ伸張ペナルティ＝０．３を有するＧＡＰ（Needleman and Wunsch.Mol.Biol.48,443-453,1970）分析（ＧＣＧプログラム）によって決定される。クエリー配列は、少なくとも５０残基長であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも５０残基の領域にわたって２つの配列をアラインする。例えば、クエリー配列は、少なくとも１００残基長であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１００残基の領域にわたって２つの配列をアラインする。例えば、２つの配列は、それらの全長にわたってアラインされる。
核酸又はポリペプチドの同一性％は、ギャップ作成ペナルティ＝５、及びギャップ伸張ペナルティ＝０．３を有するＧＡＰ（Needleman and Wunsch.Mol.Biol.48,443-453,1970）分析（ＧＣＧプログラム）によって決定される。クエリー配列は、少なくとも５０残基長であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも５０残基の領域にわたって２つの配列をアラインする。例えば、クエリー配列は、少なくとも１００残基長であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１００残基の領域にわたって２つの配列をアラインする。例えば、２つの配列は、それらの全長にわたってアラインされる。
【0152】
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合部位をコードする核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸を想定している。「中程度のストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄が、２×ＳＳＣ緩衝液中、０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ中、４５℃～６５℃の範囲の温度で、又は同等の条件で行われるものと本明細書において定義される。「高いストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄が、０．１×ＳＳＣ緩衝液、０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ中、又はより低い塩濃度で、及び少なくとも６５℃の温度で、又は同等の条件で行われるものと本明細書において定義される。特定のレベルのストリンジェンシーへの本明細書における言及は、当業者に公知のＳＳＣ以外の洗浄／ハイブリダイゼーション溶液を使用する同等の条件を包含する。例えば、二本鎖核酸の鎖が解離する温度（溶融温度、又はＴｍとしても知られている）を計算するための方法は、当該技術分野において公知である。核酸のＴｍと同様（例えば、５℃以内又は１０℃以内）又は等しい温度は、高いストリンジェンシーと考えられる。中程度のストリンジェンシーは、核酸の算出Ｔｍの１０℃～２０℃又は１０℃～１５℃以内であると考えられるべきである。
【0153】
本発明はまた、本明細書に記載される配列と比較して１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む本明細書に記載される抗原結合部位の突然変異形態を想定している。いくつかの例において、抗原結合部位は、１０以下、例えば、９又は８又は７又は６又は５又は４又は３又は２又は１つの保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖及び／又はハイドロパシー（hydropathicity）及び／又は親水性を有するアミノ酸残基で置換されたものである。
【0154】
類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において規定されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。ハイドロパシーインデックスは、例えば、Kyte and Doolittle J.Mol.Biol.,157:105-132,1982に記載され、親水性インデックスは、例えば、米国特許第４５５４１０１号に記載されている。
【0155】
本発明はまた、非保存的アミノ酸変異を想定している。例えば、荷電アミノ酸の、別の荷電アミノ酸による置換、及び中性又は正荷電アミノ酸による置換が特に興味深い。いくつかの例において、抗原結合部位は、１０以下、例えば、９又は８又は７又は６又は５又は４又は３又は２又は１つの非保存的アミノ酸置換を含む。
【0156】
一例において、突然変異は、本明細書に記載される抗原結合部位の抗原結合ドメインのＦＲ内で生じる。別の例において、突然変異は、本明細書に記載される抗原結合部位のＣＤＲ内で生じる。
【0157】
抗原結合部位の突然変異形態を産生するための例示的な方法としては、以下のものが挙げられる：
・ＤＮＡの突然変異誘発（Thie et al.,Methods Mol.Biol.525:309-322,2009）又はＲＮＡ（Kopsidas et al.,Immunol.Lett.107:163-168,2006;Kopsidas et al.BMC Biotechnology,7:18,2007；及び国際公開第１９９９／０５８６６１号）；
・ポリペプチドをコードする核酸の、突然変異誘発細胞への導入、例えば、ＸＬ－１Ｒｅｄ、ＸＬ－ｍｕｔＳ及びＸＬ－ｍｕｔＳ－Ｋａｎｒ細菌細胞（Stratagene）；
・ＤＮＡシャッフリング（例えば、Stemmer,Nature 370:389-91,1994に開示される）；並びに
・部位特異的突然変異誘発（例えば、Dieffenbach(ed)and Dveksler(ed)(PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,NY,1995)に記載される）。
・ＤＮＡの突然変異誘発（Thie et al.,Methods Mol.Biol.525:309-322,2009）又はＲＮＡ（Kopsidas et al.,Immunol.Lett.107:163-168,2006;Kopsidas et al.BMC Biotechnology,7:18,2007；及び国際公開第１９９９／０５８６６１号）；
・ポリペプチドをコードする核酸の、突然変異誘発細胞への導入、例えば、ＸＬ－１Ｒｅｄ、ＸＬ－ｍｕｔＳ及びＸＬ－ｍｕｔＳ－Ｋａｎｒ細菌細胞（Stratagene）；
・ＤＮＡシャッフリング（例えば、Stemmer,Nature 370:389-91,1994に開示される）；並びに
・部位特異的突然変異誘発（例えば、Dieffenbach(ed)and Dveksler(ed)(PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,NY,1995)に記載される）。
【0158】
本明細書に記載される突然変異体抗原結合部位の生物学的活性を決定するための例示的な方法は、当業者に明らかであり、及び／又は、例えば、抗原結合について本明細書に記載される。例えば、抗原結合、結合の競合阻害、親和性、会合、解離及び治療効果を決定するための方法は、本明細書に記載される。
【0159】
定常領域
本発明は、抗体の定常領域を含む、本明細書に記載される抗原結合部位及び／又は抗体を包含する。これは、Ｆｃに融合された抗体の抗原結合断片を含む。
本発明は、抗体の定常領域を含む、本明細書に記載される抗原結合部位及び／又は抗体を包含する。これは、Ｆｃに融合された抗体の抗原結合断片を含む。
【0160】
本発明のタンパク質を産生するのに有用な定常領域の配列は、いくつかの異なる供給源から入手され得る。いくつかの例において、タンパク質の定常領域又はその部分は、ヒト抗体に由来する。定常領域又はその部分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥ、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３を含む任意の抗体アイソタイプを含む任意の抗体クラスに由来し得る。
【0161】
一例において、定常領域のＦｃ領域は、例えば、天然又は野生型ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３ Ｆｃ領域と比較して、エフェクター機能を誘導する強化された能力を有する。一例において、エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である。タンパク質を含むＦｃ領域のエフェクター機能のレベルを評価するための方法が、当該技術分野において公知であり、及び／又は本明細書に記載されている。
【0162】
本発明のいずれかの態様において、抗原結合部位は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する強化された能力を有するように改変されたＦｃ領域を含む。好ましくは、ＡＤＣＣを誘導する強化された能力は、Ｆｃ受容体と相互作用するＦｃ領域におけるアミノ酸の突然変異、欠失又は修飾によって与えられる。好ましくは、突然変異、欠失又は修飾されるアミノ酸は、配列番号１（ここで、アラニンが１１８位である）に従い２３９、３３０、及び／又は３３２位に、又は２３９、３３０及び／又は３３２と同等の位置にある。好ましくは、アミノ酸は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅへと突然変異される。典型的に、Ｆｃは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。
【0163】
本発明のいずれかの態様において、抗原結合部位は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する低下した能力を有するように改変されていないＦｃ領域を含む。好ましくは、ここで、配列番号１（ここで、アラニンが１１８位である）に従い２３４、２３５、及び／又は３３１位に、又は２３４、２３５及び／又は３３１と同等の位置にあるアミノ酸はそれぞれ、Ｆ、Ｅ及び／又はＳではない。言い換えると、２３４位におけるアミノ酸はＦではなく、２３５位におけるアミノ酸はＥではなく、及び／又は３３１位におけるアミノ酸はＳではない。
【0164】
本発明のいずれかの態様において、抗原結合部位は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなるＦｃ領域を含まない。
【0165】
本発明のいずれかの態様において、本明細書に記載される抗原結合部位自体は、ＣＸＣＲ３＋細胞の活性又は生存率を低下させる能力をほとんど又は全く有さないことがあるが、それは、細胞の活性又は生存率を低下させる能力を有する化合物にコンジュゲート又は会合され得る。例えば、Ｆｃ領域は、例えば、天然又は野生型ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３ Ｆｃ領域と比較して、エフェクター機能を誘導する低下した能力又は機能を有し得るが、この状況において、抗原結合部位は、細胞毒性化合物にコンジュゲート又は会合される。
【0166】
低下したエフェクター機能を有するＦｃ領域の一例は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域（すなわち、ＩｇＧ４定常領域由来）、例えば、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。好適なＩｇＧ４ Ｆｃ領域の配列は、当業者に明らかであり、及び／又は一般公開されているデータベースにおいて入手可能である（例えば、アメリカ国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）から入手可能である）。
【0167】
別の例において、Ｆｃ領域は、低下したエフェクター機能を有するように修飾された領域、すなわち、「非免疫刺激性Ｆｃ領域」である。例えば、Ｆｃ領域は、２６８、３０９、３３０及び３３１からなる群から選択される１つ以上の位置に置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。別の例において、Ｆｃ領域は、以下の変異Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａの１つ以上、及びＧ２３６の欠失、及び／又は以下の変異Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓの１つ以上を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域である（Armour et al.,Eur J Immunol.29:2613-2624,1999;Shields et al.,J Biol Chem.276(9):6591-604,2001）。非免疫刺激性Ｆｃ領域のさらなる例が、例えば、Dall’Acqua et al.,J Immunol.177 :1129-1138 2006;及び／又はHezareh J Virol;75:12161-12168,2001）に記載されている。
【0168】
別の例において、Ｆｃ領域は、例えば、ＩｇＧ４抗体由来の少なくとも１つのＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ１抗体由来の少なくとも１つのＣＨ３ドメインを含むキメラＦｃ領域であり、ここで、Ｆｃ領域は、２４０、２６２、２６４、２６６、２９７、２９９、３０７、３０９、３２３、３９９、４０９及び４２７（ＥＵ番号付け）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置に置換を含む（例えば、国際公開第２０１０／０８５６８２号に記載される）。例示的な置換としては、２４０Ｆ、２６２Ｌ、２６４Ｔ、２６６Ｆ、２９７Ｑ、２９９Ａ、２９９Ｋ、３０７Ｐ、３０９Ｋ、３０９Ｍ、３０９Ｐ、３２３Ｆ、３９９Ｓ、及び４２７Ｆが挙げられる。
【0169】
これらの例のいずれかにおいて、低下したエフェクター機能を有する抗原結合部位は、細胞の活性又は生存率を低下させ得る化合物にコンジュゲート又は会合される。
【0170】
さらなる修飾
本発明はまた、Ｆｃ領域又は定常領域を含む抗体又は抗原結合部位へのさらなる修飾を想定している。
本発明はまた、Ｆｃ領域又は定常領域を含む抗体又は抗原結合部位へのさらなる修飾を想定している。
【0171】
例えば、抗体は、タンパク質の半減期を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、抗体は、新生児Ｆｃ領域（ＦｃＲｎ）に対するＦｃ領域の親和性を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含むＦｃ領域を含む。例えば、Ｆｃ領域は、より低いｐＨ、例えば、約ｐＨ６．０においてＦｃＲｎに対する増加した親和性を有し、それにより、エンドソームにおけるＦｃ／ＦｃＲｎ結合を促進する。一例において、Ｆｃ領域は、約ｐＨ７．４におけるその親和性と比較して、約ｐＨ６においてＦｃＲｎに対する増加した親和性を有し、それにより、細胞のリサイクリング後の血液中へのＦｃの再放出を促進する。これらのアミノ酸置換は、血液からのクリアランスを減少させることによって、タンパク質の半減期を延長するのに有用である。
【0172】
例示的なアミノ酸置換としては、ＥＵ番号付け方式に従って、Ｔ２５０Ｑ及び／又はＭ４２８Ｌ又はＴ２５２Ａ、Ｔ２５４Ｓ及びＴ２６６Ｆ又はＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ又はＨ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆを含む。さらなる又は代替的なアミノ酸置換は、例えば、米国特許出願公開第２００７０１３５６２０号又は米国特許第７０８３７８４号に記載されている。
【0173】
タンパク質の産生
一例において、いずれかの実施例に従う本明細書に記載される抗原結合部位は、例えば、本明細書に記載され、及び／又は当該技術分野において公知であるように、タンパク質を産生するのに十分な条件下でハイブリドーマを培養することによって産生される。
一例において、いずれかの実施例に従う本明細書に記載される抗原結合部位は、例えば、本明細書に記載され、及び／又は当該技術分野において公知であるように、タンパク質を産生するのに十分な条件下でハイブリドーマを培養することによって産生される。
【0174】
組み換え発現
別の例において、いずれかの実施例に従う本明細書に記載される抗原結合部位は、組み換え型である。
別の例において、いずれかの実施例に従う本明細書に記載される抗原結合部位は、組み換え型である。
【0175】
組み換えタンパク質の場合、それをコードする核酸が、発現構築物又はベクターへとクローニングされ得、次に、それが、タンパク質を本来産生しない宿主細胞、例えば大腸菌（E.coli）細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞、例えばシミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、又は骨髄腫細胞へとトランスフェクトされる。タンパク質を発現するために使用される例示的な細胞は、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞又はＨＥＫ細胞である。これらの目的を達成する分子クローニング技術は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ausubel et al.,（編）,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates及びWiley-Interscience（1988、現在までの全ての改訂を含む）又はSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)に記載されている。多種多様なクローニング及びインビトロ増幅方法が、組み換え核酸の構築に好適である。組み換え抗体を産生する方法も、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第４８１６５６７号又は米国特許第５５３０１０１号を参照されたい。
【0176】
単離の後、核酸は、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は無細胞系若しくは細胞内における発現のために、発現構築物におけるプロモーター又は発現ベクターに作動可能に連結されて挿入される。
【0177】
本明細書において使用される際、「プロモーター」という用語は、その最も広義に解釈されるべきであり、ＴＡＴＡボックス又は開始要素を含むゲノム遺伝子の転写調節配列を含み、それは、例えば、発生及び／又は外部刺激に応答して、又は組織特異的に、核酸の発現を変化させるさらなる調節要素（例えば、上流側活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー及びサイレンサー）を伴うか又は伴わずに、正確な転写開始のために必要とされる。本明細書の文脈において、「プロモーター」という用語はまた、それが作動可能に連結された核酸の発現を付与し、活性化し、若しくは強化する、組み換え、合成若しくは融合核酸、又はその誘導体を表すために使用される。例示的なプロモーターは、さらに発現を強化し、及び／又は前記核酸の空間的発現及び／又は時間的発現を変化させるために、１つ以上の特異的な調節要素のさらなるコピーを含有し得る。
【0178】
本明細書において使用される際、「作動可能に連結された」という用語は、核酸の発現がプロモーターによって制御されるように、核酸に対してプロモーターを配置することを意味する。
【0179】
細胞における発現のための多くのベクターが利用可能である。ベクターの構成要素は、一般に、限定はされないが、以下のものの１つ以上を含む：シグナル配列、タンパク質をコードする配列（例えば、本明細書において提供される情報から得られる）、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列。当業者は、タンパク質の発現に好適な配列を認識するであろう。例示的なシグナル配列としては、原核生物の分泌シグナル（例えば、ｐｅｌＢ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、又は耐熱性エンテロトキシンＩＩ）、酵母の分泌シグナル（例えば、インベルターゼリーダー、α因子リーダー、又は酸ホスファターゼリーダー）又は哺乳動物分泌シグナル（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）が挙げられる。
【0180】
哺乳動物細胞において活性な例示的なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ－ＩＥ）、ヒト伸長因子１－αプロモーター（ＥＦ１）、核内低分子ＲＮＡプロモーター（Ｕ１ａ及びＵ１ｂ）、α－ミオシン重鎖プロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）、アデノウイルス主要後期プロモーター、β－アクチンプロモーター；ＣＭＶエンハンサー／β－アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター又はその活性断片を含むハイブリッド調節要素が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓細胞株（２９３細胞又は懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である。
【0181】
例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）及びＳ．ポンベ（S.pombe）を含む群から選択される酵母細胞などの酵母細胞における発現に好適な典型的なプロモーターとしては、限定はされないが、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ｎｍｔプロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、又はＴＥＦ１プロモーターが挙げられる。
【0182】
単離された核酸又はそれを含む発現構築物を、発現のために細胞に導入するための手段は、当業者に公知である。所与の細胞に使用される技術は、公知の確立された技術に依存する。組み換えＤＮＡを細胞に導入するための手段としては、特に、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ－デキストランによって媒介されるトランスフェクション、リポフェクタミン（Gibco,MD,USA）及び／又はセルフェクチン（cellfectin）（Gibco,MD,USA）などを用いてリポソームによって媒介されるトランスフェクション、ＰＥＧに媒介されるＤＮＡ取込み、エレクトロポレーション及びＤＮＡ被覆タングステン又は金粒子（Agracetus Inc.,WI,USA）などを用いた微小粒子衝撃が挙げられる。
【0183】
タンパク質を産生するのに使用される宿主細胞は、使用される細胞のタイプに応じて、様々な培地で培養され得る。Ham’s Fl0（Sigma）、最小必須培地（（MEM）、（Sigma）、RPMI-1640（Sigma）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（DMEM）、Sigma）などの市販の培地が、哺乳動物細胞を培養するのに好適である。本明細書に記載される他の細胞タイプを培養するための培地は、当該技術分野において公知である。
【0184】
タンパク質の単離
タンパク質を単離するための方法が、当該技術分野において公知であり、及び／又は本明細書に記載されている。
タンパク質を単離するための方法が、当該技術分野において公知であり、及び／又は本明細書に記載されている。
【0185】
抗原結合部位が、培養培地に分泌される場合、このような発現系からの上清は、まず、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えば、Amicon又はMillipore Pellicon限外ろ過ユニットを用いて濃縮される。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために上記の工程のいずれかに含まれてもよく、抗生物質は、付随的な汚染物質の増殖を防止するために含まれてもよい。或いは、又はそれに加えて、上清は、例えば、連続遠心分離を用いて、タンパク質を発現する細胞からろ過され、及び／又は分離され得る。
【0186】
細胞から調製される抗原結合部位は、例えば、イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティクロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー又はプロテインＧクロマトグラフィー）、又は上記の任意の組合せを用いて精製され得る。これらの方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、国際公開第９９／５７１３４号又はEd Harlow and David Lane（編）Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1988)に記載されている。
【0187】
当業者はまた、タンパク質が、精製又は検出を容易にするためのタグ、例えば、ポリヒスチジンタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグ、又はインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、又はシミアンウイルス５（Ｖ５）タグ、又はＦＬＡＧタグ、又はグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを含むように修飾され得ることを認識するであろう。次に、得られたタンパク質は、アフィニティ精製などの、当該技術分野において公知の方法を用いて精製される。例えば、ヘキサｈｉｓタグを含むタンパク質は、タンパク質を含む試料を、固体又は半固体の担体に固定された、ヘキサｈｉｓタグに特異的に結合するニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）と接触させ、試料を洗浄して、非結合タンパク質を除去し、その後、結合したタンパク質を溶離することによって精製される。或いは、又はそれに加えて、タグに結合するリガンド又は抗体が、アフィニティ精製方法において使用される。
【0188】
抗原結合部位の活性のアッセイ
ＣＸＣＲ３及びその突然変異体への結合
本明細書に記載される抗原結合部位がＣＸＣＲ３に結合することは、本明細書における開示から当業者に明らかであろう。タンパク質への結合を評価するための方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Scopes(Protein purification:principles and practice,Third Edition,Springer Verlag,1994)に記載されている。このような方法は、一般に、抗原結合部位を固定し、それを標識抗原（ＣＸＣＲ３）と接触させることを必要とする。洗浄して、非特異的に結合したタンパク質を除去した後、標識の量及び、結果として、結合した抗原が検出される。当然ながら、抗原結合部位を標識し、抗原を固定化してもよい。パニングタイプのアッセイも使用され得る。或いは、又はそれに加えて、表面プラズモン共鳴アッセイが使用され得る。
ＣＸＣＲ３及びその突然変異体への結合
本明細書に記載される抗原結合部位がＣＸＣＲ３に結合することは、本明細書における開示から当業者に明らかであろう。タンパク質への結合を評価するための方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Scopes(Protein purification:principles and practice,Third Edition,Springer Verlag,1994)に記載されている。このような方法は、一般に、抗原結合部位を固定し、それを標識抗原（ＣＸＣＲ３）と接触させることを必要とする。洗浄して、非特異的に結合したタンパク質を除去した後、標識の量及び、結果として、結合した抗原が検出される。当然ながら、抗原結合部位を標識し、抗原を固定化してもよい。パニングタイプのアッセイも使用され得る。或いは、又はそれに加えて、表面プラズモン共鳴アッセイが使用され得る。
【0189】
任意選択的に、ＣＸＣＲ３又はそのエピトープに対する、固定された抗原結合部位の解離定数（Ｋｄ）、会合定数（Ｋａ）及び／又は親和定数（ＫＤ）が決定される。ＣＸＣＲ３結合タンパク質の「Ｋｄ」又は「Ｋａ」又は「ＫＤ」は、一例において、放射性標識又は蛍光標識されたＣＸＣＲ３リガンド結合アッセイによって測定される。「Ｋｄ」の場合、このアッセイは、非標識ＣＸＣＲ３の滴定系列の存在下で、最小濃度の標識ＣＸＣＲ３又はそのエピトープにより抗原結合部位を平衡させる。洗浄して、非結合ＣＸＣＲ３又はそのエピトープを除去した後、タンパク質のＫｄの指標である標識の量が決定される。
【0190】
別の例によれば、Ｋｄ、Ｋａ又はＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、例えば、固定化ＣＸＣＲ３若しくはその領域又は固定化抗原結合部位を有するBIAcore表面プラズモン共鳴（BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ）を用いて測定される。
【0191】
阻害活性の測定
本発明のいくつかの例において、タンパク質は、ＣＸＣＲ３活性を阻害することが可能である。
本発明のいくつかの例において、タンパク質は、ＣＸＣＲ３活性を阻害することが可能である。
【0192】
機能的反応をもたらす受容体を介したリガンドのシグナル伝達を阻害又は低減するタンパク質の能力を評価するための様々なアッセイが、当該技術分野において公知である。
【0193】
一例において、抗原結合部位は、ＣＸＣＲ３リガンド（例えばＭＩＧ、ＩＰ－１０及びＩ－ＴＡＣ）の存在下で培養される、ＣＸＣＲ３を発現する免疫細胞（例えば、好中球）の遊走を阻害する。遊走を評価するための方法は、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。抗原結合部位の非存在下で観察されるレベルと比較して遊走を阻害する抗原結合部位は、ＣＸＣＲ３活性、特にＣＸＣＲ３に媒介されるシグナル伝達及び遊走を阻害又は低減するものと考えられる。抗ＣＸＣＲ３抗体の阻害活性を測定するための他のアッセイとしては、カルシウム流出アッセイ、放射性リガンド結合アッセイ、ｃＡＭＰアッセイ及びβアレスチン動員アッセイが挙げられる。本明細書に記載されるアッセイのいずれも、ＭＩＧ、ＩＰ－１０及びＩ－ＴＡＣを含む１つ以上のＣＸＣＲ３リガンドを含み得る。
【0194】
治療される疾患
本発明の抗原結合部位は、ＣＸＣＲ３の存在又は過剰発現に関連するか、又はそれによって引き起こされるいずれかの疾患の治療又は予防において有用である。
本発明の抗原結合部位は、ＣＸＣＲ３の存在又は過剰発現に関連するか、又はそれによって引き起こされるいずれかの疾患の治療又は予防において有用である。
【0195】
本発明の抗原結合部位は、Ｔｈ１細胞に関連するか、又はそれによって引き起こされるいずれかの疾患の治療又は予防において有用である。
【0196】
本発明の抗原結合部位は、線維症、脂肪肝疾患（ＮＡＳＨを含む）及び移植拒絶反応（移植片対宿主病、ＧＶＨＤ）などの急性又は慢性炎症に関連するか、又はそれによって引き起こされる疾患の治療又は予防において有用である。本発明の抗原結合部位は、好ましくは、自己免疫性の炎症性疾患の治療又は予防に利用される。
【0197】
さらに他の実施形態において、本発明の抗原結合部位は、炎症によって特徴付けられる自己免疫疾患に関連する線維症の軽減に利用され得る。
【0198】
「線維症（Fibrosis）」、「線維症（Fibrotic disease）」又は「線維増殖性疾患」は、傷害の際の修復過程における過剰な線維性結合組織の形成を意味する。瘢痕は、罹患した器官又は組織構造を取り除く持続性線維症の結果である。形成された瘢痕組織を取り除かない異常な修復過程の結果として、線維症はさらに進行する。線維症は、心臓、肺、肝臓、皮膚、血管及び腎臓を含む様々な組織に見られる。線維症の例は、本明細書に記載され、肺線維症、肝硬変、全身性硬化症、進行性腎疾患及び様々な心血管疾患に関連する心筋線維化が挙げられる。
【0199】
対象が、臓器機能不全、瘢痕、正常な細胞外基質バランスの変化、コラーゲン沈着の増加、増加したコラーゲン体積分率、線維芽細胞の、筋線維芽細胞への分化、マトリックスメタロプロテアーゼのレベルの減少及びマトリックスメタロプロテアーゼの組織阻害剤のレベルの増加、Ｉ型プロコラーゲンのＮ末端若しくはＣ末端プロペプチド（ＰＩＮＰ若しくはＰＩＣＰ）のいずれかの増加したレベル及びＩ型コラーゲンのＣ末端テロペプチド（ＣＴＰ若しくはＣＩＴＰ）の減少したレベル、増加したコラーゲン沈着及び様々な非侵襲性のイメージング技術によって測定される心臓機能障害、増加したタンパク尿及びアルブミン尿によって測定される腎機能障害、低下した糸球体ろ過率、血漿クレアチニンレベルの倍増を有するかどうかを決定することによって、対象は、線維症を有するものと同定され得る。
【0200】
本発明の好ましい実施形態によれば、肝線維症は、慢性肝疾患、Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、Ｄ型肝炎ウイルス感染、住血吸虫症、アルコール性肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患、肥満、糖尿病、タンパク質栄養不良、冠動脈疾患、自己免疫性肝炎、嚢胞性線維症、α－１－アンチトリプシン欠乏症、原発性胆汁性肝硬変、薬物反応及び毒素への曝露に起因している。
【0201】
「肝線維症」という用語は、肝臓における過剰な線維性結合組織（線維症）の形成又は発生を意味し、それによって、瘢痕（線維性）組織の発生をもたらす。瘢痕組織は、線維症の過程によって健康な組織と置き換わり、肝臓のその後の肝硬変をもたらす。肝線維症は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に関連し得る。
【0202】
肝線維症としては、限定はされないが、肝硬変、及び関連する疾患、例えば、慢性ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎）が挙げられる。肺線維症としては、特発性肺線維症（ＩＰＦ）又は特発性線維化性肺胞炎、慢性線維化性間質性肺炎、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、及びびまん性実質性肺疾患（ＤＰＬＤ））、心筋線維化、鬱血性心不全、心筋症、心筋梗塞後の心臓機能の欠陥；末梢血管疾患；関節リウマチ；緑内障；加齢性黄斑変性症（ウエット型ＡＭＤ及びドライ型ＡＭＤ）；気腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；多発性硬化症が挙げられ；慢性喘息も、本明細書に記載される組成物、方法又は使用を用いて、予防、治療、又は改善され得る。
【0203】
脂肪肝疾患及びＮＡＳＨ
本発明はまた、脂肪肝疾患を発症するリスクがあるか又は脂肪肝疾患の症状を示す個体における脂肪肝疾患の発症を予防するか、脂肪肝疾患の進行を防ぐか、又は脂肪肝疾患を治療するための方法に関する。
本発明はまた、脂肪肝疾患を発症するリスクがあるか又は脂肪肝疾患の症状を示す個体における脂肪肝疾患の発症を予防するか、脂肪肝疾患の進行を防ぐか、又は脂肪肝疾患を治療するための方法に関する。
【0204】
特定の好ましい実施形態において、本発明は、ＮＡＳＨを発症するリスクがあるか又はＮＡＳＨの症状を示す個体におけるＮＡＳＨの発症を予防するか、ＮＡＳＨの進行を防ぐか、又はＮＡＳＨを治療するための方法を提供する。
【0205】
アルコールの乱用なしで発症する脂肪肝疾患は、特に、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などのように、炎症性要素が関与する場合、大きな健康負荷としてますます認識されている。イメージング及び生検研究に基づく推定は、米国及び他の西洋諸国の成人の約２０％～３０％が、肝臓における過剰な脂肪蓄積を有することを示唆している。これらの個体の約１０％、又は成人の優に２％～３％は、ＮＡＳＨの現在の診断基準を満たすと推定される。持続的な肝障害は、進行性線維症、及びＮＡＳＨ患者の約３０％において肝硬変をもたらす。ＮＡＳＨの診断基準は、進化し続けており、脂肪症、肝細胞障害（肝細胞の風船様腫大、マロリー体）、及び線維症のパターンの組織学的所見に依拠する。
【0206】
本明細書において使用される際、ＮＡＦＬＤは、非アルコール性脂肪肝疾患を指す。生命に関わらない疾患であると考えられるＮＡＦＬＤは、ＮＡＳＨと区別され、ＮＡＳＨはＮＡＦＬＤのより重度の形態であり、増加した死亡率に関連する。「非アルコール性脂肪肝疾患」又は「ＮＡＦＬＤ」、「非アルコール性脂肪性肝炎」又は「ＮＡＳＨ」、及び「単純性脂肪肝」という用語はそれぞれ、科学界によって現在認められている意味で使用される。一般に、ＮＡＦＬＤは、組織学的スペクトルの変化として存在する。ＮＡＦＬＤの段階は全て、肝細胞における脂肪の蓄積（脂肪症）を共通して有する。単純性脂肪肝は、著しい炎症及び肝細胞傷害を伴わない肝臓脂肪症を指す一方、ＮＡＳＨは、炎症及び肝細胞傷害、及び場合により線維症を示す。
【0207】
当業者は、個体が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患しているか、又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を発症するリスクがあるかどうかを決定するための方法を熟知している。特に、当業者は、個体が、非アルコール性脂肪肝疾患の症状又は兆候を有するかどうか（個体が、脂肪症、ＮＡＳＨ又はＮＡＦＤＬなどの脂肪肝疾患の亜型のいずれかに罹患しているか、又はそのリスクがあるかどうかを含む）決定するための、及び、特に、生命に関わるＮＡＳＨと、より軽度のＮＡＦＬＤとを区別するための方法を熟知している。
【0208】
「脂肪肝疾患」という用語は、当該技術分野において周知である。好ましくは、この用語は、肝臓の障害を指す。好ましくは、前記障害は、肝臓中に蓄積し、大きな液胞を形成する過剰なトリアシルグリセリドの結果である。脂肪肝疾患に伴う症状は、Stedman’s又はPschyrembelなどの医薬の標準的なテキストから周知である。脂肪肝疾患は、アルコール乱用、糖尿病、栄養不足及び間違ったダイエット、薬物の毒性又は遺伝性素因に起因し得る。本発明に従って使用される際の脂肪肝疾患は、そのより重度の形態、特に、脂肪症、ＮＡＳＨ又はＮＡＦＤＬも含む。これらの疾患に伴う症状はまた、医師には周知であり、医薬の標準的なテキストに詳細に記載されている。
【0209】
肝生検は、依然として、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨなどの肝臓の疾患の病因及び程度の評価における基準の標準又は「ゴールドスタンダード」のままである。経皮的肝生検は、ＮＡＦＬＤを決定し、ＮＡＳＨをＮＡＦＬＤと区別するための好ましい方法である。他の生検方法は、典型的に、さらに一層侵襲性であり、経静脈的及び腹腔鏡下肝生検を含む。アメリカ消化器病学会（American Gastroenterological Association）は、ＮＡＳＨを含むＮＡＦＬＤを、大滴性脂肪症グレード、壊死性炎症性活性グレード及び線維症ステージへと等級分けする方法についての詳細な推奨項目を公開している（American Gastroenterological Association 2002,Gastroenterology 123:1705-25;Brunt 1999,Am J Gastroenterol.94:2467-74,Brunt 2010,Nat Rev Gastroenterol Hepatol.7:195-203）。
【0210】
単純性脂肪肝は、比較的良性の状態のようであるが、それは、時間とともにＮＡＳＨに進行し得る。したがって、ＮＡＳＨのリスクがある人は、単純性脂肪肝を有すると診断される人であり得る。心血管系の合併症とのその関連に加えて、ＮＡＦＬＤは、肝臓に関連する罹患率及び死亡率をもたらし得る。肝硬変を発症するリスクは、ＮＡＳＨの存在下でより高く、ＮＡＳＨは、以下の特徴の存在下でより可能性が高い：
２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）
肥満（ボディー・マス・インデックス［ＢＭＩ］＞３０ｋｇ／ｍ２）
５０歳を超える年齢
正常上限の２倍超の血清アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ又はＡＳＴ）。
２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）
肥満（ボディー・マス・インデックス［ＢＭＩ］＞３０ｋｇ／ｍ２）
５０歳を超える年齢
正常上限の２倍超の血清アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ又はＡＳＴ）。
【0211】
したがって、ＮＡＦＬＤであると診断され、上記の特徴の１つ以上を有する場合、人は、ＮＡＳＨのリスクがあると考えられ得る。ＮＡＦＬＤの確定診断は、３つの因子に依存する：
１）イメージング（超音波、磁気共鳴イメージング［ＭＲＩ］）又は組織学（肝生検）のいずれかによる脂肪浸潤のエビデンス
２）著しいアルコール摂取の除外
３）肝臓脂肪症の他の理由（例えば、投薬、外科手術、代謝異常）の除外。
１）イメージング（超音波、磁気共鳴イメージング［ＭＲＩ］）又は組織学（肝生検）のいずれかによる脂肪浸潤のエビデンス
２）著しいアルコール摂取の除外
３）肝臓脂肪症の他の理由（例えば、投薬、外科手術、代謝異常）の除外。
【0212】
上記に加えて、門脈高血圧症（脾腫、増加した門脈サイズ、静脈瘤）又はＨＣＣ、門脈血栓症、若しくは腹水などの他の合併症の兆候を含む、肝硬変の合併症の兆候も考えられ得る。ＮＡＦＬＤにおける線維症及び進行性肝疾患のリスクは、インスリン抵抗性の重症度とともに増加する。メタボリック・シンドロームの特徴（肥満、複合型高脂血、（２型）糖尿病、及び高血圧）の数を用いて、インスリン抵抗性のリスクを推定することができる。メタボリック・シンドロームの３つ以上の特徴の存在は、特に、これらが中心性の肥満及び２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）を含む場合、単純性脂肪肝よりむしろＮＡＳＨの存在を予測する。さらに、家族歴は一定の役割を果たす：Ｔ２ＤＭを有する第一度近親者を有する個体は、Ｔ２ＤＭ、ひいてはＮＡＳＨを発症する９０％の可能性を有する。中心性の肥満は、患者を立位にして、呼気の終わりに、一番下の肋骨と腸骨稜との間の一番細くなっている中間点で測定した胴囲を用いて評価され得る。
【0213】
線維症の程度を推定するための非侵襲性の手段としては、トランジェントエラストグラフィ（transient elastography）（FibroScan（登録商標））、音響放射力インパルス（acoustic radiation force impulse）（ＡＲＦＩ）、並びにNAFLD Fibrosis Score、FibroTest及びHepascoreなどの非侵襲性バイオマーカーアルゴリズムが挙げられる。
【0214】
当業者はまた、個体が、ＮＡＳＨのさらなる進行の防止、ＮＡＳＨの症状の改善又はリスクのある個体におけるＮＡＳＨの発症の予防のために、首尾よく処置されているかどうかを決定するための方法を熟知しているであろう。上首尾な治療又は予防は、ＮＡＳＨに関連して上述される症状のいずれか１つ以上の改善、又は進行若しくは悪化の速度の低下を測定することによって決定され得る。
【0215】
移植拒絶反応（移植片対宿主病）
本発明の方法はまた、細胞移植を必要とする個体における、ＧＶＨＤの発症又は進行を治療若しくは予防し、又はＧＶＨＤの重症度を低減するのに有用性を有する。
本発明の方法はまた、細胞移植を必要とする個体における、ＧＶＨＤの発症又は進行を治療若しくは予防し、又はＧＶＨＤの重症度を低減するのに有用性を有する。
【0216】
ＧＶＨＤは、宿主の組織適合性及び他の組織抗原を認識するドナー移植片におけるＴ細胞によって発生される炎症性疾患であり、ＧＶＨＤは、様々なエフェクター細胞及び炎症性サイトカインによって媒介される。ＧＶＨＤは、急性及び慢性型の両方において現れる。最も一般的な症候性の器官は、皮膚、肝臓、及び胃腸管（口腔及び口腔咽頭領域を含む）である。ＧＶＨＤは、肺などの他の器官に関与し得る。
【0217】
ＧＶＨＤの治療は、一般に、５０～７５％しか成功せず；患者の残りは、一般に生存しない。この免疫媒介性疾患の危険性及び重症度は、宿主と造血細胞のドナーとの間の不一致度に直接関係する。例えば、ＧＶＨＤは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）一致同胞骨髄のレシピエントの３０％まで、ＨＬＡ適合非血縁ドナー骨髄のレシピエントの６０％まで、及びＨＬＡ不一致骨髄のレシピエントのより高いパーセンテージにおいて、進行する。軽度の腸管のＧＶＨＤを有する患者は、食欲不振、吐き気、嘔吐、腹痛及び下痢を示す一方、重度のＧＶＨＤを有する患者は、これらの症状で障害を負う。治療されない場合、腸管のＧＶＨＤの症状は持続し、多くの場合、進行し；自然寛解は稀である。その最も重度の形態では、ＧＶＨＤは、腸粘膜の上皮細胞の大部分の壊死及び剥離、多くの場合、致死的な疾患につながる。急性ＧＶＨＤの症状は、通常、移植の１００日以内に存在する。慢性ＧＶＨＤの症状は、通常、幾分遅れて、同種異系ＨＣＴの後３年まで存在し、急性ＧＶＨＤの病歴によって進行されることが多い。
【0218】
急性及び慢性の２つの異なるタイプのＧＶＨＤが、臨床的に認識されている。この疾患の急性型は、通常、移植後の最初の３か月以内に発症する。急性ＧＶＨＤの発症率は、ＨＬＡ一致同胞ドナーから移植を受けた患者の３０～５０％、及びＨＬＡ適合非血縁移植を受けた患者の５０～７０％と推定される。重度の急性ＧＶＨＤ（グレードＩＩＩ～ＩＶ）は、血縁ドナーのレシピエントの２０％まで及び非血縁ドナーのレシピエントの３５％までで発生する。重度の急性ＧＶＨＤは、予後不良を伴い、グレードＩＩＩで長期生存率が２５％及びグレードＩＶで５％である。
【0219】
当業者は、細胞移植を受ける可能性が最も高い患者群及び急性ＧＶＨＤのリスクがあるか又は慢性ＧＶＨＤの兆候を示す患者を同定することなどによって、ＧＶＨＤの治療又は予防を必要とする個体を同定することができるであろう。例えば、慢性ＧＶＨＤは、１００日を超えて生存する、ＨＬＡ一致同胞骨髄移植を受けた患者の６０％まで及び代替ドナー骨髄移植を受けた患者７０％で発症する。慢性ＧＶＨＤの症状は、通常、同種異系移植後、３か月～２年間存在し、約３分の２が、最初の１２か月以内に発症する。結局、移植された患者のわずか２０％未満が、急性又は慢性ＧＶＨＤのいずれも発症しない。
【0220】
組成物
いくつかの例において、本明細書に記載される抗原結合部位は、経口的に、非経口的に、吸入スプレー、吸着、吸収によって、局所、直腸内、鼻腔内、口腔、膣内、脳室内で、埋め込まれたリザーバを介して、従来の非毒性の薬学的に許容される担体を含む投与製剤として、又は任意の他の好都合な剤形によって投与され得る。本明細書において使用される際の「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、脳室内、胸骨内、及び頭蓋内への注射又は注入技術を含む。
いくつかの例において、本明細書に記載される抗原結合部位は、経口的に、非経口的に、吸入スプレー、吸着、吸収によって、局所、直腸内、鼻腔内、口腔、膣内、脳室内で、埋め込まれたリザーバを介して、従来の非毒性の薬学的に許容される担体を含む投与製剤として、又は任意の他の好都合な剤形によって投与され得る。本明細書において使用される際の「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、脳室内、胸骨内、及び頭蓋内への注射又は注入技術を含む。
【0221】
対象への投与のための好適な形態（例えば医薬組成物）に、抗原結合部位を調製するための方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990)及びU.S.Pharmacopeia:National Formulary(Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1984)に記載される方法が挙げられる。
【0222】
本発明の医薬組成物は、非経口投与、例えば、静脈内投与又は器官若しくは関節の内腔若しくは管腔への投与に特に有用である。投与のための組成物は、一般的に、薬学的に許容される担体、例えば水性担体に溶解された抗原結合部位の溶液を含む。様々な水性担体、例えば、緩衝生理食塩水などが使用され得る。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどの、生理学的条件を模倣するのに必要とされる薬学的に許容される助剤を含有し得る。これらの製剤における本発明の抗原結合部位の濃度は、幅広く変化し得、選択される具体的な投与方法及び患者のニーズに応じて、主に、液量、粘度、体重などに基づいて選択される。例示的な担体としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％のヒト血清アルブミンが挙げられる。混合油及びオレイン酸エチルなどの非水性ビヒクルも使用され得る。リポソームも担体として使用され得る。ビヒクルは、等張性及び化学安定性を強化する少量の添加剤、例えば、緩衝液及び保存剤を含有し得る。
【0223】
製剤化の後、本明細書に記載される抗原結合部位は、投与製剤と適合する方法で、及び治療的／予防的に有効であるような量で投与される。製剤は、上述される注射剤のタイプなどの様々な剤形で容易に投与されるが、他の薬学的に許容される形態、例えば、錠剤、丸薬、カプセル若しくは経口投与用の他の固体、坐薬、ペッサリー、点鼻液若しくはスプレー、エアゾール、吸入剤、リポソーム形態なども考えられる。医薬用の「持続放出」カプセル又は組成物も使用され得る。持続放出製剤は、一般に、長期間にわたって一定の薬物レベルを与えるように設計され、本発明の抗原結合部位を送達するのに使用され得る。
【0224】
国際公開第２００２／０８０９６７号には、例えば、喘息の治療のための抗体を含むエアロゾル化された組成物を投与するための組成物及び方法が記載されており、それは、本発明の抗原結合部位の投与にも好適である。
【0225】
投与量及び投与時期
本発明の抗原結合部位の好適な投与量は、具体的な抗原結合部位、治療される疾患及び／又は治療される対象に応じて変化する。好適な投与量を決定することは熟練した医師の能力の範囲内であり、例えば、最適量以下の投与量から開始し、最適又は有用な投与量を決定するために投与量を徐々に変更することによってなされる。或いは、治療／予防のための適切な投与量を決定するために、細胞培養アッセイ又は動物試験からのデータが使用され、ここで、好適な用量は、ほとんど又は全く毒性を有さない活性化合物のＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤形及び用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。治療的／予防的に有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、細胞培養において決定される際にＩＣ５０（すなわち、症状の最大抑制の半分を達成する化合物の濃度又は量）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて配合され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
本発明の抗原結合部位の好適な投与量は、具体的な抗原結合部位、治療される疾患及び／又は治療される対象に応じて変化する。好適な投与量を決定することは熟練した医師の能力の範囲内であり、例えば、最適量以下の投与量から開始し、最適又は有用な投与量を決定するために投与量を徐々に変更することによってなされる。或いは、治療／予防のための適切な投与量を決定するために、細胞培養アッセイ又は動物試験からのデータが使用され、ここで、好適な用量は、ほとんど又は全く毒性を有さない活性化合物のＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤形及び用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。治療的／予防的に有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、細胞培養において決定される際にＩＣ５０（すなわち、症状の最大抑制の半分を達成する化合物の濃度又は量）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて配合され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【0226】
いくつかの例において、本発明の方法は、本明細書に記載されるタンパク質の予防又は治療有効量を投与することを含む。
【0227】
「治療有効量」という用語は、治療を必要とする対象に投与されたとき、対象の予後及び／又は状態を改善し、及び／又は本明細書に記載される臨床状態の１つ以上の症状を、その状態の臨床的診断特性又は臨床的特徴として観察され、認められるレベル未満のレベルまで、低減若しくは阻害する量である。対象に投与される量は、治療される疾患の具体的な特徴、治療される疾患のタイプ及び段階、投与方法、並びに全体的な健康、他の疾患、年齢、性別、遺伝子型、及び体重などの対象の特徴に依存する。当業者は、これらの及び他の要因に応じて、適切な投与量を決定することができる。したがって、この用語は、本発明を、特定の量、例えば、タンパク質の重量又は量に限定するものと解釈されるべきではなく、むしろ、本発明は、対象において所定の結果を得るのに十分な抗原結合部位の任意の量を包含する。
【0228】
本明細書において使用される際、「予防的に有効な量」という用語は、臨床状態の１つ以上の検出可能な症状の発症を予防する又は阻害する又は遅らせるのに十分な量のタンパク質を意味すると理解されるものとする。当業者は、このような量が、例えば、投与される特定の抗原結合部位及び／又は特定の対象及び／又は疾患のタイプ若しくは重症度若しくはレベル及び／又は疾患の素因（遺伝的素因若しくはそれ以外）に応じて変化することを認識するであろう。したがって、この用語は、本発明を、特定の量、例えば、抗原結合部位の重量又は量に限定するものと解釈されるべきではなく、むしろ、本発明は、対象において所定の結果を得るのに十分な抗原結合部位の任意の量を包含する。
【0229】
キット
本発明は、以下の１つ以上を含むキットをさらに含む：
（ｉ）本明細書に記載される抗原結合部位又はそれをコードする発現構築物；
（ｉｉ）本発明の細胞；
（ｉｉｉ）本発明の複合体；又は
（ｉｉｉ）本発明の医薬組成物。
本発明は、以下の１つ以上を含むキットをさらに含む：
（ｉ）本明細書に記載される抗原結合部位又はそれをコードする発現構築物；
（ｉｉ）本発明の細胞；
（ｉｉｉ）本発明の複合体；又は
（ｉｉｉ）本発明の医薬組成物。
【0230】
ＣＸＣＲ３を検出するためのキットの場合、キットは、例えば、本発明の抗原結合部位に連結された検出手段をさらに含み得る。
【0231】
治療的／予防的使用のためのキットの場合、キットは、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。
【0232】
任意選択的に、本発明のキットは、いずれかの実施例に従い本明細書に記載される方法の使用説明書とともに包装される。
【0233】
【表1】
【0234】
【表2】
【0235】
【表3】
【0236】
【表4】
【0237】
【表5】
【実施例】
【0238】
実施例
実施例１
この実施例は、ＣＸＣＲ３抗体を産生するための方法を記載する。
実施例１
この実施例は、ＣＸＣＲ３抗体を産生するための方法を記載する。
【0239】
５ｍＭの酪酸で回収の２０時間前に刺激し、完全フロイントアジュバント（腹腔内、初回免疫）又は不完全フロイントアジュバント（腹腔内、２次～６次免疫）中で乳化させた２×１０７個のＬ１．２／ｈＣＸＣＲ３トランスフェクト細胞を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２週間隔で合計５～６回免疫を行うことによって、ヒトＣＸＣＲ３（ｈＣＸＣＲ３）と反応するモノクローナル抗体を産生する。最終免疫は、ＰＢＳ中で静脈内注射する。４日後に、脾臓を摘出し、標準的な方法を用いて、細胞をＳＰ２／０細胞株と融合させる。ハイブリドーマを、１０％のFetalclone（HyClone）、１×ＨＡＴ補給物（Sigma Aldrich）及びマウスＩＬ－６を含むDMEM（Gibco/lnvitrogen）中で増殖させる。１０～１４日の増殖の後、培養上清を、一次スクリーニングのために採取する。
【0240】
免疫蛍光染色及びFACSCalibur（BD Biosciences）を用いた分析を用いて、ヒトＣＸＣＲ３トランスフェクトＬ１．２細胞、及び非トランスフェクトＬ１．２細胞、又は無関係な若しくはＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２若しくはＣ５ａＲなどの類似する受容体でトランスフェクトされたＬ１．２細胞を用いて、ＣＸＣＲ３と反応するモノクローナル抗体を同定する。既に記載される標準的な手順（Lee et al.,2006,Nat.Biotech.24:1279-1284）を用いて、細胞のモノクローナル抗体染色を行う。
【0241】
抗体の産生は、組織培養フラスコ中でハイブリドーマを増殖させ、培養培地を回収することを含んでいた。いくつかの実験では、培養上清中の抗体の濃度は、さらなる精製なしで続けるのに十分であり得る。選択される抗体の産生を、スケールアップし、モノクローナル抗体を、プロテインＧクロマトグラフィーによって精製し、濃縮し、ＰＢＳに緩衝液交換する。モノクローナル抗体濃度を、全ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを用いて決定する。
【0242】
高いレベルのｈＣＸＣＲ３を発現するＬ１．２トランスフェクタントを用いて、マウスを免疫し、ｈＣＸＣＲ３でトランスフェクトされたＬ１．２細胞と反応したモノクローナル抗体を、フローサイトメトリーによって最初に同定する。クローン性を確保するため、選択されたハイブリドーマを、３８４ウェルプレート中への希釈平板法を用いてサブクローニングした。Ｌ１．２／ｈＣＸＣＲ３トランスフェクタント及び非トランスフェクトＬ１．２細胞との、サブクローンの交差反応性の特異性を、フローサイトメトリーによって確認する。
【0243】
実施例２
この実施例は、ＣＸＣＲ３抗体の受容体結合特異性を決定するための方法を記載する。
この実施例は、ＣＸＣＲ３抗体の受容体結合特異性を決定するための方法を記載する。
【0244】
トランスフェクト細胞に対するｍＡｂの反応性を評価するため、間接免疫蛍光染色及びフローサイトメトリーを使用する。細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＢＳＡ及び０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のアジ化ナトリウム（染色緩衝液）及び精製抗体を含む１００μｌのＰＢＳ中で再懸濁させる。４℃で３０分後、細胞を、染色緩衝液で２回洗浄し、染色緩衝液中で１：５００に希釈された、ヒト化ｍＡｂ検出用の５０μｌのＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Laboratories）又はマウスｍＡｂ検出用の５０μｌのＰＥコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Laboratories）中で再懸濁させる。４℃で２０分間インキュベートした後、細胞を、染色緩衝液で２回洗浄し、LSRIIフローサイトメーターで分析する。７－ＡＡＤ染色を用いて、死細胞を除外する。
【0245】
実施例３
この実施例は、ＣＸＣＲ３抗体をエピトープマッピングするための方法を記載する。
この実施例は、ＣＸＣＲ３抗体をエピトープマッピングするための方法を記載する。
【0246】
抗ＣＸＣＲ３ ｍＡｂによって認識されるＣＸＣＲ３内の領域を決定するため、エピトープマッピング試験を行う。最初に、Ｎ末端領域並びにＣＸＣＲ３の第１、第２及び第３の細胞外ループに対応するビオチン化ペプチドを、ＥＬＩＳＡにおいて使用する。
【0247】
次に、ヒトＣＸＣＲ３の全Ｎ末端領域にわたる重なり合うビオチン化ペプチドを合成し、より詳細なエピトープマッピング試験において使用する。簡潔に述べると、マルチウェルプレートを、ストレプトアビジンで被覆し、洗浄してから、ビオチン化ペプチドを別個のウェルに加え、プレートへのペプチドの結合を容易にするためにインキュベートする。それぞれの抗体をプレートのウェルに加え、プレートをインキュベートすることによって、異なる抗ｍＣＸＣＲ３抗体を、新たに開発されたｍＡｂと並行して試験する。アイソタイプ対照及び緩衝液のみが、陰性対照として含まれる。洗浄後、適切なコンジュゲート抗体を加え、プレートをインキュベートする。プレートを再度洗浄し、固定化されたペプチドへの抗体の結合を視覚化する。
【0248】
実施例４
この実施例は、抗ＣＸＣＲ３抗体によるＴ細胞遊走の阻害を測定するための方法を記載する。
この実施例は、抗ＣＸＣＲ３抗体によるＴ細胞遊走の阻害を測定するための方法を記載する。
【0249】
ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞を沈降させ、遊走培地（ＭＭ＝RPMI 1640、０．５％のＢＳＡ）中で洗浄し、１０７個の細胞／ｍｌで再懸濁させる。組織培養インサート（Becton Dickinson & Co.,Mountain View,Calif.）を、２４ウェル組織培養プレートのウェルのそれぞれに入れて、３ｍｍの直径の孔を有するポリエチレンテレフタレート膜で分けられた上部及び下部チャンバを形成する。走化性ＣＸＣＲ３リガンド、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）又はＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ）、（アッセイ培地中で希釈される）を、２４ウェル組織培養プレート中の６００μｌのアッセイ培地に加える。１００μｌ中の１００万個の細胞を、抗体とともに３０分間プレインキュベートする。５％のＣＯ２、３７℃のインキュベータ中で４時間にわたって、精製されたｍＡｂを、ウェルの上部チャンバに加え、細胞を、下部チャンバに通して遊走させる。インサートを遊走後に除去し、細胞を、LSRIIサイトメータ（BD Biosciences）によって計数する。３０秒の設定時間の間のイベントを得ることによって、相対細胞数を得る。
【0250】
実施例５
この実施例は、ＮＡＳＨを治療するための枯渇性抗ＣＸＣＲ３抗体の使用を記載する。
この実施例は、ＮＡＳＨを治療するための枯渇性抗ＣＸＣＲ３抗体の使用を記載する。
【0251】
ＮＡＳＨを誘導するためのＭＣＤ食
Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、５週間にわたって対照食又はＭＣＤ食を与えた。ＭＣＤ食は、コリン及びメチオニンが少なく、ＮＡＳＨの誘導及び進行をモデル化するのに使用される。ＭＣＤ食は、先行技術（例えば、Machado et al.,2015,PLoS One;10(5):e0127991を参照）に記載されるとおりであった。
Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、５週間にわたって対照食又はＭＣＤ食を与えた。ＭＣＤ食は、コリン及びメチオニンが少なく、ＮＡＳＨの誘導及び進行をモデル化するのに使用される。ＭＣＤ食は、先行技術（例えば、Machado et al.,2015,PLoS One;10(5):e0127991を参照）に記載されるとおりであった。
【0252】
抗体処理
５週間後、マウスを、アイソタイプ対照抗体又は枯渇性抗ＣＸＣＲ３抗体のいずれかで処理した。
５週間後、マウスを、アイソタイプ対照抗体又は枯渇性抗ＣＸＣＲ３抗体のいずれかで処理した。
【0253】
組織病理学
肝臓組織を処理し、標準的な手順を用いて染色した。溶血素及びエオシン染色を用いて、脂肪沈着を視覚化した。ピクロシリウスレッド染色を用いて、コラーゲン沈着を視覚化した（それによって、線維症の程度を決定した）。
肝臓組織を処理し、標準的な手順を用いて染色した。溶血素及びエオシン染色を用いて、脂肪沈着を視覚化した。ピクロシリウスレッド染色を用いて、コラーゲン沈着を視覚化した（それによって、線維症の程度を決定した）。
【0254】
総罹患面積のパーセンテージに基づいて、脂肪症を採点し、重症度を、以下のカテゴリーに等級分けした：０（＜５％）、１（５～３３％）、２（３４～６６％）及び３（＞６６％）。
【0255】
１００倍の倍率を用いて視野当たりの炎症性の病巣の数を計数することによって、炎症を評価する。
【0256】
ＮＫＴ細胞及び肝内ＣＤ８ Ｔ細胞の測定
ＮＫＴ及び肝内ＣＤ８＋ Ｔ細胞の測定
肝臓を切片にし、肝臓リンパ球を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配を用いて精製した。細胞を、抗ＣＤ４５、抗ＴＣＲβ；抗ＮＫ１．１；抗ＣＤ８及び抗ＣＸＣＲ３抗体を用いて染色した。Fortessa機器（BD Biosciences）及びFlowJoソフトウェアを、取得及びデータ分析に使用した。
ＮＫＴ及び肝内ＣＤ８＋ Ｔ細胞の測定
肝臓を切片にし、肝臓リンパ球を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配を用いて精製した。細胞を、抗ＣＤ４５、抗ＴＣＲβ；抗ＮＫ１．１；抗ＣＤ８及び抗ＣＸＣＲ３抗体を用いて染色した。Fortessa機器（BD Biosciences）及びFlowJoソフトウェアを、取得及びデータ分析に使用した。
【0257】
血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼレベルの測定
血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性を、製造業者のプロトコル（Sigma）に従ってＡＬＴ活性比色分析を用いて測定した。
血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性を、製造業者のプロトコル（Sigma）に従ってＡＬＴ活性比色分析を用いて測定した。
【0258】
結果：ＣＸＣＲ３枯渇性抗体による処理は、ＮＡＳＨを防ぐ
図４及び５に示されるように、ＭＣＤ食及びアイソタイプ抗体を与えたマウスの肝臓は、対照（普通）食のマウスと比較して、試験の最後に有意な脂肪沈着を有していた。
図４及び５に示されるように、ＭＣＤ食及びアイソタイプ抗体を与えたマウスの肝臓は、対照（普通）食のマウスと比較して、試験の最後に有意な脂肪沈着を有していた。
【0259】
ＮＡＳＨ誘導ＭＣＤ食とともに抗ＣＸＣＲ３枯渇性抗体処理を与えたマウスの肝臓は、脂肪沈着の発達を有意に防がれた。
【0260】
図４はまた、抗ＣＸＣＲ３枯渇性抗体を与えたマウスが、ＭＣＤ食とともにアイソタイプ抗体を与えたマウスと比較して、減少したレベルの肝線維症を有することを示す。
【0261】
したがって、図４及び５に示される結果は、枯渇性抗ＣＸＣＲ３抗体による処理が、ＮＡＳＨの認められたモデルにおいて、肝臓脂肪症及び線維症を阻害することを示す。
【0262】
図６は、抗ＣＸＣＲ３ ｍＡｂによる処理が、ＮＫＴ細胞及び活性化肝内ＣＤ８ Ｔ細胞を枯渇させることを示す。ＭＣＤ食は、ＣＤ８＋ ＣＸＣＲ３＋ Ｔ細胞及びＮＫＴ細胞の頻度を増加させ；ＮＫＴ細胞はＣＸＣＲ３＋であり、Ｆｃ改変抗ＣＸＣＲ３ ｍＡＢによる処理後に枯渇される。
【0263】
ＡＬＴの増加した血清中レベルは、肝臓障害を示す。図７は、抗ＣＸＣＲ３抗体による処理が、血清中へのアラニンアミノトランスフェラーゼの放出を減少させ、ＮＡＳＨの認められたモデルにおいて、肝臓中の単球の浸潤を減少させることを示す。
【0264】
要約すると、これらのデータは、ＣＸＣＲ枯渇性抗体による処理が、ＮＡＳＨ誘導食に関して：
・脂肪沈着の形成（肝臓脂肪症）を阻害し；
・コラーゲン沈着及び線維症を阻害し、
・ＮＫＴ細胞及び活性化肝内ＣＤ８＋ Ｔ細胞を枯渇させ、
・血清中へのアラニンアミノトランスフェラーゼの放出を減少させ（肝機能の改善を示す）；
・肝臓中の単球の浸潤を減少させる
ことを示す。
・脂肪沈着の形成（肝臓脂肪症）を阻害し；
・コラーゲン沈着及び線維症を阻害し、
・ＮＫＴ細胞及び活性化肝内ＣＤ８＋ Ｔ細胞を枯渇させ、
・血清中へのアラニンアミノトランスフェラーゼの放出を減少させ（肝機能の改善を示す）；
・肝臓中の単球の浸潤を減少させる
ことを示す。
【0265】
本明細書において開示され、定義される本発明は、記載されるか又は本文若しくは図面から明らかである個々の特徴の２つ以上の全ての代替的な組合せに及ぶことが理解されよう。これらの異なる組合せは全て、本発明の様々な代替的な態様を構成する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】