▶ ドイチェス クレブスフォルシュンクスツェントルムの特許一覧
特表2022-504624拡大された抗原性スペクトルを有するエプスタイン・バーウイルス様粒子
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-13
(54)【発明の名称】拡大された抗原性スペクトルを有するエプスタイン・バーウイルス様粒子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/38 20060101AFI20220105BHJP
C07K 14/05 20060101ALI20220105BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220105BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220105BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220105BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220105BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220105BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20220105BHJP
A61K 39/245 20060101ALI20220105BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220105BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20220105BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220105BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20220105BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220105BHJP
【ＦＩ】
C12N15/38
C07K14/05 ZNA
C12N7/01
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N5/0783
A61K39/245
A61K48/00
A61K38/16
A61K35/17 Z
A61P31/22
A61P37/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021519732
(86)(22)【出願日】2019-10-11
(85)【翻訳文提出日】2021-06-03
(86)【国際出願番号】 EP2019077605
(87)【国際公開番号】W WO2020074708
(87)【国際公開日】2020-04-16
(31)【優先権主張番号】18200051.3
(32)【優先日】2018-10-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】512113803
【氏名又は名称】ドイチェス クレブスフォルシュンクスツェントルム
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】デレクルーズ，ヘンリ－ジャッケス
(72)【発明者】
【氏名】ヴァン ジル，ドヴァイン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA83X
4B065AA87X
4B065AA90X
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA45
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084CA01
4C084NA14
4C084ZB33
4C085AA03
4C085BA80
4C085DD62
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZB33
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA20
4H045EA31
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、EBウイルス（EBV）DNAを本質的に不含であるEBウイルス様粒子（EB-VLP）を含む調製物であって、該EB-VLPは、EBVテグメントポリペプチドの少なくとも1種のペプチドおよび少なくとも1種の免疫原性ペプチドを含むワクチン接種ポリペプチドを含む、上記調製物；ならびにそれに関連するポリヌクレオチド、宿主細胞、および方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
エプスタイン・バーウイルス様粒子（EB-VLP）を含む調製物であって、該EB-VLPは、エプスタイン・バーウイルス（EBV）DNAを本質的に含まず、該EB-VLPは、EBVテグメントポリペプチドの少なくとも1種のペプチドおよび少なくとも1種の免疫原性ペプチドを含むワクチン接種ポリペプチドを含む、上記調製物。
【請求項2】
前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが少なくとも1種のT細胞エピトープを含む、請求項1に記載の調製物。
【請求項3】
前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが、病原性微生物の、好ましくはウイルスの、より好ましくはヘルペスウイルスの免疫原性ペプチドである、請求項1または2に記載の調製物。
【請求項4】
前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが、潜伏EBVポリペプチドの免疫原性ペプチドである、請求項1～3のいずれか1項に記載の調製物。
【請求項5】
前記潜伏EBVポリペプチドが、EBNA-1、EBNA-LP、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、LMP-1、およびLMP-2Aからなるリストより選択され；好ましくはEBNA-1である、請求項4に記載の調製物。
【請求項6】
前記EBVテグメントポリペプチドがEBV BNRF1ポリペプチドである、請求項1～5のいずれか1項に記載の調製物。
【請求項7】
前記免疫原性ペプチドが、前記BNRF1ポリペプチドの1～172位のいずれか1箇所で該BNRF1ポリペプチドに挿入され、かつ/または該位置の範囲内のアミノ酸を置き換える、請求項6に記載の調製物。
【請求項8】
前記ワクチン接種ポリペプチドが、配列番号1、2、または3のアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号1、2、または3のアミノ酸配列からなる、請求項1～7のいずれか1項に記載の調製物。
【請求項9】
請求項1～8のいずれか1項に特定される通りのワクチン接種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項10】
EBVゲノムをさらにコードする、請求項9に記載のポリヌクレオチド。
【請求項11】
請求項9または10に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項12】
医薬での使用のための、請求項1～8のいずれか1項に記載の調製物、請求項9もしくは10に記載のポリヌクレオチド、および/または請求項11に記載の宿主細胞。
【請求項13】
被験体のワクチン接種での使用のための、請求項1～8のいずれか1項に記載の調製物、請求項9もしくは10に記載のポリヌクレオチド、および/または請求項11に記載の宿主細胞。
【請求項14】
被験体に、(i) 請求項1～8のいずれか1項に記載の調製物、
(ii) 請求項9もしくは10に記載のポリヌクレオチド、
(iii) 請求項11に記載の宿主細胞、または
(v) (i)～(iii)のいずれかの組み合わせ
を接触させ、それにより該被験体のT細胞を刺激するステップ
を含む、被験体のT細胞を刺激するための方法。
【請求項15】
筐体内に含められる、請求項1～8のいずれか1項に記載の調製物、請求項9もしくは10に記載のポリヌクレオチド、および/または請求項11に記載の宿主細胞を含む、キット。
【請求項16】
請求項9または10に記載のポリヌクレオチドから生成されるかまたは生成可能なEBV粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、エプスタイン・バー（Epstein-Barr）ウイルス様粒子（EB-VLP）を含む調製物であって、該EB-VLPが、本質的にエプスタイン・バーウイルス（EBV）DNAを含まず、該EB-VLPが、EBVテグメントポリペプチドの少なくとも1種のペプチドおよび少なくとも1種の免疫原性ペプチドを含むワクチン接種ポリペプチドを含む、調製物、並びにそれに関連するポリヌクレオチド、宿主細胞、および方法に関する。
【背景技術】
【0002】
発癌性エプスタイン・バーウイルス（EBV）は、ヒトBリンパ球に潜伏感染できるガンマヘルペスウイルスのファミリーに属する。EBVは、人口の90％超での生涯持続するB細胞感染を確立する（Kieff and B. Rickinson. (2006), Epstein-Barr virus and its replication, In D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.), Fields virology, 5th ed. Lippincott-Raven, Philadelphia, PA. 2603-2654；Kuppers, R. (2003). B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus, Nat. Rev. Immunol. 3:801-812）。健康な個体では、EBVに感染しているB細胞のうちの大部分が、限定的なウイルス遺伝子発現および休眠表現型を示す。潜伏感染細胞の形質細胞への最終分化により、ウイルス再活性化、産生、およびB細胞の再感染が引き起こされる（Laichalk, L. L., and D. A. Thorley-Lawson. (2005), Terminal differentiation into plasma cells initiates the replicative cycle of Epstein-Barr virus in vivo. J. Virol. 79:1296-1307）。すべてのウイルス潜伏遺伝子の発現が、感染B細胞の増殖形質転換および増殖を引き起こし、これは、in vitroでのEBV形質転換型リンパ芽球様B細胞株の増生（outgrowth）により、およびin vivoでの種々のタイプのリンパ腫をはじめとする、様々なB細胞リンパ増殖性疾患とのEBVの関連性により反映される。先天的または医原的に誘導されたT細胞機能不全を有する患者でのEBV関連悪性腫瘍の発生増加により（Rickinson, A. B., and E. Kieff. (2006), Epstein-Barr virus, In D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.), Fields virology, 5th ed. Lippincott-Raven, Philadelphia, PA., 2655-2700）、かつポリクローナルEBV特異的T細胞株の注入による造血幹細胞移植レシピエントでのEBV関連移植後リンパ増殖性疾患の治療の成功（Rooney, C. M., et al., (1998), Infusion of cytotoxic T cells for the prevention and treatment of Epstein-Barr virus-induced lymphoma in allogeneic transplant recipients. Blood 92:1549-1555）により示される通り、EBV感染は、T細胞により制御される。
【0003】
したがって、EBV感染を予防または除去するワクチンを開発する必要性が当技術分野にはある。そのようなワクチンは、外見上は健康な被験体に投与されるであろうから、そのようなワクチンの安全性は大きな懸案事項であろう。現在までには、第II相臨床試験中のEBV gp350に対するペプチドワクチンしかない。しかしながら、このワクチンを用いた最初の臨床試験では、これがEBV陰性移植レシピエントでのEBV感染を防止しないことが示されている（Rees L, et al. (2009), A phase I trial of Epstein-Barr virus gp350 vaccine for children with chronic kidney disease awaiting transplantation. Transplantation 88(8):1025-9）。
【0004】
ウイルス様粒子（VLP）は、成熟ビリオンと類似またはそれと同一の構造体であるが、ウイルスゲノムを欠損している。一般的に、VLPは、例えば、単量体ペプチドよりも高い程度まで宿主の免疫応答を刺激し、このことが、VLPがB型肝炎ウイルスおよびパピローマウイルスなどの数種類のウイルスに対するワクチン接種のために優先的に用いられている理由である（Greenstone, H. L., et. al. (1998), Chimeric papillomavirus virus-like particles elicit antitumor immunity against the E7 oncoprotein in an HPV16 tumor model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1800-1805；Mandic, A., and T. Vujkov. (2004). Human papillomavirus vaccine as a new way of preventing cervical cancer: a dream or the future? Ann. Oncol. 15:197-200）。VLPワクチンレジメンの重要な安全性の側面は、用いられるVLPがウイルスゲノム（DNAまたはRNA）を含まないものでなければならないことである。なぜなら、そうでなければ、ワクチン接種によりウイルス複製および/またはウイルスによる潜伏感染が誘導される可能性があるからである。EBV VLPは、エンベロープ、テグメントおよびカプシドタンパク質をはじめとする数十種類の溶解性タンパク質を含有する可能性があり；EBVテグメントタンパク質は、機能的および構造的特性評価、または他のヘルペスウイルスのテグメントタンパク質に対する相同性のいずれかにより同定されてきた（Johannsen et al. (2004), Proc Natl Acad Sci U S A 101: 16286；Tarbouriech et. al. (2006), Acta Cryst D62:1276；Feederle et al. (2006), J Virol 80(1):9435）。しかしながら、EB-VLPは、潜伏タンパク質を欠く。つまり、EB-VLPに基づくEBVワクチンを用いることによっては、潜伏感染中のEBVにより産生されるタンパク質に対する免疫応答は期待することができない。
【0005】
適応性免疫系の重要な枝は、エピトープ特異的T細胞である。ヒトでは、これらの細胞はその表面にT細胞受容体を有し、該受容体の認識ドメインは、抗原性ペプチド（T細胞エピトープ）と主要組織適合性複合体（MHC）タンパク質との間の決められた複合体に対して特異的である。T細胞受容体が同族相互作用（cognate interaction）で嵌合する場合、T細胞は活性化され、増殖し、免疫応答でのその活性化性または阻害性の役割を果たす。
【0006】
MHC分子は、以下の2種類の形態を採る：MHCクラスIはすべてのヒト細胞の表面上に発現され、本質的にランダムに、細胞のサイトゾル中に存在するタンパク質由来のペプチドを提示し；つまり、それらは、細胞のタンパク質レパートリーの継続的な概観を提供し、かつ、例えば、細胞のウイルス感染中または発癌での、非正常タンパク質発現の認識を可能にする。MHCクラスI分子-ペプチド複合体を認識するために、T細胞受容体は、共受容体としてCD8表面タンパク質を必要とする。つまり、CD8+と称される、CD8共受容体を発現するT細胞のサブクラスがあり；それらの主要であるが唯一ではない機能は、細胞内での潜在的な発病過程（例えば、ウイルス感染）を示唆するペプチドを提示する体細胞を排除することであり、このため、それらは細胞傷害性T細胞とも称される。
【0007】
MHCクラスIIは、プロフェッショナル抗原提示細胞（APC）上のみで発現される。これらの細胞上では、主にエンドサイトーシスにより、APCによって消化されたタンパク質に由来するペプチドが提示される。MHCクラスIIの認識は、CD4+ T細胞の表面上でのみ発現される共受容体CD4を必要とする。Tヘルパー細胞とも称されるこれらのT細胞の主要な役割は、CD8+ T細胞、マクロファージ、およびB細胞の活性化である。したがって、APCに好適なエピトープが送達されると、これらのエピトープがMHCクラスIIを介してヘルパーT細胞に提示され、次いで、これらのT細胞が活性化され、免疫系の他の枝の活性化が引き起こされる。重要なことに、CD19/CD21複合体の同時嵌合（co-engagement）により、抗原によるB細胞受容体単独の嵌合（engagement）と比較して、迅速かつ効率的な抗原性ペプチド/クラスII複合体の産生がもたらされるという実験的証拠が存在する（Fearon et al. (2000), Annu Rev Immunol 18:393-422）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Kieff and B. Rickinson. (2006), Epstein-Barr virus and its replication, In D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.), Fields virology, 5th ed. Lippincott-Raven, Philadelphia, PA. 2603-2654
【非特許文献2】Kuppers, R. (2003). B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus, Nat. Rev. Immunol. 3:801-812
【非特許文献3】Laichalk, L. L., and D. A. Thorley-Lawson. (2005), Terminal differentiation into plasma cells initiates the replicative cycle of Epstein-Barr virus in vivo. J. Virol. 79:1296-1307
【非特許文献4】Rickinson, A. B., and E. Kieff. (2006), Epstein-Barr virus, In D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.), Fields virology, 5th ed. Lippincott- Raven, Philadelphia, PA., 2655-2700
【非特許文献5】Rooney, C. M., et al., (1998), Infusion of cytotoxic T cells for the prevention and treatment of Epstein-Barr virus-induced lymphoma in allogeneic transplant recipients. Blood 92:1549-1555
【非特許文献6】Rees L, et al. (2009), A phase I trial of Epstein-Barr virus gp350 vaccine for children with chronic kidney disease awaiting transplantation. Transplantation 88(8):1025-9
【非特許文献7】Greenstone, H. L., et. al. (1998), Chimeric papillomavirus virus-like particles elicit antitumor immunity against the E7 oncoprotein in an HPV16 tumor model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1800-1805
【非特許文献8】Mandic, A., and T. Vujkov. (2004). Human papillomavirus vaccine as a new way of preventing cervical cancer: a dream or the future? Ann. Oncol. 15:197-200
【非特許文献9】Johannsen et al. (2004), Proc Natl Acad Sci U S A 101: 16286
【非特許文献10】Tarbouriech et. al. (2006), Acta Cryst D62:1276；Feederle et al. (2006), J Virol 80(1):9435
【非特許文献11】Fearon et al. (2000), Annu Rev Immunol 18:393-422
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
したがって、特に、EBV感染に対する、ワクチン接種のための信頼できる手段を提供する必要性が、当技術分野にはある。さらに、上記で論じた通りの先行技術の欠点を少なくとも部分的に回避する手段および方法を提供する必要性がある。この課題は、独立項に記載の特徴を含む特許請求対象（subject matter）により解決される。単独で、またはいずれかの任意の組み合わせで実現され得る好ましい実施形態が、従属項に列記される。
【課題を解決するための手段】
【0010】
したがって、本発明は、エプスタイン・バーウイルス様粒子（EB-VLP）を含む調製物であって、該EB-VLPが、エプスタイン・バーウイルス（EBV）DNAを本質的に含まず、該EB-VLPが、EBVテグメントポリペプチドの少なくとも1種のペプチドおよび少なくとも1種の免疫原性ペプチドを含むワクチン接種ポリペプチドを含む、調製物に関する。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】EBVビリオンの抗原性スペクトルが、BNRF1潜伏タンパク質遺伝子融合体の構築を介して拡大されることを示す図である。(A) BNRF1-EBNA3C融合タンパク質をコードするEBVビリオンは、BNRF1およびEBNA3C特異的CD4+ T細胞を刺激する。自家LCLを、様々な量（1×104～1×106個のゲノム当量（geq））のwtEBVまたはEBVE3Cを用いてパルス刺激し、続いて、BNRF1 VSDまたはEBNA3C 5H11エピトープに特異的なCD4+ T細胞と共に共培養した。並行して、LCLを、対照ペプチド（μg～ng量）を用いてパルス刺激し、続いてCD4+ T細胞と共に共培養した。T細胞活性化を、ELISAにより分泌型IFN-γを測定することにより決定した。(B) gp350を認識する中和抗体は、wtEBVおよびEBV-E3Cの抗原性を低下させる。中和抗体72A1を力価測定し（50、5および0μg/mL）、かつ1×106geqのwtEBVおよびEBV-E3Cと共にインキュベートした。その後、上清を、T細胞活性化アッセイで用いた。各チャートに示されるデータは、トリプリケートの値であり、エラーバーは標準偏差を表す。さらに、各グラフは、少なくとも3回のうちの代表的実験である。
【図2】gp110を欠損している改変型VLPs/LPsは抗原性であり、複数のEBV特異的T細胞を刺激することを示す図である。VLPs/LPs-E3C-E1は、gp110の非存在下でそれらの抗原性特性を保持する。自家LCLを、対照ペプチド、VLPs/LPs-E3C-E1（1×106粒子）またはEBV-E3C-E1（1×106geq）を用いてパルス刺激し、gp350 1D6、BNRF1 VSD、EBNA3C 5H11またはEBNA1 3E10エピトープに特異的であるT細胞と共に培養した。T細胞活性を、ELISAを用いてIFN-γ放出を定量化することにより決定した。グラフ中に示されるデータはトリプリケートの値の平均であり、エラーバーは標準偏差を表す。さらに、各グラフは、少なくとも3回のうちの代表的実験である。
【図3A】EBNA1断片を含有するVLPs/LPsが、EBVに感染したB細胞を効果的に標的化するT細胞を増殖させることを示す図である。(A) 誘導された293/VLPs/LPs-EBNA1RI、293/VLPs/LPs-EBNA1RIIおよび293/VLPs/LPs-EBNA1RI:II産生細胞によるBNRF1-EBNA1融合タンパク質の発現。ウエスタンブロット分析は、α-BNRF1およびα-アクチン抗体を用いて行なった。
【図3B】EBNA1断片を含有するVLPs/LPsが、EBVに感染したB細胞を効果的に標的化するT細胞を増殖させることを示す図である。(B) EBNA1を含有するVLPs/LPsは、CD4+ T細胞を主に増殖させる。VLPs/LPs-EBNA1RIおよびVLPs/LPs-EBNA1RIIを1：1比率で組み合わせ（VLPs/LPs-EBNA1RI+RII）、8名のハプロタイプ分類されていないEBV陽性ドナー由来のPBMCを刺激するために用いた。同じドナー由来のPBMCを、gp350-AgAbを用いて並行して刺激した。ex vivo培養物を、2回の刺激サイクル後にCD3、CD4およびCD8に対して染色し、フローサイトメトリーを用いて分析した。ex vivo培養物中のCD4+、CD8+および合計T細胞（CD3+）の割合（％）を示す。
【図3C】EBNA1断片を含有するVLPs/LPsが、EBVに感染したB細胞を効果的に標的化するT細胞を増殖させることを示す図である。(C) VLPs/LPs-EBNA1RI+RII特異的T細胞は、感染の最初の5日間、EBVに感染したB細胞を効果的に標的化する；フローサイトメトリーの概要は、4名のドナーから得られたものである。4名のドナー由来のPBMCを(B)に記載される通りに刺激し、続いて、B95-8に一晩感染させたB細胞と共に共培養した。加えて、感染B細胞を、培地のみ、またはCD19枯渇（CD19-）PBMCと共に培養し、これらはそれぞれ、EBVに感染したB細胞のT細胞媒介型標的化に対する陰性対照および陽性対照として機能した。ex vivo培養物を、フローサイトメトリーを用いて、感染5日間後に分析した。フローサイトメトリーのために、細胞を、CD19に対して染色し、CD19+GFP+二重陽性B細胞の割合（％）を定量化した。組み換えB95-8株はGFPをコードするので、これにより、感染B細胞をGFP発現を通じて特定することが可能になった。ex vivo培養物中のCD19+GFP+ B細胞の割合（％）を、培地のみの対照のものと比較して表す。
【図4】VLPs/LPs-EBNA1RI+RII特異的T細胞が、B95-8およびM81感染B細胞の増生を妨げることを示す図である。gp350またはVLPs/LPs-EBNA1RI+RIIを認識するT細胞は、図3に記載される通りの8名のハプロタイプ分類されていないEBV陽性ドナーのPBMCから増殖させた。自家初代B細胞にB95-8またはM81を一晩感染させ、続いて、刺激されたPBMCと共に共培養した。並行して、感染B細胞を、培地のみの中で、またはCD19- PBMCと共に培養した。15日間後、ex vivo培養物を、CD19およびCD23に対して染色し、続いて、フローサイトメトリーにより分析した。図は、8名のドナーから得られたデータのまとめを示す。すべての培養物中のCD19+CD23+ B細胞の割合（％）を、gp350特異的T細胞の存在下でのCD19+CD23+ B細胞の割合（％）と比較して表す。統計学的分析は、両側スチューデントT検定を用いて行なった。0.05未満のP値のみを示す。
【図5A】EBNA1を含有するVLPs/LPsが細胞溶解性gp350およびEBNA1特異的CD4+ T細胞の増殖を可能にすることを示す図である。(A) ex vivo増殖させたCD4+ T細胞は、EBNA1またはgp350に特異的である。自家LCLを、EBNA1-AgAb、gp350-AgAb、EBNA1 3G2エピトープまたはgp350 1D6エピトープを用いてパルス刺激し、続いて、CD4+ T細胞と共に共培養した。放出IFN-γを、ELISAにより定量化した。各データ点は3回の値の平均であり、エラーバーは標準偏差を表す。各実験は、少なくとも3回のうちの代表である。
【図5B】EBNA1を含有するVLPs/LPsが細胞溶解性gp350およびEBNA1特異的CD4+ T細胞の増殖を可能にすることを示す図である。(B) EBNA1およびgp350特異的CD4+ T細胞は、グランザイムBを放出する。自家LCLを、EBNA1-AgAb、gp350-AgAbまたは関連するペプチド（EBNA1 3G2およびgp350 1D6）を用いてパルス刺激し、続いて、CD4+ T細胞と共に共培養した。グランザイムBの放出を、ELISAを用いて定量化した。各チャート中に示されるデータはトリプリケートの値を表し、エラーバーは標準偏差を表す。各グラフは、少なくとも3回のうちの代表的実験である。
【図5C】EBNA1を含有するVLPs/LPsが細胞溶解性gp350およびEBNA1特異的CD4+ T細胞の増殖を可能にすることを示す図である。(C) EBNA1およびgp350特異的CD4+ T細胞は、VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIを用いてパルス刺激された標的細胞を溶解させる。自家LCLを、VLPs/LPs-EBNA1RI+RII、EBNA1 3G2、gp350 1D6またはEBNA3C 5H11（陰性対照）ペプチドを用いて一晩パルス刺激した。その後、パルス刺激されたLCLをカルセインAMと共にインキュベートし、続いて、漸増量のEBNA1またはgp350特異的CD4+ T細胞と共に共培養した。1～30のエフェクター対標的（E.T）比を用いた。標的化された細胞からのカルセインの放出を、485nm光を用いた励起後に535nmで測定した。各データ点は3回の値の平均であり、かつエラーバーはエラーバーを表す。さらに、各実験は、2回の実験の代表である。
【図6】VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIを用いたヒト化マウスのワクチン接種が防御免疫を賦与することを示す図である。(A) 脾臓のEBER染色に基づくEBV感染の発生率。(B) 末梢血のリアルタイムqPCR分析に基づくEBV感染の発生率。統計学的解析は、片側カイ二乗検定を用いて、示された結果に対して行なった。0.05未満のP値のみを示す。
【図7】BNRF1潜伏タンパク質融合体をコードするEBV BAC DNAの構築を示す図である。(A) galK組み換えを、EBNA3C (E3C) 5H11エピトープをコードする150bp断片を用いて行なった。組み換え前後のEcoRIおよびBamHI制限部位を、これらの酵素により生成される断片のサイズと共に示す。(B) EcoRIおよびBamHIを用いる制限酵素消化は、293産生細胞由来のEBV-E3C BAC DNAが、大腸菌中で構築されたEBV-E3C BAC DNAと同じ制限断片を生じたことを確認した。白色矢印は、wtEBV DNA（B95-8）とgalK組み換えにより改変されたDNAとの間で異なるDNA断片を強調する。他の構築物の構築および確認は、同様に行なわれた。
【発明を実施するための形態】
【0012】
下記で用いられる場合、用語「有する」、「含有する（comprise）」もしくは「含む（include）」またはそれらのいずれかの任意の文法的変形は、非排他的に用いられる。つまり、これらの用語は、これらの用語により導入される特徴以外に、さらなる特徴が本文脈中に記載される実体中に存在しない状況、および1種以上のさらなる特徴が存在する状況の両方を意味し得る。例として、表現「AはBを有する」、「AはBを含有する」および「AはBを含む」は、B以外に、他の要素がAの中に存在しない状況（すなわち、Aが唯一かつ排他的にBからなる状況）および、B以外に、1種以上のさらなる要素が実体Aの中に存在する（要素C、要素CおよびD、またはさらなる要素など）状況の両方を意味し得る。
【0013】
さらに、下記で用いられる場合、用語「好ましくは」、「より好ましくは」、「最も好ましくは」、「特に」、「より詳細には」、「具体的には」、「より具体的には」または類似の用語は、さらなる可能性を制限することなく、任意選択的な特徴と共に用いられる。つまり、これらの用語により導入される特徴は任意選択的な特徴であり、特許請求の範囲を制限することは決して意図されない。本発明は、当業者が認識するだろうように、代替的な特徴を用いることにより実行されることができる。同様に、「一実施形態では」または同様の表現により導入される特徴は、本発明のさらなる実施形態に関するいかなる制限も含まず、本発明の範囲に関するいかなる制限も含まず、かつそのような方法で導入される特徴と本発明の他の任意選択的または非任意選択的な特徴とを組み合わせる可能性に関するいかなる制限も含まずに、任意選択的な特徴であることが意図される。
【0014】
本明細書中で用いる場合、用語「標準的な条件」とは、別途明記されない場合、IUPAC標準環境温度および圧力（SATP）条件、すなわち、好ましくは25℃の温度および100kPaの絶対圧力に関し；また好ましくは、標準的な条件は、pH7を含む。さらに、別途示されない場合、用語「約」とは、関連分野で一般的に許容されている技術的精度を伴う、示された値に関し、好ましくは、示された値±20％、より好ましくは±10％、最も好ましくは±5％に関する。さらに、用語「本質的には」とは、本明細書中に以下で別途定義されない場合、示される結果または使用に対する影響を有する逸脱が存在しないこと、すなわち、考えられる逸脱が、示される結果の、±20％超、より好ましくは±10％、最も好ましくは±5％の逸脱を引き起こさないことを示す。つまり、「本質的に～からなる」とは、特定される構成成分を含むが、不純物として存在する物質、構成成分を提供するために用いられるプロセスの結果として存在する不可避の物質、および本発明の技術的効果を達成する以外の目的のために添加される構成成分を除く、他の構成成分を除外することを意味する。例えば、「本質的に～からなる」との語句を用いて定義される組成物は、いずれかの公知の許容可能な添加剤、賦形剤、希釈剤、担体等を包含する。好ましくは、本質的に1組の構成成分からなる組成物は、5重量％未満、より好ましくは3重量％未満、さらにより好ましくは1％未満、最も好ましくは0.1重量％未満の特定されていない構成成分を含有するであろう。核酸配列の文脈では、用語「本質的に同一な」とは、少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性％値を示す。理解されるであろう通り、本質的に同一な、との用語は、100％同一性を含む。上記は、「本質的に相補的な」との用語に準用される。
【0015】
用語「エプスタイン・バー（Epstein-Barr）ウイルス様粒子」または「EB-VLP」とは、本明細書中で用いる場合、好適な宿主細胞で溶解複製せず、かつ潜伏感染を確立しない、EBV由来のウイルス粒子を意味し、好ましくは、電子顕微鏡により分析した場合に、本質的に典型的なヘルペスウイルス構造を有し、すなわち、カプシド、テグメント、および外膜を有する。しかしながら、正常ヘルペスウイルス粒子とは対照的に、本発明のEB-VLPは空であり、すなわち、EBV DNAを含有せず、好ましくはDNAを全く含有しない。EB-VLPは、M81株（国際公開第2013/098364号の配列番号38）をはじめとする公知のEBV型（例えば、1型EBV：Genbank登録番号：NC_007605.1；de Jesus O et al. (2003) J. Gen. Virol. 84, 1443-1450および2型EBV：Genbank登録番号：NC_009334.1、Dolan A et al. (2006) Virology Vol.350, 164-170）に関して当業者に公知であるEBウイルスタンパク質（例えば、カプシド、テグメント、外被、シェル、表面タンパク質またはエンベロープタンパク質、および糖タンパク質）を含む。
【0016】
EBVによりコードされるタンパク質に加えて、本明細書中で言及されるEB-VLPはまた、本明細書中のどこかで特定される少なくとも1種のワクチン接種ポリペプチドも含む。さらに、EB-VLPは、好ましくは、1種以上の人工ポリペプチドをさらに含むことができる。用語「人工ポリペプチド」とは、野生型EBVに含まれない、EB-VLPへと組み込まれるいずれかのポリペプチドに関する。人工ポリペプチドが組み込まれ、したがってEB-VLP中に含められるか否かは、本発明の方法に従ってEB-VLPを取得し、産生細胞からEB-VLPを分離し（例えば、下記の実施例に記載される通り、遠心分離により、または免疫沈降により）、続いて、該EB-VLP中の人工ポリペプチドの存在を決定すること（例えば、国際公開第2013/098364号に記載される免疫ブロット法または特定のポリペプチドに好適でありかつ当業者に公知のいずれかの他の方法により、達成することができる）により評価することができる。好ましくは、人工ポリペプチドは、ヘルペスウイルス糖タンパク質の膜内在性部分（membrane-integral part）を含む融合ポリペプチドである。
【0017】
しかしながら、1種以上の非必須EBウイルスポリペプチドがEB-VLPから欠損していることもまた、本発明により想定される。本明細書の文脈では、「非必須EBVポリペプチド」とは、野生型EBウイルス粒子に組み込まれるが、EB-VLPの形成に必須でないポリペプチドに関する。ポリペプチドは、該ポリペプチドの非存在下で本明細書の方法に従ってVLPを産生するよう好適な宿主細胞を誘導した後、電子顕微鏡または国際公開第2013/098364号の実施例中に記載される他の方法のうちの1種によりVLPが検出可能である場合、非必須である。例えば、EBV野生型BNRF1遺伝子の産物は、EB-VLPから欠損していてもよい。さらに、特にワクチン接種ポリペプチドが、本明細書中のどこかに特定される通りのEBVテグメントポリペプチドへのワクチン接種ポリペプチドのN末端またはC末端融合体を含む場合、該EBVテグメントポリペプチドの野生型変異体は、好ましくはEB-VLPには存在しない。EBVの溶解性感染中に宿主細胞からポリペプチドを除く方法は、当業者に周知である。好ましくは、ポリペプチドは、ウイルスゲノムから当該ポリペプチドをコードする遺伝子を欠失させることにより、または遺伝的操作により（例えば、開始コドンを非開始コドンへと突然変異させることにより）当該遺伝子を発現不可能にすることにより、除くことができる。
【0018】
用語「実質的にEBV DNAを含まない」との用語は、本明細書中で用いる場合、当業者により理解されるであろう。この用語は、すべてのEB-VLPがEBV DNAを含まないことを必ずしも意味しない。しかしながら、この用語は、調製物中のEBV粒子の総数（すなわち、EBV DNAを含むEBV粒子とEBV DNAを含まないEB-VLPとの合計）に対するEBV DNAを含まないEB-VLPの割合が、野生型EBVと比較して、好ましくはB95.8株と比較して、少なくとも1000倍、好ましくは少なくとも104倍、より好ましくは少なくとも105倍、さらにより好ましくは少なくとも106倍に増加している。つまり、好ましくは、実質的にEBV DNAを含まないEB-VLPは、好ましくは国際公開第2013/098364号の実施例に記載される通りに産生されPCRアッセイで調べられた場合に、10000個未満のEBVゲノム/上清mL、より好ましくは1000個未満のEBVゲノム/上清mL、さらにより好ましくは100個未満のEBVゲノム/上清mL、最も好ましくは10個未満のEBVゲノム/上清mLを含むEB-VLPである。好ましくは、EBVゲノムの数は、100個未満/106個のEBV-VLP、より好ましくは10個未満/106個のEBV-VLP、さらにより好ましくは1個未満/106個のEBV-VLP、またさらにより好ましくは0.1個未満/106個のEBV-VLP、最も好ましくは0.01個未満/106個のEBV-VLPである。好ましくは、実質的にEBV DNAを含まないEB-VLPは、国際公開第2013/09836号に記載される通りに産生され感染アッセイで調べられた場合に、10個未満の感染細胞/上清mL、より好ましくは1個未満の感染細胞/上清mL、より好ましくは0.1個未満の感染細胞/上清mL、最も好ましくは0.01個未満の感染細胞/上清mLの割合でRaji細胞での潜伏感染を確立するEB-VLPである。好ましくは、割合は、10個未満の感染Raji細胞/106個のEB-VLP、より好ましくは1個未満の感染細胞/106個のEB-VLP、さらにより好ましくは0.1個未満の感染細胞/106個のEB-VLP、最も好ましくは0.01個未満の感染細胞/106個のEB-VLPである。
【0019】
本明細書中で用いる場合、用語「ワクチン接種ポリペプチド」（vaccination polypeptide）とは、本明細書中に以下で特定される通りの、EBVテグメントポリペプチドの少なくとも1種のペプチドおよび少なくとも1種の免疫原性ペプチドを含む、任意の化学的分子に関する。EBVテグメントポリペプチドと免疫原性ペプチドとの間の化学的連結は、必ずしもペプチド結合である必要はないことが理解されるはずである。EBVテグメントポリペプチドと免疫原性ペプチドとの間の化学的結合がエステル結合、ジスルフィド結合、または当業者に公知のいずれかの他の好適な共有的化学結合であることも想定される。免疫原性ペプチドがEBVテグメントポリペプチドからは無視できる程度までしか解離しないであろう程に低い解離定数を有する非共有結合もまた想定される。好ましくは、該非共有結合に関する解離定数は、10-5mol/L未満（Strep-Tag：Strep-Tactin結合を用いる場合の通り）、10-6mol/L未満（Strep-TagII：Strep-Tactin結合を用いる場合の通り）、10-8mol/L未満、10-10mol/L未満、または10-12mol/L未満（ストレプトアビジン：ビオチン結合を用いる場合の通り）である。解離定数を決定する方法は、当業者に周知であり、かつ、例えば、分光学的滴定法（spectroscopic titration method）、表面プラズモン共鳴測定、平衡透析などが挙げられる。好ましくは、ワクチン接種ポリペプチドは、抗原提示を阻害することが知られる1種以上のペプチド配列を含まない。さらに、好ましくは、ワクチン接種ポリペプチドは、遺伝物質、すなわち、ポリヌクレオチドを含まない。好ましい実施形態では、ワクチン接種ポリペプチドは、本明細書中に記載される通りの構成成分からなる。
【0020】
好ましくは、EBVテグメントポリペプチドと免疫原性ペプチドとの間の化学的連結は、ペプチド結合であり、すなわち、ワクチン接種ポリペプチドは、EBVテグメントポリペプチドおよび本発明の免疫原性ペプチドを含むかまたはそれらからなる融合ポリペプチドである。好ましくは、免疫原性ペプチドは、該EBVテグメントポリペプチドのN末端に融合されるか、該EBVテグメントポリペプチドのC末端に融合されるか、または該EBVテグメントポリペプチドのアミノ酸配列へと挿入され、かつ/または該EBVテグメントポリペプチドのアミノ酸を置き換える。より好ましくは、本明細書中のどこかで特定される通り、免疫原性ペプチドは、BNRF1ポリペプチドのN末端に融合されるか、BNRF1ポリペプチドのC末端に融合されるか、またはBNRF1ポリペプチドのアミノ酸配列に挿入される。さらにより好ましくは、免疫原性ペプチドは、BNRF1ポリペプチドの1～172位のいずれか1箇所で該BNRF1ポリペプチドへと挿入され、かつ/またはこの位置の範囲内のアミノ酸を置き換える。最も好ましくは、免疫原性ペプチドは、113位で、すなわち、113位のアミノ酸の後ろで、該BNRF1ポリペプチドへと挿入される。つまり、好ましくは、ワクチン接種ポリペプチドは、配列番号1、2、もしくは3、またはそれらに対して少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも99％同一であるそれらの変異体のアミノ酸配列を含み、好ましくは該アミノ酸配列からなり；最も好ましくは、ワクチン接種ポリペプチドは、配列番号1、2、または3のアミノ酸配列を含み、好ましくは該アミノ酸配列からなる。
【0021】
本明細書中で用いる場合、用語「ポリペプチド変異体」とは、示される活性を有するが示されるポリペプチドまたは融合ポリペプチドとは一次構造が異なる、本明細書中のどこかで特定される通りの少なくとも1種のポリペプチドまたは融合ポリペプチドを含む、いずれかの化学的分子に関する。つまり、ポリペプチド変異体は、好ましくは、示される活性を有するムテインである。好ましくは、ポリペプチド変異体は、上記で特定される通りのポリペプチド中に含められる、100～2000個、より好ましくは200～1800個、さらにより好ましくは300～1600個、または最も好ましくは500～1500個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドを含む。さらに、上述のポリペプチドのさらなるポリペプチド変異体もまた包含される。そのようなポリペプチド変異体は、特定ポリペプチドと少なくとも本質的に同じ生物学的活性を有する。さらに、本発明に従って参照される通りのポリペプチド変異体が、少なくとも1箇所のアミノ酸置換、欠失および/または付加により異なっているアミノ酸配列を有するであろうことが理解されるはずであり、このとき、該変異体のアミノ酸配列は依然として、特定される通りの程度まで、特定のポリペプチドのアミノ酸配列と同一である。2種類のアミノ酸配列間の同一性の程度は、当技術分野で周知のアルゴリズムにより決定することができる。好ましくは、同一性の程度は、比較ウインドウにわたって2種類の最適にアライメントされた配列を比較することにより決定され、このとき、比較ウインドウ中のアミノ酸配列の断片が、最適なアライメントのために比較される配列と比較して、付加または欠失（例えば、ギャップまたはオーバーハング）を含む場合がある。パーセンテージは、両方の配列中に同一のアミノ酸残基が存在する位置の数を、好ましくはポリペプチドの全長にわたって、決定することにより、マッチする位置の数を取得し、比較ウインドウ中の位置の総数でマッチする位置の数を除算し、その結果に100を乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。比較のための配列の最適なアライメントは、Smith and Waterman (1981)の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch (1970)の相同性アライメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman (1988)の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装により（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI中のGAP、BESTFIT、BLAST、PASTA、およびTFASTA）、または目視検査により、実行することができる。2種類の配列が比較のために特定されていると仮定すると、GAPおよびBESTFITが、それらの最適なアライメント、つまり、同一性の程度を決定するために好ましく用いられる。好ましくは、ギャップウェイト（gap weight）に関して5.00およびギャップウェイトレングス（gap weight length）に関して0.30のデフォルト値が用いられる。本明細書中で言及されるポリペプチド変異体は、対立遺伝子変異体またはいずれかの他の生物種特有のホモログ、パラログ、もしくはオルソログであり得る。さらに、本明細書中で言及されるポリペプチド変異体は、特定のポリペプチドの断片、または上述のタイプのポリペプチド変異体を、それらの断片および/または変異体が本明細書中で言及される通りの生物学的活性（1種類または複数種類）を有する限り、含む。そのような断片は、例えば、ポリペプチドの分解産物またはスプライシング変異体であるか、またはそれらに由来し得る。さらに、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、SUMO化、もしくはミリスチル化などの翻訳後修飾により、非天然アミノ酸を含めることにより、かつ/またはペプチドミメティクスであることにより、異なっている変異体が含まれる。
【0022】
好ましくは、ワクチン接種ポリペプチドおよび/または人工ポリペプチドは、存在する場合、検出可能なタグをさらに含む。用語「検出可能なタグ」とは、本発明のワクチン接種ポリペプチドに付加されるかまたは導入されるアミノ酸の伸長部（stretch）を意味する。好ましくは、タグは、本発明のワクチン接種ポリペプチドのC末端またはN末端に付加されるであろう。アミノ酸の伸長部は、該タグを特異的に認識する抗体による融合ポリペプチドの検出を可能にするか、またはキレート剤などの機能的コンホメーションの形成を可能にするか、または蛍光による可視化を可能にするであろう。好ましいタグは、Mycタグ、FLAGタグ、6-Hisタグ、HAタグ、GSTタグまたはGFPタグである。これらのタグは、すべて当技術分野で周知である。好ましくは、上記で特定される通りのタグ、より好ましくはMycタグ、FLAGタグ、6-Hisタグ、HAタグ、GSTタグまたはGFPタグは、本明細書中で言及される通りの免疫原性ペプチドでない。
【0023】
用語「EBVテグメントポリペプチド」とは、本明細書中で用いる場合、EBV粒子、すなわち、野生型EBV粒子および/もしくは本明細書中で特定される通りのEB-VLPのテグメントへと組み込まれる生物学的活性を少なくとも有する公知のポリペプチド、または該生物学的活性を有するその断片に関する。つまり、好ましくは、EBVテグメントポリペプチドは、BNRF1ポリペプチド（Genbank登録番号：P03179.1）、BBLF1ポリペプチド（Genbank登録番号：P0CK52.1）、BDLF2ポリペプチド（Genbank登録番号：P03225.1）、BGLF1ポリペプチド（Genbank登録番号：P03222.1）、BGLF2ポリペプチド（Genbank登録番号：P0CK54.1）、BKRF4ポリペプチド（Genbank登録番号：P30117.1）、BLRF2ポリペプチド（Genbank登録番号：P03197.1）、BOLF1ポリペプチド（Genbank登録番号：P03189.1）、BPLF1ポリペプチド（Genbank登録番号：P03186.1）、BRRF1ポリペプチド（Genbank登録番号：P03207.1）、BSRF1ポリペプチド（Genbank登録番号：P0CK50.1）、または上記の生物学的活性を有する該ポリペプチドのうちの1種の断片である。より好ましくは、EBVテグメントポリペプチドは、BNRF1ポリペプチドまたは該生物学的活性を有するその断片である。最も好ましくは、EBVテグメントポリペプチドは、BNRF1ポリペプチドである。当業者には理解されるであろう通り、EBVテグメントポリペプチドの文脈で、本明細書中で言及される用語「断片」としては、N末端断片、C末端断片、ならびに1個以上のアミノ酸が異なるアミノ酸により置き換えられたEBVテグメントポリペプチド、すなわち、該EBVテグメントポリペプチドのN末端およびC末端部分を含むポリペプチドが挙げられる。
【0024】
用語「免疫原性ペプチド」は、被験体に投与される場合に、それ自体に対する、および好ましくは、該免疫原性ペプチドを含む化合物に対する免疫応答を誘導する活性を有する、いずれかのペプチドに関するものとして当業者により理解される。当業者が理解する通り、すべての免疫原性ペプチドが、各被験体において上記活性を有するわけではないであろうし；例えば、MHC分子の特定のサブタイプにより制限される（すなわち、その文脈で提示される）免疫原性ペプチドは、当該MHCサブタイプを有する被験体のみで免疫原性であり得る。つまり、本明細書中で用いる場合、免疫原性ペプチドとの用語は、好適な被験体で免疫応答を誘導する活性を有するペプチドに関する。
【0025】
好ましくは、免疫原性ペプチドは、少なくとも1種のT細胞エピトープを含む。T細胞エピトープは、当業者に公知である通り、ペプチドまたはポリペプチド中に含まれるアミノ酸の連続的な配列であり、主要組織適合性複合体（MHC）クラスIまたはクラスII分子に結合して細胞（MHC-I）またはプロフェッショナル抗原提示細胞（MHC-II）の表面に提示されることができる。当業者は、MHC-IまたはMHC-II上に提示される免疫原性ペプチドを予測する方法（Nielsen et al., (2004), Bioinformatics, 20 (9), 1388-1397), Bordner (2010), PLoS ONE 5(12): e14383）および特定のペプチドの結合性を評価する方法（例えば、Bernardeau et al., (2011), J Immunol Methods, 371(1-2):97-105）を知っている。また、T細胞エピトープは、公共データベース中で、例えば、www.iedb.orgの下に利用可能な免疫エピトープデータベースから、入手可能である。好ましくは、T細胞エピトープは、MHC-IIエピトープである。好ましくは、T細胞エピトープは、腫瘍抗原由来のエピトープ、すなわち、本質的に腫瘍細胞中または腫瘍細胞上にのみ発現されるタンパク質中に含まれるアミノ酸配列である。より好ましくは、T細胞エピトープは、B細胞リンパ球腫瘍抗原由来のエピトープである。また好ましくは、少なくとも1種の免疫原性ペプチドは、病原性微生物の、好ましくはウイルスの、より好ましくはヘルペスウイルスの免疫原性ペプチドである。より好ましくは、少なくとも1種の免疫原性ペプチドは、免疫原性EBVペプチドであり、さらにより好ましくは潜伏EBVポリペプチドの免疫原性EBVペプチドである。つまり、好ましくは、少なくとも1種の免疫原性ペプチドは、配列番号32～210から、好ましくは配列番号32～96から選択される少なくとも1種の配列のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、少なくとも1種の免疫原性ペプチドは、好ましくは配列番号32～91および97～161から選択される、少なくとも1種のT細胞エピトープを含む潜伏EBVポリペプチドの免疫原性ペプチドである。またさらにより好ましくは、少なくとも1種の免疫原性ペプチ
ドは、好ましくは配列番号32～91から選択され、好ましくは少なくとも1種のMHCクラスIIエピトープを含む、少なくとも1種のT細胞エピトープを含む潜伏EBVポリペプチドの免疫原性ペプチドである。好ましくは、潜伏EBVポリペプチドは、EBNA-1、EBNA-LP、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、LMP-1、およびLMP-2Aからなるリストより選択され；より好ましくはEBNA-1である（Long et al. (2011), Curr Opin Immunol 23(2):258-64）。
ドは、好ましくは配列番号32～91から選択され、好ましくは少なくとも1種のMHCクラスIIエピトープを含む、少なくとも1種のT細胞エピトープを含む潜伏EBVポリペプチドの免疫原性ペプチドである。好ましくは、潜伏EBVポリペプチドは、EBNA-1、EBNA-LP、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、LMP-1、およびLMP-2Aからなるリストより選択され；より好ましくはEBNA-1である（Long et al. (2011), Curr Opin Immunol 23(2):258-64）。
【0026】
好ましくは、免疫原性ペプチドは、MHCクラスI分子により提示され、好ましくはCD8+ T細胞を刺激するペプチドであり；つまり、より好ましくは、免疫原性ペプチドは、配列番号97、99～109、111～119、121～136、138、141～144、147、149～156、158～161、および164～194から選択され、好ましくは、配列番号97、99～109、111～119、121～136、138、141～144、147、149～156、および158～161から選択される少なくとも1種のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、免疫原性ペプチドは、MHCクラスII分子により提示され、好ましくはCD4+ T細胞を刺激するペプチドであり；つまり、より好ましくは、免疫原性ペプチドは、配列番号32～91、98、110、120、137、139、140、145、146、148、157、162、163、および195～210から選択され、好ましくは、配列番号32～91、98、110、120、137、139、140、145、146、148、および157、最も好ましくは配列番号32～91から選択される少なくとも1種のアミノ酸配列を含む。
【0027】
好ましくは、T細胞エピトープは、強力なT細胞エピトープ（strong T-cell epitope）であり、用語「強力なT細胞エピトープ」とは、該T細胞エピトープを認識するT細胞が被験体内に存在する確率が高いT細胞エピトープに関する。つまり、好ましくは、強力なT細胞エピトープを認識するT細胞は、被験体内に高頻度に存在する。好ましくは、T細胞エピトープは、該被験体に一般的に感染するか、またはそれに対して該被験体がワクチン接種されているウイルスのタンパク質から選択される。最も好ましい免疫原性ペプチドは、EBNA1 3E10エピトープ（NPKFENIAEGLRALL、配列番号32）、EBNA 3G2エピトープ（KTSLYNLRRGTALAI、配列番号33）、EBNA3C 5H11エピトープ（ENPYHARRGIKEHVI、配列番号34）、EBNA-3C 3H10エピトープ（VVRMFMRERQLPQS、配列番号35）、および/または配列番号36のうちの少なくとも7個、好ましくは少なくとも8個、より好ましくは少なくとも9個、最も好ましくは少なくとも10個のアミノ酸の配列などの、EBV潜伏抗原由来のエピトープを含むペプチドである。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、BNRF1ポリペプチドでなく、より好ましくは、EBVのテグメントポリペプチド由来の免疫原性ポリペプチドでない。
【0028】
用語「調製物」は、少なくとも示される構成成分を含む物質のいずれかの組成物に関するものとして当業者に理解される。つまり、調製物は、さらなる構成成分、特に少なくとも1種の溶媒、好ましくは水、緩衝剤、好ましくはリン酸緩衝剤、ギ酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、もしくはクエン酸緩衝剤、および/または1種以上の塩、好ましくは塩化ナトリウム、又は塩化カリウム等を同様に含むことができる。好ましくは、調製物は、医薬組成物である。
【0029】
用語「医薬組成物」とは、本明細書中で用いる場合、本発明の化合物（1種類または複数種類）を、製薬上許容される形態で、かつ製薬上許容される担体中に含む組成物に関する。本発明の化合物は、製薬上許容される塩として製剤化することができる。許容される塩は、酢酸塩、HCl、硫酸塩、及び塩化物塩等を含む。医薬組成物は、好ましくは、局所的または全身的に投与される。薬物投与のために慣用的に用いられる好適な投与経路は、経口投与、静脈内投与、または非経口投与、ならびに吸入である。好ましくは、本発明の医薬組成物は、非経口投与を介して、好ましくは皮下に、筋内に、または腹腔内に投与される。被験体がヒトである場合、投与は、好ましくは筋内、または、より好ましくは、静脈内である。しかしながら、ポリヌクレオチド化合物はまた、ウイルスベクター、ウイルスまたはリポソームを用いることにより、遺伝子療法アプローチで投与されてもよく、局所的に、例えば、軟膏剤として、投与されてもよい。さらに、化合物は、共通の医薬組成物中で、または別個の医薬組成物として、他の薬物と組み合わせて投与することができ、このとき、該別個の医薬組成物は、部品のキット（kit of parts）の形態で提供され得る。特に、アジュバントの追加投与が想定され得る。
【0030】
化合物は、好ましくは、慣用の手順に従って標準的な医薬担体と構成成分とを組み合わせることにより調製される慣用の投与剤形中で投与される。これらの手順は、成分を適宜、所望の調製物へと、混合するステップ、顆粒化するステップおよび圧縮するステップまたは溶解させるステップを含むことができる。製薬上許容される担体または希釈剤の形態および特性が、それが組み合わされる活性成分の量、投与経路および他の周知の変数により決定付けられることが理解されるであろう。
【0031】
担体は、製剤の他の成分と適合性であること、およびそのレシピエントに対して有害でないという意味で、許容可能でなければならない。用いられる医薬担体は、例えば、固体、ゲルまたは液体であり得、好ましくは水性液体である。つまり、液体担体の例示は、リン酸緩衝食塩溶液、シロップ、油（ラッカセイ油およびオリーブ油など）、水、エマルジョン、種々のタイプの湿潤化剤、及び無菌溶液等である。前記好適な担体は、上述のものおよび当技術分野で周知の他のものを含む。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaを参照されたい。希釈剤（1種類または複数種類）は、好ましくは、VLP、ワクチン接種ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および/または宿主細胞ならびに考えられるさらなる薬学的活性成分の生物学的活性に影響しないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩液、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。加えて、医薬組成物または製剤としてはまた、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療的、非免疫原性安定化剤等も挙げることができる。
【0032】
治療有効用量とは、本明細書中で言及される状態を予防、改善または治療する、本発明の医薬組成物中で用いられる化合物の量を意味する。化合物の治療有効性および毒性は、細胞培養または実験動物において標準的な製剤手順により、例えば、ED50（集団のうちの50％で治療上有効な用量）および/またはLD50（集団のうちの50％に対して致死性である用量）を決定することにより、決定することができる。治療作用と毒性作用との間の用量比が治療指数であり、これはLD50/ED50の比として表すことができる。
【0033】
投与レジメンは、好ましくは、関連する臨床的因子を考慮して、かつ好ましくは、本明細書中のどこかに記載される方法のうちのいずれか1つに従って、主治医により、決定されるであろう。医学分野では周知である通り、いずれか1名の患者に対する投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および経路、全身健康状態、および同時に投与される他の薬物をはじめとする、多数の因子に依存し得る。進行は、定期的な評価によりモニタリングすることができる。典型的な用量は、例えば、1μg～10000μgの範囲内であり得るが；しかしながら、この例示的な範囲未満またはこの範囲を超える用量が、特に上述の因子を考慮して、想定される。一般的に、レジメンは、初回免疫（primary immunization）としての1μg～10mgの抗原の投与、およびそれに続く、好ましくは同じ投与量での、同じ抗原の1回または2回以上の追加免疫投与を含む。しかしながら、被験体および投与様式に応じて、物質投与の量は、広範囲で変わり、好ましくは、約0.01mg/kg体重～約1mg/kg体重を提供し得る。本明細書中で言及される医薬組成物および製剤は、本明細書中に記載される疾患もしくは状態を治療または予防するために、少なくとも1回投与される。しかしながら、該医薬組成物は、2回以上、例えば、好ましくは、1～4回、より好ましくは2または3回投与することができる。
【0034】
具体的な医薬組成物は、製薬分野で周知の様式で調製され、活性化合物として、少なくともワクチン接種ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を、製薬上許容される担体または希釈剤と混合するかまたはそれ以外の方法で関連付けて、含む。それらの具体的な医薬組成物を製造するために、活性化合物は、通常は担体もしくは希釈剤と混合されるか、あるいはカプセル、サシェ、カシェ、紙もしくは他の好適な容器中または媒体中に封入またはカプセル化されるであろう。得られる製剤は、投与様式に適合しているはずであり、すなわち、錠剤、カプセル剤、坐剤、溶液剤、または懸濁液剤等の形態である。推奨投与量は、検討されているレシピエントに応じた用量調整を予想するための処方者またはユーザー取扱説明書中に示されるであろう。
【0035】
有利なことに、EBV粒子の免疫原性スペクトルは、EBVのテグメントタンパク質に免疫原性ペプチドを含めて、続いてこれをEB-VLPに組み込むことにより増大させることができることが見出された；この方法により、構造的（溶解性）抗原ならびに潜伏抗原に対する免疫応答を誘導し、それにより全体的な免疫を改善することが可能である。
【0036】
上記で行なわれた定義は、下記に準用される。以下でさらに行われる追加の定義および説明もまた、本明細書中に記載されるすべての実施形態に準用される。
【0037】
本発明はさらに、本発明のワクチン接種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【0038】
用語「ポリヌクレオチド」とは、本発明に従って用いる場合、本明細書中のどこかで特定される通りのワクチン接種ポリペプチドである活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチドに関する。上述された活性を測定するための好適なアッセイが、後述の実施例に記載される。上述の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、EBV BNRF1から、本発明に従って取得されており；つまり、ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号1、2、または3に示される通りのアミノ酸配列を有するポリペプチドをそれぞれコードする、配列番号4、5、または6に示される核酸配列を含む。配列番号1、2、または3に示される通りのアミノ酸配列を有するポリペプチドはまた、縮重した遺伝的コードに起因して、他のポリヌクレオチドにより同様にコードされ得ることが理解されるはずである。
【0039】
本明細書中で用いる場合、ポリヌクレオチドとの用語は、好ましくは、具体的に示されるポリヌクレオチドの変異体を含む。より好ましくは、ポリヌクレオチドとの用語は、示される特定のポリヌクレオチドに関する。しかしながら、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドはまた、遺伝的コードの縮重に起因して、多様なポリヌクレオチドによってもコードされ得ることが理解されるはずである。当業者は、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを選択する方法を知っており、該ポリヌクレオチドを発現させるために用いられる生物のコドン使用頻度に従って、ポリヌクレオチド中で用いられるコドンを最適化する方法も知っている。つまり、用語「ポリヌクレオチド変異体」とは、本明細書中で用いる場合、配列が、少なくとも1箇所のヌクレオチド置換、付加および/または欠失により上述の特定の核酸配列から誘導することができることを特徴とする核酸配列を含む、本明細書中で関連するポリヌクレオチドの変異体に関し、このとき、ポリヌクレオチド変異体は、特定のポリヌクレオチドに関して特定される通りの活性を有するであろうし、すなわち、本発明に従うワクチン接種ポリペプチドをコードするであろう。さらに、本発明に従って言及される通りのポリヌクレオチド変異体は、少なくとも1箇所のヌクレオチド置換、欠失および/または付加に起因して異なる核酸配列を有するであろうことが理解されるはずである。好ましくは、該ポリヌクレオチド変異体は、特定のポリヌクレオチドのオルソログ、パラログまたは他のホモログである。好ましくはまた、該ポリヌクレオチド変異体は、特定のポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子である。ポリヌクレオチド変異体はまた、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上述の特定のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能な核酸配列を含むポリヌクレオチドも包含する。これらのストリンジェント条件は当業者には公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6の中に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい例は、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（＝SSC）中のハイブリダイゼーション条件、およびそれに続く50～65℃での0.2×SSC、0.1％SDS中での1回以上の洗浄ステップである。これらのハイブリダイゼーション条件は、核酸の種類に応じて、かつ、例えば有機溶媒が存在する場合には、温度およびバッファーの濃度に関して、異なることを当業者は知っている。例えば、「標準的なハイブリダイゼーション条件」下では、温度は、0.1×～5×SSC（pH7.2）の濃度を有する水性バッファー中で、42℃～58℃の間で核酸の種類に応じて異なる。上述のバッファー中に有機溶媒が存在する場合（例えば、50％ホルムアミド）、標準条件下での温度は、約42℃である。DNA：DNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、例えば、0.1×SSCおよび20℃～45℃、好ましくは30℃～45℃である。DNA：RNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、例えば、0.1×SSCおよび30℃～55℃、好ましくは45℃～55℃である。上述のハイブリダイゼーション温度は、例えば、約100bp（＝塩基対）長および50％のG+C含量を有する核酸に関して、ホルムアミドの非存在下で、決定することができる。上記の教科書などの教科書、または以下の教科書を参照することにより、必要とされるハイブリダイゼーション条件を決定する方法を、当業者は知っている：Sambrook et al., “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989；Hames and Higgins (Ed.) 1985, “Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford；Brown (Ed.) 1991, “Essential Molecular Biology: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford。あるいは、ポリヌクレオチド変異体は、混合オリゴヌクレオチドプライマーに基づくDNAの増幅などPCRに基づく技術により、すなわち、本発明のポリペプチドの保存されたドメインに対する縮重プライマーを用いて、取得可能である。ポリペプチドの保存されたドメインは、本発明のポリヌクレオチドの核酸配列またはポリペプチドのアミノ酸配列と、他の生物の配列との配列比較により、特定することができる。鋳型として、細菌、真菌、植物由来もしくは、好ましくは、動物由来のDNAまたはcDNAを用いることができる。さらに、変異体としては、具体的に示される核酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。さらに、具体的に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドもまた包含される。同一性％値は、好ましくは、アミノ酸または核酸配列領域全体にわたって算出される。様々なアルゴリズムに基づく一連のプログラムが、異なる配列を比較するために当業者に利用可能である。この文脈では、Needleman and WunschまたはSmith and Watermanのアルゴリズムは、特に信頼性の高い結果をもたらす。配列アライメントを行なうために、プログラムPileUp（J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153）またはプログラムGapおよびBestFit（Needleman and Wunsch（J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)）およびSmith and Waterman（Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)）、これらは、GCGソフトウェアパケットの一部分である（Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)）が用いられるはずである。パーセント単位の上記配列同一性値（％）は、好ましくは、以下の設定を用いて配列領域全体にわたってプログラムGAPを用いて、決定されるはずである：ギャップウェイト：50、レングスウェイト：3、平均マッチ：10.000および平均ミスマッチ：0.000（別途特定されない限り、配列アライメントのための標準的設定として常に用いられるであろう）。
【0040】
具体的に示される核酸配列のうちのいずれかの断片を含むポリヌクレオチドはまた、コードされるポリペプチドが特定される通りの活性（1種類または複数種類）を有することを条件として、本発明の変異体ポリヌクレオチドとしても包含される。つまり、断片は、特定される通りの活性を依然として有するワクチン接種ポリペプチドを依然としてコードするであろう。したがって、コードされるワクチン接種ポリペプチドは、前記生物学的活性を賦与する、本発明のワクチン接種ポリペプチドのドメインを含むかまたはそれらからなることができる。本明細書中で意味する通りの断片は、好ましくは、特定の核酸配列のうちのいずれか1種の少なくとも150個、少なくとも200個、少なくとも500個もしくは少なくとも1000個の連続するヌクレオチドを含むか、または特定のアミノ酸配列のうちのいずれか1種の少なくとも200個、少なくとも300個、少なくとも500個、少なくとも800個、少なくとも1000個もしくは少なくとも1500個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする。
【0041】
本発明のポリヌクレオチドは、上述の核酸配列からなるか、本質的に該核酸配列からなるか、または該核酸配列を含むかのいずれかである。つまり、本発明のポリヌクレオチドは、さらなる核酸配列をさらに含むことができる。具体的には、本発明のポリヌクレオチドは融合タンパク質をコードすることができ、このとき、該融合タンパク質の1つのパートナーは、上記の核酸配列によりコードされるワクチン接種ポリペプチドである。そのような融合タンパク質は、発現をモニタリングするための追加的な部分のポリペプチドとして、いわゆる「タグ」を含むことができ、タグは、検出可能マーカーとして、または精製目的のための補助的手段として機能し得る。異なる目的のためのタグが当技術分野で周知であり、かつ本明細書中のどこかに説明される。
【0042】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、単離されたポリヌクレオチドとして（すなわち、その天然の文脈から単離されて）、または遺伝的に改変された形態で、提供されるであろう。ポリヌクレオチドは、好ましくは、cDNAをはじめとするDNAであるか、またはRNAである。この用語は、一本鎖ポリヌクレオチドならびに二本鎖ポリヌクレオチドを包含する。さらに、好ましくは、グリコシル化もしくはメチル化ポリヌクレオチドなどの天然に存在する修飾型ポリヌクレオチドまたはビオチン化ポリヌクレオチドなどの人工的に修飾されたものを含む、化学的に修飾されたポリヌクレオチドもまた含められる。
【0043】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、EBVゲノムをさらにコードする。本明細書中で用いる場合、用語「EBVゲノムをコードするポリヌクレオチド」とは、EB-VLPの生成のために必要なすべてのEBV遺伝子を含むポリヌクレオチドに関する。つまり、EBVゲノムをコードするポリヌクレオチドは、好適な宿主細胞中で本明細書に従うEB-VLPの生成を誘導する生物学的活性を有する。該活性を測定するための好適なアッセイが、後述の実施例に記載されている。本明細書中で用いる場合、この用語は、コードされるEBVゲノムが、潜伏感染を確立することができるか、または感染性EBV粒子への該EBVゲノムの封入（inclusion）を促進することができることを必要としない。好ましくは、該ポリヌクレオチドに含められるEBVゲノムは、例えば、Ruiss et al. ((2011), J Virol 85(24):13105）に記載される通り、EBV末端反復配列を欠損しているか；かつ/またはBFLF1遺伝子およびBBRF1遺伝子から選択される少なくとも1種の機能的に発現可能な遺伝子を欠損している。つまり、好ましくは、ポリヌクレオチドは、国際公開第2013/098364号の配列番号27（BFLF1ノックアウトを含む、すなわち、発現可能なBFLF1遺伝子を欠損している1型EBVゲノム、配列番号10）および国際公開第2013/098364号の配列番号28（BBRF1ノックアウトを含む、すなわち、発現可能なBBRF1遺伝子を欠損している1型EBVゲノム、配列番号11）に示される核酸配列のうちの1種を含む。より好ましくは、該ポリヌクレオチドは、配列番号7、8、または9の配列を含み、好ましくは、該配列からなる。
【0044】
さらに、本発明は、本発明に従うポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【0045】
用語「ベクター」は、好ましくは、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクターならびに細菌または酵母人工染色体などの人工染色体を包含する。さらに、この用語はまた、ゲノムDNAへの標的化構築物のランダムまたは部位特異的インテグレーションを可能にする標的化構築物にも関する。そのような標的構築物は、好ましくは、下記で詳細に記載される通り、相同または非相同（heterologous）組み換えのいずれかに対して十分な長さのDNAを含む。本発明のポリヌクレオチドを包含するベクターは、好ましくは、宿主中での伝播（propagation）および/または選択のための選択可能マーカーをさらに含む。ベクターは、当技術分野で周知の種々の技術により宿主細胞中に組み込むことができる。例えば、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物もしくは塩化ルビジウム沈殿物などの沈殿物中に、または荷電脂質を含む複合体中に、またはフラーレンなどの炭素系クラスター中へと導入することができる。あるいは、プラスミドベクターは、熱ショックまたはエレクトロポレーション技術により導入することができる。好ましい実施形態では、ベクターは、細菌ベクターである。また好ましくは、ベクターは、EBVベクターである。より好ましくは、ベクターは、細菌複製起点およびEBV複製起点を含む。
【0046】
より好ましくは、本発明のベクター中では、ポリヌクレオチドは、原核細胞もしくは真核細胞またはそれらの単離された画分中での発現を可能にする発現制御配列に作動可能に連結されている。該ポリヌクレオチドの発現は、好ましくは翻訳可能なmRNAへの、ポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞中での発現を確実にする調節エレメントは、当技術分野で周知である。それらは、好ましくは、転写の開始を確実にする調節配列、および、任意により、転写の終結および転写産物の安定化を確実にするポリAシグナルを含む。追加の調節エレメントとしては、転写ならびに翻訳エンハンサーが挙げられる。原核宿主細胞中での発現を可能にする考えられる調節エレメントは、例えば、大腸菌中のlac、trp、またはtacプロモーターを含み、真核宿主細胞中での発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母でのAOX1もしくはGAL1プロモーターまたは哺乳動物および他の動物細胞中のCMV、SV40、RSVプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、CMVエンハンサー、SV40エンハンサーもしくはグロビンイントロンである。さらに、誘導性発現制御配列を、本発明により包含される発現ベクター中で用いることができる。そのような誘導性ベクターは、熱ショックもしくは他の環境因子により誘導可能なtetまたはlacオペレーター配列（1種類または複数種類）を含むことができる。好適な発現制御配列は、当技術分野で周知である。転写の開始を担うエレメント以外には、そのような調節エレメントはまた、SV40-ポリA部位またはtk-ポリA部位などの、ポリヌクレオチドの下流の転写終結シグナルも含むことができる。この文脈では、好適な発現ベクターは当技術分野で公知であり、例えば、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1（Pharmacia社）、pBluescript（Stratagene社）、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（InVitrogene社）またはpSPORT1（GIBCO BRL社）などである。当業者に周知である方法を、組み換えウイルスベクターを構築するために用いることができ；例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.およびAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)に記載される技術を参照されたい。
【0047】
本発明はまた、本発明に従うワクチン接種ポリペプチド、本発明に従うポリヌクレオチド、および/または本発明に従うベクターを含む宿主細胞にも関する。
【0048】
本明細書中で用いる場合、用語「宿主細胞」とは、本発明のポリヌクレオチドおよび/またはベクターを受け入れ、かつ好ましくは維持することが可能であるいずれかの細胞に関する。より好ましくは、宿主細胞は、前記ポリヌクレオチドおよび/またはベクター上にコードされる本発明のワクチン接種ポリペプチドを発現することが可能である。好ましくは、細胞は、細菌細胞、より好ましくは当技術分野で公知の一般的な実験用細菌株の細胞、最も好ましくはエシェリキア属の菌株、特に大腸菌株である。また好ましくは、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは酵母細胞、例えば、パン酵母の菌株の細胞であるか、または動物細胞である。より好ましくは、宿主細胞は、昆虫細胞または哺乳動物細胞、特にヒト、マウスまたはラット細胞である。最も好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。用語「好適な宿主細胞」とは、本明細書中で用いる場合、EBVの溶解性複製を促進させ、それによりEB-VLPの生成をもたらすことが可能である細胞に関する。好ましくは、該細胞は、哺乳動物細胞、より好ましくは霊長類細胞、またさらに好ましくはヒト細胞である。最も好ましくは、好適な宿主細胞は293HEK細胞である。好適な宿主細胞は、EBVの溶解性複製に必須である特定の因子を提供することができることもまた、本発明により企図される。例えば、ウイルスが溶解サイクルに入ることを不可能にする、機能的BZLF1遺伝子を欠損しているEBVゲノムを用いる場合、そのような機能は、該BZLF1遺伝子に関する発現構築物が細胞にトランスフェクションされた後に、宿主細胞により提供され得る。
【0049】
本発明はまた、医薬での使用のための、特に被験体のワクチン接種での使用のための、本発明に従う調製物、本発明に従うポリヌクレオチド、本発明に従うベクター、および/または本発明に従う宿主細胞にも関する。
【0050】
本明細書中で用いる場合、用語「ワクチン接種」（vaccination）および「ワクチン接種すること」（vaccinating）とは、本明細書中で特定される通りの化合物を投与し、好ましくは本明細書中のどこかで特定される通りの少なくとも1種の感染性物質に対する、免疫応答を生起させることに関する。つまり、ワクチン接種は、免疫系を刺激し、かつ感染性物質による感染に対する免疫を確立または改善する。好ましくは、本発明に従うワクチン接種は、感染性物質、好ましくはEBVによる感染、または癌細胞に対する免疫を確立または改善することを可能にする。本発明に従うワクチンは、特に本明細書中のどこかに特定される通りの、さらなる構成要素を含むことができることが理解されるはずである。当業者は、ワクチン接種が、ワクチン接種されたすべての被験体で顕著な免疫応答を生起するわけではない場合があることを理解するであろう。ワクチン接種が、ワクチン接種されたすべての被験体で感染を予防するために有効であるわけではない場合があることもまた理解されるはずである。しかしながら、この用語は、好ましくは統計学的に有意な、コホートまたは集団の被験体のうちの一部分が、有効にワクチン接種されることを必要とする。また、本明細書中のどこかに示される通り、すべての免疫原性ペプチドおよび/またはワクチン接種ポリペプチドが、各被験体でワクチン接種活性を有するわけではなく；例えば、MHC分子の特定のサブタイプにより制限される免疫原性ペプチドは、該MHCサブタイプを有する被験体でのみ免疫原性であり得る。つまり、本明細書中で用いる場合、免疫原性ペプチドとの用語は、好適な被験体で免疫応答を誘導する活性を有するペプチドに関する。好ましくは、ワクチン接種は、EBV感染、および/またはEBV関連疾患に対するワクチン接種であり、好ましくは、EBV感染に対するワクチン接種である。本明細書中で用いる場合、用語「EBV関連疾患」とは、EBVによる被験体の感染により引き起こされるすべての障害に関する。好ましい実施形態では、該EBV関連疾患は、感染性単核球症、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、鼻咽頭癌、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、胃癌、または移植後リンパ増殖性障害である。これらの疾患を特徴付ける症状は当技術分野で周知であり、医学の標準的な教科書に記載されている。好ましくは、ワクチン接種は、潜伏EBV感染および/または溶解性EBV感染に対するワクチン接種であり、好ましくは、潜伏EBV感染および溶解性EBV感染に対するワクチン接種である。好ましくは、ワクチン接種は、免疫原性ペプチドに対して特異的なT細胞の、より好ましくは免疫原性ペプチドに対して特異的なCD4+ T細胞および/またはCD8+ T細胞の活性化および/または増殖を誘導し、最も好ましくは免疫原性ペプチドに対して特異的なCD4+ T細胞の活性化および/または増殖を誘導する。
【0051】
好ましくは、ワクチン接種することとは、本明細書中で特定される通りの薬剤を用いて感染を、またはそれに付随する疾患もしくは症状を治療および/または予防することである。用語「治療すること」および「治療」とは、本明細書中で言及される疾患もしくは障害またはそれに付随する症状の、有意な程度までの改善を意味する。本明細書中で用いる場合、該治療することには、本明細書中で言及される疾患または障害に関する健康状態の完全な回復もまた含まれる。本明細書中でこの用語が用いられる場合、治療することとは、治療対象のすべての被験体で有効でなくてよいことが理解されるはずである。しかしながら、この用語は、好ましくは、本明細書中で言及される疾患または障害に罹患した被験体のうちの統計学的に有意な一部分を成功裏に治療できることを必要とするであろう。一部分が統計学的に有意であるか否かは、様々な周知の統計的評価ツール、例えば、信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントのt検定、マン-ホイットニー検定等を用いて、当業者によりさらなる面倒なく決定されることができる。好ましい信頼区間は、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％である。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005、または0.0001である。好ましくは、治療は、所与のコホートまたは集団の被験体のうちの少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％に対して有効であろう。用語「予防すること」および「予防」とは、被験体において、特定の期間、本明細書中で言及される疾患または障害に関して健康を保持することを意味する。該期間は、投与された薬物化合物の量および本明細書中のどこかで論じられる被験体の個人的因子に依存し得ることが理解されるであろう。予防は、本発明に従う化合物を用いて処置されるすべての被験体で有効でなくてよいことが理解されるはずである。しかしながら、この用語は、好ましくは、コホートまたは集団の被験体のうちの統計学的に有意な一部分が、本明細書中で言及される疾患もしくは障害またはその付随する症状に罹患することが有効に防止されることを必要とする。好ましくは、この文脈では、通常、すなわち、本発明に従う予防的手段を用いずには、本明細書中で言及される通りの疾患または障害を発症するであろう被験体のコホートまたは集団が企図される。一部分が統計学的に有意であるか否かは、本明細書中に上記で論じた様々な周知の統計的評価ツールを用いて、当業者によりさらなる面倒なく決定されることができる。
【0052】
用語「被験体」とは、生物に対して外来性の分子に対する免疫応答を生成する能力を有する後生動物に関する。好ましくは、被験体は、動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。好ましくは、被験体は、免疫不全に罹患しているか、かつ/または免疫抑制処置を受けることが予定されている。
【0053】
本発明の方法はまた、(i) 本発明に従う調製物、(ii) 本発明に従うポリヌクレオチド、(iii) 本発明に従うベクター、(iv) 本発明に従う宿主細胞、または(v) (i)～(iv)のいずれかの組み合わせを被験体に接触させ；それにより該被験体のT細胞を刺激するステップを含む、被験体のT細胞を刺激するための方法にも関する。
【0054】
本発明のT細胞を刺激するための方法は、好ましくは、in vivoの方法である。しかしながら、方法は、in vitroで、例えば、単離細胞、好ましくは、末梢血単核細胞（PBMC）またはT細胞の調製物に対して行なうこともできる。好ましくは、方法がin vivoの方法である場合、これは被験体にワクチン接種する方法である。さらに、方法は、上記で明示的に言及されるものに加えて、ステップを含むことができる。例えば、さらなるステップは、例えば、接触ステップの前に感染を診断するステップ、または該接触ステップを反復するステップに関することができる。さらに、該ステップの1種以上を、自動化機器により行なうことができる。
【0055】
本発明はまた、筐体中に含められる、本発明に従う調製物、本発明に従うポリヌクレオチド、本発明に従うベクター、および/または本発明に従う宿主細胞を含むキットにも関する。
【0056】
用語「キット」とは、本明細書中で用いる場合、一緒に包装されてもよくまたは一緒に包装されなくてもよい、本発明の上述の化合物、手段または試薬の集合物を意味する。キットの構成要素は、別個のバイアルにより（すなわち、分離した部分のキットとして）含められてもよく、または単一バイアル中で提供されてもよい。さらに、本発明のキットは、好ましくは、本明細書中の上記で言及される方法の実行のために用いられるものであることが理解されるはずである。好ましくは、上記で言及される方法を実行するために、すべての構成要素がすぐに使える（ready-to-use）様式で提供されることが企図される。さらに、キットは、好ましくは、該方法を実行するための取扱い説明書を含む。取扱い説明書は、紙または電子形式のユーザーマニュアルにより提供することができる。加えて、マニュアルは、本発明のキットを用いて上述の方法を行なうための投与に関する指示および/または投与量の指示を含むことができる。上記から理解されるであろう通り、ポリヌクレオチドを含むキットの説明は、好ましくは、対応するベクターを含むキットに準用して関連する。
【0057】
好ましくは、キットは、本発明に従う調製物ならびに希釈剤、アジュバント、および投与手段（means of administration）のうちの少なくとも1種を含む。用語「アジュバント」は、当技術分野でのその通常の意味で、本明細書中で用いられる。適切な希釈剤は、本明細書中に上記で説明される。投与手段は、調製物、ポリヌクレオチド、ベクター、および/または宿主細胞を被験体に投与するために好適なすべての手段である。投与手段は、化合物または組成物の投与のための送達ユニット、および投与まで化合物または組成物を保存するための保存ユニットを含むことができる。しかしながら、本発明の手段は、そのような実施形態では別個のデバイスとして現れることができ、かつ、好ましくは、該キット中に一緒に包装されていることもまた意図される。好ましい投与手段は、専門の技術者の特定の知識なしに適用できるものである。好ましい実施形態では、投与手段は、本発明の化合物または組成物を含むシリンジ、より好ましくは針を有するシリンジである。別の好ましい実施形態では、投与手段は、化合物または組成物を含む静脈内注入（IV）器具である。また別の好ましい実施形態では、投与手段は、本発明の化合物を含む吸入器であり、このとき、より好ましくは、該化合物は、エアロゾルとしての投与のために製剤化される。
【0058】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドおよび/もしくは本発明のベクターから生成されるかまたは生成可能であるEBV粒子にも関する。好ましくは、上述のEBV粒子はEB-VLPであり；また好ましくは、EB粒子は、本明細書中のどこかで特定される通りの調製物中に含められる。
【0059】
本発明はさらに、医薬組成物、好ましくはワクチンを製造するための、本発明に従う調製物、本発明に従うポリヌクレオチド、本発明に従うベクター、および/または本発明に従う宿主細胞の使用に関する。
【0060】
また、本発明は、少なくとも1種のワクチン接種ポリペプチドを含有するEB-VLPを製造するための方法に関し、該方法は、以下のステップ：(a) 本発明に従うポリヌクレオチドおよび/または本発明のベクターを含む好適な宿主細胞を培養するステップ；および(b) 該好適な宿主細胞からEB-VLPを取得するステップを含む。
【0061】
EB-VLPを製造するための方法は、好ましくはin vivoの方法であり、かつ、例えば、培養された好適な宿主細胞の上清からEB-VLPを取得するステップに関連する、さらなるステップを含み得る。
【0062】
さらに、本発明は、本発明のEB-VLPを製造するための方法のステップおよびワクチンとしてEB-VLPを製剤化するさらなるステップを含む、ワクチンの製造のための方法に関する。
【0063】
上記に鑑みて、以下の実施形態が、特に企図される：
1. エプスタイン・バーウイルス様粒子（EB-VLP）を含む調製物であって、該EB-VLPは、エプスタイン・バーウイルス（EBV）DNAを本質的に含まず、該EB-VLPは、EBVテグメントポリペプチドの少なくとも1種のペプチドおよび少なくとも1種の免疫原性ペプチドを含むワクチン接種ポリペプチドを含む、上記調製物。
2. 前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが、少なくとも1種のT細胞エピトープを含む、実施形態1の調製物。
3. 前記T細胞エピトープが、MHCクラスIIまたはMHCクラスIエピトープ、好ましくはMHCクラスIIエピトープである、実施形態1または2の調製物。
4. 前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが、病原性微生物の、好ましくはウイルスの、より好ましくはヘルペスウイルスの免疫原性ペプチドである、実施形態1～3のいずれか1つの調製物。
5. 前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが免疫原性EBVペプチドである、実施形態1～4のいずれか1つの調製物。
6. 前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが潜伏EBVポリペプチドの免疫原性ペプチドである、実施形態1～5のいずれか1つの調製物。
7. 前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが、少なくとも1種のT細胞エピトープを含む、好ましくは少なくとも1種のMHCクラスIIエピトープを含む、潜伏EBVポリペプチドの免疫原性ペプチドである、実施形態1～6のいずれか1つの調製物。
8. 前記潜伏EBVポリペプチドが、EBNA-1、EBNA-LP、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、LMP-1、およびLMP-2Aからなるリストから選択され；好ましくはEBNA-1および/またはEBNA-3Cである、実施形態6または7の調製物。
9. 潜伏EBVポリペプチドの前記免疫原性ペプチドが、EBNA1 3E10エピトープ（NPKFENIAEGLRALL、配列番号32）、EBNA 3G2エピトープ（KTSLYNLRRGTALAI、配列番号33）、EBNA3C 5H11エピトープ（ENPYHARRGIKEHVI、配列番号34）、EBNA-3C 3H10エピトープ（VVRMFMRERQLPQS、配列番号35）のアミノ酸配列、および/または配列番号36のうちの少なくとも7個、好ましくは少なくとも8個、より好ましくは少なくとも9個、最も好ましくは少なくとも10個のアミノ酸の配列を含み、好ましくはそれからなる、実施形態6～8のいずれか1つの調製物。
10. 前記ワクチン接種ポリペプチドが、前記EBVテグメントポリペプチドおよび前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドを含む融合ポリペプチドである、実施形態1～9のいずれか1つの調製物。
11. 前記免疫原性ペプチドが、前記EBVテグメントポリペプチドのN末端に融合されるか、該EBVテグメントポリペプチドのC末端に融合されるか、または該EBVテグメントポリペプチドのアミノ酸配列へと挿入される、実施形態1～10のいずれか1つの調製物。
12. 前記EBVテグメントポリペプチドがEBV BNRF1ポリペプチドである、実施形態1～11のいずれか1つの調製物。
13. 前記免疫原性ペプチドが、前記BNRF1ポリペプチドのN末端に融合されるか、該BNRF1ポリペプチドのC末端に融合されるか、または該BNRF1ポリペプチドのアミノ酸配列へと挿入される、実施形態12の調製物。
14. 前記免疫原性ペプチドが、前記BNRF1ポリペプチドの1～172位のいずれか1箇所で該BNRF1ポリペプチドへと挿入され、かつ/または該位置の範囲内のアミノ酸を置き換える、実施形態12または13の調製物。
15. 前記免疫原性ペプチドが、113位で前記BNRF1ポリペプチドに挿入される。実施形態12～14のいずれか1つの調製物。
16. 前記ワクチン接種ポリペプチドが、配列番号1、2、または3のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、実施形態1～15のいずれか1つの調製物。
17. 前記調製物が医薬組成物である、実施形態1～16のいずれか1つの調製物。
18. 実施形態1～16のいずれか1つに特定される通りのワクチン接種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
19. 前記ポリヌクレオチドがEBVゲノムをさらにコードする、実施形態18のポリヌクレオチド。
20. 前記EBVゲノムが、EBV末端反復配列を欠損し、かつ/またはBFLF1遺伝子およびBBRF1遺伝子から選択される少なくとも1種の機能的に発現可能な遺伝子を欠損する、実施形態19のポリヌクレオチド。
21. 実施形態18～20のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
22. 実施形態18～20のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドおよび/または実施形態21に記載のベクターを含む宿主細胞。
23. 医薬での使用のための、実施形態1～17のいずれか1つに記載の調製物、実施形態18～20のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、実施形態21に記載のベクター、および/または実施形態22に記載の宿主細胞。
24. 被験体のワクチン接種での使用のための、実施形態1～17のいずれか1つに記載の調製物、実施形態18～20のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、実施形態21に記載のベクター、および/または実施形態22に記載の宿主細胞。
25. 実施形態24の使用のための調製物、ポリヌクレオチド、ベクター、および/または宿主細胞であって、前記被験体が、免疫不全に罹患しているか、かつ/または免疫抑制処置を受ける予定である、上記調製物、ポリヌクレオチド、ベクター、および/または宿主細胞。
26. 被験体を、
(i) 実施形態1～17のいずれか1つに記載の調製物、
(ii) 実施形態18～20のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、
(iii) 実施形態21に記載のベクター、
(iv) 実施形態22に記載の宿主細胞、または
(v) (i)～(iv)のいずれかの組み合わせ
と接触させ；
それにより該被験体をワクチン接種するステップ
を含む、被験体のT細胞を刺激するための方法。
27. 前記ワクチン接種が、EBV感染および/またはEBV関連疾患に対するワクチン接種であり、好ましくは、移植後リンパ増殖性障害に対するワクチン接種である、実施形態26の方法。
28. 前記ワクチン接種が、潜伏EBV感染および/または溶解性EBV感染に対するワクチン接種であり、好ましくは、潜伏EBV感染および溶解性EBV感染に対するワクチン接種である、実施形態26または27の方法。
29. 筐体中に含められる、実施形態1～17のいずれか1つに記載の調製物、実施形態18～20のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、実施形態21に記載のベクター、および/または実施形態22に記載の宿主細胞を含む、キット。
30. 希釈剤、アジュバント、および投与手段のうちの少なくとも1種をさらに含む、実施形態29のキット。
31. 実施形態18～20のいずれか1つのポリヌクレオチドおよび/または実施形態21のベクターから生成されるかまたは生成可能である、EBV粒子。
32. 医薬組成物、好ましくはワクチンを製造するための、実施形態1～17のいずれか1つに記載の調製物、実施形態18～20のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、実施形態21に記載のベクター、および/または実施形態22に記載の宿主細胞の使用。
33. 以下のステップ：
(a) 実施形態18～20のいずれか1つに記載のポリペプチドおよび/または実施形態21のベクターを含む好適な宿主細胞を培養するステップ；および
(b) 該好適な宿主細胞からEB-VLPを取得するステップ
を含む、少なくとも1種のワクチン接種ポリペプチドを含むEB-VLPを製造するための方法。
34. 前記EB-VLPが、培養された好適な宿主細胞の上清から取得される、実施形態33の方法。
35. 実施形態33または34の方法のステップおよびワクチンとしてEB-VLPを製剤化するさらなるステップを含む、ワクチンの製造のための方法。
1. エプスタイン・バーウイルス様粒子（EB-VLP）を含む調製物であって、該EB-VLPは、エプスタイン・バーウイルス（EBV）DNAを本質的に含まず、該EB-VLPは、EBVテグメントポリペプチドの少なくとも1種のペプチドおよび少なくとも1種の免疫原性ペプチドを含むワクチン接種ポリペプチドを含む、上記調製物。
2. 前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが、少なくとも1種のT細胞エピトープを含む、実施形態1の調製物。
3. 前記T細胞エピトープが、MHCクラスIIまたはMHCクラスIエピトープ、好ましくはMHCクラスIIエピトープである、実施形態1または2の調製物。
4. 前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが、病原性微生物の、好ましくはウイルスの、より好ましくはヘルペスウイルスの免疫原性ペプチドである、実施形態1～3のいずれか1つの調製物。
5. 前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが免疫原性EBVペプチドである、実施形態1～4のいずれか1つの調製物。
6. 前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが潜伏EBVポリペプチドの免疫原性ペプチドである、実施形態1～5のいずれか1つの調製物。
7. 前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが、少なくとも1種のT細胞エピトープを含む、好ましくは少なくとも1種のMHCクラスIIエピトープを含む、潜伏EBVポリペプチドの免疫原性ペプチドである、実施形態1～6のいずれか1つの調製物。
8. 前記潜伏EBVポリペプチドが、EBNA-1、EBNA-LP、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、LMP-1、およびLMP-2Aからなるリストから選択され；好ましくはEBNA-1および/またはEBNA-3Cである、実施形態6または7の調製物。
9. 潜伏EBVポリペプチドの前記免疫原性ペプチドが、EBNA1 3E10エピトープ（NPKFENIAEGLRALL、配列番号32）、EBNA 3G2エピトープ（KTSLYNLRRGTALAI、配列番号33）、EBNA3C 5H11エピトープ（ENPYHARRGIKEHVI、配列番号34）、EBNA-3C 3H10エピトープ（VVRMFMRERQLPQS、配列番号35）のアミノ酸配列、および/または配列番号36のうちの少なくとも7個、好ましくは少なくとも8個、より好ましくは少なくとも9個、最も好ましくは少なくとも10個のアミノ酸の配列を含み、好ましくはそれからなる、実施形態6～8のいずれか1つの調製物。
10. 前記ワクチン接種ポリペプチドが、前記EBVテグメントポリペプチドおよび前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドを含む融合ポリペプチドである、実施形態1～9のいずれか1つの調製物。
11. 前記免疫原性ペプチドが、前記EBVテグメントポリペプチドのN末端に融合されるか、該EBVテグメントポリペプチドのC末端に融合されるか、または該EBVテグメントポリペプチドのアミノ酸配列へと挿入される、実施形態1～10のいずれか1つの調製物。
12. 前記EBVテグメントポリペプチドがEBV BNRF1ポリペプチドである、実施形態1～11のいずれか1つの調製物。
13. 前記免疫原性ペプチドが、前記BNRF1ポリペプチドのN末端に融合されるか、該BNRF1ポリペプチドのC末端に融合されるか、または該BNRF1ポリペプチドのアミノ酸配列へと挿入される、実施形態12の調製物。
14. 前記免疫原性ペプチドが、前記BNRF1ポリペプチドの1～172位のいずれか1箇所で該BNRF1ポリペプチドへと挿入され、かつ/または該位置の範囲内のアミノ酸を置き換える、実施形態12または13の調製物。
15. 前記免疫原性ペプチドが、113位で前記BNRF1ポリペプチドに挿入される。実施形態12～14のいずれか1つの調製物。
16. 前記ワクチン接種ポリペプチドが、配列番号1、2、または3のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、実施形態1～15のいずれか1つの調製物。
17. 前記調製物が医薬組成物である、実施形態1～16のいずれか1つの調製物。
18. 実施形態1～16のいずれか1つに特定される通りのワクチン接種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
19. 前記ポリヌクレオチドがEBVゲノムをさらにコードする、実施形態18のポリヌクレオチド。
20. 前記EBVゲノムが、EBV末端反復配列を欠損し、かつ/またはBFLF1遺伝子およびBBRF1遺伝子から選択される少なくとも1種の機能的に発現可能な遺伝子を欠損する、実施形態19のポリヌクレオチド。
21. 実施形態18～20のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
22. 実施形態18～20のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドおよび/または実施形態21に記載のベクターを含む宿主細胞。
23. 医薬での使用のための、実施形態1～17のいずれか1つに記載の調製物、実施形態18～20のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、実施形態21に記載のベクター、および/または実施形態22に記載の宿主細胞。
24. 被験体のワクチン接種での使用のための、実施形態1～17のいずれか1つに記載の調製物、実施形態18～20のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、実施形態21に記載のベクター、および/または実施形態22に記載の宿主細胞。
25. 実施形態24の使用のための調製物、ポリヌクレオチド、ベクター、および/または宿主細胞であって、前記被験体が、免疫不全に罹患しているか、かつ/または免疫抑制処置を受ける予定である、上記調製物、ポリヌクレオチド、ベクター、および/または宿主細胞。
26. 被験体を、
(i) 実施形態1～17のいずれか1つに記載の調製物、
(ii) 実施形態18～20のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、
(iii) 実施形態21に記載のベクター、
(iv) 実施形態22に記載の宿主細胞、または
(v) (i)～(iv)のいずれかの組み合わせ
と接触させ；
それにより該被験体をワクチン接種するステップ
を含む、被験体のT細胞を刺激するための方法。
27. 前記ワクチン接種が、EBV感染および/またはEBV関連疾患に対するワクチン接種であり、好ましくは、移植後リンパ増殖性障害に対するワクチン接種である、実施形態26の方法。
28. 前記ワクチン接種が、潜伏EBV感染および/または溶解性EBV感染に対するワクチン接種であり、好ましくは、潜伏EBV感染および溶解性EBV感染に対するワクチン接種である、実施形態26または27の方法。
29. 筐体中に含められる、実施形態1～17のいずれか1つに記載の調製物、実施形態18～20のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、実施形態21に記載のベクター、および/または実施形態22に記載の宿主細胞を含む、キット。
30. 希釈剤、アジュバント、および投与手段のうちの少なくとも1種をさらに含む、実施形態29のキット。
31. 実施形態18～20のいずれか1つのポリヌクレオチドおよび/または実施形態21のベクターから生成されるかまたは生成可能である、EBV粒子。
32. 医薬組成物、好ましくはワクチンを製造するための、実施形態1～17のいずれか1つに記載の調製物、実施形態18～20のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、実施形態21に記載のベクター、および/または実施形態22に記載の宿主細胞の使用。
33. 以下のステップ：
(a) 実施形態18～20のいずれか1つに記載のポリペプチドおよび/または実施形態21のベクターを含む好適な宿主細胞を培養するステップ；および
(b) 該好適な宿主細胞からEB-VLPを取得するステップ
を含む、少なくとも1種のワクチン接種ポリペプチドを含むEB-VLPを製造するための方法。
34. 前記EB-VLPが、培養された好適な宿主細胞の上清から取得される、実施形態33の方法。
35. 実施形態33または34の方法のステップおよびワクチンとしてEB-VLPを製剤化するさらなるステップを含む、ワクチンの製造のための方法。
【0064】
本明細書中で引用されるすべての参考文献が、それらの開示内容全体および本明細書中で具体的に言及される開示内容に関して、参照により本明細書中に組み込まれる。
【実施例】
【0065】
以下の実施例は、単に本発明を例示するものであろう。これらは、一切、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【0066】
実施例1：材料および方法
倫理に関する記述：末梢血単核細胞（PBMC）は、健康なドナーから（Medizinische Fakultat HeidelbergのEthikkommissionにより与えられた倫理的承認（S-603/2015））またはInstitut fur Klinische Transfusionsmedizin und Zelltherapie（IKTZ、Heidelberg）から購入した匿名バフィーコートから単離し、倫理的承認を必要としなかった。動物実験は、Regierungsprasidium Karlsruhe（独国）の連邦政府獣医局により承認され（承認番号G156-12）、独国動物保護法に厳密に従って行なわれた（TierSchG）。マウスは、Federation of European Laboratory Animal Science Associations（FELASA）およびSociety for Laboratory Animal Science（GVSOLAS）により規定される通りの良好な動物実務に従って扱い、German Cancer Research CenterのクラスII封じ込め実験室で飼育された。
倫理に関する記述：末梢血単核細胞（PBMC）は、健康なドナーから（Medizinische Fakultat HeidelbergのEthikkommissionにより与えられた倫理的承認（S-603/2015））またはInstitut fur Klinische Transfusionsmedizin und Zelltherapie（IKTZ、Heidelberg）から購入した匿名バフィーコートから単離し、倫理的承認を必要としなかった。動物実験は、Regierungsprasidium Karlsruhe（独国）の連邦政府獣医局により承認され（承認番号G156-12）、独国動物保護法に厳密に従って行なわれた（TierSchG）。マウスは、Federation of European Laboratory Animal Science Associations（FELASA）およびSociety for Laboratory Animal Science（GVSOLAS）により規定される通りの良好な動物実務に従って扱い、German Cancer Research CenterのクラスII封じ込め実験室で飼育された。
【0067】
細胞株および初代細胞
細胞株は、EBV陽性Raji細胞、EBV陰性Elijah B細胞（A.B. Rickinson教授より供与）、HEK293細胞、EBNA1 3E10、EBNA3C 5H11、gp350 1D6およびBNRF1 VSDエピトープに特異的なT細胞ならびに自家LCL（J. Mautner教授より供与；本質的には、Adhikary et al., 2007. PloS One. 2:e583（BNRF1 VSD）、Adhikary et a.l, J Virol 82:3903-3911（gp350 1D6）、Yu et al., 2015, Blood 125: 1601-1610（EBNA3C 5H11）、Linnerbauer et al., PLoS Pathog 10: e10004068（EBNA1 3E10）に記載される通りに生成された）を含んだ。末梢血単核細胞（PBMC）はFicoll-Paque Plusを用いて単離し、初代B細胞は、Dynabeads CD19 Pan B（Invitrogen社）およびDETACHaBEAD CD19キット（Invitrogen社）を用いて単離した。10％ウシ胎児血清含有RPMIを、293細胞、Raji細胞およびElijah細胞を培養するために用いた。T細胞クローンおよび細胞株は、Adhikary et al. (2007), PLoS One 2: e583により以前に記載された通りに培養した。
細胞株は、EBV陽性Raji細胞、EBV陰性Elijah B細胞（A.B. Rickinson教授より供与）、HEK293細胞、EBNA1 3E10、EBNA3C 5H11、gp350 1D6およびBNRF1 VSDエピトープに特異的なT細胞ならびに自家LCL（J. Mautner教授より供与；本質的には、Adhikary et al., 2007. PloS One. 2:e583（BNRF1 VSD）、Adhikary et a.l, J Virol 82:3903-3911（gp350 1D6）、Yu et al., 2015, Blood 125: 1601-1610（EBNA3C 5H11）、Linnerbauer et al., PLoS Pathog 10: e10004068（EBNA1 3E10）に記載される通りに生成された）を含んだ。末梢血単核細胞（PBMC）はFicoll-Paque Plusを用いて単離し、初代B細胞は、Dynabeads CD19 Pan B（Invitrogen社）およびDETACHaBEAD CD19キット（Invitrogen社）を用いて単離した。10％ウシ胎児血清含有RPMIを、293細胞、Raji細胞およびElijah細胞を培養するために用いた。T細胞クローンおよび細胞株は、Adhikary et al. (2007), PLoS One 2: e583により以前に記載された通りに培養した。
【0068】
AgAbの構築および生成
AgAbは、EBNA1（390～622aa）およびgp350（1～470aa）をコードする配列を用いて構築した。潜伏タンパク質コード配列をPCR増幅し、pRK5発現ベクター内に含められたα-CD20 HC遺伝子の下流に導入した（Yu et al. (2015), Blood 125: 1601）。α-CD20抗体およびAgAbは、適切な重鎖およびα-CD20軽鎖を、ポリエチレンイミン（PEI）を用いて293細胞にトランスフェクションすることにより作製した。次の日に、PEI含有培地を除去し、血清不含FreeStyleTM293発現培地と置き換え、細胞を3日間インキュベートした。上清を400×gで10分間遠心分離し、0.22μmフィルターを通してろ過した。
AgAbは、EBNA1（390～622aa）およびgp350（1～470aa）をコードする配列を用いて構築した。潜伏タンパク質コード配列をPCR増幅し、pRK5発現ベクター内に含められたα-CD20 HC遺伝子の下流に導入した（Yu et al. (2015), Blood 125: 1601）。α-CD20抗体およびAgAbは、適切な重鎖およびα-CD20軽鎖を、ポリエチレンイミン（PEI）を用いて293細胞にトランスフェクションすることにより作製した。次の日に、PEI含有培地を除去し、血清不含FreeStyleTM293発現培地と置き換え、細胞を3日間インキュベートした。上清を400×gで10分間遠心分離し、0.22μmフィルターを通してろ過した。
【0069】
組み換えBAC DNAおよび安定的産生細胞株
組み換えBAC DNAは、galK組み換え（Warming et al. (2005), Nucleic Acids Res 33: e36）を用いて構築した。本研究では、wtEBV（B95-8）またはVLPs/LPs（B95-8ΔBFLF1/BFRF1a/BALF4）（Shumilov et al. (2017), Nat Commun 8: 14257）BAC DNAを、潜伏タンパク質断片をコードするように改変した。糖タンパク質gp110をコードするBALF4欠損VLPs/LPsのみを、それらの強化された安全性に起因して、本研究で使用した。BAC突然変異体の構築のために用いたプライマー、ならびにすべてのBAC突然変異体の説明を、表1に示す。galK組み換え中の第1ステップは、wtEBVまたはVLPs/LPs BAC DNAのBNRF1 ORFへのgalKカセットの挿入であった。続いて、galKカセットを、潜伏タンパク質部分をコードするDNA断片と置き換えた。BNRF1潜伏タンパク質融合体の完全性を確認するために、制限酵素消化（restriction digestion）および配列決定を用いて、増生中のコロニーを分析した。安定的産生細胞を、以前に記載された通りに組み換えBAC DNAを用いて作製した（Janz et al. (2000), J Virol 74: 10142-10152）。
組み換えBAC DNAは、galK組み換え（Warming et al. (2005), Nucleic Acids Res 33: e36）を用いて構築した。本研究では、wtEBV（B95-8）またはVLPs/LPs（B95-8ΔBFLF1/BFRF1a/BALF4）（Shumilov et al. (2017), Nat Commun 8: 14257）BAC DNAを、潜伏タンパク質断片をコードするように改変した。糖タンパク質gp110をコードするBALF4欠損VLPs/LPsのみを、それらの強化された安全性に起因して、本研究で使用した。BAC突然変異体の構築のために用いたプライマー、ならびにすべてのBAC突然変異体の説明を、表1に示す。galK組み換え中の第1ステップは、wtEBVまたはVLPs/LPs BAC DNAのBNRF1 ORFへのgalKカセットの挿入であった。続いて、galKカセットを、潜伏タンパク質部分をコードするDNA断片と置き換えた。BNRF1潜伏タンパク質融合体の完全性を確認するために、制限酵素消化（restriction digestion）および配列決定を用いて、増生中のコロニーを分析した。安定的産生細胞を、以前に記載された通りに組み換えBAC DNAを用いて作製した（Janz et al. (2000), J Virol 74: 10142-10152）。
【0070】
ウイルスおよびVLPs/LPsの生成
BZLF1をコードする発現プラスミド（p509）を、産生細胞へとトランスフェクションして、ウイルスまたはVLPs/LPs生成を誘導した。ex vivoおよびin vitro研究のためのEBV（B95-8またはM81）の生成のために、gp110をコードするpRAプラスミドを、感染性を高めるためにp509と共に共トランスフェクションした。リポソームに基づくトランスフェクタント（transfectant）Metafectene（Biontex社）を用いて、一晩のトランスフェクションを行なった。続いて、Metafectene含有培地を除去し、新鮮な培地に置き換えた。トランスフェクションされた細胞を3日間インキュベートし、続いて、上清を回収した。上清を400×gで10分間遠心分離し、0.44μmフィルターを通してろ過した。ex vivo T細胞増殖および動物実験のために用いるVLPs/LPsを、血清不含FreeStyle（商標）293発現培地（Gibco（商標））中で生成させた。すべての他のケースで、ウイルスおよびVLPs/LPsは、10％FCSを添加したRPMIで生成させた。最後に、動物実験に用いるウイルスおよびVLPs/LPsは、18000×gで3時間濃縮し、PBS中に再懸濁した。
BZLF1をコードする発現プラスミド（p509）を、産生細胞へとトランスフェクションして、ウイルスまたはVLPs/LPs生成を誘導した。ex vivoおよびin vitro研究のためのEBV（B95-8またはM81）の生成のために、gp110をコードするpRAプラスミドを、感染性を高めるためにp509と共に共トランスフェクションした。リポソームに基づくトランスフェクタント（transfectant）Metafectene（Biontex社）を用いて、一晩のトランスフェクションを行なった。続いて、Metafectene含有培地を除去し、新鮮な培地に置き換えた。トランスフェクションされた細胞を3日間インキュベートし、続いて、上清を回収した。上清を400×gで10分間遠心分離し、0.44μmフィルターを通してろ過した。ex vivo T細胞増殖および動物実験のために用いるVLPs/LPsを、血清不含FreeStyle（商標）293発現培地（Gibco（商標））中で生成させた。すべての他のケースで、ウイルスおよびVLPs/LPsは、10％FCSを添加したRPMIで生成させた。最後に、動物実験に用いるウイルスおよびVLPs/LPsは、18000×gで3時間濃縮し、PBS中に再懸濁した。
【0071】
リアルタイムqPCR
ウイルス力価を、以前に記載された通りにリアルタイムqPCRにより決定した（Pavlova et al. (2013), J Virol 87: 2011）。簡潔には、ウイルス含有上清を、DNaseI（5ユニット）およびプロテイナーゼK（1mg/mL）を用いて処理した。次に、リアルタイムqPCR分析を、EBV BALF5遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブを用いて行なった。末梢血中のEBVの存在を決定するために、ワクチン接種およびチャレンジした動物由来のゲノムDNAを、チャレンジしていない動物と比較した。フローサイトメトリーを用いたVLPs/LPsの定量化：リアルタイムqPCRを用いて以前に定量化されたwtEBVを、力価測定し（1、0.75、0.5、および0.25×107geq）、4℃でElijah B細胞に結合させた。細胞を洗浄し、α-gp350（クローン72A1）およびα-マウスIgG-Cy3抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーを用いて分析した。MFI値を、様々な量のウイルスに関して決定した。標準曲線を、EBVゲノムに関してMFIに対して作成した。同時に、VLPs/LPsを含有する上清をElijah B細胞と共にインキュベートし、上記の通りに染色した。VLPs/LPsに関して取得したMFI値を、VLPs/LPsを定量化するために標準曲線から外挿した。T細胞活性化アッセイ：細胞培養上清中のIFN-γを、以前に記載された通りに決定した（Yu et al.、直上）。自家LCLを、抗原を用いて一晩パルス刺激し、E：T比＝1：1でT細胞と共に最低でも18時間、共培養した。ELISAにより上清を分析した（Mabtech社）。中和抗体（72A1クローン）を用いたブロッキング研究では、ウイルス含有上清を37℃で1時間、抗体と共に予備インキュベーションし、その後、T細胞活性化アッセイで用いた。VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIまたはgp350-AgAbを用いたPBMCの短時間ex vivo刺激：EBV陽性ドナー由来のバルクPBMCを、VLPs/LPs-EBNA1（1×106粒子）またはgp350-AgAb（20ng）を用いてパルス刺激した。2日間後、培養物にIL-2（10U/mL）を添加し、その後、IL-2を含有する培地中で維持した。細胞を、10日間後に、IL-2（10U/mL）および同量のVLPs/LPs-EBNA1またはgp350-AgAbを用いて再刺激した。1週間後、CD4、CD8およびCD3発現細胞の存在に関して、またはEBVを用いて一晩感染させた初代B細胞と共培養した場合に、細胞を分析した。VLPs/LPs-EBNA1刺激PBMCによる最近感染したB細胞の標的化：4名のEBV陽性ドナー由来のバルクPBMCを、IL-2（10U/mL）の存在下でVLPs/LPs-EBNA1（1×106粒子）またはgp350-AgAb（20ng）で2ラウンド刺激した。自家初代B細胞を、B95.8（MOI＝3）を用いて一晩感染させ、続いて、刺激されたPBMC、CD19枯渇PBMCまたは培地のみを用いて共培養した。ex vivo培養物を、感染5日間後にフローサイトメトリーおよび免疫蛍光を用いて分析して、EBV陽性細胞を観察した。細胞を、α-CD19-APC（HIB19クローン）を用いてフローサイトメトリー前に、ならびにα-CD20（L26クローン）、α-EBNA2（PE2クローン）およびDAPIを用いて免疫蛍光前に、染色した。
ウイルス力価を、以前に記載された通りにリアルタイムqPCRにより決定した（Pavlova et al. (2013), J Virol 87: 2011）。簡潔には、ウイルス含有上清を、DNaseI（5ユニット）およびプロテイナーゼK（1mg/mL）を用いて処理した。次に、リアルタイムqPCR分析を、EBV BALF5遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブを用いて行なった。末梢血中のEBVの存在を決定するために、ワクチン接種およびチャレンジした動物由来のゲノムDNAを、チャレンジしていない動物と比較した。フローサイトメトリーを用いたVLPs/LPsの定量化：リアルタイムqPCRを用いて以前に定量化されたwtEBVを、力価測定し（1、0.75、0.5、および0.25×107geq）、4℃でElijah B細胞に結合させた。細胞を洗浄し、α-gp350（クローン72A1）およびα-マウスIgG-Cy3抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーを用いて分析した。MFI値を、様々な量のウイルスに関して決定した。標準曲線を、EBVゲノムに関してMFIに対して作成した。同時に、VLPs/LPsを含有する上清をElijah B細胞と共にインキュベートし、上記の通りに染色した。VLPs/LPsに関して取得したMFI値を、VLPs/LPsを定量化するために標準曲線から外挿した。T細胞活性化アッセイ：細胞培養上清中のIFN-γを、以前に記載された通りに決定した（Yu et al.、直上）。自家LCLを、抗原を用いて一晩パルス刺激し、E：T比＝1：1でT細胞と共に最低でも18時間、共培養した。ELISAにより上清を分析した（Mabtech社）。中和抗体（72A1クローン）を用いたブロッキング研究では、ウイルス含有上清を37℃で1時間、抗体と共に予備インキュベーションし、その後、T細胞活性化アッセイで用いた。VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIまたはgp350-AgAbを用いたPBMCの短時間ex vivo刺激：EBV陽性ドナー由来のバルクPBMCを、VLPs/LPs-EBNA1（1×106粒子）またはgp350-AgAb（20ng）を用いてパルス刺激した。2日間後、培養物にIL-2（10U/mL）を添加し、その後、IL-2を含有する培地中で維持した。細胞を、10日間後に、IL-2（10U/mL）および同量のVLPs/LPs-EBNA1またはgp350-AgAbを用いて再刺激した。1週間後、CD4、CD8およびCD3発現細胞の存在に関して、またはEBVを用いて一晩感染させた初代B細胞と共培養した場合に、細胞を分析した。VLPs/LPs-EBNA1刺激PBMCによる最近感染したB細胞の標的化：4名のEBV陽性ドナー由来のバルクPBMCを、IL-2（10U/mL）の存在下でVLPs/LPs-EBNA1（1×106粒子）またはgp350-AgAb（20ng）で2ラウンド刺激した。自家初代B細胞を、B95.8（MOI＝3）を用いて一晩感染させ、続いて、刺激されたPBMC、CD19枯渇PBMCまたは培地のみを用いて共培養した。ex vivo培養物を、感染5日間後にフローサイトメトリーおよび免疫蛍光を用いて分析して、EBV陽性細胞を観察した。細胞を、α-CD19-APC（HIB19クローン）を用いてフローサイトメトリー前に、ならびにα-CD20（L26クローン）、α-EBNA2（PE2クローン）およびDAPIを用いて免疫蛍光前に、染色した。
【0072】
VLPs/LPs-EBNA1刺激PBMCによるB細胞増生（outgrowth）の制限
8名のEBV陽性ドナー由来のバルクPBMCを、IL-2（10U/mL）の存在下でVLPs/LPs-EBNA1（1×106粒子）またはgp350-AgAb（20ng）で2ラウンド刺激した。B95-8またはM81を、それらの異なる形質転換能を考慮してそれぞれMOI＝3または30で用いて、B細胞に感染させた。α-CD19-APC（HIB19クローン）およびα-CD23-PE-Cy7（EBVCS2クローン）抗体を用いてex vivo培養物を染色し、フローサイトメトリーにより分析した。VLPs/LPs-EBNA1刺激PBMCからのEBNA1およびgp350特異的CD4+ T細胞の増殖：EBV陽性ドナー由来のPBMCを、IL-2の非存在下でVLPs/LPs-EBNA1RI+RII（1×106粒子）で1ラウンド刺激した。2週間後、照射（40Gy）自家PBMCを用いて細胞を再刺激し、IL-2の存在下で同じ用量のVLPs/LPs-EBNA1RI+RIIを用いてパルス刺激した。さらに2週間後、EBNA1またはgp350特異的T細胞を、EBNA1またはgp350を含むAgAb（10～50ng）を用いて2週間に1回細胞を刺激することにより、増殖させた。B95-8ΔZRを用いて生成した自家LCLを、5ラウンド目の刺激後に抗原提示細胞として用いた。T細胞を、10％プールヒト血清、IL-2（10U/mL）、10mM HEPES、2mM L-グルタミン、50μg/mLゲンタマイシンおよび0.4mg/mLシプロフロキサシンを添加したAIM V培地中で維持した。
8名のEBV陽性ドナー由来のバルクPBMCを、IL-2（10U/mL）の存在下でVLPs/LPs-EBNA1（1×106粒子）またはgp350-AgAb（20ng）で2ラウンド刺激した。B95-8またはM81を、それらの異なる形質転換能を考慮してそれぞれMOI＝3または30で用いて、B細胞に感染させた。α-CD19-APC（HIB19クローン）およびα-CD23-PE-Cy7（EBVCS2クローン）抗体を用いてex vivo培養物を染色し、フローサイトメトリーにより分析した。VLPs/LPs-EBNA1刺激PBMCからのEBNA1およびgp350特異的CD4+ T細胞の増殖：EBV陽性ドナー由来のPBMCを、IL-2の非存在下でVLPs/LPs-EBNA1RI+RII（1×106粒子）で1ラウンド刺激した。2週間後、照射（40Gy）自家PBMCを用いて細胞を再刺激し、IL-2の存在下で同じ用量のVLPs/LPs-EBNA1RI+RIIを用いてパルス刺激した。さらに2週間後、EBNA1またはgp350特異的T細胞を、EBNA1またはgp350を含むAgAb（10～50ng）を用いて2週間に1回細胞を刺激することにより、増殖させた。B95-8ΔZRを用いて生成した自家LCLを、5ラウンド目の刺激後に抗原提示細胞として用いた。T細胞を、10％プールヒト血清、IL-2（10U/mL）、10mM HEPES、2mM L-グルタミン、50μg/mLゲンタマイシンおよび0.4mg/mLシプロフロキサシンを添加したAIM V培地中で維持した。
【0073】
ヒト化NSG-A2マウスの作製、ワクチン接種およびチャレンジ
NSG-A2マウス（NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlTg (HLA-A2.1) 1Enge/SzJ）を、以前に記載された通りに、CD34+造血前駆細胞（HPC）を用いてヒト化した（Lin et al. (2015), PLoS Pathog 11: e1005344）。新生マウスに照射し（1Gy）、ヒト胎児肝臓組織から単離されたCD34+ HPC（Advanced Bioscience Resources, USA）を肝臓内に注入した。12週間後、マウスの末梢血中のヒトCD45+細胞の存在を、ヒト化の成功を確認するために決定した。合計で、20頭のヒト化NSG-A2（huNSG-A2）マウスを、ヒト化比率の類似性に従って無作為に群分けし、単盲検形式で、PBS、VLPs/LPs（1×106粒子）またはVLPs/LPs-EBNA1（1×106粒子）を腹腔内に注入した。すべてのケースで、50μgのpoly(I:C)をアジュバントとして用いた。1ヵ月後に同じ処置を用いて動物を追加免疫した。追加免疫から1ヵ月半後、動物に1×105GRUのB95-8を腹腔内注入した。感染から8週間後にマウスを屠殺し、その血液および組織を、EBV感染の証拠について分析した。動物実験で用いたすべてのVLPs/LPsおよびウイルスは、上清を18000×gで3時間遠心分離し、PBS中に再懸濁することにより取得した。
NSG-A2マウス（NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlTg (HLA-A2.1) 1Enge/SzJ）を、以前に記載された通りに、CD34+造血前駆細胞（HPC）を用いてヒト化した（Lin et al. (2015), PLoS Pathog 11: e1005344）。新生マウスに照射し（1Gy）、ヒト胎児肝臓組織から単離されたCD34+ HPC（Advanced Bioscience Resources, USA）を肝臓内に注入した。12週間後、マウスの末梢血中のヒトCD45+細胞の存在を、ヒト化の成功を確認するために決定した。合計で、20頭のヒト化NSG-A2（huNSG-A2）マウスを、ヒト化比率の類似性に従って無作為に群分けし、単盲検形式で、PBS、VLPs/LPs（1×106粒子）またはVLPs/LPs-EBNA1（1×106粒子）を腹腔内に注入した。すべてのケースで、50μgのpoly(I:C)をアジュバントとして用いた。1ヵ月後に同じ処置を用いて動物を追加免疫した。追加免疫から1ヵ月半後、動物に1×105GRUのB95-8を腹腔内注入した。感染から8週間後にマウスを屠殺し、その血液および組織を、EBV感染の証拠について分析した。動物実験で用いたすべてのVLPs/LPsおよびウイルスは、上清を18000×gで3時間遠心分離し、PBS中に再懸濁することにより取得した。
【0074】
実施例2：潜伏タンパク質を含めるためのEBVビリオンの抗原性スペクトルの拡大
拡大された抗原性スペクトルを有する免疫原性粒子を生成するために、本発明者らは、抗原をBNRF1に融合させた。しかしながら、野生型EBV（wtEB）はqPCRを通じて正確かつ高感度に定量化できるので、本発明者らはまず、組み込みを試験するためにwtEBVのBNRF1を改変した。wtEBVのBNRF1を改変して、抗原性が高い潜伏タンパク質であるEBNA3C由来の断片を含めた（図7）。wtEBV由来の細菌人工染色体（BAC）DNAを改変してEBNA3Cを含め、続いて、293細胞に安定的に導入して、ウイルス産生細胞株を作製した（293/EBV-E3C）。産生細胞内のEBV-E3C BAC DNAの完全性は、制限酵素分析を用いて確認した（S1図面）。293/EBV-E3Cおよび293/wtEBVへの溶解性トランスアクチベーターBZLF1遺伝子のトランスフェクションにより、後期溶解性タンパク質gp350を発現する細胞が同様の割合（％）で得られた（図7）。このことは、潜伏抗原を含めるBNRF1の改変が、溶解性複製に影響しないことを示す。次に、本発明者らは、T細胞活性化アッセイでEBV-E3CウイルスとwtEBVウイルスの抗原性を比較した（図1A）。自家リンパ芽球様細胞株（LCL）を、2種類のウイルスまたはペプチド対照を用いてパルス刺激し、続いて、BNRF1特異的（Adhikary et al. (2007)、直上）またはEBNA3C特異的（Yu et al. (2015)、直上）CD4+ T細胞と共に共培養した。これにより、ビリオンが、それらのBNRF1が改変されてEBNA3C断片を含む場合には、EBNA3C特異的CD4+ T細胞およびBNRF1特異的CD4+ T細胞を刺激することができることが裏付けられた。逆に、未改変型BNRF1を含むwtEBVは、BNRF1特異的CD4+ T細胞のみを刺激することができた（図1A）。すべての場合に、適用されたウイルスの用量は、T細胞により生じる応答に相関し、僅か1×104個のビリオン（ゲノム当量（geq））で、BNRF1およびEBNA3C特異的T細胞からの応答を生じることができた。重要なことに、BNRF1特異的CD4+ T細胞は、改変型および未改変型のEBVを、同程度に認識した。このことは、BNRF1-潜伏抗原融合タンパク質が、BNRF1の抗原性に影響することなく、EBVの抗原性スペクトルを拡大したことを示す。次に、本発明者らは、EBV-E3Cの拡大された抗原性スペクトルが、ビリオン内に含められたBNRF1-潜伏抗原融合体にのみ起因したのか否かを試験した。この目的で、ウイルス上清を抗gp350中和抗体と共に予備インキュベーションし、その後に、T細胞認識アッセイで用いた（図1B）。これにより、中和抗体が、EBV-E3Cの抗原性を無効にできることが示された。総合すると、これらの結果は、BNRF1-潜伏抗原融合タンパク質が成功裏にビリオン中にパッケージングされ、かつそれらの抗原性スペクトルを拡大することを裏付ける。
拡大された抗原性スペクトルを有する免疫原性粒子を生成するために、本発明者らは、抗原をBNRF1に融合させた。しかしながら、野生型EBV（wtEB）はqPCRを通じて正確かつ高感度に定量化できるので、本発明者らはまず、組み込みを試験するためにwtEBVのBNRF1を改変した。wtEBVのBNRF1を改変して、抗原性が高い潜伏タンパク質であるEBNA3C由来の断片を含めた（図7）。wtEBV由来の細菌人工染色体（BAC）DNAを改変してEBNA3Cを含め、続いて、293細胞に安定的に導入して、ウイルス産生細胞株を作製した（293/EBV-E3C）。産生細胞内のEBV-E3C BAC DNAの完全性は、制限酵素分析を用いて確認した（S1図面）。293/EBV-E3Cおよび293/wtEBVへの溶解性トランスアクチベーターBZLF1遺伝子のトランスフェクションにより、後期溶解性タンパク質gp350を発現する細胞が同様の割合（％）で得られた（図7）。このことは、潜伏抗原を含めるBNRF1の改変が、溶解性複製に影響しないことを示す。次に、本発明者らは、T細胞活性化アッセイでEBV-E3CウイルスとwtEBVウイルスの抗原性を比較した（図1A）。自家リンパ芽球様細胞株（LCL）を、2種類のウイルスまたはペプチド対照を用いてパルス刺激し、続いて、BNRF1特異的（Adhikary et al. (2007)、直上）またはEBNA3C特異的（Yu et al. (2015)、直上）CD4+ T細胞と共に共培養した。これにより、ビリオンが、それらのBNRF1が改変されてEBNA3C断片を含む場合には、EBNA3C特異的CD4+ T細胞およびBNRF1特異的CD4+ T細胞を刺激することができることが裏付けられた。逆に、未改変型BNRF1を含むwtEBVは、BNRF1特異的CD4+ T細胞のみを刺激することができた（図1A）。すべての場合に、適用されたウイルスの用量は、T細胞により生じる応答に相関し、僅か1×104個のビリオン（ゲノム当量（geq））で、BNRF1およびEBNA3C特異的T細胞からの応答を生じることができた。重要なことに、BNRF1特異的CD4+ T細胞は、改変型および未改変型のEBVを、同程度に認識した。このことは、BNRF1-潜伏抗原融合タンパク質が、BNRF1の抗原性に影響することなく、EBVの抗原性スペクトルを拡大したことを示す。次に、本発明者らは、EBV-E3Cの拡大された抗原性スペクトルが、ビリオン内に含められたBNRF1-潜伏抗原融合体にのみ起因したのか否かを試験した。この目的で、ウイルス上清を抗gp350中和抗体と共に予備インキュベーションし、その後に、T細胞認識アッセイで用いた（図1B）。これにより、中和抗体が、EBV-E3Cの抗原性を無効にできることが示された。総合すると、これらの結果は、BNRF1-潜伏抗原融合タンパク質が成功裏にビリオン中にパッケージングされ、かつそれらの抗原性スペクトルを拡大することを裏付ける。
【0075】
実施例3：gp110を欠損するVLPs/LPsの抗原性多様化
次に、本発明者らは、gp110陰性VLPs/LPs中のBNRF1-潜伏抗原融合タンパク質の抗原性を確認した。gp110はウイルスと宿主との膜融合を不可能にし（Neuhierl et al. (2009), J Virol 83: 4616）、かつ毒性を解消することが示されているので、本発明者らは、本研究ではgp110陰性VLPs/LPsのみを用いた。本発明者らは、同時に、VLPs/LPsおよびwtEBVを改変してEBNA3C断片およびEBNA1断片をコードさせ、それにより293/VLPs/LPs-E3C-E1および293/EBV-E3C-E1産生細胞をそれぞれ作製した。EBNA1は、EBNA3Cと同様に、集団により頻繁に認識される免疫原性が高い潜伏タンパク質である。DNA不含VLPs/LPs-E3C-E1を、フローサイトメトリーを用いて定量化し、続いて、qPCRを用いて定量化された同等量のEBV-E3C-E1と比較した。これにより、フローサイトメトリーが、DNA不含VLPs/LPsの信頼性の高い定量化を可能にすることが確認された。次に、VLPs/LPs-E3C-E1を、EBV-E3C-E1と並行して、T細胞活性化アッセイで分析した（図2）。これにより、VLPs/LPsが、EBVビリオンと同様に、それらが改変されてEBNA3C断片およびEBNA1断片を含む場合に、BNRF1、gp350、EBNA3CおよびEBNA1特異的CD4+ T細胞を刺激できることが示された。さらに、改変型VLPs/LPsは、改変型EBVと同程度まで、種々の溶解性タンパク質および潜伏タンパク質特異的T細胞を刺激した。このことは、VLPs/LPsを、溶解性抗原および潜伏抗原を含む免疫原性粒子を生成するためのプラットフォームとして用いることができることを裏付けた。さらに、gp110の欠損は、VLPs/LPsの抗原性に負に影響せず、これにより、それらの抗原性を損なうことなく、それらの安全性を増大させることができることが示される。
次に、本発明者らは、gp110陰性VLPs/LPs中のBNRF1-潜伏抗原融合タンパク質の抗原性を確認した。gp110はウイルスと宿主との膜融合を不可能にし（Neuhierl et al. (2009), J Virol 83: 4616）、かつ毒性を解消することが示されているので、本発明者らは、本研究ではgp110陰性VLPs/LPsのみを用いた。本発明者らは、同時に、VLPs/LPsおよびwtEBVを改変してEBNA3C断片およびEBNA1断片をコードさせ、それにより293/VLPs/LPs-E3C-E1および293/EBV-E3C-E1産生細胞をそれぞれ作製した。EBNA1は、EBNA3Cと同様に、集団により頻繁に認識される免疫原性が高い潜伏タンパク質である。DNA不含VLPs/LPs-E3C-E1を、フローサイトメトリーを用いて定量化し、続いて、qPCRを用いて定量化された同等量のEBV-E3C-E1と比較した。これにより、フローサイトメトリーが、DNA不含VLPs/LPsの信頼性の高い定量化を可能にすることが確認された。次に、VLPs/LPs-E3C-E1を、EBV-E3C-E1と並行して、T細胞活性化アッセイで分析した（図2）。これにより、VLPs/LPsが、EBVビリオンと同様に、それらが改変されてEBNA3C断片およびEBNA1断片を含む場合に、BNRF1、gp350、EBNA3CおよびEBNA1特異的CD4+ T細胞を刺激できることが示された。さらに、改変型VLPs/LPsは、改変型EBVと同程度まで、種々の溶解性タンパク質および潜伏タンパク質特異的T細胞を刺激した。このことは、VLPs/LPsを、溶解性抗原および潜伏抗原を含む免疫原性粒子を生成するためのプラットフォームとして用いることができることを裏付けた。さらに、gp110の欠損は、VLPs/LPsの抗原性に負に影響せず、これにより、それらの抗原性を損なうことなく、それらの安全性を増大させることができることが示される。
【0076】
実施例4：改変型VLPs/LPsは最近感染したB細胞を効果的に標的化するT細胞を増加させる
EBV特異的T細胞がEBV感染の制御に重要な役割を果たすので、本発明者らは、改変型VLPs/LPsが防御価値を有するEBV特異的T細胞を増加させることができるか否かを試験した。この目的のために、恣意的に領域I、領域IIおよび領域I:IIと命名されたEBNA1由来のエピトープ豊富な領域を用いて、EBNA1をコードするVLPs/LPs産生細胞を作製した。ウエスタンブロットを用いた産生細胞の分析により、293/VLP/LP-EBNA1RI:II産生細胞は大型のBNRF1-EBNA1融合体を発現できないが、293/VLP/LP-EBNA1RIおよび293/VLP/LP-EBNA1RII産生細胞はそれらのBNRF1-EBNA1融合体を成功裏に発現したことが示された（図3A）。したがって、VLPs/LPs-EBNA1RI:IIは分析から除外された。VLPs/LPs-EBNA1RIおよびVLPs/LPs-EBNA1RIIを組み合わせて（VLPs/LPs-EBNA1RI+RII）、ハプロタイプ分類されていないEBV陽性ドナー由来のバルクPBMCを刺激するために用いた（図3B）。対照として、同じドナー由来のPBMCを、主要EBV糖タンパク質であるgp350を含む抗原武装抗体（antigen-armed antibody、AgAb）でも増殖させた。AgAbは、元来はB細胞悪性腫瘍のための標的化療法として開発されたが、本研究では、目的のEBV特異的T細胞を増殖させるために別の目的で用いた。VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIまたはgp350-AgAbを用いたEBV陽性ドナー由来のPBMCの刺激は、EBV陽性ドナーのPBMCから同様の数のCD4+、CD8+および総T細胞を増殖させた（図3B）。次に、4名のEBV陽性ドナーのPBMCから増殖させたT細胞を、B95-8感染初代B細胞と共に共培養した。5日間後、ex vivo培養物をフローサイトメトリーにより分析し、EBV感染B細胞の存在を決定した（図3C）。組み換えB95-8株はGFPをコードするので、このことは、CD19+GFP+二重陽性細胞を特定することにより、感染B細胞を検出することを可能にした。これにより、ex vivo培養物が、対照サンプルと比較して、gp350特異的T細胞およびVLPs/LPs-EBNA1RI+RII特異的T細胞の存在下ではより少ないCD19+GFP+二重陽性細胞しか含まなかったことが示された。このことは、gp350特異的T細胞およびVLPs/LPs-EBNA1RI+RII特異的T細胞の両方が、感染初期にEBV感染B細胞を標的化することが可能であることを示す。しかしながら、4名のドナーからの結果は、VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIに特異的なT細胞が、gp350特異的T細胞よりも、最近感染したB細胞の標的化に関して実質的に強力であったことを示す（図3C）。ex vivo培養物は、VLPs/LPs-EBNA1RI+RII特異的なT細胞の存在下では、非常に少数のEBNA2陽性B細胞しか含まなかった。まとめると、これらの結果は、改変型VLPs/LPsが、gp350のみから構成されるワクチンと比較して、優れた防御T細胞応答を生じる可能性が高いことを示す。
EBV特異的T細胞がEBV感染の制御に重要な役割を果たすので、本発明者らは、改変型VLPs/LPsが防御価値を有するEBV特異的T細胞を増加させることができるか否かを試験した。この目的のために、恣意的に領域I、領域IIおよび領域I:IIと命名されたEBNA1由来のエピトープ豊富な領域を用いて、EBNA1をコードするVLPs/LPs産生細胞を作製した。ウエスタンブロットを用いた産生細胞の分析により、293/VLP/LP-EBNA1RI:II産生細胞は大型のBNRF1-EBNA1融合体を発現できないが、293/VLP/LP-EBNA1RIおよび293/VLP/LP-EBNA1RII産生細胞はそれらのBNRF1-EBNA1融合体を成功裏に発現したことが示された（図3A）。したがって、VLPs/LPs-EBNA1RI:IIは分析から除外された。VLPs/LPs-EBNA1RIおよびVLPs/LPs-EBNA1RIIを組み合わせて（VLPs/LPs-EBNA1RI+RII）、ハプロタイプ分類されていないEBV陽性ドナー由来のバルクPBMCを刺激するために用いた（図3B）。対照として、同じドナー由来のPBMCを、主要EBV糖タンパク質であるgp350を含む抗原武装抗体（antigen-armed antibody、AgAb）でも増殖させた。AgAbは、元来はB細胞悪性腫瘍のための標的化療法として開発されたが、本研究では、目的のEBV特異的T細胞を増殖させるために別の目的で用いた。VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIまたはgp350-AgAbを用いたEBV陽性ドナー由来のPBMCの刺激は、EBV陽性ドナーのPBMCから同様の数のCD4+、CD8+および総T細胞を増殖させた（図3B）。次に、4名のEBV陽性ドナーのPBMCから増殖させたT細胞を、B95-8感染初代B細胞と共に共培養した。5日間後、ex vivo培養物をフローサイトメトリーにより分析し、EBV感染B細胞の存在を決定した（図3C）。組み換えB95-8株はGFPをコードするので、このことは、CD19+GFP+二重陽性細胞を特定することにより、感染B細胞を検出することを可能にした。これにより、ex vivo培養物が、対照サンプルと比較して、gp350特異的T細胞およびVLPs/LPs-EBNA1RI+RII特異的T細胞の存在下ではより少ないCD19+GFP+二重陽性細胞しか含まなかったことが示された。このことは、gp350特異的T細胞およびVLPs/LPs-EBNA1RI+RII特異的T細胞の両方が、感染初期にEBV感染B細胞を標的化することが可能であることを示す。しかしながら、4名のドナーからの結果は、VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIに特異的なT細胞が、gp350特異的T細胞よりも、最近感染したB細胞の標的化に関して実質的に強力であったことを示す（図3C）。ex vivo培養物は、VLPs/LPs-EBNA1RI+RII特異的なT細胞の存在下では、非常に少数のEBNA2陽性B細胞しか含まなかった。まとめると、これらの結果は、改変型VLPs/LPsが、gp350のみから構成されるワクチンと比較して、優れた防御T細胞応答を生じる可能性が高いことを示す。
【0077】
実施例5：改変型VLPs/LPsはB95-8感染およびM81感染B細胞の増生を制限するT細胞を増加させる
VLP/LPs-EBNA1RI+RII特異的T細胞がB95-8感染B細胞を効果的に標的化することが示されたので、本発明者らは、それらが長期間にわたって感染B細胞の増生を妨げることができるか否かを試験した。加えて、本発明者らは、VLP/LPs-EBNA1RI+RII特異的T細胞が、原型B95-8株または香港由来の遠縁のM81株（Tsai et al. (2013), Cell Rep 5: 458-470）に感染させたB細胞の増生を妨げることができるか否かを試験した。本発明者らは、上記と同様に8名のEBV陽性ドナー由来のPBMCを刺激し（図3を参照されたい）、続いて、B95-8感染B細胞およびM81感染B細胞と共に共培養した。陽性および陰性対照として、感染B細胞を、CD19- PBMCと共に、または培地のみの中で、それぞれ培養した。15日間後、ex vivo培養物を、B細胞の増生を検出するために、フローサイトメトリーにより分析した（図4）。増殖B細胞はCD23を発現するので、増生中のB細胞を、CD19+CD23+二重陽性細胞を検出することにより特定した。EBV感染B細胞は、それらを培地のみの中で培養した場合に、CD19+CD23-、CD19+CD23lowおよびCD19+CD23high集団からなり、B細胞のうちの大多数はCD19+CD23high型であることが見出された。それと比較して、CD19- PBMC、gp350特異的T細胞およびVLPs/LPs-EBNA1RI+RII特異的T細胞の存在下では、CD19+CD23+細胞の数は、大幅に減少した。このことは、増殖B細胞が、これらの培養物では制限されたことを示した。興味深いことに、gp350特異的T細胞は感染初期の感染B細胞の標的化に関してCD19- PBMCよりも効果的であることが示された一方で（図3を参照されたい）、一部のドナーのCD19- PBMCは、gp350特異的T細胞よりもB細胞増生の制限に関してはるかに強力であった（図4）。このことは、一部のドナー由来のPBMCが、gp350特異的T細胞以外のEBV特異的T細胞を含み、これがB細胞増生を制限できたことを示唆する。しかしながら、VLPs/LPs-EBNA1RI+RII特異的T細胞を含んだex vivo培養物中では、より高い程度まで、増殖B細胞が制限されたことが明らかである。さらに、これは、B95-8およびM81感染B細胞に関して、ならびにすべてのドナーに関して観察された（図4）。これにより、EBNA1を装備したVLPs/LPsが、B95-8およびM81 EBVに感染したB細胞を効果的に制限するEBV特異的T細胞を増加させることが裏付けられる。
VLP/LPs-EBNA1RI+RII特異的T細胞がB95-8感染B細胞を効果的に標的化することが示されたので、本発明者らは、それらが長期間にわたって感染B細胞の増生を妨げることができるか否かを試験した。加えて、本発明者らは、VLP/LPs-EBNA1RI+RII特異的T細胞が、原型B95-8株または香港由来の遠縁のM81株（Tsai et al. (2013), Cell Rep 5: 458-470）に感染させたB細胞の増生を妨げることができるか否かを試験した。本発明者らは、上記と同様に8名のEBV陽性ドナー由来のPBMCを刺激し（図3を参照されたい）、続いて、B95-8感染B細胞およびM81感染B細胞と共に共培養した。陽性および陰性対照として、感染B細胞を、CD19- PBMCと共に、または培地のみの中で、それぞれ培養した。15日間後、ex vivo培養物を、B細胞の増生を検出するために、フローサイトメトリーにより分析した（図4）。増殖B細胞はCD23を発現するので、増生中のB細胞を、CD19+CD23+二重陽性細胞を検出することにより特定した。EBV感染B細胞は、それらを培地のみの中で培養した場合に、CD19+CD23-、CD19+CD23lowおよびCD19+CD23high集団からなり、B細胞のうちの大多数はCD19+CD23high型であることが見出された。それと比較して、CD19- PBMC、gp350特異的T細胞およびVLPs/LPs-EBNA1RI+RII特異的T細胞の存在下では、CD19+CD23+細胞の数は、大幅に減少した。このことは、増殖B細胞が、これらの培養物では制限されたことを示した。興味深いことに、gp350特異的T細胞は感染初期の感染B細胞の標的化に関してCD19- PBMCよりも効果的であることが示された一方で（図3を参照されたい）、一部のドナーのCD19- PBMCは、gp350特異的T細胞よりもB細胞増生の制限に関してはるかに強力であった（図4）。このことは、一部のドナー由来のPBMCが、gp350特異的T細胞以外のEBV特異的T細胞を含み、これがB細胞増生を制限できたことを示唆する。しかしながら、VLPs/LPs-EBNA1RI+RII特異的T細胞を含んだex vivo培養物中では、より高い程度まで、増殖B細胞が制限されたことが明らかである。さらに、これは、B95-8およびM81感染B細胞に関して、ならびにすべてのドナーに関して観察された（図4）。これにより、EBNA1を装備したVLPs/LPsが、B95-8およびM81 EBVに感染したB細胞を効果的に制限するEBV特異的T細胞を増加させることが裏付けられる。
【0078】
実施例6：改変型VLPs/LPsは溶解サイクルおよび潜伏サイクル抗原を認識する細胞溶解性T細胞を刺激する
VLPs/LPs-EBNA1RI+RII特異的T細胞がEBV感染細胞を標的化および制御することが示されたが、それにより、それらは細胞溶解性であることが示唆された。VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIが細胞溶解性T細胞を刺激することを最終的に確認するために、本発明者らは、VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIにより刺激されたPBMC由来のEBNA1およびgp350特異的T細胞を増殖させ、それらをその細胞傷害能に関して分析した。ハプロタイプ分類されていないEBV陽性ドナー由来のバルクPBMCを、2～3ラウンドにわたってVLPs/LPs-EBNA1RI+RIIを用いて刺激し、その後、gp350-AgAbまたはEBNA1-AgAbを用いてgp350特異的CD4+ T細胞およびEBNA1特異的CD4+ T細胞を増殖させた（図5A）。増殖させたCD4+ T細胞は、EBNA1またはgp350のいずれかに対して特異的であることを確認した。ex vivo増殖されたCD4+ T細胞は、EBNA1-AgAbまたはgp350-AgAbに対して、かつEBNA1 3G2またはgp350 1D6エピトープペプチドに対して特異的に応答した。次に、本発明者らは、EBNA1特異的CD4+ T細胞およびgp350特異的CD4+ T細胞が、細胞溶解顆粒（cytolytic granule）の放出に対する代理マーカーであるCD107aを発現できるか否かを決定した。自家LCLを、α-CD20、EBNA1-AgAbまたはgp350-AgAbを用いてパルス刺激し、続いて、EBNA1特異的CD4+ T細胞およびgp350特異的CD4+ T細胞と共に共培養した。これにより、両方のCD4+ T細胞株が、関連する抗原に応答してCD107aをアップレギュレーションすることが示された。しかしながら、gp350特異的CD4+ T細胞のうちの約50％がCD107aを発現した一方で、EBNA1特異的CD4+ T細胞のうちの10％しかCD107aを発現しなかった。次に、本発明者らは、EBNA1特異的CD4+ T細胞およびgp350特異的CD4+ T細胞が、細胞溶解性グランザイムBのメディエーターを放出する能力を試験した（図5B）。EBNA1特異的CD4+ T細胞およびgp350特異的CD4+ T細胞の両方が、関連するAgAbおよびエピトープペプチドに応答してグランザイムBを放出した。最後に、本発明者らは、EBNA1特異的CD4+ T細胞およびgp350特異的CD4+ T細胞が、抗原を用いてパルス刺激された自家LCLを直接的に溶解できるか否かを試験した（図5C）。これにより、EBNA1特異的CD4+ T細胞およびgp350特異的CD4+ T細胞の両方が、エピトープペプチドおよびEBNA1を含んだVLPs/LPsを用いてパルス刺激されたLCLを特異的に溶解したことが示された。併せて考えると、これらの結果は、VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIが、溶解性および潜伏抗原に特異的な細胞溶解性CD4+ T細胞を刺激する能力を有することを裏付ける。これらの結果は、EBNA1特異的およびgp350特異的T細胞が細胞溶解性であることを示した以前の研究と合致する。
VLPs/LPs-EBNA1RI+RII特異的T細胞がEBV感染細胞を標的化および制御することが示されたが、それにより、それらは細胞溶解性であることが示唆された。VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIが細胞溶解性T細胞を刺激することを最終的に確認するために、本発明者らは、VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIにより刺激されたPBMC由来のEBNA1およびgp350特異的T細胞を増殖させ、それらをその細胞傷害能に関して分析した。ハプロタイプ分類されていないEBV陽性ドナー由来のバルクPBMCを、2～3ラウンドにわたってVLPs/LPs-EBNA1RI+RIIを用いて刺激し、その後、gp350-AgAbまたはEBNA1-AgAbを用いてgp350特異的CD4+ T細胞およびEBNA1特異的CD4+ T細胞を増殖させた（図5A）。増殖させたCD4+ T細胞は、EBNA1またはgp350のいずれかに対して特異的であることを確認した。ex vivo増殖されたCD4+ T細胞は、EBNA1-AgAbまたはgp350-AgAbに対して、かつEBNA1 3G2またはgp350 1D6エピトープペプチドに対して特異的に応答した。次に、本発明者らは、EBNA1特異的CD4+ T細胞およびgp350特異的CD4+ T細胞が、細胞溶解顆粒（cytolytic granule）の放出に対する代理マーカーであるCD107aを発現できるか否かを決定した。自家LCLを、α-CD20、EBNA1-AgAbまたはgp350-AgAbを用いてパルス刺激し、続いて、EBNA1特異的CD4+ T細胞およびgp350特異的CD4+ T細胞と共に共培養した。これにより、両方のCD4+ T細胞株が、関連する抗原に応答してCD107aをアップレギュレーションすることが示された。しかしながら、gp350特異的CD4+ T細胞のうちの約50％がCD107aを発現した一方で、EBNA1特異的CD4+ T細胞のうちの10％しかCD107aを発現しなかった。次に、本発明者らは、EBNA1特異的CD4+ T細胞およびgp350特異的CD4+ T細胞が、細胞溶解性グランザイムBのメディエーターを放出する能力を試験した（図5B）。EBNA1特異的CD4+ T細胞およびgp350特異的CD4+ T細胞の両方が、関連するAgAbおよびエピトープペプチドに応答してグランザイムBを放出した。最後に、本発明者らは、EBNA1特異的CD4+ T細胞およびgp350特異的CD4+ T細胞が、抗原を用いてパルス刺激された自家LCLを直接的に溶解できるか否かを試験した（図5C）。これにより、EBNA1特異的CD4+ T細胞およびgp350特異的CD4+ T細胞の両方が、エピトープペプチドおよびEBNA1を含んだVLPs/LPsを用いてパルス刺激されたLCLを特異的に溶解したことが示された。併せて考えると、これらの結果は、VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIが、溶解性および潜伏抗原に特異的な細胞溶解性CD4+ T細胞を刺激する能力を有することを裏付ける。これらの結果は、EBNA1特異的およびgp350特異的T細胞が細胞溶解性であることを示した以前の研究と合致する。
【0079】
実施例7：EBNA1を含有するEBV VLPs/LPsを用いたワクチン接種はwtEBV感染からマウスを保護する
改変型VLPs/LPsがin vitroおよびex vivoで抗原性であることが示されたので、本発明者らは、VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIがin vivoで防御能力を有したか否かを評価する。この目的のために、EBV感染に対して感受性であり、かつEBV特異的免疫制御を発揮することが可能なヒト免疫系構成要素を用いて再構築されたマウスを用いて、VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIについて調べた。ヒト化NSG-A2（huNSG-A2）マウスを無作為に群分けし、PBS、未改変型VLPs/LPs（1×106粒子）またはVLPs/LPs-EBNA1RI+RII（1×106粒子）を、poly(I:C)をアジュバントとして用いて、腹腔内注入した。4週間後、同じ用量を用いてマウスに追加免疫した。最後の追加免疫から6週間後に、動物にB95-8（1×105GRU）をチャレンジし、8週間後に安楽死させた。文献から、本発明者らは、この力価が腫瘍の肉眼的発達を伴わない感染を可能にするであろうことを知っていた。チャレンジされた動物の脾臓を、組織学により分析した。これにより、すべての動物が、その脾臓中にヒトCD20およびCD3陽性細胞を含んだことが示された。しかしながら、CD20およびCD3陽性細胞の量と様々な処置との間に相関はなかった。in situハイブリダイゼーションにより、PBS群および未改変型VLPs/LPs群由来のマウスの脾臓において、EBVコードRNA（EBER）を発現する散在性細胞の存在が明らかになった。合計で、PBS群由来のマウスのうちの60％がEBER+細胞を含むことが見出され、一方で、VLPs/LPs群由来のマウスのうちの37.5％がEBER+細胞を含んでいた（図6A）。統計学的解析により、この観察結果が統計学的に有意でないことが示された（P＞0.05）。VLPs/LPs-EBNA1RI+RII群由来のいずれの脾臓サンプルも、EBER+細胞を含むことは見出されなかった。この結果は、PBS群（P＝0.009）およびVLPs/LPs群（P＝0.035）からは統計学的に有意であることが確認された。次に、qPCRを用いて、チャレンジされた動物の末梢血中のEBVの存在を検出した（図6B）。これにより、PBS群由来のマウスのうちの100％がその末梢血中にEBV DNAを含み、それと比較してVLPs/LPs群のうちの62％およびVLPs/LPs-EBNA1RI+RII群のうちの14％がその末梢血中にEBV DNAを含んだことが示された。ここでまた、統計学的解析により、PBS群とVLPs/LPs群との間で観察された差異は有意でなかったことが明らかになった（P＞0.05）。しかしながら、統計学的解析は、VLPs/LPs-EBNA1RI+RII群とPBS群（P＝0.0017）およびVLPs/LPs群（P＝0.0286）との間の差異は有意であったことを示した。これらの結果は、VLPs/LPs内にEBNA1を含めることによって、ワクチンにより誘導される免疫が有意に改善されたことを示し、このことは、複数の免疫優勢潜伏タンパク質に由来する抗原性断片を含有するVLPs/LPsを含む将来の研究にとっては吉兆である。
文献
改変型VLPs/LPsがin vitroおよびex vivoで抗原性であることが示されたので、本発明者らは、VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIがin vivoで防御能力を有したか否かを評価する。この目的のために、EBV感染に対して感受性であり、かつEBV特異的免疫制御を発揮することが可能なヒト免疫系構成要素を用いて再構築されたマウスを用いて、VLPs/LPs-EBNA1RI+RIIについて調べた。ヒト化NSG-A2（huNSG-A2）マウスを無作為に群分けし、PBS、未改変型VLPs/LPs（1×106粒子）またはVLPs/LPs-EBNA1RI+RII（1×106粒子）を、poly(I:C)をアジュバントとして用いて、腹腔内注入した。4週間後、同じ用量を用いてマウスに追加免疫した。最後の追加免疫から6週間後に、動物にB95-8（1×105GRU）をチャレンジし、8週間後に安楽死させた。文献から、本発明者らは、この力価が腫瘍の肉眼的発達を伴わない感染を可能にするであろうことを知っていた。チャレンジされた動物の脾臓を、組織学により分析した。これにより、すべての動物が、その脾臓中にヒトCD20およびCD3陽性細胞を含んだことが示された。しかしながら、CD20およびCD3陽性細胞の量と様々な処置との間に相関はなかった。in situハイブリダイゼーションにより、PBS群および未改変型VLPs/LPs群由来のマウスの脾臓において、EBVコードRNA（EBER）を発現する散在性細胞の存在が明らかになった。合計で、PBS群由来のマウスのうちの60％がEBER+細胞を含むことが見出され、一方で、VLPs/LPs群由来のマウスのうちの37.5％がEBER+細胞を含んでいた（図6A）。統計学的解析により、この観察結果が統計学的に有意でないことが示された（P＞0.05）。VLPs/LPs-EBNA1RI+RII群由来のいずれの脾臓サンプルも、EBER+細胞を含むことは見出されなかった。この結果は、PBS群（P＝0.009）およびVLPs/LPs群（P＝0.035）からは統計学的に有意であることが確認された。次に、qPCRを用いて、チャレンジされた動物の末梢血中のEBVの存在を検出した（図6B）。これにより、PBS群由来のマウスのうちの100％がその末梢血中にEBV DNAを含み、それと比較してVLPs/LPs群のうちの62％およびVLPs/LPs-EBNA1RI+RII群のうちの14％がその末梢血中にEBV DNAを含んだことが示された。ここでまた、統計学的解析により、PBS群とVLPs/LPs群との間で観察された差異は有意でなかったことが明らかになった（P＞0.05）。しかしながら、統計学的解析は、VLPs/LPs-EBNA1RI+RII群とPBS群（P＝0.0017）およびVLPs/LPs群（P＝0.0286）との間の差異は有意であったことを示した。これらの結果は、VLPs/LPs内にEBNA1を含めることによって、ワクチンにより誘導される免疫が有意に改善されたことを示し、このことは、複数の免疫優勢潜伏タンパク質に由来する抗原性断片を含有するVLPs/LPsを含む将来の研究にとっては吉兆である。
文献
【0080】
【表1】
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-06-16
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
エプスタイン・バーウイルス様粒子（EB-VLP）を含む調製物であって、該EB-VLPは、エプスタイン・バーウイルス（EBV）DNAを本質的に含まず、該EB-VLPは、EBVテグメントポリペプチドの少なくとも1種のペプチドおよび少なくとも1種の免疫原性ペプチドを含むワクチン接種ポリペプチドを含む、上記調製物。
【請求項2】
前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが少なくとも1種のT細胞エピトープを含む、請求項1に記載の調製物。
【請求項3】
前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが、病原性微生物の免疫原性ペプチドである、請求項1または2に記載の調製物。
【請求項4】
前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが、潜伏EBVポリペプチドの免疫原性ペプチドである、請求項1～3のいずれか1項に記載の調製物。
【請求項5】
前記潜伏EBVポリペプチドが、EBNA-1、EBNA-LP、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、LMP-1、およびLMP-2Aからなるリストより選択される、請求項4に記載の調製物。
【請求項6】
前記EBVテグメントポリペプチドがEBV BNRF1ポリペプチドである、請求項1～5のいずれか1項に記載の調製物。
【請求項7】
前記免疫原性ペプチドが、前記BNRF1ポリペプチドの1～172位のいずれか1箇所で該BNRF1ポリペプチドに挿入され、かつ/または該位置の範囲内のアミノ酸を置き換える、請求項6に記載の調製物。
【請求項8】
前記ワクチン接種ポリペプチドが、配列番号1、2、または3のアミノ酸配列を含む、請求項1～7のいずれか1項に記載の調製物。
【請求項9】
請求項1～8のいずれか1項に特定される通りのワクチン接種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項10】
EBVゲノムをさらにコードする、請求項9に記載のポリヌクレオチド。
【請求項11】
請求項9または10に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項12】
医薬での使用のための、請求項1～8のいずれか1項に記載の調製物、請求項9もしくは10に記載のポリヌクレオチド、および/または請求項11に記載の宿主細胞。
【請求項13】
被験体のワクチン接種での使用のための、請求項1～8のいずれか1項に記載の調製物、請求項9もしくは10に記載のポリヌクレオチド、および/または請求項11に記載の宿主細胞。
【請求項14】
被験体のT細胞をin vitroで刺激するための方法であって、該T細胞に、(i) 請求項1～8のいずれか1項に記載の調製物、
(ii) 請求項9もしくは10に記載のポリヌクレオチド、
(iii) 請求項11に記載の宿主細胞、または
(v) (i)～(iii)のいずれかの組み合わせ
を接触させ、それにより該被験体のT細胞を刺激するステップ
を含む、方法。
【請求項15】
筐体内に含められる、請求項1～8のいずれか1項に記載の調製物、請求項9もしくは10に記載のポリヌクレオチド、および/または請求項11に記載の宿主細胞を含む、キット。
【請求項16】
請求項9または10に記載のポリヌクレオチドから生成されるかまたは生成可能なEBV粒子。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0064】
本明細書中で引用されるすべての参考文献が、それらの開示内容全体および本明細書中で具体的に言及される開示内容に関して、参照により本明細書中に組み込まれる。
本発明は以下の態様も提供する。
［１］ エプスタイン・バーウイルス様粒子（EB-VLP）を含む調製物であって、該EB-VLPは、エプスタイン・バーウイルス（EBV）DNAを本質的に含まず、該EB-VLPは、EBVテグメントポリペプチドの少なくとも1種のペプチドおよび少なくとも1種の免疫原性ペプチドを含むワクチン接種ポリペプチドを含む、上記調製物。
［２］ 前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが少なくとも1種のT細胞エピトープを含む、［1］に記載の調製物。
［３］ 前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが、病原性微生物の、好ましくはウイルスの、より好ましくはヘルペスウイルスの免疫原性ペプチドである、［1］または[2]に記載の調製物。
［４］ 前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが、潜伏EBVポリペプチドの免疫原性ペプチドである、［1］～[3]のいずれかに記載の調製物。
［５］ 前記潜伏EBVポリペプチドが、EBNA-1、EBNA-LP、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、LMP-1、およびLMP-2Aからなるリストより選択され；好ましくはEBNA-1である、［4］に記載の調製物。
［６］ 前記EBVテグメントポリペプチドがEBV BNRF1ポリペプチドである、［1］～[5]のいずれかに記載の調製物。
［７］ 前記免疫原性ペプチドが、前記BNRF1ポリペプチドの1～172位のいずれか1箇所で該BNRF1ポリペプチドに挿入され、かつ/または該位置の範囲内のアミノ酸を置き換える、［6］に記載の調製物。
［８］ 前記ワクチン接種ポリペプチドが、配列番号1、2、または3のアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号1、2、または3のアミノ酸配列からなる、［1］～[7]のいずれかに記載の調製物。
［９］ ［1］～[8]のいずれかに特定される通りのワクチン接種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［１０］ EBVゲノムをさらにコードする、［9］に記載のポリヌクレオチド。
［１１］ ［9］または[10]に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
［１２］ 医薬での使用のための、［1］～[8]のいずれかに記載の調製物、［9］もしくは[10]に記載のポリヌクレオチド、および/または［11］に記載の宿主細胞。
［１３］ 被験体のワクチン接種での使用のための、［1］～[8]のいずれかに記載の調製物、［9］もしくは[10]に記載のポリヌクレオチド、および/または［11］に記載の宿主細胞。
［１４］ 被験体に、
(i) ［1］～[8]のいずれかに記載の調製物、
(ii) ［9］もしくは[10]に記載のポリヌクレオチド、
(iii) ［11］に記載の宿主細胞、または
(v) (i)～(iii)のいずれかの組み合わせ
を接触させ、それにより該被験体のT細胞を刺激するステップ
を含む、被験体のT細胞を刺激するための方法。
［１５］ 筐体内に含められる、［1］～[8]のいずれかに記載の調製物、［9］もしくは[10]に記載のポリヌクレオチド、および/または［11］に記載の宿主細胞を含む、キット。
［１６］ ［9］または[10]に記載のポリヌクレオチドから生成されるかまたは生成可能なEBV粒子。
本発明は以下の態様も提供する。
［１］ エプスタイン・バーウイルス様粒子（EB-VLP）を含む調製物であって、該EB-VLPは、エプスタイン・バーウイルス（EBV）DNAを本質的に含まず、該EB-VLPは、EBVテグメントポリペプチドの少なくとも1種のペプチドおよび少なくとも1種の免疫原性ペプチドを含むワクチン接種ポリペプチドを含む、上記調製物。
［２］ 前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが少なくとも1種のT細胞エピトープを含む、［1］に記載の調製物。
［３］ 前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが、病原性微生物の、好ましくはウイルスの、より好ましくはヘルペスウイルスの免疫原性ペプチドである、［1］または[2]に記載の調製物。
［４］ 前記少なくとも1種の免疫原性ペプチドが、潜伏EBVポリペプチドの免疫原性ペプチドである、［1］～[3]のいずれかに記載の調製物。
［５］ 前記潜伏EBVポリペプチドが、EBNA-1、EBNA-LP、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、LMP-1、およびLMP-2Aからなるリストより選択され；好ましくはEBNA-1である、［4］に記載の調製物。
［６］ 前記EBVテグメントポリペプチドがEBV BNRF1ポリペプチドである、［1］～[5]のいずれかに記載の調製物。
［７］ 前記免疫原性ペプチドが、前記BNRF1ポリペプチドの1～172位のいずれか1箇所で該BNRF1ポリペプチドに挿入され、かつ/または該位置の範囲内のアミノ酸を置き換える、［6］に記載の調製物。
［８］ 前記ワクチン接種ポリペプチドが、配列番号1、2、または3のアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号1、2、または3のアミノ酸配列からなる、［1］～[7]のいずれかに記載の調製物。
［９］ ［1］～[8]のいずれかに特定される通りのワクチン接種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［１０］ EBVゲノムをさらにコードする、［9］に記載のポリヌクレオチド。
［１１］ ［9］または[10]に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
［１２］ 医薬での使用のための、［1］～[8]のいずれかに記載の調製物、［9］もしくは[10]に記載のポリヌクレオチド、および/または［11］に記載の宿主細胞。
［１３］ 被験体のワクチン接種での使用のための、［1］～[8]のいずれかに記載の調製物、［9］もしくは[10]に記載のポリヌクレオチド、および/または［11］に記載の宿主細胞。
［１４］ 被験体に、
(i) ［1］～[8]のいずれかに記載の調製物、
(ii) ［9］もしくは[10]に記載のポリヌクレオチド、
(iii) ［11］に記載の宿主細胞、または
(v) (i)～(iii)のいずれかの組み合わせ
を接触させ、それにより該被験体のT細胞を刺激するステップ
を含む、被験体のT細胞を刺激するための方法。
［１５］ 筐体内に含められる、［1］～[8]のいずれかに記載の調製物、［9］もしくは[10]に記載のポリヌクレオチド、および/または［11］に記載の宿主細胞を含む、キット。
［１６］ ［9］または[10]に記載のポリヌクレオチドから生成されるかまたは生成可能なEBV粒子。
【国際調査報告】