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特表2022-504648高ポリマー密度バイオコンジュゲート組成物及び関連方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-13
(54)【発明の名称】高ポリマー密度バイオコンジュゲート組成物及び関連方法
(51)【国際特許分類】
A61K 47/32 20060101AFI20220105BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20220105BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220105BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20220105BHJP
【ＦＩ】
A61K47/32
A61K47/64
A61P43/00 111
A61K38/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021519761
(86)(22)【出願日】2019-10-10
(85)【翻訳文提出日】2021-06-02
(86)【国際出願番号】 US2019055577
(87)【国際公開番号】W WO2020077060
(87)【国際公開日】2020-04-16
(31)【優先権主張番号】62/743,670
(32)【優先日】2018-10-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514104933
【氏名又は名称】ユニヴァーシティ オブ ワシントン
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】特許業務法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ジアン，シャオイ
(72)【発明者】
【氏名】ユエン，ゼファン
(72)【発明者】
【氏名】ニウ，リチエン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076BB12
4C076EE17
4C076EE41
4C076FF68
4C084AA25
4C084MA66
4C084NA13
(57)【要約】
多層ポリマーバイオコンジュゲート、ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲート、及び多層のポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートを含む高ポリマー密度を有するバイオコンジュゲート組成物、並びに前記組成物を作製する方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体分子に共有結合した第１のポリマー及び前記第１のポリマーの少なくとも一部分に共有結合した第２のポリマーを有する前記生体分子を含むバイオコンジュゲート。
【請求項2】
前記第１のポリマーが前記生体分子を取り囲む第１の層を形成する、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項3】
前記第２のポリマーが前記生体分子を取り囲む第２の層を形成する、請求項１又は２に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項4】
前記生体分子がタンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、脂質、核酸、細胞、ウイルス、又は細菌である、請求項１～３のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項5】
前記第１のポリマーが両性イオン性のポリマー又はペプチドである、請求項１～４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項6】
前記第１のポリマーがＥＫ含有ペプチドである、請求項１～４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項7】
前記第２のポリマーが両性イオン性のポリマー又はペプチドである、請求項１～４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項8】
前記第２のポリマーがＥＫ含有ペプチドである、請求項１～４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項9】
前記ＥＫ含有ペプチドが（ＥＫ）ｎペプチドを含み、ｎが１～約５０である、請求項６又は８に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項10】
前記第１のポリマーがＥＫ含有ペプチドであり、前記第２のポリマーがＥＫ含有ペプチド又は両性イオン性ポリマーである、請求項１～４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項11】
第１のポリマーが２～約１０００個の反応性基を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項12】
前記第１のポリマーが、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、及びプロリン残基から選択される１以上のアミノ酸残基を含むペプチドである、請求項１～４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項13】
前記第１のポリマーが１以上のリジン残基を含むペプチドである、請求項１～４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項14】
前記第１のポリマーが、アミン、カルボン酸、チオール、マレイミド、炭素－炭素二重結合、炭素－炭素三重結合、及びアジド官能基から選択される１以上の官能基を含む非ペプチドポリマーである、請求項１～４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項15】
第２のポリマーが１～約１０００個の反応性基を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項16】
前記第２のポリマーが、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、及びプロリン残基から選択される１以上のアミノ酸残基を含むペプチドである、請求項１～１４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項17】
前記第２のポリマーが１以上のリジン又はグルタミン酸残基を含むペプチドである、請求項１～１４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項18】
前記第２のポリマーが水溶性の非ペプチドポリマーである、請求項１～１４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項19】
前記第２のポリマーが、ポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢ）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、ポリ（テトラメチルアミンオキシド）（ＴＭＡＯ）、ポリ（２－オキサゾリン）（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ポリＨＰＭＡ）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーからなる群から選択される非ペプチドポリマーである、請求項１～１４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項20】
前記第２のポリマーがポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）ポリマーである、請求項１～１４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項21】
前記第１の層及び前記第２の層の中間に１以上の追加のポリマー層を更に含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項22】
多層バイオコンジュゲートを作製する方法であって：（ａ）第１のポリマーを生体分子に共有結合させて、前記生体分子を取り囲む第１のポリマー層を有する生体分子を提供すること；
（ｂ）前記第１のポリマー層の前記第１のポリマーの少なくとも一部分に第２のポリマーを共有結合させて、前記生体分子を取り囲む第２のポリマー層を有する生体分子を提供すること
を含む、方法。
【請求項23】
生体分子内の反応性基の数を増大する方法であって、第１のポリマーを生体分子に共有結合させて前記生体分子を取り囲む第１のポリマー層を有する生体分子を提供することを含み、前記第１のポリマーが２～約１０００の反応性基を含む、方法。
【請求項24】
前記第１のポリマー層の前記第１のポリマーの少なくとも一部分に第２のポリマーを共有結合させて、前記生体分子を取り囲む第２のポリマー層を有する生体分子を提供することを更に含み、前記第２のポリマーが１～約１０００の反応性基を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子であって、前記第１及び第２の反応性基は異なる、生体分子；（ｂ）前記第１の反応性基に共有結合した１以上の第１のポリマー；及び
（ｃ）前記第２の反応性基に共有結合した１以上の第２のポリマー
を含むバイオコンジュゲート。
【請求項26】
前記生体分子がタンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、脂質、核酸、細胞、ウイルス、又は細菌である、請求項２５に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項27】
前記第１の反応性基がアミン、カルボン酸、チオール、マレイミド、炭素－炭素二重結合、炭素－炭素三重結合、及びアジド基から選択される、請求項２５に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項28】
前記第１の反応性基がアミン基である、請求項２５に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項29】
前記第２の反応性基がアミン、カルボン酸、チオール、マレイミド、炭素－炭素二重結合、炭素－炭素三重結合、及びアジド基から選択される、請求項２５に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項30】
前記第２の反応性基がカルボン酸（又はカルボン酸塩）基である、請求項２５に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項31】
前記第１の反応性基がアミン基から選択され、前記第２の反応性基がカルボン酸（又はカルボン酸塩）基から選択される、請求項２５に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項32】
前記第１のポリマーが、ポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢ）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、ポリ（テトラメチルアミンオキシド）（ＴＭＡＯ）、ポリ（２－オキサゾリン）（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ポリＨＰＭＡ）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーからなる群から選択されるポリマーである、請求項２５に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項33】
前記第２のポリマーが、ポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢ）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、ポリ（テトラメチルアミンオキシド）（ＴＭＡＯ）、ポリ（２－オキサゾリン）（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ポリＨＰＭＡ）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーからなる群から選択されるポリマーである、請求項２５に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項34】
前記第１のポリマーが、ポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢ）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、及びポリ（テトラメチルアミンオキシド）（ＴＭＡＯ）ポリマーからなる群から選択される両性イオン性ポリマーである、請求項２５に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項35】
前記第２のポリマーが、ポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢ）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、及びポリ（テトラメチルアミンオキシド）（ＴＭＡＯ）ポリマーからなる群から選択される両性イオン性ポリマーである、請求項２５に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項36】
前記第１のポリマー及び前記第２のポリマーが同じである、請求項２５～３５のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項37】
前記第１のポリマー及び前記第２のポリマーが異なる、請求項２５～３５のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項38】
前記第１のポリマーがポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）ポリマーであり、前記第２のポリマーがポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）ポリマーである、請求項２５に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項39】
バイオコンジュゲートを作製する方法であって：（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子に１以上の第１のポリマーを共有結合させることであって、前記第１及び第２の反応性基は異なり、前記第１のポリマーは前記第１の反応性基に共有結合している、共有結合させること；及び
（ｂ）１以上の第２のポリマーを前記第２の反応性基に共有結合させて、前記生体分子に共有結合した第１のポリマー及び第２のポリマーを有するバイオコンジュゲートを提供すること
を含む、方法。
【請求項40】
生体分子に共有結合したポリマーの数を増大する方法であって：（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子に第１のポリマーを共有結合させることであって、前記第１及び第２の反応性基は異なり、前記第１のポリマーは前記第１の反応性基に共有結合している、共有結合させること；及び
（ｂ）前記第２の反応性基に１以上の第２のポリマーを共有結合させて、前記生体分子に共有結合した第１のポリマー及び第２のポリマーを有するバイオコンジュゲートを提供することにより、前記生体分子に共有結合したポリマーの密度を増大すること
を含む、方法。
【請求項41】
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子であって、前記第１及び第２の反応性基は異なる、生体分子；（ｂ）前記第１の反応性基に共有結合した第１のポリマー；
（ｃ）前記第１のポリマーの少なくとも一部分に共有結合した第２のポリマー；及び
（ｄ）前記第２の反応性基に共有結合した１以上の第３のポリマー
を含むバイオコンジュゲート。
【請求項42】
前記生体分子がタンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、脂質、核酸、細胞、ウイルス、又は細菌である、請求項４１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項43】
前記第１のポリマーが両性イオン性のポリマー又はペプチドである、請求項４１又は４２に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項44】
前記第２のポリマーが両性イオン性のポリマー又はペプチドである、請求項４１～４３のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項45】
前記第３のポリマーが、ポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢ）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、ポリ（テトラメチルアミンオキシド）（ＴＭＡＯ）、ポリ（２－オキサゾリン）（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ポリＨＰＭＡ）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーからなる群から選択されるポリマーである、請求項４１～４４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項46】
バイオコンジュゲートを作製する方法であって：（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子に１以上の第１のポリマーを共有結合させることであって、前記第１及び第２の反応性基は異なり、前記第１のポリマーは前記第１の反応性基に共有結合している、共有結合させること；
（ｂ）前記第１のポリマーの少なくとも一部分に１以上の第２のポリマーを共有結合させること；及び
（ｃ）前記第２の反応性基に１以上の第３のポリマーを共有結合させて、前記生体分子に共有結合した第１のポリマー、第２のポリマー、及び第３のポリマーを有するバイオコンジュゲートを提供すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に明白に組み入れられる２０１８年１０月１０日に出願された米国特許出願第６２／７４３，６７０号の利益を主張するものである。
政府のライセンス権の陳述
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により授与された認可番号第Ｒ２１ＥＢ０２７８４３号の下でアメリカ国防脅威削減局により授与された認可番号第ＨＤＴＲＡ１－１３－１－００４４号による政府の支援の下でなされた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
本出願は、参照によりその全体が本明細書に明白に組み入れられる２０１８年１０月１０日に出願された米国特許出願第６２／７４３，６７０号の利益を主張するものである。
政府のライセンス権の陳述
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により授与された認可番号第Ｒ２１ＥＢ０２７８４３号の下でアメリカ国防脅威削減局により授与された認可番号第ＨＤＴＲＡ１－１３－１－００４４号による政府の支援の下でなされた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
天然に由来する生物剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｇｅｎｔ）は格別の医薬的効果及び特異性をもつ薬剤候補の広範な宝庫を含む。酵素補充療法のような多くのバイオ療法レジメンは病気を完全に治すのに多数回の投与を要する。しかし、高い免疫原性の生体分子薬剤を繰り返し注射すると、患者の免疫反応の危険性も増大し、患者から延命治療を奪い、更には致命的な副作用を引き起こす可能性もある。基本的に、外来タンパク質に対する望ましくない免疫反応は、主として抗原特異的抗体（Ａｂ）の生成によってそれらタンパク質の治療効果を弱める。一旦抗体が生体分子薬剤に結合すると、それらの薬理学的活性を直接中和する（中和）か、又は加速血液クリアランス（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）（ＡＢＣ）によってそれらの治療剤曝露を減らす（非中和）。通常抗薬物抗体（ＡＤＡ）といわれる、生体分子自体に対する抗体は、主としてタンパク質表面の低い保護ポリマー密度に起因して生じる。
天然に由来する生物剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｇｅｎｔ）は格別の医薬的効果及び特異性をもつ薬剤候補の広範な宝庫を含む。酵素補充療法のような多くのバイオ療法レジメンは病気を完全に治すのに多数回の投与を要する。しかし、高い免疫原性の生体分子薬剤を繰り返し注射すると、患者の免疫反応の危険性も増大し、患者から延命治療を奪い、更には致命的な副作用を引き起こす可能性もある。基本的に、外来タンパク質に対する望ましくない免疫反応は、主として抗原特異的抗体（Ａｂ）の生成によってそれらタンパク質の治療効果を弱める。一旦抗体が生体分子薬剤に結合すると、それらの薬理学的活性を直接中和する（中和）か、又は加速血液クリアランス（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）（ＡＢＣ）によってそれらの治療剤曝露を減らす（非中和）。通常抗薬物抗体（ＡＤＡ）といわれる、生体分子自体に対する抗体は、主としてタンパク質表面の低い保護ポリマー密度に起因して生じる。
【0003】
幾つかの生体分子は本質的に限定された結合部位を有しており、そのため高ポリマー密度バイオコンジュゲートを獲得するのが極めて難しくなるか又は伝統的な結合技術を使用するのが不可能になる。例えば、細菌に由来する酵素である有機リン加水分解酵素（ＯＰＨ）は有機リン系殺虫剤及び神経剤に対して強力な触媒効力を示す。ＯＰＨモノマー１つにつき、ポリマーによる修飾のために到達できる水がアクセス可能なリジン基は４つだけである。ＰＥＧ化のようなリジンを標的としたポリマー結合技術は利用できる結合部位の不足のためにＯＰＨを充分な保護ですっかり覆うことができない。その他の場合、ポリマー結合工程中、最初に結合したポリマーが立体障害のためにその後のポリマーの結合をブロックする。
【0004】
本発明は、高ポリマー密度バイオコンジュゲート組成物を提供するために、生体分子に共有結合したポリマーの数を増大するか又は生体分子へのポリマー結合の効率を改善するのに有効な進歩した結合技術を提供しようとする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、高ポリマー密度バイオコンジュゲート組成物及び該組成物を作製するための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
１つの態様において、本発明は、多層ポリマーバイオコンジュゲートを提供する。１つの実施形態において、バイオコンジュゲートは生体分子に共有結合した第１のポリマー及び第１のポリマーの少なくとも一部分に共有結合した第２のポリマーを有する生体分子を含む。
【0007】
本発明は多層バイオコンジュゲートを作製する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は：
（ａ）第１のポリマーを生体分子に共有結合させて、生体分子を取り囲む第１のポリマー層（即ち、内側ポリマー層）を有する生体分子を提供すること；
（ｂ）第２のポリマーを第１のポリマー層の第１のポリマーの少なくとも一部分に共有結合させて、生体分子を取り囲む第２のポリマー層（即ち、外側ポリマー層）を有する生体分子（即ち、多層バイオコンジュゲート）を提供すること
を含む。
（ａ）第１のポリマーを生体分子に共有結合させて、生体分子を取り囲む第１のポリマー層（即ち、内側ポリマー層）を有する生体分子を提供すること；
（ｂ）第２のポリマーを第１のポリマー層の第１のポリマーの少なくとも一部分に共有結合させて、生体分子を取り囲む第２のポリマー層（即ち、外側ポリマー層）を有する生体分子（即ち、多層バイオコンジュゲート）を提供すること
を含む。
【0008】
本発明は生体分子内の反応性基（例えば、アミン）の数を増大する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は第１のポリマーを生体分子に共有結合させて、生体分子を取り囲む第１のポリマー層（即ち、内側ポリマー層）を有する生体分子を提供することを含み、第１のポリマーは２～約１０００の反応性基を含む。
【0009】
別の態様において、本発明はポリマーでバックフィルされた（ｂａｃｋｆｉｌｌｅｄ，埋め戻された）バイオコンジュゲートを提供する。１つの実施形態において、ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートは：
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子であって、第１及び第２の反応性基は異なる、生体分子；
（ｂ）第１の反応性基に共有結合した１以上の第１のポリマー；及び
（ｃ）第２の反応性基に共有結合した１以上の第２のポリマー（即ち、バックフィルされたポリマー）
を含む。
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子であって、第１及び第２の反応性基は異なる、生体分子；
（ｂ）第１の反応性基に共有結合した１以上の第１のポリマー；及び
（ｃ）第２の反応性基に共有結合した１以上の第２のポリマー（即ち、バックフィルされたポリマー）
を含む。
【0010】
本発明はポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートを作製する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は：
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子に１以上の第１のポリマーを共有結合させることであって、第１及び第２の反応性基は異なり、第１のポリマーは第１の反応性基に共有結合している、共有結合させること；
（ｂ）１以上の第２のポリマーを第２の反応性基に共有結合させて、生体分子に共有結合した第１のポリマー及び第２のポリマーを有するバイオコンジュゲートを提供すること
を含む。
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子に１以上の第１のポリマーを共有結合させることであって、第１及び第２の反応性基は異なり、第１のポリマーは第１の反応性基に共有結合している、共有結合させること；
（ｂ）１以上の第２のポリマーを第２の反応性基に共有結合させて、生体分子に共有結合した第１のポリマー及び第２のポリマーを有するバイオコンジュゲートを提供すること
を含む。
【0011】
本発明は生体分子に共有結合したポリマーの数を増大する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は：
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子に第１のポリマーを共有結合させることであって、第１及び第２の反応性基は異なり、第１のポリマーは第１の反応性基に共有結合している、共有結合させること；
（ｂ）１以上の第２のポリマーを第２の反応性基に共有結合させて、生体分子に共有結合した第１のポリマー及び第２のポリマーを有するバイオコンジュゲートを提供することにより、生体分子に共有結合したポリマーの密度を増大すること
を含む。
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子に第１のポリマーを共有結合させることであって、第１及び第２の反応性基は異なり、第１のポリマーは第１の反応性基に共有結合している、共有結合させること；
（ｂ）１以上の第２のポリマーを第２の反応性基に共有結合させて、生体分子に共有結合した第１のポリマー及び第２のポリマーを有するバイオコンジュゲートを提供することにより、生体分子に共有結合したポリマーの密度を増大すること
を含む。
【0012】
更なる態様において、本発明は多層／ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートを提供する。１つの実施形態において、多層／ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートは：
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子であって、第１及び第２の反応性基は異なる、生体分子；
（ｂ）第１の反応性基に共有結合した第１のポリマー；
（ｃ）第１のポリマーの少なくとも一部分に共有結合した第２のポリマー；及び
（ｄ）第２の反応性基に共有結合した１以上の第３のポリマー（即ち、バックフィルされたポリマー）
を含む。
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子であって、第１及び第２の反応性基は異なる、生体分子；
（ｂ）第１の反応性基に共有結合した第１のポリマー；
（ｃ）第１のポリマーの少なくとも一部分に共有結合した第２のポリマー；及び
（ｄ）第２の反応性基に共有結合した１以上の第３のポリマー（即ち、バックフィルされたポリマー）
を含む。
【0013】
本発明は多層／ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートを作製する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は：
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子に１以上の第１のポリマーを共有結合させることであって、第１及び第２の反応性基は異なり、第１のポリマーは第１の反応性基に共有結合している、共有結合させること；
（ｂ）１以上の第２のポリマーを第１のポリマーの少なくとも一部分に共有結合させること；
（ｃ）１以上の第３のポリマーを第２の反応性基に共有結合させて、生体分子に共有結合した第１のポリマー、第２のポリマー、及び第３のポリマーを有するバイオコンジュゲートを提供すること
を含む。
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子に１以上の第１のポリマーを共有結合させることであって、第１及び第２の反応性基は異なり、第１のポリマーは第１の反応性基に共有結合している、共有結合させること；
（ｂ）１以上の第２のポリマーを第１のポリマーの少なくとも一部分に共有結合させること；
（ｃ）１以上の第３のポリマーを第２の反応性基に共有結合させて、生体分子に共有結合した第１のポリマー、第２のポリマー、及び第３のポリマーを有するバイオコンジュゲートを提供すること
を含む。
【0014】
本発明の前述の態様及び付随する利点の多くは、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することでより良く理解されることになるので、より容易に認識されよう。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図2A】図２Ａは、本発明の代表的なペプチドコンジュゲート（ＥＫ－アスパラギナーゼコンジュゲート）：ＡＳＰ－ＥＫ－Ｓ（単層コンジュゲート）、ＡＳＰ－ＥＫ－Ｄ（二重層コンジュゲート）、及びＡＳＰ－ＥＫ－Ｔ（三重層コンジュゲート）の調製の略図である。
【図2B】図２Ｂは、本発明の代表的なペプチドコンジュゲート：ＡＳＰ－ＥＫ－Ｓ（単層コンジュゲート）、ＡＳＰ－ＥＫ－Ｄ（二重層コンジュゲート）、及びＡＳＰ－ＥＫ－Ｔ（三重層コンジュゲート）のサイズ分布を天然のアスパラギナーゼ（ＡＳＰ）と比較して示すゲルパーミエーションクロマトグラム（ＧＰＣ）である。
【図3】図３は、天然のＡＳＰ、並びに本発明の代表的なペプチドコンジュゲートＡＳＰ－ＥＫ－Ｓ、ＡＳＰ－ＥＫ－Ｄ、及びＡＳＰ－ＥＫ－Ｔのインビトロ抗アスパラギナーゼ抗体結合親和性を比較して示す。初期濃度は１μｍｏｌ／ｍＬであった。
【図4A】図４Ａ－４Ｄは、天然のＡＳＰ（４Ａ）、並びに本発明の代表的なペプチドコンジュゲートであるＡＳＰ－ＥＫ－Ｓ（４Ｂ）、ＡＳＰ－ＥＫ－Ｄ（４Ｃ）、及びＡＳＰ－ＥＫ－Ｔ（４Ｄ）の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）結果を比較して示す。
【図4B】図４Ａ－４Ｄは、天然のＡＳＰ（４Ａ）、並びに本発明の代表的なペプチドコンジュゲートであるＡＳＰ－ＥＫ－Ｓ（４Ｂ）、ＡＳＰ－ＥＫ－Ｄ（４Ｃ）、及びＡＳＰ－ＥＫ－Ｔ（４Ｄ）の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）結果を比較して示す。
【図4C】図４Ａ－４Ｄは、天然のＡＳＰ（４Ａ）、並びに本発明の代表的なペプチドコンジュゲートであるＡＳＰ－ＥＫ－Ｓ（４Ｂ）、ＡＳＰ－ＥＫ－Ｄ（４Ｃ）、及びＡＳＰ－ＥＫ－Ｔ（４Ｄ）の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）結果を比較して示す。
【図4D】図４Ａ－４Ｄは、天然のＡＳＰ（４Ａ）、並びに本発明の代表的なペプチドコンジュゲートであるＡＳＰ－ＥＫ－Ｓ（４Ｂ）、ＡＳＰ－ＥＫ－Ｄ（４Ｃ）、及びＡＳＰ－ＥＫ－Ｔ（４Ｄ）の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）結果を比較して示す。
【図5A】図５Ａ－５Ｃは、本発明の代表的なペプチドコンジュゲートであるＡＳＰ－ＥＫ－Ｔの薬物動態プロフィールを用量：第１の用量（５Ａ）、第２の用量（５Ｂ）、及び第３の用量（５Ｃ）の関数として天然のＡＳＰと比較して示す。
【図5B】図５Ａ－５Ｃは、本発明の代表的なペプチドコンジュゲートであるＡＳＰ－ＥＫ－Ｔの薬物動態プロフィールを用量：第１の用量（５Ａ）、第２の用量（５Ｂ）、及び第３の用量（５Ｃ）の関数として天然のＡＳＰと比較して示す。
【図5C】図５Ａ－５Ｃは、本発明の代表的なペプチドコンジュゲートであるＡＳＰ－ＥＫ－Ｔの薬物動態プロフィールを用量：第１の用量（５Ａ）、第２の用量（５Ｂ）、及び第３の用量（５Ｃ）の関数として天然のＡＳＰと比較して示す。
【図7】図７は、天然のアスパラギナーゼ（ＡＳＰ）のサイズ分布を本発明の代表的なペプチドコンジュゲート：ＡＳＰ－ＥＫ－ＰＣＢ（単一のＥＫ層）と比較して示すゲルパーミエーションクロマトグラム（ＧＰＣ）である。
【図9】図９は、天然の有機リン加水分解酵素（ＯＰＨ）のサイズ分布を本発明の代表的なペプチドコンジュゲート：バックフィル付のＰＣＢ－ＯＰＨ及びバックフィルなしのＰＣＢ－ＯＰＨと比較して示すゲルパーミエーションクロマトグラム（ＧＰＣ）である。
【図10A】図１０Ａ－１０Ｃは、遊離のＯＰＨ（１０Ａ）の薬物動態プロフィールを本発明の代表的なペプチドコンジュゲート：バックフィルなしのＰＣＢ－ＯＰＨ（１０Ｂ）及びバックフィル付のＰＣＢ－ＯＰＨ（１０Ｃ）と比較して示す。
【図10B】図１０Ａ－１０Ｃは、遊離のＯＰＨ（１０Ａ）の薬物動態プロフィールを本発明の代表的なペプチドコンジュゲート：バックフィルなしのＰＣＢ－ＯＰＨ（１０Ｂ）及びバックフィル付のＰＣＢ－ＯＰＨ（１０Ｃ）と比較して示す。
【図10C】図１０Ａ－１０Ｃは、遊離のＯＰＨ（１０Ａ）の薬物動態プロフィールを本発明の代表的なペプチドコンジュゲート：バックフィルなしのＰＣＢ－ＯＰＨ（１０Ｂ）及びバックフィル付のＰＣＢ－ＯＰＨ（１０Ｃ）と比較して示す。
【図11A】図１１Ａ及び１１Ｂは、ラットモデルにおける、天然のＯＰＨ並びに本発明の代表的なペプチドコンジュゲート：バックフィル付のＰＣＢ－ＯＰＨ及びバックフィルなしのＰＣＢ－ＯＰＨに対する抗ＯＰＨ ＩｇＧ（１１Ａ）及び抗ＯＰＨ ＩｇＭ（１１Ｂ）力価を比較して示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明の詳細な説明
本発明は高ポリマー密度バイオコンジュゲート組成物及び当該組成物を作製する方法を提供する。高ポリマー密度バイオコンジュゲート組成物は、バイオコンジュゲートに超低免疫原性を付与しつつ、同時に天然の生体分子の機能性を保存する１以上のポリマーで有利に取り囲まれた（例えば、覆われた）生体分子として特徴付けられる。
本発明は高ポリマー密度バイオコンジュゲート組成物及び当該組成物を作製する方法を提供する。高ポリマー密度バイオコンジュゲート組成物は、バイオコンジュゲートに超低免疫原性を付与しつつ、同時に天然の生体分子の機能性を保存する１以上のポリマーで有利に取り囲まれた（例えば、覆われた）生体分子として特徴付けられる。
【0017】
１つの態様において、多層ポリマーバイオコンジュゲートが提供される。別の態様においてポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートが提供される。更なる態様において、多層のポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートが提供される。
【0018】
これらの高ポリマー密度バイオコンジュゲートは生物学的製剤を開発し、病気、疾患、又は状態を治療又は予防し、その他対象の健康又は幸福を改善するのに有用である。
【0019】
多層ポリマーバイオコンジュゲート
１つの態様において、本発明は多層ポリマーバイオコンジュゲートを提供する。１つの実施形態において、バイオコンジュゲートは、生体分子に共有結合した第１のポリマー及び第１のポリマーの少なくとも一部分に共有結合した第２のポリマーを有する生体分子を含む。
１つの態様において、本発明は多層ポリマーバイオコンジュゲートを提供する。１つの実施形態において、バイオコンジュゲートは、生体分子に共有結合した第１のポリマー及び第１のポリマーの少なくとも一部分に共有結合した第２のポリマーを有する生体分子を含む。
【0020】
第１のポリマーは生体分子を取り囲む（又は実質的に取り囲む）第１のポリマー層（即ち、内側ポリマー層）を形成し、第２のポリマーは第１のポリマー層及び生体分子を取り囲む（又は実質的に取り囲む）第２のポリマー層（即ち、外側ポリマー層）を形成する。
【0021】
一定の実施形態において、第１のポリマーは生体分子を取り囲む第１の層を形成、第２のポリマーは生体分子を取り囲む第２の層を形成する。
【0022】
有利に修飾されて本発明の多層ポリマーバイオコンジュゲートを提供する生体分子には、タンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、脂質、核酸、細胞、ウイルス、又は細菌がある。代表的な生体分子は以下に詳細に記載する。
【0023】
一定の実施形態において、第１のポリマーは両性イオン性のポリマー又はペプチドである。一定の実施形態において、第２のポリマーは両性イオン性のポリマー又はペプチドである。
【0024】
これらの実施形態の幾つかにおいて、ペプチドはＥＫ含有ペプチドである。本明細書で使用されるとき、用語「ＥＫ含有ペプチド」とは、実質的に同じ数のＥ（グルタミン酸）及びＫ（リジン）残基（例えば、約２～約１００のＥＫ残基）を有するペプチドをいう。一定の実施形態において、ＥＫ含有ペプチドは（ＥＫ）ｎペプチドであり、ここでｎは１～約５０である。これらの実施形態の幾つかにおいて、ｎは２～約５０である。他の実施形態において、ｎは３～約５０である。更なる実施形態において、ｎは４～約５０である。他の実施形態において、ｎは５～約５０である。更なる実施形態において、ｎは１～１０である。
【0025】
ＥＫ含有ペプチドは更に１以上の追加のペプチド残基、例えばプロリン、グリシン、セリン、スレオニン、グルタミン、アスパラギン残基（例えば、ＥＫＸ含有ペプチド、ここでＸはＰ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、又はＮである）を含んでいてもよいことが分かる。代表的なＥＫＸ含有ペプチドにはＥＫＰ及びＥＫＧがある。ある種のＥＫＸ含有ペプチドにおいて、Ｅ：Ｋの比は１：１（又は実質的に１：１）であり、Ｅ：Ｋ：Ｘの比は１：１：ｎであり、ここでｎは１又は０．１～１の端数である。
【0026】
これらの実施形態のその他において、ペプチドは組織化されてない組換えポリペプチド（ＵＲＰ）である。これらの実施形態の幾つかにおいて、ＵＲＰは少なくとも４０の連続したアミノ酸を含み、（ａ）ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の合計はＵＲＰの全アミノ酸の少なくとも８０％を構成し、残りは、存在するとき、アルギニン又はリジンからなり、残りはメチオニン、システイン、アスパラギン、及びグルタミンを含有せず；（ｂ）前記ＵＲＰは少なくとも３つの異なる種類のアミノ酸を含み；そして（ｃ）前記ＵＲＰ内の少なくとも４０の連続したアミノ酸の少なくとも５０％はＣｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより決定される二次構造を欠いている。組織化されてない組換えポリペプチドは、参照によりその全体が本明細書に明白に組み入れられる米国特許第７，８５５，２７９号に記載されている。
【0027】
これらのその他の実施形態の更に別の実施形態において、ペプチドはランダムコイルポリペプチドである。これらの実施形態の幾つかにおいて、ランダムコイルポリペプチドは５０～３０００のアミノ酸を含み、専らプロリン及びアラニンからなり、ここでポリペプチドはランダムコイルを形成する。一定の実施形態において、ランダムコイルポリペプチドは１０％～７５％のプロリン残基からなる。他の実施形態において、ランダムコイルポリペプチドは複数のアミノ酸反復配列を含み、６個以下の連続したアミノ酸残基が同一のアミノ酸である。ランダムコイルポリペプチドは、参照によりその全体が本明細書に明白に組み入れられる米国特許第９，２２１，８８２号に記載されている。
【0028】
バイオコンジュゲートの一定の実施形態において、第１のポリマーはＥＫ含有ペプチドであり、第２のポリマーはＥＫ含有ペプチド又は両性イオン性のポリマーである。
【0029】
第１のポリマーは、例えば第２のポリマーに更に共有結合させるのに利用できる反応性基を含む。一定の実施形態において、第１のポリマー（即ち、内側ポリマー層）は２～約１０００の反応性基を含む。本明細書で使用されるとき、用語「反応性基」とは、化学的結合方法により共有結合させることができる官能基をいう。適切な反応性基には、アミノ（－ＮＨ２）基、例えばリジン残基のε－アミノ基、及びカルボン酸（－ＣＯ２Ｈ）又はカルボキシレート（－ＣＯ２－）基が含まれる。例えば、（ＥＫ）ｎであり、ｎが１～５０であるＥＫ含有ペプチドの場合、ｎ＝１では合計３つの反応性基に対して２つのアミン基及び１つのカルボン酸基があり、ｎ＝５０では合計１０１の反応性基に対して５１のアミン基及び５０のカルボン酸基がある。
【0030】
一定の実施形態において、第１のポリマーはリジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、及びプロリン残基から選択される１以上のアミノ酸残基を含むペプチドである。これらの実施形態の幾つかにおいて、第１のポリマーは１以上のリジン残基を含むペプチドである。
【0031】
他の実施形態において、第１のポリマーはアミン、カルボン酸、チオール、マレイミド、炭素－炭素二重結合、炭素－炭素三重結合、及びアジド官能基から選択される１以上の官能基を含む非ペプチドポリマーである。
【0032】
第２のポリマーは、例えば第１のポリマーと更に共有結合させるのに利用できる反応性基を含む。一定の実施形態において、第２のポリマー（即ち、外側ポリマー層）は１～約１０００の反応性基を含む。代表的な反応性基には、アミン、カルボン酸（カルボキシレート）、チオール、マレイミド、炭素－炭素二重結合、炭素－炭素三重結合、及びアジド官能基のような官能基がある。
【0033】
一定の実施形態において、第２のポリマーは、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、及びプロリン残基から選択される１以上のアミノ酸残基を含むペプチドである。これらの実施形態の幾つかにおいて、第２のポリマーは１以上のリジン又はグルタミン酸残基を含むペプチドである。これらの実施形態の幾つかにおいて、第２のポリマーは本明細書に記載されているＥＫ含有ポリマーである。
【0034】
他の実施形態において、第２のポリマーは水溶性の非ペプチドポリマーである。親水性であり水溶性を有する代表的な第２のポリマーには、非ペプチドポリマー、例えばポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢ）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、ポリ（テトラメチルアミンオキシド）（ＴＭＡＯ）、ポリ（２－オキサゾリン）（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ポリＨＰＭＡ）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーがある。
【0035】
一定の実施形態において、第２のポリマーは両性イオン性ポリマー、例えばポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢ）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、及びポリ（テトラメチルアミンオキシド）（ＴＭＡＯ）ポリマーである。１つの実施形態において、第２のポリマーはポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）ポリマーである。
【0036】
他の実施形態において、第２のポリマーは本明細書に記載されている組織化されてない組換えポリペプチド（ＵＲＰ）又はランダムコイルポリペプチドである。
【0037】
内側ポリマー層（第１のポリマー）及び外側ポリマー層（第２のポリマー）に加えて、多層バイオコンジュゲートは第１の層及び第２の層の中間に１以上の追加のポリマー層（例えば、１～１０層）を含んでいてもよい。
【0038】
一定の実施形態において、追加のポリマー層の各々の組成は本明細書に記載されている第１のポリマー層の組成と同じである。
【0039】
一定の実施形態において、バイオコンジュゲートは３つの層を含み、最初の２つの層（即ち、内側ポリマー層）は同じ第１のポリマー（例えば、ＥＫ含有ペプチド）から誘導され、第３の層（即ち、外側ポリマー層）は同じポリマー（例えばＥＫ含有ペプチド）又は異なるポリマー（例えば、両性イオン性ポリマー、例えばＰＣＢ、又は組織化されてない組換えポリペプチド又はランダムコイルポリペプチド）から誘導される。
【0040】
多層バイオコンジュゲートを作製する方法
別の態様において、本発明は多層バイオコンジュゲートを作製する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は：
（ａ）第１のポリマーを生体分子に共有結合させて、生体分子を取り囲む第１のポリマー層（即ち、内側ポリマー層）を有する生体分子を提供すること；
（ｂ）第２のポリマーを第１のポリマー層の第１のポリマーの少なくとも一部分に共有結合させて、生体分子を取り囲む第２のポリマー層（即ち、外側ポリマー層）を有する生体分子（即ち、多層バイオコンジュゲート）を提供すること
を含む。
別の態様において、本発明は多層バイオコンジュゲートを作製する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は：
（ａ）第１のポリマーを生体分子に共有結合させて、生体分子を取り囲む第１のポリマー層（即ち、内側ポリマー層）を有する生体分子を提供すること；
（ｂ）第２のポリマーを第１のポリマー層の第１のポリマーの少なくとも一部分に共有結合させて、生体分子を取り囲む第２のポリマー層（即ち、外側ポリマー層）を有する生体分子（即ち、多層バイオコンジュゲート）を提供すること
を含む。
【0041】
生体分子の反応性基の数を増大する方法
更なる態様において、本発明は生体分子内の反応性基（例えば、アミン）の数を増大する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は第１のポリマーを生体分子に共有結合させて、生体分子を取り囲む第１のポリマー層（即ち、内側ポリマー層）を有する生体分子を提供することを含み、第１のポリマーは２～約１０００の反応性基を含む。
更なる態様において、本発明は生体分子内の反応性基（例えば、アミン）の数を増大する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は第１のポリマーを生体分子に共有結合させて、生体分子を取り囲む第１のポリマー層（即ち、内側ポリマー層）を有する生体分子を提供することを含み、第１のポリマーは２～約１０００の反応性基を含む。
【0042】
一定の実施形態において、（ＥＫ）ｎペプチド（ｎ＝１～５０）を第１のポリマーとして用いて、方法は、反応性基の数を２～５１のアミン基又は３～１０１のアミン及びカルボン酸（カルボキシレート）基だけ増大する。
【0043】
一定の実施形態において、方法は、第２のポリマーを第１のポリマー層の第１のポリマーの少なくとも一部分に共有結合させて生体分子を取り囲む第２のポリマー層（即ち、外側ポリマー層）を有する生体分子（即ち、多層バイオコンジュゲート組成物）を提供することを更に含み、ここで第２のポリマーは１～約１０００の反応性基を含む。これらの実施形態の幾つかにおいて、第２のポリマーは１～約５０の反応性基を含む。
【0044】
代表的な多層ポリマーバイオコンジュゲートの調製及び特性決定は実施例１、２、及び３に記載する。
【0045】
以下、本発明の多層ポリマーバイオコンジュゲートについて更に記載する。
本明細書で使用されるとき、用語「多層ポリマーバイオコンジュゲート」とは、生体分子を取り囲むか又は実質的に取り囲む多層構造のポリマーを有するバイオコンジュゲートをいう。一定の実施形態において、多層ポリマーの層の数は２～１０、２～８、２～６、２～４及び２～３の範囲であり、好ましい数は２～３である。幾つかの実施形態において、生体分子は多層構造ポリマーにより共有結合される。幾つかの実施形態において、生体分子は多数の多層構造ポリマーにより共有結合される。幾つかの実施形態において、ポリマーは生体分子からグラフト化されて多層構造を形成する。幾つかの実施形態において、多層構造のポリマーは予め構築された後、生体分子にグラフト化される。
本明細書で使用されるとき、用語「多層ポリマーバイオコンジュゲート」とは、生体分子を取り囲むか又は実質的に取り囲む多層構造のポリマーを有するバイオコンジュゲートをいう。一定の実施形態において、多層ポリマーの層の数は２～１０、２～８、２～６、２～４及び２～３の範囲であり、好ましい数は２～３である。幾つかの実施形態において、生体分子は多層構造ポリマーにより共有結合される。幾つかの実施形態において、生体分子は多数の多層構造ポリマーにより共有結合される。幾つかの実施形態において、ポリマーは生体分子からグラフト化されて多層構造を形成する。幾つかの実施形態において、多層構造のポリマーは予め構築された後、生体分子にグラフト化される。
【0046】
バイオコンジュゲート内側層
一定の実施形態において、多層ポリマーの「内側層」という用語は外側のポリマーと生体分子との間の層である。一定の実施形態において、内側層の数は１～１０、１～８、１～６、１～４、及び１～２の範囲である。一定の実施形態において、内側のポリマーは２～約１０００の反応性基を有する。少なくとも１の反応性基が生体分子からの反応性基の１つに連結しており、他は次の内側層ポリマー又は外側層ポリマーのための結合部位である。内側層ポリマーの結合は次の層ポリマー連結のためのより多くの結合部位を提供する。
一定の実施形態において、多層ポリマーの「内側層」という用語は外側のポリマーと生体分子との間の層である。一定の実施形態において、内側層の数は１～１０、１～８、１～６、１～４、及び１～２の範囲である。一定の実施形態において、内側のポリマーは２～約１０００の反応性基を有する。少なくとも１の反応性基が生体分子からの反応性基の１つに連結しており、他は次の内側層ポリマー又は外側層ポリマーのための結合部位である。内側層ポリマーの結合は次の層ポリマー連結のためのより多くの結合部位を提供する。
【0047】
幾つかの実施形態において、第１のポリマー（即ち、内側のポリマー）はリジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン及びトリプトファンから選択される反応性のアミノ酸残基を含む親水性のペプチドである。幾つかの実施形態において、親水性のペプチドはリジン、グルタミン酸、アスパラギン酸及びシステインを含有する。幾つかの実施形態において、特に好ましい親水性のペプチドはリジン、グルタミン酸及びシステインを含有する。
【0048】
幾つかの実施形態において、内側のポリマーは、アミン、カルボン酸、チオール、炭素－炭素二重結合、炭素－炭素三重結合及びアジド基から選択される反応性基を含む親水性の非ペプチドポリマーである。幾つかの実施形態において、特に好ましい親水性の非ペプチドポリマーはアミン、カルボン酸及びチオール基を含有する。
【0049】
親水性の内側層ポリマーの例には、ポリマー骨格又はポリマー側鎖のいずれかにアミン基を有するアミン含有ポリマー、例えばポリ－Ｌ－リジン及び他の天然若しくは合成のアミノ酸又はアミノ酸の混合物のポリアミノ酸、例えばポリ（リジン－コ－グルタミン酸）、ポリ（リジン－コ－アスパラギン酸）、ポリ（Ｄ－リジン）、ポリ（オルニチン）、ポリ（アルギニン）、及びポリ（ヒスチジン）、並びに非ペプチドポリアミン、例えばポリ（アミノスチレン）、ポリ（アミノアクリレート）、ポリ（Ｎ－メチルアミノアクリレート）、ポリ（Ｎ－エチルアミノアクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノアクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノアクリレート）、ポリ（アミノメタクリレート）、ポリ（Ｎ－メチルアミノメタクリレート）、ポリ（Ｎ－エチルアミノメタクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメタクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノメタクリレート）、ポリ（エチレンイミン）、第四級アミンのポリマー、例えばポリ（Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアミノアクリレートクロリド）、ポリ（メタクリルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロリド）及びそれらの誘導体がある。内側のポリマーの例には、合成のポリマー、例えばポリ（オキサゾリン）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、及びポリ（アミノ酸）、例えばポリ（セリン）、ポリ（スレオニン）、及びポリ（グルタミン）からの中性のポリマー誘導体もある。
【0050】
バイオコンジュゲート外側層
第２のポリマー（即ち、外側のポリマー）層ポリマーは生体分子を保護し、バイオコンジュゲート全体の流体力学的サイズを増大する。一定の実施形態において、外側層ポリマーは１～１０００の反応性基を有する。外側層ポリマーは内側層ポリマーと連結するために少なくとも１つの反応性基を有する。
第２のポリマー（即ち、外側のポリマー）層ポリマーは生体分子を保護し、バイオコンジュゲート全体の流体力学的サイズを増大する。一定の実施形態において、外側層ポリマーは１～１０００の反応性基を有する。外側層ポリマーは内側層ポリマーと連結するために少なくとも１つの反応性基を有する。
【0051】
幾つかの実施形態において、外側層ポリマーは内側のポリマーと連結するために１つだけ反応性基を有する。連結後、外側層ポリマーは他の小さい分子又はポリマーで更に修飾するか又は連結することができない。
【0052】
幾つかの実施形態において、外側のポリマーはリジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン及びトリプトファンから選択される反応性のアミノ酸残基を含む親水性のペプチドである。幾つかの実施形態において、親水性のペプチドはリジン、グルタミン酸、アスパラギン酸及びシステインを含有する。幾つかの実施形態において、特に好ましい親水性のペプチドはリジン、グルタミン酸及びシステインを含有する。
【0053】
幾つかの実施形態において、外側のポリマーはアミン、カルボン酸、チオール、二重結合、三重結合及びアジド基から選択される反応性基を含む親水性の非ペプチドポリマーである。幾つかの実施形態において、特に好ましい反応性基はアミン又はチオール基である。本明細書で定義されているように、「親水性のポリマー」は水又は水と幾つかの極性有機溶媒、例えば低分子量アルコール、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、アセトニトリル及びテトラヒドロフランとの混合物に可溶性のものである。極性有機溶媒は好ましくは約０～５０体積％の濃度で存在する。
【0054】
本明細書で使用されるとき、「水溶性」は、ポリマー全体が、水性又は水性／有機溶液、例えば緩衝食塩水又は小量の有機溶媒を共溶媒として添加した緩衝食塩水に完全に可溶性でなければならないということを意味する。
【0055】
水溶性のポリマーの例には、ポリマー骨格又はポリマー側鎖のいずれかにアミン基を有するポリアミン、例えばポリ－Ｌ－リジン及び天然若しくは合成のアミノ酸又はアミノ酸の混合物の他のポリアミノ酸、例えばポリ（リジン－コ－グルタミン酸）、ポリ（リジン－コ－アスパラギン酸）、ポリ（Ｄ－リジン）、ポリ（オルニチン）、ポリ（アルギニン）、及びポリ（ヒスチジン）、並びに非ペプチドポリアミン、例えばポリ（アミノスチレン）、ポリ（アミノアクリレート）、ポリ（Ｎ－メチルアミノアクリレート）、ポリ（Ｎ－エチルアミノアクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノアクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノアクリレート）、ポリ（アミノメタクリレート）、ポリ（Ｎ－メチルアミノ－メタクリレート）、ポリ（Ｎ－エチルアミノメタクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメタクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノメタクリレート）、ポリ（エチレンイミン）、第四級アミンのポリマー、例えばポリ（Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアミノアクリレートクロリド）、ポリ（メタクリルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、及び中性のポリ（アミノ酸）、例えばポリ（セリン）、ポリ（スレオニン）、及びポリ（グルタミン）がある。
【0056】
適切な外側層ポリマーには中性で負に帯電したポリマーがある。好ましい外側層ポリマーには中性のポリマーがある。
【0057】
他の適切なポリマーには天然に存在するタンパク質、例えばゼラチン、ウシ血清アルブミン、及びオボアルブミン、並びに複合糖類、例えばヒアルロン酸、デンプン及びアガロースがある。ポリマーはあらゆる生体適合性の水溶性多価電解質ポリマーであることができる。
【0058】
親水性のポリマーには、ポリ（オキシアルキレンオキシド）、例えばポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、天然又は合成の多糖及び多糖誘導体、例えばアルギン酸塩、キトサン、デキストラン、水溶性セルロース誘導体、例えばヒドロキシエチルセルロース及びカルボキシメチルセルロース、ポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、及びポリアクリルアミド、例えばイソプロピルアクリルアミドもある。本明細書で使用される「誘導体」には置換、化学基、例えば、アルキル、アルキレンの付加、ヒドロキシル化、酸化及びその他の当業者により日常的に行われる改変を有するポリマーが含まれる。
【0059】
幾つかの実施形態において、好ましい外側層親水性ポリマーはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢＭＡ）、ポリ（２－オキサゾリン）（ＰＯＺ）、及びポリ（Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ポリＨＰＭＡ）である。
【0060】
他の外側のポリマーには本明細書に記載されている組織化されてない組換えポリペプチド及びランダムコイルポリペプチドがある。
【0061】
バイオコンジュゲート生体分子
一定の実施形態において、多層ポリマーバイオコンジュゲートの生体分子はタンパク質、ペプチド、核酸、ウイルス、糖タンパク質、プロテオグリカン、又は脂質である。
一定の実施形態において、多層ポリマーバイオコンジュゲートの生体分子はタンパク質、ペプチド、核酸、ウイルス、糖タンパク質、プロテオグリカン、又は脂質である。
【0062】
タンパク質又はペプチド。幾つかの実施形態において、生体分子はタンパク質又はペプチド、例えば酵素、サイトカイン、ホルモン、成長因子、抗原、抗体、抗体の特徴的部分、凝固因子、調節タンパク質、シグナル伝達タンパク質、転写タンパク質、及び受容体である。これらとしては、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、コロニー刺激因子－１（ＣＳＦ－１）、マクロファージコロニー刺激因子、グルコセロブロシダーゼ、サイロトロピン、幹細胞因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、ＧＭ－ＣＳＦ、（ＥＯＳ）－ＣＳＦ、ＣＳＦ－１、ＥＰＯ、有機リン加水分解酵素（ＯＰＨ）、インターフェロン－アルファ（ＩＦＮ－α）、コンセンサスインターフェロン－ベータ（ＩＦＮ－β）、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１３ａ１、Ｃａｓ１３ａ２、Ｃａｓ１３ｂ、アンジオポイエチン－１（Ａｎｇ－１）、Ａｎｇ－２、Ａｎｇ－４、Ａｎｇ－Ｙ、アンジオポイエチン様ポリペプチド１（ＡＮＧＰＴＬ１）、アンジオポイエチン様ポリペプチド２（ＡＮＧＰＴＬ２）、アンジオポイエチン様ポリペプチド３（ＡＮＧＰＴＬ３）、アンジオポイエチン様ポリペプチド４（ＡＮＧＰＴＬ４）、アンジオポイエチン様ポリペプチド５（ＡＮＧＰＴＬ５）、アンジオポイエチン様ポリペプチド６（ＡＮＧＰＴＬ６）、アンジオポイエチン様ポリペプチド７（ＡＮＧＰＴＬ７）、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオジェニン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、骨形態形成タンパク質－１、骨形態形成タンパク質－２、骨形態形成タンパク質－３、骨形態形成タンパク質－４、骨形態形成タンパク質－５、骨形態形成タンパク質－６、骨形態形成タンパク質－７、骨形態形成タンパク質－８、骨形態形成タンパク質－９、骨形態形成タンパク質－１０、骨形態形成タンパク質－１１、骨形態形成タンパク質－１２、骨形態形成タンパク質－１３、骨形態形成タンパク質－１４、骨形態形成タンパク質－１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＩ、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン－１、毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、毛様体神経栄養因子受容体、クリプト（ｃｒｉｐｔｏ）、クリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）、サイトカイン誘発好中球走化因子１、サイトカイン誘発好中球走化因子２α、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン、ドロトレコギンアルファ、サイトカイン誘発好中球走化因子２β、ＳＬＦ、ＳＣＦ、マスト細胞増殖因子、内皮細胞成長因子、エンドセリン１、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、エピジェン、エピレギュリン、上皮由来好中球遊走因子、線維芽細胞増殖因子４、線維芽細胞増殖因子５、線維芽細胞増殖因子６、線維芽細胞増殖因子７、線維芽細胞増殖因子８、線維芽細胞増殖因子８ｂ、線維芽細胞増殖因子８ｃ、線維芽細胞増殖因子９、線維芽細胞増殖因子１０、線維芽細胞増殖因子１１、線維芽細胞増殖因子１２、線維芽細胞増殖因子１３、線維芽細胞増殖因子１６、線維芽細胞増殖因子１７、線維芽細胞増殖因子１９、線維芽細胞増殖因子２０、線維芽細胞増殖因子２１、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、ＥＰＡ、ラクトフェリン、Ｈ－サブユニットフェリチン、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｅ１及びＥ２、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質ａ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＤ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ＤＮＡｓｅ、フェチュイン、黄体形成（ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇ）ホルモン、アルテプラーゼ、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第Ｖｉｌａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ－１、組織因子（ＴＦ）、ＡＤＡＭＴＳ １３プロテアーゼ、成長関連タンパク質β、成長関連タンパク質、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝がん由来増殖因子、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病抑制因子、ソマトロピン、抗血友病因子、ペグアスパラガーゼ、オルソクローンＯＫＴ ３、アデノシンデアミナーゼ、アルグルセラーゼ、イミグルセラーゼ、白血病抑制因子受容体α、神経成長因子、神経成長因子受容体、ニューロポエチン（ｎｅｕｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子Ａ鎖、血小板由来成長因子ＡＡ、血小板由来成長因子ＡＢ、血小板由来成長因子Ｂ鎖、血小板由来成長因子ＢＢ、血小板由来成長因子受容体α、血小板由来成長因子受容体β、プレＢ細胞成長刺激因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、形質転換成長因子α、胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＵＰ）、インスリン、レクチンリシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、レプチン、エンブレル（エタネルセプト）、アクチビン、インヒビン、白血病抑制因子、オンコスタチンＭ、ＭＩＰ－１－Ｃ、ＭＩＰ－１－Ｂ；ＭＩＰ－２－Ｃ、ＧＲＯ－Ｃ、ＭＩＰ－２－Ｂ、及び血小板因子－４が挙げられる。
【0063】
幾つかの実施形態において機能性の生体分子は、別の設計された機能性のポリペプチド配列であってもよい。幾つかの実施形態において機能性のポリペプチド配列は機能性ポリペプチドのドメイン又は断片である。幾つかの実施形態において機能性のポリペプチド配列は、場合によりポリペプチドの化学量論結合又は修飾をもたらすことがある認識配列である。幾つかの実施形態において機能性のポリペプチド配列は、融合ポリペプチドの発現又は精製を促進するのに有用な配列である。幾つかの実施形態において機能性のポリペプチド配列は、らせん、シート、ターン、フォールディング、及びスーパードメインを含む二次以上の高次特性の構造モチーフである。幾つかの実施形態において機能性のポリペプチド配列は混合荷電ポリペプチドともう１つ別の機能性生体分子との間に存在するリンカー配列である。
【0064】
幾つかの実施形態において、機能性の生体分子は、性能の少なくとも１つの面が改良された機能性のタンパク質を生成する合理的設計、指向進化、又はその他の幾つかの技術によって改変されたタンパク質である。
【0065】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、「機能性タンパク質」、及び「機能性ペプチド」は同義で使用することができる。一定の実施形態において、ペプチドは大きさが約５～約４００００、約５～約２００００、約５～約１００００、約５～約５０００、約５～約１０００、約５～約７５０、約５～約５００、約５～約２５０、約５～約１００、約５～約７５、約５～約５０、約５～約４０、約５～約３０、約５～約２５、約５～約２０、約５～約１５、又は約５～約１０のアミノ酸の範囲である。
【0066】
核酸。本発明の一定の実施形態において、生体分子は核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの誘導体）である。幾つかの実施形態において、核酸作用物質は機能性のＲＮＡである。一般に、「機能性ＲＮＡ」は、タンパク質をコードしていないが、代わりにそのメンバーが特徴的に細胞内で１以上の異なる機能又は活性を保有するＲＮＡ分子のクラスに属するＲＮＡである。異なる配列を有する機能性のＲＮＡ分子の相対的な活性は異なることがあり、そのＲＮＡが存在する個々の細胞型に少なくとも部分的に依存し得ることが分かる。従って、用語「機能性ＲＮＡ」は本明細書であるクラスのＲＮＡ分子を指して使用されており、そのクラスの全てのメンバーが実際にそのクラスの特徴である活性をいかなる特定の組の条件下でも示すことを意味することは意図されていない。幾つかの実施形態において、機能性のＲＮＡにはＲＮＡｉ誘導性の実体（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ）、リボザイム、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、三重らせん形成に有用なＲＮＡが含まれる。
【0067】
幾つかの実施形態において、核酸作用物質はベクターである。本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」とは、結び付けられている別の核酸を輸送することができる核酸分子（必ずではないが、通例ＤＮＡ分子）をいう。ベクターは宿主細胞内で結び付けられる核酸の染色体外複製及び／又は発現を達成することができる。幾つかの実施形態において、ベクターは宿主細胞のゲノム内への統合を達成することができる。
【0068】
幾つかの実施形態において、ベクターはタンパク質及び／又はＲＮＡの発現を指令するのに使用される。幾つかの実施形態において、発現させられるタンパク質及び／又はＲＮＡは通常細胞により発現されない。幾つかの実施形態において、発現させられるタンパク質及び／又はＲＮＡは細胞により通常発現されるが、ベクターが細胞に送達されなかったときに発現されるよりも低いレベルで発現される。幾つかの実施形態において、ベクターは本明細書に記載されている機能性のＲＮＡ、例えばＲＮＡｉ誘導性の実体、リボザイムのいずれかの発現を指令する。
【0069】
ウイルス。幾つかの実施形態において、生体分子はウイルスである。一定の実施形態において、ウイルスは医学及び獣医学診療における医学療法及び診断並びに農業において有用性を有し、遺伝子治療（例えば所望の遺伝子産物の局所的発現のための遺伝子の送達）において、また非遺伝子治療用途、例えば限定されることはないがウイルス性腫瘍崩壊のために特に有用である。一定の実施形態において、ウイルスは以下の科及び属から選択される：アデノウイルス科；ビマウイルス科（Ｂｉｍａｖｉｒｉｄａｅ）；ブニヤウイルス科；カリシウイルス科；カピロウイルス属；カルラウイルス属；カルモウイルス属；カリモウイルス属；クロステロウイルス属；Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ属；コモウイルス属；コロナウイルス科；ＰＭ２ファージ属：コルチコウイルス科；クリプティックウイルス属；クリプトウイルス属；ククモウイルス属；φ６ファージファミリー；シストウイルス科；カーネーションリングスポット属；ダイアンソウイルス属；ソラマメウイルト属；ファバウイルス属；フィロウイルス科；フラビウイルス科；フロウイルス属；ジェミニウイルス属；ジアルジアウイルス属；ヘパドナウイルス科；ヘルペスウイルス科；ホルデイウイルス属；アイラー（ｌｉａｒ）ウイルス属；イノウイルス科；イリドウイルス科；レビウイルス科；リポスリクスウイルス科；ルテオウイルス属；マラフィウイルス属；トウモロコシ白化萎縮ウイルス属；ミクロウイルス科（ｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）；マイオウイルス科；ネクロウイルス属；ネポウイルス属；ノダウイルス科；オルトミクスウイルス科；パポバウイルス科、例えばアデノ随伴ウイルス；パラミクソウイルス科；パースニップ黄色斑点ウイルス属；パルティティウイルス科；パルボウイルス科；エンドウエネーションモザイクウイルス属；フィコドナウイルス科；ピコルナウイルス科；プラズマウイルス科；ポドウイルス科；ポリドナウイルス科；ポテクスウイルス属；ポティウイルス科；ポックスウイルス科；レオウイルス科；レトロウイルス科；ラブドウイルス科；リジディオウイルス属；サイフォウイルス科；ソベモウイルス属；ＳＳＶ１型ファージ；テクティウイルス科；テヌイウイルス属；テトラウイルス科；タバモウイルス属；トブラウイルス属；トガウイルス科；トンブスウイルス属；トロウイルス属；トティウイルス科；ティモウイルス属；及び植物ウイルスサテライト。一定の実施形態において、導入遺伝子の送達の目的に特に好ましいウイルスには、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びポックスウイルスがある。アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスが特に好ましい。
【0070】
糖タンパク質及びプロテオグリカン。幾つかの実施形態において、生体分子は、タンパク質に結合した炭水化物である糖タンパク質又はプロテオグリカンである。糖タンパク質又はプロテオグリカンは天然でも合成でもよい。炭水化物はまた誘導体化された天然の炭水化物であってもよい。一定の実施形態において、炭水化物は単純又は複合糖類であり得る。一定の実施形態において、炭水化物は単糖、例えば限定されることはないがグルコース、フルクトース、ガラクトース、及びリボースである。一定の実施形態において、炭水化物は二糖、例えば限定されることはないがラクトース、スクロース、マルトース、トレハロース、及びセロビオースである。一定の実施形態において、炭水化物は多糖、例えば、限定されることはないが、セルロース、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、デキストロース、デキストラン、グリコーゲン、キサンタンガム、ジェランガム、デンプン、及びプルランである。一定の実施形態において、炭水化物は糖アルコール、例えば限定されることはないがマンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール（ｍａｌｉｔｏｌ）、及びラクチトールである。
【0071】
脂質。幾つかの実施形態において、生体分子は脂質である。一定の実施形態において、脂質はタンパク質に結合している脂質（例えば、リポタンパク質）である。本発明に従って使用できる代表的な脂質には、限定されることはないが、油、脂肪酸、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、必須脂肪酸、シス脂肪酸、トランス脂肪酸、グリセリド、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ホルモン、ステロイド（例えば、コレステロール、胆汁酸）、ビタミン（例えば、ビタミンＥ）、リン脂質、スフィンゴ脂質、及びリポタンパク質がある。
【0072】
幾つかの実施形態において、脂質は１以上の脂肪酸基又はその塩を含み得る。幾つかの実施形態において、脂肪酸基は消化可能な長鎖（例えば、Ｃ８－Ｃ５０）置換又は非置換の炭化水素を含み得る。幾つかの実施形態において、脂肪酸基は酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリチスン酸、パルチミン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、又はリグノセリン酸の１以上であり得る。幾つかの実施形態において、脂肪酸基はパルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、アルファリノレン酸、ガンマ－リノール酸、アラキドン酸、ガドレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、又はエルカ酸の１以上であってもよい。
【0073】
ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲート
別の態様において、本発明はポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートを提供する。１つの実施形態において、ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートは：
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子であって、第１及び第２の反応性基は異なる、生体分子；
（ｂ）第１の反応性基に共有結合した１以上の第１のポリマー；及び
（ｃ）第２の反応性基に共有結合した１以上の第２のポリマー（即ち、バックフィルされたポリマー）
を含む。
別の態様において、本発明はポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートを提供する。１つの実施形態において、ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートは：
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子であって、第１及び第２の反応性基は異なる、生体分子；
（ｂ）第１の反応性基に共有結合した１以上の第１のポリマー；及び
（ｃ）第２の反応性基に共有結合した１以上の第２のポリマー（即ち、バックフィルされたポリマー）
を含む。
【0074】
ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートにおいて、第１のポリマーは、第１のポリマー上の適切な官能基及び生体分子の第１の反応性基の反応により生体分子に共有結合される。次いで第２のポリマーがバイオコンジュゲートをバックフィルする：第２のポリマーは第２のポリマー上の適切な官能基及び生体分子の第２の反応性基の反応により生体分子に共有結合される。
【0075】
一定の実施形態において、第１の反応性基はアミン、カルボン酸（カルボキシレート）、チオール、マレイミド、炭素－炭素二重結合、炭素－炭素三重結合、及びアジド基から選択される。他の実施形態において、第１の反応性基はアミン、カルボン酸（カルボキシレート）、チオール、及びマレイミド基から選択される。更なる実施形態において、第１の反応性基はアミン基である。
【0076】
一定の実施形態において、第２の反応性基はアミン、カルボン酸（カルボキシレート）、チオール、マレイミド、炭素－炭素二重結合、炭素－炭素三重結合、及びアジド基から選択される。他の実施形態において、第２の反応性基はアミン、カルボン酸（カルボキシレート）、チオール、及びマレイミド基から選択される。更なる実施形態において、第２の反応性基はアミン基である。
【0077】
一定の実施形態において、第１の反応性基はアミン基から選択され、第２の反応性基はカルボン酸（又はカルボキシレート）基から選択される。
【0078】
ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートの１つの実施形態において、第１のポリマー及び第２のポリマーは、ポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢ）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、ポリ（テトラメチルアミンオキシド）（ＴＭＡＯ）、ポリ（２－オキサゾリン）（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ポリＨＰＭＡ）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーから選択される親水性で、実質的に水溶性のポリマーである。
【0079】
他の実施形態において、第１及び／又は第２のポリマーはＥＫ含有ペプチドである。
更なる実施形態において、第１及び／又は第２のポリマーは上述された、米国特許第７，８５５，２７９号及び同第９，２２１，８８２号に記載されている組織化されてない組換えポリペプチド又はランダムコイルポリペプチドである。
更なる実施形態において、第１及び／又は第２のポリマーは上述された、米国特許第７，８５５，２７９号及び同第９，２２１，８８２号に記載されている組織化されてない組換えポリペプチド又はランダムコイルポリペプチドである。
【0080】
別の実施形態において、第１のポリマー及び第２のポリマーはポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢ）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、及びポリ（テトラメチルアミンオキシド）（ＴＭＡＯ）ポリマーから選択される両性イオン性のポリマーである。
【0081】
ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートポリマーの上記実施形態の幾つかにおいて、第１のポリマー及び第２のポリマーは同じである（例えば、ＰＣＢ／ＰＣＢ、ＰＳＢ／ＰＳＢ、ＰＣ／ＰＣ、及びＰＴＭＡＯ／ＰＴＭＡＯ）。上記実施形態の他において、第１のポリマー及び第２のポリマーは異なる（例えば、ＰＣＢ／ＰＳＢ、ＰＳＢ／ＰＣＢ、ＰＣＢ／ＰＣ、ＰＳＢ／ＰＣ、ＰＣ／ＰＣＢ、及びＰＣ／ＰＣＢ）。
【0082】
更なる実施形態において、第１のポリマーはポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）ポリマーであり、第２のポリマーはポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）ポリマーである。
【0083】
有利に修飾されて本発明のバックフィルされたポリマーバイオコンジュゲートを提供する生体分子には、タンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、脂質、核酸、細胞、ウイルス、又は細菌がある。代表的な生体分子は上に詳細に記載されている。
【0084】
代表的なポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートの調製及び特徴付けは実施例４に記載される。
【0085】
ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートを作製する方法
別の態様において、本発明はポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートを作製する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は：
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子に１以上の第１のポリマーを共有結合させることであって、第１及び第２の反応性基は異なり、第１のポリマーは第１の反応性基に共有結合している、共有結合させること；
（ｂ）１以上の第２のポリマーを第２の反応性基に共有結合させて生体分子に共有結合した第１のポリマー及び第２のポリマーを有するバイオコンジュゲートを提供すること
を含む。
別の態様において、本発明はポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートを作製する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は：
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子に１以上の第１のポリマーを共有結合させることであって、第１及び第２の反応性基は異なり、第１のポリマーは第１の反応性基に共有結合している、共有結合させること；
（ｂ）１以上の第２のポリマーを第２の反応性基に共有結合させて生体分子に共有結合した第１のポリマー及び第２のポリマーを有するバイオコンジュゲートを提供すること
を含む。
【0086】
生体分子に結合したポリマーの数を増大する方法
更なる態様において、本発明は生体分子に共有結合したポリマーの数を増大する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は：
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子に第１のポリマーを共有結合させることであって、第１及び第２の反応性基は異なり、第１のポリマーは第１の反応性基に共有結合している、共有結合させること；
（ｂ）１以上の第２のポリマーを第２の反応性基に共有結合させて、生体分子に共有結合した第１のポリマー及び第２のポリマーを有するバイオコンジュゲートを提供することにより、生体分子に共有結合したポリマーの密度を増大すること
を含む。
更なる態様において、本発明は生体分子に共有結合したポリマーの数を増大する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は：
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子に第１のポリマーを共有結合させることであって、第１及び第２の反応性基は異なり、第１のポリマーは第１の反応性基に共有結合している、共有結合させること；
（ｂ）１以上の第２のポリマーを第２の反応性基に共有結合させて、生体分子に共有結合した第１のポリマー及び第２のポリマーを有するバイオコンジュゲートを提供することにより、生体分子に共有結合したポリマーの密度を増大すること
を含む。
【0087】
多層／ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲート
更なる態様において、本発明は多層／ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートを提供する。１つの実施形態において、多層／ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートは：
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子であって、第１及び第２の反応性基は異なる、生体分子；
（ｂ）第１の反応性基に共有結合した第１のポリマー；
（ｃ）第１のポリマーの少なくとも一部分に共有結合した第２のポリマー；及び
（ｄ）第２の反応性基に共有結合した１以上の第３のポリマー（即ち、バックフィルされたポリマー）
を含む。
更なる態様において、本発明は多層／ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートを提供する。１つの実施形態において、多層／ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートは：
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子であって、第１及び第２の反応性基は異なる、生体分子；
（ｂ）第１の反応性基に共有結合した第１のポリマー；
（ｃ）第１のポリマーの少なくとも一部分に共有結合した第２のポリマー；及び
（ｄ）第２の反応性基に共有結合した１以上の第３のポリマー（即ち、バックフィルされたポリマー）
を含む。
【0088】
一定の実施形態において、第１及び第２のポリマーは、多層ポリマーバイオコンジュゲートに関して上記した第１及び第２のポリマーと同じである。一定の実施形態において、第１及び／又は第２のポリマーは両性イオン性のポリマー又はペプチド（例えば、ＥＫ含有ペプチド、例えば（ＥＫ）ｎペプチド、ここでｎは１～５０である）。
【0089】
他の実施形態において、第１及び／又は第２のポリマーはＥＫ含有ペプチドである。
更なる実施形態において、第１及び／又は第２のポリマーは、上述された、米国特許第７，８５５，２７９号及び同第９，２２１，８８２号に記載されている組織化されてない組換えポリペプチド又はランダムコイルポリペプチドである。
更なる実施形態において、第１及び／又は第２のポリマーは、上述された、米国特許第７，８５５，２７９号及び同第９，２２１，８８２号に記載されている組織化されてない組換えポリペプチド又はランダムコイルポリペプチドである。
【0090】
一定の実施形態において、第３のポリマーはポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢ）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、ポリ（テトラメチルアミンオキシド）（ＴＭＡＯ）、ポリ（２－オキサゾリン）（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ポリＨＰＭＡ）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーからなる群から選択されるポリマーである。
【0091】
本発明のバックフィルされたポリマーバイオコンジュゲートを提供するように有利に修飾される生体分子には、タンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、脂質、核酸、細胞、ウイルス、又は細菌がある。代表的な生体分子は上に詳細に記載されている。
【0092】
多層／ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートを作製する方法
もう１つ別の態様において、本発明は多層／ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートを作製する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は：
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子に１以上の第１のポリマーを共有結合させることであって、第１及び第２の反応性基は異なり、第１のポリマーは第１の反応性基に共有結合している、共有結合させること；
（ｂ）第１のポリマーの少なくとも一部分に１以上の第２のポリマーを共有結合させること；
（ｃ）１以上の第３のポリマーを第２の反応性基に共有結合させて、生体分子に共有結合した第１のポリマー、第２のポリマー、及び第３のポリマーを有するバイオコンジュゲートを提供すること
を含む。
もう１つ別の態様において、本発明は多層／ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートを作製する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は：
（ａ）１以上の第１の反応性基及び１以上の第２の反応性基を有する生体分子に１以上の第１のポリマーを共有結合させることであって、第１及び第２の反応性基は異なり、第１のポリマーは第１の反応性基に共有結合している、共有結合させること；
（ｂ）第１のポリマーの少なくとも一部分に１以上の第２のポリマーを共有結合させること；
（ｃ）１以上の第３のポリマーを第２の反応性基に共有結合させて、生体分子に共有結合した第１のポリマー、第２のポリマー、及び第３のポリマーを有するバイオコンジュゲートを提供すること
を含む。
【0093】
代表的な多層／ポリマーでバックフィルされたバイオコンジュゲートの調製は実施例５に記載される。
【0094】
本明細書で使用されるとき、用語「約」は記載されている値の±５％を意味する。
以下、本発明を限定することなく例示する目的で実施例を挙げる。
以下、本発明を限定することなく例示する目的で実施例を挙げる。
【実施例】
【0095】
実施例１
代表的な多層ポリマーバイオコンジュゲート：Ａｓｐ－ＥＫ－Ｓ、Ａｓｐ－ＥＫ－Ｄ、及びＡｓｐ－ＥＫ－Ｔの調製及び特徴付け
この実施例では、代表的な多層ポリマーバイオコンジュゲートであるＡｓｐ－ＥＫ－Ｓ、Ａｓｐ－ＥＫ－Ｄ、及びＡｓｐ－ＥＫ－Ｔの調製及び特徴付けについて記載する。高いポリマー密度は多数のリジン増幅によって達成される。
代表的な多層ポリマーバイオコンジュゲート：Ａｓｐ－ＥＫ－Ｓ、Ａｓｐ－ＥＫ－Ｄ、及びＡｓｐ－ＥＫ－Ｔの調製及び特徴付け
この実施例では、代表的な多層ポリマーバイオコンジュゲートであるＡｓｐ－ＥＫ－Ｓ、Ａｓｐ－ＥＫ－Ｄ、及びＡｓｐ－ＥＫ－Ｔの調製及び特徴付けについて記載する。高いポリマー密度は多数のリジン増幅によって達成される。
【0096】
異なるタンパク質は異なる表面残基分布（ｇｅｏ－ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を示す。タンパク質は十分な結合部位を提供するためにたくさんの到達できる表面基を必要とする。通常、リジン由来のアミン基がポリマーに結合するための反応性基として選ばれる。標的タンパク質が十分な表面リジンを含有していてもいなくても、本明細書に記載されているリジン増幅技術により、標的タンパク質上の高いポリマー密度を得るための解決策が提供される。
【0097】
（ＥＫ）１０－Ｃポリペプチドの合成及び特徴付け
（ＥＫ）１０－ＣはＦｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によりＬｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ自動マイクロウェーブ支援ペプチド合成機（ＣＥＭ）で合成した。配列合成スケールはＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上２．５ｍｍｏｌに設定した（０．６ｍｅｑ／ｇ置換）。脱保護は２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液中マシンデフォルトマイクロ波条件で行った。カップリング反応は、５倍モルの試薬［０．２Ｍアミノ酸溶液（ＤＭＦ中）並びに０．５ＭＤＩＣ（ＤＭＦ中）及び１．０ＭＯｘｙｍａ（ＤＭＦ中）］の存在下で、ＣＥＭから提供された２．５ｍｍｏｌカップリングサイクル法を用いることによって行った。開裂は２０ｍｌカクテル（ＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／ＥＤＴ；８２．５／５／５／５／２．５）を用いて１８０分室温で行った。開裂後、（ＥＫ）１０－Ｃ－ＮＨ２を沈降させ、氷冷無水エチルエーテルで洗浄した。Ｅｃｏｎｏ－Ｐａｃ １０ＤＧ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎを用いて生成物の純度を更に高めた。
（ＥＫ）１０－ＣはＦｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によりＬｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ自動マイクロウェーブ支援ペプチド合成機（ＣＥＭ）で合成した。配列合成スケールはＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上２．５ｍｍｏｌに設定した（０．６ｍｅｑ／ｇ置換）。脱保護は２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液中マシンデフォルトマイクロ波条件で行った。カップリング反応は、５倍モルの試薬［０．２Ｍアミノ酸溶液（ＤＭＦ中）並びに０．５ＭＤＩＣ（ＤＭＦ中）及び１．０ＭＯｘｙｍａ（ＤＭＦ中）］の存在下で、ＣＥＭから提供された２．５ｍｍｏｌカップリングサイクル法を用いることによって行った。開裂は２０ｍｌカクテル（ＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／ＥＤＴ；８２．５／５／５／５／２．５）を用いて１８０分室温で行った。開裂後、（ＥＫ）１０－Ｃ－ＮＨ２を沈降させ、氷冷無水エチルエーテルで洗浄した。Ｅｃｏｎｏ－Ｐａｃ １０ＤＧ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎを用いて生成物の純度を更に高めた。
【0098】
合成プロセスの原理を図１に示す。
多層ポリペプチド－アスパラギナーゼコンジュゲートの合成
ＥＫ－アスパラギナーゼ（ＥＫ－ＡＳＰ）コンジュゲートはリジン増幅法を用いて調製した。最初に天然のＡＳＰ上のアミンをマレイミド－ＮＨＳ二官能性架橋剤（Ｎ－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、ＡＭＡＳ）により活性化した。アミン基に対して２当量のＡＭＡＳ架橋剤をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍｌ）に溶かし、ＡＳＰ溶液（ＰＢＳ緩衝液中２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）に滴下して加えた。３０分撹拌した後、反応混合物をタンパク質濃縮管（ＭＷカットオフ：３０ｋＤａ）中で新鮮なＭＯＰＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に対して５回超遠心分離して未反応ＡＭＡＳ及びあらゆる可能な小分子不純物を除いた。次いで、ＡＭＡＳで活性化されたＡＳＰを含有する残留溶液を（ＥＫ）１０－Ｃストック溶液（ＡＳＰに対して１０質量倍過剰、ＭＯＰＳ緩衝液中）と合わせて第１のＥＫ層変性を開始させた。結合反応を一晩４℃で保ち、同じ超遠心分離工程を実行して過剰のＥＫペプチドを除去した。精製されたＡＳＰ－ＥＫ－単層（ＡＳＰ－ＥＫ－ｓ）コンジュゲートを更なる特徴付け及び次の結合工程のために２ｍｇ／ｍｌで４℃の冷蔵庫内に貯蔵した。ＡＳＰ－ＥＫ－二重層（ＡＳＰ－ＥＫ－ｄ）調合物は（ＥＫ）１０－Ｃペプチドを第１のＥＫ層により増幅されたリジンに導入することによって調製した。同じＡＭＡＳ活性化とそれに続くＥＫ変性手順を実行し、得られたＡＳＰ－ＥＫ－ｄコンジュゲートを超遠心分離（ＭＷカットオフ：１００ｋ）により精製した。同じ方法により、ＡＳＰ－ＥＫ－三重層（ＡＳＰ－ＥＫ－ｔ）調合物を調製し精製した。調製プロセスを図２に示す。
多層ポリペプチド－アスパラギナーゼコンジュゲートの合成
ＥＫ－アスパラギナーゼ（ＥＫ－ＡＳＰ）コンジュゲートはリジン増幅法を用いて調製した。最初に天然のＡＳＰ上のアミンをマレイミド－ＮＨＳ二官能性架橋剤（Ｎ－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、ＡＭＡＳ）により活性化した。アミン基に対して２当量のＡＭＡＳ架橋剤をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍｌ）に溶かし、ＡＳＰ溶液（ＰＢＳ緩衝液中２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）に滴下して加えた。３０分撹拌した後、反応混合物をタンパク質濃縮管（ＭＷカットオフ：３０ｋＤａ）中で新鮮なＭＯＰＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に対して５回超遠心分離して未反応ＡＭＡＳ及びあらゆる可能な小分子不純物を除いた。次いで、ＡＭＡＳで活性化されたＡＳＰを含有する残留溶液を（ＥＫ）１０－Ｃストック溶液（ＡＳＰに対して１０質量倍過剰、ＭＯＰＳ緩衝液中）と合わせて第１のＥＫ層変性を開始させた。結合反応を一晩４℃で保ち、同じ超遠心分離工程を実行して過剰のＥＫペプチドを除去した。精製されたＡＳＰ－ＥＫ－単層（ＡＳＰ－ＥＫ－ｓ）コンジュゲートを更なる特徴付け及び次の結合工程のために２ｍｇ／ｍｌで４℃の冷蔵庫内に貯蔵した。ＡＳＰ－ＥＫ－二重層（ＡＳＰ－ＥＫ－ｄ）調合物は（ＥＫ）１０－Ｃペプチドを第１のＥＫ層により増幅されたリジンに導入することによって調製した。同じＡＭＡＳ活性化とそれに続くＥＫ変性手順を実行し、得られたＡＳＰ－ＥＫ－ｄコンジュゲートを超遠心分離（ＭＷカットオフ：１００ｋ）により精製した。同じ方法により、ＡＳＰ－ＥＫ－三重層（ＡＳＰ－ＥＫ－ｔ）調合物を調製し精製した。調製プロセスを図２に示す。
【0099】
ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）を行ってＡＳＰ－ＥＫ－Ｓ、ＡＳＰ－ＥＫ－Ｄ、及びＡＳＰ－ＥＫ－Ｔ生成物の大きさの差を特徴付けた。また、最終のすっかり被覆されたＡＳＰ－ＥＫ－Ｔコンジュゲート生成物を得るために、疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）を用いて十分に封入されなかったものを除いた。
【0100】
特異的結合親和性特徴付け
３層の両性イオン性ポリペプチド－タンパク質コンジュゲートが有意な遮蔽効果を提供することを示すために、インビトロＥＬＩＳＡ試験を行った。一般に、ストレプトアビジンをコートした９６－ウェルを鋳型として用い、抗ＡＳＰ抗体を一次抗体として使用し、次いでＡＳＰ－ＥＫ調合溶液をウェルに加えた。洗浄後、ＨＲＰ結合抗ＡＳＰ抗体を二次抗体として導入した。このようにして、ＨＲＰ／ＴＭＢ反応により生じたＯＤ値を用いてＡＳＰと対応する抗体との結合親和性を評価した。より高い結合親和性はより低い表面遮蔽能力を示す。全体として、ＡＳＰ表面上のＥＫ層の増大は特異的抗体結合からＡＳＰを有意に遮蔽すると推論された。具体的には、１０３ｐｍｏｌ／ｍＬの検出限界を有する天然のＡＳＰと比較して、単層コンジュゲートは結合親和性を１０５ｐｍｏｌ／ｍＬの検出限界までかなり低下させるが、それでも多少の結合親和性を有する。しかしながら、第２及び第３の層はＡＳＰの結合エピソードを殆どすっかり覆い、温和な条件下で十分な保護効果を示す。
３層の両性イオン性ポリペプチド－タンパク質コンジュゲートが有意な遮蔽効果を提供することを示すために、インビトロＥＬＩＳＡ試験を行った。一般に、ストレプトアビジンをコートした９６－ウェルを鋳型として用い、抗ＡＳＰ抗体を一次抗体として使用し、次いでＡＳＰ－ＥＫ調合溶液をウェルに加えた。洗浄後、ＨＲＰ結合抗ＡＳＰ抗体を二次抗体として導入した。このようにして、ＨＲＰ／ＴＭＢ反応により生じたＯＤ値を用いてＡＳＰと対応する抗体との結合親和性を評価した。より高い結合親和性はより低い表面遮蔽能力を示す。全体として、ＡＳＰ表面上のＥＫ層の増大は特異的抗体結合からＡＳＰを有意に遮蔽すると推論された。具体的には、１０３ｐｍｏｌ／ｍＬの検出限界を有する天然のＡＳＰと比較して、単層コンジュゲートは結合親和性を１０５ｐｍｏｌ／ｍＬの検出限界までかなり低下させるが、それでも多少の結合親和性を有する。しかしながら、第２及び第３の層はＡＳＰの結合エピソードを殆どすっかり覆い、温和な条件下で十分な保護効果を示す。
【0101】
図２は、天然のＡＳＰ、ＡＳＰ－ＥＫ－Ｓ、ＡＳＰ－ＥＫ－Ｄ、及びＡＳＰ－ＥＫ－Ｔのインビトロ抗アスパラギナーゼ抗体結合親和性を比較して示す（初期濃度は１μｍｏｌ／ｍＬである）。
【0102】
非特異的結合親和性の特徴付け
大きさの増大にも関わらず、十分に包まれなかったコンジュゲートは殆どない。従って、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して、生物学的活性を維持しながら十分に包まれたコンジュゲートを分離し精製した。高塩濃度緩衝液に溶解すると、サンプル溶質の溶媒和は低減し、露出されるようになった疎水性領域は媒質に付着した。次いで一連の低下する塩勾配Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を適用してサンプルをカラムから溶出させ、十分に覆われたサンプルを洗浄し集めた。ＨＩＣの結果を図４Ａ－４Ｄに示す。
大きさの増大にも関わらず、十分に包まれなかったコンジュゲートは殆どない。従って、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して、生物学的活性を維持しながら十分に包まれたコンジュゲートを分離し精製した。高塩濃度緩衝液に溶解すると、サンプル溶質の溶媒和は低減し、露出されるようになった疎水性領域は媒質に付着した。次いで一連の低下する塩勾配Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を適用してサンプルをカラムから溶出させ、十分に覆われたサンプルを洗浄し集めた。ＨＩＣの結果を図４Ａ－４Ｄに示す。
【0103】
１．１３Ｍ濃度で溶出した天然のＡＳＰと比較して、超分岐コンジュゲートは２つのピークを示す。左のものは十分に覆われたコンジュゲートを表し、非特異的結合親和性をもたないローディング緩衝液と共に出て行く。他のものは１．７６Ｍ濃度で溶出したが、これは少し非特異的結合を示す。表１はサンプル溶出勾配を示し、３層コンジュゲートが最良の結果を有する。
【0104】
図４Ａ－４Ｄは、天然のＡＳＰ（４Ａ）、ＡＳＰ－ＥＫ－Ｓ（４Ｂ）、ＡＳＰ－ＥＫ－Ｄ（４Ｃ）、及びＡＳＰ－ＥＫ－Ｔ（４Ｄ）のＨＩＣの結果を比較して示す。
【0105】
【表1】
【0106】
超分岐ＡＳＰ－ＥＫ－Ｔコンジュゲートのインビボ薬物動態及び免疫原性研究
全ての動物実験は連邦政府ガイドラインに忠実であり、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認された。動物を各々の研究の初めに処置群にランダム化し、１群当たり５匹の動物のサンプルサイズを使用した。Ｃ５７ＬＢ／６匹マウス（雄、体重２０～２５ｇ）はＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。
全ての動物実験は連邦政府ガイドラインに忠実であり、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認された。動物を各々の研究の初めに処置群にランダム化し、１群当たり５匹の動物のサンプルサイズを使用した。Ｃ５７ＬＢ／６匹マウス（雄、体重２０～２５ｇ）はＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。
【0107】
２群のマウスを用いて天然のアスパラギナーゼ及び超分岐ＡＳＰ－ＥＫ－ｔコンジュゲートの薬物動態（ＰＫ）を検討した。連続した３週の各々の週の最初の日に静脈内（ＩＶ）投与を行った。５０μＬの１２．５ｍＵ／ｍＬのＡＳＰサンプルを尾静脈注射法により投与した。その後注射時に対してそれぞれ５分、１、４、８、及び２４時間の時点で血液サンプルを集めた。血液を２１日に集め、間接ＥＬＩＳＡによる免疫原性研究（ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体検出）に使用した。また、アスパラギナーゼ活性アッセイキットを用いて血液血清中の酵素含量を評価した。
【0108】
天然のＡＳＰ群及びＡＳＰ－ＥＫ－Ｔ群の両方のＰＫ結果を図５Ａ－５Ｃに示す。全体として、ＡＳＰ－ＥＫ－ｔコンジュゲートは天然のＡＳＰより顕著に優れており、注射後より長い期間生物活性を維持した。具体的には、ＡＳＰ－ＥＫ－Ｔコンジュゲートは第３の注射後でさえ秀でた循環時間を維持し、天然のＡＳＰは明白なＡＢＣ現象を示した。一方、ＡＳＰ－ＥＫ－ｔ群ではＡＢＣ効果が観察されない。３度の投与後のＡＳＰ－ＥＫ－ｔコンジュゲートの延ばされた変化しない循環時間は防汚（ｎｏｎ－ｆｏｕｌｉｎｇ）性及び大きさの増大を明らかにし、これらは共に免疫及び腎臓系による速いクリアランスを逃れる。
【0109】
図５Ａ－５Ｃは、ＡＳＰ調合物の第１の投与（５Ａ）、第２の投与（５Ｂ）、及び第３の投与（５Ｃ）のＰＫプロフィールを比較して示す。
【0110】
ＩｇＧ試験のための間接ＥＬＩＳＡアッセイを図６に示す。ＡＳＰ－ＥＫ－ｔマウス群における抗ＡＳＰ力価は天然のＡＳＰ群よりずっと低い。これは、免疫原性エピソードがポリペプチドによりすっかり遮蔽されたことを立証した。また、ＡＳＰ－ＥＫ－ｔマウス群における著しく低い抗ＥＫ力価は、合成されたポリペプチドが複雑な環境下でも超低免疫原性であることを示している。
【0111】
図６は、第３週でのマウス血清中の抗ＡＳＰ及び抗ＥＫＩｇＧ抗体の検出を比較して示す。
【0112】
実施例２
代表的な多層バイオコンジュゲート：Ａｓｐ－ＥＫ－ＰＣＢの調製
この実施例では、代表的な多層ポリマーバイオコンジュゲートであるＡｓｐ－ＥＫ－ＰＣＢの調製について記載する。
代表的な多層バイオコンジュゲート：Ａｓｐ－ＥＫ－ＰＣＢの調製
この実施例では、代表的な多層ポリマーバイオコンジュゲートであるＡｓｐ－ＥＫ－ＰＣＢの調製について記載する。
【0113】
（ＥＫ）３－Ｃペプチドの合成
（ＥＫ）３－ＣはＦｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によりＬｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ自動マイクロウェーブ支援ペプチド合成機（ＣＥＭ）で合成した。配列合成スケールはＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上２．５ｍｍｏｌに設定した（０．６ｍｅｑ／ｇ置換）。脱保護は２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液中マシンデフォルトマイクロ波条件で行った。カップリング反応は５倍モル過剰の試薬［０．２Ｍアミノ酸溶液（ＤＭＦ中）並びに０．５ＭのＤＩＣ（ＤＭＦ中）及び１．０ＭのＯｘｙｍａ（ＤＭＦ中）］の存在下でＣＥＭから提供された２．５ｍｍｏｌカップリングサイクル法を用いることにより行った。開裂は２０ｍｌのカクテル（ＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／ＥＤＴ；８２．５／５／５／５／２．５）を用いて１８０分室温で行った。開裂後、（ＥＫ）３－Ｃ－ＮＨ２を沈降させ、氷冷無水エチルエーテルで洗浄した。（ＥＫ）３－Ｃ－ＮＨ２を再結晶により更に精製した。
（ＥＫ）３－ＣはＦｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によりＬｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ自動マイクロウェーブ支援ペプチド合成機（ＣＥＭ）で合成した。配列合成スケールはＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上２．５ｍｍｏｌに設定した（０．６ｍｅｑ／ｇ置換）。脱保護は２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液中マシンデフォルトマイクロ波条件で行った。カップリング反応は５倍モル過剰の試薬［０．２Ｍアミノ酸溶液（ＤＭＦ中）並びに０．５ＭのＤＩＣ（ＤＭＦ中）及び１．０ＭのＯｘｙｍａ（ＤＭＦ中）］の存在下でＣＥＭから提供された２．５ｍｍｏｌカップリングサイクル法を用いることにより行った。開裂は２０ｍｌのカクテル（ＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／ＥＤＴ；８２．５／５／５／５／２．５）を用いて１８０分室温で行った。開裂後、（ＥＫ）３－Ｃ－ＮＨ２を沈降させ、氷冷無水エチルエーテルで洗浄した。（ＥＫ）３－Ｃ－ＮＨ２を再結晶により更に精製した。
【0114】
ＰＣＢ－ＳＨポリマーの調製
４ｇのアミン基で終止したＰＣＢポリマー（ＰＣＢ－ＮＨ２、Ｍｗ：１０ｋ）をトラウト試薬（５０ｍｇ）で活性化してＰＣＢ－ＳＨを得た。２つの反応物質を５００ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液中で１時間撹拌し続けた。結合工程の直前にオペレーション緩衝液としてＨＥＰＥＳを用いて脱塩カラムにより未反応のトラウト試薬を除去した。ＨＥＰＥＳ中１００ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液ストックを次の工程に直接使用した。
４ｇのアミン基で終止したＰＣＢポリマー（ＰＣＢ－ＮＨ２、Ｍｗ：１０ｋ）をトラウト試薬（５０ｍｇ）で活性化してＰＣＢ－ＳＨを得た。２つの反応物質を５００ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液中で１時間撹拌し続けた。結合工程の直前にオペレーション緩衝液としてＨＥＰＥＳを用いて脱塩カラムにより未反応のトラウト試薬を除去した。ＨＥＰＥＳ中１００ｍｇ／ｍｌのポリマー溶液ストックを次の工程に直接使用した。
【0115】
Ａｓｐ－ＰＣＢコンジュゲートの調製
最初に天然のＡＳＰ上のアミンをマレイミド－ＮＨＳ二官能性架橋剤（Ｎ－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、ＡＭＡＳ）により活性化した。アミン基に対して２当量のＡＭＡＳ架橋剤をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍｌ）に溶かし、ＡＳＰ溶液（ＰＢＳ緩衝液中２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）に滴下して加えた。３０分撹拌した後、反応混合物をタンパク質濃縮管（ＭＷカットオフ：３０ｋＤａ）中で新鮮なＭＯＰＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に対して５回超遠心分離して未反応のＡＭＡＳ及びあらゆる可能な小分子不純物を除去した。その後、ＡＭＡＳで活性化したＡＳＰを含有する残留溶液をＰＣＢ－ＳＨストック溶液と合わせ、４℃で４時間撹拌し続けた。結合反応を一晩４℃で維持した。Ａｓｐ－ＰＣＢコンジュゲートを超遠心分離（Ｍｗカットオフ：１００ｋ）により精製した。
最初に天然のＡＳＰ上のアミンをマレイミド－ＮＨＳ二官能性架橋剤（Ｎ－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、ＡＭＡＳ）により活性化した。アミン基に対して２当量のＡＭＡＳ架橋剤をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍｌ）に溶かし、ＡＳＰ溶液（ＰＢＳ緩衝液中２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）に滴下して加えた。３０分撹拌した後、反応混合物をタンパク質濃縮管（ＭＷカットオフ：３０ｋＤａ）中で新鮮なＭＯＰＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に対して５回超遠心分離して未反応のＡＭＡＳ及びあらゆる可能な小分子不純物を除去した。その後、ＡＭＡＳで活性化したＡＳＰを含有する残留溶液をＰＣＢ－ＳＨストック溶液と合わせ、４℃で４時間撹拌し続けた。結合反応を一晩４℃で維持した。Ａｓｐ－ＰＣＢコンジュゲートを超遠心分離（Ｍｗカットオフ：１００ｋ）により精製した。
【0116】
Ａｓｐ－ＥＫコンジュゲートの調製
最初に天然のＡＳＰ上のアミンをマレイミド－ＮＨＳ二官能性架橋剤（Ｎ－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、ＡＭＡＳ）により活性化した。アミン基に対して２当量のＡＭＡＳ架橋剤をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍｌ）に溶かし、ＡＳＰ溶液（ＰＢＳ緩衝液中２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）に滴下して加えた。３０分撹拌した後、反応混合物をタンパク質濃縮管（ＭＷカットオフ：３０ｋＤａ）中で新鮮なＭＯＰＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に対して５回超遠心分離して未反応のＡＭＡＳ及びあらゆる可能な小分子不純物を除去した。次いでＡＭＡＳで活性化したＡＳＰを含有する残留溶液を（ＥＫ）３－Ｃストック溶液（１０質量倍過剰のＡＳＰ、ＭＯＰＳ緩衝液中）と合わせて第１のＥＫ層変性を始めた。結合反応を一晩４℃で維持し、同じ超遠心分離工程を実行して過剰のＥＫペプチドを除去した。精製したＡＳＰ－ＥＫ－単層（ＡＳＰ－ＥＫ－ｓ）コンジュゲートを次の結合工程のために２ｍｇ／ｍＬで４℃の冷蔵庫で保存した。
最初に天然のＡＳＰ上のアミンをマレイミド－ＮＨＳ二官能性架橋剤（Ｎ－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、ＡＭＡＳ）により活性化した。アミン基に対して２当量のＡＭＡＳ架橋剤をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍｌ）に溶かし、ＡＳＰ溶液（ＰＢＳ緩衝液中２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）に滴下して加えた。３０分撹拌した後、反応混合物をタンパク質濃縮管（ＭＷカットオフ：３０ｋＤａ）中で新鮮なＭＯＰＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に対して５回超遠心分離して未反応のＡＭＡＳ及びあらゆる可能な小分子不純物を除去した。次いでＡＭＡＳで活性化したＡＳＰを含有する残留溶液を（ＥＫ）３－Ｃストック溶液（１０質量倍過剰のＡＳＰ、ＭＯＰＳ緩衝液中）と合わせて第１のＥＫ層変性を始めた。結合反応を一晩４℃で維持し、同じ超遠心分離工程を実行して過剰のＥＫペプチドを除去した。精製したＡＳＰ－ＥＫ－単層（ＡＳＰ－ＥＫ－ｓ）コンジュゲートを次の結合工程のために２ｍｇ／ｍＬで４℃の冷蔵庫で保存した。
【0117】
Ａｓｐ－ＥＫ－ＰＣＢコンジュゲートの調製
最初に天然のＡｓｐ－ＥＫ上のアミンをマレイミド－ＮＨＳ二官能性架橋剤（Ｎ－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、ＡＭＡＳ）により活性化した。アミン基に対して２当量のＡＭＡＳ架橋剤をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍＬ）に溶かし、ＡＳＰ溶液（ＰＢＳ緩衝液中２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４）に滴下して加えた。３０分撹拌した後、反応混合物をタンパク質濃縮管（ＭＷカットオフ：３０ｋＤａ）中で新鮮なＭＯＰＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に対して５回超遠心分離して未反応のＡＭＡＳ及びあらゆる可能な小分子不純物を除去した。活性化されたＡｓｐ－ＥＫコンジュゲート及びＰＣＢ－ＳＨストック溶液を合わせ、４℃で４時間撹拌し続けた。過剰のポリマー及び未反応のタンパク質を透析ろ過（Ｍｗカットオフ：１００ｋ、ＫＲ２ｉシステム、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）により除去した。
最初に天然のＡｓｐ－ＥＫ上のアミンをマレイミド－ＮＨＳ二官能性架橋剤（Ｎ－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、ＡＭＡＳ）により活性化した。アミン基に対して２当量のＡＭＡＳ架橋剤をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍＬ）に溶かし、ＡＳＰ溶液（ＰＢＳ緩衝液中２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４）に滴下して加えた。３０分撹拌した後、反応混合物をタンパク質濃縮管（ＭＷカットオフ：３０ｋＤａ）中で新鮮なＭＯＰＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に対して５回超遠心分離して未反応のＡＭＡＳ及びあらゆる可能な小分子不純物を除去した。活性化されたＡｓｐ－ＥＫコンジュゲート及びＰＣＢ－ＳＨストック溶液を合わせ、４℃で４時間撹拌し続けた。過剰のポリマー及び未反応のタンパク質を透析ろ過（Ｍｗカットオフ：１００ｋ、ＫＲ２ｉシステム、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）により除去した。
【0118】
図７に示されているように、多層Ａｓｐ－ＥＫ－ＰＣＢコンジュゲートはＡｓｐ－ＰＣＢ単層コンジュゲートと比較して顕著な大きさ改良を示した。Ａｓｐ－ＥＫ－ＰＣＢコンジュゲートのサイズ分布も狭められ、Ａｓｐコンジュゲートの改良されたポリマー密度を示していることが留意される。
【0119】
実施例３
代表的な多層バイオコンジュゲート：ウリカーゼ－ＥＫ－ＰＣＢの調製
この実施例では、代表的な多層ポリマーバイオコンジュゲートであるウリカーゼ－ＥＫ－ＰＣＢの調製について記載する。
代表的な多層バイオコンジュゲート：ウリカーゼ－ＥＫ－ＰＣＢの調製
この実施例では、代表的な多層ポリマーバイオコンジュゲートであるウリカーゼ－ＥＫ－ＰＣＢの調製について記載する。
【0120】
（ＥＫ）３－Ｃペプチドの合成
（ＥＫ）３－ＣはＦｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によりＬｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ自動マイクロウェーブ支援ペプチド合成機（ＣＥＭ）で合成した。配列合成スケールはＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上２．５ｍｍｏｌに設定した（０．６ｍｅｑ／ｇ置換）。脱保護は２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液中マシンデフォルトマイクロ波条件で行った。カップリング反応は５倍モル過剰の試薬［０．２Ｍアミノ酸溶液（ＤＭＦ中）並びに０．５ＭのＤＩＣ（ＤＭＦ中）及び１．０ＭのＯｘｙｍａ（ＤＭＦ中）］の存在下でＣＥＭから提供された２．５ｍｍｏｌカップリングサイクル法を用いることにより行った。開裂は２０ｍｌのカクテル（ＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／ＥＤＴ；８２．５／５／５／５／２．５）を用いて１８０分室温で行った。開裂の後、（ＥＫ）３－Ｃ－ＮＨ２を沈降させ、氷冷無水エチルエーテルで洗浄した。（ＥＫ）３－Ｃ－ＮＨ２を再結晶により更に精製した。
（ＥＫ）３－ＣはＦｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によりＬｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ自動マイクロウェーブ支援ペプチド合成機（ＣＥＭ）で合成した。配列合成スケールはＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上２．５ｍｍｏｌに設定した（０．６ｍｅｑ／ｇ置換）。脱保護は２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液中マシンデフォルトマイクロ波条件で行った。カップリング反応は５倍モル過剰の試薬［０．２Ｍアミノ酸溶液（ＤＭＦ中）並びに０．５ＭのＤＩＣ（ＤＭＦ中）及び１．０ＭのＯｘｙｍａ（ＤＭＦ中）］の存在下でＣＥＭから提供された２．５ｍｍｏｌカップリングサイクル法を用いることにより行った。開裂は２０ｍｌのカクテル（ＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／ＥＤＴ；８２．５／５／５／５／２．５）を用いて１８０分室温で行った。開裂の後、（ＥＫ）３－Ｃ－ＮＨ２を沈降させ、氷冷無水エチルエーテルで洗浄した。（ＥＫ）３－Ｃ－ＮＨ２を再結晶により更に精製した。
【0121】
Ｕｒｉ－ＥＫコンジュゲートの調製
最初に天然のウリカーゼ（Ｕｒｉ）上のアミンをマレイミド－ＮＨＳ二官能性架橋剤（Ｎ－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、ＡＭＡＳ）により活性化した。アミン基に対して２当量のＡＭＡＳ架橋剤をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍＬ）に溶かし、Ｕｒｉ溶液（ＰＢＳ緩衝液中２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）に滴下して加えた。３０分撹拌した後、反応混合物をタンパク質濃縮管（ＭＷカットオフ：３０ｋＤａ）中で新鮮なＭＯＰＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に対して５回超遠心分離して未反応のＡＭＡＳ及びあらゆる可能な小分子不純物を除去した。次いでＡＭＡＳで活性化されたＵｒｉを含有する残留溶液を（ＥＫ）３－Ｃストック溶液（Ｕｒｉに対して１０質量倍過剰、ＭＯＰＳ緩衝液中）と合わせて第１のＥＫ層変性を始めた。結合反応を一晩４℃で維持し、同じ超遠心分離工程を実行して過剰のＥＫペプチドを除去した。精製したＵｒｉ－ＥＫコンジュゲートを次の結合工程のために２ｍｇ／ｍｌで４℃の冷蔵庫で保存した。
最初に天然のウリカーゼ（Ｕｒｉ）上のアミンをマレイミド－ＮＨＳ二官能性架橋剤（Ｎ－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、ＡＭＡＳ）により活性化した。アミン基に対して２当量のＡＭＡＳ架橋剤をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍＬ）に溶かし、Ｕｒｉ溶液（ＰＢＳ緩衝液中２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）に滴下して加えた。３０分撹拌した後、反応混合物をタンパク質濃縮管（ＭＷカットオフ：３０ｋＤａ）中で新鮮なＭＯＰＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に対して５回超遠心分離して未反応のＡＭＡＳ及びあらゆる可能な小分子不純物を除去した。次いでＡＭＡＳで活性化されたＵｒｉを含有する残留溶液を（ＥＫ）３－Ｃストック溶液（Ｕｒｉに対して１０質量倍過剰、ＭＯＰＳ緩衝液中）と合わせて第１のＥＫ層変性を始めた。結合反応を一晩４℃で維持し、同じ超遠心分離工程を実行して過剰のＥＫペプチドを除去した。精製したＵｒｉ－ＥＫコンジュゲートを次の結合工程のために２ｍｇ／ｍｌで４℃の冷蔵庫で保存した。
【0122】
Ａｓｐ－ＥＫ－ＰＥＧコンジュゲートの調製
最初に天然のＵｒｉ－ＥＫ上のアミンをマレイミド－ＮＨＳ二官能性架橋剤（Ｎ－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、ＡＭＡＳ）により活性化した。アミン基に対して２当量のＡＭＡＳ架橋剤をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍＬ）に溶かし、Ｕｒｉ－ＥＫ溶液（ＰＢＳ緩衝液中２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４）に滴下して加えた。３０分撹拌した後、反応混合物をタンパク質濃縮管（ＭＷカットオフ：３０ｋＤａ）中で新鮮なＭＯＰＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に対して５回超遠心分離して未反応のＡＭＡＳ及びあらゆる可能な小分子不純物を除去した。活性化されたＡｓｐ－ＥＫコンジュゲート及びＰＥＧ－ＳＨ（Ｍｗ５ｋ）ストック溶液を合わせ、４℃で４時間撹拌し続けた。過剰のポリマー及び未反応のタンパク質を透析ろ過（Ｍｗカットオフ：１００ｋ、ＫＲ２ｉシステム、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）により除去した。
最初に天然のＵｒｉ－ＥＫ上のアミンをマレイミド－ＮＨＳ二官能性架橋剤（Ｎ－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、ＡＭＡＳ）により活性化した。アミン基に対して２当量のＡＭＡＳ架橋剤をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍＬ）に溶かし、Ｕｒｉ－ＥＫ溶液（ＰＢＳ緩衝液中２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４）に滴下して加えた。３０分撹拌した後、反応混合物をタンパク質濃縮管（ＭＷカットオフ：３０ｋＤａ）中で新鮮なＭＯＰＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に対して５回超遠心分離して未反応のＡＭＡＳ及びあらゆる可能な小分子不純物を除去した。活性化されたＡｓｐ－ＥＫコンジュゲート及びＰＥＧ－ＳＨ（Ｍｗ５ｋ）ストック溶液を合わせ、４℃で４時間撹拌し続けた。過剰のポリマー及び未反応のタンパク質を透析ろ過（Ｍｗカットオフ：１００ｋ、ＫＲ２ｉシステム、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）により除去した。
【0123】
実施例４
ポリマーでバックフィルされた代表的なバイオコンジュゲート：ＰＣＢ－ＯＰＨの調製及び特徴付け
この実施例では、ポリマーでバックフィルされた代表的なバイオコンジュゲートであるＰＣＢ－ＯＰＨの調製及び特徴付けについて記載する。
ポリマーでバックフィルされた代表的なバイオコンジュゲート：ＰＣＢ－ＯＰＨの調製及び特徴付け
この実施例では、ポリマーでバックフィルされた代表的なバイオコンジュゲートであるＰＣＢ－ＯＰＨの調製及び特徴付けについて記載する。
【0124】
この実施例では、有機リン加水分解酵素（ＯＰＨ）を変性し、ポリマーでバックフィルされた代表的なバイオコンジュゲートであるＰＣＢ－ＯＰＨが提供される。ＯＰＨは大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）内で発現後、二量体構造を示す。ポリマーで修飾することができる水が近づくことが可能なリジンがモノマー当たり４つだけある。ＰＥＧ化のような一般的なポリマー結合技術は、結合部位不足のため充分な立体保護をＯＰＨに提供することができない。限定されているリジンは別として、たくさんのグルタミン酸及びアスパラギン酸がＯＰＨ表面上に均一に分布しており、より多くの結合部位を提供して高いポリマー密度を達成する。結合は図８に示されている２つの主要な工程を含んでいる。
【0125】
ＰＣＢ－ＳＨポリマーの調製
４０ｇのアミン基で終止したＰＣＢポリマー（ＰＣＢ－ＮＨ２）をトラウト試薬（５００ｍｇ）により活性化してＰＣＢ－ＳＨを得た。２つの反応物質を５００ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液中で１時間撹拌し続けた。結合工程の直前にオペレーション緩衝液としてＨＥＰＥＳを用いた脱塩カラムにより未反応のトラウト試薬を除去した。ＨＥＰＥＳ中１００ｍｇ／ｍＬのポリマー溶液ストックを直接次の工程に使用した。
４０ｇのアミン基で終止したＰＣＢポリマー（ＰＣＢ－ＮＨ２）をトラウト試薬（５００ｍｇ）により活性化してＰＣＢ－ＳＨを得た。２つの反応物質を５００ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液中で１時間撹拌し続けた。結合工程の直前にオペレーション緩衝液としてＨＥＰＥＳを用いた脱塩カラムにより未反応のトラウト試薬を除去した。ＨＥＰＥＳ中１００ｍｇ／ｍＬのポリマー溶液ストックを直接次の工程に使用した。
【0126】
マレイミド－ＮＨＳ架橋剤（Ｎ－α－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、ＡＭＡＳ）によるＯＰＨの活性化
ＯＰＨ（１ｇ）をＨＥＰＥＳ（２００ｍＬ）に４℃で溶かし、架橋剤ＡＭＡＳ（１５０ｍｇ、ジメチルスルホキシド中２０ｍｇ／ｍＬ）と合わせた。溶液を４℃で１時間撹拌し続け、オペレーション緩衝液としてＨＥＰＥＳを用いた脱塩カラムにより未反応のＡＭＡＳを除去した。タンパク質溶液を限外ろ過により２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
ＯＰＨ（１ｇ）をＨＥＰＥＳ（２００ｍＬ）に４℃で溶かし、架橋剤ＡＭＡＳ（１５０ｍｇ、ジメチルスルホキシド中２０ｍｇ／ｍＬ）と合わせた。溶液を４℃で１時間撹拌し続け、オペレーション緩衝液としてＨＥＰＥＳを用いた脱塩カラムにより未反応のＡＭＡＳを除去した。タンパク質溶液を限外ろ過により２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【0127】
ＰＣＢ－ＯＰＨコンジュゲートの調製及び精製プロセス
ＯＰＨ及びＰＣＢ－ＳＨストック溶液を合わせ、４℃で４時間撹拌し続けた。過剰のポリマー及び未反応のタンパク質を透析ろ過（Ｍｗカットオフ：１００ｋ、ＫＲ２ｉシステム、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）により除去した。次いでリジンで修飾したＰＣＢ－ＯＰＨ（２０ｋ－ＯＰＨ）を直接次のバックフィル工程に使用した。
ＯＰＨ及びＰＣＢ－ＳＨストック溶液を合わせ、４℃で４時間撹拌し続けた。過剰のポリマー及び未反応のタンパク質を透析ろ過（Ｍｗカットオフ：１００ｋ、ＫＲ２ｉシステム、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）により除去した。次いでリジンで修飾したＰＣＢ－ＯＰＨ（２０ｋ－ＯＰＨ）を直接次のバックフィル工程に使用した。
【0128】
ＰＣＢ－ＯＰＨコンジュゲートのカルボキシ基上のＰＣＢバックフィル
１ｇの２０ｋ－ＯＰＨ、４０ｇのＰＣＢ－ＮＨ２ポリマー及び２ｇのスルホ－ＮＨＳを５００ｍＬのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶かした。２０ｍＬのＭＯＰＳ緩衝液中２ｇのＥＤＣをタンパク質溶液に加えた。室温で４時間撹拌した後、混合した溶液を４℃で２４時間更に撹拌した。過剰のポリマー及び小分子不純物を透析ろ過（Ｍｗカットオフ：１００ｋ、ＫＲ２ｉシステム、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）により除去した。バックフィル後、ＰＣＢ－ＯＰＨの流体力学的サイズは顕著に増大したが、これはＰＣＢ密度の増大を示す。
１ｇの２０ｋ－ＯＰＨ、４０ｇのＰＣＢ－ＮＨ２ポリマー及び２ｇのスルホ－ＮＨＳを５００ｍＬのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶かした。２０ｍＬのＭＯＰＳ緩衝液中２ｇのＥＤＣをタンパク質溶液に加えた。室温で４時間撹拌した後、混合した溶液を４℃で２４時間更に撹拌した。過剰のポリマー及び小分子不純物を透析ろ過（Ｍｗカットオフ：１００ｋ、ＫＲ２ｉシステム、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）により除去した。バックフィル後、ＰＣＢ－ＯＰＨの流体力学的サイズは顕著に増大したが、これはＰＣＢ密度の増大を示す。
【0129】
図９は、天然及びＰＣＢ変性ＯＰＨ調合物のＳＥＣ曲線を比較して示す。
ＯＰＨコンジュゲート調合物のインビボ薬物動態及び免疫原性研究
全ての動物実験は連邦政府ガイドラインに遵守しており、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認された。動物を各々の研究の初めに処置群にランダム化し、１群当たり６匹の動物のサンプルサイズを使用した。ＳＤラット（雌、体重２００～２２５ｇ）はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓから購入した。第１及び第２投薬量のＯＰＨ調合物をそれぞれ１日及び１５日に静脈内注射した。血液を収集し、ＰＫプロフィールを分析した。二回の刺激投与の後、血清を２８日及び３５日に採取してＩｇＭ及びＩｇＧレベルを得た。
ＯＰＨコンジュゲート調合物のインビボ薬物動態及び免疫原性研究
全ての動物実験は連邦政府ガイドラインに遵守しており、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認された。動物を各々の研究の初めに処置群にランダム化し、１群当たり６匹の動物のサンプルサイズを使用した。ＳＤラット（雌、体重２００～２２５ｇ）はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓから購入した。第１及び第２投薬量のＯＰＨ調合物をそれぞれ１日及び１５日に静脈内注射した。血液を収集し、ＰＫプロフィールを分析した。二回の刺激投与の後、血清を２８日及び３５日に採取してＩｇＭ及びＩｇＧレベルを得た。
【0130】
遊離のＯＰＨは第１の注射後迅速なクリアランスを示した。ポリマー保護不足のＯＰＨ自体は、その大きさは腎臓のカットオフ限界より大きいにも関わらず長い循環時間を維持することができなかった。第２の投薬はＡＢＣ現象を示したが、これは抗ＯＰＨ抗体の生成によるものである。低いＰＣＢ被覆ＯＰＨに関して、それは天然のＯＰＨと比較して顕著により長い循環時間を示したが、第２の注射後にＡＢＣ現象も起こった。バックフィルされたＰＣＢ－ＯＰＨコンジュゲートは第１の用量の秀でた循環時間及び変化しない第２の用量ＰＫプロフィールを示した。バックフィル技術による増大したＰＣＢ密度はインビボ薬物挙動で重要な役割を果たした。
【0131】
図１０Ａ－１０Ｃは、遊離のＯＰＨ（１０Ａ）、バックフィルなしのＰＣＢ－ＯＰＨ（１０Ｂ）、及びバックフィル付ＰＣＢ－ＯＰＨ（１０Ｃ）のＰＫプロフィールを比較して示す。
【0132】
ＩｇＧ及びＩｇＭ試験のための間接ＥＬＩＳＡアッセイをそれぞれ図１１Ａ及び１１Ｂに示す。バックフィルされたＰＣＢ－ＯＰＨで処置したラット群における抗ＯＰＨＩｇＭ及びＩｇＧ力価は天然のＯＰＨ又はバックフィルされてないＰＣＢ－ＯＰＨで処置した群よりずっと低かったが、これは免疫原性の発症がポリマーバックフィル技術により十分に遮蔽されたことを立証した。
【0133】
実施例５
ＰＣＢバックフィル付二重層ＯＰＨ－ＥＫ－ＰＣＢコンジュゲートの高いポリマー密度
（ＥＫ）１０－Ｃポリペプチドの合成及び特徴付け
（ＥＫ）１０－ＣはＦｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によりＬｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ自動マイクロウェーブ支援ペプチド合成機（ＣＥＭ）で合成した。配列合成スケールはＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上２．５ｍｍｏｌに設定した（０．６ｍｅｑ／ｇ置換）。脱保護は２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液中マシンデフォルトマイクロ波条件で行った。カップリング反応は５倍モル過剰の試薬［０．２Ｍアミノ酸溶液（ＤＭＦ中）並びに０．５ＭのＤＩＣ（ＤＭＦ中）及び１．０ＭＯｘｙｍａ（ＤＭＦ中）］の存在下でＣＥＭにより提供された２．５ｍｍｏｌカップリングサイクル法を用いることにより行った。開裂は２０ｍｌのカクテル（ＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／ＥＤＴ；８２．５／５／５／５／２．５）を用いて１８０分室温で行った。開裂後、（ＥＫ）１０－Ｃ－ＮＨ２を沈降させ、氷冷無水エチルエーテルで洗浄した。Ｅｃｏｎｏ－Ｐａｃ １０ＤＧ脱塩カラムを使用して生成物の純度を更に高めた。
ＰＣＢバックフィル付二重層ＯＰＨ－ＥＫ－ＰＣＢコンジュゲートの高いポリマー密度
（ＥＫ）１０－Ｃポリペプチドの合成及び特徴付け
（ＥＫ）１０－ＣはＦｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によりＬｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ自動マイクロウェーブ支援ペプチド合成機（ＣＥＭ）で合成した。配列合成スケールはＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上２．５ｍｍｏｌに設定した（０．６ｍｅｑ／ｇ置換）。脱保護は２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液中マシンデフォルトマイクロ波条件で行った。カップリング反応は５倍モル過剰の試薬［０．２Ｍアミノ酸溶液（ＤＭＦ中）並びに０．５ＭのＤＩＣ（ＤＭＦ中）及び１．０ＭＯｘｙｍａ（ＤＭＦ中）］の存在下でＣＥＭにより提供された２．５ｍｍｏｌカップリングサイクル法を用いることにより行った。開裂は２０ｍｌのカクテル（ＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／ＥＤＴ；８２．５／５／５／５／２．５）を用いて１８０分室温で行った。開裂後、（ＥＫ）１０－Ｃ－ＮＨ２を沈降させ、氷冷無水エチルエーテルで洗浄した。Ｅｃｏｎｏ－Ｐａｃ １０ＤＧ脱塩カラムを使用して生成物の純度を更に高めた。
【0134】
ＰＣＢ－ＳＨポリマーの調製
４０ｇのアミン基で終止したＰＣＢポリマー（ＰＣＢ－ＮＨ２）をトラウト試薬（５００ｍｇ）により活性化してＰＣＢ－ＳＨを得た。２つの反応物質を５００ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液中で１時間撹拌し続けた。結合工程の直前にＨＥＰＥＳをオペレーション緩衝液とした脱塩カラムにより未反応のトラウト試薬を除去した。ＨＥＰＥＳ中１００ｍｇ／ｍＬのポリマー溶液ストックを直接次の工程に使用した。
４０ｇのアミン基で終止したＰＣＢポリマー（ＰＣＢ－ＮＨ２）をトラウト試薬（５００ｍｇ）により活性化してＰＣＢ－ＳＨを得た。２つの反応物質を５００ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液中で１時間撹拌し続けた。結合工程の直前にＨＥＰＥＳをオペレーション緩衝液とした脱塩カラムにより未反応のトラウト試薬を除去した。ＨＥＰＥＳ中１００ｍｇ／ｍＬのポリマー溶液ストックを直接次の工程に使用した。
【0135】
ＯＰＨ－ＥＫコンジュゲートの調製
最初に天然のＯＰＨ上のアミンをマレイミド－ＮＨＳ二官能性架橋剤（Ｎ－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、ＡＭＡＳ）により活性化した。アミン基に対して２当量のＡＭＡＳ架橋剤をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍＬ）に溶かし、ＯＰＨ溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝液中２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２）に滴下して加えた。３０分撹拌した後、反応混合物をタンパク質濃縮管（ＭＷカットオフ：３０ｋＤａ）中で新鮮なＨＥＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．２）に対して５回超遠心分離して未反応のＡＭＡＳ及びあらゆる可能な小分子不純物を除去した。次いでＡＭＡＳで活性化されたＯＰＨを含有する残留溶液を（ＥＫ）１０－Ｃストック溶液（ＯＰＨに対して１０質量倍過剰、ＨＥＰＥＳ緩衝液中）と合わせてＥＫ層変性を開始させた。結合反応を一晩４℃で維持し、同じ超遠心分離工程を実行して過剰のＥＫペプチドを除去した。精製したＯＰＨ－ＥＫコンジュゲートを次の結合工程のために２ｍｇ／ｍｌで４℃の冷蔵庫に保存した。
最初に天然のＯＰＨ上のアミンをマレイミド－ＮＨＳ二官能性架橋剤（Ｎ－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、ＡＭＡＳ）により活性化した。アミン基に対して２当量のＡＭＡＳ架橋剤をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍＬ）に溶かし、ＯＰＨ溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝液中２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２）に滴下して加えた。３０分撹拌した後、反応混合物をタンパク質濃縮管（ＭＷカットオフ：３０ｋＤａ）中で新鮮なＨＥＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．２）に対して５回超遠心分離して未反応のＡＭＡＳ及びあらゆる可能な小分子不純物を除去した。次いでＡＭＡＳで活性化されたＯＰＨを含有する残留溶液を（ＥＫ）１０－Ｃストック溶液（ＯＰＨに対して１０質量倍過剰、ＨＥＰＥＳ緩衝液中）と合わせてＥＫ層変性を開始させた。結合反応を一晩４℃で維持し、同じ超遠心分離工程を実行して過剰のＥＫペプチドを除去した。精製したＯＰＨ－ＥＫコンジュゲートを次の結合工程のために２ｍｇ／ｍｌで４℃の冷蔵庫に保存した。
【0136】
ＯＰＨ－ＥＫ－ＰＣＢコンジュゲートの調製
最初に天然のＯＰＨ－ＥＫ上のアミンをマレイミド－ＮＨＳ二官能性架橋剤（Ｎ－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、ＡＭＡＳ）により活性化した。アミン基に対して２当量のＡＭＡＳ架橋剤をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍＬ）に溶かし、ＯＰＨ－ＥＫ溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝液中２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）に滴下して加えた。３０分撹拌した後、反応混合物をタンパク質濃縮管（ＭＷカットオフ：３０ｋＤａ）中で新鮮なＨＥＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．２）に対して５回超遠心分離して未反応のＡＭＡＳ及びあらゆる可能な小分子不純物を除去した。活性化されたＯＰＨ－ＥＫコンジュゲート及びＰＣＢ－ＳＨストック溶液を合わせ、４℃で４時間撹拌し続けた。過剰のポリマー及び未反応のタンパク質を透析ろ過（Ｍｗカットオフ：１００ｋ、ＫＲ２ｉシステム、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）により除去した。
最初に天然のＯＰＨ－ＥＫ上のアミンをマレイミド－ＮＨＳ二官能性架橋剤（Ｎ－マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、ＡＭＡＳ）により活性化した。アミン基に対して２当量のＡＭＡＳ架橋剤をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍＬ）に溶かし、ＯＰＨ－ＥＫ溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝液中２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）に滴下して加えた。３０分撹拌した後、反応混合物をタンパク質濃縮管（ＭＷカットオフ：３０ｋＤａ）中で新鮮なＨＥＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．２）に対して５回超遠心分離して未反応のＡＭＡＳ及びあらゆる可能な小分子不純物を除去した。活性化されたＯＰＨ－ＥＫコンジュゲート及びＰＣＢ－ＳＨストック溶液を合わせ、４℃で４時間撹拌し続けた。過剰のポリマー及び未反応のタンパク質を透析ろ過（Ｍｗカットオフ：１００ｋ、ＫＲ２ｉシステム、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）により除去した。
【0137】
ＰＣＢ－ＯＰＨコンジュゲートのカルボキシル基上のＰＣＢバックフィル
１ｇのＯＰＨ－ＥＫ－ＰＣＢ、４０ｇのＰＣＢ－ＮＨ２ポリマー及び２ｇのスルホ－ＮＨＳを５００ｍＬのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶かした。２０ｍＬのＭＯＰＳ緩衝液中２ｇのＥＤＣをタンパク質溶液に加えた。室温で４時間撹拌した後、混合した溶液を更に４℃で２４時間撹拌した。過剰のポリマー及び小分子不純物を透析ろ過（Ｍｗカットオフ：１００ｋ、ＫＲ２ｉシステム、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）により除去した。
１ｇのＯＰＨ－ＥＫ－ＰＣＢ、４０ｇのＰＣＢ－ＮＨ２ポリマー及び２ｇのスルホ－ＮＨＳを５００ｍＬのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶かした。２０ｍＬのＭＯＰＳ緩衝液中２ｇのＥＤＣをタンパク質溶液に加えた。室温で４時間撹拌した後、混合した溶液を更に４℃で２４時間撹拌した。過剰のポリマー及び小分子不純物を透析ろ過（Ｍｗカットオフ：１００ｋ、ＫＲ２ｉシステム、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）により除去した。
【0138】
図１２に示されているように、各結合工程でＯＰＨ調合物の大きさが増大した。二重層ＯＰＨ－ＥＫ－ＰＣＢコンジュゲートプラスＰＣＢバックフィル材は最も高いポリマー被覆を達成したが、これは多層及びバックフィル方法の組合せがポリマー密度を顕著に増大したことを示している。
【0139】
説明のための実施形態を例示し記載して来たが、本発明の思想及び範囲から逸脱することなく様々な変更をなすことができるということが理解される。
【0140】
排他的独占権が主張される本発明の実施形態は以下に定義されている。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【国際調査報告】