知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-14
(54)【発明の名称】ＮＭＤＡ受容体媒介毒性を調節するための新規の方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20220106BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20220106BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20220106BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20220106BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20220106BHJP
A61P 25/24 20060101ALI20220106BHJP
A61P 25/04 20060101ALI20220106BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220106BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20220106BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220106BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20220106BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20220106BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20220106BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20220106BHJP
A61P 33/00 20060101ALI20220106BHJP
A61P 33/02 20060101ALI20220106BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220106BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/40 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/454 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220106BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220106BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/137 20060101ALI20220106BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C07K14/705 ZNA
A61K38/16
A61P25/28
A61P25/14
A61P25/24
A61P25/04
A61P29/00
A61P37/06
A61P43/00 111
A61P25/08
A61P27/02
A61P27/06
A61P31/12
A61P33/00
A61P33/02
A61P35/00
A61P3/10
A61K31/40
A61K31/454
A61K31/7088
A61K48/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K31/137
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021521010
(86)(22)【出願日】2019-10-18
(85)【翻訳文提出日】2021-06-03
(86)【国際出願番号】 EP2019078415
(87)【国際公開番号】W WO2020079244
(87)【国際公開日】2020-04-23
(31)【優先権主張番号】PCT/EP2018/078577
(32)【優先日】2018-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】PCT/EP2019/060890
(32)【優先日】2019-04-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521154730
【氏名又は名称】ファンダメンタル ファーマ ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】110003063
【氏名又は名称】特許業務法人牛木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】バディング，ヒルマー
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，ジング
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
4C206
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084NA14
4C084ZA02
4C084ZA06
4C084ZA08
4C084ZA12
4C084ZA15
4C084ZA16
4C084ZA33
4C084ZA36
4C084ZA96
4C084ZB11
4C084ZB33
4C084ZB37
4C084ZB38
4C084ZC02
4C084ZC35
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085CC23
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC07
4C086BC21
4C086BC39
4C086EA16
4C086GA07
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZA06
4C086ZA08
4C086ZA12
4C086ZA15
4C086ZA16
4C086ZA33
4C086ZA96
4C086ZB11
4C086ZB33
4C086ZB37
4C086ZB38
4C086ZC02
4C086ZC35
4C206AA01
4C206AA02
4C206FA08
4C206MA01
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZA02
4C206ZA06
4C206ZA08
4C206ZA12
4C206ZA15
4C206ZA16
4C206ZA33
4C206ZA96
4C206ZB11
4C206ZB33
4C206ZB37
4C206ZB38
4C206ZC02
4C206ZC35
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA21
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、神経変性過程およびそれに対する保護を提供する手段の分野に関する。特に、本発明は、ＮＭＤＡ受容体媒介神経毒性を妨害することができる、一過性受容体ポテンシャルメラスタチンサブファミリーメンバー４（ＴＲＰＭ４）のＮ末端ドメインと相互作用するポリペプチド、融合タンパク質、および他の化合物に関する。本発明はまた、前述のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸、それらを含む組成物、およびヒトまたは動物の身体の疾患を治療または予防する方法、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側方硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、または脳卒中（ＨＤ）などの疾患を治療する方法における、前記ポリペプチド、融合タンパク質、および他の化合物の使用に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリペプチドであって、i）配列番号３によるアミノ酸配列であって、前記ポリペプチドが最大６８５アミノ酸長、好ましくは最大２００アミノ酸長であるアミノ酸配列、
ii）配列番号３の誘導体アミノ酸配列であって、前記誘導体アミノ酸配列が配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有し、前記ポリペプチドが最大２００アミノ酸長であるアミノ酸配列、または
iii）配列番号４によるアミノ酸配列であって、前記ポリペプチドが最大３５０アミノ酸長、好ましくは最大２００アミノ酸長であるアミノ酸配列
を含むポリペプチド。
【請求項2】
請求項１の前記ポリペプチドと、それぞれ、i）、ii）またはiii）の前記アミノ酸配列とは異種の少なくとも１つのさらなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質。
【請求項3】
前記異種ポリペプチド配列が膜アンカーポリペプチド、タンパク質伝達ドメインおよびタグからなる群のうちの１つまたは複数から選択される、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
配列番号３による前記アミノ酸配列の前記誘導体アミノ酸配列がi）配列番号３と少なくとも８０%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
ii）配列番号４、特に配列番号５のコンセンサス配列と一致する配列
であり、ただし、前記誘導体は配列番号３ではない、請求項１に記載のポリペプチドあるいは請求項２または請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
請求項１および４のいずれかに記載のポリペプチドをコードし、または請求項２、３および４のいずれかに記載の前記融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項6】
請求項１および４のいずれかに記載のポリペプチド、請求項２、３および４のいずれかに記載の融合タンパク質、および／または請求項５に記載の核酸を含み、さらに薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物。
【請求項7】
請求項１または４に記載の前記ポリペプチドを含むナノ粒子、請求項２、３および４のいずれかに記載の前記融合タンパク質、および／または請求項５に記載の前記核酸を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
ヒトまたは動物の身体の疾患を治療または予防する方法に使用するための化合物であって、以下からなる群から選択される化合物：i）請求項１および４のいずれかに記載のポリペプチド、
ii）配列番号３またはその誘導体に結合するポリペプチドであって、i）配列番号３と少なくとも８０%の配列同一性を有する配列、またはii）配列番号４による配列であって、前記ポリペプチドは抗体またはアンチカリンであるポリペプチド、
iii）請求項２および３のいずれかに記載の融合タンパク質、
iv）請求項５に記載の核酸、
v）次の式による化合物
【化1】
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、アルキル（Ｃ≦１２）、および置換アルキル（Ｃ≦１２）から選択され、そして
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、およびハロゲンから選択され、または
その薬学的に許容される塩、溶媒和物、多形体、互変異性体、ラセミ体、または鏡像異性体、および
vi）以下からなる化合物の群から選択される化合物
【化2】
【請求項9】
ヒトまたは動物の身体の疾患を治療または予防する方法に使用するための化合物であって、ＮＭＤＡ受容体／ＴＲＰＭ４複合体形成の阻害剤である化合物。
【請求項10】
請求項９に記載の使用のための化合物であって、以下からなる群から選択される化合物：i）請求項１および４のいずれかに記載のポリペプチド、
ii）配列番号３またはその誘導体に結合するポリペプチドであって、i）配列番号３と少なくとも８０%の配列同一性を有する配列、またはii）配列番号４による配列であって、前記ポリペプチドは抗体またはアンチカリンであるポリペプチド、
iii）請求項２および３のいずれかに記載の融合タンパク質、
iv）請求項５に記載の核酸、
v）次の式による化合物
【化3】
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、アルキル（Ｃ≦１２）、および置換アルキル（Ｃ≦１２）から選択され、そして
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、およびハロゲンから選択され、または
その薬学的に許容される塩、溶媒和物、多形体、互変異性体、ラセミ体、または鏡像異性体、および
vi）以下からなる化合物の群から選択される化合物
【化4】
【請求項11】
請求項８または請求項９の使用のための化合物であって、以下からなる群から選択される化合物：【化5】
【請求項12】
前記疾患が神経疾患、特に神経変性疾患である、請求項８または請求項９の使用のための化合物。
【請求項13】
前記疾患が脳卒中、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側方硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、外傷性脳損傷、多発性硬化症、グルタミン酸誘発興奮毒性、ジストニア、てんかん、視神経疾患、糖尿病性網膜症、緑内障、痛み、特に神経障害性疼痛、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎、ウイルス性脳症、血管性認知症、微小血管障害、ビンスワンガー病、脳虚血、低酸素症およびパーキンソン病、統合失調症、うつ病、脳マラリア、トキソプラズマ症関連脳損傷、ＨＩＶ感染症関連脳損傷、ジカウイルス感染に関連する脳損傷および脳腫瘍からなる群から選択される、請求項８、９、１０、１１または１２のいずれかの使用のための化合物。
【請求項14】
前記化合物がナノ粒子に含まれる、請求項８から１３のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項15】
配列番号３またはその誘導体によるアミノ酸配列を含む、または配列番号３またはその誘導体によるアミノ酸配列からなる、ポリペプチドの使用であって、前記誘導体は、i）配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、またはii）インビトロのタンパク質タンパク質相互作用アッセイにおける配列番号４による配列である、使用。
【請求項16】
配列番号３によるアミノ酸配列またはその誘導体を含む、または配列番号３によるアミノ酸配列またはその誘導体からなる、ＴＲＰＭ４タンパク質と潜在的に相互作用する化合物を同定する方法であって、前記誘導体は、i）配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、またはii）配列番号４による配列であり、i）配列番号３によるアミノ酸配列、または前記配列の誘導体へ候補化合物をコンピューター支援仮想ドッキングすることであって、前記誘導体はi）配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、またはii）配列番号４による配列であって、前記アミノ酸配列が前記アミノ酸配列を含むポリペプチドの仮想３Ｄ構造で提供され、および
ii）配列番号３によるアミノ酸配列またはその誘導体へ前記候補化合物を仮想的にドッキングするためのドッキングスコアおよび／または内部ひずみを決定すること、および任意選択で
iii）前記候補化合物がＴＲＰＭ４タンパク質の活性を調節するかどうかを決定するために候補化合物をＴＲＰＭ４タンパク質とインビトロまたはインビボで接触させること
を備えた方法。
【請求項17】
細胞、特に非神経細胞であって、前記細胞が組換えＮＭＤＡ受容体を発現し、前記細胞におけるＴＲＰＭ４の発現が存在しないかノックダウンまたはノックアウトされている細胞。
【請求項18】
ヒトまたは動物の身体の疾患を治療または予防する方法に使用するためのＴＲＰＭ４の阻害剤であって、前記疾患がＮＭＤＡ受容体媒介興奮毒性によって引き起こされる阻害剤。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、神経変性プロセスとそれに対する保護を提供するための方法の分野に関する。特に、本発明は、一過性受容体電位メラスタチンサブファミリーメンバー４（ＴＲＰＭ４）のＮ末端ドメインと相互作用し、ＮＭＤＡ受容体媒介神経毒性を妨害することができる、ポリペプチド、融合タンパク質、およびその他の化合物に関する。本発明はまた、前述のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸、それらを含む組成物、および、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）または脳卒中などの、ヒトまたは動物の身体の疾患を治療または予防するための方法における、前記ポリペプチド、融合タンパク質、およびその他の化合物の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
神経変性疾患は、ニューロンの構造または機能の進行性の喪失およびニューロンの最終的な死を伴う壊滅的な疾患である。神経変性は急性のものとゆっくり進行するものがあるが、どちらのタイプの神経変性も、細胞外グルタメート濃度の上昇またはＮＭＤＡ受容体のシナプス外部位への再局在化によって引き起こされる、シナプス外ＮＭＤＡ受容体による死のシグナル伝達の増加を伴うことがよくある。ＮＭＤＡ受容体は、カルシウムを透過するグルタメートおよび電位依存性イオンチャネルである。それらは、細胞内の位置によって、シナプスおよびシナプス外のＮＭＤＡ受容体として分類することができる。シナプス接触の内外の受容体のサブユニット組成は類似しているが、一般的なグルタミン酸イオノトロピック受容体ＮＭＤＡタイプサブユニット１（ＧＲＩＮ１）サブユニットを運ぶことに加えて、シナプス外ＮＭＤＡ受容体は優先的にＧＲＩＮ２Ｂサブユニットを含むが、ＧＲＩＮ２ＡはシナプスＮＭＤＡ受容体の主要なサブユニットである。シナプス対シナプス外ＮＭＤＡ受容体刺激の細胞への影響は劇的に異なる。シナプスＮＭＤＡ受容体は、シナプス伝達の有効性の生理学的変化を引き起こす。それらはまた、細胞核へのカルシウムシグナル伝達経路を誘発し、事実上すべての行動適応の長期的な実施に重要な遺伝子発現応答を活性化する。最も重要なことは、核カルシウムを介して作用するシナプスＮＭＤＡ受容体は、神経構造を保護し生存を促進する遺伝子の強力な活性化因子である。対照的に、シナプス外ＮＭＤＡ受容体は細胞死経路を引き起こす。シナプス外ＮＭＤＡ受容体の活性化後数分以内に、ミトコンドリア膜電位が崩壊し、続いてミトコンドリア透過性遷移が起こる。シナプス外ＮＭＤＡ受容体はまた、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）応答性エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）シャットオフ経路をトリガーし、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）－ＭＡＰＫシグナル伝達を不活性化し、そして、クラスＩＩａヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）とアポトーシス促進性転写因子Ｆｏｘｏ３Ａの核内移行をもたらすため、励起と転写のカップリングに強く拮抗し、核カルシウム駆動型適応ゲノミクスを破壊する。これは、脳由来神経栄養因子（ｂｄｎｆ）や血管内皮成長因子Ｄ（ｖｅｇｆｄ）など、複雑な樹状突起構造とシナプス接続の維持、および神経保護シールドの構築に不可欠な、多くの遺伝子の活性調節に影響を及ぼす。さらに、活性化されたＥＲＫ１／２の到達距離が短いため、シナプス外ＮＭＤＡ受容体によるそれらの遮断は、樹状突起のｍＲＮＡ翻訳や、シナプス伝達の有効性を制御するＡＭＰＡ（α－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メチル－４－イソキサゾールプロピオン酸）受容体輸送などの、重要な局所シグナル伝達イベントを混乱させる。したがって、シナプス外ＮＭＤＡ受容体シグナル伝達は、ミトコンドリア機能障害を伴う病理学的トライアドの開始、転写の調節解除、およびニューロン構造と接続性の完全性の喪失を特徴としている。
【0003】
神経学的状態の治療にＮＭＤＡ受容体の遮断薬を使用するために、いくつかの試みがなされてきた。一般的に、臨床研究の結果は、シナプスに局在するＮＭＤＡ受容体の生理学的機能に対するブロッカーの干渉によって引き起こされる深刻な副作用のために概ね期待外れであった（Ogden and Traynelis, 2011）。注目すべき例外の１つは、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬のメマンチンである（Bormann, 1989）。メマンチンによる低用量治療の有益な効果は、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、およびＭＳの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを含む、神経変性のいくつかの動物モデルで観察されている。さらに、メマンチンは２００２年以来、ＡＤの治療のために欧州医薬品庁と米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。特定の濃度範囲のメマンチンが有毒なシナプス外ＮＭＤＡ受容体を優先的に遮断するという発見は、有毒なシナプス外ＮＭＤＡ受容体シグナル伝達を病態メカニズムとして共有する広範囲の神経変性状態においてそれが効果的である理由を説明している（Bading, J ExpMed. 2017 Mar 6;214(3):569-578）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
したがって、特にシナプス外ＮＭＤＡ受容体の毒性活性を選択的に弱める方法は、広く効果的で忍容性の高い神経保護治療法の開発に大きな可能性を秘めており、そのような新しい方法がこの技術分野で依然として必要とされている。したがって、本発明によって解決されるべき課題は、シナプス外毒性ＮＭＤＡ受容体活性を弱めるための新しい方法を提供し、それにより、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（HD）、または脳卒中のような神経変性疾患の改善された（好ましくはより選択的であるための）治療を可能にすることであった。
【0005】
この課題は、添付の特許請求の範囲と以下の説明に記載されている主題によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、シナプスＮＭＤＡシグナル伝達に有意な影響を与えることなく、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性を選択的に阻害できることを発見した。本発明に使用する化合物は、一過性受容体電位メラスタチンサブファミリーメンバー４（ＴＲＰＭ４）のＮ末端ドメインの一部を模倣するか、またはＴＲＰＭ４のＮ末端ドメインに結合および／または複合体を形成する（そして、この理論に拘束されることなく、それによってシナプス外ＮＭＤＡ受容体複合体とＴＲＰＭ４のN末端ドメインとの相互作用をブロックする）。ヒトＴＲＰＭ４の２つの異なるアイソフォームが配列番号１と配列番号２に示されている。ＮＭＤＡ受容体媒介細胞毒性に対して与えられる選択的保護は、神経細胞、特に神経変性疾患の治療と予防を可能にする。
【0007】
したがって、本発明は、第１の態様において、ヒトＴＲＰＭ４のフラグメントを含む、すなわち、配列番号３によるアミノ酸配列を含む、または配列番号３による前記配列の誘導体を含むポリペプチドに関する。ヒトＴＲＰＭ４は、細胞質ゾルのN末端ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ゾルのC末端ドメインを含む。配列番号３は、ヒトＴＲＰＭ４配列のアミノ酸６３３－６８９に対応する、ヒトＴＲＰＭ４のＮ末端ドメインのＣ末端部分である（N末端ドメインに完全に保存されている配列番号１および配列番号２のアイソフォームを参照）。本発明のポリペプチドは、配列番号３またはその誘導体のほかに、さらなるＴＲＰＭ４由来の配列、特に（例えば、ヒト）ＴＲＰＭ４の配列番号３に隣接する配列を含むものであってもよい。例えば、ポリペプチドは、（例えば、ヒト）ＴＲＰＭ４のアミノ酸３４７－６３２などの追加のＮ末端配列を含むものであってもよい。しかしながら、本発明のポリペプチドは、ＴＲＰＭ４のフラグメントを含むものとして定義されるので、本発明のポリペプチドは、全長（例えば、ヒト）ＴＲＰＭ４タンパク質の配列を含まない。本明細書で使用される場合、「ＴＲＰＭ４タンパク質」は、当業者に知られている一過性受容体電位メラスタチンサブファミリーメンバー４の全長配列を指す。例えば、配列番号１と配列番号２の２つのアイソフォームは、ヒトＴＲＰＭ４タンパク質である。この用語には、マウスなどの他の種から知られているヒトＴＲＰＭ４タンパク質のすべてのオーソログも含まれる。既知のＴＲＰＭ４配列を有する種の例は、表１の左の列にリストされている。本発明によるポリペプチドは、アイソフォームに関係なく、ヒト一過性受容体電位メラスタチンサブファミリーメンバー４（ＴＲＰＭ４）の全長アミノ酸配列を含まず、また他の種のＴＲＰＭ４オーソログの全長アミノ酸配列を含まない。好ましくは、本発明のポリペプチドはまた、（アイソフォームまたは起源の種に関係なく）ＴＲＰＭ４タンパク質の機能的フラグメントの配列を含まない。「ＴＲＰＭ４の機能的フラグメント」は、ＴＲＰＭ４の生物学的活性を保持する、すなわち、カチオンチャネルを形成してカチオンチャネルとして作用することができ、それによってＮａ+などのカチオンの流入を調節する、ＴＲＰＭ４タンパク質のフラグメントである。チャネル活性を測定する技術は、この技術分野において一般に知られており、チャネル活性は、例えば、ＴＲＰＭ４またはＴＲＰＭ４のそれぞれのフラグメントの発現ベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において容易に測定することができる。適切な技術は、例えば、Amarouch et al., Neurosci Lett. 2013 Apr 29;541:105-10に開示されている。より好ましくは、ポリペプチドは、ヒトＴＲＰＭ４タンパク質のＣ末端ドメインおよびヒトＴＲＰＭ４タンパク質の膜貫通ドメインの一方または両方を含まない。より好ましくは、ポリペプチドは、（アイソフォームに関係なく）ヒトＴＲＰＭ４タンパク質のＣ末端ドメインもヒトＴＲＰＭ４タンパク質の膜貫通ドメインも含まない。最も好ましくは、本発明のポリペプチドの任意のヒトＴＲＰＭ４由来配列は、ＴＲＰＭ４タンパク質のＮ末端ドメインのフラグメント、特にヒトＴＲＰＭ４配列のアミノ酸６３３－６８９に限定される。
【0008】
ポリペプチドはまた、配列番号３の代わりに、配列番号３の誘導体を含むものであってもよい。配列番号３による配列の誘導体の例は、配列が配列番号３ではないという条件で、配列番号４によるコンセンサス配列内にある配列である。配列番号４は、以下の表１に示すように、さまざまな哺乳動物種のＴＲＰＭ４タンパク質のＮ末端ドメインのＣ末端部分のコンセンサス配列である。
【0009】
【表1A】
【0010】
【表1B】
【0011】
【表1C】
【0012】
上記の表１から明らかなように、対象のモチーフはさまざまな哺乳類種にわたってよく保存されている。ヒトのモチーフである配列番号３は、ホモ・サピエンス、ゲラダヒヒ、ミドリザル、およびチンパンジーの間で１００％保存されている。そして、他の哺乳類の種のどれも、ヒトの配列から２０％以上逸脱していない。誘導体が別の哺乳動物種に由来する、ヒト配列番号３の誘導体を含むポリペプチドは、典型的には、対応する種を対象とする治療方法に使用される（さらに以下の本発明の第９の態様および第１０の態様も参照）。しかしながら、本発明者らは、例えば、マウスＴＲＰＭ４に由来する配列を、マウスと同様の効果でヒト細胞株ＨＥＫ２９３において使用できることを示し、哺乳動物種の境界を越えた本発明のポリペプチドの保存された機能、したがって有用性を示している。したがって、本発明の好ましい実施形態では、配列番号３の誘導体は、配列番号５である。
【0013】
ヒト配列番号３の誘導体はまた、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号９と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号１１と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列配列番号１３と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号１４と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号１５と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号１７と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号１８と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号１９と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号２０と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号２１と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号２２と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号２３と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号２４と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号２５と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号２６と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号２７と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号２８と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号２９と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号３０と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号３１と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号３２と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号３３と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号３４と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号３５と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号３６と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号３７と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号３８と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号３９と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、配列番号４０と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、および配列番号４１と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、からなる群から選択される配列であってもよい。
【0014】
本明細書で使用される場合、「％の配列同一性」という用語は、以下のように理解されなければならない。比較される２つの配列は、配列間の最大の相関関係を与えるように整列される。これには、整列の程度を高めるために、一方または両方の配列に「ギャップ」を挿入することが含まれる場合がある。次に、潜在的なギャップを含む、比較されている整列された配列の全長にわたって％の同一性を決定することができる。上記の文脈において、参照アミノ酸配列に対して少なくとも、例えば、９５％の「配列同一性」を有するアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列の配列がクエリ配列と同一であるが、ただし、クエリアミノ酸配列には、参照アミノ酸配列の１００アミノ酸ごとに最大５つのアミノ酸残基の変更（置換、削除、挿入）が含まれる場合があることを意味することを意図している。２つ以上の配列の同一性を比較するための方法は、この技術分野でよく知られている。２つの配列が同一であるパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを使用して決定できる。使用できる数学的アルゴリズムの好ましいが限定的ではない例は、Karlin et a/. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴまたはＮＢＬＡＳＴプログラム（Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410 or Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402も参照、ワールドワイドウェブサイトncbi.nlm.nih.govのＮＣＢＩのホームページからアクセス可能）、およびＦＡＳＴＡ（Pearson (1 990), Methods Enzymol. 83, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448）に統合されている。これらのプログラムにより、他の配列とある程度同一である配列を特定することができる。さらに、ウィスコンシン配列分析パッケージ、バージョン９．１（Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Res., 387-395）で利用可能なプログラム、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰのプログラムを使用して、２つのポリペプチド配列間の％同一性を決定することができる。本明細書において、参照配列に対して特定の程度の配列同一性を共有するアミノ酸配列に言及する場合、配列の前記差異は、好ましくは、保存的アミノ酸置換によるものである。好ましくは、そのような配列は、多分より高いまたはより低い程度ではあるが、参照配列の機能および活性を保持している。さらに、本明細書において、「少なくとも」特定のパーセンテージの配列同一性を共有する配列に言及する場合、１００％の配列同一性は、好ましくは包含されない。
【0015】
本明細書では、それぞれの配列番号、例えば、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列が参照される場合はいつでも、前記配列は、それぞれの参照配列番号、例えば、配列番号３と、例えば、少なくとも８１％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の配列同一性を有する場合がある。参照配列が配列番号３でない場合、誘導体はまた、それぞれの参照配列と１００％の配列同一性を有する場合がある。例えば、配列番号３の誘導体は、配列番号５と１００％の配列同一性を有する配列である場合があり、すなわち、マウスのそれぞれのＴＲＰＭ４配列である場合がある。配列番号３の誘導体、特に配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を含むか、または表１に列挙された他の種のそれぞれの配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を含む任意の配列は、突然変異、好ましくは保存的突然変異（すなわち、配列番号3の所与のアミノ酸残基を類似の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性およびサイズ）を有する異なるアミノ酸に変化させるアミノ酸置換を反映する突然変異）を含む場合がある。例えば、配列番号３の３４位および３５位の２つのフェニルアラニン残基のいずれか１つ、またはその両方は、本発明のポリペプチドの神経保護効果を無効にすることなく、チロシンで置換（すなわち、芳香族アミノ酸を別の芳香族アミノ酸へ置換）することができる。前述のように、２つのフェニルアラニンモチーフは、３５位にロイシンを有するチンチラを除いて、表１に記載されているすべての哺乳動物種全体で保存されているため、本発明者らは、他の種の対応する配列で可能な同様の突然変異を検討する。したがって、ロイシンはまた、配列番号３の３５位での許容可能なアミノ酸置換である可能性が高い。代替的に、またはさらに、誘導体は、配列番号３のＮ末端および／またはＣ末端に１つまたは複数のアミノ酸を欠いている場合がある。例えば、誘導体は、配列番号３またはその誘導体のＮ末端および／またはＣ末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２アミノ酸を欠き、好ましくは、配列番号３またはその誘導体のＮ末端および／またはＣ末端に１、２、３、４、５アミノ酸を欠いている場合がある。
【0016】
本発明のポリペプチドの実施形態は、配列番号３による配列の誘導体が、配列番号４によるコンセンサス配列内にある配列であるか、表１にリストされている種のそれぞれの配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列であり、請求の範囲のポリペプチドは、それが完全長のヒトＴＲＰＭ４配列を含まないのと同じように（上記を参照）、ヒトＴＲＰＭ４のオーソログの完全長アミノ酸配列を含まない、と理解される。同様に、隣接配列またはC末端または膜貫通ドメインなどの、ＴＲＰＭ４の他の要素の有無に関して上記で説明したことは、配列番号３による配列の誘導体が、配列番号４によるコンセンサス配列内にある配列であるか、表１にリストされている種のそれぞれの配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列であるポリペプチドにも同様に適用され、すなわち、そのような要素は存在する場合があるが、好ましくは存在しない。
【0017】
好ましくは、本発明のポリペプチドは神経保護的である。本明細書で使用される場合、化合物は、前記化合物が、有害な条件によって引き起こされる細胞死からインビトロおよびインビボの両方で保護する場合、「神経保護」である。標準的なインビトロ試験では、一次海馬または皮質ニューロンをＮＭＤＡで１０分間処理した後、２４時間後に細胞死を評価する（例えば、Zhang et al., 2011, Neurosci. 31, 4978-4990の図３ｃを参照）。標準的なインビボ試験は、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）マウス脳卒中モデルである（例えば、Zhang et al., 2011の図６を参照）。適切な対照（すなわち、生理食塩水、溶媒のみ、不活性変異体）と比較した、インビトロで測定された細胞死またはインビボでの脳損傷（梗塞体積として与えられる）の速度における統計的に関連する差異は、神経保護を示す。
【0018】
好ましくは、本発明によるポリペプチドの長さは、６８５アミノ酸長を超えない。本発明のポリペプチドは、例えば、最大で約６５０アミノ酸長、最大で約６００アミノ酸長、最大で約５００アミノ酸長、最大で約４００アミノ酸長、最大で約３５０アミノ酸長、最大で約３２５アミノ酸長、最大で約３００アミノ酸長、最大で約２５０アミノ酸長、最大で約２００アミノ酸長、最大で約１７５アミノ酸長、最大で約１５０アミノ酸長、最大で約１２５アミノ酸長、最大で約１００アミノ酸長、最大で約９０アミノ酸長、最大で約８５アミノ酸長、最大で約８０アミノ酸長、最大で約７５アミノ酸長、最大で約７０アミノ酸長、最大で約６５アミノ酸長、最大で約６０アミノ酸長である場合がある。
【0019】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様のポリペプチドに結合するポリペプチド、および／または対応する領域（すなわち、配列番号３またはその誘導体）の全長ＴＲＰＭ４に結合するポリペプチドに関する。本発明の第２の態様によるポリペプチドもまた、好ましくは神経保護的である。好ましくは、ポリペプチドは抗体またはアンチカリンである。さらにより好ましくは、この態様のポリペプチドは抗体である。好ましくは、そのような抗体はウサギ抗ＴＲＰＭ４抗体ではない。
【0020】
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様による本発明のポリペプチドと、配列番号３によるアミノ酸配列またはその誘導体とは異種の少なくとも１つのさらなる（機能的）アミノ酸配列要素とを含む融合タンパク質に関する。この文脈における「異種」は、好ましくは、少なくとも１つのさらなる配列が、配列番号３によるアミノ酸配列またはその誘導体アミノ酸配列との融合として自然界に存在しないことを意味する。結果として、得られる融合タンパク質は、天然に存在しない、人工的に作成されたポリペプチドである。より正確には、この融合から生じるアミノ酸配列は、自然界ではこの形では発生しない。少なくとも１つの異種アミノ酸配列要素は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸、または少なくとも５００以上のアミノ酸の長さである場合がある。例えば、さらなるアミノ酸配列は、膜固定部分、タンパク質形質導入ドメイン、およびタグからなる群から選択されてもよい。特に好ましい膜固定部分は、ＣａａＸボックスモチーフ（プレニル化用）、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナルアンカー配列（配列番号５７）、およびＫ－Ｒａｓ４Ｂ（Ｒａｓ）タンパク質のＣ末端ターゲティングシグナル（配列番号５８）からなる群から選択される。ＣａａＸボックスモチーフに関して、Ｃはプレニル化されたシステイン、ａは任意の脂肪族アミノ酸であり、Ｘの同一性によってどの酵素がタンパク質に作用するかが決まる。ファルネシルトランスフェラーゼは、Ｘ＝Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ａ、またはＣのＣａａＸボックスを認識するが、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼＩは、Ｘ＝ＬまたはＥのＣａａＸボックスを認識する。好ましいタンパク質導入ドメインは、配列番号４２によるＴＡＴタンパク質である。好ましいタグは、ＨＡタグ（配列番号４３）またはＧＦＰなどの蛍光タンパク質タグである。本発明の第３の態様による融合タンパク質もまた、好ましくは神経保護的である。
【0021】
第４の態様において、本発明は、本発明の第１の態様、第２の態様による、および／または本発明の第３の態様の１つまたは複数の融合タンパク質による、１つまたは複数の本発明のポリペプチドをコードする核酸に関する。本発明の核酸は、核酸について考えられるすべての形態をとることができる。特に、本発明による核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらのハイブリッドであってもよい。それらは一本鎖または二本鎖であってもよい。それらは、小さな転写物のサイズ、またはウイルスゲノムなどのゲノム全体のサイズを持っている場合がある。本明細書で使用される場合、１つまたは複数の本発明のポリペプチドをコードする本発明の核酸は、センス鎖を反映する核酸である場合がある。同様に、アンチセンス鎖も含まれる。核酸は、ウイルスプロモーターまたは細菌プロモーターなどの、本発明のポリペプチドの発現のための異種プロモーターを含む場合がある。本発明による核酸は、全長ＴＲＰＭ４遺伝子をコードすることができず、好ましくは、ＴＲＰＭ４の膜貫通ドメインおよび／またはＣ末端ドメインの配列もコードしないことが理解される。
【0022】
第５の態様において、本発明は、本発明による核酸を含むベクターに関する。そのようなベクターは、例えば、本発明のポリペプチドの発現を可能にする発現ベクターであってもよい。そのようなベクターは、例えば、ウイルス発現ベクターであってもよい。前記発現は、構成的または誘導的であってもよい。ベクターはまた、クローニング目的のための本発明の核酸の配列を含むクローニングベクターであってもよい。
【0023】
第６の態様において、本発明は、本発明によるポリペプチド、融合タンパク質、核酸、および／またはベクターを含む（好ましくは単離された）細胞に関する。細胞は、特に、細菌細胞および酵母細胞（例えば、生産目的のために）ならびに哺乳動物細胞（例えば、治療目的のために、しかしおそらく生産目的のためにも）からなる群から選択されてもよい。
【0024】
第７の態様において、本発明は、本発明によるポリペプチド、融合タンパク質、核酸、ベクターおよび／または細胞を含む非ヒト動物、特に非ヒト哺乳動物に関する。そのような動物は、例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、サル、ウマ、ハムスター、モルモット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギなどからなる群から選択されてもよい。それぞれのポリペプチドを適切に発現させることができれば、そのような動物は、ＮＭＤＡ受容体によって誘発される細胞毒性からよりよく保護され、そのような核酸のない対照物よりも神経学的合併症によく耐えることができる。さらに、そのような動物は、シナプス外毒性ＮＭＤＡ受容体シグナル伝達に関与するメカニズムをより詳細に研究するためにも使用できる。
【0025】
第８の態様において、本発明は、本発明によるポリペプチド、融合タンパク質、核酸、ベクターおよび／または細胞を含み、さらに薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物に関する。好ましい実施形態では、組成物は、本発明による、前記ポリペプチド、融合タンパク質、核酸、ベクター、および／または細胞を含むナノ粒子を含む。ナノ粒子は、前記ポリペプチド、融合タンパク質、核酸、ベクター、および／または細胞を経時的に放出するように設計することができる。
【0026】
第９の態様において、本発明は、人体または動物の体の疾患を治療または予防する方法で使用するための化合物に関し、化合物は、以下からなる群から選択される。
i）本発明の第１の態様によるポリペプチド
ii）本発明の第２の態様によるポリペプチド
iii）本発明の第３の態様による融合タンパク質
iv）本発明の第４の態様による核酸
v）本発明の第１の態様で定義された配列番号３またはその誘導体に結合する非ポリペプチド化合物
vi）本発明の第８の態様による組成物
vii）一般式Ｉの化合物
i）本発明の第１の態様によるポリペプチド
ii）本発明の第２の態様によるポリペプチド
iii）本発明の第３の態様による融合タンパク質
iv）本発明の第４の態様による核酸
v）本発明の第１の態様で定義された配列番号３またはその誘導体に結合する非ポリペプチド化合物
vi）本発明の第８の態様による組成物
vii）一般式Ｉの化合物
【0027】
【化1】
【0028】
ここで、Ｒ１とＲ２はそれぞれ、水素、アルキル（Ｃ≦１２）、および置換アルキル（Ｃ≦１２）から独立して選択され、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ、水素、ヒドロキシ、およびハロゲンから独立して選択され、
または、それらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、多形体、互変異性体、ラセミ体、または鏡像異性体
viii）以下からなる化合物の群から選択される化合物、および、これらの化合物のいずれかの薬学的に許容される塩、溶媒和物、多形体、互変異性体、ラセミ体または鏡像異性体
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ、水素、ヒドロキシ、およびハロゲンから独立して選択され、
または、それらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、多形体、互変異性体、ラセミ体、または鏡像異性体
viii）以下からなる化合物の群から選択される化合物、および、これらの化合物のいずれかの薬学的に許容される塩、溶媒和物、多形体、互変異性体、ラセミ体または鏡像異性体
【0029】
【化2】
【0030】
上記のように、第９の態様による使用する化合物は、一般式Ｉによる化合物であってもよい。上記の式によれば、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、水素、アルキル（Ｃ≦１２）、および置換アルキル（Ｃ≦１２）から独立して選択される。「アルキル」という用語は、「置換」修飾剤なしで使用される場合、結合点として炭素原子を有し、線状または分枝状の非環式構造を有し、炭素および水素以外の原子を有さない一価飽和脂肪族基を指す。好ましくは、アルキルは線状である。－ＣＨ３（Ｍｅ）、－ＣＨ２ＣＨ３（Ｅｔ）、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３（ｎ Ｐｒまたはプロピル）、－ＣＨ（ＣＨ３）２（ｉ Ｐｒ、ｉＰｒまたはイソプロピル）、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３（ｎ Ｂｕ）、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３（ｓｅｃ－ブチル）、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（イソブチル）、－Ｃ（ＣＨ３）３（ｔｅｒｔ－ブチル、ｔブチル、ｔ ＢｕまたはｔＢｕ）、および－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３（ネオペンチル）の基は、アルキル基の非限定的な例である。アルキルを「置換」修飾剤とともに使用すると、１つまたは複数の水素原子が独立して、－ＯＨ、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－ＮＨ２、－ＮＯ２、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２ＣＨ３、－ＣＮ、－ＳＨ、－ＯＣＨ３、－ＯＣＨ２ＣＨ３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、－ＮＨＣＨ３、－ＮＨＣＨ２ＣＨ３、－Ｎ（ＣＨ３）２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（Ｏ)ＮＨＣＨ３、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２、－ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、または－Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２に置換される。好ましくは、１つ以上の水素原子は、－ＮＨ２または－ＯＨ、さらにより好ましくは－ＮＨ２で置換されている。好ましくは、１つの水素原子のみが置換されている。最も好ましくは、末端炭素原子の１つの水素原子のみが置換されている。好ましくは、Ｒ１および／またはＲ２は、アルキル（Ｃ≦１２）、および置換アルキル（Ｃ≦１２）である。さらにより好ましくは、Ｒ１および／またはＲ２は、アルキル（Ｃ≦６）、および置換アルキル（Ｃ≦６）から選択される。さらにより好ましくは、Ｒ１および／またはＲ２は、アルキル（Ｃ≦４）、および置換アルキル（Ｃ≦４）から選択される。好ましくは、Ｒ１およびＲ２の一方はアルキルであり、他方は置換アルキルから選択される。より好ましくは、Ｒ１は－ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である。より好ましくは、Ｒ２は直鎖アルキル（Ｃ≦４）または－ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである。最も好ましくは、Ｒ１は-ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２であり、Ｒ２は直鎖アルキル（Ｃ≦４）である。
【0031】
さらに、一般式Ｉによれば、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ、水素、ヒドロキシおよびハロゲンから独立して選択される。好ましくは、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、水素およびハロゲンから選択される。好ましくは、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうちの１つ、より好ましくは２つ、は水素である。好ましくは、Ｒ５は水素である。好ましくは、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうちの１つだけがハロゲンである。より好ましくは、Ｒ３またはＲ４はハローである。より好ましくは、Ｒ３またはＲ４は、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩから選択される。さらにより好ましくは、Ｒ３またはＲ４は、ＣｌおよびＢｒから選択される。最も好ましくは、Ｒ３またはＲ４はＣｌである。
【0032】
一般式Ｉによる好ましい化合物は以下の通りであり、これらの化合物のいずれかの薬学的に許容される塩、溶媒和物、多形体、互変異性体、ラセミ体または鏡像異性体も同様である。
【0033】
【化3】
【0034】
以下の式による化合物およびその薬学的に許容される塩が最も好ましい。
【0035】
【化4】
【0036】
本明細書に特定の化学式が提供される場合はいつでも、前記式のそれぞれの荷電／プロトン化形態もまた、本明細書に開示され、本発明を実施するのに有用であると具体的に意図される。好ましくは、そのような式の任意のアミノ残基はプロトン化され、したがって正に帯電している。
【0037】
好ましくは、疾患（本発明の第９の態様に従って治療される）は、ＮＭＤＡ受容体媒介細胞毒性を阻害することによって、特にＮＭＤＡ受容体／ＴＲＰＭ４複合体形成を阻害することによって、治療または予防される。
【0038】
第１０の態様において、本発明は、人体または動物の身体の疾患を治療または予防する方法に関すし、この方法は、疾患の治療または予防を必要とする対象に有効量の化合物を投与することを含み、化合物は、以下からなるグループから選択される。
i）本発明の第１の態様によるポリペプチド
ii）本発明の第２の態様によるポリペプチド
iii）本発明の第３の態様による融合タンパク質
iv）本発明の第４の態様による核酸
v）本発明の第１の態様で定義された配列番号３またはその誘導体に結合する非ポリペプチド化合物
vi）本発明の第８の態様による組成物
vii）一般式Ｉの化合物
i）本発明の第１の態様によるポリペプチド
ii）本発明の第２の態様によるポリペプチド
iii）本発明の第３の態様による融合タンパク質
iv）本発明の第４の態様による核酸
v）本発明の第１の態様で定義された配列番号３またはその誘導体に結合する非ポリペプチド化合物
vi）本発明の第８の態様による組成物
vii）一般式Ｉの化合物
【0039】
【化5】
【0040】
ここで、Ｒ１とＲ２はそれぞれ、水素、アルキル（Ｃ≦１２）、および置換アルキル（Ｃ≦１２）から独立して選択され、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ、水素、ヒドロキシ、およびハロゲンから独立して選択され、
または、それらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、多形体、互変異性体、ラセミ体、または鏡像異性体
viii）以下からなる化合物の群から選択される化合物、および、これらの化合物のいずれかの薬学的に許容される塩、溶媒和物、多形体、互変異性体、ラセミ体または鏡像異性体
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ、水素、ヒドロキシ、およびハロゲンから独立して選択され、
または、それらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、多形体、互変異性体、ラセミ体、または鏡像異性体
viii）以下からなる化合物の群から選択される化合物、および、これらの化合物のいずれかの薬学的に許容される塩、溶媒和物、多形体、互変異性体、ラセミ体または鏡像異性体
【0041】
【化6】
【0042】
本発明の第１０の態様に従って投与される化合物が一般式Ｉによる化合物である場合、第９の態様について上に述べたのと同じそれぞれの実施形態および選択が具体的に考慮される。特に、以下の式による化合物およびその薬学的に許容される任意の塩は、本発明の第１０の態様を実施するための好ましい実施形態である。
【0043】
【化7】
【0044】
本発明の第１０の態様の文脈における方法は、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性を阻害するための方法である場合があり、ここで、有効量の上記の化合物が対象に投与され、それにより、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性を阻害する。
【0045】
本発明の第９の態様または第１０の態様の文脈における疾患は、好ましくは、神経疾患、特に神経変性疾患、または神経変性イベントにつながるまたは関与する可能性のある疾患、例えば、特に脳において神経変性イベントを引き起こす感染症である。神経学的または神経変性疾患は、いくつかの実施形態において、炎症性要素を有する、すなわち、神経炎症性疾患である場合がある。神経変性疾患は、進行性神経変性疾患による可能性がある。好ましくは、疾患は、脳卒中、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、外傷性脳損傷、多発性硬化症、グルタミン酸誘発性興奮毒性、ジストニア、てんかん、視神経疾患、糖尿病性網膜症、緑内障、痛み、特に神経障害性の痛み、抗NMDA受容体脳炎、ウイルス性脳症、血管性認知症、微小血管障害、ビンスワンガー病、脳虚血、低酸素症、パーキンソン病、統合失調症、うつ病、脳マラリア、トキソプラズマ症（トキソプラズマ症関連の脳損傷による）、ＨＩＶ感染／ＡＩＤＳ（ＨＩＶ関連の脳損傷のリスクによる）、およびジカウイルス感染（ジカウイルス関連の脳損傷の可能性による）、または、神経変性イベントおよび対応するニューロンまたは脳の損傷にそれぞれつながる可能性のあるその他のウイルス感染、からなる群から選択される。さらなる実施形態において、疾患は、脳腫瘍、特に神経膠芽腫である場合がある。ネイチャーに最近発表された３つの論文（Nature, 2019, Vol 573 pages 499-501を参照）は、神経膠芽腫細胞がＮＭＤＡ受容体を発現し、ＮＭＤＡ受容体の活性化によってその増殖が増強／刺激されることを示している。したがって、神経膠芽腫細胞の増殖は、例えば、本明細書に記載の化合物により、ＮＭＤＡ受容体シグナル伝達が遮断されると、阻害される可能性がある。対照的に、ＮＭＤＡ受容体の従来の遮断薬は、正常なシナプス伝達および記憶などの認知機能におけるＮＭＤＡ受容体の生理学的役割を妨げるため、この場合は使用できない。
【0046】
本発明の第９の態様に従って使用するための、または第１０の態様の方法で使用されるための化合物は、本発明の第１の態様によるポリペプチドである場合がある。本発明者らは、それぞれのＴＲＰＭ４フラグメント（すなわち、配列番号３またはその誘導体）を含むポリペプチドを使用して、ＮＭＤＡ受容体によって誘発される興奮毒性から保護することができることを見出した。そのようなポリペプチドは、例えば、神経学的および／または神経変性疾患に罹患している患者に有効量で投与することができる。そのようなポリペプチドは、例えば、対象に直接投与することができる。あるいは、そのようなポリペプチドをコードするベクターを使用して、対象の細胞においてポリペプチドを発現させることができる。化合物が本発明の第２の態様によるポリペプチド、例えば、抗体またはアンチカリン、または本発明の第３の態様による融合タンパク質である場合、同じ考慮事項が適用される。化合物が本発明による融合タンパク質である場合において、融合タンパク質が、融合タンパク質を細胞膜に向ける手段を含むとき、特に膜の細胞質側に向ける手段を有するとき、これはＴＲＰＭ４の末端ドメインが通常細胞内に見られる場所であるため、特に好ましい。融合タンパク質がタンパク質形質導入ドメインを含み、ポリペプチドが細胞膜を通過せずに細胞膜を通過して細胞の細胞質ゾルに入ることを可能にする場合、同様の効果が達成される。化合物が本発明の第４の態様による核酸である場合、そのような核酸はまた、例えば、治療される対象のゲノムに恒久的または一時的に挿入される場合に、遺伝子治療の文脈において使用される場合がある。化合物が本発明の第５の態様によるベクターである場合、そのようなベクターは好ましくはウイルスベクターである。化合物はまた、本発明の第１の態様で定義される配列番号３またはその誘導体、例えば対応するＤＮＡアプタマーまたは小分子に結合する非ポリペプチド化合物である場合がある。
【0047】
通常、（第９の実施形態または第１０の実施形態の）治療方法は、障害の進行を停止または減速することに焦点を合わせている。あるいは、そのような化合物はまた、例えば、対象が神経学的および／または神経変性疾患に苦しむ（増加した）リスクにさらされている状況において、予防的な方法で投与することができる。これには、急性（増加）リスク（例えば、手術後の血栓性脳卒中）および継続的リスク（例えば、特定の神経障害および／または神経変性障害の遺伝的および／または家族性素因による）が含まれる。
【0048】
治療される対象は、好ましくは哺乳動物であり、好ましくはヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、サル、ウマ、ハムスター、およびモルモット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギなどからなる群から選択される。最も好ましくは、対象はヒトである。本発明の第９の態様による使用のための化合物または第１０の態様の方法で使用される化合物が、本発明の第１の態様によるポリペプチド、本発明の第３の態様による融合タンパク質、またはそれをコードするそれぞれの核酸またはベクターである場合、好ましくは、前記化合物は、治療される対象に一致する。例えば、ヒトの治療のために、本発明の第１の態様によるポリペプチドは、好ましくは、ヒト配列、すなわち、配列番号３によるアミノ酸配列を含む。対照的に、マウスの治療の場合、本発明によるポリペプチドは、好ましくは、配列番号５などによるアミノ酸配列を含む。
【0049】
本発明の第９の態様および第１０の態様の目的のために、当業者は、治療または予防される特定の疾患および／または治療される身体部分に応じて、適切な投与経路を容易に選択することができる。投与経路は、例えば、経口、局所、鼻腔内、非経口、静脈内、直腸、または特定の状況に適した他の任意の投与経路であってもよい。例えば、疾患が脳血管疾患である場合、例えば、脳卒中の場合、鼻腔内投与が好ましい投与経路である。鼻腔内投与は、例えば、脳卒中および脳卒中誘発性脳損傷の治療の状況において、一般に神経保護化合物を投与するのに特に適しているとして、当業者に知られている。
【0050】
化合物は、例えば、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、液体、軟膏、ローション、クリーム、スプレー、吸入剤などを含む、所与の目的に適したすべての形態で投与することができる。化合物は、非経口的に、例えば、静脈内注射または静脈内注入により、投与されるように処方することができる。特に好ましい実施形態では、本発明の第９の態様による使用のための化合部、または第１０の態様による方法で使用するための化合物は、例えば、軟膏またはクリームとして、または、例えば、スプレーを介して鼻に適用される生理食塩水として、鼻腔内に投与するように処方することができる。本発明の第９の態様による使用のための化合物、または第１０の態様の方法で使用するための化合物はまた、遅延または持続放出のために処方されてもよく、および／またはナノ粒子または小胞にカプセル化されてもよい。
【0051】
第１１の態様において、本発明は、タンパク質間相互作用アッセイにおける、それぞれ、本発明の第１、第２、または第３の態様によるポリペプチドまたは融合タンパク質の使用に関する。好ましくは、タンパク質間相互作用アッセイは、インビトロのタンパク質間相互作用アッセイである。本発明の第１、第２または第３の態様によるポリペプチド／融合タンパク質は、ＴＲＰＭ４タンパク質のさらなる結合パートナーを同定するために特に有用であると考えられる。そのようなアッセイにおける精査中のタンパク質間相互作用は、好ましくは、本発明の第１、第２、および第３の態様について上で定義された、配列番号３によるアミノ酸配列またはその誘導体配列によって指定される領域内の相互作用である。そのような結合パートナーは、神経毒性、神経保護、またはそのどちらでもないことが判明する可能性がある。この文脈において、ポリペプチド／融合タンパク質は、それ自体の相互作用パートナーに関する洞察を提供するだけでなく、例えば、特定の複合体が（例えば、競合的な）阻害ためにもはや形成できない場合、ＴＲＰＭ４シグナル伝達に関与する他の化合物の相互作用にも光を当てる。当業者は、生化学的、生物物理学的および遺伝的方法を含む、タンパク質間相互作用を決定するための多数の可能なアッセイに精通している。非限定的な例は、免疫沈降、二分子蛍光補完（例えば、スプリット－ＴＥＶ、スプリット－ＧＦＰ）、アフィニティー電気泳動、免疫電気泳動、ファージディスプレイ、タンデムアフィニティー精製、化学架橋とそれに続く質量分析、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー移動、核磁気共鳴イメージングなどである。タンパク質間相互作用アッセイは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボアッセイであってもよい。最も好ましくは、タンパク質間相互作用アッセイは、インビトロアッセイである。しかしながら、例えば、ライブイメージングの文脈において、そのようなアッセイはまた、インビボアッセイであってもよい。アッセイがインビボアッセイである場合、それは好ましくはヒトでのアッセイではない。
【0052】
第１２の態様において、および第１１の態様と同様の状況において、本発明はまた、本発明の第１の態様によるポリペプチドのアミノ酸配列を含むＴＲＰＭ４タンパク質と潜在的に相互作用する化合物を同定するための方法にも関し、ここで、この方法は以下を含む。
i）配列番号３によるアミノ酸配列または前記配列の誘導体への候補化合物のコンピューター支援仮想ドッキングであって、前記アミノ酸配列は、前記アミノ酸配列を含むポリペプチドの仮想３Ｄ構造に存在する、および
ii）候補化合物を配列番号３によるアミノ酸配列、またはその誘導体、およびに実際にドッキングするためのドッキングスコアおよび／または内部ひずみの決定、および任意選択で
iii）候補化合物が前記ＴＲＰＭ４タンパク質の活性を調節するかどうかを決定するための、候補化合物のＴＲＰＭ４タンパク質とインビトロまたはインビボでの接触。
i）配列番号３によるアミノ酸配列または前記配列の誘導体への候補化合物のコンピューター支援仮想ドッキングであって、前記アミノ酸配列は、前記アミノ酸配列を含むポリペプチドの仮想３Ｄ構造に存在する、および
ii）候補化合物を配列番号３によるアミノ酸配列、またはその誘導体、およびに実際にドッキングするためのドッキングスコアおよび／または内部ひずみの決定、および任意選択で
iii）候補化合物が前記ＴＲＰＭ４タンパク質の活性を調節するかどうかを決定するための、候補化合物のＴＲＰＭ４タンパク質とインビトロまたはインビボでの接触。
【0053】
候補化合物のタンパク質構造へのインシリコドッキングの方法は、この技術分野でよく知られている。候補化合物は、任意の化合物であってもよい。通常、化合物は小分子である。好ましくは、小分子はＡＴＰではない。より好ましくは、小さな化合物は、ヌクレオチドではなく、および／またはアデノシン部分を含まない。化合物が抗体などの大きな生体分子である可能性もある。化合物のコレクションは、例えば、シュレディンガーＬＬＣ（ニューヨーク、ニューヨーク州、米国）から入手できる。３Ｄ構造は、配列番号３によるアミノ酸配列、または前記配列の誘導体を含む任意の構造であってもよい。３Ｄ構造は、ヒトＴＲＰＭ４またはその一部の３Ｄ構造であってもよい。誘導体は、例えば、本発明の第１の態様において、上記で定義されたとおりである。好ましくは、誘導体は、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、またはii）配列番号４による配列である。この場合、ＴＲＰＭ４タンパク質の様々な構造が、例えば、タンパク質データバンクにおいて当業者に利用可能であり、そして第１２の態様の方法に使用することができる。それに限定されることなく、そのような方法に適した３Ｄ構造は、例えば、５ＷＰ６、６ＢＱＲ、６ＢＱＶなどのヒトＴＲＰＭ４の構造、またはマウス構造の６ＢＣＯである。３Ｄ構造は、例えば、Ｘ線結晶学分析、ＮＭＲ分光分析、クライオＥＭによって得られた、またはホモロジーモデリングから得られた構造に基づくことができる。本発明の第１２の態様による方法は、配列番号３またはその誘導体によるアミノ酸配列に対応するＴＲＰＭ４構造の領域への候補化合物のドッキングを含み、配列番号３またはその誘導体によるアミノ酸配列に関係しない構造の領域へのドッキングを含まないことが理解される。しかしながら、配列番号３またはその誘導体を有する領域へのドッキングが、前記領域の外側の他のアミノ酸残基との並行相互作用を必要とする場合、そのようなドッキングもまた、本発明の第１２の態様による方法に含まれる。ドッキング自体は、当業者に知られている様々な方法によって達成することができ、それぞれのソフトウェアは公に利用可能である（例えば、シュレディンガーＬＬＣ、ニューヨーク、ニューヨーク州、米国を参照）。それぞれの分析は、商業プロバイダー、例えば、プロテロスバイオストラクチャーズＧｍｂＨ（プラネック、ドイツ）に依頼することもできる。本発明の第１２の態様の方法はまた、ＮＭＤＡ受容体媒介興奮毒性の阻害剤を同定するために使用されてもよい。
【0054】
第１３の態様では、本発明は、ヒトまたは動物の身体の疾患を治療または予防する方法における使用のための化合物に関し、この化合物は、ＮＭＤＡ受容体－ＴＲＰＭ４複合体形成の阻害剤である。ＮＭＤＡ受容体－ＴＲＰＭ４複合体形成の阻害剤は、本発明の実施例（特に、それに限定されないが、実施例１、方法および材料、実施例１１、１２、および１５）に示されるようなアッセイにおいて所与の候補化合物を試験することによって同定することができる。ＮＭＤＡ受容体－ＴＲＰＭ４複合体形成の阻害剤は、例えば、本発明の第９の態様の文脈で論じられている化合物のいずれかである。この文脈で開示されるすべての実施形態は、本発明の第１３の態様についても具体的に意図されている。好ましくは、ＮＭＤＡ受容体－ＴＲＰＭ４複合体形成の阻害剤は、ＮＭＤＡ受容体チャネル自体を遮断しない（対応する試験については、実施例１４を参照）。好ましくは、ＮＭＤＡ受容体－ＴＲＰＭ４複合体形成の阻害剤は、ＴＲＰＭ４チャネル自体を遮断しない（対応する試験については、実施例１７を参照）。疾患は、本発明の第９または第１０の態様の文脈ですでに論じられているような任意の疾患であってもよい。
【0055】
第１４の態様において、本発明は、ヒトまたは動物の身体の疾患を治療または予防する方法に関し、この方法は、疾患の治療または予防を必要とする対象に有効量の化合物を投与することを含み、化合物は、ＮＭＤＡ受容体－ＴＲＰＭ４複合体形成の阻害剤である。ＮＭＤＡ受容体－ＴＲＰＭ４複合体形成の阻害剤および疾患に関して、本発明の第１３の態様および本発明の第９および第１０の態様がそれぞれ参照される。この文脈で開示されるすべての実施形態は、本発明の第１４の態様についても具体的に意図されている。
【0056】
第１５の態様において、本発明は、細胞、特にＨＥＫ２９３細胞などの非神経細胞に関するものであり、前記細胞は、組換えＮＭＤＡ受容体を発現し、ＴＲＰＭ４の発現は存在せず、ノックダウンまたはノックアウトされ、好ましくはノックアウトされる。細胞は、好ましくは、単離された細胞であり、すなわち、ヒトまたは動物の体内に存在しない。細胞は、好ましくは、グルタミン酸受容体またはサブユニットを発現していない。細胞は、好ましくは、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である。好ましくは、細胞は細胞株として培養することができる。このような細胞は、ＮＭＤＡ受容体の活性、それが今や阻害や活性化や調節であろうと、を研究するのに完全に適している。このような研究は、ＮＭＤＡ受容体機能の１つまたはいくつかの性質をブロックまたは強化する、新しい化合物（小分子、ペプチド、タンパク質など）および既知の化合物（小分子、ペプチド、タンパク質など）の発見および／または特性評価を目的とした薬理学的研究である場合があり、これには、イオンコンダクタンス、活性化および非活性化動態、およびマグネシウムのブロックおよびマグネシウムのブロック解除を含まれが、これらに限定されない。このような研究には、点突然変異または欠失突然変異体を含むＮＭＤＡ受容体のさまざまなサブユニット（ＧＲＩＮ１、ＧＲＩＮ２Ａ、ＧＲＩＮ２Ｂ、または他のＧＲＩＮ２サブユニットまたはＧＲＩＮ３）の発現ベクターを含むプラスミドがトランスフェクトされているＮＭＤＡ受容体の構造と機能の関係の評価も含まれる場合があり、続いて、上記のようなパラメーター（イオンコンダクタンスなど）の機能分析が行われる。従来のアプローチには、組換えＮＭＤＡ受容体の発現（例えば、ＨＥＫ ２９３細胞での）が通常、細胞毒性と死につながるという欠点がある。したがって、従来のアプローチでは、阻害剤であるＮＭＤＡ受容体の存在下でこのような細胞を増殖させる必要があり、これにより、ＮＭＤＡ受容体の研究と結果の解釈が、これらの細胞で困難かつ複雑になる。ＮＭＤＡ受容体活性をＴＲＰＭ４との相互作用から切り離すことにより、前記細胞毒性および死を防ぐことができ、したがって、阻害剤ＮＭＤＡ受容体の存在下での細胞培養はもう必要ない。
【0057】
第１６の態様において、本発明は、ＮＭＤＡ受容体媒介興奮毒性を阻害するための、ＴＲＰＭ４タンパク質の（チャネル）阻害剤、例えば、ヒトＴＲＰＭ４の阻害剤の使用に関する。（例えば、ヒト）ＴＲＰＭ４の阻害剤は、グリベンクラミド、９－フェナントロール、トルブタミド、レパグリニド、ナテグリニド、メグリチニド、ミダグリゾール、ＬＹ３９７３６４、ＬＹ３８９３８２、グリクラジド、グリメピリド、エストロゲン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、ゲニステイン、非ステロイド性エストロゲン、植物エストロゲン、ゼアラレノン、５－ブチル－７－クロロ－６－ヒドロキシベンゾ［ｃ］－キノリジウムクロリド、フルフェナミン酸、およびスペルミンなどの、任意の既知のＴＲＰＭ４阻害剤であってもよい。ＴＲＰＭ４の発現のノックダウンも、ＴＲＰＭ４タンパク質の阻害剤であると考えられる。使用は、インビトロまたはインビボで行うことができる。使用がインビボで行われ、治療的性質のものである場合、そのような実施形態は、ヒトまたは動物の身体の疾患の治療方法で使用するためのＴＲＰＭ４タンパク質の阻害剤を反映し、疾患は、i）ＮＭＤＡ受容体媒介細胞毒性を阻害することによって治療または予防され、および／またはii）ＮＭＤＡ受容体媒介興奮毒性によって引き起こされる。
【0058】
本明細書で使用される「含む」という用語は、「からなる」（すなわち、追加の他の事項の存在を除く）という意味に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、「含む」とは、必要に応じて追加の事項が存在する可能性があることを意味する。「含む」という用語は、その範囲内にある特に想定される実施形態として、「からなる」（すなわち、追加の他の事項の存在を除く）および「含むが、からなるではない」（すなわち、追加の他の事項の存在を必要とする）を包含し、前者がより好ましい。
【0059】
本明細書で使用される「ナノ粒子」という用語は、好ましくは、１から１００ナノメートルのサイズの粒子を指す。ナノ粒子は、ポリマーを含んでいてもよい。粒子は、シリカ、特にシリカコアを含んでいてもよい。粒子は、官能基を有する外層を含んできてもよい。そのような官能基は、例えば、ナノ粒子を目的の化合物に結合することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【0060】
以下に、添付した図面について簡単に説明する。これらの図面は、本発明の態様をより詳細に説明することを意図している。しかしながら、それらは本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【図1】ＲＮＡ干渉を使用したＴＲＰＭ４タンパク質のノックダウンが、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性からニューロンを保護することを示す。溶媒は水であった。ｓｈＴＲＭＰ４－１は配列番号４４に示され、ｓｈＴＲＭＰ４－２は配列番号４５に示されている。すべてのデータはｎ＝３の独立した実験の平均±標準偏差として示されている。二元配置分散分析は、ダネットの事後検定に従った。ｎ．ｓ．は有意差なし。＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．０１、＊＊＊はｐ≦０．００１、＊＊＊＊はｐ≦０．０００１である。
【図2】マウスＴＲＰＭ４がＮＭＤＡ誘導細胞死に対する保護を与えるポリペプチド要素を含むことを示す。Ａ）マウスＴＲＰＭ４の４つの異なるフラグメント：アミノ酸残基１－３４６（配列番号４６）、アミノ酸残基３４７－６８９（配列番号４７）、アミノ酸残基６９０－１０３６（配列番号４８）、アミノ酸残基１０３７－１２１３（配列番号４９）の神経保護効果を示す。これらのうち、配列番号４７のみが神経保護的である。Ｂ）配列番号４７による配列を有するポリペプチドの４つの異なるフラグメント：アミノ酸残基３４７－４６７（配列番号５０）、アミノ酸残基４６８－５４８（配列番号５１）、アミノ酸残基５３６－６４８（配列番号５２）、アミノ酸残基６３３－６８９（配列番号５）の神経保護効果を示す。これらのうち、配列番号５のみが神経保護的である。すべてのデータはｎ＝３の独立した実験の平均±標準偏差として示されている。二元配置分散分析は、ダネットの事後検定に従った。＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．０１、＊＊＊はｐ≦０．００１である。
【図3】配列番号５の配列を有するポリペプチドの様々な変異体の保護特性を示す。Ａ）ｒＡＡＶに感染し、配列番号４７または配列番号５３を過剰発現しているニューロンにおけるＮＭＤＡ誘発性ニューロン死の分析を示す。配列番号５３は、配列番号４７に対応するが、さらに膜アンカー（ＧＰＩ）を含む。実験は、ＧＰＩアンカーが配列番号４７によるポリペプチドの保護効果を増加させ、細胞死をより少なくすることを示した。Ｂ）ＤＩＶ３において、配列番号５、配列番号５４または配列番号５５を発現しているｒＡＡＶに感染させ、ＤＩＶ１７において、２０μＭのＮＭＤＡを１０分間曝露させ、細胞死を２４時間後に評価した、培養ニューロンにおけるＮＭＤＡ誘発性ニューロン死の分析を示す。配列番号５４は、配列番号５の誘導体であり、２つのＦを２つのＹで保存的に置換したものである。ＮＭＤＡ受容体媒介細胞毒性の低減には、配列番号５よりもわずかに効果が低いだけである。対照的に、関連するが異なるマウスタンパク質ＴＲＰＭ５、配列番号５５に由来する対応する領域は、配列番号５と約６０％の配列同一性しか共有せず、ＮＭＤＡ受容体媒介細胞毒性を低下させることができない。すべてのデータはｎ＝３の独立した実験の平均±標準偏差として示されている。二元配置分散分析は、ダネットの事後検定に従った。ｎ．ｓ．は有意差なし。＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．０１、＊＊＊はｐ≦０．００１、＊＊＊＊はｐ≦０．０００１である。
【図4】配列番号５のペプチドおよびタンパク質形質導入ドメイン（ＴＡＴ、配列番号４２）を含む１μｇおよび１０μｇの融合ペプチドへのニューロンの前曝露の効果を示す。融合タンパク質（配列番号５＋ＴＡＴ）は、配列番号５６によるアミノ酸配列を有していた。実験は、配列番号５６の適用がＮＭＤＡ興奮毒性からニューロンを保護することを示した。溶媒は、水であった。
【図5】ＭＣＡＯまたは偽手術の３週間前に、配列番号５をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の定位注射を受けたマウスの全虚血性脳における梗塞体積を示す。ＰＢＳとＧＦＰを対照として使用した。梗塞サイズをＭＣＡＯの７日後に決定した（平均±ＳＤ）。統計分析をｔ検定によって行った。統計的に有意な差をアスタリスクで示す（ｎ＝５－８）。＊＊はＰ＜０．００５、＊＊＊はＰ＜０．００１である。
【図6】初代マウス海馬ニューロンにおけるニューロンミトコンドリア膜電位の破壊に対する配列番号５および配列番号５４によるポリペプチドの予防効果を示す。カルボニルシアニド－ｐ－トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）の添加によりミトコンドリア膜電位の破壊が起こる。Ａ）トランスフェクトされていない初代マウス海馬ニューロンのミトコンドリア膜の破壊。Ｂ）配列番号５の存在下でのミトコンドリア膜電位の破壊の遅延。実験の最後の脱共役剤ＦＣＣＰの添加によりミトコンドリア膜電位の破壊が起こる。Ｃ）ニューロンミトコンドリア膜電位破壊に対する３つの異なるポリペプチドの保護効果の比較：Ｕｎｉ：非感染（陰性対照）、配列番号５、配列番号５４および配列番号５５（陰性対照）。一元配置分散分析は、テューキーの事後検定に従った。ｎ．ｓ．は有意差なし。＊＊＊＊はｐ≦０．０００１である。
【図7】配列番号５および配列番号５４について観察された効果がシナプスＮＭＤＡ受容体シグナル伝達に影響を与えていないことを示している。特に、ＧＡＢＡＡ受容体拮抗薬ガバジンによって促進されるシナプスＮＭＤＡ受容体活性化は、ミトコンドリアへのカルシウム流入を媒介し、配列番号５および配列番号５４の影響を受けない。すべてのデータはｎ＝１１－１２の３つの独立した実験の平均±標準偏差として示されている。一元配置分散分析は、テューキーの事後検定に従った。ｎ．ｓ．は有意差なし。＊＊＊＊はｐ≦０．０００１である。
【図8】仮想スクリーンにおいて、マウスＴＲＰＭ４の配列番号５と潜在的に相互作用するものとして同定された化合物の神経保護効果を示す。ＤＭＳＯを陰性対照として使用した。ＴＲＰＭ４阻害剤であるグリベンクラミドを陽性対照として使用した。Ａ）ＮＭＤＡ受容体媒介興奮毒性を誘発しないＨＥＫ２９３細胞の細胞死のベースラインレベル。Ｂ）ＧＲＩＮ１＋ＧＲＩＮ２Ａ受容体複合体によって媒介される細胞死。Ｃ）ＧＲＩＮ１＋ＧＲＩＮ２Ｂ受容体複合体によって媒介される細胞死。すべてのデータはｎ＝３の独立した実験の平均±標準偏差として示されている。一元配置分散分析は、テューキーの事後検定に従った。ｎ．ｓ．は有意差なし。＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．０１、＊＊＊はｐ≦０．００１、＊＊＊＊はｐ≦０．０００１である。
【図9】初代マウス海馬ニューロンにおけるニューロンミトコンドリア膜電位破壊に対する化合物Ｐ４および化合物Ｐ１５の神経保護効果を示す。記録の３０分前に、Ｐ４とＰ１５を培養ニューロンに適用した。ベースラインを１分間記録した後、２０μＭのＮＭＤＡを浴適用すると、ミトコンドリア膜電位の破壊につながる興奮毒性が誘発された。１０分後、ミトコンドリア脱共役剤であるカルボニルシアニド－ｐ－トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）を添加した。ＦＣＣＰの添加によりミトコンドリア膜電位の破壊が起こる。非競合的で一般的なＮＭＤＡ受容体阻害剤であるＭＫ－８０１を陽性対照として使用した。Ａ）ＤＭＳＯ、Ｐ４、Ｐ１５またはＭＫ－８０１の存在下でのミトコンドリア膜電位の破壊の遅延。Ｂ）ニューロンのミトコンドリア膜電位の破壊に対するＤＭＳＯ、Ｐ４およびＰ１５の保護効果の定量的比較。結果は、Ｐ４とＰ１５がそれぞれＮＭＤＡ興奮毒性からミトコンドリア膜電位を有意に保護することができたことを示した。すべてのデータはｎ＝６の２つの独立した実験の平均±標準偏差として示されている。一元配置分散分析は、テューキーの事後検定に従った。ｎ．ｓ．は有意差なし。＊はｐ≦０．０５、＊＊はｐ≦０．０１、＊＊＊はｐ≦０．００１、＊＊＊＊はｐ≦０．０００１である。
【図10】初代マウス海馬ニューロンにおけるＮＭＤＡ興奮毒性に対する化合物Ｐ４および化合物Ｐ４の誘導体（化合物４０１から４０９）の神経保護効果を示す。ニューロンを１０μMの示された化合物で３０分間前処理し、次にＮＭＤＡ（２０μM）に１０分間（一過性ＮＭＤＡ毒性、図１０Ａ）またはＮＭＤＡ（２０μM）に２４時間（慢性ＮＭＤＡ毒性）、図１０Ｂ）曝露した。細胞死をＮＭＤＡ曝露の２４時間後に評価した。細胞死を評価するために、ニューロンを４％パラホルムアルデヒド、４％スクロースを含むＰＢＳで１５分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（１μｇ／ｍｌ）で１０分間対比染色した。細胞をＭｏｗｉｏｌ ４－８８にマウントし、蛍光顕微鏡で検査した。死んだニューロンを無定形または収縮した核によって識別した。すべてのデータはｎ＝３－５の２－５の独立した実験の平均±標準偏差として示されている。一元配置分散分析は、ダネットの事後検定に従い、溶媒グループを比較した。＊はｐ≦０．０５、＊＊＊はｐ≦０．００１、＊＊＊＊はｐ≦０．０００１である。
【図11】トランスフェクション後の図示された時点で、野生型ＨＥＫ２９３細胞（Ａ）およびＴＲＰＭ４ノックアウトＨＥＫ２９３細胞（Ｂ）において、ＧＲＩＮ１の存在下で細胞死を誘導するＧＲＩＮ２ＡおよびＧＲＩＮ２Ｂの能力を示す。
【図12】６分間のＮＭＤＡ（２０μＭ）適用中のＮＭＤＡ誘発カルシウム流入に対する化合物Ｐ４、化合物Ｐ１５、またはＭＫ－８０１の効果を示す。ベースライン（図１２Ａ）、振幅（図１２Ｂ）、および曲線下面積（ＡＵＣ、図１２Ｃ）の定量分析が提供されている。ＮＭＤＡ誘発性カルシウムトランジェントを完全にブロックした古典的なＮＭＤＡ受容体遮断薬ＭＫ－８０１とは異なり、化合物Ｐ４もＰ１５も海馬ニューロンのＮＭＤＡ誘発性カルシウムトランジェントを減少させなかった。したがって、これらの化合物は、ＮＭＤＡによって誘発されるカルシウム流入自体には影響を与えない。
【図13】対照マウスおよび化合物Ｐ４（４０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射の２時間後、６時間後、および２４時間後のマウスから得られた皮質溶解物からのＮＭＤＡ受容体／ＴＲＰＭ４死複合体の共免疫沈降によって得られたＧＲＩＮ２ＢとＴＲＰＭ４の比率の定量分析を示す。ＮＭＤＡ受容体／ＴＲＰＭ４複合体は抗ＴＲＰＭ４抗体で免疫沈降された。４０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｐ４の単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射後、２時間で５１％および６時間で６１％のＮＭＤＡ受容体／ＴＲＰＭ４複合体形成の減少が起こり、それによって化合物Ｐ４がそのような複合体形成を効果的に妨害したことが示されている。化合物Ｐ４のｉ．ｐ．注射の２４時間後、ＮＭＤＡ受容体／ＴＲＰＭ４複合体が再形成された。
【図14】ＮＭＤＡ（２０ｎｍｏｌ）をマウスに硝子体内注射した後のＢｒｎ３ａ陽性網膜神経節細胞（ＲＧＣ）変性の定量分析を示す。分析は、溶媒または化合物Ｐ４を投与されたマウスの生きたＲＧＣをマークするためにＮＭＤＡの硝子体内注射の１週間後にＢｒｎ３ａに対する抗体で染色されたホールマウント網膜に基づいている。すべてのデータは平均値±標準偏差で示されている。化合物Ｐ４は、ＮＭＤＡ（２０ｎｍｏｌ）をマウスに硝子体内注射した後の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の変性を軽減する。
【図15】前立腺癌細胞株ＰＣ３におけるＴＲＰＭ４チャネル機能の化合物Ｐ４および化合物Ｐ１５の効果を示す。ＴＲＰＭ４電流は、カルシウム依存性と外向き整流によって特徴付けられる。要約ヒストグラムは、細胞内溶液に０または１０μMの遊離Ｃａ２＋をパッチし、３７℃で３０－６０分間プレインキュベートし、対照溶液または１０μＭのＰ４またはＰ１５で記録した個々の細胞のパラメーターを示している。結果は、１０μＭのＣａ２＋がＰＣ３細胞でＴＲＰＭ４のような外向き整流電流を活性化し、この電流がＰ４またはＰ１５の影響を受けないことを示している。データは各グループｎ＝１０－１７の３つの独立した実験の平均±標準偏差として示される。ｎ．ｓ．は有意差なし。
【発明を実施するための形態】
【0061】
以下の特定の実施例では、本発明の実施形態および態様を示している。しかしながら、本発明は、本明細書に記載の特定の実施例によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な変形は、前述の説明および以下の実施例から当業者に容易に明らかになるであろう。そのような変形はすべて、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【実施例1】
【0062】
≪方法と材料≫
以下の方法と材料は、他に示されない限り、後続の実施例において発明者によって使用された。
以下の方法と材料は、他に示されない限り、後続の実施例において発明者によって使用された。
【0063】
［ＨＥＫ２９３細胞培養］
ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、GibcoTM、10270）、１％ピルビン酸ナトリウム（GibcoTM、11360070）、１％ＭＥＭ ＮＥＡＡ（GibcoTM、11140035）、および０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ－Ｓ、Sigma、P0781）を追加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、GibcoTM、41965-039）で培養し、継代数１５－２５を実験に使用した。
ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、GibcoTM、10270）、１％ピルビン酸ナトリウム（GibcoTM、11360070）、１％ＭＥＭ ＮＥＡＡ（GibcoTM、11140035）、および０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ－Ｓ、Sigma、P0781）を追加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、GibcoTM、41965-039）で培養し、継代数１５－２５を実験に使用した。
【0064】
［発光細胞毒性アッセイ］
本発明による化合物の細胞毒性を試験するために、ＧＲＩＮ１とＧＲＩＮ２Ａ、またはＧＲＩＮ１とＧＲＩＮ２Ｂの両方をそれぞれ（１：１、０．２ｍｇ／ｃｍ２）、製造元の指示に従ってリポフェクタミン２０００でプレーティングしてから２４時間後に、ＨＥＫ２９３細胞（７０－８０％コンフルエント）をトランスフェクトした。トランスフェクション後の示された時点での集団内の死細胞の相対数を、わずかな変更を加えた製造元の指示に従って、ＣｙｔｏＴｏｘ－ＧｌｏＴＭ細胞毒性アッセイ（Promega、G9290）で測定した。簡単に説明すると、全培地の１０％を１０μＬのＡＡＦ－アミノルシフェリンと混合して、水で２００μＬの最終容量に到達させ、死細胞の相対発光単位（ＤＲＬＵ）を９６ウェルの白い底のポリスチレンマイクロプレート（Corning Costar(R)、3912）中でＧｌｏＭａｘ（Promega）によって測定した。すべての測定後、溶解試薬を細胞に添加し、溶解物の１０％を全細胞相対発光単位（ＴＲＬＵ）測定に使用した。細胞死を次の方程式で計算した。
本発明による化合物の細胞毒性を試験するために、ＧＲＩＮ１とＧＲＩＮ２Ａ、またはＧＲＩＮ１とＧＲＩＮ２Ｂの両方をそれぞれ（１：１、０．２ｍｇ／ｃｍ２）、製造元の指示に従ってリポフェクタミン２０００でプレーティングしてから２４時間後に、ＨＥＫ２９３細胞（７０－８０％コンフルエント）をトランスフェクトした。トランスフェクション後の示された時点での集団内の死細胞の相対数を、わずかな変更を加えた製造元の指示に従って、ＣｙｔｏＴｏｘ－ＧｌｏＴＭ細胞毒性アッセイ（Promega、G9290）で測定した。簡単に説明すると、全培地の１０％を１０μＬのＡＡＦ－アミノルシフェリンと混合して、水で２００μＬの最終容量に到達させ、死細胞の相対発光単位（ＤＲＬＵ）を９６ウェルの白い底のポリスチレンマイクロプレート（Corning Costar(R)、3912）中でＧｌｏＭａｘ（Promega）によって測定した。すべての測定後、溶解試薬を細胞に添加し、溶解物の１０％を全細胞相対発光単位（ＴＲＬＵ）測定に使用した。細胞死を次の方程式で計算した。
【0065】
【数1】
【0066】
薬物検査のために、トランスフェクションの６時間後に、P４、P８、P９、P１３、およびP１５を示された濃度で培地に添加した。トランスフェクションの４８時間後に、ＤＲＬＵ、ＴＲＬＵ、および細胞死を測定し計算した。
【0067】
［初代神経培養］
初代マウス海馬および皮質ニューロンを、既知のように準備し維持した。簡単に説明すると、Ｐ０ Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＣｒｌマウスの海馬または大脳皮質を分離し、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ａ培地（GibcoTM、10888022）、２％無血清Ｂ２７ＴＭサプリメント（GibcoTM、17504044）、１％ラット血清（Biowest、S2150）、０．５ｍＭ Ｌ－グルタミン（Sigma、G7513）および０．５％Ｐ－Ｓからなる増殖培地（ＧＭ）に１．２＊１０５／ｃｍ２の密度で播種した。グリア細胞の増殖を防ぐために、シトシンβ－Ｄ－アラビノフラノシド（AraC、Sigma、C1768、２．８μＭ）をＤＩＶ３に添加した。ＤＩＶ８から、実験に使用するまで、４８時間ごとにラット血清を含まないＧＭに培地の半分を交換した。実験の２４時間前に、ＧＭをトランスフェクション培地（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１１４ｍＭ ＮａＣｌ、２６．１ｍＭ ＮａＨＣＯ３、５．３ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、３０ｍＭグルコース、１ｍＭグリシン、０．５ｍＭ Ｃ３Ｈ３ＮａＯ３、および０．００１％フェノールレッド、ならびに、７．５μｇ／ｍｌのインスリン、７．５μｇ／ｍｌのトランスフェリンおよび７．５ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム（ITS Liquid Media Supplement、Sigma-Aldrich カタログ番号I3146）を添加したリン酸塩を含まないイーグル最小必須培地が１０％）に交換した。一次海馬ニューロンを生細胞イメージング、細胞死実験に使用し、皮質ニューロンをｍＲＮＡおよびタンパク質抽出分析に使用した。
初代マウス海馬および皮質ニューロンを、既知のように準備し維持した。簡単に説明すると、Ｐ０ Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＣｒｌマウスの海馬または大脳皮質を分離し、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ａ培地（GibcoTM、10888022）、２％無血清Ｂ２７ＴＭサプリメント（GibcoTM、17504044）、１％ラット血清（Biowest、S2150）、０．５ｍＭ Ｌ－グルタミン（Sigma、G7513）および０．５％Ｐ－Ｓからなる増殖培地（ＧＭ）に１．２＊１０５／ｃｍ２の密度で播種した。グリア細胞の増殖を防ぐために、シトシンβ－Ｄ－アラビノフラノシド（AraC、Sigma、C1768、２．８μＭ）をＤＩＶ３に添加した。ＤＩＶ８から、実験に使用するまで、４８時間ごとにラット血清を含まないＧＭに培地の半分を交換した。実験の２４時間前に、ＧＭをトランスフェクション培地（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１１４ｍＭ ＮａＣｌ、２６．１ｍＭ ＮａＨＣＯ３、５．３ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、３０ｍＭグルコース、１ｍＭグリシン、０．５ｍＭ Ｃ３Ｈ３ＮａＯ３、および０．００１％フェノールレッド、ならびに、７．５μｇ／ｍｌのインスリン、７．５μｇ／ｍｌのトランスフェリンおよび７．５ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム（ITS Liquid Media Supplement、Sigma-Aldrich カタログ番号I3146）を添加したリン酸塩を含まないイーグル最小必須培地が１０％）に交換した。一次海馬ニューロンを生細胞イメージング、細胞死実験に使用し、皮質ニューロンをｍＲＮＡおよびタンパク質抽出分析に使用した。
【0068】
［組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）および構築物］
この技術分野で知られているように、すべてのウイルス粒子を生成し精製した。すべてのＴＲＰＭ４由来ペプチド（配列番号５、または配列番号４６から配列番号５６のいずれかを含む）をＰＣＲによってｒＡＡＶバックボーンにクローン化した。マウスＴＲＰＭ４に対するｓｈＲＮＡを、サーモフィッシャーのＢＬＯＣＫ－ｉＴＴＭＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒにより、ggacatcgcccaaagtgaact（配列番号４４、ｓｈＴＲＰＭ４－１）およびgcatccagagagggttcattc（配列番号４５、ｓｈＴＲＰＭ４－２）をターゲットとして設計した。スクランブルｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＣＲ）はテストされ、マウスに既知のターゲットがないことが証明されている。ＧＰＩアンカー（LENGGTSLSEKTVLLLVTPFLAAAWSLHP、たとえば配列番号５３で使用）配列は、ユーロフィンジェノミクス（エーバースベルク、ドイツ）によって合成された。すべてのプライマーを合成し、すべてのプラスミドをユーロジェノミクスによるシーケンスによって確認した。
この技術分野で知られているように、すべてのウイルス粒子を生成し精製した。すべてのＴＲＰＭ４由来ペプチド（配列番号５、または配列番号４６から配列番号５６のいずれかを含む）をＰＣＲによってｒＡＡＶバックボーンにクローン化した。マウスＴＲＰＭ４に対するｓｈＲＮＡを、サーモフィッシャーのＢＬＯＣＫ－ｉＴＴＭＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒにより、ggacatcgcccaaagtgaact（配列番号４４、ｓｈＴＲＰＭ４－１）およびgcatccagagagggttcattc（配列番号４５、ｓｈＴＲＰＭ４－２）をターゲットとして設計した。スクランブルｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＣＲ）はテストされ、マウスに既知のターゲットがないことが証明されている。ＧＰＩアンカー（LENGGTSLSEKTVLLLVTPFLAAAWSLHP、たとえば配列番号５３で使用）配列は、ユーロフィンジェノミクス（エーバースベルク、ドイツ）によって合成された。すべてのプライマーを合成し、すべてのプラスミドをユーロジェノミクスによるシーケンスによって確認した。
【0069】
［ミトコンドリアイメージング］
初代培養ニューロン（ＤＩＶ１５－ＤＩＶ１７）のカバースリップを使用して、ミトコンドリア膜電位（Ψｍ）とミトコンドリアカルシウムシグナル伝達を調べたが、これは、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．０ｍＭ ＣａＣｌ２、１．０ｍＭグリシン、３５．６ｍＭグルコース、および０．５ｍＭピルビン酸ナトリウムを含むＣＯ２非依存性培地（ＣＩＣＭ）中、室温で実施した。直立顕微鏡（BX51WI、オリンパス）の冷却ＣＣＤカメラ（iXon 887、Andor）によってすべての画像を取得した。励起フィルターホイール（MT-20、オリンパス）と組み合わせたキセノンアークランプによって蛍光励起を提供した。Ｃｅｌｌ＾Ｒソフトウェア（オリンパス）を使用してデータを収集し、ＩｍａｇｅＪを使用して分析し、Ｉｇｏｒ Ｐｒｏ（WaveMetrics）を使用して定量化した。小分子蛍光指示薬ローダミン１２３（Ｒｈ１２３、Molecular ProbeTM、R302）でΨmを検出した。初代培養ニューロンにＣＩＣＭ中の４．３μＭ Ｒｈ１２３を３７℃で３０分間ロードし、洗浄してさらに３０分間ＣＩＣＭに置いてから記録した。各実験の最後に、ミトコンドリア脱共役剤ＦＣＣＰ（５μＭ、Sigma-Aldrich、カタログ番号C2920）を細胞に適用して、最大Ｒｈ１２３蛍光強度に到達させた。２０倍の対物レンズを使用して４７０±２０ｎｍの励起波長と５２５±２５nmの発光波長でＲｈ１２３を画像化した。細胞質ゾルミトコンドリアシグナルによる汚染を最小限に抑えるために核内でＲｈ１２３蛍光強度を測定し、関心のある各領域の最大ＦＣＣＰシグナルにＲｈ１２３蛍光強度を正規化した。
初代培養ニューロン（ＤＩＶ１５－ＤＩＶ１７）のカバースリップを使用して、ミトコンドリア膜電位（Ψｍ）とミトコンドリアカルシウムシグナル伝達を調べたが、これは、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．０ｍＭ ＣａＣｌ２、１．０ｍＭグリシン、３５．６ｍＭグルコース、および０．５ｍＭピルビン酸ナトリウムを含むＣＯ２非依存性培地（ＣＩＣＭ）中、室温で実施した。直立顕微鏡（BX51WI、オリンパス）の冷却ＣＣＤカメラ（iXon 887、Andor）によってすべての画像を取得した。励起フィルターホイール（MT-20、オリンパス）と組み合わせたキセノンアークランプによって蛍光励起を提供した。Ｃｅｌｌ＾Ｒソフトウェア（オリンパス）を使用してデータを収集し、ＩｍａｇｅＪを使用して分析し、Ｉｇｏｒ Ｐｒｏ（WaveMetrics）を使用して定量化した。小分子蛍光指示薬ローダミン１２３（Ｒｈ１２３、Molecular ProbeTM、R302）でΨmを検出した。初代培養ニューロンにＣＩＣＭ中の４．３μＭ Ｒｈ１２３を３７℃で３０分間ロードし、洗浄してさらに３０分間ＣＩＣＭに置いてから記録した。各実験の最後に、ミトコンドリア脱共役剤ＦＣＣＰ（５μＭ、Sigma-Aldrich、カタログ番号C2920）を細胞に適用して、最大Ｒｈ１２３蛍光強度に到達させた。２０倍の対物レンズを使用して４７０±２０ｎｍの励起波長と５２５±２５nmの発光波長でＲｈ１２３を画像化した。細胞質ゾルミトコンドリアシグナルによる汚染を最小限に抑えるために核内でＲｈ１２３蛍光強度を測定し、関心のある各領域の最大ＦＣＣＰシグナルにＲｈ１２３蛍光強度を正規化した。
【0070】
初代培養ニューロンにおけるガバジン誘発ミトコンドリアＣａ２＋応答は、ミトコンドリアに特異的に位置するＦＲＥＴカルシウムインジケーター４ｍｔＤ３ｃｐｖを使用して、以前の研究（Qiu et al, Nat Commun. 2013;4:2034、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように記録および分析される。簡単に説明すると、ＦＲＥＴベースで、ミトコンドリアを標的としたＣａ２＋インジケーター４ｍｔＤ３ｃｐｖでミトコンドリアのＣａ２＋レベルを検出した。４ｍｔＤ３ｃｐｖを４３０±１２ｎｍ（ＣＦＰ）および５００±１０ｎｍ（ＹＦＰ）で励起し、ＣＦＰ（４７０±１２ｎｍ）およびＹＦＰ（５３５±１５ｎｍ）の発光を、ＤｕａｌＶｉｅｗビームスプリッター（AHF AnalysentechnikおよびMAG Biosystems）を使用して分離、フィルター処理し、すべての蛍光画像を１Hzで２０倍の水浸対物レンズを通して記録した。
【0071】
［定量化と統計］
すべての統計作業をＰｒｉｓｍ（GraphPad）によって実行した。プロットされたすべてのデータは、平均値±標準偏差を表す。特に明記しない限り、統計分析には二元配置分散分析を使用した。
すべての統計作業をＰｒｉｓｍ（GraphPad）によって実行した。プロットされたすべてのデータは、平均値±標準偏差を表す。特に明記しない限り、統計分析には二元配置分散分析を使用した。
【0072】
［試薬］
この研究では、以下の試薬を使用した。マレイン酸ＭＫ－８０１（BN338、Biotrend）、ＤＬ－ＡＰＶ（BN0858、Biotrend）、ＮＭＤＡ（BN0385、Biotrend）。
この研究では、以下の試薬を使用した。マレイン酸ＭＫ－８０１（BN338、Biotrend）、ＤＬ－ＡＰＶ（BN0858、Biotrend）、ＮＭＤＡ（BN0385、Biotrend）。
【実施例2】
【0073】
≪ＴＲＰＭ４のノックダウンはＮＭＤＡ受容体媒介毒性からニューロンを保護する≫
ＮＭＤＡ受容体媒介興奮毒性におけるＴＲＰＭ４の役割を調査するために、本発明者らは、ＲＮＡ干渉戦略を使用して、ＴＲＰＭ４をノックダウンした。培養された初代マウス海馬ニューロンは、インビトロで３日目（ＤＩＶ３）に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に感染し、スクランブルコントロール（ｓｈＳＣＲ）、ｓｈＴＲＰＭ４－１（配列番号４４）またはｓｈＴＲＰＭ４－２（配列番号４５）を発現した。ＤＩＶ１５－１６にニューロンをＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ、２０μM）に１０分間曝露した。ＮＭＤＡを洗い流した後、分析前にさらに２４時間、培地にニューロンを保持した。ＴＲＰＭ４に対して両方のｓｈＲＮＡによるＴＲＰＭ４のノックダウンは、ニューロンをＮＭＤＡ誘発興奮毒性から有意に保護した。したがって、明らかに、ＴＲＰＭ４はＮＭＤＡ受容体媒介興奮毒性のプロセスに関与している。
ＮＭＤＡ受容体媒介興奮毒性におけるＴＲＰＭ４の役割を調査するために、本発明者らは、ＲＮＡ干渉戦略を使用して、ＴＲＰＭ４をノックダウンした。培養された初代マウス海馬ニューロンは、インビトロで３日目（ＤＩＶ３）に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に感染し、スクランブルコントロール（ｓｈＳＣＲ）、ｓｈＴＲＰＭ４－１（配列番号４４）またはｓｈＴＲＰＭ４－２（配列番号４５）を発現した。ＤＩＶ１５－１６にニューロンをＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ、２０μM）に１０分間曝露した。ＮＭＤＡを洗い流した後、分析前にさらに２４時間、培地にニューロンを保持した。ＴＲＰＭ４に対して両方のｓｈＲＮＡによるＴＲＰＭ４のノックダウンは、ニューロンをＮＭＤＡ誘発興奮毒性から有意に保護した。したがって、明らかに、ＴＲＰＭ４はＮＭＤＡ受容体媒介興奮毒性のプロセスに関与している。
【実施例3】
【0074】
≪マウスＴＲＰＭ４のＮ末端ドメインにはＨＥＫ２９３細胞において発現したときに神経保護作用を示す配列が含まれている≫
次のステップで、本発明者らは、ＮＭＤＡ受容体媒介興奮毒性に潜在的に関与するマウスＴＲＰＭ４タンパク質の領域を同定しようとした。この目的のために、マウスＴＲＰＭ４タンパク質のポリペプチドフラグメントを生成し、ＮＭＤＡ誘発興奮毒性に対するそれらの影響を分析した。そうするために、初代ニューロン培養物をＤＩＶ３でそれぞれのｒＡＡＶに感染させ、ＤＩＶ１７で１０分間ＮＭＤＡ（２０μＭ）に曝露し、２４時間後に細胞死を評価した。
次のステップで、本発明者らは、ＮＭＤＡ受容体媒介興奮毒性に潜在的に関与するマウスＴＲＰＭ４タンパク質の領域を同定しようとした。この目的のために、マウスＴＲＰＭ４タンパク質のポリペプチドフラグメントを生成し、ＮＭＤＡ誘発興奮毒性に対するそれらの影響を分析した。そうするために、初代ニューロン培養物をＤＩＶ３でそれぞれのｒＡＡＶに感染させ、ＤＩＶ１７で１０分間ＮＭＤＡ（２０μＭ）に曝露し、２４時間後に細胞死を評価した。
【0075】
最初の一連の断片化実験（それぞれ配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９を含む）により、マウスＴＲＰＭ４のＮ末端ドメイン（配列番号４７）が、海馬ニューロンで発現した場合に、ＮＭＤＡ受容体が誘導する細胞死を防ぐことができる神経保護要素を含むことが明らかになった。上記と同様の方法で実施された配列番号４７のさらなる一連の断片化実験において、本発明者らは、神経保護効果を与えるアミノ酸モチーフを絞り込んだ。以下のフラグメントを含むポリペプチドを試験した。配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５。結果として、マウスＴＲＰＭ４のＮ末端の最もＣ末端部分であるａａ４３３－４８９のみが、海馬ニューロンで発現された場合、驚くほど神経保護的である（配列番号５）。
【実施例4】
【0076】
≪膜アンカーの添加は配列番号５によるペプチドの神経保護効果を増加させる≫
ＴＲＰＭ４の配列番号５の配列は、原形質膜のすぐ下にインビボで位置している。したがって、本発明者らは、配列番号５を含むポリペプチドの膜に近い位置が、前記ポリペプチドの神経保護効果を増加させる可能性があると推論した。この仮説をテストするために、本発明者らは、配列番号５およびＧＰＩアンカー、配列番号５７を含む融合タンパク質を作成した。融合タンパク質の配列を配列番号５３に示した。ｒＡＡＶに感染し、配列番号４７（対照）または配列番号５３を発現しているニューロンをＤＩＶ１５－１６で１０分間ＮＭＤＡ（２０μＭ）に曝露し、２４時間後に細胞死を評価した。その結果、ＧＰＩのような膜アンカーがニューロンを興奮毒性から保護する能力を高めることができることが示された。
ＴＲＰＭ４の配列番号５の配列は、原形質膜のすぐ下にインビボで位置している。したがって、本発明者らは、配列番号５を含むポリペプチドの膜に近い位置が、前記ポリペプチドの神経保護効果を増加させる可能性があると推論した。この仮説をテストするために、本発明者らは、配列番号５およびＧＰＩアンカー、配列番号５７を含む融合タンパク質を作成した。融合タンパク質の配列を配列番号５３に示した。ｒＡＡＶに感染し、配列番号４７（対照）または配列番号５３を発現しているニューロンをＤＩＶ１５－１６で１０分間ＮＭＤＡ（２０μＭ）に曝露し、２４時間後に細胞死を評価した。その結果、ＧＰＩのような膜アンカーがニューロンを興奮毒性から保護する能力を高めることができることが示された。
【実施例5】
【0077】
≪配列番号５の配列の変異体もＮＭＤＡ受容体媒介細胞毒性を低下させる≫
次のステップにおいて、本発明者らは、配列番号５の変異体を作成したが、ここで、２つの隣接するフェニルアラニン残基が、チロシン残基によって置換されている（配列番号５４）。さらに、本発明者らはまた、マウスＴＲＰＭ５の配列番号５に対応する領域が神経保護効果も提供するかどうかを評価した。ＴＲＰＭ５は、ＴＲＰＭ４に関連するタンパク質であるが、それでもＴＲＰＭ４とは異なっている。配列番号５、配列番号５５に対応するＴＲＰＭ５の領域は、配列番号５と約６０％の配列同一性のみを共有する。ニューロンをＤＩＶ３で配列番号５、配列番号５４または配列番号５５を発現するｒＡＡＶに感染させ、ＤＩＶ１７でＮＭＤＡ（２０μＭ）に１０分間曝露し、２４時間後に細胞死を評価した。結果として、２つのチロシン残基を含む保存的二重変異が、配列番号５よりもＮＭＤＡ受容体媒介細胞毒性を低減する効果がわずかに低いだけであるのに対し、配列番号５５のより遠縁のＴＲＰＭ５配列は、ＮＭＤＡ受容体媒介細胞毒性を低下させなかった。
次のステップにおいて、本発明者らは、配列番号５の変異体を作成したが、ここで、２つの隣接するフェニルアラニン残基が、チロシン残基によって置換されている（配列番号５４）。さらに、本発明者らはまた、マウスＴＲＰＭ５の配列番号５に対応する領域が神経保護効果も提供するかどうかを評価した。ＴＲＰＭ５は、ＴＲＰＭ４に関連するタンパク質であるが、それでもＴＲＰＭ４とは異なっている。配列番号５、配列番号５５に対応するＴＲＰＭ５の領域は、配列番号５と約６０％の配列同一性のみを共有する。ニューロンをＤＩＶ３で配列番号５、配列番号５４または配列番号５５を発現するｒＡＡＶに感染させ、ＤＩＶ１７でＮＭＤＡ（２０μＭ）に１０分間曝露し、２４時間後に細胞死を評価した。結果として、２つのチロシン残基を含む保存的二重変異が、配列番号５よりもＮＭＤＡ受容体媒介細胞毒性を低減する効果がわずかに低いだけであるのに対し、配列番号５５のより遠縁のＴＲＰＭ５配列は、ＮＭＤＡ受容体媒介細胞毒性を低下させなかった。
【実施例6】
【0078】
≪タンパク質形質導入ドメインに融合した配列番号５を含む融合タンパク質へのニューロンの曝露はＮＭＤＡ受容体媒介細胞毒性から保護する≫
さらなる実験において、本発明者らは、配列番号５とタンパク質形質導入ドメインＴＡＴ（配列番号４２）との融合を試験した。得られた融合タンパク質は、本明細書において配列番号５６で参照される。培養ニューロンをＤＭＳＯ（溶媒）、１μｇの配列番号５６または１０μｇの配列番号５６と１時間インキュベートした後、ＤＩＶ１５－１６でＮＭＤＡ（２０μＭ）に１０分間曝露し、２４時間後に細胞死を評価した。結果として、配列番号５６による融合タンパク質は、ニューロンをＮＭＤＡ興奮毒性から保護した。
さらなる実験において、本発明者らは、配列番号５とタンパク質形質導入ドメインＴＡＴ（配列番号４２）との融合を試験した。得られた融合タンパク質は、本明細書において配列番号５６で参照される。培養ニューロンをＤＭＳＯ（溶媒）、１μｇの配列番号５６または１０μｇの配列番号５６と１時間インキュベートした後、ＤＩＶ１５－１６でＮＭＤＡ（２０μＭ）に１０分間曝露し、２４時間後に細胞死を評価した。結果として、配列番号５６による融合タンパク質は、ニューロンをＮＭＤＡ興奮毒性から保護した。
【実施例7】
【0079】
≪マウス皮質におけるウイルスベクターを介した配列番号５の発現は中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）誘発性の脳損傷から保護する≫
培養ニューロンにおける配列番号５の強力な保護効果を考慮して、本発明者らは次に、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）マウス脳卒中モデルを使用して、インビボでのその神経保護の可能性を分析した。この急性神経変性疾患が選択されたのは、ＮＭＤＡ受容体によって誘発される興奮毒性が、虚血状態の誘発後の脳損傷に大きく寄与するためである。配列番号５の発現カセットを含むｒＡＡＶを、ＭＣＡＯの３週間前に定位的にマウス皮質に送達し、脳損傷を損傷の７日後に定量化した。皮質において配列番号５を発現するマウスの梗塞体積は、ＰＢＳを脳内に注射した対照マウスの梗塞体積よりも有意に小さかった。
培養ニューロンにおける配列番号５の強力な保護効果を考慮して、本発明者らは次に、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）マウス脳卒中モデルを使用して、インビボでのその神経保護の可能性を分析した。この急性神経変性疾患が選択されたのは、ＮＭＤＡ受容体によって誘発される興奮毒性が、虚血状態の誘発後の脳損傷に大きく寄与するためである。配列番号５の発現カセットを含むｒＡＡＶを、ＭＣＡＯの３週間前に定位的にマウス皮質に送達し、脳損傷を損傷の７日後に定量化した。皮質において配列番号５を発現するマウスの梗塞体積は、ＰＢＳを脳内に注射した対照マウスの梗塞体積よりも有意に小さかった。
【0080】
［方法］
マウスの皮質への定位脳内注射
体重２５±１ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｎ雄マウス（８週±５日齢）をランダムにグループ化し、Ｓｅｄｉｎ（Ｃ）、Ｍｉｄａｚｏｌａｍ、Ｆｅｎｔａｎｙｌ（Ｒ）－Ｊａｎｓｓｅｎの混合物で麻酔し、そして、ＡＴＣ１０００ ＤＣ直腸温度計（World Precision Instruments、ベルリン）によって温度制御されるヒートパッド上の齧歯動物定位フレームに配置した。Ｕｌｔｒａ Ｍｉｃｒｏ Ｐｕｍｐ ＩＩＩ（World Precision Instruments、ベルリン）を使用して１０μｌのＮａｎｏｆｉｌシリンジ（World Precision Instruments、ベルリン）を駆動し、ｒＡＡＶ－配列番号5）を左皮質に注入した（ブレグマに対する座標：第１部位：ＡＰ ０．２ｍｍ；ＭＬ ２．０；ＤＶ －２．０；第２部位：ＡＰ ０．２；ＭＬ ２．０；ＤＶ －１．８；第３部位：ＡＰ ０．２；ＭＬ ３．０；ＤＶ －４．０；第４部位：ＡＰ ０．２；ＭＬ ３．０；ＤＶ －３．５）。ｒＡＡＶの１－２×１０９ゲノム粒子を含む総量２μｌを２００ｎｌ／分の速度で注射した後、針を抜く前に逆流を防ぐために、針を各注射部位に２分間置いたままにした。対照マウスには、同じ方法を使用して同量のＰＢＳを注射した。定位注射後、ＡＴＩＰＡＺＯＬＥ、フルマゼニル、およびナロキソンとの混合物を皮下投与することにより、マウスを麻酔から回復させ、完全に目覚めたときにホームケージに戻した。ｒＡＡＶの定位送達の３週間後、動物は中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）を受けた。
マウスの皮質への定位脳内注射
体重２５±１ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｎ雄マウス（８週±５日齢）をランダムにグループ化し、Ｓｅｄｉｎ（Ｃ）、Ｍｉｄａｚｏｌａｍ、Ｆｅｎｔａｎｙｌ（Ｒ）－Ｊａｎｓｓｅｎの混合物で麻酔し、そして、ＡＴＣ１０００ ＤＣ直腸温度計（World Precision Instruments、ベルリン）によって温度制御されるヒートパッド上の齧歯動物定位フレームに配置した。Ｕｌｔｒａ Ｍｉｃｒｏ Ｐｕｍｐ ＩＩＩ（World Precision Instruments、ベルリン）を使用して１０μｌのＮａｎｏｆｉｌシリンジ（World Precision Instruments、ベルリン）を駆動し、ｒＡＡＶ－配列番号5）を左皮質に注入した（ブレグマに対する座標：第１部位：ＡＰ ０．２ｍｍ；ＭＬ ２．０；ＤＶ －２．０；第２部位：ＡＰ ０．２；ＭＬ ２．０；ＤＶ －１．８；第３部位：ＡＰ ０．２；ＭＬ ３．０；ＤＶ －４．０；第４部位：ＡＰ ０．２；ＭＬ ３．０；ＤＶ －３．５）。ｒＡＡＶの１－２×１０９ゲノム粒子を含む総量２μｌを２００ｎｌ／分の速度で注射した後、針を抜く前に逆流を防ぐために、針を各注射部位に２分間置いたままにした。対照マウスには、同じ方法を使用して同量のＰＢＳを注射した。定位注射後、ＡＴＩＰＡＺＯＬＥ、フルマゼニル、およびナロキソンとの混合物を皮下投与することにより、マウスを麻酔から回復させ、完全に目覚めたときにホームケージに戻した。ｒＡＡＶの定位送達の３週間後、動物は中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）を受けた。
【0081】
ＭＣＡＯ
中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）は、中大脳動脈（ＭＣＡ）の永続的な遠位閉塞を誘発した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雄マウス（８週±５日齢）を５００μｌのトリブロメタノール（２５０ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射により麻酔し、横臥位に置いた。動物は自発呼吸をさせられ、換気されなかった。左目から耳まで切開した。電気凝固によって側頭筋を除去すると、頭蓋骨の半透明の側頭表面を通して左のＭＣＡが見えた。歯科用ドリルで側頭骨に小さな穿頭孔をあけた後、細い鉗子で頭蓋骨の内層を取り除き、硬膜を注意深く開いてＭＣＡを露出させた。脳組織への損傷を避けるために注意が払われた。ＭＣＡ周辺にＮａＣｌ溶液（０．９％）が存在した。マイクロバイポーラ電気凝固装置ＥＲＢＥＩＣＣ ２００（Erbe Elektromedizin GmbH、テュービンゲン）を使用して、ＭＣＡを恒久的に閉塞した。外科的処置の間、ＡＴＣ１０００ ＤＣ温度制御ヒートプレート（World Precision Instruments、ベルリン）を使用して、直腸温度を３７±０．５℃に維持した。切開を閉じた後、マウスを麻酔から回復させ、ホームケージに戻し、ケージにＨＴ ５０ Ｓヒートプレート（Minitub、ティーフェンバッハ）に置いて温度を３７℃に維持した。これらの条件で、麻酔から完全に回復するまで動物を恒温状態に維持した。偽手術されたマウスにＭＣＡ閉塞なしで同一の手順を受けさせた。ＭＣＡＯ後７日目に、Ｎａｒｃｏｒｅｎ（Ｒ）による深麻酔下で動物を犠牲にし、２０ｍｌのＮａＣｌ溶液（０．９％）を心臓内に灌流した。脳を頭蓋骨から取り出し、すぐにドライアイスで凍結させた。６つの連続した厚さ２０μｍの冠状凍結切片を４００μｍごとに切断し、標準的な銀染色技術を使用して総梗塞体積を測定した。
銀染色切片を１２００ｄｐｉでスキャンし、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（NIH Image）を使用して梗塞領域を測定した。治療群の知識を持たない研究者によって手術が行われ虚血性損傷が測定され、ｒＡＡＶまたは組換えタンパク質が定位注射または鼻腔内送達によって適用された。
中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）は、中大脳動脈（ＭＣＡ）の永続的な遠位閉塞を誘発した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雄マウス（８週±５日齢）を５００μｌのトリブロメタノール（２５０ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射により麻酔し、横臥位に置いた。動物は自発呼吸をさせられ、換気されなかった。左目から耳まで切開した。電気凝固によって側頭筋を除去すると、頭蓋骨の半透明の側頭表面を通して左のＭＣＡが見えた。歯科用ドリルで側頭骨に小さな穿頭孔をあけた後、細い鉗子で頭蓋骨の内層を取り除き、硬膜を注意深く開いてＭＣＡを露出させた。脳組織への損傷を避けるために注意が払われた。ＭＣＡ周辺にＮａＣｌ溶液（０．９％）が存在した。マイクロバイポーラ電気凝固装置ＥＲＢＥＩＣＣ ２００（Erbe Elektromedizin GmbH、テュービンゲン）を使用して、ＭＣＡを恒久的に閉塞した。外科的処置の間、ＡＴＣ１０００ ＤＣ温度制御ヒートプレート（World Precision Instruments、ベルリン）を使用して、直腸温度を３７±０．５℃に維持した。切開を閉じた後、マウスを麻酔から回復させ、ホームケージに戻し、ケージにＨＴ ５０ Ｓヒートプレート（Minitub、ティーフェンバッハ）に置いて温度を３７℃に維持した。これらの条件で、麻酔から完全に回復するまで動物を恒温状態に維持した。偽手術されたマウスにＭＣＡ閉塞なしで同一の手順を受けさせた。ＭＣＡＯ後７日目に、Ｎａｒｃｏｒｅｎ（Ｒ）による深麻酔下で動物を犠牲にし、２０ｍｌのＮａＣｌ溶液（０．９％）を心臓内に灌流した。脳を頭蓋骨から取り出し、すぐにドライアイスで凍結させた。６つの連続した厚さ２０μｍの冠状凍結切片を４００μｍごとに切断し、標準的な銀染色技術を使用して総梗塞体積を測定した。
銀染色切片を１２００ｄｐｉでスキャンし、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（NIH Image）を使用して梗塞領域を測定した。治療群の知識を持たない研究者によって手術が行われ虚血性損傷が測定され、ｒＡＡＶまたは組換えタンパク質が定位注射または鼻腔内送達によって適用された。
【0082】
結果として、配列番号５の配列を含むポリペプチドの発現は、梗塞体積を効果的に減少させ、それにより、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）によって誘発された脳損傷から保護する。
【実施例8】
【0083】
≪配列番号５の配列を含むペプチドおよびその変異体はＮＭＤＡ受容体によって誘発されるミトコンドリア膜電位の破壊から保護する≫
ミトコンドリア機能障害は、ＮＭＤＡ受容体興奮毒性の特徴であり、神経細胞死に向かう途中の初期の事象である。ミトコンドリアの完全性を評価するためによく使用されるパラメーターは、ミトコンドリア膜電位である。ミトコンドリア膜電位の崩壊は、海馬または皮質ニューロンをＮＭＤＡに曝露した後に観察され、興奮毒性に関連するミトコンドリア機能障害を示す。したがって、本発明者らは、初代マウス海馬ニューロンにおけるミトコンドリア膜電位破壊における、配列番号５または配列番号５４の配列ならびに対照ＴＲＭＰ５配列（配列番号５５）を含むポリペプチドの効果を調査した。ミトコンドリア膜電位の破壊につながる興奮毒性は、２０μＭのＮＭＤＡの浴適用で誘発された。１１分後、ミトコンドリア脱共役剤であるカルボニルシアニド－ｐ－トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）を添加した。ＦＣＣＰを追加すると、ミトコンドリア膜電位が破壊され、テストシステムの対照として機能した。
ミトコンドリア機能障害は、ＮＭＤＡ受容体興奮毒性の特徴であり、神経細胞死に向かう途中の初期の事象である。ミトコンドリアの完全性を評価するためによく使用されるパラメーターは、ミトコンドリア膜電位である。ミトコンドリア膜電位の崩壊は、海馬または皮質ニューロンをＮＭＤＡに曝露した後に観察され、興奮毒性に関連するミトコンドリア機能障害を示す。したがって、本発明者らは、初代マウス海馬ニューロンにおけるミトコンドリア膜電位破壊における、配列番号５または配列番号５４の配列ならびに対照ＴＲＭＰ５配列（配列番号５５）を含むポリペプチドの効果を調査した。ミトコンドリア膜電位の破壊につながる興奮毒性は、２０μＭのＮＭＤＡの浴適用で誘発された。１１分後、ミトコンドリア脱共役剤であるカルボニルシアニド－ｐ－トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）を添加した。ＦＣＣＰを追加すると、ミトコンドリア膜電位が破壊され、テストシステムの対照として機能した。
【0084】
結果として、それぞれ配列番号５および配列番号５４の配列を含むポリペプチドは、両方とも、ＮＭＤＡ受容体によって誘導されるミトコンドリア膜電位の破壊を防ぐことができたが、配列番号５５のより遠縁のＴＲＰＭ５配列は、 ＮＭＤＡ受容体によって誘発されるミトコンドリア膜電位の破壊を防ぐことはできなかった。
【実施例9】
【0085】
≪配列番号５および配列番号５４によるペプチドはシナプスＮＭＤＡ受容体シグナル伝達に影響を及ぼさない≫
さらなる実験において、本発明者らは、シナプスＮＭＤＡ受容体シグナル伝達の尺度であるガバジン誘導カルシウム流入（ミトコンドリア）における、それぞれ配列番号５および配列番号５４の配列を含むポリペプチドの影響を評価した。実験を上記のように初代培養ニューロンで実施した。結果として、配列番号５の配列を含むポリペプチドも配列番号５４の配列を含むポリペプチドも、ミトコンドリアへのガバジン誘導カルシウム流入を妨害せず、これらのポリペプチドのいずれもシナプスＮＭＤＡ受容体シグナル伝達に影響を及ぼさないことを示している。
さらなる実験において、本発明者らは、シナプスＮＭＤＡ受容体シグナル伝達の尺度であるガバジン誘導カルシウム流入（ミトコンドリア）における、それぞれ配列番号５および配列番号５４の配列を含むポリペプチドの影響を評価した。実験を上記のように初代培養ニューロンで実施した。結果として、配列番号５の配列を含むポリペプチドも配列番号５４の配列を含むポリペプチドも、ミトコンドリアへのガバジン誘導カルシウム流入を妨害せず、これらのポリペプチドのいずれもシナプスＮＭＤＡ受容体シグナル伝達に影響を及ぼさないことを示している。
【実施例10】
【0086】
≪マウスＴＲＰＭ４の配列番号５に結合する可能性のある化合物の仮想スクリーニング≫
次のステップにおいて、本発明者らは、ＮＭＤＡ受容体誘発毒性を無効にすることができる可能性のある化合物を特定することを目的として、ＴＲＰＭ４の上記で特定された重要なドメインと相互作用することができる小分子化合物の特定を試みた。
次のステップにおいて、本発明者らは、ＮＭＤＡ受容体誘発毒性を無効にすることができる可能性のある化合物を特定することを目的として、ＴＲＰＭ４の上記で特定された重要なドメインと相互作用することができる小分子化合物の特定を試みた。
【0087】
［タンパク質構造］
この研究に使用されたタンパク質構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ ＩＤ：６ＢＣＯ）に寄託されたマウスＴＲＰＭ４の２．８８Å低温電子顕微鏡構造であった。代替は、５ＷＰ６、６ＢＱＲ、６ＢＱＶなどのヒトの構造である。他のアクティビティの前に、構造をＭａｅｓｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｗｉｚａｒｄ（Schroedinger Release 2017-3: Maestro, Schroedinger, LLC, New York, NY, 2017）にかけ、潜在的なアーティファクトを除去し、水素原子を追加し、７．０のｐＨに従って残基のプロトン化状態を割り当てた。準備後、タンパク質に属さないすべての原子（ＡＴＰ分子など）を除去した。
この研究に使用されたタンパク質構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ ＩＤ：６ＢＣＯ）に寄託されたマウスＴＲＰＭ４の２．８８Å低温電子顕微鏡構造であった。代替は、５ＷＰ６、６ＢＱＲ、６ＢＱＶなどのヒトの構造である。他のアクティビティの前に、構造をＭａｅｓｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｗｉｚａｒｄ（Schroedinger Release 2017-3: Maestro, Schroedinger, LLC, New York, NY, 2017）にかけ、潜在的なアーティファクトを除去し、水素原子を追加し、７．０のｐＨに従って残基のプロトン化状態を割り当てた。準備後、タンパク質に属さないすべての原子（ＡＴＰ分子など）を除去した。
【0088】
［結合部位の定義］
分子ドッキングに使用される領域を、タンパク質活性に関連すると考えられるＴＲＰＭ４残基（６ＢＣＯ残基６３３－６５０、６５４、６５５、６５７、６６４－６６８）に４Å近接して定義した。配列番号５のアミノ酸残基１から３６も参照のこと。
分子ドッキングに使用される領域を、タンパク質活性に関連すると考えられるＴＲＰＭ４残基（６ＢＣＯ残基６３３－６５０、６５４、６５５、６５７、６６４－６６８）に４Å近接して定義した。配列番号５のアミノ酸残基１から３６も参照のこと。
【0089】
［分子ドッキング］
タンパク質構造へのドッキングを、Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ Ｇｌｉｄｅ（Schroedinger Release 2017-3: Glide, Schroedinger, LLC, New York, NY, 2017）を使用して実行した。初期化合物をハイスループット仮想スクリーニング（ＨＴＶＳ）モードでドッキングした。ＨＴＶＳからのヒット（－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上のドッキングスコアが必要）を、より正確で計算コストの高いＳＰドッキングモードに渡した。ドッキングスコアが－６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上のＳＰヒットを、ＯＰＬＳ３力場を使用してリガンドひずみ計算（そのポーズと最小エネルギー溶液コンフォメーション間のエネルギー差）にかけた。大量の回転可能な結合を持つ分子を除いて、７ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のひずみが一般的に望まれていた。最終的な化合物の選択を、ドッキングスコア、ひずみ値、およびドッキングされたポーズの目視検査に基づいて行った。対応する画像を、ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣを使用して生成した。
タンパク質構造へのドッキングを、Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ Ｇｌｉｄｅ（Schroedinger Release 2017-3: Glide, Schroedinger, LLC, New York, NY, 2017）を使用して実行した。初期化合物をハイスループット仮想スクリーニング（ＨＴＶＳ）モードでドッキングした。ＨＴＶＳからのヒット（－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上のドッキングスコアが必要）を、より正確で計算コストの高いＳＰドッキングモードに渡した。ドッキングスコアが－６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上のＳＰヒットを、ＯＰＬＳ３力場を使用してリガンドひずみ計算（そのポーズと最小エネルギー溶液コンフォメーション間のエネルギー差）にかけた。大量の回転可能な結合を持つ分子を除いて、７ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のひずみが一般的に望まれていた。最終的な化合物の選択を、ドッキングスコア、ひずみ値、およびドッキングされたポーズの目視検査に基づいて行った。対応する画像を、ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣを使用して生成した。
【0090】
［結果］
スクリーニングにより、以下の有望な化合物が得られた。
スクリーニングにより、以下の有望な化合物が得られた。
【0091】
【表2A】
【0092】
【表2B】
【実施例11】
【0093】
≪本発明による小分子はＮＭＤＡ受容体によって誘発される細胞毒性から保護する≫
この実験では、以下の化合物を、ＮＭＤＡ受容体によって誘発される細胞毒性からＨＥＫ２９３細胞を保護するための適合性について試験した。
この実験では、以下の化合物を、ＮＭＤＡ受容体によって誘発される細胞毒性からＨＥＫ２９３細胞を保護するための適合性について試験した。
【0094】
【表3A】
【0095】
【表3B】
【0096】
実験は上記のように実施された。その結果、化合物Ｐ４、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１３、およびＰ１５は、ＮＭＤＡ受容体によって誘発される細胞死のレベルを低下させた。グリベンクラミドはＴＲＰＭ４機能の既知のブロッカーであり、陽性対照として用いた。これらの物質で観察された効果は、ＮＭＤＡ受容体媒介細胞毒性を阻害するための適切な候補化合物を特定するための仮想スクリーニングの有用性と、ＮＭＤＡ受容体媒介細胞毒性に対する本発明のＴＲＰＭ４モチーフの重要性を確かにする。
【実施例12】
【0097】
≪本発明によるさらなる小分子≫
上記の実施例１１の化合物Ｐ４について得られた結果を考慮して、以下の追加の９つのその変形例について、実質的に上記のようにして試験した。
上記の実施例１１の化合物Ｐ４について得られた結果を考慮して、以下の追加の９つのその変形例について、実質的に上記のようにして試験した。
【0098】
【表4】
【0099】
実験は上記のように実施された。簡単に説明すると、ニューロンを１０μＭの示された化合物で３０分間前処理し、次にＮＭＤＡ（２０μＭ）に１０分間（一過性ＮＭＤＡ毒性）またはＮＭＤＡ（２０μＭ）に２４時間（慢性ＮＭＤＡ毒性）曝露した。ＮＭＤＡ曝露の２４時間後に細胞死を評価した。細胞死を評価するために、ニューロンをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒド、４％スクロースで１５分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（１μｇ／ｍｌ）で１０分間対比染色した。細胞をＭｏｗｉｏｌ４－８８にマウントし、蛍光顕微鏡で検査した。死んだニューロンを無定形または収縮した核によって識別した。その結果、化合物Ｐ４の変異体、すなわち化合物Ｐ４０１からＰ４０９は、ＮＭＤＡ受容体によって誘発される細胞死のレベルを低下させた。
【実施例13】
【0100】
≪ＴＲＰＭ４ノックアウトＨＥＫ２９３細胞におけるＮＭＤＡ受容体媒介毒性≫
さらなる実験において、ＨＥＫ２９３細胞におけるＮＭＤＡ受容体媒介毒性におけるＴＲＰＭ４ノックアウトの影響を評価した。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞（野生型系統とＴＲＰＭ４ノックアウト系統の両方）（Ozhathil et al., British Journal of Pharmacology 175, 2504-2519）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、GibcoTM、10270）、１％ピルビン酸ナトリウム（GibcoTM、11360070）、１％ＭＥＭ ＮＥＡＡ（GibcoTM、11140035）、および０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ－Ｓ、Sigma、P0781）を追加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、GibcoTM、41965-039）で培養し、継代数１５－２５を実験に使用した。本発明による化合物の細胞毒性を試験するために、ＧＲＩＮ１とＧＲＩＮ２Ａ、またはＧＲＩＮ１とＧＲＩＮ２Ｂの両方をそれぞれ（１：１、０．２ｍｇ／ｃｍ２）、製造元の指示に従ってリポフェクタミン２０００でプレーティングしてから２４時間後に、ＨＥＫ２９３細胞（７０－８０％コンフルエント）をトランスフェクトした。トランスフェクション後の示された時点での集団内の死細胞の相対数を、わずかな変更を加えた製造元の指示に従って、ＣｙｔｏＴｏｘ－ＧｌｏＴＭ細胞毒性アッセイ（Promega、G9290）で測定した。簡単に説明すると、全培地の１０％を１０μＬのＡＡＦ－アミノルシフェリンと混合して、水で２００μＬの最終容量に到達させ、死細胞の相対発光単位（ＤＲＬＵ）を９６ウェルの白い底のポリスチレンマイクロプレート（Corning Costar(R)、3912）中でＧｌｏＭａｘ（Promega）によって測定した。すべての測定後、溶解試薬を細胞に添加し、溶解物の１０％を全細胞相対発光単位（ＴＲＬＵ）測定に使用した。細胞死を次の方程式で計算した。
さらなる実験において、ＨＥＫ２９３細胞におけるＮＭＤＡ受容体媒介毒性におけるＴＲＰＭ４ノックアウトの影響を評価した。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞（野生型系統とＴＲＰＭ４ノックアウト系統の両方）（Ozhathil et al., British Journal of Pharmacology 175, 2504-2519）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、GibcoTM、10270）、１％ピルビン酸ナトリウム（GibcoTM、11360070）、１％ＭＥＭ ＮＥＡＡ（GibcoTM、11140035）、および０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ－Ｓ、Sigma、P0781）を追加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、GibcoTM、41965-039）で培養し、継代数１５－２５を実験に使用した。本発明による化合物の細胞毒性を試験するために、ＧＲＩＮ１とＧＲＩＮ２Ａ、またはＧＲＩＮ１とＧＲＩＮ２Ｂの両方をそれぞれ（１：１、０．２ｍｇ／ｃｍ２）、製造元の指示に従ってリポフェクタミン２０００でプレーティングしてから２４時間後に、ＨＥＫ２９３細胞（７０－８０％コンフルエント）をトランスフェクトした。トランスフェクション後の示された時点での集団内の死細胞の相対数を、わずかな変更を加えた製造元の指示に従って、ＣｙｔｏＴｏｘ－ＧｌｏＴＭ細胞毒性アッセイ（Promega、G9290）で測定した。簡単に説明すると、全培地の１０％を１０μＬのＡＡＦ－アミノルシフェリンと混合して、水で２００μＬの最終容量に到達させ、死細胞の相対発光単位（ＤＲＬＵ）を９６ウェルの白い底のポリスチレンマイクロプレート（Corning Costar(R)、3912）中でＧｌｏＭａｘ（Promega）によって測定した。すべての測定後、溶解試薬を細胞に添加し、溶解物の１０％を全細胞相対発光単位（ＴＲＬＵ）測定に使用した。細胞死を次の方程式で計算した。
【0101】
【数2】
【0102】
その結果、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性は、野生型ＨＥＫ２９３細胞と比較してＴＲＰＭ４ノックアウトＨＥＫ２９３細胞で大幅に減少した。これは、実施例２で報告された結果と一致している。
【実施例14】
【0103】
≪化合物Ｐ４およびＰ１５がＮＭＤＡ誘発カルシウムトランジェントに及ぼす影響≫
さらなる実験において、ＮＭＤＡによって誘発されるカルシウムトランジェントにおけるＰ4およびＰ15の影響を評価した。簡単に説明すると、カルシウムイメージングでは、カバースリップ上の初代海馬ニューロンを、細胞透過性の高親和性レシオメトリックカルシウムインジケーターＦｕｒａ２－ＡＭ（InvitrogenTM F1221）とともに、１μＭでＣＯ２非依存性培養培地（ＣＩＣＭ、ＣＩＣＭは、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．０ｍＭ ＣａＣｌ２、１．０ｍＭグリシン、３５．６ｍＭグルコースおよび０．５ｍＭピルビン酸Ｎａを含む）に３７℃で３０分間ロードし、洗浄し、ＣＩＣＭにさらに３０分間放置して脱エステル化を行った。Ｆｕｒａ２を３４０／１１ｎｍおよび３８０／１１ｎｍで励起し、蛍光発光を５１０／２０ｎｍ発光フィルターを介して４０倍のＵＶ互換対物レンズ（LUMPLFLN、オリンパス）から得た。定量化のために、ＩｍａｇｅＪを使用して、各ニューロンからの３４０ｎｍおよび３８０ｎｍの励起（Ｆ３４０およびＦ３８０）について平均バックグラウンド減算蛍光強度を計算した。細胞内カルシウムレベルを経時的にＦ３４０／Ｆ３８０比としてプロットし、そこからＮＭＤＡ応答振幅および曲線下面積（ＡＵＣ）を計算して、ＮＭＤＡ誘発性カルシウム流入を定量化した。
さらなる実験において、ＮＭＤＡによって誘発されるカルシウムトランジェントにおけるＰ4およびＰ15の影響を評価した。簡単に説明すると、カルシウムイメージングでは、カバースリップ上の初代海馬ニューロンを、細胞透過性の高親和性レシオメトリックカルシウムインジケーターＦｕｒａ２－ＡＭ（InvitrogenTM F1221）とともに、１μＭでＣＯ２非依存性培養培地（ＣＩＣＭ、ＣＩＣＭは、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．０ｍＭ ＣａＣｌ２、１．０ｍＭグリシン、３５．６ｍＭグルコースおよび０．５ｍＭピルビン酸Ｎａを含む）に３７℃で３０分間ロードし、洗浄し、ＣＩＣＭにさらに３０分間放置して脱エステル化を行った。Ｆｕｒａ２を３４０／１１ｎｍおよび３８０／１１ｎｍで励起し、蛍光発光を５１０／２０ｎｍ発光フィルターを介して４０倍のＵＶ互換対物レンズ（LUMPLFLN、オリンパス）から得た。定量化のために、ＩｍａｇｅＪを使用して、各ニューロンからの３４０ｎｍおよび３８０ｎｍの励起（Ｆ３４０およびＦ３８０）について平均バックグラウンド減算蛍光強度を計算した。細胞内カルシウムレベルを経時的にＦ３４０／Ｆ３８０比としてプロットし、そこからＮＭＤＡ応答振幅および曲線下面積（ＡＵＣ）を計算して、ＮＭＤＡ誘発性カルシウム流入を定量化した。
【0104】
驚くべきことに、ＮＭＤＡ誘発性カルシウムトランジェントを完全にブロックした古典的なＮＭＤＡ受容体遮断薬ＭＫ－８０１とは異なり、化合物Ｐ４も化合物Ｐ１５も海馬ニューロンのＮＭＤＡ誘発性カルシウムトランジェントを減少させなかった。したがって、Ｐ４とＰ１５は、ＮＭＤＡ受容体の興奮毒性をブロックするが、シナプスから核へのシグナル伝達、遺伝子調節、学習や記憶などの認知機能におけるＮＭＤＡ受容体の生理学的役割に不可欠な、ＮＭＤＡ受容体のカルシウムチャネル機能を損なうことはない。
【実施例15】
【0105】
≪ＮＭＤＡ受容体／ＴＲＰＭ４複合体免疫沈降における化合物Ｐ４の影響≫
さらなる実験において、化合物Ｐ４がＮＭＤＡ受容体／ＴＲＰＭ４複合体形成に何らかの影響を与えるかどうかを評価した。この目的のために、マウス皮質からの脳溶解物を使用する共免疫沈降実験を行った。簡単に説明すると、対照マウスと、化合物Ｐ４（４０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射の２時間、６時間および２４時間後のマウスから皮質溶解物を得て、免疫沈降緩衝液（１０mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ－４０、１０％グリセロールと、Protease Inhibitor Cocktail、Roche）中に６０分間おいた。次に、溶解物を１２００ｇで１２分間遠心分離して、細胞破片および核を除去した。上清の混合物を抗ＴＲＰＭ４抗体とともに一晩インキュベートした。ＰｉｅｒｃｅＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓを混合物に加え、さらに１２時間混合した後、免疫沈降バッファーで３回洗浄した。続いて、沈殿物をタンパク質ローディングバッファーで煮沸し、７．５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中で分離した。
さらなる実験において、化合物Ｐ４がＮＭＤＡ受容体／ＴＲＰＭ４複合体形成に何らかの影響を与えるかどうかを評価した。この目的のために、マウス皮質からの脳溶解物を使用する共免疫沈降実験を行った。簡単に説明すると、対照マウスと、化合物Ｐ４（４０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射の２時間、６時間および２４時間後のマウスから皮質溶解物を得て、免疫沈降緩衝液（１０mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ－４０、１０％グリセロールと、Protease Inhibitor Cocktail、Roche）中に６０分間おいた。次に、溶解物を１２００ｇで１２分間遠心分離して、細胞破片および核を除去した。上清の混合物を抗ＴＲＰＭ４抗体とともに一晩インキュベートした。ＰｉｅｒｃｅＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓを混合物に加え、さらに１２時間混合した後、免疫沈降バッファーで３回洗浄した。続いて、沈殿物をタンパク質ローディングバッファーで煮沸し、７．５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中で分離した。
【0106】
本発明者らは、４０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｐ４の単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射後、２時間で５１％および６時間で６１％のＮＭＤＡ受容体／ＴＲＰＭ４複合体形成の減少を発見した。化合物Ｐ４のｉ．ｐ．注射の２４時間後、ＮＭＤＡ受容体／ＴＲＰＭ４複合体が再形成された。
【実施例16】
【0107】
≪網膜神経節細胞（ＲＧＣ）のＮＭＤＡ誘発性変性における化合物Ｐ4の影響≫
本発明者らはまた、化合物Ｐ４がＮＭＤＡ誘発性変性から網膜神経節細胞を保護できるかどうかを評価した。この目的のために、２８匹のC５７ＢＬ／６Ｊマウス（２５±３．５ｇ）を２つのグループにランダムに割り当てた。すべてのマウスに、各注射の容量が５０μＬの－１６時間、－３時間、０時間、＋３時間、および＋２４時間における腹腔内注射により、溶媒（５％エタノールを含むひまわり油）またはＰ４（４０ｍｇ／ｋｇ、５％エタノールを含むひまわり油に溶解）を投与した。０時間後、マウスの左眼に硝子体内注射により２０ｎｍｏｌのＮＭＤＡ（総量２．０μＬ）を、右眼に生理食塩水（総量２．０μＬ）を投与した。硝子体内注射の７日後に安楽死させたマウスから両眼を取り出し、１５分間ホルマリンで固定した後、網膜を解剖し、全マウント免疫染色の処理を行った。網膜をブロッキング溶液（１０％ＦＢＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ １００を含むＰＢＳ）中で６時間インキュベートした後、ブロッキング溶液中で抗Ｂｒｎ３ａ抗体とともに４℃で２４時間インキュベートした。網膜をＰＢＳで３回洗浄し、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－５９４とともに室温で２４時間インキュベートした。網膜を再度洗浄し、切断してスライドに載せた。各網膜について、抹消網膜周辺（各象限から２つ、黄斑円孔まで約６００μｍまたは約１４００μｍに位置する）の８つのフィールド（５５４μｍ×５５４μｍ）から画像を取得し、ＲＧＣ密度の位置に関連する変動を最小限に抑えた。ＤＭ6 ＣＦＳ直立共焦点顕微鏡のＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８ＬＩＡのＨＣ ＰＬ ＡＰＯ ２０倍対物レンズを介し、Ｌａｓ Ｘソフトウェアを使用してすべての画像を取得した。Ｂｒｎ３ａ陽性細胞をＣｅｌｌｐｒｏｆｉｌｅｒのマクロで識別、カウントした。治療の知識がないシングルブラインドベースでデータ分析を行った。
本発明者らはまた、化合物Ｐ４がＮＭＤＡ誘発性変性から網膜神経節細胞を保護できるかどうかを評価した。この目的のために、２８匹のC５７ＢＬ／６Ｊマウス（２５±３．５ｇ）を２つのグループにランダムに割り当てた。すべてのマウスに、各注射の容量が５０μＬの－１６時間、－３時間、０時間、＋３時間、および＋２４時間における腹腔内注射により、溶媒（５％エタノールを含むひまわり油）またはＰ４（４０ｍｇ／ｋｇ、５％エタノールを含むひまわり油に溶解）を投与した。０時間後、マウスの左眼に硝子体内注射により２０ｎｍｏｌのＮＭＤＡ（総量２．０μＬ）を、右眼に生理食塩水（総量２．０μＬ）を投与した。硝子体内注射の７日後に安楽死させたマウスから両眼を取り出し、１５分間ホルマリンで固定した後、網膜を解剖し、全マウント免疫染色の処理を行った。網膜をブロッキング溶液（１０％ＦＢＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ １００を含むＰＢＳ）中で６時間インキュベートした後、ブロッキング溶液中で抗Ｂｒｎ３ａ抗体とともに４℃で２４時間インキュベートした。網膜をＰＢＳで３回洗浄し、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－５９４とともに室温で２４時間インキュベートした。網膜を再度洗浄し、切断してスライドに載せた。各網膜について、抹消網膜周辺（各象限から２つ、黄斑円孔まで約６００μｍまたは約１４００μｍに位置する）の８つのフィールド（５５４μｍ×５５４μｍ）から画像を取得し、ＲＧＣ密度の位置に関連する変動を最小限に抑えた。ＤＭ6 ＣＦＳ直立共焦点顕微鏡のＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８ＬＩＡのＨＣ ＰＬ ＡＰＯ ２０倍対物レンズを介し、Ｌａｓ Ｘソフトウェアを使用してすべての画像を取得した。Ｂｒｎ３ａ陽性細胞をＣｅｌｌｐｒｏｆｉｌｅｒのマクロで識別、カウントした。治療の知識がないシングルブラインドベースでデータ分析を行った。
【0108】
本発明者らは、ＮＭＤＡ（２０ｎｍｏｌ）をマウスに硝子体内注射した後の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の変性を化合物Ｐ４が減少させることを見出した。
【実施例17】
【0109】
≪ＴＲＰＭ４チャネル機能における化合物Ｐ４および化合物Ｐ１５の影響≫
ＮＭＤＡ受容体とは独立したＴＲＰＭ４チャネル機能に対する化合物Ｐ４および化合物Ｐ１５の直接的な影響を評価するために、本発明者らは、前立腺癌細胞株ＰＣ３およびパッチクランプ記録を使用した。ＰＣ３細胞はＴＲＰＭ４チャネルを発現することが知られている（C. Holzmann et al., Oncotarget. 6, 41783-93 (2015)）。次に、ＴＲＰＭ４電流は、カルシウム依存性と外向き整流によって特徴付けられる（P. Launay et al., Cell. 109, 397-407 (2002)）。簡単に説明すると、固定ステージ直立顕微鏡（BX51WI、オリンパス）に取り付けられた記録チャンバー（OAC-1、Science Products GmbH）内のプラチナリングで固定された１２ｍｍの丸いカバースリップにプレーティングされたＰＣ３細胞から全細胞パッチクランプ記録を行った。連続的に流れる（３ｍｌ／分）３２－３５℃の細胞外液（ｍＭでＮａＣｌが１５６、ＭｇＣｌ２が２、ＣａＣｌ２が１．５、ＨＥＰＥＳが１０、グルコースが１０）にカバースリップを沈めた。パッチ電極（３－４ＭΩ）は１．５ｍｍのホウケイ酸ガラスでできており、セシウムベースの溶液（ｍＭでＣｓＣｌが１４５、ＮａＣｌが８、ＨＥＰＥＳが１０、ＭｇＣｌ２が１、加えて、遊離Ｃａ２＋濃度が０のときＥＧＴＡが０．２、または計算された遊離Ｃａ２＋濃度が１０μＭのときＥＧＴＡが１０でＣａＣｌ２が９．４、Maxchelator, Stanford University）で満たされている。Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７００Ｂ増幅器で記録を行い、Ｄｉｇｉｄａｔａ １５５０Ｂを介してデジタル化し、ｐＣｌａｍｐ １０ソフトウェア（Molecular Devices）を使用して取得と分析を行った。アクセス抵抗（範囲が１０－２０ＭΩ）は、電圧クランプの記録中に定期的に監視され、２０％を超える変化が発生した場合はデータが拒否された。
ＮＭＤＡ受容体とは独立したＴＲＰＭ４チャネル機能に対する化合物Ｐ４および化合物Ｐ１５の直接的な影響を評価するために、本発明者らは、前立腺癌細胞株ＰＣ３およびパッチクランプ記録を使用した。ＰＣ３細胞はＴＲＰＭ４チャネルを発現することが知られている（C. Holzmann et al., Oncotarget. 6, 41783-93 (2015)）。次に、ＴＲＰＭ４電流は、カルシウム依存性と外向き整流によって特徴付けられる（P. Launay et al., Cell. 109, 397-407 (2002)）。簡単に説明すると、固定ステージ直立顕微鏡（BX51WI、オリンパス）に取り付けられた記録チャンバー（OAC-1、Science Products GmbH）内のプラチナリングで固定された１２ｍｍの丸いカバースリップにプレーティングされたＰＣ３細胞から全細胞パッチクランプ記録を行った。連続的に流れる（３ｍｌ／分）３２－３５℃の細胞外液（ｍＭでＮａＣｌが１５６、ＭｇＣｌ２が２、ＣａＣｌ２が１．５、ＨＥＰＥＳが１０、グルコースが１０）にカバースリップを沈めた。パッチ電極（３－４ＭΩ）は１．５ｍｍのホウケイ酸ガラスでできており、セシウムベースの溶液（ｍＭでＣｓＣｌが１４５、ＮａＣｌが８、ＨＥＰＥＳが１０、ＭｇＣｌ２が１、加えて、遊離Ｃａ２＋濃度が０のときＥＧＴＡが０．２、または計算された遊離Ｃａ２＋濃度が１０μＭのときＥＧＴＡが１０でＣａＣｌ２が９．４、Maxchelator, Stanford University）で満たされている。Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７００Ｂ増幅器で記録を行い、Ｄｉｇｉｄａｔａ １５５０Ｂを介してデジタル化し、ｐＣｌａｍｐ １０ソフトウェア（Molecular Devices）を使用して取得と分析を行った。アクセス抵抗（範囲が１０－２０ＭΩ）は、電圧クランプの記録中に定期的に監視され、２０％を超える変化が発生した場合はデータが拒否された。
【0110】
その結果、１０μＭ Ｃａ２＋はＰＣ３細胞においてＴＲＰＭ４のような外向き整流電流を活性化し、この電流はＰ４またはＰ１５の影響を受けなかった。したがって、Ｐ４もＰ１５もＴＲＰＭ４チャネル機能自体を損なうことはない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】