特表 2022-505107 キメラ分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-14

(54)【発明の名称】キメラ分子

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20220106BHJP

   C07K 14/73 20060101ALI20220106BHJP

   C07K 14/82 20060101ALI20220106BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20220106BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220106BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20220106BHJP

   C40B 40/06 20060101ALI20220106BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220106BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220106BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220106BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220106BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20220106BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20220106BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20220106BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220106BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20220106BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220106BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C07K14/73 ZNA

C07K14/82

C07K14/725

C07K19/00

C12N15/62 Z

C40B40/06

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12Q1/02

C12Q1/6869 Z

A61K39/00 H

A61K48/00

A61K35/76

A61P35/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021521016

(86)(22)【出願日】2019-10-18

(85)【翻訳文提出日】2021-06-10

(86)【国際出願番号】 EP2019078449

(87)【国際公開番号】W WO2020079264

(87)【国際公開日】2020-04-23

(31)【優先権主張番号】18201560.2

(32)【優先日】2018-10-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508374139

【氏名又は名称】エー・テー・ハー・チューリッヒ

【氏名又は名称原語表記】ＥＴＨ ＺＵＥＲＩＣＨ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100118371

【弁理士】

【氏名又は名称】▲駒▼谷 剛志

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】キズィエロフ， ヤン

(72)【発明者】

【氏名】オバーマイヤー， フランツ ヨーゼフ

(72)【発明者】

【氏名】コップフ， マンフレート

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ13

4B063QR32

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA87X

4B065AA87Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB211

4C084ZB261

4C085AA03

4C085CC21

4C085EE01

4C087AA01

4C087BC83

4C087CA08

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB21

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA75

4H045DA76

(57)【要約】

本発明は、抗原特異的Ｔ細胞およびこれらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により特異的に認識されるペプチドの同時検出および濃縮のための方法に関する。また、この方法により、免疫原性試験および他のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞反応性試験のための、ワクチン接種、免疫寛容の誘導、ＴＣＲの遮断およびＭＨＣ媒介毒素送達を含むｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの介入のためのＴ細胞特異的抗原の同定が可能となる。また、本発明は、前記方法において使用するキメラ分子に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＤ４、ＬＡＧ３またはＣＤ８共受容体タンパク質および前記共受容体のＮ末端に結合しているペプチドを含むキメラ分子。

【請求項2】

前記ペプチドまたは前記ペプチドの一部分が、主要組織適合複合体により提示され得る、請求項１に記載のキメラ分子。

【請求項3】

前記ペプチドが、６～２００アミノ酸残基の長さを有する、請求項１または２に記載のキメラ分子。

【請求項4】

前記ペプチドが、７～３０アミノ酸残基の長さを有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【請求項5】

前記ペプチドが、ランダムペプチドである、請求項１から４のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【請求項6】

前記ペプチドが、所与のＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子によりコードされるペプチドである、請求項１から５のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【請求項7】

前記ペプチドをコードする前記ＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子が、より大きなＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子の断片化により得られる、請求項６に記載のキメラ分子。

【請求項8】

前記ペプチドが、腫瘍細胞または病原体に感染している細胞に由来する、請求項１から７のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【請求項9】

前記ペプチドが、腫瘍抗原のエピトープを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【請求項10】

前記腫瘍抗原が、新生抗原である、請求項９に記載のキメラ分子。

【請求項11】

前記ペプチドが、腫瘍抗原のエピトープと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【請求項12】

前記共受容体タンパク質がＣＤ８である場合、前記ペプチドがＭＨＣクラスＩエピトープを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【請求項13】

前記共受容体タンパク質がＣＤ４またはＬＡＧ３である場合、前記ペプチドがＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【請求項14】

前記ＣＤ４共受容体タンパク質がヒトＣＤ４共受容体タンパク質であり、前記ＬＡＧ３共受容体タンパク質が、ヒトＬＡＧ３共受容体タンパク質であり、前記ＣＤ８共受容体タンパク質がヒトＣＤ８共受容体タンパク質である、請求項１から１３のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【請求項15】

前記ペプチドが、前記共受容体のＮ末端にリンカーを介して結合している、請求項１から１４のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【請求項16】

前記リンカーが、５～３０アミノ酸の長さを有する、請求項１５に記載のキメラ分子。

【請求項17】

前記リンカーにおけるアミノ酸残基の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％が、グリシンまたはセリン残基である、請求項１５または１６に記載のキメラ分子。

【請求項18】

前記リンカーが、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_ｘを含み、ここでＧがグリシンであり、Ｓがセリンであり、ｘが反復数であり、ｘが、１～５の任意の数であり得る、請求項１５から１７のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【請求項19】

請求項１から１８のいずれか一項に記載のキメラ分子をコードするポリヌクレオチド。

【請求項20】

請求項１９に記載の複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのライブラリー。

【請求項21】

前記ライブラリーの少なくとも２つのポリヌクレオチドが、異なるペプチドに結合している同一の共受容体タンパク質をコードする、請求項２０に記載のポリヌクレオチドのライブラリー。

【請求項22】

請求項１９に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。

【請求項23】

抗原特異的Ｔ細胞受容体および前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により特異的に認識されるペプチドを同時に同定するための方法であって、
（ａ）請求項２０または２１に記載のポリヌクレオチドのライブラリーを発現する、目的のポリクローナルＴ細胞を提供するステップと、
（ｂ）主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）とステップ（ａ）の前記Ｔ細胞を接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）における前記ＡＰＣと接触すると活性化される少なくとも１つのＴ細胞を単離するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の前記単離Ｔ細胞のＤＮＡをシーケンシングして、ＴＣＲ配列およびこのようなＴ細胞に存在するＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体に結合しているペプチド配列についての情報を得るステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において得られたシーケンシングデータに基づいて同族Ｔ細胞受容体－ペプチド対を同定するステップと
を含む、方法。

【請求項24】

少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞受容体を同定するための方法であって、
（ａ）請求項１９に記載のポリヌクレオチドを発現する、目的のポリクローナルＴ細胞を提供するステップと、
（ｂ）主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）とステップ（ａ）の前記Ｔ細胞を接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）における前記ＡＰＣと接触すると活性化される少なくとも１つのＴ細胞を単離するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において単離した少なくとも１つの前記Ｔ細胞のＴＣＲ遺伝子座をシーケンシングするステップと、
（ｅ）少なくとも１つの前記Ｔ細胞の前記ＴＣＲ遺伝子座によりコードされる少なくとも１つのＴ細胞受容体が抗原特異的であると同定するステップと
を含む、方法。

【請求項25】

少なくとも１つのＴ細胞特異的抗原を同定するための方法であって、
（ａ）請求項１９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２０または２１に記載のポリヌクレオチドのライブラリーを発現する、目的のモノクローナルＴ細胞を提供するステップと、
（ｂ）主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）とステップ（ａ）の前記Ｔ細胞を接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）における前記ＡＰＣと接触すると活性化される少なくとも１つのＴ細胞を単離するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において単離した少なくとも１つの前記Ｔ細胞のＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質のＮ末端に結合しているペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドの部分をシーケンシングするステップと、
（ｅ）少なくとも１つの前記Ｔ細胞に含まれる前記ポリヌクレオチドによりコードされる少なくとも１つのペプチドがＴ細胞特異的抗原であると同定するステップと
を含む、方法。

【請求項26】

前記ＡＰＣが、自己または異種ＡＰＣである、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記ＡＰＣが、変異ＭＨＣ分子を発現する、遺伝子改変された自己または異種細胞または細胞株である、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記変異ＭＨＣ分子が、細胞外ＭＨＣクラスＩＩアルファ鎖および天然または異種膜貫通ドメイン、ならびに細胞外ＭＨＣクラスＩＩベータ鎖および天然または異種膜貫通ドメインを含むＭＨＣクラスＩＩ分子である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記変異ＭＨＣ分子が、細胞外ＭＨＣクラスＩアルファ鎖および天然または異種膜貫通ドメイン、ならびにベータ２ミクログロブリンを含むＭＨＣクラスＩ分子である、請求項２７に記載の方法。

【請求項30】

前記ＡＰＣに含まれる前記ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩ分子である場合、前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの前記ライブラリーによりコードされる前記共受容体タンパク質が、ＣＤ８である、請求項２３から２９に記載の方法。

【請求項31】

前記ＡＰＣにより発現される前記ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩＩ分子である場合、前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記共受容体タンパク質が、ＣＤ４またはＬＡＧ－３である、請求項２３から２９に記載の方法。

【請求項32】

がんに罹患している被験体を処置するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞受容体および／または少なくとも１つのＴ細胞特異的抗原を請求項２３から３１に記載の方法により同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において同定した少なくとも１つの前記Ｔ細胞受容体および／または前記Ｔ細胞特異的抗原をがんに罹患している前記被験体に投与するステップと
を含む、方法。

【請求項33】

前記抗原特異的Ｔ細胞受容体が、ウイルス媒介遺伝子送達により前記被験体に投与される、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記Ｔ細胞特異的抗原が、ペプチドの形態またはペプチドをコードするポリヌクレオチドの形態で前記被験体に投与される、請求項３２に記載の方法。

【請求項35】

前記ペプチドまたは前記ペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記ペプチドまたは前記ペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドのＡＰＣへの送達を向上させる化合物に結合している、請求項３４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗原特異的Ｔ細胞およびこれらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により特異的に認識されるペプチドの同時検出および濃縮のための方法に関する。また、この方法により、免疫原性試験および他のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞反応性試験のための、ワクチン接種、免疫寛容の誘導、ＴＣＲの遮断およびＭＨＣ媒介毒素送達を含むｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの介入のためのＴ細胞特異的抗原の同定が可能となる。また、本発明は、前記方法において使用するキメラ分子に関する。

【背景技術】

【0002】

豊かな社会において医薬が個別化の新たな時代に入り、ほとんどの治療および医薬品は、個々の患者に合わせて漸進的に作製されている。免疫治療の場合では、Ｔ細胞の抗原特異性が着目されることとなり、これらの不偏で効率的な同定が最も重要なものとなっている。

【0003】

特には、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）に基づくがんワクチンの開発は、現代医療の主要な目標のうちの１つである。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

腫瘍特異的ペプチド、いわゆる新生抗原は、腫瘍細胞のみに存在し、正常組織には全く存在しない。このような腫瘍特異的ペプチドは、新規タンパク質配列の形成を生じる腫瘍特異的ＤＮＡの変化により生成される。腫瘍特異的ペプチドは、腫瘍細胞表面のＭＨＣとの関連において呈され、抗原提示細胞（ＡＰＣ）とも呼ばれる。ＡＰＣ、例えば、樹状細胞またはマクロファージは、ファゴサイトーシスまたは受容体媒介エンドサイトーシスにより抗原を内部移行し得る。ＭＨＣ分子は、短い直鎖状のペプチドの形態でＴ細胞に対する細胞抗原の提示において重要な役割を果たす。これらは、Ｔ細胞表面に存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用し、これによりＴ細胞の活性化が生じる。ＭＨＣは、アルファおよびベータ鎖、ならびにこれらの鎖により形成された溝に結合しているペプチドからなる。この複合体の安定性は、ペプチド結合に高度に依存しており、このため空のＭＨＣ分子が細胞表面から下方制御されて分解される。それにもかかわらず、空のＭＨＣ分子は細胞表面に存在し、細胞外ペプチドに結合してこれらをＴ細胞に提示し得る。

【0005】

腫瘍特異的ペプチドが細胞表面に提示されると、細胞は認識され、免疫系により破壊され得る。したがって、腫瘍特異的ペプチドを含むワクチンは免疫系を刺激して、このような分子をこれらの表面に提示するがん細胞を検出および破壊し得る。

【0006】

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ペプチド主要組織適合複合体（ｐＭＨＣ）に低親和性で結合し、Ｔ細胞同族ペプチド（エピトープ）の直接同定に対して大きな難題を提起する。この問題を解決するいくつかの異なる手法が開発されているが、すべて主要な欠点に悩まされており、これらは、並行処理が著しく制限されていて、多くのＴＣＲの多くのエピトープに対する同時スクリーニングは不可能である。目的のＴＣＲは、エピトープライブラリーに対して１つずつスクリーニングしなければならない。逆もまた同様に、目的のエピトープに反応性のＴＣＲを見出すには、エピトープをＴＣＲライブラリーに対して１つずつスクリーニングすることが必要である。

【0007】

したがって、抗原特異的Ｔ細胞およびこれらのＴＣＲにより特異的に認識されるペプチドの同時検出および濃縮、ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの介入のためのＴ細胞特異的抗原の同定のための手段および方法を提供する必要性が存在する。本発明は、ここで、このような手段および方法を提供するという点において、この必要性を満たし、これは、本発明の特許請求の範囲および以下の実施形態において、さらに詳細に定義する。

【0008】

発明の実施形態
Ａ１．ＣＤ４、ＬＡＧ３またはＣＤ８共受容体タンパク質および共受容体のＮ末端に結合しているペプチドを含むキメラ分子。

【0009】

Ａ２．ペプチドまたはペプチドの一部分が、主要組織適合複合体により提示され得る、実施形態Ａ１に記載のキメラ分子。

【0010】

Ａ３．ペプチドが、６～２００アミノ酸残基の長さを有する、実施形態Ａ１またはＡ２に記載のキメラ分子。

【0011】

Ａ４．ペプチドが、７～３０アミノ酸残基の長さを有する、実施形態Ａ１からＡ３のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【0012】

Ａ５．ペプチドが、ランダムペプチドである、実施形態Ａ１からＡ４のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【0013】

Ａ６．ペプチドが、所与のＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子によりコードされるペプチドである、実施形態Ａ１からＡ５のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【0014】

Ａ７．ペプチドをコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子が、より大きなＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子の断片化により得られる、実施形態Ａ６に記載のキメラ分子。

【0015】

Ａ８．ペプチドが、腫瘍細胞または病原体に感染している細胞に由来する、実施形態Ａ１からＡ７のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【0016】

Ａ９．ペプチドが、腫瘍抗原のエピトープを含む、実施形態Ａ１からＡ８のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【0017】

Ａ１０．腫瘍抗原が、新生抗原である、実施形態Ａ９に記載のキメラ分子。

【0018】

Ａ１１．ペプチドが、腫瘍抗原のエピトープと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１からＡ１０のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【0019】

Ａ１２．共受容体タンパク質がＣＤ８である場合、ペプチドが、ＭＨＣクラスＩエピトープを含む、実施形態Ａ１からＡ１１のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【0020】

Ａ１３．共受容体タンパク質がＣＤ４またはＬＡＧ３である場合、ペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む、実施形態Ａ１からＡ１２のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【0021】

Ａ１４．ＣＤ４共受容体タンパク質が、ヒトＣＤ４共受容体タンパク質であり、ＬＡＧ３共受容体タンパク質が、ヒトＬＡＧ３共受容体タンパク質であり、ＣＤ８共受容体タンパク質が、ヒトＣＤ８共受容体タンパク質である、実施形態Ａ１からＡ１３のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【0022】

Ａ１５．ペプチドが、共受容体のＮ末端にリンカーを介して結合している、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【0023】

Ａ１６．リンカーが、５～３０アミノ酸の長さを有する、実施形態Ａ１５に記載のキメラ分子。

【0024】

Ａ１７．リンカーにおけるアミノ酸残基の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％が、グリシンまたはセリン残基である、実施形態Ａ１５またはＡ１６に記載のキメラ分子。

【0025】

Ａ１８．リンカーが、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_ｘを含み、Ｇがグリシンであり、Ｓがセリンであり、ｘが反復数であり、ｘが１～５の任意の数であり得る、実施形態Ａ１５からＡ１７のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【0026】

Ａ１９．実施形態Ａ１からＡ１８のいずれか一項に記載のキメラ分子をコードするポリヌクレオチド。

【0027】

Ａ２０．実施形態Ａ１９に記載の複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのライブラリー。

【0028】

Ａ２１．ライブラリーの少なくとも２つのポリヌクレオチドが、異なるペプチドに結合している同一の共受容体タンパク質をコードする、実施形態Ａ２０に記載のポリヌクレオチドのライブラリー。

【0029】

Ａ２２．実施形態Ａ１９に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。

【0030】

Ａ２３．抗原特異的Ｔ細胞受容体および前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により特異的に認識されるペプチドを同時に同定するための方法であって、
（ａ）実施形態Ａ２０またはＡ２１に記載のポリヌクレオチドのライブラリーを発現する、目的のポリクローナルＴ細胞を提供するステップと、
（ｂ）主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）とステップ（ａ）のＴ細胞を接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）におけるＡＰＣと接触すると活性化される少なくとも１つのＴ細胞を単離するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の単離Ｔ細胞のＤＮＡをシーケンシングして、ＴＣＲ配列およびこのようなＴ細胞に存在するＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体に結合しているペプチド配列についての情報を得るステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において得られたシーケンシングデータに基づいて同族Ｔ細胞受容体－ペプチド対を同定するステップと
を含む、方法。

【0031】

Ａ２４．少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞受容体を同定するための方法であって、
（ａ）実施形態Ａ１９に記載のポリヌクレオチドを発現する、目的のポリクローナルＴ細胞を提供するステップと、
（ｂ）主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）とステップ（ａ）のＴ細胞を接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）におけるＡＰＣと接触すると活性化される少なくとも１つのＴ細胞を単離するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において単離した少なくとも１つのＴ細胞のＴＣＲ遺伝子座をシーケンシングするステップと、
（ｅ）少なくとも１つのＴ細胞のＴＣＲ遺伝子座によりコードされる少なくとも１つのＴ細胞受容体が抗原特異的であると同定するステップと
を含む、方法。

【0032】

Ａ２５．少なくとも１つのＴ細胞特異的抗原を同定するための方法であって、
（ａ）実施形態Ａ１９に記載のポリヌクレオチドまたは実施形態Ａ２０もしくはＡ２１に記載のポリヌクレオチドのライブラリーを発現する、目的のモノクローナルＴ細胞を提供するステップと、
（ｂ）主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）とステップ（ａ）のＴ細胞を接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）におけるＡＰＣと接触すると活性化される少なくとも１つのＴ細胞を単離するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において単離した少なくとも１つのＴ細胞のＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質のＮ末端に結合しているペプチドをコードするポリヌクレオチドの部分をシーケンシングするステップと、
（ｅ）少なくとも１つのＴ細胞に含まれるポリヌクレオチドによりコードされる少なくとも１つのペプチドがＴ細胞特異的抗原であると同定するステップと
を含む、方法。

【0033】

Ａ２６．ＡＰＣが、自己または異種ＡＰＣである、実施形態Ａ２３からＡ２５のいずれか一項に記載の方法。

【0034】

Ａ２７．ＡＰＣが、変異ＭＨＣ分子を発現する、遺伝子改変された自己または異種細胞または細胞株である、実施形態Ａ２３からＡ２６のいずれか一項に記載の方法。

【0035】

Ａ２８．変異ＭＨＣ分子が、細胞外ＭＨＣクラスＩＩアルファ鎖および天然または異種膜貫通ドメイン、ならびに細胞外ＭＨＣクラスＩＩベータ鎖および天然または異種膜貫通ドメインを含むＭＨＣクラスＩＩ分子である、実施形態Ａ２７に記載の方法。

【0036】

Ａ２９．変異ＭＨＣ分子が、細胞外ＭＨＣクラスＩアルファ鎖および天然または異種膜貫通ドメイン、ならびにベータ２ミクログロブリンを含むＭＨＣクラスＩ分子である、実施形態Ａ２７に記載の方法。

【0037】

Ａ３０．ＡＰＣに含まれるＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩ分子である場合、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのライブラリーによりコードされる共受容体タンパク質が、ＣＤ８である、実施形態Ａ２３からＡ２９に記載の方法。

【0038】

Ａ３１．ＡＰＣにより発現されるＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩＩ分子である場合、ポリヌクレオチドによりコードされる共受容体タンパク質が、ＣＤ４またはＬＡＧ－３である、実施形態Ａ２３からＡ２９に記載の方法。

【0039】

Ａ３２．がんに罹患している被験体を処置するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞受容体および／または少なくとも１つのＴ細胞特異的抗原を実施形態Ａ２３からＡ３１に記載の方法により同定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において同定した少なくとも１つのＴ細胞受容体および／またはＴ細胞特異的抗原をがんに罹患している被験体に投与するステップと
を含む、方法。

【0040】

Ａ３３．抗原特異的Ｔ細胞受容体が、ウイルス媒介遺伝子送達により被験体に投与される、実施形態Ａ３２に記載の方法。

【0041】

Ａ３４．Ｔ細胞特異的抗原が、ペプチドの形態またはペプチドをコードするポリヌクレオチドの形態で被験体に投与される、実施形態Ａ３２に記載の方法。

【0042】

Ａ３５．ペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドのＡＰＣへの送達を向上させる化合物に結合している、実施形態Ａ３４に記載の方法。

【0043】

本発明では、抗原特異的Ｔ細胞の同時検出および濃縮ならびにＴＣＲおよびこれらの同族エピトープの同定が可能となる方法を初めて提供する。

【0044】

したがって、一実施形態では、本発明は、ＣＤ４、ＬＡＧ３またはＣＤ８共受容体タンパク質および共受容体のＮ末端に結合しているペプチドを含むキメラ分子に関する。

【0045】

すなわち、本発明は、ＭＨＣ分子によって提示され、これによりペプチドがＴ細胞受容体により認識され得るペプチドの同定が容易となるキメラ分子に関する。本発明のキメラ分子をコードするポリヌクレオチドがＴ細胞において発現すると、共受容体のＮ末端に共有結合したペプチドとＴ細胞のすぐ近くに位置する抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面の主要組織適合複合体との間で複合体の形成が可能となることが、驚くべきことに見出されている。次いで、このペプチド－ＭＨＣ複合体は、同一のＴ細胞のＴ細胞受容体により認識されて、このＴ細胞の活性化が生じる（図１Ａを参照）。したがって、Ｔ細胞受容体とこの同族抗原ペプチド（本発明のキメラ分子の部分である）の両方は、同一のＴ細胞によりコードされ、これにより同族ＴＣＲ抗原対の同定が、これまでの方法と比較して顕著に容易となる。ＴＣＲと抗原ペプチドの両方が同一のＴ細胞表面に存在しても、他の細胞表面の適するＭＨＣ分子と抗原ペプチドが複合体を形成している場合にかぎり、Ｔ細胞は、抗原ペプチドにより活性化され得る。

【0046】

同族抗原ペプチドが共受容体ＣＤ４のＮ末端に結合していると、Ｔ細胞が活性化され得ることが、実施例において実証されている（図１Ｃ～Ｅ）。対照的に、非同族抗原ペプチドが共受容体タンパク質に結合した場合、活性化は観察されなかった。加えて、同族抗原ペプチドがＣＤ３に結合した場合、Ｔ細胞の活性化は観察されず、抗原ペプチドが、ＭＨＣ分子と直接相互作用する共受容体、例えば、共受容体ＣＤ４のＮ末端に結合していることが、ペプチド－ＭＨＣ複合体の形成に必要であることを示した。したがって、特定の実施形態では、本発明は、共受容体タンパク質がＣＤ４である、本発明のキメラ分子に関する。

【0047】

本発明のキメラ分子は、ＣＤ４の特定の部分を含むこれまでの融合タンパク質とは顕著に異なる。例えば、Al-Jaufyら（Infect Immun. 1995 Aug; 63(8): 3073-3078.）は、志賀毒素ＡサブユニットをＣＤ４の１８０Ｎ末端アミノ酸（合計４３３アミノ酸）に融合させ、これは、ＨＩＶ表面の糖タンパク質１２０に結合して、ＨＩＶの処置のための細胞毒性融合タンパク質を生成する能力を保持する。Breuerら（PLoSOne. 2011; 6(5): e20033.）は、ＣＤ４の３７アミノ酸モチーフを含むＨＩＶ－１病原性因子Ｎｅｆに対する合成タンパク質阻害剤をデザインした。したがって、両先行技術文献は、ＣＤ４の短い断片のみを含む可溶性タンパク質に関する。一方、本発明の実施形態は、細胞膜に固定された細胞表面受容体であると当業者により理解されている共受容体タンパク質に関する。

【0048】

共受容体ＣＤ４およびＬＡＧ３は、ヒトにおいて約２０％の配列同一性を共有し、ＭＨＣクラスＩＩ分子にともに結合して、Ｔ細胞受容体によるペプチド－ＭＨＣクラスＩＩ複合体の認識が容易となる。共受容体ＣＤ８は、Ｔ細胞受容体とＭＨＣクラスＩ分子を含むペプチド－ＭＨＣ複合体との間の相互作用において類似の役割を果たす。したがって、本発明の方法がまた、共受容体ＬＡＧ３またはＣＤ８を含むキメラ分子により実行可能であることが有望である。

【0049】

共受容体タンパク質に結合しているペプチドは、任意のペプチドであり得る。上に考察したように、共受容体タンパク質に結合しているペプチドは、好ましくは、ＭＨＣ分子により提示される可能性を有するペプチドである。ペプチドおよびＭＨＣが、Ｔ細胞受容体により認識され得るペプチド－ＭＨＣ複合体を形成する場合、ペプチドは、主要組織適合複合体により提示される可能性を有すると考えられ、この場合、Ｔ細胞受容体は、任意のＴ細胞受容体であり得る。本明細書において使用する場合、用語「ペプチド－ＭＨＣ複合体」は、ペプチドが、当技術分野において認識されているＭＨＣペプチド結合ポケット内で結合した、ＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ）を指す。本発明では、共受容体タンパク質に結合しているペプチド全体は、ペプチド－ＭＨＣ複合体の形成に関与し得る。しかし、本発明はまた、ペプチドの一部分のみがペプチド－ＭＨＣ複合体の形成に関与する、ペプチドを包含する。したがって、一実施形態では、本発明は、ペプチドまたはペプチドの一部分が、主要組織適合複合体により提示され得る、ＣＤ４、ＬＡＧ３またはＣＤ８共受容体タンパク質および共受容体のＮ末端に結合しているペプチドを含むキメラ分子に関する。

【0050】

特定の実施形態では、本発明は、ペプチドが、６～２００アミノ酸残基の長さを有する、本発明のキメラ分子に関する。

【0051】

すなわち、共受容体タンパク質に結合しているペプチドは、６～２００アミノ酸残基の長さを有するペプチドであり得る。特には、このペプチドの少なくとも一部分が、ペプチド－ＭＨＣ複合体の形成に関与し得ることが好ましい。

【0052】

本明細書においてＭＨＣクラスＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩペプチドとも呼ぶ、ＭＨＣクラスＩ分子により呈されるペプチドは、８～１５アミノ酸の長さを典型的に有し、ペプチドの多数が、９アミノ酸の長さを有する。本明細書においてＭＨＣクラスＩＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩペプチドとも呼ぶ、ＭＨＣクラスＩＩ分子により呈されるペプチドは、１１～３０アミノ酸の長さを典型的に有する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、ペプチドが、７～３０アミノ酸残基の長さを有する、本発明のキメラ分子に関する。

【0053】

共受容体タンパク質に結合しているペプチドは、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩエピトープのＮおよび／またはＣ末端に結合しても、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩエピトープのＭＨＣ分子への結合に顕著には影響しない、さらなるアミノ酸を含み得る。したがって、代替の実施形態では、本発明は、ペプチドが、３０～５０アミノ酸残基の長さを有する、本発明のキメラ分子に関する。

【0054】

特定の実施形態では、本発明は、ペプチドが、ランダムペプチドである、本発明のキメラ分子に関する。

【0055】

すなわち、共受容体タンパク質に結合しているペプチドは、任意のアミノ酸配列を有し得る。本発明のキメラ分子は、ＭＨＣ分子により結合している場合、Ｔ細胞受容体を刺激し得るペプチドの同定に使用し得る。「ランダムペプチド」は、本明細書において使用する場合、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子により結合していることがわかっているペプチドと、いかなる配列同一性をも共有しないランダムアミノ酸配列を有するペプチドであり得る。

【0056】

あるいは、共受容体タンパク質に結合しているペプチドは、これまでに記載されているペプチドまたはタンパク質と配列同一性を共有し得る。したがって、特定の実施形態では、本発明は、ペプチドが、所与のＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子によりコードされるペプチドである、本発明のキメラ分子に関する。

【0057】

すなわち、本発明のキメラ分子は、これまでに未知の抗原ペプチドの同定に使用し得る。例えば、ペプチドをコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子は、共受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドにクローニングし、これにより本発明のキメラ分子をコードするポリヌクレオチドを得てもよい。次いで、共受容体タンパク質に結合しているペプチドがペプチド－ＭＨＣ複合体を形成し、これによりキメラ分子をコードするポリヌクレオチドを発現するＴ細胞が活性化され得る場合、これは、本発明の方法により試験し得る。

【0058】

ＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子は、任意の供給源から得てもよい。特には、ＤＮＡは、抗原提示細胞から得てもよく、またはｃＤＮＡは、抗原提示細胞から得られたＲＮＡの逆転写により得てもよい。抗原提示細胞は、生検において得られた腫瘍細胞であり得る。あるいは、抗原提示細胞は、病原体に感染している細胞であり得る。

【0059】

あるいは、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子は、被験体に投与されるペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子であり得る。被験体に投与される薬物または他のペプチドもしくはタンパク質の開発は、化合物の被験体への投与によって望まない免疫原性反応が生じないことを確実とするための免疫原性試験を通常、含む。したがって、ペプチドもしくはタンパク質をコードするＤＮＡもしくはｃＤＮＡ分子、または前記ＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子の部分は、共受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドにクローニングして、本発明のキメラ分子をコードするポリヌクレオチドを得てもよい。

【0060】

あるいは、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子は、病原体から直接得られ、共受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドにクローニングして本発明のキメラ分子をコードするポリヌクレオチドを得てもよい。病原体は、本明細書において使用する場合、好ましくは、ウイルス性または細菌性病原体を指す。

【0061】

用語「所与のＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子」は、細胞または病原体から直接的または間接的に得られる任意のＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子を指す。例えば、ＤＮＡ分子は、前記細胞または病原体からのＤＮＡの単離によって細胞または病原体から直接得られる。ｃＤＮＡ分子は、ＲＮＡの単離およびＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写によって細胞または病原体から直接得てもよい。しかし、ＤＮＡ分子はまた、例えば、コンピュータによりデザインされたポリヌクレオチド配列の化学合成によって間接的に得てもよい。コンピュータによりデザインされたポリヌクレオチド配列は、例えば、単一細胞によるエクソームシーケンシングデータ、またはペプチドシーケンシングデータ、特には、抗原提示細胞表面から単離されたペプチドのシーケンシングデータに基づき得る。あるいは、コンピュータによりデザインされたポリヌクレオチド配列は、病原体からのゲノムデータに基づき得る。

【0062】

ＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子は、当技術分野において公知の任意の方法により得てもよい。特定の実施形態では、方法は、ペプチドをコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子が、より大きなＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子の断片化により得られる、本発明のキメラ分子に関する。

【0063】

すなわち、ペプチドは、より大きなＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子の断片化により得られたＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子によりコードされ得る。

【0064】

ＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子の断片化は、標的化された様式または標的化されない様式、例えば、エンドヌクレアーゼの使用により達成し得る。しかし、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子の断片化はまた、このような分子のランダム剪断により達成し得る。あるいは、公知のＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子の断片はまた、分子クローニングの方法、例えば、ＰＣＲにより得てもよい。当業者は、共受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片を組み合わせて、本発明のキメラ分子をコードするポリヌクレオチドを得る方法を認識している。

【0065】

したがって、特定の実施形態では、本発明は、ペプチドが、腫瘍細胞または病原体に感染している細胞に由来する、本発明のキメラ分子に関する。

【0066】

本発明のキメラ分子は、これまでに未知の腫瘍または病原体関連抗原の同定に使用し得る。ペプチドが、腫瘍細胞において合成されたペプチドまたはタンパク質と配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む場合、ペプチドは、腫瘍細胞に由来すると考えられる。ペプチドが、病原体に感染している細胞において合成されたペプチドまたはタンパク質と配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む場合、ペプチドは、病原体に感染している細胞に由来すると考えられる。腫瘍細胞または病原体に感染している細胞に由来するペプチドは、このような細胞に見出され得る任意のペプチドまたはタンパク質の部分と配列同一性を共有し得る。

【0067】

ある特定の実施形態では、本発明の共受容体タンパク質に結合しているペプチドは、ＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩ分子により提示されるとこれまでに記載されているペプチドのアミノ酸配列を含み得る。ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子により提示されることがわかっているペプチドを含むキメラ分子により、このペプチドにより効率的に刺激されるＴ細胞受容体の同定が可能となり得る。ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドにより提示されることがわかっているペプチドは、腫瘍細胞または病原体に感染している細胞に由来するペプチドであり得る。

【0068】

ある特定の実施形態では、本発明のキメラ分子は、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体の同定に使用する。例えば、被験体の腫瘍細胞の表面にＭＨＣ分子により提示されることがわかっているペプチドは、共受容体タンパク質に結合して、このエピトープを特異的に認識するＴ細胞受容体を同定し得る。したがって、特定の実施形態では、本発明は、ペプチドが、腫瘍抗原のエピトープを含む、本発明のキメラ分子に関する。ペプチドが、腫瘍抗原のエピトープのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む場合、ペプチドは、腫瘍抗原のエピトープを含むと考えられる。

【0069】

用語「腫瘍抗原」は、本明細書において使用する場合、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原であってもよく、腫瘍細胞により発現される分子（例えば、タンパク質またはペプチド）を示し、（ａ）正常細胞において発現するこの対応物とは定性的に異なるか、または（ｂ）正常細胞よりも腫瘍細胞において高いレベルで発現する。したがって、腫瘍抗原は、正常細胞において発現する対応物とは（例えば、分子がタンパク質である場合、１つまたは複数のアミノ酸残基が）異なり得るか、または同一であり得る。一部の腫瘍抗原は、正常細胞により発現しないか、または腫瘍細胞の通常の対応物よりも腫瘍細胞において少なくとも約２倍高い（例えば、約２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、４０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍または１５，０００倍高い）レベルで発現する。

【0070】

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、新生物性細胞もしくは腫瘍、例えば、がん細胞もしくは悪性腫瘍において、またはこの上に発現する免疫原性タンパク質である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、非特異的で変異体の過剰発現されるまたは異常に発現されるタンパク質であり、新生物性細胞または腫瘍と正常細胞または組織の両方に存在し得る。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍細胞に限定される腫瘍特異的抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、がん細胞に限定される、がん特異的抗原である。

【0071】

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、１つ、２つ、３つまたはこれよりも多い、すべてを含む次の特性：過剰発現／蓄積（すなわち、正常と新生物性組織の両方により発現されるが、新生物において高度に発現する）、腫瘍胎児性（すなわち、通常、胎児組織およびがん性体細胞でのみ発現する）、腫瘍ウイルス性もしくは腫瘍形成ウイルス性（すなわち、腫瘍形成形質転換ウイルスによりコードされる）、がん－精巣（すなわち、がん細胞および成体生殖組織、例えば、精巣によってのみ発現する）、系列限定性（すなわち、大部分は単一のがん組織型により発現される）、変異性（すなわち、遺伝子変異または転写における変化の結果として新生物性組織でのみ発現する）、転写後の変化（例えば、グリコシル化における腫瘍に関連する変化）またはイディオタイプ（すなわち、ＢまたはＴリンパ球の悪性クローン性拡大増殖により発生する）を示し得る。

【0072】

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、急性リンパ芽球性白血病；急性リンパ芽球性リンパ腫；急性リンパ球性白血病；急性骨髄性白血病（acute myelogenous leukemia）；急性骨髄球性白血病（acute myeloid leukemia）（成人／小児）；副腎皮質癌；ＡＩＤＳ関連がん；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；肛門がん；虫垂がん；星状細胞腫；非定型奇形様／ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；胆管がん、肝外（胆管癌（cholangiocarcinoma））；膀胱がん；骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫；脳がん（成人／小児）；脳腫瘍、小脳星状細胞腫（成人／小児）；脳腫瘍、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫脳腫瘍（malignant glioma brain tumor）；脳腫瘍、上衣細胞腫；脳腫瘍、髄芽細胞腫；脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍；脳腫瘍、視路および視床下部神経膠腫；脳幹神経膠腫；乳がん；気管支腺腫／カルチノイド；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；小児がん；カルチノイド消化管腫瘍；カルチノイド腫瘍；成体の癌、原発部位不明；原発不明癌；中枢神経系胚芽腫；中枢神経系リンパ腫、原発性；子宮頸がん；小児副腎皮質癌；小児がん；小児大脳星状細胞腫；脊索腫、小児；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄球性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸がん；結腸直腸がん；頭蓋咽頭腫；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；気腫；子宮内膜がん；上衣芽細胞腫；上衣細胞腫；食道がん；ユーイング腫瘍ファミリーにおけるユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管がん；胆嚢がん；胃（ｇａｓｔｒｉｃ／ｓｔｏｍａｃｈ）がん；胃カルチノイド；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質腫瘍；胚細胞腫瘍；頭蓋外、性腺外、または卵巣妊娠性絨毛性腫瘍；妊娠性絨毛性腫瘍、原発部位不明；神経膠腫；脳幹の神経膠腫；神経膠腫、小児視路および視床下部；有毛細胞白血病；頭頸部がん；心臓がん；肝細胞（肝臓）がん；ホジキンリンパ腫；下咽頭がん；視床下部および視路神経膠腫；眼球内黒色腫；膵島細胞癌（膵内分泌部）；カポジ肉腫；腎臓がん（腎細胞がん）；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭がん；口唇および口腔（ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ）がん；脂肪肉腫；肝臓がん（原発性）；肺がん、非小細胞；肺がん、小細胞；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ワルデンストレーム；男性乳がん；骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫；髄芽細胞腫；髄上皮腫；黒色腫；黒色腫、眼球内（眼）；メルケル細胞がん；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；中皮腫、成人悪性；原発不明の転移性頸部扁平上皮がん；口腔（ｍｏｕｔｈ）がん；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫／形質細胞新生物；菌状息肉腫、骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性疾患；骨髄性白血病、慢性；骨髄球性白血病、成人急性；骨髄球性白血病、小児急性；骨髄腫、多発性（骨髄のがん）；骨髄増殖性障害、慢性；鼻腔および副鼻腔がん；上咽頭癌；神経芽細胞腫、非小細胞肺がん；非ホジキンリンパ腫；乏突起神経膠腫；口腔（ｏｒａｌ）がん；口腔（ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ）がん；中咽頭がん；骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫；卵巣がん；卵巣上皮がん（表面上皮性－間質性腫瘍）；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓がん；膵臓がん、膵島細胞；乳頭腫症；副鼻腔および鼻腔がん；副甲状腺がん；陰茎がん；咽頭がん；褐色細胞腫；松果体星状細胞腫；松果体胚細胞腫；中間分化型の松果体実質腫瘍；松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍；下垂体（pituary）腫瘍；下垂体腺腫；形質細胞新生物／多発性骨髄腫；胸膜肺芽細胞腫；原発性中枢神経系リンパ腫；前立腺がん；直腸がん；腎細胞癌（腎臓がん）；腎盂および尿管、移行細胞がん；１５番染色体上のＮＵＴ遺伝子に関与する気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫、小児；唾液腺がん；肉腫、ユーイング腫瘍ファミリー；セザリー症候群；皮膚がん（黒色腫）；皮膚がん（非黒色腫）；小細胞肺がん；小腸がん軟部組織肉腫；軟部組織肉腫；脊髄腫瘍；扁平上皮細胞癌；原発不明の頸部扁平上皮がん、転移性；胃（ｓｔｏｍａｃｈ／ｇａｓｔｒｉｃ）がん；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；Ｔ細胞リンパ腫、皮膚性（菌状息肉腫およびセザリー症候群）；精巣がん；咽喉がん；胸腺腫；胸腺腫および胸腺癌；甲状腺がん；甲状腺がん、小児；腎盂および尿管の移行細胞がん；尿道がん；子宮がん、子宮内膜；子宮肉腫；膣がん；外陰がん；ならびにウィルムス腫瘍を含む、新生物疾患由来の抗原を含む。

【0073】

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍形成ウイルス抗原、がん－精巣抗原、腫瘍胎児抗原、組織分化抗原、変異体タンパク質抗原、新生抗原、アディポフィリン、ＡＩＭ－２、ＡＬＤＨＩＡＩ、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＩＮＧ－４、ＣＡＬＣＡ、ＣＤ４５、ＣＰＳＦ、サイクリンＤＩ、ＤＫＫＩ、ＥＮＡＨ（ｈＭｃｎａ）、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＥｐｈＡ３、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、グリピカン－３、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＩＤＯＩ、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＬ１３Ｒアルファ２、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファ－フェトプロテイン、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、レンシン（Lengsin）、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ－２、メロエ（Meloe）、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ｐ５３（非変異体）、ＰＡＸ５、ＰＢＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ－１、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、セセルニン（secernin）１、ＳＯＸＩＯ、ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原１）、サバイビン、テロメラーゼ、ＶＥＧＦ、ＷＴ１、ＥＧＦ－Ｒ、ＣＥＡ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、糖タンパク質１００（ＧＰ１００またはｇｐ１００タンパク質）、ＭＥＬ ＡＮＡ／ＭＡＲＴ１、ＭＡＲＴ２、ＮＹ－ＥＳＯ－Ｉ、ｐ５３、ＭＡＧＥ ＡＩ、ＭＡＧＥ Ａ３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＣＤＫ４、アルファ－アクチニン－４、ＡＲＴＣ１、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＢＣＲ－ＡＢＬ融合タンパク質（ｂ３ａ２）、Ｂ－ＲＡＦ、ＣＡＳＰ－５、ＣＡＳＰ－８、ベータ－カテニン、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２Ａ、ＣＬＰＰ、ＣＯＡ－１、ｄｅｋ－ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１融合タンパク質、ＦＬＴ３－ＩＴＤ、ＦＮ１、ＧＰＮＭＢ、ＬＤＬＲ－フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＮＦＹＣ、ＯＧＴ、ＯＳ－９、ｐｍｌ－ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲ、Ｈ－ｒａｓ、Ｋ－ｒａｓ（Ｖ－Ｋｉ－ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス腫瘍形成）、Ｎ－ｒａｓ、ＲＢＡＦ６００、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＳＸ、ＳＳＸ２、ＳＹＴ－ＳＳＸ１またはＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＧＦ－ベータＲＩＩ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ｏｒｍｄｍ－２、ＬＭＰ２、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（上皮増殖因子バリアントＩＩＩ）、イディオタイプ、ＧＤ２（ガングリオシドＧ２）、Ｒａｓ－変異体、ｐ５３（変異体）、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、チロシナーゼ、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＥｐｈＡ２、前立腺酸性ホスファターゼＰＡＰ、ｎｅｏ－ＰＡＰ、ＭＬ－ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢＩ、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＴＲＰ２、ＴＲＰ２－Ｉｎｔ２、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ（ａ）、ｃｙｐＩＢＩ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＯＹ－ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン（Legumain）、Ｔｉｅ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｒ関連抗原（Ｆｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）１、ＴＲＰ１、ＣＡ－１２５、ＣＡ１９－９、カルレチニン、上皮膜抗原（ＥＭＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、神経膠原線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、肉眼的嚢胞性疾患液タンパク質（ｇｒｏｓｓ ｃｙｓｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＣＤＦＰ－１５）、ＨＭＢ－４５抗原、Ｍｙｏ－ＤＩ、筋特異的アクチン（ＭＳＡ）、神経フィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトフィジン（synaptophysis）、サイログロブリン、甲状腺転写因子１、ピルビン酸キナーゼアイソザイムＭ２型（腫瘍Ｍ２－ＰＫ）の２量体形態、ＢＡＧＥ ＢＡＧＥ－１、ＣＡＧＥ、ＣＴＡＧＥ、ＦＡＴＥ、ＧＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７、ＨＣＡ６６１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５、ＭＡＧＥＡ、ＭＡＧＥＢ、ＭＡＧＥＣ、ＮＡ８８、ＮＹ－ＳＡＲ－３５、ＳＰＡＮＸＢ１、ＳＰＡ１７、ＳＳＸ、ＳＹＣＰ１、ＴＰＴＥ、炭水化物／ガングリオシドＧＭ２（腫瘍胎児抗原－免疫原性－１ ＯＦＡ－Ｉ－１）、ＧＭ３、ＣＡ１５－３（ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ５０、ＣＡＭ４３、ＣＥＡ、ＥＢＮＡ、ＥＦ２、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ１１、ＨＳＰ７０－２、ＫＩＡＡＯ２０５、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ミオシンクラスＩ、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ－Ｋ－ｍｅｌ、ＬＡＧＥ－１、ＬＡＧＥ－２、（精子タンパク質）ＳＰ１７、ＳＣＰ－１、Ｐ１５（５８）、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ－４０、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、ＴＳＰ－１８０、Ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３ＨＩ、ＴＡＧ－７２、ＴＡＧ－７２－４、ＣＡ－７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、１３－カテニン、Ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＣＴ７、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ－０２９、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０、ＴＡＡＬ６、ＴＬＰ、ＴＰＳ、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ７０、プロステイン（prostein）、ＴＡＲＰ（Ｔ細胞受容体ガンマ代替リーディングフレームタンパク質）、Ｔｒｐ－ｐ８、インテグリンαｖβ３（ＣＤ６１）、ガラクチン、またはＲａｌ－Ｂ、ＣＤ１２３、ＣＬＬ－１、ＣＤ３８、ＣＳ－１、ＣＤ１３８、およびＲＯＲＩを含む。

【0074】

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の抗原、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスの抗原、例えば、潜伏期関連核抗原、エプスタイン・バーウイルスの抗原、例えば、ＥＢＶ－ＥＡ、ＥＢＶ－ＭＡまたはＥＢＶ－ＶＣＡ、メルケル細胞ポリオーマウイルスの抗原、例えば、ＭＣＶ Ｔ抗原、またはヒトＴリンパ球向性ウイルスの抗原、例えば、ＨＴＬＶ－１Ｔａｘ抗原である、腫瘍形成ウイルス抗原を含む。

【0075】

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原である。

【0076】

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、新生抗原である。「新生抗原」は、本明細書において使用する場合、腫瘍細胞における変異により生じる抗原を意味し、このような抗原は、正常な細胞または組織において一般には発現しない。理論により拘束されることなく、健常組織がこのような抗原を一般には有しないため、新生抗原は、好ましい標的となる。加えて、理論により拘束されることなく、本発明の文脈では、新生抗原を認識するＴ細胞が胸腺による負の選択を受けていない可能性があるため、このような細胞は、抗原に対する高い結合活性を有し、腫瘍に対する強力な免疫応答を開始することができ、その上、正常組織の破壊および自己免疫による損傷を誘導するリスクがない。したがって、特定の実施形態では、本発明は、腫瘍抗原が、新生抗原である、本発明のキメラ分子に関する。

【0077】

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、抗原オルソログ、例えば、ヒト腫瘍抗原に対する哺乳動物（すなわち、非ヒト霊長類、ブタ、イヌ、ネコ、またはウマ）抗原であり得る。

【0078】

用語「エピトープ」は、本明細書において使用する場合、特定の免疫グロブリン、例えば、Ｔ細胞受容体と接触させる抗原の部分を指す。

【0079】

また、本発明のキメラ分子は、Ｔ細胞受容体により効率的に認識される公知の腫瘍抗原エピトープの変異したバリアントを同定するために使用し得る。したがって、特定の実施形態では、本発明は、ペプチドが、腫瘍抗原のエピトープと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明のキメラ分子に関する。

【0080】

すなわち、本発明のキメラ分子は、ＭＨＣ分子により認識され、変異していないそれらの対応物と比較して多かれ少なかれ効率的なＴ細胞活性化を生じる、変異抗原ペプチドを同定するために使用し得る。本発明では、キメラ分子が、細胞において発現するポリヌクレオチドによりコードされることが好ましい。当業者は、ペプチドをコードするＤＮＡ配列に変異をランダムに、または標的化された様式のいずれかで導入して、変異ペプチドを得る方法を認識している。

【0081】

特定の実施形態では、本発明は、共受容体タンパク質がＣＤ８である場合、ペプチドが、ＭＨＣクラスＩエピトープを含む、本発明のキメラ分子に関する。

【0082】

すなわち、共受容体ＣＤ８により、ペプチド－ＭＨＣクラスＩ複合体へのＴ細胞受容体の結合が容易となる。したがって、共受容体ＣＤ８に結合しているペプチドが、ＭＨＣクラスＩエピトープを含むことが好ましい。

【0083】

特定の実施形態では、本発明は、共受容体タンパク質がＣＤ４またはＬＡＧ３である場合、エピトープが、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである、本発明のキメラ分子に関する。

【0084】

すなわち、共受容体ＣＤ４およびＬＡＧ３により、ペプチド－ＭＨＣクラスＩＩ複合体へのＴ細胞受容体の結合が容易となる。したがって、共受容体ＣＤ４またはＬＡＧ３に結合しているペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩエピトープを含むことが好ましい。

【0085】

ペプチドが、ＭＨＣ分子により提示されるとまだ同定されていない場合では、ペプチドは、任意の共受容体、すなわち、ＣＤ４、ＣＤ８またはＬＡＧ３に結合し得る。

【0086】

キメラ分子の共受容体タンパク質は、任意の哺乳動物に由来し得る。しかし、共受容体が、そこで合成されることを意図するＴ細胞と同一の生物に由来することが好ましい。例えば、同族抗原ペプチド－Ｔ細胞受容体対をヒトにおいて同定することを意図する場合、キメラ分子が、ヒト共受容体タンパク質を含むことが好ましい。ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質は、特に、完全長ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質である。

【0087】

本発明では、共受容体タンパク質が、ヒト共受容体タンパク質であることが好ましい。したがって、特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ４共受容体タンパク質が、ヒトＣＤ４共受容体タンパク質であるか、ＬＡＧ３共受容体タンパク質が、ヒトＬＡＧ３共受容体タンパク質であるか、またはＣＤ８共受容体タンパク質が、ヒトＣＤ８共受容体タンパク質である、本発明のキメラ分子に関する。

【0088】

すなわち、ある特定の実施形態では、キメラ分子は、ペプチドがＣＤ４のＮ末端に結合している、ヒトＣＤ４共受容体タンパク質を含む。他の実施形態では、キメラ分子は、ペプチドがＬＡＧ３のＮ末端に結合している、ヒトＬＡＧ３共受容体タンパク質を含む。他の実施形態では、キメラ分子は、ペプチドがＣＤ８アルファ鎖またはＣＤ８ベータ鎖のＮ末端に結合している、ヒトＣＤ８共受容体タンパク質を含む。ペプチドがＣＤ８ベータ鎖のＮ末端に結合している場合、細胞により、非修飾ＣＤ８アルファ鎖も合成されることが好ましい。したがって、ヒトＣＤ４、ＣＤ８またはＬＡＧ３共受容体タンパク質を含むキメラ分子は、好ましくは、ヒト細胞、特には、ヒトＴ細胞において合成される。

【0089】

特定の実施形態では、本発明は、ペプチドが、共受容体のＮ末端にリンカーを介して結合している、本発明のキメラ分子に関する。

【0090】

すなわち、キメラ分子は、共受容体とペプチドとの間にリンカーを含み、ペプチド、Ｔ細胞受容体およびＡＰＣ上のＭＨＣ分子の間の認識を最適化し得る。

【0091】

リンカーは、ＴＣＲおよびＡＰＣ上のＭＨＣ分子とのペプチドの効率的相互作用が可能となる任意の長さを有し得る。特には、リンカーは、５～３０アミノ酸残基の長さを有し得る。したがって、特定の実施形態では、本発明は、リンカーが、５～３０アミノ酸の長さを有する、キメラ分子に関する。

【0092】

ペプチドがＴＣＲおよびＡＰＣ上のＭＨＣ分子と効率的に相互作用可能とするために、リンカーが、可撓性リンカーであることが好ましい。当業者は、高度の可撓性を有するリンカーを認識している。例えば、高いパーセンテージのグリシンまたはセリン残基を有するリンカーは、高度の可撓性を有することがわかっている。したがって、特定の実施形態では、本発明は、リンカーにおけるアミノ酸残基の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％が、グリシンまたはセリン残基である、本発明のキメラ分子に関する。

【0093】

リンカー配列ＧＧＧＧＳは、グリシン残基４つおよびＣ末端セリン残基からなり、第１のポリペプチドを第２のポリペプチドに繋留する可撓性ペプチドリンカーとして当技術分野において頻用される。したがって、本発明のリンカーは、好ましくは、配列ＧＧＧＧＳを有する１つまたは複数のモチーフを含む。したがって、特定の実施形態では、本発明は、リンカーが、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_ｘを含み、Ｇがグリシンであり、Ｓがセリンであり、ｘが反復数であり、ｘが１～５の任意の数であり得る、本発明のキメラ分子に関する。

【0094】

したがって、ある特定の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳを１回含む。他の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳを２回含む。他の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳを３回含む。他の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳを４回含む。他の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳを５回含む。リンカーがアミノ酸配列ＧＧＧＧＳを１回よりも多く含む場合、アミノＧＧＧＧＳ配列は、近接し得るか、または１つまたは複数の他のアミノ酸により中断され得る。

【0095】

実施例において、１２または１５アミノ酸からなるリンカーによりペプチドが共受容体に結合している場合、最も高いＴ細胞活性化が観察され得ることが示される（図１ＣおよびＤ）。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、リンカーが、１２～１５アミノ酸残基の長さを有する、本発明のキメラ分子に関する。より好ましい実施形態では、本発明は、リンカーが、配列ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）を含む、本発明のキメラ分子に関する。さらにより好ましい実施形態では、本発明は、リンカーが、配列ＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２）を含む、本発明のキメラ分子に関する。

【0096】

特定の実施形態では、本発明は、本発明のキメラ分子をコードするポリヌクレオチドに関する。

【0097】

本発明では、本発明のキメラ分子が、前記キメラ分子をコードするポリヌクレオチドの発現によって細胞において合成されることを意図する。加えて、本発明のキメラ分子をコードするポリヌクレオチドは、キメラ分子を細胞表面に方向づけるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み得る。

【0098】

用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において使用する場合、ホスホジエステル結合により接続しているヌクレオチドの配列を指す。本発明のポリヌクレオチドは、１本または２本鎖のいずれかの形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得る。ヌクレオチド塩基は、１文字コード：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）およびウラシル（Ｕ）により本明細書において示す。本発明のポリヌクレオチドは、当業者に周知の標準技術を使用して調製することができる。この用語は、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されるべきではなく、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに糖および／またはリン酸部分において修飾したヌクレオチドを包含する。また、この用語は、合成または天然に存在し得る、修飾骨格残基または結合を含む核酸を包含し、これは、参照核酸と類似の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される。

【0099】

特定の実施形態では、本発明は、本発明の複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのライブラリーに関する。

【0100】

本発明は、ポリヌクレオチドのライブラリーをさらに包含する。本発明のポリヌクレオチドのライブラリーは、本発明のキメラ分子をコードする複数のポリヌクレオチドを含む。例えば、ポリヌクレオチドのライブラリーは、本発明のキメラ分子をコードする２つまたはこれよりも多いポリヌクレオチドを含み得る。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドのライブラリーは、本発明のキメラ分子をコードする少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１，０００，０００または少なくとも１０，０００，０００種のポリヌクレオチドを含み得る。

【0101】

ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドのライブラリーにおけるポリヌクレオチドは、より大きなポリヌクレオチドに含まれる。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドのライブラリーにおけるポリヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに含まれる。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドのライブラリーにおけるポリヌクレオチドは、ウイルス媒介遺伝子送達に使用し得るウイルスベクターに含まれる。

【0102】

特定の実施形態では、本発明は、ライブラリーの少なくとも２つのポリヌクレオチドが、異なるペプチドに結合している同一の共受容体タンパク質をコードする、本発明のポリヌクレオチドのライブラリーに関する。

【0103】

すなわち、本発明のポリヌクレオチドのライブラリーは、Ｔ細胞応答を誘導し得る抗原ペプチドの同定に使用し得る。ライブラリーのポリヌクレオチドが、同一の共受容体タンパク質をコードするが、ペプチドをコードするポリヌクレオチドの領域が異なることが好ましい。すなわち、ある特定の実施形態では、本発明のライブラリーは、そのようなポリヌクレオチドのそれぞれが、異なるアミノ酸配列を有するペプチドに結合している共受容体ＣＤ４タンパク質をコードする、少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、本発明のライブラリーは、そのようなポリヌクレオチドのそれぞれが、異なるアミノ酸配列を有するペプチドに結合している共受容体タンパク質ＣＤ８をコードする、少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、本発明のライブラリーは、各ポリヌクレオチドが、異なるアミノ酸配列を有するペプチドに結合している共受容体タンパク質ＬＡＧ３をコードする、少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む。

【0104】

本発明のポリヌクレオチドのライブラリーにおいてコードされるペプチドは、任意のアミノ酸配列を有し得る。例えば、ペプチドは、公知の抗原ペプチド、例えば、腫瘍細胞または病原体により感染している細胞に由来する抗原ペプチドとの配列同一性を有し得る。この場合、ポリヌクレオチドのライブラリーは、共受容体タンパク質および公知の抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチドへランダムまたは標的化変異を導入することにより得てもよい。特には、変異は、抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドの部分に排他的に導入し得る。

【0105】

ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドのライブラリーは、これまでに未知の抗原ペプチドを同定するために使用し得る。例えば、ポリヌクレオチドのライブラリーは、細胞、特には、抗原提示細胞からｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することにより生成し得る。次いで、ｃＤＮＡは、共受容体タンパク質をコードする複数のポリヌクレオチドにクローニングして、本発明のポリヌクレオチドのライブラリーを得てもよい。特には、ｃＤＮＡは、クローニングステップの前に断片化してもよく、生じる断片は、共受容体タンパク質をコードする複数のポリヌクレオチドにクローニングしてもよい。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍細胞または病原体に感染している細胞から単離する。当業者は、ＲＮＡ単離、逆転写および分子クローニングのための方法を認識している。

【0106】

他の実施形態では、ポリヌクレオチドのライブラリーは、エクソームシーケンシングデータに基づいて生成し得る。当業者は、細胞のエクソームをシーケンシングするための方法を認識している。エクソームデータは、任意の細胞から得てもよい。ある特定の実施形態では、エクソームデータは、腫瘍細胞または病原体に感染している細胞から得られる。次いで、得られたエクソームデータは、生物情報学的方法により処理して、細胞のエクソームの部分、または好ましくは、全エクソームを網羅する所定のサイズの多数のＤＮＡ断片を予想し得る。予想されたＤＮＡ断片は、任意のサイズを有し得る。しかし、予想されたＤＮＡ断片が、３０～３００塩基対、より好ましくは、６０～１５０塩基対、最も好ましくは、７５～１０５塩基対のサイズを有することが好ましい。次いで、予想されたＤＮＡ断片は、化学的に合成し、共受容体をコードする複数のポリペプチドにクローニングして、本発明のポリヌクレオチドのライブラリーを得てもよい。

【0107】

ある特定の実施形態では、ＡＰＣの表面に提示されるペプチドは、ＡＰＣから単離してもよく、これらの配列は、当技術分野において公知の任意の方法、特には、質量分析により決定してもよい。次いで、このような単離ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、化学合成により生成し、共受容体タンパク質をコードする複数のポリヌクレオチドにクローニングして、本発明のポリペプチドのライブラリーを生成し得る。このようなライブラリーは、例えば、細胞表面から単離したどのペプチドが、Ｔ細胞受容体によって一般には認識され、どのＴ細胞受容体によって特異的には認識され得るか、を同定するために使用し得る。

【0108】

上記のように、ポリヌクレオチドのライブラリーは、好ましくは、異なるペプチドに結合している同一の共受容体タンパク質をコードする、少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む。しかし、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００または少なくとも１，０００，０００種のライブラリーのポリヌクレオチドが、同一の共受容体タンパク質をコードするが、共受容体タンパク質に結合しているペプチドの配列が異なることが、さらにより好ましい。

【0109】

当業者は、本発明によるポリヌクレオチドのライブラリーを生成する方法を認識している。例えば、本発明によるライブラリーは、分子クローニングにより生成し得る。例えば、共受容体タンパク質、ならびに必要に応じて、リンカーおよびシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む複数の同一ＤＮＡベクターは、第１に、１つまたは複数の制限酵素により消化し得る。第２のステップでは、種々のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドは、適合性の制限酵素により消化し、共受容体タンパク質をコードするベクターにライゲーションし得る。好ましくは、ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ベクターの、共受容体タンパク質およびリンカーをコードするポリヌクレオチドの上流、ならびにシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの下流に導入して、ペプチドを共受容体タンパク質のＮ末端に結合させる。あるいは、本発明のライブラリーに含まれるポリヌクレオチドは、コンピュータによりデザインし、化学ＤＮＡ合成により合成し得る。

【0110】

特定の実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む細胞に関する。

【0111】

すなわち、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む任意の細胞を包含する。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドを含む細胞は、Ｔ細胞である。

【0112】

特定の実施形態では、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞受容体および前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により特異的に認識されるペプチドを同時に同定するための方法であって、（ａ）本発明のポリヌクレオチドのライブラリーを発現する、目的のポリクローナルＴ細胞を提供するステップと、（ｂ）主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）とステップ（ａ）のＴ細胞を接触させるステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）におけるＡＰＣと接触すると活性化される少なくとも１つのＴ細胞を単離するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の単離Ｔ細胞のＤＮＡをシーケンシングして、ＴＣＲ配列およびこのようなＴ細胞に存在するＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体に結合したペプチド配列についての情報を得るステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）において得られたシーケンシングデータに基づいて同族Ｔ細胞受容体－ペプチド対を同定するステップとを含む、方法に関する。

【0113】

すなわち、本発明の方法は、同族Ｔ細胞受容体－ペプチド対の同時同定のために使用し得る。同族ＴＣＲ－ペプチド対の同定のためのこれまでの方法は、これらによって単一抗原ペプチドに対する複数のＴ細胞受容体のスクリーニングが同時に可能となるだけであり、これによりスクリーニング手法に時間およびコストが嵩むという不利益を有する。一方、本発明の方法は、本発明のキメラ分子をコードするポリヌクレオチドを発現する細胞が、Ｔ細胞受容体およびＴ細胞受容体を刺激する抗原ペプチドの遺伝情報を含むという利点を有する。したがって、本発明の方法では、単一の実験において複数のペプチドに対するポリクローナルＴ細胞集団のスクリーニング、ならびに同族ＴＣＲ－ペプチド対を合成するＴ細胞の濃縮および同定が可能となる。したがって、本発明の方法では、これまでに未知の抗原ペプチドおよびこのようなペプチドを認識するＴ細胞受容体の同定が顕著に容易となり得る。

【0114】

このため、第１のステップでは、本発明のキメラ分子をコードするポリヌクレオチドのライブラリーは、ポリクローナルＴ細胞の集団に導入する。当業者は、ポリヌクレオチドをＴ細胞に導入するための方法を認識している。例えば、ポリヌクレオチドは、トランスフェクションまたはウイルス形質導入によりＴ細胞に導入し得る。Ｔ細胞の集団におけるＴ細胞にポリヌクレオチドのライブラリーをトランスフェクトまたは形質導入して、各Ｔ細胞が、本発明のキメラ分子をコードするポリヌクレオチドを１つよりも多くは得ないことを意図する。Ｔ細胞が検出可能な量の本発明のキメラ分子を産生する場合、ポリクローナルＴ細胞は、本発明のポリヌクレオチドのライブラリーを発現すると考えられる。好ましくは、Ｔ細胞のポリクローナル集団におけるＴ細胞の少なくとも２つは、異なるアミノ酸配列を有するペプチドに結合している同一の共受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現する。

【0115】

用語「集団」は、本明細書において使用する場合、同一細胞型の１つよりも多い細胞を指す。「ポリクローナルＴ細胞の集団」は、本明細書において使用する場合、集団に含まれるＴ細胞の少なくとも２つが、異なるＴ細胞受容体を含む、Ｔ細胞の集団を指す。ポリクローナルＴ細胞の集団は、任意の供給源のものであり得る。例えば、ポリクローナルＴ細胞の集団は、被験体から得てもよい。当業者は、被験体から得られた試料、例えば、血液、脾臓、リンパ節もしくは腫瘍組織から、または他の適する任意の供給源から、Ｔ細胞を単離する方法を認識している。また、本発明は、遺伝子操作により得られたポリクローナルＴ細胞の集団を包含する。例えば、ＴＣＲ陰性細胞の集団に複数のＴ細胞受容体をコードするライブラリーをトランスフェクトまたは形質導入して、ポリクローナルＴ細胞の集団を得てもよい。

【0116】

特には、ＣＤ４またはＣＤ８陰性Ｔ細胞ハイブリドーマ、特には、蛍光レポーターを保有するＣＤ４またはＣＤ８陰性Ｔ細胞ハイブリドーマを使用し得る。しかし、ＣＤ４^＋細胞も使用し得るため（図２）、これは必須ではない。Ｔ細胞活性化に適する蛍光レポーターは、例えば、ｎｕｒ７７蛍光レポーター、ＮＦＡＴ蛍光レポーター、または他の適する任意のレポーター分子（例えば、ＣＤ６９）である。

【0117】

第２のステップでは、本発明のポリヌクレオチドのライブラリーを発現するポリクローナルＴ細胞は、主要組織適合複合体をこの細胞表面に含む抗原提示細胞の存在下で培養する。上記のように、ＡＰＣ表面のＭＨＣ分子は、本発明の分子に含まれるペプチドとのペプチド－ＭＨＣ複合体の形成に必要とされ、これによりペプチド－ＭＨＣ複合体は、Ｔ細胞の細胞表面のＴ細胞受容体を刺激し得る。

【0118】

用語「抗原提示細胞」は、本明細書において使用する場合、主要組織適合複合体をこの細胞表面に含む任意の細胞を広範に指す。したがって、抗原提示細胞は、Ｔ細胞それ自体であり得る。ある特定の実施形態では、抗原提示細胞は、骨髄由来初代樹状細胞（ＢＭＤＣ）である。ＡＰＣの表面に含まれるＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩのいずれかの分子であることが好ましい。ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩ分子である場合、Ｔ細胞が、共受容体ＣＤ８を含むキメラ分子をコードするポリヌクレオチドを発現することが好ましい。ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩＩ分子である場合、Ｔ細胞が、共受容体ＣＤ４またはＬＡＧ３を含むキメラ分子をコードするポリヌクレオチドを発現することが好ましい。

【0119】

用語「接触」は、本明細書において使用する場合、２つまたはこれよりも多い成分、例えば、Ｔ細胞およびＡＰＣを溶解、混合、懸濁、ブレンド、スラリー化、または撹拌することにより、一緒にする作用を指す。Ｔ細胞の共受容体に結合しているペプチドが、ＡＰＣの表面に含まれるＭＨＣ分子とペプチド－ＭＨＣ複合体を形成し得るように２つの細胞が十分すぐ近くに存在する場合、本発明のポリヌクレオチドを発現するＴ細胞は、ＡＰＣに接触すると考えられる。好ましくは、細胞は、溶液、例えば、細胞培養培地中で接触させる。細胞は、Ｔ細胞が活性化されるのに十分な任意の時間、接触させ得る。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、数時間または数日、ＡＰＣと接触させ、これによりＡＰＣと接触すると活性化される培養中のＴ細胞を増殖させて濃縮し得る。したがって、ある特定の実施形態では、用語「接触」は、用語「共培養」と互換的に使用する。すなわち、本発明のキメラ分子を合成するＴ細胞集団のＡＰＣとの接触は、液体培地中で規定された時間量にわたり、細胞を共培養することにより達成し得る。好ましくは、共培養により、同族ＴＣＲ－ペプチド対を発現するＴ細胞が活性化され、これにより、このようなＴ細胞の増殖および濃縮が生じる。

【0120】

第４のステップでは、ＡＰＣと接触すると活性化されたＴ細胞を単離する。実施例１に示すように、それらのＴ細胞受容体により認識される抗原ペプチドを含むキメラ分子を合成するＴ細胞のみが、ＡＰＣの存在下で活性化される。したがって、ＡＰＣのみと接触させると、同族抗原ペプチドを発現するＴ細胞が活性化されて増殖する。次いで、このようなＴ細胞は、ＡＰＣの存在下で活性化されなかったＴ細胞から単離して、単離Ｔ細胞の同族ＴＣＲ－ペプチド対を決定し得る。当業者は、活性化および濃縮されたＴ細胞を単離する方法を認識している。

【0121】

例えば、活性化および濃縮されたＴ細胞は、例えば、ＮＦＡＴまたはＮｕｒ７７結合配列を含むプロモーターにより駆動する活性化マーカー、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ４４もしくはＣＤ２５および／またはレポータータンパク質、例えば、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＴｏｍａｔｏ、ｄｓＲｅｄ、あるいは他の適する活性化マーカーまたはレポータータンパク質の発現によるＦＡＣＳ選別のようなフローサイトメトリーにより同定することができる。

【0122】

特には、活性化は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により測定することができる。

【0123】

ＦＡＣＳは、細胞により発現される１つまたは複数の特異的ポリペプチドの存在、非存在、またはレベルに基づいて、細胞の集団を１つまたは複数の亜集団に分別する方法を指す。ＦＡＣＳでは、個々の細胞の蛍光を含む光学特性に依存して、細胞を亜集団に選別する。本明細書に記載する方法の実行に適する細胞選別機は、当技術分野において周知であり、市販されている。例となる細胞選別機としては、ＭｏＦｌｏソーター（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、ＦｏｒｉＣｏｌｌｉｎｓ、Ｃｏｌｏ．）、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（商標）、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ（商標）、ＢＤ（商標）ＬＳＲＩＩおよびＦＡＣＳＣａｉｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）ならびに他の販売元、例えば、Ｓｏｎｙ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、およびＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒにより製造されている他の等価な細胞選別機が挙げられる。

【0124】

あるいは、ＭＨＣに効率的に提示されるペプチドを含むＴ細胞は、ＭＡＣＳに基づく細胞選別により濃縮し得る。

【0125】

「ＭＡＣＳ」は、細胞により発現される１つまたは複数のＭＡＣＳで選択可能なポリペプチドの存在、非存在、またはレベルに基づいて、細胞の集団を１つまたは複数の亜集団に分別する方法を指す。ＭＡＣＳでは、タグ付けした個々の細胞の磁化率特性に依存して、細胞を亜集団に選別する。ＭＡＣＳでは、磁気ビーズ（例えば、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ；１３０－０４８－４０２から入手可能なもの）を標識として使用することができる。本明細書に記載する方法の実行に適するＭＡＣＳ細胞選別機は、当技術分野において周知であり、市販されている。例となるＭＡＣＳ細胞選別機としては、ａｕｔｏＭＡＣＳ ＰｒｏＳｅｐａｒａｔｏｒ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）が挙げられる。

【0126】

どれほどの数の蛍光標識を使用したかに応じて、選別は、非蛍光細胞の集団および蛍光細胞の少なくとも１つの集団をもたらす。蛍光細胞を有する少なくとも１つの細胞集団の存在は、少なくとも１つの候補ペプチドがＡＰＣにより効率的に提示されることを示す。したがって、ＦＡＣＳにより、細胞集団を選別して、ＭＨＣによって効率的に提示されるペプチドを含むＴ細胞において濃縮された細胞集団を生成することが可能となる。

【0127】

第４のステップでは、単離Ｔ細胞のＤＮＡをシーケンシングする。上記のように、ＡＰＣの存在下で活性化および濃縮されるＴ細胞は、同族ＴＣＲ－ペプチド対を含む。したがって、これまでのステップにおいて単離された活性化Ｔ細胞のシーケンシングにより、どのペプチドが、どのＴ細胞受容体を活性化するかについての情報がもたらされる。

【0128】

ＴＣＲおよび対応する同族ペプチドの配列は、このような濃縮Ｔ細胞集団の単一細胞ＲＮＡ／ＤＮＡシーケンシングにより得ることができる。

【0129】

ＤＮＡ単離およびシーケンシングの方法は、当業者に公知である。

【0130】

一般には、細胞の核に存在するＤＮＡを他の細胞成分から分別することが目的である。ＤＮＡの単離は通常、細胞の溶解または分解により開始する。このプロセスは、タンパク質構造の破壊のために必須であり、このプロセスにより核からの核酸の放出が可能となる。溶解は、タンパク質を変性させる界面活性剤もしくはプロテアーゼ（タンパク質を消化する酵素）、例えば、プロテイナーゼＫを、または一部の場合では、両方を含む塩溶液中で実行する。これにより、細胞の分解および膜の溶解が生じる。ＤＮＡ単離の方法は、フェノール：クロロホルム抽出、高塩濃度沈殿、アルカリ変性、イオン交換カラムクロマトグラフィー、樹脂結合、および常磁性ビーズ結合を含むが、これらに限定されない。

【0131】

ｃＤＮＡ生成の方法は、当業者に公知である。一般には、細胞に存在する単離ＲＮＡをＤＮＡに変換、いわゆるＤＮＡのコピーを行って、これをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための鋳型として使用することが目的である。ＲＮＡの単離は通常、細胞の溶解または分解により開始する。このプロセスは、タンパク質構造の破壊のために必須であり、このプロセスにより、それからの核酸の放出が可能となる。溶解は通常、フェノールを含む溶液（例えば、ＴＲＩｚｏｌ（商標））中で実行する。これにより、細胞の分解および膜の溶解が生じ、他の細胞成分からのＲＮＡの分別が可能となる。次いで、単離ＲＮＡは、逆転写酵素（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）、Ｇｏｓｃｒｉｐｔ（商標））によりｃＤＮＡに変換する。

【0132】

次いで、活性化Ｔ細胞により保有される候補ペプチドの配列（抗原提示細胞表面に提示されるＭＨＣ複合体に結合する）は、ＰＣＲにより増幅し、当技術分野において公知の任意の方法によりシーケンシングし得る。

【0133】

候補ペプチドの配列は、デジタルＰＣＲにより決定し得る。デジタルポリメラーゼ連鎖反応（デジタルＰＣＲ、ＤｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ｄＰＣＲまたはｄｅＰＣＲ）は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸の直接的定量およびクローン的増幅のために使用可能な従来のポリメラーゼ連鎖反応方法の改良である。

【0134】

また、シーケンシングは、マイクロ流体工学（microfluidics）を使用して実施し得る。マイクロ流体工学は、小容量の流体を取り扱うマイクロスケール装置を含む。マイクロ流体工学は、小流体容量、特には、１μｌ未満の容量を正確かつ再現可能に調節および分注し得るため、マイクロ流体工学を適用すると、顕著なコスト削減がもたらされる。マイクロ流体工学技術の使用により、サイクルタイムが削減され、結果までの時間が短縮され、スループットが増加する。その上、マイクロ流体工学技術を組み込むと、システムの統合および自動化が増強される。マイクロ流体反応は、微小液滴において一般に行われる。

【0135】

また、シーケンシングは、第２世代シーケンシング（または次世代もしくはＮｅｘｔ－Ｇｅｎ）、第３世代（またはＮｅｘｔ－Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎ）または第４世代（またはＮ３－Ｇｅｎ）シーケンシング技術を使用して実施してもよく、パイロシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、単一分子シーケンシング、合成によるシーケンス（ＳＢＳ）、大規模並列クローナル、大規模並列単一分子ＳＢＳ、大規模並列単一分子リアルタイム、大規模並列単一分子リアルタイムナノポア技術を含むが、これらに限定されない。MorozovaおよびMarraは、Genomics, 92: 255 (2008)において、このような一部の技術の総説を提供する。

【0136】

シーケンシングの前、後または同時に、核酸を増幅し得る。核酸増幅技術の例示的な非限定的例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、転写増幅法（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、特定の増幅技術（例えば、ＰＣＲ）では、増幅前にＲＮＡがＤＮＡに逆転写されることが必要とされるが（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）、他の増幅技術では、ＲＮＡを直接増幅する（例えば、ＴＭＡおよびＮＡＳＢＡ）ことを認識する。

【0137】

最終ステップでは、活性化および濃縮されたＴ細胞の同族ＴＣＲ－ペプチド対は、シーケンシングデータを解析することにより同定する。当業者は、シーケンシングデータを解析する生物情報学ツールを認識している。したがって、上記の方法により、単一の実験において複数の同族ＴＣＲ－ペプチド対を同定することが可能となる。

【0138】

ある特定の実施形態では、本発明による方法は、これまでに未知の抗原ペプチドの同定に使用し得る。このため、ライブラリーの少なくとも２つのポリペプチドが種々のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする、ペプチドに結合している共受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドライブラリーは、ポリクローナルＴ細胞の集団に導入し得る。

【0139】

ある特定の実施形態では、ライブラリーにおけるペプチドは、ランダムＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子によりコードされ得る。ランダムＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子は、例えば、上記のように、細胞、特には、抗原提示細胞、例えば、腫瘍細胞または病原体に感染している細胞から得てもよい。さらに、ランダムＤＮＡ分子は、免疫原性試験のためのペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の断片であり得る。

【0140】

他の実施形態では、ライブラリーのペプチドコードポリヌクレオチドは、化学合成により得てもよい。例えば、ライブラリーのペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列は、上記のエクソームデータに基づいてコンピュータによりデザインし得る。あるいは、ライブラリーのペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列は、上記のように抗原提示細胞から単離されたペプチドの配列に基づいてデザインし得る。

【0141】

ポリヌクレオチドのライブラリーは、Ｔ細胞の任意の集団に導入し得る。特には、Ｔ細胞の集団は、ライブラリーのペプチドをコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子と同一の被験体から得られたＴ細胞の集団であり得る。

【0142】

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、これまでに未知の腫瘍抗原の同定に使用し得る。この場合、ポリヌクレオチドのライブラリーにおいてコードされるペプチドの配列情報が、腫瘍細胞から得られることが好ましい。このようなペプチドに特異的に結合するＴ細胞受容体を同定するために、ポリヌクレオチドのライブラリーを、被験体、特には、がんに罹患している被験体、特には、ポリヌクレオチドのライブラリーの生成に使用した腫瘍細胞を得られた被験体と同一の被験体から得られたモノクローナルまたはポリクローナルＴ細胞に対してスクリーニングすることがさらに好ましい。

【0143】

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、これまでに未知の病原体関連抗原の同定に使用し得る。この場合、ポリヌクレオチドのライブラリーにおいてコードされるペプチドの配列情報が、病原体に感染している細胞から得られることが好ましい。このようなペプチドに特異的に結合するＴ細胞受容体を同定するために、ポリヌクレオチドのライブラリーを、被験体、特には、感染性疾患に罹患している被験体から得られたモノクローナルまたはポリクローナルＴ細胞に対してスクリーニングすることがさらに好ましい。好ましくは、ライブラリーの生成に使用する細胞およびモノクローナルまたはポリクローナルＴ細胞の集団は、同一の感染性疾患に罹患している被験体、より好ましくは、同一の被験体から得ている。

【0144】

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、自己免疫疾患の発症および進行に関与する抗原ペプチドの同定に使用し得る。自己免疫疾患は、健常細胞に存在する抗原により活性化される病原性Ｔ細胞により生じ得る。したがって、病原性Ｔ細胞により認識されることが多い抗原ペプチドを同定すると、この認識を遮断する作用物質、例えば、抗原ペプチドに結合して病原性Ｔ細胞による認識を防ぐ結合作用物質の発生が容易となり得る。したがって、本発明の方法は、病原性Ｔ細胞により認識され得る抗原ペプチドを同定するために使用し得る。このため、ポリヌクレオチドライブラリーは、病原性Ｔ細胞のモノクローナルまたはポリクローナル集団に対してスクリーニングし得る。病原性Ｔ細胞のモノクローナルまたはポリクローナル集団が、自己免疫疾患に罹患している患者から得られることが好ましい。あるいは、１つまたは複数の公知の病原性Ｔ細胞受容体をコードするポリヌクレオチドを非病原性Ｔ細胞に導入して、病原性Ｔ細胞の集団を得てもよい。用語「病原性Ｔ細胞」は、本明細書において使用する場合、自己免疫疾患の発症または進行の間に自己抗原に応答するＴ細胞を指す。

【0145】

特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞受容体を同定するための方法であって、（ａ）本発明のポリヌクレオチドを発現する、目的のポリクローナルＴ細胞を提供するステップと、（ｂ）主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）とステップａ）のＴ細胞を接触させるステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）におけるＡＰＣと接触すると活性化される少なくとも１つのＴ細胞を単離するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）において単離した少なくとも１つのＴ細胞のＴＣＲ遺伝子座をシーケンシングするステップと、（ｅ）少なくとも１つのＴ細胞のＴＣＲ遺伝子座によりコードされる少なくとも１つのＴ細胞受容体が抗原特異的であると同定するステップとを含む、方法に関する。

【0146】

また、種々のＴ細胞受容体を複数の抗原ペプチドに対して同時にスクリーニングする代わりに、本発明のキメラ分子を、特異的抗原により刺激されるＴ細胞受容体の同定に使用し得る。このため、特異的ペプチドに結合している共受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ポリクローナルＴ細胞の集団において発現する。

【0147】

したがって、本発明の方法は、公知の抗原標的に対して高い特異性でのＴ細胞受容体の同定に使用し得る。例えば、公知の抗原標的は、被験体の抗原提示細胞表面に存在すると決定されている抗原ペプチドであり得る。特には、抗原ペプチドは、病原体に感染している細胞の表面のＭＨＣ分子により提示される病原体由来ペプチドであり得る。あるいは、抗原ペプチドは、健常細胞の表面ではなく腫瘍細胞の表面のＭＨＣ分子により特異的に提示されるペプチドであり得る。感染細胞または腫瘍細胞に提示される抗原ペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む共受容体にペプチドを結合させることにより、このような抗原ペプチドに対して高い特異性でＴ細胞受容体を同定することが可能となる。

【0148】

本発明の方法により同定し得る抗原特異的Ｔ細胞受容体は、天然に存在するＴ細胞受容体であり得る。例えば、ある特定の実施形態では、ポリクローナルＴ細胞の集団は、被験体から単離し得る。ある特定の実施形態では、ポリクローナルＴ細胞の集団は、抗原ペプチドをそれらの細胞表面に呈する感染細胞または腫瘍細胞を含むと決定されている被験体から単離し得る。

【0149】

あるいは、ポリクローナルＴ細胞の集団は、遺伝子操作により得てもよい。例えば、ポリクローナルＴ細胞の集団は、Ｔ細胞受容体のライブラリーをＴ細胞、特には、ＴＣＲ陰性Ｔ細胞の集団に導入することにより得てもよい。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体のライブラリーは、ＭＨＣ分子によりＡＰＣの表面に提示される抗原ペプチドへのある程度の結合を既に示すＴ細胞受容体の配列に基づいて生成し得る。すなわち、ライブラリーは、Ｔ細胞受容体をコードするＤＮＡ配列にランダムまたは標的化変異を導入することにより生成して、抗原ペプチドにより刺激されるＴ細胞受容体の変異したバリアントのさらに効率的な同定を目的とし得る。

【0150】

特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＴ細胞特異的抗原を同定するための方法であって、（ａ）本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドのライブラリーを発現する、目的のモノクローナルＴ細胞を提供するステップと、（ｂ）主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）とステップ（ａ）のＴ細胞を接触させるステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）におけるＡＰＣと接触すると活性化される少なくとも１つのＴ細胞を単離するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）において単離した少なくとも１つのＴ細胞のＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質のＮ末端に結合しているペプチドをコードするポリヌクレオチドの部分をシーケンシングするステップと、（ｅ）少なくとも１つのＴ細胞に含まれるポリヌクレオチドによりコードされる少なくとも１つのペプチドがＴ細胞特異的抗原であると同定するステップとを含む、方法に関する。

【0151】

すなわち、ある特定の実施形態では、本発明のキメラ分子は、特異的Ｔ細胞受容体を効率的に刺激するペプチドを同定するために使用する。このため、モノクローナルＴ細胞の集団は、本発明のポリヌクレオチドのライブラリーに対してスクリーニングし得る。モノクローナルＴ細胞の集団は、集団における本質的にすべてのＴ細胞が、同一のＴ細胞受容体を合成する、１つより多いＴ細胞の群である。したがって、本発明の方法は、特異的Ｔ細胞受容体を効率的に刺激するペプチドのライブラリーからペプチドを同定するために使用し得る。例えば、ペプチドのライブラリーは、ライブラリーの少なくとも２つのポリヌクレオチドが、異なるアミノ酸配列を有するペプチドに結合している同一の共受容体タンパク質をコードする、本発明のポリヌクレオチドのライブラリーによりコードされ得る。

【0152】

ある特定の実施形態では、共受容体タンパク質に結合しているペプチドは、ＭＨＣ分子により提示されることがわかっている少なくとも２つの異なる抗原ペプチドをこれらが含むという点において、アミノ酸配列が異なり得る。特には、抗原ペプチドは、腫瘍細胞または病原体に感染している細胞に由来するペプチドであり得る。

【0153】

他の実施形態では、共受容体タンパク質に結合しているペプチドは、これらが、公知の抗原ペプチドの変異したバリアントであるという点において、アミノ酸配列が異なり得る。すなわち、本発明の方法は、同族Ｔ細胞受容体の刺激の向上を生じる公知の抗原ペプチドの変異したバリアントを同定するために使用し得る。例えば、公知の抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドにランダムまたは標的化変異を導入して、公知のＴ細胞受容体のさらに効率的な刺激を生じるペプチドを同定し得る。

【0154】

特定の実施形態では、本発明は、ＡＰＣが、自己または異種ＡＰＣである、本発明の方法に関する。

【0155】

すなわち、本発明の方法においてＴ細胞と接触させるＡＰＣは、自己または異種ＡＰＣであり得る。「自己ＡＰＣ」は、本明細書において使用する場合、ＡＰＣを接触させるＴ細胞と同一の被験体から得られたＡＰＣである。「異種ＡＰＣ」は、本明細書において使用する場合、ＡＰＣを接触させるＴ細胞と異なる被験体から得られたＡＰＣである。

【0156】

特定の実施形態では、本発明は、ＡＰＣが、変異ＭＨＣ分子を発現する、遺伝子改変された自己または異種細胞または細胞株である、本発明の方法に関する。

【0157】

本発明の方法においてＴ細胞と接触させる自己または異種ＡＰＣは、変異ＭＨＣ分子を発現する遺伝子改変されたＡＰＣであり得る。

【0158】

特定の実施形態では、本発明は、変異ＭＨＣ分子が、細胞外ＭＨＣクラスＩＩアルファ鎖および天然または異種膜貫通ドメイン、ならびに細胞外ＭＨＣクラスＩＩベータ鎖および天然または異種膜貫通ドメインを含むＭＨＣクラスＩＩ分子である、本発明の方法に関する。

【0159】

すなわち、変異ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＭＨＣクラスＩＩアルファ鎖および天然または異種膜貫通ドメインに融合するＭＨＣクラスＩＩベータ鎖の細胞外ドメインを含み得る。あるいは、変異ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＭＨＣクラスＩＩベータ鎖および天然または異種膜貫通ドメインに融合するＭＨＣクラスＩＩアルファ鎖の細胞外ドメインを含み得る。あるいは、変異ＭＨＣクラスＩＩ分子は、天然または異種膜貫通ドメインに融合するＭＨＣクラスＩＩアルファ鎖の細胞外ドメイン、および天然または異種膜貫通ドメインに融合するＭＨＣクラスＩＩベータ鎖の細胞外ドメインを含み得る。

【0160】

特定の実施形態では、本発明は、変異ＭＨＣ分子が、細胞外ＭＨＣクラスＩアルファ鎖および天然または異種膜貫通ドメイン、ならびにベータ２ミクログロブリンを含むＭＨＣクラスＩ分子である、本発明の方法に関する。

【0161】

すなわち、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子の細胞外ドメインが、異なるＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子の膜貫通ドメインにそれぞれ共有結合によって連結している場合、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子の細胞外ドメインは、天然膜貫通ドメインに融合すると考えられる。ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子の細胞外ドメインが、他の任意の膜貫通タンパク質、特には、他の任意の哺乳動物膜貫通タンパク質由来の膜貫通ドメインに共有結合によって連結している場合、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子の細胞外ドメインは、異種膜貫通ドメインに融合すると考えられる。当業者は、第１のタンパク質の細胞外ドメインを第２のタンパク質の膜貫通ドメインに融合させる方法を認識している。

【0162】

特定の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのライブラリーによりコードされる共受容体タンパク質が、ＣＤ８であり、ＡＰＣに含まれるＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩ分子である、本発明の方法に関する。

【0163】

すなわち、共受容体タンパク質ＣＤ８により、ペプチド－ＭＨＣクラスＩ複合体と同族ＴＣＲとの間の結合が容易となることがわかっている。したがって、本発明では、ＭＨＣクラスＩ分子を含むＡＰＣと生じる細胞が接触する場合、Ｔ細胞に導入するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのライブラリーが、共受容体タンパク質ＣＤ８をコードすることが好ましい。

【0164】

ＭＨＣクラスＩ分子は、すべての有顎脊椎動物において細胞の表面に発現し、Ｔ細胞への抗原提示の原因となる。ＭＨＣ分子をコードする遺伝子は、脊椎動物ゲノムのＭＨＣ領域に見出されるが、遺伝子組成およびゲノム配列は、大幅に異なる。

【0165】

ヒトでは、このような遺伝子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子と呼ぶ。最も熱心に研究されたＨＬＡ遺伝子は、９つのいわゆる古典的ＭＨＣ遺伝子：ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡおよびＨＬＡ－ＤＲＢ１である。ヒトでは、ＭＨＣは、３つの領域：クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩに分割する。Ａ、ＢおよびＣ遺伝子は、ＭＨＣクラスＩに属するが、６つのＤ遺伝子は、クラスＩＩに属する。

【0166】

ＭＨＣクラスＩタンパク質分子は、２つのポリペプチド鎖：高度に多形性のａ鎖（３つのドメイン：ａ１、ａ２およびａ３を含む）および非共有結合のＰ２ミクログロブリンを含むヘテロ２量体である。ヒトＭＨＣクラスＩタンパク質分子は、当技術分野において「ＨＬＡ分子」または「ＨＬＡタンパク質分子」と呼び得る。

【0167】

したがって、用語「ＭＨＣクラスＩ分子」は、本明細書において使用する場合、ヒトおよび非ヒトを含むすべての哺乳動物ＭＨＣクラスＩ分子を含む。好ましくは、ＭＨＣクラスＩ分子は、ヒトＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡタンパク質分子）である。

【0168】

ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞表面の抗原の結合および提示の原因となり、このため抗原に結合しているか、または結合せずに存在する。したがって、用語ＭＨＣクラスＩ分子は、それ自体で、または抗原に結合している場合のいずれかで、ＭＨＣクラスＩ分子を指す。

【0169】

ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ分子であり得る。好ましくは、ＨＬＡ分子は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の産物である。ＨＬＡ－Ａ遺伝子は、多対立遺伝子性(polyallelic)であり、例えば、コードされるタンパク質のａ鎖におけるさまざまな差が、集団において存在する。

【0170】

好ましくは、本発明による第１の部分により結合したＨＬＡ分子は、ＨＬＡ－Ａ２遺伝子の産物である。ＨＬＡ－Ａ２は、ＨＬＡ－Ａ’Ａ’血清型群におけるＨＬＡ血清型であり、ＨＬＡ－Ａ０２０１、ＨＬＡ－Ａ０２０２、ＨＬＡ－Ａ０２０３、ＨＬＡ－Ａ０２０５、ＨＬＡ－Ａ０２０６、ＨＬＡ－Ａ０２０７およびＨＬＡ－Ａ０２１ １遺伝子産物を含むＨＬＡ－Ａ０２対立遺伝子群によりコードされる。ＨＬＡ－Ａ２は、コーカサス人種集団において非常に一般的であり（４０～５０％）、ドナーおよびレシピエントの多くの組合せにおける使用に適するため、第１の部分のための理想的な細胞標的をもたらす。この手法は、コーカサス人種集団におけるすべての移植事例のおよそ４分の１に適する。したがって、ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子群の任意のメンバーは、用語「ＨＬＡ－Ａ２」により包含される。

【0171】

特定の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドによりコードされる共受容体タンパク質が、ＣＤ４またはＬＡＧ－３であり、ＡＰＣにより発現されるＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩＩ分子である、本発明の方法に関する。

【0172】

生じる細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ分子を含むＡＰＣと接触する場合、Ｔ細胞に導入するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのライブラリーが、共受容体タンパク質ＣＤ４またはＬＡＧ３をコードすることがさらに好ましい。

【0173】

ＭＨＣクラスＩＩ分子は、同等サイズ（約３００００Ｄａ）の２つの膜貫通ポリペプチド鎖αおよびβからなる。各鎖は、２つのドメインからなり、この場合、α１およびβ１は、９ポケットペプチド結合溝を形成し、この場合、ポケット１、４、６および９は、主要なペプチド結合ポケットであると考えられる。ＭＨＣクラスＩ分子におけるα２およびβ２ｍのようなα２およびβ２は、アミノ酸配列を有し、免疫グロブリン定常ドメインとの構造類似性を有する。抗原ペプチドの末端が埋没するＭＨＣクラスＩ複合体とは対照的に、ＭＨＣクラスＩＩ複合体におけるペプチド末端は、埋没していない。ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＱおよびＤＰは、ヒトクラスＩＩ分子であり、Ｈ－２Ａ、ＭおよびＥは、マウスのクラスＩＩ分子である。

【0174】

特定の実施形態では、本発明は、がんまたは感染性疾患に罹患している被験体を処置するための方法であって、（ａ）少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞受容体および／または少なくとも１つのＴ細胞特異的抗原を本発明の方法により同定するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において同定された少なくとも１つのＴ細胞受容体および／またはＴ細胞特異的抗原をがんまたは感染性疾患に罹患している被験体に投与するステップとを含む、方法に関する。

【0175】

すなわち、本発明の方法は、がんまたは感染性疾患に罹患している被験体の処置において使用し得る抗原ペプチドまたは抗原特異的Ｔ細胞受容体を同定するために使用し得る。例えば、本発明の方法は、被験体の腫瘍細胞または病原体に感染している細胞にＭＨＣ分子により提示される抗原ペプチドにより効率的に刺激される、天然に存在するか、または操作されたＴ細胞受容体を同定するために使用し得る。この場合、同定された抗原特異的Ｔ細胞受容体は、がんに罹患している被験体に投与して、この被験体における腫瘍細胞を攻撃するか、または感染性疾患に罹患している被験体に投与して、病原体に感染している細胞を攻撃し得る。

【0176】

あるいは、本発明の方法は、これまでに未知の抗原ペプチドを同定するために使用し得る。特には、本発明の方法は、ＡＰＣ、特には、腫瘍細胞または病原体に感染している細胞により発現される、これまでに未知の抗原ペプチドを同定するために使用し得る。

【0177】

本発明の方法は、新たに同定された抗原ペプチドが、Ｔ細胞、特には、腫瘍細胞または感染細胞と同一の被験体から得られたＴ細胞により認識されるかどうかを決定するために、さらに使用し得る。これまでに未知の同族ＴＣＲ－ペプチド対が、がんまたは感染性疾患に罹患している被験体において、本発明の方法を使用することにより同定される場合、前記被験体は、抗原ペプチドまたはこの同族Ｔ細胞受容体により処置され得る。

【0178】

ある特定の実施形態では、抗原ペプチドおよび／または抗原特異的Ｔ細胞受容体の同定に使用されたモノクローナルまたはポリクローナルＴ細胞が、がんまたは感染性疾患に罹患している患者から得られたことが好ましい。さらなる実施形態では、Ｔ細胞に導入するポリヌクレオチドのライブラリーが、がんまたは感染性疾患に罹患している被験体のＡＰＣ、特には、がんに罹患している被験体の腫瘍細胞または病原体に感染している細胞から得られたポリヌクレオチド配列を含むことが好ましい。

【0179】

本発明の方法により処置され得るがんは、血管形成されていないか、または実質的には未だ血管形成されていない腫瘍、ならびに血管形成された腫瘍を含む。がんは、非固形腫瘍（例えば、血液腫瘍、例えば、白血病、およびリンパ腫）を含み得るか、または固形腫瘍を含み得る。本発明のリンパ球により処置され得るがんの型は、癌腫、芽細胞腫、および肉腫、ならびに特定の白血病またはリンパ性悪性疾患、良性および悪性腫瘍、ならびに悪性疾患、例えば、肉腫、癌腫、および黒色腫を含むが、これらに限定されない。成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんも含まれる。

【0180】

血液がんは、血液または骨髄のがんである。血液（または血行性）がんの例としては、急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）を含む白血病、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性および高悪性度型）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病および脊髄形成異常が挙げられる。

【0181】

固形腫瘍は、嚢胞または液体部位を通常含まない組織の異常腫瘤である。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。種々の型の固形腫瘍の名前は、これらを形成する細胞型に由来する（例えば、肉腫、癌腫、およびリンパ腫）。固形腫瘍、例えば、肉腫および癌腫の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜種、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性疾患、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭状癌、褐色細胞腫、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌（bile duct carcinoma）、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、黒色腫、およびＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫（例えば、脳幹神経膠腫および混合性神経膠腫）、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫としても知られる）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、シュワン細胞腫、頭蓋咽頭腫（craniopharyogioma）、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（menangioma）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫ならびに脳転移）が挙げられる。

【0182】

本発明では、感染性疾患は、任意の病原体により生じ得る。ある特定の実施形態では、感染性疾患は、ウイルス病原体により生じ得る。ある特定の実施形態では、ウイルス病原体は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、水痘帯状疱疹（Ｖａｒｉｚｅｌｌａ－Ｚｏｓｔｅｒ）ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはインフルエンザウイルスである。

【0183】

特定の実施形態では、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞受容体が、ウイルス媒介遺伝子送達により被験体に投与される、本発明の方法に関する。

【0184】

がんに罹患している被験体から得られた腫瘍細胞の表面または被験体から得られた病原体感染細胞の表面に提示される抗原を効率的に結合させる本発明の方法により同定された、天然に存在するか、または操作されたＴ細胞受容体は、任意の経路によりこの被験体に投与され得る。例えば、Ｔ細胞受容体は、ウイルス媒介遺伝子送達により被験体に投与され得る。このため、Ｔ細胞の集団を、被験体から最初に単離することが好ましい。抗原特異的ＴＣＲをコードする遺伝子をウイルス媒介遺伝子送達によりＴ細胞の集団に導入し、次いで、遺伝子を受け取って抗原特異的Ｔ細胞受容体を合成するＴ細胞を被験体に再導入する。当業者は、ウイルス媒介遺伝子送達のための方法および適するウイルスベクターを認識している。特には、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに基づくベクターは、ＴＣＲ遺伝子のＴ細胞への送達に使用し得る。

【0185】

あるいは、抗原特異的Ｔ細胞受容体は、被験体に直接投与される可溶性抗原特異的Ｔ細胞受容体であり得る。特定の実施形態では、可溶性抗原特異的Ｔ細胞受容体は、別の分子、例えば、医薬化合物にコンジュゲートする。

【0186】

特定の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞特異的抗原が、ペプチドの形態またはペプチドをコードするポリヌクレオチドの形態で被験体に投与される、本発明の方法に関する。

【0187】

本発明の方法により同定された抗原ペプチドは、がんまたは感染性疾患に罹患している被験体に任意の方法で投与され得る。すなわち、抗原ペプチドは、ペプチドの形態で被験体に投与してもよく、これによりペプチドが取り込まれて、抗原提示細胞により提示され、次いで、抗原特異的Ｔ細胞の活性化が生じ得る。あるいは、抗原ペプチドはまた、より大きなペプチドまたは抗原ペプチドを含むタンパク質の形態で被験体に投与され得る。次いで、より大きなペプチドまたはタンパク質は、抗原提示細胞により取り込まれてプロセシングされ、これにより抗原ペプチドが、ＭＨＣにより抗原提示細胞の表面に提示され得る。あるいは、抗原ペプチドは、ポリヌクレオチドの形態で被験体に投与してもよく、これはＡＰＣにより取り込まれ、これにより抗原ペプチドが発現して、ＡＰＣにより提示され得る。ある特定の実施形態では、抗原特異的ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子である。他の実施形態では、抗原特異的ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子、特には、ｍＲＮＡ分子である。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、さらなる制御エレメントまたはコード配列を含む。

【0188】

特定の実施形態では、本発明は、ペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドのＡＰＣへの送達を向上させる化合物に結合している、本発明の方法に関する。

【0189】

ペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ペプチドまたはポリヌクレオチドのＡＰＣへの送達が容易となる任意の化合物に結合させ得る。すなわち、ペプチドまたはポリヌクレオチドは、例えば、ペプチドまたはポリヌクレオチドをＡＰＣに方向づける標的化部分に結合させ得る。

【0190】

用語「投与」は、本明細書において使用する場合、本発明のＴＣＲ物質または抗原ペプチドの被験体への送達を指し、任意の特定の経路に限定されないが、むしろ、医学界により適切であると認められた任意の経路を指す。用語「被験体」は、本明細書において使用する場合、任意の動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトを表す。被験体の例としては、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌおよびネコが挙げられる。本発明では、用語「被験体」は、用語「患者」と互換的に使用する。

【0191】

用語「処置すること」は、本明細書において使用する場合、処置された被験体において生じる疾患または障害、例えば、がんまたは感染性疾患の、処置されていない被験体と比較した任意の改善を指す。このような改善は、前記疾患または障害の悪化または進行の予防であり得る。その上、このような改善はまた、疾患もしくは障害またはこの随伴症状の回復または治癒であり得る。処置は、処置される被験体の１００％が成功するわけではないことが理解される。しかし、この用語では、処置において、統計学的に優位な割合の被験体（例えば、臨床試験におけるコホート）が成功することが必要となる。割合が統計学的に有意であるかどうかは、ここでは詳細な説明はしないが、種々の周知の統計学的評価ツール、例えば、信頼区間の決定、ｐ値決定、スチューデントのｔ検定、マン・ホイットニー検定等を使用して当業者により決定することができる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons,New York 1983に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。ｐ値は、好ましくは、０．０５、０．０１、０．００５または０．０００１である。

【0192】

Ｂ１．ＣＤ４、ＬＡＧ３またはＣＤ８共受容体タンパク質および共受容体のＮ末端に結合しているペプチドを含むキメラ分子。

【0193】

Ｂ２．ペプチドが、共受容体のＮ末端にリンカーを介して結合している、実施形態Ｂ１に記載のキメラ分子。

【0194】

Ｂ３．ペプチドが、所与のｃＤＮＡまたはＤＮＡ分子によりコードされる、実施形態Ｂ１または実施形態Ｂ２に記載のキメラ分子。

【0195】

Ｂ４．ｃＤＮＡまたはＤＮＡが、断片化ｃＤＮＡまたはＤＮＡ分子に由来する、実施形態Ｂ３に記載のキメラ分子。

【0196】

Ｂ５．ペプチドが、ランダムペプチドである、実施形態Ｂ１からＢ４のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【0197】

Ｂ６．ペプチドが、ペプチドライブラリーに由来する、実施形態Ｂ１からＢ５のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【0198】

Ｂ７．ペプチドが、６～２００アミノ酸残基を有する、実施形態Ｂ１からＢ６のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【0199】

Ｂ８．ペプチドが、腫瘍ＤＮＡに存在するＳＮＰを含むＤＮＡによりコードされる、実施形態Ｂ１からＢ７のいずれか一項に記載のキメラ分子。

【0200】

Ｂ９．実施形態Ｂ１からＢ８のいずれか一項に記載のキメラ分子をコードするＤＮＡを含むキメラＤＮＡ構築物。

【0201】

Ｂ１０．実施形態Ｂ１からＢ８のいずれか一項において定義する分子の１つまたは複数を含むキメラ分子のライブラリー。

【0202】

Ｂ１１．抗原特異的Ｔ細胞およびこれらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により特異的に認識されるペプチドの同時検出および濃縮のための方法であって、
（ａ）実施形態Ｂ１からＢ８のいずれか一項に記載のキメラ分子をコードするキメラＤＮＡ構築物を過剰発現する、目的のポリクローナルＴ細胞を提供するステップと、
（ｂ）ステップａ）のキメラＤＮＡ構築物を過剰発現するＴ細胞を、ペプチド結合溝を含む主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で培養し、これにより複合体が、ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質のＮ末端に結合しているペプチドとＭＨＣのペプチド結合溝との間に形成されるステップであって、この複合体は、ＴＣＲによる認識の際にＴ細胞の活性化を導く、ステップと、
（ｃ）共培養ステップｂ）において活性化および拡大増殖させたＴ細胞を単離するステップと、必要に応じて
（ｄ）単離Ｔ細胞のＤＮＡをシーケンシングして、ＴＣＲ配列およびこのようなＴ細胞に存在するＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体に結合しているペプチド配列についての情報を得るステップと
を含む、方法。

【0203】

Ｂ１２．活性化Ｔ細胞が、ステップｂ）において形成されたＭＨＣペプチド複合体を認識するＴＣＲを含む、実施形態Ｂ１１に記載の方法。

【0204】

Ｂ１３．抗原特異的ＴＣＲ配列の同定のための方法であって、
ａ）実施形態Ｂ１からＢ８のいずれか一項に記載のキメラ分子をコードするキメラＤＮＡ構築物を過剰発現する、目的のポリクローナルＴ細胞を提供するステップと、
ｂ）ステップａ）のキメラＤＮＡ構築物を過剰発現するＴ細胞を、ペプチド結合溝を含む主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で培養し、これにより複合体が、ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質のＮ末端に結合しているペプチドとＭＨＣのペプチド結合溝との間に形成されるステップであって、この複合体は、ＴＣＲによる認識の際にＴ細胞の活性化を導く、ステップと、
ｃ）共培養ステップｂ）において活性化および拡大増殖させたＴ細胞を、活性化マーカーまたはレポータータンパク質の発現によって同定および選別するステップと、
ｄ）ステップｃ）において同定および選別したＴ細胞のＴＣＲ遺伝子座をシーケンシングするステップと
を含む、方法。

【0205】

Ｂ１４．Ｔ細胞特異的抗原の同定のための方法であって、
ａ）実施形態Ｂ１からＢ８のいずれか一項に記載のキメラ分子をコードするキメラＤＮＡ構築物を過剰発現する、目的のモノクローナルＴ細胞を提供するステップと、
ｂ）ステップａ）のキメラＤＮＡ構築物を過剰発現するＴ細胞を、ペプチド結合溝を含む主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で培養し、これにより複合体が、ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質のＮ末端に結合しているペプチドとＭＨＣのペプチド結合溝との間に形成されるステップであって、この複合体は、ＴＣＲによる認識の際にＴ細胞の活性化を導く、ステップと、
ｃ）ステップｂ）の共培養において活性化したＴ細胞を、活性化マーカーまたはレポータータンパク質の発現によって同定および選別するステップと、
ｄ）ステップｃ）において同定および選別したＴ細胞に存在するＤＮＡ／ＲＮＡを単離するステップと、
ｅ）キメラ共受容体をコードする断片を（ＰＣＲまたはｒｔＰＣＲにより）増幅するステップと、
ｆ）ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質のＮ末端に結合しているペプチドをコードする部分をシーケンシングするステップと
を含む、方法。

【0206】

Ｂ１５．ＡＰＣが、自己ＡＰＣである、実施形態Ｂ１１からＢ１４のいずれか一項に記載の方法。

【0207】

Ｂ１６．ＡＰＣが、異種ＡＰＣである、実施形態Ｂ１１からＢ１４のいずれか一項に記載の方法。

【0208】

Ｂ１７．ＡＰＣが、変異ＭＨＣ分子を過剰発現する、遺伝子改変された自己または異種細胞または細胞株である、実施形態Ｂ１１からＢ１４のいずれか一項に記載の方法。

【0209】

Ｂ１８．ステップａ）において、目的のＴ細胞において過剰発現されるキメラＤＮＡ構築物が、ペプチドライブラリーをコードする、実施形態Ｂ１１からＢ１７のいずれか一項に記載の方法。

【0210】

Ｂ１９．ペプチドライブラリーが、実施形態Ｂ１０において定義するライブラリーである、実施形態Ｂ１８に記載の方法。

【0211】

Ｂ２０．共受容体が、ＣＤ８であり、ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩ分子である、実施形態Ｂ１１からＢ１９のいずれか一項に記載の方法。

【0212】

Ｂ２１．共受容体が、ＣＤ４またはＬＡＧ－３であり、ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩＩ分子である、実施形態Ｂ１１からＢ１９のいずれか一項に記載の方法。

【0213】

Ｂ２２．変異ＭＨＣ分子が、細胞外ＭＨＣクラスＩＩアルファ鎖および天然または異種膜貫通ドメイン、ならびに細胞外ＭＨＣクラスＩＩベータ鎖および天然または異種膜貫通ドメインを含むＭＨＣクラスＩＩ分子である、実施形態Ｂ１７からＢ２１のいずれか一項に記載の方法。

【0214】

Ｂ２３．変異ＭＨＣ分子が、細胞外ＭＨＣクラスＩアルファ鎖および天然または異種膜貫通ドメイン、ならびにベータ２ミクログロブリンを含むＭＨＣクラスＩ分子である、実施形態Ｂ１７からＢ２１のいずれか一項に記載の方法。

【0215】

本発明では、抗原特異的Ｔ細胞およびこれらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により特異的に認識されるペプチドの同時検出および濃縮、ならびに免疫原性試験および他のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞反応性試験のための、ワクチン接種、免疫寛容の誘導、ＴＣＲの遮断およびＭＨＣ媒介毒素送達を含むｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの介入のためのＴ細胞特異的抗原の同定のための方法を提供する。また、本発明は、前記方法において使用するキメラ分子に関する。

【0216】

特には、この方法は、
ａ）実施形態Ｂ１からＢ４のいずれか一項に記載のキメラ分子を含むキメラＤＮＡ構築物を過剰発現する、目的のポリクローナルまたはモノクローナルＴ細胞を提供するステップと、
ｂ）ステップａ）のキメラＤＮＡ構築物を過剰発現するＴ細胞を、ペプチド結合溝を含む主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で培養し、これにより複合体が、ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質のＮ末端に結合しているペプチドとＭＨＣのペプチド結合溝との間に形成されるステップであって、この複合体は、ＴＣＲによる認識の際にＴ細胞の活性化を導く、ステップと、
ｃ）ステップｂ）の共培養において活性化したＴ細胞を、特には、フローサイトメトリーおよびＦＡＣＳにより単離し、活性化マーカー、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ４４もしくはＣＤ２５またはレポータータンパク質、例えば、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＴｏｍａｔｏ、ｄｓＲｅｄ等の発現によってＴ細胞を選別するステップと、
ｄ）ステップｃ）において同定および選別したＴ細胞に存在するＤＮＡ／ＲＮＡを単離するステップと、
ｅ）キメラ共受容体をコードする断片を（ＰＣＲまたはｒｔＰＣＲにより）増幅するステップと、
ｆ）ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質のＮ末端に結合しているペプチドをコードする部分をシーケンシングするステップと
を含む。

【0217】

本発明の種々の特定の実施形態では、ステップｂ）の共培養において活性化したＴ細胞は、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ４４もしくはＣＤ２５のような活性化マーカーおよび／または例えば、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＴｏｍａｔｏ、ｄｓＲｅｄのようなレポータータンパク質、あるいは他の適する活性化マーカーまたはレポータータンパク質の発現による、Ｔ細胞のフローサイトメトリーおよびＦＡＣＳ選別により単離し得る。

【0218】

当技術分野において公知の方法は、多くのエピトープに対する多くのＴＣＲの同時スクリーニングが不可能であるため、並行処理に関して著しく制限されている。目的のＴＣＲは、エピトープライブラリーに対して１つずつスクリーニングしなければならない。逆もまた同様に、目的のエピトープに反応性のＴＣＲを見出すには、エピトープをＴＣＲライブラリーに対して１つずつスクリーニングすることが必要である。

【0219】

本発明では、抗原特異的Ｔ細胞の同時検出および濃縮ならびにＴＣＲおよびこれらの同族エピトープの同定が可能となる方法を初めて提供する。

【0220】

これは、ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質およびこのような共受容体のＮ末端に結合しているペプチドのライブラリーを含むキメラ分子を、目的のＴ細胞において発現させることにより達成する。また、ＴＣＲのライブラリーを過剰発現するＴＣＲ陰性Ｔ細胞株を使用し得る。

【0221】

特には、目的のＴ細胞は、血液、脾臓、リンパ節もしくは腫瘍組織から、または他の適する任意の供給源から単離したＴ細胞であり得る。

【0222】

特には、上記のキメラ分子は、組換え発現ベクターに含まれる。

【0223】

ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質は、特には、完全長ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質である。

【0224】

ペプチドのＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体のＮ末端への繋留は、リンカー分子の使用によりなされ得る。

【0225】

特には、リンカー分子は、約５～３０アミノ酸を含む。

【0226】

適するリンカー分子は、（Ｇ４Ｓ）１、（Ｇ４Ｓ）２、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）５等である。

【0227】

特には、５～２８アミノ酸の範囲のＧＳリンカーを使用し得る。

【0228】

共受容体のＮ末端に結合しているペプチドは、特には、（ｉ）ランダムペプチド、（ｉｉ）所与のｃＤＮＡまたはＤＮＡ分子に由来するペプチド、（ｉｉｉ）断片化ｃＤＮＡまたはＤＮＡ分子によりコードされるペプチドである。

【0229】

断片化ｃＤＮＡまたはＤＮＡ分子は、目的の組織生検、細胞または病原体に由来するｃＤＮＡまたはＤＮＡのランダム剪断または消化により生成し得る。

【0230】

例えば、共受容体のＮ末端に結合しているペプチドは、腫瘍ＤＮＡに存在するＳＮＰを含むＤＮＡ分子または断片化ＤＮＡ分子によりコードされ得る。

【0231】

キメラ構築物において使用し得る他のペプチドは、例えば、制限されないが、
－ 腫瘍にユニークに存在するＴＳＡを同定するために使用するエクソームシーケンシングにより得られるＴＳＡ、
－ 個々の腫瘍由来変異（複数可）を保有する腫瘍特異的ペプチド、例えば、ｐ５３、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦの種々の変異を含む単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）、
－ 免疫応答を生じる抗原、例えば、病原体に由来し得るペプチド、
－ 免疫原性試験を受ける化合物、
－ 天然ペプチド（複数可）の変異型を含む、候補ペプチドのライブラリー
である。

【0232】

特には、候補ペプチドのライブラリーは、ライブラリーが、目的の細胞または病原体に由来するｃＤＮＡまたはＤＮＡのランダム剪断または消化により生成されたペプチドを含む、本明細書に開示の方法において使用し得る。このようなライブラリーは、このような細胞におけるすべてのペプチドを網羅する。

【0233】

ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質および共受容体のＮ末端に結合しているペプチドを含むキメラ分子は、目的のＴ細胞において発現する。

【0234】

特には、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される所望のタンパク質（例えば、ペプチドが繋留されたＣＤ４、Ｌａｇ－３またはＣＤ８）をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結している、（１）遺伝子発現において制御的役割を有する作用物質（複数可）、例えば、プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ならびに（３）適切な転写および翻訳開始および終止配列のアセンブリを含む複製可能なＤＮＡ構築物である組換え発現ベクターを使用し得る。プロモーターおよび他の制御エレメントの選択は、意図するレポーター細胞株に応じて一般に異なる。発現ベクターは、「プラスミド」の形態であることが多く、これは環状の２本鎖ＤＮＡループを指し、そのベクター形態において染色体に結合しない。

【0235】

エピソームとして複製する真核生物発現ベクター、例えば、ｐＣＥＰ４もしくはＢＫＶ、またはレトロウイルス、例えば、ｐＭＹ、ｐＭＸ、ｐＳＩＲ、アデノウイルス、例えば、ｐＡｄ等のようなウイルスに由来する他のベクターを利用し得る。発現ベクターでは、転写または翻訳を調節する制御エレメントは、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に一般に由来し得る。通常、複製起点（例えば、エプスタイン・バーウイルス潜伏ＤＮＡ複製起点）により付与される複製する能力と、形質転換体の認識が容易となる選択遺伝子とをさらに組み込むことができる。真核生物ウイルス由来の制御エレメントを含む発現ベクターは、真核生物発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン・バーウイルスに由来するベクターにおいて典型的に使用する。他の例となる真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥと、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞における発現に有効であるとわかっている他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現が可能となる他の任意のベクターとが挙げられる。

【0236】

「プロモーター」は、核酸の転写を方向づける一連の核酸調節配列として定義する。本明細書において使用する場合、プロモーターは、転写開始部位の付近の必要な核酸配列、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合のＴＡＴＡエレメントを含む。また、プロモーターは、遠位のエンハンサーまたはレプレッサーエレメントを必要に応じて含み、これは、転写開始部位から数千塩基対もの場所に位置してもよい。真核生物宿主細胞における使用のためのプロモーターは、当業者に公知である。このようなプロモーターの例示的な例としては、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えば、ＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、ＡＬＶプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびにヒト遺伝子、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびヒトメタロチオネイン（metalothionein）由来のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。適するプロモーターのさらに他の例としては、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、およびウサギβグロブリンスプライシングアクセプターを含むハイブリッドプロモーター、ならびにポリ（Ａ）配列）が挙げられる。

【0237】

用語「動作可能に連結している」は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、または一連の転写因子結合部位）と第２の核酸配列との間の機能的連結を指し、この場合、発現調節配列により、第２の配列に対応する核酸の転写が方向づけられる。

【0238】

ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質および共受容体のＮ末端に結合するペプチドを含む、本明細書に記載のキメラＤＮＡ分子、特には、発現ベクターに含まれるキメラＤＮＡ分子は、キメラＤＮＡ分子、特には、キメラＤＮＡ分子を含む発現ベクターを、当技術分野において公知の標準技術を使用して宿主細胞に形質導入することにより目的のＴ細胞に導入し得る。適する方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor, NY (1989)に記載されている。形質導入のための偽レトロウイルスを生成するために、レトロウイルスタンパク質ＧＡＧ、ＰＯＬおよびＥＮＶを常に発現するパッケージング細胞株（例えば、Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞株等）に、ＬＴＲ、パッケージングシグナルおよび目的の遺伝子（この場合はＭＨＣ鎖を保有するペプチド）からなるウイルスゲノムを含む構築物を一過性にトランスフェクトする。あるいは、適する細胞株、例えば、ＨＥＫ、３Ｔ３その他に、レトロウイルスタンパク質ＧＡＧ、ＰＯＬおよびＥＮＶを別々にコードするベクターならびにＬＴＲ、パッケージングシグナルおよび目的の遺伝子からなるウイルスゲノムの混合物を一過性にトランスフェクトする。このような一般に使用される戦略では、標的細胞に感染させて目的の遺伝子をこのゲノムＤＮＡに導入することが可能な不完全な偽レトロウイルスの生成が確実となる。しかし、偽レトロウイルスがｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子をこのゲノムに有しないため、感染標的細胞では、レトロウイルスを生成することができない。

【0239】

あるいは、キメラＤＮＡ分子、特には、キメラＤＮＡ分子を含む発現ベクターは、脂質、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマーもしくはＤＥＡＥデキストランに基づく試薬によるトランスフェクションにより、またはエレクトロポレーションにより目的のＴ細胞に導入することができる。

【0240】

本明細書に開示の方法において使用し得るＴ細胞は、例えば、限定されないが、血液、脾臓、リンパ節または腫瘍組織から単離したＴ細胞である。

【0241】

特には、ＣＤ４またはＣＤ８陰性Ｔ細胞ハイブリドーマ、特には、蛍光レポーターを保有するＣＤ４またはＣＤ８陰性Ｔ細胞ハイブリドーマを使用し得る。しかし、ＣＤ４^＋細胞も使用し得るため（図２）、これは必須ではない。

【0242】

Ｔ細胞活性化に適する蛍光レポーターは、例えば、ｎｕｒ７７蛍光レポーター、ＮＦＡＴ蛍光レポーター、または他の適する任意のレポーター分子である。

【0243】

ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質および共受容体タンパク質のＮ末端に結合しているペプチドを含む融合構築物の細胞表面での効率的発現は、ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８特異的抗体染色により決定し得る。抗体は、検出可能な標識に直接コンジュゲートし得る。あるいは、検出可能な標識にコンジュゲートし１次抗体に特異的な２次抗体を細胞と接触させ得る。使用に適する検出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の化合物を含む。本発明において有用な標識は、ビオチン、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、ダンシル、ウンベリフェロン、ＰＥ、ＡＰＣ、ＣＹ５、Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ、Ａｌｅｘａ色素等）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ他）および比色分析標識、例えば、コロイド金または着色したガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）のビーズを含む。適するさまざまな蛍光標識は、例えば、The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes andLabeling Technologies, 11th Editionにさらに記載されている。

【0244】

本明細書に定義するキメラ分子を過剰発現するＴ細胞を自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で培養する場合、ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質のＮ末端に結合しているペプチドを、ＡＰＣの表面に発現するＭＨＣ分子の溝に挿入し、これによりこれらがＴ細胞に提示され得る。

【0245】

ペプチドがＴＣＲにより認識されると、Ｔ細胞は、活性化されて増殖する。

【0246】

したがって、所与のペプチドをコードする本明細書に記載のキメラ分子を含む構築物を（レトロウイルス形質導入またはエレクトロポレーションにより）ポリクローナルＴ細胞にトランスフェクトすると、このペプチドに特異的なＴＣＲを含むＴ細胞の増殖および濃縮が排他的に生じる。

【0247】

形質導入に使用する構築物は、単一のペプチドだけでなくペプチドのライブラリーをもコードし得る。

【0248】

ペプチドのライブラリーをコードする構築物を（レトロウイルス形質導入またはエレクトロポレーションにより）ポリクローナルＴ細胞にトランスフェクトすると、ペプチドを保有するＴ細胞の増殖および濃縮が排他的に生じ、これらは、これらのＴＣＲに特異的に認識される。

【0249】

刺激するペプチドが、ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質のＮ末端に結合し、これによりＴ細胞に含まれるため、十分な時間の後、これらの同族ペプチドを保有するＴ細胞のみが培養物中に残存する。

【0250】

活性化および濃縮されたＴ細胞は、例えば、ＮＦＡＴまたはＮｕｒ７７プロモーターにより駆動する活性化マーカー、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ４４もしくはＣＤ２５および／またはレポータータンパク質、例えば、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＴｏｍａｔｏ、ｄｓＲｅｄあるいはレポータータンパク質の他の適する活性化マーカーの発現によるフローサイトメトリーおよびＦＡＣＳ選別により同定することができる。

【0251】

特には、活性化は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により測定することができる。

【0252】

ＦＡＣＳは、細胞により発現される１つまたは複数の特異的ポリペプチドの存在、非存在、またはレベルに基づいて、細胞の集団を１つまたは複数の亜集団に分別する方法を指す。ＦＡＣＳでは、個々の細胞の蛍光を含む光学特性に依存して、細胞を亜集団に選別する。本明細書に記載する方法の実行に適する細胞選別機は、当技術分野において周知であり、市販されている。例となる細胞選別機としては、ＭｏＦｌｏソーター（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、ＦｏｒｉＣｏｌｌｉｎｓ、Ｃｏｌｏ．）、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（商標）、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ（商標）、ＢＤ（商標）ＬＳＲＩＩおよびＦＡＣＳＣａｉｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）ならびに他の販売元、例えば、Ｓｏｎｙ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、およびＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒにより製造されている他の等価な細胞選別機が挙げられる。

【0253】

あるいは、ＭＨＣによって効率的に提示されるペプチドを含むＴ細胞は、ＭＡＣＳに基づく細胞選別により濃縮し得る。

【0254】

「ＭＡＣＳ」は、細胞により発現される１つまたは複数のＭＡＣＳで選択可能なポリペプチドの存在、非存在、またはレベルに基づいて、細胞の集団を１つまたは複数の亜集団に分別する方法を指す。ＭＡＣＳでは、タグ付けした個々の細胞の磁化率特性に依存して、細胞を亜集団に選別する。ＭＡＣＳでは、磁気ビーズ（例えば、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ；１３０－０４８－４０２から入手可能なもの）を標識として使用することができる。本明細書に記載する方法の実行に適するＭＡＣＳ細胞選別機は、当技術分野において周知であり、市販されている。例となるＭＡＣＳ細胞選別機としては、ａｕｔｏＭＡＣＳ ＰｒｏＳｅｐａｒａｔｏｒ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）が挙げられる。

【0255】

どれほどの数の蛍光標識を使用したかに応じて、選別は、非蛍光細胞の集団および蛍光細胞の少なくとも１つの集団をもたらす。。蛍光細胞を有する少なくとも１つの細胞集団の存在は、少なくとも１つの候補ペプチドがＡＰＣによって効率的に提示されることを示す。したがって、ＦＡＣＳにより、細胞集団を選別して、ＭＨＣによって効率的に提示されるペプチドを含むＴ細胞において濃縮された細胞集団を生成することが可能となる。

【0256】

ＴＣＲおよび対応する同族ペプチドの配列は、このような濃縮Ｔ細胞集団の単一細胞ＲＮＡ／ＤＮＡシーケンシングにより得ることができる。

【0257】

ＤＮＡ単離およびシーケンシングの方法は、当業者に公知である。

【0258】

一般には、細胞の核に存在するＤＮＡを他の細胞成分から分別することが目的である。ＤＮＡの単離は通常、細胞の溶解または分解により開始する。このプロセスは、タンパク質構造の破壊のために必須であり、このプロセスにより核からの核酸の放出が可能となる。溶解は、タンパク質を変性させる界面活性剤もしくはプロテアーゼ（タンパク質を消化する酵素）、例えば、プロテイナーゼＫを、または一部の場合では、両方を含む塩溶液中で実行する。これにより、細胞の分解および膜の溶解が生じる。ＤＮＡ単離の方法は、フェノール：クロロホルム抽出、高塩濃度沈殿、アルカリ変性、イオン交換カラムクロマトグラフィー、樹脂結合、および常磁性ビーズ結合を含むが、これらに限定されない。

【0259】

ｃＤＮＡ生成の方法は、当業者に公知である。一般には、細胞に存在する単離ＲＮＡをＤＮＡに変換、いわゆるＤＮＡのコピーを行って、これをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための鋳型として使用することが目的である。ＲＮＡの単離は通常、細胞の溶解または分解により開始する。このプロセスは、タンパク質構造の破壊のために必須であり、このプロセスにより、それからの核酸の放出が可能となる。溶解は通常、フェノールを含む溶液（例えば、ＴＲＩｚｏｌ（商標））中で実行する。これにより、細胞の分解および膜の溶解が生じ、他の細胞成分からのＲＮＡの分別が可能となる。次いで、単離ＲＮＡは、逆転写酵素（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）、Ｇｏｓｃｒｉｐｔ（商標））によりｃＤＮＡに変換する。

【0260】

次いで、活性化Ｔ細胞により保有される候補ペプチドの配列（抗原提示細胞表面に提示されるＭＨＣ複合体に結合する）は、ＰＣＲにより増幅し、当技術分野において公知の任意の方法によりシーケンシングし得る。

【0261】

候補ペプチドの配列は、デジタルＰＣＲにより決定し得る。デジタルポリメラーゼ連鎖反応（デジタルＰＣＲ、ＤｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ｄＰＣＲまたはｄｅＰＣＲ）は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸の直接的定量およびクローン的増幅のために使用可能な従来のポリメラーゼ連鎖反応方法の改良である。

【0262】

また、シーケンシングは、マイクロ流体工学を使用して実施し得る。マイクロ流体工学は、小容量の流体を取り扱うマイクロスケール装置を含む。マイクロ流体工学は、小流体容量、特には、１μｌ未満の容量を正確かつ再現可能に調節および分注し得るため、マイクロ流体工学を適用すると、顕著なコスト削減がもたらされる。マイクロ流体工学技術の使用により、サイクルタイムが削減され、結果までの時間が短縮され、スループットが増加する。その上、マイクロ流体工学技術を組み込むと、システムの統合および自動化が増強される。マイクロ流体反応は、微小液滴において一般に行われる。

【0263】

また、シーケンシングは、第２世代シーケンシング（または次世代もしくはＮｅｘｔ－Ｇｅｎ）、第３世代（またはＮｅｘｔ－Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎ）または第４世代（またはＮ３－Ｇｅｎ）シーケンシング技術を使用して実施してもよく、パイロシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、単一分子シーケンシング、合成によるシーケンス（ＳＢＳ）、大規模並列クローナル、大規模並列単一分子ＳＢＳ、大規模並列単一分子リアルタイム、大規模並列単一分子リアルタイムナノポア技術を含むが、これらに限定されない。MorozovaおよびMarraは、Genomics, 92: 255 (2008)において、このような一部の技術の総説を提供する。

【0264】

シーケンシングの前、後または同時に、核酸を増幅し得る。核酸増幅技術の例示的な非限定的例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、転写増幅法（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、特定の増幅技術（例えば、ＰＣＲ）では、増幅前にＲＮＡがＤＮＡに逆転写されることが必要とされるが（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）、他の増幅技術では、ＲＮＡを直接増幅する（例えば、ＴＭＡおよびＮＡＳＢＡ）ことを認識する。

【0265】

本明細書に記載の方法において同定および濃縮されるペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでの介入、例えば、免疫原性試験および他のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞反応性試験のための、ワクチン接種、免疫寛容の誘導、ＴＣＲの遮断およびＭＨＣ媒介毒素送達において使用し得る。

【0266】

一実施形態では、ワクチンは、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）に基づくがんワクチンである。

【0267】

用語「ワクチン接種」または等価物は、当技術分野において十分に理解されている。例えば、用語ワクチン接種は、被験体の抗原に対する免疫反応、およびこれにより疾患に抵抗または克服する能力が向上するプロセスであると理解され得る。「ワクチン」は、疾患（例えば、がん）の予防および／または処置のための免疫を生成するための組成物を意味するものとして理解されるべきである。したがって、ワクチンは、抗原を含む医薬であり、ワクチン接種により特異的防御および保護物質を生成するために、ヒトまたは動物において使用することを意図する。用語「ＴＳＡに基づくがんワクチン」は、腫瘍特異的抗原、例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはこれよりも多い腫瘍特異的ペプチドのプールした試料を含むワクチンを指すことを意味する。

【0268】

再発性腫瘍由来変異は、広範な患者コホートに適用可能なＴＳＡに基づくがんワクチンの開発が可能となり得る、公有（ｐｕｂｌｉｃ）の腫瘍特異的抗原として作用する。したがって、本発明の方法は、患者が、このような一般／公有ＴＳＡを免疫系に効率的に提示し、効率的な免疫応答を潜在的に生じることを同定するために使用することができる。しかし、多くの腫瘍由来変異は、患者特異的な変化に由来すると思われる。したがって、本発明の方法はまた、個別化ワクチンのための患者特異的候補ペプチドを同定するために使用することができる。

【0269】

本明細書において使用する場合、「免疫寛容」は、１つまたは複数の特異的抗原に対する宿主の免疫反応性における低減を指す。抗原は、寛容がない場合に望まない免疫応答を生じる免疫決定因子を含む。免疫寛容により、移植拒絶反応、自己免疫、アレルギー反応、または別の望ましくない免疫応答を予防または回復させるよう誘導することができる。

【0270】

「ＴＣＲの遮断」は、天然のＴＣＲ－ＭＨＣ相互作用を遮断する、ペプチド－ＭＨＣ複合体またはｐ－ＭＨＣ特異的抗体を含む、任意の作用物質を指す。「ＭＨＣ媒介毒素送達」は、毒物（タンパク質その他）をペプチド－ＭＨＣ４量体または他のＭＨＣ多量体に共有結合させることにより、前記毒素を細胞に送達して細胞死を生じる方法を指す。

【0271】

用語「免疫原性試験」は、本明細書において使用する場合、バイオ医薬に対する潜在的免疫応答の測定を指す。バイオ医薬により、これらの安全性および有効性に影響し得る免疫応答を誘発することができる。免疫原性試験は、臨床および前臨床試験の間に液性（抗体）または細胞性（Ｔ細胞）応答を監視および評価するために利用する。通常、バイオ医薬の免疫原性を試験することは、バイオ医薬に対して特異的に生成された抗体の測定を含む。本発明の方法により、ＭＨＣ分子によって効率的に提示され、Ｔ細胞に認識されて免疫応答を潜在的に誘発し得るペプチドを同定することが可能となる。これは、化合物の全体的免疫原性プロファイルの全容を提示するのに役立ち得る。

【0272】

用語「Ｔ細胞反応性」は、本明細書において使用する場合、Ｔ細胞活性化を誘発する物質の能力を指す。より詳細には、「Ｔ細胞反応性」は、Ｔ細胞の増殖またはサイトカイン産生を誘導するペプチドの能力を意味する。

【0273】

また、本発明の方法は、高スループットスクリーニングに適用し得る。高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）技術は、細胞の迅速な処理を大規模に定義するために一般に使用される。ある特定の実施形態では、複数のスクリーニングは、種々の候補ペプチドライブラリーと並行して実行し得る。高スループットスクリーニング系は、市販されており、すべての試料および試薬のピペット操作、液体分注、指定時間のインキューベーション、およびアッセイに適切な検出器（複数可）におけるマイクロプレートの最終的読取りを含む全手順が典型的に自動化されている。このような設定可能な系では、高スループットで迅速な起動ならびに高度な可撓性およびカスタマイズがもたらされる。

【0274】

用語「ペプチド」は、本明細書において使用する場合、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味する。一般には、共受容体のＮ末端に結合しているペプチドは、７アミノ酸～３０アミノ酸またはこれよりも多く、特には、１５～２４アミノ酸の長さ、特には、７～１０アミノ酸の長さで異なり得る。

【0275】

用語「抗原」は、本明細書において使用する場合、それ自体またはその部分に対する免疫応答を誘発可能なペプチドまたはタンパク質のすべてまたは部分を指す。この免疫応答は、抗体産生もしくは特異的免疫適格細胞の活性化のいずれかまたは両方を含み得る。

【0276】

用語「ライブラリー」または等価物は、本明細書において使用する場合、複数の分子を意味する。ＣＤ４、ＬＡＧ－３またはＣＤ８共受容体タンパク質に結合しているペプチドの場合、ライブラリーにより、所望の応答を示す１つまたは複数の細胞をもたらすのに確率的に十分な範囲の細胞応答をもたらすのに十分に構造的に多様なペプチドの集団がもたらされる。好ましい実施形態では、少なくとも７個、好ましくは少なくとも５０個、より好ましくは少なくとも２００個、および最も好ましくは少なくとも１０００個のペプチドを、本発明の方法において同時に解析する。ライブラリーは、ライブラリーサイズおよび多様性を最大化するようにデザインすることができる。

【0277】

用語「組換え」は、例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用する場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、または天然核酸もしくはタンパク質の変化により修飾されているか、あるいは細胞が、このように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）細胞型に見出されない遺伝子を発現するか、またはさもなければ異常に発現するか、低発現するか、もしくは全く発現しない天然遺伝子を発現する。組換え核酸は、本来、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、一般に、例えば、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用した核酸の操作により、通常、天然には見出されない形態で形成される。この方法では、種々の配列の動作可能な連結が達成される。したがって、直鎖形態の単離核酸、または通常結合しないＤＮＡ分子のライゲーションによりｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された発現ベクターはともに、本発明の目的のための組換えであると考えられる。組換え核酸を生成して宿主細胞または生物に再導入すると、非組換え的に、すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの操作ではなくｉｎ ｖｉｖｏでの宿主細胞の細胞機構を使用して複製するが、一度組換え的に生成したが、その後、非組み換え的に複製した核酸もまた、本発明の目的のための組換えであると考えられることが理解される。同様に、組換えタンパク質、例えば、本発明のＭＨＣ－ペプチド複合体は、組換え技術を使用して、すなわち、上に示すような組換え核酸の発現により生成されたタンパク質である。

【0278】

用語「異種」は、核酸の部分に関して使用する場合、核酸が、同一の相互関係において通常、天然に見出されない２つまたはこれよりも多い部分配列を含むことを示す。例えば、２つまたはこれよりも多い配列を有し、例えば、新たな機能性核酸を生成するように配列した非関連の遺伝子由来の核酸、例えば、ある供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域は、典型的には、組換え的に生成する。同様に、異種タンパク質は、同一の相互関係において天然に見出されない２つまたはこれよりも多い部分配列を指すことが多い（例えば、融合タンパク質）。

【0279】

用語「がん」は、本明細書において使用する場合、急速かつ制御されない異常細胞の増殖により特徴づけられる疾患として定義する。がん細胞は、局所的に、または血流およびリンパ系を通して身体の他の部分に広がり得る。種々のがんの例としては、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0280】

その上、特許請求の範囲では、単語「含む」は、他の要素またはステップを除外せず、不定冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明白に他に指示しない限り、複数の参照対象を含む。

【0281】

他に定義しない限り、本明細書において使用する、すべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載するものと類似または等価な方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、適する方法および材料は、以下に記載する。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。加えて、材料、方法および実施例は、単なる例示であり、制限することは意図していない。

【0282】

本発明の特定の実施形態は、以下の実施例によってさらに例示する。しかし、本発明が、このような実施例の具体的詳細に制限されないことが理解されるべきである。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例において開示する技術は、本発明の実施において十分に機能させるために本発明において使用される技術を代表し、このため、この実施に好ましい方法を構成すると考えることができることが当業者により理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、開示する特定の実施形態において多くの変更が成され、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果をさらに得ることができることを理解すべきである。

【0283】

以下に提供する図は、キメラ受容体の構造を例示し、マウスにおける概念実証を提供する。本発明による方法および本明細書に記載の方法では、不偏かつ効率的方法により、Ｔ細胞の天然エピトープを同定する。これは、基礎研究および臨床適用のために有望であり、患者におけるＴ細胞抗原の多次元的で高スループットの個別化した同定が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0284】

【図1】図１は、ＰＥＰ４の概念実証を示す図である。ａ）キメラＰＥＰ４受容体の構造、およびＴＣＲによるペプチド－ＭＨＣ複合体の認識を生じる、ＭＨＣとのこの相互作用の模式図を示す。ｂ）ｎｕｒ７７蛍光レポーターを保有するＣＤ４陰性Ｔ細胞ハイブリドーマは、Ｓｍａｒｔａ２Ｔ細胞（ｇｐ６１特異的）または２Ｄ２Ｔ細胞（ＮＦＭ特異的）に由来し、ｇｐ６１ペプチドを保有する、ＧＦＰおよびＰＥＰ４をコードする構築物（ＰＥＰ４ｇｐ６１ｉｒｅｓＧＦＰ）を形質導入した。ＰＥＰ４ｇｐ６１は、ドットプロットに示すＣＤ４特異的抗体染色により測定すると、細胞表面で効率的に発現した。ｃ、ｄ）Ｓｍａｒｔａ２ハイブリドーマに、１２～２８アミノ酸の範囲のＧＳリンカーによりＣＤ４またはＣＤ３に結合しているｇｐ６１を形質導入し、Ｃ５７ＢＬ／６（ｃ、ｄ）またはＢＡＬＢ／ｃ（ｄ）由来のＢＭＤＣとともに培養した。ｅ）Ｓｍａｒｔａ２および２Ｄ２ハイブリドーマに、ｇｐ６１、ＯＶＡまたはＮＦＭペプチドおよびＧＦＰを保有するＰＥＰ４受容体をコードする構築物を形質導入し、Ｃ５７ＢＬ／６由来のＢＭＤＣとともに培養した。ｃ、ｄ、ｅ）活性化（ｎｕｒ７７レポーターシグナル）をＦＡＣＳにより測定した。ペプチドは、特異的かつＭＨＣに限定された様式で認識され、ＣＤ４に結合しているが、ＣＤ３には結合していないペプチドのみが、ＭＨＣによって効率的に提示された。ｆ）ＣＤ４＋Ｓｍａｒｔａ２またはＢ６Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８により２４時間刺激し、ＰＥＰ４ｇｐ６１ｉｒｅｓＧＦＰを形質導入し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８を取り除いて、感染後４８時間にＢ６ＢＭＤＣと数日間共培養した。グラフは、形質導入効率に対して正規化したＧＦＰ陽性（ＰＥＰ４ｇｐ６１を発現する）細胞の割合を示す。共培養の２日目は、形質導入後４日目に対応する。ポリクローナルＢ６Ｔ細胞ではなく、ＰＥＰ４ｇｐ６１を保有するＳｍａｒｔａ２Ｔ細胞は、培養物中で漸進的に濃縮されたが、対照ペプチドｉｎｖＮＦＭを形質導入した細胞においては当てはまらなかった。

【0285】

【図2】図２は、ＣＤ４陽性細胞の概念実証を示す図である。ＣＤ４＋Ｓｍ２ハイブリドーマ細胞にｐＭＹ－ＣＤ４ｇｐ６１ｉｒｅｓＧＦＰまたはｐＭＹ－ＣＤ４ＯＶＡｉｒｅｓＧＦＰを感染させた。２日後、細胞をＢ６ ＢＭＤＣと９時間共培養した（ｎ＝４ウェル）。抗ＴＣＲ、抗ＣＤ４および抗ＣＤ６９抗体による染色後、Ｓｍ２ハイブリドーマ細胞の活性化を、ＦＡＣＳ解析によるＣＤ６９発現の決定により測定した。Ａ）のドットプロットは、形質導入細胞におけるＴＣＲ、ＣＤ４およびＧＦＰ発現を示し、Ｂ）のヒストグラムは、ＰＥＰ４－ｇｐ６１もしくはＰＥＰ４－ＯＶＡを保有するＴＣＲ＋ＣＤ４＋ＧＦＰ＋細胞またはｇｐ６１形質導入によるＴＣＲ＋ＣＤ４＋ＧＦＰ－細胞でのＣＤ６９発現を示し、Ｃ）は、ＣＤ６９発現（ＭＦＩ）の要約を示す。Ｔ検定の結果を示し、＊＊＝０．００１９、＊＊＊＊＜０．０００１である。

【実施例】

【0286】

（実施例１）
材料および方法
細胞
ＣＤ４^＋Ｔ細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｓｍａｒｔａおよび２Ｄ２マウスからＦＡＣＳにより単離した。

【0287】

フローサイトメトリー
次の抗体：Ｆｃ遮断（抗ＣＤ１６／ＣＤ３２；２．４Ｇ２；所内で作製）；ＣＤ４－ＡＰＣ（ＧＫ１．５）、ＣＤ４－ＰＥ（ＧＫ１．５）を使用した。細胞をＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩまたはＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で解析し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）により解析した。

【0288】

ハイブリドーマ生成
選別したＴ細胞を、プラスチック結合抗ＣＤ３εおよび抗ＣＤ２８抗体によってマウスＩＬ－２の存在下で２～３日間活性化した。同数の活性化Ｔ細胞およびＴＣＲα^－β^－ＢＷ５１４７融合パートナーを、ＰＥＧ－１５００を使用して融合し、限界希釈において１００ｍＭのヒポキサンチン、４００ｎＭのアミノプテリン、および１６ｍＭのチミジンの存在下（ＨＡＴ）に播種した。

【0289】

ＰＥＰ４およびＰＥＰ３構築物のクローニング
ｇｐ６１またはＮＦＭペプチドをコードするＤＮＡ断片を、リーダーペプチドと完全長ＣＤ４またはＣＤ３分子の残りに接続しているＧＳリンカー（１２～２８アミノ酸の範囲）との間に挿入し、ｐＭＹｓｉｒｅｓＧＦＰレトロウイルスベクターにクローニングした。

【0290】

レポーター細胞株および選別した胸腺細胞のレトロウイルス形質導入
レトロウイルスを含む上清を、エコトロピックＰｈｏｅｎｉｘパッケージング細胞株において生成し、レポーター細胞株および抗ＣＤ３／ＣＤ２８により２４時間活性化した選別細胞の感染に使用した。ｎｕｒ７７レポーターおよびＰＥＰ４構築物による形質導入には、ハイブリドーマのＣＤ４^－バリアントを選択した。

【0291】

ＰＥＰ４^＋およびＰＥＰ３^＋ハイブリドーマの骨髄由来樹状細胞による刺激
ＧＦＰ＋細胞は、＞３倍過剰の骨髄由来樹状細胞と８～１２時間共培養し、レポーター活性化をＦＡＣＳにより測定した。

【0292】

結果は、図に示す。すなわち、概念実証をＰＥＰ４に基づいて示す。詳細には、キメラＰＥＰ４受容体の構造、およびＴＣＲによるペプチド－ＭＨＣ複合体の認識を生じる、ＭＨＣとのこの相互作用の模式図をパートａ）に示す。図のパートｂ）からわかるように、ｎｕｒ７７蛍光レポーターを保有するＣＤ４陰性Ｔ細胞ハイブリドーマは、Ｓｍａｒｔａ２Ｔ細胞（ｇｐ６１特異的）または２Ｄ２Ｔ細胞（ＮＦＭ特異的）に由来し、ｇｐ６１ペプチドを保有する、ＧＦＰおよびＰＥＰ４をコードする構築物（ＰＥＰ４ｇｐ６１ｉｒｅｓＧＦＰ）を形質導入した。ＰＥＰ４ｇｐ６１は、ドットプロットに示すＣＤ４特異的抗体染色により測定すると、細胞表面で効率的に発現した。Ｓｍａｒｔａ２ハイブリドーマに、１２～２８アミノ酸の範囲のＧＳリンカーによりＣＤ４またはＣＤ３に連結しているｇｐ６１を形質導入し、Ｃ５７ＢＬ／６（ｃ、ｄ）またはＢＡＬ Ｂ／ｃ（ｄ）由来のＢＭＤＣとともに培養した。Ｓｍａｒｔａ２および２Ｄ２ハイブリドーマに、ｇｐ６１、ＯＶＡまたはＮＦＭペプチドおよびＧＦＰを保有するＰＥＰ４受容体をコードする構築物を形質導入し、Ｃ５７ＢＬ／６由来のＢＭＤＣとともに培養した。ｃ、ｄ、ｅ）活性化（ｎｕｒ７７レポーターシグナル）をＦＡＣＳにより測定した。

【0293】

明らかなように、ペプチドは、特異的かつＭＨＣに限定された様式により認識され、ＣＤ４に結合しているが、ＣＤ３には結合していないペプチドのみが、ＭＨＣによって効率的に提示され得た。その上、ＣＤ４＋Ｓｍａｒｔａ２またはＢ６Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８により２４時間刺激し、ＰＥＰ４ｇｐ６１ｉｒｅｓＧＦＰを形質導入し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８を取り除いて、感染後４８時間にＢ６ＢＭＤＣと数日間共培養した（パートｆ）。グラフは、形質導入効率に対して正規化したＧＦＰ陽性（ＰＥＰ４ｇｐ６１を発現する）細胞の割合を示す。共培養の２日目は、形質導入後４日目に対応する。ポリクローナルＢ６Ｔ細胞ではなく、ＰＥＰ４ｇｐ６１を保有するＳｍａｒｔａ２Ｔ細胞は、培養物中で漸進的に濃縮されたが、対照ペプチドｉｎｖＮＦＭを形質導入した細胞においては当てはまらなかった。したがって、ＣＤ４、ＬＡＧ３またはＣＤ８共受容体および共受容体のＮ末端に結合しているペプチドを含むキメラ分子が、特許請求されるように、Ｔ細胞特異的抗原の同定に利用可能であることが、驚くべきかつ予想外なことに示された。

【図1】

【図2】

【配列表】

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【国際調査報告】