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特表2022-505272がん治療のためのトポイソメラーゼＩＩ触媒阻害剤化合物による治療、方法、及び使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-14
(54)【発明の名称】がん治療のためのトポイソメラーゼＩＩ触媒阻害剤化合物による治療、方法、及び使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/44 20060101AFI20220106BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220106BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220106BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/4439 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/167 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/55 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/496 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/444 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/428 20060101ALI20220106BHJP
【ＦＩ】
A61K31/44
A61P43/00 111
A61P35/00
A61P35/02
A61K31/4439
A61K31/167
A61K31/55
A61K31/496
A61K31/444
A61K31/428
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021521237
(86)(22)【出願日】2019-08-30
(85)【翻訳文提出日】2021-06-11
(86)【国際出願番号】 CA2019051209
(87)【国際公開番号】W WO2020077437
(87)【国際公開日】2020-04-23
(31)【優先権主張番号】62/747,821
(32)【優先日】2018-10-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】300066874
【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア
(74)【代理人】
【識別番号】100109634
【弁理士】
【氏名又は名称】舛谷 威志
(74)【代理人】
【識別番号】100129263
【弁理士】
【氏名又は名称】中尾 洋之
(72)【発明者】
【氏名】チェルカソフ，アルチョーム
(72)【発明者】
【氏名】アルペルスタイン，ザッカリー
(72)【発明者】
【氏名】ドン，シュエセン
(72)【発明者】
【氏名】シェ，ニン
【テーマコード（参考）】
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC17
4C086BC31
4C086BC50
4C086BC84
4C086CB29
4C086GA02
4C086GA08
4C086GA10
4C086GA12
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZB27
4C086ZC20
4C206AA01
4C206AA02
4C206GA07
4C206GA31
4C206KA01
4C206MA01
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZB26
4C206ZB27
4C206ZC20
(57)【要約】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
トポイソメラーゼＩＩを阻害する方法であって、下記式ＩＩの構造を有する化合物を投与することを含む、方法。
Ａ２はＳ及びＯから選択され、
Ｄ２はＮ及びＣＨから選択され、
Ｍ３はＨであり、
ＱはＣ及びＮから選択され、
Ｔ１はＨ、
ＱがＮである場合にはＴ２が存在せず、又はＱがＣである場合にはＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ，
Ｚ１はＨ、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）ＣＨ３、
Ｚ２はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）ＣＨ３、
Ｚ３はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）ＣＨ３、
ＬはＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＣＦ３から選択され、
Ｇ１はＯ、Ｓ、ＣＨ２、及びＮＨから選択され、
Ｇ２はＯ、Ｓ、ＣＨ２、及びＮＨから選択され、
Ｇ３はＯ、Ｓ、ＣＨ２、及びＮＨから選択され、
Ｒａ及びＲｂはＨであり、
Ｒ１はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、
Ｒ２はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、
Ｒ３はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、
Ｒ６はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、
Ｒ７はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、
【請求項2】
トポイソメラーゼＩＩを阻害する方法であって、下記式ＩＩＩの構造を有する化合物を投与することを含む、方法。
Ａ３はＳＨ、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、
Ｄ３はＮ及びＣから選択され、
あるいは、Ｄ３がＣである場合にはＡ３はＨ又はＳＣＨ３であり、
Ｍ４は存在しないか、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒから選択され、
Ｍ５はＨ、ＣＨ３、Ｃｌ、Ｆ、及びＢｒから選択され、
ＱはＣ及びＮから選択され、
Ｔ１はＨ、
ＱがＮである場合にはＴ２が存在せず、又はＱがＣである場合にはＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ，
Ｚ１はＨ、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）ＣＨ３、
Ｚ２はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）ＣＨ３、
Ｚ３はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）ＣＨ３、
ＬはＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＣＦ３から選択され、
Ｇ１はＯ、Ｓ、ＣＨ２、及びＮＨから選択され、
Ｒａ及びＲｂはＨであり、
Ｒ１はＯＣＨ３、及びＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３から選択され、
Ｒ６はＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、
Ｒ７はＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、
ＪはＨ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＣＦ３から選択され、
Ｅ１はＯ、Ｓ、ＣＨ２、及びＮＨから選択され、かつ
Ｅ２はＯ、Ｓ、ＣＨ２、及びＮＨから選択される。
【請求項3】
トポイソメラーゼＩＩの阻害は触媒阻害である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
トポイソメラーゼＩＩの阻害はがんの治療のための阻害である請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記がんは、子宮頸がん、小細胞肺がん、精巣腫瘍、癌腫、神経芽腫、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、食道がん、胃がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、軟骨肉腫、中枢神経系腫瘍、肝がん、及び前立腺がんから選択される１以上のがんである請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記前立腺がんは、神経内分泌前立腺がん（ＮＥＰＣ）、前立腺腺がん、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）、アンドロゲン受容体経路阻害剤（ＡＲＰＩ）抵抗性前立腺がん、エンザルタミド（ＥＮＺ）抵抗性（ＥＮＺＲ）、及びアビラテロン（Ａｂｉ）抵抗性（ＡＢＩＲ）から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項7】
【請求項8】
式ＩＩ又はＩＩＩの前記化合物は、タキソール及び／又はトポイソメラーゼポイズンと組み合わせて投与されるか、及び／又は前立腺がんの治療のためのアンドロゲン受容体（ＡＲ）療法と併用して投与される請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
式ＩＩ又はＩＩＩの化合物、及び薬学的に許容される担体を含有する、がん治療用医薬組成物。
【請求項10】
前記がんは、子宮頸がん、小細胞肺がん、精巣腫瘍、癌腫、神経芽腫、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、食道がん、胃がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、軟骨肉腫、中枢神経系腫瘍、肝がん、及び前立腺がんから選択される１以上のがんである請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
式ＩＩ又はＩＩＩの化合物の、がん治療のための使用。
【請求項12】
がん治療用医薬の製造における式ＩＩ又はＩＩＩの化合物の使用。
【請求項13】
前記がんは、子宮頸がん、小細胞肺がん、精巣腫瘍、癌腫、神経芽腫、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、食道がん、胃がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、軟骨肉腫、中枢神経系腫瘍、肝がん、及び前立腺がんから選択される１以上のがんである請求項１１又は１２に記載の使用。
【請求項14】
（ａ）式ＩＩ又はＩＩＩのうちいずれか１つの化合物及び薬学的に許容される担体と、（ｂ）がんの治療のためのその使用のための添付文書とを含む商用パッケージ。
【請求項15】
（ａ）式ＩＩ又はＩＩＩのうちいずれか１つの化合物及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物と、（ｂ）がんの治療のためのその使用のための添付文書とを含む商用パッケージ。
【請求項16】
前記がんは、子宮頸がん、小細胞肺がん、精巣腫瘍、癌腫、神経芽腫、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、食道がん、胃がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、軟骨肉腫、中枢神経系腫瘍、肝がん、及び前立腺がんから選択される１以上のがんである請求項１４又は１５に記載の商用パッケージ。
【請求項17】
【請求項18】
トポイソメラーゼＩＩの阻害は触媒阻害である請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
トポイソメラーゼＩＩの阻害はがんの治療のための阻害である請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項20】
前記がんは、子宮頸がん、小細胞肺がん、精巣腫瘍、癌腫、神経芽腫、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、食道がん、胃がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、軟骨肉腫、中枢神経系腫瘍、肝がん、及び前立腺がんから選択される１以上のがんである請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記前立腺がんは、神経内分泌前立腺がん（ＮＥＰＣ）、前立腺腺がん、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）、アンドロゲン受容体経路阻害剤（ＡＲＰＩ）抵抗性前立腺がん、エンザルタミド（ＥＮＺ）抵抗性（ＥＮＺＲ）、及びアビラテロン（Ａｂｉ）抵抗性（ＡＢＩＲ）から選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記化合物は、タキソール及び／又はトポイソメラーゼポイズンと組み合わせて投与されるか、及び／又は前立腺がんの治療のためのアンドロゲン受容体（ＡＲ）療法と併用して投与される請求項１７～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
がんの治療において使用するための化合物であって、該化合物は以下の化合物から選択される１以上である、化合物。
【請求項24】
がんの治療はトポイソメラーゼＩＩの阻害によるものである請求項２３に記載の化合物。
【請求項25】
がんの治療はトポイソメラーゼＩＩの触媒阻害である請求項２３又は２４に記載の化合物。
【請求項26】
前記がんは、子宮頸がん、小細胞肺がん、精巣腫瘍、癌腫、神経芽腫、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、食道がん、胃がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、軟骨肉腫、中枢神経系腫瘍、肝がん、及び前立腺がんから選択される１以上のがんである請求項２３、２４又は２５に記載の化合物。
【請求項27】
前記前立腺がんは、神経内分泌前立腺がん（ＮＥＰＣ）、前立腺腺がん、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）、アンドロゲン受容体経路阻害剤（ＡＲＰＩ）抵抗性前立腺がん、エンザルタミド（ＥＮＺ）抵抗性（ＥＮＺＲ）、及びアビラテロン（Ａｂｉ）抵抗性（ＡＢＩＲ）から選択される請求項２６に記載の化合物。
【請求項28】
前記化合物は、タキソール及び／又はトポイソメラーゼポイズンと組み合わせて投与されるか、及び／又は前立腺がんの治療のためのアンドロゲン受容体（ＡＲ）療法と併用して使用される請求項２３～２７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項29】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本願は２０１８年１０月１９日に出願された「がん治療のためのトポイソメラーゼＩＩ触媒阻害剤化合物による治療、それに関連する方法及び使用」というタイトルの米国仮出願第６２／７４７，８２１号に基づく利益を主張する。
［技術分野］
本願は２０１８年１０月１９日に出願された「がん治療のためのトポイソメラーゼＩＩ触媒阻害剤化合物による治療、それに関連する方法及び使用」というタイトルの米国仮出願第６２／７４７，８２１号に基づく利益を主張する。
［技術分野］
【0002】
本発明はトポイソメラーゼＩＩ阻害剤の分野に関する。特に、本発明はがんの治療において使用するためのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤化合物に関する。
【背景技術】
【0003】
細胞分裂している間、ＤＮＡは１分あたり２キロベースという平均速度で素早く複製される必要があり、そのため超らせん二次構造は非常に不利である、といった厳しい制限がＤＮＡトポロジーに課せられる１。トポイソメラーゼは、ＤＮＡを更に操作するためにＤＮＡの超らせん構造を弛緩するのに重要な役割を果たす。特に、ヒトトポイソメラーゼＩＩαは正のＤＮＡ超らせんを負の超らせんよりも１０倍速く取り外し（すなわち、弛緩し）、ＤＮＡ複製に関与する。一方、トポイソメラーゼＩＩβはＤＮＡ複製において何らかの役割を果たしているとは考えられておらず、正と負の超らせんねじれを同じ速度で弛緩する２０。
【0004】
トポイソメラーゼＩＩ（ＴｏｐｏＩＩ）は周知のがん治療標的であって、トポイソメラーゼ阻害剤はヒト悪性腫瘍の治療のために現在使用されているもっとも重要な化学療法剤である。例えば、エトポシドは１９７１年にクリニックに導入され、多種多様な固形腫瘍及び血液学的腫瘍に対する化学療法用化合物として今も最も使用され続けている化合物の一つである。しかしながら、エトポシドの毒性は、急速に分裂する細胞を標的とする際に有効なだけでなく、望まれていない標的外の（オフターゲットの）活性に対しても作用を及ぼす。エトポシドは毒物として知られるトポイソメラーゼ阻害剤のクラスの一員である。毒はＴｏｐｏＩＩ－ＤＮＡ複合体に結合することにより二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の切断を安定化し、細胞死へといざなう。残念なことに、毒は標的外への重篤な副作用にも関与し、場合によっては二次性白血病を引き起こすことすらある２。トポイソメラーゼＩＩ阻害剤には触媒阻害剤として知られている別のクラスもある。触媒阻害剤は二本鎖ＤＮＡの切断を安定化しないため、高く評価されている。トポイソメラーゼＩＩ触媒阻害剤はトポイソメラーゼＩＩのＮ末端ＡＴＰａｓｅドメインを標的とし、ＤＮＡ－ｔｏｐｏＩＩクリーバブル複合体を安定化することなくトポイソメラーゼＩＩ媒介ＤＮＡ切断を抑制する。いくつかのトポイソメラーゼＩＩ触媒阻害剤（すなわちデクスラゾキサン（ＩＣＲＦ）、ソブゾキサン（ＭＳＴ－１６）、及びメルバロン）が知られている。残念なことに、これまでのところ、治験が完了した触媒阻害剤はクリニックには十分行き渡っていない３。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、本明細書に記載の化合物がトポイソメラーゼＩＩ触媒活性を調整するという驚くべき発見に部分的に基づく。具体的には、本明細書で特定される化合物の中にはがん細胞におけるトポイソメラーゼＩＩ触媒活性をも阻害するものがある。例えば、がん細胞は、子宮頸がん、小細胞肺がん、精巣腫瘍、癌腫、神経芽腫、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、食道がん、胃がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、軟骨肉腫、中枢神経系腫瘍、肝がん、及び前立腺がんのうち１以上のがんから選択される細胞であってもよい。
【0006】
一実施形態によれば、トポイソメラーゼＩＩを阻害する方法であって、式ＩＩの構造を有する化合物を投与することを含む方法が提供される。
式中、Ａ２はＳ及びＯから選択されてもよく、Ｄ２はＮ及びＣＨから選択されてもよく、Ｍ３はＨであってもよく、ＱはＣ及びＮから選択されてもよく、Ｔ１はＨ、
から選択されてもよく、ＱがＮである場合、Ｔ２は存在しなくてもよく、又はＱがＣである場合、Ｔ２はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、
から選択されてもよいが、但しＴ１、及びＴ２の両方がＨであることはなく、Ｚ１はＨ、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）ＣＨ３、
Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＣＦ３から選択されてもよく、Ｚ２はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）ＣＨ３、
Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＣＦ３から選択されてもよく、Ｚ３はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）ＣＨ３、
Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＣＦ３から選択されてもよく、ＬはＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＣＦ３から選択されてもよく、Ｇ１はＯ、Ｓ、ＣＨ２、及びＮＨから選択されてもよく、Ｇ２はＯ、Ｓ、ＣＨ２、及びＮＨから選択されてもよく、Ｇ３はＯ、Ｓ、ＣＨ２、及びＮＨから選択されてもよく、Ｒａ及びＲｂはＨであってもよく、Ｒ１はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、
Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＣＦ３から独立に選択されてもよく、Ｒ２はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、
Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＣＦ３から独立に選択されてもよく、Ｒ３はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、
Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＣＦ３から独立に選択されてもよく、Ｒ６はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、
Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＣＦ３から選択されてもよく、かつＲ７はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、
Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＣＦ３から選択されてもよい。
【0007】
別の実施形態によれば、トポイソメラーゼＩＩを阻害する方法であって、下記式ＩＩＩの構造を有する化合物を投与することを含む方法が提供される。
式中、Ａ３はＳＨ、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択されてもよく、Ｄ３はＮ及びＣから選択されてもよいが、Ｄ３がＣである場合にはＡ３はＨ又はＳＣＨ３であってもよく、Ｍ４は存在しないか、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒから選択されてもよく、Ｍ５はＨ、ＣＨ３、Ｃｌ、Ｆ、及びＢｒから選択されてもよく、ＱはＣ及びＮから選択されてもよく、Ｔ１はＨ、
から選択されてもよく、ＱがＮである場合、Ｔ２は存在しなくてもよく、又はＱがＣである場合、Ｔ２はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ，
から選択されてもよいが、但しＴ１、及びＴ２の両方がＨであることはなく、Ｚ１はＨ、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）ＣＨ３、
Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＣＦ３から選択されてもよく、Ｚ２はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）ＣＨ３、
Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＣＦ３から選択されてもよく、Ｚ３はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣ（ＣＨ３）（ＣＨ３）ＣＨ３、
Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＣＦ３から選択されてもよく、ＬはＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＣＦ３から選択されてもよく、Ｇ１はＯ、Ｓ、ＣＨ２、及びＮＨから選択されてもよく、Ｒａ及びＲｂはＨであってもよく、Ｒ１はＯＣＨ３、及びＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３から選択されてもよく、Ｒ６はＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、
及びＣＦ３から選択されてもよく、Ｒ７はＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、
及びＣＦ３から選択されてもよく、ＪはＨ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＣＦ３から選択されてもよく、Ｅ１はＯ、Ｓ、ＣＨ２、及びＮＨから選択されてもよく、かつＥ２はＯ、Ｓ、ＣＨ２、及びＮＨから選択されてもよい。
【0008】
トポイソメラーゼＩＩの阻害は触媒阻害であってもよい。トポイソメラーゼＩＩの阻害はがんの治療のための阻害であってもよい。上記がんは、子宮頸がん、小細胞肺がん、精巣腫瘍、癌腫、神経芽腫、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、食道がん、胃がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、軟骨肉腫、中枢神経系腫瘍、肝がん、及び前立腺がんのうち１以上のがんから選択されてもよい。上記前立腺がんは神経内分泌前立腺がん（ＮＥＰＣ）、前立腺腺がん、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）、アンドロゲン受容体経路阻害剤（ＡＲＰＩ）抵抗性前立腺がん、エンザルタミド（ＥＮＺ）抵抗性（ＥＮＺＲ）、及びアビラテロン（Ａｂｉ）抵抗性（ＡＢＩＲ）から選択されてもよい。上記化合物は以下の化合物のうち１以上から選択されてもよい。
【0009】
式ＩＩ又はＩＩＩの化合物はタキソール及び／又はトポイソメラーゼポイズンと組み合わせて投与されるか、及び／又は前立腺がんの治療のためのアンドロゲン受容体（ＡＲ）療法と併用して投与されてもよい。
【0010】
別の実施形態によれば、式ＩＩ又はＩＩＩの化合物及び薬学的に許容される担体を含有する、がん治療用医薬組成物が提供される。
【0011】
別の実施形態によれば、式ＩＩ又はＩＩＩの化合物の、がんの治療のための使用が提供される。
【0012】
別の実施形態によれば、がん治療用医薬の製造における式ＩＩ又はＩＩＩの化合物の使用が提供される。
【0013】
別の実施形態によれば、（ａ）式ＩＩ又はＩＩＩのうちいずれか１つの化合物及び薬学的に許容される担体と、（ｂ）がんの治療のためにそれを使用するための添付文書と、を含む商用パッケージが提供される。
【0014】
別の実施形態によれば、（ａ）式ＩＩ又はＩＩＩのうちいずれか１つの化合物及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物と、（ｂ）がんの治療のためにそれを使用するための添付文書と、を含む商用パッケージが提供される。
【0015】
別の実施形態によれば、
の構造を有する化合物を投与することを含む、トポイソメラーゼＩＩの阻害方法が提供される。
【0016】
別の実施形態によれば、がんの治療において使用するための化合物であって、該化合物は以下の化合物から選択される１以上である、化合物が提供される。
【0017】
上記がんの治療はトポイソメラーゼＩＩの阻害によるものであってもよい。上記がんの治療はトポイソメラーゼＩＩの触媒阻害によるものであってもよい。上記がんは、子宮頸がん、小細胞肺がん、精巣腫瘍、癌腫、神経芽腫、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、食道がん、胃がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、軟骨肉腫、中枢神経系腫瘍、肝がん、及び前立腺がんのうち１以上から選択されてもよい。上記前立腺がんは神経内分泌前立腺がん（ＮＥＰＣ）、前立腺腺がん、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）、アンドロゲン受容体経路阻害剤（ＡＲＰＩ）抵抗性前立腺がん、エンザルタミド（ＥＮＺ）抵抗性（ＥＮＺＲ）、及びアビラテロン（Ａｂｉ）抵抗性（ＡＢＩＲ）から選択されてもよい。上記化合物はタキソール及び／又はトポイソメラーゼポイズンと組み合わせて投与されるか、及び／又は前立腺がんの治療用アンドロゲン受容体（ＡＲ）療法と併用して投与されてもよい。上記化合物は
から選択されてもよい。
【0018】
上記化合物は式ＩＩ又は式ＩＩＩの構造を有していてもよい。
式中、Ａ２はＳ及びＯから選択されてもよく、Ａ３はＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択されてもよく、Ｄ２はＮ及びＣＨから選択されてもよく、Ｄ３はＮ及びＣから選択されてもよく、Ｍ３はＨであってもよく、Ｍ４は存在しないか、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、及びＢｒから選択されてもよく、Ｍ５はＨ、ＣＨ３、Ｃｌ、Ｆ及びＢｒから選択されてもよい。
【0019】
トポイソメラーゼＩＩの阻害は触媒阻害であってもよい。トポイソメラーゼＩＩの阻害はがんの治療のための阻害であってもよい。上記がんは、子宮頸がん、小細胞肺がん、精巣腫瘍、癌腫、神経芽腫、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、食道がん、胃がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、軟骨肉腫、中枢神経系腫瘍、肝がん、及び前立腺がんのうち１以上から選択されてもよい。上記前立腺がんは神経内分泌前立腺がん（ＮＥＰＣ）、前立腺腺がん、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）、アンドロゲン受容体経路阻害剤（ＡＲＰＩ）抵抗性前立腺がん、エンザルタミド（ＥＮＺ）抵抗性（ＥＮＺＲ）、及びアビラテロン（Ａｂｉ）抵抗性（ＡＢＩＲ）から選択されてもよい。式ＩＩ又はＩＩＩの化合物はタキソール及び／又はトポイソメラーゼポイズンと組み合わせて投与されてもよく、かつ前立腺がんの治療のためのアンドロゲン受容体（ＡＲ）療法と併用して投与されてもよい。式ＩＩ又はＩＩＩの化合物はタキソール及び／又はトポイソメラーゼポイズンと組み合わせて投与されてもよく、及び／又は前立腺がんの治療用のアンドロゲン受容体（ＡＲ）療法と併用して投与されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】図１は化合物＃６０（Ｔ６０又はＴｏｐ６０）がＴＯＰ２活性を阻害していることを示している。（ａ）５０μＭのエトポシド、５０μＭのＩＣＲＦ１９３又は０～５０μＭのＴｏｐ６０化合物の存在下、キネプラストＤＮＡカテナンをヒトＴＯＰ２ａと共に３７℃で１時間インキュベートした。０．８％アガロースゲル上での電気泳動によりＤＮＡ試料を分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。Ｋ－ＤＮＡ、及びデカネテートされた（ｄｅｃａｔｅｎａｔｅｄ）（Ｄ）ＤＮＡ産物の位置を矢印で示す。実験を５回繰り返し、Ｄバンドのデンシトメトリーを用いてＩＣ５０を計算するための阻害カーブを確立した。（ｂ）５０μＭのエトポシド、５０μＭのＩＣＲＦ１９３又は０～５０μＭの化合物＃６０（Ｔｏｐ６０化合物）の存在下、超らせん構造を有するｐＨＯＴ（商標）プラスミドをヒトＴＯＰ２ａと共に３７℃で１時間インキュベートした。１％アガロースゲル上での電気泳動によりＤＮＡ産物を分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。超らせん構造の（ＳＣ）ＤＮＡ、切断された（ｎｉｃｋｅｄ）（Ｎ）ＤＮＡ、及び弛緩された（Ｒ）ＤＮＡのバンドの位置を矢印で示す。実験を５回繰り返し、ＳＣバンドのデンシトメトリーを用いてＩＣ５０を計算するための阻害カーブを確立させた。（ｃ）ｍＡＭＳＡ又は化合物＃６０（Ｔｏｐ６０）のいずれかを０、５、１０、２５、及び５０μＭの濃度で添加する前に、超らせん構造を有するｐＨＯＴ（商標）プラスミドをトポイソメラーゼＩと共に３７℃で３０分間インキュベートした。１％ＳＤＳにより、３７℃で１５分間反応を停めた。１％アガロースゲル上での電気泳動によりＤＮＡ産物を分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。超らせん構造の（ＳＣ）ＤＮＡ及び弛緩された（Ｒ）ＤＮＡのバンドの位置を矢印で示す。（ｄ）切断アッセイ：超らせん構造のｐＨＯＴプラスミドを用いて、ビヒクル、並びに各５０μＭのエトポシド、ＩＣＲＦ１９３、及び化合物＃６０（Ｔｏｐ６０）の存在下、ＤＮＡ切断アッセイを行った。超らせん構造の（ＳＣ）ＤＮＡ、切断された（Ｎ）ＤＮＡ、及び弛緩された（Ｒ）ＤＮＡのバンドの位置を矢印で示す。
【0021】
【図2】図２は、Ｔｏｐ６０が細胞周期の中のＳ期におけるＤＮＡ合成を阻害することを示す。（ａ）ＨｅＬａ細胞をビヒクル又は２０μＭのＴｏｐ６０、エトポシド又はＩＣＲＦ１８７と共に４８時間処理した。ＢｒｄＵの取り込み率はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）ＢｒｄＵ取り込みキット（ＢｒｄＵ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ）（ＣＡＴ＃２７５０）により決定した。（ｂ－ｃ）ＨｅＬａ細胞をビヒクル又は２０μＭのＴｏｐ６０と共に４８時間処理した。次に細胞をＡＰＣ－ＢｒｄＵ及び７－ＡＡＤで４時間染色し、ＦＡＣＳアッセイを行い、Ｓｕｂ－Ｇ０／Ｇ１期、Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期、及びＧ２／Ｍ期における細胞数を決定した。３つの独立した実験から結果を収集した。（ｄ－ｅ）ＨｅＬａ細胞をビヒクル又は２０μＭのＴ６０のいずれかと共に４８時間処理した。細胞を固定し、ＤＡＰＩ及びファロイジンで共染色し、共焦点顕微鏡で調べた。５つの高倍率視野から５０個の細胞を選択して、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで核の大きさを分析した。明視野顕微鏡像の代表的なものも同様に示した。スケールバーは５０μｍである。
【0022】
【図3】図３はＴｏｐ６０が細胞増殖を阻害するが、その細胞毒性は低いことを示している。（ａ）ＨｅＬａ細胞を０、１、５、１０、１５、及び２０μＭのＴｏｐ６０、エトポシド、及びＩＣＲＦ１８７で４８時間処理した。細胞培養培地からＬＤＨレベルを測定することにより細胞毒性を評価した。（ｂ）Ｋ５６２細胞をビヒクル又は１０－２０μＭのＴｏｐ６０、エトポシド、及びＩＣＲＦ１８７のうちいずれかで４時間処理した。細胞溶解物全体を回収してローディング対照としてのビンキュリンを用いてγＨ２ＡＸレベルを測定した。（ｃ）Ｋ５６２細胞を０、１、５、１０、１５、及び２０μＭのＴｏｐ６０、２０μＭのエトポシド、又は２０μＭのＩＣＲＦ１８７で４８時間処理した。細胞増殖率をＭＴＳアッセイで測定した。（ｄ）Ｋ５６２細胞を２０μＭのＴｏｐ６０、エトポシド又はＩＣＲＦ１８７で０、２４、４８、及び７２時間処理した。細胞増殖率をＭＴＳアッセイで測定した。３つの独立した実験から全結果を収集した。
【0023】
【図4】図４は細胞内でのＴｏｐ６０のオンターゲット効果を示す。（ａ）Ｋ５６２細胞をビヒクル又は２０μＭのＴｏｐ６０で２時間処理した後、図中に示した異なる温度に曝露した。細胞溶解物全体を回収し、その細胞溶解物全体をローディング対照としてのβ－アクチンを用いてＴＯＰ２α、ＴＯＰ２βのタンパク質レベルを測定するのに使用した。（ｂ）Ｋ５６２細胞を０、１、及び１０μＭのＴｏｐ６０で２４時間処理した。タンパク質溶解物を可溶性核抽出液、クロマチン画分、又は細胞溶解物全体から回収した。ＴＯＰ２α及びＴＯＰ２βタンパク質レベルを、ローディング対照としてのラミンＡ／Ｃ、ヒストンＨ３、及びβ－Ａｃｔｉｎを用いた免疫ブロット法により決定した。（ｃ）０．５μＭのエトポシドで細胞を６ヶ月間処理することによりエトポシド抵抗性Ｋ５６２細胞株を確立した。ＴＯＰ２α、ＴＯＰ２β、及びβ－アクチンのタンパク質レベルを免疫ブロット法により測定した。エトポシド抵抗性Ｋ５６２細胞を０、１、１０、１５及び２０μＭのＴｏｐ６０、エトポシド、又はＩＣＲＦ１８７で４８時間処理した。細胞増殖率をＭＴＳアッセイで測定した。
【0024】
【0025】
【0026】
【発明を実施するための形態】
【0027】
以下の発明の詳細な説明は、添付の図面を組み合わせて読むことによりよりよく理解できるであろう。発明を例示する目的で、図面は本発明の実施形態を示している。しかしながら、本発明は示された正確な配置、例、及び手段に限定されるものではない。
【0028】
これまでのトポイソメラーゼＩＩ触媒阻害剤の性能は高くなかったが、本発明者らは触媒阻害剤の設計におけるこのようなこれまでの失敗はその阻害の機構によるものではなく、有毒なスキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）又は最適ではないリガンド結合部位の存在によるものであると考えている。例えば、ＩＣＲＦ（すなわちＩＵＰＡＣ名４－［２－（３，５－ジオキソ－１－ピペラジニル）－１－メチルプロピル］ピペラジン－２，６－ジオン；ＣＡＳ番号２１４１６－６８－２；デクスラゾキサン；ＩＣＲＦ－１８７又はＩＣＲＦ－１９３）はＴｏｐｏＩＩの潜在的触媒阻害剤である。しかしながら、それが結合するポケットは小さく、そのためその医薬品化学の範囲は制限されている。コンピュータ支援創薬（ＣＡＤＤ）キャンペーンはＴｏｐｏＩＩ上の新規なポケットに対し、ＺＩＮＣ１５４データベースから約６００万個の分子をスクリーニングすることから始まった。これは、種々の仮想スクリーニングプログラム５からコンセンサススコアリングを実行することにより容易になる。我々の高度にコーディネートされたｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ（イン・シリコ）、及びウェットラボの合理的な創薬パイプラインを用いることで、我々は潜在性の高い触媒阻害剤をいくつか発見し、特性を評価することに成功した。特に、化合物の１つである化合物６０がナノモルレベルのＩＣ５０でＴｏｐｏＩＩを阻害することが示された。更に、弛緩アッセイにおいてトポイソメラーゼＩＩと共にインキュベーションする際に直鎖ＤＮＡが形成されないことから、特定された薬剤候補は毒としては作用しないことが本明細書内において実証された。興味深いことに、化合物６０がデカテネーションチェックポイントにおいてＤＮＡ複製をブロックする可能性があり、それにより核を大きくすることを見いだした。最後に、本明細書においては、生物学的実験及びｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ実験に基づく、リード化合物の作用機序が提案される。
【0029】
興味深いことに、公知のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤であるメルバロン（すなわちＣＡＳ番号９７５３４－２１－９；５－（Ｎ－フェニルカルバモイル）－２－チオバルビツール酸）は、本明細書中で特定したトポイソメラーゼＩＩ触媒阻害剤化合物の一部と構造的に類似している。メルバロンの構造は
である。
【0030】
本明細書中で直接定義していない語は、一般的に本発明の属する技術分野において理解されるような、それらに一般的に関連する意味を有するものとして理解される。
【0031】
トポイソメラーゼＩＩ複合体は直接阻害のため格好の標的である。ＺＩＮＣデータベースから６００万個を超える購入可能な化合物の仮想スクリーニングを行うのにｉｎ－ｓｉｌｉｃｏコンピュータ援用創薬法を使用し（Ｉｒｗｉｎ，Ｊ．ら、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ｐａｐｅｒｓ Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００５）２３０：Ｕ１００９）、潜在的トポイソメラーゼＩＩ複合体結合体を特定した。ｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ法は大規模なドッキング、ｉｎ－ｓｉｔｅ再スコアリング、及びコンセンサス投票（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｖｏｔｉｎｇ）手順を含んでいた。
【0032】
当業者は、ＣＯＯＨ及びＮＲ２がそれに対応するイオン、例えば、それぞれカルボキシレートイオンやアンモニウムイオンを含んでもよいことを理解するであろう。また上記イオンが示されている場合、当業者であれば対イオンも存在することを認識するであろう。
【0033】
本明細書に記載の上記化合物に対して基（ｍｏｉｅｔｙ）が共有結合している点は、例えば、特に限定されないが、特定の条件下で切断することができることを当業者であれば認識するであろう。特に限定されないが、特定の条件はｉｎ ｖｉｖｏ（イン・ビボ）での酵素的又は非酵素的手段であってもよい。特に限定されないが、基の切断は、例えば自発的に起こってもよく、また触媒作用によって引き起こされてもよく、他の剤によって誘導されてもよく、あるいは物理的パラメータ又は環境パラメータ（例えば、酵素、光、酸、体温、又はｐＨ）の変化によって誘導されてもよい。上記基は、特に限定されないが、例えば、官能基をマスクするように作用する保護基であってもよく、１以上の能動若しくは受動輸送機構のための基質として作用する基であってもよく、上記化合物にある特性（例えば溶解性、生化学的利用能、又は局在化など）を付与する、又は特性を高めるように作用する基であってもよい。
【0034】
ある実施形態においては、本明細書に記載の式ＩＩ、及びＩＩＩの化合物は、子宮頸がん、小細胞肺がん、精巣腫瘍、癌腫、神経芽腫、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、食道がん、胃がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、軟骨肉腫、中枢神経系腫瘍、肝がん、及び前立腺がんからなる群から選択される１以上の徴候の全身的治療のために使用されてもよい。あるいは、式ＩＩとＩＩＩの化合物が、前立腺がん、乳がん、結腸がん、子宮頸がん、小細胞肺がん、神経芽細胞腫、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、及び骨髄性白血病からなる群から選択される１以上の徴候の全身的治療のために使用されてもよい。ある実施形態においては、式ＩＩとＩＩＩの化合物が、本明細書に記載の徴候の全身的治療用の医薬又は組成物の製造において使用されてもよい。ある実施形態においては、本明細書に記載の徴候の全身的治療の方法もまた提供される。
【0035】
本明細書に記載の化合物は遊離型であってもよく、その塩の形態であってもよい。ある実施形態においては、本明細書に記載の化合物は、当該技術分野で公知の薬学的に許容される塩であってもよい（Ｂｅｒｇｅ Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９７７）６６（１）：１－１９）。本明細書に記載の薬学的に許容される塩は、例えば、親化合物の所望の薬学的活性を有する塩（親化合物の生物学的作用及び／又は生物学的特性を保持しつつ、生物学的に及び／又は他の理由で望ましくない塩に該当しない塩）を含んでもよい。塩を形成することができる１つ以上の官能基を有する本明細書に記載の化合物は、例えば、薬学的に許容される塩として形成されてもよい。塩基性官能基を１つ以上含んでいる化合物は、例えば、薬学的に許容される有機酸又は無機酸と共に薬学的に許容される塩を形成することができるものであってもよい。薬学的に許容される塩は、特に限定されないが、例えば、酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、酪酸、桂皮酸、クエン酸、樟脳酸、カンファースルホン酸、シクロペンタンプロピオン酸、ジエチル酢酸、ジグルコン酸酸、ドデシルスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、グルコヘプタン酸（ｇｌｕｃｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、グルコン酸、グリセロリン酸、グリコール酸、ヘミスルホン酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、イソニコチン酸、乳酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ニコチン酸、硝酸、シュウ酸、パモ酸、ペクチニン酸、３－フェニルプロピオン酸、リン酸、ピクリン酸、ピメリン酸、ピバル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、硫酸、スルファミン酸、酒石酸、チオシアン酸、又はウンデカン酸に由来するものであってもよい。酸性官能基を１つ以上含んでいる化合物は、例えば、薬学的に許容される塩基と共に薬学的に許容される塩類を形成することができるものであってもよく、例えば、特に限定されないが、アルカリ金属又はアルカリ土類金属を基礎とする無機塩基、又は第一級アミン化合物、第二級アミン化合物、第三級アミン化合物、第四級アミン化合物、置換アミン、天然置換アミン、環状アミンなどの有機アミン、又は塩基性イオン交換樹脂であってもよい。薬学的に許容される塩類は、特に限定されないが、例えば、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン若しくはアルミニウムなどの薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩又は重炭酸塩、アンモニア、ベンザチン、メグルミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、イソプロピルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、２－ジメチルアミノエタノール、２－ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、グルカミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、プロカイン、Ｎ－エチルピペリジン、テオブロミン、テトラメチルアンモニウム化合物、テトラエチルアンモニウム化合物、ピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、モルホリン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－エチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ－ジベンジルフェネチルアミン、１－エフェンアミン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、又はポリアミン樹脂に由来するものであってもよい。ある実施形態においては、本明細書に記載の化合物は酸性と塩基性の両方の基を含んでいてもよく、分子内塩又は双性イオンの形態であってもよく、特に限定されないが、例えばベタインであってもよい。本明細書に記載の塩は当業者に公知の従来の方法によって製造してもよく、特に限定されないが、例えば遊離型を有機酸若しくは無機酸又は塩基と反応させるか、又は他の塩からアニオン交換若しくはカチオン交換によって製造してもよい。当業者であれば、化合物の単離、及び精製中にｉｎ ｓｉｔｕで調製するか、又は単離若しくは生成された化合物を別途反応させることによって塩が調製され得ることを認識するであろう。
【0036】
ある実施形態においては、本明細書に記載の化合物とその異なる形態全て（例えば遊離型、塩、多形、異性体などの形態）は、溶媒が付加した形態、例えば溶媒和物であってもよい。溶媒和物は、化学量論量又は非化学量論量の溶媒が化合物に物理的に結合したもの又はその塩のいずれかを含む。上記溶媒は、特に限定されないが、例えば、薬学的に許容される溶媒であってもよい。例えば、水和物は上記溶媒が水の場合に形成され、アルコラートは上記溶媒がアルコールの場合に形成される。
【0037】
ある実施形態においては、本明細書に記載の化合物とその異なる形態全て（例えば遊離型、塩、多形、異性体などの形態）には結晶形態及び無定形形態が含まれてもよく、例えば、多形型、擬多形型、立体配座多形型、無定形型、又はその組み合わせで含まれてもよい。多形型には、同一の元素組成を有する化合物の異なる結晶充填配置が含まれる。多形型は、異なるＸ線回折パターン、赤外線スペクトル、融点、密度、硬度、結晶形状、光学的・電気的特性、安定性、及び／又は溶解度を通常有する。当業者は、再結晶溶媒、結晶化速度、及び保存温度などの種々の要因によって単結晶が支配的になる場合があることも認識するであろう。
【0038】
ある実施形態においては、本明細書に記載の化合物とその異なる形態全て（例えば遊離型、塩、多形、異性体などの形態）には、幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体、個々のエナンチオマー、個々のジアステレオマー、ラセミ体、ジアステレオマー混合物、及びその組み合わせなどの異性体が含まれ、便宜のために示した式の記述によって限定されない。
【0039】
ある実施形態においては、本明細書に記載の医薬組成物はそのような化合物の塩、好ましくは薬学的又は生理学的に許容される塩を含んでもよい。医薬製剤は、注射、吸入、局所投与、洗浄、又は選択した治療に好適な他の態様により行われる、上記製剤の投与態様に対し許容される担体、賦形剤、又は希釈剤の１以上を典型的には含むであろう。好適な担体、賦形剤、又は希釈材（本明細書では相互に交換可能に使用される）は、上記投与態様において使用される、当該技術分野において公知のものである。
【0040】
好適な医薬組成物は当該技術分野において公知の手段によって処方してもよく、その投与態様や服用量は熟練した実務者によって決定される。非経口投与の場合、化合物は滅菌水若しくは生理食塩水、又はビタミンＫに使用されるような非水溶性化合物の投与に使用される薬学的に許容されるビヒクルに溶解されてもよい。経腸投与の場合、上記化合物は錠剤、カプセル、又は液体に溶解された形態で投与されてもよい。上記錠剤又はカプセルは腸溶コーティングされていてもよく、徐放するための剤形であってもよい。剤型としては、化合物を局所的に投与するのに使用できる、放出される化合物をカプセル化した高分子又はタンパク質微粒子、あるいは軟膏、ペースト、ゲル、ヒドロゲル、溶液などの多くの好適な剤型が知られている。徐放性パッチ又はインプラントは長期にわたって薬剤を放出するのに使用することができる。当業者に公知の手法の多くはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ｂｙ Ａｌｆｏｎｓｏ Ｇｅｎｎａｒｏ，２０ｔｈ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２０００）に記載されている。非経口投与用の製剤は、例えば、賦形剤、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物性油、又は水素化ナフタレンを含んでいてもよい。生体適合性で生分解性のラクチド重合体、ラクチド／グリコリド共重合体、又はポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン共重合体を、化合物の放出を制御するのに使用してもよい。調節化合物のための他の潜在的に有用な非経口送達システムには、エチレン／酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み注入システム、及びリポソームが含まれる。吸入用製剤は賦形剤、例えばラクトースを含んでもよく、例えば、ポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテル、グリココール酸塩、及びデオキシコール酸塩を含む水溶液であってもよく、また点鼻薬の形態で、又はゲルとして投与するための油性溶液であってもよい。
【0041】
本明細書に記載の化合物若しくは医薬組成物、又は本発明に記載の使用のための化合物若しくは医薬組成物はインプラント、グラフト、プロテーゼ、ステントなどの医療機器又は医療器具によって投与してもよい。また、インプラントは上記化合物や組成物を含み、かつ放出するように工夫されていてもよい。ある一定期間化合物を放出するように適合された高分子材料からなるインプラントはその一例である。
【0042】
本明細書に記載の医薬組成物の「有効（な）量」には治療上有効な量や予防上有効な量が含まれる。「治療上有効な量」とは、必要な投与量及び必要な期間において、所望の治療結果（例えば腫瘍を小さくする、寿命を延ばす、又は余命を伸ばすなど）を達成するのに有効な量をいう。化合物の治療上有効な量は患者・患畜の病状、年齢、性別、及び体重などの要因、並びにその化合物が患者・患畜において所望の応答を引き出す能力に応じて変えてもよい。投与計画は、最適な治療上の応答が得られるように調整されてもよい。治療上有効な量は、化合物の何らかの有毒又は有害な作用を治療的に有益な作用が上回る量でもある。「予防上有効な量」とは、必要な投与量及び必要な期間において、所望の予防的結果（例えば腫瘍をより小さくする、寿命を延ばす、余命を伸ばす、又は前立腺がんがアンドロゲン非依存性前立腺がんに進行するのを防ぐ、など）を達成するために有効な量をいう。典型的には、疾患の初期の段階よりも前、あるいは初期の段階で患者・患畜に予防的な用量を用いることから、予防上有効な量は治療学上有効な量よりも少なくてもよい。
【0043】
なお、投薬量の値は軽減すべき病状の重症度に伴って変動し得る。特定の患者・患畜に対し、その患者・患畜特有の投与計画は、個々のニーズや上記化合物の投与を管理又は監督する者の専門的判断に応じて時間とともに調整してもよい。本明細書に記載の投薬量の範囲は典型的なものでしかなく、医療従事者によって選択され得る投薬量の範囲を制限するものではない。組成物中の活性化合物の量は、患者・患畜の病状、年齢、性別、及び体重などの要因に応じて変えてもよい。投与計画は、最適な治療上の応答が得られるように調整されてもよい。例えば、単回のボーラス投与であってもよく、時間をかけて数回の分割した服用量で投与してもよく、治療状況の緊急度に比例するように用量を減らしたり増やしたりしてもよい。投与が容易で、かつ投与量が一定になることから、非経口組成物を単位剤形に処方するのが有利な場合もある。
【0044】
ある実施形態においては、本明細書に記載の化合物及びその全ての異なる形態は、特に限定されないが、例えば子宮頸がん、小細胞肺がん、精巣腫瘍、癌腫、神経芽腫、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、食道がん、胃がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、軟骨肉腫、中枢神経系腫瘍、肝がん、及び前立腺がんからなる群から選択される１以上の徴候に対する他の治療方法と組み合わせて使用してもよい。あるいは、本明細書に記載の化合物は、子宮頸がん、小細胞肺がん、精巣腫瘍、リンパ腫、白血病、食道がん、胃がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、軟骨肉腫、中枢神経系腫瘍、肝がん、及び前立腺がんから選択される１以上の治療に有用であってもよい。例えば、本明細書に記載の化合物及びその全ての異なる形態は、手術、放射線治療（小線源治療又は体外照射療法）や他の治療（例えば、ＨＩＦＵ）と共に、ネオアジュバント療法（処置前）、補助的療法（処置中）、及び／又は術後補助療法（処置後）として使用してもよい。更に、本明細書に記載の化合物は公知の化学療法と共に投与あるいは併用してもよい。例えば、式ＩＩ又はＩＩＩのうちいずれか１つの化合物はタキソール及び／又はトポイソメラーゼポイズンと組み合わせて投与されてもよく、また前立腺がん（ＰＣａ）の治療のためのアンドロゲン受容体（ＡＲ）療法（例えば、ＡＤＴ、ＡＲＰＩなど）と併用して投与されてもよい。
【0045】
一般的に、本明細書に記載の化合物は、実質的な毒性を引き起こすことなく使用される必要がある。本明細書に記載の化合物の毒性は標準的な手法を用いて決定することができ、例えば細胞培養又は実験動物で試験し、治療指数（すなわち、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致命的な用量）とＬＤ１００（集団の１００％にとって致命的な用量）の間の比率）を測定することで決定することができる。しかしながら、ある状況、例えば病状が重篤な状態においては、かなり過剰な量の組成物を投与するのが適当な場合がある。本明細書に記載の化合物の一部は、ある濃度においては有毒な場合がある。毒性のある濃度及び毒性のない濃度を決定するのに滴定による検討を用いてもよい。毒性は、ＡＲを発現しない負の対照としてＰＣ３細胞を用いて細胞系全体に対する特定の化合物又は組成物の特異性を調べることによって評価することができる。化合物が他の組織に影響を及ぼすかどうかの指標を提供するために動物実験を使用してもよい。抗アンドロゲンとアンドロゲン不感性症候群が致命的でないことから、ＡＲを標的とする全身療法はおそらく他の組織に重大な問題を生じさせないと考えられる。
【0046】
本明細書に記載の化合物は、患者・患畜に投与されてもよい。本明細書で使用されるように「患者・患畜」はヒト、人間以外の霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどであってもよい。患者・患畜は、子宮頸がん、小細胞肺がん、精巣腫瘍、癌腫、神経芽腫、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、食道がん、胃がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、軟骨肉腫、中枢神経系腫瘍、肝がん、及び前立腺がんなどのがんの疑いがある、あるいはがんのリスクを有する患者又は患畜であってもよい。子宮頸がん、小細胞型肺がん、精巣がん、リンパ腫、白血病、食道がん、胃がん、直腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、軟骨肉腫、中枢神経系腫瘍、肝がん、及び前立腺がんなどの種々のがんのための診断法は当業者に公知である。
【0047】
本明細書で具体的に述べる化合物は全て市販されている。更に、当業者の知識に基づけば、その化合物の改変も可能である。
【0048】
種々の別の実施形態、及び実施例を本明細書にて述べる。この実施形態や実施例は例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
[物質、及び方法]
[物質、及び方法]
【0049】
潜在的トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の仮想スクリーニング
【0050】
Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ Ｍａｅｓｔｒｏ（商標）タンパク質プレパレーション（ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）ソフトウェアモジュールと共に、トポイソメラーゼＩＩの４ｆｍ９ＰＤＢエントリーをダウンロードして準備した。手短に言うと、元々存在する水素を全て取り除き、再付加し、結晶状のイオン及び水も取り除き、ｐＨ７．４でＰＲＯＰＫＡ（商標）オプティマイザを使用してアミノ酸のプロトン化状態を計算した。ＯＰＬＳ－３（商標）フォースフィールド（ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ）を用いて構造を最小化した。仮想原子プローブを用いてタンパク質表面を調べるＭＯＥ（商標）サイトファインダー（ｓｉｔｅ－ｆｉｎｄｅｒ）アルゴリズムを用いて好適なポケットを提示するのを支援した。ポケットの空洞容積はＰｏｃｋ Ｄｒｕｇ（商標）を用いて算出した。[仮想スクリーニングライブラリの準備]：約４億の化合物のデータベースであるＺＩＮＣ（商標）から、在庫があるもの、という追加の基準を付して、約６００万の薬物様分子をダウンロードした。[ドッキンググリッド計算]：上記ポケットの中心にグリッドを配置し、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒｓ Ｇｒｉｄ（商標）生成プログラムを用いて計算した。[Ｇｌｉｄｅ（商標）リガンドドッキング]：標準精密ドッキングを用い、他のパラメータは全てデフォルトの値にセットした。[Ｅ－Ｈｉｔｓドッキング]：Ｇｌｉｄｅ（商標）によってスコア付けされ、ランキングされた上位の１００，０００分子をＥ－ｈｉｔｓプログラムを用いてドッキングさせた。両方のプログラムのコンセンサスに基づき、原子の位置の平均二乗偏差又はそれぞれのプログラムにおいてドッキングされた分子間の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を測定し、分子の平均二乗偏差が２Å未満である場合にはその分子をキープした。最後にＡＤＭＥＴ（商標）を、パラメータはデフォルトの状態で用いてＡＤＭＥＴ＿Ｒｉｓｋ、Ｔｏｘ＿Ｒｉｓｋ、及びＣＹＰ＿Ｒｉｓｋディスクリプタを計算した。このときスコアがそれぞれ６．５未満、３．３未満、及び１未満の場合にはその分子をキープした。[ＲＯＣＳ（商標）形状類似度]：Ｏｐｅｎ Ｅｙｅ（商標）によって提供されたＲＯＣＳ（商標）形状類似度プログラムを使用して、我々のリード化合物と類似する分子を探した。ここで、Ｉｍｐｌｉｃｉｔ Ｄｅａｎ Ｍｉｌｌｓフォースフィールドを、他のパラメータは全てデフォルトのまま使用した１０。[ポケット容積の算出]：Ｐｏｃｋ Ｄｒｕｇ（商標）ソフトウェアを用いてポケットの容積を算出した１１。[Ａｍｂｅｒシミュレーション]：ニュートン・ラフソンアルゴリズムを用いてタンパク質を２００サイクルで最小化した。ＳＨＡＫＥアルゴリズムを用いて、圧力制御せずに系を３００Ｋまで加熱し、水素への結合を凍結させた。ランジュヴァン・サーモスタットをこの目的のために用いた。Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｒｎ陰溶媒をＰＢｒａｄｉｉと共に使用した。加熱の後、２フェムト秒のタイムステップで２５００ステップごとに書き込みながらプロダクションランを実行した。シミュレーションを９３５９ステップ実行した１２。Ｇｌｉｄｅ（商標）ドッキングスコアとリガンド効率のバランスがよく、ポケット内の周囲の側鎖との好ましい相互作用が起こる５３の化合物を、以降の実験的な試験のために購入した。
【0051】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴｏｐｏＩＩ活性アッセイ－ヒトＴｏｐｏＩＩ分析キット（ＴＧ１００１、ＴｏｐｏＧＥＮＥ（商標））を用いてＫ－ＤＮＡデカテネーション分析を行った。このとき、エトポシド及びＩＣＲＦ１９３をそれぞれ毒及び触媒阻害剤とした。超らせん構造を有するｐＨＯＴ（商標）をヒトＴｏｐｏＩＩα（ＴＧ２０００Ｈ（商標）、ＴｏｐｏＧＥＮＥ（商標））と共に３７度で１時間インキュベートすることによりＤＮＡ弛緩アッセイを行った。１０％ＳＤＳ、ＥＤＴＡ及びプロテアーゼＫを添加することにより反応を停止させた。プラスミドＤＮＡをＤＮＡアガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色して可視化した。
【0052】
ＤＮＡ挿入（インターカレーティング）アッセイ－超らせん構造を有するｐＨＯＴ（商標）プラスミドＤＮＡをＤＮＡトポイソメラーゼＩ（ＴＧ１０１５）によって切断し、その後ｍＡＭＳＡ又は化合物＃６０（Ｔｏｐ６０）の存在した状態でその用量を増加させながら、ＴｏｐｏＩＩと共にインキュベートした。ストップバッファを加えた後、プラスミドＤＮＡをＤＮＡアガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色して可視化した。
【0053】
ＤＮＡ切断アッセイ－超らせん構造を有するｐＨＯＴ（商標）プラスミドＤＮＡを、エトポシド、ＩＣＲＦ１９３、及び化合物＃６０（Ｔｏｐ６０）の存在下、ヒトＴｏｐｏＩＩαと共に３７度で３０分間インキュベートした。１０％ＳＤＳ、ＥＤＴＡ及びプロテアーゼＫを添加することにより反応を停止させた。
【0054】
ＢｒＤＵ取り込み及び細胞増殖アッセイ－、ＣｅｌｌＴｉｔｒｅ（商標） ９６ ＡｑｕｅｏｕｓＯｎｅ（商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ（商標））、及びブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）アッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標））を用い、製造業者のプロトコルに従い、Ｌｉ Ｈ．らによって以前に報告されたような少しの修正を加えて細胞増殖率を測定した１９。
【0055】
ＦＡＣＳアッセイ－ＡＰＣ ＢｒｄＵフローキット（ＢＤファーミンジェン（商標）；フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）を用い、製造業者のプロトコルに従って、Ｓ期のＤＮＡへのＢｒｄＵ取り込みを用いることにより細胞周期を評価した。手短に言うと、１ｍＭのＢｒｄＵを細胞に加えて、６時間インキュベートした。細胞を抗ＢｒｄＵ抗体と共にインキュベートし、７－ＡＡＤで染色して、フローサイトメトリー用に細胞を加工した。
【0056】
共焦点顕微鏡観察－細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．２５％のトリトンＸ－１００内で１５分間処理し、Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ－ｉＦｌｕｏｒ４８８（商標）（アブカム（商標）；ケンブリッジ、英国）に接合されたＦ－アクチンと共にインキュベートし、ＤＡＰＩ染色マウント（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ（商標）；バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）を用いてマウントした。次に細胞を共焦点顕微鏡（ツァイスＬＳＭ７８０（商標）、カールツァィスＡＧ（商標）、オーバーコッヘン、ドイツ）により倍率６３倍で画像化した
【0057】
細胞毒性アッセイ－Ｐｉｅｒｃｅ（ＣＡＴ＃８０７８）の市販キットを用いて細胞毒性分析を行った。手短に言うと、培養メディアを回収し、製造プロトコルの実施後、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）濃度を比色方法で測定するのに用いた。
【0058】
サーマルシフトアッセイ及びクロマチン分画アッセイ－サーマルシフトアッセイでは、細胞をビヒクル又は化合物＃６０（Ｔｏｐ６０）で１時間処理し、等分のアリコートに分割して、ＰＣＲマシンで３７～４６度に加熱した。タンパク質溶解物を回収して、ＴｏｐｏＩＩ抗体と共に免疫ブロッティングアッセイを行った。クロマチン分画アッセイでは、細胞をビヒクル又は化合物＃６０（Ｔｏｐ６０）で処理した。両方の可溶性クロマチン関連タンパク質を、Ｗｙｓｏｃｋａ Ｊら１８によって報告されたプロトコルに従って分画した。タンパク質溶解物を回収し、ＴｏｐｏＩＩ抗体と共に免疫ブロッティングアッセイを行った。
【実施例】
【0059】
［実施例１］トポイソメラーゼＩＩサイトを標的とするｈｉｔ化合物のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ特定
【0060】
ポケット結合サイトの特定
トポイソメラーゼＩＩα（ＴｏｐｏＩＩ）上の有効な結合部位の位置を決定するために、ＭＯＥ６（ＰＤＢ ＩＤ：４ＦＭ９）でタンパク質を視覚化した。ファンデルワールスタンパク質表面を調べた後に、１６７１．８８Å３の凸閉包体積を有し、５４％の極性残基と、１４％の芳香族（Ｆ、Ｙ、ＨとＷ）と、結合に利用可能な２６の残基を含むタンパク質の表面上で好ましい特性を有するポケットを発見した。このポケットもＤＮＡ結合部位の中央において偶然発見されたものであり、新薬の開発につながるような非常に有望な部位である。タンパク質がどの程度擬原子プローブを収容することができるか算出することによって小分子を結合するポケット候補の特徴を調べるＭＯＥｓサイトファインダープローブソフトウェアによって上記ポケットを検証した。我々が知る限りでは、ＴｏｐｏＩＩ上のこの部位が標的とされたのはこれが初めてである。高度に柔軟なポケットは動き回ることが予想され、そのためシミュレーションを通してＲＭＳＤが大きく変化するはずであるから、分子動力学シミュレーションでポケットの柔軟性を測定することでこのポケットを評価した。４６ナノ秒のシミュレーションの後、ＲＭＳＤがわずかに変化することが観察され、ポケットの選択が妥当であったことを更に確認した。トポイソメラーゼＩＩαのアンバー・シミュレーションからのポケット残基のＲＭＳＤによれば、残基が４３２～４３４、３５０～３５９、３２１～３２３、２９９～３０３、２８６～２８９、２７３～２８４，２２３～２３１、及び２１９～２２２で使用されていることが示された。各フレームは、それぞれ２５００ステップ／２フェムト秒を表す。
トポイソメラーゼＩＩα（ＴｏｐｏＩＩ）上の有効な結合部位の位置を決定するために、ＭＯＥ６（ＰＤＢ ＩＤ：４ＦＭ９）でタンパク質を視覚化した。ファンデルワールスタンパク質表面を調べた後に、１６７１．８８Å３の凸閉包体積を有し、５４％の極性残基と、１４％の芳香族（Ｆ、Ｙ、ＨとＷ）と、結合に利用可能な２６の残基を含むタンパク質の表面上で好ましい特性を有するポケットを発見した。このポケットもＤＮＡ結合部位の中央において偶然発見されたものであり、新薬の開発につながるような非常に有望な部位である。タンパク質がどの程度擬原子プローブを収容することができるか算出することによって小分子を結合するポケット候補の特徴を調べるＭＯＥｓサイトファインダープローブソフトウェアによって上記ポケットを検証した。我々が知る限りでは、ＴｏｐｏＩＩ上のこの部位が標的とされたのはこれが初めてである。高度に柔軟なポケットは動き回ることが予想され、そのためシミュレーションを通してＲＭＳＤが大きく変化するはずであるから、分子動力学シミュレーションでポケットの柔軟性を測定することでこのポケットを評価した。４６ナノ秒のシミュレーションの後、ＲＭＳＤがわずかに変化することが観察され、ポケットの選択が妥当であったことを更に確認した。トポイソメラーゼＩＩαのアンバー・シミュレーションからのポケット残基のＲＭＳＤによれば、残基が４３２～４３４、３５０～３５９、３２１～３２３、２９９～３０３、２８６～２８９、２７３～２８４，２２３～２３１、及び２１９～２２２で使用されていることが示された。各フレームは、それぞれ２５００ステップ／２フェムト秒を表す。
【0061】
１回目のスクリーニング
結合部位の特定後に分子スクリーニングを行った。ドッキングのための分子のデータベースを作成するために、約４億個の化合物を収めたＺＩＮＣ－１５（商標）ライブラリを、（リピンスキールールの第５によって決定したように）購入が可能でかつ薬様特性を有する分子を選別することによって６００万個まで絞った。以前に報告されているように５、分子ドッキング・ソフトウェアＧｌｉｄｅ－ＳＰ（商標）７とＥ－ｈｉｔｓ８によるコンセンサススコアリングを用いた。最後に、ＡＤＭＥＴ（商標）９ソフトウェア使用しＡＤＭＥＴ＿Ｒｉｓｋ、ＴＯＸ＿Ｒｉｓｋ、及びＣＹＰ＿Ｒｉｓｋスコアを調べ、ソフトウェア・マニュアルで推奨されるよう、上記スコアがそれぞれ６．５，３．３及び１を超える分子を候補から外した。手元にあるこのランキングを用い、ランキングの上から５３の分子を発注した。
結合部位の特定後に分子スクリーニングを行った。ドッキングのための分子のデータベースを作成するために、約４億個の化合物を収めたＺＩＮＣ－１５（商標）ライブラリを、（リピンスキールールの第５によって決定したように）購入が可能でかつ薬様特性を有する分子を選別することによって６００万個まで絞った。以前に報告されているように５、分子ドッキング・ソフトウェアＧｌｉｄｅ－ＳＰ（商標）７とＥ－ｈｉｔｓ８によるコンセンサススコアリングを用いた。最後に、ＡＤＭＥＴ（商標）９ソフトウェア使用しＡＤＭＥＴ＿Ｒｉｓｋ、ＴＯＸ＿Ｒｉｓｋ、及びＣＹＰ＿Ｒｉｓｋスコアを調べ、ソフトウェア・マニュアルで推奨されるよう、上記スコアがそれぞれ６．５，３．３及び１を超える分子を候補から外した。手元にあるこのランキングを用い、ランキングの上から５３の分子を発注した。
【0062】
ミディアムスループットスクリーニングアッセイ
超らせん構造のプラスミド弛緩アッセイを、候補小分子を決定するための第１のコース・フィルターとして用いた。第１回スクリーニングで十分に活性であった小分子候補に対し、次にｋＤＮＡデカテネーションを行った。検査したものの中では、化合物１９と２３が最も活性があることがわかった。
超らせん構造のプラスミド弛緩アッセイを、候補小分子を決定するための第１のコース・フィルターとして用いた。第１回スクリーニングで十分に活性であった小分子候補に対し、次にｋＤＮＡデカテネーションを行った。検査したものの中では、化合物１９と２３が最も活性があることがわかった。
【0063】
２回目のスクリーニング
活性であることがわかった化合物１９と２３を用いて、類似の分子を探すための新たなスクリーニングを開始した。このスクリーニングには、形状類似性スクリーニングプログラムＲＯＣＳ（商標）１０を使用した。ＲＯＣＳ（商標）サーチのために選択した化合物は化合物２３のドッキングコンフォメーションに基づくものであった。上述の、６００万個の分子に絞ったＺＩＮＣ－１５ライブラリをこのスクリーニングに用いた。ＲＯＣＳ（商標）類似性とそのドッキングスコアに基づいて上位６２個の分子を厳選した。これらの分子を発注し、上述したのと同じミディアムスループットアッセイで試験した。第１回のスクリーニングに比べて、活性のある分子の比率は大きく増加して約１０倍となり、これにより仮想スクリーニング・パイプラインの妥当性が確認された。最後に、化合物６０はグループの中で最も活性が高いものとして発見され、ＴｏｐｏＩＩに対してＩＣＲＦ－１９３よりも強力な阻害活性があって、デカテネーションアッセイと弛緩アッセイの両方においてＩＣ５０がナノモルレベルであった（図３ａと３ｂを参照）。
活性であることがわかった化合物１９と２３を用いて、類似の分子を探すための新たなスクリーニングを開始した。このスクリーニングには、形状類似性スクリーニングプログラムＲＯＣＳ（商標）１０を使用した。ＲＯＣＳ（商標）サーチのために選択した化合物は化合物２３のドッキングコンフォメーションに基づくものであった。上述の、６００万個の分子に絞ったＺＩＮＣ－１５ライブラリをこのスクリーニングに用いた。ＲＯＣＳ（商標）類似性とそのドッキングスコアに基づいて上位６２個の分子を厳選した。これらの分子を発注し、上述したのと同じミディアムスループットアッセイで試験した。第１回のスクリーニングに比べて、活性のある分子の比率は大きく増加して約１０倍となり、これにより仮想スクリーニング・パイプラインの妥当性が確認された。最後に、化合物６０はグループの中で最も活性が高いものとして発見され、ＴｏｐｏＩＩに対してＩＣＲＦ－１９３よりも強力な阻害活性があって、デカテネーションアッセイと弛緩アッセイの両方においてＩＣ５０がナノモルレベルであった（図３ａと３ｂを参照）。
【0064】
［実施例２］化合物＃６０（Ｔｏｐ６０）の特性評価
【0065】
Ｔｏｐ６０はＴｏｐｏＩＩの触媒阻害剤である
我々のリード化合物である化合物６０（Ｔｏｐ６０）の妥当性を検証するために、細胞内及び細胞外の両方で二本鎖ＤＮＡ切断が形成されるかどうかを分析した。Ｔｏｐ６０が細胞外で二本鎖ＤＮＡを切断するかどうかを評価するために、ＴｏｐｏＩＩの存在下、Ｔｏｐ６０と共に、及びＴｏｐ６０無しで超らせん構造のプラスミドをインキュベートした（図１ｄ）。満足なことに、直鎖ＤＮＡに相当するバンドはほとんど形成されておらず、公知の触媒阻害剤ＩＣＲＦ－１９３と同様の強度である。さらに、Ｈ２ＡＸγタンパク質発現をウエスタンブロットにより評価して上記リード化合物が細胞内でＤＮＡ損傷を引き起こすことができるかどうかを評価し、対照としてのエトポシドと比較した（図３ｂ）。確かにＴｏｐ６０がＤＮＡ損傷を引き起こさないことが確認され、したがってＴｏｐ６０は実際に触媒阻害剤である可能性が高い。Ｔｏｐ６０は触媒阻害剤であるかもしれないが、これはＴｏｐ６０がインターカレータである可能性を排除していない。インターカレータはＤＮＡの操作を含む多くのプロセスを干渉し、オフターゲット作用を引き起こすため、もしＴｏｐ６０がインターカレータであればそれは好ましくないことである。Ｔｏｐ６０がＤＮＡをインターカレーションするかどうかを確認するために、弛緩プラスミドを、その濃度を増加させながらＴｏｐ６０と共にインキュベートし、公知のインターカレータであるｍ－ＡＭＳＡと比較した。インターカレータはＤＮＡ中に負の超らせんを残し、負の超らせんは、弛緩されたその相手に比較してゲル上をより早く泳動するため、これを可視化することができる。この結果にからＴｏｐ６０はインターカレータではないことが示される（図１ｃ）。
我々のリード化合物である化合物６０（Ｔｏｐ６０）の妥当性を検証するために、細胞内及び細胞外の両方で二本鎖ＤＮＡ切断が形成されるかどうかを分析した。Ｔｏｐ６０が細胞外で二本鎖ＤＮＡを切断するかどうかを評価するために、ＴｏｐｏＩＩの存在下、Ｔｏｐ６０と共に、及びＴｏｐ６０無しで超らせん構造のプラスミドをインキュベートした（図１ｄ）。満足なことに、直鎖ＤＮＡに相当するバンドはほとんど形成されておらず、公知の触媒阻害剤ＩＣＲＦ－１９３と同様の強度である。さらに、Ｈ２ＡＸγタンパク質発現をウエスタンブロットにより評価して上記リード化合物が細胞内でＤＮＡ損傷を引き起こすことができるかどうかを評価し、対照としてのエトポシドと比較した（図３ｂ）。確かにＴｏｐ６０がＤＮＡ損傷を引き起こさないことが確認され、したがってＴｏｐ６０は実際に触媒阻害剤である可能性が高い。Ｔｏｐ６０は触媒阻害剤であるかもしれないが、これはＴｏｐ６０がインターカレータである可能性を排除していない。インターカレータはＤＮＡの操作を含む多くのプロセスを干渉し、オフターゲット作用を引き起こすため、もしＴｏｐ６０がインターカレータであればそれは好ましくないことである。Ｔｏｐ６０がＤＮＡをインターカレーションするかどうかを確認するために、弛緩プラスミドを、その濃度を増加させながらＴｏｐ６０と共にインキュベートし、公知のインターカレータであるｍ－ＡＭＳＡと比較した。インターカレータはＤＮＡ中に負の超らせんを残し、負の超らせんは、弛緩されたその相手に比較してゲル上をより早く泳動するため、これを可視化することができる。この結果にからＴｏｐ６０はインターカレータではないことが示される（図１ｃ）。
【0066】
［実施例３］化合物＃６０（Ｔｏｐ６０）はがん細胞の増殖を遅らせる
ＢｒｄＵアッセイによって実証されているように、ＨｅＬａ細胞では細胞複製が減少することが観察された（図２ａ）。複製速度の低下が観察されたことを更に詳しく調べるために、ＰＩ染色してＦＡＣＳを行った（図２ｂと２ｃ）。ＴｏｐｏＩＩはＤＮＡを複製しやすくするために重要であることから、Ｓ期に遅延した細胞が多数あることは思いがけないことでない。またＭ期よりも前にデカテネーションチェックポイントがＧ２に存在するものと仮説を立てることができ１５、これはＧ２／Ｍで細胞数が増加したことと合致する（図２ｂと２ｃ）。細胞成長を遅延させる効果を視覚化するために、ＤＡＰＩ染色を用いた蛍光顕微鏡観察を行い、細胞をＴｏｐ６０の存在下で、及びＴｏｐ６０なしで処理した。実際、図２ｄと２ｅで見られているように、拡大した核が観察されることは触媒阻害の特徴である。このような状況はＤＮＡが複製されるもの紡錘体によって適切に分離されない場合に起こる場合があり、核の拡大を引き起こす。
ＢｒｄＵアッセイによって実証されているように、ＨｅＬａ細胞では細胞複製が減少することが観察された（図２ａ）。複製速度の低下が観察されたことを更に詳しく調べるために、ＰＩ染色してＦＡＣＳを行った（図２ｂと２ｃ）。ＴｏｐｏＩＩはＤＮＡを複製しやすくするために重要であることから、Ｓ期に遅延した細胞が多数あることは思いがけないことでない。またＭ期よりも前にデカテネーションチェックポイントがＧ２に存在するものと仮説を立てることができ１５、これはＧ２／Ｍで細胞数が増加したことと合致する（図２ｂと２ｃ）。細胞成長を遅延させる効果を視覚化するために、ＤＡＰＩ染色を用いた蛍光顕微鏡観察を行い、細胞をＴｏｐ６０の存在下で、及びＴｏｐ６０なしで処理した。実際、図２ｄと２ｅで見られているように、拡大した核が観察されることは触媒阻害の特徴である。このような状況はＤＮＡが複製されるもの紡錘体によって適切に分離されない場合に起こる場合があり、核の拡大を引き起こす。
【0067】
［実施例４］Ｔｏｐ６０はＴｏｐｏＩＩ依存性がん細胞の無毒性阻害剤である
ＨｅＬａ細胞上でＴｏｐ６０から観察される細胞毒作用は低く、ＩＣＲＦと同等である（図３ａ）。触媒阻害剤として、ＩＣＲＦとＴｏｐ６０は共にＨ２ＡＸγタンパク質レベルによって示されるようなＤＮＡの損傷を引き起こさない。しかしながら、Ｔｏｐ６０には時間依存的及び用量依存的な実験の両方においてｋ５６２細胞増殖に対し強い阻害効果があり、これはエトポシドと同等の作用である（図３ｃと３ｄ）。
ＨｅＬａ細胞上でＴｏｐ６０から観察される細胞毒作用は低く、ＩＣＲＦと同等である（図３ａ）。触媒阻害剤として、ＩＣＲＦとＴｏｐ６０は共にＨ２ＡＸγタンパク質レベルによって示されるようなＤＮＡの損傷を引き起こさない。しかしながら、Ｔｏｐ６０には時間依存的及び用量依存的な実験の両方においてｋ５６２細胞増殖に対し強い阻害効果があり、これはエトポシドと同等の作用である（図３ｃと３ｄ）。
【0068】
［実施例５］細胞内でのＴｏｐ６０のオンターゲット効果
【0069】
ＴｏｐｏＩＩに対するリード化合物の結合を評価するために、サーマルシフトアッセイを行った。このアッセイによってタンパク質の熱分解による結合が示され、例えば小分子がタンパク質に結合する場合、小分子が結合していないときよりも高温での分解に対してタンパク質をより安定化すると予想される。ＴｏｐｏＩＩαがリード化合物の存在下で４３℃まで安定化されることが確認された（図４Ａ）。さらに、細胞分画を行い、化合物治療に対するＴｏｐｏＩＩの局所的な変化を評価した。ＴｏｐｏＩＩαは細胞複製中のＤＮＡのデカテネーションに重要であることからクロマチンに結合することが予想される。Ｔｏｐ６０で処理すると、核の総量は一定のまま、ＴｏｐｏＩＩαのクロマチンに対する結合が解かれ（そしてＴｏｐｏＩＩβがより少なくな）る。ＴｏｐｏＩＩがＴｏｐ６０の唯一の観察可能な標的であることを更に確かめるために、エトポシド抵抗性細胞系を産出した。これらの細胞は、ＴｏｐｏＩＩタンパク質を下方制御することによって、エトポシドに対し抵抗性を示すようになる。これらの細胞上でのＴｏｐ６０の阻害効果は激減した。これらの結果は、Ｔｏｐ６０の阻害作用が細胞中のＴｏｐｏＩＩタンパク質を通してのみ媒介される、という我々の仮説を裏付けるものである。
【0070】
［実施例６］結合親和性の分子起源
【0071】
発見された小分子の結合効率を理解するために、３０ナノ秒間、化合物２３のＭＤシミュレーションを行った。シミュレーションの全体を通じて、水素結合相互作用がＧ７３７、Ｑ７４２、Ｎ７８６、Ｑ７８９、Ｇ７９３、Ｎ７９５、Ｎ８６７、Ｎ８６８、及びＲ９４５で観察される。相互作用は、強い順からＧ７３７＞Ｇ７４２＞Ｎ７９５＞Ｑ７８９＞Ｇ７９３＞Ｇ８６８となる（図５）。興味深いことに、Ｑ７８９相互作用はＧ７９３と相互に排他的であるとわかり、このことは、上記リガンドのピリジノチオンアミドに対しパラ位にある（ｐａｒａ ｔｏ）水素結合ドナーアミドが、２２ナノ秒後にＱ７８９の側鎖カルボニル又はＧ７９３の主鎖カルボニルと相互作用する、というシミュレーションの全体を通じて観察された２つの入れ替わり可能なコンフォメーションを表している（図５）。ＲＭＳＤがそれほどこの点で変化しないことから、第２のコンフォメーションは安定なコンフォメーションを表すと考えられる。この観察によって、２２ナノ秒のカットオフより後のタンパク質－リガンド相互作用を視覚化して分析することが促された（図６）。ピリジオチオンの隣のアミドは、シミュレーション全体を通してタンパク質と安定的に相互作用しており、そのカルボニル水素はＧ８６８の主鎖に結合し、リガンドのＮＨはＮ７８６に対し非常に安定な水橋を通して結合している（図６）。最も強い相互作用を下記に示す（図７）。ドッキングされた構造でのシミュレーションから得られる最終的なスナップショットを比較すると、リガンドに向かって振れたＮ７８６が、リガンドアミドのカルボニルとの水橋相互作用を通じて水素結合相互作用を形成するという誘導適合が一部で観察される。初期のドッキングした構造でのΔＲＭＳＤが３．３８Åであることから明らかなように、タンパク質構造全体がリガンドに対して好ましい形態に変形している。シミュレーションで後ほど観察された安定な形態は、初期のドッキングされたコンフォメーションでのΔＲＭＳＤが約１．５Åである。しかしながら、最初に観察したコンフォメーションではドッキングされたコンフォメーションとほぼ同じでΔＲＭＳＤが０．５Åであり、これはこの変化がポケット内でのわずかな再調整によって起こったものであることを示している。
【0072】
［実施例７］トポイソメラーゼＩＩ触媒阻害のための代替化合物の試験
【0073】
下記表１と表２に示す多数の化合物を（別途示す場合を除き）試験した。この中で活性化合物、及び活性であることが予想される化合物（試験は行っていない）は表１に示し、活性のない化合物は表２に示した。
【0074】
（表１）
トポイソメラーゼＩＩ阻害活性有する試験した式ＩＩ、及びＩＩＩの構造
Ｙは活性が見られたことを示す。
トポイソメラーゼＩＩ阻害活性有する試験した式ＩＩ、及びＩＩＩの構造
【0075】
（表２）
トポイソメラーゼＩＩ阻害活性のない試験化合物
トポイソメラーゼＩＩ阻害活性のない試験化合物
【0076】
本明細書では本発明の種々の実施形態を開示するが、当業者の技術常識に従って本発明の範囲内で多くの調整や改変を行うことができる。上記改変には、実質的に同様な方法で同様の結果を達成するために、本発明のいずれかの態様の代替として公知の同等物に置き換えることが含まれる。数値範囲は、範囲を決めるその両端の数字を含む。「含む・含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、非限定的な（ｏｐｅｎ－ｅｎｄｅｄ）語であり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～に限定されない」などと実質的に等価な語であり、現在形の「含む・含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」も対応する意味を有する。本発明で使用されているように、単数形の形態のａ”、“ａｎ”、及び“ｔｈｅ”は、文脈で明らかにそうではないことが述べられていない限り、複数形の指示対象をも含む。したがって、例えば「物（“ａ ｔｈｉｎｇ”）」は２以上の物も含む。本明細書に記載の参考文献の引用は、引用された参考文献が本発明の実施形態に対する先行技術であることを認めるものではない。本発明は、実質的に上で述べたような実施形態や変形であって、実施例や図面を参照するものを全て含む。
参考文献
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15. Downes CS, Clarke DJ, Mullinger AM, Gimenez-Abian JF, Creighton AM, Johnson RT (1994) A topoisomerase II-dependent G2 cycle checkpoint in mammalian cells. Nature 372: 467-470
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18. Wysocka J, Reilly PT, Herr W. Loss of HCF-1-chromatin association precedes temperature-induced growth arrest of tsBN67 cells. Mol Cell Biol. 21(11):3820-9, 2001.
19. Li H, Xie N, Chen R, Verreault M, Fazli L, Gleave ME, Barbier O, Dong X UGT2B17 Expedites Progression of Castration-Resistant Prostate Cancers by Promoting Ligand-Independent AR Signaling. Cancer Res. ;76(22):6701-6711, 2016. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-16-1518. Epub 2016 Sep 22.
20. McClendon AK, Rodriguez AC, Osheroff N. Human topoisomerase IIalpha rapidly relaxes positively supercoiled DNA: implications for enzyme action ahead of replication forks. J Biol Chem.; 280(47):39337-45, 2005.
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】