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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-14
(54)【発明の名称】免疫調節剤を含む徐放性医薬組成物およびその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 9/127 20060101AFI20220106BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20220106BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220106BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20220106BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20220106BHJP
A61K 47/04 20060101ALI20220106BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20220106BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20220106BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/403 20060101ALI20220106BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/137 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/4704 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/4245 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/426 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/397 20060101ALI20220106BHJP
【ＦＩ】
A61K9/127
A61P37/06
A61K45/00
A61K47/24
A61K47/34
A61K47/04
A61K47/26
A61K47/36
A61K47/28
A61K31/403
A61P37/02
A61K31/137
A61K31/4704
A61K31/4245
A61K31/426
A61K31/397
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021521380
(86)(22)【出願日】2019-10-15
(85)【翻訳文提出日】2021-06-10
(86)【国際出願番号】 US2019056186
(87)【国際公開番号】W WO2020081485
(87)【国際公開日】2020-04-23
(31)【優先権主張番号】62/746,810
(32)【優先日】2018-10-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521158749
【氏名又は名称】タイワン リポソーム カンパニー リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】521158750
【氏名又は名称】ティーエルシー バイオファーマシューティカルズ， インク
(74)【代理人】
【識別番号】110000671
【氏名又は名称】八田国際特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】ホン，キールン
(72)【発明者】
【氏名】グワスニー，ウォルター
(72)【発明者】
【氏名】ファン，ジョナサン
(72)【発明者】
【氏名】カオ，ハオ－ウェン
(72)【発明者】
【氏名】リン，イ－ユ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076BB11
4C076BB15
4C076BB16
4C076CC03
4C076CC07
4C076DD24
4C076DD26
4C076DD63
4C076DD63F
4C076DD67
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4C076DD70F
4C076EE23
4C076EE23F
4C076EE30
4C076FF16
4C076FF31
4C084AA17
4C084MA24
4C084MA66
4C084NA12
4C084ZB071
4C084ZB072
4C084ZB081
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC02
4C086BC10
4C086BC29
4C086BC71
4C086BC82
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA24
4C086MA66
4C086NA12
4C086ZB07
4C086ZB08
4C206AA01
4C206AA02
4C206FA08
4C206KA01
4C206KA14
4C206MA03
4C206MA05
4C206MA44
4C206MA86
4C206NA12
4C206ZB07
4C206ZB08
(57)【要約】
本発明は、薬物対脂質比が高く、カプセル化効率が高い、少なくとも１つのリポソームおよび自己免疫疾患を治療するための治療剤を含む医薬組成物に関する。本医薬組成物は、薬物動態プロファイルを改善し、治療薬の放出を持続させる。また、本明細書に開示される医薬組成物を使用して自己免疫疾患を治療するための方法も提供される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）二重層膜を含む少なくとも１つのリポソームであって、前記二重層膜が少なくとも１つの脂質を含む、リポソーム、（ｂ）捕捉剤、および
（ｃ）免疫調節剤
を含み、前記脂質に対する免疫調節剤のモル比が約０．２より高い、医薬組成物。
【請求項2】
前記リポソームの平均粒径が約５０ｎｍ～２０μｍである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記二重層膜がコレステロールをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記二重層膜中の前記コレステロールのモルパーセントが約２０～約５５％である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記脂質が第１の脂質と第２の脂質との混合物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記第１の脂質がＰＣ、ＨＳＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＰＳＰＣおよびそれらの組み合わせから実質的になる群より選択され、前記第２の脂質がホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、ＤＰＰＧおよびそれらの組み合わせから実質的になる群より選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記二重層膜中の前記第１の脂質のモルパーセントが約４０～７９．９％であり、前記二重層膜中の前記第２の脂質のモルパーセントが約０．１～１０％である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記捕捉剤が、スクロースオクタ硫酸トリエチルアンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸デキストランおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記スクロースオクタ硫酸トリエチルアンモニウムの濃度が約１０～２００ｍＭである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記硫酸アンモニウムの濃度が約１００～６００ｍＭである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記リン酸アンモニウムの濃度が約１００～６００ｍＭである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記硫酸デキストランの濃度が約０．１～２０ｍＭである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記免疫調節剤がスフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体アゴニストである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体アゴニストが、エトラシモド、フィンゴリモド、ラキニモド、オザニモド、ポネシモド、シポニモドおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記免疫調節剤が、５０％より高いカプセル化効率で前記リポソーム中にカプセル化される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項16】
自己免疫疾患を治療するための方法であって、医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、前記医薬組成物は、
（ａ）二重層膜を含む少なくとも１つのリポソームであって、前記二重層膜が少なくとも１つの脂質を含む、リポソーム、
（ｂ）捕捉剤、および
（ｃ）免疫調節剤
を含み、前記脂質に対する前記免疫調節剤のモル比が約０．２より高い、自己免疫疾患を治療するための方法。
【請求項17】
前記免疫調節剤の半減期が、自己免疫疾患を治療するための遊離治療剤の半減期と比較して、少なくとも約２倍延長される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記医薬組成物が、少なくとも１週間に１回、２週間に１回、または１ヶ月に１回投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
前記医薬組成物が、皮膚注射によって投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項20】
前記皮膚注射が、皮内(intracutaneous)、皮下(subcutaneous)、皮下(subdermal)、皮内(intradermal)または筋肉内経路を含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１７日に出願された、米国特許出願第６２／７４６，８１０号の利益を主張し、その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年１０月１７日に出願された、米国特許出願第６２／７４６，８１０号の利益を主張し、その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
技術分野
本発明は、少なくとも１つの捕捉剤を使用して、高い薬物対脂質比(drug to lipid ratio)および高いカプセル化効率を有する免疫調節剤を含む徐放性医薬組成物に関する。請求項に規定される医薬組成物の高い薬物対脂質比、高いカプセル化効率および徐放性プロファイルは、薬物投与の頻度を減少させ、患者のコンプライアンスを増加させ、治療結果を改善する。
本発明は、少なくとも１つの捕捉剤を使用して、高い薬物対脂質比(drug to lipid ratio)および高いカプセル化効率を有する免疫調節剤を含む徐放性医薬組成物に関する。請求項に規定される医薬組成物の高い薬物対脂質比、高いカプセル化効率および徐放性プロファイルは、薬物投与の頻度を減少させ、患者のコンプライアンスを増加させ、治療結果を改善する。
【背景技術】
【0003】
フィンゴリモドなどのスフィンゴシン－１－リン酸(Sphingosine-1-phosphate)（Ｓ１Ｐ）受容体アゴニストは、再発型の多発性硬化症（ＲＭＳ）を含む多発性硬化症などの自己免疫疾患の治療で承認されており、Ｓ１Ｐ受容体アゴニストは経口投与され、主要な懸念はＳ１Ｐ受容体のアゴニスト作用(agonism)が徐脈をもたらす可能性があることである。この潜在的に致死的な心臓事象を考慮して、フィンゴリモドの最初の投与を受けた患者は、投与後少なくとも６時間、医療従事者によってモニターされる（ＧＩＬＥＮＹＡ（登録商標）（フィンゴリモド）添付文書）。心臓の有害事象を最小限に抑え、薬剤耐性を改善し、用量調節の必要性を軽減する製剤を開発することは有益であろう。さらに、Ｓ１Ｐ受容体アゴニストの用量または投与頻度を減少させるための徐放性製剤が有利であろう。
【0004】
薬物送達システムとしてのリポソームは成功した技術であり、種々の薬物に対し徐放性製剤を開発するために広く使用されている。リポソームへの薬物充填(loading)は受動的に（薬物はリポソーム形成の間にカプセル化される）または遠隔／能動的に（リポソーム形成の間に膜貫通ｐＨ勾配またはイオン勾配を作製し、続いてリポソーム形成の後に勾配から生成される駆動力によって薬物を充填する）のいずれかで達成され得る（米国特許第５，１９２，５４９号および同第５，９３９，０９６号を参照のこと）。リポソームへの薬物充填の一般的な方法は文献において十分に実証されているが、少数の治療剤しか、高いカプセル化効率でリポソームに充填されなかった。以下に制限されないが、治療薬の物理的および化学的特性、例えば、親水性／疎水性特性、解離定数、溶解度および分配係数、脂質組成、捕捉剤、反応溶媒、および粒子径などの、多くの因子がリポソームのカプセル化効率に影響を及ぼし得る（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１４； １１１（６）： ２２８３－２２８８ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｐｏｓ． ２０１５； ４３ （８）：１２３６－４５）。
【0005】
Ｍａｏらは、受動充填法(passive loading method)および溶剤注入法(solvent injection method)を用いた、卵ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（Ｎａｎｏｍｅｄ． ２０１４； １０（２）： ３９３－４００）を含むリポソームフィンゴリモド製剤を開示している。リポソームは直径１５７．５ｎｍであり、カプセル化効率は８５．２％であり、最終薬物対脂質比（Ｄ／Ｌ）は０．１１であった。残念ながら、受動的充填は、リポソーム中にカプセル化され得る薬物の量を制限する。
【0006】
免疫調節剤の投薬頻度を減少させ、治療結果を改善するために、高い薬物対脂質比および高いカプセル化効率を有する徐放性製剤に対する満たされていない必要性が依然として存在する。本発明は、この必要性および他の必要性に対処する。
【発明の概要】
【0007】
発明の概要
一実施形態では、（ａ）二重層膜を含む少なくとも１つのリポソーム；（ｂ）捕捉剤；および（ｃ）免疫調節剤を含み、二重層膜が少なくとも１つの脂質を含み、免疫調節剤対脂質のモル比(molar ratio of the immunomodulating agent to the lipid)が約０．２以上である、徐放性医薬組成物が提供される。
一実施形態では、（ａ）二重層膜を含む少なくとも１つのリポソーム；（ｂ）捕捉剤；および（ｃ）免疫調節剤を含み、二重層膜が少なくとも１つの脂質を含み、免疫調節剤対脂質のモル比(molar ratio of the immunomodulating agent to the lipid)が約０．２以上である、徐放性医薬組成物が提供される。
【0008】
本発明の別の実施形態によれば、自己免疫疾患を治療するための方法であって、本明細書に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を有する方法が提供される。
【0009】
また、自己免疫疾患を治療するための薬剤の製造における、本明細書に記載の医薬組成物の使用が提供される。
【0010】
さらに、本明細書に記載の医薬組成物の治療有効量を含む、対象の自己免疫疾患を治療するための薬剤が提供される。
【0011】
本特許で使用される用語「発明(invention)」、「本発明(the invention)」、「本発明(this invention)」、および「本発明(the present invention)」は、本特許および以下の特許請求の範囲の主題のすべてを広く指すことを意図している。これらの用語を含む記述は、本明細書に記載される主題を限定するものではなく、以下の特許請求の範囲の意味または範囲を限定するものでもないと理解されるべきである。この特許によってカバーされる本発明の実施形態は、この概要ではなく、以下の特許請求の範囲によって定義される。この概要は本発明の様々な態様の高レベルの概要であり、以下の詳細な説明のセクションでさらに説明される概念のいくつかを紹介する。この概要は、請求項に規定される主題の重要なまたは必須の特徴を特定することを意図するものではなく、請求項に規定される主題の範囲を決定するために単独で使用されることを意図するものでもない。主題は、明細書全体、任意のまたはすべての図面、および各請求項の適切な部分を参照することによって理解されるべきである。
【0012】
本発明の本質および利点は明細書および図面の残りの部分を参照することにより一層理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【0013】
図面の簡単な説明
【発明を実施するための形態】
【0014】
発明の詳細な説明
上記および本開示全体を通して使用される、下記用語は、本明細書中で特記しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈で明確に示されない限り、複数形を含む。
上記および本開示全体を通して使用される、下記用語は、本明細書中で特記しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈で明確に示されない限り、複数形を含む。
【0015】
本明細書中のすべての数字は「約」によって修飾されたものとして理解され得る。本明細書中で使用される、「約」という用語は、特定の値の±１０％の範囲を指す。
【0016】
本明細書中で使用される、「有効量」は、自己免疫疾患の症状および／または徴候を減少させるなどの、免疫調節効果を引き出す医薬組成物の用量をいう。「有効量」および「治療有効量」という用語は互換的に使用される。
【0017】
「免疫調節剤」および「自己免疫疾患を処置するための治療剤」という用語は、互換的に使用され、自己免疫疾患の症状および／または徴候を減少させる免疫調節効果を引き出す治療剤を指す。
【0018】
本明細書で使用される「治療する(treat)」、「治療される(treated)」、または「治療(treatment)」という用語は、予防的な(preventative)（例えば、予防的な(prophylactic)）、緩和的な(palliative)、および治癒的な(curative)方法、使用、または結果を含む。「治療(treatment)」または「治療(treatments)」という用語は、組成物または薬剤を指すこともできる。本出願全体を通して、治療とは、自己免疫疾患の１以上の症状もしくは徴候を軽減もしくは遅延させる方法または当技術分野で公知の技術によって検出される際に自己免疫疾患の完全な改善を意味する。自己免疫疾患およびその症状（赤血球沈降速度、Ｃ反応性タンパク質濃度、抗環状シトルリン化ペプチド抗体、抗核抗体、およびＸ線を含むが、これらに限定されない）を評価するために、当技術分野で認識されている方法が利用可能である。したがって、軽減は、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはその間の任意の量の軽減であり得る。
【0019】
本明細書中で使用される、「自己免疫疾患」という用語は、以下に限定されないが、橋本甲状腺炎リウマチ性関節炎(Hashimoto’s thyroiditis rheumatoid arthritis)、全身性および皮膚型のエリテマトーデス、潰瘍性大腸炎および多発性硬化症を含む疾患群であり、ここで、個人の免疫系はそれ自身を異物として認識し、身体自身の組織構成成分に対する体液性または細胞性免疫応答を介して正常組織の機能喪失または破壊を引き起こす。一実施形態では、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデスなどの全身性である。他の実施形態では、自己免疫は、甲状腺炎などの局在性または器官特異的である。
【0020】
「対象(subject)」という用語は、自己免疫疾患を有するかまたは有する疑いのある脊椎動物を指すことができる。対象には、霊長類などの哺乳動物、より好ましくはヒトなどのすべての温血動物が含まれる。非ヒト霊長類も同様に対象である。対象という用語は、ネコ、イヌなどの飼いならされた動物、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）および実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、アレチネズミ、モルモットなど）を含む。したがって、獣医学的使用および医学的製剤が、本明細書中に包含される。
【0021】
リポソーム
本明細書中で使用される用語「リポソーム(liposome)」、「リポソームの(liposomal)」および関連する用語は、小胞を形成する１つ以上の二重層膜によって外部媒体から隔離された内部水性空間を特徴とする。特定の実施形態において、リポソームの内部水性空間は、トリグリセリド、非水相（油相）、水－油エマルジョンまたは非水相を含む他の混合物などの、中性脂質を実質的に含まない。リポソームの非限定的な例には、５０～２０μｍ、５０～４５０ｎｍ、５０～４００ｎｍ、５０～３５０ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２５０ｎｍ、５０～２００ｎｍ、１００～５００ｎｍ、１００～４５０ｎｍ、１００～４００ｎｍ、１００～３５０ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２５０ｎｍまたは１００～２００ｎｍの平均直径範囲を有する小さな単ラメラ小胞（ＳＵＶ）、大きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ）、および多ラメラ小胞（ＭＬＶ）が含まれる。
本明細書中で使用される用語「リポソーム(liposome)」、「リポソームの(liposomal)」および関連する用語は、小胞を形成する１つ以上の二重層膜によって外部媒体から隔離された内部水性空間を特徴とする。特定の実施形態において、リポソームの内部水性空間は、トリグリセリド、非水相（油相）、水－油エマルジョンまたは非水相を含む他の混合物などの、中性脂質を実質的に含まない。リポソームの非限定的な例には、５０～２０μｍ、５０～４５０ｎｍ、５０～４００ｎｍ、５０～３５０ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２５０ｎｍ、５０～２００ｎｍ、１００～５００ｎｍ、１００～４５０ｎｍ、１００～４００ｎｍ、１００～３５０ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２５０ｎｍまたは１００～２００ｎｍの平均直径範囲を有する小さな単ラメラ小胞（ＳＵＶ）、大きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ）、および多ラメラ小胞（ＭＬＶ）が含まれる。
【0022】
リポソームの二重層膜は、典型的には少なくとも１つの脂質、すなわち、空間的に分離された疎水性および親水性ドメインを含む合成または天然起源の両親媒性分子によって形成される。脂質の例としては、リン脂質、ジグリセリド、ジ脂肪族（dialiphatic）糖脂質等のジ脂肪族鎖脂質(dialiphatic chain lipids)、スフィンゴミエリンおよびスフィンゴ糖脂質のような単一脂質、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。本開示によるリン脂質の例としては、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＳＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル１－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ナトリウム塩）（ＤＭＰＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ナトリウム塩）（ＤＰＰＧ）、１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ナトリウム塩）（ＰＳＰＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ナトリウム塩）（ＤＳＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）（ＤＭＰＳ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）（ＤＰＰＳ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）（ＤＳＰＳ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ナトリウム塩）（ＤＭＰＡ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ナトリウム塩）（ＤＰＰＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ナトリウム塩）（ＤＳＰＡ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ナトリウム塩）（ＤＯＰＡ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール）－１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ミオ－イノシトール）（アンモニウム塩）（ＤＰＰＩ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホイノシトール（アンモニウム塩）（ＤＳＰＩ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ミオ－イノシトール）（アンモニウム塩）（ＤＯＰＩ）、カルジオリピン、Ｌ－α－ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、およびＬ－α－ホスファチジルエタノールアミン（ＥＰＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、脂質は、１つ以上の上記脂質の脂質混合物、または１つ以上の上記脂質と１つ以上の上記に列挙されていない他の脂質、膜安定化剤もしくは酸化防止剤との混合物である。
【0023】
特定の実施形態では、リポソームの二重層膜中の脂質のモルパーセントは、約８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、またはそれらの間の任意の値もしくは値の範囲（例えば、約４５～８０％、約４５～７５％、約４５～７０％、約４５～６５％、約５０～８０％、約５０～７５％、約５０～７０％、約５０～６５％）である。
【0024】
いくつかの実施形態では、脂質が第１の脂質と第２の脂質との混合物を含む。いくつかの実施形態では、第１の脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ＨＳＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＰＳＰＣおよびそれらの組み合わせから実質的に構成される群より選択され、第２の脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、ＤＰＰＧおよびそれらの組み合わせから実質的に構成される群より選択される。他の実施形態では、リポソーム中の第１の脂質のモルパーセントは、約７９．９、７９．５、７９．１、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０以下、またはそれらの間の任意の値または値の範囲（例えば、約４０～７９．９％、約４０～７９．５％、約４０～７９．１％、約４０～７５％、約４０～７０％、約４０～６５％、約４５～７９．９％、約４５～７９．５％、約４５～７９．１％、約４５～７５％、約４５～７０％、約４５～６５％、約４５～６０％、約５０～７９．９％、約５０～７９．５％、約５０～７９．１％、約５０～７５％、約５０～７０％、約５０～６５％、約５０～６０％）であり、リポソーム中の第２の脂質のモルパーセントは、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０．１以下、またはその間の任意の値または値の範囲（例えば、約０．１～１０％、約０．１～９％、約０．１～８％、約０．１～７％、約０．１～６％、約０．１～５％、約０．５～１０％、約０．５～９％、約０．５～８％、約０．５～７％、約０．５～６％または約０．５～５％）である。
【0025】
リポソームの二重層膜は、約５５モルパーセント未満のステロイド、好ましくはコレステロールをさらに含む。特定の実施形態では、二重層膜中のステロイド（コレステロールなど）のパーセントは、約２０～５５％、約２０～５０％、約２０～４５％、約２０～４０％、約２５～５５％、約２５～５０％、約２５～４５％、または約２５～４０％である。
【0026】
具体的な一実施形態では、リポソームの二重層膜中の脂質およびコレステロールのモルパーセントは、約４５～８０％：２０～５５％または５０～７５％：２５～５０％である。他の具体的な実施形態では、二重層膜中の第１の脂質、第２の脂質およびコレステロールのモルパーセントは、約４０～７９．５％：０．５～１０％：２０～５５％、４０～７９．９％：０．１％～１０％：２０～５５％、４０～７５％：０．１～１０％：２０～５０％または４５～７０％：０．１～１０％：２５～４５％であり、第１の脂質は、ＨＳＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣまたはそれらの組み合わせであり、第２の脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＰＰＧまたはそれらの組み合わせである。
【0027】
リモート充填(Remote Loading)
本明細書で使用される「リモート充填(remote loading)」という用語は、多原子イオン勾配(polyatomic ion-gradient)によって、治療薬を外部媒体からリポソームの二重層膜を横切って内部水性空間に移動させる手順を含む薬物充填方法である。このような勾配は、少なくとも１つの多原子イオンを捕捉剤としてリポソームの内部水性空間にカプセル化し、カラム分離、透析または遠心分離などの公知の技術によって、リポソームの外部媒体をより低い多原子イオン濃度の外部媒体、例えば、純水、スクロース溶液および生理食塩水などに置き換えることによって生成される。多原子イオン勾配は、リポソームの内部水性空間と外部媒体との間に生成され、治療薬をリポソームの内部水性空間に捕捉する。捕捉剤としての具体的な多原子イオンとしては、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、モリブデン酸塩、炭酸塩および硝酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な捕捉剤としては、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、モリブデン酸アンモニウム、スクロースオクタ硫酸アンモニウム(ammonium sucrose octasulfate)、スクロースオクタ硫酸トリエチルアンモニウム(triethylammonium sucrose octasulfate)、および硫酸デキストランが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「リモート充填(remote loading)」という用語は、多原子イオン勾配(polyatomic ion-gradient)によって、治療薬を外部媒体からリポソームの二重層膜を横切って内部水性空間に移動させる手順を含む薬物充填方法である。このような勾配は、少なくとも１つの多原子イオンを捕捉剤としてリポソームの内部水性空間にカプセル化し、カラム分離、透析または遠心分離などの公知の技術によって、リポソームの外部媒体をより低い多原子イオン濃度の外部媒体、例えば、純水、スクロース溶液および生理食塩水などに置き換えることによって生成される。多原子イオン勾配は、リポソームの内部水性空間と外部媒体との間に生成され、治療薬をリポソームの内部水性空間に捕捉する。捕捉剤としての具体的な多原子イオンとしては、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、モリブデン酸塩、炭酸塩および硝酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な捕捉剤としては、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、モリブデン酸アンモニウム、スクロースオクタ硫酸アンモニウム(ammonium sucrose octasulfate)、スクロースオクタ硫酸トリエチルアンモニウム(triethylammonium sucrose octasulfate)、および硫酸デキストランが挙げられるが、これらに限定されない。
【0028】
一実施形態では、硫酸アンモニウムの濃度は、約１００～約６００ｍＭ、約１５０～約５００ｍＭまたは約２００～約４００ｍＭである。他の実施形態では、スクロースオクタ硫酸トリエチルアンモニウムの濃度は、約１０～約２００ｍＭまたは約５０～約１５０ｍＭである。さらなる他の実施形態では、リン酸アンモニウムの濃度は、約１００～約６００ｍＭ、約１５０～約５００ｍＭまたは約２００～約４００ｍＭである。さらなる他の実施形態では、硫酸デキストランの濃度は、約０．１～２０ｍＭまたは約１～１０ｍＭである。
【0029】
本発明によれば、捕捉剤をカプセル化するリポソームは、現在知られているかまたは後に開発される技術のいずれかによって調製することができる。例えば、ＭＬＶリポソームは、捕捉剤を含む所定の脂質組成物の水和脂質フィルム、噴霧乾燥粉末または凍結乾燥ケーキによって直接形成することができる；ＳＵＶリポソームおよびＬＵＶリポソームは、超音波処理、均質化、マイクロ流動化(microfluidization)または押出によってＭＬＶリポソームからサイズ調整する(sized)ことができる。
【0030】
医薬組成物
本発明は（ａ）二重層膜を含む少なくとも１つのリポソーム；（ｂ）捕捉剤；および（ｃ）免疫調節剤を含み、二重層膜が少なくとも１つの脂質を含み、免疫調節剤対脂質のモル比(molar ratio of the immunomodulating agent to the lipid)が約０．２以上である徐放性医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、治療薬対脂質のモル比(molar ratio of the therapeutic agent to the lipid)が約０．２以上約２０未満、約１５未満、約１０未満、約５未満、約４未満、約３未満または約２未満である。
本発明は（ａ）二重層膜を含む少なくとも１つのリポソーム；（ｂ）捕捉剤；および（ｃ）免疫調節剤を含み、二重層膜が少なくとも１つの脂質を含み、免疫調節剤対脂質のモル比(molar ratio of the immunomodulating agent to the lipid)が約０．２以上である徐放性医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、治療薬対脂質のモル比(molar ratio of the therapeutic agent to the lipid)が約０．２以上約２０未満、約１５未満、約１０未満、約５未満、約４未満、約３未満または約２未満である。
【0031】
一実施形態では、徐放性医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、ビヒクル、担体、活性成分のための媒体、防腐剤、凍結保護剤またはそれらの組み合わせをさらに含む。具体的な一実施形態では、医薬組成物中の二重層膜の重量パーセントは約０．１～１２％であり；医薬組成物中の捕捉剤の重量パーセントは約０．１～１０％であり；医薬組成物中の薬学的に許容される賦形剤（スクロース、ヒスチジン、塩化ナトリウムおよび超純水など）、希釈剤、ビヒクル、担体、活性成分のための媒体、防腐剤、凍結保護剤またはそれらの組み合わせの重量パーセントは約８０．０～９９．９％である。
【0032】
特定の実施形態において、自己免疫疾患を治療するための治療剤または免疫調節剤は、スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体アゴニスト(sphingosine-1-phosphate (S1P) receptor agonist)である。特定の実施形態では、免疫調節剤は、エトラシモド(etrasimod)、フィンゴリモド(fingolimod)、ラキニモド(laquinimod)、オザニモド(ozanimod)、ポネシモド(ponesimod)、シポニモド(siponimod)、およびそれらの組み合わせである。医薬組成物の徐放性プロファイルは免疫調節剤の半減期、治療濃度および作用期間を延長し、したがって、治療効力を持続させ、免疫調節剤の投薬量および／または投薬頻度を減少させる。
【0033】
一態様では、医薬組成物の徐放性プロファイルは、高い薬物カプセル化効率による。これらの製剤のカプセル化効率は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％である。
【0034】
他の態様では、医薬組成物の徐放性プロファイルは、より高い薬物対脂質モル比(drug to lipid molar ratio)による。具体的な一実施形態において、１つ以上の脂質に対する免疫調節剤のモル比(molar ratio of the immunomodulating agent to the one or more lipids)は、約０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４または０．３５以上から約２０、１５、１０、５または２未満、あるいは０．２から２０、０．２から１５、０．２から１０、０．２から５、０．２から２、０．３から２０、０．３から１５、０．３から１０、０．３から５または０．２から２である。
【0035】
さらなる他の態様では、免疫調節剤の半減期が遊離免疫調節剤(free immunomodulating agent)の半減期と比較して、少なくとも２倍延長される。
【0036】
医薬組成物は、皮下(subcutaneous)、皮下(subdermal)、皮内(intradermal)または筋肉内(intramuscular)経路などの注射に適するように製剤化される。
【0037】
本発明の医薬組成物の投与量は、実施形態に応じて当業者が決定することができる。単位用量または複数用量形態が包含され、各々は、特定の臨床設定において利点を提供する。本発明によれば、投与されるべき医薬組成物の実際の量は、治療される対象の年齢、体重、状態、および任意の既存の医学的状態に従って、ならびに医療専門家の裁量により変化することができる。
【0038】
一実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、免疫調節剤の有意な徐放性プロファイルを示す。例えば、本発明の医薬組成物は、ＦＤＡが承認したフィンゴリモド製剤の好ましい経口投与経路（ラットにおいて２１．０時間、ＧＩＬＥＮＹＡ（登録商標） 新薬物承認申請， Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．： ２２－５２７）と比較して、好ましい皮下投与経路（実施例５に開示されているような）を介してラットにおいてフィンゴリモドの半減期を９５．５時間にまで延長した。これらの医薬組成物は、フィンゴリモドの投薬頻度を減少させるために開発されている。
【0039】
本発明はまた、自己免疫疾患を治療するための方法を提供し、これは、本明細書に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。
【実施例】
【0040】
実施例
本発明の実施形態を以下の実施例によって説明するが、下記実施例はその範囲に限定を課すものとして決して解釈されるべきではない。それどころか、本明細書の説明を読んだ後、本発明の概念から逸脱することなく当業者にそれ自体を示唆し得る、様々な他の実施形態、修飾、およびそれらの同等物の対象となり得ることが明確に理解されるべきである。以下の実施例に記載される研究の間、特記しない限り、従来の手順に従った。
本発明の実施形態を以下の実施例によって説明するが、下記実施例はその範囲に限定を課すものとして決して解釈されるべきではない。それどころか、本明細書の説明を読んだ後、本発明の概念から逸脱することなく当業者にそれ自体を示唆し得る、様々な他の実施形態、修飾、およびそれらの同等物の対象となり得ることが明確に理解されるべきである。以下の実施例に記載される研究の間、特記しない限り、従来の手順に従った。
【0041】
実施例１ リポソームフィンゴリモド製剤の調製
空のリポソームを、脂質フィルム水和－押出法(lipid film hydration-extrusion method)によって調製した。ＨＳＰＣ、コレステロール、およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（モルパーセント ５９．５／３９．６／０．９）をクロロホルムに溶解し、ロータリーエバポレーター中で真空下で有機溶媒を除去することによって、薄い脂質フィルムを形成した。乾燥脂質フィルムを３００ｍＭ 硫酸アンモニウム中、６０℃で３０分間水和し、硫酸アンモニウムが水性コアにカプセル化された空のリポソームを形成した。液体窒素と６０℃の水との間の６回の凍結融解サイクルの後、空のリポソームを、続いて、０．２μｍの孔径を有するポリカーボネートフィルター膜を通して１０回押し出した。カプセル化されていない硫酸アンモニウムを、９．４％スクロース溶液に対する透析によって除去した。
空のリポソームを、脂質フィルム水和－押出法(lipid film hydration-extrusion method)によって調製した。ＨＳＰＣ、コレステロール、およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（モルパーセント ５９．５／３９．６／０．９）をクロロホルムに溶解し、ロータリーエバポレーター中で真空下で有機溶媒を除去することによって、薄い脂質フィルムを形成した。乾燥脂質フィルムを３００ｍＭ 硫酸アンモニウム中、６０℃で３０分間水和し、硫酸アンモニウムが水性コアにカプセル化された空のリポソームを形成した。液体窒素と６０℃の水との間の６回の凍結融解サイクルの後、空のリポソームを、続いて、０．２μｍの孔径を有するポリカーボネートフィルター膜を通して１０回押し出した。カプセル化されていない硫酸アンモニウムを、９．４％スクロース溶液に対する透析によって除去した。
【0042】
７．８ｍｇ／ｍＬのフィンゴリモド塩酸塩（ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ）、２０．７ｍＭの空のリポソームの脂質および５０ｍＭ ヒスチジン緩衝液（ｐＨ ７）を含む反応混合物を６０℃で１５分間インキュベートした。カプセル化されていないフィンゴリモド塩酸塩を、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ Ｇ－５０ファインゲル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または９．４％スクロース溶液に対する透析袋（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ）によって分離して、リポソームフィンゴリモド製剤(liposomal fingolimod formulation)を得た。リポソームフィンゴリモド製剤のカプセル化されたフィンゴリモド塩酸塩および脂質の濃度を、紫外／可視（ＵＶ／Ｖｉｓ）分光光度計を用いて測定し、リポソームフィンゴリモド製剤の薬物対脂質モル比（Ｄ／Ｌ）を計算した。
【0043】
カプセル化効率は、フィンゴリモド塩酸塩の濃度を空のリポソームの脂質濃度で割ることによって計算された、反応混合物の公称Ｄ／Ｌと比較したフィンゴリモド塩酸塩カプセル化リポソームの薬物対脂質モル比（Ｄ／Ｌ）によって計算された。粒度分布は動的光散乱装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ９０， Ｍａｌｖｅｒｎ）により測定した。
【0044】
捕捉剤として３００ｍＭ硫酸アンモニウムを使用した場合、リポソームフィンゴリモド製剤は、最終Ｄ／Ｌが１．１であり、カプセル化効率が１００％である。リポソームの平均径は１６２ｎｍであった。
【0045】
実施例２ リポソームオザニモド製剤の調製
空のリポソームを、脂質フィルム水和－押出法によって調製した。ＨＳＰＣ、コレステロール、およびＤＰＰＧ（モルパーセント ５９．５／３９．６／０．９）をクロロホルムに溶解し、有機溶媒をロータリーエバポレーター中で真空下で除去することによって、薄い脂質フィルムを形成した。乾燥脂質フィルムを３００ｍＭ 硫酸アンモニウム中、６０℃で３０分間水和し、硫酸アンモニウムが水性コアにカプセル化された空のリポソームを形成した。液体窒素と６０℃の水との間の６回の凍結融解サイクルの後、空のリポソームを、続いて、０．２μｍの孔径を有するポリカーボネートフィルター膜を通して１０回押し出した。カプセル化されていない硫酸アンモニウムを、９．４％スクロース溶液に対する透析によって除去した。
空のリポソームを、脂質フィルム水和－押出法によって調製した。ＨＳＰＣ、コレステロール、およびＤＰＰＧ（モルパーセント ５９．５／３９．６／０．９）をクロロホルムに溶解し、有機溶媒をロータリーエバポレーター中で真空下で除去することによって、薄い脂質フィルムを形成した。乾燥脂質フィルムを３００ｍＭ 硫酸アンモニウム中、６０℃で３０分間水和し、硫酸アンモニウムが水性コアにカプセル化された空のリポソームを形成した。液体窒素と６０℃の水との間の６回の凍結融解サイクルの後、空のリポソームを、続いて、０．２μｍの孔径を有するポリカーボネートフィルター膜を通して１０回押し出した。カプセル化されていない硫酸アンモニウムを、９．４％スクロース溶液に対する透析によって除去した。
【0046】
７．２ｍｇ／ｍＬのオザニモド（ＤＣ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、２０．６ｍＭの空のリポソームの脂質、および５０ｍＭ ヒスチジン緩衝液（ｐＨ ６．５）を含む反応混合物を、６０℃で１５分間インキュベートした。カプセル化されていないオザニモドを、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ Ｇ－５０ファインゲル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または９．４％スクロース溶液に対する透析袋（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ）によって分離して、リポソームオザニモド製剤を得た。リポソームオザニモド製剤のカプセル化されたオザニモドおよび脂質の濃度を、紫外／可視（ＵＶ／Ｖｉｓ）分光光度計を用いて測定し、リポソームオザニモド製剤の薬物対脂質モル比（Ｄ／Ｌ）を計算した。
【0047】
カプセル化効率は、オザニモドの濃度を空のリポソームの脂質濃度で割ることによって計算された、反応混合物の公称Ｄ／Ｌと比較したオザニモドカプセル化リポソームの薬物対脂質モル比（Ｄ／Ｌ）によって計算された。粒度分布は動的光散乱装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ９０， Ｍａｌｖｅｒｎ）により測定した。
【0048】
捕捉剤として３００ｍＭ硫酸アンモニウムを使用した場合、リポソームオザニモド製剤は、最終Ｄ／Ｌが０．８７であり、カプセル化効率が約１００％である。リポソームの平均径は１８６．７ｎｍであった。
【0049】
実施例３ 薬物充填プロファイルに対する異なる捕捉剤の効果
リポソーム製剤を、以下の捕捉剤：（１）７５ｍＭのスクロースオクタ硫酸トリエチルアンモニウム、（２）３００ｍＭの硫酸アンモニウム、（３）２００ｍＭのリン酸アンモニウム、および（４）７．０ｍＭの硫酸デキストランを用いて、実施例１に従って調製した。表１は、薬物充填(drug loading)に対する種々の捕捉剤の効果を示す。
リポソーム製剤を、以下の捕捉剤：（１）７５ｍＭのスクロースオクタ硫酸トリエチルアンモニウム、（２）３００ｍＭの硫酸アンモニウム、（３）２００ｍＭのリン酸アンモニウム、および（４）７．０ｍＭの硫酸デキストランを用いて、実施例１に従って調製した。表１は、薬物充填(drug loading)に対する種々の捕捉剤の効果を示す。
【0050】
【表1】
【0051】
実施例４ リポソームフィンゴリモドの持続放出プロファイル
インビトロ放出システムを準備するために、実施例１に従って調製した０．５ｍＬのリポソームフィンゴリモド製剤(liposomal fingolimod formulation)および０．５ｍＬの遊離フィンゴリモド塩酸塩(free fingolimod hydrochloride)を、それぞれ、０．５ｍＬのウシ胎仔血清と混合した。遊離フィンゴリモド／血清混合物およびリポソームフィンゴリモド／血清混合物を別々の透析バッグ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ（登録商標）６ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＷＣＯ ５０ｋＤａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ）に入れ、透析バッグの両端を密封した。各透析バッグを、５０ｍＬの遠心分離管内で０．０６Ｎ ＨＣｌを含有するｐＨ ７．４の１５ｍＬ ＰＢＳに浸漬し、３７±１℃の水浴でインキュベートした。インキュベーションしてから所定の時点（１、２、４、８および２４時間）で、１５ｍＬのＰＢＳからの０．５ｍＬのアリコートをサンプリングし、毎回０．５ｍＬの新鮮なＰＢＳを添加して、サンプリングアリコートを補充した。各時点でのサンプリングアリコートの薬物濃度を、ＨＰＬＣを使用して分析して、試験した製剤のインビトロ放出プロファイルを作成した。
インビトロ放出システムを準備するために、実施例１に従って調製した０．５ｍＬのリポソームフィンゴリモド製剤(liposomal fingolimod formulation)および０．５ｍＬの遊離フィンゴリモド塩酸塩(free fingolimod hydrochloride)を、それぞれ、０．５ｍＬのウシ胎仔血清と混合した。遊離フィンゴリモド／血清混合物およびリポソームフィンゴリモド／血清混合物を別々の透析バッグ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ（登録商標）６ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＷＣＯ ５０ｋＤａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ）に入れ、透析バッグの両端を密封した。各透析バッグを、５０ｍＬの遠心分離管内で０．０６Ｎ ＨＣｌを含有するｐＨ ７．４の１５ｍＬ ＰＢＳに浸漬し、３７±１℃の水浴でインキュベートした。インキュベーションしてから所定の時点（１、２、４、８および２４時間）で、１５ｍＬのＰＢＳからの０．５ｍＬのアリコートをサンプリングし、毎回０．５ｍＬの新鮮なＰＢＳを添加して、サンプリングアリコートを補充した。各時点でのサンプリングアリコートの薬物濃度を、ＨＰＬＣを使用して分析して、試験した製剤のインビトロ放出プロファイルを作成した。
【0052】
図１に示すように、遊離フィンゴリモドのほぼ８０％が４時間以内に透析袋を通って放出された。これに対して、２４時間にわたる透析袋を通るリポソームフィンゴリモド製剤の放出率（＜１０％）は、遊離薬物の放出率（＞８０％）よりも低かった。本発明のリポソームフィンゴリモド製剤の持続放出プロファイルから、持続薬物送達システムとしてのリポソームフィンゴリモド製剤の可能性が示される。
【0053】
実施例５ リポソームフィンゴリモドの薬物動態（ＰＫ）研究
７～８週齢の雌Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを用いて、リポソームフィンゴリモド製剤のインビボＰＫ評価を行った。ラットを、１２時間の明／１２時間の暗の概日周期で操作した保持室に収容し、水および食物を自由に摂取させた。
７～８週齢の雌Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを用いて、リポソームフィンゴリモド製剤のインビボＰＫ評価を行った。ラットを、１２時間の明／１２時間の暗の概日周期で操作した保持室に収容し、水および食物を自由に摂取させた。
【0054】
ラットを３群（各群のｎ＝４）に分け、第１群には、最終濃度２．００ｍｇ／ｍＬで５％ジメチルスルホキシドを含む９．４％スクロース溶液にフィンゴリモド塩酸塩を溶解することによって調製した、遊離フィンゴリモド塩酸塩５ｍｇ／ｋｇを静脈内（ＩＶ）注射で投与した。第２群には、実施例１に従って調製したリポソームフィンゴリモド製剤５ｍｇ／ｋｇを静脈内（ＩＶ）注射で投与した。第３群には、実施例１に従って調製したリポソームフィンゴリモド製剤５ｍｇ／ｋｇを皮下（ＳＣ）注射で投与した。血液サンプルを、注射してから５分、１５分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間で集めた。血漿サンプルを遠心分離によって得、－８０℃で凍結させておき、ＰＫＳｏｌｖｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ．２０１０；９９（３）：３０６－３１４）の非コンパートメント分析モデルを用いて分析した。３つのフィンゴリモド製剤のＰＫパラメータを表２に要約する。
【0055】
表２から、ＩＶリポソームフィンゴリモド群におけるフィンゴリモドの半減期（ｔ１／２）がＩＶ遊離フィンゴリモド群のそれと類似していたことが示される。ＩＶ投与された遊離フィンゴリモドおよびリポソームフィンゴリモドは、ＩＶ投与の約７０時間後に循環から排除され、両方のフィンゴリモド形態で約５半減期(approximately 5 half-lives)であった。ＳＣリポソームフィンゴリモド群のＣｍａｘはＩＶ投与された遊離フィンゴリモドおよびリポソームフィンゴリモドのいずれにも見られたＣｍａｘよりも小さく、皮下投与されたリポソームフィンゴリモドの半減期（ｔ１／２）はＩＶ投与された遊離フィンゴリモドおよびリポソームフィンゴリモドの半減期に比べて、有意に長かった。測定した曲線下面積（ＡＵＣ０－ｔ）と外挿曲線下面積（ＡＵＣ０－ｉｎｆ）との比から、皮下注射してから９６時間後にリポソームフィンゴリモド製剤から３９．９％のフィンゴリモドが放出されたのに対して、静脈内注射した遊離フィンゴリモドのＡＵＣ０－ｔ／ＡＵＣ０－ｉｎｆ比は注射してから９６時間後に約１００％であったことが示される。
【0056】
表２はさらに、ＳＣ注射された本発明のリポソームフィンゴリモド製剤の用量正規化(dose normalized)Ｃｍａｘ（Ｃｍａｘ／Ｄ）が４．８（ｎｇ／ｍＬ）／（ｍｇ／Ｋｇ）であることを示しており、これは、ＦＤＡ承認の経口投与フィンゴリモド（２０．４～３０（ｎｇ／ｍＬ）／（ｍｇ／Ｋｇ）の範囲）のそれと比較して有意に低いことを示す。同様に、ＳＣ注射された本発明のリポソームフィンゴリモド製剤のｔ１／２は９５．５時間であり、これは、ＦＤＡ承認の経口投与フィンゴリモドのそれ（ラットでは１３．６～２５．１時間）と比較して有意に長い。皮下投与された本発明のリポソームフィンゴリモド製剤は、ＦＤＡ承認のフィンゴリモド製剤の６分の１（１／６）～４分の１（１／４）のＣｍａｘ／Ｄを有するが、ｔ１／２はＦＤＡ承認のフィンゴリモド製剤のそれより３．８～７．０倍長い。
【0057】
【表2】
【0058】
表３は、ＩＶ注射した本発明のリポソームフィンゴリモド製剤およびＩＶ注射したＭａｏら（Ｎａｎｏｍｅｄ．２０１４； １０（２）：３９３－４００）のリポソームフィンゴリモド製剤のＰＫパラメータを示す。本発明のＣｍａｘおよびＡＵＣ０－ｉｎｆ値（リポソーム薬物対遊離薬物の比率）は、マオらのものより約４倍高い。さらに、本発明の見かけの分配容積（Ｖｄ）およびクリアランス（ＣＬ）値（リポソーム薬物対遊離薬物の比率）は、Ｍａｏらのものよりも有意に低い。これらの結果から、本発明のリポソームフィンゴリモド製剤がマオらのリポソーム製剤と比較して、循環中の薬物放出を持続させることが示される。
【0059】
【表3】
【図1】
【図2】
【国際調査報告】