特表 2022-505445 ＣＤ３８に結合する重鎖抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-14

(54)【発明の名称】ＣＤ３８に結合する重鎖抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20220106BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220106BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220106BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220106BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220106BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220106BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20220106BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20220106BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20220106BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20220106BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220106BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20220106BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220106BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220106BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20220106BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20220106BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20220106BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20220106BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20220106BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220106BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20220106BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20220106BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220106BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/19

C12N1/21

C12N1/15

C12N5/10

C12P21/08

C12P21/02 C

C07K16/28

C07K16/46

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61P1/00

A61P29/00

A61P35/00

A61P37/06

A61P29/00 101

A61P19/02

A61P17/00

A61P37/02

A61P9/10

A61P25/00

A61P9/00

A61P13/12

A61P43/00 121

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021521481

(86)(22)【出願日】2019-10-28

(85)【翻訳文提出日】2021-06-17

(86)【国際出願番号】 US2019058325

(87)【国際公開番号】W WO2020087065

(87)【国際公開日】2020-04-30

(31)【優先権主張番号】62/751,520

(32)【優先日】2018-10-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518452881

【氏名又は名称】テネオバイオ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ヴァン ショーテン， ウィム

(72)【発明者】

【氏名】クラーク， スターリン

(72)【発明者】

【氏名】ダン， ケビン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA01

4B064CA19

4B064CC24

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA14

4C085BB11

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

ＣＤ３８に結合するヒト重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂ（商標））などの結合化合物、ならびにかかる結合化合物を作製する方法、かかる結合化合物を含む医薬組成物を含む組成物、及びそれらの様々な使用が開示される。
【選択図】【図１１】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｃｄ３８上の第１のエピトープに結合親和性を有する第１のポリペプチドと、
Ｃｄ３８上の第２の重複しないエピトープに結合親和性を有する第２のポリペプチドと、を含む、二重特異性結合化合物。

【請求項2】

前記第１のポリペプチドが、ＣＤ３８上の前記第１のエピトープまたは前記第２のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の抗原結合ドメインを含み、かつ
（ｉ）配列番号１～５のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ１配列、及び／または
（ｉｉ）配列番号６～１２のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ２配列、及び／または
（ｉｉｉ）配列番号１３～１７のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ３配列を含む、請求項１に記載の二重特異性結合化合物。

【請求項3】

前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列が、ヒトフレームワーク内に存在する、請求項２に記載の二重特異性結合化合物。

【請求項4】

（ｉ）配列番号１～５のいずれか１つを含むＣＤＲ１配列、及び／または
（ｉｉ）配列番号６～１２のいずれか１つを含むＣＤＲ２配列、及び／または
（ｉｉｉ）配列番号１３～１７のいずれか１つを含むＣＤＲ３配列を含む、請求項２または３に記載の二重特異性結合化合物。

【請求項5】

（ｉ）配列番号１～５のいずれか１つを含むＣＤＲ１配列、及び
（ｉｉ）配列番号６～１２のいずれか１つを含むＣＤＲ２配列、及び
（ｉｉｉ）配列番号１３～１７のいずれか１つを含むＣＤＲ３配列を含む、請求項４に記載の二重特異性結合化合物。

【請求項6】

配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列、または
配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列、または
配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１７のＣＤＲ３配列を含む、請求項５に記載の二重特異性結合化合物。

【請求項7】

ＣＤ３８上の前記第１のエピトープに結合親和性を有する前記重鎖抗体の前記抗原結合ドメインが、配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含み、
ＣＤ３８上の前記第２のエピトープに結合親和性を有する前記重鎖抗体の前記抗原結合ドメインが、配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列を含む、請求項６に記載の二重特異性結合化合物。

【請求項8】

配列番号１８～２８の配列のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変領域配列を含む、請求項２～７のいずれか１項に記載の二重特異性結合化合物。

【請求項9】

配列番号１８～２８からなる群から選択される可変領域配列を含む、請求項８に記載の二重特異性結合化合物。

【請求項10】

ＣＤ３８上の前記第１のエピトープに結合親和性を有する前記重鎖抗体の前記抗原結合ドメインが、配列番号１８の可変領域配列を含み、
ＣＤ３８上の前記第２のエピトープに結合親和性を有する前記重鎖抗体の前記抗原結合ドメインが、配列番号２３の可変領域配列をふくむ、請求項９に記載の二重特異性結合化合物。

【請求項11】

ＣＤ３８に結合する重鎖抗体であって、
（ｉ）配列番号１～５のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ１配列、及び／または
（ｉｉ）配列番号６～１２のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ２配列、及び／または
（ｉｉｉ）配列番号１３～１７のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有する抗原結合ドメインを含む、重鎖抗体。

【請求項12】

前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列がヒトフレームワーク内に存在する、請求項１１に記載の重鎖抗体。

【請求項13】

ＣＨ１配列を含まない重鎖定常領域配列をさらに含む、請求項１１に記載の重鎖抗体。

【請求項14】

（ａ）配列番号１～５のいずれか１つを含むＣＤＲ１配列、及び／または
（ｂ）配列番号６～１２のいずれか１つを含むＣＤＲ２配列、及び／または
（ｃ） 配列番号１３～１７のいずれか１つを含むＣＤＲ３配列を含む、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の重鎖抗体。

【請求項15】

（ａ）配列番号１～５のいずれか１つを含むＣＤＲ１配列、及び
（ｂ）配列番号６～１２のいずれか１つを含むＣＤＲ２配列、及び
（ｃ）配列番号１３～１７のいずれか１つを含むＣＤＲ３配列を含む、請求項１４に記載の重鎖抗体。

【請求項16】

配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列、または
配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列、または
配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１７のＣＤＲ３配列を含む、請求項１５に記載の重鎖抗体。

【請求項17】

配列番号１８～２８の配列のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変領域配列を含む、請求項１１～１６のいずれか１項に記載の重鎖抗体。

【請求項18】

配列番号１８～２８からなる群から選択される可変領域配列を含む、請求項１７の重鎖抗体。

【請求項19】

単一特異性である、請求項１１～１８のいずれか１項に記載の重鎖抗体。

【請求項20】

多重特異性である、請求項１１～１８のいずれか１項に記載の重鎖抗体。

【請求項21】

二重特異性である、請求項２０に記載の重鎖抗体。

【請求項22】

同じＣＤ３８タンパク質上の２つの異なるエピトープに結合親和性を有する、請求項２１に記載の重鎖抗体。

【請求項23】

前記２つの異なるエピトープが、重複しないエピトープである、請求項２２に記載の重鎖抗体。

【請求項24】

エフェクター細胞に結合親和性を有する、請求項２０に記載の重鎖抗体。

【請求項25】

Ｔ細胞抗原に結合親和性を有する、請求項２０に記載の重鎖抗体。

【請求項26】

ＣＤ３に結合親和性を有する、請求項２５に記載の重鎖抗体。

【請求項27】

ＣＡＲ－Ｔフォーマットである、請求項１１～２６のいずれか１項に記載の重鎖抗体。

【請求項28】

第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の重複しないＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する二重特異性結合化合物であって、
（ａ）前記第１のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する第１のポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む重鎖抗体の抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）ヒンジ領域の少なくとも一部と、
（ｉｉｉ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメインと、を含む、前記第１のポリペプチドと、
（ｂ） 前記第２のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する第２のポリペプチドであって、
（ｉ）（ａ）配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列を含む重鎖抗体の抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）ヒンジ領域の少なくとも一部と、
（ｉｉｉ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメインと、を含む、前記第２のポリペプチドと、
（ｃ） 前記第１のポリペプチドのＣＨ３ドメインと前記第２のポリペプチドのＣＨ３ドメインとの間の非対称的界面と、を含む、前記二重特異性結合化合物。

【請求項29】

ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、及びサイレンシングされたヒトＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選択されるＦｃ領域を含む、請求項２８に記載の二重特異性結合化合物。

【請求項30】

第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の重複しないＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する二重特異性結合化合物であって、それぞれが、
（ｉ）配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む、前記第１のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の第１の抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列を含む、前記第２のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の第２の抗原結合ドメインと、
（ｉｉｉ）ヒンジ領域の少なくとも一部と、
（ｉｖ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメインと、を含む２個の同一のポリペプチドを含む、前記二重特異性結合化合物。

【請求項31】

ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、及びサイレンシングされたヒトＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選択されるＦｃ領域を含む、請求項３０に記載の二重特異性結合化合物。

【請求項32】

第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の重複しないＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する二重特異性結合化合物であって、
（ａ）第１及び第２の重鎖ポリペプチドであって、それぞれが、
（ｉ）配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む、前記第１のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）ヒンジ領域の少なくとも一部と、
（iii）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメインと、を含む前記第１及び第２の重鎖ポリペプチドと、
（ｂ）第１及び第２の軽鎖ポリペプチドであって、それぞれが、
（ｉ）配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列を含む、前記第２のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）ＣＬドメインと、を含む前記第１及び第２の軽鎖ポリペプチドと、を含む、前記二重特異性結合化合物。

【請求項33】

ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、及びサイレンシングされたヒトＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選択されるＦｃ領域を含む、請求項３２に記載の二重特異性結合化合物。

【請求項34】

第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の重複しないＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する二重特異性結合化合物であって、
（ａ）ヒト重鎖フレームワーク内に配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む第１のポリペプチドサブユニットと、
（ｂ）ヒト軽鎖フレームワーク内に配列番号４９のＣＤＲ１配列、配列番号５０のＣＤＲ２配列、及び配列番号５１のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチドサブユニットであって、
前記第１のポリペプチドサブユニットと前記第２のポリペプチドサブユニットとは共に前記第１のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する、前記第１のポリペプチドサブユニット及び前記第２のポリペプチドサブユニットと、
（ｃ）一価または二価の形態で、ヒト重鎖フレームワーク内に配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列を含む重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む第３のポリペプチドサブユニットであって、
前記第２の重複しないＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する前記第３のポリペプチドサブユニットと、を含む、前記二重特異性結合化合物。

【請求項35】

前記第１のポリペプチドサブユニットが、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインをさらに含む、請求項３４に記載の二重特異的結合性化合物。

【請求項36】

前記第３のポリペプチドサブユニットが、ＣＨ１ドメインを含まず、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む定常領域配列をさらに含む、請求項３４または３５に記載の二重特異的結合性化合物。

【請求項37】

前記ヒト軽鎖フレームワークが、ヒトκ軽鎖フレームワークまたはヒトλ軽鎖フレームワークである、請求項３４～３６のいずれか１項に記載の二重特異性結合化合物。

【請求項38】

前記第２のポリペプチドサブユニットがさらにＣＬドメインを含む、請求項３４～３７のいずれか１項に記載の二重特異的結合性化合物。

【請求項39】

ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、及びサイレンシングされたヒトＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選択されるＦｃ領域を含む、請求項３４～３８のいずれか１項に記載の二重特異性結合化合物。

【請求項40】

前記第１のポリペプチドサブユニットの前記ＣＨ３ドメインと前記第３のポリペプチドサブユニットの前記ＣＨ３ドメインとの間に非対称的界面を含む、請求項３４～３９のいずれか１項に記載の二重特異的結合性化合物。

【請求項41】

第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の重複しないＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する二重特異性結合化合物であって、
（ａ）配列番号４６の配列を含む第１の重鎖ポリペプチドと、
（ｂ）配列番号４８の配列を含む第１の軽鎖ポリペプチドと、
（ｃ）配列番号４７の配列を含む第２の重鎖ポリペプチドと、を含む、前記二重特異性結合化合物。

【請求項42】

請求項１～４１のいずれか１項に記載の結合化合物または重鎖抗体を含む、医薬組成物。

【請求項43】

ＣＤ３８の発現を特徴とする疾患を治療するための方法であって、前記疾患を有する対象に請求項１～４１のいずれか１項に記載の結合化合物もしくは重鎖抗体、または請求項４２に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。

【請求項44】

前記疾患が、ＣＤ３８の加水分解酵素酵素活性によって特徴付けられる、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記疾患が、大腸炎である、請求項４３に記載の方法。

【請求項46】

前記疾患が、多発性骨髄腫（ＭＭ）である、請求項４３に記載の方法。

【請求項47】

前記疾患が、自己免疫疾患である、請求項４３に記載の方法。

【請求項48】

前記疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）である、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記疾患が、尋常性天疱瘡（ＰＶ）である、請求項４７に記載の方法。

【請求項50】

前記疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、請求項４７に記載の方法。

【請求項51】

前記疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性強皮症または線維症である、請求項４７に記載の方法。

【請求項52】

前記疾患が、虚血性損傷である、請求項４３に記載の方法。

【請求項53】

前記虚血性損傷が、虚血性脳損傷、虚血性心臓損傷、虚血性胃腸損傷、または虚血性腎臓損傷である、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

ＣＤ３８に結合する第２の抗体を前記対象に投与することをさらに含む、請求項４３～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

ＣＤ３８に結合する前記第２の抗体が、イサツキシマブまたはダラツムマブである、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

請求項１～４１のいずれか１項に記載の結合化合物または重鎖抗体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項57】

請求項５６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項58】

請求項５７に記載のベクターを含む細胞。

【請求項59】

前記結合化合物または前記重鎖抗体の発現を許容する条件下で請求項５８に記載の細胞を増殖させることと、前記細胞及び／または前記細胞を増殖させた細胞培養培地から前記結合化合物または前記重鎖抗体を単離することと、を含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載の結合化合物または重鎖抗体を生産する方法。

【請求項60】

ＵｎｉＲａｔ動物をＣＤ３８タンパク質で免疫することと、ＣＤ３８タンパク質結合重鎖配列を同定することと、を含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載の結合化合物または重鎖抗体を製造する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、本明細書にその開示内容の全容を参照により援用するところの２０１８年１０月２６日出願の米国特許仮出願第６２／７５１，５２０号の出願日に対する優先権の利益を主張するものである。

【0002】

本発明は、ＣＤ３８に結合するヒト重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂｓ（商標））などの結合化合物に関する。本発明の態様は、抗ＣＤ３８重鎖抗体、ＣＤ３８上の重複しないエピトープを標的とする、抗ＣＤ３８重鎖抗体の相乗的組み合わせを含む組み合わせ、ＣＤ３８上の複数の重複しないエピトープに対して結合特異性を有する多重特異性抗ＣＤ３８重鎖抗体、ならびにかかる結合化合物を製造する方法、かかる結合化合物を含む医薬組成物を含む組成物、及びそれらの様々な用途に関する。

【背景技術】

【0003】

ＣＤ３８エクト酵素
ＣＤ３８エクト酵素は、細胞外コンパートメントの膜の外側にその触媒部位を有する膜タンパク質である。この細胞表面タンパク質は多くの機能を促進し、免疫細胞、内皮細胞、神経組織細胞などの広範な細胞に見られる。

【0004】

ＣＤ３８は、ＡＤＰリボシルシクラーゼ／サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼ１としても知られ、エクト酵素活性を有する１回貫通ＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＣＤ３８は、ＮＡＤ（Ｐ）を基質として用い、サイクリックＡＤＰリボース（ｃＡＤＰＲ）、ＡＤＰリボース（ＡＤＰＲ）、ニコチン酸アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＡＤＰ）、ニコチン酸（ＮＡ）、ＡＤＰリボース－２’－リン酸（ＡＤＰＲＰ）などのいくつかの生成物の形成を触媒する（例えば、Ｈ． Ｃ． Ｌｅｅ， Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．， ２００６， １２： ３１７－３２３を参照）。ＣＤ３８は、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を基質として用い、これをニコチンアミドとＲ５Ｐに変換することもできる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｏｆ ａｎ ＮＡＤ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ， ｈｕｍａｎ ＣＤ３８．”Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １５（１０）：１０６８－７８）。

【0005】

ＣＤ３８は主として、形質細胞、活性化エフェクターＴ細胞、抗原提示細胞、肺の平滑筋細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病細胞、Ｔ細胞リンパ腫細胞、乳がん細胞、骨髄由来サプレッサー細胞、Ｂ調節細胞、及びＴ調節細胞などの免疫細胞で発現する。免疫細胞上のＣＤ３８は、内皮細胞及び他の細胞系統によって発現されるＣＤ３１ ／ ＰＥＣＡＭ－１と相互作用する。この相互作用は、白血球の増殖、遊走、Ｔ細胞の活性化、及び単球由来ＤＣの成熟を促進する。

【0006】

ＣＤ３８に結合する抗体は、例えば、Ｄｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ２０１４， ２０（１７）：４５７４－８３及び米国特許第８，１５３，７６５号、同第８，２６３，７４６号、同第８，３６２，２１１号、同第８，９２６，９６９号、同第９，１８７，５６５号、同第９，１９３，７９９号、同第９，２４９，２２６；及び同第９，６７６，８６９号に記載されている。

【0007】

ヒトＣＤ３８に特異的な抗体であるダラツムマブは、多発性骨髄腫の治療用に２０１５年にヒトでの使用が承認された（Ｓｈａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１７，６６（６）：６９７－７０３））。ＣＤ３８に対する別の抗体であるイサツキシマブ（ＳＡＲ６５０９８４）は、多発性骨髄腫の治療用に臨床試験中である。（例えば、Ｄｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃｅｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２０１４， ２０（１７）：４５７４－８３；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ２０１５， １２６：５０９；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ２０１７， １２９：３２９４－３３０３を参照）。これらの抗体は、強力な補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、及び腫瘍細胞の間接アポトーシスを誘導する。イサツキシマブはまた、ＣＤ３８のシクラーゼ及びヒドロラーゼ酵素活性を遮断し、腫瘍細胞の直接アポトーシスを誘導する。

【0008】

抗体によるタンパク質のアロステリック調節の例は、ヒト成長ホルモン、インテグリン、及びベータグラクトシダーゼである（Ｌ．Ｐ．Ｒｏｇｕｉｎ ＆ Ｌ．Ａ．Ｒｅｔｅｇｕｉ，２００３，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５８（４）：３８７－３９４）。これらの例は、異なるエピトープを標的とする単一の抗体によるリガンド－受容体相互作用の調節を示すものである。単一分子上の２つのエピトープを標的とする二重特異性抗体の一例として、ｃ－ＭＥＴまたは肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）に対するものがある（ＤａＳｉｌｖａ，Ｊ．，Ａｂｓｔｒａｃｔ ３４：Ａ ＭＥＴ ｘ ＭＥＴ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ＭＥＴ－ａｄｄｉｃｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．ＡＡＣＲ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ２０１７；Ａｐｒｉｌ １－５，２０１７；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）。

【0009】

重鎖抗体
従来のＩｇＧ抗体では、重鎖と軽鎖との会合は、軽鎖定常領域と重鎖のＣＨ１定常ドメインとの間の疎水性相互作用に一部依っている。重鎖のフレームワーク２（ＦＲ２）及びフレームワーク４（ＦＲ４）領域には、重鎖と軽鎖の間のこの疎水性相互作用にやはり寄与するさらなる残基が存在する。

【0010】

ただし、ラクダ（ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマを含むラクダ亜目 ）の血清には、Ｈ鎖のペアのみで構成される主要なタイプの抗体（重鎖単独抗体、重鎖抗体、またはＵｎｉＡｂｓ（商標））が含まれていることが知られている。ラクダ科（ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）、フタコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）、ラマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）、グアナコ（Ｌａｍａ ｇｕａｎａｃｏ）、アルパカ（Ｌａｍａ ａｌｐａｃａ）及びビクーニャ（Ｌａｍａ ｖｉｃｕｇｎａ））のＵｎｉＡｂｓ（商標）は、１個の可変ドメイン（ＶＨＨ）、ヒンジ領域、及び２個の定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）からなる固有の構造を有しており、２個の定常ドメインは古典的な抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインと高度な相同性を有している。これらのＵｎｉＡｂｓ（商標）は、定常領域の第１のドメイン（ＣＨ１）を欠いており、これはゲノム中に存在するがｍＲＮＡプロセシングの間にスプライスされる。ＣＨ１ドメインがないことは、このドメインが軽鎖の定常ドメインの固定位置であることから、ＵｎｉＡｂｓ（商標）に軽鎖がないことを説明する。こうしたＵｎｉＡｂｓ（商標）は、従来の抗体、またはそのフラグメントに由来する３つのＣＤＲによって抗原結合特異性及び高い親和性を与えるように自然に進化したものである（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２００１；Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７４：２７７－３０２；Ｒｅｖｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ５：１１１－１２４）。サメなどの軟骨魚類も、ＩｇＮＡＲと呼ばれる異なるタイプの免疫グロブリンを進化させており、これは、軽鎖のポリペプチド鎖を欠き、全体が重鎖で構成されている。ＩｇＮＡＲ分子は、分子工学によって操作して単一の重鎖ポリペプチドの可変ドメイン（ｖＮＡＲ）を生成することができる（Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３－３５５４（２００３）；Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５５，１８７－１９７（２００４）；Ｄｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０，２５－３３（２００３））。

【0011】

軽鎖を欠く重鎖単独抗体が抗原に結合する能力は、１９６０年代に確立されている（Ｊａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５－４１９５）。軽鎖から物理的に分離された重鎖免疫グロブリンは、四量体抗体と比較して抗原結合活性の８０％を維持していた。Ｓｉｔｉａ ｅｔ ａｌ.（１９９０） Ｃｅｌｌ，６０，７８１－７９０は、再構成後のマウスμ遺伝子からのＣＨ１ドメインを除去することによって、哺乳動物細胞培養中で軽鎖を欠く重鎖単独抗体が産生されることを示している。産生された抗体は、ＶＨの結合特異性及びエフェクター機能を保持していた。

【0012】

免疫によって様々な抗原に対する高い特異性と親和性を有する重鎖抗体を生成することが可能であり（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４３１，３７－４６ （１９９９））、また、ＶＨＨ部分は、容易に酵母にクローニングして発現させることができる（Ｆｒｅｎｋｅｎ， Ｌ．Ｇ .Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８，１１－２１（２０００））。それらの発現、溶解度及び安定性のレベルは、古典的なＦ（ａｂ）またはＦｖフラグメントのものより有意に高い（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，５２１－５２６（１９９７））。

【0013】

λ（ラムダ）軽（Ｌ）鎖遺伝子座及び／またはλ及びκ（カッパ）Ｌ鎖遺伝子座が機能的にサイレンシングされたマウス、及びそのようなマウスによって産生される抗体が、米国特許第７，５４１，５１３号及び同第８，３６７，８８８号に記載されている 。マウス及びラットにおける重鎖単独抗体の組換え産生については、例えば、ＷＯ２００６００８５４８号、米国特許出願公開第２０１００１２２３５８号；Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１０９（１），９３－１０１；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；２００６，２６（５）：３７７－９０；及びＺｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００７， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；２０４（１３）： ３２７１－３２８３に報告されている。ジンクフィンガーヌクレアーゼの胚マイクロインジェクションによるノックアウトラットの作製については、Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５（５９３９）：４３３に記載されている。可溶性の重鎖単独抗体及びそのような抗体を産生する異種重鎖遺伝子座を有するトランスジェニックげっ歯類は、米国特許第８，８８３，１５０号及び同第３６５，６５５号に記載されている。結合（ターゲティング）ドメインとしてのシングルドメイン抗体を含むＣＡＲＴ－Ｔ構造が、例えば、Ｉｒｉ－Ｓｏｆｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１７：２６３０－２６４１ ａｎｄ Ｊａｍｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１８４０：３７８-３８６．０ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１７：２６３０－２６４１及びＪａｍｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１８４０：３７８－３８６．０に記載されている。

【発明の概要】

【0014】

本発明の態様は、エクト酵素上の第１のエピトープに結合親和性を有する第１のポリペプチドと、エクト酵素上の第２の重複しないエピトープに結合親和性を有する第２のポリペプチドと、を含む二重特異性結合化合物を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、第１のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、第２のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２のポリペプチドはそれぞれ、ヒンジ領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２のポリペプチドはそれぞれ、少なくとも１つのＣＨドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＨドメインは、ＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＨドメインは、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＨドメインは、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ４ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＨドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域は、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＣＨドメインは、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域は、サイレンシングされたヒトＩｇＧ４のＦｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＣＨドメインは、ＣＨ１ドメインを含まない。いくつかの実施形態において、非対称的界面が、第１と第２のポリペプチドとのＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４ドメインの間に存在する。

【0015】

いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、第１のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の第１の抗原結合ドメインと、第２のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の第２の抗原結合ドメインとを含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、第１のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の第１の抗原結合ドメインと、第２のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の第２の抗原結合ドメインとを含む。いくつかの実施形態において、第１と第２の抗原結合ドメインとは、ポリペプチドリンカーによって連結される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドリンカーは、配列番号４５のアミノ酸配列からなる。

【0016】

いくつかの実施形態において、二重特異性結合化合物は、それぞれが、第１のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む第１及び第２の重鎖ポリペプチドと、それぞれが、第２のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む第１及び第２の軽鎖ポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の軽鎖ポリペプチドはそれぞれ、ＣＬドメインを含む。

【0017】

いくつかの実施形態において、エクト酵素はＣＤ３８である。

【0018】

本発明の態様は、ＣＤ３８に結合する重鎖抗体であって、（ｉ）配列番号１～５のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ１配列、及び／または（ｉｉ）配列番号６～１２のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ２配列、及び／または（ｉｉｉ）配列番号１３～１７のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ３配列を含む抗原結合ドメインを含む、重鎖抗体を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、ヒトフレームワーク内に存在する。いくつかの実施形態において、重鎖抗体は、ＣＨ１配列を含まない重鎖定常領域配列をさらに含む。

【0019】

いくつかの実施形態において、重鎖抗体は、配列番号１８～２８の配列のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変領域を含む。いくつかの実施形態において、重鎖抗体は、配列番号１８～２８からなる群から選択される可変領域配列を含む。いくつかの実施形態において、重鎖抗体は、単一特異性である。いくつかの実施形態において、重鎖抗体は、多重特異性である。いくつかの実施形態において、重鎖抗体は、二重特異性である。いくつかの実施形態において、重鎖単独抗体は、同じＣＤ３８タンパク質上の２つの異なるエピトープに結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、２つの異なるエピトープは、重複しないエピトープである。いくつかの実施形態において、重鎖抗体は、エフェクター細胞に結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、重鎖抗体は、Ｔ細胞抗原に結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、重鎖抗体は、ＣＤ３に結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、重鎖抗体は、ＣＡＲ－Ｔフォーマットである。

【0020】

本発明の態様には、本明細書に記載される結合化合物または重鎖抗体を含む医薬組成物が含まれる。

【0021】

本発明の態様には、本明細書に記載される結合化合物または重鎖抗体と、ＣＤ３８に結合する第２の抗体とを含む治療的組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３８に結合する第２の抗体は、イサツキシマブまたはダラツミマブである。

【0022】

本発明の態様は、ＣＤ３８の発現を特徴とする疾患を治療するための方法であって、前記疾患を有する対象に本明細書に記載される結合化合物もしくは重鎖抗体、医薬組成物、及び／または治療的組み合わせを投与することを含む方法を含む。いくつかの実施形態において、疾患は、ＣＤ３８の加水分解酵素の酵素活性によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、疾患は、大腸炎である。いくつかの実施形態において、疾患は、多発性骨髄腫（ＭＭ）である。いくつかの実施形態において、疾患は、自己免疫疾患である。いくつかの実施形態において、疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）である。いくつかの実施形態において、疾患は、尋常性天疱瘡（ＰＶ）である。いくつかの実施形態において、疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。いくつかの実施形態において、疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性強皮症または線維症である。いくつかの実施形態において、疾患は、虚血性損傷である。いくつかの実施形態において、虚血性損傷は、虚血性脳損傷、虚血性心臓損傷、虚血性胃腸損傷、または虚血性腎臓損傷である。いくつかの実施形態において、方法は、ＣＤ３８に結合する第２の抗体を対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３８に結合する第２の抗体は、イサツキシマブまたはダラツミマブである。

【0023】

これらの態様及びさらなる態様は、実施例を含む、本開示の残りの部分でさらに説明される。

【0024】

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】パネルＡ～Ｅは、Ｆ１１ファミリーの各抗ＣＤ３８結合化合物について、ＣＤＲ配列、可変領域配列、Ｖ遺伝子及びＪ遺伝子情報、ＣＤ３８加水分解酵素活性阻害率（％）、ならびに細胞結合のＭＦＩデータを提供する。

【図2】パネルＡ～Ｄは、Ｆ１２ファミリーの各抗ＣＤ３８結合化合物について、ＣＤＲ配列、可変領域配列、Ｖ遺伝子及びＪ遺伝子情報、ＣＤ３８加水分解酵素活性阻害率（％）、ならびに細胞結合のＭＦＩデータを提供する。

【図3】パネルＡ～Ｂは、Ｆ１３ファミリーの各抗ＣＤ３８結合化合物について、ＣＤＲ配列、可変領域配列、Ｖ遺伝子及びＪ遺伝子情報、ＣＤ３８加水分解酵素活性阻害率（％）、ならびに細胞結合のＭＦＩデータを提供する。

【図4】本出願におけるさらなるアミノ酸配列の配列情報を示す。

【図5】本出願におけるさらなるアミノ酸配列の配列情報を示す。

【図6】示された結合化合物の濃度の関数としての細胞結合データを示すグラフを示す。

【図7】示された結合化合物の濃度の関数としての細胞ベースの加水分解酵素活性を示すグラフを示す。

【図8】二価のＵｎｉＡｂ（商標）によるＣＤ３８の加水分解酵素活性の酵素阻害を示すグラフを示す。

【図9】ＵｎｉＡｂ（商標）のＣＤ３８＿Ｆ１３ＡまたはＣＤ３８＿Ｆ１３Ｂのいずれかとイサツキシマブとの混合物によるＣＤ３８の加水分解活性の酵素阻害を示すグラフを示す。

【図10】本発明の実施形態による結合化合物により誘導されたＤａｕｄｉ細胞の直接的細胞毒性を示すグラフを示す。

【図11】本発明の実施形態による２種類の二価（パネルＣ及びＤ）及び２種類の四価（パネルＡ及びＢ）ＵｎｉＡｂ（商標）のフォーマットの模式図を示す。

【図12】ＣＨＯ細胞上で発現させたヒトＣＤ３８の加水分解酵素活性の、図１１に示される四価のＵｎｉＡｂ（商標）による酵素阻害を示すグラフを示す。

【図13】各ＵｎｉＡｂとイサツキシマブとの混合物の阻害を示すグラフを示す。

【図14】各ＵｎｉＡｂの混合物によるＣＤ３８の加水分解酵素活性の阻害を示すグラフを示す。

【図15】各ＵｎｉＡｂの混合物によるＣＤ３８の加水分解酵素活性の阻害を示す別のグラフを示す。

【図16】図１１に示されるような本発明の実施形態による２種類の四価の二重特異性結合化合物に対する細胞ベースの加水分解酵素活性を示すグラフを示す。

【図17】本発明の実施形態による異なる結合化合物について細胞ベースの加水分解酵素活性を示すグラフを示す。

【図18】本発明の実施形態による結合化合物の異なる活性を要約した表形式のデータを示す。

【図19】パネルＡ及びＢは、それぞれ、Ｄａｕｄｉ細胞及びＲａｍｏｓ細胞について結合化合物の関数としての細胞内ＮＡＤ ＋濃度を示すグラフを示す。

【図20】パネルＡ～Ｃは、Ｔ細胞増殖アッセイ及びＩＦＮγ産生アッセイの結果を示すグラフを示す。

【図21】本発明の実施形態による異なる結合化合物について結合化合物の濃度の関数としてのＣＤ３８シクラーゼ活性を示すグラフを示す。

【図22】結合化合物の濃度の関数として３種類の異なる細胞株におけるオンターゲットの細胞結合活性を示すグラフを示す。

【図23】結合化合物の濃度の関数として４種類の異なる細胞株におけるオフターゲットの細胞結合活性を示すグラフを示す。

【図24】パネルＡ及びＢは、それぞれ、Ｄａｕｄｉ細胞株及びＲａｍｏｓ細胞株について結合化合物の関数としての細胞細胞生存率（％）を示すグラフを示す。パネルＣは、表形式でデータを示す。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明の実施に当たっては、特に断らない限り、当該技術分野の技能の範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を用いる。かかる技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）、“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１９９４）、“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．，１９８８）、“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）、Ｈａｒｌｏｗ，Ｌａｎｅ ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．Ｉ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）、及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；（１９８８）などの文献に完全に説明されている。

【0027】

ある値の範囲が与えられる場合、文脈上、そうでない旨が明らかに示されないかぎり、下限値の単位の１／１０までの値、その範囲の上限値と下限値との間のそれぞれの間の値、及びその記載された範囲内の他のすべての記載された値または間の値は、本発明に包含される点を理解されたい。これらのより狭い範囲の上限値及び下限値は、そのより狭い範囲に独立して含まれてよく、記載される範囲内のすべての具体的に除外された範囲を除き、本発明にやはり包含される。記載される範囲が一方または両方の限界値を含む場合、これらの含まれる限界値の一方または両方を除外した範囲もまた、本発明に含まれる。

【0028】

特に明記しない限り、抗体残基は、カバット（Ｋａｂａｔ）の番号付けシステムに従って番号付けされる（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））。

【0029】

以下の説明では、本発明のより完全な理解を与えるために、多くの具体的な詳細を記載する。しかしながら、本発明がこれらの具体的な詳細の１つ以上を欠いても実施され得る点は、当業者には明らかであろう。他の例では、本発明を曖昧にすることを回避するため、当業者には周知の特徴及び手順は記載していない。

【0030】

特許出願及び公報を含む、本開示の全体を通じて引用されるすべての参考文献をその全容にわたって参照により本明細書に援用するものである。

【0031】

Ｉ．定義
「～を含む」とは、記載された要素が組成物／方法／キットにおいて必要であるが、特許請求の範囲内において他の要素が組成物／方法／キットなどを形成するために含まれてもよいことを意味する。

【0032】

「～から本質的になる 」とは、記載される組成物または方法の範囲の、本発明の基本的かつ新規な特徴（複数可）に実質的に影響しない特定された材料または工程への限定を意味する。

【0033】

「～からなる」とは、特許請求の範囲において特定されていない要素、工程、または成分の、組成物、方法、またはキットからの除外を意味する。

【0034】

本明細書で互換可能に使用される「結合化合物」及び「結合組成物」なる用語は、１つ以上の結合標的に結合親和性を有する分子実体を指す。本発明の実施形態による結合化合物としては、これらに限定されるものではないが、抗体、抗体の抗原結合ドメイン、抗体の抗原結合フラグメント、抗体様分子、重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂ（商標））、リガンド、受容体が挙げられる。

【0035】

本明細書における「抗体」なる用語は広義の意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示す限りにおいて、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単量体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、重鎖単独抗体、三本鎖抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ナノボディなどを含み、抗体フラグメントを含む（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０：４８５４－４８６１）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラ、または他の種に由来するものであってよい。

【0036】

抗体なる用語は、完全長の重鎖、完全長の軽鎖、インタクトな免疫グロブリン分子、またはこれらのポリペプチドのいずれかの免疫学的活性部分、すなわち、対象とする標的の抗原またはその部分と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含むポリペプチドのことを指し、かかる標的には、これらに限定されるものではないが、がん細胞または自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞が含まれる。本明細書に開示される免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子のいずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、または、低下もしくは上昇したエフェクター細胞活性を与える改変されたＦｃ部分を有する操作されたサブクラスを含むサブクラスのものであってもよい。対象とする抗体の軽鎖は、カッパ軽鎖（Ｖκ）またはラムダ軽鎖（Ｖλ）とすることができる。免疫グロブリンはいずれの種に由来するものであってもよい。一態様において、免疫グロブリンは、大部分がヒト由来のものである。

【0037】

本明細書における抗体残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステム及びＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされている。Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、一般的に可変ドメイン内の残基（概ね、重鎖の１～１１３番目の残基）を指す場合に用いられる（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵ番号付けシステム」または「ＥＵインデックス」は、一般的に免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合に用いられる（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（前出）に報告されているＥＵインデックス）。「Ｋａｂａｔと同様のＥＵ指標」とは、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。本明細書では特に断らない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号の指定は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基の番号付けを意味する。本明細書で特に断らない限り、抗体の定常ドメイン内の残基番号の指定は、ＥＵ番号付けシステムによる残基の番号付けを意味する。

【0038】

本明細書で使用するところの「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す（すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在しうる可能な自然発生変異を除いて同じである）。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を標的としている。さらに、異なる決定基（エピトープ）を標的とする異なる抗体を通常含む通常のポリクローナル抗体調製物と異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を標的とする。例えば、本発明によるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって記載されたハイブリドーマ法によって作製するか、または、例えば組換えタンパク質産生法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって作製することもできる。

【0039】

抗体との関連で用いられる「可変」なる用語は、抗体の可変ドメインの特定の部分はその配列が抗体間で大きく異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性に与っていることを指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布していない。可変性は、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインのいずれにおいても超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主としてβシートの形態をとる４つのＦＲを含み、これらのＦＲは、βシート構造を接続し、場合によりその一部を形成するループを形成する３つの超可変領域によって連結されている。各鎖の超可変領域同士はＦＲによって互いに近接して保持されており、他の鎖の超可変領域とともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照）。定常ドメインは抗体の抗原との結合に直接関与していないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。

【0040】

本明細書で使用する場合、「超可変領域」なる用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、重鎖可変ドメインの残基３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））、及び／または重鎖可変ドメインの「超可変ループ」の残基２６～３２（Ｈ１）、５３～５５ （Ｈ２）及び９６～１０１（Ｈ３）由来の残基（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク領域」すなわち「ＦＲ」残基は、本明細書に定義される超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。

【0041】

例示的なＣＤＲの指定が本明細書に示されているが、当業者には、配列のばらつきに基づく、最も広く用いられているＫａｂａｔの定義を含むＣＤＲの多くの定義が広く用いられている点は理解されよう（“Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ａ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｂａｓｅｄ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ．”Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；４７：６９４－７００）。Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造的なループ領域の位置に基づいたものである（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ．”Ｎａｔｕｒｅ．１９８９；３４２：８７７－８８３）。対象とする代替的なＣＤＲ定義としては、これらに限定されるものではないが、本明細書に援用によってそれぞれを詳細に援用する、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，“Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ．” Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００１；３０９：６５７－６７０；Ｏｆｒａｎ ｅｔ ａｌ．“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ（ＣＤＲｓ） ｒｅｖｅａｌｓ ｐｅｃｕｌｉａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＣＤＲｓ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．”Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８１：６２３０－６２３５；Ａｌｍａｇｒｏ“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｚｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．” Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００４；１７：１３２－１４３；及びＰａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．” Ｆａｓｅｂ Ｊ．１９９５；９：１３３－１３９．により開示されるものが挙げられる。

【0042】

「重鎖単独抗体」及び「重鎖抗体」なる用語は本明細書では互換可能に使用され、最も広い意味で従来の抗体の軽鎖を欠いた抗体を指す。これらの用語には、具体的には、これらに限定されるものではないが、ＣＨ１ドメインを含まず、ＶＨ抗原結合ドメインとＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインと含むホモ二量体抗体；かかる抗体の機能性（抗原結合）変異体、可溶性ＶＨ変異体、１個の可変ドメイン（Ｖ－ＮＡＲ）と５個のＣ様定常ドメイン（Ｃ－ＮＡＲ）のホモ二量体を含むＩｇ－ＮＡＲ及びその機能性フラグメント；及び可溶性シングルドメイン抗体（ｓＵｎｉＤａｂｓ（商標））が含まれる。一実施形態において、重鎖単独抗体は、フレームワーク１、ＣＤＲ１、フレームワーク２、ＣＤＲ２、フレームワーク３、ＣＤＲ３、及びフレームワーク４からなる可変領域の抗原結合ドメインで構成される。別の実施形態において、重鎖単独抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、ならびにＣＨ２及びＣＨ３ドメインで構成され、ＣＨ１ドメインを欠く。別の実施形態において、重鎖単独抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、及びＣＨ２ドメインで構成される。さらなる実施形態において、重鎖単独抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、及びＣＨ３ドメインで構成される。ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインが切り詰められた重鎖単独抗体も本明細書に含まれる。さらなる実施形態において、重鎖は、抗原結合ドメインと、少なくとも１つのＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）ドメインとで構成されるが、ヒンジ領域は含まない。さらなる実施形態において、重鎖は、抗原結合ドメイン、少なくとも１つのＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）ドメイン、及びヒンジ領域の少なくとも一部で構成される。重鎖単独抗体は、２つの重鎖がジスルフィド結合しているか、そうでなければ、共有結合または非共有結合で互いに結合している二量体の形をとることができる。重鎖単独抗体はＩｇＧサブクラスに属するものでよいが、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥサブクラスなどの他のサブクラスに属する抗体も本明細書に含まれる。特定の実施形態において、重鎖抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、特にＩｇＧ１、またはＩｇＧ４サブタイプのものである。一実施形態において、重鎖抗体は、ＩｇＧ４サブタイプのものであり、１つ以上のＣＨドメインが、抗体のエフェクター機能を変化させるように改変されたものである。一実施形態において、重鎖抗体は、ＩｇＧ１サブタイプのものであり、１つ以上のＣＨドメインが、抗体のエフェクター機能を変化させるように改変されたものである。エフェクター機能を変化させるＣＨドメインの改変については、本明細書でさらに説明する。重鎖抗体の非限定的な例が、例えば、本明細書に参照によりその全容を援用するところのＷＯ２０１８／０３９１８０に記載されている。

【0043】

一実施形態において、本明細書の重鎖単独抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の結合（ターゲティング）ドメインとして用いられる。この定義には、ＵｎｉＡｂｓ（商標）と呼ばれるヒト免疫グロブリントランスジェニックラット（ＵｎｉＲａｔ（商標））によって産生されるヒト重鎖単独抗体が具体的に含まれる。ＵｎｉＡｂｓ（商標）の可変領域（ＶＨ）はＵｎｉＤａｂｓ（商標）と呼ばれ、多重特異性、高い効力及び長い半減期を有する新規治療薬を開発するため、Ｆｃ領域または血清アルブミンと結合させることができる汎用性の高い構成単位である。ホモ二量体のＵｎｉＡｂｓ（商標）は、軽鎖、したがってＶＬドメインを欠いているため、抗原は、単一のドメイン、すなわち重鎖抗体（ＶＨ）の重鎖の可変ドメイン（抗原結合ドメイン）によって認識される。

【0044】

本明細書で使用するところの「インタクトな抗体鎖」とは、完全長の可変領域と完全長の定常領域（Ｆｃ）とを含むものである。インタクトな「従来の」抗体とは、インタクトな軽鎖及びインタクトな重鎖、ならびに分泌型ＩｇＧの軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ＩｇＭまたはＩｇＡなどの他のアイソタイプは、異なるＣＨドメインを有し得る。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であってよい。インタクトな抗体は、１つ以上の「エフェクター機能」を有することができるが、エフェクター機能とは、抗体のＦｃ定常領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因し得る生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害作用、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、及び細胞表面受容体の発現低下が挙げられる。定常領域変異体には、エフェクタープロファイル、Fc受容体への結合などを変化させるものが含まれる。

【0045】

抗体及び様々な抗原結合タンパク質は、それらの重鎖のＦｃ（定常ドメイン）のアミノ酸配列に応じて、異なるクラスとして与えることができる。重鎖Ｆｃ領域には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つの主要な抗体クラスが存在し、そのうちのいくつかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２のようなサブクラス（アイソタイプ）にさらに分類することができる。抗体の異なるクラスに対応するＦｃ定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる場合がある。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元配置は周知のものである。Ｉｇの形態としては、ヒンジ改変またはヒンジなしの形態が含まれる（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３－４０９０；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：７２４６－７２５６；ＵＳ２００５／００４８５７２；ＵＳ２００４／０２２９３１０）。あらゆる脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプの一方に分類することができる。本発明の実施形態による抗体は、カッパ軽鎖配列またはラムダ軽鎖配列を含むことができる。

【0046】

「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を保有する。エフェクター機能の非限定的な例としては、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）などの発現低下などが挙げられる。こうしたエフェクター機能は、一般的に、Ｆｃ領域が、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦＣγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦＣγＲＩＩＢ２、ＦＣγＲＩＩＩＡ、ＦＣγＲＩＩＩＢ受容体などの受容体、及び低親和性のＦｃＲｎ受容体と相互作用することを必要とし、当該技術分野では周知の様々なアッセイを用いて評価することができる。「デッド」または「サイレンス」Ｆｃとは、例えば、血清半減期の延長に関して活性を維持するように変異されているが、高親和性Ｆｃ受容体を活性化しないか、またはＦｃ受容体に対する親和性が低下しているものである。

【0047】

「天然配列Ｆｃ領域」は、天然で見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域としては、例えば、天然配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）、天然配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域、及び天然配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ならびにそれらの天然に存在する変異型が含まれる。

【0048】

「変異型Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列と、少なくとも１つのアミノ酸の改変、好ましくは１つ以上のアミノ酸の置換（複数可）において異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異型Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域中または親ポリペプチドのＦｃ領域中に約１～約１０個のアミノ酸置換、好ましくは約１～約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書における変異型Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域及び／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは、それらと少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは、それらと少なくとも約９５％の相同性を有する。

【0049】

変異型Ｆｃ配列は、ＥＵインデックスの２３４位、２３５位、及び２３７位において、ＦｃγＲＩ結合を減少させるＣＨ２領域内の３個のアミノ酸置換を有することができる（Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：５６３を参照）。ＥＵインデックスの３３０位及び３３１位の補体Ｃ１ｑ結合部位内の２個のアミノ酸置換は補体結合を減少させる（Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７８：６６１（１９９３）及びＣａｎｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３（１９９１）を参照）。２３３～２３６位のヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２残基への置換、ならびに３２７位、３３０位、及び３３１位のＩｇＧ４残基への置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に減少させる（例えば、Ａｒｍｏｕｒ ＫＬ．ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３－２４；及びＳｈｉｅｌｄｓ ＲＬ．ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１－６０４）。ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ０１８５７）は、本明細書では配列番号４３として示される。ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ０１８６１）は、本明細書では配列番号４４として示される。サイレンスＩｇＧ１は、例えば、本明細書に参照によりその開示内容の全体を援用するところのＢｏｅｓｃｈ，Ａ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ Ｆｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．” ＭＡｂｓ，２０１４．６（４）：ｐ．９１５－２７に記載されている。

【0050】

これらに限定されるものではないが、ジスルフィド結合を形成することができる領域が欠失されているもの、または天然ＦｃのＮ末端の特定のアミノ酸残基が除去されているもの、またはメチオニン残基が付加されているものを含む、他のＦｃ変異体も可能である。したがって、いくつかの実施形態において、結合化合物の１つ以上のＦｃ部分は、ヒンジ領域にジスルフィド結合を除去するための１つ以上の変異を含むことができる。さらに別の実施形態において、Ｆｃのヒンジ領域を完全に除去することができる。さらに別の実施形態において、結合化合物は、Ｆｃ変異体を含むことができる。

【0051】

さらに、Ｆｃ変異体は、補体結合またはＦｃ受容体結合を引き起こすためのアミノ酸残基を置換（変異）、欠失、または付加することによってエフェクター機能を除去または大幅に低減させるように構築することもできる。例えば、限定するものではないが、欠失は、Ｃ１ｑ結合部位などの補体結合部位で行うことができる。免疫グロブリンＦｃフラグメントのそのような配列誘導体を調製するための技術が、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号及び同第ＷＯ９６／３２４７８号に開示されている。さらに、Ｆｃドメインは、リン酸化、硫酸化、アシル化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化などによって修飾することができる。

【0052】

Ｆｃは、天然の糖鎖、天然型と比較して増加した糖鎖、もしくは天然型と比較して減少した糖鎖を有する形態であってよく、または非グリコシル化または脱グリコシル化型であってよい。糖鎖の増加、減少、除去または他の改変は、化学的方法、酵素的方法などの当該技術分野では一般的な方法によって、または遺伝子操作された酸性細胞株で糖鎖を発現させることによって実現することができる。そのような細胞株は、グリコシル化酵素を天然に発現する微生物（例えば、ピキア・パストリス）及び哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）を含み得る。さらに、微生物または細胞は、グリコシル化酵素を発現するように操作することができ、またはグリコシル化酵素を発現できないようにすることができる（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：１４４１（２００６）；Ｋａｎｄａ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３０：３００（２００７）；Ｋｉｔａｇａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（２７）：１７８７２（１９９４）；Ｕｊｉｔａ－Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４（２３）：１３８４８（１９８９）；Ｉｍａｉ－Ｎｉｓｈｉｙａ，ｅｔ ａｌ，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：８４（２００７）；及びＷＯ０７／０５５９１６を参照されたい）。シアル化活性を変化させるように操作された細胞の一例として、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ１遺伝子がチャイニーズハムスター卵巣細胞及びｓｆ９細胞に遺伝子操作によって導入されている。したがって、これらの操作された細胞によって発現される抗体は、外因性の遺伝子産物によってシアル化される。複数の天然分子と比較して改変された量の糖残基を有するＦｃ分子を得るためのさらなる方法は、例えばレクチンアフィニティークロマトグラフィーを使用して、前記複数の分子をグリコシル化画分と非グリコシル化画分とに分離することを含む（例えば、ＷＯ０７／１１７５０５を参照されたい）。特定のグリコシル化部分の存在は、免疫グロブリンの機能を変化させることが示されている。例えば、Ｆｃ分子から糖鎖を除去すると、第１の補体成分Ｃ１のＣ１ｑ部分への結合親和性が急激に低下するとともに抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）が減少または喪失し、それによりインビボで不要な免疫応答を誘発することがない。さらなる重要な改変としては、シアル化及びフコシル化が挙げられ、ＩｇＧ中のシアル酸の存在が抗炎症活性との相関が示されている（例えば、Ｋａｎｅｋｏ，ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３：７６０（２００６）を参照）のに対して、ＩｇＧからのフコースの除去はＡＤＣＣ活性の増大につながる（例えば、Ｓｈｏｊ－Ｈｏｓａｋａ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４０：７７７（２００６）を参照）。

【0053】

代替的な実施形態では、本発明の結合化合物は、例えばＦｃγＲＩＩＩＡへの結合能力が増大し、また、ＡＤＣＣ活性が増大することによって、エフェクター機能が増大したＦｃ配列を有することができる。例えば、Ｎ結合型グリカンにＦｃのＡｓｎ－２９７で結合したフコースは、ＦｃとＦｃγＲＩＩＩＡとの相互作用を立体的に阻害し、糖鎖工学によってフコースを除去するとＦｃγＲＩＩＩＡへの結合が増大し、これにより、野生型ＩｇＧ１コントロールと比較してＡＤＣＣが５０倍以上高くなる。タンパク質工学により、ＩｇＧ１のＦｃ部分におけるアミノ酸変異によって、ＦｃγＲＩＩＩＡへのＦｃ結合の親和性を増大させる複数の変異体が作製されている。注目すべき点として、三重アラニン変異体Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａは、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合性の２倍の増加及びＡＤＣＣ機能を示す。Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（２Ｘ）及びＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ（３Ｘ）変異体は、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合親和性が有意に増大し、インビトロ及びインビボでのＡＤＣＣ能力が有意に増強されている。酵母ディスプレイによって同定された他のＦｃ変異体もマウス異種移植モデルにおいてＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を向上させ、腫瘍細胞殺滅の増大を示した。例えば、本明細書に参照により具体的に援用するＬｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＪＢＣ ２８９（６）：３５７１－９０を参照されたい。

【0054】

「Ｆｃ領域含有抗体」なる用語は、Ｆｃ領域を含む抗体を指す。Ｆｃ領域のＣ末端リシン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の精製時に、または抗体をコードする核酸の組換え操作にって除去することができる。したがって、本発明によるＦｃ領域を有する抗体は、Ｋ４４７を有する、または有さない抗体を含むことができる。

【0055】

一本鎖抗体を含む、非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含んだキメラ抗体（一本鎖抗体を含む）である。例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４，４８７－４９９；Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７－４９９；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，２６２３－２６３２；Ｗｅｒｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５７：４９８６－４９９５；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：３７９－３８９を参照されたい。さらなる詳細については、米国特許第５，２２５，５３９号、同第６，５４８，６４０号、同第６，９８２，３２１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第６，４０７，２１３号、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９を参照されたい。Ｍｅｔｈｏｄｓ １５７：４９８６－４９９５、及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：３７９－３８９。さらなる詳細については、米国特許第５，０５９，０５９号を参照されたい。米国特許第５，２２５，５３９号、同第６，５４８，６４０号、同第６，９８２，３２１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第６，４０７，２１３号、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２－５２５；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎｅｔ ａｌ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９を参照されたい。

【0056】

本発明の態様は、これらに限定されるものではないが、二重特異性、三重特異性などを含む多重特異性形態を有する結合化合物を含む。二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡＢ）、三重特異性抗体などでは多岐にわたる方法及びタンパク質形態が知られ、使用されている。

【0057】

本発明の態様は、一価または二価形態の重鎖のみの可変領域を含む抗体を含む。本明細書で使用するところの、重鎖単独の可変領域ドメインに関して使用される「一価形態」なる用語は、単一の結合部位を有する、１個のみの重鎖単独の可変領域ドメインが存在することを意味する（例えば、図１１、パネルＤ、図示された分子の右側を参照）。本明細書で使用するところの、重鎖単独の可変領域ドメインに関して使用される「二価形態」なる用語は、２個の重鎖単独の可変領域ドメインが存在し、リンカー配列によって連結されていることを意味する（例えば、図１１、パネルＢ、図示された分子の両側を参照）。リンカー配列の非限定的な例については本明細書でさらに検討するが、これらに限定されるものではないが、様々な長さのＧＳリンカー配列を含む。重鎖単独の可変領域が二価構成である場合、２つの重鎖のみの可変領域ドメインのそれぞれは、同じ抗原または異なる抗原（例えば、同じタンパク質上の異なるエピトープに対して、２つの異なるタンパク質に対して、など）に結合特異性を有することができる。しかしながら、特に断らない限り、「二価形態」として示される重鎖単独の可変領域は、リンカー配列によって連結された２個の同一の重鎖単独の可変領域ドメインを含むものとして理解され、２個の同一の重鎖単独の可変領域ドメインのそれぞれは同じ標的抗原に結合親和性を有する。

【0058】

多価人工抗体を製造するための様々な方法が、２つ以上の抗体の可変ドメインを組換えにより融合することによって開発されている。いくつかの実施形態において、ポリペプチド上の第１と第２の抗原結合ドメインが、ポリペプチドリンカーによって連結される。かかるポリペプチドリンカーの１つの非限定的な例として、４個のグリシン残基とそれに続く１個のセリン残基からなるアミノ酸配列を有し、その配列がｎ回繰り返されるＧＳリンカーがあり、ただし、ｎは１～約１０の範囲の整数、例えば２、３、４、５、６、７、８、または９である。かかるリンカーの非限定的な例としては、ＧＧＧＧＳ（配列番号２９）（ｎ＝１）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４５）（ｎ＝２）が挙げられる。他の適当なリンカーも使用することができ、例えば、本明細書に参照によりその開示内容の全体を援用するところのＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１３ Ｏｃｔｏｂｅｒ １５；６５（１０）：１３５７－６９に記載されている。

【0059】

「二重特異性三本鎖抗体様分子」または「ＴＣＡ」なる用語は、本明細書では、３個のポリペプチドサブユニットを含む、本質的になる、またはそれらからなる抗体様分子であって、そのうちの２個がモノクローナル抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖、または抗原結合領域と少なくとも１つのＣＨドメインとを含むそのような抗体鎖の機能性抗原結合フラグメントを含む、本質的になる、またはそれらからなる抗体様分子を指して用いられる。この重鎖/軽鎖のペアは、第１の抗原に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態において、ＴＣＡは、ヒトＶＨフレームワーク内に、配列番号４９のＣＤＲ１配列、配列番号５０のＣＤＲ２配列、及び配列番号５１のＣＤＲ３配列を含む軽鎖ポリペプチドサブユニットを含む。いくつかの実施形態において、ヒト軽鎖フレームワークは、ヒトカッパ（Ｖκ）またはヒトラムダ（Ｖλ）フレームワークである。いくつかの実施形態において、ＴＣＡは、配列番号５２の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む軽鎖ポリペプチドサブユニットを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＡは、配列番号５２の配列を含む軽鎖ポリペプチドサブユニットを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＡは、軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖ポリペプチドサブユニットを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖定常領域は、ヒトκ軽鎖定常領域またはヒトλ軽鎖定常領域である。いくつかの実施形態において、ＴＣＡは、配列番号４８の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む完全長の軽鎖を含む軽鎖ポリペプチドサブユニットを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＡは、配列番号４８の配列を含む軽鎖ポリペプチドサブユニットを含む。第３のポリペプチドサブユニットは、ＣＨ１ドメインを含まず、ＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分と、第２の抗原のエピトープまたは第１の抗原の異なるエピトープに結合する抗原結合ドメインであって、抗体重鎖または軽鎖の可変領域に由来するかまたは可変領域と配列同一性を有する抗原結合ドメインと、を含む重鎖単独抗体を含む、本質的になる、またはそれらからなる。かかる可変領域の部分は、Ｖ_Ｈ及び／またはＶ_Ｌ遺伝子セグメント、Ｄ及びＪ_Ｈ遺伝子セグメント、またはＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされてもよい。可変領域は、再編成されたＶ_ＨＤＪ_Ｈ、Ｖ_ＬＤＪ_Ｈ、Ｖ_ＨＪ_Ｌ、またはＶ_ＬＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされてもよい。

【0060】

ＴＣＡ結合化合物は、「重鎖単独抗体」または「重鎖抗体」または「重鎖ポリペプチド」を利用したものであり、これは、本明細書で使用される場合、重鎖定常領域ＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４を含むが、ＣＨ１ドメインは含まない一本鎖抗体を意味する。一実施形態において、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、ならびにＣＨ２及びＣＨ３ドメインで構成される。別の実施形態において、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、及びＣＨ２ドメインとで構成される。さらなる実施形態において、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、及びＣＨ３ドメインで構成される。ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインが切り詰められた重鎖抗体も本明細書に含まれる。さらなる実施形態において、重鎖は、抗原結合ドメインと、少なくとも１つのＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）ドメインとで構成されるが、ヒンジ領域は含まない。重鎖単独抗体は、２本の重鎖が互いにジスルフィド結合しているか、他の形で互いに共有結合または非共有結合により結合している二量体の形態であってよく、場合により、２つ以上のＣＨドメイン間にポリペプチド鎖間の適切な対合を促進する非対称的界面を有することができる。重鎖抗体はＩｇＧサブクラスに属するものでよいが、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥサブクラスなどの他のサブクラスに属する抗体も本明細書に含まれる。特定の実施形態において、重鎖抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、特にＩｇＧ１サブタイプまたはＩｇＧ４サブタイプのものである。ＴＣＡ結合化合物の非限定的な例は、例えば、本明細書に参照によりその開示内容の全体を援用するところのＷＯ２０１７／２２３１１１及びＷＯ２０１８／０５２５０３に記載されている。

【0061】

重鎖抗体は、ラクダ科動物、例えばラクダ及びラマによって産生されるＩｇＧ抗体の約４分の１を構成する（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．３６３，４４６－４４８（１９９３））。これらの抗体は２本の重鎖で形成されるが、軽鎖は含まない。結果として、可変抗原結合部分はＶＨＨドメインと呼ばれ、長さがわずかアミノ酸約１２０個である、天然に存在する最小のインタクトな抗原結合部位を表す（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２６２８５－２６２９０（２００１））。免疫によって様々な抗原に対する高い特異性と親和性を有する重鎖抗体を生成することが可能であり（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４３１，３７－４６ （１９９９））、また、ＶＨＨ部分は、容易に酵母にクローニングして発現させることができる（Ｆｒｅｎｋｅｎ， Ｌ．Ｇ ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８，１１－２１（２０００））。それらの発現、溶解度及び安定性のレベルは、古典的なＦ（ａｂ）又はＦｖフラグメントより有意に高い（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，５２１－５２６（１９９７））。サメもまた、ＶＮＡＲと呼ばれる、単一のＶＨ様ドメインをそれらの抗体内に有していることが示されている（Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ． Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３－３５５４（２００３）；Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５５，１８７－１９７（２００４）；Ｄｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０，２５－３３（２００３））。（Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３－３５５４（２００３）；Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５５，１８７－１９７（２００４）；Ｄｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０，２５－３３（２００３））。

【0062】

本明細書で使用するところの「界面」なる用語は、第２の重鎖定常領域内の１つ以上の「接触」アミノ酸残基（または他の非アミノ酸基）と相互作用する、第１の重鎖定常領域内の「接触」アミノ酸残基（または、例えば、炭水化物基などの他の非アミノ酸基）を含む領域を指して用いられる。

【0063】

「非対称的界面」なる用語は、第１及び第２の重鎖定常領域などの２つのポリペプチド鎖間、及び／または重鎖定常領域とその一致する軽鎖との間に形成される界面（上記で定義したような）を指して用いられ、第１及び第２の鎖内の接触残基は、相補的な接触残基を含み、設計が異なる。非対称的界面は、例えば、ノブ／ホール相互作用及び／または塩橋カップリング（電荷交換）及び／または当該技術分野では周知の他の方法によって形成することができる。

【0064】

「キャビティ」または「ホール」は、第２のポリペプチドの界面から凹んでおり、したがって、第１のポリペプチドの隣接する界面上の対応する特突起（「ノブ」）を収容する少なくとも１つのアミノ酸側鎖のことを指す。キャビティ（ホール）は、元の界面内に存在してもよく、または、合成により（例えば、界面の残基をコードする核酸を改変することによって）導入することができる。通常は、第２のポリペプチドの界面をコードする核酸がキャビティをコードするように改変される。これを実現するには、第２のポリペプチドの界面内の少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸を、元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有する少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基をコードするＤＮＡに置き換える。複数の元の残基及び対応する移入残基が存在し得る点は理解されよう。置き換えられる元の残基の数の上限は、第２のポリペプチドの界面内の残基の総数である。キャビティの形成に好ましい移入残基は、通常、天然に存在するアミノ酸残基であり、好ましくはアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）から選択される。最も好ましいアミノ酸残基は、セリン、アラニンまたはスレオニン、最も好ましくはアラニンである。一実施形態では、キャビティを形成するための元の残基は、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、またはトリプトファンなどの大きい側鎖体積を有する。非対称的界面は、例えば、本明細書に参照によりその全容を援用するところのＸｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ‘ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ’ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ”，ＭＡｂｓ．２０１５，７（１）：２３１－４２に詳細に記載されている。

【0065】

本明細書で使用するところの「ＣＤ３８」なる用語は、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ／環状ＡＤＰ－リボースヒドロラーゼ１としても知られる、エクト酵素活性を有する１回膜貫通型ＩＩ型タンパク質を指す。「ＣＤ３８」なる用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物種のＣＤ３８タンパク質を含み、詳細にはヒトＣＤ３８及び非ヒト哺乳動物のＣＤ３８を含む。

【0066】

本明細書で使用するところの「ヒトＣＤ３８」なる用語は、その由来源または調製法に関係なく、ヒトＣＤ３８（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ２８９０７）の任意の変異体、アイソフォーム及び種ホモログを含む。したがって、「ヒトＣＤ３８」には、細胞により自然に発現されるヒトＣＤ３８と、ヒトＣＤ３８遺伝子をトランスフェクトした細胞上で発現されるＣＤ３８が含まれる。

【0067】

「抗ＣＤ３８重鎖単独抗体」、「ＣＤ３８重鎖単独抗体」、「抗ＣＤ３８重鎖抗体」、及び「ＣＤ３８重鎖抗体」なる用語は、本明細書では、上記で定義したようなヒトＣＤ３８を含むＣＤ３８に免疫特異的に結合する、上記で定義した重鎖単独抗体を指して互換可能に使用される。この定義には、これらに限定されるものではないが、上記に定義したようなヒト抗ＣＤ３８ ＵｎｉＡｂ（商標）抗体を産生するＵｎｉＲａｔｓ（商標）を含む、ヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニックラットまたはトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック動物によって産生されるヒト重鎖抗体が含まれる。

【0068】

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一率（％）」は、保存的置換を配列同一性の一部として考慮せず、最大の配列同一率（％）が得られるように配列同士を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同じである候補配列内のアミノ酸残基の割合（％）として定義される。アミノ酸配列同一率（％）を決定する目的でのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野の技能の範囲内である種々の方法で実現することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長にわたって最大のアライメントを得るために必要とされるあらゆるアルゴリズムを含む、配列同士を整列するために適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的では、アミノ酸配列同一率（％）の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。

【0069】

「単離された」結合化合物（単離抗体など）とは、その自然環境の成分から識別及び分離され、かつ／または回収された抗体である。その自然環境の混入成分は、結合化合物の診断または治療における使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。好ましい実施形態において、結合化合物は、（１）ローリー法により測定した場合に９５重量％超の結合化合物、最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップシーケネータ（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を使用してＮ末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに充分な程度にまで、または（３）クーマシーブルー、若しくは好ましくは銀染色を用いて還元若しくは非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均質となるまで、精製される。単離された結合化合物には、その抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイチューの結合化合物が含まれる。しかしながら、通常、単離された結合化合物は、少なくとも１つの精製工程により調製される。

【0070】

本発明の実施形態による結合化合物には、多重特異性結合化合物が含まれる。多重特異性結合化合物は、複数の結合特異性を有する。「多重特異性」なる用語には、具体的には、「二重特異性」及び「三重特異性」、ならびにより高次のポリエピトープ特異性などのより高次の独立した特異的結合親和性、ならびに四価の結合化合物及び結合化合物の抗原結合フラグメント（例えば、抗体及び抗体フラグメント）が含まれる。「多重特異性」結合化合物は、異なる結合物の組み合わせを含む抗体だけでなく、複数の同じ結合物を含む抗体を具体的に含む。「多重特異性抗体」、「多重特異性重鎖単独抗体」、「多重特異性重鎖抗体」、及び「多重特異性ＵｎｉＡｂ（商標）」なる用語は、本明細書では最も広い意味で用いられ、複数の結合特異性を有するすべての抗体を包含する。本発明の多重特異性重鎖抗ＣＤ３８抗体は、ヒトＣＤ３８などのＣＤ３８タンパク質上の２つ以上の重複しないエピトープに免疫特異的に結合する抗体を具体的に含む。

【0071】

「エピトープ」とは、結合化合物の抗原結合領域が結合する、抗原分子の表面上の部位である。一般に、抗原は数個または多数の異なるエピトープを有し、多くの異なる結合化合物（例えば、多くの異なる抗体）と反応する。この用語には具体的には、線形エピトープ及びコンフォメーションエピトープが含まれる。

【0072】

「エピトープマッピング」とは、標的抗原上の抗体の結合部位、すなわちエピトープを特定するプロセスである。抗体エピトープは、線形エピトープまたはコンフォメーションエピトープであってよい。線形エピトープは、タンパク質内のアミノ酸の連続した配列によって形成される。コンフォメーションエピトープは、タンパク質配列内で不連続であるが、タンパク質がその三次元構造に折り畳まれる際に互いに寄せ集められるアミノ酸で形成される。

【0073】

「ポリエピトープ特異性」とは、同じまたは異なる標的(複数可)上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。上記のように、本発明は、ポリエピトープ特異性を有する抗ＣＤ３８重鎖抗体、すなわち、ヒトＣＤ３８などのＣＤ３８タンパク質上の２つ以上の重複しないエピトープに結合する抗ＣＤ３８重鎖抗体を具体的に含む。抗原の「重複しないエピトープ（複数可）」または「非競合的エピトープ（複数可）」なる用語は、本明細書では、抗原特異的抗体のペアの一方のメンバーによって認識されるが、他方のメンバーによっては認識されないエピトープ（複数可）を意味するものとして定義される。重複しないエピトープを認識する抗体のペア、または多重特異性抗体上の同じ抗原を標的とする抗原結合領域は、その抗原への結合について競合せず、その抗原に同時に結合することができる。

【0074】

結合化合物と参照抗体が同一または立体的に重複するエピトープを認識する場合、結合化合物は、参照結合化合物（例えば、参照抗体）と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つの抗体が同じまたは立体的に重複するエピトープに結合するかどうかを決定するために最も広く使用されている迅速な方法は競合アッセイであり、標識抗原または標識抗体のいずれかを用いてあらゆる数の異なるフォーマットで構成することができる。通常、抗原は９６ウェルプレートに固定化され、標識抗体の結合をブロックする非標識抗体の能力を放射性標識または酵素標識を使用して測定する。

【0075】

結合化合物（例えば、抗体）及び参照結合化合物（例えば、参照抗体）に関して本明細書で使用するところの「競合する」なる用語は、本明細書に記載される競合結合アッセイなどの標準的な方法によって測定した場合に、結合化合物が、標的抗原への参照結合化合物の結合の約１５～１００％の減少をもたらすことを意味する。

【0076】

本明細書で使用される「競合群」なる用語は、同じ標的抗原（またはエピトープ）に結合し、標的抗原との結合について競合群のメンバーと競合する２つ以上の結合化合物（例えば、第１及び第２の抗体）を指す。同じ競合群のメンバーは、標的抗原との結合について互いに競合するが、必ずしも同じ機能的活性を有するとは限らない。

【0077】

本明細書で使用するところの「価」なる用語は、抗体分子または結合化合物内の特定の数の結合部位を指す。

【0078】

「多価」結合化合物は、２つ以上の結合部位を有する。したがって、「二価」、「三価」、及び「四価」なる用語は、それぞれ、２つの結合部位、３つの結合部位、及び４つの結合部位の存在を指す。したがって、本発明による二重特異性抗体は、少なくとも二価であり、三価、四価、または他の多価であってもよい。多種多様な方法及びタンパク質の形態が知られており、二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡＢ）、三重特異性抗体などの調製に使用されている。

【0079】

「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」なる用語は、本明細書において、所望の結合特異性（例えば、モノクローナル抗体または他のリガンドの抗原結合領域）を膜貫通及び細胞内シグナル伝達ドメインと結び付ける操作された受容体を指して最も広い意味で使用される。通常、受容体は、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に結び付けてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作製するために使用される。（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，２０１６；１０８（７）：ｄｊｖ４３９；及びＪａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１６；１３：３７０－３８３．）．

【0080】

「ヒト抗体」なる用語は、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むものとして用いられる。本明細書のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基、例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入される変異を有することができる。「ヒト抗体」なる用語は、トランスジェニックラットまたはマウスなどのトランスジェニック動物によって産生される、ヒト重鎖可変領域配列を有する重鎖単独抗体、具体的には、上記で定義したＵｎｉＲａｔｓ（商標）によって産生されるＵｎｉＡｂｓ（商標）を具体的に含む。

【0081】

「キメラ抗体」または「キメラ免疫グロブリン」とは、少なくとも２つの異なるＩｇ遺伝子座からのアミノ酸配列を含む免疫グロブリン分子、例えば、ヒトＩｇ遺伝子座によってコードされる部分とラットＩｇ遺伝子座によってコードされる部分とを含むトランスジェニック抗体を意味する。キメラ抗体には、非ヒトＦｃ領域または人工Ｆｃ領域を有するトランスジェニック抗体、及びヒトイディオタイプが含まれる。かかる免疫グロブリンは、かかるキメラ抗体を産生するように操作された本発明の動物から単離することができる。

【0082】

本明細書で使用するところの「エフェクター細胞」なる用語は、免疫反応の認識及び活性化段階ではなく、免疫反応のエフェクター段階に関与する免疫細胞を指す。一部のエフェクター細胞は特定のFc受容体を発現し、特定の免疫機能を行う。いくつかの実施形態において、ナチュラルキラー細胞などのエフェクター細胞は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。例えば、ＦｃＲを発現する単球及びマクロファージは、標的細胞の特異的な死滅及び免疫系の他の構成成分への抗原の提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与している。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食することができる。

【0083】

「ヒトエフェクター細胞」は、Ｔ細胞受容体またはＦｃＲなどの受容体を発現し、エフェクター機能を行う白血球である。好ましくは、これらの細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を行う。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、及び好中球が挙げられ、ＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然由来源から、例えば、本明細書に記載されるように血液またはＰＢＭＣから単離することができる。

【0084】

「免疫細胞」なる用語は本明細書において最も広い意味で使用され、これらに限定されるものではないが、骨髄またはリンパ組織由来の細胞、例えばリンパ球（Ｂ細胞及び細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞など）、キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好酸球、多形核細胞、例えば好中球、顆粒球、マスト細胞、好塩基球などを含む。

【0085】

抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列変異型Ｆｃ領域）に起因し得る生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害作用、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の発現低下などが挙げられる。

【0086】

「抗体依存性細胞媒介細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞に結合した抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞介在性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するには、例えば米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されるようなインビトロＡＤＣＣアッセイを行うことができる。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞(NK)が挙げられる。上記に代えるかまたは加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ (ＵＳＡ) ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルで評価することもできる。

【0087】

「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的を溶解させる分子の能力を指す。補体活性化経路は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）が、同種抗原と複合体化した分子（例えば、抗体）と結合することによって開始される。補体活性化を評価するには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されるようなＣＤＣアッセイを行うことができる。

【0088】

「結合親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の残基相互作用を総和した強度のことを指す。特に明記しない限り、本明細書で使用するところの「結合親和性」とは、結合ペア（例えば、抗体と抗原）の要素間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は、当該技術分野では周知の一般的な方法により測定することができる。低親和性抗体が一般に抗原にゆっくり結合し、速やかに解離する傾向を有するのに対して、高親和性抗体は一般に抗原により速く結合し、結合したままである傾向がある。

【0089】

本明細書で使用するところの「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」とは、Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４機器（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を動力学モードで使用してバイオレイヤー干渉法によって決定される解離定数を指す。例えば、抗マウスＦｃセンサーにマウスＦｃ融合抗原をロードしてから抗体が入ったウェルに浸漬することで、濃度依存性の結合速度（ｋｏｎ）が測定される。抗体の解離速度（ｋｏｆｆ）は、センサーをバッファーのみを含むウェルに浸漬する最終ステップで測定される。Ｋｄは、ｋｏｆｆ ／ ｋｏｎの比である。（詳細については、Ｃｏｎｃｅｐｃｉｏｎ， Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ，１２（８），７９１－８００，２００９を参照されたい）。

【0090】

「治療」、「治療する」、及びこれに類する用語は、本明細書では、所望の薬理学的及び／または生理学的作用を得ることを一般的に意味して用いられる。その効果は、疾患またはその症状を完全または部分的に予防する観点から予防的であってもよく、及び／または疾患及び／またはその疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒という観点から治療的であってもよい。本明細書で使用するところの「治療」とは、哺乳動物における疾患のあらゆる治療を包含し、（ａ）その疾患の素因を有し得るがまだ疾患を有するとは診断されていない対象における発病を予防すること、（ｂ）その疾患を阻止すること、すなわち、その発現を阻止すること、または（ｃ）その疾患を軽減すること、すなわち、その疾患を退行させることを含む。治療薬は、疾患または傷害の発症前、発症中、または発症後に投与することができる。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化または軽減するような進行中の疾患の治療が特に対象となり得る。こうした治療は、罹患組織の機能が完全に喪失する前に行われることが望ましい。対象の治療は、疾患の症候性ステージの間、及び場合により疾患の症候性ステージの後に投与することができる。

【0091】

「治療有効量」とは、対象に治療効果をもたらすうえで必要な活性剤の量を意味する。例えば、「治療有効量」は、疾患に関連する病理学的症状、疾患の進行または生理学的状態の改善を誘発、改善、または他の形でもたらすか、または疾患に対する抵抗性を高める量である。

【0092】

本発明との関連において、「Ｂ細胞新生物」または「成熟Ｂ細胞新生物」なる用語には、これらに限定されるものではないが、すべてのリンパ性白血病及びリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、前リンパ球性白血病、前駆体Ｂリンパ芽球性白血病、毛細胞白血病、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫などの形質細胞新生物、形質細胞腫、モノクローナル免疫グロブリン沈着症、重鎖疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、リンパ節辺縁Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、毛細胞白血病、原発性滲出液リンパ腫、及びＡＩＤＳ関連の非ホジキンリンパ腫が含まれる。

【0093】

本明細書で使用するところの「大腸炎」なる用語は、結腸の内層の炎症を特徴とする疾患を広く指す。本明細書で使用するところの「大腸炎」には、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、またはクローン病によって引き起こされる可能性がある自己免疫性大腸炎；便流性大腸炎、化学的大腸炎、化学療法誘発性大腸炎、または例えばＰＤ－１ ／ ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、及びその他の免疫チェックポイント阻害剤などの１つ以上の治療薬による治療によって誘発される大腸炎などの治療誘発性大腸炎；虚血性大腸炎などの血管疾患；クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、志賀毒素、または寄生虫感染症（例えば、赤痢アメーバ）によって引き起こされる感染性大腸炎などの感染性大腸炎；原因不明の大腸炎、例えば、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性大腸炎、または膠原性大腸炎；または非定型大腸炎（すなわち、臨床的に受け入れられているタイプの大腸炎の基準に適合しない大腸炎）が含まれる。

【0094】

本明細書で使用するところの「虚血性損傷」なる用語は、組織への血流の減少によって引き起こされるあらゆる損傷を指す。虚血性損傷としては、これらに限定されるものではないが、虚血性脳損傷、虚血性心臓損傷、虚血性腎臓損傷、虚血性胃腸（ＧＩ）損傷などが挙げられる。

【0095】

「対象」、「個体」、及び「患者」なる用語は、本明細書では、治療についての評価が行われる、及び／または治療が行われる哺乳動物を指して互換的に使用される。一実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。「対象」、「個体」、及び「患者」なる用語には、これらに限定されるものではないが、がんを有する個体、及び／または自己免疫疾患を有する個体などが含まれる。対象はヒトであってもよいが、他の哺乳動物、例えば、マウス、ラットなどの、特にヒトの疾患の実験モデルとして有用な哺乳動物も含まれる。

【0096】

「医薬製剤」なる用語は、有効成分の生物学的活性が有効となるような形態であり、製剤が投与される対象にとって許容されない毒性を示すさらなる成分を含まない製剤のことを指す。かかる製剤は、無菌である。「薬学的に許容される」賦形剤（ビヒクル、添加剤）とは、対象の哺乳動物に適度に投与されることで用いられる有効成分の有効用量を与えることができるものである。

【0097】

本明細書で使用するところの「相乗作用」及び「相乗作用」なる用語は、特定の結果（例えば、加水分解酵素活性の低下）を得るうえで、２つ以上の個別の成分が別々に使用された場合に得られる結果と比較して、併用される場合により効果的であるような２つ以上の個別の成分（例えば、２つ以上の重鎖抗体）の組み合わせを指す。例えば、２つ以上の加水分解酵素阻害重鎖抗体の相乗的組み合わせは、加水分解酵素活性を阻害するうえで別々に使用された場合の個々の加水分解酵素阻害重鎖抗体のいずれよりもより効果的である。同様に、相乗的な治療の組み合わせは、治療の組み合わせを構成する２つ以上の単一の薬剤の効果よりも効果的である。治療の組み合わせにおける２つ以上の単一の薬剤間の相乗的相互作用の測定は、当該技術分野では周知の様々なアッセイから得られた結果に基づいたものとすることができる。これらのアッセイの結果は、組み合わせインデックス「ＣＩ」を得るためのＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙの組み合わせ法及びＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアを用いた用量効果分析を使用して分析することができる（Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙ（１９８４）Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．２２：２７－５５）。併用療法は、各化合物を別々に使用した場合に生じる効果よりも各活性成分を併用した場合に得られる効果の方が高い場合に「相乗効果」を与え、「相乗的」、すなわち、相乗作用を示し得る。相乗効果は、各活性成分が、（１）組み合わされた単位用量の配合物として同時処方されて投与されるか、または同時に送達される場合、（２）別個の配合物として交互に送達される場合、または（３）他の何らかのレジメンによる場合に得ることができる。交互療法で送達される場合、相乗効果は、各化合物を例えば別個の注射器中の異なる注射液によって順次、投与または送達する場合に得ることができる。一般に、交互療法では、各活性成分の有効用量を連続的に、すなわち時間的に連続して投与する。

【0098】

「滅菌」製剤は、無菌であるか、またはあらゆる微生物及びそれらの芽胞を含まないか、または本質的に含まない。「凍結」製剤とは、０℃未満の温度のものである。

【0099】

「安定した」製剤とは、その中に含まれるタンパク質が保管時にその物理的安定性及び／または化学的安定性及び／または生物学的活性を本質的に維持するような製剤である。好ましくは、製剤は、保管時にその物理的及び化学的安定性、ならびにその生物学的活性を本質的に維持する。保管期間は一般に、製剤の想定される貯蔵寿命に基づいて選択される。タンパク質安定性を測定するための様々な分析技術が当該技術分野で利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７－３０１．Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ．Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９－９０（１９９３）に概説されている。安定性は、選択された温度で選択された期間にわたって測定することができる。安定性は、凝集体形成の評価（例えば、濁度を測定することによる、かつ／または目視検査によるサイズ排除クロマトグラフィーを用いた）；カチオン交換クロマトグラフィー、イメージキャピラリー等電点フォーカシング（ｉｃＩＥＦ）またはキャピラリーゾーン電気泳動を用いて電荷不均一性を評価することによって；アミノ末端またはカルボキシ末端配列分析；質量分光分析；還元型とインタクトな抗体を比較するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析；ペプチドマップ（例えば、トリプシンまたはＬＹＳ－Ｃ）分析；抗体の生物学的活性または抗原結合機能を評価することによって、様々な異なる方法で定性的及び／または定量的に評価することができる。不安定性には、凝集、脱アミド化（例えば、Ａｓｎの脱アミド化）、酸化（例えば、Ｍｅｔの酸化）、異性化（例えば、Ａｓｐの異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えば、ヒンジ領域の断片化）、スクシンイミド形成、非対合システイン（複数可）、Ｎ末端の伸長、Ｃ末端のプロセシング、グリコシル化の差などのうちのいずれか１つ以上が関与しうる。

【0100】

ＩＩ．詳細な説明
本発明は、エクト酵素上の１つ以上のエピトープに結合特異性を有する重鎖抗体などの結合化合物を使用することで、腫瘍細胞を溶解し、及び／または標的エクト酵素の酵素活性を阻害することができるという発見に少なくとも一部基づいたものである。本発明はまた、エクト酵素上の少なくとも２つの重複しないエピトープに対して結合特異性を有する結合化合物（例えば、多重特異性、例えば、二重特異性結合化合物）またはそれらの組み合わせが、腫瘍細胞を溶解し、かつ/または標的エクト酵素の酵素活性を調節（例えば阻害）するうえで相乗的に作用するという発見にも少なくとも一部基づいている。したがって、本発明の態様は、これらに限定されるものではないが、単一の標的（例えば、エクト酵素上の単一のエピトープ）に対する結合特異性を有する単一特異性結合化合物、ならびに少なくとも２つの標的（例えば、エクト酵素上の第１及び第２のエピトープ）に対する結合特異性を有する多重特異性（例えば、二重特異性）結合化合物を含む結合化合物に関する。本発明の態様はまた、本明細書に記載される結合化合物の治療的組み合わせ、ならびにかかる結合化合物を製造及び使用する方法にも関する。

【0101】

エクト酵素
エクト酵素は、原形質膜の外側に触媒部位を有する膜タンパク質の多様なグループである。多くのエクト酵素が白血球及び内皮細胞に見られ、複数の生物学的役割を担っている。すべてに共通する細胞外触媒活性とは別に、エクト酵素は大きく異なる種類の酵素反応に関与する多様な分子のクラスである。異なるエクト酵素が、白血球と内皮の接触相互作用の各段階、及びその後の組織内の細胞遊走を調節することができる。エクト酵素には、これらに限定されるものではないが、ＣＤ３８、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ２０３、ＶＡＰ１、ＡＲＴ２、及びＭＴ１－ＭＭＰが含まれる。

【0102】

エクト酵素ＣＤ３８は、ヌクレオチドのリサイクルに加えて、細胞のホメオスタシス及び代謝を制御する化合物を生成するヌクレオチド代謝酵素のファミリーに属している。ＣＤ３８の触媒活性は、インスリン分泌、膵臓腺房細胞におけるムスカリン性のＣａ２^＋シグナル伝達、好中球の走化性、樹状細胞のトラフィッキング、オキシトシン分泌、及び食事誘発性肥満の発症をはじめとする様々な生理学的プロセスにおいて必要である。Ｖａｉｓｉｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｅｕｋｅｍｉａ，２０１５，２９：３５６－３６８、及び当該文献に引用される参考文献を参照されたい。ＣＤ３８は、二機能性のエクト酵素シクラーゼ及び加水分解酵素活性を有している。ＣＤ３８は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）をはじめとする様々な悪性疾患で発現される。ＣＤ３８は、ＣＬＬの特に進行性の形態を同定することが示されており、予後不良マーカーとみなされ、このようなＣＬＬの進行型を有する患者の短い全生存期間を予測するものである。Ｍａｌａｖａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｂｌｏｏｄ，１１８：３４７０－３４７８及びＶａｉｓｉｔｔｉ，２０１５（前出）を参照されたい。

【0103】

ＣＤ３８は固形腫瘍にも発現し、ＰＤ１抵抗性の非小細胞肺癌患者（ＳＮＣＬＣ）の腫瘍細胞で過剰発現する（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ，８（９）：１１５６－７５）。ＣＤ３８は、膵臓腫瘍、腎細胞癌、黒色腫、結腸直腸癌など、免疫チェックポイント阻害に耐性を有する他の固形腫瘍において一定の役割を果たしていると考えられている。

【0104】

抗ＣＤ３８結合化合物
本発明の態様は、ＣＤ３８などのエクト酵素に結合親和性を有する結合化合物を含む。結合化合物としては、これらに限定されるものではないが、図１１に示されるものなどの様々な抗体様分子を挙げることができる。いくつかの実施形態において、結合化合物は、エクト酵素上の特定のエピトープに結合親和性を有する抗体の可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、結合化合物は、特定のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。特定の実施形態において、結合化合物は、２つ以上の抗原結合ドメインを含み、１つの抗原結合ドメインは第１のエピトープに結合親和性を有し、１つの抗原結合ドメインは第２のエピトープに結合親和性を有する。特定の実施形態において、エピトープは、重複しないエピトープである。本明細書に記載される結合化合物は、臨床治療薬（複数可）としての有用性に寄与する多くの利点を与えるものである。結合化合物には、広範な結合親和性を有するメンバーが含まれているため、所望の結合親和性を有する特定の配列を選択することができる。

【0105】

本発明の態様は、ヒトＣＤ３８に結合する重鎖抗体を含む。これらの抗体は、本明細書に定義され、図１～３及び図５に示されるようなＣＤＲ配列のセットを含み、図１～３に示される配列番号１８～２８の提供される重鎖可変領域（ＶＨ）配列によって例示される。これらの抗体は、臨床治療薬（複数可）としての有用性に寄与する多くの利点を与えるものである。抗体には、広範な結合親和性を有するメンバーが含まれているため、所望の結合親和性を有する特定の配列を選択することができる。

【0106】

適当な結合化合物は、例えば図１１に示されるような二重結合化合物、または三重特異性抗体、またはＣＡＲ－Ｔ構造の一部としての使用を含むがこれに限定されない、開発及び治療または他の使用のために本明細書に提供されるものから選択することができる。

【0107】

候補タンパク質に対する親和性の決定は、Ｂｉａｃｏｒｅ測定などの当該技術分野では周知の方法を使用して行うことができる。本明細書に記載される結合化合物は、これらに限定されるものではないが、Ｋｄが、約１０^－６～約１０^－１０、約１０^－６ ～約１０^－９、約１０^－６ ～約１０^－８、約１０^－８ ～約１０^－１１、約１０^－８ ～約１０^－１０、約１０^－８ ～約１０^－９、約１０^－９ ～約１０^－１１、約１０^－９ ～約１０^－１０、またはこれらの範囲内の任意の値を含む、約１０^－６～約１０^－１１の値であるような、ＣＤ３８に対する親和性を有することができる。親和性選択は、インビトロアッセイ、前臨床モデル、及び臨床試験、ならびに潜在的な毒性の評価を含む、加水分解酵素活性などのＣＤ３８の生物学的活性を調節する、例えば遮断する生物学的評価によって確認することができる。

【0108】

本明細書に記載される結合化合物は、カニクイザルのＣＤ３８タンパク質との交差反応性を示さないが、必要に応じて、カニクイザルのＣＤ３８タンパク質、または他の任意の動物種のＣＤ３８との交差反応性を与えるように操作することができる。

【0109】

本明細書のＣＤ３８特異的結合化合物は、ヒトＶＨフレームワーク内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む抗原結合ドメインを含む。ＣＤＲ配列は、例として、配列番号１８～２８に示される提供される例示的な可変領域配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３についてそれぞれ、アミノ酸残基２６～３５、５３～５９、及び９８～１１７付近の領域に位置し得る。一般的に、配列の順序は同じままであるが、異なるフレームワーク配列が選択される場合には各ＣＤＲ配列は異なる位置に存在し得る点は当業者には理解されよう。

【0110】

代表的なＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を、図１～３及び図５に示す。

【0111】

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８重鎖抗体は、配列番号１～５のいずれか１つのＣＤＲ１配列を含む。特定の実施形態において、ＣＤＲ１配列は配列番号１である。特定の実施形態において、ＣＤＲ１配列は配列番号３である。特定の実施形態において、ＣＤＲ１配列は配列番号４である。

【0112】

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８重鎖抗体は、配列番号６～１２のいずれか１つのＣＤＲ２配列を含む。特定の実施形態において、ＣＤＲ２配列は配列番号６である。特定の実施形態において、ＣＤＲ２配列は配列番号９である。特定の実施形態において、ＣＤＲ２配列は配列番号１１である。

【0113】

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８重鎖抗体は、配列番号１３～１７のいずれか１つのＣＤＲ３配列を含む。特定の実施形態において、ＣＤＲ３配列は、配列番号１３である。特定の実施形態において、ＣＤＲ３配列は、配列番号１６である。特定の実施形態において、ＣＤＲ３配列は、配列番号１７である。

【0114】

さらなる実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８重鎖抗体は、配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む。さらなる実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８重鎖抗体は、配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列を含む。さらなる実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８重鎖抗体は、配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１７のＣＤＲ３配列を含む。

【0115】

さらなる実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８重鎖抗体は、配列番号１８～２８の重鎖可変領域アミノ酸配列（図１～３）のいずれかを含む。

【0116】

さらに別の実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８重鎖抗体は、配列番号１８の重鎖可変領域配列を含む。さらに別の実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８重鎖抗体は、配列番号２３の重鎖可変領域配列を含む。さらに別の実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８重鎖抗体は、配列番号２７の重鎖可変領域配列を含む。

【0117】

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ３８重鎖抗体のＣＤＲ配列は、配列番号１～１７（図１～３）または配列番号４９～５１（図５）のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３配列、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列のセットに対する１つまたは２つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本明細書の重鎖抗ＣＤ３８抗体は、配列番号１８～２８（図１～３に示される）または配列番号４６または４７（図５に示される）の重鎖可変領域配列のいずれかに対して少なくとも約８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域配列を含む。

【0118】

いくつかの実施形態において、これらに限定されるものではないが、非対称の界面を介して互いに会合した２個の同じでないポリペプチドサブユニットを含む二重特異性で二価の重鎖抗体；それぞれが第１及び第２の抗原結合ドメインを有する２個の同じポリペプチドサブユニットを含む二重特異性で四価の重鎖抗体；２個の同じ重鎖ポリペプチドサブユニット及び２個の同じ軽鎖ポリペプチドサブユニットを含む二重特異性で四価の重鎖抗体；または第１の重鎖ポリペプチドサブユニット、第１の軽鎖ポリペプチドサブユニット、及び第２の重鎖ポリペプチドサブユニットを含む二重特異性の三本鎖抗体様分子を含む、本明細書で検討される構成のいずれかを有することができる二重特異性または多重特異性結合化合物が提供される。

【0119】

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ＣＤ３８に対する結合特異性を有する少なくとも１つの重鎖可変領域と、ＣＤ３８以外のタンパク質に対する結合特異性を有する少なくとも１つの重鎖可変領域とを含むことができる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、第１の抗原に対して結合特異性を有する重鎖／軽鎖のペアと、ＣＨ１ドメインは含まないがＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分と第２の抗原のエピトープまたは第１の抗原の異なるエピトープ（例えば、ＣＤ３８タンパク質上の第２の重複しないエピトープ）に結合する抗原結合ドメインとを含む重鎖単独抗体由来の重鎖と、を含むことができる。特定の一実施形態において、二重特異性抗体は、エフェクター細胞上の抗原（例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３タンパク質）に対する結合特異性を有する重鎖／軽鎖のペアと、ＣＤ３８に対する結合特異性を有する抗原結合ドメインを含む重鎖単独抗体由来の重鎖と、を含む。

【0120】

本発明のタンパク質が二重特異性抗体であるようないくつかの実施形態において、抗体の一方のアーム（１つの結合部分）はヒトＣＤ３８に対して特異的であり、他方のアームは標的細胞、腫瘍関連抗原、ターゲティング抗原（例えば、インテグリンなど）、病原体抗原、チェックポイントタンパク質などに対して特異的であってよい。標的細胞としては、以下で述べるように、これらに限定されるものではないが、血液腫瘍、例えば、Ｂ細胞腫瘍由来の細胞を含むがん細胞が具体的に挙げられる。

【0121】

これらに限定されるものではないが、一本鎖ポリペプチド、二本鎖ポリペプチド、三本鎖ポリペプチド、四本鎖ポリペプチド、及びそれらの倍数を含む、様々なフォーマットの二重特異性結合化合物が本発明の範囲に含まれる。本明細書の二重特異性結合化合物としては免疫細胞上で主に発現されるＣＤ３８とＣＤ３に結合するＴ細胞二重特異性抗体（抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３抗体）が具体的に挙げられる。かかる抗体は、ＣＤ３８を発現する細胞の強力なＴ細胞介在性の殺滅を誘導する。

【0122】

いくつかの実施形態において、結合化合物は、第１及び第２のポリペプチド、すなわち第１及び第２のポリペプチドサブユニットを含み、各ポリペプチドは、重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２のポリペプチドのそれぞれは、ヒンジ領域、またはヒンジ領域の少なくとも一部をさらに含み、それにより、第１と第２のポリペプチドとの間の少なくとも１つのジスルフィド結合の形成を促進することができる。いくつかの実施形態において、第１及び第２のポリペプチドのそれぞれは、ＣＨ２ドメイン、及び／またはＣＨ３ドメイン、及び／またはＣＨ４ドメインなどの少なくとも１つの重鎖定常領域（ＣＨ）ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＨドメインは、ＣＨ１ドメインを欠く。第１及び第２のポリペプチドのそれぞれの抗原結合ドメインは、結合化合物に抗原結合能力を付与するために、本明細書に記載されるＣＤＲ配列及び／または可変領域配列のいずれかを組み込むことができる。したがって、特定の実施形態では、結合化合物中の各ポリペプチドは、同じエピトープまたは異なるエピトープ（例えば、ＣＤ３８タンパク質上の第１及び第２の重複しないエピトープ）に結合特異性を有する抗原結合ドメインを含むことができる。

【0123】

本発明の実施形態による結合化合物の非限定的な例を図１１のパネルＣに示す。図に示される実施形態において、結合化合物は、重鎖抗体の抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む（かつＣＨ１ドメインを欠く）ＣＨドメインを含む第１のポリペプチドと、重鎖抗体の抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、及びＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む（かつＣＨ１ドメインを欠く）ＣＨドメインを含む第２のポリペプチドとを含む二重特異性、二価の重鎖抗体である。図に示される実施形態は、第１のポリペプチドのＣＨ３ドメインと第２のポリペプチドのＣＨ３ドメインとの間の非対称的界面、及び第１と第２のポリペプチドとを連結して結合化合物を形成するヒンジ領域内の少なくとも１つのジスルフィド結合を含む。本発明の実施形態による非対称的界面については、本明細書でさらに説明する。

【0124】

いくつかの実施形態において、結合化合物は、第１及び第２のポリペプチド、すなわち第１及び第２のポリペプチドサブユニットを含み、各ポリペプチドは２個の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２のポリペプチドのそれぞれは、ヒンジ領域、またはヒンジ領域の少なくとも一部をさらに含み、それにより、第１と第２のポリペプチドとの間の少なくとも１つのジスルフィド結合の形成を促進することができる。いくつかの実施形態において、第１及び第２のポリペプチドのそれぞれは、ＣＨ２ドメイン、及び／またはＣＨ３ドメイン、及び／またはＣＨ４ドメインなどの少なくとも１つの重鎖定常領域（ＣＨ）ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＨドメインは、ＣＨ１ドメインを欠く。第１及び第２のポリペプチドのそれぞれの抗原結合ドメインは、結合化合物に抗原結合能力を付与するために、本明細書に記載されるＣＤＲ配列及び／または可変領域配列のいずれかを組み込むことができる。したがって、特定の実施形態では、結合化合物中の各ポリペプチドは、同じエピトープまたは異なるエピトープ（例えば、ＣＤ３８タンパク質上の第１及び第２の重複しないエピトープ）に結合特異性を有する２個の抗原結合ドメインを含むことができる。

【0125】

本発明の実施形態による結合化合物の非限定的な例を図１１のパネルＢに示す。図に示される実施形態において、結合化合物は、一方が第１のエピトープに結合特異性を有し、もう一方が第２の重複しないエピトープに結合特異性を有する２個の抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む（かつＣＨ１ドメインを欠く）ＣＨドメインを含む第１のポリペプチドと、一方が第１のエピトープに結合特異性を有し、もう一方が第２の重複しないエピトープに結合特異性を有する２個の抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む（かつＣＨ１ドメインを欠く）ＣＨドメインを含む第２のポリペプチドとを含む二重特異性、四価の重鎖抗体である。図に示される実施形態は、第１と第２のポリペプチドとを連結して結合化合物を形成する少なくとも１つのジスルフィド結合をヒンジ領域内に含む。

【0126】

いくつかの実施形態において、各ポリペプチド上の第１と第２の抗原結合ドメインは、ポリペプチドリンカーによって連結される。第１と第２の抗原結合ドメインとを連結することができるポリペプチドリンカーの１つの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号２９）を有するＧ４ＳリンカーなどのＧＳリンカーである。他の適当なリンカーも使用することができ、例えば、本明細書に参照によりその開示内容の全体を援用するところのＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１３ Ｏｃｔｏｂｅｒ １５；６５（１０：１３５７－６９に記載されている。

【0127】

いくつかの実施形態において、結合化合物は、第１及び第２の重鎖ポリペプチド、すなわち第１及び第２の重鎖ポリペプチドサブユニット、ならびに第１及び第２の軽鎖ポリペプチド、すなわち第１及び第２の軽鎖ポリペプチドサブユニットを含む。いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチドのそれぞれは、重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチドのそれぞれは、ヒンジ領域、またはヒンジ領域の少なくとも一部をさらに含み、それにより、第１と第２の重鎖ポリペプチドとの間の少なくとも１つのジスルフィド結合の形成を促進することができる。いくつかの実施形態において、第１及び第２の重鎖ポリペプチドのそれぞれは、ＣＨ２ドメイン、及び／またはＣＨ３ドメイン、及び／またはＣＨ４ドメインなどの少なくとも１つの重鎖定常領域（ＣＨ）ドメインをさらに含む。特定の実施形態では、ＣＨドメインは、ＣＨ１ドメインを含む。第１及び第２の重鎖ポリペプチドのそれぞれの抗原結合ドメインは、結合化合物に抗原結合能力を付与するために、本明細書に記載されるＣＤＲ配列及び／または可変領域配列のいずれかを組み込むことができる。

【0128】

いくつかの実施形態において、軽鎖ポリペプチドのそれぞれは、重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖ポリペプチドのそれぞれは、軽鎖定常領域（ＣＬ）ドメインをさらに含む。第１及び第２の軽鎖ポリペプチドのそれぞれの抗原結合ドメインは、結合化合物に抗原結合能力を付与するために、本明細書に記載されるＣＤＲ配列及び／または可変領域配列のいずれかを組み込むことができる。さらに、重鎖ポリペプチドのＣＨ１ドメイン及び軽鎖ポリペプチドのＣＬドメインはそれぞれ、各軽鎖ポリペプチドを重鎖ポリペプチドの一方に連結するジスルフィド結合の形成を促進する少なくとも１個のシステイン残基を含むことができる。

【0129】

本発明の実施形態による結合化合物の非限定的な例を図１１、パネルＡに示す。図に示される実施形態では、結合化合物は、２個の重鎖ポリペプチドと２個の軽鎖ポリペプチドを含む二重特異性、四価の結合化合物である。各重鎖ポリペプチドは、第１のエピトープに結合特異性を有する抗原結合ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。図に示される実施形態は、第１と第２の重鎖ポリペプチドとを連結する少なくとも１つのジスルフィド結合をヒンジ領域内に含む。各軽鎖ポリペプチドは、第２のエピトープに結合特異性を有する抗原結合ドメイン、及びＣＬドメインを含む。図に示される実施形態は、第１及び第２の重鎖ポリペプチドと第１及び第２の軽鎖ポリペプチドとに連結して結合化合物を形成する、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の少なくとも１つのジスルフィド結合を含む。

【0130】

本発明の実施形態による結合化合物の非限定的な例を図１１、パネルＤに示す。図に示される実施形態では、結合化合物は、３個のポリペプチド（２個の重鎖ポリペプチド及び１個の軽鎖ポリペプチド）を含む二重特異性、二価の結合化合物である。第１の重鎖ポリペプチドサブユニットと軽鎖ポリペプチドサブユニットとは共に第１のエピトープに結合親和性を有する結合単位を形成し、第２の重鎖ポリペプチドは、第２のエピトープに結合親和性を有する重鎖単独可変領域を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドサブユニットは、単一の重鎖単独可変領域ドメイン（一価形態）を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドサブユニットは、リンカーによって連結された２個の重鎖単独可変領域（二価形態）を含む。第１のポリペプチドは、第１のエピトープに結合特異性を有する抗原結合ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。図に示される実施形態は、第１と第２の重鎖ポリペプチドとを連結する少なくとも１つのジスルフィド結合をヒンジ領域内に含む。軽鎖ポリペプチドは、第１のエピトープに結合特異性を有する抗原結合ドメイン、及びＣＬドメインを含む。

【0131】

好ましい一実施形態において、第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の重複しないＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する二重特異性結合化合物は、第１のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する第１のポリペプチドであって、配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む重鎖抗体の抗原結合ドメインと、ヒンジ領域の少なくとも一部と、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメインと、を含む第１のポリペプチドと、第２のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する第２のポリペプチドであって、配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列を含む重鎖抗体の抗原結合ドメインと、ヒンジ領域の少なくとも一部と、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメインと、を含む第２のポリペプチドと、第１のポリペプチドのＣＨ３ドメインと第２のポリペプチドのＣＨ３ドメインとの間の非対称的界面と、を含む。特定の好ましい実施形態において、この結合化合物は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、またはサイレンシングされたヒトＩｇＧ４のＦｃ領域であるＦｃ領域を含む。

【0132】

別の好ましい実施形態では、第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の重複しないＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する二重特異性結合化合物は、２つの同じポリペプチドを含み、各ポリペプチドは、配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む、第１のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の第１の抗原結合ドメインと、配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列を含む、第２のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の第２の抗原結合ドメインと、ヒンジ領域の少なくとも一部と、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメインとを含む。特定の好ましい実施形態では、この結合化合物は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、及びサイレンシングされたヒトＩｇＧ４のＦｃ領域であるＦｃ領域を含む。

【0133】

別の好ましい実施形態では、第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の重複しないＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する二重特異性結合化合物は、それぞれが、抗原配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む、第１のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の結合ドメインと、ヒンジ領域の少なくとも一部と、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメインと、を含む第１及び第２の重鎖ポリペプチドと、それぞれが、配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列を含む、第２のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の抗原結合ドメインと、ＣＬドメインと、を含む第１及び第２の軽鎖ポリペプチドと、を含む。特定の好ましい実施形態において、この結合化合物は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、またはサイレンシングされたヒトＩｇＧ４のＦｃ領域であるＦｃ領域を含む。

【0134】

別の好ましい実施形態において、第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の重複しないＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する二重特異性結合化合物は、ヒト重鎖フレームワーク内に抗原配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む第１のポリペプチドサブユニットと、ヒト軽鎖フレームワーク内に配列番号４９のＣＤＲ１配列、配列番号５０のＣＤＲ２配列、及び配列番号５１のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチドサブユニットであって、共に第１のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する第１のポリペプチドサブユニットと第２のポリペプチドサブユニットと、一価または二価形態で、ヒト重鎖フレームワーク内に配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列を含む重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む第３のポリペプチドサブユニットであって、第２の重複しないＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する第３のポリペプチドサブユニットとを、含む。いくつかの好ましい実施形態において、第１のポリペプチドサブユニットは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインをさらに含む。いくつかの好ましい実施形態において、第３のポリペプチドサブユニットは、ＣＨ１ドメインを含まず、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む定常領域配列をさらに含む。いくつかの好ましい実施形態において、ヒト軽鎖フレームワークは、ヒトκ軽鎖フレームワークまたはヒトλ軽鎖フレームワークである。いくつかの好ましい実施形態において、第２のポリペプチドサブユニットは、ＣＬドメインをさらに含む。いくつかの好ましい実施形態において、二重特異性結合化合物は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、及びサイレンシングされたヒトＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選択されるＦｃ領域を含む。いくつかの好ましい実施形態において、二重特異性結合化合物は、第１のポリペプチドサブユニットのＣＨ３ドメインと第３のポリペプチドサブユニットのＣＨ３ドメインとの間に非対称的界面を含む。

【0135】

本発明の態様は、本明細書に記載される２つ以上の結合化合物の組み合わせ（例えば、治療的組み合わせ）を含む。いくつかの実施形態において、治療的組み合わせは、ＣＤ３８上の第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の結合化合物と、ＣＤ３８上の第２の重複しないエピトープに対する結合特異性を有する第２の結合化合物とを含む。本発明の実施形態による治療的組み合わせは、本明細書に記載される２つ以上の結合化合物を含むことができ、または本明細書に記載される１つ以上の結合化合物と、当該技術分野では周知の１つ以上の結合化合物、例えばＣＤ３８に結合する１つ以上の第２の抗体とを含むことができる。

【0136】

例えば、多発性骨髄腫の治療用に臨床試験が行われている抗体であるイサツキシマブ（ＳＡＲ６５０９８４）は、強力な補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）、及び腫瘍細胞の間接的なアポトーシスを誘導する。イサツキシマブはまた、ＣＤ３８のシクラーゼ及びヒドロラーゼ酵素活性を遮断し、腫瘍細胞の直接アポトーシスを誘導する。本発明の態様は、本明細書に記載される１つ以上の結合化合物及びイサツキシマブを含む治療的組み合わせを含む。イサツキシマブの重鎖可変領域の配列を配列番号３０に示し、イサツキシマブの軽鎖可変領域の配列を配列番号３１に示す。イサツキシマブは、例えば、Ｄｅｃｋｅｒｔ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，“ＳＡＲ６５０９８４， ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＣＤ３８－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ＣＤ３８＋ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．” Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１４．２０（１７）：ｐ．４５７４－８３に記載されており、その開示内容の全体を本明細書に参照により援用する。

【0137】

ヒトＣＤ３８に特異的な抗体であるダラツムマブは、多発性骨髄腫の治療用に２０１５年にヒトでの使用が承認されている（Ｓｈａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１７，６６（６）：６９７－７０３））。本発明の態様は、本明細書に記載される１つ以上の結合化合物及びダラツムマブを含む治療的組み合わせを含む。

【0138】

１つの好ましい実施形態において、治療的組み合わせは、ＣＤ３８に結合する重鎖抗体であって、配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１７のＣＤＲ３配列を含む抗原結合ドメインと、ＣＤ３８に結合する第２の抗体としてのイサツキシマブとを含む。

【0139】

抗エクト酵素結合化合物の調製
本発明の結合化合物は、当該技術分野では周知の方法によって調製することができる。好ましい実施形態において、本明細書の結合化合物は、内因性の免疫グロブリン遺伝子をノックアウトまたは無効化したトランスジェニックマウス及びラット、好ましくはラットを含むトランスジェニック動物によって産生される。好ましい実施形態において、本明細書の結合化合物は、ＵｎｉＲａｔ（商標）で産生される。ＵｎｉＲａｔ（商標）は、内因性の免疫グロブリン遺伝子をサイレンシングし、ヒト免疫グロブリン重鎖の導入遺伝子座を用いて完全ヒト重鎖抗体の多様で自然に最適化されたレパートリーを発現する。ラットの内因性免疫グロブリン遺伝子座は、様々な技術を用いてノックアウトまたはサイレンシングすることができるが、ＵｎｉＲａｔ（商標）では、ジンクフィンガー（エンド）ヌクレアーゼ（ＺＮＦ）技術を用いて内因性のラット重鎖Ｊ遺伝子座、軽鎖Ｃκ遺伝子座、及び軽鎖Ｃλ遺伝子座を不活性化させる。卵母細胞へのマイクロインジェクション用のＺＮＦコンストラクトによって、ＩｇＨ及びＩｇＬノックアウト（ＫＯ）系統を作製することができる。詳細については、例えば、Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２５：４３３を参照されたい。Ｉｇ重鎖ノックアウトラットの特性評価は、Ｍｅｎｏｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：２９３２－２９４１により報告されている。ＺＮＦ技術の利点は、最大数ｋｂの欠失によって遺伝子または遺伝子座をサイレンシングさせる非相同末端結合が、相同組み込みの標的部位も与えることができる点である（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：６４－６７）。ＵｎｉＲａｔ（商標）で産生されたヒト重鎖抗体はＵｎｉＡｂ（商標）と呼ばれ、従来の抗体では攻撃することができないエピトープに結合することができる。その高い特異性、親和性、及び小さなサイズのため、ＵｎｉＡｂｓ（商標）は、単一及び多重特異的な用途において理想的である。

【0140】

ＵｎｉＡｂｓ（商標）以外に、本明細書には、ラクダ科のＶＨＨフレームワーク及び変異、及びそれらの機能的なＶＨ領域を欠く重鎖単独抗体が具体的に含まれる。かかる重鎖単独抗体は、例えばＷＯ２００６／００８５４８に記載されるように完全ヒト重鎖単独遺伝子座を含むトランスジェニックラットまたはマウスで産生させることができるが、ウサギ、モルモット、ラットなどの他のトランスジェニック哺乳動物も使用することができ、ラット及びマウスが好ましい。それらのＶＨＨまたはＶＨ機能性フラグメントを含む重鎖単独抗体は、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、大腸菌または酵母を含む適当な真核生物または原核生物宿主内でのコード核酸（複数可）の発現によって組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。

【0141】

重鎖単独抗体のドメインは抗体と小分子薬の利点を兼ね備えている。すなわち、一価または多価とすることができ、毒性が低く、製造コストが低い。これらのドメインはその小さいサイズのため、経口または局所投与を含めた投与が容易であり、胃腸安定性を含む高い安定性を特徴とし、その半減期を所望の用途または適応症に合わせて調節することができる。さらに、重鎖抗体のＶＨ及びＶＨＨドメインは、コスト効率の高い方法で製造することができる。

【0142】

特定の実施形態において、ＵｎｉＡｂｓ（商標）を含む本発明の重鎖抗体は、ＦＲ４領域の第１の位置（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによるアミノ酸位置１０１）の天然アミノ酸残基が、その位置の天然アミノ酸残基を含むかまたは天然アミノ酸残基に関連した表面に露出した疎水性パッチを破壊することができる別のアミノ酸残基で置換されている。このような疎水性パッチは通常は抗体の軽鎖定常領域との界面に埋め込まれているが、重鎖抗体では表面に露出しており、重鎖抗体の望ましくない凝集及び軽鎖の会合に少なくとも部分的に関与している。置換されるアミノ酸残基は、好ましくは荷電しているものであり、より好ましくは、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）またはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、好ましくはアルギニン（Ｒ）などの正に荷電したものである。好ましい実施形態において、トランスジェニック動物に由来する重鎖単独抗体は、１０１位にＴｒｐからＡｒｇへの変異を含む。得られた重鎖抗体は、好ましくは、凝集のない生理学的条件下で高い抗原結合親和性及び溶解性を有する。

【0143】

特定の実施形態において、結合化合物は、ＣＤ３８に結合する抗エクト酵素重鎖抗体である。好ましい実施形態において、抗ＣＤ３８重鎖抗体は、ＵｎｉＡｂ（商標）である。

【0144】

本発明の一環として、ＥＬＩＳＡ（組換えＣＤ３８細胞外ドメイン）タンパク質及び細胞結合アッセイにおいてヒトＣＤ３８に結合する、ＵｎｉＲａｔ（商標）動物由来の固有のＣＤＲ３配列を有するヒトＩｇＧ重鎖抗ＣＤ３８抗体ファミリー（ＵｎｉＡｂ（商標））を同定した。３つの配列ファミリー（Ｆ１１、Ｆ１２、及びＦ１３、図１～３及び図５を参照）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）配列は、ヒトＣＤ３８タンパク質結合及び／またはＣＤ３８＋細胞への結合について陽性であり、ＣＤ３８を発現しない細胞への結合についてはすべて陰性である。これら３つの配列ファミリーからのＵｎｉＡｂ（商標）は、ＣＤ３８の加水分解酵素機能を阻害する能力に基づいて、２つの大きな相乗性グループに分類される。

【0145】

一方の相乗性グループには、Ｆ１１及びＦ１２配列ファミリーが含まれる。Ｆ１１／Ｆ１２相乗性グループのメンバーは、ＣＤ３８の加水分解酵素機能を阻害するうえでイサツキシマブと相乗作用しないが、互いと相乗的な加水分解酵素阻害を示す。例えば、Ｆ１１ＡとＦ１２Ａは組み合わせた場合に、Ｆ１１ＡまたはＦ１２Ａのどちらかが個々に実現できるよりも高い加水分解酵素阻害レベルを実現する（図７）。

【0146】

別の相乗性グループには、Ｆ１３シーケンスファミリー及びイサツキシマブが含まれる。イサツキシマブ単独では、ＣＤ３８の加水分解酵素活性の部分的阻害を誘発する（約５５％の阻害率、図９）。Ｆ１３Ａ単独も、ＣＤ３８の加水分解酵素活性の部分的阻害を誘発する。イサツキシマブとＦ１３Ａは組み合わせた場合に、どちらかの抗体が個別に実現するよりも大きな加水分解酵素活性の低下を実現することにより、加水分解酵素活性の相乗的阻害を示す。Ｆ１３相乗グループの一部のメンバーは、ＣＤ３８加水分解酵素活性をそれ自体では遮断しないがイサツキシマブと相乗作用して遮断する。例えば、Ｆ１３Ｂは、それ自体ではＣＤ３８加水分解酵素活性を遮断しないが、イサツキシマブと相乗作用して、ＣＤ３８加水分解酵素活性を最大７５％阻害する（例えば、図９）。

【0147】

特に、Ｆ１２Ａはそれ自体でＣＤ３８加水分解酵素活性を阻害するが（約５０％の阻害率、図１３～１４）、イサツキシマブとは相乗作用しない。Ｆ１２Ａとイサツキシマブとの組み合わせは、イサツキシマブ単独よりもわずかに低い阻害を生じた（イサツキシマブ単独では約６５％であるのに対して、イサツキシマブとＦ１２Ａとの組み合わせでは約５８％）。

【0148】

別個の重複しないエピトープに結合する２つ以上のＵｎｉＡｂ（商標）の組み合わせが強力なＣＤＣ活性及び直接アポトーシスを誘導するのに対して、同じＵｎｉＡｂ（商標）が単独で投与された場合にはこれらのエフェクター機能のどちらも誘導しない。ＵｎｉＡｂ（商標）の組み合わせはまた、個々のＵｎｉＡｂ（商標）を単独で投与した場合よりも、より強力に酵素活性を阻害した。換言すると、特定の実施形態において、本発明の２つの異なる結合化合物の組み合わせ（例えば、治療的組み合わせ）は、１つ以上の相乗的結果（例えば、相乗的ＣＤＣ活性、相乗的酵素調節活性、例えば、相乗的加水分解酵素遮断活性）をもたらす。

【0149】

本発明の実施形態による結合化合物は、ＣＤ３８陽性バーキットリンパ腫細胞株であるＲａｍｏｓに結合し、カニクイザルのＣＤ３８タンパク質と交差反応性を示す。さらに、本明細書に記載される抗体は、必要に応じて、任意の動物種のＣＤ３８タンパク質との交差反応性を与えるように操作することができる。

【0150】

本発明の実施形態による結合化合物は、Ｋｄが、これらに限定されるものではないが、約１０^－６～約１０^－１０、約１０^－６～約１０^－９、約１０^－６～約１０^－８、約１０^－８～約１０^－１１、約１０^－８～約１０^－１０、約１０^－８～約１０^－９、約１０^－９～約１０－１１、約１０^－９～約１０^－１０、またはこれらの範囲内の任意の値を含む、約１０^－６～約１０^－１１の値であるような、ＣＤ３８に対する親和性を有することができる。親和性選択は、インビトロアッセイ、前臨床モデル、及び臨床試験、ならびに潜在的な毒性の評価を含む、ＣＤ３８の生物学的活性を調節する、例えば遮断する生物学的評価によって確認することができる。

【0151】

抗ＣＤ３８重鎖抗体を含むがこれに限定されない、エクト酵素標的上の２つ以上の重複しないエピトープに結合する本発明の実施形態による結合化合物（例えば、ＵｎｉＡｂ（商標））は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡアッセイ）またはフローサイトメトリー競合結合アッセイなどの競合結合アッセイによって同定することができる。例えば、標的抗原に結合する既知の抗体と対象とする抗体との間の競合を利用することができる。この手法を用いることにより、抗体のセットを参照抗体と競合するものと競合しないものとに分けることができる。非競合抗体は、参照抗体が結合するエピトープと重複しない異なるエピトープに結合するものとして特定される。多くの場合、１つの抗体を固定化し、抗原を結合させ、第２の標識された（例えば、ビオチン化された）抗体をＥＬＩＳＡアッセイで、捕捉された抗原に結合する能力について試験する。これは、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ、Ｉｎｃ）、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００及びＢｉａｃｏｒｅＴ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびにＭＸ９６ ＳＰＲイメージャー（Ｉｂｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｂ．Ｖ．）などの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）プラットフォーム、ならびにＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４やＯｃｔｅｔ ＨＴＸ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ Ｉｎｃ）などのバイオレイヤー干渉法プラットフォームを用いて行うこともできる。さらなる詳細については、下記実施例のセクションを参照されたい。

【0152】

一般的に、結合化合物（例えば抗体）は、本明細書に記載される競合結合アッセイなどの標準的な方法で測定した場合に、参照抗体と標的抗原との結合の約１５～１００％の低下を生じる場合に参照結合化合物（例えば、参照抗体）と競合する。様々な実施形態において、相対阻害率は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれ以上である。

【0153】

医薬組成物
本発明の別の態様は、適当な薬学的に許容される担体と混合された本発明の１つ以上の結合化合物を含む医薬組成物を提供することである。本明細書で使用される薬学的に許容される担体としては、これらに限定されるものではないが、アジュバント、固体担体、水、緩衝液、または治療成分を保持するために当該技術分野で使用される他の担体、またはそれらの組み合わせが例示される。

【0154】

一実施形態では、医薬組成物は、例えば、ＣＤ３８、ＣＤ７３、またはＣＤ３９などのエクト酵素上の重複しないエピトープに結合する２つ以上の重鎖抗体を含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、例えば、ＣＤ３８、ＣＤ７３、またはＣＤ３９などのエクト酵素の重複しないエピトープに結合する２つ以上の重鎖抗体の相乗的組み合わせを含む。

【0155】

別の実施形態において、医薬組成物は、例えば、ＣＤ３８、ＣＤ７３、またはＣＤ３９などのエクト酵素上の２つ以上の重複しないエピトープに対する結合特異性を有する多重特異性（二重特異性を含む）重鎖抗体を含む。好ましい実施形態において、医薬組成物は、同じエピトープに結合する単一特異性抗体のいずれと比較しても相乗的に向上した特性を有する、例えばＣＤ３８、ＣＤ７３、またはＣＤ３９などのエクト酵素上の２つ以上の重複しないエピトープに結合特異性を有する多重特異性（二重特異性を含む）重鎖抗体を含む。

【0156】

本発明に従って使用される結合化合物の医薬組成物は、例えば凍結乾燥製剤または水溶液の形態として、所望の純度を有するタンパク質を任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤(例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することにより保存用に調製される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量及び濃度で投与対象に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

【0157】

非経口投与用の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、実質的に等張であり、適正製造基準（ＧＭＰ）条件下で製造される。医薬組成物は、単位剤形（すなわち、単回投与用量）で提供することができる。製剤は選択される投与経路によって決まる。本明細書の結合化合物は、静脈内注射または点滴または皮下投与によって投与することができる。注射投与の場合、本明細書の結合化合物を、水溶液、好ましくは注射部位の不快感を軽減するための生理学的に適合性を有する緩衝液として製剤化することができる。溶液は、上記に述べたように担体、賦形剤、または安定剤を含むことができる。あるいは、結合化合物は、使用に先立って適当なビヒクル、例えば無菌パイロジェンフリー水で戻すための凍結乾燥形態とすることもできる。

【0158】

抗ＣＤ３８抗体製剤については、例えば米国特許第９，０３４，３２４号に開示されている。同様の製剤を、本発明のＵｎｉＡｂ（商標）を含む重鎖抗体に使用することができる。皮下抗体製剤については、例えば、ＵＳ２０１６０３５５５９１及びＵＳ２０１６０１６６６８９に記載されている。

【0159】

製造品
本発明の態様は、本明細書に記載される疾患及び障害の治療に有用な本発明の１つ以上の結合化合物を含む製造品、すなわち「キット」を含む。一実施形態では、キットは、本明細書に記載される抗ＣＤ３８結合化合物を含む容器を含む。キットは、容器上の、または容器に付属したラベルまたは添付文書をさらに含んでもよい。「添付文書」なる用語は、かかる治療薬の適応症、使用法、投薬量、投与、禁忌症についての情報、及び／またはその使用に関する警告を含む、治療薬の市販のパッケージに通例含まれる説明書を指して用いられる。適当な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの各種の材料で形成することができる。容器は、状態を治療するうえで有効な本発明に記載される１つ以上の抗ＣＤ３８結合化合物またはその製剤、例えば、２つ以上の抗ＣＤ３８結合化合物の複合製剤を保持してもよく、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静注溶液バッグ、または皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであってよい）。ラベルまたは添付文書は、組成物ががんまたは免疫疾患などの選択された状態の治療に使用されることを示す。上記に代えるかまたは加えて、製造品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジをはじめとする、商業的な及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。

【0160】

キットは、１つ以上の結合化合物、及び存在する場合はそれらの複合製剤の投与のための指示書をさらに含むことができる。例えば、キットが第１の抗ＣＤ３８結合化合物を含む第１の医薬組成物及び第２の抗ＣＤ３８結合化合物を含む第２の医薬組成物を含む場合、キットは、必要とする患者に第１及び第２の医薬組成物の同時、順次、または別個の投与についての指示書をさらに含むことができる。キットが２つ以上の組成物を含む場合、キットは、分割されたボトルまたは分割されたホイルパケットなどの別々の組成物を入れるための容器を含んでもよいが、別々の組成物が単一の分割されていない容器に含まれてもよい。キットは、別々の成分の投与、またはそれらの複合製剤の投与のための指示書を含むことができる。

【0161】

使用方法
エクト酵素上の重複しないエピトープに結合する本明細書に記載される結合化合物、かかる結合化合物の相乗的組み合わせを含む組み合わせ、エクト酵素上の２つ以上の重複しないエピトープに結合特異性を有する多重特異性抗体、ならびにかかる抗体及び抗体の組み合わせを含む医薬組成物を使用して、標的エクト酵素の発現を特徴とする疾患及び状態を標的とすることができる。

【0162】

様々な実施形態において、エクト酵素は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ２０３、ＶＡＰ１、ＡＲＴ２、及びＭＴ１－ＭＭＰからなる群から選択される。

【0163】

特定の実施形態において、エクト酵素は、ＣＤ３８、ＣＤ７３及び／またはＣＤ３９である。

【0164】

ＣＤ３８は、２０ａａの短いＮ末端細胞質テールと２５６ａａの長い細胞外ドメインを有する４６ｋＤａのＩＩ型膜貫通糖タンパク質である（Ｍａｌａｖａｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１９９４，１５：９５－９７）。多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫（Ｓｈａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２０１７，６６（６）：６９７－７０３に概説）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）（Ｖａｉｓｉｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０１５，２９”３５６－３６８）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ｄＴ細胞ＡＬＬをはじめとする多くの血液悪性腫瘍におけるその高い発現レベルのため、ＣＤ３８は、血液悪性腫瘍を治療するための抗体ベースの治療法の有望なターゲットとなっている。ＣＤ３８は、加齢性のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）低下の主要な因子としての関与も示唆されており、ＣＤ３８の阻害とＮＡＤ前駆体との組み合わせは、代謝機能障害及び加齢性疾患の潜在的な治療法となりうることが示唆されている（例えば、Ｃａｍａｃｈｏ－Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２０１６，２３：１１２７－１１３９を参照）。ＣＤ３８はまた、喘息の顕著な特徴である気道過敏性の発症への関与が記載されており、かかる状態を治療するための標的として提案されている。

【0165】

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）代謝は、代謝性疾患及びアルツハイマー病をはじめとする多くの炎症性疾患で重要な役割を担っている。ＮＡＤは生体エネルギープロセスの主要な補酵素であり、ＣＤ３８を含むいくつかの酵素によるその切断は、細胞代謝、炎症反応、細胞死などの多くの生物学的プロセスの鍵となる（Ｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ，３９（４）：４２４－３６）。

【0166】

ＮＡＤ切断酵素であるＣＤ３８は、動物モデルにおいて腸の炎症を促進する。ＣＤ３８は、ＮＡＤ＋の分解、ならびにアデノシン二リン酸リボース（ＡＤＰＲ）及びサイクリックＡＤＰＲ（ｃＡＤＰＲ）などの細胞活性化代謝産物の生成に関与する多機能エクト酵素である。ＣＤ３８は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージなどの造血細胞で主に発現する。免疫細胞は、活性化及び分化の後にＣＤ３８の発現を増大させる。動物実験に基づくと、Ｔ細胞、マクロファージ、及び好中球のいずれの免疫反応もＣＤ３８によって調節されていると考えられる。高レベルのＣＤ３８発現とそれに関連するエクト酵素機能は、炎症性疾患の発症を促進するようである。対照的に、ＣＤ３８欠損症、及び付随するＮＡＤ濃度の増大は、炎症部位への細胞の動員を減らし、炎症誘発性サイトカインの産生を減少させる（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏｓ Ｏｎｅ，１０（５）：ｅ０１２６００７（２０１５）；Ｇｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ，０６ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１７，ｄｏｉ：１０．１１３６／ｇｕｔｊｎｌ－２０１７－３１４２４１；Ｇａｒｃｉａ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，８（１）：３３５７（２０１８））。自己免疫モデルにおいて、ＣＤ３８－／－マウスは、疾患の発症の改善、コラーゲン誘発関節炎モデルでの関節炎症の減少、及びデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）大腸炎モデルにおける腸の炎症の減少を示す（Ｇａｒｃｉａ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，８（１）：３３５７ （２０１８））。これらすべての結果を合わせると、結腸の炎症は、ＣＤ３８の活性化を介して細胞内のＮＡＤレベルの低下につながるという仮説が裏付けられる。その後のＮＡＤの低下は、抗炎症作用及び組織保護作用を有することが知られているＮＡＤ依存性デアセチラーゼ（サーチュイン）の活性を低下させる。

【0167】

ＣＤ３８に対するモノクローナル抗体は、多発性骨髄腫（ＭＭ）の治療に極めて有効であることが示されているものの、ＩＢＤの治療には適さない。現在、４種類のモノクローナル抗体でＣＤ３８＋悪性腫瘍の治療用に臨床試験が行われている。最も先進的なものは、２０１５年にＭＭの治療用にヒトでの使用がＦＤＡにより承認されたダラツムマブ（ＪａｎｓｓｅｎＢｉｏｔｅｃｈ）である。ＭＭ用に臨床試験中の３つの抗ＣＤ３８モノクローナル抗体はいずれも、同様の好ましい安全性及び有効性のプロファイルを示している（ｖａｎ ｄｅ Ｄｏｎｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１７，ｂｌｏｏｄ－２０１７－０６－７４０９４４；ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１７－０６－７４０９４４）。１つのモノクローナル抗体（ＴＡＫ－０７９）が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び関節リウマチなどの自己免疫疾患の治療用に臨床試験が行われている。抗ＣＤ３８モノクローナル抗体は、形質細胞以外にすべてのＮＫ細胞、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞の約５０％を含む、脾臓及び血液中の他のＣＤ３８＋細胞を枯渇させる。Ｔｒｅｇ細胞及び骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）などの重要な制御性免疫細胞は、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体による治療後にＭＭ患者で枯渇し、エフェクターＴ細胞の増殖が観察される（Ｋｒｅｊｃｉｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１２８ （３）：３８４－９４（２０１６））。おそらくは、抗腫瘍エフェクターＴ細胞の増殖は、ＭＭにおける抗ＣＤ３８ｍＡｂの有効性に寄与している。しかしながら、自己免疫疾患における重要な調節免疫細胞を除去すると、疾患の増悪につながる場合がある。

【0168】

ＣＤ３８の酵素機能の阻害は、炎症性疾患の治療に対する安全かつ効果的なアプローチとなる可能性がある。ＣＤ３８の強力な効力（Ｋｄ－５ｎＭ， Ｈａｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５）を有するものを含む、いくつかの小分子阻害剤が開発されている（Ｈａｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，５８（８）： ３５４８－７１（２０１５））。この化合物は、注射の６時間後にマウスの組織中のＮＡＤレベルを上昇させ、ＣＤ３８の阻害がマウスの細胞内ＮＡＤの上昇につながることを示している。しかしながら、ＣＤ３８は脳でも発現し、行動に一定の役割を有することから、こうした分子には重大な毒性のリスクがある。小分子化合物と対照的に、抗体は血液脳関門を通過できず、一般に小分子と比較して優れた標的特異性を持っているため、安全性プロファイルが大幅に向上すると考えられる。炎症性疾患には、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、移植片対宿主病などが含まれる。

【0169】

臨床試験中の抗体は細胞溶解に基づいて選択されたものであり、ＣＤ３８の生物学的機能はほとんど阻害しないが、これらの機能の調節はがん治療にも関係する可能性がある。Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら及びＣｈｅｎらによる最近の論文により、ＣＤ３８－ＮＡＤ ＋軸が肺癌及び黒色腫の前臨床モデルで重要であることが確立された。これらの研究は、ＣＤ３８によって負に調節される高レベルのＮＡＤ＋がエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の機能を維持することを示している。

【0170】

本明細書の重鎖単独抗ＣＤ３８抗体、抗体の組み合わせ、多重特異性抗体、及び医薬組成物を含む本明細書に記載される結合化合物は、上記に列記される状態及び疾患を含むがこれらに限定されない、ＣＤ３８の発現または過剰発現を特徴とする疾患及び状態の標的化に使用することができる。

【0171】

一態様では、本明細書のＣＤ３８結合化合物及び医薬組成物は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）及びＴ細胞ＡＬＬを含む、ＣＤ３８の発現を特徴とする血液悪性腫瘍を治療するために使用することができる。本発明のＣＤ３８結合化合物及び医薬組成物は、気道過敏性を特徴とする喘息及び他の状態、ならびにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の低下を特徴とする加齢性及び代謝機能障害を治療するために使用することもできる。本発明のＣＤ３８結合化合物及び医薬組成物は、大腸炎の治療に使用することもできる。

【0172】

ＭＭは、骨髄コンパートメント内での異常な形質細胞のモノクローナル増殖と蓄積を特徴とするＢ細胞悪性腫瘍である。ＭＭの現在の治療法は寛解につながることも多いが、ほとんどすべての患者が最終的に再発し、死亡する。同種造血幹細胞移植の場面で骨髄腫細胞の免疫介在性の消失の確かなエビデンスが存在するが、このアプローチの毒性は高く、治癒する患者はほとんどいない。一部のモノクローナル抗体は前臨床研究及び初期臨床試験でＭＭの治療に有望であることが示されているが、ＭＭに対するモノクローナル抗体治療の安定的な臨床効果は決定的には実証されてない。したがって、ＭＭに対する免疫療法を含む新たな治療法が強く求められている（Ｓｈａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ（前出）を参照）。

【0173】

本明細書のＣＤ３８結合化合物及び医薬組成物は、これらに限定されるものではないが、関節リウマチ（ＲＡ）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症（全身性強皮症、びまん性強皮症）、線維症、及び多発性硬化症（ＭＳ）を含む自己免疫疾患の治療に使用することもできる。本明細書のＣＤ３８結合化合物及び医薬組成物は、これらに限定されるものではないが、虚血性脳損傷、虚血性心臓損傷、虚血性ＧＩ損傷、及び虚血性腎臓損傷（例えば、急性腎臓虚血性損傷）を含む虚血性損傷の治療に使用することもできる。

【0174】

ＣＤ７３は、アデノシン受容体シグナル伝達を介して抗腫瘍Ｔ細胞免疫を制限することにより腫瘍増殖を促進する細胞外アデノシンを産生するエクト酵素として機能することが報告されている。ＣＤ７３は、乳癌、結腸癌、前立腺癌などの特定のがんで発現する。マウス腫瘍モデルにおけるＣＤ７３を標的とする小分子阻害剤またはモノクローナル抗体を用いた結果は、ＣＤ７３の発現を特徴とする腫瘍の増殖を制御するための、免疫療法を含む標的化ＣＤ７３療法の、単剤療法としての、または他の抗癌剤との併用による可能性を示唆するものである。

【0175】

ＣＤ３９及びＣＤ７３は、アデノシン産生による免疫抑制性微小環境の形成に極めて重要であると広く考えられてきた。ＣＤ３９の発現上昇が多くの上皮性及び血液悪性腫瘍で報告されており、慢性リンパ性白血病におけるその発現は予後不良との相関が示されている（Ｐｕｌｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｌｅｕｋ．２０１１；１１：３６７－３７２；Ｂａｓｔｉｄ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，３２：１７４３－１７５１；Ｂａｓｔｉｄ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．，３：２５４－２６５）。ＣＤ３９は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）でも高度に発現しており、ＣＤ３９欠損マウスにおけるＴｒｅｇの抑制活性の低下によって示されるように、それらの抑制機能に必要である（Ｄｅａｇｌｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，２０４：１２５７－１２６５）。ＣＤ３９は、Ｔｒｅｇ、腫瘍関連ストロマ、または悪性上皮細胞のいずれかに対するその酵素活性の増強により腫瘍形成を促進することで、抗腫瘍Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のアデノシン介在性免疫抑制及び化学療法によるＡＴＰ誘発性細胞死の中和をもたらし得ることが示唆されている（Ｂａｓｔｉｄ ｅｔ ａｌ．，２０１３ ａｎｄ ２０１５（前出）；Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，１３：２０６－２１６）。免疫抑制性のＣＤ３９／ＣＤ７３－アデノシン経路の調節が、癌治療における有望な免疫療法戦略として提案されている（Ｓｉｔｋｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１４，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２：５９８－６０５）。Ｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓ Ｒｅｓ，２０１５，７（６）：１１８１－１１８８も参照されたい。

【0176】

Ｔ細胞分化におけるＣＤ７３及びＣＤ３９エクトヌクレオチダーゼの役割の概説は、例えば、Ｂｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１５，５８９：３４５４－３４６０を参照されたい。

【0177】

疾患を治療するための本発明の組成物の有効な用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか別の動物であるか、投与される他の薬剤、及び処置が予防的なものであるか治療的なものであるかを含む多くの異なる要因に応じて異なる。通常、患者はヒトであるが、例えば、イヌ、ネコ、ウマなどのコンパニオンアニマル、例えば、ウサギ、マウス、ラットなどの実験用哺乳動物などの非ヒト哺乳動物を治療することもできる。治療用量は、安全性及び有効性を最適化するために滴定してもよい。

【0178】

投与量は、当業者によって容易に決定することが可能であり、必要に応じて、例えば、治療に対する対象の応答を変化させるうえで必要に応じて変更することが可能である。単回剤形を与えるために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療される宿主及び特定の投与様式に応じて異なる。単位剤形は一般的に約１ｍｇ～約５００ｍｇの有効成分を含む。

【0179】

いくつかの実施形態において、薬剤の治療的投与量は、約０．０００１～１００ｍｇ ／ｋｇ（宿主体重）、より一般的には０．０１～５ｍｇ ／ ｋｇの範囲とすることができる。例えば投与量は、１ｍｇ ／ｋｇ（体重）もしくは１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、または１～１０ｍｇ ／ ｋｇの範囲内とすることができる。例示的な治療計画では、２週間に１回、または月１回、または３～６ヶ月に１回の投与を行う。本発明の治療物は、通常、複数の機会に投与される。単回投与間の間隔は、週単位、月単位または年単位とすることができる。また、間隔は、患者の治療物の血中レベルを測定することによって示される場合、不規則であってもよい。あるいは、本発明の治療物は、徐放性製剤として投与してもよく、その場合、投与頻度を減らすことができる。用量及び頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期に応じて異なる。

【0180】

一般的に、組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの注射剤として調製され、また、注射に先立って液体溶媒中に溶解または懸濁するのに適した固体形態も調製することができる。本明細書の医薬組成物は、直接または固体（例えば、凍結乾燥）組成物を戻した後での静脈内または皮下投与に適している。製剤はまた、上記で述べたようにアジュバント効果を高めるために、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはコポリマーなどのリポソームまたは微粒子中に乳化またはカプセル化することができる。Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７，１９９０及びＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８：９７－１１９，１９９７。本発明の薬剤は、有効成分の持続的またはパルス放出を可能とする形で製剤化することができるデポー注射またはインプラント製剤の形態として投与することもできる。医薬組成物は一般に、無菌で、実質的に等張であり、米国食品医薬品局の適正製造基準（ＧＭＰ）規制のすべてに完全に準拠したものとして製剤化される。

【0181】

本明細書に記載される結合化合物の毒性は、細胞培養または実験動物で標準的な薬学的手順により、例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％致死用量）またはＬＤ_１００（集団の１００％致死用量）を決定することにより、測定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数である。これらの細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータを、ヒトでの使用に毒性のない投与量範囲を決定するうえで使用することができる。本明細書に記載される結合化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくない有効用量を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。正確な配合、投与経路、及び投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる。

【0182】

投与用の組成物は、一般に、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体に溶解された結合化合物を含む。様々な水性担体、例えば、緩衝生理食塩水などを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、望ましくない物質を一般的に含まない。これらの組成物は従来の周知の滅菌法によって滅菌することができる。組成物は、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び乳酸ナトリウムなどのｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤など、生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質を含むことができる。これらの製剤中の活性剤の濃度は大きく異なってよく、選択された特定の投与様式及び患者のニーズに応じて、主に液量、粘度、体重などに基づいて選択される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１５ｔｈ ｅｄ．，１９８０） ａｎｄ Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｌｍａｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９６）を参照）。

【0183】

本発明の活性剤及びその製剤、ならびに使用説明書を含む製造品、またはキット（上記に述べたもの）も本発明の範囲内に含まれる。キットは、少なくとも１つの追加の試薬、例えば化学療法薬などをさらに含むことができる。キットは、通常、キットの内容物の目的とする用途を示すラベルを含む。「ラベル」なる用語には、キットの表面に、もしくはキットと共に提供される、または他の形でキットに付属する、あらゆる文書または記録物が含まれる。

【0184】

以上、本発明を完全に記載したが、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修正を行うことができる点は当業者には明白であろう。

【0185】

材料及び方法
以下の材料及び方法を使用して、以下に記載する実施例を実施した。

【0186】

ＣＤ３８細胞結合
ＣＤ３８陽性細胞への結合を、ヒトＣＤ３８を安定的に発年するＲａｍｏｓ細胞株（ＡＴＣＣ）またはＣＨＯ細胞を使用したフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって評価した。要約すると、１０万個の標的細胞を４℃で３０分間、精製したＵｎｉＡｂｓ（商標）の希釈系列で染色した。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリーバッファー（１Ｘ ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３）で２回洗浄し、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）に結合したヤギＦ（ａｂ ’）_２抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０４２－０９）で染色して細胞に結合した抗体を検出した。４℃で２０分間インキュベートした後、細胞をフローサイトメトリーバッファーで２回洗浄し、次いで平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーで測定した。

【0187】

抗体誘導直接アポトーシス
抗体誘導直接アポトーシスによる細胞傷害性を、ＣＤ３８陽性Ｒａｍｏｓ細胞（ＡＴＣＣ）を使用して分析した。要約すると、４５０００個の標的細胞を２μｇ／ｍＬの精製ＵｎｉＡｂ（商標）で４８時間（３７℃、８％ＣＯ_２）処理した。インキュベーション後、細胞をアネキシンＶ結合バッファー（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２２０１）で２回洗浄し、アネキシンＶ及び７－ＡＡＤ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号６４０９４５及び４２０４０４）で染色した。次に、試料をフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析し、生細胞の割合（％）をアネキシンＶ及び７ＡＡＤについて陰性の集団として決定した。

【0188】

ＣＤ３８加水分解酵素活性アッセイ
ＣＤ３８加水分解酵素活性の阻害を測定するため、組換えヒトＣＤ３８タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）またはヒトＣＤ３８を発現するＣＨＯ細胞（１２５０００細胞／ウェル）を、加水分解酵素活性バッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ ショ糖、２５μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ７．５）中でそれぞれの精製抗ＣＤ３８ＵｎｉＡｂ（商標）と、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、ε－ＮＡＤ^＋（ＢｉｏＬｏｇカタログ番号Ｎ０１０）を最終濃度１５０μＭになるように添加した。蛍光産物の生成をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して１時間後（励起３００ｎｍ／発光４１０ｎｍ）に測定した。ＵｎｉＡｂ（商標）で処理したウェルからのシグナルを、ＣＤ３８タンパク質をアイソタイプコントロール抗体で処理した場合に観察される全酵素活性（最大）の割合（％）と比較することによって加水分解酵素の阻害率を評価した。

【実施例】

【0189】

実施例１：遺伝子のアセンブリ、発現、シークエンシング
リンパ節細胞で高度に発現される重鎖単独抗体をコードするｃＤＮＡを遺伝子アセンブリ用に選択し、発現ベクターにクローニングした。その後、これらの重鎖配列を、ＵｎｉＡｂ（商標）重鎖単独抗体（ＣＨ１を欠失させた、軽鎖のないもの）としてＨＥＫ細胞で発現させた。

【0190】

図１、２、３、及び５は、それぞれ、抗ＣＤ３８ＵｎｉＡｂｓ（商標）ファミリーＣＤ３８＿Ｆ１１、ＣＤ３８＿Ｆ１２、及びＣＤ３８＿Ｆ１３の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。これらの図は、試験したＵｎｉＡｂ（商標）のクローン番号、コントロールＵｎｉＡｂ（商標）に対するそれぞれのＣＤ３８結合ＵｎｉＡｂ（商標）の存在下における組換えＣＤ３８の加水分解酵素活性の阻害率（％）、及びＲａｍｏｓ細胞に対する細胞結合の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図１、２、３、及び５は、それぞれ、配列（ＣＤＲ配列、可変領域配列（アミノ酸とヌクレオチドの両方））、ならびにファミリーＦ１１、Ｆ１２、及びＦ１３のＣＤ３８結合重鎖抗体のＶＨ及びＶＪ遺伝子の使用も示す。さらなる配列を表４に示す。

【0191】

実施例２：抗ＣＤ３８ＵｎｉＡｂの細胞結合
図１及び２は、ＣＤ３８＿Ｆ１１及びＣＤ３８＿Ｆ１２ファミリーのメンバーのＲａｍｏｓ細胞への結合についての細胞結合データを示す。図６は、ヒトＣＤ３８を安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞への異なる濃度の抗ＣＤ３８ＵｎｉＡｂ ＣＤ３８＿Ｆ１１及びＣＤ３８＿Ｆ１２抗体の結合を示す。

【0192】

実施例３：ＣＤ３８の加水分解酵素活性の阻害におけるＣＤ３８結合重鎖抗体の相乗効果
図７に示すように、２つの固有の重鎖ＣＤＲ３配列ファミリー、ＣＤ３８＿Ｆ１１及びＣＤ３８＿Ｆ１２を代表するＵｎｉＡｂｓ（商標）は、単独で投与した場合にＣＤ３８の加水分解酵素活性を部分的に阻害したが、等モル濃度で混合した（組み合わせた）場合、ＣＤ３８加水分解酵素活性をより強く阻害した。

【0193】

図８は、二価のＵｎｉＡｂｓ（商標）によるＣＤ３８の加水分解酵素活性の酵素阻害を示す。２つの抗ＣＤ３８ＵｎｉＡｂｓ（商標）の混合物（ＣＤ３８＿Ｆ１１Ａ＋ＣＤ３８＿Ｆ１２Ａ）は、一方のアームがＣＤ３８＿Ｆ１１ＡのＶＨを含み、他方のアームがＣＤ３８＿Ｆ１２ＡのＶＨを含む二価重鎖抗体（ＣＤ３８＿Ｆ１１Ａ＿Ｆ１２Ａ）と、細胞の加水分解酵素活性の阻害において同等に効果的であった。ＩｇＧ１のＦｃテールまたはＩｇＧ４のＦｃテールを有するバイパラトピックＵｎｉＡｂｓ（商標）（ＣＤ３８＿Ｆ１１Ａ＿Ｆ１２Ａ）は、どちらも細胞に対する加水分解酵素活性を阻害した。これらのＵｎｉＡｂ（商標）及びそれらのＶＨドメインは、ＣＤ３８上の２つの非重複エピトープに結合する。

【0194】

図９は、ＵｎｉＡｂ（商標）のＣＤ３８＿Ｆ１３ＡまたはＣＤ３８＿Ｆ１３Ｂのいずれかとイサツキシマブとの混合物によるＣＤ３８の加水分解酵素活性の阻害を示す。イサツキシマブ単独ではＣＤ３８加水分解酵素活性を部分的に阻害したが、イサツキシマブとＣＤ３８＿Ｆ１３ＡまたはＣＤ３８＿Ｆ１３Ｂとの組み合わせは酵素活性をより強く阻害し、相乗効果を示した。

【0195】

図１０は、Ｄａｕｄｉ細胞の直接的な細胞毒性を示す。ＵｎｉＡｂ（商標）ＣＤ３８＿Ｆ１１Ａを等モル量のＣＤ３８＿Ｆ１２Ａと混合したところ、Ｄａｕｄｉ細胞のアポトーシスを誘導しないことが示された。ＣＤ３８＿Ｆ１１Ａ及びＣＤ３８＿Ｆ１２ＡのＶＨを含むバイパラトピックの二価抗体もＤａｕｄｉ細胞を殺傷しなかった。イサツキシマブをポジティブコントロールとして用いたところ、Ｄａｕｄｉ細胞を殺傷する強い能力が示された。

【0196】

図１１は、本発明の実施形態による２種類の二価（パネルＣ及びＤ）及び２種類の四価（パネルＡ及びＢ）ＵｎｉＡｂ（商標）のフォーマットの模式図を示す。これらの模式図は非限定的なものである。

【0197】

図１２は、ＣＨＯ細胞上で発現させたヒトＣＤ３８の加水分解酵素活性の、図１１に示される四価のＵｎｉＡｂ（商標）による酵素阻害を示す（パネルＢはこの例のフォーマットを表す）。全体的な設計は、最初に最も遠位に位置するＶＨのＩＤ、次にリンカーのグリシン－グリシン－グリシン－グリシン－セリン（ＧＧＧＧＳ（配列番号２９））、次にＦｃテールの近位に位置するＶＨのＩＤとなっている。四価のＵｎｉＡｂ（商標）は、ヒトＩｇＧ１とともに、ヒトＩｇＧ４をサイレンシングさせ、また、ヒトＩｇＧ１をサイレンシングさせて発現させた。いずれの四価抗体も、３３０２０４（ＣＤ３８Ｆ１２Ａとも呼ばれる）及び３０９１５７（ＣＤ３８Ｆ１１Ａとも呼ばれる）の２つのＵｎｉＡｂの混合物よりも完全かつより強力にＣＤ３８の加水分解酵素活性を阻害した。ＶＨの方向（Ｆｃの近位または遠位）及びＦｃアイソタイプも同様の効力を示した。

【0198】

図１３は、各ＵｎｉＡｂとイサツキシマブとの混合物の阻害を示す。各ＵｎｉＡｂ及びイサツキシマブは、４００ｎＭで個別に試験し、２００ｎＭの各抗体の混合物として試験した。イサツキシマブはＣＤ３８の加水分解酵素活性を部分的に（６０％）阻害した。各ＵｎｉＡｂは、加水分解酵素活性の部分遮断薬でもあった。これらの部分的遮断薬の混合物は、それ自体でイサツキシマブよりも強力にＣＤ３８の加水分解酵素活性を阻害することはできなかった。

【0199】

図１４は、各ＵｎｉＡｂの混合物によるＣＤ３８の加水分解酵素活性の阻害を示す。ＵｎｉＡｂ ＣＤ３８＿Ｆ１２Ａは、４００ｎＭで個別に試験し、他のＵｎｉＡｂと各抗体２００ｎＭで混合した。ＣＤ３８＿Ｆ１２Ａは、ＣＤ３８の加水分解酵素活性を部分的に（約５０％）阻害した。ＣＤ３８の他の部分阻害剤は、ＣＤ３８の加水分解酵素活性を阻害するうえでＣＤ３８＿Ｆ１２Ａとの相乗効果を示さなかった。例えば、ＣＤ３８＿Ｆ１３Ａは、イサツキシマブと組み合わせた場合に相乗効果を示すが、ＣＤ３８＿Ｆ１２Ａと組み合わせて投与した場合には阻害を増強しない。

【0200】

図１５は、各ＵｎｉＡｂの混合物によるＣＤ３８の加水分解酵素活性の阻害を示す。ＵｎｉＡｂ ＣＤ３８＿Ｆ１１Ａは、４００ｎＭで個別に試験し、他のＵｎｉＡｂと各抗体２００ｎＭで混合した。ＣＤ３８＿Ｆ１１Ａは、ＣＤ３８の加水分解酵素活性を部分的に（約５８％）阻害した。ＣＤ３８の他の部分阻害剤は、ＣＤ３８の加水分解酵素活性を阻害するうえでＣＤ３８＿Ｆ１１Ａとの相乗効果を示さなかった。例えば、ＣＤ３８＿Ｆ１３Ａは、イサツキシマブと共に投与した場合に相乗効果を示すが、ＣＤ３８＿Ｆ１１Ａと組み合わせた場合には阻害を増強しない。

【0201】

図１６は、ＣＨＯ細胞上で発現させたヒトＣＤ３８の加水分解酵素活性の、図１１に示される四価のＵｎｉＡｂ（商標）による酵素阻害を示す（パネルＢはＣＤ３８Ｆ１２Ａ＿２ＧＳ＿ＣＤ３８Ｆ１１Ａのフォーマットを表し、パネルＡはＣＤ３８Ｆ１２Ａ＿ ＩＨ／ＣＤ３８Ｆ１１Ａ＿ＩｇＫのフォーマットを表す）。全体的な設計は、最初に最も遠位に位置するＶＨの抗原結合ドメイン（ＩＤ）、次にリンカーのグリシン－グリシン－グリシン－グリシン－セリン（ＧＧＧＧＳ（配列番号２９））、次にＦｃ領域の近位に位置するＶＨの抗原結合ドメイン（ＩＤ）となっている。四価の各ＵｎｉＡｂ（商標）をヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域と共に発現させた。いずれの四価抗体もＣＤ３８の加水分解酵素活性を完全に阻害し、同等の効力を示した（パネルＡのフォーマットのＩＣ５０＝８．６ｎＭに対してパネルＢのフォーマットのＩＣ５０＝４．５ｎＭ）。

【0202】

実施例４：ＤＳＳ大腸炎モデルにおける加水分解酵素阻害性ＵｎｉＡｂの有効性
手順の説明：Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはヒトＣＤ３８ノックインマウスに飲料水中でＤＳＳ（０．５％～５％）を与える。低用量（０．５％～３％）では慢性大腸炎の発症をもたらし、高用量（２％～５％）では急性大腸炎の発症をもたらす。大腸炎の後、体重、潜血、及び腸の炎症の他のマーカーを測定する（Ｃｈａｓｓａｉｎｇ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ（ＤＳＳ）－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．”Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１４． １０４：ｐ．Ｕｎｉｔ １５ ２５）。体重、腸組織の組織学的検査、及び結腸の長さを用いて処置の有効性の評価を行う（Ｃｈａｓｓａｉｎｇ，Ｂ．， ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ（ＤＳＳ）－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ”，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１４，１０４：ｐ．Ｕｎｉｔ １５ ２５）。マウスに週１回、２回、または３回、選択したＵｎｉＡｂを０．５ｍｇ ／ ｋｇ～５ｍｇ ／ ｋｇの範囲の用量で静脈内注射することによって処置する。

【0203】

動物及び種の選択：実験は、ヒトＣＤ３８ノックインモデルまたは野生型マウスで行う。Ｃ５７ＢＬ／Ｃマウス系統または他の感受性マウス系統が使用されており、ヒトにおけるＩＢＤの広く受け入れられているモデルとなっている。性別：雄と雌、年齢：４週～２～３歳。体重：可変。

【0204】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるヒトＣＤ３８構成的ノックインモデルの作製：エクソン１及び部分的イントロン１のコード配列を、「ヒトＣＤ３８のＣＤＳ－ｐｏｌｙＡ」カセットに置き換える。ターゲティングベクターを作製するため、Ｃ５７ＢＬ／６ライブラリーからのＢＡＣクローンＲＰ２４－１６３Ｆ１０またはＲＰ２３－５８Ｃ２０をテンプレートとして使用したＰＣＲによって相同性アームを生成する。ターゲティングベクター内で、ＮｅｏカセットはＳＤＡ（自己欠失アンカー）部位で挟まれている。ＤＴＡをネガティブセレクションに使用する。Ｃ５７ＢＬ／６ＥＳ細胞を遺伝子ターゲティングに使用する。ヒトＣＤ３８導入遺伝子についてヘテロ接合性のファウンダー動物を作製し、その後、交配させてホモ接合性とする。

【0205】

サンプルサイズ：各群８匹以上の動物を飲料水中のＤＳＳに曝露し、加水分解酵素ブロッキング抗体またはコントロール抗体で処置する。一部の測定は、確実な生物学的及び統計的検出力を得るために少なくとも２～３回繰り返す。一般的に、過去の生化学的及び生理学的研究では、ｎ＝４～６匹の動物のサンプルサイズが、２標本ｔ検定を両側有意水準０．０５で用いて各処置条件間で１．６ＳＤ単位の有効サイズを検出するうえで適当な統計的検定力（つまり、８０％の検定力）を与えることが示されている。抗ＣＤ３８抗体は、ＤＳＳ動物モデルにおいて炎症を統計的に有意に減少させ、臨床スコア（体重、便中の血液、及び下痢の複合）を改善する。

【0206】

実施例５：ＣＤ３８加水分解酵素活性の阻害
ＣＤ３８加水分解酵素活性を阻害する本発明の実施形態による異なる結合化合物の能力を評価した。各結合化合物を、２０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．２中、０．９７ｍｇ ／ ｍＬの濃度で配合した。試験物質は使用当日まで－８０℃で冷凍保存した。細胞表面のＣＤ３８加水分解酵素活性を、ヒトＣＤ３８を発現するように安定的にトランスフェクトしたＣＤ３８陽性細胞株であるＤａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ、及びＣＨＯ細胞を使用して評価した。各ＣＤ３８陽性細胞株を、抗体の存在下または非存在下でエテノＮＡＤ基質とインキュベートした。３００ｎｍの励起と４１０ｎｍの発光における蛍光を経時的に測定した。

【0207】

細胞表面ＣＤ３８加水分解酵素阻害アッセイ：３００ｎｍの励起及び４１０ｎｍの発光における蛍光をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘで経時的に分析した。飽和する前の時点で非処理ＲＬＵを実験ＲＬＵで割って、最大ＣＤ３８活性の割合（％）を求める。

【0208】

図１７に示される結果は、各結合化合物が、ヒトＣＤ３８を発現するように安定的にトランスフェクトしたＤａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ、及びＣＨＯ細胞上の細胞表面ＣＤ３８の加水分解酵素活性をそれぞれ３．４ ｎＭ、５．１ ｎＭ、及び９．０ｎＭのＥＣ５０値で強力に阻害することを示している。最大阻害率は８２～８８％の範囲であった。これらの結果は、各結合化合物が細胞表面ＣＤ３８の加水分解酵素活性の強力な阻害剤であることを示している。

【0209】

実施例６：アイソタイプ及び各価数フォーマットの活性の概要
本発明の実施形態による異なる結合化合物、ならびに参照結合化合物としてイサツキシマブ及びダラツムマブについて酵素阻害活性、細胞結合活性、及びアポトーシス活性を評価した。これらの活性の相対レベルを定量化し、図１８に表の形に要約して示す。

【0210】

実施例７：ＮＡＤ＋アッセイ
ＣＤ３８のエクトＮＭＮａｓｅ活性を本発明の結合化合物により遮断することによって、ＣＤ３８を発現するＢ細胞株Ｒａｍｏｓ及びＤａｕｄｉ内でＮＡＤ＋のＮＭＮ介在性の増加が高まるかどうかを評価する実験を行った。このアッセイは、ＮＡＤ＋がＮＡＤＨに還元される酵素サイクリング反応に基づいたものである。ＮＡＤ＋は、比色プローブと反応して着色生成物を生成する。色の濃さは、試料中のＮＡＤ＋及びＮＡＤＨに比例する。酸化型が塩基性溶液中で加熱することにより選択的に破壊されるのに対して、還元型は酸性溶液中で安定的でない。

【0211】

各結合化合物を、２０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．２中、０．９７ｍｇ ／ ｍＬの濃度で配合した。試験物質は使用当日まで－８０℃で冷凍保存した。

【0212】

図１９に示される結果は、二重特異性、二価の三本鎖結合化合物が、ＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓ細胞でＮＭＮの存在下で、ＮＭＮの非存在下と比較してＮＡＤ ＋レベルを著しく増加させたことを示している。これらの結果は、ＤａｕｄｉではなくＲａｍｏｓにおいてイサツキシマブの場合にＮＡＤ＋増加に微妙な差があることを示している。これはおそらく、イサツキシマブはＣＤ３８酵素遮断薬でもあるが、細胞の直接アポトーシスも誘発し、ＲａｍｏｓがＤａｕｄｉよりも感受性が低いことによるものと考えられる。イサツキシマブは２４時間でＤａｕｄｉ細胞の直接アポトーシスを引き起こす。

【0213】

ＮＡＤ＋のそのような増加は、アイソタイプ処理細胞では、または結合化合物の非存在下では観察されず、ＮＭＮの存在下または非存在下でのＮＡＤ＋の増加の効果がＣＤ３８酵素活性の阻害と完全に関連していることを示している。

【0214】

実施例８：ＭＬＲにおけるＴ細胞の増殖
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を活性化することなくＣＤ３８加水分解酵素活性を阻害する本発明の実施形態による異なる結合化合物の能力を評価した。ＭＬＲは、ＭＨＣが一致しない免疫細胞同士が相互作用し、Ｔ細胞の過剰増殖及びサイトカイン放出の悪化による免疫反応を誘発する場合に生じる。この現象は、Ｔ細胞結合抗体、または一般にエフェクター機能を示す治療抗体でより顕著である。各結合化合物を、２０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．２中、０．９７ｍｇ ／ ｍＬの濃度で配合した。試験物質は使用当日まで－８０℃で冷凍保存した。

【0215】

ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖及びＩＦＮγ産生を評価する分析を行った。結果を表２０に示す。パネルＡは、二重特異性、二価の三本鎖結合化合物が、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖の割合（％）の増加を引き起こさなかったのに対して、ダラツムマブではＣＤ４ Ｔ細胞増殖の増加をもたらしたことを示している。ＣＤ４ Ｔ細胞増殖の割合（％）は、他の様々な結合化合物についてパネルＣにも示されている。ＩＦＮγ産生はパネルＢに示され、ダラツムマブがＩＦＮγ産生の増加を引き起こしたのに対して、他の結合化合物はＩｇＧ４ ｉｓｔｐコントロールと比較してＩＦＮγ産生に影響しなかったことを示している。

【0216】

この研究の結果は、ダラツムマブがＭＬＲの際のＴ細胞増殖及びＩＦＮγ産生を悪化させるのに対して、二重特異性の二価の三本鎖結合化合物はＭＬＲの際のＴ細胞活性化を誘導しないことを示している。

【0217】

実施例９：ＩｇＧ４二価によるシクラーゼの部分的阻害
図１０のパネルＤに示されるような二重特異性、二価の三本鎖結合化合物がＣＤ３８シクラーゼ活性を阻害する能力を評価した。結合化合物を、２０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．２中、０．９７ｍｇ ／ ｍＬの濃度で配合した。試験物質は使用当日まで－８０℃で冷凍保存した。細胞表面のＣＤ３８シクラーゼ活性を、ヒトＣＤ３８を発現するように安定的にトランスフェクトしたＣＤ３８陽性細胞株であるＤａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ、及びＣＨＯ細胞を使用して評価した。各ＣＤ３８陽性細胞株を、結合化合物の存在下または非存在下でＮＧＤ＋基質とインキュベートした。３００ｎｍの励起と４１０ｎｍの発光における蛍光を経時的に測定した。

【0218】

細胞表面ＣＤ３８シクラーゼ酵素阻害アッセイ：３００ｎｍの励起及び４１０ｎｍの発光における蛍光をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘで経時的に分析した。飽和する前の時点で非処理ＲＬＵを実験ＲＬＵで割って、最大ＣＤ３８活性の割合（％）を求める。

【0219】

図２１に示される結果は、二重特異性、二価の三本鎖結合化合物が、ヒトＣＤ３８を発現するように安定的にトランスフェクトしたＲａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、及びＣＨＯ細胞株上のＣＤ３８のシクラーゼ活性を、それぞれ３．３ｎＭ、１．６ｎＭ、及び２９．２ｎＭのＥＣ５０値で部分的に阻害したことを示している。最大阻害率は５７～６１％の範囲であった。これらの結果は、結合化合物がＣＤ３８シクラーゼ活性の部分阻害剤であることを示している。

【0220】

実施例１０：オンターゲット及びオフターゲットの細胞結合
図１１のパネルＤに示されるような二重特異性、二価の三本差結合化合物のオンターゲット及びオフターゲットの細胞結合の評価を行った。結合化合物を、２０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．２中、０．９７ｍｇ ／ ｍＬの濃度で配合した。試験物質は使用当日まで－８０℃で冷凍保存した。ＣＤ３８陽性及びＣＤ３８陰性細胞株への結合をフローサイトメトリーを使用して評価した。使用したＣＤ３８陽性細胞株は、ＣＤ３８を安定的に発現するようにトランスフェクトしたＤａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ、及びＣＨＯ細胞株であった。使用したＣＤ３８陰性細胞株は、２９３－Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ、ＨＬ－６０、Ｋ５６２、及びＣＨＯであった。

【0221】

細胞結合のフローサイトメトリー分析： 染色していないウェルの平均ＭＦＩをバックグラウンドシグナルとして設定した。各実験試料のバックグラウンドに対する倍数を計算するため、実験試料のＭＦＩを平均バックグラウンドＭＦＩで割った。

【0222】

図２２に示される標的細胞結合の結果は、二重特異性、二価の三本鎖結合化合物が、それぞれ５０．２５ｎＭ、７０．２ｎＭ、及び３９．６７ｎＭのＥＣ５０値でＲａｍｏｓ、ＣＨＯ ＨｕＣＤ３８、及びＤａｕｄｉ細胞に結合することを示している。二重特異性、二価の三本差結合化合物は、図２３に示されるように、試験したＣＤ３８陰性細胞株（２９３－Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ、ＣＨＯ、Ｋ５６２、及びＨＬ－６０）に結合していない。これらの結果は、二重特異性、二価の三本鎖結合化合物がＣＤ３８に特異的に結合し、オフターゲット細胞株には結合しないことを示している。

【0223】

実施例１１：直接アポトーシス
図１０のパネルＤに示されるような二重特異性、二価の三本鎖結合化合物が直接アポトーシスを誘導する能力を評価した。結合化合物を、２０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．２中、０．９７ｍｇ ／ ｍＬの濃度で配合した。試験物質は使用当日まで－８０℃で冷凍保存した。

【0224】

直接アポトーシスの誘導は、フローサイトメトリーを使用したアネキシンＶ及び７－ＡＡＤ染色によって評価した。アネキシンＶは、原形質膜の外側のリーフレットに存在する場合にアポトーシスのマーカーとなるホスファチジルセリンに結合する能力によってアポトーシス細胞を検出するために一般的に使用されている。７－ＡＡＤは、膜が損傷している死にかけの細胞または死んだ細胞に取り込まれる二本鎖ＤＮＡに結合する。この研究で使用したＣＤ３８陽性細胞株はＤａｕｄｉ及びＲａｍｏｓ細胞であった。

【0225】

直接アポトーシスのフローサイトメトリー分析：クワッドゲートを用いて初期アポトーシス細胞（アネキシンＶ＋、７－ＡＡＤ－）、後期アポトーシス（アネキシンＶ＋、７－ＡＡＤ＋）、及び生細胞（アネキシンＶ＋、７－ＡＡＤ＋）を区別した。結合化合物の濃度をＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ ８の生存率に対してプロットした。得られたプロットを非線形回帰に当てはめてＥＣ５０を決定した。

【0226】

図２４に示される結果は、二重特異性、二価の三本鎖結合化合物の結合が、Ｄａｕｄｉ細胞またはＲａｍｏｓ細胞のいずれの直接アポトーシスも引き起こさなかったことを示している。イサツキシマブの結合は、Ｄａｕｄｉ細胞及びＲａｍｏｓ細胞の両方に直接アポトーシスを引き起こし、最大アポトーシス率はそれぞれ５７％と３７％であった。これらの結果は、二重特異性、二価の三本鎖結合化合物が、結合時にＣＤ３８陽性細胞の望ましくないアポトーシスを引き起こさないことを示している。

【0227】

添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は以下の条項によっても定義される。

【0228】

１．エクト酵素上の第１のエピトープに結合親和性を有する第１のポリペプチドと、エクト酵素上の第２の重複しないエピトープに結合親和性を有する第２のポリペプチドと、を含む、二重特異性結合化合物。

【0229】

２．前記第１のポリペプチドが前記第１のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む、条項１に記載の二重特異性結合化合物。

【0230】

３．前記第２のポリペプチドが、前記第２のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む、条項２に記載の二重特異性結合化合物。

【0231】

４．前記第１及び第２のポリペプチドがそれぞれ、ヒンジ領域の少なくとも一部を含む、条項１に記載の二重特異性結合化合物。

【0232】

５．前記第１及び第２のポリペプチドがそれぞれ、少なくとも１つのＣＨドメインを含む、条項４に記載の二重特異性結合化合物。

【0233】

６．前記ＣＨドメインが、ＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４ドメインを含む、条項５に記載の二重特異性結合化合物。

【0234】

７．前記ＣＨドメインが、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む、条項６に記載の二重特異性結合化合物。

【0235】

８．前記CHドメインが、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ４ドメインを含む、条項６に記載の二重特異性結合化合物。

【0236】

９．前記ＣＨドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含む、条項６に記載の二重特異性結合化合物。

【0237】

１０．前記ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域領域が、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である、条項９に記載の二重特異性結合化合物。

【0238】

１１．前記ＣＨドメインが、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域を含む、条項６に記載の二重特異性結合化合物。

【0239】

１２．前記ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域領域が、サイレンシングされたヒトＩｇＧ４のＦｃ領域である、条項１１に記載の二重特異性結合化合物。

【0240】

１３．前記ＣＨドメインが、ＣＨ１ドメインを含まない、条項６に記載の二重特異性結合化合物。

【0241】

１４．前記第１及び第２のポリペプチドの前記ＣＨ２及び／または前記ＣＨ３及び／または前記ＣＨ４ドメイン間に非対称的界面を含む、条項６に記載の二重特異性結合化合物。

【0242】

１５．前記第１のポリペプチドが、前記第１のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の第１の抗原結合ドメインと、前記第２のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の第２の抗原結合ドメインとを含む、条項１に記載の二重特異性結合化合物。

【0243】

１６．前記第１と前記第２の抗原結合ドメインとがポリペプチドリンカーによって連結されている、条項１５に記載の二重特異性結合化合物。

【0244】

１７．前記ポリペプチドリンカーが、配列番号４５の配列からなる、条項１６に記載の二重特異性結合化合物。

【0245】

１８．前記第２のポリペプチドが、前記第１のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の第１の抗原結合ドメインと、前記第２のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の第２の抗原結合ドメインとを含む、条項１５に記載の二重特異性結合化合物。

【0246】

１９．前記第１と前記第２の抗原結合ドメインとがポリペプチドリンカーによって連結されている、条項１８に記載の二重特異性結合化合物。

【0247】

２０．前記ポリペプチドリンカーが、配列番号４５の配列からなる、条項１９に記載の二重特異性結合化合物。

【0248】

２１．前記第１及び第２のポリペプチドがそれぞれ、ヒンジ領域の少なくとも一部を含む、条項１５に記載の二重特異性結合化合物。

【0249】

２２．前記第１及び第２のポリペプチドがそれぞれ、少なくとも１つのＣＨドメインを含む、条項２１に記載の二重特異性結合化合物。

【0250】

２３．前記ＣＨドメインが、ＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４ドメインを含む、条項２２に記載の二重特異性結合化合物。

【0251】

２４．前記ＣＨドメインが、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む、条項２３に記載の二重特異性結合化合物。

【0252】

２５．前記ＣＨドメインが、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ４ドメインを含む、条項２３に記載の二重特異性結合化合物。

【0253】

２６．前記ＣＨドメインが、ＣＨ１ドメインを含まない、条項２３に記載の二重特異性結合化合物。

【0254】

２７．前記ＣＨドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含む、条項２２に記載の二重特異性結合化合物。

【0255】

２８．前記ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域領域が、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である、条項２７に記載の二重特異性結合化合物。

【0256】

２９．前記ＣＨドメインが、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域を含む、条項２２に記載の二重特異性結合化合物。

【0257】

３０．前記ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域領域が、サイレンシングされたヒトＩｇＧ４のＦｃ領域である、条項２９に記載の二重特異性結合化合物。

【0258】

３１．それぞれが、前記第１のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む第１及び第２の重鎖ポリペプチドと、それぞれが、前記第２のエピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む第１及び第２の軽鎖ポリペプチドと、を含む、条項１に記載の二重特異性結合化合物。

【0259】

３２．前記第１及び第２の重鎖ポリペプチドがそれぞれ、ヒンジ領域の少なくとも一部を含む、条項３１に記載の二重特異性結合化合物。

【0260】

３３．前記第１及び第２の重鎖ポリペプチドがそれぞれ、少なくとも１つのＣＨドメインを含む、条項３１に記載の二重特異性結合化合物。

【0261】

３４．前記ＣＨドメインが、ＣＨ１及び／またはＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４ドメインを含む、条項３３に記載の二重特異性結合化合物。

【0262】

３５．前記ＣＨドメインが、ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む、条項３３に記載の二重特異性結合化合物。

【0263】

３６．前記ＣＨドメインが、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ４ドメインを含む、条項３３に記載の二重特異性結合化合物。

【0264】

３７．前記第１及び第２の軽鎖ポリペプチドがそれぞれ、ＣＬドメインを含む、条項３１に記載の二重特異性結合化合物。

【0265】

３８．前記ＣＨドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含む、条項３３に記載の二重特異性結合化合物。

【0266】

３９．前記ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域領域が、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である、条項３８に記載の二重特異性結合化合物。

【0267】

４０．前記ＣＨドメインが、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域を含む、条項３３に記載の二重特異性結合化合物。

【0268】

４１．前記ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域領域が、サイレンシングされたヒトＩｇＧ４のＦｃ領域である、条項４０に記載の二重特異性結合化合物。

【0269】

４２．前記エクトザイムが、ＣＤ３８である、条項１～４１のいずれか１項に記載の二重特異性結合化合物。

【0270】

４３．ＣＤ３８上の前記第１のエピトープまたは前記第２のエピトープに結合親和性を有する前記重鎖抗体の前記抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１～５のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ１配列、及び／または（ｉｉ）配列番号６～１２のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ２配列、及び／または（ｉｉｉ）配列番号１３～１７のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ３配列を含む、条項４２に記載の二重特異性結合化合物。

【0271】

４４．前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列が、ヒトフレームワーク内に存在する、条項４３に記載の二重特異性結合化合物。

【0272】

４５．（ｉ）配列番号１～５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、及び／または（ｉｉ）配列番号６～１２からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び／または（ｉｉｉ）配列番号１３～１７からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む、条項４３または４４に記載の二重特異性結合化合物。

【0273】

４６．（ｉ）配列番号１～５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、（ｉｉ）配列番号６～１２からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、（ｉｉｉ）配列番号１３～１７からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む、条項４５に記載の二重特異性結合化合物。

【0274】

４７．配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列、または、配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列、または、配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１７のＣＤＲ３配列を含む、条項４６に記載の二重特異性結合化合物。

【0275】

４８．ＣＤ３８上の前記第１のエピトープに結合親和性を有する前記重鎖抗体の前記抗原結合ドメインが、配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含み、ＣＤ３８上の前記第２のエピトープに結合親和性を有する前記重鎖抗体の前記抗原結合ドメインが、配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列を含む、条項４７に記載の二重特異性結合化合物。

【0276】

４９．配列番号１８～２８の配列のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変領域配列を含む、条項４３～４８のいずれか１項に記載の二重特異性結合化合物。

【0277】

５０．配列番号１８～２８からなる群から選択される可変領域配列を含む、条項４９に記載の二重特異性結合化合物。

【0278】

５１．ＣＤ３８上の前記第１のエピトープに結合親和性を有する前記重鎖抗体の前記抗原結合ドメインが配列番号１８の可変領域配列を含み、ＣＤ３８上の前記第２のエピトープに結合親和性を有する前記重鎖抗体の前記抗原結合ドメインが配列番号２３の可変領域配列を含む、条項５０に記載の二重特異性結合化合物。

【0279】

５２．ＣＤ３８に結合する重鎖抗体であって、（ｉ）配列番号１～５のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ１配列、及び／または（ｉｉ）配列番号６～１２のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ２配列、及び／または（ｉｉｉ）配列番号１３～１７のアミノ酸配列のいずれかに２個以下の置換を有するＣＤＲ３配列を含む抗原結合ドメインを含む、前記重鎖抗体。

【0280】

５３．前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列がヒトフレームワーク内に存在する、条項５２に記載の重鎖抗体。

【0281】

５４．ＣＨ１配列を含まない重鎖定常領域配列をさらに含む、条項５２に記載の重鎖抗体。

【0282】

５５．（ａ）配列番号１～５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、及び／または（ｂ）配列番号６～１２からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び／または（ｃ）配列番号１３～１７からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む、条項５２～５４のいずれか１項に記載の重鎖抗体。

【0283】

５６．（ａ）配列番号１～５からなる群からされるＣＤＲ１配列、及び（ｂ）配列番号６～１２からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び（ｃ）配列番号１３～１７からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む、条項５５に記載の重鎖抗体。

【0284】

５７．配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列、または、配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列、または、配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１７のＣＤＲ３配列を含む、条項５６に記載の重鎖抗体。

【0285】

５８．配列番号１８～２８の配列のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変領域配列を含む、条項５２～５７のいずれか１項に記載の重鎖抗体。

【0286】

５９．配列番号１８～２８からなる群から選択される可変領域配列を含む、条項５８に記載の重鎖抗体。

【0287】

６０．単一特異性である、条項５２～５９のいずれか１項に記載の重鎖抗体。

【0288】

６１．多重特異性である、条項５２～５９のいずれか１項に記載の重鎖抗体。

【0289】

６２．二重特異性である、条項６１に記載の重単独抗体。

【0290】

６３．同じＣＤ３８タンパク質上の２つの異なるエピトープに結合親和性を有する、条項６２に記載の重鎖抗体。

【0291】

６４．前記２つの異なるエピトープが、重複しないエピトープである、条項６３に記載の重鎖抗体。

【0292】

６５．エフェクター細胞に結合親和性を有する、条項６１に記載の重鎖抗体。

【0293】

６６．Ｔ細胞抗原に結合親和性を有する、条項６１に記載の重鎖抗体。

【0294】

６７．ＣＤ３に結合親和性を有する、条項６６に記載の重鎖抗体。

【0295】

６８．ＣＡＲ－Ｔフォーマットである、条項５２～６７のいずれか１項に記載の重鎖抗体。

【0296】

６９．第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の重複しないＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する二重特異性結合化合物であって、（ａ）第１のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する第１のポリペプチドであって、（ｉ）配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む重鎖抗体の抗原結合ドメインと、（ｉｉ）ヒンジ領域の少なくとも一部と、（ｉｉｉ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメインと、を含む前記第１のポリペプチドと、（ｂ）前記第２のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する第２のポリペプチドであって、（ｉ）配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列を含む重鎖抗体の抗原結合ドメインと、（ｉｉ）ヒンジ領域の少なくとも一部と、（ｉｉｉ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメインと、を含む前記第２のポリペプチドと、（ｃ）前記第１のポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインと前記第２のポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインとの間の非対称的界面と、を含む、前記二重特異性結合化合物。

【0297】

７０．ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、及びサイレンシングされたヒトＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選択されるＦｃ領域を含む、条項６９に記載の二重特異性結合化合物。

【0298】

７１．第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の重複しないＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する二重特異性結合化合物であって、２つの同じポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、（ｉ）配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む、前記第１のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の第１の抗原結合ドメインと、（ｉｉ）配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列を含む、前記第２のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の第２の抗原結合ドメインと、（ｉｉｉ）ヒンジ領域の少なくとも一部と、（ｉｖ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメインとを含む、二重特異性結合化合物。

【0299】

７２．ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、及びサイレンシングされたヒトＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選択されるＦｃ領域を含む、条項71に記載の二重特異性結合化合物。

【0300】

７３．第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の重複しないＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する二重特異性結合化合物であって、（ａ）それぞれが、（ｉ）抗原配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号１３のＣＤＲ３配列を含む、第１のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の結合ドメインと、（ｉｉ）ヒンジ領域の少なくとも一部と、（ｉｉｉ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメインと、を含む第１及び第２の重鎖ポリペプチドと、（ｂ）それぞれが、（ｉ）配列番号３のＣＤＲ１配列、配列番号９のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６のＣＤＲ３配列を含む、第２のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の抗原結合ドメインと、（ｉｉ）ＣＬドメインと、を含む第１及び第２の軽鎖ポリペプチドと、を含む、二重特異性結合化合物。

【0301】

７４．ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、及びサイレンシングされたヒトＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選択されるＦｃ領域を含む、条項７３に記載の二重特異性結合化合物。

【0302】

７５．条項１～７４のいずれか１項に記載の結合化合物または重鎖抗体を含む、医薬組成物。

【0303】

７６．条項５２～６８のいずれか１項に記載の結合化合物または重鎖抗体と、ＣＤ３８に結合する第２の抗体とを含む、治療的組み合わせ。

【0304】

７７．前記ＣＤ３８に結合する第２の抗体が、イサツキシマブまたはダラツムマブである、条項７６に記載の治療的組み合わせ。

【0305】

７８．ＣＤ３８の発現を特徴とする疾患を治療するための方法であって、前記疾患を有する対象に条項１～７４のいずれか１項に記載の結合化合物もしくは重鎖抗体、または条項７５に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。

【0306】

７９．前記疾患が、ＣＤ３８の加水分解酵素酵素活性によって特徴付けられる、条項７８に記載の方法。

【0307】

８０．前記疾患が、大腸炎である、条項７８に記載の方法。

【0308】

８１．前記疾患が、多発性骨髄腫（ＭＭ）である、条項７８に記載の方法。

【0309】

８２．前記疾患が、自己免疫疾患である、条項７８に記載の方法。

【0310】

８３．前記疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）である、条項８２に記載の方法。

【0311】

８４．前記疾患が、尋常性天疱瘡（ＰＶ）である、条項８２に記載の方法。

【0312】

８５．前記疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、条項８２に記載の方法。

【0313】

８６．前記疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性強皮症または線維症である、条項８２に記載の方法。

【0314】

８７．前記疾患が、虚血性損傷である、条項７８に記載の方法。

【0315】

８８．前記虚血性損傷が、虚血性脳損傷、虚血性心臓損傷、虚血性胃腸損傷、または虚血性腎臓損傷である、条項８７に記載の方法。

【0316】

８９．ＣＤ３８に結合する第２の抗体を前記対象に投与することをさらに含む、条項７８～８８のいずれか１項に記載の方法。

【0317】

９０．前記ＣＤ３８に結合する第２の抗体が、イサツキシマブまたはダラツムマブである、条項８９に記載の方法。

【0318】

９１．条項１～７４のいずれか１項に記載の結合化合物または重鎖抗体をコードするポリヌクレオチド。

【0319】

９２．条項９１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【0320】

９３．条項９２に記載のベクターを含む細胞。

【0321】

９４．前記結合化合物または前記重鎖抗体の発現を許容する条件下で条項８６に記載の細胞を増殖させることと、前記細胞及び／または前記細胞を増殖させた細胞培養培地から前記結合化合物または前記重鎖抗体を単離することと、を含む、条項１～７４のいずれか１項に記載の結合化合物または重鎖抗体を生産する方法。

【0322】

９５．ＵｎｉＲａｔ動物をエクト酵素で免疫することと、エクト酵素結合重鎖配列を同定することと、を含む、条項１～７４のいずれか１項に記載の結合化合物または重鎖抗体を製造する方法。

【0323】

以上、本発明の好ましい実施形態について本明細書に図示及び記載したが、かかる実施形態はあくまで実例として与えられるものに過ぎない点は当業者には明らかであろう。ここで、当業者には、多数の変形、変更、及び置換を本発明から逸脱することなく想定されるであろう。本明細書に記載される発明の実施形態の様々な代替物を本開示の実施に当たって用いることが可能である点を理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲に含まれる方法及び構造、ならびにそれらの等価物が特許請求の範囲によって網羅されるものとする。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

2022505445000001.app

【国際調査報告】