▶ インスティチュート フォー ベーシック サイエンスの特許一覧 ▶ ポステック アカデミー−インダストリー ファンデーションの特許一覧
特表2022-505483ＴＲＥＧ細胞を誘導する酵母由来多糖体の構造及び機能特性
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-14
(54)【発明の名称】ＴＲＥＧ細胞を誘導する酵母由来多糖体の構造及び機能特性
(51)【国際特許分類】
C08B 37/00 20060101AFI20220106BHJP
A61K 31/736 20060101ALI20220106BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20220106BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220106BHJP
A23L 33/125 20160101ALI20220106BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20220106BHJP
【ＦＩ】
C08B37/00
A61K31/736
A61P37/02
A61K35/17 Z
A23L33/125
C12N5/0783 ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021521531
(86)(22)【出願日】2019-07-29
(85)【翻訳文提出日】2021-05-31
(86)【国際出願番号】 KR2019009422
(87)【国際公開番号】W WO2020080653
(87)【国際公開日】2020-04-23
(31)【優先権主張番号】10-2018-0123814
(32)【優先日】2018-10-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519444052
【氏名又は名称】インスティチュート フォー ベーシック サイエンス
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＢＡＳＩＣ ＳＣＩＥＮＣＥ
(71)【出願人】
【識別番号】506376458
【氏名又は名称】ポステック アカデミー－インダストリー ファンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(74)【代理人】
【識別番号】100090251
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 憲一
(72)【発明者】
【氏名】イン シンヒョク
(72)【発明者】
【氏名】べルマ ラビ
(72)【発明者】
【氏名】イ チャンホン
【テーマコード（参考）】
4B018
4B065
4C086
4C087
4C090
【Ｆターム（参考）】
4B018LB08
4B018LB10
4B018MD33
4B018MD40
4B018MD81
4B018ME14
4B018MF01
4B065AA90X
4B065BB18
4B065BB23
4B065BB40
4B065BD38
4B065BD42
4B065BD50
4B065CA44
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA20
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB07
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB07
4C090AA01
4C090BA61
4C090BB12
4C090BB14
4C090BB38
4C090BB52
4C090BC17
4C090BD50
4C090CA09
4C090DA22
(57)【要約】
本発明は、Ｔｒｅｇ細胞を誘導する酵母由来多糖体及びその用途に関し、詳しくは、マンナン（ｍａｎｎａｎ）及びβ－グルカン（β－ｇｌｕｃａｎ）を含む多糖体、該多糖体を有効成分として含有する免疫調節用組成物、前記多糖体を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用医薬組成物又は食品、前記多糖体を用いた調節Ｔ細胞の製造方法、該製造方法で製造された調節Ｔ細胞を有効成分として含有する細胞治療剤及びこれを用いた治療方法に関する。本発明に係る新規な多糖体は、低い容量でも、多糖体が持つβ－グルカン及びマンナン（ｍａｎｎａｎ）構造によって免疫寛容性抗原提示細胞（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）を生成し、これによって抗原特異的な調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の分化又は生成を誘導し、少ない副作用で目標とする免疫体系を調節することができる。したがって、ＭＧＣＰ及び前記多糖体によって誘導されたＴｒｅｇ細胞は、免疫疾患又は炎症性疾患の予防及び治療に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
マンナン（ｍａｎｎａｎ）及びβ－グルカン（β－ｇｌｕｃａｎ）を含む多糖体。
【請求項2】
前記多糖体は、α－１，６－結合（α－１，６－ｌｉｎｋｅｄ）で連結されたマンノース骨格（ｍａｎｎｏｓｅ ｂａｃｋ ｂｏｎｅ）を有するマンナン（ｍａｎｎａｎ）とβ－１，６－結合（β－１，６－ｌｉｎｋｅｄ）で結合されたグルコース骨格（ｇｌｕｃｏｓｅ ｂａｃｋ ｂｏｎｅ）を有するβ－グルカン（β－ｇｌｕｃａｎ）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の多糖体。
【請求項3】
前記マンナン（ｍａｎｎａｎ）は、ｉ）α－１，６－結合（α－１，６－ｌｉｎｋｅｄ）で連結されたマンノース骨格（ｍａｎｎｏｓｅ ｂａｃｋ ｂｏｎｅ）；及び
ｉｉ）α－１，３－結合又はα－１，２－結合で連結された単一マンノース（ｓｉｎｇｌｅ ｍａｎｎｏｓｅ）、２ユニットマンノース（ｔｗｏ ｕｎｉｔ ｍａｎｎｏｓｅ）及び３ユニットマンノース（ｔｈｒｅｅ ｕｎｉｔ ｍａｎｎｏｓｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の側鎖を含むことを特徴とする、請求項１に記載の多糖体。
【請求項4】
前記多糖体は、単一マンノース側鎖２０％～４０％：２ユニットマンノース側鎖１０％～３０％：３ユニットマンノース側鎖２０％～４０％：側鎖のないマンノース骨格２０％～４０％の含量比で含むことを特徴とする、請求項３に記載の多糖体。
【請求項5】
前記多糖体は、分子量が４ｋＤａ～６０ｋＤａであることを特徴とする、請求項１に記載の多糖体。
【請求項6】
前記β－グルカン（β－ｇｌｕｃａｎ）は、ｉ）β－１，６－結合（β－１，６－ｌｉｎｋｅｄ）で結合されたグルコース骨格、及び
ｉｉ）β－１，３－結合（β－１，３－ｌｉｎｋ）で連結された単一ユニットグルコース側鎖を含むことを特徴とする、請求項１に記載の多糖体。
【請求項7】
前記β－１，３－結合で連結された単一ユニットグルコース側鎖は、全グルコースに対してβ－１，３－結合グルコース側鎖が１０％～３０％の比率で含まれていることを特徴とする、請求項６に記載の多糖体。
【請求項8】
マンノース７０％～９０％：グルコース１０％～３０％の含量比で含まれていることを特徴とする、請求項１に記載の多糖体。
【請求項9】
調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の多糖体。
【請求項10】
前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節Ｔ細胞であることを特徴とする、請求項９に記載の多糖体。
【請求項11】
酵母（ｙｅａｓｔ）由来であることを特徴とする、請求項１に記載の多糖体。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の多糖体を有効成分として含有する免疫調節用組成物。
【請求項13】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の多糖体を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項14】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の多糖体を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は改善用食品。
【請求項15】
次の段階を含む調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の製造方法：（ａ）抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）に請求項１～１１のいずれか一項に記載の多糖体を処理して免疫寛容性抗原提示細胞（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）を得る段階；及び
（ｂ）前記免疫寛容性抗原提示細胞（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）をＣＤ４＋ Ｔ細胞と共培養（ｃｏ－ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）して調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を誘導する段階。
【請求項16】
前記抗原提示細胞は、樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ；ＤＣ）であることを特徴とする、請求項１５に記載の調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の製造方法。
【請求項17】
前記抗原提示細胞は、パターン認識受容体（ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＰＲＲｓ）を発現することを特徴とする、請求項１５に記載の調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の製造方法。
【請求項18】
前記パターン認識受容体（ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＰＲＲｓ）は、Ｄｅｃｔｉｎ１、Ｄｅｃｔｉｎ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＴＬＲ６からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１７に記載の調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の製造方法。
【請求項19】
前記免疫寛容性抗原提示細胞（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）は、ＩＬ－１０、Ｃｄ２７４、インドールアミン２，３－デオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、Ｔｇｆβ１及びＣｏｘ２からなる群から選ばれるいずれか一つ以上を過発現することを特徴とする、請求項１５に記載の調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の製造方法。
【請求項20】
請求項１５～１９のいずれか一項に記載の製造方法で製造された調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用細胞治療剤。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｔｒｅｇ細胞を誘導する酵母由来多糖体及びその用途に関し、詳しくは、マンナン（ｍａｎｎａｎ）及びβ－グルカン（β－ｇｌｕｃａｎ）を含む多糖体、該多糖体を有効成分として含有する免疫調節用組成物、前記多糖体を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用医薬組成物又は食品、前記多糖体を用いた調節Ｔ細胞の製造方法、該製造方法で製造された調節Ｔ細胞を有効成分として含有する細胞治療剤及びこれを投与する段階を含む免疫疾患又は炎症性疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【0002】
哺乳類は免疫システムと絶えず相互作用する一連の微生物を保有している。共生微生物は宿主と共生関係を結び、消化、行動、免疫システムの成熟のような様々な過程で宿主と相互作用する（Ｃｅｒｆ－Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ Ｎ，Ｇａｂｏｒｉａｕ－Ｒｏｕｔｈｉａｕ Ｖ．Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ：ｆｒｉｅｎｄｓ ｏｒ ｆｏｅｓ？ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１０；１０（１０）：７３５－４４．）。同様に、かびは人体に存在し、宿主の免疫システムに影響を与える（Ｗｈｅｅｌｅｒ ＭＬ，Ｌｉｍｏｎ ＪＪ，Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ ＤＭ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ Ｆｕｎｇｉ：Ｄｅｔｅｎｔｅ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐａｔｈｏｌ ２０１７；１２：３５９－８５．）。先天性免疫細胞は、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＴＬＲｓ）のようなパターン認識受容体（ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＰＲＲｓ）を用いて、多糖類を含むかび細胞表面の様々な病原菌関連分子パターン（ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ，ＰＡＭＰｓ）を検出する。信号を探知すれば先天性免疫細胞が遺伝子発現プロファイルを変更し、後天的免疫を調律するためにサイトカインのような免疫信号分子を生産する（Ｉｌｉｅｖ ＩＤ，Ｌｅｏｎａｒｄｉ Ｉ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７；１７（１０）：６３５－４６．，Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ ＤＭ，Ｉｌｉｅｖ ＩＤ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１４（６）：４０５－１６．及びＢｒｕｂａｋｅｒ ＳＷ，Ｂｏｎｈａｍ ＫＳ，Ｚａｎｏｎｉ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５；３３：２５７－９０．）。
【0003】
このような共生微生物は、Ｔヘルパー１７細胞（Ｔｈ１７）又は調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）のようなＣＤ４細胞の特定系統の発達と分化を調節する。Ｔｒｅｇ細胞は、免疫抑制機能を持つＣＤ４＋細胞の下位集合であり、転写因子Ｆｏｘｐ３の発現を特徴とする。Ｔｒｅｇ細胞は、大きく生成位置によって、胸腺由来細胞（ｎＴｒｅｇ細胞）及び非胸腺細胞に分けられ、２次免疫器官においてＣＤ４＋ Ｔ ｎａｉｖｅから誘導されたＴｒｅｇ細胞（ｉＴｒｅｇ又はｐＴｒｅｇ）に分けられる。生体内Ｔｒｅｇ細胞の強化は、自己免疫及びアレルギー疾患のような様々な過免疫疾患を調節することができる。このようなＴｒｅｇ細胞生成の基本分子メカニズムは明らかにされたものがなく、様々な研究によれば、バクテリアが生産した代謝産物又は特定化学構造を有する細胞壁由来多糖体がＴｒｅｇ細胞の分化を促進できるとされている。例えば、ブチレートはクロストリディアによって結腸Ｔｒｅｇ細胞を誘導する主要効果分子として報告された（Ｆｕｒｕｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５０４：４４６－４５０，２０１３）。Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓの双性イオン多糖類である多糖類Ａ（ＰＳＡ）は、Ｔｒｅｇ細胞を生産するＩＬ－１０誘導に重要な効果免疫調節剤として確認された（Ｍａｚｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １２２：１０７－１１８，２００５；Ｏｃｈｏａ－Ｒｅｐａｒａｚ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８５：４１０１－４１０８，２０１０）。また、ビフィドバクテリウムビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）由来細胞表面多糖体であるＣＳＧＧなどがＴｒｅｇ細胞を誘導できると報告されたことがある（Ｒａｖｉ Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３（２８）、ｅａａｔ６９７５）。
【0004】
このような微生物又はその代謝産物などを患者の治療に用いるために、一部の患者は過剰活性化された免疫反応（すなわち、アレルギー又は自己免疫疾患）を抑制しなければならないが、一部の患者では免疫系を強化（すなわち、癌又はウイルス感染）させる必要がある。例えば、Ｔｈ１７－誘導プロバイオティクス菌であるビフィドバクテリウムをリウマチ性関節炎動物モデルに投与したとき、関節炎症状を悪化させた（Ｔｚｅ Ｇｕａｎ Ｔａｎ，１１３（５０）：Ｅ８１４１－Ｅ８１５０，２０１６）。したがって、有益な微生物の同定及びその作用因子のメカニズムを明らかにすることは治療学的に非常に重要である。
【0005】
一方、酵母由来多糖類は免疫調節機能を有しており、免疫システムを活性化又は抑制するための治療剤として用いられる（Ｔｚｉａｎａｂｏｓ ＡＯ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２０００；１３（４）：５２３－３３．）β－グルカンは複雑で様々な構造を持つかび細胞壁の最も豊富な多糖類である（Ｃａｍｉｌｌｉ Ｇ，Ｔａｂｏｕｒｅｔ Ｇ，Ｑｕｉｎｔｉｎ Ｊ．Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ Ｆｕｎｇａｌ ｂｅｔａ－Ｇｌｕｃａｎ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｐｈａｇｏｃｙｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ．）。それらは免疫反応に影響を及ぼす生物学的反応を調節するものと知られている（Ｓｉｌｖａ ＶｄＯ，ｄｅ Ｍｏｕｒａ ＮＯ，ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ ＬＪＲ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｂｅｔａ－Ｇｌｕｃａｎｓ ｏｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：Ｒｅｖｉｅｗ Ａｒｔｉｃｌｅ．）。
【0006】
一般に、研究者らはβ－グルカンを伝染病治療剤又は癌治療剤の補助剤として使用してきた（Ｓｕｎ Ｂ，Ｙｕ Ｓ，Ｚｈａｏ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１８；３６（３５）：５２２６－３４．及びＮｏｖａｋ Ｍ，Ｖｅｔｖｉｃｋａ Ｖ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ ２００８；５（１）：４７－５７．）。一方、いくつかのの研究では、β－グルカンを抗炎症性機能を有するものと報告している（Ｄａｌｏｎｓｏ Ｎ，Ｇｏｌｄｍａｎ ＧＨ，Ｇｅｒｎ ＲＭ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１５；９９（１９）：７８９３－９０６．及びＬｅｅ ＫＨ，Ｐａｒｋ Ｍ，Ｊｉ ＫＹ，ｅｔ ａｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｅｔａ－（１，３）－ｇｌｕｃａｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ＤＳＳ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＩＢＤ ｂｙ ｒｅｓｔｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ．）。かびのβ－グルカンと類似に、かびのマンナンも免疫調節機能を担うものと報告された（Ｓａｉｊｏ Ｓ，Ｉｋｅｄａ Ｓ，Ｙａｍａｂｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｃｔｉｎ－２ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ－ｍａｎｎａｎｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈ１７ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ．）。しかしながら、免疫調節因子としての多糖類の役割が報告されているにもかかわらず、多糖類が免疫系を調節する正確な要素及びメカニズムは未だ明らかにされていない。特に、多糖体の構造と分子量によって個別に起きる免疫反応（免疫増強又は過敏免疫抑制反応）については正確に規定されたものがない。これを糾明することは、特定疾患から観察される、誤った免疫反応を所望の方向に再設計する上で非常に重要であり、疾患治療剤の開発にも適用可能である。
【0007】
ザイモサン（ｚｙｍｏｓａｎ）は酵母の幽霊細胞（ｇｈｏｓｔ ｃｅｌｌ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、大部分の酵母は類似の細胞壁成分を有している。酵母（イースト）細胞壁は、マンナンで構成された外膜と、β－１，６－グルカンで連結された複数層のβ－１，３－ｌｉｎｋｅｄグルカンの複雑な構造を持つグルカンで構成された内膜とに区分される２層構造を有する（Ｇｏｗ ＮＡＲ，Ｌａｔｇｅ ＪＰ，Ｍｕｎｒｏ ＣＡ．Ｔｈｅ Ｆｕｎｇａｌ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ ２０１７；５（３））。ザイモサンの多糖類は、主に、構造的にイーストと類似なβ－グルカンとマンナンで構成される。その他多くの研究でかび多糖類の免疫システムへの役割を研究するためにザイモサンを活用したが、このような研究結果は論難の余地がある。一部の研究によれば、ザイモサンが免疫システムを活性化させて炎症性疾患を悪化させることが知られており（Ｓａｎｇｕｅｄｏｌｃｅ ＭＶ，Ｃａｐｏ Ｃ，Ｂｏｎｇｒａｎｄ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｚｙｍｏｓａｎ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ及びＧａｎｔｎｅｒ ＢＮ，Ｓｉｍｍｏｎｓ ＲＭ，Ｃａｎａｖｅｒａ ＳＪ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００３；１９７（９）：１１０７－１７）、自己免疫疾患を緩和させるために抗原特異的Ｔ細胞反応を抑制するＩＬ－１０生成免疫寛容性抗原提示細胞を誘導することによって免疫学的に耐性を誘導できることを証明する他の研究もある（Ｋａｒｕｍｕｔｈｉｌ－Ｍｅｌｅｔｈｉｌ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２０１５；６４（４）：１３４１－５７．及びＤｉｌｌｏｎ Ｓ，Ａｇｒａｗａｌ Ｓ，Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００６；１１６（４）：９１６－２８．）。
【0008】
このような技術的背景下で、本発明者らは酵母由来の多糖体において免疫調節機能を有する正確な要素及びメカニズムを明らかにし、これにより、低い容量でも効率的にＴｒｅｇの分化又は生成を誘導できる物質を見出すために鋭意努力した結果、酵母細胞壁から新規な多糖体を精製し、ＭＧＣＰ（ｍａｎｎａｎ／ｂｅｔａ－ｇｌｕｃａｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）と命名した。また。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで前記ＭＧＣＰによってＴｒｅｇ細胞の誘導が可能であり、ＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞の誘導にβ－１，６－グルカンが必須であることを確認し、ＭＧＣＰ又はＭＧＣＰによって誘導されたＴｒｅｇ細胞の投与は大膓炎を抑制できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【0009】
本背景技術の部分に記載された前記情報は、単に本発明の背景に関する理解を向上させるためのものであり、したがって、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者に既に知られた先行技術を形成する情報を含まなくてもよい。
【発明の概要】
【0010】
本発明の目的は、マンナン（ｍａｎｎａｎ）及びβ－グルカン（β－ｇｌｕｃａｎ）を含む新規な多糖体を提供することにある。
【0011】
本発明の他の目的は、前記多糖体を有効成分として含有する免疫調節用組成物を提供することにある。
【0012】
本発明のさらに他の目的は、前記多糖体を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防、治療用医薬組成物を提供することにある。
【0013】
本発明のさらに他の目的は、前記多糖体を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防、改善用食品を提供することにある。
【0014】
本発明のさらに他の目的は、前記多糖体を有効成分として含有する組成物を投与することを含む免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療方法を提供することにある。
【0015】
本発明のさらに他の目的は、免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療のための前記多糖体を有効成分として含有する組成物の用途を提供することにある。
【0016】
本発明のさらに他の目的は、前記多糖体を用いた調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の製造方法を提供することにある。
【0017】
本発明のさらに他の目的は、前記方法で製造された調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防、治療又は改善用細胞治療剤を提供することにある。
【0018】
本発明のさらに他の目的は、前記細胞治療剤を投与することを含む免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療方法を提供することにある。
【0019】
本発明のさらに他の目的は、免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療のための前記細胞治療剤の用途を提供することにある。
【0020】
前記目的を達成するために、本発明は、マンナン（ｍａｎｎａｎ）及びβ－グルカン（β－ｇｌｕｃａｎ）を含む多糖体を提供する。
【0021】
本発明はまた、多糖体を有効成分として含有する免疫調節用組成物を提供する。
【0022】
本発明はまた、前記多糖体を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防、治療用医薬組成物を提供する。
【0023】
本発明はまた、前記多糖体を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防、改善用食品を提供する。
【0024】
本発明はまた、前記多糖体を有効成分として含有する組成物を投与することを含む免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0025】
本発明はまた、免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療のための前記多糖体を有効成分として含有する組成物の用途を提供する。
【0026】
本発明はまた、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）に前記多糖体を処理して免疫寛容性抗原提示細胞（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）を得る段階；及び前記免疫寛容性抗原提示細胞（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）をＣＤ４＋ Ｔ細胞と共培養（ｃｏ－ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）して調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を誘導する段階を含む、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の製造方法を提供する。
【0027】
本発明はまた、前記方法で製造された調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防、治療又は改善用細胞治療剤を提供する。
【0028】
本発明はまた、前記細胞治療剤を投与することを含む免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0029】
本発明はまた、免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療のための前記細胞治療剤の用途を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0030】
図１は、ザイモサン由来の多糖体成分がｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇ細胞の生成に差別的な影響を及ぼすことに関するものである。脾臓ＣＤ１１ｃ＋ ＤＣを、標識された容量のザイモサンで刺激させた後、未分化ＣＤ４Ｔ細胞（ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ）と共に培養した。流動細胞計測プロット（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｐｌｏｔｓ）は、３回の独立実験を代表する。全てのグラフはｍｅａｎ±ＳＥＭ値である。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である（スチューデントｔテスト）。
【0031】
図１Ａは、様々な濃度のザイモサンによって誘導されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の頻度を示すものである。
【0032】
【0033】
図１Ｂは、β－１，３－グルカナーゼ（β－１，３－ｇｌｕｃａｎａｓｅ）処理されたザイモサンによって誘導されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の頻度を示すものである。
【0034】
図１Ｃは、標識された酵素と切断されたザイモサンによるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の誘導を示すものである。
【0035】
図２は、ザイモサンの多糖体の免疫反応に対する役割に関するものである。
【0036】
脾臓ＣＤ１１ｃ＋ ＤＣは、異なる容量のザイモサンで刺激された後、Ｔｈ１及びＴｈ１７細胞方向への準最適の（ｓｕｂ－ｏｐｔｉｍａｌ）非対称（ｓｋｅｗｉｎｇ）条件（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下でｎａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ細胞と共に培養された。全てのグラフはｍｅａｎ±ＳＥＭ値である。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である（スチューデントｔテスト）。
【0037】
図２Ａは、Ｔｈ１及びＴｈ１７細胞方向への最適の（ｏｐｔｉｍａｌ）非対称（ｓｋｅｗｉｎｇ）条件下でＴ－ｂｅｔ又はＲＯＲγｔの流動細胞計測プロット及びＭＦＩを示すものである。
【0038】
脾臓ＤＣを刺激する前に同種の切断酵素を処理し、標識された容量のザイモサンから特定多糖類を除去した。変形されたザイモサンをＴｈ１又はＴｈ１７走行環境においてｎａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ細胞と共に培養したＤＣに処理した。
【0039】
図２Ｂは、β－１，３－グルカン除去されたザイモサンによるＴ－ｂｅｔ又はＲＯＲγｔのＭＦＩを示すものである。
【0040】
図２Ｃは、マンノシダーゼ又はβ－１，６－グルカナーゼ処理されたザイモサンによるＴ－ｂｅｔ又はＲＯＲγｔのＭＦＩを示すものである。
【0041】
図３は、ＭＧＣＰの化学的組成及び機能的特性に関するものである。
【0042】
図３Ａは、ＭＧＣＰの組成を示すものである。
【0043】
ｎａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ細胞と共に培養される前に、脾臓ＤＣは標識された多糖類によって刺激された。
【0044】
図３Ｂは、マンナン又はカードラン（β－１，３－グルカン）によって誘導されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の頻度を示すものである。
【0045】
図３Ｃは、プスツラン（線形β－１，６－グルカン）によって誘導されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の頻度を示すものである。
【0046】
図３Ｄは、様々な濃度のＤ－（＋）マンノースによって誘導されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の頻度を示すものである。
【0047】
図３Ｅは、非損傷イースト細胞壁又はβ－１，３－グルカンが除去されたイースト細胞壁から精製されたＭＧＣＰによって誘導されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の頻度を示すものである。
【0048】
全てのバーグラフは、ｍｅａｎ±ＳＥＭ値である。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である（スチューデントｔテスト）。
【0049】
図４は、ＭＧＣＰの組成を分析した結果を示す表である。
【0050】
図５は、ＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞の分化においてβ－１，６－グルカンの役割を示すものである。
【0051】
図５Ａは、ＭＧＣＰの陽性子ＮＭＲスペクトルを示すものである。
【0052】
図５Ｂは、マンナンの化学的構造を示すものである。
【0053】
図５Ｃは、ＭＧＣＰのβ－１，６－グルカン部分の化学的構造を示すものである。
【0054】
【0055】
図５Ｄは、ＭＧＣＰによって誘導されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の頻度を示すものである。
【0056】
図５Ｅは、標識された酵素で切断されたＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞の誘導を示すものである。
【0057】
流動細胞計測プロットは、類似の結果を有する３回の独立実験を代表する。全てのグラフプロットは、ｍｅａｎ±ＳＥＭ値である。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１（スチューデントｔテスト）。
【0058】
図６は、ＨＰＬＣを用いて全体ＭＧＣＰを分析した結果である。ＨＰＬＣ分析条件は、ＴＳＫ Ｇ－５０００ＰＷＸＬサイズ排除カラムを使用し、溶離剤はアンモニウム重炭酸塩（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）５０ｍＭ、流速は０．８ｍｌ／ｍｉｎである。分析結果は示差屈折率検出器（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）と２０６ｎｍ波長のＵＶ検出器を用いて確認した。分子量確認のために用いたｓｔａｎｄａｒｄ物質は、ｄｅｘｔｒａｎ ｓｔａｎｄａｒｄを使用し、それに関する情報は表２に示す。Ａ、Ｂ、Ｃは、ＨＰＬＣ分析結果に基づいて分画した３つの分画を示す。
【0059】
図７は、図６におけるＭＧＣＰのＡ、Ｂ、Ｃ分画をＨＰＬＣ分析した結果である。分析条件は図６と同一にした。分子量確認のために使用したｓｔａｎｄａｒｄ物質はｄｅｘｔｒａｎ ｓｔａｎｄａｒｄを使用し、それに関する情報は表２に示す。
【0060】
図８は、ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞の炎症性免疫反応の抑制に関するものである（ｉｎ ｖｉｖｏ）。ｉＴｒｅｇ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて脾臓ＤＣと類遺伝子形に（ｃｏｎｇｅｎｉｃａｌｌｙ）標識されたｎａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＥＧＦＰ－ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ）と脾臓ＤＣの共同培養によって生成された。ｉＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４５．１＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＥＧＦＰ＋）は、選別されたＦＡＣｓであり、Ｒａｇ１－／－マウスに米接触ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４５．１－ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３Ｔｈｙ１．１ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ）と共に養子移入された。マウスをエンドポイント（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）で分析した。各点は個々のマウスを示し、全てのバーグラフは、ｍｅａｎ±ＳＥＭ値である。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である（スチューデントｔテスト）。
【0061】
図８Ａは、体重の変化を示すものである。
【0062】
図８Ｂは、結腸長さを表す写真である。
【0063】
図８Ｃは、Ｈ＆Ｅ染色された結腸を示す写真である。
【0064】
図８Ｄは、大膓炎の組織病理学スコアを示すものである。
【0065】
図８Ｅは、ドナー米接触ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４５．１－）におけるＩＦＮ－γ生産を示すものである。
【0066】
図９は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＭＧＣＰの補充がＴｒｅｇ細胞の新規な生成を促進することを示すものである。マウス（ＣＤ４５．１－）を２週間毎日ｍｏｃｋ又は２００μｇのＭＧＣＰで処理した後、類遺伝子形に（ｃｏｎｇｅｎｉｃａｌｌｙ）標識されたｎａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＥＧＦＰ－ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ）を取り込んだ。ＭＧＣＰは、細胞の伝達後に１週間さらに投与された。ＣＤ４ Ｔ細胞を受容者マウスの結腸粘膜固有層（ｃｏｌｏｎｉｃ ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ）で分析した。各点は個々のマウスを示す。流動細胞計測プロットは独立実験を代表する。全てのバーグラフは、ｍｅａｎ±ＳＥＭ値である。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である（スチューデントｔテスト）。
【0067】
図９Ａは、供与者細胞由来のＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４５．１＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＥＧＦＰ＋）の頻度を示すものである。
【0068】
図９Ｂは、供与者細胞（ＣＤ４５．１＋）由来のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＥＧＦＰ－及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＥＧＦＰ＋ ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ－４のＭＦＩを示すものである。
【0069】
図９Ｃは、受容者由来細胞（ＣＤ４５．１－ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＥＧＦＰ＋）のＴｒｅｇ細胞頻度を示すものである。
【0070】
図９Ｄは、ホスト（ＣＤ４５．１－）由来ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－細胞及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞においてＣＴＬＡ－４の発現を示すものである。
【0071】
図９Ｅは、結腸粘膜固有層（ｃｏｌｏｎｉｃ ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ）において受容者由来のＴｒｅｇ細胞の数を示すものである。
【0072】
図９Ｆは、ホスト由来のＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４５．１－ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＥＧＦＰ＋Ｈｅｌｉｏｓ－）において末梢Ｔｒｅｇ細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌｓ）の頻度を示すものである。
【0073】
図９Ｇは、結腸Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＥＧＦＰ＋）からＩＬ－１０の生産を示すものである。
【0074】
図９Ｈは、エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＥＧＦＰ－）においてＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７Ａの量を示すものである。
【0075】
図１０は、ＭＧＣＰの補充が小腸においてＴｒｅｇ細胞を誘導し、リンパ節組織では誘導しないことを示すものである。図９と同じ方法で、ＭＧＣＰ（２００μｇ）を毎日２週間投与した後、類遺伝子形に（ｃｏｎｇｅｎｉｃａｌｌｙ）標識されたｎａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ細胞を取り込んだ。ＭＧＣＰの補充は１週間さらに継続した。小腸の粘膜固有層のＣＤ４ Ｔ細胞を評価した（Ａ～Ｈ）。各点は個別マウスを代表する。流動細胞計測プロットは、類似結果を有する３回の独立実験を代表する。全てのバーグラフは、ｍｅａｎ±ＳＥＭ値である。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である（スチューデントｔテスト）。
【0076】
図１０Ａは、ドナー細胞からのＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞への分化を示すものである。
【0077】
図１０Ｂは、ドナー由来ＣＤ４ Ｔ細胞からのＣＴＬＡ－４発現を示すものである。
【0078】
図１０Ｃは、受容体細胞においてＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の頻度を示すものである。
【0079】
図１０Ｄは、ホスト由来ＣＤ４ Ｔ細胞においてＣＴＬＡ－４のＭＦＩを示すものである。
【0080】
図１０Ｅは、マウス結腸においてＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の数を示すものである。
【0081】
図１０Ｆは、受容者由来のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞において誘導性Ｔｒｅｇ細胞の比率を示すものである。
【0082】
図１０Ｇは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞においてＩＬ－１０の生産を示すものである。
【0083】
図１０Ｈは、エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－）においてＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７Ａの生産を示すものである。
【0084】
図１０Ｉは、ｍＬＮにおいて受容者及び供与者細胞に由来するＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞を示すものである。
【0085】
図１０Ｊは、脾臓において受容者及び供与者細胞に由来するＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞を示すものである。
【0086】
図１１は、ＭＧＣＰの投与が抗原－反応性Ｔｒｅｇ細胞を誘導し、実験性大膓炎を緩和することを示すものである。ＣＢｉｒマウスから分離したＮａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＥＧＦＰ－ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ）を、Ｒａｇ１欠乏マウスに養子移入した。全実験期間にわたって細胞養子移入の前日から隔日でＤＷ（ｍｏｃｋ）又は２００μｇのＭＧＣＰを補充した。受容体はエンドポイントで分析された。各点は個々のマウスを示す。データは３回の独立実験を代表する。全てのバーグラフは、ｍｅａｎ±ＳＥＭ値である。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である（スチューデントｔテスト）。
【0087】
図１１Ａは、体重の変化を示すものである。
【0088】
図１１Ｂは、結腸の代表写真である。
【0089】
図１１Ｃは、初期体重で正常の結腸長さを示すものである。
【0090】
図１１Ｄは、Ｈ＆Ｅ染色された結腸を示す写真である。
【0091】
図１１Ｅは、大膓炎の組織病理学スコアを示すものである。
【0092】
図１１Ｆは、体重減少初期段階で結腸粘膜固有層（ｃｏｌｏｎｉｃ ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ）からのＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞誘導を分析したものである。
【0093】
図１１Ｇは、実験のエンドポイントにおいて結腸ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＥＧＦＰ－）からＩＦＮ－γの生産を示すものである。
【0094】
図１２は、大膓炎状態下の免疫に対するＭＧＣＰ投与の影響を示すものである。
【0095】
図１２Ａは、体重減少前、ｍｏｃｋ及びＭＧＣＰ投与及びＣＢｉｒ ｎａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ細胞授与されたＲａｇ１欠乏マウスの結腸ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞におけるＣＤ１０３及びＣＴＬＡ－４の発現量を示すものである。
【0096】
図１２Ｂは、実験終結段階で結腸粘膜固有層に由来したＣＤ４ Ｔ細胞のＩＬ－１７Ａの生産を示すものである。
【0097】
全てのバーグラフは、ｍｅａｎ±ＳＥＭ値である。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である（スチューデントｔテスト）。
【0098】
図１３は、ＭＧＣＰが調節表現型に対するＤＣの転写体形態（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を調節することを示すものである。ＤＣサブセット（ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋）は、ＣＤ１０３及びＣＤ１１ｂの発現によって小腸から分類されたＦＡＣｓであり、図１と同じ実験手順によってＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞誘導能力を試験した。データは、類似の結果を有する３回の独立実験を代表し、全てのバーグラフは、ｍｅａｎ±ＳＥＭ値である。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である（スチューデントｔテスト）。
【0099】
図１３Ａは、各ＤＣサブセットにおいてＭＧＣＰ媒介のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の誘導のデータを示すものである。
【0100】
ＧＦマウス（ｎ＝６）にｍｏｃｋ又はＭＧＣＰを２週間投与した転写体は、結腸ＣＤ１１ｃ＋ ＤＣから精製した。
【0101】
図１３Ｂは、ｍｏｃｋ及びＭＧＣＰ投与されたＧＦマウス結腸ＤＣの免疫抑制関連マーカーを示すものである。
【0102】
図１３Ｃは、結腸ＤＣにおいて免疫寛容性ＤＣマーカーの発現を示すものである。
【0103】
Ｃｏｘ２は、ＭＧＣＰ処理前脾臓ＤＣにおいて抑制され、Ｎａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ細胞はＣｏｘ２選択的阻害剤であるセレコキシブ（Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）の存在下に前記ＤＣと共に７２時間培養された。
【0104】
図１３Ｄは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の流動細胞計測プロットを示すものである。
【0105】
図１３Ｅは、ｍｏｃｋ又はＭＧＣＰ処理されたセレコキシブの存在／不在下に誘導されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の頻度を示すものである。
【0106】
図１４は、ＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞の生成において、腸大食細胞の影響に関するものである。精製された場内大食細胞（ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋ＣＤ１０３－）ＦＡＣｓは、ｎａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ細胞と共に培養される前にＭＧＣＰで刺激された。流動細胞計測プロットは、類似の結果を有する２回の独立的実験を代表するものである。
【0107】
図１５は、様々なＰＲＲのＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞の生成との関連性を示すものである。図１と類似の方法により、特定の先天的免疫受容体欠乏マウスから精製された脾臓ＤＣをＭＧＣＰで処理した。Ｎａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ細胞はＭＧＣＰ刺激されたＤＣと共に培養された。
【0108】
図１５Ａは、各受容体欠乏ＤＣにおいてＭＧＣＰ又はｍｏｃｋを処理した場合にＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の頻度を示すものである。
【0109】
図１５Ｂは、ＭｙＤ８８信号伝達体系欠乏ＤＣにおいてＭＧＣＰ又はｍｏｃｋを処理した場合にＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の頻度を示すものである。
【0110】
図１５Ｃは、生成されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の頻度を示すものである。図１５Ｃでは、ＭＧＣＰを脾臓ＤＣに処理する前に特定ＣＬＲを拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）で遮断した。残っている拮抗剤及びＭＧＣＰを洗い落とした後、ＤＣはＮａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ細胞と共に培養された。
【0111】
全てのバーグラフは、ｍｅａｎ±ＳＥＭ値である。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である（スチューデントｔテスト）。
【0112】
図１６は、Ｄｅｃｔｉｎ１がＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞の誘導に及ぼす影響に関するものである。Ｄｅｃｔｉｎ１豊富／欠乏マウスの腸間膜リンパ節ＣＤ１１ｃ＋ＤＣをＭＧＣＰで８時間刺激した。Ｄｅｃｔｉｎ１損傷／非損傷したマウスに２００μｇのＭＧＣＰを毎日２週間補充し、類遺伝子形に（ｃｏｎｇｅｎｉｃａｌｌｙ）標識されたＯＴ－ＩＩ ｎａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ細胞（Ｔｈｙ１．１＋Ｖα２＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＥＧＦＰ－ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ）を授与した。受容者は細胞を移す１日前から始めてＯＶＡタンパク質（２０ｍｇ）を隔日で投与し、同時にＭＧＣＰは１週間毎日さらに投与した。
【0113】
図１６Ａは、ｍｏｃｋ又はＭＧＣＰで処理されたＤＣにおいてＣｏｘ２転写体の発現を示すものである。
【0114】
図１６Ｂは、小腸の粘膜固有層（ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ）において供与者ＯＴ－ＩＩ ＣＤ４ Ｔ細胞由来のＴｒｅｇ細胞の流動細胞計測プロットを示すものである。
【0115】
図１６Ｃは、小腸の粘膜固有層（ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ）において供与者ＯＴ－ＩＩ ＣＤ４ Ｔ細胞由来のＴｒｅｇ細胞の頻度を示すものである。
【0116】
図１６Ｄは、小腸において受容者細胞から分化した誘導性Ｔｒｅｇ細胞比率の流動細胞計測プロットを示すものである。
【0117】
図１６Ｅは、小腸において受容者細胞から分化した誘導性Ｔｒｅｇ細胞比率の頻度を示すものである。
【0118】
データは、類似の結果を有する３回の独立実験を代表し、全てのバーグラフは、ｍｅａｎ±ＳＥＭ値である。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である（スチューデントｔテスト）。
【0119】
図１７は、Ｄｅｃｔｉｎ１がＭＧＣＰを認識し、Ｔｒｅｇ細胞の生成を誘導することを示すものである。Ｄｅｃｔｉｎ１豊富／欠乏マウスの腸間膜リンパ節ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを８時間刺激させた。図１７Ｂ～図１５Ｄの場合、ＯＴ－ＩＩ ｎａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ細胞（Ｔｈｙ１．１＋Ｖα２＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＥＧＦＰ－ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ）を授与する前に、Ｄｅｃｔｉｎ１損傷／非損傷マウスに２週間毎日２００μｇのＭＧＣＰを補充した。ＯＶＡタンパク質（２０ｍｇ／マウス）を隔日で投与しながら１週間ＭＧＣＰをさらに投与した。
【0120】
図１７Ａは、標識された免疫寛容性ＤＣ関連転写体の発現レベルを示すものである。
【0121】
図１７Ｂは、小腸において受容者由来のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の頻度を示すものである。
【0122】
図１７Ｃは、小腸において受容者由来のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の数を示すものである。
【0123】
図１７Ｄは、腸間膜リンパ節において供与者由来のＯＶＡ－反応性ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ細胞の頻度を示すものである。
【0124】
各点は個々のマウスを示す。データは、類似の結果の３回の独立実験を代表する。全てのバーグラフは、ｍｅａｎ±ＳＥＭ値である。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である（スチューデントｔテスト）。
【発明を実施するための形態】
【0125】
別に断りのない限り、本明細書で使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われる命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。
【0126】
多くの研究において、ザイモサンは炎症前に免疫反応を刺激することができ、いくつかの結果は、免疫減少の役割を担うことが報告された。しかし、免疫反応を決定する酵母の正確な多糖体の構造ついては依然として知られたところがない。
【0127】
本発明の一実施例において、ザイモサンの実験データは、多い量（５００μｇ／ｍＬ）がＴｒｅｇ細胞の分化を促進させることを示したが、低い容量（５０μｇ／ｍＬ）ではむしろＲＯＲγｔの発現を促進し、Ｔｒｅｇの分化を促進できないことを示した。また、多糖体の構成のうち、β－１，６－グルカン及びマンナンがＴｒｅｇ細胞の分化を促進し、β－１，３－グルカンはＴｒｅｇ細胞の分化を抑制することを確認した。
【0128】
本発明の他の実施例において、酵母の細胞壁から、本発明者が、上記の実施例から明らかにしたＴｒｅｇ細胞誘導成分であるマンナン及びβ－グルカンを含有する新規な多糖体を精製し、これをＭＧＣＰ（Ｍａｎｎａｎ／β－Ｇｌｕｃａｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）と命名し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて前記多糖体の低い濃度の処理又は投与によっても効果的にＴｒｅｇ細胞が誘導され得ることを確認した。これによって、酵母細胞壁由来の新規な多糖体の構成及び構造によるＴｒｅｇ細胞分化メカニズムを受容体、遺伝子転写体形態変化及びサイトカイン発現レベルまで確立し、前記多糖体又はこれによって誘導されたＴｒｅｇ細胞の投与はｉｎ ｖｉｖｏにおいて効果的に大膓炎を抑制できることを確認した。
【0129】
したがって、本発明は、一観点において、マンナン（ｍａｎｎａｎ）及びβ－グルカン（β－ｇｌｕｃａｎ）を含む多糖体に関する。
【0130】
本発明において、前記多糖体は、α－１，６－結合（α－１，６－ｌｉｎｋｅｄ ｍａｎｎｏｓｅ）で連結されたマンノース骨格（ｂａｃｋ ｂｏｎｅ）を有するマンナン（ｍａｎｎａｎ）と、β－１，６－結合（β－１，６－ｌｉｎｋｅｄ）で結合されたグルコース骨格（ｂａｃｋ ｂｏｎｅ）を有すβ－グルカン（β－ｇｌｕｃａｎ）とが結合していることを特徴とし得る。
【0131】
本発明の一実施例において、酵母由来の新規な多糖体（ＭＧＣＰ）を構造的／機能的に分析した結果、マンナン及びβ－グルカンの具体的な結合構造を確認し、β－１，６－グルカンバックボーン及びマンナンがＴｒｅｇ細胞の分化を促進し、β－１，３－グルカンはＴｒｅｇ細胞の分化を抑制することを確認した。
【0132】
本発明の一実施例において、多糖体は、マンノース（８０．６％）：グルコース（１４．９％）：ガラクトース（４．５％）の組成比を有することを確認した。マンナンユニットの詳細な構造は、α－１，６－結合マンノースバックボーンを有していることが確認され、α－１，２－結合又はα－１，３－結合で連結された単一ユニットマンノース（３０％）、２ユニットマンノース（１６．８％）又は３ユニットマンノース（２８．４％）を側鎖（ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎ）としてそれぞれ連結されていること（側鎖のないマンノース（２４．８％））を確認した（図５Ｂ）。
【0133】
本発明において、前記多糖体は、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）及びガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）の含量比がマンノース（８０．５％）：グルコース（１５．０％）：ガラクトース（４．５％）の組成を有することを特徴とし、具体的にマンノース（８０．６％）：グルコース（１４．９％）：ガラクトース（４．５％）、より具体的にマンノース（７９．４％）：グルコース（１４．７％）：ガラクトース（４．４％）の組成を有することができるが、これに限定されない。
【0134】
したがって、本発明において、前記多糖体は、マンノース及びグルコースの含量比がマンノース７０％～９０％：グルコース１０％～３０％であることを特徴とし、場合によって、０％超過１０％未満のガラクトースをさらに含むことができる。
【0135】
本発明において、前記マンナン（ｍａｎｎａｎ）は、ｉ）α－１，６－結合（α－１，６－ｌｉｎｋｅｄ ｍａｎｎｏｓｅ）で連結されたマンノース骨格（ｂａｃｋ ｂｏｎｅ）及びｉｉ）α－１，２－結合又はα－１，３－結合で連結された単一マンノース（ｓｉｎｇｌｅ ｍａｎｎｏｓｅ）、２ユニットマンノース（ｔｗｏ ｕｎｉｔ ｍａｎｎｏｓｅ）及び３ユニットマンノース（ｔｈｒｅｅ ｕｎｉｔ ｍａｎｎｏｓｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上を側鎖として含むこと特徴とし得る。具体的に、前記マンナンは、ｉ）α－１，６－結合（α－１，６－ｌｉｎｋｅｄ ｍａｎｎｏｓｅ）で連結されたマンノース骨格（ｂａｃｋ ｂｏｎｅ）及びｉｉ）α－１，２－結合又はα－１，３－結合で連結された単一マンノース（ｓｉｎｇｌｅ ｍａｎｎｏｓｅ）、２ユニットマンノース（ｔｗｏ ｕｎｉｔ ｍａｎｎｏｓｅ）及び３ユニットマンノース（ｔｈｒｅｅ ｕｎｉｔ ｍａｎｎｏｓｅ）を側鎖として含むことができる。
【0136】
本発明において、前記多糖体は、単一マンノース側鎖２０％～４０％：２ユニットマンノース側鎖１０％～３０％：３ユニットマンノース側鎖２０％～４０％：側鎖のないマンノース骨格２０％～４０％の含量比で含むことを特徴とし得る。
【0137】
具体的に、前記多糖体のマンナンは、単一ユニットマンノース３０％：２ユニットマンノース１７．０％：３ユニットマンノース２８．５％でよく、具体的に、単一ユニットマンノース３０％：２ユニットマンノース１６．８％：３ユニットマンノース２８．４％、より具体的に、単一ユニットマンノース２５．７％：２ユニットマンノース２２．６％：３ユニットマンノース２７．０％でよいが、これに限定されない。
【0138】
本発明の一実施例において、前記マンナンは、単一マンノース（３０％）：２ユニットマンノース（１６．８％）：３ユニットマンノース（２８．４％）の組成で含んでいることを確認した。
【0139】
また、本発明において、前記β－グルカン（β－ｇｌｕｃａｎ）は、β－１，６－結合（β－１，６－ｌｉｎｋｅｄ）で結合されたグルコース骨格及びβ－１，３－結合（β－１，３－ｌｉｎｋ）で連結された単一ユニットグルコースを側鎖として含むことを特徴とし得る。好ましくは、全グルコースに対してβ－１，３－結合グルコース側鎖の含量比は２０．０％、具体的に１８．０％でよく、これに限定されない。本発明の一実施例において、全体グルコースに対して１８％のβ－１，３－結合グルコース側鎖を含むことが確認された。
【0140】
本発明において、多糖体の構成のうち、β－１，６－グルカン及びマンナンがＴｒｅｇ細胞の分化を促進し、β－１，３－グルカンはＴｒｅｇ細胞の分化を抑制することを確認した。したがって、前記β－グルカンは、β－１，３－結合グルコースが除去され、β－１，６－結合グルコースだけで構成されたことを特徴とし得る。
【0141】
本発明の一実施例において、酵母由来の新規な多糖体（ＭＧＣＰ）の分子量を確認した結果、大きく、２つのピークを確認することができ、多糖体の分子量が約４ｋＤａ～６０ｋＤａであることを確認した。全体多糖体を大きく３分画に分けて確認した結果もまた、約３．５ｋＤａ～６０ｋＤａの分子量を有することを確認した。また、多糖体の分子量が小さくなるほど、好ましくは２０ｋＤａ以下である場合においてＴｒｅｇ誘導活性に優れ、１００ｋＤａ以上の大きい分子量を有する場合にはＴｒｅｇ誘導活性に劣ることが見られた。
【0142】
したがって、本発明において、前記多糖体は、分子量が３．５ｋＤａ～６０ｋＤａであることを特徴とし、好ましくは、４ｋＤａ～２０ｋＤａである分子量を有することを特徴とし得る。
【0143】
本発明において、前記多糖体は、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導することを特徴とし、前記調節Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節Ｔ細胞であることが好ましいが、これに限定されない。
【0144】
本発明の用語“調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）”とは、分化したＴ細胞の一種類であり、免疫作用を抑制する役割を担って自己抗原に対する寛容を維持し、自己免疫疾病の発病を抑制する。調節Ｔ細胞は一般に、ＩＬ－１０などの免疫抑制性サイトカインを発現し、エフェクターＴ細胞の誘導と拡散を抑制する。
【0145】
本発明の用語“誘導”とは、目的とする細胞の分化又は生成を誘導することを意味し、本発明では未接触Ｔ細胞などから調節Ｔ細胞に分化させることを意味する。
【0146】
本発明において“誘導”とは、“分化”、“生成”又は“生産”などと同じ意味で使われてよい。
【0147】
本発明における用語“未接触Ｔ細胞（ｎａｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ）”とは、骨髄におけるｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌが胸腺において成熟した分化前のＴ細胞を意味する。未接触Ｔ細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＴＧＦ－βなどの刺激を受けてエフェクターＴ細胞、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）などに分化可能である。
【0148】
本発明において、前記調節Ｔ細胞の誘導は、ＤＣ（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ）によって媒介されることを特徴とし、前記ＤＣはパターン認識受容体（ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＰＲＲｓ）を発現することを特徴とし得る。前記パターン認識受容体は、好ましくは、Ｄｅｃｔｉｎ１、Ｄｅｃｔｉｎ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＴＬＲ６からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であり得るが、これに限定されない。
【0149】
本発明において、前記ＤＣによって媒介は前記多糖体の処理で刺激され、免疫寛容性ＤＣに転写体地形が変形されてＴｒｅｇ細胞の誘導を媒介することを特徴とし、好ましくは、前記転写体地形の変形は、ＩＬ－１０、Ｃｄ２７４、インドールアミン２，３－デオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、Ｔｇｆβ１及びＣｏｘ２（シクロオキシゲナーゼコーディング遺伝子、Ｐｔｇｓ２）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上を過発現させるものでよいが、これに限定されない。
【0150】
また、本発明において、前記多糖体は、Ｔｒｅｇからヘリオス（Ｈｅｌｉｏｓ）、ＩＬ－１０及びＣＴＬＡ－４の発現を増加させることを特徴とし、エフェクターＴ細胞のＩＦＮ－γを減少させることを特徴とし得る。
【0151】
本発明の一実施例において、新規な多糖体は酵母抽出物に由来し、具体的には、酵母の細胞壁から分離された。β－１，３－グルカンが除去された酵母細胞壁に由来したマンナン／β－グルカン含有多糖体（ＭＧＣＰ）の場合、増加したＴｒｅｇ細胞誘導能を示した。
【0152】
本発明において、前記多糖体は酵母（ｙｅａｓｔ）由来であることを特徴とし、好ましくは酵母細胞壁由来であり、より好ましくは、β－１，３－グルカンが除去された酵母の細胞壁由来であることを特徴とし得る。
【0153】
本発明において、前記多糖体は、抗炎症機能又は免疫機能調節活性を有することが好ましく、より好ましくは免疫抑制活性のものであるが、これに限定されない。例えば、腸出血などの腸内傷がある人の場合、プロバイオティックスを誤って服用すれば副作用が発生することがあるが、その場合、多糖体を投与して治療効果を奏することができる。
【0154】
本発明は、他の観点において、前記多糖体を有効成分として含有する免疫調節用組成物に関する。
【0155】
本発明における用語“免疫調節”とは、血液内免疫アンバランスを解消し、免疫恒常性を維持することを意味する。免疫恒常性の維持は、免疫を抑制させる免疫寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）と免疫を増進する免疫反応（ｉｍｍｕｎｉｔｙ）間のバランスが取れている状態を指し、このような状態の維持は、免疫疾患治療、特に自己免疫疾患の治療において必須の要素である。
【0156】
前記免疫調節用組成物は、免疫活性の調節及び免疫疾患の予防、改善又は治療のための目的で医薬組成物又は健康機能食品などに用いることができ、このとき、使用量及び使用形態は目的によって適切に調節することができる。
【0157】
本発明の一実施例において、ＭＧＣＰの経口投与は、結腸Ｔｒｅｇ細胞の誘導を増加させることが確認された。これに加えて、ＭＧＣＰの経口投与はＴｒｅｇ細胞のＣＴＬＡ－４及びＩＬ－１０の発現を有意に増加させ、エフェクターＴ細胞のＩＦＮ－γ発現を顕著に減少させた。
【0158】
本発明の他の実施例において、ＭＧＣＰを給与した微生物フラジェリン反応性ＣＤ４ Ｔ細胞を保有したマウスにおいて体重減少及び結腸長さの短縮を顕著に減少させ、上皮細胞の増殖及びリンパ球の結腸内侵入も効果的に抑制した。組織病理学スコアリング結果もｍｏｃｋ投与マウスに比べて顕著に緩和された結果を示した。
【0159】
したがって、本発明は、さらに他の観点において、前記多糖体を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用医薬組成物に関する。
【0160】
本発明の用語“免疫疾患”とは、免疫体系の異常が直接な原因となって発病し得る疾患を意味し、皮膚炎、アレルギー、鼻炎、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ）、腱鞘炎、１型糖尿病、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、退行性神経疾患、２型糖尿病、珪肺症、粥状動脈硬化症、白斑症、結膜炎及び自己免疫疾患からなる群から選ばれるいずれか一つに該当し得るが、これに制限されない。
【0161】
本発明における用語“自己免疫疾患”とは、生体内の免疫細胞が外部侵入抗原ではなく生体自体の組織又は細胞を抗原として認識して攻撃して発生する疾患であり、リウマチ性関節炎、全身性強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、アトピー皮膚炎、乾癬、喘息、ギランバレー症候群（Ｇｕｉｌｌｉａｎ－Ｂａｒｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、重症筋無力症、皮膚筋炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、自己免疫性脳脊髓炎、結節性多発性動脈炎（ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｎｏｄｏｓａ）、側頭動脈炎（ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、小児期糖尿病、円形脱毛症、天疱瘡、アフタ口内炎、クローン病及びベーチェット病からなる群から選ばれるいずれか一つに該当し得るが、これに制限されない。
【0162】
本発明の用語“炎症性疾患”は、炎症を主病変とする疾病を総称するものであり、むくみ、アレルギー、喘息、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、片道炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大膓炎、痔疾、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ性熱、ループス、線維筋痛（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ）、乾癬関節炎、骨関節炎、リウマチ性関節炎、肩関節周囲炎、腱炎、腱鞘炎、筋肉炎、肝炎、膀胱炎、腎臓炎、シェーグレン症候群（ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、重症筋無力症及び多発性硬化症から構成される群から選ばれるいずれか一つに該当し得るが、これに制限されない。
【0163】
本発明で使われる用語“予防”とは、本発明に係る医薬組成物の投与によって免疫疾患又は炎症性疾患を抑制させたり或いは発病を遅延させる全ての行為を意味する。
【0164】
本発明で使われる用語“治療”とは、本発明に係る医薬組成物の投与によって免疫疾患又は炎症性疾患に対する症状が好転したり或いは有益に変更される全ての行為を意味する。
【0165】
本発明の医薬組成物は、その有効成分の上述した免疫増進効果、又は免疫過剰抑制効果を用いて様々な免疫疾患に対する予防又は治療及び抗炎症効果を奏する。
【0166】
前記医薬組成物は、前記多糖体を含有する他にも、一般に医薬組成物に用いられる適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。
【0167】
前記組成物に含まれてよい担体、賦形剤及び希釈剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油などがある。前記組成物を製剤化する場合には、一般に用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。
【0168】
本発明に係る医薬組成物は、通常の方法によって様々な形態に剤形化して使用可能である。適合な剤形には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、糖衣錠、硬質又は軟質のカプセル剤、溶液剤、懸濁剤又は乳化液剤、注射剤、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液などがあるが、これに限定されない。
【0169】
本発明に係る医薬組成物は、薬学的に不活性である有機又は無機担体を用いて適合な剤形に製造できる。すなわち、剤形が錠剤、コーティングされた錠剤、糖衣錠及び硬質カプセル剤である場合、ラクトース、スクロース、澱粉又はその誘導体、タルク、カルシウムカーボネート、ゼラチン、ステアリン酸又はその塩を含むことができる。また、剤形が軟質カプセル剤である場合には、植物性オイル、ワックス、脂肪、半固体及び液体のポリオールを含むことができる。また、剤形が溶液又はシロップの形態である場合、水、ポリオール、グリセロール、及び植物性オイルなどを含むことができる。
【0170】
本発明に係る医薬組成物は、前記の担体の他にも、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、溶解剤、甘味剤、着色剤、浸透圧調節剤、酸化防止剤などをさらに含むことができる。
【0171】
本発明に係る医薬組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、“薬学的に有効な量”は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られた要素によって決定可能である。本発明に係る医薬組成物は、個別治療剤として投与したり、或いは他の治療剤と併用して投与可能であり、従来の治療剤とは順次に又は同時に投与でき、また、１回又は多回投与できる。上記の要素を全て考慮し、副作用無しで最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者にとって容易に決定可能である。
【0172】
本発明の組成物は、免疫、特に自己免疫又はアレルギー関連タンパク質と共に投与可能である。具体的なタンパク質には、自己免疫疾患に関与する自己抗原、例えば、リウマチ関節炎は、熱ショックタンパク質（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ；ＨＳＰｓ）、シトルリン化フィラグリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ｐ２０５、コラーゲンなどを含むことができ、１型糖尿病は、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、亜鉛トランスポーター８タンパク質（Ｚｉｎｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ８ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＺｎＴ８）、膵臓及び十二指腸のホメオボックス１（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｎｄ ｄｕｏｄｅｎａｌ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １；ＰＤＸ１）、クロモグラニンＡ（Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ Ａ；ＣＨＧＡ）、膵島アミロイドポリペプチド（Ｉｓｌｅｔ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ＩＡＰＰ）を含むことができ、重症筋無力症に関連した自己抗原であるアセチルコリン受容体を含むことができる。また、このような自己免疫疾患に知られたあらゆる種類の自己抗原だけでなく、食品アレルギーを起こすものと知られている様々なアレルギー誘導物質であるピーナッツ、牛乳、卵、ナッツ類（Ｔｒｅｅ ｎｕｔｓ）、豆、海老などの甲殻類、魚由来物質なども含むことができる。
【0173】
本発明の医薬組成物は、個体に様々な経路で投与可能である。投与の方式は、例えば、皮下、静脈、筋肉又は子宮内硬膜又は脳血管内注射によって投与できる。本発明の医薬組成物は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重及び疾患の重症度などの様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類によって決定される。
【0174】
本発明に係る医薬組成物の投与方法は剤形によって容易に選択可能であり、経口又は非経口投与できる。投与量は、患者の年齢、性別、体重、病症の程度、投与経路によって変更可能である。
【0175】
本発明は、さらに他の観点において、本発明の多糖体又は前記多糖体を有効成分として含有する医薬組成物を投与することを含む免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療方法に関する。
【0176】
本発明は、さらに他の観点において、免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療のための本発明の多糖体又は前記多糖体を有効成分として含有する組成物の用途に関する。
【0177】
本発明は、さらに他の観点において、免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用薬剤の製造のための本発明の多糖体の使用に関する。
【0178】
本発明に係る医薬組成物は、優れた免疫増強及び免疫過剰抑制効果を提供する他、薬物による毒性及び副作用もほとんどないので、免疫疾患の治療又は予防の目的で長期間服用することができる。
【0179】
本発明は、さらに他の観点において、前記多糖体を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は改善用食品に関する。
【0180】
前記免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は改善用食品は、免疫活性を増強させたり或いは過剰免疫を抑制又は改善して免疫機能の恒常性を維持する活性を有する健康機能食品であることを特徴とし得る。
【0181】
本発明の用語“食品”とは、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤、健康機能食品及び健康食品などがあり、通常の意味におけるいかなる食品も含む。
【0182】
前記健康機能（性）食品（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄ）とは、特定の保健用食品（ｆｏｏｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉａｌ ｈｅａｌｔｈ ｕｓｅ；ＦｏＳＨＵ）と同じ意味の用語であり、栄養供給の他にも生体調節機能を効率的に呈するように加工された医学、医療効果の高い食品を意味する。ここで、“機能（性）”とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調節したり、又は生理学的作用などのような保健用途に有用な効果を得ることを意味する。本発明の食品は、当業界で通常用いられる方法によって製造可能であり、前記製造時には、当業界で通常添加する原料及び成分を添加して製造することができる。また、前記食品の剤形また食品として認められる剤形であればいずれも製造可能であり、本発明に係る健康機能食品は、粉末、顆粒、錠剤、カプセル又は飲料の形態でよい。
【0183】
前記健康食品（ｈｅａｌｔｈ ｆｏｏｄ）は一般食品に比べて積極的な健康維持や増進効果を有する食品を意味し、健康補助食品（ｈｅａｌｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｆｏｏｄ）は健康補助目的の食品を意味する。場合によって、健康機能食品、健康食品、健康補助食品の用語は同じ意味で使われる。
【0184】
前記食品組成物は生理学的に許容可能な担体をさらに含むことができるが、担体の種類は特に制限されず、当該技術分野に通常用いられる担体であればいずれも使用可能である。
【0185】
また、前記組成物は食品組成物に通常用いられて匂い、味、視覚などを向上させ得る追加成分を含むことができる。例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ナイアシン（ｎｉａｃｉｎ）、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、ホレート（ｆｏｌａｔｅ）、パントテン酸（ｐａｎｔｈｏｔｅｎｉｃ ａｃｉｄ）などを含むことができる。また、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、クロム（Ｃｒ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、銅（Ｃｕ）、クロミウム（Ｃｒ）などのミネラルを含むことができる。また、リジン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含むことができる。
【0186】
また、前記組成物は、防腐剤（ソルビン酸カリウム、ベンゾ酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、殺菌剤（さらし粉と高度さらし粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニゾール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）など）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜硝酸ナトリウム、亜酢酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（ＭＳＧなど）、甘味料（ズルチン、シクラメート、サッカリン、ナトリウムなど）、香料（バニリン、ラクトン類など）、膨張剤（ミョウバン、Ｄ－酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、皮膜剤、ガム基礎剤、気泡抑制剤、溶剤、改良剤などの食品添加物（ｆｏｏｄ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）を含むことができる。前記添加物は、食品の種類によって選別し、適度の量を使用することができる。
【0187】
本発明の前記多糖体に加えて、食品学的に許容可能な食品補助添加剤をさらに含むことができ、他の食品又は食品成分と共に使用可能であり、通常の方法によって適切に使用することができる。有効成分の混合量は、その使用目的（予防、健康又は治療的処置）によって適切に決定することができる。
【0188】
本発明の一実施例において、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏを問わずにＭＧＣＰが結腸Ｔｒｅｇ細胞を誘導し、Ｔｒｅｇ細胞におけるＩＬ－１０及びＣＴＬＡ－４の発現を増加させており、また、エフェクターＴ細胞においてＩＦＮ－γの発現を抑制することによって、免疫作用を抑制することを確認した。
【0189】
本発明の他の実施例において、前記多糖体はＤＣを媒介してＴｒｅｇ細胞を誘導することを確認した。具体的に、ＤＣのＤｅｃｔｉｎ１、Ｄｅｃｔｉｎ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＴＬＲ６が欠乏している場合、Ｔｒｅｇの細胞分化が減少することを確認したが、特に、Ｄｅｃｔｉｎ１及びＴＬＲ４が欠乏している場合にその減少幅が顕著であった。また、ＭｙＤ８８信号伝達体系が欠乏している場合にもＴｒｅｇ細胞の誘導が減少することを確認した。
【0190】
本発明のさらに他の実施例において、このようなＰＲＲを用いた多糖体の認識は、ＩＬ－１０、Ｃｄ２７４、インドールアミン２，３－デオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、Ｔｇｆβ１及びＣｏｘ２などのＤＣの転写体地形（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｌａｎｄｓｃａｐｅ）を免疫寛容性（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ）ＤＣの表現型に変形させ、特に、セレコキシブを処理して実験した結果、Ｃｏｘ２が過発現することにより、Ｔｒｅｇ細胞を誘導することが分かった。樹状細胞の他にも、Ｔｒｅｇ細胞は抗原を認識し提示する如何なる細胞によっても誘導可能である。
【0191】
したがって、本発明は、さらに他の観点において、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）に上記の多糖体を処理して免疫寛容性抗原提示細胞（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）を得る段階；及び前記免疫寛容性抗原提示細胞をＣＤ４＋ Ｔ細胞と共培養（ｃｏ－ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）して調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を誘導する段階を含む調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の製造方法に関する。
【0192】
本発明の用語“抗原提示細胞”とは、抗原を取り込んで処理した後、抗原由来断片をＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子のような抗原提示分子と共にＴ細胞に提示して分化を誘導する細胞を意味する。例えば、前記抗原提示細胞は、大食細胞、Ｂ細胞、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｅ ｃｅｌｌ；ＤＣ）、ランゲルハンス細胞などがあるが、これに限定されない。
【0193】
本発明の用語“免疫寛容性抗原提示細胞”とは、様々な抑制抗原に対して免疫系を免疫耐性（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ）状態にさせる免疫抑制性を有する抗原提示細胞の一種である。免疫寛容性抗原提示細胞は主に、Ｔ細胞のアネルギー化及び死滅誘導、Ｔｒｅｇの誘導のようなＴ細胞調節によって免疫環境に影響を及ぼす。このような免疫抑制的特性から、アレルギー疾患、自己免疫疾患などにおいて細胞治療剤の候補物質として脚光を浴びている。免疫寛容性抗原提示細胞は、例えば、免疫寛容性大食細胞、免疫寛容性樹状細胞（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ ＤＣ）又は免疫寛容性Ｂ細胞であり得るが、これに限定されない。
【0194】
本発明において、前記抗原提示細胞は、パターン認識受容体（ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＰＲＲｓ）を発現することを特徴とし得る。前記パターン認識受容体は、好ましくは、Ｄｅｃｔｉｎ１、Ｄｅｃｔｉｎ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＴＬＲ６からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であり得るが、これに限定されない。
【0195】
本発明において、前記免疫抗原提示細胞（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）は、ＩＬ－１０、Ｃｄ２７４、インドールアミン２、３－デオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、Ｔｇｆβ１及びＣｏｘ２からなる群から選ばれるいずれか一つ以上を過発現することを特徴とし得るが、これに限定されない。
【0196】
本発明において、前記調節Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節Ｔ細胞であることが好ましいが、これに限定されない。
【0197】
また、本発明において、前記多糖体はＴｒｅｇ細胞からヘリオス（Ｈｅｌｉｏｓ）、ＩＬ－１０及びＣＴＬＡ－４の発現を増加させることを特徴とし、エフェクターＴ細胞のＩＦＮ－γを減少させることを特徴とし得る。
【0198】
本発明の一実施例において、ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで機能的活性を持って大膓炎を緩和させ得るかとうかを確認するために、ＭＧＣＰ処理されたＤＣによって生成されたＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４５＋）を未接触ＣＤ４＋ Ｔ細胞と共にマウスに養子移入した。受容体マウスの体重減少及び結腸長さの短縮は、ＭＧＣＰ－Ｔｒｅｇ受容マウスにおいて有意に減少し、結腸組織の上皮細胞構造破壊を予防し、組織病理学スコアから見られるように、結腸粘膜固有層に対するリンパ球の侵入を抑制した。また、ドナー未接触ＣＤ４＋ Ｔ細胞のＩＦＮ－γ生産数値を顕著に減少させた。
【0199】
したがって、本発明は、さらに他の観点において、前記方法で製造された調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用細胞治療剤に関する。
【0200】
本発明は、さらに他の観点において、免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療のための前記方法で製造された調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を有効成分として含有する細胞治療剤の用途に関する。
【0201】
本発明において、前記調節Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節Ｔ細胞であることが好ましいが、これに限定されない。
【0202】
本発明は、さらに他の観点において、免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用薬剤製造のための前記多糖体又は細胞治療剤の使用に関する。
【0203】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものとして解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【0204】
材料及び方法
１．マウス
マウスは、ポステック生命工学センター（ＰＯＳＴＥＣＨ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）の動物施設で飼育された。全ての実験手順はポステック研究所動物管理及び使用委員会の承認下で進行した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ポステックで同種繁殖で保持された。Ｆｏｘｐ３－ｅＧＦＰ、Ｔｌｒ２－／－、Ｔｌｒ４－／－、Ｔｌｒ６－／－及びＭｙＤ８８－／－マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒｔｏｒｙから得た。ＣＤ４５ａ－Ｒａｇ１－／－ＴＣＲ ＯＴ－ＩＩ（Ｒａｇ１－／－ＯＴＩＩ ＴＣＲ形質転換体）及びＲａｇ１－／－マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃから得た。Ｄｅｃｔｉｎ１－／－及びＤｅｃｔｉｎ２－／－動物は、Ｙｏｉｃｈｉｒｏ Ｉｗａｋｕｒａ博士（Ｔｏｋｙｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊａｐａｎ）から提供された。無菌（Ｇｅｒｍ－Ｆｒｅｅ，ＧＦ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスコロニーがＡｎｄｒｅｗ Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ博士（Ｂｅｒｎ Ｕｎｉｖ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及びＤａｖｉｄ Ａｒｔｉｓ博士（Ｔｈｅｎ ａｔ Ｕｎｉｖ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ ａｔ Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖ．，ＵＳＡ）の助力でブリーダーによって確立された。ＧＦマウスは無菌軟性膜アイソレータ（ｓｔｅｒｉｌｅ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｆｉｌｍ ｉｓｏｌａｔｏｒｓ，Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｌｅａｎ Ｌｔｄ．，ＵＳＡ）で維持された。ＣＢｉｒマウスはバーミンガムのアラバマ大学のＣｈａｒｌｅｓ Ｏ．Ｅｌｓｏｎから提供された。生後６～１２週齢の性別及び年齢に合うマウスを使用した。
１．マウス
マウスは、ポステック生命工学センター（ＰＯＳＴＥＣＨ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）の動物施設で飼育された。全ての実験手順はポステック研究所動物管理及び使用委員会の承認下で進行した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ポステックで同種繁殖で保持された。Ｆｏｘｐ３－ｅＧＦＰ、Ｔｌｒ２－／－、Ｔｌｒ４－／－、Ｔｌｒ６－／－及びＭｙＤ８８－／－マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒｔｏｒｙから得た。ＣＤ４５ａ－Ｒａｇ１－／－ＴＣＲ ＯＴ－ＩＩ（Ｒａｇ１－／－ＯＴＩＩ ＴＣＲ形質転換体）及びＲａｇ１－／－マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃから得た。Ｄｅｃｔｉｎ１－／－及びＤｅｃｔｉｎ２－／－動物は、Ｙｏｉｃｈｉｒｏ Ｉｗａｋｕｒａ博士（Ｔｏｋｙｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊａｐａｎ）から提供された。無菌（Ｇｅｒｍ－Ｆｒｅｅ，ＧＦ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスコロニーがＡｎｄｒｅｗ Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ博士（Ｂｅｒｎ Ｕｎｉｖ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及びＤａｖｉｄ Ａｒｔｉｓ博士（Ｔｈｅｎ ａｔ Ｕｎｉｖ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ ａｔ Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖ．，ＵＳＡ）の助力でブリーダーによって確立された。ＧＦマウスは無菌軟性膜アイソレータ（ｓｔｅｒｉｌｅ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｆｉｌｍ ｉｓｏｌａｔｏｒｓ，Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｌｅａｎ Ｌｔｄ．，ＵＳＡ）で維持された。ＣＢｉｒマウスはバーミンガムのアラバマ大学のＣｈａｒｌｅｓ Ｏ．Ｅｌｓｏｎから提供された。生後６～１２週齢の性別及び年齢に合うマウスを使用した。
【0205】
２．酵母細胞壁からＭＧＣＰの精製
酵母抽出物（ｔｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）２０ｇ、ポリソルベート８０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）２ｇ、クエン酸アンモニウム（Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）４ｇ、酢酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１０ｇ、硫酸マグネシウム（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１ｇのマンガン硫酸塩（Ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｓｕｌｆａｔｅ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び４ｇのリン酸二カリウム（Ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２Ｌの蒸留水に溶解させた。該溶液をオートクレーブ（ａｕｔｏ ｃｌａｖｅ）し室温で冷却させた。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を最終濃度０．４％となるように前記溶液に処理し、一晩自己撹拌しながら４℃で培養した。ＴＣＡ処理された溶液を、冷却された３滴（３Ｖｏｌｕｍｅ）のエタノールと共に一晩－２０℃で培養した。培養された溶液を遠心分離した後、上澄液の除去、及びペレットを乾燥して、残っているエタノールを除去し、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ ７．５）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファーで懸濁させた。懸濁された溶液をＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＤＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）で最終濃度０．４ｍｇ／ｍｌとなるように処理し、３７℃で一晩培養した。その後、アジ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ）で最終濃度０．０５％となるように処理し、３７℃で３０分間培養した。培養後、プロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）（Ｐｒｏｔｅａｓｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液を０．３ｍｇ／ｍｌで処理し、一晩３７℃で培養した。最終濃度が０．３ｍｇ／ｍＬとなるようにプロナーゼを１回さらに追加し、２時間さらに培養した。最終濃度０．４％となるようにＴＣＡを添加し、３７℃で２時間培養した。溶液を遠心分離し、上澄液を３滴の冷却されたエタノールに移し、一晩－２０℃で培養した。遠心分離後、上澄液を除去し、ペレットを乾燥させて残留エタノールを除去した。ペレットを１００ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ ７．５）で懸濁し、同一量のフェノールを処理して数回ひっくり返してよく混ぜた。溶液を遠心分離し、上位チューブを新しいチューブに移し、フェノールを繰り返し処理した。溶液を遠心分離し、上澄液を新しいチューブに移し、同一量のイソアミルアルコール（ｉｓｏｍｙｌ Ａｌｃｏｈｏｌ）：クロロホルム（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）１：２９（ｖ：ｖ）溶液を処理してよく混ぜた。遠心分離した後に上澄液を移し、これを１回さらに反復した。多糖類を蒸留水で３日間透析し、凍結乾燥させて得た。多糖類の濃度は酸性フェノール分析で測定した。
酵母抽出物（ｔｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）２０ｇ、ポリソルベート８０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）２ｇ、クエン酸アンモニウム（Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）４ｇ、酢酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１０ｇ、硫酸マグネシウム（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１ｇのマンガン硫酸塩（Ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｓｕｌｆａｔｅ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び４ｇのリン酸二カリウム（Ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２Ｌの蒸留水に溶解させた。該溶液をオートクレーブ（ａｕｔｏ ｃｌａｖｅ）し室温で冷却させた。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を最終濃度０．４％となるように前記溶液に処理し、一晩自己撹拌しながら４℃で培養した。ＴＣＡ処理された溶液を、冷却された３滴（３Ｖｏｌｕｍｅ）のエタノールと共に一晩－２０℃で培養した。培養された溶液を遠心分離した後、上澄液の除去、及びペレットを乾燥して、残っているエタノールを除去し、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ ７．５）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファーで懸濁させた。懸濁された溶液をＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＤＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）で最終濃度０．４ｍｇ／ｍｌとなるように処理し、３７℃で一晩培養した。その後、アジ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ）で最終濃度０．０５％となるように処理し、３７℃で３０分間培養した。培養後、プロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）（Ｐｒｏｔｅａｓｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液を０．３ｍｇ／ｍｌで処理し、一晩３７℃で培養した。最終濃度が０．３ｍｇ／ｍＬとなるようにプロナーゼを１回さらに追加し、２時間さらに培養した。最終濃度０．４％となるようにＴＣＡを添加し、３７℃で２時間培養した。溶液を遠心分離し、上澄液を３滴の冷却されたエタノールに移し、一晩－２０℃で培養した。遠心分離後、上澄液を除去し、ペレットを乾燥させて残留エタノールを除去した。ペレットを１００ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ ７．５）で懸濁し、同一量のフェノールを処理して数回ひっくり返してよく混ぜた。溶液を遠心分離し、上位チューブを新しいチューブに移し、フェノールを繰り返し処理した。溶液を遠心分離し、上澄液を新しいチューブに移し、同一量のイソアミルアルコール（ｉｓｏｍｙｌ Ａｌｃｏｈｏｌ）：クロロホルム（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）１：２９（ｖ：ｖ）溶液を処理してよく混ぜた。遠心分離した後に上澄液を移し、これを１回さらに反復した。多糖類を蒸留水で３日間透析し、凍結乾燥させて得た。多糖類の濃度は酸性フェノール分析で測定した。
【0206】
３．リンパ球の分離及び流動細胞計測分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）
未接触ＣＤ４ Ｔ細胞（Ｎａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ）は、ＦＡＣｓ分流器（ＦＡＣｓ ｓｏｒｔｅｒ，Ａｓｔｒｉｏｓ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）又はＥａｓｙＳｅｐＴＭマウスＮａｉｖｅ（登録商標） ＣＤ４＋ Ｔ細胞分離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてｐＬＮ、ｍＬＮ及び脾臓からメーカーのプロトコルにしたがって分離された。大腸及び小腸からの分離において、腸を縦に切開し、ＰＢＳで洗浄して粘液と糞便を除去した。腸を小さい切片に切り、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び３％ ＦＢＳを含むＰＢＳと共に磁石棒で撹拌しながら３７℃で２０分間培養した。組織を粉砕し、３７℃で４５分間３％ ＦＢＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ）及びＤＮａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が添加されたＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。組織を１０ｍＭ ＥＤＴＡ下で５分間さらに培養した。上澄液を１００ｍｍセルストレーナー（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）で濾過し、冷却されたＰＢＳに移し、残った酵素及びＥＤＴＡを除去した。細胞をＰｅｒｃｏｌｌTM（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）グラジエントに４０％及び７５％でロードした。リンパ球をｐｅｒｃｏｌｌグラジエント膜の表面から収穫し、１％ ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトシンが添加されたＤＭＥＭ培地で洗浄した。サイトカインの分析のために、１０％ ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸及び０．１％β－ＭＥ（ｖ／ｖ）を含有する完全なＲＰＭＩ培地において３７℃で４～５時間Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下にＰＭＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）及びイオノマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で細胞を刺激した。細胞は、流動細胞計測分析のためにメーカーのプロトコルにしたがって染色された。
未接触ＣＤ４ Ｔ細胞（Ｎａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ）は、ＦＡＣｓ分流器（ＦＡＣｓ ｓｏｒｔｅｒ，Ａｓｔｒｉｏｓ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）又はＥａｓｙＳｅｐＴＭマウスＮａｉｖｅ（登録商標） ＣＤ４＋ Ｔ細胞分離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてｐＬＮ、ｍＬＮ及び脾臓からメーカーのプロトコルにしたがって分離された。大腸及び小腸からの分離において、腸を縦に切開し、ＰＢＳで洗浄して粘液と糞便を除去した。腸を小さい切片に切り、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び３％ ＦＢＳを含むＰＢＳと共に磁石棒で撹拌しながら３７℃で２０分間培養した。組織を粉砕し、３７℃で４５分間３％ ＦＢＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ）及びＤＮａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が添加されたＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。組織を１０ｍＭ ＥＤＴＡ下で５分間さらに培養した。上澄液を１００ｍｍセルストレーナー（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）で濾過し、冷却されたＰＢＳに移し、残った酵素及びＥＤＴＡを除去した。細胞をＰｅｒｃｏｌｌTM（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）グラジエントに４０％及び７５％でロードした。リンパ球をｐｅｒｃｏｌｌグラジエント膜の表面から収穫し、１％ ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトシンが添加されたＤＭＥＭ培地で洗浄した。サイトカインの分析のために、１０％ ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸及び０．１％β－ＭＥ（ｖ／ｖ）を含有する完全なＲＰＭＩ培地において３７℃で４～５時間Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下にＰＭＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）及びイオノマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で細胞を刺激した。細胞は、流動細胞計測分析のためにメーカーのプロトコルにしたがって染色された。
【0207】
細胞の染色には下記の試薬が用いられた：
Ｌｉｖｅ／ＤＥＡＤ固定可能染料（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、固定／透過バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、透過バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＣ固定バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗体。
Ｌｉｖｅ／ＤＥＡＤ固定可能染料（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、固定／透過バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、透過バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＣ固定バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗体。
【0208】
前記実験には下記の抗体クローンが用いられた：
ＣＤ４（ＲＭ４－５）、ＣＤ４４（ＩＭ７）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ－１４）、ＣＤ４５．１（Ａ２０）、ＣＤ１０３（２Ｅ７）、Ｆｏｘｐ３（ＦＪＫ－１６ｓ）、ＣＴＬＡ４（ＵＣ１０－４Ｂ９）、Ｎｒｐ１（３Ｅ１２）、ＩＬ－１０（ＪＥＳ５－１６Ｅ３）、ＩＦＮ－γ（ＸＭＧ１．２）、ＩＬ－１７Ａ（１７Ｂ７）、ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、Ｆ４／８０（ＢＭ８）、ＭＨＣＩＩ（Ｍ５／１１４．１５．２）。
ＣＤ４（ＲＭ４－５）、ＣＤ４４（ＩＭ７）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ－１４）、ＣＤ４５．１（Ａ２０）、ＣＤ１０３（２Ｅ７）、Ｆｏｘｐ３（ＦＪＫ－１６ｓ）、ＣＴＬＡ４（ＵＣ１０－４Ｂ９）、Ｎｒｐ１（３Ｅ１２）、ＩＬ－１０（ＪＥＳ５－１６Ｅ３）、ＩＦＮ－γ（ＸＭＧ１．２）、ＩＬ－１７Ａ（１７Ｂ７）、ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、Ｆ４／８０（ＢＭ８）、ＭＨＣＩＩ（Ｍ５／１１４．１５．２）。
【0209】
４．Ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原提示細胞依存的Ｔ細胞分化
２×１０４個の標識組織（ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ）由来のＣＤ１１ｃ＋ ＤＣを、標識された多糖類又はＭＧＣＰで処理し、１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｒｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下に１４時間ＲＰＭＩ１６４０完全培地で培養した。ＭＧＣＰを処理してＤＣを刺激する場合に、ＤＣはＭＧＣＰ濃度が別途記載された場合以外は、大部分のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において５０μｇ／ｍＬのＭＧＣＰで刺激された。刺激されたＤＣを洗浄し、２×１０５未接触ＣＤ４ Ｔ細胞と共に３日間共同培養した。大部分の実験は、０．１μｇ／ｍｌのａｎｔｉ－ＣＤ３（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２、０．１又は０．０５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－ベータ１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及び１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含む準最適Ｔｒｅｇ細胞分化（ｓｋｅｗｉｎｇ）条件で行われた。準最適Ｔｈ１走行環境のために、０．１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２、２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１２、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ－４存在下で細胞を培養した。３日の培養後に、細胞を上記の流動細胞計測法で分析した。いくつかの実験において拮抗剤は、ＭＧＣＰの刺激に先立って脾臓ＤＣに処理された。多糖類分解酵素を使用する実験手順の場合、脾臓ＤＣに処理する前にザイモサン又はＭＧＣＰをメーカーのプロトコルにしたがって同一の酵素で分解し、未接触ＣＤ４ Ｔ細胞と共に培養した。セレコキシブを使用した実験において、抑制剤は、ＭＧＣＰを用いて脾臓ＤＣを刺激する前に３０分間処理され、その後、セレコキシブの存在条件下に未接触ＣＤ４ Ｔ細胞と共に培養した。
２×１０４個の標識組織（ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ）由来のＣＤ１１ｃ＋ ＤＣを、標識された多糖類又はＭＧＣＰで処理し、１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｒｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下に１４時間ＲＰＭＩ１６４０完全培地で培養した。ＭＧＣＰを処理してＤＣを刺激する場合に、ＤＣはＭＧＣＰ濃度が別途記載された場合以外は、大部分のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において５０μｇ／ｍＬのＭＧＣＰで刺激された。刺激されたＤＣを洗浄し、２×１０５未接触ＣＤ４ Ｔ細胞と共に３日間共同培養した。大部分の実験は、０．１μｇ／ｍｌのａｎｔｉ－ＣＤ３（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２、０．１又は０．０５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－ベータ１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及び１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含む準最適Ｔｒｅｇ細胞分化（ｓｋｅｗｉｎｇ）条件で行われた。準最適Ｔｈ１走行環境のために、０．１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２、２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１２、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ－４存在下で細胞を培養した。３日の培養後に、細胞を上記の流動細胞計測法で分析した。いくつかの実験において拮抗剤は、ＭＧＣＰの刺激に先立って脾臓ＤＣに処理された。多糖類分解酵素を使用する実験手順の場合、脾臓ＤＣに処理する前にザイモサン又はＭＧＣＰをメーカーのプロトコルにしたがって同一の酵素で分解し、未接触ＣＤ４ Ｔ細胞と共に培養した。セレコキシブを使用した実験において、抑制剤は、ＭＧＣＰを用いて脾臓ＤＣを刺激する前に３０分間処理され、その後、セレコキシブの存在条件下に未接触ＣＤ４ Ｔ細胞と共に培養した。
【0210】
前記実験には下記の試薬が用いられた：
α－（１－６）ｃｏｒｅ ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ（ＱＡｂｉｏ）、ｐｕｓｔｕｌａｎａｓｅ（Ｐｒｏｋａｚｙｍｅ）、ｚｙｍｏｌｙａｓｅ（ＭＰｂｉｏ）、Ｍｉｎｃｌｅ単一クローン抗体（ａｎｔｉ－Ｍｉｎｃｌｅ ｍＡｂ，ＭＢＬ）、ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体（ａｎｔｉ－ＤＣ－ＳＩＧＮ Ａｂ，Ａｂｃａｍ）、組換えマウスＭＭＲタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）
α－（１－６）ｃｏｒｅ ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ（ＱＡｂｉｏ）、ｐｕｓｔｕｌａｎａｓｅ（Ｐｒｏｋａｚｙｍｅ）、ｚｙｍｏｌｙａｓｅ（ＭＰｂｉｏ）、Ｍｉｎｃｌｅ単一クローン抗体（ａｎｔｉ－Ｍｉｎｃｌｅ ｍＡｂ，ＭＢＬ）、ＤＣ－ＳＩＧＮ抗体（ａｎｔｉ－ＤＣ－ＳＩＧＮ Ａｂ，Ａｂｃａｍ）、組換えマウスＭＭＲタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）
【0211】
５．ＣＤ４ Ｔ細胞伝達を用いた実験性大膓炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｌｉｔｉｓ）の誘導
実験性大膓炎は、過去知られた方法によって誘導された（Ｐｏｗｒｉｅ Ｆ，Ｌｅａｃｈ ＭＷ，Ｍａｕｚｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９４；１（７）：５５３－６２．及びＬｅａｃｈ ＭＷ，Ｂｅａｎ ＡＧ，Ｍａｕｚｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９６；１４８（５）：１５０３－１５．）。具体的に、類遺伝子型（ｃｏｎｇｅｎｉｃ，ＣＤ４５．１＋）Ｆｏｘｐ３－ＥＧＦＰマウス又はＣＢｉｒマウスから分類されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ－ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ未接触Ｔ細胞（１Ｘ１０６）ＦＡＣｓがＲａｇ１欠乏マウスに伝達された。Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生成されたＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞の効能を評価するために、未接触ＣＤ４ Ｔ細胞を、標識されたＴｒｅｇ細胞（２×１０５）と同時に養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）した。ＣＢｉｒマウス由来の未接触ＣＤ４ Ｔ細胞を用いて大膓炎を誘導するために、受容体は、全実験期間にわたってｍｏｃｋ又はＭＧＣＰが隔日で経口投与された。週に２回体重を測定して大膓炎の進行をモニタリングし、マウスは体重が約２０％減少すると犧牲にさせた。疾病の重症度は、結腸の長さ、組織学的評価及びドナー未接触ＣＤ４ Ｔ細胞からのサイトカイン生成を測定して分析した。
実験性大膓炎は、過去知られた方法によって誘導された（Ｐｏｗｒｉｅ Ｆ，Ｌｅａｃｈ ＭＷ，Ｍａｕｚｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９４；１（７）：５５３－６２．及びＬｅａｃｈ ＭＷ，Ｂｅａｎ ＡＧ，Ｍａｕｚｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９６；１４８（５）：１５０３－１５．）。具体的に、類遺伝子型（ｃｏｎｇｅｎｉｃ，ＣＤ４５．１＋）Ｆｏｘｐ３－ＥＧＦＰマウス又はＣＢｉｒマウスから分類されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ－ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ未接触Ｔ細胞（１Ｘ１０６）ＦＡＣｓがＲａｇ１欠乏マウスに伝達された。Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生成されたＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞の効能を評価するために、未接触ＣＤ４ Ｔ細胞を、標識されたＴｒｅｇ細胞（２×１０５）と同時に養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）した。ＣＢｉｒマウス由来の未接触ＣＤ４ Ｔ細胞を用いて大膓炎を誘導するために、受容体は、全実験期間にわたってｍｏｃｋ又はＭＧＣＰが隔日で経口投与された。週に２回体重を測定して大膓炎の進行をモニタリングし、マウスは体重が約２０％減少すると犧牲にさせた。疾病の重症度は、結腸の長さ、組織学的評価及びドナー未接触ＣＤ４ Ｔ細胞からのサイトカイン生成を測定して分析した。
【0212】
６．Ｉｎ ｖｉｖｏ養子移入
未接触ＣＤ４ Ｔ細胞を伝達させる前に、２００μｇのＭＧＣＰをＣ５７ＢＬ／６又はＤｅｃｔｉｎ１－／－マウスに毎日２週間経口投与した。類遺伝子対立形質（ｃｏｎｇｅｎｉｃ ａｌｌｅｌｅ）を保有するＦｏｘｐ３－ＥＧＦＰ又はＯＴ－ＩＩマウスから分離されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＥＧＦＰ－ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ未接触Ｔ細胞（精製＞９９％、１．５～２×１０６）を、ＭＧＣＰが投与された欠乏マウスに静脈投与によって移し、ＭＧＣＰを１週間毎日さらに投与した。ＯＴ－ＩＩ未接触ＣＤ４ Ｔ細胞が授与されたマウスには、２０ｍｇのＯＶＡタンパク質を細胞伝達前日から実験が終わるまで１週間隔日で補充した。
未接触ＣＤ４ Ｔ細胞を伝達させる前に、２００μｇのＭＧＣＰをＣ５７ＢＬ／６又はＤｅｃｔｉｎ１－／－マウスに毎日２週間経口投与した。類遺伝子対立形質（ｃｏｎｇｅｎｉｃ ａｌｌｅｌｅ）を保有するＦｏｘｐ３－ＥＧＦＰ又はＯＴ－ＩＩマウスから分離されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＥＧＦＰ－ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ未接触Ｔ細胞（精製＞９９％、１．５～２×１０６）を、ＭＧＣＰが投与された欠乏マウスに静脈投与によって移し、ＭＧＣＰを１週間毎日さらに投与した。ＯＴ－ＩＩ未接触ＣＤ４ Ｔ細胞が授与されたマウスには、２０ｍｇのＯＶＡタンパク質を細胞伝達前日から実験が終わるまで１週間隔日で補充した。
【0213】
７．ＲＮＡ塩基配列分析（ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
ＧＦマウスにｍｏｃｋ及びＭＧＣＰを２週間毎日投与した。ｍｏｃｋ及びＭＧＣＰが補充されたＧＦマウス由来の結腸ＣＤ１１ｃ＋ ＤＣは、マイクロビーズを用いてメーカーのプロトコルにしたがって結腸粘膜固有層全細胞から分離された。全ＲＮＡはｍｏｃｋ又はＭＧＣＰ給与マウスの結腸ＤＣから精製された。リボスピンTMＩＩ（ＲｉｂｏｓｐｉｎTMＩＩ，ＧｅｎｅＡｌｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が全ＲＮＡの分離に使用された。ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡサンプル準備キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）をライブラリー準備に使用した。ＲＮＡ塩基配列分析は、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍで行われた。ＲＮＡ塩基配列データはＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＮＣＢＩ）データ保存所に寄託された（登録番号ＧＥＯ：ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ：ＧＳＥ１２６９３７）。
ＧＦマウスにｍｏｃｋ及びＭＧＣＰを２週間毎日投与した。ｍｏｃｋ及びＭＧＣＰが補充されたＧＦマウス由来の結腸ＣＤ１１ｃ＋ ＤＣは、マイクロビーズを用いてメーカーのプロトコルにしたがって結腸粘膜固有層全細胞から分離された。全ＲＮＡはｍｏｃｋ又はＭＧＣＰ給与マウスの結腸ＤＣから精製された。リボスピンTMＩＩ（ＲｉｂｏｓｐｉｎTMＩＩ，ＧｅｎｅＡｌｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が全ＲＮＡの分離に使用された。ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡサンプル準備キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）をライブラリー準備に使用した。ＲＮＡ塩基配列分析は、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍで行われた。ＲＮＡ塩基配列データはＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＮＣＢＩ）データ保存所に寄託された（登録番号ＧＥＯ：ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ：ＧＳＥ１２６９３７）。
【0214】
８．定量逆転写重合酵素ＰＣＲ（ＱｒｔＰＣＲ）
全転写体はｍｏｃｋ及びＭＧＣＰ補充ＧＦマウス由来の結腸ＣＤ１１ｃ＋ ＤＣから精製された。細胞を収穫した後、ＴＲＩｚｏｌ試薬に溶解させた。総ＲＮＡはメーカーのプロトコルにしたがって精製された。精製された総ＲＮＡは、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素（ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｃＤＮＡに合成された。標識されたマーカーの発現量は、下記表のプライマー対及び前記方法で製造されたｃＤＮＡを用いて分析した。全てのデータはＨＰＲＴ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の発現レベルに正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）された。結果は、ｍｏｃｋ対照群の発現レベルに対する相対的な発現レベルとしてさらに分析された。
全転写体はｍｏｃｋ及びＭＧＣＰ補充ＧＦマウス由来の結腸ＣＤ１１ｃ＋ ＤＣから精製された。細胞を収穫した後、ＴＲＩｚｏｌ試薬に溶解させた。総ＲＮＡはメーカーのプロトコルにしたがって精製された。精製された総ＲＮＡは、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素（ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｃＤＮＡに合成された。標識されたマーカーの発現量は、下記表のプライマー対及び前記方法で製造されたｃＤＮＡを用いて分析した。全てのデータはＨＰＲＴ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の発現レベルに正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）された。結果は、ｍｏｃｋ対照群の発現レベルに対する相対的な発現レベルとしてさらに分析された。
【0215】
【表1】
【0216】
９．組織学的分析
実験性大膓炎の臨床学的点数は、Ｈ＆Ｅ染色を用いた組織学的分析で測定した。簡単にいえば、コロン１ｃｍを１０％ホルムアルデヒドに固定させ、パラフィン片に埋めた。パラフィン片を３μｍ厚に切断し、ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びエオシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。
実験性大膓炎の臨床学的点数は、Ｈ＆Ｅ染色を用いた組織学的分析で測定した。簡単にいえば、コロン１ｃｍを１０％ホルムアルデヒドに固定させ、パラフィン片に埋めた。パラフィン片を３μｍ厚に切断し、ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びエオシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。
【0217】
１０．統計分析
統計分析は、グラフパッドプリズムソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ）を用いて行った。対照群と実験群における差異は、両側のアンペアード－スチューデントｔ－テストを用いて評価した。データは、平均±ＳＥＭで示した。
統計分析は、グラフパッドプリズムソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ）を用いて行った。対照群と実験群における差異は、両側のアンペアード－スチューデントｔ－テストを用いて評価した。データは、平均±ＳＥＭで示した。
【0218】
実施例１：ザイモサン（ｚｙｍｏｓａｎ）のＴｒｅｇ細胞誘導能力確認
免疫システムにおいてイースト多糖類の免疫調節機能を研究するために、ザイモサンをＤＣに処理した後、未接触ＣＤ４ Ｔ細胞と共に培養した。ザイモサン処理されたＤＣは濃度依存的にＴｒｅｇ細胞の誘導を促進し、ザイモサンは５００μｇ／ｍＬで最高の誘導性能を示した（図１Ａ）。次に、ザイモサンがエフェクターＴ細胞を誘導するのに類似の濃度依存効果を示すかどうか確認した。ザイモサンは、最低の濃度でＲＯＲγｔの発現を誘導するが、Ｔ－ｂｅｔの発現には影響を及ぼさなかった（図２Ａ）。驚くべきことに、エフェクターＴ細胞においてＴ－ｂｅｔ及びＲＯＲγｔの発現はザイモサンの濃度が増加するにつれて抑制された（図２Ａ）。
免疫システムにおいてイースト多糖類の免疫調節機能を研究するために、ザイモサンをＤＣに処理した後、未接触ＣＤ４ Ｔ細胞と共に培養した。ザイモサン処理されたＤＣは濃度依存的にＴｒｅｇ細胞の誘導を促進し、ザイモサンは５００μｇ／ｍＬで最高の誘導性能を示した（図１Ａ）。次に、ザイモサンがエフェクターＴ細胞を誘導するのに類似の濃度依存効果を示すかどうか確認した。ザイモサンは、最低の濃度でＲＯＲγｔの発現を誘導するが、Ｔ－ｂｅｔの発現には影響を及ぼさなかった（図２Ａ）。驚くべきことに、エフェクターＴ細胞においてＴ－ｂｅｔ及びＲＯＲγｔの発現はザイモサンの濃度が増加するにつれて抑制された（図２Ａ）。
【0219】
また、Ｔｒｅｇ細胞の誘導に関与する正確なザイモサン由来の多糖体を確認するために、切断酵素を用いて異なる構造の多糖体を切断した。ザイモサンにおいて、β－１，３－グルカンを除去すればＴｒｅｇ細胞の誘導が劇的に増加する（図１Ｂ）。一方、ザイモサンのβ－１，６－グルカン及びマンナンの切断はＴｒｅｇ細胞の誘導を抑制し、対照的な効果を示す（図１Ｃ）。β－１，３－グルカン及びβ－１，６－グルカンの切断は、ザイモサン媒介ＲＯＲγｔ抑制の補償と別個に処理しなかった対照群に比べて、ＲＯＲγｔの発現増加を示した（図２Ｂ及び図２Ｃ）。前記結果は、ザイモサンの特定多糖体構造の免疫学的効果を示す。前記結果から、β－１，６－グルカン及びマンナンはＴｒｅｇ細胞の生成に必須であるのに対し、β－１，３－グルカンはＴｈ１免疫反応を誘導し、Ｔｒｅｇ細胞の生成を抑制することが分かる。
【0220】
実施例２：ＭＧＣＰの精製及び構造及び機能的特性分析
材料及び方法において、上記のような方法で酵母細胞壁から多糖体を精製した後、構造的特性及び免疫機能的関連性を確認した。酵母由来多糖体の組成分析結果は、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ，８０．６％）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ，１４．９％）及びガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ，４．５％）で構成されていることを確認した（図３Ａ及び図４）。陽性子核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光学を用いた多糖類構造及び形態の追加的分析は、マンナン及びβ－１，６－グルカンを主成分とするということを裏付ける（図５Ａ）。マンナンユニットの詳細な構造はα－１，６－結合マンノースバックボーンを有していることが見つけられ、α－１，２－結合又はα－１，３－結合で連結された単一ユニットマンノース（３０％）、２ユニットマンノース（１６．８％）又は３ユニットマンノース（２８．４％）を側鎖としてそれぞれ連結されていること（側鎖のないマンノース（２４．８％））を確認した（図５Ｂ）。マンナン成分の構造は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞壁から発見される典型的なマンナン構造に似ていた。β－１，６－グルカンはβ－１，６－結合グルコース骨格を中心に構成され、骨格のグルコースのうち１８％は、β－１，３－結合された単一ユニットグルコースを側鎖とする（図５Ｃ）。このような構造を有する酵母由来の多糖体は新規なものであり、精製された多糖体をＭＧＣＰ（Ｍａｎｎａｎ／β－Ｇｌｕｃａｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）と命名した。
材料及び方法において、上記のような方法で酵母細胞壁から多糖体を精製した後、構造的特性及び免疫機能的関連性を確認した。酵母由来多糖体の組成分析結果は、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ，８０．６％）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ，１４．９％）及びガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ，４．５％）で構成されていることを確認した（図３Ａ及び図４）。陽性子核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光学を用いた多糖類構造及び形態の追加的分析は、マンナン及びβ－１，６－グルカンを主成分とするということを裏付ける（図５Ａ）。マンナンユニットの詳細な構造はα－１，６－結合マンノースバックボーンを有していることが見つけられ、α－１，２－結合又はα－１，３－結合で連結された単一ユニットマンノース（３０％）、２ユニットマンノース（１６．８％）又は３ユニットマンノース（２８．４％）を側鎖としてそれぞれ連結されていること（側鎖のないマンノース（２４．８％））を確認した（図５Ｂ）。マンナン成分の構造は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞壁から発見される典型的なマンナン構造に似ていた。β－１，６－グルカンはβ－１，６－結合グルコース骨格を中心に構成され、骨格のグルコースのうち１８％は、β－１，３－結合された単一ユニットグルコースを側鎖とする（図５Ｃ）。このような構造を有する酵母由来の多糖体は新規なものであり、精製された多糖体をＭＧＣＰ（Ｍａｎｎａｎ／β－Ｇｌｕｃａｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）と命名した。
【0221】
ＭＧＣＰの分子量を確認するために、本技術分野に知られた方法で、ＨＰＬＣを用いて分析した。ＴＳＫ Ｇ－Ｇ５０００ＰＷＸＬサイズ排除カラムを使用し、溶離剤（Ｅｌｕｅｎｔ）は５０ｍＭのアンモニウム重炭酸塩（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）を０．８ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した。分析結果は、時差屈折分析器（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）と２０６ｎｍ波長の紫外線分析器（ＵＶ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いて確認した。分子量の確認のために使用した基準物質は、Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｔａｎｄａｒｄを使用し、これに関する情報は、下記表２の通りである。
【0222】
【表2】
【0223】
ＨＰＬＣの結果、大きく２つのピークを確認し、ＭＧＣＰの分子量は４ｋＤａ～６０ｋＤａであることを確認した（図６及び下記表３）。ＭＧＣＰ全体のＨＰＬＣ分析結果に基づいて、図６に示すように、全体ＭＧＣＰをＡ、Ｂ、Ｃの３部分に分画し、各分画の分子量をＨＰＬＣによって確認した（図７及び下記表３）。
【0224】
【表3】
【0225】
ＭＧＣＰの免疫機能的関連性を分析し、具体的に、Ｔｒｅｇ細胞誘導能力を確認した。ＭＧＣＰが処理された脾臓ＤＣは、Ｔｒｅｇ細胞を容量依存的に誘導した（図５Ｄ）。ＭＧＣＰの各構造のＴｒｅｇ細胞誘導関連性を分析するために、まず、一般に入手可能なマンナン、β－１，６－グルカン（Ｐｕｓｔｕｌａｎ）又はβ－１，３－グルカン（ｃｕｒｄｌａｎ）を独立に処理した結果、これらのいずれも独立的にはＴｒｅｇ細胞を誘導することができなかった（図３Ｂ及び図３Ｃ）。これに対し、以前の報告のように、Ｄ－（＋）マンノースはＴｒｅｇ細胞を誘導できることを確認した（図３Ｄ）。Ｔｒｅｇ細胞分化の誘導を担当するＧＭＣＰの必須部位を決定するために、マンナン、β－１，６－グルカン及びβ－１，３－グルカンのそれぞれを切断する酵素で構造を切断して実験した。ＭＧＣＰにおいてβ－１，６－グルカンを切断すればＴｒｅｇ細胞の生成が顕著に減少し、マンナンの切断は、減少したＴｒｅｇ細胞の分化を示すが、有意の値ではなかった（図５Ｅ）。また、両多糖類の同時除去は、Ｔｒｅｇ細胞誘導においてβ－１，６－グルカンを単独で切断したのと類似に現れ、これは、Ｔｒｅｇ細胞の誘導がβ－１，６－グルカンに主に依存するということを意味する（図５Ｅ）。興味深いことに、β－１，３－グルカン除去イースト細胞壁から精製された多糖類は、損傷していないイースト細胞壁から精製されたＭＧＣＰと比較してより多いＴｒｅｇ細胞の生成を示した（図３Ｅ）。このような結果は、ＭＧＣＰの構成がいずれもＴｒｅｇ細胞を誘導する決定的な要素であることを示唆する。β－１，３－連結単一グルコースを側鎖として含むβ－１，６－グルカン部位は、ＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞誘導能力において必須であり、一方、β－１，３－グルカン部位はＴｒｅｇ細胞を抑制する。
【0226】
図示してはいないが、多糖体の分子量が大きくなる場合、特に１００ｋＤａ以上になる場合には、Ｔｒｅｇ細胞の誘導活性が低下することが見られた。
【0227】
実施例３：Ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞の炎症性大膓炎緩和効能確認
ＭＧＣＰがＴｒｅｇ細胞の分化を促進することを確認したところ、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化したＴｒｅｇ細胞が大膓炎の発病したマウス（ｉｎ ｖｉｖｏ）において緩和効果を示すかどうか確認した。類遺伝子型（ｃｏｎｇｅｎｉｃ）マーカー（ＣＤ４５．１＋）を有するＴｒｅｇ細胞は、ＤＣにＭＧＣＰを処理してｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され、未接触ＣＤ４ Ｔ細胞と同時に受容マウスに養子移入され（ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）、ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞の免疫抑制機能を確認した。その結果、ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞は大膓炎の進行を妨害することが確認された。具体的に、体重減少及び結腸長さの短縮は、ＭＧＣＰ－Ｔｒｅｇ細胞受容マウスで有意に減少した（図８Ａ及び図６Ｂ）。大膓炎の臨床的症状と関連して、ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞の転移は、結腸組織の上皮細胞構造の破壊を予防し、組織病理学スコアで表示された結腸粘膜固有層（ｃｏｌｏｎｉｃ ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ）にリンパ球の侵入を抑制した（図８Ｃ及び図６Ｄ）。大膓炎の発病機転においてＩＦＮ－γが重要な役割を担うことが知られているので、結腸粘膜固有層のＣＤ４ Ｔ細胞から病原性サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）であるＩＦＮ－γの生産を評価した。ドナー未接触ＣＤ４ Ｔ細胞のＩＦＮ－γの生産レベルは、単に未接触ＣＤ４ Ｔ細胞だけが授与された個体に比べてＭＧＣＰ－Ｔｒｅｇ細胞授与個体において劇的に減少した（図８Ｅ）。前記結果は、ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞が炎症サイトカインの生成を抑制し、炎症性大膓炎を改善させることを示す。
ＭＧＣＰがＴｒｅｇ細胞の分化を促進することを確認したところ、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化したＴｒｅｇ細胞が大膓炎の発病したマウス（ｉｎ ｖｉｖｏ）において緩和効果を示すかどうか確認した。類遺伝子型（ｃｏｎｇｅｎｉｃ）マーカー（ＣＤ４５．１＋）を有するＴｒｅｇ細胞は、ＤＣにＭＧＣＰを処理してｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され、未接触ＣＤ４ Ｔ細胞と同時に受容マウスに養子移入され（ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）、ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞の免疫抑制機能を確認した。その結果、ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞は大膓炎の進行を妨害することが確認された。具体的に、体重減少及び結腸長さの短縮は、ＭＧＣＰ－Ｔｒｅｇ細胞受容マウスで有意に減少した（図８Ａ及び図６Ｂ）。大膓炎の臨床的症状と関連して、ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞の転移は、結腸組織の上皮細胞構造の破壊を予防し、組織病理学スコアで表示された結腸粘膜固有層（ｃｏｌｏｎｉｃ ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ）にリンパ球の侵入を抑制した（図８Ｃ及び図６Ｄ）。大膓炎の発病機転においてＩＦＮ－γが重要な役割を担うことが知られているので、結腸粘膜固有層のＣＤ４ Ｔ細胞から病原性サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）であるＩＦＮ－γの生産を評価した。ドナー未接触ＣＤ４ Ｔ細胞のＩＦＮ－γの生産レベルは、単に未接触ＣＤ４ Ｔ細胞だけが授与された個体に比べてＭＧＣＰ－Ｔｒｅｇ細胞授与個体において劇的に減少した（図８Ｅ）。前記結果は、ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞が炎症サイトカインの生成を抑制し、炎症性大膓炎を改善させることを示す。
【0228】
実施例４：ＭＧＣＰの経口投与を用いた結腸Ｔｒｅｇ細胞の生成誘導
Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＭＧＣＰは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて機能的に活性を有するＴｒｅｇ細胞の誘導を促進した。ＭＧＣＰがｉｎ ｖｉｖｏにおいてもＴｒｅｇ細胞を生成できるかどうか確認するために、ＭＧＣＰをマウスに口腔内投与した後、結腸未接触ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋）を伝達（ｔｒａｎｓｆｅｒ）させた。興味深いことに、ＭＧＣＰの投与は、対照群よりも結腸においてドナーＣＤ４ Ｔ細胞から非常に高い頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）のＴｒｅｇ細胞を生成させた（図９Ａ）。前記Ｔｒｅｇ細胞は、Ｔｒｅｇ細胞の抑制性を示す重要な指標であるＣＴＬＡ－４を発現させる（図９Ｂ）。小腸からも、ドナー細胞のうちＴｒｅｇ細胞頻度の類似の増加が観察され、それらもＣＴＬＡ－４を発現させた（図１０Ａ及び図８Ｂ）。一方、受容体由来のＴｒｅｇ細胞の頻度及びホストＴｒｅｇ細胞のＣＴＬＡ－４発現量は、結腸及び小腸において対照群と類似に現れた（図９Ｃ、図７Ｄ、図８Ｃ及び図８Ｄ）。ＭＧＣＰを処理したマウスの結腸Ｔｒｅｇ細胞の絶対的な数字は結腸において増加を示したが、有意の値ではなかった（図９Ｅ及び図８Ｅ）。ＭＧＣＰ投与マウスの腸全体の受容体Ｔｒｅｇ細胞のうち、ヘリオス（Ｈｅｌｉｏｓ）を発現する細胞が増加したことが観察された（図９Ｆ及び図８Ｆ）。機能的に、ＭＧＣＰの投与は、単に結腸粘膜固有層のＴｒｅｇ細胞のＩＬ－１０生産を有意に増加させ、小腸では増加させなかった（図９Ｇ及び図８Ｇ）。結腸粘膜固有層においてエフェクターＴ細胞のＩＦＮ－γの生産はＭＧＣＰ処理後に減少したが、ＩＬ－１７Ａのレベルは変わらなかった（図９Ｈ）。これに対し、小腸ＣＤ４ Ｔ細胞のＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７Ａの発現は、ｍｏｃｋとＭＧＣＰ処理マウスの両方で類似に示された（図１０Ｈ）。ＭＧＣＰの投与は、腸においでドナーＣＤ４ Ｔ細胞からＴｒｅｇ細胞の分化を誘導するが、ＭＧＣＰの処理は、脾臓又はｍＬＮにおいてホスト又はドナー由来のＣＤ４ Ｔ細胞からＴｒｅｇ細胞の分化を誘導できなかった（図１０Ｉ及び図８Ｊ）。要するに、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＭＧＣＰは結腸エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞において炎症性サイトカインであるＩＦＮ－γを減少させるだけでなく、ＩＬ－１０生産が向上した機能性結腸Ｔｒｅｇ細胞の新しい生成を促進した。この結果は、ＭＧＣＰが恒常性条件下の結腸の免疫調節環境に影響を及ぼし得ることを示す。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＭＧＣＰは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて機能的に活性を有するＴｒｅｇ細胞の誘導を促進した。ＭＧＣＰがｉｎ ｖｉｖｏにおいてもＴｒｅｇ細胞を生成できるかどうか確認するために、ＭＧＣＰをマウスに口腔内投与した後、結腸未接触ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋）を伝達（ｔｒａｎｓｆｅｒ）させた。興味深いことに、ＭＧＣＰの投与は、対照群よりも結腸においてドナーＣＤ４ Ｔ細胞から非常に高い頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）のＴｒｅｇ細胞を生成させた（図９Ａ）。前記Ｔｒｅｇ細胞は、Ｔｒｅｇ細胞の抑制性を示す重要な指標であるＣＴＬＡ－４を発現させる（図９Ｂ）。小腸からも、ドナー細胞のうちＴｒｅｇ細胞頻度の類似の増加が観察され、それらもＣＴＬＡ－４を発現させた（図１０Ａ及び図８Ｂ）。一方、受容体由来のＴｒｅｇ細胞の頻度及びホストＴｒｅｇ細胞のＣＴＬＡ－４発現量は、結腸及び小腸において対照群と類似に現れた（図９Ｃ、図７Ｄ、図８Ｃ及び図８Ｄ）。ＭＧＣＰを処理したマウスの結腸Ｔｒｅｇ細胞の絶対的な数字は結腸において増加を示したが、有意の値ではなかった（図９Ｅ及び図８Ｅ）。ＭＧＣＰ投与マウスの腸全体の受容体Ｔｒｅｇ細胞のうち、ヘリオス（Ｈｅｌｉｏｓ）を発現する細胞が増加したことが観察された（図９Ｆ及び図８Ｆ）。機能的に、ＭＧＣＰの投与は、単に結腸粘膜固有層のＴｒｅｇ細胞のＩＬ－１０生産を有意に増加させ、小腸では増加させなかった（図９Ｇ及び図８Ｇ）。結腸粘膜固有層においてエフェクターＴ細胞のＩＦＮ－γの生産はＭＧＣＰ処理後に減少したが、ＩＬ－１７Ａのレベルは変わらなかった（図９Ｈ）。これに対し、小腸ＣＤ４ Ｔ細胞のＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７Ａの発現は、ｍｏｃｋとＭＧＣＰ処理マウスの両方で類似に示された（図１０Ｈ）。ＭＧＣＰの投与は、腸においでドナーＣＤ４ Ｔ細胞からＴｒｅｇ細胞の分化を誘導するが、ＭＧＣＰの処理は、脾臓又はｍＬＮにおいてホスト又はドナー由来のＣＤ４ Ｔ細胞からＴｒｅｇ細胞の分化を誘導できなかった（図１０Ｉ及び図８Ｊ）。要するに、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＭＧＣＰは結腸エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞において炎症性サイトカインであるＩＦＮ－γを減少させるだけでなく、ＩＬ－１０生産が向上した機能性結腸Ｔｒｅｇ細胞の新しい生成を促進した。この結果は、ＭＧＣＰが恒常性条件下の結腸の免疫調節環境に影響を及ぼし得ることを示す。
【0229】
実施例５：ＭＧＣＰで誘導された微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）－特異的Ｔｒｅｇ細胞の大膓炎改善
ＭＧＣＰが微生物抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞を誘導し、生体内炎症性免疫反応を抑制するか否かを確認するために、微生物フラジェリン－反応性ＣＤ４ Ｔ細胞（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｆｌａｇｅｌｌｉｎ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ）を保有したＣＢｉｒマウスを使用した。ＣＢｉｒマウスの未接触ＣＤ４ Ｔ細胞をＲａｇ１－／－マウスに移し、経口投与によってｍｏｃｋ（ＤＷ）又はＭＧＣＰを毎日投与した。免疫の弱化したマウスに微生物反応性未接触ＣＤ４ Ｔ細胞（ｍｉｃｒｏｂｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｎａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ）を養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）することは、共生微生物叢に対する過度な免疫反応による実験性大膓炎を誘発するという報告がある（図１１Ａ）。しかし、ＭＧＣＰの補充は、体重減少に顕著な抵抗性を示した（図１１Ａ）。体重変化に対する効果に加えて、結腸長さの短縮もＭＧＣＰの投与で予防された（図１１Ｂ及び図９Ｃ）。臨床的徴候とも一致するように、ＭＧＣＰ投与マウスは上皮細胞の増殖及びリンパ球の結腸内侵入を抑制した（図１１Ｄ）。また、組織病理学スコアはｍｏｃｋ処理されたマウスに比べて緩和されたことが見られた（図１１Ｅ）。これらの結果は、ＭＧＣＰが機能性Ｔｒｅｇ細胞の新しい生成を促進し、炎症前環境において病原性サイトカインの生産を抑制できることを示唆する（図８及び図９）。
ＭＧＣＰが微生物抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞を誘導し、生体内炎症性免疫反応を抑制するか否かを確認するために、微生物フラジェリン－反応性ＣＤ４ Ｔ細胞（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｆｌａｇｅｌｌｉｎ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ）を保有したＣＢｉｒマウスを使用した。ＣＢｉｒマウスの未接触ＣＤ４ Ｔ細胞をＲａｇ１－／－マウスに移し、経口投与によってｍｏｃｋ（ＤＷ）又はＭＧＣＰを毎日投与した。免疫の弱化したマウスに微生物反応性未接触ＣＤ４ Ｔ細胞（ｍｉｃｒｏｂｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｎａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ）を養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）することは、共生微生物叢に対する過度な免疫反応による実験性大膓炎を誘発するという報告がある（図１１Ａ）。しかし、ＭＧＣＰの補充は、体重減少に顕著な抵抗性を示した（図１１Ａ）。体重変化に対する効果に加えて、結腸長さの短縮もＭＧＣＰの投与で予防された（図１１Ｂ及び図９Ｃ）。臨床的徴候とも一致するように、ＭＧＣＰ投与マウスは上皮細胞の増殖及びリンパ球の結腸内侵入を抑制した（図１１Ｄ）。また、組織病理学スコアはｍｏｃｋ処理されたマウスに比べて緩和されたことが見られた（図１１Ｅ）。これらの結果は、ＭＧＣＰが機能性Ｔｒｅｇ細胞の新しい生成を促進し、炎症前環境において病原性サイトカインの生産を抑制できることを示唆する（図８及び図９）。
【0230】
したがって、ＭＧＣＰの処理がＴｒｅｇ細胞の生成を促進しながらも、受容マウスの共生抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞から有害サイトカインの生産を抑制できるか否かを確認した。ＭＧＣＰ投与されたマウスは、ｍｏｃｋ処理されたマウスに比較して、ドナー未接触ＣＤ４ Ｔ細胞から微生物反応性Ｔｒｅｇ細胞（ｍｉｃｒｏｂｅ－ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔｒｅｇ細胞ｃｅｌｌ）の分化を増加させ（図１１Ｆ）、Ｔｒｅｇ細胞の安定性と機能に重要な分子であるＣＤ１０３及びＣＴＬＡ－４の発現は、ＭＧＣＰ処理されたマウス及びｍｏｃｋ処理されたマウスのＴｒｅｇ細胞において類似に現れた（図１２Ａ）。大膓炎の臨床的徴候と一致し、ドナーＣＤ４ Ｔ細胞からＩＦＮ－γの生産は、ｍｏｃｋ処理されたマウスに比べてＭＧＣＰ投与されたマウスにおいて実質的に抑制されたが（図１１Ｇ）、ＩＬ－１７Ａ数値は、結腸粘膜固有層において類似に現れた（図１２Ｂ）。要するに、前記結果は、ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞の転移だけでなく、ＭＧＣＰの投与も、共生抗原に反応するＴｒｅｇ細胞の生成を促進し、炎症性大膓炎の発達及びＩＦＮ－γの生産を抑制するということを示す。
【0231】
実施例６：腸ＣＤ１０３＋ＣＤ１１ｂ ＋ＤＣによるＭＧＣＰ媒介Ｔｒｅｇ細胞の誘導においてＣｏｘ２の必要性
ＭＧＣＰが抗原提示細胞によってＴｒｅｇ細胞を誘導するメカニズムを確立するためにＭＧＣＰ刺激によるＴｒｅｇ細胞の分化を誘導するＤＣサブセット及び大食細胞の能力を評価した。ＤＣは、腸においてＣＤ１１ｂ及びＣＤ１０３の発現によって区別される。各章のＤＣサブセット及び大食細胞をＭＧＣＰで刺激した後、未接触ＣＤ４ Ｔ細胞と共に培養した。ＭＧＣＰを処理した腸ＣＤ１０３＋ＣＤ１１ｂ＋ ＤＣは、ｍｏｃｋを処理した場合に比べて約１０倍のＴｒｅｇ細胞の生成増加を誘導した（図１３Ａ）。ＣＤ１０３＋ＣＤ１１ｂ－ＤＣ及び大食細胞は、ＭＧＣＰ刺激後にＴｒｅｇ細胞のレベルは増加しなかったが、ＭＧＣＰ処理されなかった場合にも、Ｔｒｅｇ細胞を効率的に誘導した（図１３Ａ及び図１４）。ＭＧＣＰがＤＣを刺激してＤＣがＴｒｅｇ細胞を誘導し、微生物刺激剤（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｔｉｍｕｌａｎｔｓ）によるＤＣ活性化機能を抑制するメカニズムを確立するために、無菌マウス（Ｇｅｒｍ Ｆｒｅｅ ｍｉｃｅ，ＧＦ）にＤＷ（ｍｏｃｋ）又はＭＧＣＰを２週間毎日経口投与した。転写体形態分析（ａｎａｌｙｚｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）のために、ＣＤ１１ｃ＋ ＤＣをｍｏｃｋ又はＭＧＣＰ処理マウスの結腸から分離した。ＭＧＣＰの投与は、Ｉｌ１０、Ｃｄ２７４（ＰＤ－Ｌ１コーディング遺伝子）、インドールアミン２，３－デオキシゲナーゼ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ＩＤＯ）及びＴｇｆβ１などの免疫寛容性（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ）ＤＣ関連マーカーの発現を増進させた（図１３Ｂ及び図１１Ｃ）。興味深いことに、ＭＧＣＰ処理されたマウスのＤＣは、ｍｏｃｋ（ＤＷ）処理されたマウスのＤＣに比較してＰｔｇｓ２（シクロオキシゲナーゼ－２コーディング遺伝子、Ｃｏｘ２）の発現を約２０倍増加させた（図１３Ｂ及び図１１Ｃ）。Ｃｏｘ２は、腫瘍環境でＴｒｅｇ細胞を誘導するものと既に知られていたため、ＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞分化に対するＣｏｘ２の役割を評価した。脾臓ＤＣはＭＧＣＰで刺激され、Ｃｏｘ２選択的抑制剤であるＣｅｌｃｅｃｏｘｉｂの存在下に未接触ＣＤ４ Ｔ細胞と共に培養した。ＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞の誘導は、Ｃｏｘ２を抑制することによって相当減少した（図１３Ｄ及び図１１Ｅ）。前記結果は、ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞の増加がＣｏｘ２依存的にＣＤ１０３＋ＣＤ１１ｂ＋腸ＤＣサブセットによって特異的に媒介されるということを示唆する。また、ＭＧＣＰは、ＤＣ転写体地形（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｌａｎｄｓｃａｐｅ）を免疫寛容性ＤＣの表現型で現れるように変形させた。
ＭＧＣＰが抗原提示細胞によってＴｒｅｇ細胞を誘導するメカニズムを確立するためにＭＧＣＰ刺激によるＴｒｅｇ細胞の分化を誘導するＤＣサブセット及び大食細胞の能力を評価した。ＤＣは、腸においてＣＤ１１ｂ及びＣＤ１０３の発現によって区別される。各章のＤＣサブセット及び大食細胞をＭＧＣＰで刺激した後、未接触ＣＤ４ Ｔ細胞と共に培養した。ＭＧＣＰを処理した腸ＣＤ１０３＋ＣＤ１１ｂ＋ ＤＣは、ｍｏｃｋを処理した場合に比べて約１０倍のＴｒｅｇ細胞の生成増加を誘導した（図１３Ａ）。ＣＤ１０３＋ＣＤ１１ｂ－ＤＣ及び大食細胞は、ＭＧＣＰ刺激後にＴｒｅｇ細胞のレベルは増加しなかったが、ＭＧＣＰ処理されなかった場合にも、Ｔｒｅｇ細胞を効率的に誘導した（図１３Ａ及び図１４）。ＭＧＣＰがＤＣを刺激してＤＣがＴｒｅｇ細胞を誘導し、微生物刺激剤（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｔｉｍｕｌａｎｔｓ）によるＤＣ活性化機能を抑制するメカニズムを確立するために、無菌マウス（Ｇｅｒｍ Ｆｒｅｅ ｍｉｃｅ，ＧＦ）にＤＷ（ｍｏｃｋ）又はＭＧＣＰを２週間毎日経口投与した。転写体形態分析（ａｎａｌｙｚｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）のために、ＣＤ１１ｃ＋ ＤＣをｍｏｃｋ又はＭＧＣＰ処理マウスの結腸から分離した。ＭＧＣＰの投与は、Ｉｌ１０、Ｃｄ２７４（ＰＤ－Ｌ１コーディング遺伝子）、インドールアミン２，３－デオキシゲナーゼ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ＩＤＯ）及びＴｇｆβ１などの免疫寛容性（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ）ＤＣ関連マーカーの発現を増進させた（図１３Ｂ及び図１１Ｃ）。興味深いことに、ＭＧＣＰ処理されたマウスのＤＣは、ｍｏｃｋ（ＤＷ）処理されたマウスのＤＣに比較してＰｔｇｓ２（シクロオキシゲナーゼ－２コーディング遺伝子、Ｃｏｘ２）の発現を約２０倍増加させた（図１３Ｂ及び図１１Ｃ）。Ｃｏｘ２は、腫瘍環境でＴｒｅｇ細胞を誘導するものと既に知られていたため、ＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞分化に対するＣｏｘ２の役割を評価した。脾臓ＤＣはＭＧＣＰで刺激され、Ｃｏｘ２選択的抑制剤であるＣｅｌｃｅｃｏｘｉｂの存在下に未接触ＣＤ４ Ｔ細胞と共に培養した。ＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞の誘導は、Ｃｏｘ２を抑制することによって相当減少した（図１３Ｄ及び図１１Ｅ）。前記結果は、ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞の増加がＣｏｘ２依存的にＣＤ１０３＋ＣＤ１１ｂ＋腸ＤＣサブセットによって特異的に媒介されるということを示唆する。また、ＭＧＣＰは、ＤＣ転写体地形（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｌａｎｄｓｃａｐｅ）を免疫寛容性ＤＣの表現型で現れるように変形させた。
【0232】
実施例７：ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞の生成メカニズムにおいてパターン認識受容体の重要性
ＤＣは、パターン認識受容体（ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＰＲＲｓ）を発現させ、場内に存在する多糖類を含む微生物抗原を認識する。ＭＧＣＰ媒介免疫調節において多糖類認識受容体の役割を調べるために、特定の受容体が損傷したマウスのＤＣを用いてＴｒｅｇ細胞の分化を確認した。Ｄｅｃｔｉｎ１が欠乏した脾臓ＤＣは、ＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞の生成を有意に減少させたが、Ｄｅｃｔｉｎ２の欠乏は、Ｔｒｅｇ細胞の分化を比較的少なく減少させた（図１５Ａ）。また、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＴＬＲ６がそれぞれ欠乏したＤＣは、ＷＴ ＤＣと比較してＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞分化を減少させ、ＴＬＲ４は最も顕著な効果を示した（図１５Ａ）。ＤＣにおいてＴＬＲ欠乏によるＴｒｅｇ細胞生成減少と一致し、ＭｙＤ８８信号伝達が損傷したＤＣは、Ｔｒｅｇ細胞分化が顕著に減少することが見られた（図１５Ｂ）。その上、異なるＣ－ｔｙｐｅレクチン受容体の可能な役割を研究するために、ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｍｉｎｃｌｅ及びマンノース受容体のそれぞれの拮抗的遮断抗体を用いた。ＤＣにおいてＤＣ－ＳＩＧＮ信号の遮断は、ＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞分化の部分的減少を示したが、他の受容体の場合、いかなる有意の効果も示さなかった（図１５Ｃ）。要するに、前記結果は、Ｄｅｃｔｉｎ１及びＴＬＲ４がＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞の誘導に重要な役割を担うことを示唆し、その他にもＭＧＣＰは様々な先天的受容体によってＴｒｅｇ細胞を誘導する。
ＤＣは、パターン認識受容体（ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＰＲＲｓ）を発現させ、場内に存在する多糖類を含む微生物抗原を認識する。ＭＧＣＰ媒介免疫調節において多糖類認識受容体の役割を調べるために、特定の受容体が損傷したマウスのＤＣを用いてＴｒｅｇ細胞の分化を確認した。Ｄｅｃｔｉｎ１が欠乏した脾臓ＤＣは、ＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞の生成を有意に減少させたが、Ｄｅｃｔｉｎ２の欠乏は、Ｔｒｅｇ細胞の分化を比較的少なく減少させた（図１５Ａ）。また、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＴＬＲ６がそれぞれ欠乏したＤＣは、ＷＴ ＤＣと比較してＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞分化を減少させ、ＴＬＲ４は最も顕著な効果を示した（図１５Ａ）。ＤＣにおいてＴＬＲ欠乏によるＴｒｅｇ細胞生成減少と一致し、ＭｙＤ８８信号伝達が損傷したＤＣは、Ｔｒｅｇ細胞分化が顕著に減少することが見られた（図１５Ｂ）。その上、異なるＣ－ｔｙｐｅレクチン受容体の可能な役割を研究するために、ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｍｉｎｃｌｅ及びマンノース受容体のそれぞれの拮抗的遮断抗体を用いた。ＤＣにおいてＤＣ－ＳＩＧＮ信号の遮断は、ＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞分化の部分的減少を示したが、他の受容体の場合、いかなる有意の効果も示さなかった（図１５Ｃ）。要するに、前記結果は、Ｄｅｃｔｉｎ１及びＴＬＲ４がＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞の誘導に重要な役割を担うことを示唆し、その他にもＭＧＣＰは様々な先天的受容体によってＴｒｅｇ細胞を誘導する。
【0233】
実施例８：ＭＧＣＰによるＴｒｅｇ細胞誘導においてＤｅｃｔｉｎ１の重要性確認
ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞生成におけるＤｅｃｔｉｎ１の役割を確認するために、Ｄｅｃｔｉｎ１が完全であるか或いは欠乏しているマウスのｍＬＮ ＤＣをｍｏｃｋ又はＭＧＣＰで刺激した。Ｄｅｃｔｉｎ１豊富ＤＣは、ＭＧＣＰ刺激後にＣｏｘ２及び他の調節マーカーの発現増加を示したが、Ｄｅｃｔｉｎ１欠乏ＤＣでは、ＭＧＣＰがＣｏｘ２の発現を促進させることができなかった（図１６Ａ及び図１５Ａ）。ＭＧＣＰ処理後のＣｏｘ２発現に対するＤｅｃｔｉｎ１の役割とも一致するように、Ｉｄｏ及びＴｇｆβ１転写体はＤｅｃｔｉｎ１豊富ＤＣにおいてＭＧＣＰ刺激によって特異的に増加したが、損傷したＤＣではそうでないことが見られた（図１７Ａ）。驚くべきことに、Ｄｅｃｔｉｎ１の不在は、Ｉｌ１０及びＣｄ２７４のような他の調節ＤＣマーカーのＭＧＣＰ媒介された発現増加において変化を起こさなかった（図１７Ａ）。ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞生成に対するＤｅｃｔｉｎ１の必須な役割を裏付けるために、Ｄｅｃｔｉｎ１欠乏マウスにおいてＭＧＣＰの効果を試験した。ＯＴ－ＩＩマウスから未接触ＣＤ４ Ｔ細胞が授与されたマウスにＭＧＣＰを投与し、隔日でオボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）を補充した。ＭＧＣＰは、実験全体にわたって受容体ネズミに投与された。興味深いことに、ＭＧＣＰの投与は、Ｄｅｃｔｉｎ１豊富受容体の小腸においてオボアルブミン活性Ｔｒｅｇ細胞の分化を劇的に増加させたが、Ｄｅｃｔｉｎ１欠乏ネズミにおけるＭＧＣＰのＴｒｅｇ細胞分化誘導効果は減少した（図１６Ｂ及び図１４Ｃ）。一方、Ｄｅｃｔｉｎ１欠乏又は豊富受容体において受容体由来の細胞のうちＴｒｅｇ細胞の頻度は、ｍｏｃｋ及びＭＧＣＰ処理された場合が類似に現れた（図１７Ｂ）。ＭＧＣＰ処理したＤｅｃｔｉｎ１非損傷マウスのホスト細胞に由来したＴｒｅｇ細胞の頻度は、ｍｏｃｋ処理されたマウスのものと類似に現れたが、ＭＧＣＰ下でＤｅｃｔｉｎ１豊富マウスだけがＴｒｅｇ細胞の数が相当増加し、Ｄｅｃｔｉｎ１欠乏マウスではそうでなかった（図１７Ｃ）。興味深いことに、ＭＧＣＰ投与は、Ｄｅｃｔｉｎ１豊富マウスにおいて受容体由来細胞のうち誘導性Ｔｒｅｇ細胞（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｒｅｇ細胞ｃｅｌｌ）の頻度を増加させたが、Ｄｅｃｔｉｎ１ノックアウトマウスではそうでなかった（図１６Ｄ及び図１４Ｅ）。また、ＭＧＣＰがそれらのマウスの腸間膜リンパ節（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）においてＴｒｅｇ細胞の誘導に影響を与えるかどうか評価した。Ｄｅｃｔｉｎ１非損傷（ｉｎｔａｃｔ）マウスにおいてＴｒｅｇ細胞分化の頻度が増加したが、Ｄｅｃｔｉｎ１ノックアウトマウスではＭＧＣＰの影響が無視できた（図１７Ｄ）。要するに、ＭＧＣＰによるｉｎ ｖｉｖｏ Ｔｒｅｇ細胞誘導分子メカニズムがＤＣのＣｏｘ２上向き調節によって媒介されるＤｅｃｔｉｎ１に依存することを示唆する。
ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞生成におけるＤｅｃｔｉｎ１の役割を確認するために、Ｄｅｃｔｉｎ１が完全であるか或いは欠乏しているマウスのｍＬＮ ＤＣをｍｏｃｋ又はＭＧＣＰで刺激した。Ｄｅｃｔｉｎ１豊富ＤＣは、ＭＧＣＰ刺激後にＣｏｘ２及び他の調節マーカーの発現増加を示したが、Ｄｅｃｔｉｎ１欠乏ＤＣでは、ＭＧＣＰがＣｏｘ２の発現を促進させることができなかった（図１６Ａ及び図１５Ａ）。ＭＧＣＰ処理後のＣｏｘ２発現に対するＤｅｃｔｉｎ１の役割とも一致するように、Ｉｄｏ及びＴｇｆβ１転写体はＤｅｃｔｉｎ１豊富ＤＣにおいてＭＧＣＰ刺激によって特異的に増加したが、損傷したＤＣではそうでないことが見られた（図１７Ａ）。驚くべきことに、Ｄｅｃｔｉｎ１の不在は、Ｉｌ１０及びＣｄ２７４のような他の調節ＤＣマーカーのＭＧＣＰ媒介された発現増加において変化を起こさなかった（図１７Ａ）。ＭＧＣＰで誘導されたＴｒｅｇ細胞生成に対するＤｅｃｔｉｎ１の必須な役割を裏付けるために、Ｄｅｃｔｉｎ１欠乏マウスにおいてＭＧＣＰの効果を試験した。ＯＴ－ＩＩマウスから未接触ＣＤ４ Ｔ細胞が授与されたマウスにＭＧＣＰを投与し、隔日でオボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）を補充した。ＭＧＣＰは、実験全体にわたって受容体ネズミに投与された。興味深いことに、ＭＧＣＰの投与は、Ｄｅｃｔｉｎ１豊富受容体の小腸においてオボアルブミン活性Ｔｒｅｇ細胞の分化を劇的に増加させたが、Ｄｅｃｔｉｎ１欠乏ネズミにおけるＭＧＣＰのＴｒｅｇ細胞分化誘導効果は減少した（図１６Ｂ及び図１４Ｃ）。一方、Ｄｅｃｔｉｎ１欠乏又は豊富受容体において受容体由来の細胞のうちＴｒｅｇ細胞の頻度は、ｍｏｃｋ及びＭＧＣＰ処理された場合が類似に現れた（図１７Ｂ）。ＭＧＣＰ処理したＤｅｃｔｉｎ１非損傷マウスのホスト細胞に由来したＴｒｅｇ細胞の頻度は、ｍｏｃｋ処理されたマウスのものと類似に現れたが、ＭＧＣＰ下でＤｅｃｔｉｎ１豊富マウスだけがＴｒｅｇ細胞の数が相当増加し、Ｄｅｃｔｉｎ１欠乏マウスではそうでなかった（図１７Ｃ）。興味深いことに、ＭＧＣＰ投与は、Ｄｅｃｔｉｎ１豊富マウスにおいて受容体由来細胞のうち誘導性Ｔｒｅｇ細胞（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｒｅｇ細胞ｃｅｌｌ）の頻度を増加させたが、Ｄｅｃｔｉｎ１ノックアウトマウスではそうでなかった（図１６Ｄ及び図１４Ｅ）。また、ＭＧＣＰがそれらのマウスの腸間膜リンパ節（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）においてＴｒｅｇ細胞の誘導に影響を与えるかどうか評価した。Ｄｅｃｔｉｎ１非損傷（ｉｎｔａｃｔ）マウスにおいてＴｒｅｇ細胞分化の頻度が増加したが、Ｄｅｃｔｉｎ１ノックアウトマウスではＭＧＣＰの影響が無視できた（図１７Ｄ）。要するに、ＭＧＣＰによるｉｎ ｖｉｖｏ Ｔｒｅｇ細胞誘導分子メカニズムがＤＣのＣｏｘ２上向き調節によって媒介されるＤｅｃｔｉｎ１に依存することを示唆する。
【0234】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとってこのような具体的技術は単に好ましい実施態様であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【産業上の利用可能性】
【0235】
本発明に係る新規な多糖体は、低い容量でも、多糖体が持つβ－グルカン及びマンナン（ｍａｎｎａｎ）構造によって免疫寛容性抗原提示細胞（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）を生成し、これによって抗原特異的な調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の分化又は生成を誘導し、少ない副作用で目標とする免疫体系を調節することができる。したがって、ＭＧＣＰ及び前記多糖体によって誘導されたＴｒｅｇ細胞は、免疫疾患又は炎症性疾患の予防及び治療に有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】