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特表2022-505684筋肉及び肉を酸化から保護するために使用するタキソジオン
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-14
(54)【発明の名称】筋肉及び肉を酸化から保護するために使用するタキソジオン
(51)【国際特許分類】
A23L 33/105 20160101AFI20220106BHJP
A61K 31/122 20060101ALI20220106BHJP
A61K 36/53 20060101ALI20220106BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20220106BHJP
A61P 39/06 20060101ALI20220106BHJP
A23L 3/3499 20060101ALI20220106BHJP
A23B 4/00 20060101ALI20220106BHJP
A23B 4/20 20060101ALI20220106BHJP
A23B 5/14 20060101ALI20220106BHJP
A23K 50/75 20160101ALI20220106BHJP
A23K 10/30 20160101ALI20220106BHJP
【ＦＩ】
A23L33/105
A61K31/122
A61K36/53
A61P21/00
A61P39/06
A23L3/3499
A23B4/00 H
A23B4/20 Z
A23B5/14
A23K50/75
A23K10/30
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021522134
(86)(22)【出願日】2019-07-03
(85)【翻訳文提出日】2021-02-18
(86)【国際出願番号】 EP2019067814
(87)【国際公開番号】W WO2020007895
(87)【国際公開日】2020-01-09
(31)【優先権主張番号】18305871.8
(32)【優先日】2018-07-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506316557
【氏名又は名称】サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック
(71)【出願人】
【識別番号】517007286
【氏名又は名称】ユニヴェルスィテ ドゥ モンペリエ
(71)【出願人】
【識別番号】518095987
【氏名又は名称】アンスティチュート ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ レシェルシュ メディカル （アンセルム）
(71)【出願人】
【識別番号】518027472
【氏名又は名称】エコール プラティーク デ オート エチュード
【氏名又は名称原語表記】ＥＣＯＬＥ ＰＲＡＴＩＱＵＥ ｄｅｓ ＨＡＵＴＥＳ ＥＴＵＤＥＳ
(71)【出願人】
【識別番号】521000781
【氏名又は名称】ユニベルスィテ モンペリエ トルワジエム ポール・ヴァレリー
(71)【出願人】
【識別番号】521000792
【氏名又は名称】アンスティチュ ドゥ ルシェルシュ プール ル デベロップマン
(71)【出願人】
【識別番号】521000806
【氏名又は名称】フロール アン タイム
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】サン、ナタリー
(72)【発明者】
【氏名】ラピオール、シルビー
(72)【発明者】
【氏名】ビトー、マノン
(72)【発明者】
【氏名】ブーゲ、ギョーム
(72)【発明者】
【氏名】カルナック、ジル
(72)【発明者】
【氏名】モレル、シルビー
【テーマコード（参考）】
2B005
2B150
4B018
4B021
4C088
4C206
【Ｆターム（参考）】
2B005DA03
2B150AA05
2B150AB05
2B150DD32
2B150DD44
2B150DD57
4B018LB05
4B018LB06
4B018LB07
4B018LB08
4B018LB09
4B018LB10
4B018MD08
4B018MD66
4B018ME06
4B018ME14
4B018MF01
4B018MF06
4B018MF14
4B021LW03
4B021LW04
4B021LW05
4B021LW07
4B021LW08
4B021LW10
4B021MC03
4B021MK17
4C088AB38
4C088AC05
4C088BA08
4C088BA09
4C088BA10
4C088BA11
4C088BA32
4C088CA08
4C088CA11
4C088CA14
4C088NA14
4C088ZA94
4C206AA01
4C206AA02
4C206CB24
4C206KA05
4C206KA17
4C206KA18
4C206MA01
4C206NA14
4C206ZA94
(57)【要約】
本発明は、筋肉消耗性疾患及び／又は障害の治療におけるその使用のための、アビエタンジテルペンタキソジオン及びタキソジオンを含有するローズマリー茎抽出物に関し；それはまた、天然の肉保存剤としてのタキソジオンの使用にも関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
筋肉における酸化を防止及び／又は減少させる使用のためのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物。
【請求項2】
筋肉におけるタンパク質の酸化分解を防止及び／もしくは減少させるため、及び／又は筋肉における酸化促進分子の蓄積を防止及び／もしくは減少させるための、請求項１に記載の使用のためのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物。
【請求項3】
筋肉量の喪失及び／又は筋肉疲労及び／もしくは筋肉消耗疾患を予防及び／又は治療し、前記筋肉量の喪失、筋肉疲労、及び筋肉消耗性疾患が、酸化ストレスに関連している、請求項１又は請求項２に記載の使用のためのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物。
【請求項4】
ローズマリー茎抽出物が、少なくとも１％ｗ／ｗのタキソジオンを含む、請求項１～３のいずれかに記載の使用のためのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物。
【請求項5】
ローズマリー茎抽出物が、ローズマリー茎の乾燥粉末を調製すること；前記乾燥粉末を有機又は水冷溶媒中で少なくとも５日間、好ましくは７日間浸軟させること；任意に、超音波抽出を適用すること；液相を回収し、溶媒を留去すること；により得られ、前記溶媒が、アルコール、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、アセトン、酢酸エチル、水、又はそれらの混合物の中から選択される、請求項１～４のいずれかに記載の使用のためのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物。
【請求項6】
タンパク質及び／又は脂質を含有する食品用天然防腐薬剤としてのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物の使用。
【請求項7】
タンパク質を含有する食品が、肉を含有する食品、非熱処理の加工肉、熱処理された加工肉、加工魚及び水産物、加工卵及び卵製品、ならびに粉乳の中から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項8】
脂質を含有する食品が、調味料、卓上調味料、マスタード、スープ及びブロスソース、本質的に水を含まない脂肪及び油の中から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項9】
タンパク質及び／又は脂質を含有する食品が、新鮮な肉及びデリカテッセンからなる群において選択された肉を含有する食品である、請求項６に記載の使用。
【請求項10】
貯蔵寿命が改善された肉を含有する食品を調製する方法であって、前記プロセスが、前記肉を含有する食品にタキソジオン又はローズマリー茎抽出物を添加する工程を含む、方法。
【請求項11】
肉及び肉由来食品の品質を改善するための家畜用栄養剤としてのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物の使用。
【請求項12】
肉又は肉由来食品のタンパク質分解及び／又は脂質過酸化を低減し、及び／又は色、風味、及び／もしくは食感の安定性を改善するための、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
タキソジオン又はローズマリー茎の抽出物を家畜飼料に添加する工程を含む、家畜肉の品質を改善するための方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、筋肉消耗性疾患及び／又は障害の治療での使用のためのアビエタンジテルペンタキソジオンに関し；それはまた、天然の肉保存剤としてのタキソジオンの使用にも関する。
【0002】
実際、本発明者らは、骨格筋細胞における酸化ストレスの有害な影響を防止することができる、ローズマリー・オフィシナリス茎中の化合物を同定した。より具体的には、本発明者らは、タキソジオンが、（細胞生存率、ＲＯＳ産生、Ｈ２ＡＸリン酸化、及びＣＨＯＰ遺伝子発現を監視することにより、実験部分を参照）ローズマリー葉抽出物の２つの主要な参照抗酸化化合物であるカルノシン酸及びカルノソールよりも効率的に、過酸化水素誘発細胞毒性損傷からヒト骨格筋細胞を保護することを示した。さらに、本発明者らはまた、タキソジオンが冷蔵保存中にミンチ肉の脂質及びタンパク質の酸化を減少させることを示した。したがって、本発明者らの研究は、タキソジオンを、ヒト骨格筋及び加工肉の酸化を制限するために使用できる天然薬剤の安価な供給源として定義することを可能にした。
【0003】
酸化プロセスは、生体分子に損傷を与え、ヒトの筋肉消耗性疾患、及び食物システムの望ましくない変化に関連している（Ｃａｎｔｏｎ，Ｍｅｎａｚｚａ，＆Ｄｉ Ｌｉｓａ，２０１４；Ｃｈｏｉ，Ｏｗ，Ｙａｎｇ，＆Ｔａｎｅｊａ，２０１６；Ｐａｐｕｃ，Ｇｏｒａｎ，Ｐｒｅｄｅｓｃｕ，＆Ｎｉｃｏｒｅｓｃｕ，２０１７）。ヒト及び動物の疾患では、活性酸素種（ＲＯＳ）に由来する酸化促進分子の蓄積が、タンパク質合成と分解とのバランスに影響を及ぼし、筋肉疲労、細胞死、及び骨格筋修復機能障害を引き起こす可能性があり、時間の経過とともに広範囲の筋肉喪失をもたらす（Ｃａｎｔｏｎ，Ｍｅｎａｚｚａ，＆Ｄｉ Ｌｉｓａ，２０１４；Ｃｈｏｉ，Ｏｗ，Ｙａｎｇ，＆Ｔａｎｅｊａ，２０１６）。動物の肉の酸化中、脂質の過酸化及び変色（ミオグロビン酸化）などの多数の化合物の変化は、肉製品の側面及び品質に悪影響を及ぼし、それらの貯蔵寿命を制限する（Ｐａｐｕｃ，Ｇｏｒａｎ，Ｐｒｅｄｅｓｃｕ，＆Ｎｉｃｏｒｅｓｃｕ，２０１７）。抗酸化化合物は、これらの酸化プロセスを防止又は遅延させるために使用することができる。合成抗酸化剤は、肉及び肉製品に成功裏に添加されてきたが、それらの毒性効果及び最近の消費者の天然物への関心のために、それらの使用は推奨されていない。
【0004】
したがって、食肉業界は、新しい安価で効果的な天然抗酸化剤を同定するための研究を推進している（Ｓｈａｈ，Ｂｏｓｃｏ，＆Ｍｉｒ，２０１４）。この研究努力は、ヒトにも有用であり得る。実際、骨格筋機能を改善するための抗酸化治療の臨床的関連性及び抗酸化補助への一般の人々の大きな関心にもかかわらず、それらの有効性に関する証拠は、非常に限られており（Ｐａｓｓｅｒｉｅｕｘ，Ｈａｙｏｔ，Ｊａｕｓｓｅｎｔ，Ｃａｒｎａｃ，Ｇｏｕｚｉ，Ｐｉｌｌａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，２０１５）、筋肉量の喪失を遅らせる、防止する、又は逆転させる抗酸化能力は、不明である（Ｓｔｅｉｎｈｕｂｌ，２００８）。さらに、いくつかの抗酸化剤は、骨格筋前駆体の分化に有害な影響をもたらす（Ｄｉｎｇ，Ｃｈｏｉ，Ｋｉｍ，Ｈａｎ，Ｐｉａｏ，Ｊｅｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００８）。
【0005】
したがって、食品用途及びヒトの健康のための効果的で安全な天然抗酸化分子を同定することが依然として必要とされている。
【0006】
植物は、生物活性分子の重要な供給源である（Ｎｅｗｍａｎ＆Ｃｒａｇｇ，２０１２）。ローズマリー（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ．、Ｌａｍｉａｃｅａｅ）葉抽出物は、多くの主要な生物学的特性（抗糖尿病、抗炎症、抗酸化、及び抗癌）を有する、フラボノイドならびにフェノール性ジテルペン及びトリテルペンを含む多くの異なるフェノール化合物（Ｂｏｒｒａｓ－Ｌｉｎａｒｅｓ，Ｓｔｏｊａｎｏｖｉｃ，Ｑｕｉｒａｎｔｅｓ－Ｐｉｎｅ，Ａｒｒａｅｚ－Ｒｏｍａｎ，Ｓｖａｒｃ－Ｇａｊｉｃ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，ｅｔ ａｌ．，２０１４）を含有する（Ａｌｔｉｎｉｅｒ，Ｓｏｓａ，Ａｑｕｉｎｏ，Ｍｅｎｃｈｅｒｉｎｉ，Ｄｅｌｌａ Ｌｏｇｇｉａ，＆Ｔｕｂａｒｏ，２００７；Ｂａｋｉｒｅｌ，Ｂａｋｉｒｅｌ，Ｋｅｌｅｓ，Ｕｌｇｅｎ，＆Ｙａｒｄｉｂｉ，２００８；Ｌｏ，Ｌｉａｎｇ，Ｌｉｎ－Ｓｈｉａｕ，Ｈｏ，＆Ｌｉｎ，２００２；Ｐｅｒｅｚ－Ｆｏｎｓ，Ｇａｒｚｏｎ，＆Ｍｉｃｏｌ，２０１０）。ローズマリー葉抽出物の抗酸化活性は、主に２つのフェノール性ジテルペンであるカルノシン酸（ＣＡ）及びカルノソール（ＣＯ）に起因する可能性があり、ロスマリン酸などの他のフェノール化合物に起因する程度は少ない（Ｂｉｒｔｉｃ，Ｄｕｓｓｏｒｔ，Ｐｉｅｒｒｅ，Ｂｉｌｙ，＆Ｒｏｌｌｅｒ，２０１５；Ｓｒａｎｃｉｋｏｖａ，Ｈｏｒｖａｔｈｏｖａ，＆Ｋｏｚｉｃｓ，２０１３）。ローズマリー葉抽出物は、欧州議会及び理事会の規則１３３３／２００８に基づき、食品添加物Ｅ９３２として欧州連合での使用が承認されている。ローズマリー由来の成分は、多くの化粧品の配合にも使用されている。ローズマリーベースの食事及びその活性分子、本質的にカルノシン酸は、動物骨格筋の抗酸化状態を高めることができる（Ｏｒｔｕｎｏ，Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｊｏｒｄａｎ，＆Ｂａｎｏｎ，２０１６）。ローズマリー・オフィシナリス（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）葉抽出物は、化学抗酸化物質の代わりにかつ酸化から保護するために加工肉における防腐剤としても使用されている（ＡＫＡＲＰＡＴ，ＴＵＲＨＡＮ，＆ＵＳＴＵＮ，２００８；Ｎａｖｅｅｎａ，Ｖａｉｔｈｉｙａｎａｔｈａｎ，Ｍｕｔｈｕｋｕｍａｒ，Ｓｅｎ，Ｋｕｍａｒ，Ｋｉｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｘｉｏｎｇ，２０１７）。さらに、ローズマリーのエッセンシャルオイルは、冷蔵肉の貯蔵寿命を延ばすためにも使用されている（Ｓｉｒｏｃｃｈｉ，Ｄｅｖｌｉｅｇｈｅｒｅ，Ｐｅｅｌｍａｎ，Ｓａｇｒａｔｉｎｉ，Ｍａｇｇｉ，Ｖｉｔｔｏｒｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
【発明の概要】
【0007】
本発明者らが実施した研究の目的は、ローズマリー副産物、例えば、茎から抽出でき、かつ哺乳類の骨格筋細胞、特にヒトの健康及び食品用途の肉での酸化ストレスの悪影響を防止することができる新しい天然分子を同定することである。
【0008】
これに関連して、本発明者らは、タキソジオンを、生物学的複合媒体、特に哺乳類の筋肉での酸化を防止することができる非常に効率的な分子として同定した。
【0009】
第１の実施形態によれば、本発明は、筋肉での酸化、より具体的には、ヒト、家畜、及びペットなどの哺乳動物の骨格筋細胞で起こる酸化を防止及び／又は減少させるその使用のためのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物に関する。
【0010】
タキソジオン（ＣＡＳ １９０２６－３１－４）は、（４ｂＳ，８ａＳ）－４ｂ，５，６，７，８，８ａ－ヘキサヒドロ－４－ヒドロキシ－２－イソプロピル－４ｂ，８，８－トリメチルフェナントレン－３，９－ジオン又は１１－ヒドロキシアビエタ－７，９（１１），１３－トリエン－６，１２－ジオンとも呼ばれるアビエタンジテルペンであり、以下の化学構造を有する：
【化1】
【0011】
タキソジオン（ＴＸ）は、以前には、ローズマリー・オフィシナリス（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）根から０．１４ｍｇ／ｇの乾燥根の精製収率で単離され（Ａｂｏｕ－Ｄｏｎｉａ，Ａｓｓａａｄ，Ｇｈａｚｙ，Ｔｅｍｐｅｓｔａ，＆Ｓａｎｓｏｎ，１９８９）、茎で同定され（未指定の精製）（Ｅｌ－Ｌａｋａｎｙ，２００４）、葉の［９］－ショウガオールとの混合物で単離された（Ｂｏｒｒａｓ－Ｌｉｎａｒｅｓ，Ｐｅｒｅｚ－Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｌｏｚａｎｏ－Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｂａｒｒａｊｏｎ－Ｃａｔａｌａｎ，Ａｒｒａｅｚ－Ｒｏｍａｎ，Ｃｉｆｕｅｎｔｅｓ，ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＴＸは、異なる植物：ラクウショウ（Ｔａｘｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ）、タキソジウム・アセンデンス（Ｔａｘｏｄｉｕｍ ａｓｃｅｎｄｅｎｓ）、ホソイトスギ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、ヴォルカメリア・エリオフィラ（Ｖｏｌｋａｍｅｒｉａ ｅｒｉｏｐｈｙｌｌａ）（同義語：クレロデンドラム・エリオフィルム（Ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ ｅｒｉｏｐｈｙｌｌｕｍ））、コレウス・フォルスコリ（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ｂａｒｂａｔｕｓ）、タイワンウオクサギ（Ｐｒｅｍｎａ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ）、及びいくつかのアキギリ属（Ｓａｌｖｉａ ｓｐ．）でも説明された。以下に示すように、大量のＴＸを取得することに焦点を当てた研究はほとんどない：ラクウショウ（Ｔａｘｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ）の種子及び球果から（３～３．４ｍｇ／ｇの乾燥物）（Ｈｉｒａｓａｗａ，Ｉｚａｗａ，Ｍａｔｓｕｎｏ，Ｋａｗａｈａｒａ，Ｇｏｄａ，＆Ｍｏｒｉｔａ，２００７；Ｋｕｐｃｈａｎ，Ｋａｒｉｍ，＆Ｍａｒｃｋｓ，１９６８）、サルビア・フロモイデス（Ｓａｌｖｉａ ｐｈｌｏｍｏｉｄｅｓ）根から（３．７２ｍｇ／ｇの乾燥根）（Ｈｕｅｓｏ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｊｉｍｅｎｏ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｓａｖｏｎａ，＆Ｂｒｕｎｏ，１９８３）、形質転換されたサルビア・アウストリアカ（Ｓａｌｖｉａ ａｕｓｔｒｉａｃａ）毛状根から（０．４３ｍｇ／ｇの乾燥根及び超高速液体クロマトグラフィー－ダイオードアレイ検出器－タンデム質量分析による１．１５ｍｇ／ｇ）（Ｋｕｚｍａ，Ｗｙｓｏｋｉｎｓｋａ，Ｓｉｋｏｒａ，Ｏｌｓｚｅｗｓｋａ，Ｍｉｋｉｃｉｕｋ－Ｏｌａｓｉｋ，＆Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ，２０１６）（Ｋｕｚｍａ，Ｋａｉｓｅｒ，＆Ｗｙｓｏｋｉｎｓｋａ，２０１７）。
【0012】
タキソジオンは、様々な生物活性：抗真菌性、抗微生物性、抗リーシュマニア性、抗原虫性、抗真菌性、ヒトコリンエステラーゼ阻害剤、抗酸化剤、ならびに癌細胞株における抗増殖性及びアポトーシス促進性を有する（表１－１～表１－４を参照）：
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【0013】
Ｂｏｒｒａｓ Ｌｉｎａｒｅｓ（２０１５）が言及するローズマリーの葉におけるタキソジオンの存在については、本発明者らはローズマリー葉抽出物においてこの化合物を検出できなかったため、確認していない（例２を参照）。
【0014】
本発明において、タキソジオンは、ローズマリー茎抽出物に含有され得る。
【0015】
茎とは、葉及び花のないローズマリー植物の地上部分であると理解すべきである。
【0016】
本発明は、筋肉におけるタンパク質の酸化分解及び／もしくは脂質酸化を防止及び／もしくは減少させるため、及び／又は筋肉における酸化促進分子の蓄積を防止及び／もしくは減少させるために使用するためのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物に関する。
【0017】
したがって、本発明は、筋肉量の喪失及び／又は筋肉疲労及び／又は筋肉消耗疾患を予防及び／又は治療するその使用のためのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物に関し、上記筋肉量の喪失、筋肉疲労、及び筋肉消耗性疾患は、酸化ストレスに関連している。
【0018】
筋肉消耗とは、進行性の筋肉量の喪失、ならびに／又は運動を制御する骨格筋もしくは随意筋、心臓を制御する心筋（心筋症）及び平滑筋を含む進行性の筋肉の衰弱及び変性を指す。慢性的な筋肉消耗は、進行性の筋肉量の喪失、ならびに筋肉の衰弱及び変性を特徴とする慢性的な状態である（つまり、長期間持続する）。
【0019】
筋肉消耗中に発生する筋肉量の喪失は、異化作用による筋肉タンパク質の分解によって特徴付けることができる。タンパク質異化作用は、異常に高いタンパク質分解速度、異常に低いタンパク質合成速度、又はその両方の組み合わせが原因で発生する。筋肉タンパク質異化作用は、高度のタンパク質分解又は低度のタンパク質合成によって引き起こされるかどうかにかかわらず、筋肉量の減少及び筋肉消耗につながる。
【0020】
筋肉消耗は、通常、加齢及び慢性、神経学的、遺伝的又は感染性の病状、疾患、病気、又は状態に関連している。これらには、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、及び筋緊張性ジストロフィーなどの筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型ジストロフィー、ラミノパシー、コラーゲンＶＩ及びジスフェリン遺伝子の変異によって引き起こされるジストロフィー；ポリオ後筋萎縮（ＰＰＭＡ）などの筋萎縮；心臓悪液質、ＡＩＤＳ悪液質、及び癌悪液質などの悪液質；ならびに栄養失調、ハンセン病、糖尿病、腎疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、癌、末期腎不全、サルコペニア、肺気腫、骨軟化症、ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、及び心筋症が含まれる。
【0021】
筋肉消耗は、減じないままにしておくと、健康に深刻な影響を与える可能性がある。例えば、筋肉消耗中に発生する変化は、個人の健康に有害な身体状態の弱体化につながる可能性があり、その結果、骨折に対する感受性が高まり、身体能力状態が低下する。
【0022】
本発明はまた、それを必要とする対象における酸化ストレスに関連する筋肉消耗性疾患の治療、重症度の軽減、発生率の低下、発症の遅延、又は病因の軽減の方法であって、上記対象に治療上有効量のタキソジオン又はローズマリー茎抽出物を投与する工程を含む、方法に関する。
【0023】
本発明の特定の実施形態では、タキソジオン又はローズマリー茎抽出物は、医薬組成物に処方される。
【0024】
本明細書で使用される場合、医薬組成物は、治療有効量の活性成分、すなわち、タキソジオン又はローズマリー茎抽出物を、医薬的に許容される担体又は希釈剤と共に含む。本明細書で使用される「治療有効量」は、所与の状態及び投与計画に対して治療効果を提供する量を指す。
【0025】
本明細書で使用される場合、「投与する」という用語は、対象を本発明の化合物と接触させることを指す。
【0026】
本発明の化合物を含有する医薬組成物は、経口、非経口、血管内、傍癌、経粘膜、経皮、筋肉内、鼻腔内、静脈内、皮内、皮下、舌下、腹腔内、脳室内、頭蓋内、膣内、吸入による、直腸内、腫瘍内などの当業者に公知の任意の方法によって対象に投与することができる。
【0027】
一実施形態では、医薬組成物は、経口投与され、したがって経口投与に適した形態で、つまり固体又は液体調製物として処方される。好適な固形経口製剤には、錠剤、カプセル、ピル、顆粒、ペレット、粉末などが含まれる。好適な液体経口製剤には、溶液、懸濁液、分散液、乳濁液、油などが含まれる。
【0028】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体又は希釈剤」は、当業者に周知である。担体又は希釈剤は、固体製剤用の固体担体もしくは希釈剤、液体製剤用の液体担体もしくは希釈剤、又はそれらの混合物であり得る。
【0029】
タキソジオン又はローズマリー茎抽出物は、筋肉中のタンパク質の酸化分解及び／もしくは脂質酸化を防止及び／もしくは減少させることができ、及び／又は筋肉中の酸化促進分子の蓄積を防止及び／もしくは減少させることができるため、それらは、家畜用栄養剤としての貴重な用途を見出す。
【0030】
したがって、別の実施形態では、本発明は、肉の抗酸化状態、したがって肉及び肉由来の食品の品質を改善するための家畜用栄養剤としてのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物の使用に関する。
【0031】
実際、タキソジオン又はローズマリー茎の抽出物を給餌する家畜の補給は、肉の脂質過酸化及び／又はタンパク質分解を遅らせ、かつ肉の色、風味、及び食感の安定性を改善するのに効果的である。
【0032】
本発明はまた、タンパク質分解及び／もしくは脂質過酸化の減少、及び／又は肉もしくは肉由来食品の色、風味、及び／もしくは食感の安定性の改善、特に肉又は肉由来の食品の変色及び酸敗を回避することを含む、家畜肉の品質を改善するための方法であって、タキソジオン又はローズマリー茎の抽出物を家畜飼料に添加する工程を含む、方法に関する。
【0033】
特定の実施形態では、上記タキソジオンは、１～２０ｍｇ／ｋｇの飼料を含んだ量で投与される。
【0034】
食品防腐剤は、供給源に応じて、天然防腐剤及び合成防腐剤の２つのカテゴリーに分類することができる。天然防腐剤は、コストが高いため、長い間食品加工に広く使用されていない。安息香酸ナトリウムなどの人工合成防腐剤は、その低価格及び優れた防腐効果により、食品加工で手に入れられている。しかしながら、広く使用された研究では、一部の合成防腐剤には発癌性、催奇形性、及び食中毒への感受性などの問題があることが分かった。例えば、安息香酸塩は、食中毒を引き起こす場合があり、亜硝酸塩及び硝酸塩を生成する場合がある（発癌性ニトロソアミン）。
【0035】
したがって、低コストで簡単に製造される新しい天然防腐剤を見出す必要がある。
【0036】
本発明者らはまたその研究において、タキソジオンが、加工肉で発生する酸化、特に加工肉に含有されるタンパク質もしくは脂質の酸化を防止及び／又は低減するのに非常に効率的であることを示した。
【0037】
したがって、別の実施形態によれば、本発明は、肉を含有する食品などのタンパク質及び／又は脂質を含有する複合食品用天然防腐薬剤としてのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物の使用に関する。
【0038】
本発明の天然防腐剤は、肉を含有する食品を噴霧、含浸、もしくはコーティングして、層状フィルムを形成し得るか、又は上記食品に組み込まれ得、これにより、上記食品の貯蔵寿命を大幅に延ばすことができ、防腐剤は、抗酸化機能を示すことができる。
【0039】
本発明によれば、「タンパク質を含有する食品」は、非熱処理の加工肉及び熱処理された加工肉、軟体動物及び甲殻類を含む加工魚及び水産物、加工卵及び卵製品、粉乳…であり得；より具体的には、「肉を含有する食品」は、販売前に包装することを意図されているであろう、あらゆる起源の新鮮な肉、牛肉、子牛肉、子羊及び羊、豚肉、鶏肉、例えば、スライス肉、ミンチ肉、又は挽肉、パテ、ハム、及びスモックハム、ソーセージなどのデリカテッセンを包含し；「脂質を含有する食品」は、調味料、卓上調味料、マスタード、スープ、及びブロスソース、本質的に水を含まない油脂…を包含する。
【0040】
本発明はまた、改善された貯蔵寿命を有する、肉を含有する食品などのタンパク質及び／又は脂質を含有する食品の調製プロセスであって、上記プロセスが、タキソジオン又はローズマリー茎抽出物を、肉を含有する食品などのタンパク質及び／又は脂質を含有する上記食品に添加する工程を含む、プロセスに関する。
【0041】
当業者は、タンパク質及び／又は脂質を含有する食品に添加されるタキソジオン又はローズマリー茎抽出物の量を選択し得；例えば、上記量は、タンパク質を含有する複合食品１ｋｇあたり１～５０ｍｇ、好ましくは１～１０ｍｇのタキソジオンを表し得る。
【0042】
本発明のすべての実施形態では、タキソジオンは、ローズマリー茎抽出物に含有され得る。上記ローズマリー茎抽出物は、少なくとも１％ｗ／ｗのタキソジオンを含み、上記抽出物は、好ましくは少なくとも３％ｗ／ｗ、より好ましくは５％ｗ／ｗのタキソジオンを含む。
【0043】
上記抽出物は、好ましくは、ローズマリー茎の乾燥粉末を調製することによって得られ；上記乾燥粉末を、アルコール又は水アルコールなどの有機溶媒中で少なくとも５日間、好ましくは７日間浸軟させ、上記溶媒は、好ましくは、アルコール、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、アセトン、酢酸エチル、水、又はこれらの溶媒の混合物であり；溶媒を留去することにより液相を回収する。溶媒は、好ましくは、エタノールなどのＣ１－Ｃ４アルコール、又は水とエタノールもしくはヘキサンなどのＣ１－Ｃ４アルコールとの混合物である。代替の実施形態によれば、上記抽出物は、ローズマリー茎の乾燥粉末を調製することによっても得られ得；上記乾燥粉末を、アルコール又は水アルコールなどの有機溶媒中で少なくとも５日間、好ましくは７日間浸軟させ、上記溶媒は、好ましくは、アルコール、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、アセトン、酢酸エチル、水、又はこれらの溶媒の混合物であり；超音波抽出を適用し、溶媒を留去することによって液相を回収する。
【0044】
少なくとも部分的に茎に由来する、蒸気蒸留（つまり、水蒸気蒸留）を使用した精油の抽出後に得られたローズマリーの乾燥残留物（固形廃棄物）も、本発明の茎抽出物を調製するためにローズマリー茎の乾燥粉末の代わりに使用され得る。
【0045】
抽出物中のタキソジオンの濃度は、以下の実験部分で説明されているように決定することができる。
【0046】
タキソジオン又はローズマリー茎抽出物の有利な特性をさらに高めるために、それらは、ビタミン、ミネラル、抗酸化剤などの関心のある栄養剤と関連付けし得る。
【0047】
本発明は、以下の例によってさらに説明することができる。
【図面の簡単な説明】
【0048】
【図1】ローズマリー茎抽出物が、誘発された酸化ストレスからヒト筋芽細胞を保護する図である。 （Ａ、Ｂ）１２０μＭのＨ２Ｏ２（致死濃度）とのインキュベーション前の、（Ａ）ローズマリー・オフィシナリス（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）全抽出物（ＲＷ）もしくはテンポル（合成抗酸化剤；対照として５０μＭ）又は（Ｂ）異なる濃度のローズマリー・オフィシナリス（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）葉（ＲＬ）もしくは茎（ＲＳ）抽出物とインキュベートしたヒト筋芽細胞における細胞死の定量化（すべての細胞のパーセンテージ）。ＣＴＲＬ：Ｈ２Ｏ２とインキュベートされていない細胞。細胞死は、細胞計数及び生存率キットならびにＭｕｓｅ細胞分析装置を使用して定量化した；Ｈ２Ｏ２（Ａ、Ｂ）と比較してｐ＜０．００１（＊＊＊）及びｐ＜０．０００１（＊＊＊＊）（一元配置分散分析）。
【図2】ローズマリー茎抽出物からのタキソジオン精製の異なる工程である。
【図3】タキソジオンが、ヒト筋肉細胞に対して強力な抗酸化作用を有する図である。 （Ａ、Ｂ）１２０μＭのＨ２Ｏ２（致死濃度）への曝露前の、（Ａ、Ｂ）示した濃度のタキソジオン（ＴＸ）又は（Ｂ）ローズマリー、カルノシン酸（ＣＡ）、及びカルノソル（ＣＯ）の主要な生物活性化合物とのインキュベーション時のヒト筋芽細胞における細胞死の定量化（すべての細胞のパーセンテージ）。ＣＴＲＬ：Ｈ２Ｏ２とインキュベートされていない細胞。細胞死は、細胞計数及び生存率キットならびにＭｕｓｅ細胞分析装置を使用して定量化した。Ｈ２Ｏ２（Ａ、Ｂ）と比較してｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、及びｐ＜０．００１（＊＊＊）（一元配置分散分析）。
【図4】タキソジオンが、ヒト筋肉細胞の酸化損傷を減少させる図である。 筋芽細胞は、Ｈ２Ｏ２に曝露する前に、タキソジオン（ＴＸ）（０．５μｇ／ｍＬ）と共に２４時間インキュベートした。（Ａ）活性酸素種（ＲＯＳ）の生成は、「Ｍｕｓｅ酸化ストレスキット」及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して定量化した。（Ｂ）リン酸化γＨ２ＡＸタンパク質レベルのウエスタンブロット分析；ヒストンＨ１．４をローディングコントロールとして使用した（右パネル）。Ｏｄｙｓｓｅｙソフトウェアを使用したウエスタンブロットデータの定量化（左パネル）。（Ｃ）ＣＨＯＰ遺伝子の相対的発現レベル（未処理の対照と比較）を示すＲＴ－ｑＰＣＲ分析；ＲＰＬＰＯを参照遺伝子として使用した。（Ｄ、Ｅ）コンフルエントなヒト初代筋芽細胞を４日間分化培地に切り替えた。２日目に、細胞をＴＸ（０．５μｇ／ｍＬ）と共に２４時間インキュベートし、次いでＨ２Ｏ２に２４時間曝露した。（Ｄ）Ｈ２Ｏ２毒性を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を定量化することによって決定した；（Ｅ）ＣｅｌｌＲｏｘ（ＲＯＳ活性プローブ）を筋管にロードし、ＴＥＣＡＮ分光光度計を使用して蛍光を定量化した；Ｈ２Ｏ２と比較して、ｐ＜０．０１（＊＊）及びｐ＜０．００１（＊＊＊）（一元配置分散分析）。
【図5】タキソジオンが、冷蔵保存中にマウスのミンチ肉を脂質及びタンパク質の酸化から保護する図である。 生後６か月のＣ５７ＢＬ／６雄マウスのミンチにした腓腹筋をエタノール（ＣＴＲＬ）又はエタノールに溶解したＢＨＴ（０．０１０％、０．００５％、０．００２５％ｗ／ｗのミンチにした筋肉）、カルノシン酸（ＣＡ）（０．０１５％、０．００７５％、０．００３７５％ｗ／ｗのミンチにした筋肉）、又はタキソジオン（ＴＸ）（０．０１５％、０．００７５％、０．００３７５％ｗ／ｗのミンチにした筋肉）と混合した。冷蔵保存（＋４℃）の０日目及び７日目に、（Ａ）脂質酸化をＴＢＡＲＳ定量化によって評価し、（Ｂ）タンパク質酸化を総チオール定量化によって評価した；ＣＴＲＬと比較して、ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．００１（＊＊＊）（一元配置分散分析）。
【図6】冷蔵保存中のマウスのミンチ肉の脂質酸化に関するエタノール性ローズマリー茎抽出物（ＲＳ（ＥｔＯＨ））とヒドロエタノール性ローズマリー茎抽出物（ＲＳ）との比較である。
【図7】冷蔵保存中のマウスのミンチ肉の脂質酸化に関するローズマリー茎抽出物（ＲＳ）とローズマリー葉抽出物（ＲＬ）との比較である。
【図8】冷蔵保存中のマウスのミンチ肉の脂質酸化に関するローズマリー茎抽出物（ＲＳ）とビタミンＣとの比較である。
【図9】マウスの肉脂質の過酸化に関するいくつかのタキソジオン濃縮抽出物とＥ３９２との比較である。
【図10】牛肉脂質の過酸化に関するいくつかのタキソジオン濃縮抽出物とＥ３９２との比較である。
【0049】
例
例１
材料及び方法
１．一般的な実験手順
フラッシュカラムクロマトグラフィーは、ＵＶ／可視分光光度計、クォータナリポンプ、及びフラクションコレクターを備えたスポット液体クロマトグラフィーフラッシュ装置（Ａｒｍｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓａｉｎｔ－Ａｖｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して実行した。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、及び２Ｄ ＮＭＲスペクトルは、ＢＲＵＫＥＲ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ－６００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計で適切な重水素化溶媒中で記録した。
例１
材料及び方法
１．一般的な実験手順
フラッシュカラムクロマトグラフィーは、ＵＶ／可視分光光度計、クォータナリポンプ、及びフラクションコレクターを備えたスポット液体クロマトグラフィーフラッシュ装置（Ａｒｍｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓａｉｎｔ－Ａｖｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して実行した。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、及び２Ｄ ＮＭＲスペクトルは、ＢＲＵＫＥＲ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ－６００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計で適切な重水素化溶媒中で記録した。
【0050】
２．試薬及び標準
ＤＰＰＨラジカル（９７％）、シクロヘキサン（９９．８％）、クロロホルム（９９％）、ジクロロメタン（９９．９％）、重水素化クロロホルム（９９．８％）、ＤＭＳＯ（９９．９％）、及びテンポルは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。アセトニトリル（９９．９％）は、Ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖ（Ｓｅｅｌｚｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ギ酸（９８％）、酢酸エチル（９９％）、及びアセトン（９９．５％）は、Ｐａｎｒｅａｃ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）から購入した。Ｔｒｏｌｏｘ（９８％）は、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入し、エタノール（９９．９％）は、ＶＷＲ ＢＤＨ Ｐｒｏｌａｂｏ（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）から購入した。Ｌ－アスコルビン酸（ビタミンＣ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）
ＤＰＰＨラジカル（９７％）、シクロヘキサン（９９．８％）、クロロホルム（９９％）、ジクロロメタン（９９．９％）、重水素化クロロホルム（９９．８％）、ＤＭＳＯ（９９．９％）、及びテンポルは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。アセトニトリル（９９．９％）は、Ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖ（Ｓｅｅｌｚｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ギ酸（９８％）、酢酸エチル（９９％）、及びアセトン（９９．５％）は、Ｐａｎｒｅａｃ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）から購入した。Ｔｒｏｌｏｘ（９８％）は、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入し、エタノール（９９．９％）は、ＶＷＲ ＢＤＨ Ｐｒｏｌａｂｏ（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）から購入した。Ｌ－アスコルビン酸（ビタミンＣ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）
【0051】
３．植物材料
ローズマリー・オフィシナリス（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）は、２０１５年２月にＭｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ（Ｆｒａｎｃｅ）の北部で収集した。乾燥茎及び葉を粉砕し、直接抽出した。
ローズマリー・オフィシナリス（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）は、２０１５年２月にＭｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ（Ｆｒａｎｃｅ）の北部で収集した。乾燥茎及び葉を粉砕し、直接抽出した。
【0052】
４．抽出
１５０ｇの粉砕したローズマリー茎を、室温の暗所で９００ｇの無水エタノール及び４５０ｇの蒸留水と２４時間ごとに撹拌しながら浸軟させた。７日後、茎抽出物を濾過した。減圧下で蒸発乾固させて、ＲＳ（ローズマリー茎）と名付けられた１２．２ｇのヒドロエタノール抽出物を得た。同じ手順を１５０ｇの粉砕した葉に使用し、ＲＬ（ローズマリー葉）と名付けられた６９ｇのヒドロエタノール抽出物を得ることができた。同じ手順を、ＲＷ（ローズマリーホール）と名付けられた１５０ｇの粉砕した葉及び茎に使用した。１００％のエタノール抽出物も、１５０ｇの粉砕した茎に対して同じ手順で調製して；ＲＳ（ＥｔＯＨ）と名付けられた５．３ｇの抽出物が得られた。乾燥抽出物を、分析及び精製まで－２０℃に保った。
１５０ｇの粉砕したローズマリー茎を、室温の暗所で９００ｇの無水エタノール及び４５０ｇの蒸留水と２４時間ごとに撹拌しながら浸軟させた。７日後、茎抽出物を濾過した。減圧下で蒸発乾固させて、ＲＳ（ローズマリー茎）と名付けられた１２．２ｇのヒドロエタノール抽出物を得た。同じ手順を１５０ｇの粉砕した葉に使用し、ＲＬ（ローズマリー葉）と名付けられた６９ｇのヒドロエタノール抽出物を得ることができた。同じ手順を、ＲＷ（ローズマリーホール）と名付けられた１５０ｇの粉砕した葉及び茎に使用した。１００％のエタノール抽出物も、１５０ｇの粉砕した茎に対して同じ手順で調製して；ＲＳ（ＥｔＯＨ）と名付けられた５．３ｇの抽出物が得られた。乾燥抽出物を、分析及び精製まで－２０℃に保った。
【0053】
５．ローズマリー茎抽出物からのタキソジオンのバイオアッセイガイドによる単離
各精製工程で、以下に説明するアッセイを使用して画分を試験した。ＲＳ抽出物（１２．２ｇ）をＣＨ２Ｃｌ２可溶性画分と水性画分とに分配した。減圧下で蒸発乾固した後、これらの２つの画分は、４．４１ｇのＣＨ２Ｃｌ２可溶性抽出物及び７．７９ｇの水溶性抽出物をもたらした。ＣＨ２Ｃｌ２可溶性抽出物は、順相フラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｉｍｉｅ ＳＶＦ Ｄ２６－ＳＩ６０、１５～４０μｍ～３０ｇ、流速６．５ｍＬ／分、２５ｍＬ／画分）で分離した。溶出は、シクロヘキサン：酢酸エチル（１００：０～０：１００）、次いでクロロホルム：メタノール（１％、次いで５％の段階的に１００：０～８０：２０）の混合物で完了した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析後、１００％のシクロヘキサンで溶出した第１の画分（画分１～６９）を合わせ、減圧下で濃縮して、画分Ｆ１（３７０ｍｇ）を得た。Ｆ１をＬＨ－２０セファデックスゲルで精製した（２．４×３８ｃｍ、４０ｇのＬＨ－２０、溶出：１００％のジクロロメタンから１００％のメタノール、５０％の段階的、次いで１００％のアセトン、３ｍＬ／画分）。１００％のＣＨ２Ｃｌ２で溶出された画分１７～３３を合わせ、減圧下で濃縮して、画分Ｆ１－２（１６０ｍｇ）を得た。Ｆ１－２は、最終的に逆相フラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｃｈｒｏｍａｂｏｎｄ（登録商標）Ｆｌａｓｈ、ＲＳ４Ｃ１８、４．３ｇ、流速：５ｍＬ／分、２５ｍＬ／画分）で精製した。アセトニトリル／水（５０：５０～１００：０）の混合物で溶出を完了し、１１１の画分を得た。アセトニトリル／水（６０：４０）で溶出した画分１７～２９を合わせ（Ｆ１－２－３）、５０ｍｇの純粋なタキソジオンを得た。
各精製工程で、以下に説明するアッセイを使用して画分を試験した。ＲＳ抽出物（１２．２ｇ）をＣＨ２Ｃｌ２可溶性画分と水性画分とに分配した。減圧下で蒸発乾固した後、これらの２つの画分は、４．４１ｇのＣＨ２Ｃｌ２可溶性抽出物及び７．７９ｇの水溶性抽出物をもたらした。ＣＨ２Ｃｌ２可溶性抽出物は、順相フラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｉｍｉｅ ＳＶＦ Ｄ２６－ＳＩ６０、１５～４０μｍ～３０ｇ、流速６．５ｍＬ／分、２５ｍＬ／画分）で分離した。溶出は、シクロヘキサン：酢酸エチル（１００：０～０：１００）、次いでクロロホルム：メタノール（１％、次いで５％の段階的に１００：０～８０：２０）の混合物で完了した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析後、１００％のシクロヘキサンで溶出した第１の画分（画分１～６９）を合わせ、減圧下で濃縮して、画分Ｆ１（３７０ｍｇ）を得た。Ｆ１をＬＨ－２０セファデックスゲルで精製した（２．４×３８ｃｍ、４０ｇのＬＨ－２０、溶出：１００％のジクロロメタンから１００％のメタノール、５０％の段階的、次いで１００％のアセトン、３ｍＬ／画分）。１００％のＣＨ２Ｃｌ２で溶出された画分１７～３３を合わせ、減圧下で濃縮して、画分Ｆ１－２（１６０ｍｇ）を得た。Ｆ１－２は、最終的に逆相フラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｃｈｒｏｍａｂｏｎｄ（登録商標）Ｆｌａｓｈ、ＲＳ４Ｃ１８、４．３ｇ、流速：５ｍＬ／分、２５ｍＬ／画分）で精製した。アセトニトリル／水（５０：５０～１００：０）の混合物で溶出を完了し、１１１の画分を得た。アセトニトリル／水（６０：４０）で溶出した画分１７～２９を合わせ（Ｆ１－２－３）、５０ｍｇの純粋なタキソジオンを得た。
【0054】
６．高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析
定量分析のためのクロマトグラフィーによる分離及び検出は、Ｐ４０００ポンプ、ＳＣＭ１０００デガッサ、ＡＳ３０００自動サンプラー、及びＵＶ６０００ＬＰ ＤＡＤ検出器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）を含んだＳｐｅｃｔｒｏＳＹＳＴＥＭ（登録商標）機器で実行した。システムは、ＣｈｒｏｍＱｕｅｓｔソフトウェアバージョン５．０を使用して操作した。クロマトグラフ分離は、ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｙｌ Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）で、カラム温度を３０℃に維持して実現した。溶媒Ａ（水／ギ酸９９．９：０．１ｖ／ｖ）及び溶媒Ｂ（アセトニトリル）を使用して、画分を１ｍＬ／分（初期背圧約１０５ｂａｒ）の流速で溶出した。標準及びローズマリー抽出物の分析に使用された勾配は、０～１０分、８５％Ａ；１０～２０分、８５～６５％Ａ；２０～２５分、６５～３０％Ａ；２５～３０分、３０％Ａ；３０～５０分、３０～２０％Ａ；５０～６０分、２０～１０％Ａ；６０～７０分、１０～８５％；７０～８０分８５％Ａであった。ＵＶ／ｖｉｓスペクトルを２００～４００ｎｍの範囲で記録し、２３０、２８０、及び３３０ｎｍでクロマトグラムを取得した。粗抽出物及び画分中のロスマリン酸、カルノソール、カルノシン酸、及びロスマノールの同定は、市販の標準の保持時間及びＵＶスペクトルとの比較に基づいた。
定量分析のためのクロマトグラフィーによる分離及び検出は、Ｐ４０００ポンプ、ＳＣＭ１０００デガッサ、ＡＳ３０００自動サンプラー、及びＵＶ６０００ＬＰ ＤＡＤ検出器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）を含んだＳｐｅｃｔｒｏＳＹＳＴＥＭ（登録商標）機器で実行した。システムは、ＣｈｒｏｍＱｕｅｓｔソフトウェアバージョン５．０を使用して操作した。クロマトグラフ分離は、ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｙｌ Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）で、カラム温度を３０℃に維持して実現した。溶媒Ａ（水／ギ酸９９．９：０．１ｖ／ｖ）及び溶媒Ｂ（アセトニトリル）を使用して、画分を１ｍＬ／分（初期背圧約１０５ｂａｒ）の流速で溶出した。標準及びローズマリー抽出物の分析に使用された勾配は、０～１０分、８５％Ａ；１０～２０分、８５～６５％Ａ；２０～２５分、６５～３０％Ａ；２５～３０分、３０％Ａ；３０～５０分、３０～２０％Ａ；５０～６０分、２０～１０％Ａ；６０～７０分、１０～８５％；７０～８０分８５％Ａであった。ＵＶ／ｖｉｓスペクトルを２００～４００ｎｍの範囲で記録し、２３０、２８０、及び３３０ｎｍでクロマトグラムを取得した。粗抽出物及び画分中のロスマリン酸、カルノソール、カルノシン酸、及びロスマノールの同定は、市販の標準の保持時間及びＵＶスペクトルとの比較に基づいた。
【0055】
７．ＨＰＬＣによるタキソジオンの定量化
直線性／作業範囲：０．０２９～１ｍｇ／ｍＬ（ｎ＝３）の濃度範囲に対応するＴＸの量を増やして検量線を作成した。タキソジオンのピーク面積を統合し、検量線を構成した。回帰分析では、回帰係数ｒが＞０．９９の場合、カーブフィッティングは、許容できると見なした。
直線性／作業範囲：０．０２９～１ｍｇ／ｍＬ（ｎ＝３）の濃度範囲に対応するＴＸの量を増やして検量線を作成した。タキソジオンのピーク面積を統合し、検量線を構成した。回帰分析では、回帰係数ｒが＞０．９９の場合、カーブフィッティングは、許容できると見なした。
【0056】
検出限界／定量限界（ＬＯＤ／ＬＯＱ）：ＬＯＤは、ノイズレベルの３倍の応答が得られるサンプル濃度として定義した。ＬＯＱは、ノイズレベルの１０倍の応答が得られるサンプル濃度として定義した。
【0057】
タキソジオンの回収率は、３つの異なる濃度（０．０５、０．４、０．８ｍｇ／ｍＬ）でのサンプル分析によって評価した。精度は、パーセント誤差［（測定された平均）／予想した平均］ｘ１００として表され、精度は、決定された変動係数（ＣＶ、％）であった。
【0058】
標準的な既知量のタキソジオンを添加した後の抽出物サンプルの回収率：ＲＳ抽出物をＨＰＬＣで分析して、ＴＸ濃度を定量化し、既知濃度の純粋なＴＸでスパイクした同じ抽出物と比較した。回収率は、［（スパイクされた抽出物の平均値－スパイクされていない抽出物の平均値）／（予想濃度）ｘ１００］として決定した。
【0059】
８．ヒト筋芽細胞の初代培養
大腿四頭筋生検は、１人の健康な成人からのものであった（ＡＦＭ－ＢＴＲ「Ｂａｎｑｕｅ ｄｅ ｔｉｓｓｕｓ ｐｏｕｒ ｌａ ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ」）。以前に説明したように、筋芽細胞を筋生検から精製し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１％のＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ、及び１ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞成長因子（増殖培地）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地でコラーゲンコーティングディッシュ上で培養した（Ｋｉｔｚｍａｎｎ，Ｂｏｎｎｉｅｕ，Ｄｕｒｅｔ，Ｖｅｒｎｕｓ，Ｂａｒｒｏ，Ｌａｏｕｄｊ－Ｃｈｅｎｉｖｅｓｓｅ，ｅｔ ａｌ．，２００６）。細胞分化のために、コンフルエントな細胞を４％のＦＢＳを含むＤＭＥＭで３～５日間培養した（分化培地）。
大腿四頭筋生検は、１人の健康な成人からのものであった（ＡＦＭ－ＢＴＲ「Ｂａｎｑｕｅ ｄｅ ｔｉｓｓｕｓ ｐｏｕｒ ｌａ ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ」）。以前に説明したように、筋芽細胞を筋生検から精製し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１％のＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ、及び１ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞成長因子（増殖培地）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地でコラーゲンコーティングディッシュ上で培養した（Ｋｉｔｚｍａｎｎ，Ｂｏｎｎｉｅｕ，Ｄｕｒｅｔ，Ｖｅｒｎｕｓ，Ｂａｒｒｏ，Ｌａｏｕｄｊ－Ｃｈｅｎｉｖｅｓｓｅ，ｅｔ ａｌ．，２００６）。細胞分化のために、コンフルエントな細胞を４％のＦＢＳを含むＤＭＥＭで３～５日間培養した（分化培地）。
【0060】
９．細胞死及びＲＯＳの定量化
筋芽細胞：筋芽細胞を３５ｍｍのコラーゲンコーティングディッシュに播種し、増殖培地で培養し、試験化合物と２４時間プレインキュベートし、又はプレインキュベートせず、次いで致死濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、強力な酸化促進／アポトーシス促進化合物と２４時間インキュベートし、又はインキュベートしなかった。最適なＨ２Ｏ２濃度は、すべての細胞の３０％～５０％を死滅させるのに必要な濃度であり、各実験の前に確立された。一般に、筋芽細胞は、１２０μＭのＨ２Ｏ２とインキュベートした。死んだ筋芽細胞は、Ｍｕｓｅ（登録商標）計数及び生存率キットで染色することにより同定し、ＲＯＳは、Ｍｕｓｅ（登録商標）酸化ストレスキットで定量した後、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）Ｍｕｓｅ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）で分析した。
筋芽細胞：筋芽細胞を３５ｍｍのコラーゲンコーティングディッシュに播種し、増殖培地で培養し、試験化合物と２４時間プレインキュベートし、又はプレインキュベートせず、次いで致死濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、強力な酸化促進／アポトーシス促進化合物と２４時間インキュベートし、又はインキュベートしなかった。最適なＨ２Ｏ２濃度は、すべての細胞の３０％～５０％を死滅させるのに必要な濃度であり、各実験の前に確立された。一般に、筋芽細胞は、１２０μＭのＨ２Ｏ２とインキュベートした。死んだ筋芽細胞は、Ｍｕｓｅ（登録商標）計数及び生存率キットで染色することにより同定し、ＲＯＳは、Ｍｕｓｅ（登録商標）酸化ストレスキットで定量した後、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）Ｍｕｓｅ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）で分析した。
【0061】
筋管：筋芽細胞を３５ｍｍのコラーゲンコーティングディッシュに播種し、増殖培地でコンフルエントになるまで培養した後、分化培地に４日間切り替えた。２日目に、Ｈ２Ｏ２で２４時間インキュベートする前に、細胞をＴＸで２４時間インキュベートした。筋管培養で使用されるＨ２Ｏ２濃度（５５０μＭ）は、筋芽細胞で使用される濃度よりも高く、これは、筋管がアポトーシス誘導物質に耐性があることを示唆している（未発表の結果；（Ｓａｌｕｃｃｉ，Ｂｕｒａｔｔｉｎｉ，Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｉ，Ｂａｔｔｉｓｔｅｌｌｉ，Ｃａｎｏｎｉｃｏ，Ｖａｌｍｏｒｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１３））。筋管は、ＦＡＣＳ分析には大きすぎるため、Ｈ２Ｏ２効果は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を定量化することによって決定し、これは、ＬＤＨ細胞毒性キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、組織損傷時に培地で増加する。並行して、筋管培養物にＲＯＳ蛍光プローブ（ＣｅｌｌＲｏｘ）をロードし、続いてＴＥＣＡＮ分光光度計を使用して蛍光を定量化した。
【0062】
１０．ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイ
筋芽細胞を３５ｍｍのコラーゲンコーティングディッシュに播種し、増殖培地で培養し、ＴＸと２４時間プレインキュベートし、又はプレインキュベートせず、次いで致死量以下の濃度のＨ２Ｏ２（８０μＭ；死細胞との干渉を避けるため）と２４時間インキュベートし、又はインキュベートしなかった。次いで、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ，Ｈｏｅｒｄｔ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、筋肉細胞から全ＲＮＡを単離した。各サンプルのＲＮＡ濃度は、エッペンドルフバイオフォトメーターで測定した。ｃＤＮＡは、Ｖｅｒｓｏ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｌｋｉｒｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して調製した。
筋芽細胞を３５ｍｍのコラーゲンコーティングディッシュに播種し、増殖培地で培養し、ＴＸと２４時間プレインキュベートし、又はプレインキュベートせず、次いで致死量以下の濃度のＨ２Ｏ２（８０μＭ；死細胞との干渉を避けるため）と２４時間インキュベートし、又はインキュベートしなかった。次いで、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ，Ｈｏｅｒｄｔ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、筋肉細胞から全ＲＮＡを単離した。各サンプルのＲＮＡ濃度は、エッペンドルフバイオフォトメーターで測定した。ｃＤＮＡは、Ｖｅｒｓｏ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｌｋｉｒｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して調製した。
【0063】
ＣＨＯＰ（標的）及びＲＰＬＰＯ（対照）遺伝子の発現は、前述のように（Ｅｌ Ｈａｄｄａｄ，Ｎｏｔａｒｎｉｃｏｌａ，Ｅｖａｎｏ，Ｅｌ Ｋｈａｔｉｂ，Ｂｌａｑｕｉｅｒｅ，Ｂｏｎｎｉｅｕ，ｅｔ ａｌ．，２０１７）、以下のプライマーを使用して、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍｅｙｌａｎ，Ｆｒａｎｃｅ）での定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって分析した。
ＲＰＬＰＯ：
配列番号Ｎ°１：ＴＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＴＴＣＧ
配列番号Ｎ°２：ＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＡＡ
ＣＨＯＰ：
配列番号Ｎ°３：ＡＡＧＧＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＡＧＣ
配列番号Ｎ°４：ＡＴＴＣＡＣＣＡＴＴＣＧＧＴＣＡＡＴＣＡＧＡ．
ＲＰＬＰＯ：
配列番号Ｎ°１：ＴＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＴＴＣＧ
配列番号Ｎ°２：ＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＡＡ
ＣＨＯＰ：
配列番号Ｎ°３：ＡＡＧＧＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＡＧＣ
配列番号Ｎ°４：ＡＴＴＣＡＣＣＡＴＴＣＧＧＴＣＡＡＴＣＡＧＡ．
【0064】
１１．ウエスタンブロッティング
筋芽細胞を３５ｍｍのコラーゲンコーティングディッシュに播種し、増殖培地で培養し、ＴＸと２４時間プレインキュベートし、又はプレインキュベートせず、次いで８０μＭのＨ２Ｏ２と２４時間インキュベートし、又はインキュベートしなかった。タンパク質抽出物をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写し、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（Ｅｕｒｏｂｉｏ，Ｆｒａｎｃｅ）で室温でブロックし、ウサギポリクローナル抗ヒストンＨ１．４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；１／５０００）でプローブし、ウサギポリクローナル抗ガンマＨ２ＡＸ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ；１／３０００）抗体、続いてＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤ及びＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＲＤ二次抗体（Ｅｕｒｏｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ）でプローブした。Ｏｄｙｓｓｅｙソフトウェアを用いて蛍光を定量化した。データは、α－チューブリン発現に対して正規化した。
筋芽細胞を３５ｍｍのコラーゲンコーティングディッシュに播種し、増殖培地で培養し、ＴＸと２４時間プレインキュベートし、又はプレインキュベートせず、次いで８０μＭのＨ２Ｏ２と２４時間インキュベートし、又はインキュベートしなかった。タンパク質抽出物をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写し、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（Ｅｕｒｏｂｉｏ，Ｆｒａｎｃｅ）で室温でブロックし、ウサギポリクローナル抗ヒストンＨ１．４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；１／５０００）でプローブし、ウサギポリクローナル抗ガンマＨ２ＡＸ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ；１／３０００）抗体、続いてＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤ及びＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＲＤ二次抗体（Ｅｕｒｏｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ）でプローブした。Ｏｄｙｓｓｅｙソフトウェアを用いて蛍光を定量化した。データは、α－チューブリン発現に対して正規化した。
【0065】
１２．筋肉のサンプリング及び調製
この研究の実験プロトコルは、欧州指令（８６／６０９／ＣＥＥ）に厳密に従っており、ラングドックルシヨン地域の倫理委員会によって承認された。生後６か月のＣ５７ＢＬ／６雄マウスの腓腹筋を取り出し、すぐに氷上に置いた。次いで、筋肉を滅菌はさみで５分間ミンチにし、６００ｍｇのバッチに分割した。ミンチにした筋肉の各バッチを、エタノール（５０μＬ／６００ｍｇ）に溶解した、異なる量のブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）（０．０１０％、０．００５％、０．００２５％ｗ／ｗのミンチにした筋肉）、ＣＡ（０．０１５％、０．００７５％、０．００３７５％ｗ／ｗのミンチにした筋肉）、又はＴＸ（０．０１５％、０．００７５％、０．００３７５％ｗ／ｗのミンチにした筋肉）と混合した。対照バッチは、エタノール（５０μＬ／６００ｍｇ）のみと混合した。分子量の違いを補正するために、異なるパーセンテージの３つの抗酸化剤を使用した。ミンチにした筋肉の各バッチは、計量カップを使用して４つの部分（１５０ｍｇ）に分割し、ポリプロピレンフィルムバッグに個別に包装した。３つの部分を４±１℃の暗所で７日間保存した。最後の１つ（０日）は、Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーを用いて５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（１：９）で直ちにホモジナイズした。チオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）の測定に必要なホモジナートの画分をすばやく凍結し、総チオールの測定のために－２０℃で保存する前に、残りを１０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。同じ手順を牛肉（「アントルコート」）に採用した。肉片は、１週間前に屠殺された動物からのものであった。
この研究の実験プロトコルは、欧州指令（８６／６０９／ＣＥＥ）に厳密に従っており、ラングドックルシヨン地域の倫理委員会によって承認された。生後６か月のＣ５７ＢＬ／６雄マウスの腓腹筋を取り出し、すぐに氷上に置いた。次いで、筋肉を滅菌はさみで５分間ミンチにし、６００ｍｇのバッチに分割した。ミンチにした筋肉の各バッチを、エタノール（５０μＬ／６００ｍｇ）に溶解した、異なる量のブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）（０．０１０％、０．００５％、０．００２５％ｗ／ｗのミンチにした筋肉）、ＣＡ（０．０１５％、０．００７５％、０．００３７５％ｗ／ｗのミンチにした筋肉）、又はＴＸ（０．０１５％、０．００７５％、０．００３７５％ｗ／ｗのミンチにした筋肉）と混合した。対照バッチは、エタノール（５０μＬ／６００ｍｇ）のみと混合した。分子量の違いを補正するために、異なるパーセンテージの３つの抗酸化剤を使用した。ミンチにした筋肉の各バッチは、計量カップを使用して４つの部分（１５０ｍｇ）に分割し、ポリプロピレンフィルムバッグに個別に包装した。３つの部分を４±１℃の暗所で７日間保存した。最後の１つ（０日）は、Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーを用いて５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（１：９）で直ちにホモジナイズした。チオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）の測定に必要なホモジナートの画分をすばやく凍結し、総チオールの測定のために－２０℃で保存する前に、残りを１０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。同じ手順を牛肉（「アントルコート」）に採用した。肉片は、１週間前に屠殺された動物からのものであった。
【0066】
１３．α，α－ジフェニル－β－ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）フリーラジカルスカベンジングアッセイ
ラジカル捕捉活性は、いくつかの変更を加えたＭｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．によって記述された方法に従って、ＤＰＰＨを使用して評価した（Ｍｏｒｅｌ，Ｌａｎｄｒｅａｕ，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄｅｒｂｒｅ，Ｇｒｅｌｌｉｅｒ，Ｐａｐｅ，ｅｔ ａｌ．，２０１２）。試験した抽出物及び標準液を、異なる濃度の絶対エタノールで希釈した。エタノールをブランクとして使用し、１０、２５、５０、及び７５μＭのＴｒｏｌｏｘをキャリブレーション溶液として使用した。試験した化合物又は標準溶液（１００μＬ）を、試験濃度ごとに３回ずつ９６ウェルプレートに入れた。絶対エタノールを添加した（７５μＬ）。２５μＬの新たに調製したＤＰＰＨ溶液（１ｍＭ）を添加して、反応を開始し、最終容量を２００μＬ／ウェルにした。室温の暗所で３０分後、ＵＶＭＡＸモレキュラーデバイスマイクロタイタープレートリーダー（ＭＤＳ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて５５０ｎｍで吸光度を決定した。結果は、ＤＰＰＨラジカルの５０％が除去される有効濃度として表した（ＥＣ５０、μｇ／ｍＬ）。結果は、３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である（各実験の濃度ごとに３つのウェル）。
ラジカル捕捉活性は、いくつかの変更を加えたＭｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．によって記述された方法に従って、ＤＰＰＨを使用して評価した（Ｍｏｒｅｌ，Ｌａｎｄｒｅａｕ，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄｅｒｂｒｅ，Ｇｒｅｌｌｉｅｒ，Ｐａｐｅ，ｅｔ ａｌ．，２０１２）。試験した抽出物及び標準液を、異なる濃度の絶対エタノールで希釈した。エタノールをブランクとして使用し、１０、２５、５０、及び７５μＭのＴｒｏｌｏｘをキャリブレーション溶液として使用した。試験した化合物又は標準溶液（１００μＬ）を、試験濃度ごとに３回ずつ９６ウェルプレートに入れた。絶対エタノールを添加した（７５μＬ）。２５μＬの新たに調製したＤＰＰＨ溶液（１ｍＭ）を添加して、反応を開始し、最終容量を２００μＬ／ウェルにした。室温の暗所で３０分後、ＵＶＭＡＸモレキュラーデバイスマイクロタイタープレートリーダー（ＭＤＳ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて５５０ｎｍで吸光度を決定した。結果は、ＤＰＰＨラジカルの５０％が除去される有効濃度として表した（ＥＣ５０、μｇ／ｍＬ）。結果は、３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である（各実験の濃度ごとに３つのウェル）。
【0067】
１４．ＴＢＡＲＳ測定
脂質過酸化指数は、ＴＢＡＲＳを測定することによって筋肉ホモジナートで決定した（Ｓｕｎｄｅｒｍａｎ，Ｍａｒｚｏｕｋ，Ｈｏｐｆｅｒ，Ｚａｈａｒｉａ，＆Ｒｅｉｄ，１９８５）。簡単に説明すると、筋肉ホモジナートを１５４ｍＭのＫＣｌ、リン酸（１％ｖ／ｖ）、及び３０ｍＭのチオバルビツール酸（ＴＢＡ）と混合した。混合物を１００℃で１時間煮沸した。冷却後、ｎ－ブタノールで抽出し、１０００ｇ、室温で１５分間遠心分離した。有機相の蛍光強度を分光蛍光光度計（Ｅｘ：５１５ｎｍ；Ｅｍ：５５３ｎｍ）で測定した。標準は、１，１，３，３－テトラエトキシプロパン（ＴＥＰ）から調製して、結果は、組織１グラムあたりのＴＢＡＲＳのナノモルとして表し、３回の実験の平均±ＳＤであった。
脂質過酸化指数は、ＴＢＡＲＳを測定することによって筋肉ホモジナートで決定した（Ｓｕｎｄｅｒｍａｎ，Ｍａｒｚｏｕｋ，Ｈｏｐｆｅｒ，Ｚａｈａｒｉａ，＆Ｒｅｉｄ，１９８５）。簡単に説明すると、筋肉ホモジナートを１５４ｍＭのＫＣｌ、リン酸（１％ｖ／ｖ）、及び３０ｍＭのチオバルビツール酸（ＴＢＡ）と混合した。混合物を１００℃で１時間煮沸した。冷却後、ｎ－ブタノールで抽出し、１０００ｇ、室温で１５分間遠心分離した。有機相の蛍光強度を分光蛍光光度計（Ｅｘ：５１５ｎｍ；Ｅｍ：５５３ｎｍ）で測定した。標準は、１，１，３，３－テトラエトキシプロパン（ＴＥＰ）から調製して、結果は、組織１グラムあたりのＴＢＡＲＳのナノモルとして表し、３回の実験の平均±ＳＤであった。
【0068】
１５．タンパク質酸化アッセイ又はスルフヒドリル基測定
総チオール定量化（Ｆａｕｒｅ＆Ｌａｆｏｎｄ，１９９５）は、５，５'－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）と、４１２ｎｍで分光光度的に定量できる黄色の生成物であるチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）を生成するサンプルとの反応に基づく。結果は、タンパク質１ミリグラムあたりの総チオールのナノモルとして表し、３回の実験の平均±ＳＤであった。タンパク質濃度は、ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）及び標準としてウシ血清アルブミンを使用して決定した。
総チオール定量化（Ｆａｕｒｅ＆Ｌａｆｏｎｄ，１９９５）は、５，５'－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）と、４１２ｎｍで分光光度的に定量できる黄色の生成物であるチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）を生成するサンプルとの反応に基づく。結果は、タンパク質１ミリグラムあたりの総チオールのナノモルとして表し、３回の実験の平均±ＳＤであった。タンパク質濃度は、ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）及び標準としてウシ血清アルブミンを使用して決定した。
【0069】
１６．統計分析
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。すべての実験を３回実行した。エラーバーは、平均のＳＤを表す。統計的有意性は、一元配置分散分析を使用して決定した；ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．００１（＊＊＊）、及びｐ＜０．０００１（＊＊＊＊）を有意であると見なした。
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。すべての実験を３回実行した。エラーバーは、平均のＳＤを表す。統計的有意性は、一元配置分散分析を使用して決定した；ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．００１（＊＊＊）、及びｐ＜０．０００１（＊＊＊＊）を有意であると見なした。
【0070】
結果及び考察
１．ローズマリー茎抽出物は、複雑な生体系で強力な抗酸化作用を有する
強力な酸化促進分子であるＨ２Ｏ２は、ヒト筋芽細胞（骨格筋前駆体）の付着培養におけるアポトーシス細胞の割合を増加させることが以前に実証されている（Ｊｅａｎ，Ｌａｏｕｄｊ－Ｃｈｅｎｉｖｅｓｓｅ，Ｎｏｔａｒｎｉｃｏｌａ，Ｒｏｕｇｅｒ，Ｓｅｒｒａｔｒｉｃｅ，Ｂｏｎｎｉｅｕ，ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
１．ローズマリー茎抽出物は、複雑な生体系で強力な抗酸化作用を有する
強力な酸化促進分子であるＨ２Ｏ２は、ヒト筋芽細胞（骨格筋前駆体）の付着培養におけるアポトーシス細胞の割合を増加させることが以前に実証されている（Ｊｅａｎ，Ｌａｏｕｄｊ－Ｃｈｅｎｉｖｅｓｓｅ，Ｎｏｔａｒｎｉｃｏｌａ，Ｒｏｕｇｅｒ，Ｓｅｒｒａｔｒｉｃｅ，Ｂｏｎｎｉｅｕ，ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
【0071】
葉と茎との混合物からのローズマリー・オフィシナリス（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）抽出物（全ローズマリー抽出物、ＲＷ）又は強力な合成抗酸化剤であるテンポルの濃度を増加させて、ヒト筋芽細胞をプレインキュベートする効果は、致死濃度のＨ２Ｏ２とのインキュベーションの前に２４時間試験される。予想通り、テンポルは、Ｈ２Ｏ２誘発細胞死からヒト筋芽細胞を効率的に保護した（図１Ａ）。ＲＷはまた、試験したすべての濃度で細胞死を効率的に減少させた。
【0072】
次いで、ローズマリー・オフィシナリス（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の葉（ＲＬ）又は茎（ＲＳ）抽出物を調製し、筋芽細胞を１０μｇ／ｍＬ未満のＲＬ又はＲＳ抽出物の濃度を上げながら２４時間インキュベートした後、Ｈ２Ｏ２を添加して細胞死を定量化した。ＲＳは、１、２、及び４μｇ／ｍＬでＨ２Ｏ２誘発細胞死から筋芽細胞を保護するのに最も効率的であった（図１Ｂ）。２つの主要な既知のローズマリー抗酸化物質であるカルノシン酸（ＣＡ）及びカルノソール（ＣＯ）は、主に葉から抽出され、茎などの植物の木質部分に非常に低レベルで存在するため、この結果は、非常に驚くべきものであった（ｄｅｌ Ｂａｎｏ，Ｌｏｒｅｎｔｅ，Ｃａｓｔｉｌｌｏ，Ｂｅｎａｖｅｎｔｅ－Ｇａｒｃｉａ，ｄｅｌ Ｒｉｏ，Ｏｒｔｕｎｏ，ｅｔ ａｌ．，２００３）。これは、他の分子（複数可）がＲＳ抗酸化活性に寄与する可能性があることを示唆した。
【0073】
２．ＲＳ抽出物からの抗酸化化合物のバイオアッセイガイドによる単離
ＲＳ抽出物の抗酸化活性の原因となる化合物（複数可）を単離するために、バイオアッセイガイドによる分画アプローチが使用されている。具体的には、ＲＳ抽出物は、ＣＨ２Ｃｌ２と水画分に分離され（図２）、Ｈ２Ｏ２誘発細胞死から筋芽細胞を保護する能力を評価した。このアプローチは、ＣＨ２Ｃｌ２可溶性画分がＲＳ抗酸化活性の原因であったことを示した（データは、図示せず）。したがって、この画分をさらに分画して（図２及び方法を参照）、５０ｍｇの純粋な化合物を得る。ＮＭＲ及び質量分析により、この化合物をタキソジオン（ＴＸ）として同定し（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，２００３）、精製収率は、０．３３ｍｇの乾燥茎のタキソジオン（ＴＸ）／ｇ又は４．１ｍｇ／ｇの乾燥抽出物であった。
ＲＳ抽出物の抗酸化活性の原因となる化合物（複数可）を単離するために、バイオアッセイガイドによる分画アプローチが使用されている。具体的には、ＲＳ抽出物は、ＣＨ２Ｃｌ２と水画分に分離され（図２）、Ｈ２Ｏ２誘発細胞死から筋芽細胞を保護する能力を評価した。このアプローチは、ＣＨ２Ｃｌ２可溶性画分がＲＳ抗酸化活性の原因であったことを示した（データは、図示せず）。したがって、この画分をさらに分画して（図２及び方法を参照）、５０ｍｇの純粋な化合物を得る。ＮＭＲ及び質量分析により、この化合物をタキソジオン（ＴＸ）として同定し（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，２００３）、精製収率は、０．３３ｍｇの乾燥茎のタキソジオン（ＴＸ）／ｇ又は４．１ｍｇ／ｇの乾燥抽出物であった。
【0074】
ＲＳ及びＲＬ抽出物中のＴＸを定量化するために、方法が開発され、ＨＰＬＣによって検証され；この方法は、ＲＳ抽出物では、ＴＸ濃度が１１．７ｍｇ／ｇの乾燥抽出物であったのに対し、ＲＬ抽出物では検出できなかったことを示した（＜ＬＯＤ）。ＲＳ（ＥｔＯＨ）では、ＴＸ濃度は、３８ｍｇ／ｇの乾燥抽出物であった。ＨＰＬＣによる定量化は、ＲＳ抽出物中のＴＸ濃度が精製収率によって示唆されたものよりも高かったことを示唆し、これは抽出及び精製の条件を改善できることを含意する。
【0075】
３．タキソジオンは、Ｈ２Ｏ２誘発ストレスからヒト筋芽細胞及び筋管を保護する
Ｈ２Ｏ２を添加する前に、筋芽細胞を０．１２５μｇ／ｍＬ、０．２５０μｇ／ｍＬ、及び０．５μｇ／ｍＬのＴＸと２４時間インキュベートした。３つの濃度すべてが、Ｈ２Ｏ２誘発細胞死に対して同様かつ強力な保護効果を有した（図３Ａ）。
Ｈ２Ｏ２を添加する前に、筋芽細胞を０．１２５μｇ／ｍＬ、０．２５０μｇ／ｍＬ、及び０．５μｇ／ｍＬのＴＸと２４時間インキュベートした。３つの濃度すべてが、Ｈ２Ｏ２誘発細胞死に対して同様かつ強力な保護効果を有した（図３Ａ）。
【0076】
次いで、ＴＸ抗酸化活性を、ローズマリーの主要な生物活性化合物：ＣＡ及びＣＯの活性と比較した（図３Ｂ）。ＴＸは、試験したすべての濃度で大幅に効率的であったのに対して、発明者らは、以前に報告されたように、Ｔｒｏｌｏｘのような強力な抗酸化能力を示したＣＡ、ＣＯ、及びロスマリン酸と比較して、ＴＸが低いＤＰＰＨフリーラジカル捕捉活性を示すことを見出した（Ｅｒｋａｎ，Ａｙｒａｎｃｉ，＆Ａｙｒａｎｃｉ，２００８；Ｌｕｉｓ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ，２００５）。
【0077】
Ｈ２Ｏ２などの酸化促進分子は、ＲＯＳ産生、ＤＮＡ損傷、小胞体小胞体ストレス、及び細胞分化の変化を促進する。したがって、Ｈ２Ｏ２損傷から筋芽細胞を効率的に保護するＴＸ容量が評価されている。ＴＸと２４時間プレインキュベーションし、Ｈ２Ｏ２に２４時間曝露した後、ＲＯＳのレベル（図４Ａ）、ＤＮＡ二本鎖切断形成時にリン酸化されるタンパク質であるγＨ２ＡＸのレベル（図４Ｂ）、及び小胞体ストレスのマーカーであるＣＨＯＰ遺伝子のレベル（図４Ｃ）を定量化した。
【0078】
予想通り、Ｈ２Ｏ２処理により、ＲＯＳ、γＨ２ＡＸタンパク質、ＣＨＯＰ ｍＲＮＡのレベルが上昇した。ＴＸによる前処理は、Ｈ２Ｏ２効果を減少させたのに対して、ＴＸ単独では、効果がなかった。筋細胞の分化中、衛星幹細胞の子孫である筋芽細胞は、細胞周期を終了し、筋肉特異的な構造タンパク質を発現する静止多核細胞である筋管に自発的に分化する。ＴＸがより成熟した骨格筋細胞でも抗酸化活性を示すかどうかを決定するために、本発明者らは、コンフルエントなヒト初代筋芽細胞を分化培地に４日間切り替えた。２日目に、本発明者らは、細胞をＴＸと２４時間インキュベートし、続いてＨ２Ｏ２をさらに２４時間インキュベートした。ＬＤＨ活性及びＲＯＳレベルは、Ｈ２Ｏ２とのみインキュベートした筋管で増加した（図４Ｄ、Ｅ）。逆に、ＴＸとのプレインキュベーションは、Ｈ２Ｏ２効果を大幅に減少させた。
【0079】
したがって、ＴＸは、酸化ストレスからヒトの骨格筋細胞を効率的に保護することが実証されている。これは、ＴＸが酸化ストレス及び骨格筋消耗性疾患に関連するヒトの病状に有用であり得ることを示唆している。また、これらの状態に関連する強力な酸化ストレスを軽減することにより、骨格筋疾患の治療アプローチの有効性を改善させることができる。
【0080】
４．タキソジオンは、ミンチ肉における脂質及びタンパク質の酸化を制限する。
加工肉では、脂質及びタンパク質は、時間の経過とともに酸化されるが、このプロセスは、抗酸化物質の添加によって遅らせることができる（Ｓｈａｈ，Ｂｏｓｃｏ，＆Ｍｉｒ，２０１４）。
加工肉では、脂質及びタンパク質は、時間の経過とともに酸化されるが、このプロセスは、抗酸化物質の添加によって遅らせることができる（Ｓｈａｈ，Ｂｏｓｃｏ，＆Ｍｉｒ，２０１４）。
【0081】
ＴＸの抗酸化能を特徴付けるためのマウスの死後の肉に関する実験が開発されきた。
【0082】
食品用肉に示されているように、ＴＢＡＲＳによって定量化された脂質酸化は、４℃での保存の２日目からマウスの筋肉で徐々に増加するが、チオールレベルは、急激に減少し、これは高レベルのタンパク質酸化を示している（データは、示さず）。ＴＸ抗酸化能を決定するために、ＴＸ、ＣＡ、及び合成フェノール系抗酸化剤ＢＨＴの、ＲＳ及びＲＬの、ならびにＲＳ、ＢＨＴ、及びビタミンＣの脂質及びタンパク質酸化を減少させる効果を比較した（それぞれ図５、図７、図８）。
【0083】
マウスのミンチ肉（ＣＴＲＬ）では、ＴＢＡＲＳ分析によって定量化された脂質酸化が、４℃で７日間保存した後に激しく増加した。逆に、チオールレベルは、著しく低下し、これは高レベルのタンパク質酸化を示している（図５Ａ及びＢ）。ＢＨＴ、ＣＡ、又はＴＸを含有する肉サンプルでは、ＴＢＡＲＳ値は、０日目（図５Ａ）ですでに有意に低く、７日目（図５Ａ）でも対照（ＣＴＲＬ；未処理サンプル）よりも低いままであった。０日目では、チオールレベルは、対照及びＢＨＴ、ＣＡ、又はＴＸのサンプルで同等であったが、総チオールレベルが大幅に低いＴＸ濃度が最も高い（０．０１５％）サンプルでは同等ではなかった（図５Ｂ）。７日間の保存後、肉のチオールレベルは、抗酸化剤を含むサンプルよりも対照で有意に低かったが、０．０１％のＢＨＴでは有意に低くはなかった（図５Ｂ）。ハイドロエタノール（ＲＳ）又はエタノール（ＲＳ（ＥｔＯＨ））バッファーで抽出された粉砕したローズマリー茎の抽出物の抗酸化能を比較した。エタノール抽出物は、ハイドロエタノール抽出物（１．１７％のタキソジオン）よりも多くのタキソジオン（２．８６％のタキソジオン、３３０ｎｍでのＨＰＬＣ－ＵＶによる定量化）を含有する。０日目に、肉サンプルは、ＲＳ又はＲＳ（ＥｔＯＨ）の添加によって大幅に減少したＴＢＡＲＳ値によって特徴付けられる（図６）。７ｊでは、ＲＳ又はＲＳ（ＥｔＯＨ）で処理されたサンプルは、同じ日に対照群と比較して、非常に低いレベルでＴＢＡＲＳ値を維持した（図６）。しかしながら、ローズマリー茎の「エタノール性」抽出物は、「ヒドロエタノール性」抽出物よりもはるかに効果的である。
【0084】
【0085】
これらの結果は、肉保存中の脂質及びタンパク質の酸化に対するＴＸの保護効果がＢＨＴ及びＣＡの保護効果に匹敵し、ＲＳ（ＥｔＯＨ）はＲＬ及びビタミンＣよりも良好であることを示している。
【0086】
例２－いくつかのローズマリー抽出物の比較
２．１．いくつかの製品におけるタキソジオンの定量化
抽出方法：
－ＲＳ、ＲＳＥ、ＲＬのハイドロエタノール及びエタノール浸軟：乾物及び粉砕物を７日間の浸軟により、ハイドロエタノール溶液又はエタノール（比率植物／溶媒：１ｇ／１０ｍＬ）で抽出した。次いで、減圧下での濾過及び蒸発により、乾燥抽出物が得られる。
－ＲＳＪ－ヘキサン及びＲＬ－ヘキサンのヘキサン抽出物。タキソジオンの抽出収率を高めるために、乾物及び粉砕物をヘキサン（比率植物／溶媒：１ｇ／１０ｍＬ）で超音波処理しながら３＊１５分間抽出した。次いで、減圧下での濾過及び蒸発により、乾燥抽出物が得られる。この方法を使用して、濃縮抽出物を得た。この方法を使用して、葉抽出物も調製した。
２．１．いくつかの製品におけるタキソジオンの定量化
抽出方法：
－ＲＳ、ＲＳＥ、ＲＬのハイドロエタノール及びエタノール浸軟：乾物及び粉砕物を７日間の浸軟により、ハイドロエタノール溶液又はエタノール（比率植物／溶媒：１ｇ／１０ｍＬ）で抽出した。次いで、減圧下での濾過及び蒸発により、乾燥抽出物が得られる。
－ＲＳＪ－ヘキサン及びＲＬ－ヘキサンのヘキサン抽出物。タキソジオンの抽出収率を高めるために、乾物及び粉砕物をヘキサン（比率植物／溶媒：１ｇ／１０ｍＬ）で超音波処理しながら３＊１５分間抽出した。次いで、減圧下での濾過及び蒸発により、乾燥抽出物が得られる。この方法を使用して、濃縮抽出物を得た。この方法を使用して、葉抽出物も調製した。
【0087】
ＲＳ：ローズマリー茎
ＲＳ：ハイドロエタノール溶媒中で７日間浸軟させた茎抽出物。
ＲＳＥ：エタノール溶媒中で７日間浸軟させた茎抽出物
ＲＳＪ－ヘキサン：ヘキサン中の茎の超音波抽出物
ＲＳ：ハイドロエタノール溶媒中で７日間浸軟させた茎抽出物。
ＲＳＥ：エタノール溶媒中で７日間浸軟させた茎抽出物
ＲＳＪ－ヘキサン：ヘキサン中の茎の超音波抽出物
【0088】
ＲＬ：ローズマリー葉
ＲＬ：ハイドロエタノール溶媒で７日間浸軟させた葉抽出物。
ＲＬ－ヘキサン：ヘキサン中の葉の超音波抽出物
ＲＬ：ハイドロエタノール溶媒で７日間浸軟させた葉抽出物。
ＲＬ－ヘキサン：ヘキサン中の葉の超音波抽出物
【表2】
【0089】
２．２．マウスの肉脂質の過酸化に対するタキソジオン強化抽出物の効果（図９）
Ｅ３９２の抗酸化活性は、ミンチ肉における脂質酸化を減少させるその能力について、ＴＸが豊富な抽出物と比較している。
Ｅ３９２の抗酸化活性は、ミンチ肉における脂質酸化を減少させるその能力について、ＴＸが豊富な抽出物と比較している。
【0090】
ＲＳＥ及びＲＳＪ－ヘキサンの調製は、２．１項に記載されているとおりである。
【0091】
マウスのミンチにした筋肉（ＣＴＲＬ）では、ＴＢＡＲＳ分析によって定量化された脂質酸化が、４℃で７日間保存した後に激しく増加した。Ｅ３９２、ＲＳＥ、又はＲＳＪ－ヘキサンを含有する死後の筋肉サンプルでは、ＴＢＡＲＳ値は、０．０４％及び０．０１％の濃度で有意に低かった。Ｅ３９２、ＲＳＥ、又はＲＳＪ－ヘキサンの間で０．０４％の濃度で有意差は、観察されなかった。しかしながら、０．０１％の濃度では、ＲＳＥ又はＲＳＪ－ヘキサンは、Ｅ３９２よりもＴＢＡＲＳレベルを下げる効率が高かった。
【0092】
２．３．牛肉脂質の過酸化に対するタキソジオン強化抽出物の効果（図１０）
ヒトが消費するための肉に関するこれらの結果を検証するために、牛のミンチ肉をＢＨＴ、ＴＸ、Ｅ３９２、ＲＳＥ、又はＲＳＪ－ヘキサンを用いて４℃で７日間処理した。予想通り、脂質の酸化は、７日間の保存後に大幅に増加した。マウスの筋肉で実証されているように、脂質酸化は、ＢＨＴ、ＴＸ、Ｅ３９２、ＲＳＥ、又はＲＳＪ－ヘキサンで処理された牛のミンチ肉で低いままであった：ＲＳＪ－ヘキサンは、Ｅ３９２よりもＴＢＡＲＳレベルを低下させる効率が高かった。
ヒトが消費するための肉に関するこれらの結果を検証するために、牛のミンチ肉をＢＨＴ、ＴＸ、Ｅ３９２、ＲＳＥ、又はＲＳＪ－ヘキサンを用いて４℃で７日間処理した。予想通り、脂質の酸化は、７日間の保存後に大幅に増加した。マウスの筋肉で実証されているように、脂質酸化は、ＢＨＴ、ＴＸ、Ｅ３９２、ＲＳＥ、又はＲＳＪ－ヘキサンで処理された牛のミンチ肉で低いままであった：ＲＳＪ－ヘキサンは、Ｅ３９２よりもＴＢＡＲＳレベルを低下させる効率が高かった。
【0093】
これらの結果は、肉の保存中の脂質及びタンパク質の酸化に対するＴＸ及びＴＸが豊富な抽出物の保護効果を裏付ける。牛肉分析からのこれらの結果は、死後のマウスの筋肉から観察されたものと同様である。
【0094】
これらの実験はまた、死後の骨格筋の変化を予測し、肉の完全性を保つための生物学的試験を確立するのに有用な動物モデルとして齧歯動物を確証する。
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【手続補正書】
【提出日】2021-09-16
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
筋肉における酸化を防止及び／又は減少させる使用のためのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物。
【請求項2】
筋肉におけるタンパク質の酸化分解を防止及び／もしくは減少させるため、及び／又は筋肉における酸化促進分子の蓄積を防止及び／もしくは減少させるための、請求項１に記載の使用のためのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物。
【請求項3】
筋肉量の喪失及び／又は筋肉疲労及び／もしくは筋肉消耗疾患を予防及び／又は治療し、前記筋肉量の喪失、筋肉疲労、及び筋肉消耗性疾患が、酸化ストレスに関連している、請求項１又は請求項２に記載の使用のためのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物。
【請求項4】
ローズマリー茎抽出物が、少なくとも１％ｗ／ｗのタキソジオンを含む、請求項１～３のいずれかに記載の使用のためのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物。
【請求項5】
ローズマリー茎抽出物が、ローズマリー茎の乾燥粉末を調製すること；前記乾燥粉末を有機又は水冷溶媒中で少なくとも５日間、好ましくは７日間浸軟させること；任意選択で、超音波抽出を適用すること；液相を回収し、溶媒を蒸発させること；により得られ、前記溶媒が、アルコール、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、アセトン、酢酸エチル、水、又はそれらの混合物の中から選択される、請求項１～４のいずれかに記載の使用のためのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物。
【請求項6】
タンパク質及び／又は脂質を含有する食品用天然防腐薬剤としてのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物の使用。
【請求項7】
タンパク質を含有する食品が、肉を含有する食品、非熱処理の加工肉、熱処理された加工肉、加工魚及び水産物、加工卵及び卵製品、ならびに粉乳の中から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項8】
脂質を含有する食品が、調味料、卓上調味料、マスタード、スープ及びブロスソース、本質的に水を含まない脂肪及び油の中から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項9】
タンパク質及び／又は脂質を含有する食品が、新鮮な肉及びデリカテッセンからなる群において選択された肉を含有する食品である、請求項６に記載の使用。
【請求項10】
貯蔵寿命が改善された肉を含有する食品を調製する方法であって、前記プロセスが、前記肉を含有する食品にタキソジオン又はローズマリー茎抽出物を添加する工程を含む、方法。
【請求項11】
肉及び肉由来食品の品質を改善するための家畜用栄養剤としてのタキソジオン又はローズマリー茎抽出物の使用。
【請求項12】
肉又は肉由来食品のタンパク質分解及び／又は脂質過酸化を低減し、及び／又は色、風味、及び／もしくは食感の安定性を改善するための、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
タキソジオン又はローズマリー茎の抽出物を家畜飼料に添加する工程を含む、家畜肉の品質を改善するための方法。
【請求項14】
以下による、少なくとも１％ｗ／ｗのタキソジオンを含むローズマリー茎の抽出物を調製する方法：ローズマリー茎の乾燥粉末を調製すること；
乾燥粉末を有機溶媒又は水アルコール溶媒中で少なくとも５日間、好ましくは７日間浸軟すること；
任意に超音波抽出を適用すること；
液相を回収し、溶媒を留去すること
該溶媒はアルコール、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、アセトン、酢酸エチル、水又はそれらの混合物から選択される。
【請求項15】
少なくとも１％ｗ／ｗ、好ましくは３％ｗ／ｗのタキソジオンを含むローズマリー茎の抽出物。
【国際調査報告】