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特表2022-505689治療的使用のための、遺伝子操作された霊長類シスチン／システイン分解酵素
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-14
(54)【発明の名称】治療的使用のための、遺伝子操作された霊長類シスチン／システイン分解酵素
(51)【国際特許分類】
C12N 15/60 20060101AFI20220106BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220106BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220106BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220106BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220106BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220106BHJP
C12N 9/88 20060101ALI20220106BHJP
A61P 13/02 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/133 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/198 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/401 20060101ALI20220106BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220106BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20220106BHJP
A61P 13/04 20060101ALI20220106BHJP
A61K 38/43 20060101ALI20220106BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220106BHJP
A61K 33/10 20060101ALI20220106BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220106BHJP
【ＦＩ】
C12N15/60 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N9/88
A61P13/02
A61K31/133
A61K31/198
A61K31/401
A61P43/00 121
A61P13/12
A61P13/04
A61K38/43
A61K48/00
A61K33/10
A61K31/7088
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021522334
(86)(22)【出願日】2019-10-25
(85)【翻訳文提出日】2021-05-28
(86)【国際出願番号】 US2019058021
(87)【国際公開番号】W WO2020086937
(87)【国際公開日】2020-04-30
(31)【優先権主張番号】62/751,197
(32)【優先日】2018-10-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500039463
【氏名又は名称】ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム
【氏名又は名称原語表記】ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＲＥＧＥＮＴＳ，ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＥＸＡＳ ＳＹＳＴＥＭ
【住所又は居所原語表記】２１０ Ｗｅｓｔ ７ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ ７８７０１ Ｕ．Ｓ．Ａ．
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】ストーン エベレット
(72)【発明者】
【氏名】ルー ウェイ－チェン
(72)【発明者】
【氏名】カラミトロス クリストス
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
4C084
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B050CC04
4B050CC05
4B050DD11
4B050LL01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA13
4C084MA02
4C084NA14
4C084ZA811
4C084ZC751
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC07
4C086EA16
4C086GA16
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA81
4C086ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206FA03
4C206JA26
4C206JA58
4C206MA03
4C206MA05
4C206MA86
4C206NA14
4C206ZA81
4C206ZC75
(57)【要約】
L-シスチン/システイン分解酵素活性を有するタンパク質の遺伝子操作に関する方法および組成物を説明する。例えば、1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、L-シスチン/システインを分解する能力を有する改変シスタチオニン-γ-リアーゼが開示される。さらに、開示される改変酵素または該酵素をコードする核酸を用いてシスチン尿症を治療するための組成物および方法も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
天然のヒトCGLアミノ酸配列(SEQ ID NO: 1)と比べて少なくとも以下の置換を含む、単離された改変霊長類シスタチオニン-γ-リアーゼ(CGL)酵素であって、該改変酵素がシスチナーゼ活性とシステイナーゼ活性の両方を有し、該置換が以下：(a)193位のアラニン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(b)200位のプロリン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(c)193位のアラニン、200位のプロリン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(d)55位のグルタミン酸、59位のトレオニン、91位のメチオニン、234位のリジン、336位のアスパラギン酸、および339位のバリン；
(e)55位のグルタミン酸、59位のトレオニン、91位のセリン、234位のリジン、336位のアスパラギン酸、および339位のバリン；
(f)189位のセリン、193位のグリシン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(g)163位のアルギニン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(h)51位のトリプトファン、55位のグルタミン酸、59位のトレオニン、336位のアスパラギン酸、および339位のバリン；
(i)55位のグルタミン酸、193位のアラニン、311位のグリシン、336位のアスパラギン酸、339位のバリン、および353位のセリン；
(j)200位のヒスチジン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(k)311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(l)59位のイソロイシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(m)91位のメチオニンおよび339位のバリン；ならびに
(n)339位のバリンおよび353位のセリン
からなる群より選択される、単離された改変霊長類シスタチオニン-γ-リアーゼ(CGL)酵素。
【請求項2】
改変CGL酵素が改変スマトラオランウータン(Pongo abelii)CGL酵素である、請求項1記載の単離された改変CGL酵素。
【請求項3】
改変スマトラオランウータンCGL酵素が、以下：(a)P193A、T311G、E339V、およびV353S；
(b)A200P、T311G、E339V、およびV353S；
(c)P193A、A200P、T311G、E339V、およびV353S；
(d)H55E、V59T、L91M、N234K、T336D、およびE339V；
(e)H55E、V59T、L91S、N234K、T336D、およびE339V；
(f)T189S、P193G、T311G、E339V、およびV353S；
(g)T163R、T311G、E339V、およびV353S；
(h)A51W、H55E、V59T、T336D、およびE339V；
(i)H55E、P193A、T311G、T336D、E339V、およびV353S；
(j)A200H、T311G、E339V、およびV353S；
(k)T311G、E339V、およびV353S；
(l)V59I、E339V、およびV353S；
(m)L91MおよびE339V；ならびに
(n)E339VおよびV353S
からなる群より選択される置換を含む、請求項2記載の単離された改変CGL酵素。
【請求項4】
改変CGL酵素が、改変ヒトCGL酵素、改変チンパンジー(Pan troglodytes)CGL酵素、または改変ボノボ(Pan paniscus)CGL酵素である、請求項1記載の単離された改変CGL酵素。
【請求項5】
改変ヒトCGL酵素、改変チンパンジーCGL酵素、または改変ボノボCGL酵素が、以下：(a)P193A、T311G、E339V、およびI353S；
(b)A200P、T311G、E339V、およびI353S；
(c)P193A、A200P、T311G、E339V、およびI353S；
(d)H55E、E59T、L91M、N234K、T336D、およびE339V；
(e)H55E、E59T、L91S、N234K、T336D、およびE339V；
(f)T189S、P193G、T311G、E339V、およびI353S；
(g)T163R、T311G、E339V、およびI353S；
(h)A51W、H55E、E59T、T336D、およびE339V；
(i)H55E、P193A、T311G、T336D、E339V、およびI353S；
(j)A200H、T311G、E339V、およびI353S；
(k)T311G、E339V、およびI353S；
(l)E59I、E339V、およびI353S；
(m)L91MおよびE339V；ならびに
(n)E339VおよびI353S
からなる群より選択される置換を含む、請求項4記載の単離された改変CGL酵素。
【請求項6】
改変CGL酵素が改変カニクイザル(Macaca fascicularis)CGL酵素である、請求項1記載の単離された改変CGL酵素。
【請求項7】
改変カニクイザルCGL酵素が、以下：(a)P193A、T311G、E339V、およびI353S；
(b)A200P、T311G、E339V、およびI353S；
(c)P193A、A200P、T311G、E339V、およびI353S；
(d)H55E、E59T、L91M、N234K、T336D、およびE339V；
(e)H55E、E59T、L91S、N234K、T336D、およびE339V；
(f)T189S、P193G、T311G、E339V、およびI353S；
(g)V163R、T311G、E339V、およびI353S；
(h)A51W、H55E、E59T、T336D、およびE339V；
(i)H55E、P193A、T311G、T336D、E339V、およびI353S；
(j)A200H、T311G、E339V、およびI353S；
(k)T311G、E339V、およびI353S；
(l)E59I、E339V、およびI353S；
(m)L91MおよびE339V；ならびに
(n)E339VおよびI353S
からなる群より選択される置換を含む、請求項6記載の単離された改変CGL酵素。
【請求項8】
異種ペプチドセグメントまたは多糖類をさらに含む、請求項1～7のいずれか一項記載の単離された改変CGL酵素。
【請求項9】
異種ペプチドセグメントが、XTENペプチド、IgG Fc、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチドである、請求項8記載の単離された改変CGL酵素。
【請求項10】
多糖類がポリシアル酸ポリマーを含む、請求項8記載の単離された改変CGL酵素。
【請求項11】
ポリエチレングリコール(PEG)に結合されている、請求項1～10のいずれか一項記載の単離された改変CGL酵素。
【請求項12】
1つまたは複数のリジン残基を介してPEGに結合されている、請求項11記載の単離された改変CGL酵素。
【請求項13】
請求項1～7のいずれか一項記載の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項14】
細菌、真菌、昆虫、または哺乳動物における発現のためにコドン最適化されている、請求項13記載の核酸。
【請求項15】
細菌が大腸菌(E. coli)である、請求項14記載の核酸。
【請求項16】
SEQ ID NO: 81～95のうちの1つに記載の配列を含む、請求項15記載の核酸。
【請求項17】
請求項13～16のいずれか一項記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項18】
請求項13～16のいずれか一項記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項19】
細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、請求項18記載の宿主細胞。
【請求項20】
薬学的に許容される担体中に請求項1～12のいずれか一項記載の酵素または請求項13～16のいずれか一項記載の核酸を含む、治療的製剤。
【請求項21】
シスチン尿症に罹患しているかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、請求項20記載の製剤の治療的有効量を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項22】
前記対象がL-シスチンおよび/またはL-システインを制限された食事で維持される、請求項21記載の方法。
【請求項23】
前記対象がメチオニンを制限された食事で維持される、請求項21記載の方法。
【請求項24】
前記対象が普通の食事で維持される、請求項21記載の方法。
【請求項25】
前記対象がヒト患者である、請求項21記載の方法。
【請求項26】
前記製剤が、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、筋肉内に、血管内に、皮下に、注射により、輸注により、持続輸注により、またはカテーテルを介して投与される、請求項21記載の方法。
【請求項27】
前記対象が、以前にシスチン尿症の治療を受けたことがあり、前記酵素が、シスチン尿症の再発を予防するために投与される、請求項21記載の方法。
【請求項28】
少なくとも第2のシスチン尿症治療法を前記対象に施す段階をさらに含む、請求項21記載の方法。
【請求項29】
第2のシスチン尿症治療法が外科的療法または衝撃波療法である、請求項28記載の方法。
【請求項30】
第2のシスチン尿症治療法が、重炭酸塩、トリス-ヒドロキシメチレン-アミノメタン(トロメタミン-E)、アセチルシステイン、D-ペニシラミン、α-メルカプトプロピオニルグリシン、およびカプトプリルからなる群より選択される作用物質または薬物を含む、請求項28記載の方法。
【請求項31】
前記対象の血漿および/または血清中のシステインおよび/またはシスチンのレベルを低下させる、請求項21記載の方法。
【請求項32】
前記対象の尿中のシステインおよび/またはシスチンのレベルを低下させる、請求項21記載の方法。
【請求項33】
前記対象の尿路におけるシスチン結石の形成を予防する、請求項21記載の方法。
【請求項34】
前記対象の腎臓におけるシスチン結石の形成を予防する、請求項21記載の方法。
【請求項35】
前記対象の腎臓中のシスチン結石の数を減らす、請求項1記載の方法。
【請求項36】
シスチン尿症患者に治療適用するための医薬を製造するための、請求項1～12のいずれか一項記載の単離もしくは改変されたCGL酵素または該改変CGL酵素を含む組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる2018年10月26日に出願された米国特許仮出願第62/751,197号の優先権恩典を主張する。
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる2018年10月26日に出願された米国特許仮出願第62/751,197号の優先権恩典を主張する。
【0002】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金第R01 CA189623号のもとで、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有している。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金第R01 CA189623号のもとで、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有している。
【0003】
配列表の参照
本出願は、EFS-Webを介してASCII形式で提出された、そっくりそのまま参照により本明細書に組み入れられる、配列表を含む。2019年10月22日に作成された該ASCIIコピーは、UTFBP1212WO_ST25.txtと名付けられ、サイズは365キロバイトである。
本出願は、EFS-Webを介してASCII形式で提出された、そっくりそのまま参照により本明細書に組み入れられる、配列表を含む。2019年10月22日に作成された該ASCIIコピーは、UTFBP1212WO_ST25.txtと名付けられ、サイズは365キロバイトである。
【0004】
共同研究契約の当事者
本明細書において開示および特許請求される発明は、Aeglea BioTherapeutics, Inc.とThe Board of Regents of The University of Texas Systemの共同研究契約の範囲内で開発された。
本明細書において開示および特許請求される発明は、Aeglea BioTherapeutics, Inc.とThe Board of Regents of The University of Texas Systemの共同研究契約の範囲内で開発された。
【0005】
1 分野
ヒト治療法に適する高いシステイン/システイン分解活性を有する、組換えによって遺伝子操作された霊長類酵素変種が、開示される。L-シスチンとL-システインの両方を枯渇させる酵素を用いてシスチン尿症を治療するための組成物および方法もまた、提供される。
ヒト治療法に適する高いシステイン/システイン分解活性を有する、組換えによって遺伝子操作された霊長類酵素変種が、開示される。L-シスチンとL-システインの両方を枯渇させる酵素を用いてシスチン尿症を治療するための組成物および方法もまた、提供される。
【背景技術】
【0006】
2 関連技術の説明
シスチン尿症は、腎臓の近位尿細管のシスチンおよび二塩基性アミノ酸の輸送体をコードするSLC3A1遺伝子およびSLC7A9遺伝子の変異に起因する、シスチン(アミノ酸システインのジスルフィド型)の異常排泄および尿路内でのシスチン結晶/結石の形成をもたらす遺伝性障害である。腎臓輸送体に欠陥があるため腎臓濾過時にシステインを再吸収できない遺伝性障害シスチン尿症に罹患している患者にとって、利用可能な治療物質はわずかしかない。アミノ酸L-システインのジスルフィド型であるシスチンは、著しく不溶性であり、シスチン尿症患者の尿路で高濃度に達し、結果としてシスチン結晶および結石を形成する。循環血中シスチンレベルを低下させる既存の治療法は、尿路結石形成をある程度は予防するが、顕著な有害作用があるため使用が制限されている。腎臓および膀胱におけるシスチン結石形成を低減および予防するための治療法が必要とされている。
シスチン尿症は、腎臓の近位尿細管のシスチンおよび二塩基性アミノ酸の輸送体をコードするSLC3A1遺伝子およびSLC7A9遺伝子の変異に起因する、シスチン(アミノ酸システインのジスルフィド型)の異常排泄および尿路内でのシスチン結晶/結石の形成をもたらす遺伝性障害である。腎臓輸送体に欠陥があるため腎臓濾過時にシステインを再吸収できない遺伝性障害シスチン尿症に罹患している患者にとって、利用可能な治療物質はわずかしかない。アミノ酸L-システインのジスルフィド型であるシスチンは、著しく不溶性であり、シスチン尿症患者の尿路で高濃度に達し、結果としてシスチン結晶および結石を形成する。循環血中シスチンレベルを低下させる既存の治療法は、尿路結石形成をある程度は予防するが、顕著な有害作用があるため使用が制限されている。腎臓および膀胱におけるシスチン結石形成を低減および予防するための治療法が必要とされている。
【発明の概要】
【0007】
概要
本発明は、L-シスチンとL-システインの両方(本明細書において「L-シスチン/システイン」と呼ぶ)を血清から効率的に分解できるように霊長類シスタチオニン-γ-リアーゼ(「CGL」)酵素を操作することおよびヒト治療法に適した製剤の形態で改変CGL酵素を提供することに関する。天然酵素と比べて低いKMおよび高い触媒活性kcatを示す酵素を開発するために、選択したアミノ酸を改変することによって天然酵素を操作した。この改変により、酵素特性が劇的に向上した酵素が得られる。したがって、本明細書において説明するように、改変CGL酵素は、L-シスチン/システイン分解触媒活性が向上したヒトまたは霊長類ポリペプチド配列を含む新規の酵素を提供することにより、当技術分野の大きな欠陥を克服するものである。この酵素はヒト配列から構成されているため、有害な免疫学的応答を誘導する可能性が低い。したがって、これらの改変酵素は、ヒト治療法に適し、低い免疫原性を有する可能性がある。
本発明は、L-シスチンとL-システインの両方(本明細書において「L-シスチン/システイン」と呼ぶ)を血清から効率的に分解できるように霊長類シスタチオニン-γ-リアーゼ(「CGL」)酵素を操作することおよびヒト治療法に適した製剤の形態で改変CGL酵素を提供することに関する。天然酵素と比べて低いKMおよび高い触媒活性kcatを示す酵素を開発するために、選択したアミノ酸を改変することによって天然酵素を操作した。この改変により、酵素特性が劇的に向上した酵素が得られる。したがって、本明細書において説明するように、改変CGL酵素は、L-シスチン/システイン分解触媒活性が向上したヒトまたは霊長類ポリペプチド配列を含む新規の酵素を提供することにより、当技術分野の大きな欠陥を克服するものである。この酵素はヒト配列から構成されているため、有害な免疫学的応答を誘導する可能性が低い。したがって、これらの改変酵素は、ヒト治療法に適し、低い免疫原性を有する可能性がある。
【0008】
シスチンをシステインパースルフィドに効率的に変換する操作されたヒトシスタチオニン-γ-リアーゼ(CGL)酵素を利用する方法が開示される。システインパースルフィドは、その後、遊離システインおよびH2Sに自然分解する。したがって、これは、腎臓および尿路におけるシスチン蓄積および結石形成を予防することによってシスチン尿症患者を治療するための適切な治療法である。さらに、操作されたヒトCGL酵素は、システインをピルビン酸、アンモニア、および硫化水素に変換して、酸化してシスチンを形成し得るシステインの量を実際に減らすこともできる。シスチンは、大半の細胞によって通常は産生される非必須アミノ酸であり、動物モデルにおいて長期にシスチンを枯渇させても毒性は誘導されないことが判明している。シスチン分解治療物質は、毒性を生じずに循環血中シスチンの合計レベルを下げることができ、このことから、シスチン結石形成を予防するための、既存の治療レジメンよりも優れた治療レジメンであろうことが示される。
【0009】
霊長類CGL酵素から導かれる、L-シスチン/システイン分解活性を有する改変CGL酵素が、本明細書において提供される。改変CGL酵素は、ヒトCGL酵素(SEQ ID NO: 1)、スマトラオランウータン(Pongo abelii)CGL酵素(Genbank ID: NP_001124635.1; SEQ ID NO: 2)、カニクイザル(Macaca fascicularis)CGL酵素(Genbank ID: AAW71993.1; SEQ ID NO: 3)、チンパンジー(Pan troglodytes)CGL酵素(Genbank ID: XP_513486.2; SEQ ID NO: 4)、またはボノボ(Pan paniscus)CGL酵素(Genbank ID: XP_003830652.1; SEQ ID NO: 5)に由来してよい。天然CGL酵素は、化学修飾、置換、挿入、欠失、および/または切断などの1つまたは複数の他の改変によって改変されてよい。
【0010】
改変CGL酵素は、SEQ ID NO: 1～5のアミノ酸51位、55位、59位、91位、163位、189位、193位、200位、234位、311位、336位、339位、および/または353位における1個、2個、3個、4個、またはそれより多い置換によって改変することにより、天然の霊長類CGL酵素から導くことができる。これらの例では、各配列の最初のメチオニンがアミノ酸1位に相当し、そこから各アミノ酸に通し番号が振られる。アミノ酸51位での置換はトリプトファン(W)でよく、55位での置換はグルタミン酸(E)でよく、59位での置換はトレオニン(T)もしくはイソロイシン(I)でよく、91位での置換はメチオニン(M)もしくはセリン(S)でよく、163位での置換はアルギニン(R)でよく、189位での置換はセリン(S)でよく、193位での置換はグリシン(G)もしくはアラニン(A)でよく、200位での置換はプロリン(P)もしくはヒスチジン(H)でよく、234位での置換はリジン(K)でよく、311位での置換はグリシン(G)でよく、336位での置換はアスパラギン酸(D)でよく、339位での置換はバリン(V)でよく、かつ/または353位での置換はセリン(S)でよい。
【0011】
改変CGL酵素は、SEQ ID NO: 6～95のアミノ酸配列を有してよい。改変CGL酵素は、生理的条件下でL-シスチン/システインを分解する能力があり得る。改変CGL酵素は、L-シスチン/システインに対して、少なくともまたは約1000s-1M-1、2000s-1M-1、3000s-1M-1、4000s-1M-1、5000s-1M-1、6000s-1M-1、7000s-1M-1、8000s-1M-1、9000s-1M-1、104s-1M-1、105s-1M-1、106s-1M-1、またはその中で導き出せる任意の範囲の触媒効率(kcat/KM)を有し得る。例示的なCGL酵素は、L-シスチンに対して104s-1M-1より大きな触媒効率を、L-システインに対して103s-1M-1より大きな触媒効率を有し得る。
【0012】
これらの置換は、ヒトCGLに対するP193A、T311G、E339V、およびI353Sの組合せであってよい(例えば、SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列を有する改変ポリペプチドまたはその断片もしくはホモログ)。例えば、SEQ ID NO: 1のI353と同等の置換がSEQ ID NO: 2で起こる場合、SEQ ID NO: 1の場合のようにイソロイシンが改変されるのではなく、バリンが改変されるであろう。これらの置換は、ヒトCGLに対するA200P、T311G、E339V、およびI353Sの組合せであってよい(例えば、SEQ ID NO: 7のアミノ酸配列を有する改変ポリペプチドまたはその断片もしくはホモログ)。これらの置換は、ヒトCGLに対するP193A、A200P、T311G、E339V、およびI353Sの組合せであってよい(例えば、SEQ ID NO: 8のアミノ酸配列を有する改変ポリペプチドまたはその断片もしくはホモログ)。これらの置換は、ヒトCGLに対するH55E、E59T、L91M、N234K、T336D、およびE339Vの組合せであってよい(例えば、SEQ ID NO: 9のアミノ酸配列を有する改変ポリペプチドまたはその断片もしくはホモログ)。例えば、SEQ ID NO: 1のE59と同等の置換がSEQ ID NO: 2で起こる場合、SEQ ID NO: 1の場合のようにグルタミン酸が改変されるのではなく、バリンが改変されるであろう。これらの置換は、ヒトCGLに対するH55E、E59T、L91S、N234K、T336D、およびE339Vの組合せであってよい(例えば、SEQ ID NO: 10のアミノ酸配列を有する改変ポリペプチドまたはその断片もしくはホモログ)。これらの置換は、ヒトCGLに対するT189S、P193G、T311G、E339V、およびI353Sの組合せであってよい(例えば、SEQ ID NO: 11のアミノ酸配列を有する改変ポリペプチドまたはその断片もしくはホモログ)。これらの置換は、ヒトCGLに対するT163R、T311G、E339V、およびI353Sの組合せであってよい(例えば、SEQ ID NO: 12のアミノ酸配列を有する改変ポリペプチドまたはその断片もしくはホモログ)。例えば、SEQ ID NO: 1のT163と同等の置換がSEQ ID NO: 3で起こる場合、SEQ ID NO: 1の場合のようにトレオニンが改変されるのではなく、バリンが改変されるであろう。これらの置換は、ヒトCGLに対するA51W、H55E、E59T、T336D、およびE339Vの組合せであってよい(例えば、SEQ ID NO: 13のアミノ酸配列を有する改変ポリペプチドまたはその断片もしくはホモログ)。これらの置換は、ヒトCGLに対するH55E、P193A、T311G、T336D、E339V、およびI353Sの組合せであってよい(例えば、SEQ ID NO: 14のアミノ酸配列を有する改変ポリペプチドまたはその断片もしくはホモログ)。これらの置換は、ヒトCGLに対するA200H、T311G、E339V、およびI353Sの組合せであってよい(例えば、SEQ ID NO: 15のアミノ酸配列を有する改変ポリペプチドまたはその断片もしくはホモログ)。これらの置換は、ヒトCGLに対するT311G、E339V、およびI353Sの組合せであってよい(例えば、SEQ ID NO: 16のアミノ酸配列を有する改変ポリペプチドまたはその断片もしくはホモログ)。これらの置換は、ヒトCGLに対するE59I、E339V、およびI353Sの組合せであってよい(例えば、SEQ ID NO: 17のアミノ酸配列を有する改変ポリペプチドまたはその断片もしくはホモログ)。これらの置換は、ヒトCGLに対するL91MおよびE339Vの組合せであってよい(例えば、SEQ ID NO: 18のアミノ酸配列を有する改変ポリペプチドまたはその断片もしくはホモログ)。これらの置換は、ヒトCGLに対するE339VおよびI353Sの組合せであってよい(例えば、SEQ ID NO: 19のアミノ酸配列を有する改変ポリペプチドまたはその断片もしくはホモログ)。これらの置換は、ヒトCGLに対するE339Vであってよい(例えば、SEQ ID NO: 20のアミノ酸配列を有する改変ポリペプチドまたはその断片もしくはホモログ)。
【0013】
改変ポリペプチドは、スマトラオランウータンCGL-P193A-T311G-E339V-V353S変異体(SEQ ID NO: 24)、スマトラオランウータンCGL-A200P-T311G-E339V-V353S変異体(SEQ ID NO: 25)、スマトラオランウータンCGL-P193A-A200P-T311G-E339V-V353S変異体(SEQ ID NO: 26)、スマトラオランウータンCGL-H55E-V59T-L91M-N234K-T336D-E339V変異体(SEQ ID NO: 27)、スマトラオランウータンCGL-H55E-V59T-L91S-N234K-T336D-E339V変異体(SEQ ID NO: 28)、スマトラオランウータンCGL-T189S-P193G-T311G-E339V-V353S変異体(SEQ ID NO: 29)、スマトラオランウータンCGL-T163R-T311G-E339V-V353S変異体(SEQ ID NO: 30)、スマトラオランウータンCGL-A51W-H55E-V59T-T336D-E339V変異体(SEQ ID NO: 31)、スマトラオランウータンCGL-H55E-P193A-T311G-T336D-E339V-V353S変異体(SEQ ID NO: 32)、スマトラオランウータンCGL-A200H-T311G-E339V-V353S変異体(SEQ ID NO: 33)、スマトラオランウータンCGL-T311G-E339V-V353S変異体(SEQ ID NO: 34)、スマトラオランウータンCGL-V59I-E339V-V353S変異体(SEQ ID NO: 35)、スマトラオランウータンCGL-L91M-E339V変異体(SEQ ID NO: 36)、スマトラオランウータンCGL-E339V-V353S変異体(SEQ ID NO: 37)、またはスマトラオランウータンCGL-E339V変異体(SEQ ID NO: 38)であってよい。
【0014】
改変ポリペプチドは、カニクイザルCGL-P193A-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 42)、カニクイザルCGL-A200P-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 43)、カニクイザルCGL-P193A-A200P-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 44)、カニクイザルCGL-H55E-E59T-L91M-N234K-T336D-E339V変異体(SEQ ID NO: 45)、カニクイザルCGL-H55E-E59T-L91S-N234K-T336D-E339V変異体(SEQ ID NO: 46)、カニクイザルCGL-T189S-P193G-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 47)、カニクイザルCGL-V163R-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 48)、カニクイザルCGL-A51W-H55E-E59T-T336D-E339V変異体(SEQ ID NO: 49)、カニクイザルCGL-H55E-P193A-T311G-T336D-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 50)、カニクイザルCGL-A200H-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 51)、カニクイザルCGL-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 52)、カニクイザルCGL-E59I-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 53)、カニクイザルCGL-L91M-E339V変異体(SEQ ID NO: 54)、カニクイザルCGL-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 55)、またはカニクイザルCGL-E339V変異体(SEQ ID NO: 56)であってよい。
【0015】
改変ポリペプチドは、チンパンジーCGL-P193A-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 60)、チンパンジーCGL-A200P-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 61)、チンパンジーCGL-P193A-A200P-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 62)、チンパンジーCGL-H55E-E59T-L91M-N234K-T336D-E339V変異体(SEQ ID NO: 63)、チンパンジーCGL-H55E-E59T-L91S-N234K-T336D-E339V変異体(SEQ ID NO: 64)、チンパンジーCGL-T189S-P193G-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 65)、チンパンジーCGL-T163R-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 66)、チンパンジーCGL-A51W-H55E-E59T-T336D-E339V変異体(SEQ ID NO: 67)、チンパンジーCGL-H55E-P193A-T311G-T336D-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 68)、チンパンジーCGL-A200H-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 69)、チンパンジーCGL-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 70)、チンパンジーCGL-E59I-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 71)、チンパンジーCGL-L91M-E339V変異体(SEQ ID NO: 72)、チンパンジーCGL-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 73)、またはチンパンジーCGL-E339V変異体(SEQ ID NO: 74)であってよい。
【0016】
改変ポリペプチドは、ボノボCGL-P193A-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 78)、ボノボCGL-A200P-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 79)、ボノボCGL-P193A-A200P-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 80)、ボノボCGL-H55E-E59T-L91M-N234K-T336D-E339V変異体(SEQ ID NO: 81)、ボノボCGL-H55E-E59T-L91S-N234K-T336D-E339V変異体(SEQ ID NO: 82)、ボノボCGL-T189S-P193G-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 83)、ボノボCGL-T163R-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 84)、ボノボCGL-A51W-H55E-E59T-T336D-E339V変異体(SEQ ID NO: 85)、ボノボCGL-H55E-P193A-T311G-T336D-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 86)、ボノボCGL-A200H-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 87)、ボノボCGL-T311G-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 88)、ボノボCGL-E59I-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 89)、ボノボCGL-L91M-E339V変異体(SEQ ID NO: 90)、ボノボCGL-E339V-I353S変異体(SEQ ID NO: 91)、またはボノボCGL-E339V変異体(SEQ ID NO: 92)であってよい。
【0017】
本明細書で論じる改変CGL酵素は、未改変CGL酵素(例えば天然CGL酵素)と比べた場合に、特定の同一性パーセンテージを有すると特徴付けることができる。例えば、未改変CGL酵素は、天然の霊長類シスタチオナーゼ(すなわち、シスタチオニン-γ-リアーゼ)であってよい。改変CGL酵素の未改変部分(すなわち、SEQ ID NO: 1～5のアミノ酸51位、55位、59位、91位、163位、189位、193位、200位、234位、311位、336位、339位、および/または353位における任意の置換を除く、改変CGL酵素の配列。図1を参照されたい)と天然CGL酵素との同一性パーセンテージは、少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％(またはその中で導き出せる任意の範囲)であってよい。上記の同一性パーセントは、対応する天然酵素の未改変領域と比べた、ある酵素の特定の改変領域に関する場合があることも企図される。例えば、改変CGL酵素は、改変されるかまたは変異した基質認識部位を含んでよく、この部位は、該改変されるかまたは変異した基質認識部位のアミノ酸配列の、同じ種または別の種に由来する未改変または天然のCGL酵素のアミノ酸配列に対する同一性に基づいて特徴付けることができる。例えば、ある改変ヒトCGL酵素が、未改変ヒトCGL酵素に対して少なくとも90％の同一性を有すると特徴付けられることは、該改変ヒトCGL酵素中のアミノ酸の少なくとも90％が該未改変ヒトCGL酵素中のアミノ酸と同一であることを意味する。
【0018】
改変CGL酵素は、異種ペプチド配列または多糖に連結することができる。例えば、改変CGL酵素は、融合タンパク質として、異種ペプチド配列に連結されてよい。改変CGL酵素は、インビボ半減期を延ばすために、IgG Fc、アルブミン、アルブミン結合ペプチド、またはXTENポリペプチドなどのアミノ酸配列に連結されてよい。改変CGL酵素は、ポリシアル酸ポリマーに連結されてよい。
【0019】
血清中での持続性を高めるために、改変CGL酵素を1つまたは複数のポリエーテル分子に連結してよい。ポリエーテルは、ポリエチレングリコール(PEG)であってよい。改変CGL酵素は、リジンまたはシステインなどの特定のアミノ酸残基を介してPEGに連結されてよい。治療的投与の場合、改変CGL酵素はしたがって、薬学的に許容される担体に分散されてよい。
【0020】
改変CGL酵素をコードする核酸が企図される。この核酸を、大腸菌(E. coli)のような細菌における発現のためにコドン最適化することができる。SEQ ID NO: 6～20に提供される改変CGL酵素を大腸菌において発現させるためにコドン最適化されている核酸が、SEQ ID NO: 96～110にそれぞれ提供される。あるいは、この核酸を、真菌(例えば酵母)、昆虫、または哺乳動物における発現のためにコドン最適化することもできる。さらに、このような核酸を含むベクター、例えば発現ベクターも企図される。改変CGL酵素をコードする核酸を、限定されるわけではないが異種プロモーターを含むプロモーターに機能的に連結することができる。改変CGL酵素は、ベクター(例えば遺伝子冶療ベクター)によって標的細胞に送達されてよい。このようなベクターは、改変CGLをコードする核酸を標的細胞において発現させることができるように、組換えDNA技術によって改変されていてよい。これらのベクターは、非ウイルス(例えばプラスミド)またはウイルス(例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、もしくはワクシニアウイルス)起源のベクターに由来してよい。非ウイルスベクターは、DNAが細胞膜を通過して入るのを容易にする作用物質との複合体にしてよい。このような非ウイルスベクター複合体の例には、DNAの凝縮を促進するポリカチオン物質と脂質ベースの送達系とを含む製剤が含まれる。脂質ベースの送達系には、リポソームベースの核酸送達が含まれる。
【0021】
このようなベクターを含む宿主細胞が提供される。宿主細胞は、細菌(例えば大腸菌)、真菌細胞(例えば酵母)、昆虫細胞、または哺乳動物細胞であってよい。
【0022】
ベクターを、改変CGL酵素を発現させるための宿主細胞に導入することができる。改変CGL酵素は、任意の適切な様式で発現されてよい。改変CGL酵素は、そのタンパク質がグリコシル化されるように、宿主細胞において発現されてよい。あるいは、改変CGL酵素は、そのタンパク質が非グリコシル化されるように、宿主細胞において発現されてもよい。
【0023】
改変CGL酵素および薬学的に許容される担体を含む治療的製剤が、提供される。治療的製剤は、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、輸注により、持続輸注により、カテーテルを介して、脂質組成物(例えばリポソーム)中に入れて、投与することができる。
【0024】
シスチン尿症に罹患しているかまたは発症するリスクがある対象を治療するための方法が提供され、これらの方法は、天然の霊長類CGLアミノ酸配列(SEQ ID NO: 1～5を参照されたい)と比べて少なくとも1つの置換を有する単離された改変霊長類CGL酵素または該単離された改変霊長類CGL酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、を含む製剤の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。該単離された改変霊長類CGL酵素は、SEQ ID NO: 6～95のいずれか1つに記載の配列を有してよい。これらの方法は、対象の血漿、血清、および/または尿中のシステインおよび/またはシスチンのレベルを低くすることができる。
【0025】
対象は、任意の動物、例えばマウスであってよい。例えば、対象は、哺乳動物、げっ歯動物、霊長類、またはヒト患者であってよい。対象または患者は、説明した組成物を用いて治療されることと組み合わせて、L-シスチン/システインを制限された食事、メチオニンを制限された食事、または普通の食事で維持されてよい。
【0026】
対象は、以前にシスチン尿症の治療を受けたことがあってよい。CGL酵素は、シスチン尿症の再発を治療するかもしくは和らげるか、またはシスチン尿症に関連する1種もしくは複数種の状態および/もしくは症状を改善するために投与される。これらの方法はまた、少なくとも1つの第2の治療法、例えば、食事の変更、栄養療法、および衝撃波療法などの第2のシスチン尿症治療法を対象に施す段階も含んでよい。これらの方法は、対象の尿路、腎臓、および/または膀胱の中のシスチン結石体積またはシスチン結石数を減らすことができる。これらの方法は、対象の尿路、腎臓、および/または膀胱におけるシスチン結石の形成を予防することができる。これらの方法は、対象の尿中のシスチン結晶数を減らすことができる。これらの方法は、対象の尿におけるシスチン結晶の形成を予防することができる。
【0027】
したがって、シスチン尿症に罹患している患者においてシスチン結石の形成を予防するための方法が提供され、これらの方法は、天然の霊長類CGLアミノ酸配列(SEQ ID NO: 1～5を参照されたい)と比べて少なくとも1つの置換を有する単離された改変霊長類CGL酵素または該単離された改変霊長類CGL酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、を含む製剤の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。該単離された改変霊長類CGL酵素は、SEQ ID NO: 6～95のいずれか1つに記載の配列を有してよい。これらの方法は、患者の腎臓および/または膀胱におけるシスチン結石の形成を予防することができる。
【0028】
改変CGL酵素または改変CGL酵素をコードする核酸を含む組成物が、対象のシスチン尿症を治療する際に使用するために提供される。シスチン尿症患者に治療適用するための医薬の製造における、単離もしくは改変したCGL酵素、改変CGL酵素をコードする核酸、または該改変CGL酵素を含む組成物の使用が、提供される。改変CGL酵素は、本明細書において開示する任意の改変CGL酵素であってよい。
【0029】
以下もまた、本明細書において提供される。
１．
天然のヒトCGLアミノ酸配列(SEQ ID NO: 1)と比べて少なくとも以下の置換を含む、単離された改変霊長類シスタチオニン-γ-リアーゼ(CGL)酵素であって、該改変酵素がシスチナーゼ活性とシステイナーゼ活性の両方を有し、該置換が以下：
(a)193位のアラニン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(b)200位のプロリン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(c)193位のアラニン、200位のプロリン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(d)55位のグルタミン酸、59位のトレオニン、91位のメチオニン、234位のリジン、336位のアスパラギン酸、および339位のバリン；
(e)55位のグルタミン酸、59位のトレオニン、91位のセリン、234位のリジン、336位のアスパラギン酸、および339位のバリン；
(f)189位のセリン、193位のグリシン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(g)163位のアルギニン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(h)51位のトリプトファン、55位のグルタミン酸、59位のトレオニン、336位のアスパラギン酸、および339位のバリン；
(i)55位のグルタミン酸、193位のアラニン、311位のグリシン、336位のアスパラギン酸、339位のバリン、および353位のセリン；
(j)200位のヒスチジン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(k)311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(l)59位のイソロイシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(m)91位のメチオニンおよび339位のバリン；ならびに
(n)339位のバリンおよび353位のセリン
からなる群より選択される、単離された改変霊長類シスタチオニン-γ-リアーゼ(CGL)酵素。
２．
改変CGL酵素が改変スマトラオランウータン(Pongo abelii)CGL酵素である、局面1の単離された改変CGL酵素。
３．
改変スマトラオランウータンCGL酵素が、以下：
(a)P193A、T311G、E339V、およびV353S；
(b)A200P、T311G、E339V、およびV353S；
(c)P193A、A200P、T311G、E339V、およびV353S；
(d)H55E、V59T、L91M、N234K、T336D、およびE339V；
(e)H55E、V59T、L91S、N234K、T336D、およびE339V；
(f)T189S、P193G、T311G、E339V、およびV353S；
(g)T163R、T311G、E339V、およびV353S；
(h)A51W、H55E、V59T、T336D、およびE339V；
(i)H55E、P193A、T311G、T336D、E339V、およびV353S；
(j)A200H、T311G、E339V、およびV353S；
(k)T311G、E339V、およびV353S；
(l)V59I、E339V、およびV353S；
(m)L91MおよびE339V；ならびに
(n)E339VおよびV353S
からなる群より選択される置換を含む、局面2の単離された改変CGL酵素。
４．
改変CGL酵素が、改変ヒトCGL酵素、改変チンパンジー(Pan troglodytes)CGL酵素、または改変ボノボ(Pan paniscus)CGL酵素である、局面1の単離された改変CGL酵素。
５．
改変ヒトCGL酵素、改変チンパンジーCGL酵素、または改変ボノボCGL酵素が、以下：
(a)P193A、T311G、E339V、およびI353S；
(b)A200P、T311G、E339V、およびI353S；
(c)P193A、A200P、T311G、E339V、およびI353S；
(d)H55E、E59T、L91M、N234K、T336D、およびE339V；
(e)H55E、E59T、L91S、N234K、T336D、およびE339V；
(f)T189S、P193G、T311G、E339V、およびI353S；
(g)T163R、T311G、E339V、およびI353S；
(h)A51W、H55E、E59T、T336D、およびE339V；
(i)H55E、P193A、T311G、T336D、E339V、およびI353S；
(j)A200H、T311G、E339V、およびI353S；
(k)T311G、E339V、およびI353S；
(l)E59I、E339V、およびI353S；
(m)L91MおよびE339V；ならびに
(n)E339VおよびI353S
からなる群より選択される置換を含む、局面4の単離された改変CGL酵素。
６．
改変CGL酵素が改変カニクイザル(Macaca fascicularis)CGL酵素である、局面1の単離された改変CGL酵素。
７．
改変カニクイザルCGL酵素が、以下：
(a)P193A、T311G、E339V、およびI353S；
(b)A200P、T311G、E339V、およびI353S；
(c)P193A、A200P、T311G、E339V、およびI353S；
(d)H55E、E59T、L91M、N234K、T336D、およびE339V；
(e)H55E、E59T、L91S、N234K、T336D、およびE339V；
(f)T189S、P193G、T311G、E339V、およびI353S；
(g)V163R、T311G、E339V、およびI353S；
(h)A51W、H55E、E59T、T336D、およびE339V；
(i)H55E、P193A、T311G、T336D、E339V、およびI353S；
(j)A200H、T311G、E339V、およびI353S；
(k)T311G、E339V、およびI353S；
(l)E59I、E339V、およびI353S；
(m)L91MおよびE339V；ならびに
(n)E339VおよびI353S
からなる群より選択される置換を含む、局面6の単離された改変CGL酵素。
８．
異種ペプチドセグメントまたは多糖類をさらに含む、局面1～7のいずれかの単離された改変CGL酵素。
９．
異種ペプチドセグメントが、XTENペプチド、IgG Fc、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチドである、局面8の単離された改変CGL酵素。
１０．
多糖類がポリシアル酸ポリマーを含む、局面8の単離された改変CGL酵素。
１１．
ポリエチレングリコール(PEG)に結合されている、局面1～10のいずれかの単離された改変CGL酵素。
１２．
1つまたは複数のリジン残基を介してPEGに結合されている、局面11の単離された改変CGL酵素。
１３．
局面1～7のいずれかの酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
１４．
細菌、真菌、昆虫、または哺乳動物における発現のためにコドン最適化されている、局面13の核酸。
１５．
細菌が大腸菌(E. coli)である、局面14の核酸。
１６．
SEQ ID NO: 81～95のうちの1つに記載の配列を含む、局面15の核酸。
１７．
局面13～16のいずれかの核酸を含む、発現ベクター。
１８．
局面13～16のいずれかの核酸を含む、宿主細胞。
１９．
細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、局面18の宿主細胞。
２０．
薬学的に許容される担体中に局面1～12のいずれかの酵素または局面13～16のいずれかの核酸を含む、治療的製剤。
２１．
シスチン尿症に罹患しているかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、局面20の製剤の治療的有効量を該対象に投与する段階を含む、方法。
２２．
前記対象がL-シスチンおよび/またはL-システインを制限された食事で維持される、局面21の方法。
２３．
前記対象がメチオニンを制限された食事で維持される、局面21の方法。
２４．
前記対象が普通の食事で維持される、局面21の方法。
２５．
前記対象がヒト患者である、局面21の方法。
２６．
前記製剤が、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、筋肉内に、血管内に、皮下に、注射により、輸注により、持続輸注により、またはカテーテルを介して投与される、局面21の方法。
２７．
前記対象が、以前にシスチン尿症の治療を受けたことがあり、前記酵素が、シスチン尿症の再発を予防するために投与される、局面21の方法。
２８．
少なくとも第2のシスチン尿症治療法を前記対象に施す段階をさらに含む、局面21の方法。
２９．
第2のシスチン尿症治療法が外科的療法または衝撃波療法である、局面28の方法。
３０．
第2のシスチン尿症治療法が、重炭酸塩、トリス-ヒドロキシメチレン-アミノメタン(トロメタミン-E)、アセチルシステイン、D-ペニシラミン、α-メルカプトプロピオニルグリシン、およびカプトプリルからなる群より選択される作用物質または薬物を含む、局面28の方法。
３１．
前記対象の血漿および/または血清中のシステインおよび/またはシスチンのレベルを低下させる、局面21の方法。
３２．
前記対象の尿中のシステインおよび/またはシスチンのレベルを低下させる、局面21の方法。
３３．
前記対象の尿路におけるシスチン結石の形成を予防する、局面21の方法。
３４．
前記対象の腎臓におけるシスチン結石の形成を予防する、局面21の方法。
３５．
前記対象の腎臓中のシスチン結石の数を減らす、局面1の方法。
３６．
シスチン尿症患者に治療適用するための医薬を製造するための、局面1～12のいずれかの単離もしくは改変されたCGL酵素または該改変CGL酵素を含む組成物の使用。
１．
天然のヒトCGLアミノ酸配列(SEQ ID NO: 1)と比べて少なくとも以下の置換を含む、単離された改変霊長類シスタチオニン-γ-リアーゼ(CGL)酵素であって、該改変酵素がシスチナーゼ活性とシステイナーゼ活性の両方を有し、該置換が以下：
(a)193位のアラニン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(b)200位のプロリン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(c)193位のアラニン、200位のプロリン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(d)55位のグルタミン酸、59位のトレオニン、91位のメチオニン、234位のリジン、336位のアスパラギン酸、および339位のバリン；
(e)55位のグルタミン酸、59位のトレオニン、91位のセリン、234位のリジン、336位のアスパラギン酸、および339位のバリン；
(f)189位のセリン、193位のグリシン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(g)163位のアルギニン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(h)51位のトリプトファン、55位のグルタミン酸、59位のトレオニン、336位のアスパラギン酸、および339位のバリン；
(i)55位のグルタミン酸、193位のアラニン、311位のグリシン、336位のアスパラギン酸、339位のバリン、および353位のセリン；
(j)200位のヒスチジン、311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(k)311位のグリシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(l)59位のイソロイシン、339位のバリン、および353位のセリン；
(m)91位のメチオニンおよび339位のバリン；ならびに
(n)339位のバリンおよび353位のセリン
からなる群より選択される、単離された改変霊長類シスタチオニン-γ-リアーゼ(CGL)酵素。
２．
改変CGL酵素が改変スマトラオランウータン(Pongo abelii)CGL酵素である、局面1の単離された改変CGL酵素。
３．
改変スマトラオランウータンCGL酵素が、以下：
(a)P193A、T311G、E339V、およびV353S；
(b)A200P、T311G、E339V、およびV353S；
(c)P193A、A200P、T311G、E339V、およびV353S；
(d)H55E、V59T、L91M、N234K、T336D、およびE339V；
(e)H55E、V59T、L91S、N234K、T336D、およびE339V；
(f)T189S、P193G、T311G、E339V、およびV353S；
(g)T163R、T311G、E339V、およびV353S；
(h)A51W、H55E、V59T、T336D、およびE339V；
(i)H55E、P193A、T311G、T336D、E339V、およびV353S；
(j)A200H、T311G、E339V、およびV353S；
(k)T311G、E339V、およびV353S；
(l)V59I、E339V、およびV353S；
(m)L91MおよびE339V；ならびに
(n)E339VおよびV353S
からなる群より選択される置換を含む、局面2の単離された改変CGL酵素。
４．
改変CGL酵素が、改変ヒトCGL酵素、改変チンパンジー(Pan troglodytes)CGL酵素、または改変ボノボ(Pan paniscus)CGL酵素である、局面1の単離された改変CGL酵素。
５．
改変ヒトCGL酵素、改変チンパンジーCGL酵素、または改変ボノボCGL酵素が、以下：
(a)P193A、T311G、E339V、およびI353S；
(b)A200P、T311G、E339V、およびI353S；
(c)P193A、A200P、T311G、E339V、およびI353S；
(d)H55E、E59T、L91M、N234K、T336D、およびE339V；
(e)H55E、E59T、L91S、N234K、T336D、およびE339V；
(f)T189S、P193G、T311G、E339V、およびI353S；
(g)T163R、T311G、E339V、およびI353S；
(h)A51W、H55E、E59T、T336D、およびE339V；
(i)H55E、P193A、T311G、T336D、E339V、およびI353S；
(j)A200H、T311G、E339V、およびI353S；
(k)T311G、E339V、およびI353S；
(l)E59I、E339V、およびI353S；
(m)L91MおよびE339V；ならびに
(n)E339VおよびI353S
からなる群より選択される置換を含む、局面4の単離された改変CGL酵素。
６．
改変CGL酵素が改変カニクイザル(Macaca fascicularis)CGL酵素である、局面1の単離された改変CGL酵素。
７．
改変カニクイザルCGL酵素が、以下：
(a)P193A、T311G、E339V、およびI353S；
(b)A200P、T311G、E339V、およびI353S；
(c)P193A、A200P、T311G、E339V、およびI353S；
(d)H55E、E59T、L91M、N234K、T336D、およびE339V；
(e)H55E、E59T、L91S、N234K、T336D、およびE339V；
(f)T189S、P193G、T311G、E339V、およびI353S；
(g)V163R、T311G、E339V、およびI353S；
(h)A51W、H55E、E59T、T336D、およびE339V；
(i)H55E、P193A、T311G、T336D、E339V、およびI353S；
(j)A200H、T311G、E339V、およびI353S；
(k)T311G、E339V、およびI353S；
(l)E59I、E339V、およびI353S；
(m)L91MおよびE339V；ならびに
(n)E339VおよびI353S
からなる群より選択される置換を含む、局面6の単離された改変CGL酵素。
８．
異種ペプチドセグメントまたは多糖類をさらに含む、局面1～7のいずれかの単離された改変CGL酵素。
９．
異種ペプチドセグメントが、XTENペプチド、IgG Fc、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチドである、局面8の単離された改変CGL酵素。
１０．
多糖類がポリシアル酸ポリマーを含む、局面8の単離された改変CGL酵素。
１１．
ポリエチレングリコール(PEG)に結合されている、局面1～10のいずれかの単離された改変CGL酵素。
１２．
1つまたは複数のリジン残基を介してPEGに結合されている、局面11の単離された改変CGL酵素。
１３．
局面1～7のいずれかの酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
１４．
細菌、真菌、昆虫、または哺乳動物における発現のためにコドン最適化されている、局面13の核酸。
１５．
細菌が大腸菌(E. coli)である、局面14の核酸。
１６．
SEQ ID NO: 81～95のうちの1つに記載の配列を含む、局面15の核酸。
１７．
局面13～16のいずれかの核酸を含む、発現ベクター。
１８．
局面13～16のいずれかの核酸を含む、宿主細胞。
１９．
細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、局面18の宿主細胞。
２０．
薬学的に許容される担体中に局面1～12のいずれかの酵素または局面13～16のいずれかの核酸を含む、治療的製剤。
２１．
シスチン尿症に罹患しているかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、局面20の製剤の治療的有効量を該対象に投与する段階を含む、方法。
２２．
前記対象がL-シスチンおよび/またはL-システインを制限された食事で維持される、局面21の方法。
２３．
前記対象がメチオニンを制限された食事で維持される、局面21の方法。
２４．
前記対象が普通の食事で維持される、局面21の方法。
２５．
前記対象がヒト患者である、局面21の方法。
２６．
前記製剤が、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、筋肉内に、血管内に、皮下に、注射により、輸注により、持続輸注により、またはカテーテルを介して投与される、局面21の方法。
２７．
前記対象が、以前にシスチン尿症の治療を受けたことがあり、前記酵素が、シスチン尿症の再発を予防するために投与される、局面21の方法。
２８．
少なくとも第2のシスチン尿症治療法を前記対象に施す段階をさらに含む、局面21の方法。
２９．
第2のシスチン尿症治療法が外科的療法または衝撃波療法である、局面28の方法。
３０．
第2のシスチン尿症治療法が、重炭酸塩、トリス-ヒドロキシメチレン-アミノメタン(トロメタミン-E)、アセチルシステイン、D-ペニシラミン、α-メルカプトプロピオニルグリシン、およびカプトプリルからなる群より選択される作用物質または薬物を含む、局面28の方法。
３１．
前記対象の血漿および/または血清中のシステインおよび/またはシスチンのレベルを低下させる、局面21の方法。
３２．
前記対象の尿中のシステインおよび/またはシスチンのレベルを低下させる、局面21の方法。
３３．
前記対象の尿路におけるシスチン結石の形成を予防する、局面21の方法。
３４．
前記対象の腎臓におけるシスチン結石の形成を予防する、局面21の方法。
３５．
前記対象の腎臓中のシスチン結石の数を減らす、局面1の方法。
３６．
シスチン尿症患者に治療適用するための医薬を製造するための、局面1～12のいずれかの単離もしくは改変されたCGL酵素または該改変CGL酵素を含む組成物の使用。
【0030】
本明細書において使用される場合、核酸に関する用語「コードする」または「コードしている」は、本発明を当業者が容易に理解できるようにするために使用される。しかし、これらの用語は、それぞれ「含む」または「含んでいる」と同義的に使用されてよい。
【0031】
本明細書において使用される場合、指定された構成成分の観点から「本質的に含まない」とは、該指定された構成成分が全く組成物に意図的に配合されていないこと、かつ/または混入物としてもしくは極微量にのみ存在することを意味するために本明細書において使用される。したがって、組成物に対する何らかの意図的でない混入に起因する該指定された構成成分の総量は、0.05％を十分に下回る、好ましくは0.01％未満である。該指定された構成成分が標準的分析方法によって検出できない量である組成物が、最も好ましい。
【0032】
本明細書において文中で使用される場合、「1つの(a)」または「1つの(an)」は、1つまたは複数を意味し得る。本明細書の特許請求の範囲において使用されるように、単語「含む(comprising)」と組み合わせて使用される場合、単語「1つの(a)」または「1つの(an)」は、1つまたは複数を意味し得る。
【0033】
特許請求の範囲における用語「または(or)」の使用は、代替案のみを指すと明瞭に示されない限り、または代替案が相互に排他的でない限り、「および/または(and/or)」を意味するために使用されるが、本開示は、代替案のみおよび「および/または」を指すという定義を支持する。本明細書において使用される場合、 「別の(another)」とは、少なくとも2つ目またはそれ以降を意味し得る。
【0034】
本明細書において使用される場合、用語「約(about)」は、当業者によって理解され、使用される文脈に応じてある程度変わる。通常、「約」は、基準とされる値から±10％である値の範囲を包含する。
【図面の簡単な説明】
【0035】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、説明される方法、化合物、および組成物をさらに例示するために含まれる。
【図1】SEQ ID NO: 1～5の配列アラインメント。アスタリスクは、様々な改変CGL酵素における操作された位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【0036】
詳細な説明
システインは、必須アミノ酸L-メチオニンに由来するホモシステインから硫黄転移経路によって合成され得るため、非必須アミノ酸とみなされる。この経路は、酵素シスタチオニン-β-シンターゼ(CBS)およびシスタチオニン-γ-リアーゼ(CGL)を含む。したがって、L-シスチン/システインの枯渇は、完全な硫黄転移経路を有する正常組織にとっては比較的非毒性であると予想される。少ない投与量の使用を場合によっては可能にする、高いkcat/KMでL-シスチン/システインを分解する操作された治療的酵素が提供される。該酵素を用いてシスチン尿症を治療する方法もまた、提供される。
システインは、必須アミノ酸L-メチオニンに由来するホモシステインから硫黄転移経路によって合成され得るため、非必須アミノ酸とみなされる。この経路は、酵素シスタチオニン-β-シンターゼ(CBS)およびシスタチオニン-γ-リアーゼ(CGL)を含む。したがって、L-シスチン/システインの枯渇は、完全な硫黄転移経路を有する正常組織にとっては比較的非毒性であると予想される。少ない投与量の使用を場合によっては可能にする、高いkcat/KMでL-シスチン/システインを分解する操作された治療的酵素が提供される。該酵素を用いてシスチン尿症を治療する方法もまた、提供される。
【0037】
I 定義
本明細書において使用される場合、用語「酵素」ならびに「タンパク質」および「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸を含む化合物を意味し、同義的に使用される。
本明細書において使用される場合、用語「酵素」ならびに「タンパク質」および「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸を含む化合物を意味し、同義的に使用される。
【0038】
本明細書において使用される場合、用語「融合タンパク質」は、天然ではない方式で機能的に連結されたタンパク質またはタンパク質断片を含むキメラタンパク質を意味する。
【0039】
本明細書において使用される場合、用語「半減期」(1/2減少期)とは、例えば哺乳動物への注射後に、あるポリペプチドの濃度がインビトロ(すなわち細胞培養培地中で測定された場合)またはインビボ(すなわち血清中で測定された場合)で半分まで減少するのに必要とされると思われる時間を意味する。「半減期」を測定するための方法は、ELISA形式で使用されるCGLまたはPEGに特異的な抗体の使用を含み、タンパク質の物理量が時間の関数として測定される。半減期を測定することと密接に関係のある他の方法は、L-シスチン/システインの変換の結果として生じる任意の基質の生成を検出する任意のアッセイ法、例えば、試薬3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)を用いた誘導体化後に生じる反応生成物ピルビン酸の検出によって、酵素薬物の触媒活性を時間の関数として測定することを含む。
【0040】
用語「機能的な組合せで」、「機能的な順序で」、および「機能的に連結される」とは、そのように記載された構成成分が、意図された様式でそれらが機能するのを可能にする関係にある結合を意味する。例えば、ある核酸分子が所与の遺伝子の転写および/もしくは所望のタンパク質分子の合成を指示できるような様式の核酸配列の結合、または融合タンパク質が産生されるような様式のアミノ酸配列の結合である。
【0041】
用語「リンカー」は、2つの異なる分子を機能的に連結する分子架橋の役割を果たす化合物または部分を指すことを意図しており、その際、リンカーの1つの部分が第1の分子に機能的に連結され、該リンカーの別の部分が第2の分子に機能的に連結されている。
【0042】
用語「PEG化された」は、高度な生体適合性および修飾の容易さから薬物担体として広く使用されているポリエチレングリコール(PEG)との結合を意味する。PEGは、化学的方法によってPEG鎖の末端のヒドロキシ基を介して活性物質に結合(例えば共有結合的に連結)され得る。しかし、PEGそれ自体は、1分子につき最大で2個の活性物質に限定される。別のアプローチでは、PEGとアミノ酸の共重合体が新規の生体材料として調査されている。この生体材料は、PEGの生体適合性を保持すると思われるが、1分子当たりの結合箇所が多数あるという付加的な利点を有すると思われ(したがって、より多くの薬物を搭載する)、かつ様々な用途に合うように合成によって設計することができる。
【0043】
用語「遺伝子」は、ポリペプチドまたはその前駆体の産生に必要な制御配列およびコード配列を含むDNA配列を意味する。ポリペプチドは、完全長のコード配列によって、または所望の酵素活性が保持されるような、コード配列の任意の部分によって、コードされてよい。
【0044】
用語「天然の」は、天然に存在する供給源から単離された場合の、典型的形態もしくは野生型形態の遺伝子、遺伝子産物、または該遺伝子もしくは遺伝子産物の特徴を指す。対照的に、用語「改変された」、「変種」、「ムテイン」、または「変異体」は、天然の遺伝子または遺伝子産物と比べた場合に配列および機能的特性の改変(すなわち、変化した特徴)を示す遺伝子または遺伝子産物を意味し、その際、改変された遺伝子または遺伝子産物は、遺伝子操作されており、天然には存在も発生もしない。
【0045】
用語「ベクター」は、核酸配列を複製できる場となる細胞中に導入するために該核酸配列を挿入することができる運搬体核酸分子を意味するために使用される。核酸配列は「外因性」であってよい。「外因性」とは、ベクターが導入される細胞にとって該配列が外来であること、または該配列が、細胞中のある配列と相同であるものの通常は該配列が存在しない宿主細胞核酸内の位置にあることを意味する。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス)、ならびに人工染色体(例えばYAC)が含まれる。当業者には、標準的な組換え技術(例えば、Maniatis et al., 1988およびAusubel et al., 1994を参照されたい。どちらも参照により本明細書に組み入れられる)を用いてベクターを構築する能力が充分に備わっていると思われる。
【0046】
用語「発現ベクター」とは、RNAをコードする転写可能な核酸を含む任意のタイプの遺伝子構築物を意味する。いくつかの場合において、RNA分子は、次いでタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合において、例えばアンチセンス分子またはリボザイムを生じる際には、これらの配列は翻訳されない。発現ベクターは、様々な「制御配列」を含むことができる。「制御配列」とは、機能的に連結されたコード配列を特定の宿主細胞において転写、場合によっては翻訳するのに必要な核酸配列を意味する。転写および翻訳を管理する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能を果たす核酸配列もまた含んでよい。
【0047】
本明細書で使用される用語「治療的有効量」は、治療的効果を得る、すなわち、患者の血液循環中のL-シスチン/システインを約0～15μmol/Lのレベルまで激減させるための方法において使用される治療的組成物(すなわち、改変CGL酵素またはそのような酵素をコードする核酸)の量を意味する。本出願の全体を通して使用される用語「治療恩恵」または「治療的に有効な」とは、この状態の医学的治療に関する、対象の健康を促進または増進する任意のものを意味する。これには、疾患の徴候または症状の頻度または重症度の低減が含まれるが、それに限定されるわけではない。例えば、シスチン尿症の治療は、尿中のシスチンの濃度を下げること、シスチン結石を小さくすること、シスチン結石を消失させること、またはシスチン結石の形成を予防することを含んでよい。治療的組成物を投与するための投与量範囲は、シスチン尿症の症状が軽減される所望の効果をもたらすのに十分な大きさの範囲である。例えば、治療的組成物の治療的有効量は、生理学的に許容される組成物の形態で投与された場合に、改変CGL酵素が約0.001～約100単位(U)/mL、好ましくは約0.1U/mLを上回る、およびより好ましくは1U/mLを上回る血管内(血漿)濃度に達するのに十分であるような量であってよい。典型的な投与量は、体重に基づいて投与することができ、約1～100U/キログラム(kg)/日、好ましくは約2～25U/kg/日、およびより好ましくは約2～8U/kg/日の範囲の量である。例示的な量は、5U/kg/日または35U/kg/週であることができる。正常なヒト血清L-シスチン/システインレベルは、約200μMである。シスチン尿症患者では、腎臓でのシスチン再吸収がないため、血清L-シスチン/システインレベルは約半分に低下しており、投与量は、約0～10μMの血清L-シスチン/システインレベルを得るように投与されるであろう。投与量は、過粘稠度症候群、肺水腫、およびうっ血性心不全などの有害な副作用を引き起こすほどに多いべきではない。通常、投与量は、患者の年齢、状態、性別、および疾患の程度によって変動し、当業者が決定することができる。何らかの合併症が万一発生したら、個々の医師が投与量を調整してよい。該投与量は、約12～24時間で対象の血清中のL-シスチン/システイン含有量を少なくとも50％、少なくとも60％、および少なくとも70％減少させるべきである。該投与量は、6時間で対象の血清中のL-シスチン/システイン含有量を少なくとも50％～70％減少させ得る。
【0048】
本明細書で使用される用語「KM」は、酵素のミカエリス・メンテン定数を指す。これは、ある酵素触媒反応において所与の酵素が最高速度の半分の速度を示す、特異的基質の濃度と定義される。本明細書で使用される用語「kcat」は、代謝回転数、すなわち酵素が最大効率で作用しているときの、各酵素部位が単位時間当たりに生成物に変換する基質分子の数を指す。本明細書で使用される用語「kcat/KM」は、特異性定数であり、酵素が基質を生成物に変換する効率の指標である。
【0049】
用語「シスタチオニン-γ-リアーゼ」(CGLまたはシスタチオナーゼ)は、シスタチオニンをγ脱離してシステインにする反応を触媒する任意の酵素を意味する。本明細書において使用される場合、この用語は、ヒト型のシスタチオニン-γ-リアーゼを含む、霊長類型のシスタチオニン-γ-リアーゼ(またはシスタチオニン-γ-リアーゼ)も意図する。
【0050】
「治療」および「治療すること」とは、疾患または健康に関係した状態についての治療恩恵を得るための、対象への治療物質の投与もしくは適用、または対象に対する処置もしくはモダリティの実施を意味する。例えば、治療は、血清L-シスチン/システインレベルを低下させるために治療的有効量の改変CGL酵素を投与することを含む。
【0051】
「対象」および「患者」は、ヒト、または霊長類、哺乳動物、および脊椎動物などの非ヒトのいずれかを意味する。
【0052】
II シスタチオニン-γ-リアーゼ
リアーゼは、様々な化学結合の切断を触媒して、新たな二重結合または新たな環構造をしばしば形成させる酵素である。例えば、この反応を触媒した酵素はリアーゼであると思われる:ATP→cAMP+PPi。ある種のリアーゼは、1つの基質しか必要としない。例えば、シスタチオニン-γ-リアーゼは、L-シスタチオニンをL-システイン、α-ケト酪酸、およびアンモニアに変換する。他のリアーゼはシンターゼとして公知であり、2つの基質を必要とする。例えば、シスタチオニン-β-シンターゼはセリンとホモシステインを縮合してシスタチオニンを形成させる。
リアーゼは、様々な化学結合の切断を触媒して、新たな二重結合または新たな環構造をしばしば形成させる酵素である。例えば、この反応を触媒した酵素はリアーゼであると思われる:ATP→cAMP+PPi。ある種のリアーゼは、1つの基質しか必要としない。例えば、シスタチオニン-γ-リアーゼは、L-シスタチオニンをL-システイン、α-ケト酪酸、およびアンモニアに変換する。他のリアーゼはシンターゼとして公知であり、2つの基質を必要とする。例えば、シスタチオニン-β-シンターゼはセリンとホモシステインを縮合してシスタチオニンを形成させる。
【0053】
いくつかのピリドキサル-5'-リン酸(PLP)依存性酵素が、システイン、ホモシステイン、およびメチオニンの代謝に関与しており、これらの酵素は、システイン/メチオニン(Cys/Met)代謝PLP依存性酵素と呼ばれる進化的に関係のあるファミリーを形成している。これらの酵素は、約400個のアミノ酸からなるタンパク質であり、PLP基が、ポリペプチドの中央部位に位置するリジン残基と共に内部アルジミンを形成する。このファミリーのメンバーには、シスタチオニン-γ-リアーゼ(CGL)、シスタチオニン-γ-シンターゼ(CGS)、シスタチオニン-β-リアーゼ(CBL)、メチオニンγ-リアーゼ(MGL)、およびO-アセチルホモセリン(OAH)/O-アセチル-セリン(OAS)スルフヒドリラーゼ(OSHS)が含まれる。すべてのPLP依存性酵素に共通であるのは、ミカエリス複合体の形成、それに続く基質のトランスアルジミネーション、それによる外アルジミンの形成である。その後の反応過程は、個々の酵素の基質特異性によって決まる。
【0054】
例えば、本発明者らは、PLP依存性リアーゼファミリーのメンバーであるシスタチオニン-γ-リアーゼに特定の変異を導入して、その基質特異性を変更した。このようにして、L-シスチンとL-システインの両方を分解する能力が増強された変種を作製した。新規なL-シスチン/システイン分解活性を得るための、他のPLP依存性酵素の改変もまた、企図されてよい。
【0055】
CGLは、哺乳動物の硫黄転移経路の最終段階を触媒する四量体である(Rao et al., 1990)。CGLは、L-シスタチオニンの、L-システイン、α-ケト酪酸、およびアンモニアへの変換を触媒する。ピリドキサールリン酸は、この酵素の補欠分子団である。タンパク質工学を用いて、L-システインおよびL-シスチンを分解するための弱い活性しか持たないCGLを、L-システインおよびL-シスチンを高速で分解できる酵素に変換した(その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第9,481,877号)。
【0056】
III シスチナーゼ/システイナーゼの遺伝子操作
非ヒトタンパク質治療物質の使用に伴い、望まれない免疫原性作用が臨床的に認められるため、治療的に重要なL-シスチンおよびL-システイン分解活性をヒト酵素に遺伝子工学的に加える(すなわち、L-シスチンとL-システインの両方に対して大きなkcat値および小さなKM値を示し、かつこれら2種の基質に対して良好な特異性も示すL-シスチナーゼ/システイナーゼ酵素を遺伝子操作する)ことが望ましい。ヒトは、シスタチオニン-γ-リアーゼ(hCGL)と呼ばれる酵素を有しており、この酵素の機能は、哺乳動物の硫黄転移経路の最後の段階(Rao et al., 1990)、すなわちL-シスタチオニンをL-システイン、α-ケト酪酸、およびアンモニアに変換する段階を触媒することである。ヒトCGLはまた、L-システインおよびそのジスルフィド型であるL-シスチンを弱い力で分解できることから、操作するための理想的な候補となる。ランダム変異誘発アプローチと共に、構造的および系統学的に導かれた変異誘発を用いて、L-システインとL-シスチンの両方を効率的に加水分解するようにhCGL変種を遺伝子操作した。
非ヒトタンパク質治療物質の使用に伴い、望まれない免疫原性作用が臨床的に認められるため、治療的に重要なL-シスチンおよびL-システイン分解活性をヒト酵素に遺伝子工学的に加える(すなわち、L-シスチンとL-システインの両方に対して大きなkcat値および小さなKM値を示し、かつこれら2種の基質に対して良好な特異性も示すL-シスチナーゼ/システイナーゼ酵素を遺伝子操作する)ことが望ましい。ヒトは、シスタチオニン-γ-リアーゼ(hCGL)と呼ばれる酵素を有しており、この酵素の機能は、哺乳動物の硫黄転移経路の最後の段階(Rao et al., 1990)、すなわちL-シスタチオニンをL-システイン、α-ケト酪酸、およびアンモニアに変換する段階を触媒することである。ヒトCGLはまた、L-システインおよびそのジスルフィド型であるL-シスチンを弱い力で分解できることから、操作するための理想的な候補となる。ランダム変異誘発アプローチと共に、構造的および系統学的に導かれた変異誘発を用いて、L-システインとL-シスチンの両方を効率的に加水分解するようにhCGL変種を遺伝子操作した。
【0057】
未改変CGL酵素に類似する少なくとも1種の機能活性を示す改変CGL酵素が、説明される。改変CGL酵素には、例えば、未改変CGL酵素と比べて付加的な利点、例えばシスチナーゼ/システイナーゼ酵素活性を備えているタンパク質が含まれる。未改変のタンパク質またはポリペプチドは、ヒトシスタチオニン-γ-リアーゼのような天然シスタチオニン-γ-リアーゼであってよい。
【0058】
活性の測定は、当業者によく知られている、特にタンパク質活性に関するアッセイ法を用いて達成することができ、比較のために、例えば、天然型および/または組換え型の改変酵素または未改変酵素のいずれかの使用を含んでよい。例えば、野生型ヒトCGLは、L-システインをピルビン酸、アンモニア、およびH2Sにゆっくりと分解し、L-シスチンをピルビン酸、アンモニア、およびチオシステインに変換する(kcat/KMはそれぞれ約0.2s-1mM-1および約0.8s-1mM-1)。チオシステインは、非酵素的にL-システインおよびH2Sにさらに分解される。したがって、L-シスチン/システイン分解活性は、L-シスチンおよび/またはL-システインの分解の結果として生じる任意の基質の生成を検出する任意のアッセイ法、例えば、試薬3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)による誘導体化によって生じる反応生成物ピルビン酸の検出によって測定することができる(Takakura et al., 2004)。
【0059】
改変CGL酵素は、L-シスチン/システイン分解活性の上昇に基づいて同定することができる。例えば、未改変ポリペプチドの基質認識部位を同定することができる。この同定は、構造解析または相同性解析に基づいてよい。このような基質認識部位の改変を含む変異体の集団を作り出すことができる。L-シスチン/システイン分解活性が上昇した変異体を、変異体集団より選択することができる。所望の変異体の選択には、L-シスチン/システイン分解の副生成物または生成物を検出するための方法が含まれてよい。
【0060】
改変CGL酵素は、アミノ酸の欠失および/または置換を有してよく、したがって、欠失を有する酵素、置換を有する酵素、ならびに欠失および置換を有する酵素は、改変CGL酵素である。これらの改変CGL酵素は、挿入または付加されたアミノ酸、例えば、融合タンパク質またはリンカーを伴うタンパク質などをさらに含んでもよい。「改変欠失CGL酵素」は、天然酵素の1つまたは複数の残基を欠くが、該天然酵素の特異性および/または活性を有し得る。改変欠失CGL酵素はまた、低減した免疫原性または抗原性を有し得る。改変欠失CGL酵素の例は、少なくとも1つの抗原性領域からアミノ酸残基が欠失しているものである。抗原性領域とは、改変CGL酵素が投与される可能性があるタイプの生物のような特定の生物において抗原性であることが明らかになっている酵素領域である。
【0061】
置換CGL酵素変種または置き換えCGL酵素変種は、該タンパク質内の1つまたは複数の部位における、あるアミノ酸の別のアミノ酸への交換を含んでよく、該ポリペプチドの1つまたは複数の特性、特にそのエフェクター機能および/または生物学的利用能を調節するように設計されてよい。置換は、保存的でも保存的でなくてもよい。保存的とは、1つのアミノ酸が大きさおよび荷電が類似したアミノ酸で置き換えられていることである。保存的置換は当技術分野において周知であり、例えば、以下の変更が含まれる:アラニンからセリン;アルギニンからリジン;アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン;アスパラギン酸からグルタミン酸;システインからセリン;グルタミンからアスパラギン;グルタミン酸からアスパラギン酸;グリシンからプロリン;ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン;イソロイシンからロイシンまたはバリン;ロイシンからバリンまたはイソロイシン;リジンからアルギニン;メチオニンからロイシンまたはイソロイシン;フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニン;セリンからトレオニン;トレオニンからセリン;トリプトファンからチロシン;チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン;およびバリンからイソロイシンまたはロイシン。
【0062】
用語「生物学的機能等価物」は、当技術分野では十分に理解されており、さらに本明細書において詳細に定義する。したがって、SEQ ID NO: 1に対して約90％もしくはそれより大きな配列同一性を有するCGL酵素配列、またはさらに、本明細書において開示する改変CGL酵素のアミノ酸と同一もしくはその保存的置換であるアミノ酸のうちの約91％～約99％(92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、および99％を含む)を有するCGL酵素配列が、以下を条件として含まれる。すなわち、該酵素の生物活性が維持され、その結果、測定可能な生物活性パラメーター(例えば、L-シスチンおよび/またはL-システインからピルビン酸への変換)は、本明細書において開示する改変CGL酵素との差が約20％、約15％、約10％、または約5％以内であることを条件とする。改変CGL酵素は、その未改変対応物と生物学的機能が等価であり得る。
【0063】
タンパク質発現に関して言えば生物学的タンパク質活性の維持を含む前記基準を配列が満たす限りにおいて、アミノ酸配列および核酸配列は、付加的な残基、例えば、付加的なN末端アミノ酸もしくはC末端アミノ酸または5′配列もしくは3′配列を含んでよく、それでもなお、本質的には、本明細書において開示する配列のうちの1つに記載されるとおりである。末端配列の付加は、例えば、コード領域の5’部分もしくは3’部分のいずれかに隣接する様々な非コード配列を含み得る核酸配列または遺伝子内部に存在することが公知である様々な内部配列、すなわちイントロンを含み得る核酸配列に、特に適用される。
【0064】
IV 治療のための酵素的L-シスチン/システイン分解
シスチン尿症は、腎臓の近位尿細管のシスチンおよび二塩基性アミノ酸の輸送体をコードするSLC3A1遺伝子およびSLC7A9遺伝子の変異に起因し、シスチン(アミノ酸システインのジスルフィド型)の異常排泄およびシスチンの低溶解度に起因する尿路内でのシスチン結晶/結石の形成を引き起こす、遺伝性障害である。
シスチン尿症は、腎臓の近位尿細管のシスチンおよび二塩基性アミノ酸の輸送体をコードするSLC3A1遺伝子およびSLC7A9遺伝子の変異に起因し、シスチン(アミノ酸システインのジスルフィド型)の異常排泄およびシスチンの低溶解度に起因する尿路内でのシスチン結晶/結石の形成を引き起こす、遺伝性障害である。
【0065】
Slc7a9 ノックアウトマウス、Slc3a1ノックアウトマウス、D140G Slc3a1変異体マウス、およびE383K Slc3a1変異体マウスを含むいくつかのシスチン尿症マウスモデルが利用可能である(Feliubadalo et al., 2003; Ercolani et al., 2010; Peters et al., 2003; Livrozet et al., 2014。それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。129S2/SvPasCrlマウス由来のSlc3a1ゲノムDNAの配列解析により、129S2/SvPasCrlマウスのエクソン7におけるホモ接合性変異が明らかになった。A1232G点変異は、高度に保存された配列中のミスセンス変異(c.1232G>A)である。A1232Gミスセンス変異の結果として、383位のグルタミンでリジンが置換される(E383K)。この置換は、rBATの細胞外部分にあり、129S2/SvPasCrlマウスにおけるrBAT発現およびシスチン尿症の減少に関与している(Livrozet et al., 2014)。383位のグルタミンは、様々な種の間で高度に保存されている。
【0066】
シスチン尿症の患者は、生活の質が低く、シスチン結石形成のリスクが生涯続き、腎臓機能が損なわれ、しばしば、たび重なる外科的処置を必要とする。腎臓輸送体に欠陥があるため腎臓濾過時にシステインを再吸収できない遺伝性障害シスチン尿症に罹患している患者にとって、利用可能な治療物質はわずかしかない。アミノ酸L-システインのジスルフィド型であるシスチンは、著しく不溶性であり、シスチン尿症患者の尿路で高濃度に達し、結果としてシスチン結晶および結石を形成する。循環血中シスチンレベルを低下させる既存の治療法は、尿路結石形成をある程度は予防するが、顕著な有害作用があるため使用が制限されている。
【0067】
シスチン尿症を治癒する既存の治療法はなく、治療は、シスチンの溶解度を高め、尿中シスチン濃度を下げることに照準を合わせている。尿量増加が、一般的な治療である。しかし、これには、4リットルを超える水の摂取と3リットルを超える尿量が毎日必要とされ、この量を達成し維持するのが困難である。小型チオール分子など他の薬物治療は、シスチンと反応して混合ジスルフィドを形成することにより機能する。混合ジスルフィドはシスチンよりも可溶性であるが、白血球減少、発疹、発熱、タンパク尿、および腎炎症候群など顕著な毒性を有しており、これらによって用途は限定される。
【0068】
本発明は、L-シスチン/システインを分解する、遺伝子操作された治療的酵素を用いてシスチン尿症のような疾患を治療する方法を提供する。この方法は、血液循環からシスチンを除去するものであり、シスチン尿症患者において腎臓および尿中のシスチン結石形成の発生率を低めることが臨床的に示されている。本明細書において説明する方法は、シスチン尿症に対する現行の薬物に関連付けられている副作用を起こすことなく、循環血中シスチンを検出レベル未満に減らすことができる。
【0069】
システインは、必須アミノ酸L-メチオニンに由来するホモシステインから硫黄転移経路によって合成され得るため、非必須アミノ酸とみなされる。この経路は、酵素シスタチオニン-β-シンターゼ(CBS)およびシスタチオニン-γ-リアーゼ(CGL)を含む。したがって、システインの枯渇は、完全な硫黄転移経路を有する正常組織にとっては比較的非毒性であると予想される。
【0070】
これらのポリペプチドは、L-シスチンおよび/またはL-システインを枯渇させる新規な酵素を用いてシスチン尿症のような疾患を治療するために使用され得る。L-シスチン/システイン分解活性を有する改変CGLを用いる治療方法が、開示される。治療的有効性を高めるためにL-シスチン/システイン分解活性を有する酵素が提供される。
【0071】
シスチン尿症を治療するためにL-シスチン/システイン分解活性を有する改変CGL酵素が提供される。改変ポリペプチドはヒトポリペプチド配列を有してよく、したがって、ヒト患者に投与された際の有害な免疫原性反応を防ぎ、反復投薬を可能にし、かつ治療的有効性を高めることができる。
【0072】
例として、PEG-hCGL-TVは、マウスモデルにおいて血清のシスチンレベル(＞95％)を96時間より長い期間、システインレベル(80％)を48時間より長い期間、大幅に低下させることができる。これを明らかにするために、6～7週齢の雄FVB/Nマウス(JAX001800)に50mg/kgのPEG-hCGL-TVを腹腔内(i.p.)注射し、血液および血清を採取するために0日目、1日目、2日目、4日目、および6日目(n=5/群)に犠死させた。血清試料を10ピコモルの重水素化したシスチンおよびシステインからなる内部標準混合物と混合し、NANOSEP(登録商標)OMEGA(商標)遠心装置、3kDaカットオフ(Pall Life Biosciences)を用いて限外濾過した(Tiziani et al., 2008; Tiziani et al., 2013)。逆相BEH C18、1.7μm、2.1×150mmカラム(THERMO SCIENTIFIC(商標)ACCELA(登録商標)1250 UPLC、Waters Corporation、USA)を用いて、濾過した極性画分をクロマトグラフィーにかけ、エレクトロスプレーイオン化法と組み合わせたEXACTIVE(商標)Plus ORBITRAP(商標)質量分析計(Thermo Fisher Scientific,San Jose, CA)に、製造業者の説明書に従って導入した。測定器と一緒に提供されるXCALIBUR(商標)ソフトウェアを用い、50～700m/z質量範囲のデータをMSセントロイドモードで取得した。
【0073】
さらに、PEG-hCGL-TVは、約23時間の吸収T1/2および40±7時間の消失T1/2を示した。これを測定するために、ドットブロット法による濃度測定技術を使用した。その際、適切な血清試料を抗hCGL抗体(ウサギ抗CTH Sigma C8248番)でプローブし、続いて、抗ウサギIgG-フルオレセインイソチオシアナート(FITC)(Santa Cruz Biotechnology sc-2012番)を添加し、TYPHOON(商標)スキャナー(GE Healthcare)において488nmで励起して可視化した。ImageJソフトウェア(Schneider et al., 2012)を用いて、スキャンされたドットブロットに基づく試料の濃度測定を、同じブロット内の公知量のPEG-hCGL-TVの滴定と比較して検量線を作成し、相対的な血清PEG-hCGL-TVレベルを算出した。このデータを、血管外投与モデルに当てはめた(Foye et al., 2007)。
【0074】
枯渇は、哺乳類の血液循環においてインビボで、組織培養培地または他の生物学的培地におけるL-シスチンおよび/またはL-システインの枯渇が望ましい場合にインビトロで、ならびに生物学的流体、細胞、または組織が体外で扱われ、その後に罹患哺乳動物の体内に戻されるエクスビボ手順で、行うことができる。血液循環、培地、生物学的流体、または細胞からのL-シスチンおよび/またはL-システインの枯渇は、処理される材料に到達可能なL-シスチンおよび/またはL-システインの量を減らすために行われ、したがって、枯渇させようとする材料を、L-シスチンおよび/またはL-システインを分解する条件下で、L-シスチンおよび/またはL-システインを分解する量の遺伝子操作された酵素と接触させ、接触された材料の周辺環境に存在するL-シスチンおよび/またはL-システインを分解する段階を含む。
【0075】
L-シスチンおよび/またはL-システイン分解効率は、用途に応じて幅広く変化することができ、典型的には、材料中に存在するL-シスチンおよび/またはL-システインの量、所望の枯渇速度、ならびにシスチナーゼ/システイナーゼに対する材料の曝露耐性に応じて変わる。材料中のL-シスチンおよび/またはL-システインのレベル、ならびにしたがって、材料からのL-シスチンおよび/またはL-システインの枯渇速度は、当技術分野において周知の様々な化学的および生化学的方法により、容易にモニターすることができる。例示的なL-シスチンおよび/またはL-システイン分解量は、本明細書においてさらに説明され、処理される材料1ミリリットル(mL)当たり0.001～100単位(U)の遺伝子操作されたシスチナーゼ/システイナーゼ、好ましくは約0.01～10U、およびより好ましくは約0.1～5Uの遺伝子操作されたシスチナーゼ/システイナーゼの範囲であることができる。
【0076】
L-シスチンおよび/またはL-システイン分解条件は、CGL酵素の生物活性と適合性のある緩衝液条件および温度条件であり、これには、酵素と適合性のある適度な温度、塩、およびpH条件、例えば生理学的条件が含まれる。例示的な条件には、約4～40℃、約0.05～0.2M NaClに相当するイオン強度、および約5～9のpHが含まれ、生理学的条件が含まれる。
【0077】
インビボで接触させる段階は、改変CGL酵素を含む生理学的に許容される組成物の治療的有効量を静脈内注射または腹腔内注射によって患者に投与することにより達成され、それによって、患者に存在する循環血中のL-シスチンおよび/またはL-システインを枯渇させる。
【0078】
改変CGL酵素は、注射により、または時間をかけて徐々に注入することにより、非経口的に投与することができる。改変CGL酵素は、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に投与することができ、またはL-シスチン/システインに対するバイオセンサーとなり得るものを含んでよいカテーテルに連結されたポンプによって投与することができる。シスチン尿症の場合、CGL酵素を皮下投与することが望ましい場合がある。
【0079】
改変CGL酵素を含む治療的組成物は、従来、例えば単位用量を注射することによって静脈内投与される。用語「単位用量」は、治療的組成物に関して使用される場合、対象に対する単位投薬量として適切な物理的に別個の単位を意味し、各単位は、必要とされる希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと共同して所望の治療的効果をもたらすように算出された所定の量の活性物質を含む。
【0080】
組成物は、投薬製剤に適合した様式で、かつ治療的有効量で投与される。投与される量は、治療される対象、対象の身体が活性成分を利用する能力、および所望の治療的効果の程度に応じて変わる。投与されるのに必要な活性成分の正確な量は、医師の判断によって決まり、各個体に固有である。しかし、全身適用のために適切な投薬量範囲は本明細書において開示され、投与経路に応じて変わる。初回投与およびブースター投与のための適切な治療プログラムもまた企図され、これらは、初回投与と、それに続く後続の注射または他の投与による1時間以上の間隔での反復投与に代表される。例示的な複数回投与が本明細書において説明され、これらは、改変CGL酵素については高い血清および組織レベルを、ならびにL-シスチン/システインについては逆に低い血清および組織レベルを継続的に維持するために特に好ましい。あるいは、インビボ治療法のために指定された範囲で血液中濃度を維持するのに十分な静脈内持続輸注も企図される。
【0081】
V 結合体
提供される組成物および方法は、例えば、異種ペプチドセグメントまたはポリマー、例えばポリエチレングリコールとの結合体の形成による、改良のための改変CGL酵素のさらなる改変を含む。改変CGL酵素は、酵素の流体力学半径を大きくし、それによって血清残留性を高めるかまたは半減期を長くするために、PEGに連結してもよい。開示されるポリペプチドは、任意のターゲティング物質、例えば、細胞上の外部受容体または結合部位に特異的かつ安定的に結合する能力を有するリガンドと結合させてもよい(米国特許出願公開第2009/0304666号)。PEGは、約3,000～20,000ダルトンのサイズであることができ、例示的なサイズは5,000ダルトンである。
提供される組成物および方法は、例えば、異種ペプチドセグメントまたはポリマー、例えばポリエチレングリコールとの結合体の形成による、改良のための改変CGL酵素のさらなる改変を含む。改変CGL酵素は、酵素の流体力学半径を大きくし、それによって血清残留性を高めるかまたは半減期を長くするために、PEGに連結してもよい。開示されるポリペプチドは、任意のターゲティング物質、例えば、細胞上の外部受容体または結合部位に特異的かつ安定的に結合する能力を有するリガンドと結合させてもよい(米国特許出願公開第2009/0304666号)。PEGは、約3,000～20,000ダルトンのサイズであることができ、例示的なサイズは5,000ダルトンである。
【0082】
A 融合タンパク質
改変CGL酵素がN末端またはC末端において異種ドメインに連結されていてよい融合タンパク質が提供される。例えば、融合は、異種宿主におけるタンパク質の組換え発現を可能にするために、他の種に由来するリーダー配列を使用してもよい。別の有用な融合は、融合タンパク質の精製を容易にするために、血清アルブミンアフィニティータグもしくは6個のヒスチジン残基などのタンパク質アフィニティータグ、または抗体エピトープのような免疫学的に活性なドメイン、好ましくは切断可能なものの付加を含む。非限定的なアフィニティータグには、ポリヒスチジン、キチン結合タンパク質(CBP)、マルトース結合タンパク質(MBP)、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)が含まれる。
改変CGL酵素がN末端またはC末端において異種ドメインに連結されていてよい融合タンパク質が提供される。例えば、融合は、異種宿主におけるタンパク質の組換え発現を可能にするために、他の種に由来するリーダー配列を使用してもよい。別の有用な融合は、融合タンパク質の精製を容易にするために、血清アルブミンアフィニティータグもしくは6個のヒスチジン残基などのタンパク質アフィニティータグ、または抗体エピトープのような免疫学的に活性なドメイン、好ましくは切断可能なものの付加を含む。非限定的なアフィニティータグには、ポリヒスチジン、キチン結合タンパク質(CBP)、マルトース結合タンパク質(MBP)、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)が含まれる。
【0083】
改変CGL酵素は、インビボ半減期を延ばすペプチド、例えば、XTENポリペプチド(Schellenberger et al.、2009)、IgG Fcドメイン、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチドに連結されてよい。
【0084】
融合タンパク質を作り出す方法は、当業者に周知である。このようなタンパク質は、例えば、完全な融合タンパク質のデノボ合成により、または異種ドメインをコードするDNA配列を結合させ、続いてインタクトな融合タンパク質を発現させることにより、作製することができる
【0085】
親タンパク質の機能的活性を取り戻す融合タンパク質の作製は、タンデムに結合されたポリペプチド間につなぎ合わされるペプチドリンカーをコードする架橋DNAセグメントに遺伝子を連結することにより、容易にすることができる。リンカーは、結果として生じる融合タンパク質の適切なフォールディングを可能にするのに十分な長さのものである。
【0086】
B リンカー
改変CGL酵素は、二官能性架橋試薬を用いて化学的に結合されてもよく、またはペプチドリンカーを用いてタンパク質レベルで融合されてもよい。二官能性架橋試薬は、アフィニティマトリックスの調製、種々の構造体の改変および安定化、リガンドおよび受容体結合部位の同定、ならびに構造研究を含む、様々な目的のために広く使用されてきた。適切なペプチドリンカー、例えばGly-Serリンカーもまた、改変CGL酵素を連結するのに使用されてよい。
改変CGL酵素は、二官能性架橋試薬を用いて化学的に結合されてもよく、またはペプチドリンカーを用いてタンパク質レベルで融合されてもよい。二官能性架橋試薬は、アフィニティマトリックスの調製、種々の構造体の改変および安定化、リガンドおよび受容体結合部位の同定、ならびに構造研究を含む、様々な目的のために広く使用されてきた。適切なペプチドリンカー、例えばGly-Serリンカーもまた、改変CGL酵素を連結するのに使用されてよい。
【0087】
2つの同一の官能基を有するホモ二官能性試薬は、同一および異なる高分子または高分子のサブユニットの間に架橋を導入し、ポリペプチドリガンドをそれらの特異的結合部位に連結することができる。ヘテロ二官能性試薬は、2つの異なる官能基を含む。2つの異なる官能基の示差的な反応性を利用することによって、選択的かつ逐次的に架橋を制御することができる。二官能性架橋試薬は、それらの官能基、例えばアミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、カルボキシルに特異的な基の特異性に基づいて分類することができる。これらのうち、遊離アミノ基を対象とする試薬は、それらが市販されており、合成が容易であり、かつ穏やかな反応条件下で適用できることから、人気となった。
【0088】
一部のヘテロ二官能性架橋試薬は、第一級アミン反応性基およびチオール反応性基を含む。別の例では、ヘテロ二官能性架橋試薬およびこれらの架橋試薬を使用する方法が記載されている(その全体が参照により本明細書に具体的に組み入れられる米国特許第5,889,155号)。これらの架橋試薬は、求核性ヒドラジド残基を求電子性マレイミド残基と組み合わせて、一例では遊離チオールへのアルデヒドの結合を可能にする。架橋試薬を改変して、様々な官能基を架橋させることができる。
【0089】
さらに、当業者に公知である他の任意の連結/カップリング剤および/または連結/カップリング機序、例えば、抗体-抗原相互作用、アビジンビオチン結合、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、リン酸エステル結合、ホスホラミド結合、無水物結合、ジスルフィド結合、イオン性相互作用および疎水性相互作用、二重特異性の抗体および抗体断片、またはこれらの組合せを使用して、改変CGL酵素を結合させることもできる。
【0090】
血液中で適度な安定性を有する架橋剤を用いることが好ましい。ターゲティング物質および治療的/予防的物質を結合させるために首尾よく使用できる多くの種類のジスルフィド結合含有リンカーが、公知である。立体障害型ジスルフィド結合を含むリンカーが、より大きな安定性をインビボで付与する結果となり得る。したがって、これらのリンカーは、連結剤の1つのグループである。
【0091】
立体障害型架橋剤に加えて、非立体障害型リンカーもまた、使用することができる。保護されたジスルフィドを含むとも生成するとも考えられない他の有用な架橋剤には、SATA、SPDP、および2-イミノチオランが含まれる(Wawrzynczak and Thorpe, 1987)。このような架橋剤の使用は、当技術分野において十分に理解されている。柔軟なリンカーもまた、使用されてよい。
【0092】
化学的に結合させた後、通常、ペプチドを精製して、結合されていない作用物質および他の混入物から結合体を分離する。多数の精製技術が、臨床的に有用にするのに十分な程度の純度を有する結合体を提供するにあたって使用するために利用可能である。
【0093】
通常、サイズ分離に基づく精製法、例えば、ゲル濾過、ゲル浸透、または高速液体クロマトグラフィーが、最も役に立つ。Blue-Sepharose分離のような他のクロマトグラフィー技術もまた、使用されてよい。弱い洗剤、例えばN-ラウロイルサルコシンナトリウム(SLS)を使用するような、融合タンパク質を封入体から精製する従来の方法が、有用であり得る。
【0094】
C PEG化
改変CGL酵素のPEG化に関する方法および組成物が、開示される。例えば、改変CGL酵素は、本明細書において開示する方法に従ってPEG化されてよい。
改変CGL酵素のPEG化に関する方法および組成物が、開示される。例えば、改変CGL酵素は、本明細書において開示する方法に従ってPEG化されてよい。
【0095】
PEG化は、ポリ(エチレングリコール)ポリマー鎖を別の分子、普通は薬物または治療的タンパク質に共有結合する工程である。PEG化は、PEGの反応性誘導体を標的高分子とインキュベーションすることにより、ごく普通に実現する。薬物または治療的タンパク質にPEGを共有結合することにより、作用物質を宿主免疫系から「隠す」(低下させた免疫原性および抗原性)か、または作用物質の流体力学的サイズ(溶解状態でのサイズ)を大きくして、腎クリアランスを減らすことにより循環時間を延長することができる。PEG化によって、疎水性の薬物およびタンパク質に水溶性を付与することもできる。
【0096】
PEG化の第1段階は、PEGポリマーの一方または両方の末端を適切に官能化することである。同じ反応性部分で各末端が活性化されたPEGは「ホモ二官能性」として公知であり、一方、存在する官能基が異なる場合、そのPEG誘導体は「ヘテロ二官能性」または「ヘテロ官能性」と呼ばれる。PEGポリマーの化学的に活性または活性化された誘導体を調製して、PEGを所望の分子に結合させる。
【0097】
PEG誘導体のために適切な官能基の選択は、PEGに結合される分子上の利用可能な反応性基のタイプに基づく。タンパク質の場合、典型的な反応性アミノ酸には、リジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、およびチロシンが含まれる。N末端のアミノ基およびC末端のカルボン酸もまた、使用することができる。
【0098】
第一世代のPEG誘導体を形成するために使用される技術では、通常、PEGポリマーを、ヒドロキシル基、典型的には無水物、酸塩化物、クロロホルマート、およびカルボナートに対して反応性である基と反応させる。
【0099】
PEG化の用途がますます進歩し精巧になるにつれ、結合用のヘテロ二官能性PEGの必要性が増してきている。これらのヘテロ二官能性PEGは、親水性で柔軟かつ生体適合性のスペーサーが必要とされる場合、2つの実体を連結する際に非常に有用である。ヘテロ二官能性PEGの場合の好ましい末端基は、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸、およびNHSエステルであり得る。
【0100】
最も一般的な修飾物質、またはリンカーは、メトキシPEG(mPEG)分子をベースにしている。これらの活性は、アルコール末端へのタンパク質修飾基の付加に依存する。いくつかの場合において、ポリエチレングリコール(PEGジオール)が前駆分子として使用される。続いて、ジオールは、PEGによって連結されたへテロ二量体またはホモ二量体の分子を作製するために、両末端を修飾される。
【0101】
通常、タンパク質は、求核性部位、例えばプロトン化されていないチオール(システイニル残基)またはアミノ基の位置でPEG化される。システイニルに特異的な修飾試薬の例には、PEGマレイミド、PEGヨードアセテート、PEGチオール、およびPEGビニルスルホンが含まれる。これら4つはすべて、穏やかな条件下および中性から若干アルカリ性のpHでは極めてシステイニル特異的であるが、いくつかの欠点をそれぞれ有する。マレイミドと共に形成されるチオエーテルはアルカリ性条件下でいくらか不安定である可能性があり、したがって、このリンカーを用いる製剤の選択肢にはいくらか制限がある場合がある。ヨードPEGと共に形成されるカルバモチオアート結合の方が安定であるが、いくつかの条件下では遊離ヨウ素がチロシン残基を修飾する可能性がある。PEGチオールはタンパク質チオールと共にジスルフィド結合を形成するが、この結合もまた、アルカリ性条件下で不安定である可能性がある。PEG-ビニルスルホンの反応性はマレイミドおよびヨードPEGと比べて相対的に遅い。しかし、形成されるチオエーテル結合はかなり安定である。また、反応速度が遅いことによって、PEG-ビニルスルホン反応が制御しやすくなり得る。
【0102】
天然のシステイニル残基における部位特異的PEG化は、めったに行わない。これらの残基が通常はジスルフィド結合の形態で存在すること、または生物活性に必要とされることがその理由である。その一方で、部位特異的変異誘発を用いて、チオール特異的リンカーに対してシステイニルPEG化部位を組み込むことができる。システイン変異は、PEG化試薬に接近可能であり、かつPEG化後も依然として生物学的に活性であるように設計しなければならない。
【0103】
アミン特異的な修飾物質には、PEG NHSエステル、PEGトレシラート、PEGアルデヒド、PEGイソチオシアナート、および他のいくつかのものが含まれる。いずれも穏やかな条件下で反応し、アミノ基に非常に特異的である。PEG NHSエステルは、反応性が相対的に高い物質の1つである可能性が高い。しかし、その高い反応性が原因となって、大規模ではPEG化反応が制御し難くなる場合がある。PEGアルデヒドはアミノ基と共にイミンを形成し、次いでイミンがシアノ水素化ホウ素ナトリウムによって還元されて第二級アミンになる。水素化ホウ素ナトリウムとは違って、シアノ水素化ホウ素ナトリウムはジスルフィド結合を還元しない。しかし、この化学物質は毒性が高く、特にそれが揮発性になる低pHでは慎重に取り扱わなければならない。
【0104】
たいていのタンパク質表面には複数のリジン残基があるため、部位特異的PEG化は難題であり得る。幸いにも、これらの試薬は非プロトン化アミノ基と反応するため、低pHで反応を行うことによってPEG化を低pKのアミノ基に方向付けることができる。通常、α-アミノ基のpKは、リジン残基のε-アミノ基よりも1～2pH単位低い。pH7またはそれ未満で分子をPEG化することによって、N末端に対する高い選択性を獲得できることがしばしばある。しかし、これは、そのタンパク質のN末端部分が生物活性に必要とされない場合に実現可能であるにすぎない。それでもなお、PEG化による薬物動態学的利益は、インビトロでの生物活性の顕著な損失をしばしば上回り、その結果、PEG化の化学的性質に関わらずはるかに高いインビボ生物活性を有する生成物が得られる。
【0105】
PEG化手順を開発する際に考慮すべきいくつかのパラメーターがある。幸いにも、普通は、4つまたは5つのパラメーターしかない。PEG化条件の最適化への「実験計画」アプローチは、非常に有用であり得る。チオール特異的なPEG化反応の場合、考慮すべきパラメーターには、タンパク質濃度、PEGとタンパク質の比(モル基準で)、温度、pH、反応時間、および場合によっては酸素の排除が含まれる。(酸素はタンパク質による分子間ジスルフィド形成を引き起こすもととなる場合がある。分子間ジスルフィド形成が起こるとPEG化生成物の収量が減る)。アミン特異的修飾の場合は、N末端アミノ基を標的とする場合に特に、pHがさらに重大な意味を持ち得ることを除いて、(酸素は例外として)同じ因子が考慮されるべきである。
【0106】
アミン特異的修飾およびチオール特異的修飾のどちらの場合も、反応条件がタンパク質の安定性に影響し得る。このことによって、温度、タンパク質濃度、およびpHが限定される場合がある。さらに、PEGリンカーの反応性は、PEG化反応を開始する前に知っておくべきである。例えば、PEG化剤が70％だけ活性である場合、使用されるPEGの量については、タンパク質とPEGの反応化学量論比において、活性なPEG分子のみを数に入れることを徹底すべきである。
【0107】
VI タンパク質およびペプチド
改変CGL酵素のような少なくとも1種のタンパク質またはペプチドを含む組成物が提供される。これらのペプチドは、融合タンパク質に含まれるか、または前述の作用物質に結合されてよい。
改変CGL酵素のような少なくとも1種のタンパク質またはペプチドを含む組成物が提供される。これらのペプチドは、融合タンパク質に含まれるか、または前述の作用物質に結合されてよい。
【0108】
本明細書において使用される場合、タンパク質またはペプチドは、遺伝子から翻訳された完全長配列以下の、約200個超のアミノ酸からなるタンパク質;約100個超のアミノ酸からなるポリペプチド;および/または約3～約100個のアミノ酸からなるペプチドを通常は指すが、これらに限定されるわけではない。便宜上、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、本明細書において同義的に使用される。
【0109】
したがって、用語「タンパク質またはペプチド」は、天然タンパク質中に見出される一般的アミノ酸20種のうちの少なくとも1つまたは少なくとも1つの修飾アミノ酸もしくは非天然アミノ酸を含むアミノ酸配列を包含する。
【0110】
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技術によるタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの発現、天然供給源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に公知である任意の技術によって作製することができる。本明細書において開示するかまたは当業者に公知であると思われる技術を用いて、公知の遺伝子のコード領域を増幅および/または発現させることができる。あるいは、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドの様々な市販調製物が、当業者に公知である。
【0111】
VII 核酸およびベクター
改変CGL酵素をコードする核酸配列または改変CGL酵素を含む融合タンパク質が、開示される。どの発現系が使用されるかに応じて、従来の方法に基づいて核酸配列を選択することができる。例えば、改変CGL酵素がヒトシスタチオナーゼに由来し、大腸菌ではめったに使用されないコドンを複数含む場合、そのことが発現の邪魔をする場合がある。したがって、個々の遺伝子またはその変種を、自由に利用可能なソフトウェア(Hoover & Lubkowski, 2002を参照されたい)を用いて大腸菌発現用にコドン最適化して、珍しいコドンを含まないコード配列を設計してよい。改変CGL酵素のような関心対象のタンパク質を発現させるために、様々なベクターもまた使用してよい。例示的なベクターには、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾン、またはリポソームベースのベクターが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
改変CGL酵素をコードする核酸配列または改変CGL酵素を含む融合タンパク質が、開示される。どの発現系が使用されるかに応じて、従来の方法に基づいて核酸配列を選択することができる。例えば、改変CGL酵素がヒトシスタチオナーゼに由来し、大腸菌ではめったに使用されないコドンを複数含む場合、そのことが発現の邪魔をする場合がある。したがって、個々の遺伝子またはその変種を、自由に利用可能なソフトウェア(Hoover & Lubkowski, 2002を参照されたい)を用いて大腸菌発現用にコドン最適化して、珍しいコドンを含まないコード配列を設計してよい。改変CGL酵素のような関心対象のタンパク質を発現させるために、様々なベクターもまた使用してよい。例示的なベクターには、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾン、またはリポソームベースのベクターが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【0112】
VIII 宿主細胞
宿主細胞は、改変CGL酵素およびその結合体の発現および分泌を可能にするように形質転換され得る任意のものであってよい。宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、酵母、または糸状菌であってよい。様々な細菌には、エシェリキア属(Escherichia)およびバチルス属(Bacillus)が含まれる。サッカロミセス属(Saccharomyces)、キウイベロマイセス属(Kiuyveromyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、またはピキア属(Pichia)に属する酵母は、適切な宿主細胞として使用されるであろう。以下の属を含む様々な種の糸状菌を、発現宿主として使用してよい:アスペルギルス属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、アカパンカビ属(Neurospora)、ペニシリウム属(Penicillium)、セファロスポリウム属(Cephalosporium)、ワタカビ属(Achlya)、ポドスポラ属(Podospora)、エンドチア属(Endothia)、ケカビ属(Mucor)、コクリオボルス属(Cochliobolus)、およびピリクラリア属(Pyricularia)。
宿主細胞は、改変CGL酵素およびその結合体の発現および分泌を可能にするように形質転換され得る任意のものであってよい。宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、酵母、または糸状菌であってよい。様々な細菌には、エシェリキア属(Escherichia)およびバチルス属(Bacillus)が含まれる。サッカロミセス属(Saccharomyces)、キウイベロマイセス属(Kiuyveromyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、またはピキア属(Pichia)に属する酵母は、適切な宿主細胞として使用されるであろう。以下の属を含む様々な種の糸状菌を、発現宿主として使用してよい:アスペルギルス属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、アカパンカビ属(Neurospora)、ペニシリウム属(Penicillium)、セファロスポリウム属(Cephalosporium)、ワタカビ属(Achlya)、ポドスポラ属(Podospora)、エンドチア属(Endothia)、ケカビ属(Mucor)、コクリオボルス属(Cochliobolus)、およびピリクラリア属(Pyricularia)。
【0113】
利用可能な宿主生物の例には、細菌、例えば、大腸菌(Escherichia coli)MC1061、枯草菌(Bacillus subtilis)BRB1の派生株(Sibakov et al.，1984)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)SAI123(Lordanescu，1975)、またはストレプトコッカス・リビダンス(Streptococcus lividans)(Hopwood et al.，1985);酵母、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)AH22(Mellor et al., 1983)またはシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe);および糸状菌、例えば、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori)(Ward, 1989)、またはトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)(Penttila et al.，1987;Harkki et al.，1989)が含まれる。
【0114】
哺乳類宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-K1; American Type Culture Collection(ATCC)番号CCL61)、ラット下垂体細胞(GH1;ATCC番号CCL82)、HeLa S3細胞(ATCC番号CCL2.2)、ラット肝癌細胞(H-4-II-E;ATCC番号CRL-1548)、SV40によって形質転換されたサル腎臓細胞(COS-1;ATCC番号CRL-1650)、およびマウス胚細胞(NIH-3T3;ATCC番号CRL-1658)が含まれる。前述のものは例示的なものであり、当技術分野において公知である多くの宿主生物候補を限定することを意図していない。原則的に、分泌する能力がある宿主はすべて、原核細胞であれ真核細胞であれ使用することができる。
【0115】
改変CGL酵素および/またはそれらの融合タンパク質を発現する哺乳動物宿主細胞は、親細胞株を培養するのに典型的に使用される条件下で培養される。通常、細胞は、生理学的塩類および栄養素を含む標準的培地、例えば、標準的なRPMI、MEM、IMEM、またはDMEMにおいて培養され、該培地には、典型的には、ウシ胎児血清または所望の細胞について説明されるように5％～10％の血清が添加されている。培養条件もまた標準的である。例えば、培養物は、タンパク質が所望のレベルに達するまで、静止培養または回転培養にて37℃でインキュベートされる。
【0116】
IX タンパク質精製
タンパク質精製技術は、当業者に周知である。これらの技術は、1つの段階において、細胞、組織または器官をホモジナイゼーションし、ポリペプチド画分および非ポリペプチド画分に粗分画することを含む。別段の指定がない限り、関心対象のタンパク質またはポリペプチドを、クロマトグラフィー技術および電気泳動技術を用いてさらに精製して、部分的または完全な精製(もしくは均質になるまでの精製)を実現してよい。純粋なペプチドの調製に特に適している分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、および等電点電気泳動である。特に効率的なペプチド精製方法は、高速性能液体クロマトグラフィー(FPLC)またはさらに高速液体クロマトグラフィー(HPLC)である。
タンパク質精製技術は、当業者に周知である。これらの技術は、1つの段階において、細胞、組織または器官をホモジナイゼーションし、ポリペプチド画分および非ポリペプチド画分に粗分画することを含む。別段の指定がない限り、関心対象のタンパク質またはポリペプチドを、クロマトグラフィー技術および電気泳動技術を用いてさらに精製して、部分的または完全な精製(もしくは均質になるまでの精製)を実現してよい。純粋なペプチドの調製に特に適している分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、および等電点電気泳動である。特に効率的なペプチド精製方法は、高速性能液体クロマトグラフィー(FPLC)またはさらに高速液体クロマトグラフィー(HPLC)である。
【0117】
精製されたタンパク質またはペプチドとは、該タンパク質またはペプチドが、自然に入手可能な状態と比べて任意の程度で精製されている、他の構成成分から単離可能な組成物を意味するものとする。したがって、単離または精製されたタンパク質またはペプチドとはまた、自然に存在し得る環境から離されたタンパク質またはペプチドを意味する。一般に、「精製された」とは、分画に供されて他の様々な構成成分を除去されており、かつ発現される生物活性を実質的に保持している、タンパク質組成物またはペプチド組成物を意味する。用語「実質的に精製された」が使用される場合、この名称は、そのタンパク質またはペプチドが組成物の主な構成成分となっている、例えば、組成物中の全タンパク質のうちの約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、またはそれより多くを構成している、組成物を意味する。
【0118】
タンパク質精製での使用に適した様々な技術は、当業者に周知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、PEG、および抗体などを用いる沈殿、または熱変性とそれに続く遠心分離による沈殿;クロマトグラフィー工程、例えば、イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト、およびアフィニティークロマトグラフィー;等電点電気泳動;ゲル電気泳動;ならびにこれらおよび他の技術の組合せが含まれる。当技術分野において一般に公知であるように、様々な精製工程を行う順序を変更してよく、または特定の工程を省略してよく、それでもなお、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドを調製するための適切な方法が得られると考えられている。
【0119】
タンパク質またはペプチドの精製度を定量化するための様々な方法は、当業者に公知である。これらには、例えば、活性画分の比活性を測定すること、またはドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS/PAGE)解析によって画分内のポリペプチドの量を評価することが含まれる。画分の純度を評価するための好ましい方法は、画分の比活性を計算すること、それを最初の抽出物の比活性と比較すること、およびこのようにして、「精製倍率」に基づいて評価される、画分の純度の程度を算出することである。活性量を表すために使用される実際の単位は、当然、精製後に選択される個々のアッセイ技術、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かによって決まる。
【0120】
タンパク質またはペプチドは最も精製された状態で常に提供されるという一般的要件はない。実際、実質的レベルより低いレベルで精製された産生物が役に立つ場合があることが予想される。部分的精製は、より少ない精製工程を組み合わせて使用することにより、または同じ一般的精製スキームの異なる形態を利用することにより、遂行することができる。例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)装置を利用して実施される陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、通常、低圧クロマトグラフィー系を利用する同じ技術よりも高度な「～倍の」精製をもたらすと理解されている。相対的に低い精製度を示す方法が、タンパク質産生物の全回収、または発現タンパク質の活性の維持において有利である場合がある。
【0121】
タンパク質またはペプチド、例えば、改変CGL酵素、改変CGL酵素を含む融合タンパク質、またはPEG化後の改変CGL酵素は、単離または精製されてよい。精製を容易にするために、例えば、Hisタグまたは親和性エピトープが、このような改変CGL酵素に含まれてよい。アフィニティークロマトグラフィーは、単離しようとする物質とその物質が特異的に結合できる分子との特異的親和性に依拠するクロマトグラフィー手順である。これは、受容体-リガンドタイプの相互作用である。カラム材料は、結合パートナーのうちの一方を不溶性マトリックスに共有結合させることにより合成される。したがって、カラム材料は、溶液から前記物質を特異的に吸着することができる。条件を結合が起こらない条件に変更すること(例えば、pH、イオン強度、温度などの変更)により、溶出が起こる。マトリックスは、有意な程度に分子を吸着せず、かつ広範囲の化学的、物理的、および熱的安定性を有する物質であるべきである。リガンドは、結合特性に影響を与えないような方法で結合されるべきである。リガンドはまた、比較的堅固な結合を実現すべきである。試料またはリガンドを破壊することなく前記物質を溶出できるべきである。
【0122】
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、サイズ、またはより専門的な用語では流体力学的体積に基づいて溶液中の分子が分離されるクロマトグラフィー方法である。通常、この方法は、大型分子または高分子複合体、例えばタンパク質および工業用ポリマーに適用される。典型的には、カラムを通して試料を輸送するのに水溶液が使用される場合、この技術はゲル濾過クロマトグラフィーとして公知であり、これに対して、有機溶媒が移動相として使用される場合には、ゲル浸透クロマトグラフィーという名称が使用される。
【0123】
SECの基本原理は、異なるサイズの粒子は異なる速度で固定相を通って溶出する(染み出る)というものである。これにより、サイズに基づいて粒子の溶液が分離される。すべての粒子が同時またはほとんど同時に添加された場合、同じサイズの粒子は一緒に溶出するはずである。各サイズ排除カラムは、分離可能な分子量範囲を有する。排除限界は、この範囲の上限の分子量を定める。これは、分子が大きすぎて固定相中に捕捉できなくなる値である。浸透限界は、分離範囲の下限の分子量を定める。これは、十分に小さいサイズの分子が固定相の孔中に完全に浸透することができ、この分子量未満の分子がすべて、非常に小さいために単一のバンドとして溶出する値である。
【0124】
高速液体クロマトグラフィー(または高圧液体クロマトグラフィー、HPLC)は、化合物を分離、同定、および定量化するために生化学および分析化学において頻繁に使用される、カラムクロマトグラフィーの一形態である。HPLCは、クロマトグラフィー充填材量(固定相)を保持するカラム、カラムに移動相を通すポンプ、および分子の保持時間を示す検出器を利用する。保持時間は、固定相と分析される分子と使用される溶媒との相互作用によって異なる。
【0125】
X 治療的組成物
ヒトシスタチオニン-γ-リアーゼ遺伝子は、大腸菌ではめったに使用されず、発現の邪魔をする場合があるコドンを複数含む。したがって、大腸菌におけるタンパク質発現を最適化するために、DNA-Worksソフトウェア(Hoover et al., 2002)を用いて設計したコドン最適化オリゴヌクレオチドを用いて各遺伝子を組み立ててよい。各構築物は、クローニングを容易にするために、N末端のNcoI制限部位、インフレームのN末端His6タグ、およびC末端のEcoRI部位を含んでよい。pET28aベクター(Novagen)中にクローニングした後、適切な改変CGL発現ベクターを含む大腸菌(BL21)を、振盪フラスコに入れた50μg/mLカナマイシン含有テリフィックブロス(TB)培地を用いて250rpm、37℃にて、OD600が約0.5～0.6に達するまで増殖させてよい。この時点で、培養物を25℃の振盪機に移し、0.5mM IPTGを用いて誘導し、さらに12時間、タンパク質を発現させてよい。次いで、遠心分離によって細胞ペレットを回収し、IMAC緩衝液(10mM NaPO4/10mMイミダゾール/300mM NaCl、pH8)に再懸濁してよい。フレンチプレッシャーセルプレスまたは高圧ホモジナイザーによって溶解した後、溶解物を20,000×g、4℃で20分間遠心分離し、得られた上清をニッケルIMACカラム(ビーズサイズ45～165μm、Qiagen)にアプライし、0.1％TRITON(登録商標)114を含むIMAC緩衝液で徹底的に(90～100カラム体積)洗浄し、10～20カラム体積のIMAC緩衝液を用いて洗浄し、その後、IMAC溶出緩衝液(50mM NaPO4/250mMイミダゾール/300mM NaCl、pH8)を用いて溶出させてよい。精製されたタンパク質を、10,000 MWCO(分子量カットオフ)濾過装置(Amicon)を用いるバッファー交換に供して、pH8.3の100mM NaPO4緩衝液に交換した。次いで、酵素を含む画分を10mMピリドキサール-5´-リン酸(PLP)と共に25℃で1時間インキュベートしてよい。次いで、メトキシPEGスクシンイミジルカルボキシメチルエステル5000MW(JenKem Technology)を改変CGL酵素にモル比80:1で添加し、連続的に撹拌しながら25℃で1時間反応させた。得られた混合物を、100,000 MWCO濾過装置(Amicon)を用いて徹底的にバッファー交換(10％グリセロールを含むPBS)し、0.2ミクロンシリンジフィルター(VWR)によって滅菌した。次いで、酵素分取物を液体窒素中で急速冷凍し、-80℃で保存してよい。この方式で精製された改変CGL酵素変種は、SDS-PAGEおよびクーマシー染色によって評価した場合に、均一性が95％を超えるはずである。収量は、6Mグアニジニウム塩酸塩、20mMリン酸緩衝液、pH6.5の最終緩衝液濃度における算出された吸光係数、すなわちλ280=29,870M-1cm-1に基づいて計算することができる(Gill and von Hippel, 1989)。PEG化した改変CGL酵素のリポ多糖(LPS)含有量を、リムルスアメーバ様細胞溶解物(LAL)キットを用いて解析してよい。
ヒトシスタチオニン-γ-リアーゼ遺伝子は、大腸菌ではめったに使用されず、発現の邪魔をする場合があるコドンを複数含む。したがって、大腸菌におけるタンパク質発現を最適化するために、DNA-Worksソフトウェア(Hoover et al., 2002)を用いて設計したコドン最適化オリゴヌクレオチドを用いて各遺伝子を組み立ててよい。各構築物は、クローニングを容易にするために、N末端のNcoI制限部位、インフレームのN末端His6タグ、およびC末端のEcoRI部位を含んでよい。pET28aベクター(Novagen)中にクローニングした後、適切な改変CGL発現ベクターを含む大腸菌(BL21)を、振盪フラスコに入れた50μg/mLカナマイシン含有テリフィックブロス(TB)培地を用いて250rpm、37℃にて、OD600が約0.5～0.6に達するまで増殖させてよい。この時点で、培養物を25℃の振盪機に移し、0.5mM IPTGを用いて誘導し、さらに12時間、タンパク質を発現させてよい。次いで、遠心分離によって細胞ペレットを回収し、IMAC緩衝液(10mM NaPO4/10mMイミダゾール/300mM NaCl、pH8)に再懸濁してよい。フレンチプレッシャーセルプレスまたは高圧ホモジナイザーによって溶解した後、溶解物を20,000×g、4℃で20分間遠心分離し、得られた上清をニッケルIMACカラム(ビーズサイズ45～165μm、Qiagen)にアプライし、0.1％TRITON(登録商標)114を含むIMAC緩衝液で徹底的に(90～100カラム体積)洗浄し、10～20カラム体積のIMAC緩衝液を用いて洗浄し、その後、IMAC溶出緩衝液(50mM NaPO4/250mMイミダゾール/300mM NaCl、pH8)を用いて溶出させてよい。精製されたタンパク質を、10,000 MWCO(分子量カットオフ)濾過装置(Amicon)を用いるバッファー交換に供して、pH8.3の100mM NaPO4緩衝液に交換した。次いで、酵素を含む画分を10mMピリドキサール-5´-リン酸(PLP)と共に25℃で1時間インキュベートしてよい。次いで、メトキシPEGスクシンイミジルカルボキシメチルエステル5000MW(JenKem Technology)を改変CGL酵素にモル比80:1で添加し、連続的に撹拌しながら25℃で1時間反応させた。得られた混合物を、100,000 MWCO濾過装置(Amicon)を用いて徹底的にバッファー交換(10％グリセロールを含むPBS)し、0.2ミクロンシリンジフィルター(VWR)によって滅菌した。次いで、酵素分取物を液体窒素中で急速冷凍し、-80℃で保存してよい。この方式で精製された改変CGL酵素変種は、SDS-PAGEおよびクーマシー染色によって評価した場合に、均一性が95％を超えるはずである。収量は、6Mグアニジニウム塩酸塩、20mMリン酸緩衝液、pH6.5の最終緩衝液濃度における算出された吸光係数、すなわちλ280=29,870M-1cm-1に基づいて計算することができる(Gill and von Hippel, 1989)。PEG化した改変CGL酵素のリポ多糖(LPS)含有量を、リムルスアメーバ様細胞溶解物(LAL)キットを用いて解析してよい。
【0126】
治療的調製物の具体的な性質については、いかなる制限も意図されない。例えば、このような組成物は、生理学的に容認される液状、ゲル状、または固形の担体、希釈剤、および賦形剤と合わせて製剤にして提供することができる。これらの治療的調製物は、家畜を用いるような獣医学的使用のために哺乳動物に、およびヒトでの臨床使用のために、他の治療物質と同様にして投与することができる。通常、治療的有効性に必要とされる投与量は、使用のタイプおよび投与様式、ならびに個々の対象について具体的に挙げられる要件によって変動する。
【0127】
典型的には、このような組成物は、注射剤として使用するために溶液剤または懸濁剤として調製される。適切な希釈剤および賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、またはグリセロールなど、およびそれらの組合せである。さらに、望ましいならば、組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、安定化剤、またはpH緩衝剤など少量の補助物質を含んでもよい。
【0128】
臨床応用が企図される場合、意図される応用に適した形態で、タンパク質、抗体、および薬物を含む治療的組成物を調製することが必要な可能性がある。通常、治療的組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散させた有効量の1種もしくは複数種の改変CGL酵素または付加的物質を含んでよい。「治療的または治療的に許容される」という表現は、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与された場合に有害反応も、アレルギー反応も、他の不適当な反応ももたらさない分子実体および組成物を指す。本明細書において開示する方法によって単離された少なくとも1種の改変CGL酵素または付加的な活性成分を含む治療的組成物の調製は、参照により本明細書に組み入れられるRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990によって例示されるように、当業者には公知であろう。さらに、動物(例えばヒト)に投与する場合、調製物は、FDA Office of Biological Standardsが要求する無菌性、発熱性、全般的安全、および純度の基準を満たさなくてはならないことも理解されよう。
【0129】
当業者には公知であるように(例えば、参照により本明細書に組み入れられるRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990を参照されたい)、本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、任意およびすべての溶媒、分散媒、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤(例えば、抗菌剤、抗真菌剤)、等張化剤、吸収遅延剤、塩類、保存剤、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、それらと同様の材料、およびそれらの組合せが含まれる。任意の従来の担体が活性成分と不適合である場合を除いて、治療的組成物におけるその使用が企図される。
【0130】
当業者には公知であるように(例えば、参照により本明細書に組み入れられるRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990を参照されたい)、組成物は、皮下に、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、筋肉内に、注射により、輸注により、持続輸注により、カテーテルを介して、脂質組成物(例えばリポソーム)中に入れて、または他の方法もしくは前述のものの任意の組合せにより、投与することができる。
【0131】
改変ポリペプチドは、遊離塩基型、中性型、または塩型の組成物に調製されてよい。治療的に許容される塩には、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と共に形成されるもの、または例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、もしくはマンデル酸などの有機酸と共に形成されるものが含まれる。遊離のカルボキシル基と共に形成される塩もまた、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしくは水酸化第二鉄などの無機塩基;またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカインなどの有機塩基から誘導することができる。製剤化されると、液剤は、投薬製剤と適合性のある様式かつ治療的に有効であるような量で投与される。製剤は、様々な剤形で投与されてよく、例えば、注射液剤のような非経口投与用に製剤化されたもの、または肺に送達するためのエアロゾル、または薬物放出カプセル剤のような食事性投与用に製剤化されたものなどである。
【0132】
投与に適した開示組成物は、不活性な希釈剤を含むまたは含まない薬学的に許容される担体中に含まれた形態で提供されてよい。任意の従来の媒体、作用物質、希釈剤、または担体が、受容者またはその中に含まれる組成物の治療的有効性にとって不利益である場合以外は、方法を実践する際に使用するための投与可能な組成物においてそれらを使用することは、適切である。担体または希釈剤の例には、脂肪、油、水、生理食塩水、脂質、およびリポソームなど、またはそれらの組合せが含まれる。組成物はまた、1種または複数種の構成成分の酸化を遅らせるために様々な抗酸化剤も含んでよい。さらに、微生物の活動の防止は、限定されるわけではないが、パラベン(例えばメチルパラベン、プロピルパラベン)、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはそれらの組合せを含む、様々な抗菌剤および抗真菌剤などの保存剤によっても実現することができる。
【0133】
開示される組成物は、任意の簡便かつ実用的な様式で、すなわち、溶解、懸濁、乳化、混合、カプセル封入、および吸収などによって、担体と組み合わせることができる。
【0134】
患畜に投与される組成物の実際の投与量は、体重、状態の重症度、治療される疾患のタイプ、以前または同時の治療的介入、患者の特発性疾患などの身体的および生理的因子に基づいて、かつ投与経路に基づいて、決定することができる。投与量および投与経路に応じて、好ましい投与量および/または治療的有効量の投与回数は、対象の応答によって変動し得る。いずれにしても、投与を担当する医師が、組成物中の活性成分の濃度および個々の対象に対して適切な用量を決定する。
【0135】
治療的組成物は、例えば、少なくとも約0.1％の活性化合物を含んでよい。活性化合物は、例えば、構成単位の重量の約2％～約75％、または約25％～約60％、およびその中で導き出せる任意の範囲を構成してよい。当然、治療的に有用な各組成物中の活性化合物の量は、適切な投与量が該化合物の任意の所与の単位用量において得られるように、調製されてよい。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品の貯蔵寿命などの因子、ならびに他の薬理学的な考慮すべき事柄が、このような治療用製剤を調製する当業者によって熟考され、したがって、様々な投与量および治療計画が望ましい場合がある。
【0136】
用量はまた、投与1回当たり約500マイクログラム/kg体重、約1ミリグラム/kg体重、約5ミリグラム/kg体重、約10ミリグラム/kg体重、約50ミリグラム/kg体重、約100ミリグラム/kg体重、約750ミリグラム/kg体重またはそれより多い量、およびその中で導き出せる任意の範囲を含んでよい。用量が週に1回投与される場合、用量は、5mg/kg体重の量、すなわち、例えば70kgの対象の場合は350mgのタンパク質であってよい。
【0137】
XI 併用治療
本明細書において提供される組成物および方法は、第2または追加の治療法と組み合わせた改変CGL酵素の投与を含んでよい。このような治療法は、シスチン/システイン依存性に関連付けられている任意の疾患の治療に適用することができる。例えば、疾患はシスチン尿症であってよい。
本明細書において提供される組成物および方法は、第2または追加の治療法と組み合わせた改変CGL酵素の投与を含んでよい。このような治療法は、シスチン/システイン依存性に関連付けられている任意の疾患の治療に適用することができる。例えば、疾患はシスチン尿症であってよい。
【0138】
併用療法は、治療効果もしくは防御効果を高め、かつ/または別の治療法の治療効果を増大させ得る。治療的および予防的な方法および組成物は、所望の効果、例えば尿路中のシステイン結石の消失または尿路、腎臓、および/もしくは膀胱におけるシスチン結石の形成の予防を達成するのに有効な組合せ量で提供することができる。この方法は、改変CGL酵素と第2の治療物質の両方を投与することを含んでよい。組織、器官、もしくは細胞を、作用物質のうちの1つもしくは複数(すなわち、改変CGL酵素もしくは第2の作用物質)を含む、1種または複数種の組成物もしくは薬理学的製剤に曝露することができ、または組織、器官、および/もしくは細胞を、2種またはそれより多い異なる組成物もしくは製剤と接触させることができる。ここで、1種の組成物は、1)改変CGL酵素、2)第2の作用物質、または3)改変CGL酵素と第2の作用物質の両方を提供する。併用療法は、衝撃波療法または外科的療法と組み合わせて使用されてよい。
【0139】
細胞に適用される場合の用語「接触させた」および「曝露された」は、治療的構築物が標的器官に送達されるかまたは標的細胞と直接隣り合わせに配置される工程を説明するために本明細書において使用される。結石の溶解を実現するには、例えば、両方の作用物質を、結石を溶解させるためまたは結石が形成もしくは再形成するのを防ぐために有効な組合せ量で細胞に送達する。
【0140】
改変CGL酵素は、第2のシスチン尿症治療薬に対して、その前、間、後、または様々な組合せで投与されてよい。投与は、同時～数分、数日、数週間の範囲の間隔であってよい。改変CGL酵素が第2のシスチン尿症治療薬とは別に患者に提供される場合、通常、それら2種の治療薬が有利な併用効果を患者に対して発揮することが引き続きできるように、有効な期間が各送達期間の間に終了しないよう徹底する。このような例において、改変CGL酵素および第2のシスチン尿症治療物質を、互いに約12～24時間もしくは72時間以内、または互いに約6～12時間以内に、患者に提供してよい。いくつかの状況においては、治療のための期間を延長することが望ましい場合があり、その際、各投与間の期間は数日間(2日、3日、4日、5日、6日、または7日)～数週間(1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、または8週間)である。
【0141】
改変CGLが、1日目～90日目(このような範囲は、間の日を含む)の任意の日またはそれらの任意の組合せに与えられてよく、かつ別の治療薬が、1日目～90日目(このような範囲は、間の日を含む)の任意の日またはそれらの任意の組合せに与えられてよいことが意図される。1日(24時間の期間)以内に、患者に1回または複数回の治療薬投与がなされてよい。治療の1コースの後、治療薬が投与されない期間があってよい。この期間は、患者の状態、例えば彼らの予後、体力、健康状態などに応じて、1～7日、および/または1～5週間、および/または1～12か月、またはそれより長く(このような範囲は間の日を含む)続いてよい。治療サイクルは必要に応じて繰り返すことができる。
【0142】
様々な組合せが使用されてよい。以下の例において、改変CGL酵素は「A」であり、第2のシスチン尿症治療物質は「B」である。
【0143】
患者への任意の化合物または治療物質の投与は、もしあれば、該治療物質の毒性を考慮に入れて、そのような化合物の投与用の一般的プロトコールに従う。したがって、該治療物質に起因する毒性をモニターする段階があってよい。
【0144】
A 外科手術
シスチン結石を除去するための最も一般的な方法の1つは、経皮的腎切石術であり、この方法では、背中に鍵穴型の切開部を作り、腎盂鏡を用いて結石を粉砕し除去する。この手法は、開放手術よりも侵襲性が低いものの、2～3日の入院および数週間の回復期間と共に、標準の麻酔または脊髄麻酔が通常は必要とされる。
シスチン結石を除去するための最も一般的な方法の1つは、経皮的腎切石術であり、この方法では、背中に鍵穴型の切開部を作り、腎盂鏡を用いて結石を粉砕し除去する。この手法は、開放手術よりも侵襲性が低いものの、2～3日の入院および数週間の回復期間と共に、標準の麻酔または脊髄麻酔が通常は必要とされる。
【0145】
B 衝撃波療法
シスチン尿症患者は、しばしば、生涯において結石形成の症状発現を繰り返し、手術を受ける。高エネルギー衝撃波を用いて結石を破砕する衝撃波砕石術は、1.5cm未満のシスチン結石の治療に使用することができる。シスチン結石は、あらゆる尿路結石のうちで最も堅く、通常、砕石術ではこれらを粉砕することはできない。しかし、より高いエネルギーでより高頻度の衝撃を使用することができるため、小さめのシスチン結石は、砕石術によって破砕することができる。
シスチン尿症患者は、しばしば、生涯において結石形成の症状発現を繰り返し、手術を受ける。高エネルギー衝撃波を用いて結石を破砕する衝撃波砕石術は、1.5cm未満のシスチン結石の治療に使用することができる。シスチン結石は、あらゆる尿路結石のうちで最も堅く、通常、砕石術ではこれらを粉砕することはできない。しかし、より高いエネルギーでより高頻度の衝撃を使用することができるため、小さめのシスチン結石は、砕石術によって破砕することができる。
【0146】
C 薬物療法
シスチン結石に関連した医学的状態に対する薬物療法は、チオール含有薬物、例えば、D-ペニシラミン、α-メルカプトプロピオニルグリシン、またはチオプロニン(Thiola(登録商標))、およびカプトプリルを使用して、シスチンジスルフィド結合を切断し、より可溶性の混合ジスルフィドまたはシステインそれ自体を形成することを含む。しかし、これらの薬物は、胃腸不耐症、発疹、および関節痛など種々の不快な副作用を患者に与えることがしばしばある(Sakhaee and Sutton, 1996)。
シスチン結石に関連した医学的状態に対する薬物療法は、チオール含有薬物、例えば、D-ペニシラミン、α-メルカプトプロピオニルグリシン、またはチオプロニン(Thiola(登録商標))、およびカプトプリルを使用して、シスチンジスルフィド結合を切断し、より可溶性の混合ジスルフィドまたはシステインそれ自体を形成することを含む。しかし、これらの薬物は、胃腸不耐症、発疹、および関節痛など種々の不快な副作用を患者に与えることがしばしばある(Sakhaee and Sutton, 1996)。
【0147】
D 他の方法
シスチン結石を除去するためのその他の治療コースは、通常、尿中シスチンレベルを管理して結石形成のリスクを低下させることを含む。これらの管理方法は、水の摂取量を実質的に増やす(それによって、尿量および可溶化できるシスチンの量を増やす)こと、ナトリウムおよびメチオニン、すなわちシスチンの代謝前駆物質の食事制限、ならびにクエン酸カリウムを経口投与して尿のpHを上げ、それによってシスチンの溶解性を高めることを含む。
シスチン結石を除去するためのその他の治療コースは、通常、尿中シスチンレベルを管理して結石形成のリスクを低下させることを含む。これらの管理方法は、水の摂取量を実質的に増やす(それによって、尿量および可溶化できるシスチンの量を増やす)こと、ナトリウムおよびメチオニン、すなわちシスチンの代謝前駆物質の食事制限、ならびにクエン酸カリウムを経口投与して尿のpHを上げ、それによってシスチンの溶解性を高めることを含む。
【0148】
シスチン結石を治療するためのその他の方法は、非外科的かつ侵襲性を最小限に抑えた経路であり、化学溶解としても公知である結石の化学的溶解のために、腎瘻用カテーテルを用いて腎臓に化学溶液を送達することを含む。重炭酸ナトリウムおよびpH10の有機緩衝液トリス-ヒドロキシメチレン-アミノメタン(トロメタミン-E)を含む、様々な化学溶解剤がこの技術において使用されており、これらはどちらも、強アルカリ性の環境を与えてシスチン結石を溶解する役割を果たす。アセチルシステインもまた、化学溶解の際に頻繁に使用され、D-ペニシラミンおよびThiola(登録商標)と同様に、シスチンジスルフィドを切断し、それよりも溶解性の高いジスルフィドを形成することによって結石を溶解する。しかし、これらの化学溶解剤はゆっくりと機能し、典型的には結石を溶解するのに数週間から数ヶ月かかる可能性があるため、この溶解方法は、シスチン結石の治療における役割が限定的である(Ng and Streem, 2001)。
【0149】
XII キット
治療用キットのようなキットが提供される。例えば、キットは、本明細書において説明する1種または複数種の治療的組成物、および任意でそれらの使用説明書を含んでよい。キットはまた、そのような組成物の投与を遂行するための1種または複数種の器具も含んでよい。例えば、対象キットは、治療的組成物、および該組成物の標的組織への直接的静脈注射を遂行するためのカテーテルを含んでよい。キットは、送達器具と共に使用するための、任意で治療的組成物として調製されるかまたは凍結乾燥された改変CGL酵素を予め詰められたアンプルを含んでよい。
治療用キットのようなキットが提供される。例えば、キットは、本明細書において説明する1種または複数種の治療的組成物、および任意でそれらの使用説明書を含んでよい。キットはまた、そのような組成物の投与を遂行するための1種または複数種の器具も含んでよい。例えば、対象キットは、治療的組成物、および該組成物の標的組織への直接的静脈注射を遂行するためのカテーテルを含んでよい。キットは、送達器具と共に使用するための、任意で治療的組成物として調製されるかまたは凍結乾燥された改変CGL酵素を予め詰められたアンプルを含んでよい。
【0150】
キットは、ラベルを付けた容器を含んでよい。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど様々な材料から形成されてよい。容器には、前述のもののような、治療的適用または非治療的適用に有効な改変CGL酵素を含む組成物が入れられてよい。容器に付けられたラベルは、組成物が特定の治療法または非治療的適用のために使用されることを示してよく、また、前述したもののようなインビボまたはインビトロの使用のいずれかのための指示を示してもよい。典型的には、キットは、前述の容器、ならびに緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用に関する指示が書かれた添付文書を含む、商業的観点かつ使用者の観点から望ましい材料を含む1つまたは複数の他の容器を含む。
【実施例】
【0151】
XIII 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明を実施する際にうまく機能する本発明者らによって発見された技術を代表するものであり、したがって、本発明の実施のために好ましい態様を構成するとみなせることが当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、開示される個々の態様において多くの変更を加えることができ、かつ本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をなお得ることができることを、本開示に照らして理解すべきである。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明を実施する際にうまく機能する本発明者らによって発見された技術を代表するものであり、したがって、本発明の実施のために好ましい態様を構成するとみなせることが当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、開示される個々の態様において多くの変更を加えることができ、かつ本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をなお得ることができることを、本開示に照らして理解すべきである。
【0152】
実施例1 シスチナーゼ/システイナーゼ活性の96ウェルプレートスクリーニング
システイナーゼ酵素は、L-システインをピルビン酸、アンモニア、およびH2Sに分解し、L-シスチンをピルビン酸、アンモニア、およびチオシステインに変換する(kcat/KMはそれぞれ約0.2mM-1s-1および0.5mM-1s-1)(チオシステインは、非酵素的にL-システインおよびH2Sにさらに分解される)。小規模のライブラリーをスクリーニングし、シスチンリアーゼ活性および/またはシステインリアーゼ活性が最も大きなクローンを順位付けするために、3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)を用いてピルビン酸を検出する比色アッセイ法(Takakura et al., 2004)を96ウェルプレート形式の規模に調整した。このプレートスクリーニングは、最も活性なクローンを変異原性ライブラリーから注意深く選ぶための容易な方法となる。
システイナーゼ酵素は、L-システインをピルビン酸、アンモニア、およびH2Sに分解し、L-シスチンをピルビン酸、アンモニア、およびチオシステインに変換する(kcat/KMはそれぞれ約0.2mM-1s-1および0.5mM-1s-1)(チオシステインは、非酵素的にL-システインおよびH2Sにさらに分解される)。小規模のライブラリーをスクリーニングし、シスチンリアーゼ活性および/またはシステインリアーゼ活性が最も大きなクローンを順位付けするために、3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)を用いてピルビン酸を検出する比色アッセイ法(Takakura et al., 2004)を96ウェルプレート形式の規模に調整した。このプレートスクリーニングは、最も活性なクローンを変異原性ライブラリーから注意深く選ぶための容易な方法となる。
【0153】
変異誘発されたhCGLまたは対照hCGLを含む単一コロニーを採取して、50μg/mLカナマイシンを含むTB培地をウェル当たり100μL含む96ウェル培養プレートに入れた。次いで、これらの培養物をプレートシェーカーに載せて37℃で12時間増殖させた。25℃に冷却した後、50μg/mLカナマイシンおよび1mM IPTGを含む培地をウェル当たり100μL、さらに加えた。振盪しながら25℃で16時間発現させ、続いて、100μL/ウェルの培養物を96ウェルアッセイプレートに移した。次いで、アッセイプレートを遠心分離して細胞をペレットにし、培地を除去し、100μL/ウェルのB-PERタンパク質抽出試薬(Pierce)を添加することにより細胞を溶解した。遠心分離によって溶解物を清澄化した後に、上清90μLをHis-Sorbプレート(Qiagen)の各ウェルに移し、ゆっくりと撹拌しながら10℃で3時間インキュベートした。次いで、生じた上清を廃棄し、各ウェルに200μLのPBSを加え、4℃で15分間、プレートをゆっくりと撹拌し、洗浄緩衝液を吸引除去することにより、プレートを合計3回洗浄した。次いで、0.5mMシスチンを含む反応緩衝液100μLをHis-Sorbプレートの各ウェルに添加し、37℃で2時間インキュベートした。続いて、反応物50μLを別の96ウェルプレートに移し、150μL/ウェルのMBTH使用液を添加して誘導体化した。次いで、プレートを50℃で40分間加熱し、冷却後、マイクロタイタープレートリーダーによってλ=320nmで読み取った。親対照よりも大きな活性を示すクローンを、さらなる特性決定のために選択した。
【0154】
実施例2 遺伝子操作されたヒトシステイナーゼの変異誘発ライブラリーの構築
構造解析および系統発生解析により、残基A51、E59、L91、T163、V166、T189、P193、A200、N234、T311、E339、I353、K361、およびN362が、システイナーゼによるシスチン分解において役割を果たしている可能性があることが示唆された。オーバーラップ伸長PCRによって、様々な縮重コドン飽和変異誘発ライブラリーをこれらの位置で構築した。得られるPCR産物をNcoIおよびEcoRIで消化し、T4 DNAリガーゼを用いてpET28aベクターに連結した。これらの連結物を大腸菌 (BL21-DE3)に直接導入して形質転換し、実施例1で説明したような後続のスクリーニング実験で使用するためにLB-カナマイシンプレートに播種した。すべてのライブラリーを、理論上のサイズより2倍大きな規模でスクリーニングした。親対照の反応と比べて高い活性を示すクローンを単離し、配列を決定して変異を特定した。
構造解析および系統発生解析により、残基A51、E59、L91、T163、V166、T189、P193、A200、N234、T311、E339、I353、K361、およびN362が、システイナーゼによるシスチン分解において役割を果たしている可能性があることが示唆された。オーバーラップ伸長PCRによって、様々な縮重コドン飽和変異誘発ライブラリーをこれらの位置で構築した。得られるPCR産物をNcoIおよびEcoRIで消化し、T4 DNAリガーゼを用いてpET28aベクターに連結した。これらの連結物を大腸菌 (BL21-DE3)に直接導入して形質転換し、実施例1で説明したような後続のスクリーニング実験で使用するためにLB-カナマイシンプレートに播種した。すべてのライブラリーを、理論上のサイズより2倍大きな規模でスクリーニングした。親対照の反応と比べて高い活性を示すクローンを単離し、配列を決定して変異を特定した。
【0155】
実施例3 システイナーゼ変種の発現および精製
96ウェルプレートのスクリーニングにおいて増強された活性を示すシステイナーゼ変種を、振盪フラスコに入れた50μg/mLカナマイシン含有テリフィックブロス(TB)培地に加え、250rpmで、OD600が0.5～0.6に達するまで培養した。この時点で、培養物を25℃の振盪機に移し、0.5mM IPTGを用いて誘導し、さらに12時間、タンパク質を発現させた。次いで、遠心分離によって細胞ペレットを回収し、IMAC緩衝液(10mM NaPO4/10mM イミダゾール/300mM NaCl、pH8)に再懸濁した。フレンチプレッシャーセルによって溶解した後、溶解物を20,000×g、4℃で20分間遠心分離し、得られた上清をニッケルIMACカラムにアプライし、10～20カラム体積のIMAC緩衝液で洗浄し、その後、IMAC溶出緩衝液(50mM NaPO4/250mMイミダゾール/300mM NaCl、pH8)を用いて溶出させた。次いで、酵素を含む画分を、5mMピリドキサールリン酸(PLP)と共に25℃で1時間インキュベートした。10,000 MWCOの遠心濾過機(Amicon)を用いて、数回、タンパク質を100mM PBS、10％グリセロール、pH7.3溶液へのバッファー交換に供した。システイナーゼの変種酵素の分取物は、生物物理学的特性を直ちに解析するか、または液体窒素中で急速冷凍し、-80℃で保存した。この方式で精製したhCGL変種酵素は、SDS-PAGEおよびクーマシー染色によって評価した場合に、均一性が95％を超えた。
96ウェルプレートのスクリーニングにおいて増強された活性を示すシステイナーゼ変種を、振盪フラスコに入れた50μg/mLカナマイシン含有テリフィックブロス(TB)培地に加え、250rpmで、OD600が0.5～0.6に達するまで培養した。この時点で、培養物を25℃の振盪機に移し、0.5mM IPTGを用いて誘導し、さらに12時間、タンパク質を発現させた。次いで、遠心分離によって細胞ペレットを回収し、IMAC緩衝液(10mM NaPO4/10mM イミダゾール/300mM NaCl、pH8)に再懸濁した。フレンチプレッシャーセルによって溶解した後、溶解物を20,000×g、4℃で20分間遠心分離し、得られた上清をニッケルIMACカラムにアプライし、10～20カラム体積のIMAC緩衝液で洗浄し、その後、IMAC溶出緩衝液(50mM NaPO4/250mMイミダゾール/300mM NaCl、pH8)を用いて溶出させた。次いで、酵素を含む画分を、5mMピリドキサールリン酸(PLP)と共に25℃で1時間インキュベートした。10,000 MWCOの遠心濾過機(Amicon)を用いて、数回、タンパク質を100mM PBS、10％グリセロール、pH7.3溶液へのバッファー交換に供した。システイナーゼの変種酵素の分取物は、生物物理学的特性を直ちに解析するか、または液体窒素中で急速冷凍し、-80℃で保存した。この方式で精製したhCGL変種酵素は、SDS-PAGEおよびクーマシー染色によって評価した場合に、均一性が95％を超えた。
【0156】
実施例4 動態を測定するための、乳酸デヒドロゲナーゼ組合せアッセイ法
システイナーゼ変種の定常状態での動態パラメーターを測定するために、連続的な分光光度的組合せアッセイ法を開発した。このアッセイ法は、システイナーゼによって触媒されるシスチンとの反応によって生成するピルビン酸が、補助酵素、すなわち乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)によって利用されることに基づいている。LDHは、ピルビン酸の存在下でNADHを化学量論的に酸化して乳酸およびNAD+を生じさせる。NADHの酸化は、ピルビン酸に比例し、言い換えると、これは、システイナーゼ酵素の活性に比例する。NADHの消失を、広範囲のシスチン濃度を用いて340nmで分光測定して、時間の関数としてモニターし、トレースの直線部分を用いて、基質の10％が減少する前(初速度の条件)の反応速度を計算した。観察された基質濃度依存性の速度を、反応に使用される酵素濃度に対して標準化し、続いて、基質濃度の関数としてプロットした。得られたデータを、定常状態のパラメーターを計算するためにミカエリス・メンテンの式に当てはめた。絶対濃度へのNADH吸光度の変換は、NADHのモル吸光消衰係数(6.22mM-1cm-1)を用いて計算した。このアッセイ法を用いて変種を試験して、定常状態の動態パラメーターを求め、得られたkcat/KM値を、並行して解析した基準システイナーゼ変種(hCGL-H55E-E59T-T336D-E339V;その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第15/977,246号を参照されたい)のものと直接比較した。多数の変種が、シスチン分解についてのkcat/KMの増加を示した(表1、kcat/KMの改善倍率)。
システイナーゼ変種の定常状態での動態パラメーターを測定するために、連続的な分光光度的組合せアッセイ法を開発した。このアッセイ法は、システイナーゼによって触媒されるシスチンとの反応によって生成するピルビン酸が、補助酵素、すなわち乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)によって利用されることに基づいている。LDHは、ピルビン酸の存在下でNADHを化学量論的に酸化して乳酸およびNAD+を生じさせる。NADHの酸化は、ピルビン酸に比例し、言い換えると、これは、システイナーゼ酵素の活性に比例する。NADHの消失を、広範囲のシスチン濃度を用いて340nmで分光測定して、時間の関数としてモニターし、トレースの直線部分を用いて、基質の10％が減少する前(初速度の条件)の反応速度を計算した。観察された基質濃度依存性の速度を、反応に使用される酵素濃度に対して標準化し、続いて、基質濃度の関数としてプロットした。得られたデータを、定常状態のパラメーターを計算するためにミカエリス・メンテンの式に当てはめた。絶対濃度へのNADH吸光度の変換は、NADHのモル吸光消衰係数(6.22mM-1cm-1)を用いて計算した。このアッセイ法を用いて変種を試験して、定常状態の動態パラメーターを求め、得られたkcat/KM値を、並行して解析した基準システイナーゼ変種(hCGL-H55E-E59T-T336D-E339V;その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第15/977,246号を参照されたい)のものと直接比較した。多数の変種が、シスチン分解についてのkcat/KMの増加を示した(表1、kcat/KMの改善倍率)。
【0157】
（表１）基準システイナーゼ(hCGL-H55E-E59T-T336D-E339V)と比べた、シスチン分解のkcat/KMの改善倍率
【0158】
本明細書において開示および特許請求する方法はすべて、本発明の開示に照らして、過度に実験をすることなく作成および実行できる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態の立場から説明してきたが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書において説明する方法、および方法の段階もしくは段階の順序に変更を加え得ることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、本明細書において説明する作用物質の代わりに、化学的にも生理学的にも関係している特定の作用物質を用いてよく、それでいて同じまたは同様の結果が達成されるであろうことも明らかである。当業者に明らかなこのような同様の代用および改良はすべて、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、および概念の範囲内にあるとみなされる。
【0159】
参照文献
以下の参照文献は、本明細書において説明されたものを補足する例示的な手順の詳細またはその他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
以下の参照文献は、本明細書において説明されたものを補足する例示的な手順の詳細またはその他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】