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特表2022-505714腫瘍細胞の選択的イメージングのための融合性リポソーム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-14
(54)【発明の名称】腫瘍細胞の選択的イメージングのための融合性リポソーム
(51)【国際特許分類】
A61K 47/54 20170101AFI20220106BHJP
A61K 47/62 20170101ALI20220106BHJP
A61K 51/04 20060101ALI20220106BHJP
A61K 51/02 20060101ALI20220106BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220106BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220106BHJP
A61K 47/61 20170101ALI20220106BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20220106BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220106BHJP
A61K 47/58 20170101ALI20220106BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20220106BHJP
A61K 49/18 20060101ALI20220106BHJP
A61K 51/12 20060101ALI20220106BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20220106BHJP
【ＦＩ】
A61K47/54
A61K47/62
A61K51/04 200
A61K51/02 200
A61K45/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K47/61
A61K45/00 101
A61K47/60
A61P35/00
A61K47/58
A61K49/00
A61K49/18
A61K51/02 100
A61K51/04 300
A61K51/12 200
A61K9/127 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021522360
(86)(22)【出願日】2019-10-24
(85)【翻訳文提出日】2021-06-17
(86)【国際出願番号】 IL2019051153
(87)【国際公開番号】W WO2020084623
(87)【国際公開日】2020-04-30
(31)【優先権主張番号】62/749,794
(32)【優先日】2018-10-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519374944
【氏名又は名称】エイピーエイ－ アドバンスト・テクノロジーズ・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡＰＡ－ ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ヌデルマン、イーゴリ
(72)【発明者】
【氏名】カネティ、ガロズ
(72)【発明者】
【氏名】ミリツィン、ルスラナ
(72)【発明者】
【氏名】ゴールドソベル、アビ
(72)【発明者】
【氏名】シュローダー、アビ
(72)【発明者】
【氏名】ゲルション、デビッド
(72)【発明者】
【氏名】アルカレー、ハイム
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076AA95
4C076CC41
4C076EE59
4C076FF68
4C084AA12
4C084AA17
4C084MA24
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4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA13
4C085BB11
4C085HH03
4C085HH07
4C085HH11
4C085JJ05
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4C085KB05
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4C085KB08
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4C085KB12
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4C085KB19
4C085KB26
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4C085KB56
4C085KB78
(57)【要約】
【課題】融合性リポソーム及びそれを用いた癌の処置方法を提供する。
【解決手段】 内部の水性コンパートメント内にあるまたはリポソーム膜に結合されている、検出可能な作用物質および必要に応じて細胞傷害性薬物を含み、前記融合性リポソームは、１４～２４個の炭素原子を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層を含み、前記脂質分子の少なくとも１つは、カチオン性基、カチオン性天然高分子もしくはカチオン性合成高分子、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性の癌細胞結合ペプチドをさらに含み；前記脂質分子の少なくとも１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル－ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ（アクリロイルモルホリン）およびポリアクリルアミドからなる群より選択される安定化部分をさらに含む、融合性リポソームを調製する。
【解決手段】 内部の水性コンパートメント内にあるまたはリポソーム膜に結合されている、検出可能な作用物質および必要に応じて細胞傷害性薬物を含み、前記融合性リポソームは、１４～２４個の炭素原子を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層を含み、前記脂質分子の少なくとも１つは、カチオン性基、カチオン性天然高分子もしくはカチオン性合成高分子、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性の癌細胞結合ペプチドをさらに含み；前記脂質分子の少なくとも１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル－ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ（アクリロイルモルホリン）およびポリアクリルアミドからなる群より選択される安定化部分をさらに含む、融合性リポソームを調製する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
内部の水性コンパートメント内にあるまたはリポソーム膜に結合されている、検出可能な作用物質および必要に応じて細胞傷害性薬物を含む融合性リポソームであって、前記融合性リポソームは、１４～２４個の炭素原子を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層を含み、前記脂質分子の少なくとも１つは、カチオン性基、カチオン性天然高分子もしくはカチオン性合成高分子、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性の癌細胞結合ペプチドをさらに含み；
前記脂質分子の少なくとも１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル－ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ（アクリロイルモルホリン）およびポリアクリルアミドからなる群より選択される安定化部分をさらに含む、融合性リポソーム。
【請求項2】
前記検出可能な作用物質が、蛍光プローブ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）用またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の造影剤および光力学剤から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記検出可能な作用物質が、（ａ）ｃｙ３、ｃｙ５、ｃｙ５．５、ｃｙ７ ｃｙ９、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７９０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７５０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７００、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６８０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６６０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６４７、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６３３、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５９４、５８５ｎｍ～８００ｎｍの範囲のＱｄｏｔ、蛍光プロトポルフィリンオリゴマー、イソシアニングリーン（ＩＣＧ）から選択される蛍光プローブ；または（ｂ）フルオレセインアナログ（例えば、ジアセテート修飾アナログ）、クマリンアナログ（例えば、ｐｙ＋ＢＣ６９０－（１－メチル－４－（２－オキソ－８－（ピロリジン－１－イル）－２Ｈ－ベンゾ［ｇ］クロメン－３－イル）ピリジニウムトリフルオロメタンスルホネート））、ＣＦＳＥ（５（６）－カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－スクシンイミジルエステル）、ローダミンアナログ（例えば、ｇＧｌｕ－ＨＭＲＧ（γ－グルタミルヒドロキシメチルローダミングリーン））、クルクミノイドジフルオロボロンベースの腫瘍標的化γ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）によって活性化可能な）蛍光プローブ（Ｇｌｕ－ＤＦＢ）およびインドシアニンアナログ（例えば、ＡＰ－Ｇｌｕ（３Ｈ－インドリウム、２－［（１Ｅ）－２－［４－［［４－［［（４Ｓ）－４－アミノ－４－カルボキシ－１－オキソブチル］アミノ］フェニル］メトキシ］フェニル］エテニル］－１－（５－カルボキシペンチル）－３，３－ジメチル－，ブロミド（１：１）、ならびに他の近赤外蛍光活性化分子から選択される活性化可能な蛍光プローブ
である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＭＲＩ用の造影剤が、酸化鉄造影剤（例えば、磁鉄鉱、Ｆｅ３Ｏ４）；硫酸バリウム；およびガドリニウム造影剤（例えば、ガドテレート、ガドジアミド、ガドベネート、ガドペンテテート、ガドブトロール）から選択されるか；ＣＴ用の造影剤が、金属元素（例えば、ヨウ素、ビスマス、臭素、タンタル、金、白金、イッテルビウム、イットリウム、ガドリニウム、タングステン、インジウムおよびルテチウム）から選択されるか；または前記ＰＥＴ用の造影剤が、６４Ｃｕ－ＰＳＴＭ、１８Ｆ－ＦＤＧ、１８Ｆ－フッ化物、１８Ｆ－フルオロミソニダゾールおよびガリウムから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記脂質分子の少なくとも１つが、特異的結合対の相補的な第２の官能基に結合することができる、前記結合対の第１の官能基で官能化されている、請求項１に記載の融合性リポソーム。
【請求項6】
前記融合性リポソームが、前記脂質二重層と前記第１の官能基との間に第１のスペーサーをさらに含む、請求項５に記載の融合性リポソーム。
【請求項7】
各々が、前記相補的な第２の官能基で官能化されており、かつ前記第２の官能基を介して前記第１の官能基に結合されている、同一のもしくは異なる追加の検出可能な作用物質または免疫系活性化剤をさらに含み、ここで、前記同一のまたは異なる追加の検出可能な作用物質は、蛍光プローブおよび磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）用またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の造影剤から選択される、請求項５に記載の融合性リポソーム。
【請求項8】
前記免疫系活性化剤が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体またはそれらの組み合わせ、ＣＤ３とＣＤ８の両方に結合することができる抗体、およびＣＤ３とＮＫＧ２Ｄの両方に結合することができる抗体から選択される作用物質である、請求項７に記載の融合性リポソーム。
【請求項9】
前記検出可能な作用物質または免疫系活性化剤が、融合性リポソームの外葉において結合されている、請求項７に記載の融合性リポソーム。
【請求項10】
前記検出可能な作用物質または免疫系活性化剤が、前記検出可能な作用物質または免疫系活性化剤と前記第２の官能基との間に第２のスペーサーをさらに含む、請求項７に記載の融合性リポソーム。
【請求項11】
前記第１のスペーサーが、ＰＥＧ、（Ｃ６－Ｃ１２）アルキル、フェノール酸、安息香酸またはナフトエ モノ、ジ－またはトリカルボン酸、テトラヒドロピレンモノ－、ジ－もしくはトリ－カルボン酸またはそれらの塩、環状エーテル、グルタル酸、コハク酸、ムコン酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸およびセバシン酸、ならびに約２～２０アミノ酸残基長、例えば、３アミノ酸残基長のポリＧｌｙペプチドなどのペプチドからなる群より選択される、請求項６に記載の融合性リポソーム。
【請求項12】
前記第１または第２のスペーサーが、約１０６Ｄａ～約４ｋＤａの分子量のＰＥＧである、請求項１１に記載の融合性リポソーム。
【請求項13】
ＰＥＧが、約１９４Ｄａの分子量のＰＥＧ（ＰＥＧ４）である、請求項１２に記載の融合性リポソーム。
【請求項14】
前記第１のスペーサーが、（Ｃ６－Ｃ１２）アルキル、好ましくは、ヘプチルまたはドデカノイルである、請求項１１に記載の融合性リポソーム。
【請求項15】
カチオン性基を含む脂質分子の前記少なくとも１つが、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（１８：０ＤＤＡＢ）およびＮ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチル－カルボキサミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド（ＭＶＬ５）から選択される、請求項１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【請求項16】
カチオン性基を含む前記脂質分子の前記少なくとも１つが、ＤＯＴＡＰである、請求項１５に記載の融合性リポソーム。
【請求項17】
前記カチオン性合成高分子が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびポリ（２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレートから選択される、請求項１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【請求項18】
前記カチオン性天然高分子が、キトサンである、請求項１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【請求項19】
前記カチオン性アミノ糖が、グルコサミンである、請求項１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【請求項20】
前記カチオン性ポリアミノ酸が、ポリ（Ｌ－リジン）、ポリ（Ｌ－アルギニン）、ポリ（Ｄ－リジン）、ポリ（Ｄ－アルギニン）、ポリ（Ｌ－オルニチン）およびポリ（Ｄ－オルニチン）から選択される、請求項１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【請求項21】
前記両親媒性の癌細胞結合ペプチドが、セクロピンＡ；セクロピンＡ １－８；および環状ＣＮＧＲＣから選択される、請求項１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【請求項22】
前記脂質分子の前記少なくとも１つが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるリン脂質であり、それらのそれぞれ１つが、１つまたは２つの同一のまたは異なる脂肪酸残基を含み、前記ホスファチジル部分における脂肪酸残基は、飽和、一不飽和または多価不飽和であり、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４個の炭素という炭素鎖長（例えば、リン脂質配置およびリゾリン脂質配置の、ミリストイル、ステアロイル、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル（共役リノレノイルを含む）、アラキドノイルおよびそれらの組み合わせ）を有する、請求項１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【請求項23】
前記リン脂質が、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および１，２－ジオレオイル－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２－ジミリストイル－３－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）；１，２－ジステアロイル－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）；１，２－ジミリストレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジミリステライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）；１，２－ジパルミトレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジパルミテライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）；１，２－ジペトロセレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ６－Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジオレオイル－３－ホスファチジルコリン（１８：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ（ＤＯＰＣ））；１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）；１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：２（Ｃｉｓ）ＰＣ（ＤＬＰＣ））；１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：３（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：４（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：６（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジネルボノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２４：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジミリストイル－３－－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）；１，２－ジパルミトイル－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）；ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）；１，２－ジオレオイル－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２－ジステアロイル－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）；１，２－ジミリストイル－３－ホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）；１，２－ジパルミトイル－３－ホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）；パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；および１，２－ジオレオイル－３－ホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）からなる群より選択される、請求項２２に記載の融合性リポソーム。
【請求項24】
前記リン脂質が、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰＰＥから選択される、請求項２３に記載の融合性リポソーム。
【請求項25】
前記安定化部分が、約１０６Ｄａ～約４ｋＤａの分子量のＰＥＧである、請求項１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【請求項26】
ＰＥＧが、約２ｋＤａの分子量である、請求項２５に記載の融合性リポソーム。
【請求項27】
前記安定化部分が、切断可能なペプチドリンカーを介して前記脂質分子の少なくとも１つに接続されている、請求項１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【請求項28】
前記特異的結合対の前記第１の官能基が、前記結合対の前記相補的な第２の官能基と共有結合を形成することができる、請求項４～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【請求項29】
前記特異的結合対の前記第１の官能基が、クリックケミストリー反応を介して前記結合対の前記相補的な第２の官能基と共有結合を形成することができる、請求項２８に記載の融合性リポソーム。
【請求項30】
ｉ）前記特異的結合対の第１の官能基が、アルキンまたはホスフィンであり、前記結合対の第２の官能基が、アジドであるか、またはその逆であるか；ｉｉ）前記特異的結合対の第１の官能基が、シクロアルケン、シクロアルキン、シクロプロパン、イソニトリル（イソシアニド）またはビニルボロン酸であり、前記結合対の第２の官能基が、テトラジンであるか、またはその逆であるか；ｉｉｉ）前記特異的結合対の第１の官能基が、アルキンまたはマレイミドであり、前記結合対の第２の官能基が、チオールであるか、またはその逆であるか；ｉｖ）前記特異的結合対の第１の官能基が、共役ジエンであり、前記結合対の第２の官能基が、置換アルケンであるか、またはその逆であるか；ｖ）前記特異的結合対の第１の官能基が、アルケン、アルキンまたはアセチレン化銅であり、前記結合対の第２の官能基が、ニトロンであるか、またはその逆であるか；ｖｉ）前記特異的結合対の第１の官能基が、アルデヒドまたはケトンであり、前記結合対の第２の官能基が、アルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはヒドラジドであるか、またはその逆であるか；またはｖｉｉ）前記特異的結合対の第１の官能基が、アルデヒド、ケトン、イソチオシアネート、カルボン酸またはその誘導体（例えば、エステル、無水物、ハロゲン化アシル、トシルおよびＮ－ヒドロスクシンイミド（ＮＨＳ））であり、前記結合対の第２の官能基が、アミンであるか、またはその逆であるか；ｖｉｉｉ）官能基である、請求項２８に記載の融合性リポソーム。
【請求項31】
前記特異的結合対が、アルキン－アジドである、請求項３０に記載の融合性リポソーム。
【請求項32】
前記特異的結合対の前記第１の官能基が、前記結合対の前記相補的な第２の官能基と非共有結合を形成することができる、請求項４～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【請求項33】
前記特異的結合対の第１の官能基が、ビオチンであり、前記結合対の第２の官能基が、ビオチン結合ペプチドまたはビオチン結合タンパク質から選択される結合パートナーであるか、またはその逆である、請求項３２に記載の融合性リポソーム。
【請求項34】
前記ビオチン結合タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジンおよび抗ビオチン抗体から選択される、請求項３３に記載の融合性リポソーム。
【請求項35】
前記ビオチン結合ペプチドが、ＡＥＧＥＦＣＳＷＡＰＰＫＡＳＣＧＤＰＡＫ（配列番号１）、ＣＳＷＲＰＰＦＲＡＶＣ（配列番号２）、ＣＳＷＡＰＰＦＫＡＳＣ（配列番号３）およびＣＮＷＴＰＰＦＫＴＲＣ（配列番号４）から選択される、請求項３４に記載の融合性リポソーム。
【請求項36】
前記融合性リポソームが、コレステロール（ＣＨＯ）またはその誘導体をさらに含む、請求項１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【請求項37】
前記融合性リポソームが、ＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥまたはＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋおよび必要に応じてコレステロールを含み、ここで、ＰＥＧ２Ｋは、約２ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを表し、ＤＯＰＣの相対モル量は、最大約８０％であり、ＤＯＴＡＰの相対モル量は、最大約８０％であり、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋの相対モル量は、最大約２０％であり、ＤＯＰＥの相対モル量は、最大約２０％であり、コレステロールの相対モル量は、最大約４０％である、請求項１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【請求項38】
前記融合性リポソームが、（iii）５２．５：３５：０．６：１０、５２．５：３５：１．２５：１０、５２．５：３５：２．５：１０、５２．５：３５：５：１０、５２．５：３５：０．６：５、５２．５：３５：１．２５：５、５２．５：３５：２．５：５、５２．５：３５：５：５、６５：２０：５：１０、５０：３５：５：１０、５２．５：３５：１．２５：７、５２．５：３５：１．２５：５または５２．５：３５：２．５：７というモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ；または
（iv）５２．５：３５：０．６、５２．５：３５：１．２５、５２．５：３５：２．５、５２．５：３５：５、５２．５：３５：０．６、５２．５：３５：１．２５、５２．５：３５：２．５、５２．５：３５：５、６５：２０：５、５０：３５：５、５２．５：３５：１．２５、５２．５：３５：１．２５または５２．５：３５：２．５というモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ
を含む、請求項３７に記載の融合性リポソーム。
【請求項39】
前記融合性リポソームが、５２．５：３５：２．５：５というモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ；または５２．５：３５：２．５というモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋを含む、請求項３８に記載の融合性リポソーム。
【請求項40】
前記リポソームの融解温度（Ｔｍ）が、４５℃未満であり、その温度において、前記融合性リポソームが、非結晶転移相で維持されることにより、リポソームと細胞膜との融合に必要な膜の流動性がもたらされる、請求項１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【請求項41】
前記融合性リポソームが、最大２００ｎｍのサイズ、例えば、約１５ｎｍ～約２００ｎｍ、約２０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約１１０ｎｍ～約２００ｎｍ、例えば、約１００ｎｍを有する、請求項１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【請求項42】
癌細胞を選択的に検出するための方法であって、前記癌細胞を請求項１に記載の融合性リポソームと接触させる工程；および前記検出可能な作用物質が、活性化可能な蛍光プローブである場合は、その蛍光プローブによって吸収される波長を有する光を細胞に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって、前記蛍光プローブを検出する工程；前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画する工程、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出する工程を含む、方法。
【請求項43】
癌患者における癌細胞の選択的な検出が、ナノ粒子に含められた制癌剤による癌の処置に対する前記癌患者の応答性を示唆する、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
応答性と判断された癌患者が、前記制癌剤を含むナノ粒子で処置される、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
癌細胞を選択的に検出するための方法であって、（ａ）前記癌細胞を請求項５に記載の官能化された融合性リポソームと接触させる工程；（ｂ）前記癌細胞を、蛍光プローブおよび磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）用またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の造影剤から選択される検出可能な作用物質と接触させる工程であって、ここで、前記検出可能な作用物質は、前記脂質分子の前記第１の官能基に結合することができる、結合対の相補的な第２の官能基で官能化されている、工程；および（ｃ）前記検出可能な作用物質が蛍光プローブである場合は、その蛍光プローブによって吸収される波長を有する光を細胞に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって、前記蛍光プローブを検出し；前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画し、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出し、それにより、前記癌細胞を選択的に検出する工程を含む、方法。
【請求項46】
前記検出可能な作用物質が、（ａ）ｃｙ３、ｃｙ５、ｃｙ５．５、ｃｙ７ ｃｙ９、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７９０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７５０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７００、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６８０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６６０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６４７、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６３３、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５９４、５８５ｎｍ～８００ｎｍの範囲のＱｄｏｔ、蛍光プロトポルフィリンオリゴマー、イソシアニングリーン（ＩＣＧ）から選択される蛍光プローブ；または（ｂ）フルオレセインアナログ（例えば、ジアセテート修飾アナログ）、クマリンアナログ（例えば、ｐｙ＋ＢＣ６９０－（１－メチル－４－（２－オキソ－８－（ピロリジン－１－イル）－２Ｈ－ベンゾ［ｇ］クロメン－３－イル）ピリジニウムトリフルオロメタンスルホネート））、ＣＦＳＥ（５（６）－カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－スクシンイミジルエステル）、ローダミンアナログ（例えば、ｇＧｌｕ－ＨＭＲＧ（γ－グルタミルヒドロキシメチルローダミングリーン））、クルクミノイドジフルオロボロンベースの腫瘍標的化γ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）によって活性化可能な）蛍光プローブ（Ｇｌｕ－ＤＦＢ）およびインドシアニンアナログ（例えば、ＡＰ－Ｇｌｕ（３Ｈ－インドリウム、２－［（１Ｅ）－２－［４－［［４－［［（４Ｓ）－４－アミノ－４－カルボキシ－１－オキソブチル］アミノ］フェニル］メトキシ］フェニル］エテニル］－１－（５－カルボキシペンチル）－３，３－ジメチル－，ブロミド（１：１））から選択される活性化可能な蛍光プローブである、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
癌患者における癌細胞の選択的な検出が、ナノ粒子に含められた制癌剤による癌の処置に対する前記癌患者の応答性を示唆する、請求項４５に記載の方法。
【請求項48】
応答性と判断された癌患者が、前記制癌剤を含むナノ粒子で処置される、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
蛍光ガイド手術または標的化放射線治療によって癌を処置するための方法であって、前記方法は、請求項４２又は４５に記載の方法および癌細胞を含む腫瘍を除去する工程を含む、方法。
【請求項50】
前記癌患者が、皮膚癌などの腫瘍のイメージングまたは全身イメージングを受けており、前記方法が、前記融合性リポソームおよび必要に応じて前記官能化された検出可能な作用物質を全身投与する工程または局所的に適用する工程；および前記検出可能な作用物質が、活性化可能な蛍光プローブまたは蛍光プローブである場合は、皮膚の領域または全身に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって前記蛍光プローブを検出し、前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画し、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出し、皮膚などの器官の領域または全身を走査し、それにより、腫瘍の位置および縁を明確化する工程を含む、請求項４２又は４５に記載の方法。
【請求項51】
請求項５０に記載の方法および癌細胞を含む腫瘍を除去する工程を含む、癌を処置するための方法。
【請求項52】
癌細胞の選択的検出を必要とする癌患者から取り出された組織または血液由来画分における癌細胞をエキソサイチュで選択的に検出するための請求項４２または４５に記載の方法であって、前記方法は、前記融合性リポソーム、および必要に応じて、官能化された蛍光プローブを、全身投与するかまたは前記組織もしくは血液由来画分に適用する工程、ならびに前記組織または血液由来画分に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって前記蛍光プローブを検出し、それにより、前記癌細胞を選択的に検出する工程を含む、請求項４２または４５に記載の方法。
【請求項53】
前記組織が、皮膚であり、前記癌患者が、皮膚癌を除去するための手術（モース術）を受けており、前記手術は、前記皮膚組織が、検出可能な癌細胞を有さなくなるまで反復される、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記血液由来画分中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を選択的に検出するための、請求項５２に記載の方法。
【請求項55】
前記癌が、トリプルネガティブ乳癌などの乳癌、メラノーマ、肺癌、甲状腺癌および前立腺癌の群から選択される、請求項４２又は４５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項56】
癌細胞を選択的に検出し、癌を処置するための、請求項４２または４５に記載の方法であって、前記方法は、前記融合性リポソームおよび必要に応じて前記官能化された検出可能な作用物質を全身投与するかまたは局所的に適用する工程であって、ここで、前記融合性リポソームは、前記検出可能な作用物質ならびに細胞傷害剤および／または免疫系活性化剤を含む、工程；前記検出可能な作用物質が、活性化可能な蛍光プローブまたは蛍光プローブである場合は、皮膚の領域または全身に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって前記蛍光プローブを検出する工程、前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画する工程、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出する工程；および必要に応じて、前記検出可能な作用物質を長時間繰り返し検出することによって、処置の応答をモニタリングする工程を含む、請求項４２または４５に記載の方法。
【請求項57】
（ａ）１４～２４個の炭素原子を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層を含み、前記脂質分子の少なくとも１つは、カチオン性基、カチオン性天然高分子もしくはカチオン性合成高分子、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性の癌細胞結合ペプチドを含み；前記脂質分子の少なくとも１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル－ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ（アクリロイルモルホリン）およびポリアクリルアミドからなる群より選択される安定化部分をさらに含み、 該脂質分子の少なくとも１つが、特異的結合対の相補的な第２の官能基に結合することができる、前記結合対の第１の官能基で官能化されている、融合性リポソームを含む第１の容器；
（ｂ）蛍光プローブおよび磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）用またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の造影剤から選択される検出可能な作用物質を含む第２の容器であって、前記検出可能な作用物質は、前記脂質分子の前記第１の官能基に結合することができる、結合対の相補的な第２の官能基で官能化されている、第２の容器；および
（ｃ）（ａ）の融合性リポソームおよび続いて（ｂ）の検出可能な作用物質を癌患者に投与する工程を含む癌細胞を選択的に検出するための方法についての指示を含むパンフレットを備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、癌細胞を選択的に検出するための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
蛍光検出（国際公開第０３／０５７２５９号パンフレット、米国特許第８，９５６，５９１号明細書、米国特許第９，２８９，５１７号明細書）、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）および超音波イメージングは、癌病変を画像化する方法として一般的に用いられる。しかしながら、これらの手法は、腫瘍の部位を間接的に標識するものであり、癌細胞自体の選択的な標識を促進するわけではない。ゆえに、癌細胞の選択的イメージングの方法が緊急に必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】国際公開第０３／０５７２５９号パンフレット
【特許文献2】米国特許第８，９５６，５９１号明細書
【特許文献3】米国特許第９，２８９，５１７号明細書
【発明の概要】
【0004】
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＬ２０１８／０５０４３４（本明細書中に完全に開示されたかのように参照により援用される）には、融合性リポソームおよび癌を処置する際のそれらの使用が開示されている。この癌選択的な融合性リポソームは、全身投与することができ、インビボ条件下において癌細胞と融合すると本明細書中で示される。この癌選択的なリポソームはさらに、検出可能な部分を身体内の癌の部位に運ぶためにも使用することができる。癌細胞と選択的に融合する（かつ正常細胞とは融合しない）というこれらのリポソームの固有の能力を、癌細胞を選択的に検出するために本発明において利用する。
【0005】
１つの態様において、本発明は、内部の水性コンパートメント内にあるまたはリポソーム膜に結合されている、検出可能な作用物質および必要に応じて細胞傷害性薬物を含む融合性リポソームを提供し、
ここで、前記融合性リポソームは、１４～２４個の炭素原子を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層を含み、前記脂質分子の少なくとも１つは、カチオン性基、カチオン性天然高分子もしくはカチオン性合成高分子、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性の癌細胞結合ペプチドをさらに含み；
前記脂質分子の少なくとも１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル－ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ（アクリロイルモルホリン）およびポリアクリルアミドからなる群より選択される安定化部分をさらに含む。
ここで、前記融合性リポソームは、１４～２４個の炭素原子を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層を含み、前記脂質分子の少なくとも１つは、カチオン性基、カチオン性天然高分子もしくはカチオン性合成高分子、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性の癌細胞結合ペプチドをさらに含み；
前記脂質分子の少なくとも１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル－ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ（アクリロイルモルホリン）およびポリアクリルアミドからなる群より選択される安定化部分をさらに含む。
【0006】
追加の態様において、本発明は、癌細胞を選択的に検出するための方法を提供し、その方法は、前記癌細胞を本明細書中で定義される融合性リポソームと接触させる工程；および前記検出可能な作用物質が、活性化可能な蛍光プローブである場合は、その蛍光プローブによって吸収される波長を有する光を細胞に照射し、励起した蛍光プローブから放射される光を検出することによって、前記蛍光プローブを検出する工程；前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画する工程、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出する工程を含む。
【0007】
さらなる態様において、本発明は、癌細胞を選択的に検出するための方法を提供し、その方法は、（ａ）官能化された融合性リポソームに関する上記の実施形態のいずれか１つに係る官能化された融合性リポソームと前記癌細胞を接触させる工程；（ｂ）蛍光プローブおよび磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）用またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の造影剤から選択される検出可能な作用物質と前記癌細胞を接触させる工程であって、ここで、前記検出可能な作用物質は、前記脂質分子の前記第１の官能基に結合することができる、結合対の相補的な第２の官能基で官能化されている、工程；および（ｃ）前記検出可能な作用物質が蛍光プローブである場合は、その蛍光プローブによって吸収される波長を有する光を細胞に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって、前記蛍光プローブを検出し；前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画し、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出し、それにより、前記癌細胞を選択的に検出する工程を含む。
【0008】
なおも追加の態様において、本発明は、蛍光ガイド手術または標的化放射線治療によって癌を処置するための方法を提供し、前記方法は、上記に定義された癌細胞を選択的に検出するための方法および癌細胞を含む腫瘍を除去するための方法のうちの１つを含む。
【0009】
上記に定義された癌細胞を選択的に検出するための方法のいずれか１つのある特定の実施形態において、癌患者は、皮膚癌などの腫瘍のイメージングまたは全身イメージングを受けており、その方法または使用は、融合性リポソーム、および必要に応じて、官能化された検出可能な作用物質を全身投与するかまたは局所的に適用すること；および前記検出可能な作用物質が、活性化可能な蛍光プローブまたは蛍光プローブである場合は、皮膚の領域または全身に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって、前記蛍光プローブを検出し、前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、皮膚などの器官の領域または全身を走査するＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画し、それにより、腫瘍の位置および縁を明確化することを含む。
【0010】
なおもさらなる態様において、本発明は、癌を処置するための方法を提供し、その方法は、癌患者が皮膚癌などの腫瘍のイメージングまたは上に記載された全身イメージングを受けている方法および癌細胞を含む腫瘍を外科的に除去する工程を含む。
【0011】
さらに別の態様において、本発明は、（ａ）１４～２４個の炭素原子を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層を含む融合性リポソームを含む第１の容器であって、前記脂質分子の少なくとも１つは、カチオン性基、カチオン性天然高分子もしくはカチオン性合成高分子、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性の癌細胞結合ペプチドをさらに含み；前記脂質分子の少なくとも１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル－ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ（アクリロイルモルホリン）およびポリアクリルアミドからなる群より選択される安定化部分をさらに含み；前記脂質分子の少なくとも１つは、特異的結合対の相補的な第２の官能基に結合することができる前記結合対の第１の官能基で官能化されている、第１の容器；（ｂ）蛍光プローブおよび磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）用またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の造影剤から選択される検出可能な作用物質を含む第２の容器であって、ここで、前記検出可能な作用物質は、前記脂質分子の前記第１の官能基に結合することができる、結合対の相補的な第２の官能基で官能化されている、第２の容器；および（ｃ）（ａ）の融合性リポソームおよび続いて（ｂ）の検出可能な作用物質を癌患者に投与する工程を含む癌細胞を選択的に検出するための方法についての指示を含むパンフレットを備えるキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1A】図１Ａは、マウスにおけるトリプルネガティブ乳癌のインサイチュ検出の写真を示している。ＩＣＧをロードされたリポソームをＩＶ注射した２４時間後に、腫瘍保有マウスを、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて画像化した。腫瘍シグナル（ｍＣｈｅｒｒｙ）を記録した。Ａの画像に示されているマウスに注射されたリポソームは、ＰＥＧ４－アジドを用いて修飾したリポソームである。
【図1B】図１Ｂは、マウスにおけるトリプルネガティブ乳癌のインサイチュ検出の写真を示している。ＩＣＧをロードされたリポソームをＩＶ注射した２４時間後に、腫瘍保有マウスを、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて画像化した。リポソームシグナル（ＩＣＧ）を記録した。Ｂの画像に示されているマウスに注射されたリポソームは、ＰＥＧ４－アジドを用いて修飾したリポソームである。
【図1C】図１Ｃは、マウスにおけるトリプルネガティブ乳癌のインサイチュ検出の写真を示している。ＩＣＧをロードされたリポソームをＩＶ注射した２４時間後に、腫瘍保有マウスを、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて画像化した。腫瘍シグナル（ｍＣｈｅｒｒｙ）を記録した。パネルＣに示されているマウスには、ＰＥＧ４－ビオチンで修飾されたリポソームを注射した。
【図1D】図１Ｄは、マウスにおけるトリプルネガティブ乳癌のインサイチュ検出の写真を示している。ＩＣＧをロードされたリポソームをＩＶ注射した２４時間後に、腫瘍保有マウスを、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて画像化した。リポソームシグナル（ＩＣＧ）を記録した。パネルＤに示されているマウスには、ＰＥＧ４－ビオチンで修飾されたリポソームを注射した。
【図2A】図２Ａは、注射の４８時間後の器官の蛍光像および非蛍光像のオーバーレイ画像を示している。ＩＣＧをロードされたリポソームをＩＶ注射した４８時間後に、マウスを屠殺し、器官を取り出し、図１Ａ～図１Ｄと同一条件下（励起および発光）で画像化して、リポソームからのＩＣＧシグナルを測定した。器官の順序は、上部から下部、左から右に：肺、肝臓、脾臓、腎臓、腫瘍。未処置のマウス（Ａ）を、閾値レベルを測定するために用いた。
【図2B】図２Ｂは、注射の４８時間後の器官の蛍光像および非蛍光像のオーバーレイ画像を示している。ＩＣＧをロードされたリポソームをＩＶ注射した４８時間後に、マウスを屠殺し、器官を取り出し、図１Ａ～図１Ｄと同一条件下（励起および発光）で画像化して、リポソームからのＩＣＧシグナルを測定した。器官の順序は、上部から下部、左から右に：肺、肝臓、脾臓、腎臓、腫瘍。アジド修飾リポソーム（Ｂ）からの３匹のマウスからの器官は、腫瘍および肝臓における蛍光シグナルを示している。
【図2C】図２Ｃは、注射の４８時間後の器官の蛍光像および非蛍光像のオーバーレイ画像を示している。ＩＣＧをロードされたリポソームをＩＶ注射した４８時間後に、マウスを屠殺し、器官を取り出し、図１Ａ～図１Ｄと同一条件下（励起および発光）で画像化して、リポソームからのＩＣＧシグナルを測定した。器官の順序は、上部から下部、左から右に：肺、肝臓、脾臓、腎臓、腫瘍。ビオチン修飾リポソーム（Ｃ）からの３匹のマウスからの器官は、腫瘍および肝臓における蛍光シグナルを示している。
【図3A】図３Ａは、最後の注射の２４時間後のＧｄ－ＤＴＰＡの腫瘍到達および体内分布プロファイルと比べた、腫瘍保有マウスの腫瘍における蛍光シグナルの変化を示している。ガドリニウム（Ｇｄ）とインドシアニングリーン（ＩＣＧ）とを同時ロードされたリポソームであって、Ｔ細胞活性化抗体（抗ＣＤ３および抗ＣＤ８）に結合したリポソームを、腫瘍保有マウスに注射して、２回目の処置の腫瘍部位への到達を試験することにより、処置間の最適な間隔を決定した。この概念証明では、ＭＲＩ造影剤であるＧｄ－ＤＴＰＡと蛍光プローブＩＣＧとの送達を比較する。Ａ．腫瘍のＧｄレベルを、３３５．０４８ｎｍ発光におけるＩＣＰ解析を用いて測定した。単回の処置を、４８時間後（鉛直線）、７２時間後（斜めの四角形）および９６時間後（水平線）における２回目の処置と比較した。Ｎ＝１群あたり４匹の動物。
【図3B】図３Ｂは、最後の注射の２４時間後のＧｄ－ＤＴＰＡの腫瘍到達および体内分布プロファイルと比べた、腫瘍保有マウスの腫瘍における蛍光シグナルの変化を示している。ガドリニウム（Ｇｄ）とインドシアニングリーン（ＩＣＧ）とを同時ロードされたリポソームであって、Ｔ細胞活性化抗体（抗ＣＤ３および抗ＣＤ８）に結合したリポソームを、腫瘍保有マウスに注射して、２回目の処置の腫瘍部位への到達を試験することにより、処置間の最適な間隔を決定した。この概念証明では、ＭＲＩ造影剤であるＧｄ－ＤＴＰＡと蛍光プローブＩＣＧとの送達を比較する。Ｂ．ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＣＴインビボイメージングシステムを用いて、ｍＣｈｅｒｒｙ（腫瘍）およびＩＣＧ（リポソーム）シグナルを記録した。ｍＣｈｅｒｒｙシグナルを用いて、手作業で腫瘍関心領域を決定し、それを用いて１秒あたりのＩＣＧフォトンを記録した。示されているデータは、単回処置に対する２回目の処置の比である。エラーバーは、標準偏差を表している。
【図3C】図３Ｃは、最後の注射の２４時間後のＧｄ－ＤＴＰＡの腫瘍到達および体内分布プロファイルと比べた、腫瘍保有マウスの腫瘍における蛍光シグナルの変化を示している。ガドリニウム（Ｇｄ）とインドシアニングリーン（ＩＣＧ）とを同時ロードされたリポソームであって、Ｔ細胞活性化抗体（抗ＣＤ３および抗ＣＤ８）に結合したリポソームを、腫瘍保有マウスに注射して、２回目の処置の腫瘍部位への到達を試験することにより、処置間の最適な間隔を決定した。この概念証明では、ＭＲＩ造影剤であるＧｄ－ＤＴＰＡと蛍光プローブＩＣＧとの送達を比較する。Ｃ．ＩＣＰによって測定したリポソームの体内分布が、組織１グラムあたりのパーセント注射量として提示されている。腫瘍へのリポソーム到達を、単回の処置または異なる間隔での２回の処置における肝臓（水平線、脾臓（横長の四角形）、腎臓（鉛直線）心臓（斜線）および肺（斜めの四角形）と比較する。
【図4A】図４Ａは、ＩＣＧをロードされたリポソームを用いて処置されたマウス対未処置マウスにおけるリポソームのクリアランスおよびそれらの蓄積を示している。Ａ．４Ｔ１ｍＣｈｅｒｒｙ腫瘍保有マウスを、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて画像化して、腫瘍から放射されるｍＣｈｅｒｒｙシグナル（ｅｘ５７０ｎｍ、ｅｍ６４０ｎｍ、露光時間１秒）を処置当日に測定した（左のマウスおよび右のマウス）。
【図4B】図４Ｂは、ＩＣＧをロードされたリポソームを用いて処置されたマウス対未処置マウスにおけるリポソームのクリアランスおよびそれらの蓄積を示している。Ｂ．マウス（左から１番目および４番目のマウス）を、リポソームに結合した治療用抗体（抗ＣＤ３および抗ＣＤ８）とともに、共被包されたＩＣＧ－およびＧｄ－ＤＴＰＡで処置し、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて画像化して、動物の全身から放射されるリポソームＩＣＧシグナル（ｅｘ７４５ｎｍ、ｅｍ８７０ｎｍ、露光時間４秒）を処置当日に測定した。左から２番目および３番目のマウスは、ＩＣＧ－およびＧｄ－ＤＴＰＡリポソームを投与されなかった。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下の説明において、本願の様々な態様を記載する。本願の完全な理解を提供するために、説明の目的で、具体的な配置および詳細を示す。しかしながら、本願は、本明細書中に提示される具体的な詳細がなくても実施され得ることが当業者には明らかだろう。さらに、本願を不明瞭にしないために、周知の特徴は、省略または単純化されている場合がある。
【0014】
請求項において使用される用語「含む」は、「オープンエンド」であり、記載のエレメントまたはそれらの構造もしくは機能の等価物および記載されていない他の任意のエレメントを意味する。この用語は、その後に列挙される意味に限定されると解釈されるべきでなく、他のエレメントまたは工程を排除しない。この用語は、述べた特徴、整数、工程または構成要素の存在を、言及したとおりに明示すると解釈される必要があるが、他の１つ以上の特徴、整数、工程もしくは構成要素またはそれらの群の存在または追加を排除しない。したがって、「ｘおよびｚを含むデバイス」という表現の範囲は、構成要素ｘおよびｚだけからなるデバイスに限定されるべきでない。また、「工程ｘおよびｚを含む方法」という表現の範囲も、これらの工程だけからなる方法に限定されるべきでない。
【0015】
具体的に述べられていない限り、本明細書中で使用されるとき、用語「約」は、当該分野において通常許容される範囲内、例えば平均値の２標準偏差以内と理解される。１つの実施形態において、用語「約」は、それが使用されている数の報告されている数値の１０％以内、好ましくは、報告されている数値の５％以内を意味する。例えば、用語「約」は、述べた値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％以内であるとすぐに理解できる。他の実施形態において、用語「約」は、例えば、用いられた実験手法に応じて、より大きい変動の許容を意味することができる。特定の値の前記変動は、当業者によって理解され、本発明の文脈の範囲内である。例証として、「約１～約５」という数値範囲は、約１～約５という明示的に記載された値を含むだけでなく、その示された範囲内の個々の値および部分的な範囲も含むと解釈されるべきである。したがって、この数値範囲内に含まれるのは、２、３および４などの個々の値、ならびに例えば、１～３、２～４および３～５といった部分的な範囲、ならびに個々に１、２、３、４、５または６である。この同じ原理が、最小値または最大値として１つの数値だけが記載されている範囲にも適用される。別段文脈から明らかでない限り、本明細書中に提供されるすべての数値が、用語「約」によって修飾される。「実質的に」、「一般に」、「最大」などのような他の類似の用語も、それが絶対的なものではないように用語または値を修飾すると解釈される。そのような用語は、それらの用語が当業者によって理解されるように、それらが修飾する状況および用語によって定義される。これには、最低でも、値を計測するために使用される所与の実験、手法または機器に対する予想される実験誤差、技術的誤差および機器誤差の程度が含まれる。
【0016】
本明細書中で使用されるとき、用語「および／または」は、列挙される関連する項目の１つ以上の任意のおよびすべての組み合わせを含む。別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての用語（専門用語および科学用語を含む）が、本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。通常使用される辞書において定義される用語などの用語は、本明細書および関連分野の状況における意味と一致した意味を有すると解釈されるべきであって、本明細書中ではっきりと定義されない限り、理想的な意味または過度に正式な意味で解釈されるべきでないことがさらに理解される。周知の機能または構成は、簡潔および／または明確にするために、詳細に記載されていないことがある。
【0017】
正常細胞よりも癌細胞と好ましく融合する特性を有する融合性リポソームを用いることにより、インビボまたはインビトロにおいて癌細胞を選択的に検出し、可視化できることが本発明によって見出された。
【0018】
したがって、１つの態様において、本発明は、内部の水性コンパートメント内にあるまたはリポソーム膜に結合されている、検出可能な作用物質および必要に応じて細胞傷害性薬物を含む融合性リポソームを提供し、ここで、
前記融合性リポソームは、１４～２４個の炭素原子を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層を含み、前記脂質分子の少なくとも１つは、カチオン性基、カチオン性天然高分子もしくはカチオン性合成高分子、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性の癌細胞結合ペプチドをさらに含み；
前記脂質分子の少なくとも１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル－ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ（アクリロイルモルホリン）およびポリアクリルアミドからなる群より選択される安定化部分をさらに含む。
前記融合性リポソームは、１４～２４個の炭素原子を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層を含み、前記脂質分子の少なくとも１つは、カチオン性基、カチオン性天然高分子もしくはカチオン性合成高分子、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性の癌細胞結合ペプチドをさらに含み；
前記脂質分子の少なくとも１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル－ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ（アクリロイルモルホリン）およびポリアクリルアミドからなる群より選択される安定化部分をさらに含む。
【0019】
本明細書中で使用される用語「リポソーム」とは、リポソームの水性の内部を被包する、内葉および外葉から構成される脂質二重層を含む脂質ナノ粒子または構築物のことを指す。
【0020】
本明細書中で使用される用語「融合性リポソーム」とは、標的細胞の原形質膜と優先的に融合し、より少ない程度でエンドサイトーシスによって取り込まれる、リポソーム構築物のことを指す。
【0021】
一般に、本明細書中で定義されるように、用語「細胞を（の）標識」は、未修飾細胞と構造的に区別する、細胞の任意の修飾に関する。特に、本発明における細胞は、融合性リポソームの官能基または検出可能な作用物質で修飾されるかまたは「標識される」。
【0022】
本明細書中で使用される用語「安定化部分」とは、リポソームの脂質二重層内に組み込まれたとき、安定化部分を欠く同一のリポソームと比べてそのリポソームの血液循環半減期を延長する部分のことを指す。
【0023】
ある特定の実施形態において、検出可能な作用物質は、蛍光プローブ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）用またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の造影剤および光力学剤（ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ａｇｅｎｔ）から選択される。
【0024】
ある特定の実施形態において、検出可能な作用物質は、ｃｙ３、ｃｙ５、ｃｙ５．５、ｃｙ７ ｃｙ９、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７９０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７５０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７００、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６８０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６６０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６４７、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６３３、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５９４、５８５ｎｍ～８００ｎｍの範囲のＱｄｏｔ、蛍光プロトポルフィリンオリゴマー、イソシアニングリーン（ＩＣＧ）から選択される蛍光プローブ；またはエステル結合が切断可能な活性化可能なフルオロフォアの１タイプである活性化可能な蛍光プローブである。フルオロフォアに対するエステル修飾は、フルオロフォアを非蛍光にし、そのフルオロフォアは、リポソームが癌細胞と融合し、続いて細胞質エステラーゼによって細胞質で切断されると、蛍光性になる。
【0025】
ある特定の実施形態において、活性化可能な蛍光プローブは、フルオレセインアナログ（例えば、ジアセテート修飾アナログ）、クマリンアナログ（例えば、ｐｙ＋ＢＣ６９０－（１－メチル－４－（２－オキソ－８－（ピロリジン－１－イル）－２Ｈ－ベンゾ［ｇ］クロメン－３－イル）ピリジニウムトリフルオロメタンスルホネート））、ＣＦＳＥ（５（６）－カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－スクシンイミジルエステル）、ローダミンアナログ（例えば、ｇＧｌｕ－ＨＭＲＧ（γ－グルタミルヒドロキシメチルローダミングリーン））、クルクミノイドジフルオロボロンベースの腫瘍標的化γ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）によって活性化可能な）蛍光プローブ（Ｇｌｕ－ＤＦＢ）、インドシアニンアナログ（例えば、ＡＰ－Ｇｌｕ（３Ｈ－インドリウム、２－［（１Ｅ）－２－［４－［［４－［［（４Ｓ）－４－アミノ－４－カルボキシ－１－オキソブチル］アミノ］フェニル］メトキシ］フェニル］エテニル］－１－（５－カルボキシペンチル）－３，３－ジメチル－，ブロミド（１：１）、ＣＡＳ登録番号１８８４６９８－０６－９）および他の近赤外蛍光活性化分子から選択される。
【0026】
組織の自己蛍光が比較的低く、長波長の組織透過が、より短波長のものよりも良いので、インビボ条件下では近赤外フルオロフォア（６３０／６６１またはそれより長い波長；例えば、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６３３、ｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ ｆａｒ－ｒｅｄまたはＣｙ５）が好ましい。
【0027】
ある特定の実施形態において、ＭＲＩ用の造影剤は、酸化鉄造影剤（例えば、磁鉄鉱、Ｆｅ３Ｏ４）；硫酸バリウム；およびガドリニウム造影剤（例えば、ガドテレート、ガドジアミド、ガドベネート、ガドペンテテート、ガドブトロール）から選択されるか；ＣＴ用の造影剤は、金属元素（例えば、ヨウ素、ビスマス、臭素、タンタル、金、白金、イッテルビウム、イットリウム、ガドリニウム、タングステン、インジウムおよびルテチウム）から選択されるか；またはＰＥＴ用の造影剤は、６４Ｃｕ－ＰＳＴＭ、１８Ｆ－ＦＤＧ、１８Ｆ－フッ化物、１８Ｆ－フルオロミソニダゾールおよびガリウムから選択される。
【0028】
ある特定の実施形態において、光力学剤は、ポルフィマーナトリウム（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標））、Ｍｅｔｖｉｘ（登録商標）／Ｍｅｔｖｉｘｉａ、テモポルフィン／ｍＴＨＰＣ／Ｆｏｓｃａｎ、タラポルフィン／ＮＰｅ６／Ｌａｓｅｒｐｈｙｒｉｎ、Ｒｅｄａｐｏｒｆｉｎ（登録商標）／ＬＵＺ１１、Ｔｏｏｋａｄ、Ｐｈｏｔｏｃｈｌｏｒ、Ｆｏｔｏｌｏｎ、Ａｎｔｒｉｎ、Ｐｕｒｌｙｔｉｎ、ＴＬＤ１４３３、ＷＳＴ１１およびＬｕｔｅｘ、または金ナノ粒子（例えば、球状または路状のナノ粒子）から選択される。
【0029】
ある特定の実施形態において、複数の脂質の少なくとも１つの脂質の親水性頭部はそれぞれ、通常の条件下では他の分子への結合またはそれら自体の間における共有結合もしくは非共有結合性の高親和性結合体の形成に優先して互いに結合することができる結合対の第１の官能基または第２の官能基で官能化され、ここで、その結合対の第１の官能基および第２の官能基は、例えば、（ｉ）クリックケミストリー反応の反応基；または（ｉｉ）ビオチンおよびビオチン結合ペプチドもしくはビオチン結合タンパク質であるが、これらに限定されない。
【0030】
本明細書中で使用される用語「高親和性」とは、化学的会合もしくは生物物理的会合、例えば、キレート剤－金属の結合（例えば、Ｎｉと、Ｈｉｓ６などのいくつかのＨｉｓ残基を含むペプチド配列との結合）または結合対の２つのメンバー、例えば、抗体とその標的エピトープ、またはビオチンとストレプトアビジンなどの間の結合体化のことを指し、ここで、２つの結合対の間の会合は、１０－４Ｍ～１０－３０Ｍ、例えば、１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、１０－１２Ｍまたは１２－１３ＭというＫｄを有する。
【0031】
ある特定の実施形態において、前記脂質分子の少なくとも１つは、前記結合対の相補的な第２の官能基に結合することができる、特異的結合対の第１の官能基で官能化される。
【0032】
本明細書中で使用される用語「結合対」とは、異なる分子の対のことを指し、その分子の各々が、それ自体の特異的な官能基を含み、両方の官能基が、互いに対する（または互いに相補的な）特定の特異性を有する。換言すれば、これらの基は、通常の条件下では、他の分子への結合に優先して互いに結合することができる。その結合は、共有結合性であっても非共有結合性であってもよい。そのような結合対の非限定的な例は、チオール－マレイミド、アジド－アルキン、アルデヒド－ヒドロキシルアミンなどである。
【0033】
一般に、官能基は、分子の特徴的な化学反応に関与する、それらの分子内の原子または結合の特定の基または部分である。特に、本明細書中で定義される官能基または結合対の官能基とは、前記結合対の別の官能基（本明細書中以後、「第２の官能基」）に結合することができる、結合対の原子または結合の特定の反応基または部分（本明細書中以後、「第１の官能基」）のことを指す。上で述べたように、第１および第２の官能基は、互いに相補的である。上記の非限定的な例において、第１の官能基は、チオール、アジドまたはアルデヒドであり、それらの相補的な（第２の）官能基は、それぞれマレイミド、アルキンまたはヒドロキシルアミンである。
【0034】
一般に、本明細書中で定義される架橋試薬（または架橋剤）とは、タンパク質上または他の分子上の特定の反応基（第１級アミン、スルフヒドリルなど）に化学的に結合することができる２つ以上の反応性末端（官能基）を含む分子のことを指す。特に、本明細書中で定義される架橋剤は、官能基およびスペーサーを含む。
【0035】
ある特定の実施形態において、融合性リポソームは、脂質二重層と第１の官能基との間に第１のスペーサーをさらに含む。
【0036】
ある特定の実施形態において、融合性リポソーム 第１の官能基で官能化された前記脂質分子の少なくとも１つは、同一のもしくは異なる追加の検出可能な作用物質、光治療薬、すなわち光力学剤、または免疫系活性化剤をさらに含み、それらのそれぞれが、前記相補的な第２の官能基で官能化されており、前記第２の官能基を介して前記第１の官能基に結合され、ここで、前記追加の同一のまたは異なる検出可能な作用物質は、蛍光プローブおよび磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）用またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の造影剤から選択される。
【0037】
ある特定の実施形態において、免疫系活性化剤は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体またはそれらの組み合わせ、ＣＤ３とＣＤ８の両方に結合することができる抗体およびＣＤ３とＮＫＧ２Ｄの両方に結合することができる抗体から選択される作用物質である。
【0038】
融合性リポソームが、免疫系活性化剤、または金ナノ粒子などの光治療薬を含むとき、その融合性リポソームは、本質的にセラノスティック剤である。
【0039】
ある特定の実施形態において、検出可能な作用物質、光治療薬または免疫系活性化剤は、融合性リポソームの外葉において結合されている。
【0040】
ある特定の実施形態において、検出可能な作用物質または免疫系活性化剤は、検出可能な作用物質または免疫系活性化剤と第２の官能基との間に第２のスペーサーをさらに含む。
【0041】
ある特定の実施形態において、第１または第２のスペーサーは、ＰＥＧ、（Ｃ６－Ｃ１２）アルキル、フェノール酸、安息香酸またはナフトエ モノ、ジ－またはトリカルボン酸、テトラヒドロピレンモノ－、ジ－もしくはトリ－カルボン酸またはそれらの塩、環状エーテル、グルタル酸、コハク酸、ムコン酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸およびセバシン酸、ならびに約２～２０アミノ酸残基長、例えば、３アミノ酸残基長のポリＧｌｙペプチドなどのペプチドからなる群より選択される。
【0042】
ある特定の実施形態において、第１または第２のスペーサーは、約１０６Ｄａ～約４ｋＤａの分子量のＰＥＧである。
【0043】
ある特定の実施形態において、第１または第２のスペーサーは、約１９４Ｄａの分子量のＰＥＧ（ＰＥＧ４）である。
【0044】
ある特定の実施形態において、第１または第２のスペーサーは、（Ｃ６－Ｃ１２）アルキル、好ましくは、ヘプチルまたはドデカノイルである。
【0045】
ある特定の実施形態において、免疫系活性化剤は、Ｔ細胞活性化剤；炎症促進性サイトカイン；メモリーキラーＴ細胞活性化ペプチド；ペプチドを提示する可溶性ヒト白血球抗原（ｓＨＬＡ）；およびスーパー抗原から選択される。
【0046】
ある特定の実施形態において、免疫系活性化剤は、Ｔ細胞活性化剤である。
【0047】
ある特定の実施形態において、Ｔ細胞活性化剤は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体またはそれらの組み合わせ、ＣＤ３とＣＤ８の両方に結合することができる抗体およびＣＤ３とＮＫＧ２Ｄの両方に結合することができる抗体から選択される。
【0048】
本明細書中に記載される抗体またはその機能的フラグメントは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；抗体の機能的フラグメント；ナノボディなどの単一ドメイン抗体；および組換え抗体；（ｉｉ）抗体ミメティック、例えば、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子；アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）；アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）；アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎ）；アルファボディ；アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）；アビマー（ａｖｉｍｅｒ）；ＤＡＲＰｉｎ；ファイノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）；クニッツドメインペプチド；およびモノボディ；または（ｉｉｉ）アプタマーのことも指す。
【0049】
本発明において使用される抗体またはその機能的フラグメントは、標的化剤の機能（リポソームをある特定の標的細胞に連れて行くこと）を果たさないが、その代わりに免疫系活性化剤の機能を果たすことを明確にするべきである。
【0050】
上記実施形態のいずれか１つにおいて、カチオン性基を含む前記脂質分子の少なくとも１つは、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（１８：０ＤＤＡＢ）およびＮ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチル－カルボキサミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド（ＭＶＬ５）から選択される。
【0051】
ある特定の実施形態において、カチオン性基を含む前記脂質分子の少なくとも１つは、ＤＯＴＡＰである。
【0052】
上記実施形態のいずれか１つにおいて、カチオン性合成高分子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびポリ（２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレートから選択される。
【0053】
上記実施形態のいずれか１つにおいて、カチオン性天然高分子は、キトサンである。
【0054】
上記実施形態のいずれか１つにおいて、カチオン性アミノ糖は、グルコサミンである。
【0055】
上記実施形態のいずれか１つにおいて、カチオン性ポリアミノ酸は、ポリ（Ｌ－リジン）、ポリ（Ｌ－アルギニン）、ポリ（Ｄ－リジン）、ポリ（Ｄ－アルギニン）、ポリ（Ｌ－オルニチン）およびポリ（Ｄ－オルニチン）から選択される。
【0056】
上記実施形態のいずれか１つにおいて、両親媒性の癌細胞結合ペプチドは、セクロピンＡ；セクロピンＡ １－８；および環状ＣＮＧＲＣから選択される。
【0057】
上記実施形態のいずれか１つにおいて、前記脂質分子の少なくとも１つは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるリン脂質であり、それらのそれぞれ１つが、１つまたは２つの同一のまたは異なる脂肪酸残基を含み、ホスファチジル部分における脂肪酸残基は、飽和、一不飽和または多価不飽和であり、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４個の炭素という炭素鎖長（例えば、リン脂質配置およびリゾリン脂質配置の、ミリストイル、ステアロイル、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル（共役リノレノイルを含む）、アラキドノイルおよびそれらの組み合わせ）を有する。
【0058】
ある特定の実施形態において、リン脂質は、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および１，２－ジオレオイル－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２－ジミリストイル－３－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）；１，２－ジステアロイル－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）；１，２－ジミリストレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジミリステライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）；１，２－ジパルミトレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジパルミテライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）；１，２－ジペトロセレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ６－Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジオレオイル－３－ホスファチジルコリン（１８：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ（ＤＯＰＣ））；１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）；１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：２（Ｃｉｓ）ＰＣ（ＤＬＰＣ））；１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：３（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：４（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：６（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジネルボノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２４：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジミリストイル－３－－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）；１，２－ジパルミトイル－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）；ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）；１，２－ジオレオイル－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２－ジステアロイル－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）；１，２－ジミリストイル－３－ホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）；１，２－ジパルミトイル－３－ホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）；パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；および１，２－ジオレオイル－３－ホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）からなる群より選択される。
【0059】
ある特定の実施形態において、リン脂質は、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰＰＥから選択される。
【0060】
上記実施形態のいずれか１つにおいて、安定化部分は、約１０６Ｄａ～約４ｋＤａの分子量のＰＥＧである。
【0061】
ある特定の実施形態において、安定化部分のＰＥＧは、約２ｋＤａ分子量のＰＥＧである。
【0062】
上記実施形態のいずれか１つにおいて、安定化部分は、切断可能なペプチドリンカーを介して前記脂質分子の少なくとも１つに接続される。
【0063】
官能基を含むリポソームに関する上記実施形態のいずれか１つにおいて、特異的結合対の第１の官能基は、前記結合対の前記相補的な第２の官能基と共有結合を形成することができる。
【0064】
ある特定の実施形態において、特異的結合対の第１の官能基は、クリックケミストリー反応を介して前記結合対の前記相補的な第２の官能基と共有結合を形成することができる。
【0065】
ある特定の実施形態において、ｉ）特異的結合対の第１の官能基は、アルキンまたはホスフィンであり、前記結合対の第２の官能基は、アジドであるか、またはその逆であるか；ｉｉ）特異的結合対の第１の官能基は、シクロアルケン、シクロアルキン、シクロプロパン、イソニトリル（イソシアニド）またはビニルボロン酸であり、前記結合対の第２の官能基は、テトラジンであるか、またはその逆であるか；ｉｉｉ）特異的結合対の第１の官能基は、アルキンまたはマレイミドであり、前記結合対の第２の官能基は、チオールであるか、またはその逆であるか；ｉｖ）特異的結合対の第１の官能基は、共役ジエンであり、前記結合対の第２の官能基は、置換アルケンであるか、またはその逆であるか；ｖ）特異的結合対の第１の官能基は、アルケン、アルキンまたはアセチレン化銅であり、前記結合対の第２の官能基は、ニトロンであるか、またはその逆であるか；ｖｉ）特異的結合対の第１の官能基は、アルデヒドまたはケトンであり、前記結合対の第２の官能基は、アルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはヒドラジドであるか、またはその逆であるか；またはｖｉｉ）特異的結合対の第１の官能基は、アルデヒド、ケトン、イソチオシアネート、カルボン酸またはその誘導体（例えば、エステル、無水物、ハロゲン化アシル、トシルおよびＮ－ヒドロスクシンイミド（ＮＨＳ））であり、前記結合対の第２の官能基は、アミンであるか、またはその逆であり；ｖｉｉｉ）官能基である。
【0066】
ある特定の実施形態において、特異的結合対は、アルキン－アジドである。
【0067】
官能基を含むリポソームに関する上記実施形態のいずれか１つにおいて、特異的結合対の第１の官能基は、前記結合対の前記相補的な第２の官能基と非共有結合を形成することができる。
【0068】
ある特定の実施形態において、特異的結合対の第１の官能基は、ビオチンであり、前記結合対の第２の官能基は、ビオチン結合ペプチドまたはビオチン結合タンパク質から選択される結合パートナーであるか、またはその逆である。
【0069】
ある特定の実施形態において、ビオチン結合タンパク質は、アビジン、ストレプトアビジンおよび抗ビオチン抗体から選択される。
【0070】
ある特定の実施形態において、ビオチン結合ペプチドは、ＡＥＧＥＦＣＳＷＡＰＰＫＡＳＣＧＤＰＡＫ（配列番号１）、ＣＳＷＲＰＰＦＲＡＶＣ（配列番号２）、ＣＳＷＡＰＰＦＫＡＳＣ（配列番号３）およびＣＮＷＴＰＰＦＫＴＲＣ（配列番号４）から選択される。
【0071】
上記実施形態のいずれか１つにおいて、融合性リポソームは、コレステロール（ＣＨＯ）またはその誘導体をさらに含む。
【0072】
上記実施形態のいずれか１つにおいて、融合性リポソームは、ＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥまたはＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋおよび必要に応じてコレステロールを含み、ここで、ＰＥＧ２Ｋは、約２ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを表し、ＤＯＰＣの相対モル量は、最大約８０％であり、ＤＯＴＡＰの相対モル量は、最大約８０％であり、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋの相対モル量は、最大約２０％であり、ＤＯＰＥの相対モル量は、最大約２０％であり、コレステロールの相対モル量は、最大約４０％である。
【0073】
ある特定の実施形態において、融合性リポソームは、
（ｉ）５２．５：３５：０．６：１０、５２．５：３５：１．２５：１０、５２．５：３５：２．５：１０、５２．５：３５：５：１０、５２．５：３５：０．６：５、５２．５：３５：１．２５：５、５２．５：３５：２．５：５、５２．５：３５：５：５、６５：２０：５：１０、５０：３５：５：１０、５２．５：３５：１．２５：７、５２．５：３５：１．２５：５または５２．５：３５：２．５：７というモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ；または
（ｉｉ）５２．５：３５：０．６、５２．５：３５：１．２５、５２．５：３５：２．５、５２．５：３５：５、５２．５：３５：０．６、５２．５：３５：１．２５、５２．５：３５：２．５、５２．５：３５：５、６５：２０：５、５０：３５：５、５２．５：３５：１．２５、５２．５：３５：１．２５または５２．５：３５：２．５というモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ
を含む。
（ｉ）５２．５：３５：０．６：１０、５２．５：３５：１．２５：１０、５２．５：３５：２．５：１０、５２．５：３５：５：１０、５２．５：３５：０．６：５、５２．５：３５：１．２５：５、５２．５：３５：２．５：５、５２．５：３５：５：５、６５：２０：５：１０、５０：３５：５：１０、５２．５：３５：１．２５：７、５２．５：３５：１．２５：５または５２．５：３５：２．５：７というモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ；または
（ｉｉ）５２．５：３５：０．６、５２．５：３５：１．２５、５２．５：３５：２．５、５２．５：３５：５、５２．５：３５：０．６、５２．５：３５：１．２５、５２．５：３５：２．５、５２．５：３５：５、６５：２０：５、５０：３５：５、５２．５：３５：１．２５、５２．５：３５：１．２５または５２．５：３５：２．５というモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ
を含む。
【0074】
ある特定の実施形態において、融合性リポソームは、５２．５：３５：２．５：５というモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ；または５２．５：３５：２．５というモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋを含む。
【0075】
上記実施形態のいずれか１つにおいて、リポソームの融解温度（Ｔｍ）は、４５℃未満であり、その温度において、その融合性リポソームは、非結晶転移相で維持されることにより、リポソームと細胞膜との融合に必要な膜の流動性がもたらされる。
【0076】
上記実施形態のいずれか１つにおいて、融合性リポソームは、最大２００ｎｍのサイズ、例えば、約１５ｎｍ～約２００ｎｍ、約２０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約１１０ｎｍ～約２００ｎｍ、例えば、約１００ｎｍを有する。
【0077】
本発明の融合性リポソームを作製するために用いられる方法は、動力学的反応制御の概念に基づく。それらのリポソームは、２つの官能基の間に化学結合が形成される速度よりもかなり高い反応速度で脂質二重層から自己集合する。したがって、未反応の検出可能な作用物質および他の試薬または触媒（例えば、銅依存性のクリックケミストリー反応のための銅触媒）は、任意の重大な化学反応が溶液中で起きる前に、リポソームの水性の内部内に被包される。検出可能な作用物質および／または化学反応に必要な他の試薬は、リポソームの内側に被包されず、例えば、形成したリポソームを洗浄することによって、溶液からさらに物理的に除去される。本発明のリポソームを形成するクリックケミストリー反応のための触媒の非限定的な例は、銅（ＩＩ）アセチルアセトネート、銅（Ｉ）イソニトリル、および還元剤としてアスコルビン酸ナトリウムを使用して銅（Ｉ）塩または銅（ＩＩ）塩から生成される他の任意の活性な銅（Ｉ）触媒である。免疫系活性化剤および他の試薬または触媒は、例えば、透析もしくはゲル濾過によって、または免疫活性化剤もしくは脂質の官能基の一方もしくは両方を過剰量の対応する遊離官能基と反応させる（その免疫活性化剤もしくは脂質の官能基を枯渇させるがゆえにその反応を停止もしくは阻害する）ことによって、除去され得る。
【0078】
リポソームを調製する方法は、当該分野で周知である。Ｂａｔｚｒｉ，Ｓ．＆ Ｋｏｒｎ，Ｅ．Ｄ．Ｓｉｎｇｌｅ ｂｉｌａｙｅｒ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ ２９８，１０１５－１０１９（１９７３）。例えば、有機溶媒中の脂質溶液を、リポソームの形成をもたらす条件において、例えば、ナノアセンブラーアセンブラーまたは他の類似のデバイスによって、Ｔｍを超える温度を有する水溶液に注入し、それにより、融合性リポソームを生成してもよいし；Ｔｍを超える温度を有する水溶液に脂質溶液を注入し、混合することにより、リポソーム溶液を得て、そのリポソーム溶液を、少なくとも１つの支持体および５０～４００ｎｍの直径を有するポアを有する少なくとも１つのエッチドメンブレンを備える押出し成形機を介して押し出してもよい。
【0079】
追加の態様において、本発明は、癌細胞を選択的に検出するための方法を提供し、その方法は、上記実施形態のいずれか１つおよびそれらの任意の組み合わせにおいて定義された融合性リポソームと前記癌細胞を接触させる工程、ならびに前記検出可能な作用物質が、活性化可能な蛍光プローブである場合は、その蛍光プローブによって吸収される波長を有する光を細胞に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって、前記蛍光プローブを検出する工程；前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画する工程、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出する工程を含む。ある特定の実施形態において、検出工程は、エキソサイチュ（ｅｘ ｓｉｔｕ）で行われる。
【0080】
同様に、追加の態様において、本発明は、癌細胞の選択的な検出において使用するための上記実施形態のいずれか１つの融合性リポソームを提供し、その使用または検出は、上記実施形態のいずれか１つおよびそれらの任意の組み合わせにおいて定義された融合性リポソームと前記癌細胞を接触させること、および前記検出可能な作用物質が、活性化可能な蛍光プローブである場合は、その蛍光プローブによって吸収される波長を有する光を細胞に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって、前記蛍光プローブを検出すること；前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画すること、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出することを含む。
【0081】
同様に、追加の態様において、本発明は、癌細胞を選択的に検出するための組成物を調製するための、上記実施形態のいずれか１つの融合性リポソームの使用を提供し、その使用または検出は、上記実施形態のいずれか１つおよびそれらの任意の組み合わせにおいて定義された融合性リポソームと前記癌細胞を接触させること、ならびに前記検出可能な作用物質が、活性化可能な蛍光プローブである場合は、その蛍光プローブによって吸収される波長を有する光を細胞に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって、前記蛍光プローブを検出すること；前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画すること、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出することを含む。
【0082】
用語「融合性リポソームと前記癌細胞を接触させる」は、本発明の融合性リポソームが、細胞にまたは癌細胞のみもしくは癌細胞と正常細胞との混合物を含む器官にインビトロで、あるいは癌を有する患者または癌細胞を有する器官にインビボまたはインサイチュで投与される、任意のシナリオを記載するために本明細書中で使用される。
【0083】
ある特定の実施形態において、癌患者における癌細胞の選択的な検出は、前記制癌剤を含むナノ粒子が前記癌患者の腫瘍に到達する能力を予測することによって、ナノ粒子に含められた制癌剤による癌の処置に対する前記癌患者の応答性を示唆する。
【0084】
ある特定の実施形態において、癌患者における癌細胞の選択的な検出は、第１の結合対に結合したリポソームを全身投与（すなわち、結合対の第１の官能基で官能化されたリポソームの投与）した後に、新生物が疑われる組織から得たバイオプシーを用いて行われ、生検染色および／もしくは対比染色、例えば、ヘマトキシリン、エオシン、ＤＡＰＩ、蛍光抗体、蛍光ファロイジンといった標準的な染色に加えて加えられる蛍光プローブ、または西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素に結合された第２の官能基を用いて染色される。
【0085】
ある特定の実施形態において、選択的な検出は、第１の結合対に結合したリポソームと新生物が疑われる組織切片をインキュベートした後に、その組織から得たバイオプシーを用いて行われ、その後、生検染色および／または対比染色、例えば、ヘマトキシリン、エオシン、ＤＡＰＩ、蛍光抗体、蛍光ファロイジンといった標準的な染色に加えて加えられる蛍光プローブまたはＨＲＰに結合された第２の結合対を用いて染色される。
【0086】
ある特定の実施形態において、応答性と判断された癌患者は、前記制癌剤を含む前記ナノ粒子で処置される。
【0087】
ある特定の実施形態において、癌患者が、応答性と判断された場合、前記制癌剤を含むナノ粒子は、その癌患者の処置において使用するためのナノ粒子である。
【0088】
ある特定の実施形態において、癌患者が、応答性と判断された場合、本発明は、その癌患者を処置するための薬を調製するための、前記制癌剤を含むナノ粒子の使用を提供する。
【0089】
さらなる態様において、本発明は、癌細胞を選択的に検出するための方法を提供し、その方法は、（ａ）官能化された融合性リポソームに関する上記の実施形態のいずれか１つに係る官能化された融合性リポソームと前記癌細胞を接触させる工程；（ｂ）蛍光プローブおよび磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）用またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の造影剤から選択される検出可能な作用物質と前記癌細胞を接触させる工程であって、ここで、前記検出可能な作用物質は、前記脂質分子の前記第１の官能基に結合することができる、結合対の相補的な第２の官能基で官能化されている、工程；および（ｃ）前記検出可能な作用物質が蛍光プローブである場合は、その蛍光プローブによって吸収される波長を有する光を細胞に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって、前記蛍光プローブを検出し；前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画し、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出し、それにより、前記癌細胞を選択的に検出する工程を含む。
【0090】
同様に、追加の態様において、本発明は、癌細胞の選択的な検出において使用するための、上記実施形態のいずれか１つの融合性リポソームを提供し、その使用または検出は、（ａ）官能化された融合性リポソームに関する上記の実施形態のいずれか１つに係る官能化された融合性リポソームと前記癌細胞を接触させること；（ｂ）蛍光プローブおよび磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）用またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の造影剤から選択される検出可能な作用物質と前記癌細胞を接触させることであって、ここで、前記検出可能な作用物質は、前記脂質分子の前記第１の官能基に結合することができる、結合対の相補的な第２の官能基で官能化されている、こと；および（ｃ）前記検出可能な作用物質が蛍光プローブである場合は、その蛍光プローブによって吸収される波長を有する光を細胞に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって、前記蛍光プローブを検出し；前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画し、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出し、それにより、前記癌細胞を選択的に検出することを含む。
【0091】
また同様に、追加の態様において、本発明は、癌細胞を選択的に検出するための組成物を調製するための、上記実施形態のいずれか１つの融合性リポソームの使用を提供し、その使用または検出は、（ａ）官能化された融合性リポソームに関する上記の実施形態のいずれか１つに係る官能化された融合性リポソームと前記癌細胞を接触させること；（ｂ）蛍光プローブおよび磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）用またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の造影剤から選択される検出可能な作用物質と前記癌細胞を接触させることであって、ここで、前記検出可能な作用物質は、前記脂質分子の前記第１の官能基に結合することができる、結合対の相補的な第２の官能基で官能化されている、こと；および（ｃ）前記検出可能な作用物質が蛍光プローブである場合は、その蛍光プローブによって吸収される波長を有する光を細胞に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって、前記蛍光プローブを検出し；前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画し、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出し、それにより、前記癌細胞を選択的に検出することを含む。
【0092】
あるいは、工程（ｂ）において、相補的な第２の官能基で官能化された検出可能な作用物質と前記癌細胞を接触させる代わりに、（ａ）の官能化された融合性リポソームおよび第２の官能基の検出可能な作用物質とは異なる検出可能な作用物質をその表面に含む第２のリポソームまたはナノ粒子と癌細胞を接触させる。この組み合わせは、シグナル対ノイズを改善するため、ならびに肝臓および脾臓などの組織における偽陽性を減少させるために、２工程注射の様式で用いることができる。第１の結合対を有する第１のリポソームは、癌細胞と融合し、一方のフルオロフォアを付加する。第２の結合対を有する第２のナノ粒子は、第１のリポソームで標識された癌細胞上の基に結合し、第２のフルオロフォアを送達する。２つのシグナルが存在することにより、偽陽性が減少し、さらに、それを用いることにより、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を行うことができる。ＦＲＥＴは、インビボ条件下においても用いることができ、ここで、第１の融合性リポソームが、１つのフルオロフォアおよび第１の結合対を有し、第２のリポソーム／ナノ粒子が、相補的な結合対、およびＦＲＥＴにおいて使用でき、それら２つのフルオロフォアを有する２つのリポソームが近接した場合にシグナルをもたらす第２のフルオロフォアを有する。
【0093】
ある特定の実施形態において、検出可能な作用物質は、ｃｙ３、ｃｙ５、ｃｙ５．５、ｃｙ７ ｃｙ９、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７９０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７５０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７００、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６８０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６６０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６４７、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６３３、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５９４、５８５ｎｍ～８００ｎｍの範囲のＱｄｏｔ、蛍光プロトポルフィリンオリゴマー、イソシアニングリーン（ＩＣＧ）から選択される蛍光プローブ；または
フルオレセインアナログ（例えば、ジアセテート修飾アナログ）、クマリンアナログ（例えば、ｐｙ＋ＢＣ６９０－（１－メチル－４－（２－オキソ－８－（ピロリジン－１－イル）－２Ｈ－ベンゾ［ｇ］クロメン－３－イル）ピリジニウムトリフルオロメタンスルホネート））、ＣＦＳＥ（５（６）－カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－スクシンイミジルエステル）、ローダミンアナログ（例えば、ｇＧｌｕ－ＨＭＲＧ（γ－グルタミルヒドロキシメチルローダミングリーン））、クルクミノイドジフルオロボロンベースの腫瘍標的化γ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）によって活性化可能な）蛍光プローブ（Ｇｌｕ－ＤＦＢ）、インドシアニンアナログ（例えば、ＡＰ－Ｇｌｕ（ａｐ－ｇｌｕ３Ｈ－インドリウム、２－［（１Ｅ）－２－［４－［［４－［［（４Ｓ）－４－アミノ－４－カルボキシ－１－オキソブチル］アミノ］フェニル］メトキシ］フェニル］エテニル］－１－（５－カルボキシペンチル）－３，３－ジメチル－，ブロミド（１：１）、ＣＡＳ登録番号１８８４６９８－０６－９）および他の近赤外蛍光活性化分子から選択される活性化可能な蛍光プローブ
である。
フルオレセインアナログ（例えば、ジアセテート修飾アナログ）、クマリンアナログ（例えば、ｐｙ＋ＢＣ６９０－（１－メチル－４－（２－オキソ－８－（ピロリジン－１－イル）－２Ｈ－ベンゾ［ｇ］クロメン－３－イル）ピリジニウムトリフルオロメタンスルホネート））、ＣＦＳＥ（５（６）－カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－スクシンイミジルエステル）、ローダミンアナログ（例えば、ｇＧｌｕ－ＨＭＲＧ（γ－グルタミルヒドロキシメチルローダミングリーン））、クルクミノイドジフルオロボロンベースの腫瘍標的化γ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）によって活性化可能な）蛍光プローブ（Ｇｌｕ－ＤＦＢ）、インドシアニンアナログ（例えば、ＡＰ－Ｇｌｕ（ａｐ－ｇｌｕ３Ｈ－インドリウム、２－［（１Ｅ）－２－［４－［［４－［［（４Ｓ）－４－アミノ－４－カルボキシ－１－オキソブチル］アミノ］フェニル］メトキシ］フェニル］エテニル］－１－（５－カルボキシペンチル）－３，３－ジメチル－，ブロミド（１：１）、ＣＡＳ登録番号１８８４６９８－０６－９）および他の近赤外蛍光活性化分子から選択される活性化可能な蛍光プローブ
である。
【0094】
ある特定の実施形態において、癌患者における癌細胞の選択的な検出は、前記制癌剤を含むナノ粒子が前記癌患者の腫瘍に到達する能力を予測することによって、ナノ粒子に含められた制癌剤による癌の処置に対する前記癌患者の応答性を示唆する。
【0095】
ある特定の実施形態において、応答性と判断された癌患者は、前記制癌剤を含む前記ナノ粒子で処置される。
【0096】
ある特定の実施形態において、癌患者が、応答性と判断された場合、前記制癌剤を含むナノ粒子は、その癌患者の処置において使用するためのナノ粒子である。
【0097】
ある特定の実施形態において、癌患者が、応答性と判断された場合、本発明は、その癌患者を処置するための薬を調製するための、前記制癌剤を含むナノ粒子の使用を提供する。
【0098】
癌処置においてまたは癌処置の開発中に使用されるナノ粒子のタイプの非限定的な例は、リポソーム；タンパク質ベースのナノ粒子（例えば、アルブミン、フェリチン、ゼラチンおよびトランスフェリン）；共重合体（例えば、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ））；高分子ミセル（例えば、ヒドラゾン結合を含むトリブロック共重合体ＰＥＧ－ＤｉＨｙｄ－ＰＬＡでできたミセル）；金ナノ粒子；およびインビボでの使用に適合するポリマーで覆われた磁鉄鉱コアナノ粒子である。
【0099】
ナノ粒子として製剤化され得る細胞傷害性薬物のタイプの非限定的な例は、化学療法剤（例えば、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、アジリジン、エポキシド、スルホン酸アルキル）、シスプラチンおよびそのアナログ（例えば、カルボプラチン、オキサリプラチン））、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、フルダラビン）、トポイオメラーゼ相互作用剤（例えば、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、テニポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン）、抗微小管剤（例えば、ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびビノレルビン；タキサン、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、インターフェロン、インターロイキン－２、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、モノクローナル抗体、エストロゲン調節剤（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン）、メゲストロール、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、オクトレオチド）、オクトレオチド、抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、カソデックス）、キナーゼおよびチロシン阻害剤（例えば、イマチニブ（ＳＴＩ５７１またはＧｌｅｅｖａｃ）；ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）；およびエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）であり、両親媒性の癌細胞結合ペプチドは、セクロピンＡ；セクロピンＡ １－８；および環状ＣＮＧＲＣ；フォトフリンなどの光力学剤、金から選択される。
【0100】
したがって、上に記載されたナノ粒子に含められる制癌剤は、上に記載されたナノ粒子と細胞傷害性薬物との任意の組み合わせであり得る。
【0101】
ナノ粒子薬物、すなわち、細胞傷害性薬物を含む粒子の非限定的な例は、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（循環時間を延長するためおよびバイオアベイラビリティを高めるためにアルブミンに結合されたパクリタキセル）；およびアクティブローディング法を用いてリポソームに被包されたドキソルビシン製剤であるＤｏｘｉｌ（登録商標）である。これらのドキソルビシンリポソーム（ＨＳＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を５６．６：３８．２：５．３のモル比で含む）は、癌治療におけるナノ医薬の代表格の１つである。
【0102】
代替のシナリオでは、結合対の第１の官能基で官能化された融合性リポソームによって応答性と判断された癌患者は、前記制癌剤を含む前記ナノ粒子で処置され、ここで、前記ナノ粒子は、相補的な第２の官能基で官能化されている。例えば、アルブミン部分が第２の結合対で修飾されたＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）が、全身性に注射されるか、または第２の結合対で官能化されたリポソーム内にアクティブローディングされたドキソルビシンが、全身性に注射される。したがって、官能化された第２のナノ粒子は、すでに第１の官能基で標識または官能化された癌細胞に標的化され、第２の官能基を介してその癌細胞に結合する。
【0103】
さらに追加の態様において、本発明は、蛍光ガイド手術または標的化放射線治療によって癌を処置するための方法を提供し、前記方法は、上記に定義された癌細胞を選択的に検出するための方法の１つおよび癌細胞を含む腫瘍を除去する工程を含む。
【0104】
ある特定の実施形態では、手術中に使用される、エステラーゼで切断可能なフルオロフォア（活性化可能なフルオロフォア）を有する本発明のリポソームを、静脈内に注射し得るか、または腫瘍組織、および新生物組織と疑われる周囲組織に灌注するために使用し得る。次いで、その組織を食塩水溶液で洗浄して、未結合のリポソームおよび血液のアクセスを除去し、シグナル対ノイズを改善する。リポソームが癌細胞と融合すると、フルオロフォア上のエステル基が除去され、使用されるフルオロフォアに対応する蛍光の励起波長および発光波長を用いた検出が可能になる。
【0105】
癌細胞を選択的に検出するための方法、または上記に定義された癌細胞の選択的な検出において使用するための融合性リポソームのうちのいずれか１つのある特定の実施形態において、癌患者は、皮膚などの器官の領域の走査または皮膚癌などの腫瘍の全身イメージングまたは全身イメージングを受けており、その方法または使用は、融合性リポソーム、および必要に応じて、官能化された検出可能な作用物質を全身投与するまたは局所的に適用すること；および前記検出可能な作用物質が、活性化可能な蛍光プローブまたは蛍光プローブである場合は、皮膚の領域または全身に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって、前記蛍光プローブを検出し、前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画し、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出し、それにより、腫瘍の位置および縁を明確化することを含む。
【0106】
なおもさらなる態様において、本発明は、癌を処置するための方法を提供し、その方法は、癌患者が、皮膚癌などの腫瘍のイメージングまたは上に記載された全身イメージングを受けている方法、および癌細胞を含む腫瘍を外科的に除去する工程を含む。
【0107】
上記に定義された癌細胞を選択的に検出するための方法のいずれか１つのある特定の実施形態において、その方法は、癌細胞の選択的な検出を必要とする癌患者から取り出された組織（例えば、生検材料）または血液由来画分における癌細胞をエキソサイチュで選択的に検出することを目的とし、前記方法は、融合性リポソーム、および必要に応じて、官能化された蛍光プローブを全身投与するかまたはその癌患者から取り出された組織もしくは血液由来画分に適用する工程、およびその組織または血液由来画分に照射し、蛍光プローブから放射される光をエキソサイチュで検出することによって前記蛍光プローブを検出し、それにより、前記癌細胞を選択的に検出する工程を含む。
【0108】
ある特定の実施形態において、上記組織は、皮膚であり、前記癌患者は、皮膚癌を除去するための手術（モース術）を受けており、前記手術は、その皮膚組織が、エキソサイチュで検出される検出可能な癌細胞を有さなくなるまで反復される。
【0109】
ある特定の実施形態では、新形成が疑われる組織を摘出し、生理学的等張性緩衝液で洗浄して血餅を除去し、その組織を活性化可能なフルオロフォアリポソーム溶液、例えば、０．１～５０ｍＭ脂質を含む溶液に浸漬する。リポソームで処置された組織を、ＰＢＳまたは他の生理学的等張性溶液（例えば、食塩水）で洗浄し、フルオロフォアに対応する励起波長および発光波長を用いて蛍光顕微鏡下で画像化する。
【0110】
あるいは、新形成が疑われる組織を摘出し、ＰＢＳまたは他の緩衝液で洗浄して血餅を除去し、前記結合対の相補的な第２の官能基に結合することができる、特異的結合対の第１の官能基を含む本発明の融合性リポソームを含む溶液（例えば、５ｍＭ脂質の溶液）に浸漬する。次いで、リポソームで処置された組織を生理学的等張性溶液で洗浄し、相補的な第２の官能基を含む検出可能なフルオロフォアを含む溶液に浸漬し、洗浄し、フルオロフォアに対応する励起波長および発光波長を用いて蛍光顕微鏡下で画像化する。
【0111】
ある特定の実施形態において、癌細胞をエキソサイチュで選択的に検出することを目的とした方法は、前記血液由来画分中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）をエキソサイチュで選択的に検出するために用いられる。これは、当該分野で周知の方法を用いてＣＴＣを単離し、それらを上記の実施形態のいずれか１つの融合性リポソームと接触させることによって達成される。
【0112】
ある特定の実施形態において、上記実施形態のいずれか１つに従って選択的に検出または処置される癌は、トリプルネガティブ乳癌などの乳癌、メラノーマ、肺癌、甲状腺癌および前立腺癌の群から選択される。
【0113】
ある特定の実施形態において、癌細胞を選択的に検出することを目的とする方法は、癌細胞を選択的に検出するためおよび癌を処置するために用いられ、前記方法は、融合性リポソーム、および必要に応じて、官能化された検出可能な作用物質を全身投与するまたは局所的に適用する工程を含み、ここで、その融合性リポソームは、前記検出可能な作用物質ならびに細胞傷害剤および／または免疫系活性化剤を含み；前記検出可能な作用物質が、活性化可能な蛍光プローブまたは蛍光プローブである場合は、皮膚の領域または全身に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって、前記蛍光プローブを検出する工程、前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画する工程、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出する工程；および必要に応じて、前記検出可能な作用物質を長時間繰り返し検出することによって、処置の応答をモニタリングする工程を含む。
【0114】
別の態様において、本発明は、癌を処置するための方法を提供し、その方法は、内部の水性コンパートメントに細胞傷害性薬物または光力学剤を含むかまたは被包する融合性リポソームを投与する工程を含み、ここで、前記融合性リポソームは、（ａ）１４～２４個の炭素原子を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層であって、ここで、前記脂質分子の少なくとも１つは、カチオン性基、カチオン性天然高分子もしくはカチオン性合成高分子、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性の癌細胞結合ペプチドをさらに含み；前記脂質分子の少なくとも１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル－ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ（アクリロイルモルホリン）およびポリアクリルアミドからなる群より選択される安定化部分をさらに含む、脂質二重層；（ｂ）必要に応じて、前記結合対の相補的な第２の官能基に結合することができる、特異的結合対の第１の官能基；および（ｃ）（ｂ）が存在する場合、必要に応じて、前記第１の官能基に結合した前記結合対の前記相補的な第２の官能基を含む免疫系活性化剤を含む。
【0115】
別の態様において、本発明は、癌の処置において使用するための融合性リポソームを提供し、ここで、その融合性リポソームは、内部の水性コンパートメントに細胞傷害性薬物または光力学剤を含むかまたは被包し、ここで、前記融合性リポソームは、（ａ）１４～２４個の炭素原子を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層であって、ここで、前記脂質分子の少なくとも１つは、カチオン性基、カチオン性天然高分子もしくはカチオン性合成高分子、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性の癌細胞結合ペプチドをさらに含み；前記脂質分子の少なくとも１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル－ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ（アクリロイルモルホリン）およびポリアクリルアミドからなる群より選択される安定化部分をさらに含む、脂質二重層；（ｂ）必要に応じて、前記結合対の相補的な第２の官能基に結合することができる、特異的結合対の第１の官能基；および（ｃ）（ｂ）が存在する場合、必要に応じて、前記第１の官能基に結合した前記結合対の前記相補的な第２の官能基を含む免疫系活性化剤を含む。
【0116】
ある特定の実施形態において、（ｂ）は存在するが（ｃ）が存在しない場合、上記方法または使用は、前記脂質分子の前記第１の官能基に結合することができる、結合対の相補的な第２の官能基で官能化された免疫系活性化剤を投与することをさらに含む。
【0117】
ある特定の実施形態において、細胞傷害性薬物は、化学療法剤（例えば、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、アジリジン、エポキシド、スルホン酸アルキル）、シスプラチンおよびそのアナログ（例えば、カルボプラチン、オキサリプラチン））、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、フルダラビン）、トポイオメラーゼ相互作用剤（例えば、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、テニポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン）、抗微小管剤（例えば、ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびビノレルビン；タキサン、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、インターフェロン、インターロイキン－２、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、モノクローナル抗体、エストロゲン調節剤（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン）、メゲストロール、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、オクトレオチド）、オクトレオチド、抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、カソデックス）、キナーゼ阻害剤およびチロシン阻害剤（例えば、イマチニブ（ＳＴＩ５７１またはＧｌｅｅｖａｃ）；ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）；およびエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）であり、両親媒性の癌細胞結合ペプチドは、セクロピンＡ；セクロピンＡ １－８；および環状ＣＮＧＲＣ；フォトフリンなどの光力学剤、金から選択される。
【0118】
さらに別の態様において、本発明は、（ａ）１４～２４個の炭素原子を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層を含む融合性リポソームを含む第１の容器であって、前記脂質分子の少なくとも１つは、カチオン性基、カチオン性天然高分子もしくはカチオン性合成高分子、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性の癌細胞結合ペプチドをさらに含み；前記脂質分子の少なくとも１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル－ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ（アクリロイルモルホリン）およびポリアクリルアミドからなる群より選択される安定化部分をさらに含み；前記脂質分子の少なくとも１つは、前記結合対の相補的な第２の官能基に結合することができる、特異的結合対の第１の官能基で官能化されている、第１の容器；（ｂ）蛍光プローブおよび磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）用またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の造影剤から選択される検出可能な作用物質を含む第２の容器であって、ここで、前記検出可能な作用物質は、前記脂質分子の前記第１の官能基に結合することができる、結合対の相補的な第２の官能基で官能化されている、第２の容器；および（ｃ）（ａ）の融合性リポソームおよび続いて（ｂ）の検出可能な作用物質を癌患者に投与する工程を含む癌細胞を選択的に検出するための方法についての指示を含むパンフレットを備えるキットを提供する。
【0119】
用語「キャリア」とは、活性な作用物質とともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルのことを指す。薬学的組成物中のキャリアとしては、結合剤（例えば、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン（ポリビドンまたはポビドン）、トラガカントゴム、ゼラチン、デンプン、ラクトースまたはラクトース一水和物）；崩壊剤（例えば、アルギン酸、トウモロコシデンプンなど）；潤滑剤または界面活性剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウム）；および滑剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）が挙げられ得る。
【0120】
上記組成物は、注射、例えば、ボーラス注射または持続注入または腫瘍への直接注射による非経口投与のために製剤化され得る。注射用の製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルに入った状態で、または保存剤もしくは安定剤が加えられた複数回用量容器に入った状態で、提供され得る。上記組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとり得、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌された発熱物質フリー水で構成するための粉末の形態でもあり得る。
【0121】
上記組成物は、必要に応じて、口腔癌ならびに場合によっては頭頸部癌、食道癌および他の上部消化管腫瘍病変に局所的な様式でリポソームを送達する口腔ウォッシュとして、液体の形態／粘膜付着性製剤で製剤化され得る。その液体の形態は、溶液、シロップまたは懸濁液であってもよいし、使用前に、水、注射可能な等張性ビヒクルまたは他の好適なビヒクルで再構成するための薬物製品として提供されてもよい。そのような液体調製物は、薬学的に許容され得る添加剤（例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチン）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油性エステルまたは分留植物油）；および保存剤（例えば、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはｐ－ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸））とともに従来の手段を用いて、調製され得る。上記薬学的組成物は、例えば、薬学的に許容され得る賦形剤（例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム））を用いて従来の手段によって調製される錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、当該分野で周知の方法によってコーティングされてもよい。
【0122】
頬側投与の場合、上記組成物は、従来の様式で製剤化された、錠剤、粘膜付着性パッチ／ステッカーまたはロゼンジの形態をとり得る。
【0123】
上記組成物は、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含む、停留浣腸などの直腸組成物にも製剤化され得る。
【0124】
吸入による投与の場合、本発明に従って使用するための組成物は、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体を使用する加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で好都合に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、定量を送達するようにバルブを定めることによって決定され得る。本化合物とラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含む、吸入器または注入器において使用するための、例えばゼラチンまたはグリセロールの、カプセルおよびカートリッジが製剤化され得る。
【0125】
本明細書中で使用される用語「処置する」とは、所望の生理学的効果を得る手段のことを指す。その効果は、疾患および／またはその疾患が原因の症状を部分的にまたは完全に治癒するという点で治療的であり得る。この用語は、疾患を阻害すること、すなわち、その発症を止めること；または疾患を回復させること、すなわち、疾患を後退させることを指す。
【0126】
本願のある特定の特徴を本明細書中に例証し、記載してきたが、多くの改変、置換、変更および等価物が、当業者には明らかになるだろう。ゆえに、添付の請求項は、本願の真の趣旨の範囲内に入るそのようなすべての改変および変更を網羅することを目的とすると理解される。
【0127】
要するに、実施形態１によると、本発明は、内部の水性コンパートメント内にあるまたはリポソーム膜に結合されている、検出可能な作用物質および必要に応じて細胞傷害性薬物を含む融合性リポソームを提供し、ここで、
前記融合性リポソームは、１４～２４個の炭素原子を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層を含み、前記脂質分子の少なくとも１つは、カチオン性基、カチオン性天然高分子もしくはカチオン性合成高分子、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性の癌細胞結合ペプチドをさらに含み；
前記脂質分子の少なくとも１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル－ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ（アクリロイルモルホリン）およびポリアクリルアミドからなる群より選択される安定化部分をさらに含む。
前記融合性リポソームは、１４～２４個の炭素原子を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層を含み、前記脂質分子の少なくとも１つは、カチオン性基、カチオン性天然高分子もしくはカチオン性合成高分子、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性の癌細胞結合ペプチドをさらに含み；
前記脂質分子の少なくとも１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル－ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ（アクリロイルモルホリン）およびポリアクリルアミドからなる群より選択される安定化部分をさらに含む。
【0128】
実施形態２：前記検出可能な作用物質が、蛍光プローブ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）用またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の造影剤および光力学剤から選択される、請求項１に記載の方法。
【0129】
実施形態３：前記検出可能な作用物質が、ｃｙ３、ｃｙ５、ｃｙ５．５、ｃｙ７ ｃｙ９、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７９０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７５０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７００、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６８０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６６０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６４７、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６３３、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５９４、５８５ｎｍ～８００ｎｍの範囲のＱｄｏｔ、蛍光プロトポルフィリンオリゴマー、イソシアニングリーン（ＩＣＧ）から選択される蛍光プローブ；または
フルオレセインアナログ（例えば、ジアセテート修飾アナログ）、クマリンアナログ（例えば、ｐｙ＋ＢＣ６９０－（１－メチル－４－（２－オキソ－８－（ピロリジン－１－イル）－２Ｈ－ベンゾ［ｇ］クロメン－３－イル）ピリジニウムトリフルオロメタンスルホネート））、ＣＦＳＥ（５（６）－カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－スクシンイミジルエステル）、ローダミンアナログ（例えば、ｇＧｌｕ－ＨＭＲＧ（γ－グルタミルヒドロキシメチルローダミングリーン））、クルクミノイドジフルオロボロンベースの腫瘍標的化γ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）によって活性化可能な）蛍光プローブ（Ｇｌｕ－ＤＦＢ）およびインドシアニンアナログ（例えば、ＡＰ－Ｇｌｕ（３Ｈ－インドリウム、２－［（１Ｅ）－２－［４－［［４－［［（４Ｓ）－４－アミノ－４－カルボキシ－１－オキソブチル］アミノ］フェニル］メトキシ］フェニル］エテニル］－１－（５－カルボキシペンチル）－３，３－ジメチル－，ブロミド（１：１）、ＣＡＳ登録番号１８８４６９８－０６－９）ならびに他の近赤外蛍光活性化分子から選択される活性化可能な蛍光プローブ
である、実施形態１に記載の融合性リポソーム。
フルオレセインアナログ（例えば、ジアセテート修飾アナログ）、クマリンアナログ（例えば、ｐｙ＋ＢＣ６９０－（１－メチル－４－（２－オキソ－８－（ピロリジン－１－イル）－２Ｈ－ベンゾ［ｇ］クロメン－３－イル）ピリジニウムトリフルオロメタンスルホネート））、ＣＦＳＥ（５（６）－カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－スクシンイミジルエステル）、ローダミンアナログ（例えば、ｇＧｌｕ－ＨＭＲＧ（γ－グルタミルヒドロキシメチルローダミングリーン））、クルクミノイドジフルオロボロンベースの腫瘍標的化γ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）によって活性化可能な）蛍光プローブ（Ｇｌｕ－ＤＦＢ）およびインドシアニンアナログ（例えば、ＡＰ－Ｇｌｕ（３Ｈ－インドリウム、２－［（１Ｅ）－２－［４－［［４－［［（４Ｓ）－４－アミノ－４－カルボキシ－１－オキソブチル］アミノ］フェニル］メトキシ］フェニル］エテニル］－１－（５－カルボキシペンチル）－３，３－ジメチル－，ブロミド（１：１）、ＣＡＳ登録番号１８８４６９８－０６－９）ならびに他の近赤外蛍光活性化分子から選択される活性化可能な蛍光プローブ
である、実施形態１に記載の融合性リポソーム。
【0130】
実施形態４：前記ＭＲＩ用の造影剤が、酸化鉄造影剤（例えば、磁鉄鉱、Ｆｅ３Ｏ４）；硫酸バリウム；およびガドリニウム造影剤（例えば、ガドテレート、ガドジアミド、ガドベネート、ガドペンテテート、ガドブトロール）から選択されるか；ＣＴ用の造影剤が、金属元素（例えば、ヨウ素、ビスマス、臭素、タンタル、金、白金、イッテルビウム、イットリウム、ガドリニウム、タングステン、インジウムおよびルテチウム）から選択されるか；または前記ＰＥＴ用の造影剤が、６４Ｃｕ－ＰＳＴＭ、１８Ｆ－ＦＤＧ、１８Ｆ－フッ化物、１８Ｆ－フルオロミソニダゾールおよびガリウムから選択される、態様１に記載の融合性リポソーム。
【0131】
実施形態５：前記脂質分子の少なくとも１つが、特異的結合対の相補的な第２の官能基に結合することができる、前記結合対の第１の官能基で官能化されている、実施形態１～４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0132】
実施形態６：前記融合性リポソームが、前記脂質二重層と前記第１の官能基との間に第１のスペーサーをさらに含む、実施形態５に記載の融合性リポソーム。
【0133】
実施形態７：各々が、前記相補的な第２の官能基で官能化されており、かつ前記第２の官能基を介して前記第１の官能基に結合されている、同一のもしくは異なる追加の検出可能な作用物質または免疫系活性化剤をさらに含み、ここで、前記同一のまたは異なる追加の検出可能な作用物質は、蛍光プローブおよび磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）用またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の造影剤から選択される、実施形態５または６に記載の融合性リポソーム。
【0134】
実施形態８：前記免疫系活性化剤が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体またはそれらの組み合わせ、ＣＤ３とＣＤ８の両方に結合することができる抗体、およびＣＤ３とＮＫＧ２Ｄの両方に結合することができる抗体から選択される作用物質である、実施形態７に記載の融合性リポソーム。
【0135】
実施形態９：前記検出可能な作用物質または免疫系活性化剤が、融合性リポソームの外葉において結合されている、実施形態５～８のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0136】
実施形態１０：前記検出可能な作用物質または免疫系活性化剤が、前記検出可能な作用物質または免疫系活性化剤と前記第２の官能基との間に第２のスペーサーをさらに含む、実施形態５～９のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0137】
実施形態１１：前記第１または第２のスペーサーが、ＰＥＧ、（Ｃ６－Ｃ１２）アルキル、フェノール酸、安息香酸またはナフトエ モノ、ジ－またはトリカルボン酸、テトラヒドロピレンモノ－、ジ－もしくはトリ－カルボン酸またはそれらの塩、環状エーテル、グルタル酸、コハク酸、ムコン酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸およびセバシン酸、ならびに約２～２０アミノ酸残基長、例えば、３アミノ酸残基長のポリＧｌｙペプチドなどのペプチドからなる群より選択される、実施形態１０に記載の融合性リポソーム。
【0138】
実施形態１２：前記第１または第２のスペーサーが、約１０６Ｄａ～約４ｋＤａの分子量のＰＥＧである、実施形態１１に記載の融合性リポソーム。
【0139】
実施形態１３：ＰＥＧが、約１９４Ｄａの分子量のＰＥＧ（ＰＥＧ４）である、実施形態１２に記載の融合性リポソーム。
【0140】
実施形態１４：前記第１または第２のスペーサーが、（Ｃ６－Ｃ１２）アルキル、好ましくは、ヘプチルまたはドデカノイルである、実施形態１０に記載の融合性リポソーム。
【0141】
実施形態１５：カチオン性基を含む脂質分子の前記少なくとも１つが、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（１８：０ＤＤＡＢ）およびＮ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチル－カルボキサミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド（ＭＶＬ５）から選択される、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0142】
実施形態１６：カチオン性基を含む前記脂質分子の前記少なくとも１つが、ＤＯＴＡＰである、実施形態１５に記載の融合性リポソーム。
【0143】
実施形態１７：前記カチオン性合成高分子が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびポリ（２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレートから選択される、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0144】
実施形態１８：前記カチオン性天然高分子が、キトサンである、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0145】
実施形態１９：前記カチオン性アミノ糖が、グルコサミンである、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0146】
実施形態２０：前記カチオン性ポリアミノ酸が、ポリ（Ｌ－リジン）、ポリ（Ｌ－アルギニン）、ポリ（Ｄ－リジン）、ポリ（Ｄ－アルギニン）、ポリ（Ｌ－オルニチン）およびポリ（Ｄ－オルニチン）から選択される、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0147】
実施形態２１：前記両親媒性の癌細胞結合ペプチドが、セクロピンＡ；セクロピンＡ １－８；および環状ＣＮＧＲＣから選択される、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0148】
実施形態２２：前記脂質分子の前記少なくとも１つが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるリン脂質であり、それらのそれぞれ１つが、１つまたは２つの同一のまたは異なる脂肪酸残基を含み、前記ホスファチジル部分における脂肪酸残基は、飽和、一不飽和または多価不飽和であり、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４個の炭素という炭素鎖長（例えば、リン脂質配置およびリゾリン脂質配置の、ミリストイル、ステアロイル、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル（共役リノレノイルを含む）、アラキドノイルおよびそれらの組み合わせ）を有する、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0149】
実施形態２３：前記リン脂質が、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および１，２－ジオレオイル－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２－ジミリストイル－３－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）；１，２－ジステアロイル－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）；１，２－ジミリストレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジミリステライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）；１，２－ジパルミトレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジパルミテライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）；１，２－ジペトロセレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ６－Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジオレオイル－３－ホスファチジルコリン（１８：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ（ＤＯＰＣ））；１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）；１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：２（Ｃｉｓ）ＰＣ（ＤＬＰＣ））；１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：３（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：４（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：６（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジネルボノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２４：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）；１，２－ジミリストイル－３－－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）；１，２－ジパルミトイル－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）；ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）；１，２－ジオレオイル－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２－ジステアロイル－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）；１，２－ジミリストイル－３－ホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）；１，２－ジパルミトイル－３－ホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）；パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；および１，２－ジオレオイル－３－ホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）からなる群より選択される、実施形態２２に記載の融合性リポソーム。
【0150】
実施形態２４：前記リン脂質が、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰＰＥから選択される、実施形態２３に記載の融合性リポソーム。
【0151】
実施形態２５：前記安定化部分が、約１０６Ｄａ～約４ｋＤａの分子量のＰＥＧである、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0152】
実施形態２６：ＰＥＧが、約２ｋＤａの分子量である、実施形態２５に記載の融合性リポソーム。
【0153】
実施形態２７：前記安定化部分が、切断可能なペプチドリンカーを介して前記脂質分子の少なくとも１つに接続されている、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0154】
実施形態２８：前記特異的結合対の前記第１の官能基が、前記結合対の前記相補的な第２の官能基と共有結合を形成することができる、実施形態４～２７のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0155】
実施形態２９：前記特異的結合対の前記第１の官能基が、クリックケミストリー反応を介して前記結合対の前記相補的な第２の官能基と共有結合を形成することができる、実施形態２８に記載の融合性リポソーム。
【0156】
実施形態３０：ｉ）前記特異的結合対の第１の官能基が、アルキンまたはホスフィンであり、前記結合対の第２の官能基が、アジドであるか、またはその逆であるか；ｉｉ）前記特異的結合対の第１の官能基が、シクロアルケン、シクロアルキン、シクロプロパン、イソニトリル（イソシアニド）またはビニルボロン酸であり、前記結合対の第２の官能基が、テトラジンであるか、またはその逆であるか；ｉｉｉ）前記特異的結合対の第１の官能基が、アルキンまたはマレイミドであり、前記結合対の第２の官能基が、チオールであるか、またはその逆であるか；ｉｖ）前記特異的結合対の第１の官能基が、共役ジエンであり、前記結合対の第２の官能基が、置換アルケンであるか、またはその逆であるか；ｖ）前記特異的結合対の第１の官能基が、アルケン、アルキンまたはアセチレン化銅であり、前記結合対の第２の官能基が、ニトロンであるか、またはその逆であるか；ｖｉ）前記特異的結合対の第１の官能基が、アルデヒドまたはケトンであり、前記結合対の第２の官能基が、アルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはヒドラジドであるか、またはその逆であるか；またはｖｉｉ）前記特異的結合対の第１の官能基が、アルデヒド、ケトン、イソチオシアネート、カルボン酸またはその誘導体（例えば、エステル、無水物、ハロゲン化アシル、トシルおよびＮ－ヒドロスクシンイミド（ＮＨＳ））であり、前記結合対の第２の官能基が、アミンであるか、またはその逆であるか；ｖｉｉｉ）官能基である、実施形態２８に記載の融合性リポソーム。
【0157】
実施形態３１：前記特異的結合対が、アルキン－アジドである、実施形態３０に記載の融合性リポソーム。
【0158】
実施形態３２：前記特異的結合対の前記第１の官能基が、前記結合対の前記相補的な第２の官能基と非共有結合を形成することができる、実施形態４～２７のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0159】
実施形態３３：前記特異的結合対の第１の官能基が、ビオチンであり、前記結合対の第２の官能基が、ビオチン結合ペプチドまたはビオチン結合タンパク質から選択される結合パートナーであるか、またはその逆である、実施形態３２に記載の融合性リポソーム。
【0160】
実施形態３４：前記ビオチン結合タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジンおよび抗ビオチン抗体から選択される、実施形態３３に記載の融合性リポソーム。
【0161】
実施形態３５：前記ビオチン結合ペプチドが、ＡＥＧＥＦＣＳＷＡＰＰＫＡＳＣＧＤＰＡＫ（配列番号１）、ＣＳＷＲＰＰＦＲＡＶＣ（配列番号２）、ＣＳＷＡＰＰＦＫＡＳＣ（配列番号３）およびＣＮＷＴＰＰＦＫＴＲＣ（配列番号４）から選択される、実施形態３４に記載の融合性リポソーム。
【0162】
実施形態３６：前記融合性リポソームが、コレステロール（ＣＨＯ）またはその誘導体をさらに含む、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0163】
実施形態３７：前記融合性リポソームが、ＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥまたはＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋおよび必要に応じてコレステロールを含み、ここで、ＰＥＧ２Ｋは、約２ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを表し、ＤＯＰＣの相対モル量は、最大約８０％であり、ＤＯＴＡＰの相対モル量は、最大約８０％であり、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋの相対モル量は、最大約２０％であり、ＤＯＰＥの相対モル量は、最大約２０％であり、コレステロールの相対モル量は、最大約４０％である、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0164】
実施形態３８：前記融合性リポソームが、
５２．５：３５：０．６：１０、５２．５：３５：１．２５：１０、５２．５：３５：２．５：１０、５２．５：３５：５：１０、５２．５：３５：０．６：５、５２．５：３５：１．２５：５、５２．５：３５：２．５：５、５２．５：３５：５：５、６５：２０：５：１０、５０：３５：５：１０、５２．５：３５：１．２５：７、５２．５：３５：１．２５：５または５２．５：３５：２．５：７というモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ；または
５２．５：３５：０．６、５２．５：３５：１．２５、５２．５：３５：２．５、５２．５：３５：５、５２．５：３５：０．６、５２．５：３５：１．２５、５２．５：３５：２．５、５２．５：３５：５、６５：２０：５、５０：３５：５、５２．５：３５：１．２５、５２．５：３５：１．２５または５２．５：３５：２．５というモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ
を含む、実施形態３７に記載の融合性リポソーム。
５２．５：３５：０．６：１０、５２．５：３５：１．２５：１０、５２．５：３５：２．５：１０、５２．５：３５：５：１０、５２．５：３５：０．６：５、５２．５：３５：１．２５：５、５２．５：３５：２．５：５、５２．５：３５：５：５、６５：２０：５：１０、５０：３５：５：１０、５２．５：３５：１．２５：７、５２．５：３５：１．２５：５または５２．５：３５：２．５：７というモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ；または
５２．５：３５：０．６、５２．５：３５：１．２５、５２．５：３５：２．５、５２．５：３５：５、５２．５：３５：０．６、５２．５：３５：１．２５、５２．５：３５：２．５、５２．５：３５：５、６５：２０：５、５０：３５：５、５２．５：３５：１．２５、５２．５：３５：１．２５または５２．５：３５：２．５というモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ
を含む、実施形態３７に記載の融合性リポソーム。
【0165】
実施形態３９：前記融合性リポソームが、５２．５：３５：２．５：５というモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ；または５２．５：３５：２．５というモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋを含む、実施形態３８に記載の融合性リポソーム。
【0166】
実施形態４０：前記リポソームの融解温度（Ｔｍ）が、４５℃未満であり、その温度において、前記融合性リポソームが、非結晶転移相で維持されることにより、リポソームと細胞膜との融合に必要な膜の流動性がもたらされる、実施形態１～３９のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0167】
実施形態４１：前記融合性リポソームが、最大２００ｎｍのサイズ、例えば、約１５ｎｍ～約２００ｎｍ、約２０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約１１０ｎｍ～約２００ｎｍ、例えば、約１００ｎｍを有する、実施形態１～４０のいずれか１つに記載の融合性リポソーム。
【0168】
実施形態４２：癌細胞を選択的に検出するための方法であって、前記癌細胞を実施形態１～３９のいずれか１つに記載の融合性リポソームと接触させる工程；および前記検出可能な作用物質が、活性化可能な蛍光プローブである場合は、その蛍光プローブによって吸収される波長を有する光を細胞に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって、前記蛍光プローブを検出する工程；前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画する工程、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出する工程を含む、方法。
【0169】
実施形態４３：癌患者における癌細胞の選択的な検出が、ナノ粒子に含められた制癌剤による癌の処置に対する前記癌患者の応答性を示唆する、実施形態４２に記載の方法。
【0170】
実施形態４４：応答性と判断された癌患者が、前記制癌剤を含むナノ粒子で処置される、実施形態４３に記載の方法。
【0171】
実施形態４５：癌細胞を選択的に検出するための方法であって、（ａ）前記癌細胞を実施形態４～４１のいずれか１つに記載の官能化された融合性リポソームと接触させる工程；（ｂ）前記癌細胞を、蛍光プローブおよび磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）用またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の造影剤から選択される検出可能な作用物質と接触させる工程であって、ここで、前記検出可能な作用物質は、前記脂質分子の前記第１の官能基に結合することができる、結合対の相補的な第２の官能基で官能化されている、工程；および（ｃ）前記検出可能な作用物質が蛍光プローブである場合は、その蛍光プローブによって吸収される波長を有する光を細胞に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって、前記蛍光プローブを検出し；前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画し、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出し、それにより、前記癌細胞を選択的に検出する工程を含む、方法。
【0172】
実施形態４６：前記検出可能な作用物質が、（ａ）ｃｙ３、ｃｙ５、ｃｙ５．５、ｃｙ７ ｃｙ９、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７９０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７５０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７００、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６８０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６６０、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６４７、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６３３、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５９４、５８５ｎｍ～８００ｎｍの範囲のＱｄｏｔ、蛍光プロトポルフィリンオリゴマー、イソシアニングリーン（ＩＣＧ）から選択される蛍光プローブ；または（ｂ）フルオレセインアナログ（例えば、ジアセテート修飾アナログ）、クマリンアナログ（例えば、ｐｙ＋ＢＣ６９０－（１－メチル－４－（２－オキソ－８－（ピロリジン－１－イル）－２Ｈ－ベンゾ［ｇ］クロメン－３－イル）ピリジニウムトリフルオロメタンスルホネート））、ＣＦＳＥ（５（６）－カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－スクシンイミジルエステル）、ローダミンアナログ（例えば、ｇＧｌｕ－ＨＭＲＧ（γ－グルタミルヒドロキシメチルローダミングリーン））、クルクミノイドジフルオロボロンベースの腫瘍標的化γ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）によって活性化可能な）蛍光プローブ（Ｇｌｕ－ＤＦＢ）およびインドシアニンアナログ（例えば、ＡＰ－Ｇｌｕ（３Ｈ－インドリウム、２－［（１Ｅ）－２－［４－［［４－［［（４Ｓ）－４－アミノ－４－カルボキシ－１－オキソブチル］アミノ］フェニル］メトキシ］フェニル］エテニル］－１－（５－カルボキシペンチル）－３，３－ジメチル－，ブロミド（１：１））ならびに他の近赤外蛍光活性化分子から選択される活性化可能な蛍光プローブである、実施形態４２～４５のいずれか１つに記載の方法。活性化可能なフルオロフォアに対するエステル修飾は、フルオロフォアを非蛍光にし、そのフルオロフォアは、リポソームが癌細胞と融合し、続いて細胞質エステラーゼによって細胞質で切断されると、蛍光性になる。
【0173】
実施形態４７：癌患者における癌細胞の選択的な検出が、ナノ粒子に含められた制癌剤による癌の処置に対する前記癌患者の応答性を示唆する、実施形態４５または４６に記載の方法。
【0174】
実施形態４８：応答性と判断された癌患者が、前記制癌剤を含むナノ粒子で処置される、実施形態４７に記載の方法。
【0175】
実施形態４９：蛍光ガイド手術または標的化放射線治療によって癌を処置するための方法であって、前記方法は、実施形態４２～４８のいずれか１つに記載の方法および癌細胞を含む腫瘍を除去する工程を含む、方法。
【0176】
実施形態５０：前記癌患者が、皮膚癌などの腫瘍のイメージングまたは全身イメージングを受けており、前記方法が、前記融合性リポソームおよび必要に応じて前記官能化された検出可能な作用物質を全身投与する工程または局所的に適用する工程；および前記検出可能な作用物質が、活性化可能な蛍光プローブまたは蛍光プローブである場合は、皮膚の領域または全身に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって前記蛍光プローブを検出し、前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画し、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出し、皮膚などの器官の領域または全身を走査し、それにより、腫瘍の位置および縁を明確化する工程を含む、実施形態４２～４８のいずれか１つに記載の方法。
【0177】
実施形態５１：実施形態５０に記載の方法および癌細胞を含む腫瘍を除去する工程を含む、癌を処置するための方法。
【0178】
実施形態５２：癌細胞の選択的検出を必要とする癌患者から取り出された組織または血液由来画分における癌細胞をエキソサイチュで選択的に検出するための実施形態４２または４５に記載の方法であって、前記方法は、前記融合性リポソーム、および必要に応じて、官能化された蛍光プローブを、全身投与するかまたは前記組織もしくは血液由来画分に適用する工程、ならびに前記組織または血液由来画分に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって前記蛍光プローブを検出し、それにより、前記癌細胞を選択的に検出する工程を含む、実施形態４２または４５に記載の方法。
【0179】
実施形態５３：前記組織が、皮膚であり、前記癌患者が、皮膚癌を除去するための手術（モース術）を受けており、前記手術は、前記皮膚組織が、検出可能な癌細胞を有さなくなるまで反復される、実施形態５２に記載の方法。
【0180】
実施形態５４：前記血液由来画分中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を選択的に検出するための、実施形態５２に記載の方法。
【0181】
実施形態５５：前記癌が、トリプルネガティブ乳癌などの乳癌、メラノーマ、肺癌、甲状腺癌および前立腺癌の群から選択される、実施形態４２～５４のいずれか１つに記載の方法。
【0182】
実施形態５６：癌細胞を選択的に検出し、癌を処置するための、実施形態４２または４５に記載の方法であって、前記方法は、前記融合性リポソームおよび必要に応じて前記官能化された検出可能な作用物質を全身投与するかまたは局所的に適用する工程であって、ここで、前記融合性リポソームは、前記検出可能な作用物質ならびに細胞傷害剤および／または免疫系活性化剤を含む、工程；前記検出可能な作用物質が、活性化可能な蛍光プローブまたは蛍光プローブである場合は、皮膚の領域または全身に照射し、蛍光プローブから放射される光を検出することによって前記蛍光プローブを検出する工程、前記検出可能な作用物質が造影剤である場合は、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴデバイスによってシグナル強度の変化を解析することによって像を描画する工程、または前記融合性リポソームが、蛍光プローブと造影剤の両方を含む場合は、前記蛍光プローブと前記造影剤の両方を検出する工程；および必要に応じて、前記検出可能な作用物質を長時間繰り返し検出することによって、処置の応答をモニタリングする工程を含む、実施形態４２または４５に記載の方法。
【0183】
実施形態５７：（ａ）実施形態５～４１のいずれか１つに記載の融合性リポソームを含む第１の容器；（ｂ）蛍光プローブおよび磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）用またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）用の造影剤から選択される検出可能な作用物質を含む第２の容器であって、前記検出可能な作用物質は、前記脂質分子の前記第１の官能基に結合することができる、結合対の相補的な第２の官能基で官能化されている、第２の容器；および（ｃ）（ａ）の融合性リポソームおよび続いて（ｂ）の検出可能な作用物質を癌患者に投与する工程を含む癌細胞を選択的に検出するための方法についての指示を含むパンフレットを備える、キット。
【0184】
本発明は、以下の非限定的な例によって例証される。
【実施例】
【0185】
材料および方法：
脂質：ＤＯＰＥ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン，Ｌｉｐｏｉｄ）、ＤＳＰＥ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＯＰＣ，Ｌｉｐｏｉｄ）、ＨＳＰＣ（水素添加ダイズホスホコリン，Ｌｉｐｏｉｄ）、ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイルオキシ－３－トリメチルアンモニウムプロパンクロリド，Ｌｉｐｏｉｄ）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、ＭＰＥＧ－２０００－ＤＳＰＥ，Ｌｉｐｏｉｄ）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ）、ＤＯＰＥ－ＦＩＴＣ（社内合成）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ４－アジド（社内合成）、ＤＯＰＥ－ＰＥＧ４－アジド（社内合成）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ４－ビオチン（社内合成）。
脂質：ＤＯＰＥ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン，Ｌｉｐｏｉｄ）、ＤＳＰＥ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＯＰＣ，Ｌｉｐｏｉｄ）、ＨＳＰＣ（水素添加ダイズホスホコリン，Ｌｉｐｏｉｄ）、ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイルオキシ－３－トリメチルアンモニウムプロパンクロリド，Ｌｉｐｏｉｄ）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、ＭＰＥＧ－２０００－ＤＳＰＥ，Ｌｉｐｏｉｄ）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ）、ＤＯＰＥ－ＦＩＴＣ（社内合成）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ４－アジド（社内合成）、ＤＯＰＥ－ＰＥＧ４－アジド（社内合成）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ４－ビオチン（社内合成）。
【0186】
ＰＥＧ４は、約１９４Ｄａの分子量を有するＰＥＧを表す。
【0187】
イソシアニングリーン、カルディオグリーン（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号２１９８０）。
【0188】
無水エタノールを用いて、脂質を７０℃で溶解する。
【0189】
薄膜水和法を用いた検出可能なリポソームの作製：
脂質をクロロホルムまたはクロロホルムメタノール混合物に溶解して、ガラス球状物内で完全に可溶化することができる。球状物を絶えず回転させながら、真空下または窒素気流下において蒸発させることにより、均一な薄膜を形成することができる。目に見える溶媒が蒸発した後、溶媒を真空下で１時間蒸発させる。
脂質をクロロホルムまたはクロロホルムメタノール混合物に溶解して、ガラス球状物内で完全に可溶化することができる。球状物を絶えず回転させながら、真空下または窒素気流下において蒸発させることにより、均一な薄膜を形成することができる。目に見える溶媒が蒸発した後、溶媒を真空下で１時間蒸発させる。
【0190】
Ｇｄ－ＤＴＰＡまたはＩＣＧなどの検出可能な作用物質を含む水性緩衝液（例えば、ＰＢＳ）を、使用するリン脂質に係る最高Ｔｍ超に予め加温する。球状物を同じ温度に加熱し、水性緩衝液を脂質薄膜に加える。ボルテックスして混合し、６０分間回転させる。押出し成形機またはプローブ超音波処理またはマイクロフルイディクスベースのフローセルを用いて、リポソームにダウンサイズする。透析またはサイズ排除法を用いて、被包されていない材料を除去する。４００ＲＰＭで混合しながら、エタノール－アミン基を２５℃において１時間、５モル過剰量のＮＨＳ－リンカー－第２の官能基で修飾する。透析またはサイズ排除法を用いて、未結合リンカー－第２の官能基を除去する。
【0191】
エタノール注入を用いた免疫標識リポソームの作製：
リポソーム調製は、当該分野で周知の手法であり、例えば、Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ Ｖ．Ｐ．ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｉｇ Ｖ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（ＯＵＰ Ｏｘｆｏｒｄ，２００３）に開示されているプロトコルに従って、行うことができる。
リポソーム調製は、当該分野で周知の手法であり、例えば、Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ Ｖ．Ｐ．ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｉｇ Ｖ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（ＯＵＰ Ｏｘｆｏｒｄ，２００３）に開示されているプロトコルに従って、行うことができる。
【0192】
本発明者らの場合は、脂質（Ａｖａｎｔｉ－極性脂質またはリポイド）を、必要な組成に従って計量し、必要なリポソーム体積の１０％という最終体積の無水ＥｔＯＨに可溶化した。脂質－ＥｔＯＨ混合物をその脂質のＴｍ（融解温度）超に加熱した。カルシウムまたはマグネシウムを含まず、ｐＨ＝７．２～７．４のＰＢＳへのＥｔＯＨ注入を、同一の温度において行い、脂質－緩衝液を混合し、押出し成形機を用いて押出し成形して、約９０ｎｍ～１００ｎｍという所望のサイズ分布のリポソームを得た。
【0193】
あるいは、脂質をガラス容器内のクロロホルムまたはクロロホルム－ＭｅＯＨ（２：１）またはクロロホルム－ＭｅＯＨ（３：１）に可溶化し、しっかり混合して、均一な溶液を得た。次いで、有機溶媒中の脂質を陰圧（１５０ｍＢａｒ）下で２時間蒸発させて、有機溶媒を除去し、それにより、ガラス容器上に脂質の薄膜を作った。フルオロフォアを含み（含有量は目的のフルオロフォアに依存する）、予熱され（脂質Ｔｍ超に）、濃縮された水溶液（例えば、ＰＢＳ／０．９％ＮａＣｌ／ＤＤＷ／５％デキストロースを用いて、脂質の薄膜を水和した。例えば、インドシアニングリーン（ＩＣＧ、カルディオグリーン）は、５％デキストロースに容易に可溶化され、リポソーム被包を可能にする。しかしながら、ＩＣＧは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で凝集物を生成するので、リポソーム被包の目的ではＰＢＳに適合しない。
【0194】
フルオロフォアを脂質に連結する場合（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）－ＤＯＰＥ、そのフルオロフォアを脂質混合物に加え、ＥｔＯＨに溶解した後、ＥｔＯＨ注入を行う。そのような蛍光標識された脂質はまた、薄膜水和法において、またはナノアセンブラーもしくは他のマイクロフルイディクスベースのリポソームアセンブリ方法を用いて、使用され得る。次いで、脂質水溶液を混合（ボルテックス）し、Ｔｍ超に加熱した。沈殿物が見えた場合、薄膜が十分に水和され、均一な乳濁溶液が得られるまで、超音波処理を行った。
【0195】
Ｎ８製剤と命名された非限定的な例を、通常、下記に示される研究において、癌細胞と選択的に融合するために使用した：
３５：５２．５：１０：２．５というモル比のＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００
３５：５２．５：１０：２．５というモル比のＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００
【0196】
リポソームのサイズ測定を通例のとおり行い、この場合は動的光散乱（ＤＬＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて行ったが、クライオＴＥＭ電子顕微鏡法を用いて測定することもできる。
【0197】
Ｔｍ測定：サンプルを加熱し、次いで冷却し、サンプルの変化を計測する機械である示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用することによって、Ｔｍを測定する。例えば、Ｅｐａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｌａｙｅｒ ｔｏ ｈｅｘａｇｏｎａｌ ｐｈａｓｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅｓ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ １９８５）を参照のこと。本発明者らはまた、Ａｖａｎｔｉ（登録商標）－Ｐｏｌａｒ ＬｉｐｉｄｓのウェブサイトおよびＬｉｐｏｉｄのウェブサイトを用いてＴｍを測定した。
【0198】
細胞媒介性標識のためのフルオロフォアの被包：
薄膜およびエタノール注入の場合、フルオロフォア（例えば、インドシアニングリーン（ＩＣＧ））を、１ｍｇ／ｍｌの濃度で使用したが、必要に応じ低下もしくは上昇させることができるか、または第１級アミンに共有結合でき、フルオレセイン上にそのフルオロフォアを非蛍光にする２つのエステル修飾を有する、官能化された活性化可能なフルオロフォアであるＣＦＳＥ（５（６）－カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－スクシンイミジルエステル）。このフルオロフォアは、リポソームが癌細胞と融合し、続いて細胞質で切断されると、蛍光性になる。類似のエステル修飾を有する他の分子は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによって入手可能である（ｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ：Ｂｌｕｅ、Ｖｉｏｌｅｔ、ＣＦＳＥ、Ｙｅｌｌｏｗ、Ｆａｒ Ｒｅｄは、それぞれ３７５／４１０ｎｍ、４０５／４５０ｎｍ、４９５／５１９ｎｍ、５４６／５７９ｎｍ、６３０／６６１ｎｍという励起／発光波長において使用され得る）。
薄膜およびエタノール注入の場合、フルオロフォア（例えば、インドシアニングリーン（ＩＣＧ））を、１ｍｇ／ｍｌの濃度で使用したが、必要に応じ低下もしくは上昇させることができるか、または第１級アミンに共有結合でき、フルオレセイン上にそのフルオロフォアを非蛍光にする２つのエステル修飾を有する、官能化された活性化可能なフルオロフォアであるＣＦＳＥ（５（６）－カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－スクシンイミジルエステル）。このフルオロフォアは、リポソームが癌細胞と融合し、続いて細胞質で切断されると、蛍光性になる。類似のエステル修飾を有する他の分子は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによって入手可能である（ｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ：Ｂｌｕｅ、Ｖｉｏｌｅｔ、ＣＦＳＥ、Ｙｅｌｌｏｗ、Ｆａｒ Ｒｅｄは、それぞれ３７５／４１０ｎｍ、４０５／４５０ｎｍ、４９５／５１９ｎｍ、５４６／５７９ｎｍ、６３０／６６１ｎｍという励起／発光波長において使用され得る）。
【0199】
過剰量の被包されなかったフルオロフォアを、透析（２Ｌの緩衝液に対して５－１ｍｌのリポソーム、２４時間にわたって少なくとも３回交換した）またはサイズ排除法を用いて除去した。ＤＯＰＥなどのエタノールアミン脂質を用いる場合、ＣＦＳＥ（および他の類似のＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒの分子プローブ）におけるＮＨＳは、その脂質に共有結合し、そのフルオロフォアは、そのリポソームから漏出できないので、蛍光リポソームの安定性を改善する。
【0200】
活性化可能なフルオロフォアを有するリポソームを調製する場合は、エステルに結合した基を切断しない条件下で、これらのフルオロフォアを被包しなければならない。塩基性ｐＨの条件および高温により、フルオレセインからのメチル－Ｅｓｔｈｅｒ切断が生じ、偽陽性が生じ得る。
【0201】
生成後のリポソームの修飾：
エタノールアミン基を含むリポソームを、押出し成形後に、ＮＨＳエステル化学反応（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）を用いてリンカーおよびアジド（結合対の一方のメンバー）で化学修飾した。典型的には、ＮＨＳ－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４－アジド（ＮＨＳ基）を、第１級アミン基（ＤＯＰＥ脂質）１つあたり５モル当量で使用する。過剰量の未結合物を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて除去した。
エタノールアミン基を含むリポソームを、押出し成形後に、ＮＨＳエステル化学反応（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）を用いてリンカーおよびアジド（結合対の一方のメンバー）で化学修飾した。典型的には、ＮＨＳ－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４－アジド（ＮＨＳ基）を、第１級アミン基（ＤＯＰＥ脂質）１つあたり５モル当量で使用する。過剰量の未結合物を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて除去した。
【0202】
あるいは、予め修飾された脂質を用いてリポソームを作製することにより、銅依存性または銅非依存性のクリック反応を可能にする類似のリポソーム生成物を得た。簡潔には、ＰＥＧ４－アルキンまたはアジドで予め修飾されたＤＳＰＥまたはＤＯＰＥ脂質を、ＥｔＯＨ注入前に脂質混合物に組み込んだ。
【0203】
修飾抗体および修飾リポソームを用いる２ＳＴＥＰアプローチおよびＯＵＴアプローチの作成：
２ＳＴＥＰ：このアプローチでは、解除細胞を２工程で標識する。まず、それらの細胞を、官能化されたリポソームと接触させ、第２の工程において、それらの細胞を、官能化された抗体または検出可能なプローブまたはＭＲＩ／ＣＴ／ＰＥＴ／蛍光用のナノ粒子と接触させる。結合対の一方のメンバー（例えば、アジド）に共有結合的に連結されたリポソームを、適切な希釈度で細胞に対して直接使用した（または動物モデルでは静脈内（ＩＶ）注射した）後、処置された細胞を洗浄し（インビボの状況では適用されず）、結合対の相補的なメンバー（例えば、ＢＣＮ）で修飾された、抗体、蛍光プローブ（インドシアニングリーン）、またはＭＲＩ／ＣＴ／ＰＥＴ／蛍光用のナノ粒子と反応させた。
２ＳＴＥＰ：このアプローチでは、解除細胞を２工程で標識する。まず、それらの細胞を、官能化されたリポソームと接触させ、第２の工程において、それらの細胞を、官能化された抗体または検出可能なプローブまたはＭＲＩ／ＣＴ／ＰＥＴ／蛍光用のナノ粒子と接触させる。結合対の一方のメンバー（例えば、アジド）に共有結合的に連結されたリポソームを、適切な希釈度で細胞に対して直接使用した（または動物モデルでは静脈内（ＩＶ）注射した）後、処置された細胞を洗浄し（インビボの状況では適用されず）、結合対の相補的なメンバー（例えば、ＢＣＮ）で修飾された、抗体、蛍光プローブ（インドシアニングリーン）、またはＭＲＩ／ＣＴ／ＰＥＴ／蛍光用のナノ粒子と反応させた。
【0204】
ＯＵＴ：このアプローチでは、官能化された抗体または検出可能なプローブを外葉上に有するリポソームで癌細胞を１工程で標識する。結合対の一方のメンバー（例えば、アジド）に共有結合的に連結されたリポソームを、結合対の相補的なメンバー（例えば、ＢＣＮ）を有する抗体またはインドシアニングリーンと反応させた。次いで、この修飾されたリポソームを、適切な希釈度で細胞に対して直接使用した（または動物モデルではＩＶ注射した）後、処置された細胞を洗浄した（インビボの状況では適用されず）。
【0205】
実施例１：１工程手順を用いたトリプルネガティブ乳癌のインサイチュ検出
インドシアニングリーン（ＩＣＧ）を含むリポソームを、４Ｔ１ｍＣｈｅｒｒｙ（トリプルネガティブ乳癌）腫瘍保有マウスにＩＶ注射した。リポソーム注射の２４時間後に、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、マウスをＩＣＧシグナルおよびｍＣｈｅｒｒｙについて画像化した。左のパネルの画像は、腫瘍のｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示しており（図１Ａおよび図１Ｃ）、右のパネルの画像（図１Ｂおよび図１Ｄ）は、第１の結合対の例としてＰＥＧ４－アジド（Ｃ）またはＰＥＧ４－ビオチン（Ｄ）で修飾された、ＩＣＧがロードされたリポソームの注射の２４時間後に記録された、ＩＣＧシグナルを示している。アジド官能基またはビオチン官能基が存在することにより、標識された癌細胞に結合するＴ細胞活性化剤（例えば、ＢＣＮまたはアビジンで官能化された抗ＣＤ３および抗ＣＤ８抗体）の投与によるそれらのリポソームのセラノスティックな使用が可能になるので、この方法は、癌細胞を可視化するだけでなく、それらに対するＴ細胞応答も誘起する。
インドシアニングリーン（ＩＣＧ）を含むリポソームを、４Ｔ１ｍＣｈｅｒｒｙ（トリプルネガティブ乳癌）腫瘍保有マウスにＩＶ注射した。リポソーム注射の２４時間後に、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、マウスをＩＣＧシグナルおよびｍＣｈｅｒｒｙについて画像化した。左のパネルの画像は、腫瘍のｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示しており（図１Ａおよび図１Ｃ）、右のパネルの画像（図１Ｂおよび図１Ｄ）は、第１の結合対の例としてＰＥＧ４－アジド（Ｃ）またはＰＥＧ４－ビオチン（Ｄ）で修飾された、ＩＣＧがロードされたリポソームの注射の２４時間後に記録された、ＩＣＧシグナルを示している。アジド官能基またはビオチン官能基が存在することにより、標識された癌細胞に結合するＴ細胞活性化剤（例えば、ＢＣＮまたはアビジンで官能化された抗ＣＤ３および抗ＣＤ８抗体）の投与によるそれらのリポソームのセラノスティックな使用が可能になるので、この方法は、癌細胞を可視化するだけでなく、それらに対するＴ細胞応答も誘起する。
【0206】
【0207】
図２Ａ～図２Ｃに示されているデータは、死後に集められたにもかかわらず、融合性リポソームが、蛍光イメージング支援外科手技、光線力学的療法（妥当な光力学性フルオロフォアを使用すると仮定して）または癌性塊の照射において、およびバイオプシーをエキソサイチュで解析するために、使用できることを示している。
【0208】
同様に、ＭＲＩ／ＣＴ／ＰＥＴ造影剤を含むリポソームを、４Ｔ１ｍＣｈｅｒｒｙ（トリプルネガティブ乳癌）腫瘍保有マウスにＩＶ注射する。リポソーム注射の２４時間後に、ｍＣｈｅｒｒｙに対してはＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用い、ＭＲＩ／ＣＴ／ＰＥＴ造影剤のシグナルに対しては適切なイメージングデバイスを用いて、マウスを画像化する。
【0209】
実施例２．２工程手順を用いた癌のインサイチュ検出
特異的結合対の第１の官能基（例えば、アジド）を含む融合性リポソームを静脈内注射し、３０分～４８時間後に、相補的な官能基を有する検出可能なプローブを含む第２のナノ粒子（例えば、ＢＣＮで官能化されたナノ金粒子、またはＣＴにおいて検出可能なＢＣＮ－ヨウ素を有するリポソーム、またはＢＣＮに結合したＩＣＧをロードされたリポソーム）を注射する。第１の融合性リポソームおよび第２のナノ粒子の循環半減期および薬力学的プロファイルは、イメージングまでの最適な時間を規定し、肝臓および脾臓などの器官におけるオフターゲット標識を回避するために用いることができる。
特異的結合対の第１の官能基（例えば、アジド）を含む融合性リポソームを静脈内注射し、３０分～４８時間後に、相補的な官能基を有する検出可能なプローブを含む第２のナノ粒子（例えば、ＢＣＮで官能化されたナノ金粒子、またはＣＴにおいて検出可能なＢＣＮ－ヨウ素を有するリポソーム、またはＢＣＮに結合したＩＣＧをロードされたリポソーム）を注射する。第１の融合性リポソームおよび第２のナノ粒子の循環半減期および薬力学的プロファイルは、イメージングまでの最適な時間を規定し、肝臓および脾臓などの器官におけるオフターゲット標識を回避するために用いることができる。
【0210】
２つのタイプのリポソームまたは２つのナノ技術ベース粒子またはそれらの組み合わせを使用することにより、シグナル対ノイズを改善することができ、偽陽性を減少させることができる。癌細胞と選択的に融合する、第１の結合対を有する１つのリポソーム、および融合した細胞の検出を助ける、第２の結合対を有する第２のナノ粒子も、使用することができる。この組み合わせ（正に帯電したリポソームと、より長い循環時間を有する他のＣＴ／ＭＲＩ／蛍光の検出可能なリポソーム、または金ナノ粒子もしくは他の高分子ナノ粒子）は、シグナル対ノイズを改善するため、ならびに肝臓および脾臓などの組織における偽陽性を減少させるために、２工程注射の様式で用いることができる。第１のリポソームは、癌細胞との選択的な融合を起こして、第１の結合対を癌細胞の膜の外葉に付加するのに対して、第２のナノ粒子は、第２の結合対を用いて結合する。リポソームを最初に注射し、少なくとも２半減期を経て、第２のナノ粒子を注入することによって、肝臓および脾臓におけるシグナル対ノイズを改善することができる。インビボ条件下では、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）も使用することができ、ここで、第１の融合性リポソームが、脂質に結合した１つのフルオロフォアおよび特異的結合対の第１の官能基を有し、第２のリポソーム／ナノ粒子が、相補的な官能基、およびＦＲＥＴにおいて使用でき、それら２つのフルオロフォアを有する２つのリポソームが近接した場合にシグナルをもたらす、第２のフルオロフォアを有し、これは、リポソームで標識された癌細胞の膜が、他方のフルオロフォアを有する第２のリポソームに近づくと、ＦＲＥＴが可能になり、シグナル蛍光シフトが起きることを意味する。
【0211】
実施例３．活性化可能な蛍光プローブを用いた癌のインサイチュ検出
手術中に使用される、エステラーゼで切断可能なフルオロフォアを有するリポソームを、静脈内に注射するか、または腫瘍組織、および新生物組織と疑われる周囲に灌注するために使用する。次いで、その組織を、食塩水溶液で洗浄して、未結合のリポソームおよび血液を除去して、シグナル対ノイズを改善する。リポソームが癌細胞と融合すると、フルオロフォア上のエステル基が除去され、使用されるフルオロフォアに対応する蛍光の励起波長および発光波長を用いて検出が可能になる。
手術中に使用される、エステラーゼで切断可能なフルオロフォアを有するリポソームを、静脈内に注射するか、または腫瘍組織、および新生物組織と疑われる周囲に灌注するために使用する。次いで、その組織を、食塩水溶液で洗浄して、未結合のリポソームおよび血液を除去して、シグナル対ノイズを改善する。リポソームが癌細胞と融合すると、フルオロフォア上のエステル基が除去され、使用されるフルオロフォアに対応する蛍光の励起波長および発光波長を用いて検出が可能になる。
【0212】
次いで、この手法を蛍光ガイド手術または標的化放射線治療に利用して、可視化された腫瘍を除去する。
【0213】
実施例４．癌細胞のエキソサイチュでの選択的な検出
１工程手順：新形成が疑われる組織（例えば、モース術の場合は皮膚）を摘出し、ＰＢＳまたは他の緩衝液で洗浄して血餅を除去し、シグナル対ノイズを改善し、５ｍＭ脂質の活性化可能なフルオロフォアリポソーム溶液に１５分間浸漬する。リポソームで処置された組織を、ＰＢＳまたは他の生理学的等張性溶液（例えば、食塩水）で洗浄し、フルオロフォアに対応する励起波長および発光波長を用いて蛍光顕微鏡下で画像化する。
１工程手順：新形成が疑われる組織（例えば、モース術の場合は皮膚）を摘出し、ＰＢＳまたは他の緩衝液で洗浄して血餅を除去し、シグナル対ノイズを改善し、５ｍＭ脂質の活性化可能なフルオロフォアリポソーム溶液に１５分間浸漬する。リポソームで処置された組織を、ＰＢＳまたは他の生理学的等張性溶液（例えば、食塩水）で洗浄し、フルオロフォアに対応する励起波長および発光波長を用いて蛍光顕微鏡下で画像化する。
【0214】
２工程手順：新形成が疑われる組織を摘出し、ＰＢＳまたは他の緩衝液で洗浄して血餅を除去することにより、シグナル対ノイズを改善し、特異的結合対の官能基（例えば、アジド）を含む選択的な融合性リポソーム（例えば、５ｍＭ脂質）に１５分間浸漬する。リポソームで処置された組織を、ＰＢＳまたは他の生理学的等張性溶液（例えば、食塩水）で洗浄し、５～５００マイクログラム／ｍｌの、相補的な官能基を含むフルオロフォア（例えば、ＤＢＣＯ－Ｃｙ５）の４℃の溶液に１時間浸漬し、洗浄し、フルオロフォアに対応する励起波長および発光波長を用いて蛍光顕微鏡下で画像化する。
【0215】
癌細胞が、解析された組織サンプルにおいて検出された場合、その疑われる領域からさらなる組織を取り出し、サンプル中にシグナルが検出されなくなるまで、上に記載されたように解析する。
【0216】
実施例５．血液中の循環癌細胞（ＣＴＣ）の検出
生きている循環腫瘍細胞を単離するために、濾過などの種々のデバイスを使用する。
生きている循環腫瘍細胞を単離するために、濾過などの種々のデバイスを使用する。
【0217】
これらの細胞を、識別のために抗ＣＤ４５染色を必要とする白血球とともに共単離する。癌細胞は、必ずしも公知の標的マーカーを有するわけではないので、蛍光色素または活性化可能な色素を有する選択的な融合性リポソームを用いることにより、血液から単離された癌細胞を直接標識することができる。
【0218】
実施例６．腫瘍の全身処置、腫瘍の存在の検出、および処置の有効性の予測：
腫瘍保有マウスに、抗ＣＤ３および抗ＣＤ８に結合した、ＧｄとＩＣＰとが共被包されたリポソーム（エフェクターＴ細胞活性化リポソーム）を、単回投与で、または試験される因子が注射間の時間である場合は反復投与で、投与した。これらのリポソームは、脂質頭部基（Ａｖａｎｔｉ極性脂質）にＤＴＰＡキレート剤が予め結合された１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジエチレントリアミン五酢酸（ガドリニウム塩）であるＤＳＰＥ－ＤＴＰＡ（Ｇｄ）と統合され得る。
腫瘍保有マウスに、抗ＣＤ３および抗ＣＤ８に結合した、ＧｄとＩＣＰとが共被包されたリポソーム（エフェクターＴ細胞活性化リポソーム）を、単回投与で、または試験される因子が注射間の時間である場合は反復投与で、投与した。これらのリポソームは、脂質頭部基（Ａｖａｎｔｉ極性脂質）にＤＴＰＡキレート剤が予め結合された１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジエチレントリアミン五酢酸（ガドリニウム塩）であるＤＳＰＥ－ＤＴＰＡ（Ｇｄ）と統合され得る。
【0219】
１回目の処置が、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ８抗体を同一の用量（マウス１匹あたり各１００マイクログラムのｍＡｂ）で有する空のリポソームであったマウスに対して２回目の処置を行った。試験された２回目の処置の間隔は、４８時間、４８時間および９６時間であった。ＧｄおよびＩＣＧの計測を用いた、２回目の処置の２４時間後の、腫瘍へのフルオロフォアの到達および蓄積を図３Ａ～図３Ｃに示す。死後に腫瘍から回収されたＧｄシグナルおよびインビボ研究中（生存マウス）に記録されたＩＣＧシグナルは、十分に相関しており、腫瘍への２回目の処置の到達について似た傾向を示す。図３Ｃには、Ｇｄをロードされたリポソームの体内分布が示されており、それらは、単回処置と２回目の処置について類似のプロファイルを示している。肝臓および脾臓における蓄積は、組織特異的なマクロファージ／単球による取り込みが原因である。全身の画像が図４Ａ～図４Ｄに示されており、それらは、ＩＣＧシグナルを計測することによる、全身からのクリアランスおよび腫瘍部位における蓄積を示している（図４Ｂおよび図４Ｄ）。腫瘍のｍＣｈｅｒｒｙシグナルが、図４ＡおよびＣに示されている。図３ＢにおけるＩＣＧシグナルの定量は、ｍＣｈｅｒｒｙ腫瘍シグナルによって測定された関心領域に基づいて行われた。
【0220】
画像を取得した後（図４Ｃおよび図４Ｄ）、マウスを屠殺し、器官を単離し、計量し、燃やして灰にし、１％硝酸に溶解し、０．４５ミクロンフィルターで濾過した。器官に関連するＧｄレベルを、ＩＣＰ元素分析を用いて測定して、到達組織１グラムあたりの注射量パーセントを測定した（図３Ｃ）。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【配列表】
【国際調査報告】