▶ ソルボンヌ・ユニヴェルシテの特許一覧 ▶ セントレ ナショナル デ ラ ルシェルシェ サイエンティフィック−シーエヌアールエスの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-14
(54)【発明の名称】免疫原性細胞死を誘導する合成ペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20220106BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20220106BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20220106BHJP
C12N 5/09 20100101ALI20220106BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20220106BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220106BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220106BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06 ZNA
C07K7/08
C07K14/47
C12N5/09
A61K38/08
A61P35/00
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021522985
(86)(22)【出願日】2019-11-06
(85)【翻訳文提出日】2021-05-14
(86)【国際出願番号】 EP2019080366
(87)【国際公開番号】W WO2020094701
(87)【国際公開日】2020-05-14
(31)【優先権主張番号】18306454.2
(32)【優先日】2018-11-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518059934
【氏名又は名称】ソルボンヌ・ユニヴェルシテ
【氏名又は名称原語表記】ＳＯＲＢＯＮＮＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ
(71)【出願人】
【識別番号】511134470
【氏名又は名称】セントレ ナショナル デ ラ ルシェルシェ サイエンティフィック
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】特許業務法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】カロヤン，フィリップ
(72)【発明者】
【氏名】マルチネス トーレス，アナ，カロリーナ
(72)【発明者】
【氏名】ロドリゲス パディージャ，マリア，クリスティーナ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AC20
4B065BA30
4B065BB19
4B065CA44
4B065CA60
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA09
4C084BA17
4C084BA18
4C084BA23
4C084MA16
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA15
4H045BA16
4H045BA17
4H045CA40
4H045EA20
4H045EA28
4H045FA40
(57)【要約】
本発明は、免疫原性細胞死、特に免疫原性癌細胞死を誘導することができるＴＳＰ－１由来ペプチドに関する。本発明はさらに、そのようなペプチドの使用、特に、医薬組成物を調製して、該組成物を必要とする対象において、癌治療を有効にする、又は有効性を向上させることに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
癌の治療において免疫原性細胞死を誘導するために使用する、ＴＳＰ－１由来合成ペプチド。
【請求項2】
前記ＴＳＰ－１由来合成ペプチドが、式（Ｉ）のヘキサペプチド配列を含む化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩である、請求項１に記載の用途のＴＳＰ－１由来合成ペプチド。－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－ （Ｉ）
式中、
－Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６は、独立に、ペプチド結合又は少なくとも１つの擬ペプチド結合により、式（Ｉ）に従って互いに結合しており、
－Ｘ１は、置換又は非置換のフェニルアラニン、置換又は非置換のｐ－チロシン、置換又は非置換のｏ－チロシン、置換又は非置換のｍ－チロシン、又は置換又は非置換のホモフェニルアラニンからなるリストから選択される残基であり、
－Ｘ２は、置換又は非置換のｐ－チロシン、置換又は非置換のｏ－チロシン、置換又は非置換のｍ－チロシン、置換又は非置換のフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ホモ－ｍ－チロシン、ホモ－ｐ－チロシンあるいはホモ－ｏ－チロシンからなるリストから選択される残基であり、
－Ｘ３は、置換又は非置換のバリン、置換又は非置換のアラニン、置換又は非置換のロイシン、置換又は非置換のイソロイシンからなるリストから選択される残基であり、好ましくはバリンであり、
－Ｘ４は、置換又は非置換のバリン、置換又は非置換のアラニン、置換又は非置換のロイシン、置換又は非置換のイソロイシンからなるリストから選択される残基であり、好ましくはバリンであり、
－Ｘ５は、置換又は非置換のメチオニン、あるいはメチル化ホモシステイン、リジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸からなるリストから選択される残基であり、
－Ｘ６は、置換又は非置換のトリプトファン、置換又は非置換のヘテロ－トリプトファン、置換又は非置換のｐ－チロシン、置換又は非置換のｏ－チロシン、置換又は非置換のｍ－チロシン、置換又は非置換のフェニルアラニン、あるいは置換又は非置換のナフチルアラニンからなるリストから選択される残基であり、
－Ｘ１は式（Ｉ）の分子のＮ末端側であり、Ｘ６は式（Ｉ）の分子のＣ末端側である。
【請求項3】
前記ペプチドが、ＰＫＨＢ１（配列番号２）、ＰＫＴ１６（配列番号１７）、ＰＫＴＤ１０（配列番号２５）、ＰＫＤ１０（配列番号２１）、ＰＫＴＤｉ２－ＦＦ（配列番号３４）及びＰＫＴＤ１０－Ｘ－ＲＮＭｅ（配列番号２７）の中から選択される、請求項１又は２に記載の用途のＴＳＰ－１由来合成ペプチド。
【請求項4】
前記ペプチドが、ＰＫＨＢ１（配列番号２）、ＰＫＴ１６（配列番号１７）及びＰＫＴＤ１０（配列番号２５）の中から選択される、請求項１又は２に記載の用途のＴＳＰ－１由来合成ペプチド。
【請求項5】
癌が、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、多発性骨髄腫、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭及び下咽頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔及び中咽頭癌、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌、黒色腫、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、腟癌、外陰癌、及び子宮癌からなる群から選択される、請求項１～４のいずれかに記載の用途のＴＳＰ－１由来合成ペプチド。
【請求項6】
腫瘍細胞において免疫原性細胞死を誘導するための、ＴＳＰ－１由来合成ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項7】
ＴＳＰ－１由来合成ペプチドで前記細胞を処理する工程を含む、腫瘍細胞の調製方法。
【請求項8】
癌の治療のための免疫原性細胞死を誘導するために使用する、ＴＳＰ－１由来合成ペプチドで処理した腫瘍細胞。
【請求項9】
ＴＳＰ－１由来合成ペプチドで処理された腫瘍細胞及び薬学的に許容できる担体を含む、注射可能な医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫原性細胞死、特に免疫原性癌細胞死を誘導することができるＴＳＰ－１由来ペプチドに関する。本発明はさらに、そのようなペプチドの使用、特に、医薬組成物を調製して、該組成物を必要とする対象において、癌治療を有効にする、又は有効性を向上させることに関する。
【背景技術】
【0002】
免疫原性細胞死（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ：ＩＣＤ）は、死細胞関連抗原に対する適応免疫応答を活性化し、腫瘍細胞免疫原性を誘導する制御された細胞死の一種である（１、２）。ＩＣＤは、内因性免疫原性生体分子、すなわち損傷関連分子パターン（ｄａｍａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ：ＤＡＭＰｓ）の曝露又は放出を特徴とする（３）。生理学的条件では、ＤＡＭＰｓは細胞内に存在しているが、ストレス、損傷、又は細胞死が起こる場合に、曝露又は放出されると、免疫細胞上の受容体に結合する（４、５）。細胞表面で曝露される、及び／又は細胞外培地に放出される、ＩＣＤに関連する主なＤＡＭＰｓには、カルレティキュリン（ＣＲＴ）（６～８）及び熱ショックタンパク質７０、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０）等の他の小胞体（ＥＲ）タンパク質（９、１０）、並びにＡＴＰ（１１～１３）及び非ヒストン性クロマチンタンパク質高移動群ボックス（Ｈｉｇｈ－Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｇｒｏｕｐ Ｂｏｘ１：ＨＭＧＢ１）の分泌（１４、１５）がある。したがって、これらのＤＡＭＰｓは、抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ：ＡＰＣｓ）をＩＣＤ部位に動員し、死細胞関連抗原の取込み、処理、及び提示を刺激し、適応免疫応答をもたらす（１、１６～１８）。近年、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）は、免疫正常宿主において適応免疫応答を活性化するのに十分に「制御された細胞死（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ：ＲＣＤ）の形態」と定義されている（６７）。
【0003】
ドキソルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、及びアントラサイクリンを含む化学療法剤のサブセットは、ＩＣＤを引き起こすことができ（１８、２１）、したがって抗癌免疫応答を活性化する（１）。これらの薬物は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）等の血液悪性腫瘍を含む様々な種類の癌を治療するために使用される。
【0004】
別のＩＣＤ誘導物質を使用した過去の報告でも、腫瘍の成長を妨げた。例えば、黒色腫の治療で使用されるアルキル化剤であるメルファランの場合、Ｃ５７ＢＬ６マウスに、メルファランによって死滅したマウスＢ７８黒色腫細胞を注入し、１０日後にＢ７８生細胞を再注入したところ、４０％のマウスの腫瘍を抑制した（５１）。マウス結腸癌（ＣＴ２６）細胞株にドキソルビシンを使用して、同様の結果を得た（４２）。このワクチンの使用によって、ＤＣｓの成熟及び細胞傷害性Ｔ細胞活性化をさせること（５２）並びにＮＫ細胞傷害活性を向上させることで、抗癌免疫の活性化が促進される（５３）。
【0005】
免疫療法は、癌に対して宿主免疫防御を使用し、癌細胞への免疫原性の付与を試みる（５５）、癌に対する有望な治療選択肢である（５４）。腫瘍細胞の免疫原性が増すと、長期間の治療効果を提供し得る抗腫瘍免疫応答が引き起こされる（１）。特定の薬物が、ＤＡＭＰｓを放出すること及びＩＣＤを引き起こすことで、免疫応答の覚醒を誘導することができるという知見は、このような薬剤を探求する研究を促進した（１、４２、５３、５６）。アントラサイクリン、白金誘導体、アルキル化剤、及びプロテアソーム阻害剤は、ＩＣＤを誘発することに関する膨大な証拠を有する化学療法薬の一部である（５７）。ＩＣＤ誘導を示す別の療法には、光線力学的療法（５８）、放射線療法（５９）、腫瘍溶解性ウイルス（６０、６１）、高静水圧（６２）、並びにシコニン（６３、６４）及びカプサイシン（６５、６６）等の別のファイトケミカル剤（ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Annu Rev Immunol. 2013; 31:51-72.
【非特許文献2】Cell Death Differ. 2018; 25(3):486-541.
【非特許文献3】Sultan Qaboos University Medical Journal. 2015;15(2): e157.
【非特許文献4】Trends Immunol. 2007;28(10):429-36.
【非特許文献5】Biofactors. 2013;39(4):355-67.
【非特許文献6】Nat Med. 2007;13(1):54-61.
【非特許文献7】EMBO J. 2012;31(5):1062-79.
【非特許文献8】Immunol Lett. 2018; 193:25-34.
【非特許文献9】Blood. 2007;109(11):4839-45.
【非特許文献10】Front Immunol. 2015;6:588.
【非特許文献11】Nature. 2009;461(7261):282.
【非特許文献12】Cancer Res. 2010;70(3):855-8.
【非特許文献13】Cell Death Differ 2014;21(1):79-9175.
【非特許文献14】Nature. 2002;418(6894):191-5.
【非特許文献15】Cell death and differentiation. 2014;21(1):39-49.
【非特許文献16】Cell death and Differ. 2008;15(1):3-12.
【非特許文献17】Nature Reviews Cancer. 2012;12(12):860.
【非特許文献18】Front Immunol. 2015;6:187.
【非特許文献19】Oncoimmunology. 2014;3(9):e955691.
【非特許文献20】OncoImmunology. 2017;6(12):e1386829.
【非特許文献21】Nat Rev Immunol. 2017;17(2):97-111
【非特許文献22】Cancer. 2015;121(15):2517-28.
【非特許文献23】Blood Cancer J. 2017;7(6):e577.
【非特許文献24】https://seer.cancer.gov/statfacts/html/alyl.html
【非特許文献25】Pediatric Oncology. Springer, Cham. 2017;151-175
【非特許文献26】Pediatric Blood & Cancer. 2018;65(6):e26989.
【非特許文献27】Clin Lymphoma, Myeloma Leuk. 2017;17(9):590-4.
【非特許文献28】PLoS medicine. 2016;13(12):e1002200.
【非特許文献29】Blood. 2012;120(14):2807-16.
【非特許文献30】Anticancer Res. 2015;35(10):5667-70.
【非特許文献31】Blood. 2016;127(3):303-9.
【非特許文献32】Cell. 2009;138(2):286-99.
【非特許文献33】PLoS medicine. 2015;12(3):e1001796.
【非特許文献34】J. Med Chem. 2016;59(18):8412-21.
【非特許文献35】Cancer Res. 2011 Feb 15;71(4):1374-84.
【非特許文献36】Annu Rev Immunol. 2014;32:25-50.
【非特許文献37】Critical Rev Biochem Mol Biol. 2015;50(3):212-30.
【非特許文献38】Nat Med. 2015;21(10):1209-15.
【非特許文献39】Cell death Dis. 2018;9(5).
【非特許文献40】Nat Med. 1999;5(11):1277-84.
【非特許文献41】Br J Pharmacol. 2012;167(7):1415-30.
【非特許文献42】J Exp Med. 2005;202(12):1691-701.
【非特許文献43】ISRN Hematol. 2013;2013:1-19.
【非特許文献44】A. J Immunol. 2003;170(7):3544-53.
【非特許文献45】Cell Death Dis. 2016;7(3):e2134.
【非特許文献46】Cell. 2005;123(2):321-34.
【非特許文献47】Sci Transl Med. 2010;2(63):63-94
【非特許文献48】Biomed Pharmacother. 2015;73:109-15.
【非特許文献49】Cancer Res. 2011;71(14):4821-33.
【非特許文献50】Oncol Lett. 2017;14(1):844-52.
【非特許文献51】Cancer Res. 2015;75(8):1603-14.
【非特許文献52】Adv Cancer Res 2013;119:421-75).
【非特許文献53】Cytokine. 2017;97:123-32.
【非特許文献54】Ann Transl Med. 2016;4(14) :261-261.
【非特許文献55】Tumori J 2018;104(1):1-8.
【非特許文献56】Oncoimmunology. 2015;4(4):e1008866.
【非特許文献57】Oncoimmunology. 2014;3(1):e27048.
【非特許文献58】Oncotarget. 2016;7(30):47242-51.
【非特許文献59】Semin Radiat Oncol. 2015;25(1):11-7
【非特許文献60】Cancer Res. 2012;72(9):2327-38.
【非特許文献61】Mol Ther-Oncolytics. 2016;3:16031.
【非特許文献62】Int J Cancer. 2014;135(5):1165-77.
【非特許文献63】Mol Cancer. 2015;14(1):174.
【非特許文献64】Recept Clin Investig. 2016;3:1-5.
【非特許文献65】Cell Stress and Chaperones. 2013;18(6):801-8.
【非特許文献66】Exp Ther Med. 2016;12(2):765-70.
【非特許文献67】Intl. J. Mol. Sci. 2019, 20, 959.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
ＩＣＤ誘導物質等の、免疫系を活性化することができる新しい治療の開発は、化学療法抵抗性悪性腫瘍と闘うために、依然として重要である。
【課題を解決するための手段】
【0008】
現在、本発明者等は、合成ペプチドの既知のファミリーが、癌細胞株において、選択的免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を誘導することができることを証明した。
【0009】
合成ペプチドは、プログラム細胞死（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ：ＰＣＤ）を誘発して、その結果ＰＣＤの欠陥に関連する疾患を治療することができるＣＤ－４７作動薬として、先行して記載されている（国際特許出願第２０１７１９４６３４号、国際特許出願第２０１７１９４６２７号）。
【0010】
実際に、本発明者等は、ＰＫＨＢ１が、マウス及びヒトの非腫瘍細胞を残しつつ、白血病細胞において、カスパーゼ非依存性細胞死及びカルシウム依存性細胞死を誘導することを示すデータを得た。さらに、これらの結果は、ＰＫＨＢ１がｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＲＴ曝露及びＤＡＭＰｓ放出を誘導し、予防的ワクチン接種がｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍確立を阻害することから、ＰＫＨＢ１が白血病細胞においてＩＣＤを誘導することができることを示す。
【0011】
したがって、本発明は、癌治療において免疫原性細胞死を誘導するために使用する、ＴＳＰ－１由来合成ペプチドに関する。
【0012】
また、本発明は、癌治療において、免疫原性細胞死を誘導するための医薬組成物調製用のＴＳＰ－１由来合成ペプチドの使用に関する。
【0013】
本発明によれば、図１に表すように、ＴＳＰ－１由来合成ペプチドは、ＴＳＰ－１のβストランド７番を模倣するペプチド、又はＴＳＰ－１のβストランド７番及び８番の結合によって形成されるβシートを模倣するペプチド中から選択される。
【0014】
一実施形態によれば、ＴＳＰ－１由来合成ペプチドは、式（Ｉ）のヘキサペプチド配列を含む化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩であり、
－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－ （Ｉ）
式中、
－Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６は、独立に、ペプチド結合又は少なくとも１つの擬ペプチド結合により、式（Ｉ）に従って互いに結合しており、
－Ｘ１は、置換又は非置換のフェニルアラニン、置換又は非置換のｐ－チロシン、置換又は非置換のｏ－チロシン、置換又は非置換のｍ－チロシン、又は置換又は非置換のホモフェニルアラニンからなるリストから選択される残基であり、
－Ｘ２は、置換又は非置換のｐ－チロシン、置換又は非置換のｏ－チロシン、置換又は非置換のｍ－チロシン、置換又は非置換のフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ホモ－ｍ－チロシン、ホモ－ｐ－チロシンあるいはホモ－ｏ－チロシンからなるリストから選択される残基であり、
－Ｘ３は、置換又は非置換のバリン、置換又は非置換のアラニン、置換又は非置換のロイシン、置換又は非置換のイソロイシンからなるリストから選択される残基であり、好ましくはバリンであり、
－Ｘ４は、置換又は非置換のバリン、置換又は非置換のアラニン、置換又は非置換のロイシン、置換又は非置換のイソロイシンからなるリストから選択される残基であり、好ましくはバリンであり、
－Ｘ５は、置換又は非置換のメチオニン、あるいはメチル化ホモシステイン、リジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸からなるリストから選択される残基であり、
－Ｘ６は、置換又は非置換のトリプトファン、置換又は非置換のヘテロ－トリプトファン、置換又は非置換のｐ－チロシン、置換又は非置換のｏ－チロシン、置換又は非置換のｍ－チロシン、置換又は非置換のフェニルアラニン、あるいは置換又は非置換のナフチルアラニンからなるリストから選択される残基であり、
－Ｘ１は式（Ｉ）の分子のＮ末端側であり、Ｘ６は式（Ｉ）の分子のＣ末端側である。
－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－ （Ｉ）
式中、
－Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６は、独立に、ペプチド結合又は少なくとも１つの擬ペプチド結合により、式（Ｉ）に従って互いに結合しており、
－Ｘ１は、置換又は非置換のフェニルアラニン、置換又は非置換のｐ－チロシン、置換又は非置換のｏ－チロシン、置換又は非置換のｍ－チロシン、又は置換又は非置換のホモフェニルアラニンからなるリストから選択される残基であり、
－Ｘ２は、置換又は非置換のｐ－チロシン、置換又は非置換のｏ－チロシン、置換又は非置換のｍ－チロシン、置換又は非置換のフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ホモ－ｍ－チロシン、ホモ－ｐ－チロシンあるいはホモ－ｏ－チロシンからなるリストから選択される残基であり、
－Ｘ３は、置換又は非置換のバリン、置換又は非置換のアラニン、置換又は非置換のロイシン、置換又は非置換のイソロイシンからなるリストから選択される残基であり、好ましくはバリンであり、
－Ｘ４は、置換又は非置換のバリン、置換又は非置換のアラニン、置換又は非置換のロイシン、置換又は非置換のイソロイシンからなるリストから選択される残基であり、好ましくはバリンであり、
－Ｘ５は、置換又は非置換のメチオニン、あるいはメチル化ホモシステイン、リジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸からなるリストから選択される残基であり、
－Ｘ６は、置換又は非置換のトリプトファン、置換又は非置換のヘテロ－トリプトファン、置換又は非置換のｐ－チロシン、置換又は非置換のｏ－チロシン、置換又は非置換のｍ－チロシン、置換又は非置換のフェニルアラニン、あるいは置換又は非置換のナフチルアラニンからなるリストから選択される残基であり、
－Ｘ１は式（Ｉ）の分子のＮ末端側であり、Ｘ６は式（Ｉ）の分子のＣ末端側である。
【0015】
好ましくは、式（Ｉ）のヘキサペプチド配列は、少なくとも１つの置換又は非置換のｐ－チロシン、置換又は非置換のｏ－チロシン、置換又は非置換のｍ－チロシンの残基を含む。
【0016】
具体的な実施形態によれば、ＴＳＰ－１由来合成ペプチドは、アミノ酸配列、ＫＲＦＹＶＶＭＷＫＫ（配列番号１）を含むペプチドについて示している、国際特許出願第２０１３／１８２６５０号に記載されている通りである。
【0017】
一実施形態では、本発明のペプチドは、配列番号１と、１個、２個又は３個のアミノ酸が異なっていてよい。
【0018】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、配列番号１と、４個又は５個のアミノ酸が異なっていてよい。
【0019】
一実施形態では、本発明のペプチドは、配列番号１と、少なくとも７５％一致し、さらにより好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％一致し、依然として腫瘍細胞においてＩＣＤを誘導することができる。
【0020】
一実施形態では、本発明のペプチドは、配列番号１と、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は９９．９％一致する、配列番号１が定めるアミノ酸配列又はそれらの変異体であり、依然として腫瘍細胞においてＩＣＤを誘導することができる。
【0021】
本発明の別の実施形態では、ペプチドは、本明細書に記載の配列番号１のアミノ酸配列を含む、４５アミノ酸長未満のアミノ酸配列である。
【0022】
本発明の別の実施形態では、ペプチドは、本明細書に記載の配列番号１のアミノ酸配列を含む、４０アミノ酸長未満のアミノ酸配列である。
【0023】
本発明の別の実施形態では、ペプチドは、本明細書に記載の配列番号１のアミノ酸配列を含む、３０アミノ酸長未満のアミノ酸配列である。
【0024】
本発明の別の実施形態では、ペプチドは、本明細書に記載の配列番号１のアミノ酸配列を含む、２０アミノ酸長未満のアミノ酸配列である。
【0025】
本発明の別の実施形態では、ペプチドは、本明細書に記載の配列番号１のアミノ酸配列を含む、１５アミノ酸長未満のアミノ酸配列である。
【0026】
具体的な実施形態によれば、ＴＳＰ－１由来合成ペプチドは、国際特許出願第２０１７／１９４６２７号に記載されている通りであり、該出願は、式（ＩＩ）の配列を含むペプチドと対応することを示し、
－Ａ－Ｂ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－ （ＩＩ）
式中、
－Ａ及びＢは、上に定義した通り、アミノ酸残基であり、好ましくは天然又は合成のアミノ酸残基であり、
－Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は本明細書で定義される通り、
又はそれらの薬学的塩である。
－Ａ－Ｂ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－ （ＩＩ）
式中、
－Ａ及びＢは、上に定義した通り、アミノ酸残基であり、好ましくは天然又は合成のアミノ酸残基であり、
－Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は本明細書で定義される通り、
又はそれらの薬学的塩である。
【0027】
式（ＩＩ）において、好ましくは、Ａは（Ｄ）－リジンであり、Ｂはアルギニンである。
【0028】
式（ＩＩ）において、好ましくは、Ａ（（Ｄ）－リジン等）及びＢ（（Ｌ）－アルギニン等）は、（－ＣＯ－ＮＭｅ）等の擬ペプチド結合によって互いに結合しており、より好ましくは、Ｂはアルギニンであり、Ａ及びＢは結合－ＣＯ－ＮＭｅによって互いに結合する。
【0029】
式（ＩＩ）において、好ましくはＸ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６は、ＦＹＶＶＸＷ、ＦＹＶＶＩＷ、ＦＹＶＶＫＷ又はＦＹＶＶＬＷであり、Ｘはノルロイシンである。
【0030】
あるいは、式（ＩＩ）において、Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６はＦＦＶＶＸＷ、ＦＦＶＶＩＷ、ＦＦＶＶＫＷ又はＦＦＶＶＬＷであり、Ｘはノルロイシンである。
【0031】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩＩ）の配列を含むペプチドであり、
－Ａ－Ｂ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｃ－Ｄ－ （ＩＩＩ）
式中、
－Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、上に定義した通り、アミノ酸残基、好ましくは天然又は合成のアミノ酸残基であり、
－Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は本明細書で定義される通りであるか、
又はそれらの薬学的塩である。
－Ａ－Ｂ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｃ－Ｄ－ （ＩＩＩ）
式中、
－Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、上に定義した通り、アミノ酸残基、好ましくは天然又は合成のアミノ酸残基であり、
－Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は本明細書で定義される通りであるか、
又はそれらの薬学的塩である。
【0032】
式（ＩＩＩ）において、好ましくは、Ａは（Ｄ）－リジンであり、Ｂはアルギニンであり、好ましくは、Ｃは（Ｌ）－リジンであり、Ｄは（Ｄ）－リジンである。
【0033】
式（ＩＩＩ）において、好ましくは、Ａ（（Ｄ）－リジン等）及びＢ（（Ｌ）－アルギニン等）は、（－ＣＯ－ＮＭｅ－）等の擬ペプチド結合によって互いに結合する。
【0034】
式（ＩＩＩ）において、好ましくは、Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６はＦＹＶＶＸＷ、ＦＹＶＶＩＷ、ＦＹＶＶＫＷ又はＦＹＶＶＬＷであり、Ｘはノルロイシンである。
【0035】
あるいは、式（ＩＩＩ）において、Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６はＦＦＶＶＸＷ、ＦＦＶＶＩＷ、ＦＦＶＶＫＷ又はＦＦＶＶＬＷであり、Ｘはノルロイシンである。
【0036】
有利なことに、式（Ｉ）の化合物は、配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６（式（Ｉ））を含むペプチドであり、式（Ｉ）のペプチドの溶解性を維持するために、構造の性質及び大きさは、６～２０個のアミノ酸、より好ましくは７～１５個のアミノ酸、さらにより好ましくは８～１２個のアミノ酸、最も好ましくは１０個のアミノ酸を備える。
【0037】
より好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、ペプチド結合又は擬ペプチド結合を介して、配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６（式（Ｉ））のＮ末端に結合したジペプチドと、ペプチド結合又は擬ペプチド結合を介して、配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６のＣ末端に結合したジペプチドとを有するデカペプチド（１０個のアミノ酸）であり、Ｎ末端上で、式（ＩＶ）を表し、
Ｙ－Ａ－Ｂ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｃ－Ｄ－Ｚ （ＩＶ）
式中、
－Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、上に定義した通り、アミノ酸残基、好ましくは天然又は合成のアミノ酸残基であり、
－Ｙは、水素、Ｃ１～Ｃ６のアルキル基、Ｃ５～Ｃ８のアリール基、断片Ｒ１－ＣＯ－（式中、Ｒ１は水素原子、Ｃ１～Ｃ６のアルキル基、好ましくはメチル、又はＣ５～Ｃ８のアリール基、好ましくはフェニルであり、
－Ｚは、－ＯＨ、Ｃ１～Ｃ６のアルキル基、Ｃ５～Ｃ８のアリール基、ＮＨ２基、Ｃ１～Ｃ６のアルコキシ基又はＣ５～Ｃ８のアリールオキシ基、あるいはそれらの薬学的塩である。
Ｙ－Ａ－Ｂ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｃ－Ｄ－Ｚ （ＩＶ）
式中、
－Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、上に定義した通り、アミノ酸残基、好ましくは天然又は合成のアミノ酸残基であり、
－Ｙは、水素、Ｃ１～Ｃ６のアルキル基、Ｃ５～Ｃ８のアリール基、断片Ｒ１－ＣＯ－（式中、Ｒ１は水素原子、Ｃ１～Ｃ６のアルキル基、好ましくはメチル、又はＣ５～Ｃ８のアリール基、好ましくはフェニルであり、
－Ｚは、－ＯＨ、Ｃ１～Ｃ６のアルキル基、Ｃ５～Ｃ８のアリール基、ＮＨ２基、Ｃ１～Ｃ６のアルコキシ基又はＣ５～Ｃ８のアリールオキシ基、あるいはそれらの薬学的塩である。
【0038】
式（ＩＶ）において、好ましくは、ペプチド配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６の両側のすべてのアミノ残基は、上に定義される通り、（Ｄ）型若しくは（Ｌ）型の天然アミノ酸残基及び／又は（Ｄ）型若しくは（Ｌ）型の合成アミノ酸残基である。
【0039】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の側鎖及び／又はバックボーンは、上記の定義に従って、化学的に保護される。
【0040】
式（ＩＶ）において、好ましくは、Ａは（Ｄ）－リジンであり、Ｂはアルギニンである。
【0041】
好ましくは、Ｃは（Ｌ）－リジンであり、Ｄは（Ｄ）－リジンである。
【0042】
式（ＩＶ）において、好ましくは、Ａ（（Ｄ）－リジン等）及びＢ（（Ｌ）－アルギニン等）は、（－ＣＯ－ＮＭｅ－）等の擬ペプチド結合によって互いに結合する。
【0043】
式（ＩＶ）において、Ｙは、好ましくは、水素原子又はアセチルであり、ＺはＮＨ２である。
【0044】
式（ＩＶ）において、好ましくは、Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６はＦＹＶＶＸＷ、ＦＹＶＶＩＷ、ＦＹＶＶＫＷ又はＦＹＶＶＬＷであり、Ｘはノルロイシンである。
【0045】
あるいは、式（ＩＶ）において、Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６は、ＦＦＶＶＸＷ、ＦＦＶＶＩＷ、ＦＦＶＶＫＷ又はＦＦＶＶＬＷであり、Ｘはノルロイシンである。
【0046】
本発明は、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５及び／又はＸ６が非イオン性アミノ酸残基であり、例えばＸ５がノルロイシン、ロイシン又はイソロイシン残基、好ましくはノルロイシン残基であることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0047】
本発明は、少なくとも１個の擬ペプチド結合が、Ｎ－メチルペプチド結合であること、好ましくは式（Ｉ）の化合物のＮ末端側で、断片がＸ１に結合すること及び／又は式（Ｉ）の化合物のＣ末端側で、断片がＸ６に結合することを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0048】
本発明は、水素原子、アミノ酸残基又はペプチド断片が、式（Ｉ）のヘキサペプチドのＮ末端アミンに結合することを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0049】
本発明は、－ＯＨ基、－ＮＨ２基、アミノ酸残基又はペプチド断片が、式（Ｉ）のヘキサペプチドのＣ末端カルボニルに結合することを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0050】
本発明は、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関し、化合物（Ｉ）又はそれらの薬学的に許容できる塩のＮ末端アミンが、好ましくは、Ｃ１～Ｃ６のアルキル基、Ｃ５～Ｃ８のアリール基、断片Ｒ１－ＣＯ－からなるリストから選択される非イオン性の基によりキャップされることを特徴とし、式中、Ｒ１は、
－水素原子、
－Ｃ１～Ｃ６のアルキル基、好ましくはメチル又は
－Ｃ５～Ｃ８のアリール基、好ましくはフェニルである。
－水素原子、
－Ｃ１～Ｃ６のアルキル基、好ましくはメチル又は
－Ｃ５～Ｃ８のアリール基、好ましくはフェニルである。
【0051】
本発明は、Ｃ末端カルボン酸が、ＣＯＲ２（式中、Ｒ２はＣ１～Ｃ６のアルキル基、Ｃ５～Ｃ８のアリール基、ＮＨ２基、Ｃ１～Ｃ６のアルコキシ基又はＣ５～Ｃ８のアリールオキシ基である）等の非イオン性基に置き換えられることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0052】
本発明は、好ましくはＸ２－Ｘ３－Ｘ４の位置に、配列ＹＶＶを含むことを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0053】
本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0054】
本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0055】
本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ２がチロシンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ２がフェニルアラニンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0056】
本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ３がバリンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0057】
本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ４がバリンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0058】
本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ６がトリプトファンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0059】
本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであり、Ｘ２がチロシンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであり、Ｘ２がフェニルアラニンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0060】
本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであり、Ｘ３がバリンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0061】
本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであり、Ｘ４がバリンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0062】
本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであり、Ｘ６がトリプトファンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0063】
本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであり、Ｘ２がチロシンであり、Ｘ３がバリンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであり、Ｘ２がフェニルアラニンであり、Ｘ３がバリンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0064】
本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであり、Ｘ２がチロシンであり、Ｘ４がバリンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであり、Ｘ２がフェニルアラニンであり、Ｘ４がバリンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0065】
本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであり、Ｘ２がチロシンであり、Ｘ６がトリプトファンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであり、Ｘ２がフェニルアラニンであり、Ｘ６がトリプトファンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0066】
本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであり、Ｘ２がチロシンであり、Ｘ３がバリンであり、Ｘ４がバリンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであり、Ｘ２がフェニルアラニンであり、Ｘ３がバリンであり、Ｘ４がバリンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0067】
本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであり、Ｘ２がチロシンであり、Ｘ３がバリンであり、Ｘ６がトリプトファンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであり、Ｘ２がフェニルアラニンであり、Ｘ３がバリンであり、Ｘ６がトリプトファンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0068】
本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであり、Ｘ２がチロシンであり、Ｘ３がバリンであり、Ｘ４がバリンであり、Ｘ６がトリプトファンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。本発明は、Ｘ５がリジン、ノルロイシン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｘ１がフェニルアラニンであり、Ｘ２がフェニルアラニンであり、Ｘ３がバリンであり、Ｘ４がバリンであり、Ｘ６がトリプトファンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0069】
本発明は、好ましくはＸ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５の位置に、配列ＹＶＶ－ノルロイシン（配列番号５）を含むことを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0070】
本発明は、Ｘ１、Ｘ２、及び／又はＸ６が、ｐ－フルオロ－フェニルアラニン、ｐ－アミノーフェニルアラニン又はｐ－ニトロ－フェニルアラニンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0071】
本発明は、Ｘ１が置換又は非置換のフェニルアラニンであり、Ｘ２が置換又は非置換のｐ－チロシンであり、Ｘ６が置換又は非置換のトリプトファンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0072】
本発明は、Ｘ１が置換又は非置換のフェニルアラニンであり、Ｘ２が置換又は非置換のフェニルアラニンであり、Ｘ６が置換又は非置換トリプトファンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0073】
本発明は、Ｘ１が置換又は非置換フェニルアラニンであり、Ｘ２が非置換のフェニルアラニンであり、Ｘ６が置換又は非置換のトリプトファンであることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0074】
本発明は、式（Ｉ）のヘキサペプチドが、２個の（Ｄ）－リジン等の、２個の（Ｄ）型のアミノ酸残基の間に構成されることを特徴とする、本明細書で開示される化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩に関する。
【0075】
本発明のペプチドの例を以下に挙げる。
【0076】
ＫＲＦＹＶＶＭＷＫＫ（４Ｎ１Ｋ、配列番号１、下の化学構造を参照）
（Ｄ）Ｋ－Ｒ－Ｆ－Ｙ－Ｖ－Ｖ－Ｍ－Ｗ－Ｋ－（Ｄ）Ｋ（ＰＫＨＢ１、配列番号２、下の化学構造を参照）
Ｈ－（Ｄ）ＫΨ（ＣＯＮＭｅ）ＲＦＹＶＶＸＷＫ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（ＰＫＴ１６、配列番号１７、下の化学構造を参照）
（Ｄ）Ｋ－Ｒ－Ｆ－Ｙ－Ｖ－Ｖ－Ｍ－Ｗ－Ｋ－（Ｄ）Ｋ（ＰＫＨＢ１、配列番号２、下の化学構造を参照）
Ｈ－（Ｄ）ＫΨ（ＣＯＮＭｅ）ＲＦＹＶＶＸＷＫ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（ＰＫＴ１６、配列番号１７、下の化学構造を参照）
【0077】
【化1】
【0078】
化合物又はそれらの薬学的に許容できる塩の別の例は、以下の通りである。
【0079】
Ａｃ－ＲＦＹＶＶＭＷＫ－ＮＨ２（配列番号３）
Ａｃ－ＫＲＦＹＶＶＭＷＫＫ－ＮＨ２（配列番号４）
Ｈ－（Ｄ）ＫＡＦＹＶＶＭＷＫ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号５）
Ｈ－（Ｄ）ＫＲＦＹＶＶ（Ｎｌｅ）ＷＫ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号６）
Ｈ－ＦＹＶＶＸＷ－ＯＨ（配列番号７）
Ｈ－ＦＹＶＶＸＷ－ＮＨ２（配列番号８）
Ａｃ－ＦＹＶＶＸＷ－ＯＨ（配列番号９）
Ａｃ－ＦＹＶＶＸＷ－ＮＨ２（配列番号１０）
Ｈ－（Ｄ）ＫＦＹＶＶＸＷ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号１１）
Ｈ－ＦＹＶＶＫＷ－ＯＨ（配列番号１２）
Ｈ－ＦＹＶＶＫＷ－ＮＨ２（配列番号１３）
Ｈ－（Ｄ）ＫΨ（ＣＯＮＭｅ）ＲＦＹＶＶＭＷＫ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号１４）
Ｈ－（Ｄ）ＫＲＦＹＶＶＭＷΨ（ＣＯＮＭｅ）Ｋ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号１５）
Ｈ－（Ｄ）ＫΨ（ＣＯＮＭｅ）ＲＦＹＶＶＭＷΨ（ＣＯＮＭｅ）Ｋ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号１６）
Ｈ－（Ｄ）ＫΨ（ＣＯＮＭｅ）ＲＦＹＶＶＬＷＫ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号１８）
Ｈ－（Ｄ）ＫΨ（ＣＯＮＭｅ）ＲＦＹＶＶＩＷＫ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号１９）
Ｈ－（Ｄ）ＫΨ（ＣＯＮＭｅ）ＲＦＦＶＶＸＷＫ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号２０）
Ａｃ－ＫＲＦＹＶＶＭＷＫＫ－ＮＨ２（配列番号４）
Ｈ－（Ｄ）ＫＡＦＹＶＶＭＷＫ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号５）
Ｈ－（Ｄ）ＫＲＦＹＶＶ（Ｎｌｅ）ＷＫ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号６）
Ｈ－ＦＹＶＶＸＷ－ＯＨ（配列番号７）
Ｈ－ＦＹＶＶＸＷ－ＮＨ２（配列番号８）
Ａｃ－ＦＹＶＶＸＷ－ＯＨ（配列番号９）
Ａｃ－ＦＹＶＶＸＷ－ＮＨ２（配列番号１０）
Ｈ－（Ｄ）ＫＦＹＶＶＸＷ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号１１）
Ｈ－ＦＹＶＶＫＷ－ＯＨ（配列番号１２）
Ｈ－ＦＹＶＶＫＷ－ＮＨ２（配列番号１３）
Ｈ－（Ｄ）ＫΨ（ＣＯＮＭｅ）ＲＦＹＶＶＭＷＫ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号１４）
Ｈ－（Ｄ）ＫＲＦＹＶＶＭＷΨ（ＣＯＮＭｅ）Ｋ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号１５）
Ｈ－（Ｄ）ＫΨ（ＣＯＮＭｅ）ＲＦＹＶＶＭＷΨ（ＣＯＮＭｅ）Ｋ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号１６）
Ｈ－（Ｄ）ＫΨ（ＣＯＮＭｅ）ＲＦＹＶＶＬＷＫ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号１８）
Ｈ－（Ｄ）ＫΨ（ＣＯＮＭｅ）ＲＦＹＶＶＩＷＫ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号１９）
Ｈ－（Ｄ）ＫΨ（ＣＯＮＭｅ）ＲＦＦＶＶＸＷＫ（Ｄ）Ｋ－ＯＨ（配列番号２０）
【0080】
上記ペプチドにおいて、
－構造の左側の「Ｈ」は水素原子を表し、
－用語「Ａｃ」は、ｎ末端アミンがアセチル化されていることを意味し、
－構造の右側の「ＯＨ」は、Ｃ末端ＣＯＯＨのＯＨを表し、
－「Ｘ」はノルロイシン残基を表し、
－構造の右側の「ＮＨ２」は、Ｃ末端ＣＯＯＨのＯＨがＮＨ２に置き換えられていることを意味し、
－（Ｄ）は、以下のアミノ酸残基が（Ｄ）型であることを意味し、用語「ｈＲ」及び「ｈＫ」は、それぞれホモ－アルギニン及びホモ－リジンを表し、
－「Ψ（ＣＯＮＭｅ）」は、この用語の両側の２個のアミノ酸残基を結合させる擬ペプチド結合を表し、
－Ｎｌｅはノルロイシン残基を表す。
－構造の左側の「Ｈ」は水素原子を表し、
－用語「Ａｃ」は、ｎ末端アミンがアセチル化されていることを意味し、
－構造の右側の「ＯＨ」は、Ｃ末端ＣＯＯＨのＯＨを表し、
－「Ｘ」はノルロイシン残基を表し、
－構造の右側の「ＮＨ２」は、Ｃ末端ＣＯＯＨのＯＨがＮＨ２に置き換えられていることを意味し、
－（Ｄ）は、以下のアミノ酸残基が（Ｄ）型であることを意味し、用語「ｈＲ」及び「ｈＫ」は、それぞれホモ－アルギニン及びホモ－リジンを表し、
－「Ψ（ＣＯＮＭｅ）」は、この用語の両側の２個のアミノ酸残基を結合させる擬ペプチド結合を表し、
－Ｎｌｅはノルロイシン残基を表す。
【0081】
別の実施形態によれば、本発明のＴＳＰ－１由来合成ペプチドは、国際特許出願第２０１７／１９４６３４号に記載されている、一般式（Ｖ）の単離環状ペプチド又はそれらの薬理学的に許容できる塩若しくは生物活性のある誘導体であり：
【化2】
【0082】
－Ｚ１は、存在しないか、ヘテロキラル配列Ｄ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏ（ｐ－Ｐとも示され、ｐはＤ－プロリンであり、ＰはＬ－プロリンである）又はヘテロキラル配列若しくはβターンを模倣することができる２個のアミノ酸若しくはアミノ酸類似体の任意の配列であって、配列のアミノ酸又はアミノ酸類似体の例は、ニペコチン酸、イソニペコチン酸、ピペリジンカルボン酸、シラプロリン、チオプロリン及びそれらの任意の別の置換誘導体（フルオロ、メチル、ブロモ等）、擬プロリン、置換プロリン、Ｎ－メチルアミノ酸、シクロプロピルアミノ酸（Ｋａｒｏｙａｎ等、Ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ｓｙｓｔｅｍ、（２００４）及びＫａｒｏｙａｎ等、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ（２０１１）、１２（７）、１０３９－１０４２及びＬａｒｒｅｇｏｌａ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１１）、１７（９）、６３２－６４３を参照されたい）又はビアリールアミノ酸鋳型であり、好ましい実施形態では、Ｚ１はＤ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏであり；
【0083】
－Ｂ１は、（配列ＲＦＹＶＶＭＷＫの）ＴＳＰ－１のβストランド７番に由来するペプチド配列Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ１６を表し、式中、
Ｘ７は、存在しないか、セリンあるいはグリシン又はアラニン又はトレオニン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ８は、存在しないか、アルギニンあるいはホモアルギニン、リジン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン、ホモフェニルアラニン、又はオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の別の環置換類似体等の類似した特性を有する任意のアミノ酸を指し、例えば、アルギニンに関して、誘導体はグアニド基及び／又は１個以上のアミン基を含む任意の別の側鎖を含み、
Ｘ９は、フェニルアラニン、あるいはナフチルアラニン、ホモフェニルアラニン又はｐ－フルオロ－フェニルアラニン、オルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の別の環置換類似体（例えば、ｐ－アミノ－フェニルアラニン又はｐ－ニトロ－フェニルアラニン）等の類似の特性を有する任意のアミノ酸、及びチロシン又は芳香族側鎖を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ１０は、チロシン又は芳香族側鎖を有する任意のアミノ酸、フェニルアラニン又はナフチルアラニン、ホモフェニルアラニン若しくはオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の別の環置換類似体（例えば、ｐ－フルオロ－フェニルアラニン、ｐ－アミノ－フェニルアラニン又はｐ－ニトロ－フェニルアラニン）等の類似した特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ１１は、バリン又はロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン、メチオニンを含む類似する特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ１２は、バリン、又はロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン、メチオニン等の類似する特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ１３は、メチオニン若しくはリジン又はバリン、メチオニン、ノルロイシン、ロイシン若しくはイソロイシン若しくはｔｅｒｔ－ロイシン等の類似する特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ１４は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ナフチル－アラニン、ｐ－フルオロ－フェニルアラニン、ｐ－アミノーフェニルアラニン、ｐ－ニトローフェニルアラニン、Ｄ－プロリノートリプトファン又はＤ－プロリノ－ホモトリプトファンを指し、
Ｘ１５は、存在しないか、リジン、あるいはアルギニン、ホモアルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン又はホモフェニルアラニン又はオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の別の環置換換類似体又はヒスチジン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ１６は、存在しないか、グルタミン若しくはアラニン又はアスパラギン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸を指し、
好ましくは、Ｘ８が存在しない場合、Ｘ７は存在せず、及び／又はＸ１５が存在しない場合、Ｘ１６は存在せず、
好ましくは、Ｂ１は、少なくとも６個のアミノ酸－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｘ１４を含み、より好ましくは、Ｂ１は、少なくともペプチド断片－ＦＹＶＶＭＷ－を含み、
Ｘ７は、存在しないか、セリンあるいはグリシン又はアラニン又はトレオニン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ８は、存在しないか、アルギニンあるいはホモアルギニン、リジン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン、ホモフェニルアラニン、又はオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の別の環置換類似体等の類似した特性を有する任意のアミノ酸を指し、例えば、アルギニンに関して、誘導体はグアニド基及び／又は１個以上のアミン基を含む任意の別の側鎖を含み、
Ｘ９は、フェニルアラニン、あるいはナフチルアラニン、ホモフェニルアラニン又はｐ－フルオロ－フェニルアラニン、オルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の別の環置換類似体（例えば、ｐ－アミノ－フェニルアラニン又はｐ－ニトロ－フェニルアラニン）等の類似の特性を有する任意のアミノ酸、及びチロシン又は芳香族側鎖を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ１０は、チロシン又は芳香族側鎖を有する任意のアミノ酸、フェニルアラニン又はナフチルアラニン、ホモフェニルアラニン若しくはオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の別の環置換類似体（例えば、ｐ－フルオロ－フェニルアラニン、ｐ－アミノ－フェニルアラニン又はｐ－ニトロ－フェニルアラニン）等の類似した特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ１１は、バリン又はロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン、メチオニンを含む類似する特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ１２は、バリン、又はロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン、メチオニン等の類似する特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ１３は、メチオニン若しくはリジン又はバリン、メチオニン、ノルロイシン、ロイシン若しくはイソロイシン若しくはｔｅｒｔ－ロイシン等の類似する特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ１４は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ナフチル－アラニン、ｐ－フルオロ－フェニルアラニン、ｐ－アミノーフェニルアラニン、ｐ－ニトローフェニルアラニン、Ｄ－プロリノートリプトファン又はＤ－プロリノ－ホモトリプトファンを指し、
Ｘ１５は、存在しないか、リジン、あるいはアルギニン、ホモアルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン又はホモフェニルアラニン又はオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の別の環置換換類似体又はヒスチジン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ１６は、存在しないか、グルタミン若しくはアラニン又はアスパラギン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸を指し、
好ましくは、Ｘ８が存在しない場合、Ｘ７は存在せず、及び／又はＸ１５が存在しない場合、Ｘ１６は存在せず、
好ましくは、Ｂ１は、少なくとも６個のアミノ酸－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｘ１４を含み、より好ましくは、Ｂ１は、少なくともペプチド断片－ＦＹＶＶＭＷ－を含み、
【0084】
－Ｚ２は、存在しないか、ヘテロキラル配列Ｄ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏ（ｐ－Ｐとも示される）又はヘテロキラル配列若しくはβターンを模倣することができる２個のアミノ酸又はアミノ酸類似体の任意の配列であって、配列のアミノ酸又はアミノ酸類似体の例は、ニペコチン酸、イソニペコチン酸、ピペリジンカルボン酸、シラプロリン、チオプロリン及びそれらの任意の別の置換誘導体（フルオロ、メチル、ブロモ等）、擬プロリン、置換プロリン、Ｎ－メチルアミノ酸、シクロプロピルアミノ酸（Ｋａｒｏｙａｎ等、Ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ｓｙｓｔｅｍ、（２００４）及びＫａｒｏｙａｎ等、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ（２０１１）、１２（７）、１０３９－１０４２及びＬａｒｒｅｇｏｌａ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１１）、１７（９）、６３２－６４３）又はビアリールアミノ酸鋳型であり、好ましい実施形態では、Ｚ２はＤ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏであり、
【0085】
－ＢｎはＢ１又はＢ２を表し、
【0086】
Ｂ２は、存在しないか、（配列ＧＬＳＶＫＶＶＮＳの）ＴＳＰ－１のβストランド８番に由来する６～１０個のアミノ酸を含むペプチド配列であり、一実施形態では、Ｂ２は以下の配列－Ｘ２２－Ｘ１７－Ｘ１８－Ｘ２３－Ｘ２４－Ｘ１９－Ｘ２５－Ｘ２６－Ｘ２０－Ｘ２１－を含み、好ましくは、Ｂ２は、以下の配列－Ｘ２２－Ｘ１７－Ｘ１８－Ｓ－Ｖ－Ｘ１９－Ｖ－Ｖ－Ｘ２０－Ｘ２１－を含み、式中、
Ｘ１７は、存在しないか、グリシン若しくはアラニン又はセリン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１８は、イソロイシン若しくはロイシン若しくはアラニン又はｔｅｒｔ－ロイシン、バリン、メチオニン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１９は、リジン若しくはアラニン、又はアルギニン、ホモアルギニン、リジン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン若しくはホモフェニルアラニン若しくは任意の別の環置換類似体（オルト、メタ、パラ）等の類似した特性を有する任意のアミノ酸、ヒスチジン若しくはメチオニン、又はバリン、ロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２０は、存在しないか、アスパラギン若しくはアラニン、又はグルタミンを含む類似した特性を有する任意のアミノ酸、あるいはリジン又はアルギニン、ホモアルギニン、リジン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン若しくはホモフェニルアラニン若しくは任意の他の環置換類似体（オルト、メタ、パラ）等の類似した特性を有する任意のアミノ酸、ヒスチジンであり、
Ｘ２１は、存在しないか、セリン若しくはグリシン、又は類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２２は、存在しないか、セリン若しくはアラニン、又は類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２３は、セリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２４は、バリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２５は、バリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、また
Ｘ２６は、バリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、
好ましくは、Ｘ１７が存在しない場合、Ｘ２２は存在せず、及び／又はＸ２０が存在しない場合、Ｘ２１は存在せず、
好ましくは、Ｂ２は、少なくとも６個のアミノ酸－Ｘ１８－Ｓ－Ｖ－Ｘ１９－Ｖ－Ｖ－を含み、より好ましくは、Ｂ２は、少なくともペプチド断片－ＬＳＶＫＶＶ－を含み、
単離環状ペプチドは、８～２６個のアミノ酸、好ましくは１４～２２個のアミノ酸を含み、別の実施形態によれば、単離環状ペプチドは、１８個～２２個のアミノ酸を含む。
Ｘ１７は、存在しないか、グリシン若しくはアラニン又はセリン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１８は、イソロイシン若しくはロイシン若しくはアラニン又はｔｅｒｔ－ロイシン、バリン、メチオニン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１９は、リジン若しくはアラニン、又はアルギニン、ホモアルギニン、リジン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン若しくはホモフェニルアラニン若しくは任意の別の環置換類似体（オルト、メタ、パラ）等の類似した特性を有する任意のアミノ酸、ヒスチジン若しくはメチオニン、又はバリン、ロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２０は、存在しないか、アスパラギン若しくはアラニン、又はグルタミンを含む類似した特性を有する任意のアミノ酸、あるいはリジン又はアルギニン、ホモアルギニン、リジン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン若しくはホモフェニルアラニン若しくは任意の他の環置換類似体（オルト、メタ、パラ）等の類似した特性を有する任意のアミノ酸、ヒスチジンであり、
Ｘ２１は、存在しないか、セリン若しくはグリシン、又は類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２２は、存在しないか、セリン若しくはアラニン、又は類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２３は、セリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２４は、バリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２５は、バリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、また
Ｘ２６は、バリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン等の類似した特性を有する任意のアミノ酸であり、
好ましくは、Ｘ１７が存在しない場合、Ｘ２２は存在せず、及び／又はＸ２０が存在しない場合、Ｘ２１は存在せず、
好ましくは、Ｂ２は、少なくとも６個のアミノ酸－Ｘ１８－Ｓ－Ｖ－Ｘ１９－Ｖ－Ｖ－を含み、より好ましくは、Ｂ２は、少なくともペプチド断片－ＬＳＶＫＶＶ－を含み、
単離環状ペプチドは、８～２６個のアミノ酸、好ましくは１４～２２個のアミノ酸を含み、別の実施形態によれば、単離環状ペプチドは、１８個～２２個のアミノ酸を含む。
【0087】
本発明の一般式（Ｖ）の単離環状ペプチドは、ＴＳＰ－１のＣ－末端ドメインの、βシート７番の少なくとも一部又はβシート７番及び８番の少なくとも一部を含むが、ＴＳＰ－１のＣ－末端ドメインの全配列は含まない（Ｋｏｓｆｅｌｄ ＭＤ，Ｆｒａｚｉｅｒ ＷＡ（１９９３）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ｔｗｏ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＣＯＯＨ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｃｅｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ．Ｊ ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：８８０６－８８１４に記載）。これは、該ドメインが、本発明の環状ペプチドと同様の生物活性を有さないためである。
【0088】
明示的に言及する場合を除いて、すべてのアミノ酸は、（Ｄ）型又は（ｌ）型のどちらかであるかについては関係がない。
【0089】
したがって、本発明は、式Ｂ１－Ｂ２、Ｚ１－Ｂ１－Ｂ２、Ｂ１－Ｚ２－Ｂ１、Ｂ１－Ｂ１（各Ｂ１は同一又は異なる）及びＢ１－Ｚ２－Ｂ１（各Ｂ１は同一又は異なる）の環状ペプチドを含む。
【0090】
好ましくは、単離環状ペプチドは、偶数個のアミノ酸（すなわち、Ｂ１及びＢｎは同じ数のアミノ酸を有し、両方とも６、７、８、９又は１０個のアミノ酸の断片からなる。）を含み、単離環状ペプチドは、８～２６個のアミノ酸、好ましくは１２～２２個のアミノ酸を含み、より好ましくは、本発明の単離環状ペプチドは、１２、１４、１６、１８、２０又は２２個のアミノ酸からなる。
【0091】
好ましい実施形態では、Ｂ１及びＢ２は、以下に表すように、Ｂ１のＸ５がＢ２のＸ１６に面し、Ｂ１のＸ８がＢ２のＸ１５に面するように配置される。
【化3】
【0092】
特定の実施形態によれば、Ｚ１及びＺ２の両方は、存在しなくてもよく、Ｚ１が２個のアミノ酸からなる場合、Ｚ２は存在せず、Ｚ２が２個のアミノ酸からなる場合、Ｚ１は存在しない。
【0093】
環状ペプチドの合成は、国際特許出願第２０１７／１９４６３４号に記載されている。
【0094】
本発明の単離環状ペプチドの例は、表Ｉに記載の通りである。
【表1】
【0095】
また、本発明は、上に定義したペプチドの変異体の使用に関し、変異体は、欠失、挿入及び／又は置換等のアミノ酸変異を有するタンパク質を含む。
【0096】
「欠失」は、タンパク質中に１つ以上のアミノ酸が存在しないことを指す。
【0097】
「挿入」は、タンパク質中で１つ以上のアミノ酸が付加することを指す。
【0098】
「置換」は、タンパク質中で、別のアミノ酸残基によって１つ又は複数のアミノ酸が置き換えられることを指す。
【0099】
典型的には、所与のアミノ酸は、類似した特性（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香性等）を有するアミノ酸で置き換えられる。この所与のアミノ酸は、天然アミノ酸でも非天然アミノ酸でもよい。保存されていると示されているもの以外のアミノ酸は、タンパク質が異なっていてもよく、その結果、類似する機能を有する２個のタンパク質間における、タンパク質又はアミノ酸配列中の類似する割合は異なっていてよく、例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくクラスター法等の配列図に従って決定されるように、７０％～９９％であってよい。
【0100】
典型的には、本発明は、本明細書で上に記載した通り、１つ以上の残基が、機能的に類似する残基によって、保存的に置換され、ＴＳＰ－１由来合成ペプチドの機能的態様を示し、すなわち、所与のアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同じ方法で、依然としてＩＣＤを誘導することができる、上に定義したペプチドと実質的に同一であるペプチドを含む。
【0101】
保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン等の１個の非極性（疎水性）残基を別の非極性残基で置換すること、アルギニンとリジン間、グルタミンとアスパラギン間、グリシンとセリン間のように、１個の極性（親水性）残基を別の極性残基で置換すること、リジン、アルギニン又はヒスチジン等の１個の塩基性残基を別の塩基性残基で置換すること、又はアスパラギン酸、グルタミン酸等の１個の酸性残基を別の酸性残基で置換することが挙げられる。
【0102】
用語「保存的置換」は、非誘導体化残基の代わりに化学的誘導体化残基を使用することも含む。
【0103】
「化学的誘導体」は、官能側基の反応によって、化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する、対象ペプチドを指す。
【0104】
このような誘導体化分子の例には、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ－トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ－ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成する分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は誘導体化され、塩、メチル及びエチルエステル又は別の種類のエステル若しくはヒドラジドを形成することができる。遊離ヒドロキシル基は誘導体化され、Ｏ－アシル又はＯ－アルキルの誘導体を形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導体化され、Ｎ－ｉｍ－ベンジルヒスチジンを形成することができる。化学的誘導体は、２０種類の標準アミノ酸のうち、１つ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドも含む。例えば、プロリンは、４－ヒドロキシプロリンで置換されてもよく、リジンは、５－ヒドロキシリジンはで置換されてもよく、ヒスチジンは、３－メチルヒスチジンで置換されてもよく、セリンは、ホモセリンで置換されてもよく、リジンは、オルニチンで置換されてもよい。また、用語「保存的置換」という用語は、ペプチド又はタンパク質の二次構造を制御及び安定化することを目的とした非天然アミノ酸の使用を含む。これらの非天然アミノ酸は、本明細書で以下に記載されるように、プロリノアミノ酸、βアミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸、シクロプロピルアミノ酸、α，α－置換アミノ酸等の化学修飾したアミノ酸である。また、これらの非天然アミノ酸には、フッ素化、塩素化、臭素化又はヨウ素化によって修飾したアミノ酸を含んでよい。
【0105】
好ましくは、ＴＳＰ－１由来合成ペプチドは、ＰＫＨＢ１（配列番号２）、ＰＫＴ１６（配列番号１７）、ＰＫＤ１０（配列番号２１）、ＰＫＴＤ１０（配列番号２５）、ＰＫＴＤｉ２－ＦＦ（配列番号３４）及びＰＫＴＤ１０－Ｘ－ＲＮＭｅ（配列番号２７）の中から選択される。
【0106】
好ましくは、ＴＳＰ－１由来合成ペプチドは、ＰＫＨＢ１（配列番号２）、ＰＫＴ１６（配列番号１７）及びＰＫＤ１０（配列番号２１）の中から選択される。
【0107】
ＴＳＰ－１由来合成ペプチドは、任意の癌又は新生物、例えば、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、多発性骨髄腫、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭及び下咽頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔及び中咽頭癌、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌、黒色腫及び転移性黒色腫、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、腟癌、外陰癌、並びに子宮癌、好ましくは慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病等の白血病からなる群から選択される癌を治療するために、免疫原性癌細胞死を誘導するために使用される。
【0108】
別の実施形態によれば、本発明は、腫瘍細胞において免疫原性細胞死を誘導するためのＴＳＰ－１由来合成ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ使用に関する。
【0109】
本発明で言及される腫瘍細胞は、癌、特に上に記載した癌の少なくとも１つに罹患している対象の腫瘍から得られる細胞である。対象の腫瘍から得られた細胞を同定するために使用される用語「腫瘍細胞」は、本明細書では、循環している腫瘍細胞（例えば、白血病の場合）、腫瘍床から得た細胞、又は転移部から得た細胞を同定するためにも使用されることを理解されたい。
【0110】
また、本発明は、癌の治療のための免疫原性細胞死を誘導するために使用する、「免疫活性のために使用されるワクチン」とも示される、ＴＳＰ－１由来合成ペプチドで処理される腫瘍細胞に関する。
【0111】
免疫活性のために使用されるワクチンは、腫瘍細胞を培養し、次いで得られた腫瘍細胞の培養物をＴＳＰ－１由来合成ペプチドで処理することによって得られる。
【0112】
このような処理の例は、実験部分に記載する。
【0113】
好ましくは、「ＴＳＰ－１由来合成ペプチドで処理された腫瘍細胞」は、死腫瘍細胞からなり、特に、死腫瘍細胞は、ＴＳＰ－１由来合成ペプチドで処理した腫瘍細胞の溶解物であり、このような溶解物の調製は当業者に周知である。
【0114】
また、本発明は、本発明に従って使用可能な腫瘍細胞を調製するためのＴＳＰ－１由来合成ペプチドの使用、及び細胞をＴＳＰ－１由来合成ペプチドで処理する工程を含む、そのような腫瘍細胞、好ましくは死細胞、より好ましくは死細胞溶解物を調製する方法に関する。
【0115】
さらに、本発明は、ＴＳＰ－１由来合成ペプチド及び薬学的に許容できる担体で処理された、腫瘍細胞、好ましくは死腫瘍細胞、より好ましくは腫瘍細胞溶解物を含む、好ましくは注射可能な医薬組成物に関する。
【0116】
特定の実施形態では、注射される医薬製剤は、腫瘍（個体又は液体）をＴＳＰ－１由来合成ペプチドで処理することによって得られ、液体腫瘍（白血病）の患者から血液試料を採取した後、又は手術後に固形腫瘍を採取した後、少なくとも１０６個の細胞を得て、培養し、ＴＳＰ－１由来合成ペプチドで腫瘍を処理した後、次いで、細胞を死滅させ、好ましくは溶解させた後、医薬製剤を調製する。医薬製剤の投与（注射）は、液体腫瘍、及び手術後の固形腫瘍に対する、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、特異的キナーゼ阻害剤に基づく療法、抗血管新生剤に基づく療法、抗体に基づく療法、特にモノクローナル抗体に基づく療法から選択される「従来の癌治療」の前、同時に及び／又は後に行うことができる。
【0117】
本発明の目的に対して適切な薬学的に許容できる担体には、これだけに限定されないが、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（ラクトース、アミロース、デンプン等）、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース及びポリビニルピロリドン、脂質、例えばそれだけに限定されないが、リン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロール脂肪酸エステルが挙げられる。
【0118】
本発明の医薬組成物は滅菌することができ、所望される場合、活性化合物に悪影響を及ぼさない補助剤、例えば潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、緩衝剤、着色剤、香味料及び／又は芳香剤等と混合することができる。本発明の医薬組成物は、所望される場合、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含むことができる。
【0119】
本発明の医薬組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョンとすることができる。いくつかの適切で厳密な製剤については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、１９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９５、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。
【0120】
本発明の医薬組成物は、個体への静脈内投与に適した組成物としての慣習的手順に従って調製することができる。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌の水性等張緩衝剤又は無菌の乾燥凍結剤中の溶液であり、注射前に再構成され、そのような注射は静脈内、筋肉内、皮下、鞘内注射とし、該医薬組成物は、鼻腔及び／又は肺送達を通して吸入することもできる。好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、注射によって、例えば腫瘍内注射によって投与するための液体組成物である。腫瘍内注射は、例えば、定位脳手術を使用することによって行うことができる。この投与は、腫瘍を除去するための外科手術の前又は後に行うことができる。第１の例では、該組成物は、腫瘍の成長を阻害し、腫瘍細胞の播種及び対象に対する劇的な症状の発生を回避することを可能にし、第２の例では、該組成物は、外科手術中に除去されなかったすべての腫瘍細胞を破壊するために使用することができる。
【0121】
ＴＳＰ－１由来合成ペプチド又は「ＴＳＰ－１由来合成ペプチドで処理された腫瘍細胞」の有効用量は、例えば、選択された投与方法、治療される個体の体重、年齢、性別、及び感受性等の多くの要因を関数として変化する。その結果、最適な用量は、関連する要因に応じて、医療専門家によって個別に決定されなければならない。ヒトにおいて予想される活性用量を予測するために、初めての動物実験を以下に示し、またＲｏｃｃｈｅｔｔｉ等（２００７）によって記載されるｆｃ２及びＣＴ値も使用することができる。
【0122】
別の実施形態によれば、本発明は、ＴＳＰ－１由来合成ペプチド及び／又は腫瘍細胞、好ましくは死腫瘍細胞、より好ましくは腫瘍細胞溶解物を、それを必要とする個体に、ＩＣＤを誘導するのに十分な量で患者に投与する工程を含み、該腫瘍細胞が、患者にＩＣＤを誘導するのに十分な量のＴＳＰ－１由来合成ペプチドで処理される方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0123】
【図1】ｐｄｂ１ｕｘ６からのＴＳＰ－１のＣＴＤを表す図である。Ａ．Ｔ３５－７－ＣＴＤ Ｃ９７４Ｓ／Ｎ１０４９Ｋ二重変異体が、５ｍＭのカルシウム（分解能１．９Å）の存在下での、Ａｌａ８１３から、１５本のβストランドで構成されるＰｒｏ１１５１への結晶化を表す図である。Ｂ．レクチン様βサンドイッチからの１０本のβストランドを表す図である。βストランド７及び８は、それぞれオレンジ色（ストランド７、ＲＦＹＶＶＭＷＫ）及び青色（ストランド８、ＧＬＳＫＶＶＫ）で着色されており、ストランドの結合によって形成された逆平行βシートを強調している［７、８］。
【図2】ＰＫＨＢ１は、Ｔ－ＡＬＬ白血病細胞株において細胞死を誘導する。アネキシンＶ－ＡＰＣ及びＰＩ染色によって細胞死を測定し、処理なし（対照）並びに１００、２００及び３００μＭのＰＫＨＢ１で２時間処理した、Ａ．ＣＥＭ、Ｂ．ＭＯＬＴ－４ヒト白血病細胞、及びＣ．Ｌ５１７８Ｙマウス細胞株をグラフ化した。
【図3】ＰＫＨＢ１は、白血病細胞株において、カスパーゼ非依存性、カルシウム依存性の細胞死及びミトコンドリア膜の消失を誘導する。Ａ．処理なし（対照）あるいは実験を行ったそれぞれの細胞株において、ＰＫＨＢ１（２００μＭ、２時間）で処理した後に、放置したもの（－）又はＱＶＤ若しくはＣＡ２＋キレート剤ＢＡＰＴＡで３０分、予備培養したものを表すグラフである。Ｂ．ＰＫＨＢ１（２００μｍ、２時間）によって誘導されたＵΨｍの消失が、Ｔ－ＡＬＬ細胞において測定された。細胞蛍光測定法によるプロット図を示す。
【図4】ＰＫＨＢ１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでマウス及びヒトの非癌性初代白血球を残す。Ａ．ＰＫＨＢ１で処理したＰＢＭＣｓの細胞死を、アネキシン－Ｖ／ＰＩ染色によって測定した（ｎ＝１０のドナー）。Ｂ．未処理又はＰＫＨＢ１で処理した各ドナーのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合。Ｃ．細胞死をアネキシンＶ－ＡＰＣによって測定し、グラフ化した。Ｄ．ＰＫＨＢ１で処理したマウスＰＢＭＣｓの細胞死を、Ａｎｎ／ＰＩ染色によって測定した（ｎ＝１０）。Ｅ．ＭＴＴアッセイによって測定した健康なマウスの骨髄、脾臓、胸腺及びリンパ節の細胞生存率。ｎ＝９匹のマウス
【図5】Ｌ５１７８Ｙ－Ｒ担癌マウスに対するＰＫＨＢ１処理によって、腫瘍部位への白血球浸潤が誘導され、白血球細胞の数が向上された。Ａ．Ｈ＆Ｅで染色した、対照マウス及びＰＫＨＢ１処理マウス（１８日目）の腫瘍の組織構造である。有糸分裂細胞（赤色矢印）、リンパ球（青色矢印）、好酸球（黄色矢印）、巨細胞（黒色矢印）、壊死（褐色矢印）及び正常組織（緑色矢印）である。Ｂ．免疫組織化学染色のために、対照マウス及びＰＫＨＢ１処理マウスの腫瘍組織において、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞を標識した。矢印は、陽性標識を有する細胞を指す。Ｃ．未処理の腫瘍を有するマウス（対照）、ＰＫＨＢ１で処理した腫瘍を有するマウス又は腫瘍もなく処理もされていないマウス（健康）のリンパ系器官の細胞数を、トリパンブルー染色を使用して測定した（ｎ＝６）。Ｄ．血液生体測定分析を使用して得た、対照マウス、ＰＫＨＢ１処理マウス及び健康なマウスの様々種類の白血球をグラフに示す。
【図6】ＰＫＨＢ１はカルレティキュリン曝露を誘導する。Ａ．左の図は、ＦＡＣＳを使用した、ＣＥＭ細胞（上）、ＭＯＬＴ－４細胞（中）及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞（下）における表面ＣＲＴ検出を示す図である。ＩｇＧアイソタイプ抗体を含む陰性対照を、点線（ＩｇＧ－Ｃ）及び実線（ＩｇＧ－ＰＫ）で示し、灰色（対照）は基礎量のＣＲＴであり、黒色は処理細胞（ＰＫＨＢ１）である。Ｂ．ＰＫＨＢ１で処理された細胞において、ＣＲＴ－ＰＥ染色によって、ＥＣＴＯ－ＣＲＴが認められ、核がＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色され、共焦点顕微鏡法で、４０倍で可視化された。
【図7】ＰＫＨＢ１による処理に応答した、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＣＲＴ及びＨＭＧＢ１タンパク質の発現及び放出。未処理及びＰＫＨＢ１で処理した、ＣＥＭ、ＭＯＬＴ－４及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞の細胞溶解物（Ａ）又は上清（Ｂ）を使用して、ウエスタンブロッティング及びデンシトメトリー分析を行った。ローディング・コントロールは、β－アクチン及びポンソーレッドであった。
【図8】ＰＫＨＢ１は、ＣＥＭ、ＭＯＬＴ－４及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞株において、ＨＭＧＢ１及びＡＴＰの放出を誘導する。ＣＣ５０及びＣＣ１００で、ＰＫＨＢ１で２時間，細胞を処理し、次いで、各試料の上清１００μＬを採取して、ＥＬＩＳＡ（Ａ）によってＨＭＧＢ１放出又は生物発光検出によってＡＴＰ放出（Ｂ）を測定した。示されている図は、３回の同様の実験を表すグラフである。
【図9】ＰＫＨＢ１は、予防的ワクチン接種又は腫瘍への事前曝露及び処理を通じて、短期間及び長期間の免疫記憶を誘導する。Ａ．ワクチン未接種マウス（対照；ｎ＝６）又はｈ１．５×１０６（１．５Ｍ；ｎ＝４）、３×１０６（３Ｍ；ｎ＝８）若しくは５×１０６（５Ｍ；ｎ＝６）のＣＣ１００ＰＫＨＢ１で処理したＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞のワクチンを接種し、Ｌ５１７８Ｙ－Ｒ生細胞を再注入したマウスにおける腫瘍成長を示すグラフである。Ｂ．ワクチン接種したマウスにおける、経時的生存率。Ｃ．２００万個のＬ５１７８ＹＲ細胞を再注入した寛解状態のマウスの長期間抗腫瘍記憶（対照ｎ＝６、ＰＫＨＢ１処理ｎ＝６）。Ｄ．再注入されたマウスにおける経時的生存率。生存率はカプラン・マイヤー法によるグラフで表す。
【図10】ＣＤ４７媒介ＩＣＤを表す概略図である。ＰＫＨＢ１は、Ｔ－ＡＬＬ細胞において迅速な免疫原性細胞死を誘導して、ＤＡＭＰ放出をもたらす。ＰＫＨＢ１で事前に処理した腫瘍細胞である予防的抗腫瘍ワクチンの投与は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍確立を妨げた。
【図11】異なるＣＤ４７作動薬ペプチドによる２時間の処理後に、ＭＥＣ－１（Ａ）及びＪｕｒｋａｔ（Ｂ）白血病細胞で観察されたカルレティキュリン曝露を表すヒストグラムである。ＩｇＧアイソタイプ抗体を有する陰性対照は点線で示されており、未処理又はペプチドで処理した細胞のＣＲＴは灰色で示される。
【図12】異なるＣＤ４７作動薬ペプチドで２時間処理した後の、ＭＥＣ－１及びＪＵＲＫＡＴ白血病細胞で観察されたカルレティキュリン曝露を表すヒストグラムである。グラフは、２回の独立した実験の平均値（±ＳＤ）を表す。
【図13】異なるＣＤ４７作動薬ペプチドによる処理の２時間後に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（Ａ）、ＭＣＦ－７（Ｂ）、ＰＡＮＣ－１（Ｃ）及びＨＣＴ－１１６の細胞で観察されたカルレティキュリン曝露を表すヒストグラムである。ＩｇＧアイソタイプ抗体を有する陰性対照は点線で示されており、未処理又はペプチドで処理した細胞のＣＲＴは灰色で示される。
【図14】処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７の細胞におけるＨＭＧＢ１放出を示す。
【図15】処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７の細胞におけるＨＭＧＢ１放出を示す。
【図16】処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１の細胞におけるＡＴＰ放出を示す。
【図17】処理されたＭＣＦ－７の細胞におけるＡＴＰ放出を示す。
【図18】処理されたＰＡＮＣ－１の細胞におけるＡＴＰ放出を示す。
【図19】処理されたＨＣＴ１１６の細胞におけるＡＴＰ放出を示す。
【図20】ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＣＤ４７媒介免疫原性細胞死を表す概略図である。ＫＢＴＸ－１は、Ｌ５１７８Ｙ－Ｒ細胞株において選択的ＩＣＤを誘導し、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）放出をもたらす。ＤＡＭＰｓは、樹状細胞（ＤＣ）成熟及び抗原の部分配列の提示及びＴ細胞活性化を促進して、癌細胞死を誘導する。さらに、治療ワクチンとして投与されたＫＢＴＸ－１処理細胞は、Ｌ５１７８Ｙ－Ｒ腫瘍担持同系マウスにおいて腫瘍退縮を誘導する。ＣＲＴ、カルレティキュリン、ＨＭＧＢ１、高移動群ボックス１、ＨＳＰ、熱ショックタンパク質、ＩＣＤ、免疫原性細胞死、ＴＳＰ－１、トロンボスポンジン－１。
【図21】ＫＢＴＸ－１は、ＣＥＭ及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞株において細胞死を誘導する。アネキシン－Ｖ－アロフィコシアニン（アネキシン－Ｖ－ＡＰＣ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって細胞死を測定し、グラフに表した。グラフは、３回の独立した実験の平均（±ＳＤ）を表す。ＫＢＴＸ１によって誘導された細胞死を、前処理なしで放置した細胞（対照）又はＢＡＰＴＡ、Ｑ－ＶＤ－ｏＰｈ（ＱＶＤ）で前処理（３０分間）した細胞と同様に評価し、カスパーゼ非依存性細胞死及びカルシウム依存性細胞死を強調した。
【図22】ＫＢＴＸ－１は、カルレティキュリン曝露を誘導する。Ａ．グラフ（左側）は、ＦＡＣＳを使用した、ＣＥＭ（上）及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞（下）における表面ＣＲＴ検出を表す。ＩｇＧアイソタイプ抗体を含む陰性対照を、点線（ＩｇＧ－Ｃ）及び実線（ＩｇＧ－ＫＢ）で示し、灰色（対照）は基礎量のＣＲＴであり、黒色は処理された細胞（ＫＢＴＸ－１）である。Ｂ．ＣＲＴ－ＰＥ染色によって、ＫＢＴＸ－１で処理した細胞においてＥＣＴＯ－ＣＲＴが観察された。
【図23】ＫＢＴＸ１は、ＣＥＭ及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞株において、ＨＭＧＢ１及びＡＴＰの放出を誘導する。ＣＣ１００のＫＢＴＸ－１で２時間，細胞を処理し、次いで、各試料の上清１００μＬを採取して、以下を測定した。Ａ及びＢは、ＣＥＭ及びＬ５１７８Ｙ－Ｒに対する生物発光検出によってＡＴＰ放出を測定した。Ｃ及びＤは、ＥＬＩＳＡアッセイによって、ＨＭＧＢ１放出を測定した。示されるグラフによって、３回実施された３つの同様の実験を表す。
【図24】ＫＢＴＸ－１－ＴＣＬ治療ワクチン接種は、長期間の抗腫瘍記憶を誘導する。治療ワクチン接種後に寛解状態にあるマウスに、２×１０６個のＬ５１７８Ｙ－Ｒ生細胞を再注入した。グラフは、ＫＢＴＸ－１－ＴＣＬで事前に処理した後寛解したマウスへの、Ｌ５１７８Ｙ－Ｒ生細胞（ＫＢＴＸ－１－ＴＣＬ－Ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅ）を再注入したマウスを示す。治療的ワクチン接種は、以下のように長期間の抗腫瘍記憶に対する評価の前に行った。Ｌ５１７８Ｙ－Ｒ細胞を移植し、腫瘍が１００ｍｍ３に達したときにＫＢＴＸ－１－ＴＣＬ（５×１０６個のＣＣ１００のＫＢＴＸ－１で処理したＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞）で処理を開始し、次いで、ＫＢＴＸ－１－ＴＣＬを３日に１回、２週間（合計４回の注射）投与した。
【実施例】
【0124】
実施例１
Ｉ．材料及び方法
血液及びＰＢＭＣｓの単離
書面によるインフォームドコンセントを得た後、１０名の健康な志願者から末梢血を採取した。この研究は、ヌエボ・レオン自治大学生物科学部（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ Ａｕｔｏｎｏｍａ ｄｅ Ｎｕｅｖｏ Ｌｅｏｎ、Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の倫理委員会によって承認された。動物実験は、動物倫理委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ：ＣＥＩＢＡ）、第０１／２０１５号によって承認された。すべての実験は、メキシコの規定、ＮＯＭ－０６２－ＺＯＯ－１９９９に従って実施した。
Ｉ．材料及び方法
血液及びＰＢＭＣｓの単離
書面によるインフォームドコンセントを得た後、１０名の健康な志願者から末梢血を採取した。この研究は、ヌエボ・レオン自治大学生物科学部（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ Ａｕｔｏｎｏｍａ ｄｅ Ｎｕｅｖｏ Ｌｅｏｎ、Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の倫理委員会によって承認された。動物実験は、動物倫理委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ：ＣＥＩＢＡ）、第０１／２０１５号によって承認された。すべての実験は、メキシコの規定、ＮＯＭ－０６２－ＺＯＯ－１９９９に従って実施した。
【0125】
屠殺したマウスの血液を心穿刺によって採取し、ヒトの血液は静脈穿刺によって採取した。末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣｓ）の単離を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ－１１１９（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、ＵＳＡ）を使用した密度勾配遠心分離によって行った。４×１０５個の白血球細胞を洗浄し、播種した。一次抗体（ＣＤ４、ＭＴ３１０ ｓｃ－１９６４１及びＣＤ８、３２－Ｍ４－ｓｃ－１１７７、サンタクルズ、カルフォルニア州、米国）を使用して、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋の分類を行った。
【0126】
脾臓、胸腺、リンパ節、及び骨髄の細胞の抽出
屠殺後の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓、胸腺、リンパ節、及び骨髄の細胞を得た。灌流によって脾臓細胞を得て、浸軟によって胸腺細胞及びリンパ節細胞を得て、骨髄細胞（マウス１匹あたり１つの大腿骨及び脛骨から）をＰＢＳで洗い流した。細胞を洗浄し、トリパンブルー染色を使用して計数した。
屠殺後の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓、胸腺、リンパ節、及び骨髄の細胞を得た。灌流によって脾臓細胞を得て、浸軟によって胸腺細胞及びリンパ節細胞を得て、骨髄細胞（マウス１匹あたり１つの大腿骨及び脛骨から）をＰＢＳで洗い流した。細胞を洗浄し、トリパンブルー染色を使用して計数した。
【0127】
細胞培養
ＣＥＭ、ＭＯＬＴ－４（Ｔ－急性リンパ芽球性白血病、Ｔ－ＡＬＬ）、及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ（マウスリンパ芽球性Ｔ細胞株）を、ＡＴＣＣから得た。ヒト及びマウスのＰＢＭＣｓ、ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、並びに一次リンパ器官の細胞を、健康な個体から得た。細胞を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地で維持し、３７℃、ＣＯ２が５％である制御された加湿状態で培養した。細胞数の測定は、ＡＴＣＣの標準プロトコルによって提案されているように、トリパンブルー（０．４％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ノイバウアーチャンバ及び光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ｐｒｉｍｏ Ｓｔａｒ）を使用して行った。
ＣＥＭ、ＭＯＬＴ－４（Ｔ－急性リンパ芽球性白血病、Ｔ－ＡＬＬ）、及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ（マウスリンパ芽球性Ｔ細胞株）を、ＡＴＣＣから得た。ヒト及びマウスのＰＢＭＣｓ、ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、並びに一次リンパ器官の細胞を、健康な個体から得た。細胞を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地で維持し、３７℃、ＣＯ２が５％である制御された加湿状態で培養した。細胞数の測定は、ＡＴＣＣの標準プロトコルによって提案されているように、トリパンブルー（０．４％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ノイバウアーチャンバ及び光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ｐｒｉｍｏ Ｓｔａｒ）を使用して行った。
【0128】
フローサイトメトリー細胞死の誘導及び阻害
アネキシン－Ｖ－アロフィコシアニン（Ａｎｎ－Ｖ－ＡＰＣ０．１μｇ／ｍｌ、ＢＤＰｈａｒｉｎｇｅｎ、サンジョーズ、カルフォルニア州、米国）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、０．５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ、２０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、それぞれ、ＢＤ ＡｃｃｕｒｙＣ６フローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）における、ホスファチジルセリン曝露、細胞生存率、及びミトコンドリア膜電位差（ＵΨｍ）の定量に使用した（合計１０，０００個の細胞）。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを分析した。
アネキシン－Ｖ－アロフィコシアニン（Ａｎｎ－Ｖ－ＡＰＣ０．１μｇ／ｍｌ、ＢＤＰｈａｒｉｎｇｅｎ、サンジョーズ、カルフォルニア州、米国）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、０．５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ、２０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、それぞれ、ＢＤ ＡｃｃｕｒｙＣ６フローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）における、ホスファチジルセリン曝露、細胞生存率、及びミトコンドリア膜電位差（ＵΨｍ）の定量に使用した（合計１０，０００個の細胞）。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを分析した。
【0129】
１×１０６細胞／ｍＬをＰＫＨＢ１で（示されるように）２時間処理した。阻害アッセイのために、カルシウムキレート剤、ＢＡＰＴＡ（５ｍＭ、ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）又はパンカスパーゼ阻害剤Ｑ－ＶＤ－ＯＰｈ（ＱＶＤ、１０μＭ、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、ミルピタス、カルフォルニア州、米国）をＰＫＨＢ１の３０分前に添加した。
【0130】
全血球計算（ＣＢＣ）
マウスから得たヘパリン処理血液を、自動血液分析装置ＫｏｎｔｒｏＬａｂを使用して評価した。塗抹を行い、メタノールで固定し、ライトで染色し、顕微鏡で観察して、白血球細胞分画を行った。
マウスから得たヘパリン処理血液を、自動血液分析装置ＫｏｎｔｒｏＬａｂを使用して評価した。塗抹を行い、メタノールで固定し、ライトで染色し、顕微鏡で観察して、白血球細胞分画を行った。
【0131】
カルレティキュリン曝露
１×１０６細胞／ｍＬをプレートに載せ、ＰＫＨＢ１で処理し、２時間培養した。細胞を回収、洗浄、及びＦＡＣＳ緩衝液中のカルレティキュリン－ＰＥ（ＦＭＣ－７５、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ファーミングデール、ニューヨーク州、米国）抗体（１：１０００）で染色した。室温の暗所で１時間培養した後、細胞を洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、フローシトメトリーを評価した。共焦点顕微鏡観察（ＯｌｙｍｐｕｓＸ７０）のために、ポリ－リジンを滅菌カバーガラスに２４時間添加し、１×１０６細胞／ｍＬを播種した。ＰＫＨＢ１を添加し、２時間培養した。次いで、細胞をカルレティキュリン－ＰＥ抗体（１：５００）及びＨｏｅｃｈｓｔで染色し、１時間培養し、共焦点顕微鏡によって評価した。
１×１０６細胞／ｍＬをプレートに載せ、ＰＫＨＢ１で処理し、２時間培養した。細胞を回収、洗浄、及びＦＡＣＳ緩衝液中のカルレティキュリン－ＰＥ（ＦＭＣ－７５、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ファーミングデール、ニューヨーク州、米国）抗体（１：１０００）で染色した。室温の暗所で１時間培養した後、細胞を洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、フローシトメトリーを評価した。共焦点顕微鏡観察（ＯｌｙｍｐｕｓＸ７０）のために、ポリ－リジンを滅菌カバーガラスに２４時間添加し、１×１０６細胞／ｍＬを播種した。ＰＫＨＢ１を添加し、２時間培養した。次いで、細胞をカルレティキュリン－ＰＥ抗体（１：５００）及びＨｏｅｃｈｓｔで染色し、１時間培養し、共焦点顕微鏡によって評価した。
【0132】
ウエスタンブロッティング
１×１０６細胞／ｍＬを無血清培地に播種し、ＰＫＨＢ１（各細胞株に対してＣＣ５０及びＣＣ１００）で処理するか、又は２時間放置した（対照）。上清を回収し、溶解緩衝液（２０ｍＭのトリス ｐＨ６．８、２ｍＭのＥＤＴＡ、３００ｍＭのＮａＣｌ及びＳＤＳ２％）で溶解した。
１×１０６細胞／ｍＬを無血清培地に播種し、ＰＫＨＢ１（各細胞株に対してＣＣ５０及びＣＣ１００）で処理するか、又は２時間放置した（対照）。上清を回収し、溶解緩衝液（２０ｍＭのトリス ｐＨ６．８、２ｍＭのＥＤＴＡ、３００ｍＭのＮａＣｌ及びＳＤＳ２％）で溶解した。
【0133】
ＤＣタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を使用してタンパク質濃度を測定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに５０μｇのタンパク質をロードした。ブロッティング後、ＨＭＧＢ１（ＨＡＰ４６．５：ｓｃ－５６６９８）、ＨＳＰ７０（Ｃ９２Ｆ３Ａ－５：ｓｃ－６６０４８）、ＨＳＰ９０（Ｆ－８：ＳＣ－１３１１９）及びカルレティキュリン（Ｆ－４：ｓｃ３７３８６３）に対する一次抗体（１：１０００）をニトロセルロースフィルタにプローブした。抗マウス又は抗ラビット－ＨＲＰは、二次抗体として機能した（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州、米国）。ＥＣＬ基質法（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を用いて可視化を行った。
【0134】
ＡＴＰ放出アッセイ
１×１０６細胞／ｍＬを、ＰＫＨＢ１（各細胞株に対してＣＣ５０及びＣＣ１００）で２時間処理した。
１×１０６細胞／ｍＬを、ＰＫＨＢ１（各細胞株に対してＣＣ５０及びＣＣ１００）で２時間処理した。
【0135】
上清を使用して、製造業者の指示書に従って、ルシフェラーゼアッセイ（ＥＮＬＩＴＥＮキット、Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州、米国）によって、細胞外ＡＴＰを評価した。マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ、ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｇｅｎ５、ウィヌースキ、バーモント州、米国）において、５６０ｎｍで生物発光を評価した。
【0136】
ＨＭＧＢ１放出アッセイ
未処理及び処理した（各細胞株に対してＰＫＨＢ１ＣＣ５０及びＣＣ１００）白血病細胞（１×１０６細胞／ｍＬ）の上清を使用して、製造業者の指示書に従って、ＨＭＧＢ１ ＥＬＩＳＡキットを使用して、ＣＥＭ、ＭＯＬＴ－４又はＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞（（ヒト用、マウス用それぞれの）ＢｉｏＡｓｓａｙＥＬＩＳＡキット、ＵＳ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、セーレム、マサチューセッツ州、米国）の細胞外ＨＭＧＢ１を測定した。４５０ｎｍで吸光度を評価した。
未処理及び処理した（各細胞株に対してＰＫＨＢ１ＣＣ５０及びＣＣ１００）白血病細胞（１×１０６細胞／ｍＬ）の上清を使用して、製造業者の指示書に従って、ＨＭＧＢ１ ＥＬＩＳＡキットを使用して、ＣＥＭ、ＭＯＬＴ－４又はＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞（（ヒト用、マウス用それぞれの）ＢｉｏＡｓｓａｙＥＬＩＳＡキット、ＵＳ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、セーレム、マサチューセッツ州、米国）の細胞外ＨＭＧＢ１を測定した。４５０ｎｍで吸光度を評価した。
【0137】
ｉｎ ｖｉｖｏモデル
６～８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、制御された環境条件（２５℃及び１２時間の明／暗サイクル）で維持し、げっ歯類用の餌（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｄｉｅｔ）及び水を制約なしに与えた。
６～８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、制御された環境条件（２５℃及び１２時間の明／暗サイクル）で維持し、げっ歯類用の餌（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｄｉｅｔ）及び水を制約なしに与えた。
【0138】
－予防ワクチンＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞（１．５、３、５×１０６個）を３００μＭのＰＫＨＢ１（ＣＣ１００）で２時間処理した。トリパンブルー染色及びフローサイトメトリーを使用して細胞死を確認した。処理した細胞を、１００μｌのＰＢＳ中で左後脚に皮下接種し、７日後に、２×１０６個の未処理対照細胞を右後脚に接種した（４２）。
【0139】
－腫瘍の確立及び測定１００μＬのＰＢＳ中の１×１０６個のＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞を、左脚後部に皮下注射することによって、腫瘍を確立した。キャリパ（デジマチックキャリパ、ミツトヨ株式会社、日本）及びデジタル重量計（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｃａｌｅ－６００－ＢＬＫ、米国）を用いて、腫瘍の体積及び質量を週３回測定した。腫瘍が１００ｍｍ３に達したとき、最初のＰＫＨＢ１注射（２００μｇ）を注入した（０日目）。腫瘍の体積は、式、腫瘍体積（ｍｍ３）＝４π／３＊Ａ＊Ｂ＊Ｃを用いて決定した。
【0140】
長期間記憶アッセイＰＫＨＢ１処理後に完全に寛解したマウスに、１００μＬのＰＢＳ中の２×１０６個の細胞を、反対肢に再注入し、腫瘍体積を上記のように測定した。
【0141】
組織学及び免疫組織化学
組織及び器官を得て、１０％の中性ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋し、切片化（厚さ５μｍ）して、Ｈ＆Ｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）で染色した。
組織及び器官を得て、１０％の中性ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋し、切片化（厚さ５μｍ）して、Ｈ＆Ｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）で染色した。
【0142】
外部の獣医病理学者（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ２５９３０１２）が組織病理学的分析を行った。適切な一次抗体（ＣＤ４／ＣＤ８）を使用し、ビオチン化二次抗体を添加することによって、免疫組織化学を行った。最後に、マウント液として樹脂を使用して、ヘマトキシリンで対比染色したスライドをカバーガラスで覆い、顕微鏡で観察する。
【0143】
統計分析
すべてのｉｎ ｖｉｖｏ実験において、マウスを異なる群に無作為に割り当てた。独立した実験を３回繰り返した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（サンディエゴ、カルフォルニア州、米国）を使用してマン・ホイットニー検定及び両側・対応のないスチューデントＴ検定を行い、平均値をＳＤとして示した。ｐ値は、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１の通り有意とみなした。
すべてのｉｎ ｖｉｖｏ実験において、マウスを異なる群に無作為に割り当てた。独立した実験を３回繰り返した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（サンディエゴ、カルフォルニア州、米国）を使用してマン・ホイットニー検定及び両側・対応のないスチューデントＴ検定を行い、平均値をＳＤとして示した。ｐ値は、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１の通り有意とみなした。
【0144】
ＩＩ．結果
ＣＤ４７作動薬ペプチドＰＫＨＢ１は、ヒト及びマウスの腫瘍リンパ芽球性Ｔ細胞株において細胞死を誘導する。
しだいに増やしたＰＫＨＢ１濃度（１００，２００及び３００μＭ）で２時間接種された細胞は、Ａｎｎ－Ｖ－ＡＰＣ／ＰＩ陽性ＣＥＭ細胞（図２Ａ）、ＭＯＬＴ－４細胞（図２Ｂ）及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞（図２Ｃ）の数の増加を示すため、ＰＫＨＢ１は、濃度依存方式で細胞死を誘導する。約５０％の細胞死（ＣＣ５０）を誘導する細胞傷害性濃度は、ＣＥＭでは、２００μＭであり、ＭＯＬＴ－４では３００μＭであり、Ｌ５１７８Ｙ－Ｒでは２００μＭである。
ＣＤ４７作動薬ペプチドＰＫＨＢ１は、ヒト及びマウスの腫瘍リンパ芽球性Ｔ細胞株において細胞死を誘導する。
しだいに増やしたＰＫＨＢ１濃度（１００，２００及び３００μＭ）で２時間接種された細胞は、Ａｎｎ－Ｖ－ＡＰＣ／ＰＩ陽性ＣＥＭ細胞（図２Ａ）、ＭＯＬＴ－４細胞（図２Ｂ）及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞（図２Ｃ）の数の増加を示すため、ＰＫＨＢ１は、濃度依存方式で細胞死を誘導する。約５０％の細胞死（ＣＣ５０）を誘導する細胞傷害性濃度は、ＣＥＭでは、２００μＭであり、ＭＯＬＴ－４では３００μＭであり、Ｌ５１７８Ｙ－Ｒでは２００μＭである。
【0145】
ＰＫＨＢ１は、ＣＥＭ、ＭＯＬＴ－４及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞におけるミトコンドリア膜電位の消失を伴う、カスパーゼ非依存性、カルシウム依存性の細胞死を促進する。
次に、Ｔ－ＡＬＬ細胞におけるＰＫＨＢ１誘導細胞死が、カスパーゼ非依存性（４３）、持続的カルシウム流入及びミトコンドリア膜電位（ＵΨｍ）消失（３３、４４）を含む、ＣＤ４７媒介細胞死に関する、上に記載した主な生化学的特徴を共有するかについて評価した。したがって、ｐａｎ－カスパーゼ阻害剤（Ｑ－ＶＤーＯＰＨ）又は細胞外Ｃａ２＋キレート剤（ＢＡＰＴＡ）で予備培養し、細胞死を試験した。カスパーゼ阻害は、ＣＥＭ細胞（５１％±４～４８％±５）、ＭＯＬＴ－４細胞（５７％±４～５１％±６）及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞（５２％±５～４９％±３）におけるＰＫＨＢ１誘導殺傷を妨げなかった。しかし、細胞外カルシウムキレート化は、すべての場合においてＰＫＨＢ１誘導細胞死を有意に減少させた。ＣＥＭ（５１％±４～１８％±１１）、ＭＯＬＴ－４（５７％±４～３８％±３）及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ（５２％±５～２１％±８）（図３Ａ）であった。固定化した抗ＣＤ４７（Ｂ６Ｈ１２）によって誘導された細胞死に対するカルシウム依存性が、ＣＥＭ細胞（ＳＦ１）においても裏付けられた。
次に、Ｔ－ＡＬＬ細胞におけるＰＫＨＢ１誘導細胞死が、カスパーゼ非依存性（４３）、持続的カルシウム流入及びミトコンドリア膜電位（ＵΨｍ）消失（３３、４４）を含む、ＣＤ４７媒介細胞死に関する、上に記載した主な生化学的特徴を共有するかについて評価した。したがって、ｐａｎ－カスパーゼ阻害剤（Ｑ－ＶＤーＯＰＨ）又は細胞外Ｃａ２＋キレート剤（ＢＡＰＴＡ）で予備培養し、細胞死を試験した。カスパーゼ阻害は、ＣＥＭ細胞（５１％±４～４８％±５）、ＭＯＬＴ－４細胞（５７％±４～５１％±６）及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞（５２％±５～４９％±３）におけるＰＫＨＢ１誘導殺傷を妨げなかった。しかし、細胞外カルシウムキレート化は、すべての場合においてＰＫＨＢ１誘導細胞死を有意に減少させた。ＣＥＭ（５１％±４～１８％±１１）、ＭＯＬＴ－４（５７％±４～３８％±３）及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ（５２％±５～２１％±８）（図３Ａ）であった。固定化した抗ＣＤ４７（Ｂ６Ｈ１２）によって誘導された細胞死に対するカルシウム依存性が、ＣＥＭ細胞（ＳＦ１）においても裏付けられた。
【0146】
また、ＣＣ５０のＰＫＨＢ１による処理は、ＣＥＭで４９％±５、ＭＯＬＴ－４で６１％±４、Ｌ５１７８Ｙ－Ｒで５１％±８である、Ｔ－ＡＬＬにおけるＵΨｍの消失を誘導することを示した（図３Ｂ）。
【0147】
ＰＫＨＢ１処理は、ヒト及びマウスの非癌性初代白血球を残す。
健康なドナーのヒトＰＢＭＣｓ並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋ヒトＴ細胞における、ＰＫＨＢ１の選択性についてテストした（図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃをそれぞれ参照）。
健康なドナーのヒトＰＢＭＣｓ並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋ヒトＴ細胞における、ＰＫＨＢ１の選択性についてテストした（図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃをそれぞれ参照）。
【0148】
さらに、間接的な細胞生存率分析によって、マウスＰＢＭＣｓ（図４Ｄ）、並びに、健康な（腫瘍がなく処理されていない）ＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄（ＢＭ）、脾臓、胸腺及びリンパ節の初代培養物において、ＰＫＨＢ１の選択性をテストした（図４Ｅ）。すべての器官が新生物細胞（ＳＦ２）と同様のレベルのＣＤ４７を発現しても、ＰＫＨＢ１処理によって、ヒト及びマウスの非癌性細胞の細胞生存率に有意な影響を及ぼさなかった（図４）。これらの結果は、悪性細胞においてのみ細胞死を誘導するＰＫＨＢ１の選択性を示した。
【0149】
ＰＫＨＢ１で処理したＬ５１７８Ｙ－Ｒ腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスは、腫瘍部位への白血球浸潤及び白血球細胞数の改善を示す。
ＰＫＨＢ１処理がｉｎ ｖｉｔｒｏで健康な白血球に影響を及ぼさなかったことを確認した後、ｉｎ ｖｉｖｏにおける効果を評価した。雌の免疫正常ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用してＬ５１７８Ｙ－Ｒ腫瘍細胞を生成し、マウスに２００μｇのＰＫＨＢ１を毎週腹膜内に処理した。１８日後、すべての対照マウスを屠殺し、ＰＫＨＢ１処理マウスの一部を、比較のために、無作為に選択して、屠殺した。腫瘍を解剖し、それらの形態学的及び細胞的差異を分析した（図５Ａ）。対照群は、Ｌ５１７８Ｙ－Ｒ細胞とみられる未分化リンパ系細胞を提示し、それらの一部は有糸分裂を行っていた（図５Ａの左）。反対に、ＰＫＨＢ１処理マウスにおける腫瘍は、リンパ球と多形核細胞（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＭＮ）との混合物を含有していた（図５Ａの中央）。
ＰＫＨＢ１処理がｉｎ ｖｉｔｒｏで健康な白血球に影響を及ぼさなかったことを確認した後、ｉｎ ｖｉｖｏにおける効果を評価した。雌の免疫正常ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用してＬ５１７８Ｙ－Ｒ腫瘍細胞を生成し、マウスに２００μｇのＰＫＨＢ１を毎週腹膜内に処理した。１８日後、すべての対照マウスを屠殺し、ＰＫＨＢ１処理マウスの一部を、比較のために、無作為に選択して、屠殺した。腫瘍を解剖し、それらの形態学的及び細胞的差異を分析した（図５Ａ）。対照群は、Ｌ５１７８Ｙ－Ｒ細胞とみられる未分化リンパ系細胞を提示し、それらの一部は有糸分裂を行っていた（図５Ａの左）。反対に、ＰＫＨＢ１処理マウスにおける腫瘍は、リンパ球と多形核細胞（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＭＮ）との混合物を含有していた（図５Ａの中央）。
【0150】
さらに、３０日目に大部分のマウスにおいて完全な腫瘍退縮が観察され、組織スライドは、接種部位における抗腫瘍免疫応答であるとみられるものを示している（図５Ａの右）。したがって、腫瘍切片に対する免疫組織化学の実施が決定され、ＰＫＨＢ１処理マウスにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の存在を示した（図５Ｂ）。
【0151】
さらに、対照マウス、ＰＫＨＢ１処理マウス又は健康なマウスのリンパ系器官の細胞数の測定を行った。注目すべきことに、ＰＫＨＢ１処理マウスでは、ＢＭ、脾臓及び胸腺の細胞の数が有意に増加し、また、リンパ節の細胞数に有意な減少が観察された（図５Ｃ）。さらに、ＰＫＨＢ１処理マウスにおける同じ器官の細胞数は、健康なマウスのものと類似していた。さらに、ＷＢＣ分画を実施したところ、健康なマウスとＰＫＨＢ１処理マウスとの間に有意差は示されなかったが、非処理担癌マウスは、すべての白血球型において他の２つの群との間に有意差を示した（図５Ｄ）。結果として、上記により、ＰＫＨＢ１が腫瘍担持マウスの抗腫瘍免疫系を改善することが示唆され、完全な腫瘍退縮における免疫系の関与の可能性が示される。
【0152】
ＰＫＨＢ１処理は、Ｔ－ＡＬＬ細胞においてＤＡＭＰｓの曝露及び放出を誘導する。
Ｔ－ＡＬＬ細胞におけるいくつかのＤＡＭＰｓの曝露及び放出の評価を行った。図６では、フローシトメトリー（図６Ａ）及び共焦点顕微鏡による観察（図６Ｂ）で分析したところ、ＣＣ５０のＰＫＨＢ１で培養した、ＣＥＭ、ＭＯＬＴ－４及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞が、ＣＲＴ曝露において、有意な増加を示したことが観察できる。
Ｔ－ＡＬＬ細胞におけるいくつかのＤＡＭＰｓの曝露及び放出の評価を行った。図６では、フローシトメトリー（図６Ａ）及び共焦点顕微鏡による観察（図６Ｂ）で分析したところ、ＣＣ５０のＰＫＨＢ１で培養した、ＣＥＭ、ＭＯＬＴ－４及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞が、ＣＲＴ曝露において、有意な増加を示したことが観察できる。
【0153】
次いで、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＣＲＴ及びＨＭＧＢ１の発現及び放出を測定した。試験を行った各細胞株について、未処理の細胞並びにＣＣ５０及びＣＣ１００でＰＫＨＢ１処理した細胞の細胞溶解物及び上清中におけるウエスタンブロッティングによって、これらのＤＡＭＰｓの存在を決定した。図７Ａは、ＰＫＨＢ１で処理した細胞の細胞溶解物中の、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＣＲＴ及びＨＭＧＢ１の発現の低下を示す。反対に、これらのＤＡＭＰｓの発現は、未処理細胞と比較して、ＰＫＨＢ１処理上清において増加した（図７Ｂ）。このような結果は、ＰＫＨＢ１処理によって、熱ショックタンパク質、ＣＲＴ及びＨＭＧＢ１の細胞外培地への放出が促進されることを示している。
【0154】
ＨＭＧＢ１放出は，ウエスタンブロッティングによってはほとんど検出されなかったので、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。
【0155】
ＨＭＧＢ１の放出は、試験を行った細胞株及び使用したＰＫＨＢ１の濃度に応じて変動した。ＣＣ１００のＰＫＨＢ１を使用した場合、ＣＥＭ、ＭＯＬＴ－４及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞株において、未処理対照と比較したＨＭＧＢ１放出はそれぞれ６倍、４倍及び２倍であったが、ＣＣ５０のＰＫＨＢ１を使用した場合、ＭＯＬＴ－４細胞のＨＭＧＢ１放出は、対照と比較して８倍であった（図８Ａ）。
【0156】
免疫原性死が行われているという別の重要な指標は、ＡＴＰ放出である。
【0157】
したがって、生物発行アッセイを行ったところ、ＣＣ５０及びＣＣ１００のＰＫＨＢ１処理細胞の上清において、ＡＴＰの存在が有意に増大したことが見出された（図８Ｂ）。
【0158】
予防ワクチンとしてのＰＫＨＢ１処理細胞は、Ｌ５１７８Ｙ－Ｒ細胞の腫瘍確立を妨げた。
ＰＫＨＢ１処理がＩＣＤを誘導することを示す以前のデータを考慮すると、次の工程は、ＰＫＨＢ１処理がｉｎ ｖｉｖｏでＩＣＤを誘導するかどうかを確認するための判断基準である予防ワクチン接種を実施することであった。ワクチンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＣ１００のＰＫＨＢ１で処理したＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞の使用に基づく。使用したマウスの４つの群は、ｉ．ワクチンなしの対照群、ｉｉ．１．５×１０６個のＰＫＨＢ１処理細胞を有する１．５Ｍワクチン群、ｉｉｉ．３×１０６個のＰＫＨＢ１処理細胞を有する３Ｍワクチン群、ｉｖ．５×１０６個のＰＫＨＢ１処理細胞を有する５Ｍワクチン群である。結果は、ＰＫＨＢ１処理細胞を含有するワクチン接種が、Ｌ５１７８Ｙ－Ｒ腫瘍の確立を妨げ、ペプチドに起因するより多くの死細胞が、ワクチン投与の７日後に接種された腫瘍細胞に対して良好な応答を示したことを実証した（図９）。対照群では、６匹中６匹のマウス（１００％）が生細胞の接種後に腫瘍を発症し（図９Ａ、上段左）、１．５Ｍワクチン群では、４匹中３匹のマウス（７５％）が腫瘍を発症し（図７Ａ、上段右）、３Ｍワクチン群では、１４匹中７匹（５０％）が腫瘍を発症し（図７Ａ、下段左）、５Ｍワクチン群では、いずれのマウスも（０％）腫瘍を発症しなかった（図７Ａ、下段右）。各群のマウスの６０日間生存率は腫瘍成長と一貫しており、５Ｍワクチン群では１００％であった（図９Ｂ）。
ＰＫＨＢ１処理がＩＣＤを誘導することを示す以前のデータを考慮すると、次の工程は、ＰＫＨＢ１処理がｉｎ ｖｉｖｏでＩＣＤを誘導するかどうかを確認するための判断基準である予防ワクチン接種を実施することであった。ワクチンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＣ１００のＰＫＨＢ１で処理したＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞の使用に基づく。使用したマウスの４つの群は、ｉ．ワクチンなしの対照群、ｉｉ．１．５×１０６個のＰＫＨＢ１処理細胞を有する１．５Ｍワクチン群、ｉｉｉ．３×１０６個のＰＫＨＢ１処理細胞を有する３Ｍワクチン群、ｉｖ．５×１０６個のＰＫＨＢ１処理細胞を有する５Ｍワクチン群である。結果は、ＰＫＨＢ１処理細胞を含有するワクチン接種が、Ｌ５１７８Ｙ－Ｒ腫瘍の確立を妨げ、ペプチドに起因するより多くの死細胞が、ワクチン投与の７日後に接種された腫瘍細胞に対して良好な応答を示したことを実証した（図９）。対照群では、６匹中６匹のマウス（１００％）が生細胞の接種後に腫瘍を発症し（図９Ａ、上段左）、１．５Ｍワクチン群では、４匹中３匹のマウス（７５％）が腫瘍を発症し（図７Ａ、上段右）、３Ｍワクチン群では、１４匹中７匹（５０％）が腫瘍を発症し（図７Ａ、下段左）、５Ｍワクチン群では、いずれのマウスも（０％）腫瘍を発症しなかった（図７Ａ、下段右）。各群のマウスの６０日間生存率は腫瘍成長と一貫しており、５Ｍワクチン群では１００％であった（図９Ｂ）。
【0159】
ＰＫＨＢ１処理は腫瘍確立の長期間の予防を誘導した。
さらに、ＰＫＨＢ１処理後に完全な腫瘍退縮を示したマウスにおける長期間の腫瘍予防を評価した。これらの実験では、２×１０６個のＬ５１７８Ｙ－Ｒ生細胞を再注入された６匹のマウス中１匹（約１７％）が腫瘍を発症したが、ナイーブ対照群では、６匹中６匹（１００％）が腫瘍成長を示した（図９Ｃ）。カプラン・マイヤー曲線を用いて生存率をグラフ化したところ、再注入されたマウスは９０％の生存率を示した（図９Ｄ）。
さらに、ＰＫＨＢ１処理後に完全な腫瘍退縮を示したマウスにおける長期間の腫瘍予防を評価した。これらの実験では、２×１０６個のＬ５１７８Ｙ－Ｒ生細胞を再注入された６匹のマウス中１匹（約１７％）が腫瘍を発症したが、ナイーブ対照群では、６匹中６匹（１００％）が腫瘍成長を示した（図９Ｃ）。カプラン・マイヤー曲線を用いて生存率をグラフ化したところ、再注入されたマウスは９０％の生存率を示した（図９Ｄ）。
【0160】
ＩＩＩ．考察
本アッセイでは、ｉ）ＣＤ４７媒介細胞死の保存された特徴を有するＴ－ＡＬＬ細胞において選択的に細胞死を誘導するＰＫＨＢ１ペプチドの能力、及びｉｉ）このタイプの細胞死が免疫原性であるかどうかを決定するＰＫＨＢ１の能力を評価した。
本アッセイでは、ｉ）ＣＤ４７媒介細胞死の保存された特徴を有するＴ－ＡＬＬ細胞において選択的に細胞死を誘導するＰＫＨＢ１ペプチドの能力、及びｉｉ）このタイプの細胞死が免疫原性であるかどうかを決定するＰＫＨＢ１の能力を評価した。
【0161】
ＣＥＭ、ＭＯＬＴ－４及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞におけるＰＫＨＢ１誘導死（図２）は、原形質膜透過化とともに、ホスファチジルセリン曝露を示唆する高速カスパーゼ非依存性プロセスであること、悪性細胞に選択的なミトコンドリア膜電位の喪失であることを観察した。（図３）（図４）。さらに、以前にＣＬＬ細胞で観察されたように、ＰＫＨＢ１によって誘導された細胞死に対するカルシウム依存性がＴ－ＡＬＬ細胞に保存されていることが観察された（３３）。
【0162】
これらの結果は、腫瘍担持マウスへのＰＫＨＢ１による処理が、腫瘍部位への白血球浸潤を誘導し、異なるリンパ系器官における白血球細胞数を改善することを示した（図５）。実際、ＰＫＨＢ１は、Ｔ－ＡＬＬ細胞において、ＤＡＭＰｓ曝露及び放出を促進することが可能であった。ＣＲＴは、細胞死が免疫原性であることを決定するために必要であることが示されている主要な分子の１つである（６、１８）。ＰＫＨＢ１処理後のＴ－ＡＬＬに対する、フローサイトメトリー及び共焦点顕微鏡による観察によって、ＣＲＴの曝露が実証されている（図６）。免疫分野における様々な研究は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ１：ＬＲＰ１）に結合することによって，ＡＰＣｓによる抗原取込みを助ける「イート・ミー」シグナル（６、１５、４６，、４７）としてのＣＲＴ曝露の重要性を強調している（７）。癌細胞におけるＣＲＴ発現とＣＤ４７発現との間には密接な相互関係がある（４７）。実際、最近、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）による乳癌細胞株の処理が、ＴＳＰとＣＲＴ及びＣＤ４７との相互作用を促進し、異種移植マウスにおいて細胞オートファジー及び腫瘍成長の阻害を誘導することが明らかになった（４８）。このような結果は、ＴＳＰ又はＴＳＰ由来のペプチドが、ＣＤ４７活性化及びＣＲＴ曝露との相互関係を介して、細胞死を誘導することができるという考えを支持する。また、ＣＥＭ、ＭＯＬＴ－４及びＬ５１７８Ｙ－Ｒの細胞株に対するＰＫＨＢ１処理によって、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０、ＨＭＧＢ１並びにＡＴＰが放出された（図７及び図８）。これらの分子の放出は、免疫系の活性化及び強力な抗癌免疫の誘導に関与する（１７、４９、５０）。しかし、ＤＡＭＰｓの放出は、ＩＣＤ誘導を確実にするのに十分ではなく、ｉｎ ｖｉｖｏワクチン接種が判断基準と考えられている（１、１８、２１）。多くの場合で腫瘍成長を妨げたため、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイは、ＰＫＨＢ１が短期間及び長期間の免疫記憶を活性化し、免疫正常マウスモデルにおいて防御的抗癌応答を誘導することを示した（図１０）。ワクチン中のＰＫＨＢ１処理細胞の数が増すと、その防御的抗腫瘍応答が改善される（図９）。
【0163】
実施例２
Ｔ－ＡＬＬ細胞に対するＤＡＭＰｓ曝露及び放出を促進することができるＰＫＨＢ１と同じ方法で、より強力なＴＳＰ１－Ｃ末端結合ドメイン擬ペプチドがＤＡＭＰｓ曝露を誘導する能力を、より低い濃度で評価した。ＣＲＴは、細胞死が免疫原性であることを決定するために必要であることが示されている主要な分子の１つであるため、該ＴＳＰ－１－Ｃ－末端結合ドメイン擬ペプチドで処理した際の様々な癌細胞株（ＭＥＣ－１、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ７、Ｐａｎｃ－１、ＨＣＴ１１６）に対するＣＲＴの放出、並びにＡＴＰ及びＨＭＧＢ１の放出（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ７、Ｐａｎｃ－１、ＨＣＴ１１６）を評価した。
Ｔ－ＡＬＬ細胞に対するＤＡＭＰｓ曝露及び放出を促進することができるＰＫＨＢ１と同じ方法で、より強力なＴＳＰ１－Ｃ末端結合ドメイン擬ペプチドがＤＡＭＰｓ曝露を誘導する能力を、より低い濃度で評価した。ＣＲＴは、細胞死が免疫原性であることを決定するために必要であることが示されている主要な分子の１つであるため、該ＴＳＰ－１－Ｃ－末端結合ドメイン擬ペプチドで処理した際の様々な癌細胞株（ＭＥＣ－１、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ７、Ｐａｎｃ－１、ＨＣＴ１１６）に対するＣＲＴの放出、並びにＡＴＰ及びＨＭＧＢ１の放出（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ７、Ｐａｎｃ－１、ＨＣＴ１１６）を評価した。
【0164】
以下の例では、
ＰＫＤ１０（配列番号２１）及びＫＢＴＸ－１、
ＰＫＴＤ１０－Ｘ－ＲＮＭｅ（配列番号２７）及びＫＢＴＸ－５、
ＰＫＴＤｉ２－ＦＦ（配列番号３４）及びＫＢＴＸ－７、並びに
ＰＫＴＤ１０（配列番号２５）及びＫＢＴＸ－９は、それぞれ同様のペプチドを示す。
ＰＫＤ１０（配列番号２１）及びＫＢＴＸ－１、
ＰＫＴＤ１０－Ｘ－ＲＮＭｅ（配列番号２７）及びＫＢＴＸ－５、
ＰＫＴＤｉ２－ＦＦ（配列番号３４）及びＫＢＴＸ－７、並びに
ＰＫＴＤ１０（配列番号２５）及びＫＢＴＸ－９は、それぞれ同様のペプチドを示す。
【0165】
カルレティキュリン曝露
ＭＥＣ－１、ＪＵＲＫＡＴ細胞を培養し（５×１０６細胞／ｍＬ）、未処理又は以下に記載されるように示されるマイクロＭの濃度である、異なる作動薬ペプチドで処理した。
ＭＥＣ－１、ＪＵＲＫＡＴ細胞を培養し（５×１０６細胞／ｍＬ）、未処理又は以下に記載されるように示されるマイクロＭの濃度である、異なる作動薬ペプチドで処理した。
【0166】
【表2】
【0167】
次いで、試験を行った各ペプチドに、細胞を２時間培養した。
【0168】
ＦＡＣＳ緩衝剤中で、細胞を回収、洗浄、及びカルレティキュリン－フィコエリトリン（カルレティキュリン－ＰＥ、ＦＭＣ－７５、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ファーミングデール、ニューヨーク州、米国）抗体（１：１０００）で染色した。室温（Ｒｏｏｍ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：ＲＴ）の暗所で１時間後、細胞を洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ１×及び２％のウシ胎児血清）に再懸濁して、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏフローシトメトリー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（総数：細胞１０，０００万個）よって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを分析した。
【0169】
結果を図１１に示す。異なるＣＤ４７作動薬ペプチドによる２時間の処理後に、ＭＥＣ－１（Ａ）及びＪｕｒｋａｔ（Ｂ）白血病細胞で観察されたカルレティキュリン曝露を表すヒストグラムである。ＩｇＧアイソタイプ抗体を含む陰性対照は点線で示され、未処理又はペプチドで処理した細胞のＣＲＴは灰色で示され、また図１２は、異なるＣＤ４７作動薬ペプチドで２時間処理した後の、ＭＥＣ－１及びＪＵＲＫＡＴ白血病細胞で観察されたカルレティキュリン曝露を表すヒストグラムである。グラフは、２回の独立した実験の平均（±ＳＤ）を表す。
【0170】
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７、ＰＡＮＣ－１及びＨＣＴ１１６の細胞を培養し（１×１０６細胞／ｍＬ）、未処理、又は以下に記載されるような異なるＣＤ４７作動薬ペプチドで処理した。
【0171】
【表3】
【0172】
次いで、細胞をペプチドで２時間培養した。
【0173】
ＦＡＣＳ緩衝剤中で、細胞を回収、洗浄、及びカルレティキュリン－フィコエリトリン（カルレティキュリン－ＰＥ、ＦＭＣ－７５、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ファーミングデール、ニューヨーク州、米国）抗体（１：１０００）で染色した。室温（Ｒｏｏｍ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：ＲＴ）の暗所で１時間後、細胞を洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ１×及び２％のウシ胎児血清）に再懸濁して、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏフローシトメトリー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（総数：細胞１０，０００万個）よって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを分析した。
【0174】
図１３は、異なるＣＤ４７作動薬ペプチドによる処理の２時間後に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ａ）、ＭＣＦ－７（Ｂ）ＰＡＮＣ－１（Ｃ）及びＨＣＴ－１１６の細胞で観察されたカルレティキュリン曝露を表すヒストグラムである。ＩｇＧアイソタイプ抗体を有する陰性対照は点線で示されており、未処理又はペプチドで処理した細胞のＣＲＴは灰色で示される。
【0175】
ＨＭＧＢ１放出
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＣＦ－７の細胞を培養し（１×１０６細胞／ｍＬ）、未処理、又は以下に記載されるような異なるＣＤ４７作動薬ペプチドで処理した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＣＦ－７の細胞を培養し（１×１０６細胞／ｍＬ）、未処理、又は以下に記載されるような異なるＣＤ４７作動薬ペプチドで処理した。
【0176】
【表4】
【0177】
次いで、細胞をペプチドで２時間培養した。
【0178】
上清を回収し、２０００ｒｐｍ／１０分で遠心分離し、－７０℃で凍結させた。
【0179】
製造業者による指示書に従って、ＨＭＧＢ１のＣｈｅｍｉ－Ｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｔ ＥＬＩＳＡキットを使用した。
【0180】
【0181】
ＡＴＰ放出
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７、ＰＡＮＣ－１及びＨＣＴ１１６の細胞を培養し（１×１０６細胞／ｍＬ）、未処理、又は以下に記載されるような異なるＣＤ４７作動薬ペプチドで処理した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７、ＰＡＮＣ－１及びＨＣＴ１１６の細胞を培養し（１×１０６細胞／ｍＬ）、未処理、又は以下に記載されるような異なるＣＤ４７作動薬ペプチドで処理した。
【0182】
【表5】
【0183】
次いで、細胞をペプチドで２時間培養した。
【0184】
上清を回収し、２０００ｒｐｍ／１０分で遠心分離し、－７０℃で凍結させた。
【0185】
製造業者による指示書に従って、ＡＴＰ用のＥＮＬＩＴＥＮ ＡＴＰ ＡＳＳＡＹ ＳＹＳＴＥＭ ＢＩＯＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＣＥ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮキットを使用した。
【0186】
【0187】
結論
これら事例の結果は、ＴＳＰ１－Ｃ末端結合ドメイン疑ペプチドが、ＤＡＭＰｓ曝露を誘導することができることを実証し、少なくとも主要分子のＣＲＴの１つは、これらの疑ペプチドによって誘導される細胞死が免疫原性であり、予防的及び治療的ワクチン接種を可能にすると結論付ける。
これら事例の結果は、ＴＳＰ１－Ｃ末端結合ドメイン疑ペプチドが、ＤＡＭＰｓ曝露を誘導することができることを実証し、少なくとも主要分子のＣＲＴの１つは、これらの疑ペプチドによって誘導される細胞死が免疫原性であり、予防的及び治療的ワクチン接種を可能にすると結論付ける。
【0188】
この最後の点は、急性リンパ性白血病Ｔ－ＡＬＬ細胞株（ＣＥＭ細胞、ヒト）でＰＫＤ１０（配列番号２１）（ＫＢＴＸ－１）を用いて、及び免疫正常ＢＡＬＢ／ｃマウスでそれらのマウスに相同であるＬ５１７８Ｙ－Ｒ（Ｔ－マウス腫瘍リンパ芽球細胞株）をｉｎ ｖｉｖｏで用いて実証された（図２０参照）。
【0189】
材料及び方法
ｉｎ ｖｉｖｏモデル
６～８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、制御された環境条件（２５℃及び１２時間の明／暗サイクル）で維持し、げっ歯類の餌（ＬａｂＤｉｅｔ、セントルイス、ミズーリ州、米国）及び水を制限なしに与えた。
ｉｎ ｖｉｖｏモデル
６～８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、制御された環境条件（２５℃及び１２時間の明／暗サイクル）で維持し、げっ歯類の餌（ＬａｂＤｉｅｔ、セントルイス、ミズーリ州、米国）及び水を制限なしに与えた。
【0190】
１００μＬのＰＢＳ中の２×１０６個のＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞を左脚後部に皮下注射することによって、腫瘍を確立した。キャリパ（デジマチックキャリパ、ミツトヨ株式会社、日本）及びデジタル重量計（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｗｅｉｇｈ Ｓｃａｌｅ－６００－ＢＬＫ、米国）を用いて、腫瘍の体積及びマウスの重量をそれぞれ週３回測定した。腫瘍体積は、式、腫瘍体積（ｍｍ３）＝４π／３＊Ａ（長さ）＊Ｂ（幅）＊Ｃ（高さ）によって決定した。腫瘍が１００ｍｍ３に達したとき、ＫＢＴＸ１腫瘍細胞溶解物（ＫＢＴＸ１－ＴＣＬ）の最初の治療ワクチンを以下のように適用した。
【0191】
Ｌ５１７８Ｙ－Ｒ細胞（５×１０６個）を、無血清ＲＰＭＩ培地中で２時間（ＣＣ１００）、ＫＢＴＸ－１により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで処理した。細胞死は上に報告したように確認された。処理した細胞を、１００μｌの無血清培地で右後脚に週に２回、皮下接種した。対照を、１００μｌの無血清培地で処理した。
【0192】
長期間の記憶の評価のために、本発明者等は、ナイーブマウス６匹（対照）及びＫＢＴＸ１－ＴＣＬ処理語完全寛解したマウス（腫瘍のない状態が６０日を超えるマウス）６匹を使用した。両群において、１００μＬのＰＢＳ中の２×１０６個のＬ５１７８Ｙ－Ｒ生細胞を左後脚に注射した。後者の群をＫＢＴＸ１－ＴＣＬ再注入と命名した。上に記載したように、腫瘍体積及び生存率を評価した。
【0193】
統計分析
すべてのｉｎ ｖｉｖｏ実験において、マウスを異なる群に無作為に割り当てた。少なくとも３回の独立した実験を３回独立して繰り返した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（サンディエゴ、カルフォルニア州、米国）を使用してマン・ホイットニー検定及び両側・対応のないスチューデントＴ検定を行い、平均値を±ＳＤとして示した。ｐ値は、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１の通り有意とみなした。
すべてのｉｎ ｖｉｖｏ実験において、マウスを異なる群に無作為に割り当てた。少なくとも３回の独立した実験を３回独立して繰り返した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（サンディエゴ、カルフォルニア州、米国）を使用してマン・ホイットニー検定及び両側・対応のないスチューデントＴ検定を行い、平均値を±ＳＤとして示した。ｐ値は、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１の通り有意とみなした。
【0194】
結果
ＫＢＴＸ－１は、ＣＥＭ及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞株において細胞死を誘導する。アネキシン－Ｖ－アロフィコシアニン（アネキシン－Ｖ－ＡＰＣ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって細胞死を測定し、グラフに表した。グラフは、３回の独立した実験の平均（±ＳＤ）を表す。ＫＢＴＸ１によって誘導された細胞死を、前処理なしで放置した細胞（対照）又はＢＡＰＴＡ、Ｑ－ＶＤ－ｏＰｈ（ＱＶＤ）で前処理した細胞（３０分間）と同様に評価し、カスパーゼ非依存性及びカルシウム依存性の細胞死導入に焦点を当てた。（図２１）。
ＫＢＴＸ－１は、ＣＥＭ及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞株において細胞死を誘導する。アネキシン－Ｖ－アロフィコシアニン（アネキシン－Ｖ－ＡＰＣ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって細胞死を測定し、グラフに表した。グラフは、３回の独立した実験の平均（±ＳＤ）を表す。ＫＢＴＸ１によって誘導された細胞死を、前処理なしで放置した細胞（対照）又はＢＡＰＴＡ、Ｑ－ＶＤ－ｏＰｈ（ＱＶＤ）で前処理した細胞（３０分間）と同様に評価し、カスパーゼ非依存性及びカルシウム依存性の細胞死導入に焦点を当てた。（図２１）。
【0195】
ＫＢＴＸ－１は、カルレティキュリン曝露を誘導する。Ａ．グラフ（左側）は、ＦＡＣＳを使用した、ＣＥＭ（上）及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞（下）における表面ＣＲＴ検出を表す。ＩｇＧアイソタイプ抗体を含む陰性対照を、点線（ＩｇＧ－Ｃ）及び実線（ＩｇＧ－ＫＢ）で示し、灰色（対照）は基礎量のＣＲＴであり、黒色は処理された細胞（ＫＢＴＸ－１）である。Ｂ．ＣＲＴ－ＰＥ染色によって、ＫＢＴＸ－１で処理した細胞においてＥＣＴＯ－ＣＲＴが観察された（図２２）
【0196】
ＫＢＴＸ１は、ＣＥＭ及びＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞株において、ＨＭＧＢ１及びＡＴＰの放出を誘導する。ＣＣ１００のＫＢＴＸ－１で２時間，細胞を処理し、次いで、各試料の上清１００μＬを採取して、以下を測定した。Ａ及びＢは、ＣＥＭ及びＬ５１７８Ｙ－Ｒに対する生物発光検出によってＡＴＰ放出を測定した。Ｃ及びＤは、ＥＬＩＳＡアッセイによって、ＨＭＧＢ１放出を測定した。示されるグラフによって、３回実施された３つの同様の実験を表す（図２３）
【0197】
ＫＢＴＸ－１－ＴＣＬ治療ワクチン接種は、長期間の抗腫瘍記憶を誘導する。治療ワクチン接種後に寛解状態にあるマウスに、２×１０６個のＬ５１７８Ｙ－Ｒ生細胞を再注入した。グラフは、ＫＢＴＸ－１－ＴＣＬで事前に処理した後寛解したマウスへの、Ｌ５１７８Ｙ－Ｒ生細胞（ＫＢＴＸ－１－ＴＣＬ－Ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅ）を再注入したマウスを示す。治療ワクチンは、次のように、実現化された長期間の抗腫瘍記憶の以前の評価である。Ｌ５１７８Ｙ－Ｒ細胞を移植し、腫瘍が１００ｍｍ３に達したときに、ＫＢＴＸ－１－ＴＣＬ（５×１０６個のＣＣ１００ＫＢＴＸ－１で処理されたＬ５１７８Ｙ－Ｒ細胞）で処理を開始し、次いで、ＫＢＴＸ－１－ＴＣＬを３日ごとに２週間（合計４回の注射）投与した（図２４）。
【0198】
結論
この研究は、ＫＢＴＸ－１－ＴＣＬが、確立されたＬ５１７８Ｙ－Ｒ腫瘍においてｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍免疫応答を導入することができたことから、ＣＤ４７作動薬ペプチドである、ＫＢＴＸ－１によって誘導されるＩＣＤが、癌疾患に対処する治療的可能性があることを実証した。さらに、ＫＢＴＸ－１－ＴＣＬ処理マウスは、長期免疫記憶を発現した。
この研究は、ＫＢＴＸ－１－ＴＣＬが、確立されたＬ５１７８Ｙ－Ｒ腫瘍においてｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍免疫応答を導入することができたことから、ＣＤ４７作動薬ペプチドである、ＫＢＴＸ－１によって誘導されるＩＣＤが、癌疾患に対処する治療的可能性があることを実証した。さらに、ＫＢＴＸ－１－ＴＣＬ処理マウスは、長期免疫記憶を発現した。
【0199】
参考文献
1. Kroemer G, Galluzzi L, Kepp O, Zitvogel L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annu Rev Immunol. 2013; 31:51-72.
2. Galluzzi L, Vitale I, Aaronson SA, Abrams JM, Adam D, Agostinis P, Alnemri ES, Altucci L, Amelio I, Andrews DW, Annicchiarico-Petruzzelli M. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death Differ. 2018; 25(3):486-541.
3. Land WG. The role of damage-associated molecular patterns (DAMPs) in human diseases: part II: DAMPs as diagnostics, prognostics and therapeutics in clinical medicine. Sultan Qaboos University Medical Journal. 2015;15(2): e157.
4. Rubartelli A, Lotze MT. Inside, outside, upside down: damage-associated molecular-pattern molecules (DAMPs) and redox. Trends Immunol. 2007;28(10):429-36.
5. Garg AD, Dudek AM, Agostinis P. Cancer immunogenicity, danger signals, and DAMPs: what, when, and how?. Biofactors. 2013;39(4):355-67.
6. Obeid M, Tesniere A, Ghiringhelli F, Fimia GM, Apetoh L, Perfettini JL, Castedo M, Mignot G, Panaretakis T, Casares N, Metivier D. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med. 2007;13(1):54-61.
7. Garg AD, Krysko DV, Verfaillie T, Kaczmarek A, Ferreira GB, Marysael T, et al. A novel pathway combining calreticulin exposure and ATP secretion in immunogenic cancer cell death. EMBO J. 2012;31(5):1062-79.
8. Fucikova J, Kasikova L, Truxova I, Laco J, Skapa P, Ryska A, et al. Relevance of the chaperone-like protein calreticulin for the biological behavior and clinical outcome of cancer. Immunol Lett. 2018; 193:25-34.
9. Spisek R, Charalambous A, Mazumder A, Vesole DH, Jagannath S, Dhodapkar MV. Bortezomib enhances dendritic cell (DC)-mediated induction of immunity to human myeloma via exposure of cell surface heat shock protein 90 on dying tumor cells: therapeutic implications. Blood. 2007;109(11):4839-45.
10. Garg AD, Galluzzi L, Apetoh L, Baert T, Birge RB, Pedro BS, et al. Molecular and translational classifications of DAMPs in immunogenic cell death. Front Immunol. 2015;6:588.
11. Elliott MR, Chekeni FB, Trampont PC, Lazarowski ER, Kadl A, Walk SF, et al. Nucleotides released by apoptotic cells act as a find-me signal to promote phagocytic clearance. Nature. 2009;461(7261):282.
12. Aymeric L, Apetoh L, Ghiringhelli F, Tesniere A, Martins I, Kroemer G, et al. Tumor cell death and ATP release prime dendritic cells and efficient anticancer immunity. Cancer Res. 2010;70(3):855-8.
13. Martins I, Wang Y, Michaud M, Ma Y, Sukkurwala AQ, Shen S, et al. Molecular mechanisms of ATP secretion during immunogenic cell death. Cell Death Differ 2014;21(1):79-9175.
14. Scaffidi P, Misteli T, Bianchi ME. Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation. Nature. 2002;418(6894):191-5.
15. Inoue H, Tani K. Multimodal immunogenic cancer cell death as a consequence of anticancer cytotoxic treatments. Cell death and differentiation. 2014;21(1):39-49.
16. Tesniere A, Panaretakis T, Kepp O, Apetoh L, Ghiringhelli F, Zitvogel L, et al. Molecular characteristics of immunogenic cancer cell death. Cell death and Differ. 2008;15(1):3-12.
17. Krysko DV, Garg AD, Kaczmarek A, Krysko O, Agostinis P, Vandenabeele P. Immunogenic cell death and DAMPs in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 2012;12(12):860.
18. Bezu L, Gomes-da-Silva LC, Dewitte H, Breckpot K, Fucikova J, Spisek R, et al. Combinatorial strategies for the induction of immunogenic cell death. Front Immunol. 2015;6:187.
19. Kepp O, Senovilla L, Vitale I, Vacchelli E, Adjemian S, Agostinis P, et al. Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death. Oncoimmunology. 2014;3(9):e955691.
20. Garg AD, More S, Rufo N, Mece O, Sassano ML, Agostinis P, et al. Trial Watch: Immunogenic cell death induction by anticancer chemotherapeutics. OncoImmunology. 2017;6(12):e1386829.
21. Galluzzi L, Buque A, Kepp O, Zitvogel L, Kroemer G. Immunogenic cell death in cancer and infectious disease. Nat Rev Immunol. 2017;17(2):97-111
22. Jabbour E, O'brien S, Konopleva M, Kantarjian H. New insights into the pathophysiology and therapy of adult acute lymphoblastic leukemia. Cancer. 2015;121(15):2517-28.
23. Terwilliger T, Abdul-Hay M. Acute lymphoblastic leukemia: a comprehensive review and 2017 update. Blood Cancer J. 2017;7(6):e577.
24. National Cancer Institute. SEER cancer statistics review, 1975-2015. Leukemia, annual incidence rates (acute lymphocytic leukemia). https://seer.cancer.gov/statfacts/html/alyl.html
25. McNeer J.L., Bleyer A., Conter V., Stock W. Acute Lymphoblastic Leukemia. In: Bleyer A., Barr R., Ries L., Whelan J., Ferrari A. (eds) Cancer in Adolescents and Young Adults. Pediatric Oncology. Springer, Cham. 2017;151-175
26. McNeer JL, Bleyer A. Acute lymphoblastic leukemia and lymphoblastic lymphoma in adolescents and young adults. Pediatric Blood & Cancer. 2018;65(6):e26989.
27. Jaime-Perez JC, Fernandez LT, Jimenez-Castillo RA, Gomez-De Leon A, Cantu-Rodriguez OG, Gutierrez-Aguirre CH, et al. Age Acts as an Adverse Independent Variable for Survival in Acute Lymphoblastic Leukemia: Data From a Cohort in Northeast Mexico. Clin Lymphoma, Myeloma Leuk. 2017;17(9):590-4.
28. Li Y, Buijs-Gladdines JG, Cante-Barrett K, Stubbs AP, Vroegindeweij EM, Smits WK, et al. IL-7 receptor mutations and steroid resistance in pediatric t cell acute lymphoblastic leukemia: A Genome Sequencing Study. PLoS medicine. 2016;13(12):e1002200.
29. Locatelli F, Schrappe M, Bernardo ME, Rutella S. How I treat relapsed childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2012;120(14):2807-16.
30. Pogorzala M, Kubicka M, Rafinska B, Wysocki M, Styczynski J. Drug-resistance profile in multiple-relapsed childhood acute lymphoblastic leukemia. Anticancer Res. 2015;35(10):5667-70.
31. Thompson PA, Tam CS, O’Brien SM, Wierda WG, Stingo F, Plunkett W, et al. Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2016;127(3):303-9.
32. Majeti R, Chao MP, Alizadeh AA, Pang WW, Jaiswal S, Gibbs Jr KD, et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 2009;138(2):286-99.
33. Martinez-Torres AC, Quiney C, Attout T, Boullet H, Herbi L, Vela L, et al. CD47 agonist peptides induce programmed cell death in refractory chronic lymphocytic leukemia B cells via PLCγ1 activation: evidence from mice and humans. PLoS medicine. 2015;12(3):e1001796.
34. Denefle T, Boullet H, Herbi L, Newton C, Martinez-Torres AC, Guez A, et al. Thrombospondin-1 Mimetic Agonist Peptides Induce Selective Death in Tumor Cells: Design, Synthesis, and Structure-Activity Relationship Studies. J. Med Chem. 2016;59(18):8412-21.
35. Chao MP, Alizadeh AA, Tang C, Jan M, Weissman-Tsukamoto R, Zhao F, et al. Therapeutic antibody targeting of CD47 eliminates human acute lymphoblastic leukemia. Cancer Res. 2011 Feb 15;71(4):1374-84.
36. Barclay AN, van den Berg TK. The interaction between signal regulatory protein alpha (SIRPα) and CD47: structure, function, and therapeutic target. Annu Rev Immunol. 2014;32:25-50.
37. Soto-Pantoja DR, Kaur S, Roberts DD. CD47 signaling pathways controlling cellular differentiation and responses to stress. Critical Rev Biochem Mol Biol. 2015;50(3):212-30.
38. Liu X, Pu Y, Cron K, Deng L, Kline J, Frazier WA, et al. CD47 blockade triggers T cell-mediated destruction of immunogenic tumors. Nat Med. 2015;21(10):1209-15.
39. Leclair P, Liu CC, Monajemi M, Reid GS, Sly LM, Lim CJ. CD47-ligation induced cell death in T-acute lymphoblastic leukemia. Cell death Dis. 2018;9(5).
40. Mateo V, Lagneaux L, Bron D, Biron G, Armant M, Delespesse G, et al. CD47 ligation induces caspase-independent cell death in chronic lymphocytic leukemia. Nat Med. 1999;5(11):1277-84.
41. Sick E, Jeanne A, Schneider C, Dedieu S, Takeda K, Martiny L. CD47 update: a multifaceted actor in the tumour microenvironment of potential therapeutic interest. Br J Pharmacol. 2012;167(7):1415-30.
42. Casares N, Pequignot MO, Tesniere A, Ghiringhelli F, Roux S, Chaput N, et al. Caspase-dependent immunogenicity of doxorubicin-induced tumor cell death. J Exp Med. 2005;202(12):1691-701.
43. Oldenborg PA. CD47: a cell surface glycoprotein which regulates multiple functions of hematopoietic cells in health and disease. ISRN Hematol. 2013;2013:1-19.
44. Manna PP, Frazier WA. The mechanism of CD47-dependent killing of T cells: heterotrimeric Gi-dependent inhibition of protein kinase A. J Immunol. 2003;170(7):3544-53.
45. Zhou H, Forveille S, Sauvat A, Yamazaki T, Senovilla L, Ma Y, et al. The oncolytic peptide LTX-315 triggers immunogenic cell death. Cell Death Dis. 2016;7(3):e2134.
46. Gardai SJ, McPhillips KA, Frasch SC, Janssen WJ, Starefeldt A, Murphy-Ullrich JE, et al. Cell-surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through trans-activation of LRP on the phagocyte. Cell. 2005;123(2):321-34.
47. Chao MP, Jaiswal S, Weissman-Tsukamoto R, Alizadeh AA, Gentles AJ, Volkmer J. et al. Calreticulin is the dominant pro-phagocytic signal on multiple human cancers and is counterbalanced by CD47. Sci Transl Med. 2010;2(63):63-94
48. Chen Q, Fang X, Jiang C, Yao N, Fang X. Thrombospondin promoted anti-tumor of adenovirus-mediated calreticulin in breast cancer: Relationship with anti-CD47. Biomed Pharmacother. 2015;73:109-15.
49. Fucikova J, Kralikova P, Fialova A, Brtnicky T, Rob L, Bartunkova J, et al. Human tumor cells killed by anthracyclines induce a tumor-specific immune response. Cancer Res. 2011;71(14):4821-33.
50. Rodriguez-Salazar MD, Franco-Molina MA, Mendoza-Gamboa E, Martinez-Torres AC, Zapata-Benavides P, Lopez-Gonzalez JS, et al. The novel immunomodulatory IMMUNEPOTENT CRP combined with chemotherapy agent increased the rate of immunogenic cell death and prevented melanoma growth. Oncol Lett. 2017;14(1):844-52.
51. Dudek-Peric AM, Ferreira GB, Muchowicz A, Wouters J, Prada N, Martin S, et al. Antitumor immunity triggered by melphalan is potentiated by melanoma cell surface-associated calreticulin. Cancer Res. 2015;75(8):1603-14.
52. Guo C, Manjili MH, Subjeck JR, Sarkar D, Fisher PB, Wang XY. Therapeutic cancer vaccines: past, present, and future. Adv Cancer Res 2013;119:421-75).
53. Showalter A, Limaye A, Oyer JL, Igarashi R, Kittipatarin C, Copik AJ, et al. Cytokines in immunogenic cell death: Applications for cancer immunotherapy. Cytokine. 2017;97:123-32.
54. Papaioannou NE, Beniata OV, Vitsos P, Tsitsilonis O, Samara P. Harnessing the immune system to improve cancer therapy. Ann Transl Med. 2016;4(14) :261-261.
55. Li X. The inducers of immunogenic cell death for tumor immunotherapy. Tumori J 2018;104(1):1-8.
56. Pol J, Vacchelli E, Aranda F, Castoldi F, Eggermont A, Cremer I, et al. Trial Watch: Immunogenic cell death inducers for anticancer chemotherapy. Oncoimmunology. 2015;4(4):e1008866.
57. Vacchelli E, Aranda F, Eggermont A, Galon J, Sautes-Fridman C, Zitvogel L, et al. Trial Watch: Tumor-targeting monoclonal antibodies in cancer therapy. Oncoimmunology. 2014;3(1):e27048.
58. Tanaka M, Kataoka H, Yano S, Sawada T, Akashi H, Inoue M, et al. Immunogenic cell death due to a new photodynamic therapy (PDT) with glycoconjugated chlorin (G-chlorin). Oncotarget. 2016;7(30):47242-51.
59. Golden EB, Apetoh L. Radiotherapy and immunogenic cell death. Semin Radiat Oncol. 2015;25(1):11-7
60. Diaconu I, Cerullo V, Hirvinen ML, Escutenaire S, Ugolini M, Pesonen SK, et al. Immune response is an important aspect of the antitumor effect produced by a CD40L-encoding oncolytic adenovirus. Cancer Res. 2012;72(9):2327-38.
61. Yamano T, Kubo S, Fukumoto M, Yano A, Mawatari-Furukawa Y, Okamura H, et al. Whole cell vaccination using immunogenic cell death by an oncolytic adenovirus is effective against a colorectal cancer model. Mol Ther-Oncolytics. 2016;3:16031.
62. Fucikova J, Moserova I, Truxova I, Hermanova I, Vancurova I, Partlova S, et al. High hydrostatic pressure induces immunogenic cell death in human tumor cells. Int J Cancer. 2014;135(5):1165-77.
63. Lin TJ, Lin HT, Chang WT, Hsiao PW, Yin SY, et al. Shikonin-enhanced cell immunogenicity of tumor vaccine is mediated by the differential effects of DAMP components. Mol Cancer. 2015;14(1):174.
64. Yin S, Yang NS, Lin TJ. Molecular basis of shikonin-induced immunogenic cell death: insights for developing cancer therapeutics. Recept Clin Investig. 2016;3:1-5.
65. D’Eliseo D, Manzi L, Velotti F. Capsaicin as an inducer of damage-associated molecular patterns (DAMPs) of immunogenic cell death (ICD) in human bladder cancer cells. Cell Stress and Chaperones. 2013;18(6):801-8.
66. Jin T, Wu H, Wang Y, Peng H. Capsaicin induces immunogenic cell death in human osteosarcoma cells. Exp Ther Med. 2016;12(2):765-70.
67. Rapoport BL, Anderson R. Realizing the clinical potential of immunogenic cell death in cancer chemotherapy and radiotherapy. Intl. J. Mol. Sci. 2019, 20, 959.
1. Kroemer G, Galluzzi L, Kepp O, Zitvogel L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annu Rev Immunol. 2013; 31:51-72.
2. Galluzzi L, Vitale I, Aaronson SA, Abrams JM, Adam D, Agostinis P, Alnemri ES, Altucci L, Amelio I, Andrews DW, Annicchiarico-Petruzzelli M. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death Differ. 2018; 25(3):486-541.
3. Land WG. The role of damage-associated molecular patterns (DAMPs) in human diseases: part II: DAMPs as diagnostics, prognostics and therapeutics in clinical medicine. Sultan Qaboos University Medical Journal. 2015;15(2): e157.
4. Rubartelli A, Lotze MT. Inside, outside, upside down: damage-associated molecular-pattern molecules (DAMPs) and redox. Trends Immunol. 2007;28(10):429-36.
5. Garg AD, Dudek AM, Agostinis P. Cancer immunogenicity, danger signals, and DAMPs: what, when, and how?. Biofactors. 2013;39(4):355-67.
6. Obeid M, Tesniere A, Ghiringhelli F, Fimia GM, Apetoh L, Perfettini JL, Castedo M, Mignot G, Panaretakis T, Casares N, Metivier D. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med. 2007;13(1):54-61.
7. Garg AD, Krysko DV, Verfaillie T, Kaczmarek A, Ferreira GB, Marysael T, et al. A novel pathway combining calreticulin exposure and ATP secretion in immunogenic cancer cell death. EMBO J. 2012;31(5):1062-79.
8. Fucikova J, Kasikova L, Truxova I, Laco J, Skapa P, Ryska A, et al. Relevance of the chaperone-like protein calreticulin for the biological behavior and clinical outcome of cancer. Immunol Lett. 2018; 193:25-34.
9. Spisek R, Charalambous A, Mazumder A, Vesole DH, Jagannath S, Dhodapkar MV. Bortezomib enhances dendritic cell (DC)-mediated induction of immunity to human myeloma via exposure of cell surface heat shock protein 90 on dying tumor cells: therapeutic implications. Blood. 2007;109(11):4839-45.
10. Garg AD, Galluzzi L, Apetoh L, Baert T, Birge RB, Pedro BS, et al. Molecular and translational classifications of DAMPs in immunogenic cell death. Front Immunol. 2015;6:588.
11. Elliott MR, Chekeni FB, Trampont PC, Lazarowski ER, Kadl A, Walk SF, et al. Nucleotides released by apoptotic cells act as a find-me signal to promote phagocytic clearance. Nature. 2009;461(7261):282.
12. Aymeric L, Apetoh L, Ghiringhelli F, Tesniere A, Martins I, Kroemer G, et al. Tumor cell death and ATP release prime dendritic cells and efficient anticancer immunity. Cancer Res. 2010;70(3):855-8.
13. Martins I, Wang Y, Michaud M, Ma Y, Sukkurwala AQ, Shen S, et al. Molecular mechanisms of ATP secretion during immunogenic cell death. Cell Death Differ 2014;21(1):79-9175.
14. Scaffidi P, Misteli T, Bianchi ME. Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation. Nature. 2002;418(6894):191-5.
15. Inoue H, Tani K. Multimodal immunogenic cancer cell death as a consequence of anticancer cytotoxic treatments. Cell death and differentiation. 2014;21(1):39-49.
16. Tesniere A, Panaretakis T, Kepp O, Apetoh L, Ghiringhelli F, Zitvogel L, et al. Molecular characteristics of immunogenic cancer cell death. Cell death and Differ. 2008;15(1):3-12.
17. Krysko DV, Garg AD, Kaczmarek A, Krysko O, Agostinis P, Vandenabeele P. Immunogenic cell death and DAMPs in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 2012;12(12):860.
18. Bezu L, Gomes-da-Silva LC, Dewitte H, Breckpot K, Fucikova J, Spisek R, et al. Combinatorial strategies for the induction of immunogenic cell death. Front Immunol. 2015;6:187.
19. Kepp O, Senovilla L, Vitale I, Vacchelli E, Adjemian S, Agostinis P, et al. Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death. Oncoimmunology. 2014;3(9):e955691.
20. Garg AD, More S, Rufo N, Mece O, Sassano ML, Agostinis P, et al. Trial Watch: Immunogenic cell death induction by anticancer chemotherapeutics. OncoImmunology. 2017;6(12):e1386829.
21. Galluzzi L, Buque A, Kepp O, Zitvogel L, Kroemer G. Immunogenic cell death in cancer and infectious disease. Nat Rev Immunol. 2017;17(2):97-111
22. Jabbour E, O'brien S, Konopleva M, Kantarjian H. New insights into the pathophysiology and therapy of adult acute lymphoblastic leukemia. Cancer. 2015;121(15):2517-28.
23. Terwilliger T, Abdul-Hay M. Acute lymphoblastic leukemia: a comprehensive review and 2017 update. Blood Cancer J. 2017;7(6):e577.
24. National Cancer Institute. SEER cancer statistics review, 1975-2015. Leukemia, annual incidence rates (acute lymphocytic leukemia). https://seer.cancer.gov/statfacts/html/alyl.html
25. McNeer J.L., Bleyer A., Conter V., Stock W. Acute Lymphoblastic Leukemia. In: Bleyer A., Barr R., Ries L., Whelan J., Ferrari A. (eds) Cancer in Adolescents and Young Adults. Pediatric Oncology. Springer, Cham. 2017;151-175
26. McNeer JL, Bleyer A. Acute lymphoblastic leukemia and lymphoblastic lymphoma in adolescents and young adults. Pediatric Blood & Cancer. 2018;65(6):e26989.
27. Jaime-Perez JC, Fernandez LT, Jimenez-Castillo RA, Gomez-De Leon A, Cantu-Rodriguez OG, Gutierrez-Aguirre CH, et al. Age Acts as an Adverse Independent Variable for Survival in Acute Lymphoblastic Leukemia: Data From a Cohort in Northeast Mexico. Clin Lymphoma, Myeloma Leuk. 2017;17(9):590-4.
28. Li Y, Buijs-Gladdines JG, Cante-Barrett K, Stubbs AP, Vroegindeweij EM, Smits WK, et al. IL-7 receptor mutations and steroid resistance in pediatric t cell acute lymphoblastic leukemia: A Genome Sequencing Study. PLoS medicine. 2016;13(12):e1002200.
29. Locatelli F, Schrappe M, Bernardo ME, Rutella S. How I treat relapsed childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2012;120(14):2807-16.
30. Pogorzala M, Kubicka M, Rafinska B, Wysocki M, Styczynski J. Drug-resistance profile in multiple-relapsed childhood acute lymphoblastic leukemia. Anticancer Res. 2015;35(10):5667-70.
31. Thompson PA, Tam CS, O’Brien SM, Wierda WG, Stingo F, Plunkett W, et al. Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2016;127(3):303-9.
32. Majeti R, Chao MP, Alizadeh AA, Pang WW, Jaiswal S, Gibbs Jr KD, et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 2009;138(2):286-99.
33. Martinez-Torres AC, Quiney C, Attout T, Boullet H, Herbi L, Vela L, et al. CD47 agonist peptides induce programmed cell death in refractory chronic lymphocytic leukemia B cells via PLCγ1 activation: evidence from mice and humans. PLoS medicine. 2015;12(3):e1001796.
34. Denefle T, Boullet H, Herbi L, Newton C, Martinez-Torres AC, Guez A, et al. Thrombospondin-1 Mimetic Agonist Peptides Induce Selective Death in Tumor Cells: Design, Synthesis, and Structure-Activity Relationship Studies. J. Med Chem. 2016;59(18):8412-21.
35. Chao MP, Alizadeh AA, Tang C, Jan M, Weissman-Tsukamoto R, Zhao F, et al. Therapeutic antibody targeting of CD47 eliminates human acute lymphoblastic leukemia. Cancer Res. 2011 Feb 15;71(4):1374-84.
36. Barclay AN, van den Berg TK. The interaction between signal regulatory protein alpha (SIRPα) and CD47: structure, function, and therapeutic target. Annu Rev Immunol. 2014;32:25-50.
37. Soto-Pantoja DR, Kaur S, Roberts DD. CD47 signaling pathways controlling cellular differentiation and responses to stress. Critical Rev Biochem Mol Biol. 2015;50(3):212-30.
38. Liu X, Pu Y, Cron K, Deng L, Kline J, Frazier WA, et al. CD47 blockade triggers T cell-mediated destruction of immunogenic tumors. Nat Med. 2015;21(10):1209-15.
39. Leclair P, Liu CC, Monajemi M, Reid GS, Sly LM, Lim CJ. CD47-ligation induced cell death in T-acute lymphoblastic leukemia. Cell death Dis. 2018;9(5).
40. Mateo V, Lagneaux L, Bron D, Biron G, Armant M, Delespesse G, et al. CD47 ligation induces caspase-independent cell death in chronic lymphocytic leukemia. Nat Med. 1999;5(11):1277-84.
41. Sick E, Jeanne A, Schneider C, Dedieu S, Takeda K, Martiny L. CD47 update: a multifaceted actor in the tumour microenvironment of potential therapeutic interest. Br J Pharmacol. 2012;167(7):1415-30.
42. Casares N, Pequignot MO, Tesniere A, Ghiringhelli F, Roux S, Chaput N, et al. Caspase-dependent immunogenicity of doxorubicin-induced tumor cell death. J Exp Med. 2005;202(12):1691-701.
43. Oldenborg PA. CD47: a cell surface glycoprotein which regulates multiple functions of hematopoietic cells in health and disease. ISRN Hematol. 2013;2013:1-19.
44. Manna PP, Frazier WA. The mechanism of CD47-dependent killing of T cells: heterotrimeric Gi-dependent inhibition of protein kinase A. J Immunol. 2003;170(7):3544-53.
45. Zhou H, Forveille S, Sauvat A, Yamazaki T, Senovilla L, Ma Y, et al. The oncolytic peptide LTX-315 triggers immunogenic cell death. Cell Death Dis. 2016;7(3):e2134.
46. Gardai SJ, McPhillips KA, Frasch SC, Janssen WJ, Starefeldt A, Murphy-Ullrich JE, et al. Cell-surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through trans-activation of LRP on the phagocyte. Cell. 2005;123(2):321-34.
47. Chao MP, Jaiswal S, Weissman-Tsukamoto R, Alizadeh AA, Gentles AJ, Volkmer J. et al. Calreticulin is the dominant pro-phagocytic signal on multiple human cancers and is counterbalanced by CD47. Sci Transl Med. 2010;2(63):63-94
48. Chen Q, Fang X, Jiang C, Yao N, Fang X. Thrombospondin promoted anti-tumor of adenovirus-mediated calreticulin in breast cancer: Relationship with anti-CD47. Biomed Pharmacother. 2015;73:109-15.
49. Fucikova J, Kralikova P, Fialova A, Brtnicky T, Rob L, Bartunkova J, et al. Human tumor cells killed by anthracyclines induce a tumor-specific immune response. Cancer Res. 2011;71(14):4821-33.
50. Rodriguez-Salazar MD, Franco-Molina MA, Mendoza-Gamboa E, Martinez-Torres AC, Zapata-Benavides P, Lopez-Gonzalez JS, et al. The novel immunomodulatory IMMUNEPOTENT CRP combined with chemotherapy agent increased the rate of immunogenic cell death and prevented melanoma growth. Oncol Lett. 2017;14(1):844-52.
51. Dudek-Peric AM, Ferreira GB, Muchowicz A, Wouters J, Prada N, Martin S, et al. Antitumor immunity triggered by melphalan is potentiated by melanoma cell surface-associated calreticulin. Cancer Res. 2015;75(8):1603-14.
52. Guo C, Manjili MH, Subjeck JR, Sarkar D, Fisher PB, Wang XY. Therapeutic cancer vaccines: past, present, and future. Adv Cancer Res 2013;119:421-75).
53. Showalter A, Limaye A, Oyer JL, Igarashi R, Kittipatarin C, Copik AJ, et al. Cytokines in immunogenic cell death: Applications for cancer immunotherapy. Cytokine. 2017;97:123-32.
54. Papaioannou NE, Beniata OV, Vitsos P, Tsitsilonis O, Samara P. Harnessing the immune system to improve cancer therapy. Ann Transl Med. 2016;4(14) :261-261.
55. Li X. The inducers of immunogenic cell death for tumor immunotherapy. Tumori J 2018;104(1):1-8.
56. Pol J, Vacchelli E, Aranda F, Castoldi F, Eggermont A, Cremer I, et al. Trial Watch: Immunogenic cell death inducers for anticancer chemotherapy. Oncoimmunology. 2015;4(4):e1008866.
57. Vacchelli E, Aranda F, Eggermont A, Galon J, Sautes-Fridman C, Zitvogel L, et al. Trial Watch: Tumor-targeting monoclonal antibodies in cancer therapy. Oncoimmunology. 2014;3(1):e27048.
58. Tanaka M, Kataoka H, Yano S, Sawada T, Akashi H, Inoue M, et al. Immunogenic cell death due to a new photodynamic therapy (PDT) with glycoconjugated chlorin (G-chlorin). Oncotarget. 2016;7(30):47242-51.
59. Golden EB, Apetoh L. Radiotherapy and immunogenic cell death. Semin Radiat Oncol. 2015;25(1):11-7
60. Diaconu I, Cerullo V, Hirvinen ML, Escutenaire S, Ugolini M, Pesonen SK, et al. Immune response is an important aspect of the antitumor effect produced by a CD40L-encoding oncolytic adenovirus. Cancer Res. 2012;72(9):2327-38.
61. Yamano T, Kubo S, Fukumoto M, Yano A, Mawatari-Furukawa Y, Okamura H, et al. Whole cell vaccination using immunogenic cell death by an oncolytic adenovirus is effective against a colorectal cancer model. Mol Ther-Oncolytics. 2016;3:16031.
62. Fucikova J, Moserova I, Truxova I, Hermanova I, Vancurova I, Partlova S, et al. High hydrostatic pressure induces immunogenic cell death in human tumor cells. Int J Cancer. 2014;135(5):1165-77.
63. Lin TJ, Lin HT, Chang WT, Hsiao PW, Yin SY, et al. Shikonin-enhanced cell immunogenicity of tumor vaccine is mediated by the differential effects of DAMP components. Mol Cancer. 2015;14(1):174.
64. Yin S, Yang NS, Lin TJ. Molecular basis of shikonin-induced immunogenic cell death: insights for developing cancer therapeutics. Recept Clin Investig. 2016;3:1-5.
65. D’Eliseo D, Manzi L, Velotti F. Capsaicin as an inducer of damage-associated molecular patterns (DAMPs) of immunogenic cell death (ICD) in human bladder cancer cells. Cell Stress and Chaperones. 2013;18(6):801-8.
66. Jin T, Wu H, Wang Y, Peng H. Capsaicin induces immunogenic cell death in human osteosarcoma cells. Exp Ther Med. 2016;12(2):765-70.
67. Rapoport BL, Anderson R. Realizing the clinical potential of immunogenic cell death in cancer chemotherapy and radiotherapy. Intl. J. Mol. Sci. 2019, 20, 959.
【0200】
配列表
KRFYVVMWKK (配列番号l).
PKHB1: (D)K-R-F-Y-V-V-M-W-K-(D)K ; (配列番号2)
Ac-RFYVVMWK-NH2 (配列番号3)
Ac-KRFYVVMWKK-NH2 (配列番号4)
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H-(D)K ψ(CONMe)R F Y V V M W K (D)K-OH (配列番号14)
H-(D)K R F Y V V M W ψ(CONMe)K (D)K-OH (配列番号15)
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KRFYVVMWKK (配列番号l).
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Ac-FYVVXW-NH2 (配列番号10)
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H-(D)K ψ(CONMe)R F F V V X W K (D)K-OH (配列番号20)
【表6】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図9-4】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図14】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図17-1】
【図17-2】
【図18-1】
【図18-2】
【図19-1】
【図19-2】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】
【国際調査報告】