特表 2022-505934 差異的アイソタイプ検出のためのラテラルフローアッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-14

(54)【発明の名称】差異的アイソタイプ検出のためのラテラルフローアッセイ

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20220106BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20220106BHJP

【ＦＩ】

G01N33/543 521

G01N33/53 N

G01N33/543 541Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021523022

(86)(22)【出願日】2019-10-23

(85)【翻訳文提出日】2021-04-22

(86)【国際出願番号】 US2019057568

(87)【国際公開番号】W WO2020086664

(87)【国際公開日】2020-04-30

(31)【優先権主張番号】62/749,776

(32)【優先日】2018-10-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】502431489

【氏名又は名称】オラシュアテクノロジーズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リード、マイケル

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィス、マンリ

(72)【発明者】

【氏名】ギロン、ジェラルディン

(72)【発明者】

【氏名】フィスクル、マーク

(57)【要約】

急性免疫応答に関連する抗体クラスの検出のためのラテラルフローアッセイ方法、ラテラルフローアッセイ試験ストリップ、およびデバイスが開示される。本発明は概して、アッセイ方法、特に、急性感染症に関連する抗体アイソタイプの検出のためのラテラルフローアッセイ方法、および本発明の方法において使用するためのラテラルフローアッセイストリップに関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

急性免疫応答に関連する抗体アイソタイプの検出のためのラテラルフローアッセイ方法であって、
ａ）液体生体試料を標識抗原と接触させて、抗原特異的抗体との複合体を形成するステップと、
ｂ）ステップａ）からの標識抗原－抗体複合体を、第１の捕捉ゾーンにおいて、成熟免疫応答に関連する抗体アイソタイプに特異的に結合する固定化された捕捉試薬で捕捉するステップと、
ｃ）ステップａ）からの標識抗原－抗体複合体を、前記第１の捕捉ゾーンの下流の第２の捕捉ゾーンにおいて、急性免疫応答に関連する抗体アイソタイプに特異的な固定化された捕捉試薬で捕捉するステップと、
ｄ）ステップｃ）からの前記捕捉された複合体を検出するステップと、を含む、上記方法。

【請求項2】

成熟免疫応答に関連する前記抗体アイソタイプが、ＩｇＧであり、急性免疫応答に関連する前記抗体アイソタイプが、ＩｇＭである、請求項１に記載のラテラルフローアッセイ方法。

【請求項3】

前記標識抗原が、標識ウイルス抗原である、請求項１または２に記載のラテラルフローアッセイ方法。

【請求項4】

前記標識ウイルス抗原が、標識ジカウイルス抗原である、請求項３に記載のラテラルフローアッセイ方法。

【請求項5】

前記標識ジカウイルス抗原が、標識ジカＮＳ１ポリペプチドである、請求項４に記載のラテラルフローアッセイ方法。

【請求項6】

前記標識抗原の標識が、コロイド金である、請求項１～５のいずれか一項に記載のラテラルフローアッセイ方法。

【請求項7】

ステップｂ）における前記捕捉試薬が、プロテインＧである、請求項２～６のいずれか一項に記載のラテラルフローアッセイ方法。

【請求項8】

ステップｃ）における前記捕捉試薬が、抗ヒトＩｇＭ抗体、またはその断片である、請求項２～７のいずれか一項に記載のラテラルフローアッセイ方法。

【請求項9】

前記液体生体試料を前記標識抗原と接触させる前に、前記液体生体試料を、前記標識抗原と交差反応する抗体に結合させるための少なくとも１つの他の抗原と接触させるステップをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のラテラルフローアッセイ方法。

【請求項10】

前記標識抗原が、標識ジカＮＳ１ポリペプチドであり、前記少なくとも１つの他の抗原が、デングＮＳ１ポリペプチドである、請求項９に記載のラテラルフローアッセイ方法。

【請求項11】

急性感染症に関連する抗体アイソタイプの検出のためのラテラルフローアッセイストリップであって、
ａ）生体試料の試料受容区域と、
ｂ）前記試料受容区域の下流にあるブロッカ―区域と、
ｃ）前記生体試料中の抗体に特異的に結合する標識抗原を含有する、前記ブロッカ―区域から下流の前記ラテラルフローアッセイ試験ストリップ上のコンジュゲート区域と、
ｄ）成熟免疫応答に関連する抗体アイソタイプを特異的に捕捉するための捕捉試薬を含有する、前記コンジュゲート区域から下流の前記ラテラルフローアッセイ試験ストリップ上の第１の捕捉ゾーンと、
ｅ）急性免疫応答に関連する抗体アイソタイプを特異的に捕捉するための捕捉試薬を含有する、前記コンジュゲート区域から下流の前記ラテラルフローアッセイ試験ストリップ上の第２の捕捉ゾーンと、
ｆ）任意選択的に、アッセイの完了を示すための、前記第２の捕捉ゾーンから下流の前記ラテラルフローアッセイ試験ストリップ上の対照ゾーンと、
ｇ）任意選択的に、前記ラテラルフローアッセイ試験ストリップと流れ連通しており、前記第２の捕捉ゾーンおよび任意選択的な対照ゾーンから下流に位置する、吸収パッドと、を含む、ラテラルフローアッセイストリップ。

【請求項12】

成熟免疫応答に関連する前記抗体アイソタイプが、ＩｇＧであり、急性免疫応答に関連する前記抗体アイソタイプが、ＩｇＭである、請求項１１に記載のラテラルフローアッセイストリップ。

【請求項13】

前記標識抗原が、標識ウイルス抗原である、請求項１１または１２に記載のラテラルフローアッセイストリップ。

【請求項14】

前記標識ウイルス抗原が、標識ジカウイルス抗原である、請求項１３に記載のラテラルフローアッセイストリップ。

【請求項15】

前記標識ジカウイルス抗原が、標識ジカＮＳ１ポリペプチドである、請求項１４に記載のラテラルフローアッセイストリップ。

【請求項16】

前記標識抗原の標識が、コロイド金である、請求項１１～１５のいずれか一項に記載のラテラルフローアッセイストリップ。

【請求項17】

前記第１の捕捉ゾーンにおける前記捕捉試薬が、プロテインＧである、請求項１２～１６のいずれか一項に記載のラテラルフローアッセイストリップ。

【請求項18】

前記第１の捕捉ゾーンにおける前記捕捉試薬が、抗ヒトＩｇＭ抗体、またはその断片である、請求項１７に記載のラテラルフローアッセイストリップ。

【請求項19】

前記ブロッカ―区域が、前記標識抗原と交差反応する抗体を結合させるための少なくとも１つの他の抗原を含む、請求項１１～１８のいずれか一項に記載のラテラルフローアッセイストリップ。

【請求項20】

前記標識抗原が、標識ジカＮＳ１ポリペプチドであり、前記少なくとも１つの他の抗原が、デングＮＳ１ポリペプチドである、請求項１９に記載のラテラルフローアッセイストリップ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月２４日に出願された米国特許出願第６２／７４９，７７６号に対する優先権を主張するものであり、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、ラテラルフロー技術による急性免疫応答に関連する抗体クラスの検出のための診断方法およびデバイスに関する。

【背景技術】

【0003】

急性免疫応答は、感染症から癌、組織傷害に及ぶ多くの状態を示し得る。これらの応答が、差異的免疫グロブリンＦｃクラスまたはアイソタイプ検出（例えば、ＩｇＧ対ＩｇＭクラス）によって判定されるとき、あるアイソタイプとアッセイ成分との相互作用が、アッセイ成分との別のアイソタイプとの相互作用を妨害しないことが重要である。これは、一方のアイソタイプが他方のアイソタイプを超過し、かつ／またはアッセイ成分に対してより高い親和性を有する場合、または試薬が反応性抗体アイソタイプを区別できない場合、特にリスクになる。例えば、ジカ等のウイルスに対する免疫応答を試験する場合、成熟免疫応答のＩｇＧ抗体の存在ではなく、急性、最近の曝露または感染に関連するＩｇＭ抗体を検出することが望ましい。

【0004】

イムノアッセイは、抗体試薬または標的の特異性および選択性に基づいて、生物学的に関心のある分子を定量化するために使用される。臨床現場即時検査の場合、イムノアッセイは、しばしばラテラルフローアッセイ形式で使用される。例えば、米国特許第８，０６２，９０８号、米国特許第７，５４１，１９４号、米国特許第７，１９２，５５５号、および米国特許第６，３０３，０８１号を参照されたい。しかしながら、急性感染症を識別するための診断ツールはほとんどない。

【0005】

ＩｇＭ抗体は、多くの場合、感染症に対する急性免疫応答を示す。ＩｇＭ抗体は、典型的には、抗原への初期曝露に応答して免疫系によって産生される抗体の第１のアイソタイプであるため、抗原特異的ＩｇＭを検出するイムノアッセイは、一次感染の後の最初の数日間に産生される抗体を検出し、数ヶ月間持続するため、急性感染症の識別に有用である。特定の抗原に対する免疫応答が成熟すると、構造的に異なるＦｃ領域（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）を有する他のアイソタイプへの切り替えが発生し、混合クラス応答を引き起こす。いくつかの感染症では、宿主Ｂ細胞が、ＩｇＭアイソタイプの産生を完全に停止するように進むことさえできる。抗体のＮ末端の配列およびフォールディングは、結合特異性を決定し、複数の遺伝子カセットから形成され、免疫応答中にＡＩＤ依存性プロセスで獲得された体細胞変異によって微調整される。このプロセス中、いくつかのＢ細胞はまた、同じＡＩＤ酵素を使用して、単一の遺伝子（エクソン）中にＩｇＭ Ｆｃ定常領域を含有する可変領域の末端の下流（３’）に介在するＤＮＡをループアウトし、それを切断し、「下流アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１等）」に再ライゲーションする。これは所与のＢ細胞におけるＤＮＡレベルでの永続的な変化であり、ＩｇＭを再び作製することはできない。したがって、持続感染における追加の時間は、ＩｇＭ以外のアイソタイプの、特定の抗体のより高い濃度およびより高い親和性抗体のより多い集団を含む、応答の成熟を可能にする。

【0006】

ＩｇＭ等の所与の試料から特定のクラスの抗体を検出するために、ＩｇＧ等の他のより高い存在量またはより高い親和性の抗体クラスの存在によって引き起こされる干渉を除去することが必要であることもある。これらのＦｃ抗体クラスまたはアイソタイプは、それらが当該技術分野で既知のものに呼び出されるとき、アッセイ成分に優先的に結合し、ＩｇＭ等の目的とする抗体の検出を妨げる。したがって、別のクラスの抗体の検出を可能にするために、１つまたは複数のクラスの抗体から干渉を排除するアッセイ試験設計の必要性である。

【0007】

ある場合には、ラテラルフローアッセイはまた、偽陽性結果をもたらし得る交差反応抗体に関連する問題に悩まされる可能性がある。例えば、ジカウイルスとデングウイルスは近縁のフラビウイルスである。ジカおよびデングウイルスの非構造タンパク質１（ＮＳ１）は、高い相同性を示す。デングのＮＳ１タンパク質に対する抗体はまた、ジカ由来のＮＳ１を認識する可能性があり、逆もまた同様である。したがって、交差反応抗体とは別に、試料中の目的の標的に対する抗体アイソタイプを差異的に検出する必要性も存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は概して、アッセイ方法、特に、急性感染症に関連する抗体アイソタイプの検出のためのラテラルフローアッセイ方法、ならびに本発明の方法において使用するためのラテラルフローアッセイストリップに関する。本発明によるアッセイ方法において、抗体アイソタイプの検出は、標的抗体に特異的な標識抗原を使用することによって達成される。本発明のラテラルフローアッセイ方法は、
ａ）液体生体試料を標識抗原と接触させて、抗原特異的抗体との複合体を形成し、
ｂ）ステップａ）からの標識抗原－抗体複合体を、第１の捕捉ゾーンにおいて成熟免疫応答に関連する抗体アイソタイプに特異的に結合する固定化された捕捉試薬で捕捉し、
ｃ）ステップａ）からの標識抗原－抗体複合体を、第１の捕捉ゾーンの下流の第２の捕捉ゾーンにおいて急性免疫応答に関連する抗体アイソタイプに特異的な固定化された捕捉試薬で捕捉し、
ｄ）ステップｃ）からの捕捉された複合体を検出する。

【0009】

本発明のいくつかの方法はまた、標識抗原への交差反応性抗体の結合の低減も提供する。かかる方法は、例えば、液体生体試料を標識抗原と接触させる前に、液体生体試料を、標識抗原と交差反応する抗体を結合させるための少なくとも１つの他の抗原と接触させる、追加のステップを含む。

【0010】

本発明によるラテラルフローアッセイ試験ストリップは、特定の抗原に結合する液体生体試料中の少なくとも２つの異なるアイソタイプを区別するように設計される。本発明によるラテラルフローアッセイ試験ストリップは、それぞれの捕捉ゾーンでアイソタイプ特異的捕捉試薬でコーティングされる。本発明によるラテラルフローアッセイ試験ストリップは、
ａ）生体試料の試料受容区域と、
ｂ）試料受容区域の下流にあるブロッカ―区域と、
ｃ）生体試料中の抗体に特異的に結合する標識抗原を含有する、ブロッカ―区域から下流のラテラルフローアッセイ試験ストリップ上のコンジュゲート区域と、
ｄ）成熟免疫応答に関連する抗体アイソタイプを特異的に捕捉するための捕捉試薬を含有する、コンジュゲート区域から下流のラテラルフローアッセイ試験ストリップ上の第１の捕捉ゾーンと、
ｅ）急性免疫応答に関連する抗体アイソタイプを特異的に捕捉するための捕捉試薬を含有する、コンジュゲート区域から下流のラテラルフローアッセイ試験ストリップ上の第２の捕捉ゾーンと、
ｆ）任意選択的に、アッセイの完了を示すための、第２の捕捉ゾーンから下流のラテラルフローアッセイ試験ストリップ上の対照ゾーンと、
ｇ）任意選択的に、ラテラルフローアッセイ試験ストリップと流れ連通（ｆｌｏｗ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）しており、第２の捕捉ゾーンおよび任意選択的な対照ゾーンから下流に位置する吸収パッドと、を含む。

【0011】

本発明のいくつかのラテラルフローアッセイストリップはまた、交差反応性抗体が標識抗原に結合するのを低減するように構成される。かかるラテラルフローアッセイストリップは、標識抗原と交差反応する抗体に結合するための少なくとも１つの他の抗原を含むブロッカ―区域を含み得る。

【0012】

本発明はまた、ラテラルフローアッセイデバイスに関する。本発明によるラテラルフローアッセイデバイスは、本発明によるラテラルフローストリップを収容するアッセイ部分と、試験ゾーンおよび任意選択的な対照ゾーンを表示するための開口部と，を備える。本発明はまた、本発明のラテラルフローアッセイストリップと展開剤溶液とを含むラテラルフローアッセイキットに関する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】本発明によるラテラルフローアッセイ試験ストリップ［１００］の代表的な概略図を示す。試料を試料受容区域［１０１］に適用した後、試料は、矢印によって示される方向で試験ストリップ［１００］を横切って移動し、ブロッカ―区域［１０２］、生体試料中の抗体が標識抗原に結合するコンジュゲート区域［１０３］を横切って流れ、その後、抗体アイソタイプによって標識複合体を捕捉する第１の捕捉ゾーン［１０４］に流れ、続いて急性感染症抗体アイソタイプで標識複合体を捕捉する第２の捕捉ゾーン［１０５］に流れ、続いて、捕捉されていない標識抗原を収集するための対照ゾーン［１０６］に流れ、最終的に吸収パッド［１０７］に到達する。

【図2】本発明による、感染症、例えば、ジカ感染症の検出のためのラテラルフローデバイスを例示する。ラテラルフローデバイス［２００］は、試料ポート［２０２］を有するハウジング［２０１］を有する。示されるように、ラテラルフロー試験デバイス［２００］はまた、試料受容区域に液体生体物質を送達するためのウィック（ｗｉｃｋ）として機能し得るフラットパッド［２０３］として本明細書に示される追加の試料適用部材を含んでもよい。デバイス［２００］は、フラットパッド［２０３］と流れ連通している図１のラテラルフローアッセイ試験ストリップ［１００］を含む。試料がラテラルフローアッセイストリップ上に移動すると、標識複合体の存在がＩｇＭ捕捉ラインで可視化され得る（ハウジングにＴと標識される［２０１］）。アッセイの完了は、対照ラインで示される（ハウジングにＣと標識される［２０１］）。流れの方向は矢印で示される。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明は、急性感染症に関連する抗体アイソタイプの検出のためのラテラルフローアッセイ方法に関する。本発明のラテラルフローアッセイ方法は、ａ）液体生体試料を標識化抗原と接触させて、抗原特異的抗体との複合体を形成し、ｂ）ステップａ）からの標識抗原－抗体複合体を、第１の捕捉ゾーンにおいて成熟免疫応答に関連する抗体アイソタイプに特異的に結合する固定化された捕捉試薬で捕捉し、ｃ）ステップａ）からの標識抗原－抗体複合体を、第１の捕捉ゾーンの下流の第２の捕捉ゾーンにおいて急性免疫応答に関連する抗体アイソタイプに特異的な固定化された捕捉試薬で捕捉し、ｄ）ステップｃ）からの捕捉された複合体を検出する。

【0015】

本発明の方法、アッセイストリップおよびデバイスは、早期治療が必要とされる感染の早期検出に特に有用である。本発明のアッセイ方法は、アイソタイプに従って、特定の疾患抗原に結合する少なくとも２つの異なる抗体を区別することによって、早期感染を特定し、疾患の過去の感染と区別することができる。本発明のいくつかのアッセイ方法については、急性応答に関連するアイソタイプを検出するために、成熟応答に関連するアイソタイプの生体試料を最初に枯渇させることが有利である。

【0016】

急性期が患者もしくは集団の安全性を向上させるための介入の機会を与える疾患、またはあるクラスの抗体の枯渇が特定のアッセイ形式で感度を高める可能性がある試料型において特に興味深い。かかる疾患としては、例えば、アルボウイルス神経疾患（例えば、ＷＮＶ、ＥＥＥウイルス、およびＳＬＥウイルス感染症）、アルボウイルス発疹病（例えば、デングウイルス、ＣＨＩＫウイルス、およびジカウイルス感染症）、ＣＭＶおよびＥＢＶ感染性単核球症、ハンタウイルス肺症候群、Ａ型、Ｂ型、およびＥ型肝炎ウイルス感染症、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２感染症、麻疹、風疹、流行性耳下腺炎、パルボウイルスＢ１９伝染性紅斑、ヘリコバクターピロリ感染症、ボレリアブルグドルフェリ感染症、ＨＣＶ、ならびに他のウイルス感染症が挙げられる。例えば、Ｌａｎｄｒｙ，Ｃｌｉｎ．ａｎｄ Ｖａｃｃ．Ｉｍｍｕｎ．Ｖｏｌ．２３，ｐｐ．５４０－４５，２０１６を参照されたい。例えば、ＩｇＭクラス抗麻疹抗体の存在は、急性麻疹感染を示し、ＩｇＧクラス抗麻疹抗体の存在は、麻疹に対する以前の曝露および免疫を示す。ＩｇＭ抗体の存在はまた、急性Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）感染の指標である。ＨＡＶ特異的ＩｇＭ抗体は、感染の４週間～６ヶ月後の血清中で検出可能である。ジカウイルスに関して以下の実施例が記載されているが、本発明のアッセイ方法は、特定の疾患抗原に結合するアイソタイプによる少なくとも２つの異なる抗体の区別が、任意の感染症の識別、判定、および／もしくは治療を補助するか、または識別、判定、および／もしくは治療のために必要とされる場合に使用され得る。

【0017】

当該技術分野で知られているように、抗体は、１つもしくは複数の免疫グロブリン遺伝子、またはそれらの断片によって実質的にコードされる、ヘテロ二量体糖タンパク質ポリペプチドまたはポリペプチドの複合体を指す。認識される免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、それぞれ免疫グロブリンクラス（アイソタイプ）、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを定義する、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類される。重鎖の定常ドメインが抗体のＦｃ領域を構成する。抗体のＦｃ部分は、抗体クラスを決定する。２つの異なる抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＭおよびＩｇＧは、同じ抗原に特異的に結合することを可能にする抗体のＮ末端可変領域において類似性を共有し得るが、異なるエフェクター機能および配列を有する下流定常領域において異なる。

【0018】

典型的には、抗体は、その表面上または空洞内に、別の分子の特定の空間的および極性構成に特異的に結合し、それによって相補的であると定義される区域を有する免疫グロブリンである。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。抗体は、完全免疫グロブリンまたはその断片を含んでもよい。その断片は、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’等を含み得る。抗体は、組換え方法によって作製されるキメラ抗体またはその断片を含んでもよい。

【0019】

抗原は、目的の抗体に特異的に結合することができる任意の化合物である。抗原と抗体との間の特異的結合は、２つの分子が、互いに結合することが、抗原と非特異的抗体との間の結合、または抗体と異なる抗原との間の結合に対する識別が可能であるように関連していることを意味する。結合は、化学的または物理的手段を介してもよい。分子は、分子の集合体に特異的に結合してもよく、例えば、二次抗体およびその対応する抗原の免疫複合体に対して産生された抗体は、免疫複合体の特異的結合パートナーであるとみなされてもよい。

【0020】

本発明のアッセイ方法は、ラテラルフローアッセイストリップ上で実行される。本方法は、ラテラルフローアッセイストリップを展開剤溶液と接触させることをさらに含む。接触すると、展開剤溶液はラテラルフローアッセイストリップを横切って移動する。本発明の方法では、液体生体試料を展開剤溶液中に配置し、得られた生体試料を含む展開剤溶液は、アッセイストリップを横切ってラテラルフローアッセイストリップ上の下流の地点に移動する。本発明の別の方法において、液体生体試料は、ラテラルフローアッセイストリップの試料受容区域上に配置され、展開剤溶液は、ラテラルフローアッセイストリップに接触して、試料受容区域から下流の地点までアッセイストリップを横切る生体試料の流れを促進する。

【0021】

本発明のアッセイ方法を使用して分析するために採取される液体生体試料は、目的とする抗体を含有し得る生体流体等、任意の液体生体試料であり得る。生体流体の例としては、限定されないが、尿、血液、血漿、血清、口腔液、汗、精液、便、痰、脳脊髄液、涙液、粘液、羊水、母乳等が挙げられる。口腔液は、口腔内に存在する液体である。口腔液は唾液と口腔粘膜浸出液の混合物である。唾液は唾液腺によって生成される。口腔粘膜浸出液は、毛細血管から頬粘膜を横断することによって口に入る。口腔液は病原体と抗体の両方を含有する。口腔液、全血、血漿、および血清等の生体流体試料は、本発明のアッセイで使用可能な好ましいタイプの試料である。これらのそれぞれは、当該技術分野で既知の手段および技法を使用して取得され得る。

【0022】

ジカウイルスからの感染等のウイルス感染は、臨床徴候および症状ならびに／または疫学的危険因子を有する患者由来の全血（静脈または指先）、血清および血漿、口腔液（例えば、唾液および口腔粘膜浸出液）、尿、精液、ならびに母乳等の液体生体試料を含み得る複数のマトリックスにおいて検出することができる。口腔液の迅速な収集およびアッセイのための方法は、米国特許第８，０６２，９０８号に開示されている。全血を測定することを対象とする本発明の方法では、医療従事者によって適切な体積の血液がデバイス上に配置される。使用する液体生体試料の量は、液体生体試料およびアッセイ形式に基づいて変化することができる。

【0023】

液体生体試料を標識抗原と接触させるステップは、液相で生じる。本発明の１つの方法によれば、液体生体試料および標識抗原を、コンジュゲートパッド上またはラテラルフローアッセイ試験ストリップ上のコンジュゲート区域上の溶液中で接触させる。本発明の方法では、以下に記載される展開剤溶液が使用され、アッセイストリップ上への試料の移行を促進する。液体生体試料を、コンジュゲート区域でのアッセイストリップ上の溶液中の標識抗原と接触させて配置する。本発明の方法では、コンジュゲート区域を標識抗原と共にインキュベートして乾燥させ、展開剤溶液がコンジュゲート区域に到達すると、標識抗原をコンジュゲート区域のマトリックスから溶出させ、生体試料中に存在する抗原特異的抗体への結合のために利用可能になる。本発明の別の方法によれば、液体生体試料および標識抗原を溶液中で接触させてから、ラテラルフローアッセイ試験ストリップに配置する。

【0024】

生体試料中に存在する抗体は、標識抗原を使用して検出することができる。標識抗原を使用する場合、標識複合体は、標識抗原に結合する抗体によって形成される。標識抗体を形成するための結合反応は、上述のように、特異的結合抗体－抗原相互作用を使用する。下流捕捉ゾーンにおける抗体の存在は、視覚的または機器による検出を通じて標識の存在を検出することによって検出することができる。

【0025】

標識は、それ自体が可視であるか、または視覚的もしくは機器的手段によって検出可能なシグナルを生成することができる任意の物質であり得る。特定の標識の選択は、本発明にとって重要ではないが、標識は、単独で検出可能なシグナルを生成することができるか、または機器的に検出可能であるか、または酵素／基質シグナル生成システム等の１つ以上の追加のシグナル生成構成要素と組み合わせて検出可能であるべきである。

【0026】

当該技術分野で既知であるように、標識の種類の選択は、検出される分析物および所望の検出手段を考慮することを伴う。検出可能な標識の検出は、選択された部分または試薬に依存し、例えば、目視検査、紫外線および可視分光光度測定、蛍光光度法、放射能計数等の最先端の既知の方法のいずれかによって行うことができる。好ましい実施形態では、金粒子を検出可能な標識として使用する場合、目視検査によって、アッセイの結果を取得し、分析する。当該技術分野で既知であり、本発明の方法での使用に好適な様々な標識には、それ自体が可視であるか、または化学的もしくは物理的手段のいずれかを介してシグナルを生成する標識が含まれる。そのような標識には、酵素および基質、発色原、触媒、蛍光化合物、化学発光化合物、分子ビーコン、カーボンブラック、ポリスチレンビーズ、および放射性標識が含まれ得る。当該技術分野で既知の他の好適な標識としては、コロイド金などのコロイド金属粒子、セレンまたはテルリウムなどのコロイド非金属粒子、染色プラスチックまたは染色微生物などの染色粒子または着色粒子、有機ポリマーラテックス粒子およびリポソーム、着色ビーズ、ポリマーマイクロカプセル、嚢、赤血球、赤血球ゴースト、または直接的に可視物質を含有する他の小胞などの粒子標識が挙げられる。米国特許第４，３１３，７３４号は、抗体の標識としての金ゾルの使用を記載している。典型的には、視覚的に検出可能な標識が使用される。これにより、試験ゾーンで追加のシグナル生成構成要素を必要とせずに、試料中の分析物の存在または量を直接視覚的または器具的に読み取ることが可能になる。ポリペプチドなどの抗原に標識を付加する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．，２０１３を参照されたい。

【0027】

本発明による好ましいアッセイ方法では、検出可能な標識は、金微粒子または金ナノ粒子などの金属コロイド粒子であり、これは、ヒトの目ならびに機器による読み取りによって見ることができる。本発明のアッセイ方法では、検出可能な標識として使用されるコロイド粒子は、２０ｎｍ～８０ｎｍの粒径を有する。機器読み取りアッセイの場合、粒子の濃度は、分光光度計を使用して、特定の波長で光学密度（ＯＤ）を測定することによって測定される。次いで、ＯＤを標識抗原の総量の尺度として使用する。本発明によるアッセイ方法では、標識抗原の量は、完全な標識を可能にするために検出される抗体を超えることが好ましい。

【0028】

本発明によるアッセイ方法では、標識抗原は、任意の標識ウイルス抗原であってもよい。本発明の方法では、標識ウイルス抗原は、少なくとも２つの異なるアイソタイプ、すなわち、急性免疫応答に関連するアイソタイプ、および急性免疫応答に関連するアイソタイプの抗体を認識する。本発明のラテラルフローアッセイ方法では、ウイルス抗原はジカウイルス抗原である。本発明による好ましい方法では、ジカウイルス抗原は、ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体に結合することができるＮＳ１ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントである。本発明によるアッセイ方法では、標識抗原は、ジカＮＳ１ポリペプチドをコロイド金とコンジュゲートすることによって形成されるジカＮＳ１金コンジュゲートである。かかるラテラルフローアッセイ方法では、成熟免疫応答に関連するアイソタイプの抗体は、抗ジカ－ＮＳ１ ＩｇＧであり、急性免疫応答に関連する抗体は、抗ジカ－ＮＳ１ ＩｇＭである。

【0029】

捕捉試薬は、特定のクラスの抗体に特異的に結合するが、別のクラスの抗体には結合しない試薬である。重鎖の定常ドメインが抗体のＦｃ領域を構成する。抗体のＦｃ部分は、抗体クラスを決定する。したがって、特定のアイソタイプのための捕捉試薬は、Ｆｃ領域を特異的に認識する。捕捉試薬は、抗体もしくはタンパク質、もしくはアプタマー、または抗体のアイソタイプもしくはクラスを認識する他の特異的親和性試薬であってもよい。例えば、当該技術分野で知られているように、プロテインＧは、ヒトＩｇＧのすべてのサブクラスに結合するが、ヒトＩｇＭには結合しない。プロテインＡは、ＩｇＧの特定のサブクラス、ならびに他のクラスの抗体のみに結合する。あるクラスの抗体に特異的な抗体も、捕捉試薬として使用され得る。例えば、抗ＩｇＭ抗体、またはその断片を、ＩｇＭを捕捉するために使用してもよい。

【0030】

捕捉試薬は、表面上の特定の領域で固定されて、特定のクラスの抗体の捕捉ゾーンを形成し得る。例えば、捕捉試薬は、ラテラルフローアッセイ試験ストリップ上の特定の領域、区域、ゾーン、またはライン上に固定化され得る。捕捉試薬は、当該技術分野で既知の技法を使用して、ラテラルフローアッセイストリップの捕捉ゾーン上に固定化され得る。

【0031】

本発明によるアッセイ方法では、成熟免疫応答に関連する抗体アイソタイプは、ＩｇＧであり、急性免疫応答に関連する抗体アイソタイプは、ＩｇＭである。両方の抗体アイソタイプは、同じ標識抗原に結合する。抗体アイソタイプは、抗原に対して異なる親和性を有し得、液体生体試料中で異なるレベルで発現され得る。本発明によるラテラルフローアッセイ方法では、成熟免疫応答に関連する抗体アイソタイプを捕捉するステップは、急性免疫応答に関連する抗体アイソタイプを捕捉するステップの前に生じる。したがって、本発明の方法において、使用されるラテラルフローアッセイストリップは、成熟免疫応答抗体アイソタイプ捕捉ゾーンが急性免疫応答抗体アイソタイプ捕捉ゾーンの上流にあるように構成される。

【0032】

本発明によるアッセイ方法は、生体試料からのジカＩｇＭ抗体の検出のために実行される。このような方法では、まず生体試料からＩｇＧを捕捉する。プロテインＧをニトロセルロース膜上に固定化して、ＩｇＭ捕捉ラインの上流にヒトＩｇＧを捕捉する。プロテインＧは、ヒトＩｇＧサブクラス１～４と高親和性を示すが、ヒトＩｇＭとは親和性を示さない。加えて、プロテインＧラインは、抗ジカＮＳ１ ＩｇＧ抗体の検出を可能にし、試料中に存在するＩｇＧの量をデバイスを通過する際、および試料がＩｇＭ検出ラインを通過する前に低減させる。このＩｇＧ捕捉ラインは、デバイスのＩｇＭ感度に必要である。

【0033】

抗ジカＩｇＭの検出のための本発明による好ましいラテラルフローアッセイ方法は、
ａ）液体生体試料をジカＮＳ１金コンジュゲートと接触させて、標識ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体複合体を形成するステップと、
ｂ）標識ＩｇＧ抗体をプロテインＧと反応させて、標識ＩｇＧ抗体を捕捉するステップと、
ｃ）ＩｇＧ捕捉ゾーンの下流で標識ＩｇＭを抗ＩｇＭ抗体と反応させて、標識ＩｇＭを捕捉するステップと、
ｄ）捕捉されたＩｇＭを検出するステップと、を含む。

【0034】

本発明による１つのアッセイ方法において、液体生体試料は、本発明のラテラルフローアッセイ試験ストリップを通って流れ、液体生体試料からの抗ジカＩｇＧおよびＩｇＭ抗体は、コンジュゲートパッドからの比色ジカＮＳ１金コンジュゲートに接触し、液体生体試料が抗ジカＮＳ１ ＩｇＧ抗体を含有する場合、標識複合体および非標識抗ジカＮＳ１ ＩｇＧ抗体は、第１の捕捉ゾーン［１０４］でプロテインＧに結合し、第１の捕捉ジーンで赤紫色のラインを生じ、液体生体試料が抗ジカＩｇＧ抗体を含有しない場合、色は観察されない。同様に、液体生体試料が抗ジカＮＳ１ ＩｇＭ抗体を含有する場合、標識複合体および非標識抗ジカＮＳ１ ＩｇＭ抗体は、第２の捕捉ゾーン［１０５］（または図２に示すように試験ライン（Ｔ））で抗ＩｇＭ抗体に結合し、赤紫色のラインを生じ、液体生体試料が抗ジカＩｇＭ抗体を含有しない場合、色は観察されない。いずれかの捕捉ゾーンに結合していないジカＮＳ１金コンジュゲートは、ニトロセルロースを対照ゾーン対照（または図２に示すように対照ライン（Ｃ））まで移動する。

【0035】

本発明のいくつかの方法は、交差反応性抗体に起因する偽陽性を低減することをさらに対象とする。かかる方法は、液体生体試料を標識抗原と接触させる前に、液体生体試料を、交差反応性抗体に結合するための少なくとも１つの他の抗原と接触させる、追加のステップを含む。抗原間の交差反応性は、ある特定の抗原に対する抗体が別の異なる抗原と結合する場合に生じる。２つの抗原は類似したエピトープを有し、これにより、１つの抗原に対する抗体が他方の抗原を認識することが可能になる。交差反応性抗体は、調査される感染症の抗原と交差反応する、調査される感染症の抗体以外の抗体である。本発明の一方法において、少なくとも他の抗原は、ラテラルフローストリップのブロッカ―区域上に存在する。本発明の別の方法では、少なくとも他の抗原を展開剤溶液に添加する。本発明の他の方法では、少なくとも１つの他の抗原を標識抗原と同時に生体試料と接触させるか、または生体試料を標識抗原と接触させた後、標識抗原－抗体複合体を捕捉するステップの前に添加する。

【0036】

本発明の方法において、標識抗原は標識ジカＮＳ１ポリペプチドであり、少なくとも１つの他の抗原はデングＮＳ１ポリペプチドである。抗ジカＩｇＭの検出のための本発明の方法であって、本発明の方法は以下のステップは、
ａ）液体生体試料をデングＮＳ１ポリペプチドと接触させるステップと、
ｂ）液体生体試料をジカＮＳ１金コンジュゲートと接触させて、標識ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体複合体を形成するステップと、
ｃ）標識ＩｇＧ抗体をプロテインＧと反応させて、標識ＩｇＧ抗体を捕捉するステップと、
ｄ）ＩｇＧ捕捉ゾーンの下流で標識ＩｇＭを抗ＩｇＭ抗体と反応させて、標識ＩｇＭを捕捉するステップと、
ｅ）前記捕捉されたＩｇＭを検出するステップと、を含む。

【0037】

上記方法の一実施形態において、デングＮＳ１ポリペプチドが展開剤溶液に添加される。このような方法では、液体生体試料が展開剤溶液に添加されると、試料は、ラテラルフローアッセイストリップ上に流れる前に溶液中のデングＮＳ１ポリペプチドと接触する。別のそのような方法では、液体生体試料が試料ポートに添加されると、試料ポートのラテラルフローアッセイストリップ上の溶液中のデングポリペプチドと試料が接触する。上記方法の別の実施形態では、デングＮＳ１ポリペプチドは、ブロッカ―区域に存在し、生体試料が展開剤溶液と共にブロッカ―区域に移行するとき、デングＮＳ１ポリペプチドが、ブロッカ―区域のマトリックスから溶出され、溶液中の生体試料に接触する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、デングＮＳ１への事前結合は、交差反応性抗デングＮＳ１抗体が後にジカＮＳ１に結合するのをブロックすると考えられる。

【0038】

ラテラルフローアッセイ試験ストリップは、急性感染症を検出するための本発明の方法に有用である。ラテラルフロークロマトグラフィアッセイ、ストリップ、およびデバイスは、当業者に周知であり（例えば、米国特許第５，５６９，６０８号、同第５，１２０，６４３号、同第５，６５６，５０３号、同第４，８５５，２４０号、および同第５，５９１，６４５号、英国特許ＧＢ２２０４３９８Ａ、および欧州特許ＥＰ０３２３６０５Ｂ１を参照されたい）、かかるアッセイは、多数の分析物について小売またはＯＥＭベースで市販されている。

【0039】

図１に示すように、本発明によるラテラルフローアッセイ試験ストリップ［１００］は、ａ）生体試料の試料受容区域［１０１］と、ｂ）試料受容区域の下流のブロッカ―区域［１０２］と、ｃ）生体試料中の抗体に特異的に結合する標識抗原を含有する、ブロッカ―区域から下流のラテラルフローアッセイ試験ストリップ上のコンジュゲート区域［１０３］、ｄ）成熟免疫応答に関連する抗体アイソタイプを特異的に捕捉するための捕捉試薬を含有する、コンジュゲート区域から下流のラテラルフローアッセイ試験ストリップ上の第１の捕捉ゾーンまたは捕捉ライン［１０４］と、ｅ）急性免疫応答に関連する抗体アイソタイプを特異的に捕捉するための捕捉試薬を含有する、コンジュゲート区域から下流のラテラルフローアッセイ試験ストリップ上の第２の捕捉ゾーンまたは捕捉ラインと、ｆ）任意選択的に、アッセイ完了を示すために、第２の捕捉ゾーンから下流のラテラルフローアッセイ試験ストリップ上の対照ゾーンまたは対照ライン［１０６］と、ｇ）任意選択的に、ラテラルフローアッセイ試験ストリップと流れ連通し、第２の捕捉ゾーンおよび任意選択的な対照ゾーンから下流に配置された吸収性パッド［１０７］と、を含む。

【0040】

ラテラルフローアッセイ試験ストリップは、ラテラルフロークロマトグラフィのために利用される試験ストリップを指す。ラテラルフロー（クロマトグラフィ）アッセイは、一般的に、ラテラルフロー（免疫クロマトグラフィ）アッセイストリップの試料受容区域への、検出されるべき分析物を含有することが疑われる液体生体試料の適用を含む。アッセイストリップは、マトリックス材料（例えば、紙、ニトロセルロース等、例えば、米国特許第５，５６９，６０８号を参照されたい）を含み、試験流体およびその中に懸濁もしくは溶解された分析物が、毛細管作用によりそこを通ってサンプル受容区域から１つ以上の捕捉ゾーンに流れることができ、そこで可視シグナルまたはそのようなシグナルの不在が分析物の存在または不在を明らかにする。典型的には、アッセイストリップは、検出可能な標識で修飾される、その特異的結合パートナー（例えば、分析物が抗体である場合、結合パートナーが抗原である）で検出される分析物に特異的に結合するための手段を含むであろう。分析物が液体生体試料中に存在する場合、それは、その標識結合パートナーと組み合わせて複合体を形成し、それがストリップに沿って捕捉ゾーンに流れ、そこで標識抗体が検出される。

【0041】

ラテラルフローアッセイ試験ストリップの試料受容区域は、試料が最初に適用されるラテラルフローアッセイ試験ストリップの区域を指す。試料を受容することに加えて、試料受容区域の機能は、例えば、適用される試料のｐＨ調整／修正および／もしくは比重調整／修正、アッセイにおける非特異的結合を妨害もしくは引き起こし得る試料の成分の除去もしくは変更、または試料フローを試験領域へ向けて制御することを含み得る。例えば、デバイスの収集パッドを使用して、対象の口から口腔液試料を収集し、次いで、展開剤溶液のバイアル中に入れることができる。収集パッドは、ラテラルフローアッセイ試験のために口腔液試料を一緒運ぶ展開剤溶液を毛管作用で吸い上げる（ｗｉｃｋ ｕｐ）。全血、血清または血漿収集の場合、試料は、試料受容区域または収集上に直接ピペットで移され、収集パッドはその後、展開剤バイアル内に配置されて、ラテラルフローアッセイ試験を通って流れ、それによって試料を輸送する。本発明による特定のアッセイ方法では、全血は、試料適用区域に直接適用され、例えば、任意のタイプの事前希釈または治療なしに、指先または静脈穿刺または針から得られた全血の一滴（５μＬ～５０μＬ）である。

【0042】

試料受容区域は、試料パッドであってもよく、液体生体試料を受容し、適用されるときに液体試料を吸収し、液体試料をブロッカ―パッドに通過させることができる任意の材料から作製されてもよい。本発明のアッセイストリップでの使用に好適な試料パッド材料には、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，０７５，０７８号に開示されるそれらの適用パッド材料も含まれる。試料適用区域に好適な材料としては、限定されないが、親水性ポリエチレン材料またはパッド、アクリル繊維、ガラス繊維、濾紙またはパッド、乾燥紙、紙パルプ、布地等が挙げられる。

【0043】

あるいは、図２に示すように、試料受容区域はフラットパッド［２０３］であってもよい。試料受容区域は、追加の試料適用部材（例えば、ウィック）から構成されてもよい。したがって、一態様では、試料受容ゾーンは、試料適用パッドと、試料適用部材とを含むことができる。多くの場合、試料適用部材は、本明細書で企図される様々な流体試料のいずれかを容易に吸収し、物理的形態で頑丈なままである材料から構成される。しばしば、試料適用部材は、白色接着ポリエステル線維などの材料で構成される。さらに、試料適用部材は、存在する場合、試料適用パッドと流体流動接触して配置される。この流体流動接触は、重なり合っている、隣接している、またはインターレースされたタイプの接触を含むことができる。試料適用部材は、親水性仕上げ剤で処理することもできる。多くの場合、試料適用部材は、存在する場合、同様の試薬を含有し得、例示的な試料適用パッドで使用されるものと同様の材料から構成され得る。液体生体試料は、フラットパッド［２０３］に直接適用され得る。例えば、フラットパッド［２０３］を対象の口に挿入し、口腔液の収集パッドとして使用することができる。他の流体、例えば、血液または血清は、フラットパッド［２０３］上に直接置くことができる。液体生体試料はまた、バイアル内の展開剤溶液中で希釈されてもよく、フラットパッド［２０３］がバイアル内に配置されてもよい。

【0044】

本発明のアッセイストリップは、任意選択的にブロッカ―パッドを含むことができる。当該技術分野で既知のように、ブロッカ―パッドは、様々な試料マトリックスに存在する非特異的または干渉物質に対するデバイス内の反応性を最小限に保証する試薬を含有する。ブロッカ―パッドは、ラテラルフローアッセイ試験ストリップの下流への口腔液の流れを妨げない限り、多種多様な材料から構成され得る。そのような材料には、紙、セルロース、ニトロセルロース、ポリエステル、ガラス繊維等が含まれるが、これらに限定されない。材料は、クロマトグラフィ試験ストリップから毛細管マトリックスへの試薬または口腔液の逆流を低減または排除するように選択され得る。緩衝試薬と塩の両方が存在する場合、ブロッカ―パッドに含まれる製剤は、試験ラインにおける最終反応のｐＨおよびイオン強度を調整するのに役立つ。ブロッカ―パッドは、液体生体試料の試料ｐＨが流れるときに、試料ｐＨを調整しおよびラテラルフローアッセイとの適合性のため緩衝液を含浸させることもできる。

【0045】

ブロッカ―パッドはまた、交差反応性を低減し、それによって偽陽性の発生を低減する１つ以上の遮断試薬を含むことができる。本発明の１つのラテラルフローアッセイストリップでは、ブロッカ―区域は、交差反応性抗体に結合するための少なくとも１つの他の抗原を含む。例えば、抗ジカ抗体の検出に使用するための本発明の１つのラテラルフローアッセイストリップにでは、標識抗原は、標識ジカＮＳ１ポリペプチドであり、少なくとも１つの他の抗原は、デングＮＳ１ポリペプチドである。

【0046】

ブロッカ―パッド上の他の例示的な遮断試薬には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、メチル化ＢＳＡ、カゼイン、脱脂粉乳、デオキシコール酸塩、およびｎ－ラウロイルサルコシンが含まれるが、これらに限定されない。遮断溶液はまた、界面活性剤、防腐剤、およびその他の試薬を含有して、試験ストリップを横切る流れを増強し、アッセイ結果を改善し、試料の完全性を保護してもよい。ブロッカ―パッドは、適切な体積の遮断溶液をパッドに適用して乾燥させてから、ラテラルフローアッセイ試験ストリップ上に配置することによって作製される。

【0047】

ラテラルフローアッセイ試験ストリップのコンジュゲート区域またはコンジュゲートパッドは、標識試薬および対照試薬を安定した状態に維持し、液体生体試料内に存在する可能性のある目的の分析物とのそれらの迅速かつ効果的な可溶化、可動化、および特異的反応を促進するのに役立つ。本発明によるラテラルフローアッセイ試験ストリップでは、コンジュゲート区域は、コンジュゲートパッドであり得る。コンジュゲートパッドは、液体生体試料が試験ゾーンまたはラインに移行するためにコンジュゲートパッドを横切るか、またはそれを通過する必要があるように、ラテラルフローアッセイ試験ストリップ上に配置される。あるいは、コンジュゲート区域は、ラテラルフローアッセイ試験ストリップに織り込むことができ、またはラテラルフローアッセイ試験ストリップと同じ場所にインラインで配置することができる。ブロッカ―パッドと同様に、コンジュゲートパッドは、アッセイと適合し、口腔液および試薬の流れを実質的に妨げない任意の好都合な材料（例えば、ニトロセルロース）から作製され得る。本発明による使用に好適な他のコンジュゲートパッド材料には、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，０７５，０７８号に開示されるクロマトグラフィ材料が含まれる。

【0048】

本発明によるラテラルフローアッセイ試験ストリップでは、コンジュゲートパッドは、標識にコンジュゲートされた特定の抗原、ならびに試験ゾーンまたはラインでの抗原の検出を可能にする放出および安定化剤を担持する。コンジュゲートパッドはまた、アッセイデバイス内の非特異的結合事象を抑制することによって、ある程度の制御を提供する。本発明によるラテラルフローアッセイ試験ストリップでは、コンジュゲートパッドは、遮断薬および標識安定化剤を含む抗原標識溶液で処理される。遮断薬には、上記に論じられるものが含まれる。安定化剤は、容易に入手可能であり、当該技術分野で周知であり、例えば、標識試薬を安定化するために使用し得る。

【0049】

本発明によるアッセイストリップは、マトリックス材料（例えば、紙、ニトロセルロース等、例えば、米国特許第５，５６９，６０８号を参照されたい）を含み、試験流体およびその中に懸濁もしくは溶解された分析物が、毛細管作用によりそこを通って流れることができる。マトリックス材料としては、天然、合成、もしくは合成的に改変された天然に存在する材料、例えば多糖類（例えば、酢酸セルロースおよびニトロセルロースなどの紙およびセルロース誘導体などのセルロース材料）、ポリエーテルスルホン、ナイロン、シリカ等、無機材料、例えば非活性化アルミナ、珪藻土、ＭｇＳ０_４等、または多孔質ポリマーマトリックス、例えば塩化ビニル、塩化ビニル－プロピレンコポリマー、および塩化ビニル－酢酸ビニルコポリマー等、の中に均一に分散された他の無機微細物質、ならびに布であって、天然に存在する（例えば、綿）および合成（例えば、レーヨン）の両方のもの、多孔質ゲル、例えばシリカゲル、アガロース、デキストラン、およびゼラチン等、高分子フィルム、例えばポリアクリルアミド等、などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましいアッセイストリップにおいて、マトリックス材料はニトロセルロース膜である。異なるタイプの市販のニトロセルロース膜（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＨＦ９０、ＧＥ ＦＦ１２０、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）は、異なる吸収容量および毛細管流を有する。

【0050】

ラテラルフローアッセイ試験ストリップでは、マトリックス材料を積層裏地（ｌａｍｉｎａｔｅ ｂａｃｋｉｎｇ）に接着させてもよい。裏地は、例えば、マイラーまたはＰＶＣまたはポリストリレン等のプラスチック材料であり得る。アッセイストリップの調製において、マトリックス材料は、当該技術分野で既知の技法を使用して、プラスチックカード上に積層することができる。積層裏地を有するニトロセルロース膜は市販されている。

【0051】

本発明によるアッセイストリップは、２つ以上の捕捉ゾーンを有する。本発明のラテラルフローアッセイストリップでは、捕捉ゾーンは、アイソタイプによって抗体を特異的に捕捉するための固定化された捕捉試薬を含有する。ラテラルフローマトリックス上に捕捉ゾーンを作製するタンパク質固定化のための技法は、当該技術分野で既知である。本発明によるラテラルフローアッセイ試験ストリップでは、ラテラルフローアッセイ試験ストリップ上の第１の捕捉ゾーンは、第１のアイソタイプの抗体を特異的に捕捉するためにコンジュゲート区域から下流にある。第１の捕捉ゾーンは、第２の捕捉ゾーンの上流にある。存在する捕捉ゾーンおよび任意の対照ゾーンは、異なるゾーンを視覚的に区別するために互いに十分に（例えば、約５ｍｍ）分離されるべきである。

【0052】

本発明によるラテラルフローアッセイ試験ストリップでは、成熟免疫応答に関連する抗体は、ＩｇＧであってもよい。ＩｇＧ試験ラインとしても知られるＩｇＧの捕捉ゾーンは、試験した試料中に存在するＩｇＧに結合する。プロテインＧは、ヒトＩｇＧのすべてのサブクラスに結合する。本発明によるラテラルフローアッセイ試験ストリップでは、第１の捕捉ゾーンは、プロテインＧにより縞が付けられたニトロセルロース膜上のゾーンを含む。そのようなラテラルフローアッセイ試験ストリップでは、第１の捕捉ゾーンは、生体試料からＩｇＧ抗体を実質的に枯渇させる役割を果たす。さらなるアイソタイプ検出および／または識別のために、追加の捕捉ゾーンが含まれ得る。

【0053】

本発明によるラテラルフローアッセイ試験ストリップでは、ラテラルフローアッセイ試験ストリップ上の第２の捕捉ゾーンは、第１の捕捉ゾーンから下流に配置される。本発明によるラテラルフローアッセイ試験ストリップでは、急性免疫応答に関連する抗体アイソタイプは、ＩｇＭであり得る。ＩｇＭ試験ラインとしても知られるＩｇＭの捕捉ゾーンは、試験した試料中に存在するＩｇＭに結合する。本発明によるラテラルフローアッセイ試験ストリップでは、第２の捕捉ゾーンは、抗ＩｇＭ抗体により縞が付けられたニトロセルロース膜上のゾーンを含む。

【0054】

任意選択的な対照ゾーン、または対照ライン（Ｃ）は、過剰な抗原標識を捕捉する、標識抗原に特異的な抗体を含有し、液体がデバイスを通って適切に移動したことを示している。試料が感染症に対して反応性であるか非反応性であるかにかかわらず、すべての有効な試験の実行中にＣラインに赤紫色のラインが表示される。抗ジカＩｇＭの検出のための本発明によるラテラルフローアッセイ試験ストリップでは、対照ゾーンは、抗ＮＳ１抗体により縞が付けられたニトロセルロース膜を含み得る。例えば、抗ジカ抗体の検出のためのイムノアッセイ試験ストリップでは、対照ゾーンは、ニトロセルロース膜上に固定化された抗ＮＳ１抗体を含有し、コロイド金標識ジカＮＳ１抗原の可視化を使用して、成分溶出、試薬活性、および適切なデバイス性能を確認する。

【0055】

過剰な試薬は、対照（Ｃ）ラインを経て、過剰なデバイス流体のリザーバとして機能する、吸収パッド［１０７］に移行する。吸収パッドは、ラテラルフローアッセイ試験デバイスでは、対照ラインの下流に存在し得る。膜からの流体（未結合複合体および未反応試薬を含有する）は、吸収パッドに移動する。吸収パッドは、デバイス流体のエンドリザーバとしての役割を果たすだけでなく、ラテラルフローアッセイ試験ストリップの全体にわたって流体を引き出す。吸収パッドは、アッセイストリップ上流で液体が逆流するのを防止するのに十分なウィッキング特性（ｗｉｃｋｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）を有する必要がある。吸収性パッドは、当該技術分野で既知の材料で作製され得る。

【0056】

抗ジカＩｇＭの検出のための本発明のラテラルフローアッセイストリップは、試料受容区域、試料受容区域の下流に、任意選択的にデングＮＳ１ポリペプチドを含有するブロッカ―区域、コロイド金標識ジカＮＳ１ポリペプチドを含有するブロッカ―区域の下流にコンジュゲート区域、固定化プロテインＧを含有するコンジュゲート区域の下流に第１の捕捉ゾーン、固定化抗ＩｇＭ抗体を含有する第１の捕捉ゾーンの下流に第２の捕捉ゾーン、および任意選択的に第２の捕捉ゾーンの下流に対照ラインを含むように構成される。

【0057】

本発明によるアッセイ試験ストリップは、当該技術分野で既知の技法を使用して調製および組み立てられ得る。本発明によるアッセイ試験ストリップは、ハウジング内にあってもよい。本発明によるアッセイデバイスは、試験される液体生体試料を適用するための試料ポート、ならびに１つ以上の捕捉ゾーンおよび対照ゾーンを表示するための開口部または窓を有するハウジングを備える。例えば、ハウジングは、第２の捕捉ゾーンおよび対照ゾーンのみを表示するための開口部を有し得る。

【0058】

本発明によるアッセイ方法およびデバイスは、展開剤溶液をさらに使用し得る。展開剤溶液は、液体生体試料のデバイス内およびアッセイストリップ上への毛細管流を容易にする。展開剤溶液は、典型的には、当該技術分野で既知であるように、界面活性剤、塩、防腐剤、緩衝剤等の水溶液である。使用される展開剤溶液の量は、試料を輸送するのに十分であるべきであるが、アッセイを圧倒する、または結果を希釈して結果を判定することができないほどであるべきではない。

【0059】

本発明はまた、本明細書に記載のアッセイデバイスのうちの１つ以上を含むアッセイキットおよびこのキットの使用方法も提供する。キットは、任意選択的に、本発明の方法の実施に有用な緩衝液、試薬、検出試薬等のうちのいずれかを含有し得る。本発明によるアッセイキットは、本発明によるアッセイデバイスと、デバイスと共に使用するための展開剤溶液の事前測定バイアルと、を含む。

【0060】

本発明によるジカ感染症のための好ましいアッセイ方法では、図２に示すように、生体液体試料をデバイスの頚部の試料ポートに直接添加し、デバイスの収集パッドを展開剤溶液に挿入することによって、アッセイを開始する。展開剤溶液および液体生体試料は、クロマトグラフィのラテラルフロー、水和ブロッカ―およびコンジュゲートパッド構成要素を介してデバイス上に輸送され、捕捉ゾーン、および対照ラインを通って吸収パッドに進む。

【0061】

本明細書に記載される実施例および実施形態は、例示の目的のみのためであり、それに照らして様々な修正または変更が当業者に提案され、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることを理解されたい。本明細書に引用されるすべての公報、特許、および特許出願は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0062】

実施例１
ヒトＩｇＭに特異的に親和性を有するモノクローナル抗体を用いてラテラルフローアッセイ方法を実施し、ラテラルフローアッセイストリップの試験ライン（図１の第２の捕捉ゾーン、［１０５］）上に縞が付けられた。ＩｇＧ捕捉ゾーン（図１の［１０４］）は、試験ラインの上流でプロテインＧにより縞が付けられた。ジカ感染症の患者から収集された試料のパネルを、抗ジカＮＳ１ ＩｇＭ抗体の存在について試験した。ヒト抗ジカＮＳ１ ＩｇＭ抗体の存在または不在を、ＩｎＢｉｏｓによるＺＩＫＡ Ｄｅｔｅｃｔ（商標）Ｃａｐｔｕｒｅ ＥＬＩＳＡで検証した。以下の表１に示されるように、ヒト抗ジカＮＳ１ ＩｇＭ抗体は、急性感染時にジカデバイスの試験ライン上で検出されたが、症状の発症後９０日を超えて収集された試料中では検出されず、試験ライン上でＩｇＧ抗体ではなくＩｇＭが特異的に捕捉されたことを示す。一連の抽出１０４３－ＴＤＳ－０２５７では、抗ジカＮＳ１ ＩｇＭ抗体は、３日目には検出可能ではなく、１９～６２日の間に検出可能であったが、症状の発症後９１日では減少した。一連の抽出１０４３－ＴＤＳ－０３４３では、抗ジカＮＳ１ ＩｇＭ抗体は、症状の発症から１８～６０日後に検出可能であった。試料ＺＩＫ１７０７１３ＣおよびＺＩＫ１７０１８Ｂは、感染から１年後に収集され、これら２つの試料において検出可能なレベルの抗ジカＮＳ１ ＩｇＭはなかった。

【表1】

【0063】

実施例２
ヒトＩｇＭに特異的に親和性を有するモノクローナル抗体を用いてラテラルフローアッセイ方法を実施し、ラテラルフローアッセイストリップの試験ライン（図１の第２の捕捉ゾーン、［１０５］）上に縞が付けられた。ＩｇＧ捕捉ゾーン（図１の［１０４］）は、試験ラインの上流でプロテインＧにより縞が付けられた。表２は、ラテラルフローデバイスのブロッカ―パッド上に０．５μｇのデングＮＳ１タンパク質が存在したアッセイの結果を示す。ブロッカ―パッド中のデングＮＳ１は、デング陽性抗体試料で観察された交差反応性を低減した。

【表2】

【0064】

表３は、ブロッカ―パッドの代わりにデングＮＳ１タンパク質を展開剤溶液に添加したアッセイの結果を示す。デング試料に対して同様の交差反応性の低減を達成するために、０．５μｇと比較して、より多くの量のデングＮＳ１、１６７μｇが必要とされた。

【表3】

【0065】

表４は、デングＮＳ１タンパク質が、プロテインＧラインの上流または下流のいずれかであるが、ＩｇＭ捕捉ラインの上流でラテラルフローアッセイストリップ上に固定化されたアッセイの結果を示す。交差反応性の低下は、これらの構成において有意ではなかった。

【表4】

【図1】

【図2】

【国際調査報告】