特表2022-507268結合ドメインおよび分泌可能なペプチドの遺伝子を含む組換えベクター
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-18
(54)【発明の名称】結合ドメインおよび分泌可能なペプチドの遺伝子を含む組換えベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/48 20060101AFI20220111BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20220111BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220111BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220111BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220111BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220111BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20220111BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20220111BHJP
A61K 38/45 20060101ALI20220111BHJP
A61K 38/51 20060101ALI20220111BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220111BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220111BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220111BHJP
【ＦＩ】
C12N15/48
C12N15/86 Z ZNA
C12N7/01
C12N5/10
A61K35/76
A61K48/00
A61K38/19
A61K38/20
A61K38/45
A61K38/51
A61P35/00
A61P37/04
A61K39/395 N
A61K39/395 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021525756
(86)(22)【出願日】2019-11-13
(85)【翻訳文提出日】2021-07-09
(86)【国際出願番号】 US2019061297
(87)【国際公開番号】W WO2020102437
(87)【国際公開日】2020-05-22
(31)【優先権主張番号】62/760,912
(32)【優先日】2018-11-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/893,673
(32)【優先日】2019-08-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520425176
【氏名又は名称】デノボ バイオファーマ エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】リン， エイミー エイチ．
(72)【発明者】
【氏名】ジョリー， ダグラス ジェイ．
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90Y
4B065AA93X
4B065AA97X
4B065AA97Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BC11
4B065BD15
4B065BD18
4B065CA24
4B065CA27
4B065CA44
4C084AA13
4C084DA01
4C084DA12
4C084DA21
4C084DA25
4C084DC25
4C084DC26
4C084NA14
4C084ZB091
4C084ZB261
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB26
(57)【要約】
本開示は、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結している２Ａ－ペプチドまたはペプチド様コード配列を含有する、異種分泌シグナルを有するタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、改変組換えレトロウイルスを提供する。本開示はさらに、そのようなベクターを発現するまたは含む細胞およびベクター、ならびに疾患および障害の処置においてそのような改変ベクターを使用する方法に関する。本開示は、免疫グロブリン（Ｉｇ）足場タンパク質と非免疫グロブリン（非Ｉｇ）足場タンパク質の両方のポリペプチドサブユニットであって、各々が、抗原結合ドメインと、多量体化ドメイン、例えば、二量体化、三量体化および五量体ドメインと、必要に応じて、安定したホモおよび二量体タンパク質を形成することができるＩｇＧ Ｆｃドメインとの融合ポリペプチドを含む、ポリペプチドサブユニットをさらに記載する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換え複製可能レトロウイルスであって、レトロウイルスＧＡＧタンパク質；
レトロウイルスＰＯＬタンパク質；
レトロウイルスエンベロープ；
レトロウイルスポリヌクレオチドであって、前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列の３’末端にある長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列と、前記レトロウイルスポリヌクレオチドの５’末端にあるプロモーター配列であって、哺乳動物細胞における発現に好適であるプロモーター配列と、ｇａｇ核酸ドメインと、ｐｏｌ核酸ドメインと、ｅｎｖ核酸ドメインとを含む、レトロウイルスポリヌクレオチド；
２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列、続いて異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結している分泌シグナルペプチドコード配列を含むカセットであって、前記カセットが、前記３’ＬＴＲの５’側に位置し、前記レトロウイルスエンベロープをコードする前記ｅｎｖ核酸ドメインに作動可能に連結しており、前記ｅｎｖ核酸ドメインの３’側にある、カセット；および
標的細胞における逆転写、パッケージングおよび組み込みに必要なシス作用性配列
を含む、組換え複製可能レトロウイルス。
【請求項2】
前記エンベロープが、両種指向性、多種指向性、異種指向性、１０Ａ１、ＧＡＬＶ、ヒヒ内在性ウイルス、ＲＤ１１４、ラブドウイルス、アルファウイルス、麻疹またはインフルエンザウイルスエンベロープのうちの１つから選択される、請求項１に記載の組換え複製可能レトロウイルス。
【請求項3】
前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列が、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢＥＶ）、ブタ内在性ウイルス（ＰＥＲＶ）、ネコ由来レトロウイルスＲＤ１１４、リスザルレトロウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）、トリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ）、またはテナガサル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）からなる群より選択されるウイルスから操作される、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項4】
ガンマレトロウイルスである、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項5】
前記標的細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項6】
前記２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列が、配列番号１の配列を含有するペプチドをコードする、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項7】
前記２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列が、配列番号５５～１２５のいずれか１つのペプチドをコードする、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項8】
前記２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列が、配列番号８～１９のいずれか１つに記載の配列を含む、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項9】
前記異種ポリヌクレオチドが、＞５００ｂｐである、請求項１から８までのいずれか一項に記載のレトロウイルス。
【請求項10】
前記異種ポリヌクレオチドが、少なくとも２つのコード配列を含む、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項11】
前記カセットの下流に２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列を含む第２のカセットをさらに含む、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項12】
前記分泌シグナルペプチドコード配列が、配列番号２８９～３０１および３０２からなる群より選択される配列を含むペプチドをコードする、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項13】
前記異種ポリヌクレオチドが、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、抗原結合ドメインまたは生体分子と同族のペプチドをコードする、前記請求項のいずれかに記載のレトロウイルス。
【請求項14】
前記異種ポリヌクレオチドが、異種タンパク質またはポリペプチドに作動可能に連結している分泌シグナルペプチドをコードする配列を含み、前記異種タンパク質またはポリペプチドが、プロドラッグ活性化酵素、サイトカイン、受容体リガンド、免疫グロブリン由来の結合ポリペプチド、非免疫グロブリン結合ポリペプチド、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択され、複数の異種タンパク質またはポリペプチドが、２Ａまたは２Ａ様ペプチドにより分離されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載のレトロウイルス。
【請求項15】
前記カセットの下流に異なる異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結している内部プロモーターまたは遺伝子発現エレメントを含む第２のカセットをさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のレトロウイルス。
【請求項16】
前記標的細胞が、肺がん細胞、結腸直腸がん細胞、乳がん細胞、前立腺がん細胞、尿路がん細胞、子宮がん細胞、脳がん細胞、頭頸部がん細胞、膵臓がん細胞、黒色腫細胞、胃がんおよび卵巣がん細胞からなる群より選択される、請求項５に記載のレトロウイルス。
【請求項17】
前記ｇａｇ核酸ドメインが、ガンマレトロウイルスに由来する、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項18】
前記ｇａｇ核酸ドメインが、ＴがＵであり得る、配列番号２の約ヌクレオチド番号１２０３～約ヌクレオチド２８１９の配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは９９．８％の同一性を有する配列を含む、請求項１７に記載のレトロウイルス。
【請求項19】
前記ｐｏｌ核酸ドメインが、ガンマレトロウイルスに由来する、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項20】
前記ｐｏｌ核酸ドメインが、ＴがＵであり得る、配列番号２の約ヌクレオチド番号２８２０～約ヌクレオチド６３５８の配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは９９．９％の同一性を有する配列を含む、請求項１９に記載のレトロウイルス。
【請求項21】
前記ｅｎｖ核酸ドメインが、ＴがＵであり得る、配列番号２の約ヌクレオチド番号６３５９～約ヌクレオチド８３２３の配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは９９．８％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項22】
前記３’末端にあるＬＴＲ配列が、ガンマレトロウイルスに由来する、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項23】
前記３’ＬＴＲが、Ｕ３－Ｒ－Ｕ５ドメインを含む、請求項２２に記載のレトロウイルス。
【請求項24】
前記異種核酸配列が、生体応答修飾物質または免疫強化サイトカインをコードする、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項25】
前記免疫強化サイトカインが、インターロイキン１から３８、インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）からなる群より選択される、請求項２４に記載のレトロウイルス。
【請求項26】
前記異種核酸が、非毒性プロドラッグを毒性薬物に変換するポリペプチドをコードする、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項27】
非毒性プロドラッグを毒性薬物に変換する前記ポリペプチドが、チミジンキナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、またはシトシンデアミナーゼである、請求項２６に記載のレトロウイルス。
【請求項28】
前記異種核酸配列が、受容体ドメイン、抗体、抗体断片、または非免疫グロブリン結合ドメインをコードする、請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項29】
請求項１に記載のレトロウイルスを産生するための組換えポリヌクレオチド。
【請求項30】
ＧＳＧリンカーコード配列を伴うまたは伴わない２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列とインフレームのＭＬＶ ４０７０Ａエンベロープタンパク質遺伝子、および前記２Ａペプチドまたは２Ａ様コード配列とインフレームの第２の遺伝子を含む、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項31】
ＧＳＧリンカーコード配列を伴うまたは伴わない２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列とインフレームのＭＬＶ １０Ａ１エンベロープタンパク質遺伝子、および前記２Ａペプチドまたは２Ａ様コード配列とインフレームの第２の遺伝子を含む、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項32】
ＧＳＧリンカーコード配列を伴うまたは伴わない２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列とインフレームのＸＭＲＶエンベロープタンパク質遺伝子、および前記２Ａペプチドまたは２Ａ様コード配列とインフレームの第２の遺伝子を含む、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項33】
ＧＳＧリンカーコード配列を伴うまたは伴わない２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列とインフレームの非フレンドＭＬＶエンベロープタンパク質遺伝子、および前記２Ａペプチドまたは２Ａ様コード配列とインフレームの第２の遺伝子を含む、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項34】
ＧＳＧリンカーコード配列を伴うまたは伴わない前記２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列と、分泌されるポリペプチドをコードする遺伝子または異種ポリヌクレオチドとの間に位置する分泌ペプチド配列をさらに含む、請求項２９から３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項35】
分泌されるポリペプチドをコードする前記遺伝子または異種ポリヌクレオチドが、分泌、膜、細胞質、核または細胞区画特異的タンパク質である、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項36】
前記レトロウイルスおよび／または前記ポリヌクレオチドが、ヒトＡＰＯＢＥＣ高頻度変異を起こしやすいトリプトファンコドンを除去するように操作されている、請求項１に記載のレトロウイルスまたは請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項37】
前記異種ポリヌクレオチドが、シトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項３６に記載のレトロウイルスまたはポリヌクレオチド。
【請求項38】
シトシンデアミナーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号２９のポリペプチドをコードし、ここでＸａａがトリプトファンを除く任意のアミノ酸である、請求項３７に記載のレトロウイルスまたはポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は２０１８年１１月１３日に出願した米国特許仮出願第６２／７６０，９１２号および２０１９年８月２９日に出願した米国特許仮出願第６２／８９３，６７３号の優先権を主張するものであり、これらの開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
本願は２０１８年１１月１３日に出願した米国特許仮出願第６２／７６０，９１２号および２０１９年８月２９日に出願した米国特許仮出願第６２／８９３，６７３号の優先権を主張するものであり、これらの開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
【0002】
配列表
本願は、電子形式での配列表とともに出願されている。配列表は、サイズが４０８，８１６バイトである、２０１９年１１月１３日に作成したＳｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと題するファイルとして提供される。この電子形式の配列表の情報は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本願は、電子形式での配列表とともに出願されている。配列表は、サイズが４０８，８１６バイトである、２０１９年１１月１３日に作成したＳｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと題するファイルとして提供される。この電子形式の配列表の情報は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【0003】
本開示は、ウイルスベクターに関する。本開示はさらに、細胞における異種核酸の送達および発現のためのそのようなウイルスベクターの使用、ならびにそれらの発現および分泌に関する。
【背景技術】
【0004】
細胞および被験体への遺伝子および異種核酸の有効な送達方法は、研究者の科学的開発についてのならびに疾患および障害の考えられる処置についての研究目標になっている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本開示は、２Ａ－ペプチドの下流および分泌される異種遺伝子の上流に分泌ペプチドコード配列を含有する２Ａ－ペプチドカセットを含むウイルスを提供する。さらなる実施形態は、抗体、一本鎖抗体、または他の抗体関連構造、非免疫グロブリン足場タンパク質に由来する結合タンパク質などをコードする、異種遺伝子を含む。さらなる実施形態では、抗体関連ペプチドまたは非免グロブリン結合タンパク質は、標的実在に対するより高い結合親和性を提供するために結合タンパク質の多量体化をもたらす配列を含む。なおさらなる実施形態は、分泌される異種遺伝子産物の上流に、ウイルスと遺伝子の両方への、異種分泌シグナルを有する異種遺伝子を含むウイルスを含む。
【0006】
本開示は、免疫グロブリン（Ｉｇ）足場タンパク質と非免疫グロブリン（非Ｉｇ）足場タンパク質の両方のポリペプチドサブユニットであって、各々が、抗原結合ドメインと、多量体化ドメイン、例えば、二量体化、三量体化および五量体ドメインと、必要に応じて、安定したホモおよび二量体タンパク質を形成することができるＩｇＧ Ｆｃドメインとの融合ポリペプチドを含む、ポリペプチドサブユニットをさらに記載する。非Ｉｇ足場タンパク質のオリゴマー複合体は、単一または複数のＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーにより形成されることもある。
【0007】
本開示は、ヒト、マウス、ラクダ（ラクダ科動物）、サメおよび雌ウシに由来する重鎖可変ドメインを含む操作されたＩｇ足場タンパク質（参照により本明細書に組み入れられる、Curr Opin Struct Biol. 2017 Aug;45:10-16. doi: 10.1016/j.sbi.2016.10.019）（参照により本明細書に組み入れられる、Nat Biotechnol. 2017 Dec 8;35(12):1115-1117. doi: 10.1038/nbt1217-1115）、ならびに非Ｉｇ足場タンパク質（例えば、Skrlec et al., Trends Biotechnol., 33(7):408-18, Jul. 2015およびSimeon & Chen Protein& Cell 9:2-14, 2018を参照されたい；これらの両方が参照により本明細書に組み入れられる）を含み、これらは、アドネクチン、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アンチカリン、アトリマー、アビマー、センチリン、ＤＡＲＰｉｎ、Ｂｙｎｏｍｅｒ、Ｃｙｓ－ノット、クニッツドメイン、ＯＢｏｄｙ、プロネクチン、Ｔｎ３、Ｈｃｋ、ＮＰＨＰ１、Ｔｅｃ、Ａｍｐｈ、ＲＩＭＢＰ＃３、ＩＲＩＫＳ、ＳＮＸ３３、Ｅｐｓ８Ｌ１、ＦＩＳＨ＃５、ＣＭＳ＃１、およびＯＳＴＦ１を含み、これらの全てをヒトＩｇＧのＦｃのＮ末端部分に作動可能に連結することができ、それによって、非常に複雑なオリゴマータンパク質を形成するためのジスルフィド結合形成による単量体またはオリゴマー足場タンパク質の二量体化が可能になる。
【0008】
レトロウイルス複製ベクターおよびレトロウイルス非複製ベクター、他のウイルスベクター、腫瘍溶解性ウイルスベクター、ならびに非ウイルス発現ベクターを含む、ウイルスベクターより送達されるがん免疫療法に有用である組成物および方法が、提供される。
【0009】
一実施形態では、非Ｉｇ足場は、抗足場タンパク質免疫応答を最小限に抑えるためにヒト由来のものである。
【0010】
一実施形態では、非Ｉｇ足場タンパク質の抗原特異的結合サブユニットは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤＬ１、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＯＸ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＩＬ－２Ｒアルファ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－１５Ｒアルファ、ＩＬ－１５Ｒベータ、またはＩＬ－１５Ｒガンマ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、メソテリン、ガングリオシドＧＤ２、線維芽細胞関連タンパク質ＦＡＰ、ＢＣＭＡ、ＣＤ３、ＦＯＸＰ３、ＩＬ－１２Ｒアルファまたはベータ、ＣＤ４７、ＳＩＲＰアルファ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２、ＣＤ２４４／２Ｂ４、アデノシン受容体Ａ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦＲ／ＭＥＴ、ＨＧＦ、ＩＧＦ－ＩＲ、ＩＧＦ－１、ＨＥＲ－１、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ＣＥＡ、ＥＢ－Ｄ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、細胞外ドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）、ＩＬ－１０およびＩＬ－３５を標的とする、アゴニストまたはアンタゴニストとして機能する。
【0011】
別の実施形態では、非Ｉｇ足場タンパク質の抗原特異的結合サブユニットは、以下のもののうちの少なくとも１つを標的とするアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する：６０より多くの現行メンバーからなるインターロイキン１から３８；ならびにそれらの受容体、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１で構成されているＩＬ－２ファミリーのＩＬ－１０およびＩＬ－３５受容体（これらの受容体は、共通のサイトカイン受容体γ鎖（ＣＤ１３２ γｃ）を含有する）；ＩＬ－１３Ｒは、ＩＬ－４とＩＬ－４Ｒαを共有し、ＩＬ－４およびＩＬ－１３の受容体は、２つの受容体鎖からなり － ＩＬ－４およびＩＬ－１３は、ＩＬ－４Ｒα（ＣＤ１２４）およびＩＬ－１３Ｒα１鎖からなるＩＬ－４Ｒに結合し、ＩＬ－１３Ｒは、ＩＬ－１３Ｒα１およびＩＬ－１３Ｒα２という２つのサブユニットからなり、シグナル伝達が、ＩＬ－４ＲαおよびＩＬ－１３ＲαからなるＩＬ－４Ｒ複合体ＩＩ型を介して行われる；ＴＳＬＰＲ（ＣＲＦｌＲ－２）は、ＩＬ－７とＩＬ－７Ｒを共有する；特有のα鎖および共通のβ鎖（βｃ、ＣＤ１３１）サブユニットを有するヘテロ二量体である、ＩＬ－３、ＩＬ－５およびＧＭ－ＣＳＦの受容体；ＩＬ－１０ファミリーメンバー（ＩＬ－１０、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２４、ＩＬ－２６、ＩＬ－２８、およびＩＬ－２９）、および示されているような、共通の受容体サブユニットを共有する対応する受容体；ＴＮＦ－αならびにその受容体ＴＮＦＲＩおよびＴＮＦＲ２；ＴＧＦ－β、ならびにＴＧＦ－βＲ１およびＴＧＦ－βＲ２からなるそのヘテロ二量体受容体；ＩＬ１２ならびに２つのサブユニット：ＩＬ－１２Ｒβ１およびＩＬ－１２Ｒβ３からなるその受容体ＩＬ－１２Ｒ。ＩＬ－２３および／またはそのヘテロ二量体受容体サブユニット、ＩＬ－１２Ｒβ１およびＩＬ－２３Ｒ；ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－β、ならびに／またはＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２からなるそれらのヘテロ二量体受容体；ＩＦＮ－γならびに／またはそのヘテロ二量体受容体サブユニットＩＦＮ－γＲ１およびＩＦＮ－γＲ２。
【0012】
一実施形態では、非Ｉｇ足場タンパク質が自己集合してホモ二量体、ホモ三量体、ホモ五量体タンパク質複合体、ホモ六量体または他のタイプのタンパク質複合体、例えばヘテロマー複合体などを構築し得る、非Ｉｇ足場タンパク質の抗原結合ドメインは、各々が抗原結合非Ｉｇ足場タンパク質、グリシン－セリンリンカー、機能的多量体化ドメインを含む、融合タンパク質である。
【0013】
一実施形態では、ホモ六量体非Ｉｇ足場タンパク質複合体は、各々が非Ｉｇ足場タンパク質、グリシン－セリンリンカー、機能的三量体化ドメインおよびＩｇＧ Ｆｃドメインからなる、６つの抗原結合非Ｉｇ足場タンパク質を含む、融合タンパク質である。
【0014】
一実施形態では、ホモ十量体非Ｉｇ足場タンパク質複合体は、各々が非Ｉｇ足場タンパク質、グリシン－セリンリンカー、機能的五量体ドメインおよびＩｇＧ Ｆｃドメインからなる、１０の抗原結合非Ｉｇ足場タンパク質を含む、融合タンパク質である。
【0015】
別の実施形態では、非Ｉｇ足場タンパク質が自己集合してヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ多量体タンパク質を構築し得る、非Ｉｇ足場タンパク質の抗原結合ドメインは、異なる抗原結合非Ｉｇ足場タンパク質、グリシン－セリンリンカーを含む、多価融合タンパク質複合体である。
【0016】
一実施形態では、ネオ抗原プライミングのために抗原経験Ｔ細胞および／または活性化ＮＫ細胞および樹状細胞の生存または増殖を促進する方法であって、オリゴマー形態の非Ｉｇ足場タンパク質が、腫瘍細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、骨髄性細胞、腫瘍関連線維芽細胞、Ｂ細胞の表面の抗原に特異的に結合することができる、方法。
【0017】
さらなる実施形態では、導入遺伝子は、プロドラッグ活性化タンパク質をコードし、このプロドラッグ活性化タンパク質は、分泌可能なペプチドまたはタンパク質として作製されたものである。さらなる実施形態では、プロドラッグ活性化導入遺伝子は、酵母由来のシトシンデアミナーゼである。
【0018】
本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および下記の説明で示される。他の特徴、目的および利点は、本明細書および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【0020】
【0021】
【図3】図３は、ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１プラスミドＤＮＡの概略図である。（Ａ）ＰＤ－Ｌ１に対する２対の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）がｐＡＣ３ ＲＲＶ骨格にコードされていた。一方の対は、ヒトＩｇＧ１からのＦｃを伴うｓｃＦｖおよび伴わないｓｃＦｖからなり、それぞれ、ｐＡＣ３－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１およびｐＡＣ３－ｓｃＦｖＦｃ－ＰＤＬ１とそれぞれ表記されている。別の対は、Ｃ末端に組み入れられたＨＡおよびＦｌａｇエピトープを有するｓｃＦｖ－ＰＤＬ１およびｓｃＦｖＦｃ－ＰＤＬ１からなり、それぞれ、ｐＡＣ３－ｓｃＦｖ－ＨＦ－ＰＤＬ１、ｐＡＣ３－ｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ－ＰＤＬ１と表記されている。灰色で塗りつぶされている長方形は、ｅｎｖ遺伝子の下流に位置する、２Ａペプチド、ＩＲＥＳまたはミニプロモーターを示し、黒で塗りつぶされている長方形（ＳＰ＝シグナルペプチド、表Ａ）は、例えばヒトＩＬ－２に由来する、分泌／リーダー配列を示す。
【0022】
【図4A】図４Ａ～Ｂは、一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞における、ＰＤＬ１ｓｃＦｖおよびＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃタンパク質発現、ならびにＥｎｖ－ｓｃＦｖおよびＥｎｖ－ＳｃＦｖＦｃポリタンパク質の分離効率を示す図である。（Ａ）ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ－タグ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ－タグを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのｓｃＦｖ－タグ（約３０ＫＤａ）およびｓｃＦｖＦｃ－タグ（約５５Ｋｄ）タンパク質発現。（Ｂ）一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物の抗２Ａ免疫ブロット。約１１０ＫＤａより上で検出されたタンパク質バンドは、Ｅｎｖ－ｓｃＦｖおよびＥｎｖ－ＳｃＦｖＦｃ融合ポリタンパク質を表す。約８５ＫＤａで検出されたタンパク質バンドは、融合ポリタンパク質から分離されたＰｒ８５ウイルスエンベロープタンパク質を表し、約１５ＫＤａで検出されたタンパク質バンドは、Ｐｒ８５ウイルスエンベロープタンパク質からプロセシングされたｐ１５Ｅ－２Ａタンパク質を表す。
【図4B】図４Ａ～Ｂは、一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞における、ＰＤＬ１ｓｃＦｖおよびＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃタンパク質発現、ならびにＥｎｖ－ｓｃＦｖおよびＥｎｖ－ＳｃＦｖＦｃポリタンパク質の分離効率を示す図である。（Ａ）ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ－タグ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ－タグを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのｓｃＦｖ－タグ（約３０ＫＤａ）およびｓｃＦｖＦｃ－タグ（約５５Ｋｄ）タンパク質発現。（Ｂ）一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物の抗２Ａ免疫ブロット。約１１０ＫＤａより上で検出されたタンパク質バンドは、Ｅｎｖ－ｓｃＦｖおよびＥｎｖ－ＳｃＦｖＦｃ融合ポリタンパク質を表す。約８５ＫＤａで検出されたタンパク質バンドは、融合ポリタンパク質から分離されたＰｒ８５ウイルスエンベロープタンパク質を表し、約１５ＫＤａで検出されたタンパク質バンドは、Ｐｒ８５ウイルスエンベロープタンパク質からプロセシングされたｐ１５Ｅ－２Ａタンパク質を表す。
【0023】
【図5】図５は、２９３Ｔ細胞において一過性トランスフェクションを生じさせたウイルスエンベロープタンパク質のウェスタンブロット分析を示す図である。２０マイクログラムの全タンパク質溶解物をウェルごとにローディングした。膜を、（左側のパネル）ＨＡタグ付きおよびＦｌａｇタグ付きｓｃＦｖ－ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ－ＰＤ－Ｌ１を検出する抗ＨＡとインキュベートしたか、または（右側のパネル）Ｅｎｖ－ｓｃＦｖポリタンパク質（Ｅｎｖ－ｓｃＦｖ）、Ｅｎｖ－ｓｃＦｖポリタンパク質から分離されたプロセシングされていないウイルス前駆体エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ－２Ａ）、およびＣ末端に２Ａペプチドでタグ付けされているプロセシングされたウイルスエンベロープタンパク質（ｐ１５Ｅ－２Ａ）を検出する抗２Ａペプチド抗体とインキュベートした。ハウスキーピングタンパク質ＧＡＰＤＨをローディング対照として含めた、抗ＧＡＰＤＨ抗体（左側のパネルの下方）。
【0024】
【図6】図６Ａ～Ｂは、競合ＥＬＩＳＡによるＰＤ－Ｌ１へのｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１結合の検出を示す図である。９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを、（Ａ）組換えヒトまたは（Ｂ）マウスＰＤ－Ｌ１－Ｆｃでコーティングし、その後、ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１およびＲＲＶ－ｓｃＦｖＦｃ－ＰＤＬ１にそれぞれ最大限感染させたＣＴ２６細胞から回収した未定義ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１（ｓｃＦｖ）およびｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１（ｓｃＦｖＦｃ）タンパク質濃度の上清との競合で、Ｈｉｓタグ付き組換えＰＤ－１－Ｆｃと共インキュベートした。抗ＰＤ－Ｌ１抗体を陽性対照としてインキュベートした。抗６Ｘ ＨＩｓタグ抗体を使用して、結合したＨｉｓタグ付きＰＤ－１－Ｆｃを検出した。４５０ｎｍで光学密度を測定した。阻害パーセンテージを、競合に使用したＲＲＶ－ＧＦＰ（非ｓｃＦｖ－ＰＤ－Ｌ１）に最大限感染させたＣＴ２６からの上清に対して計算した。エラーバーは、データセットの標準偏差を示す。
【0025】
【0026】
【図8】図８Ａ～Ｄは、用量依存性抗腫瘍活性を実証する、ｓｃＦＶ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１を発現する事前に形質導入した腫瘍細胞を示す図である。（Ａ）示されている比のＲＲＶ－ＧＦＰを事前に形質導入した腫瘍細胞と混合した、ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１およびＲＲＶ－ｓｃＦｖＦｃ－ＰＤＬ１を事前に形質導入したＥＭＴ６腫瘍細胞を使用する同所性乳がんモデルを、８週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（１群当たりｎ＝１０）の乳房脂肪体に移植した。生存を９０日間モニターした。抗ＰＤ－１抗体を対照として含め、１０日目（マウス１匹当たり３００μｇ）、１３日目、１６日目および１９日目（マウス１匹当たり２００μｇ）にｉ．ｐ．投与した。＊０％ｓｃＦｖ／ｓｃＦｖＦｃ対抗ＰＤ－１の場合、ｐ＝０．２５２９；＊＊０％対２％の場合、ｐ＝０．２５２９；＊＊＊０％対３０％の場合、ｐ＝０．０９１９；＊＊＊＊０％対１００％の場合、ｐ＝０．１６７４。グラフ上のチェックマークは、腫瘍壊死に起因して打ち切ったマウスを示し、終了された。これらのマウスを死亡として採点せず、グラフから除外しなかった。（Ｂ～Ｄ）ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１およびＲＲＶ－ｓｃＦｖＦｃ－ＰＤＬ１処置群からの最初の腫瘍移植を生き延びたマウス（ｎ＝５）をその側腹部に１×１０６ＥＭＴ６腫瘍細胞でチャレンジし、腫瘍成長を経時的にモニターした。ナイーブ動物（ｎ＝５）を対照として含めた。エラーバーは、データセットのＳＥＭを示す。
【0027】
【図9】図９Ａ～Ｂは、用量依存性抗腫瘍活性を実証する、ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１の頭蓋内注射を施した同所性神経膠腫モデルからのデータを示す図である。（Ａ）雌Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウス（８週齢；１群当たりｎ＝１０）に１×１０４のＴｕ－２４４９細胞をｉ．ｃ．移植した。生存分析を９０日間モニターした。実験群のマウスには腫瘍移植後４日目に１×１０５または１×１０６形質導入単位（ＴＵ）の精製ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１を注射した。対照群は、１００％事前形質導入ｓｃＦｖ－ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍細胞を担持するマウス、および抗ＰＤ－１抗体もしくはアイソタイプ対照で処置したマウスである。ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１および抗ＰＤ－１抗体を発現するＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１で１００％事前形質導入（４日目にマウス１匹当たり３００μｇのｉ．ｐ．誘導；１０、１４および１７日目にマウス１匹当たり２００μｇの維持用量）したＴｕ－２４４９細胞を対照に含めた。生存データをカプラン・マイヤー法によりプロットした。アイソタイプで処置したマウスと、ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤ－Ｌ１で１００％事前形質導入した群または注射処置ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１群との間の生存の統計的有意性を、ログランク（マンテル－コックス）により決定した。（Ｂ）ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１処置群からの最初の腫瘍移植を生き延びたマウスをその右側腹部に２×１０６Ｔｕ－２４４９細胞でチャレンジした。腫瘍成長および測定値を経時的にモニターした。エラーバーは、データセットのＳＥＭを示す。
【0028】
【0029】
【0030】
【図12】図１２は、ＲＲＶ－足場プラスミドＤＮＡの概略図である。非Ｉｇ足場に由来する抗原結合ドメイン［００６６］は、ｐＡＣ３－２Ａ、ｐＡＣ３－ＩＲＥＳまたはｐＡＣ３－ミニプロモーター骨格にコードされている。灰色で塗りつぶされている長方形は、導入遺伝子の発現を指示するためにｅｎｖ遺伝子の下流に配置した２Ａペプチド、ＩＲＥＳまたはミニプロモーターを示し、黒で塗りつぶされている長方形は、リーダー配列（表Ａ）を示す。オリゴマー化ドメイン（表４、５および６）をリンカーで非Ｉｇ足場のＮ末端またはＣ末端に配置してオリゴマーを形成することができる。二重特異性または三重特異性抗体（Labrijn et al., Nature Rev. Drug Disc. 18:585-608 2019）のような２つまたは３つの標的に対する応答を結び付ける特性を有する二重特異性および三重特異性結合分子の分泌につながる構成も、最後の２つの線で示されている。
【0031】
【発明を実施するための形態】
【0032】
本明細書でおよび添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の明白な指図がない限り、複数の言及対象を含む。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「ベクター」への言及は、１つまたは複数のベクターへの言及を含む。
【0033】
また、「または」の使用は、別段の記述がない限り、「および／または」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、互換的であり、限定することを意図したものではない。
【0034】
様々な実施形態の説明が用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合、一部の特定の事例では、実施形態が、その代わりに「から本質的になる」または「からなる」という言葉を使用して説明されることがあることは、当業者には理解されるであろう。
【0035】
別段に定義されない限り、本明細書において使用するすべての技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を、本明細書で開示される方法および組成物の実施の際に使用することができるが、例示的な方法、デバイスおよび材料が本明細に記載される。
【0036】
ベクター、プロモーターおよび多くの他の関連トピックスの使用を含む、本明細書において有用な分子生物学技法を記載している一般的な文書としては、以下のものが挙げられる：Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology Volume 152, (Academic Press, Inc., San Diego, Calif.)（「Ｂｅｒｇｅｒ」）；Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 2d ed., Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999)（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）；およびS. Carson, H. B. Miller & D. S. Witherow and Molecular Biology Techniques: A Classroom Laboratory Manual, Third Edition, Elsevier, San Diego (2012)。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ－レプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技法（例えば、ＮＡＳＢＡ）を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅法を通して、例えば、本開示の相同核酸の産生のために、当業者を指導するのに十分なプロトコールの例は、Berger, Sambrook, and Ausubel, as well as in Mullis et al.(1987) 米国特許第４，６８３，２０２号；Innis et al., eds.(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press Inc. San Diego, Calif.)（「Ｉｎｎｉｓ」）；Arnheim & Levinson (Oct. 1, 1990) C&EN 36-47；The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94；Kwoh et al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173；Guatelli et al.(1990) Proc. Nat'l.Acad. Sci. USA 87: 1874；Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem 35: 1826；Landegren et al.(1988) Science 241: 1077-1080；Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294；Wu and Wallace (1989) Gene 4:560；Barringer et al.(1990) Gene 89:117；およびSooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564において見い出される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅核酸をクローニングするための改善された方法は、Wallace et al.、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。最大４０ｋｂのＰＣＲアンプリコンが生成される、大きい核酸をＰＣＲにより増幅するための改善された方法は、Cheng et al. (1994) Nature 369: 684-685およびそこに引用されている参考文献に要約されている。本質的に任意のＲＮＡを、逆転写酵素を使用する制限酵素消化、ＰＣＲによる拡大およびシークエンシングに好適な二本鎖ＤＮＡに変換することができることは、当業者には理解されるであろう。例えば、Ausubel, Sambrook and Berger、全て上掲、を参照されたい。
【0037】
本文全体にわたって論じられる刊行物は、本願の出願日より前のそれらの開示についてもっぱら提供される。過去の開示を理由にそのような開示に先行する資格が本発明者らにないことを認めると解釈すべきものは、本明細書中に存在しない。
【0038】
用語「発現する」および「発現」は、遺伝子またはＤＮＡ配列における情報の顕在化を可能にするまたは引き起こすこと、例えば、対応する遺伝子もしくはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによりタンパク質を産生すること、または阻害剤ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）の場合には、ＲＮＡｉ分子を、それがプロセシングされ、標的遺伝子の発現を阻害できるように、転写することを意味する。
【0039】
ＤＮＡ配列は、細胞においてまたは細胞により発現されて、ポリペプチドまたはタンパク質などの「発現産物」を形成する。発現産物自体、例えば、結果として生じるポリペプチドまたはタンパク質も、細胞により「発現され」得る。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、例えば、それが、外来もしくはネイティブプロモーターの制御下で外来宿主細胞においてまたは外来プロモーターの制御下でネイティブ宿主細胞において発現または産生される場合、組換え発現される。
【0040】
一部の事例では、上述の用語「発現する」は、阻害性ＲＮＡ分子（ＲＮＡｉ）の産生を含む。そのような分子の発現は、細胞の翻訳機構に関与せず、むしろ、宿主細胞の遺伝子発現を改変するために細胞の機構を利用する。一部の実施形態では、本開示の組換えウイルスベクターは、コード配列（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質）、ＲＮＡｉ分子、またはコード配列（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質を発現する）とＲＮＡｉ分子の両方を、コード配列および／またはＲＮＡｉ分子をその後発現することができる宿主細胞に送達するように、改変され得る。
【0041】
「２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様配列」は、配列番号１のコンセンサス配列、図１および２における配列のいずれかと９７％同一であり、配列番号１のコンセンサス配列を含有する配列を指す。２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様配列を「コードする」配列は、例えば配列番号１のコンセンサス配列を有する、２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様配列をコードする、ポリヌクレオチド配列である。コード配列は、ＥＮＶおよび異種配列に作動可能に連結しており、一実施形態では、ＥＮＶと異種配列の間に配置されており、したがって、配列が転写されると、その配列は単一の転写物（例えば、ポリｍＲＮＡ）として転写され、転写物が翻訳されたときにその２つのポリペプチド（例えば、ＥＮＶおよび異種ペプチド）が産生される。
【0042】
内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）は、コード配列の翻訳中にリボソームの、通常はＩＲＥＳの３’側への、侵入またはそこでの保持を促進する、核酸のセグメントを指す。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、スプライスアクセプター／ドナー部位を含み得るが、好ましいＩＲＥＳは、スプライスアクセプター／ドナー部位を欠いている。通常は、メッセンジャーＲＮＡへのリボソームの侵入は、全ての真核生物ｍＲＮＡの５’末端に位置するキャップを介して起こる。しかし、この普遍的規則には例外がある。一部のウイルスｍＲＮＡにおけるキャップの非存在は、これらのＲＮＡの内部部位へのリボソームの侵入を可能にする代替構造の存在を示唆する。今までに、それらの機能のためにＩＲＥＳと呼ばれる多数のこれらの構造が、キャップのないウイルスｍＲＮＡの５’非コード領域、例えば、ピコルナウイルス、特に、ポリオウイルス（Pelletier et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8, 1103-1112）およびＥＭＣＶウイルス（脳心筋炎ウイルス）（Jang et al., J. Virol., 62, 2636-2643 1988；B. T. Baranick et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 105:4733-8, 2008）のものにおいて、同定されている。本開示は、複製可能レトロウイルスベクターに関連してＩＲＥＳの使用を提供する。
【0043】
用語「プロモーター領域」は、その通常の意味で、本明細書で使用され、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域であって、調節配列が、ＲＮＡポリメラーゼに結合することおよび下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができる遺伝子に由来する、ヌクレオチド領域を指す。調節配列は、所望の遺伝子配列と同種であることもあり、異種であることもある。例えば、ウイルスまたは哺乳動物プロモーターを含む、広範なプロモーターが、利用され得る。
【0044】
用語「調節核酸配列」は、レシピエント細胞のコード配列の複製、転写および翻訳を共同で提供する、プロモーター配列／領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、エンハンサーなどを集合的に指す。選択されるコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写および翻訳され得るのであれば、これらの制御配列の全てが必ずしも存在する必要はない。当業者は、公開データベースおよび材料から調節核酸配列を容易に同定することができる。さらに、当業者は、例えばｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの、意図された使用に適用可能な調節配列を同定することができる。
【0045】
本明細書で使用される場合、用語「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）は、短鎖干渉核酸（ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））により媒介される配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す。用語「ＲＮＡ干渉を媒介することができる薬剤」は、ｓｉＲＮＡはもちろん、細胞内で転写されたときにｓｉＲＮＡをコードしているＤＮＡおよびＲＮＡベクターも指す。用語ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、配列特異的ＲＮＡ干渉を媒介することができる任意の核酸分子、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉オリゴヌクレオチド、短鎖干渉核酸、短鎖干渉改変オリゴヌクレオチド、化学的に改変されたｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）などを包含することが意図される。
【0046】
用語「分泌シグナルドメイン」または「分泌シグナルペプチド」（ＳＳＰ）または「シグナルペプチド」は、前駆体タンパク質配列の一部として典型的にＮ末端に位置する短いペプチドを意味する。真核細胞の翻訳機構は、これらの短いペプチドを利用してタンパク質を標的化された目的地に選別する。ＳＳＰの一般的特性は、次の３つのドメインからなる：（１）Ｎ領域：正荷電ドメイン、（２）Ｈ領域：疎水性コア、および（３）Ｃ領域：切断部位（Owji et al., Euro J. of Cell Biol., 2018）。ＳＳＰは、エンドプロテアーゼＳＰａｓｅ Ｉにより、それらのパッセンジャータンパク質またはポリペプチドから切断される。ポリペプチドまたはタンパク質発現レベルは、翻訳効率のみならず、分泌機構およびＳＳＰにより決定されるトランスロケーション効率にも関連している。ＳＳＰの配列は、トランスロケーション効率に影響に影響を及ぼすことができ、したがって、パッセンジャーポリペプチドまたはタンパク質に連結している異種ＳＳＰの組合せを核酸レベルで操作して、分泌タンパク質のレベルをモジュレートすることができる（Kober et al., 2013；Zamani et al., 2015；Negahdaripour et al., 2017；Mousavi et al., 2017）。さらに、真核細胞系と原核細胞系の両方におけるタンパク質分泌を増進するように設計された人工ＳＳＰがある（Barash et al., Biochem and Biophy Res Comm., 2002；Clerico et al., Biopolymers, 2008）。ＳＳＰの存在および一般機能は、何十年にもわたって公知であるが、ＳＳＰが、特に、他の膜タンパク質、例えば、レトロウイルスベクターのＥＮＶタンパク質および２Ａ発現システムと組み合わせられたとき、機能的な非ネイティブ発現遺伝子産物を宿主細胞から分泌することができることは、これまで記載されたことがない。
【0047】
用語「ベクター」、「ベクター構築物」および「発現ベクター」は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するために、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができる、ビヒクルを意味する。ベクターは、典型的には、タンパク質、ポリペプチド、核酸などをコードする外来ＤＮＡが制限酵素技術によって挿入される、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。よく見られるタイプのベクターは、「プラスミド」であり、一般に、これは、追加の（外来）ＤＮＡを容易に許容することができ、好適な宿主細胞に容易に導入され得る、二本鎖ＤＮＡの独立式分子である。プラスミドおよび真菌ベクターをはじめとする多数のベクターが、様々な真核生物および原核生物宿主における複製および／または発現について記載されている。非限定的な例としては、ｐＫＫプラスミド（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、ｐＲＳＥＴもしくはｐＲＥＰプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、またはｐＭＡＬプラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）が挙げられる。本明細書で開示もしくは引用されるまたはそうでなければ関連技術分野の当業者に公知の方法を使用する、多くの適切な宿主細胞が、そのようなトランスフェクションに使用されている。組換えクローニングベクターは、クローニングまたは発現のための１つまたは複数の複製系、宿主における選択のための１つまたは複数のマーカー、例えば抗生物質耐性、または１つまたは複数の発現カセットを、多くの場合、含むことになる。
【0048】
本開示は、細胞または被験体への遺伝子またはタンパク質送達に有用な方法および組成物を提供する。そのような一実施形態では、方法および組成物は、タンパク質またはポリペプチドが、タンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子を取り込んだ細胞から分泌されることになるような、方法および組成物である。そのような方法および組成物は、がんならびに他の細胞増殖性疾患および障害を含む、被験体における様々な疾患および障害を処置するために使用することができる。本開示は、細胞への遺伝子送達のための複製可能ウイルスベクターを提供し、一実施形態では、ウイルスベクターは、複製可能レトロウイルスベクターである。
【0049】
本開示は、細胞または被験体に送達され得る、例えば、シトシンデアミナーゼもしくはその変異体、ｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ、サイトカイン、抗原結合ドメイン（例えば、抗体もしくは抗体断片；または非抗体結合ドメイン）、非免疫グロブリン（Ｉｇ）足場タンパク質、またはコード配列の組合せなどをコードする、異種ポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターを提供する。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、麻疹ベクター、ヘルペスベクター、レトロウイルスベクター（アルファ－、ベータ－、ガンマ－、デルタ－レトロウイルスベクター、スプーマウイルス、例えば、サル泡沫状ウイルス（ＳＦＶ）もしくはヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）、またはレンチウイルスベクターを含む）、ラブドウイルスベクター、例えば、水疱性口内炎ウイルスベクター、レオウイルスベクター、セネカバレーウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（動物ポックスまたはワクシニア由来のベクターを含む）、パルボウイルスベクター（ＡＡＶベクターを含む）、アルファウイルスベクター、または当業者に公知の他のウイルスベクターであり得る（例えば、Concepts in Genetic Medicine, ed. Boro Dropulic and Barrie Carter, Wiley, 2008, Hoboken, NJ.；The Development of Human Gene Therapy, ed. Theodore Friedmann, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold springs Harbor, New York, 1999；Gene and Cell Therapy, ed. Nancy Smyth Templeton, Marcel Dekker Inc., New York, New York, 2000；およびGene & Cell Therapy: Therapeutic Mechanism and Strategies, 3rd. ed., ed. Nancy Smyth Templetone, CRC Press, Boca Raton, FL, 2008も参照されたい；これらの開示は、参照により本明細書に組み入れられる）。
【0050】
下記で説明されるように、本開示のＲＲＶは、ＭＬＶ、ＭｏＭＬＶ、ＧＡＬＶ、ＦＥＬＶなどに由来し得（すなわち、親ヌクレオチド配列は、これらから得られ）、異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結している２Ａペプチドまたは２Ａ様ペプチド（本明細書では「２Ａ－ペプチドカセット」と呼ばれることもある）を含有するように操作され得る。一部の事例では、２Ａペプチドまたは２Ａ様ペプチドは、分泌シグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドにより異種ヌクレオチド配列から分離される。
【0051】
組換え複製可能レトロウイルスベクターまたはレトロウイルス複製ベクター（ＲＲＶ）は、ウイルスのレトロウイルス科のメンバーに基づくベクターを指す。レトロウイルスの構造は、より十分に下記で説明されるように、十分に特徴付けられている。レトロウイルスは、様々な方法で分類されているが、命名法は、この１０年間で標準化された（ワールワイドウェブ（ｗｗｗ）上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＩＣＴＶｄｂ／ＩＣＴＶｄＢ／でのＩＣＴＶｄＢ－Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｄａｔａｂａｓｅ、ｖ ４、および教科書"Retroviruses" Eds.Coffin, Hughs and Varmus, Cold Spring Harbor Press 1997を参照されたい；この開示は、参照により本明細書に組み入れられる）。組換え遺伝子技術を使用してそのようなベクターを操作して、親ウイルスを、異種遺伝子または配列を挿入することにより天然に存在しないＲＲＶになるように改変することができる。そのような改変は、ベクターに、宿主細胞への発現される遺伝子の送達をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで可能にする特質をもたらすことができる。
【0052】
レトロウイルスは、それらがそれらの遺伝物質を複製する方法により定義される。複製中、ウイルスのＲＮＡゲノムはＤＮＡ（プロウイルスＤＮＡと呼ばれる）に変換される。細胞の感染後、逆転写として公知の分子プロセスによりウイルス粒子で運ばれるＲＮＡの２つの分子から、ＤＮＡの二本鎖が生成される。このＤＮＡ形態は、宿主細胞ゲノムにプロウイルスとして共有結合により組み込まれ、この宿主細胞ゲノムから細胞および／またはウイルス因子の助けを借りてウイルスＲＮＡが発現される。発現されたウイルスＲＮＡは、粒子にパッケージングされ、感染性ビリオンとして放出される。
【0053】
レトロウイルス粒子は、２つの同一のＲＮＡ分子で構成されている。各野生型ゲノムは、５’末端がキャップされており、３’テールがポリアデニル化されている、一本鎖プラス鎖ＲＮＡ分子を有する。二倍体ウイルス粒子は、ｇａｇタンパク質の「コア」構造内でｇａｇタンパク質、ウイルス酵素（ｐｏｌ遺伝子産物）および宿主ｔＲＮＡ分子と複合体を形成している、２本のＲＮＡ鎖を含有する。宿主細胞膜に由来し、ウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質を含有する、脂質二重層（脂質エンベロープ）が、このカプシドを包囲し、保護している。ｅｎｖタンパク質は、ウイルスの細胞受容体に結合し、ウイルスは、典型的には、受容体媒介エンドサイトーシスおよび／または膜融合によって宿主細胞に侵入する。
【0054】
標的化された細胞へのウイルス粒子の放出後、外側のエンベロープは脱落し、ウイルスＲＮＡは、逆転写によりＤＮＡにコピーされる。これは、ｐｏｌ領域によりコードされる逆転写酵素により触媒され、ビリオンにパッケージングされた宿主細胞ｔＲＮＡをＤＮＡ合成のプライマーとして使用する。このようにして、ＲＮＡゲノムは、より複雑なＤＮＡゲノムに変換される。
【0055】
逆転写により産生される二本鎖直鎖状ＤＮＡは、核内で環状化されていることもあり、されていないこともある。ここでプロウイルスは、長鎖末端反復（ＬＴＲ）として公知の、２つの同一の反復を、両方の末端に有する。２つのＬＴＲ配列の末端は、組み込みを触媒するｐｏｌ産物－－インテグラーゼタンパク質－－により認識される部位を産生し、したがって、プロウイルスは、ＬＴＲの末端から２塩基対（ｂｐ）が宿主ＤＮＡに常に結合されている。細胞配列の重複が両方のＬＴＲの末端に見られ、これは、転位遺伝因子の組み込みパターンを想起させる。レトロウイルスは、それらのＤＮＡを宿主ＤＮＡの多くの部位に組み込むことができるが、異なるレトロウイルスは、異なる組み込み部位優先性を有する。ＨＩＶ－１およびサル免疫不全ウイルスＤＮＡは、発現された遺伝子に優先的に組み込まれ、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ＤＮＡは、転写開始部位（ＴＳＳ）付近に優先的に組み込まれ、トリ肉腫・白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）およびヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）ＤＮＡは、ほぼランダムに組み込まれ、遺伝子へのわずかな優先性しか示さない（Derse D, et al.(2007), J Virol 81:6731-6741；Lewinski MK, et al.(2006), PLoS Pathog 2:e601）。
【0056】
組み込まれたウイルスＤＮＡの転写、ＲＮＡスプライシングおよび翻訳は、宿主細胞タンパク質により媒介される。様々にスプライシングされた転写物が生成される。ヒトの場合、レトロウイルスＨＩＶ－１／２およびＨＴＬＶ－Ｉ／ＩＩウイルスタンパク質は、遺伝子発現を調節するためにも使用される。細胞因子とウイルス因子間の相互作用は、ウイルス潜伏のおよびウイルスが発現される時系列の制御因子である。
【0057】
レトロウイルスを水平または垂直伝染させることができる。レトロウイルスの効率的感染は、ウイルスエンベロープタンパク質を特異的に認識する受容体の標的細胞上での発現を必要とするが、ウイルスは、効率の低い、受容体非依存性、非特異的侵入経路を使用することがある。通常は、ウイルス感染は、重複感染に対する耐性をもたらす結果となる受容体隠蔽または下方調節のため、細胞１個につき単一コピーまたは少数コピーのウイルスゲノムをもたらす（Ch3 p104 in "Retroviruses", JM Coffin, SH Hughes, & HE Varmus, 1997, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY；Fan et al. J. Virol 28:802, 1978）。組織培養における状況を操作することにより、ある程度、多重感染する可能性はあるが、これは、典型的には５コピー未満／二倍体ゲノムである。加えて、標的細胞型は、ウイルスが結合して浸透した後の複製サイクルの全ての段階を支援できなければならない。垂直伝染は、ウイルスゲノムが宿主の生殖細胞系列に組み込まれると起こる。次いで、プロウイルスは、まるで細胞遺伝子のように、世代から世代へと受け継がれることになる。したがって、多くの場合潜伏しているが、宿主が適切な作用因子に曝露されると活性化され得る、内在性プロウイルスが、樹立される。
【0058】
用語「レンチウイルス」は、その従来の意味で、逆転写酵素を含有するウイルスの属を記述するために使用される。レンチウイルスは、ヒト免疫不全（ＨＩＶ）１型および２型（ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２）ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む、「免疫不全ウイルス」を含む。
【0059】
オンコウイルスは、ウイルス成熟中に電子顕微鏡下で見られるような粒子形態に基づいて、昔からＡ、Ｂ、ＣおよびＤ群にさらに細分されている。Ａ型粒子は、感染細胞の細胞質に見られるＢおよびＤ型粒子の未成熟粒子を意味する。これらの粒子は、感染性ではない。Ｂ型粒子は、細胞質内Ａ型粒子のエンベロープ形成により原形質膜から成熟ビリオンとして出芽する。膜において、それらは、７５ｎｍのドーナツ型コアを有し、そのコアから長い糖タンパク質スパイクが突き出している。出芽後、Ｂ型粒子は、遍心的に位置する、高電子密度のコアを含有する。原型Ｂ型ウイルスは、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）である。Ｃ型ウイルスに感染した細胞では細胞質内粒子を観察することができない。その代わり、成熟粒子は、三日月「Ｃ」形に凝縮することによって細胞表面から直接出芽し、次いで、それ自体が接近し、原形質膜によって包囲される。エンベロープ糖タンパク質スパイクは、均一な高電子密度のコアとともに可視であり得る。出芽は、表面原形質膜から生じることもあり、または直接細胞内液胞へ生じることもある。Ｃ型ウイルスは、最もよく研究されており、トリおよびマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）の多くを含む。ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ならびにヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型およびＩＩ型（ＨＴＬＶ－Ｉ／ＩＩ）は、細胞表面からのそれらの出芽形態を理由に、同様にＣ型粒子として分類される。しかし、それらはまた、正六角形の形態、およびマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などの原型Ｃ型ウイルスよりも複雑なゲノム構造を有する。Ｄ型粒子は、これらのビリオンが短い表面糖タンパクスパイクを取り込むが、感染細胞の細胞質中で環状構造のように見える点でＢ型粒子に似ており、細胞表面から出芽する。高電子密度のコアも、粒子内に遍心的に位置する。Ｍａｓｏｎ－Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス（ＭＰＭＶ）は、原型Ｄ型ウイルスである。
【0060】
組換え複製可能レトロウイルスを治療に使用するための多くの状況で、組換え複製可能レトロウイルスによりコードされる導入遺伝子の発現レベルが高いことは有利である。例えば、シトシンデアミナーゼ遺伝子などのプロドラッグ活性化遺伝子に関して、プロドラッグ５－ＦＣの５－ＦＵへの変換が効率的であるために細胞におけるＣＤタンパク質の発現レベルがより高いことは有利である。同様に、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの高い発現レベルは、標的遺伝子発現のより効率的な抑制につながる。サイトカインまたはポリペプチド結合ドメイン（例えば、一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）など）についても、高レベルのサイトカインまたは結合ドメインを発現することは、通常、有利である。加えて、ベクターまたは導入遺伝子の活性を不活性化するまたは損なわせる変異がベクターの一部のコピーにある場合、標的細胞にベクターの複数のコピーがあることは、それによって無傷の導入遺伝子が効率的に発現される確率が高くなるので、有利である。
【0061】
上述の通り、組み込まれたＤＮＡ中間体は、プロウイルスと呼ばれる。以前の遺伝子療法または遺伝子送達系は、適切なヘルパーウイルスの存在下で、または夾雑ヘルパーウイルスの同時産生を伴わずにカプシド内封入を可能にする適切な配列を含有する細胞系において、プロウイルスの転写および感染性ウイルスへの集合を必要とする、方法およびレトロウイルスを使用する。同様の方法（ヘルパーウイルスまたは細胞系を補完する）が、ヘルパーなしのウイルスベクター調製物、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）からのものを生成するために使用されている。下記で説明されるように、カプシド内封入のための配列がゲノム内に備わっており、ひいては遺伝子送達または治療のための複製可能レトロウイルスベクターをもたらすので、ヘルパーウイルスは、本開示の組換えレトロウイルスの産生に必要とされない。同様に、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ラブドウイルス、麻疹、ポリオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、アルファウイルス、ワクシニアまたは他のポックスウイルスに由来するものなどの、複製可能ウイルスベクターについては、特定の操作された補完細胞系が必要なく、ウイルスベクターは、正常の宿主細胞の感染、および結果として生じるウイルスの回収により作製される。
【0062】
本開示のレトロウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは、少なくとも３つの遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを有し、これらの遺伝子は、１つもしくは２つの長鎖末端反復（ＬＴＲ）と隣接しており、またはプロウイルスの場合は、２つの長鎖末端反復（ＬＴＲ）、およびｐｓｉなどのシス作用性配列を含有する配列と隣接している。ｇａｇ遺伝子は、内部構造（マトリクス、カプシドおよびヌクレオカプシド）タンパク質をコードし、ｐｏｌ遺伝子は、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼおよびインテグラーゼをコードし、ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。５’および／または３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進する働きをする。ＬＴＲは、ウイルス複製に必要な全ての他のシス作用性配列を含有する。レンチウイルスは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、およびｖｐｘ（ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２および／またはＳＩＶの場合）を含む、追加の遺伝子を有する。レンチウイルスゲノムが、ＲＮＡゲノムであり、したがって、いずれのレトロウイルスゲノム配列への言及も、「Ｔ」が「Ｕ」である配列を暗に指すことは、当業者には理解されるであろう。したがって、レトロウイルスゲノムに言及するとき、Ｔを含有する特定の配列を有するｇａｇ核酸配列への言及は、ＴがＵで置き換えられることを暗に意味する。
【0063】
５’ＬＴＲには、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）、および粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なカプシド封入に必要な配列（Ｐｓｉ部位）が隣接している。カプシド封入（またはレトロウイルスＲＮＡの感染性ビリオンへのパッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムから欠けている場合、結果として、ゲノムウイルスＲＮＡのカプシド封入を妨げるシス欠損となる。このタイプの改変ベクターは、非複製性だがパッケージング可能なＲＮＡゲノムをパッケージングするウイルスタンパク質をトランスで提供する「ヘルパー」エレメントのような、以前の遺伝子送達系に典型的に使用されているもの（すなわち、ビリオンのカプシド封入に必要とされるエレメントを欠く系）である。
【0064】
本開示は、改変レトロウイルスベクターを提供する。改変レトロウイルスベクターは、レトロウイルス科のメンバーに由来し得、ＥＮＶ－２Ａ－ＳＳＰ－導入遺伝子カセットを含有するように操作され得る。上述の通り、レトロウイルス科は、次の３つの群からなる：スプーマウイルス－（または泡沫状ウイルス）、例えばヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）；レンチウイルス、およびヒツジのビスナウイルス；およびオンコウイルス（この群内の全てのウイルスが発がん性であるとは限らないが）。
【0065】
一実施形態では、ウイルスベクターは、分裂哺乳動物細胞のみを感染させることができる複製可能なレトロウイルスベクターであり得る。一実施形態では、複製可能なレトロウイルスベクターは、レトロウイルスエンベロープのすぐ下流にありそれに作動可能に連結しており、かつ分泌シグナルペプチド（ＳＳＰ）のコード配列のすぐ上流にある２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様配列を含み、そしてまたＳＳＰは、発現される異種核酸配列に連結している。ある特定の実施形態では、ベクターは、ＩＲＥＳカセットまたはＰｏｌＩＩ（もしくはミニプロモーター）もしくはｐｏｌＩＩＩカセットをさらに含むことができる。異種ポリヌクレオチドは、例えば、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、サイトカイン、受容体、抗体、抗体断片、結合ドメイン（例えば、非抗体結合ドメインもしくは非Ｉｇポリペプチド）などをコードすることができる。ｐｏｌＩＩＩプロモーターが含まれている場合、ベクターは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、または他のＲＮＡｉ配列をさらに発現することができる。
【0066】
別の実施形態では、本開示は、ＥＮＶ－２Ａ－ＳＳＰ－異種遺伝子カセットを提供する。カセットは、両種指向性、多種指向性、異種指向性、１０Ａ１、ＧＡＬＶ、ヒヒ内在性ウイルス、ＲＤ１１４、ラブドウイルス、アルファウイルス、麻疹およびインフルエンザウイルスエンベロープのうちの１つから選択されるエンベロープを含むことができる。２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列は、エンベロープコード配列のＣ末端に作動可能に連結している、図１または２に記載の配列のいずれかであり得る。別の実施形態では、２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列は、ＧＳＧリンカー配列（例えば、ｇｇａａｇｃｇｇａ（配列番号３））を介して連結している。別の実施形態では、ＧＳＧ－２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列は、ＳＳＰコード配列に連結している。異種遺伝子は、ＳＳＰコード配列のＣ末端に作動可能に連結している。異種遺伝子は、標的細胞内に送達され、発現される任意の所望の遺伝子であり得る。一実施形態では、異種遺伝子は、長さ５００～１５００ｂｐまたはその間の任意の数値（例えば、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐなど）を有する。別の実施形態では、異種遺伝子は、長さ＞１５００ｂｐを有する。別の実施形態では、カセットは、ＳＳＰペプチドコード配列の上流に、２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列により分離された２つの異種遺伝子を含む。さらに別の実施形態では、カセットは、ＥＮＶのＣ末端と、異種遺伝子のＮ末端に連結しているＳＳＰ配列のＮ末端との間に、作動可能に連結している２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様配列をコードするポリヌクレオチドであって、異種遺伝子の後に、第２の異種配列に連結しているＩＲＥＳまたはプロモーターを含む第２のカセットが続く、ポリヌクレオチドを含むことができる。
【0067】
異種核酸配列は、２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様配列に作動可能に連結しており、かつ２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様配列の下流にある、ＳＳＰペプチドをコードする配列に作動可能に連結している。本明細書で使用される場合、用語「異種」核酸配列または導入遺伝子は、（ｉ）野生型レトロウイルス内に通常は存在しない配列、（ｉｉ）外来種が起源である配列、または（ｉｉｉ）同じ種からのものである場合、その元の形態から実質的に改変され得る配列を指す。あるいは、細胞内に通常は発現されない不変の核酸配列は、異種核酸配列である。
【0068】
本開示のレトロウイルスベクターの使用目的に依存して、任意の数の異種ポリヌクレオチドまたは核酸配列をレトロウイルスベクターに挿入することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究のために、抗生物質耐性および蛍光分子（例えば、ＧＦＰ）または発光分子を含む、一般に使用されるマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子を、使用することができる。任意の所望のポリペプチド配列をコードする追加のポリヌクレオチド配列を本開示のベクターに挿入することもできる。
【0069】
異種核酸配列のｉｎ ｖｉｖｏ送達が求められる場合、治療用配列と非治療用配列の両方が使用され得る。本開示のＲＲＶは、ＳＳＰドメインを含む少なくとも１つのカセットを含むことになる。典型的には、ＳＳＰドメインは、ＲＲＶに感染した細胞から分泌される特定のポリペプチドまたはタンパク質の上流にある。一実施形態では、ＳＳＰが翻訳されたときに結合する分泌ポリペプチドの量を、ＳＳＰを欠く同じポリペプチドと比較して測定することにより、ＳＳＰの生物学的効果を決定することができる。
【0070】
一部の実施形態では、－２Ａ－ＳＳＰ－導入遺伝子カセットの後に、ミニプロモーター－カセット、ｐｏｌＩＩＩ－ＲＮＡｉカセット、またはＩＲＥＳ－カセットが続くことがある。例えば、ミニプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩカセットが使用される場合、カセットは、細胞増殖性障害または他の遺伝子関連疾患もしくは障害に関連する特定の遺伝子に方向付けられたｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどを含む、異種配列を含むことができる。他の実施形態では、ＳＳＰペプチドコード配列またはＩＲＥＳの下流の異種遺伝子は、自殺遺伝子（例えば、ＨＳＶ－ｔｋもしくはＰＮＰ、またはシトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチド；改変型または未改変型のいずれか）、成長因子または治療用タンパク質（例えば、第ＩＸ因子、ＩＬ２など）であり得る。本開示に適用可能な他の治療用タンパク質は、当技術分野において容易に同定される。異種遺伝子が、分泌されるタンパク質またはポリペプチドをコードする、ある特定の実施形態では、異種配列の前に、ＳＳＰペプチドのコード配列がある。例えば、抗体、抗体断片、または結合ドメインが、異種遺伝子によりコードされる場合、治療用カセットは、２Ａ－ペプチドまたはペプチド様コード配列、続いてＳＳＰコード配列を含み、ＳＳＰコード配列の後に、分泌されるポリペプチドまたはペプチド（例えば、抗体、抗体断片または結合ドメイン）をコードする異種ポリヌクレオチド配列が続く。ある特定の実施形態では、分泌されるポリペプチドは、チミジンキナーゼではない。一部の実施形態では、ＲＲＶは、２つのカセットを含み、一方のカセットは、分泌されるポリペプチドを含み、そのカセットの前にＳＳＰドメインがあり、もう一方のカセットは、分泌されないことになるポリペプチドまたは部分を含む。例えば、そのような二重カセットは、－２Ａ－ＳＳＰ－（分泌されるポリペプチド）－（２ＡまたはＩＲＥＳまたはミニプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩ）－（ポリペプチドまたはｍｉＲＮＡ）－を含み得る。
【0071】
一実施形態では、ベクター内の異種ポリヌクレオチドは、ヒト細胞における発現のために最適化された、シトシンデアミナーゼまたはチミジンキナーゼを含む。さらなる実施形態では、シトシンデアミナーゼは、ヒトコドン最適化されている配列を含み、シトシンデアミナーゼ安定性を増大させる変異（例えば、分解の減少もしくは熱安定性の増大）を含み、および／または野生型シトシンデアミナーゼと比較してトリプトファンコドンを非トリプトファンコードコドンに変化させる変異を含む。さらに別の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、ＵＰＲＴまたはＯＰＲＴ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している、シトシンデアミナーゼ活性を有する（ヒトコドン最適化されているまたは最適化されていないいずれか、変異したまたは変異していないいずれか）ポリペプチドを含む、融合構築物をコードする。
【0072】
抗体（およびそれらの断片）は、治療薬の重要なクラスである。それらの特異的結合および機能特性は、それらの作用様式を決定付ける。ＦＤＡ認可抗体のほとんどがアンタゴニストであり、それらの標的に対する高い結合親和性を有する。あるいは、抗体に置き換わる天然内在性タンパク質に由来する非免疫グロブリン（非Ｉｇ）足場タンパク質の開発が行われている。非Ｉｇタンパク質を使用する利点は、それらが、高い結合親和性を達成すること、それらが、抗体と比較して相対的に小さく、したがって、より効率的に組織に浸透することができることである。多価になるように、および／または複数の標的に対して特異的になるように、それらを操作することもできる。
【0073】
本開示は、プロドラッグ活性化遺伝子、サイトカインまたは受容体リガンドまたはそれらのアナログ、免疫グロブリン（Ｉｇ）および非Ｉｇ由来タンパク質を含むがこれらに限定されない、分泌タンパク質またはポリペプチドを産生するためのＧＳＧ連結２Ａペプチド構成を有するＲＲＶ中の天然または人工シグナルペプチドの使用を記載する。本開示は、異種分泌シグナルペプチドを有する異種導入遺伝子の発現のためのＩＲＥＳまたはミニ／マイクロプロモーターを有するものなどの、他のＲＲＶ構成も記載する。
【0074】
典型的には、本開示の組換え複製可能ウイルスベクターは、宿主細胞内に送達され、発現される異種遺伝子または配列を典型的に含有する「カセット」を含むように改変される。異種遺伝子または配列は、有効な発現を可能にするエレメント（例えば、異種配列の転写または翻訳を可能にするプロモーター、ＩＲＥＳまたはリードスルーエレメント）に作動可能に連結している。
【0075】
導入遺伝子（例えば、発現される異種配列）を、多数の位置のレトロウイルスゲノムに、例えば、長鎖末端反復（ＬＴＲ）、エンベロープの下流およびスプライスアクセプターの後への挿入、ｇａｇまたはｐｏｌタンパク質との融合体、エンベロープコード配列の下流の内部ＩＲＥＳ配列または小さい内部プロモーターなどに、挿入することができる。ＬＴＲへの導入遺伝子の挿入および追加のスプライスアクセプターの導入は、ベクターゲノムの急速な不安定化をもたらしたが、ＩＲＥＳおよび他の方法は、より大きな有望性を示している。導入遺伝子の発現および構成は、少なくとも一部は、潜在スプライスアクセプターの排除および導入遺伝子配列のヒト化などのキー配列の賢明な変化の影響を受け得る（例えば、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第８，７２２，８６７号を参照されたい）。導入遺伝子のサイズもベクターの安定性に影響を及ぼし得る。例えば、ある特定のベクターでは、導入遺伝子のサイズが増加するにつれて、ウイルスが不安定になり、異種遺伝子または配列の少なくとも一部を迅速に欠失する。この制限に、一部の事例では、例えばＭＬＶでは、異種遺伝子または配列のわずか９００～１２００ｂｐの挿入物しか残さない可能性がある、ＩＲＥＳ（通常は約６００ｂｐ、例えば、米国特許第８，７２２，８６７号を参照されたい）または小さいプロモーター（通常は２５０～３００ｂｐ、例えば、参照により本明細書に組み入れられる国際出願公開番号ＷＯ２０１４／０６６７００を参照されたい）などの発現可能化配列を含む必要性が、追い打ちをかける。したがって、利用可能な導入遺伝子のサイズを最大化して導入遺伝子のより多くの選択または複数の導入遺伝子を含めることができることは、非常に有用であろう。
【0076】
ヒト細胞において効率的に複製するレトロウイルスの一部の例としては、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）の両種指向性、多種指向性、異種指向性および１０Ａ１株、ならびにテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ヒヒ内在性ウイルスおよびネコウイルスＲＤ１１４が、挙げられる。同様に、両種指向性偽型ＲＲＶなどの非同種指向性エンベロープ遺伝子を含有するように改変されたＭＬＶの同種指向性株も、処置される様々な種および細胞型において効率的複製することができる。しかし、レトロウイルスエンベロープを、非レトロウイルスエンベロープ、例えば、ラブドウイルス、アルファウイルス、麻疹またはインフルエンザウイルスエンベロープにより置換することもできる。
【0077】
ピコルナウイルスおよび脳心筋炎ウイルスを含むいくつかのウイルスは、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からの複数のタンパク質発現を媒介するために、それらのゲノムに２Ａまたは２Ａ様ペプチドをコードする。２Ａペプチドは、典型的には配列が約１６～１８アミノ酸であり、コンセンサスモチーフ：Ｄ［Ｖ／Ｉ］ＥＸＮＰＧＰ（配列番号１）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である）を共有する。２Ａペプチドが人工マルチシストロニックｍＲＮＡのＯＲＦ間にコードされている場合、それは、リボソームを翻訳中のポリペプチドにおける２ＡペプチドのＣ末端で停止させ、したがって、各ＯＲＦに由来するポリペプチドが分離する結果となる（Doronina et al., 2008）。分離点は、２ＡのＣ末端であり、下流ＯＲＦの第１のアミノ酸はプロリンとなる（例えば図１を参照されたい）。２Ａペプチドのユニークな特徴は、単一のマルチシストロニックｍＲＮＡ構成からの複数タンパク質発現のための分子ツールとしてのその利用につながっている。
【0078】
２Ａペプチドは、ピコルナウイルス科ウイルスファミリー、例えば、口蹄疫ウイルスおよびウマ鼻炎Ａウイルス、ならびに他のウイルス、例えば、ブタテッショウウイルス－１および昆虫ウイルスＴｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルスの、ウイルスゲノムに存在する（図１）。２Ａペプチドは、それらのネイティブの状況でほぼ１００％「分離」効率を有し、それらが非ネイティブ配列に導入されたときにより低い「分離」効率を有することが多い。ウイルスの異なるクラスに見られる他の２Ａ様配列も、非ネイティブ配列において約８５％「分離」効率を達成することが示されている（Donnelly et al., 1997）。導入遺伝子を発現させるために本開示の方法および組成物において使用することができる多数の２Ａ様配列がある（図２）。
【0079】
２Ａ配列は、約２０年間存在することが公知であるが、非ネイティブ状況で機能するそれらの能力は疑問視されている。特に、２Ａ配列は、先行翻訳タンパク質のＣ末端におよそ１７～２２の追加のアミノ酸を残し、下流タンパク質のＮ末端にプロリンを加え、したがって、先行タンパク質の機能する能力に影響を与える可能性がある。タンパク質が、多くのウイルスエンベロープタンパク質の場合（T. Murakami, Mol Biol Int., 2012）と同様に、小胞体およびゴルジ体においてならびに／またはビリオンの成熟中に翻訳後修飾を必要とする場合、先行タンパク質の機能不全のさらなるリスクがある。
【0080】
通常は、ネイティブＭＬＶエンベロープタンパク質のプロセシングは、感染宿主細胞において起こる、前駆体タンパク質Ｐｒ８５からｇｐ７０（ＳＵ）およびｐ１５Ｅ（ＴＭ）サブユニットへの切断を伴う。Ｐｒ８５の切断は、宿主細胞からの出芽中のビリオンへのウイルスエンベロープタンパク質の効率的組み入れに必要とされる。ビリオンが宿主細胞膜から出芽するにつれて、ビリオンは、成熟プロセスを経て感染性になる。ＭＬＶビリオン成熟におけるプロセスの１つは、ウイルスプロテアーゼによる、エンベロープタンパク質のＴＭサブユニットのＣ末端に位置するＲ－ペプチドの除去を含む。最後のアミノ酸残基プロリン（Ｐｒｏ）を除いて、２Ａペプチドは、Ｒ－ペプチドの下流に発現され、それにより、２Ａペプチドの配列に依存して１６アミノ酸から少なくとも３２アミノ酸の長さのＲペプチドが生じる。Ｒ－ペプチドの長さは、理論的には、２Ａペプチド配列の付加により延長されるが、２Ａペプチドは、Ｒペプチドの切断により同時に除去され、その結果、機能的なエンベロープペプチドが得られることになる。
【0081】
エンベロープ配列が、非機能的であった場合または弱毒化された場合、ウイルスベクターは、有用でない可能性が高い。マウスのみを感染させる特定のエンベロープ（同種指向性）を有するレトロウイルス構築物において特定の２Ａ配列（ブタテッショウウイルス－１からのもの、「Ｐ２Ａ」）を使用することが試みられている（S. Stavrou et al., PLoS Pathog 10(5):e1004145, 2014；およびE.P. Browne, J.Virol. 89:155-64, 2015）。しかし、これらのウイルスは、ヒト細胞を感染させず、一般的なタンパク質プロセシング問題が解決されたという期待はない。その上、そのように構築されたウイルスは、治療効果を達成するのではなく、ｉｎ ｖｉｖｏでのウイルス複製を助長する遺伝子を発現するように設計された。
【0082】
一部の事例では、感染細胞から分泌される宿主に組換えレトロウイルスベクターにより送達されるタンパク質またはポリペプチドを有することが望ましい。すなわち、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含有するカセットを有するＲＲＶが、感染標的細胞から分泌されるように操作され、結果として生じるＲＲＶのプロウイルスＤＮＡは、標的細胞のゲノムに組み入れられる。上述の通り、分泌シグナルペプチドをポリペプチドまたはタンパク質の上流で操作して、ポリペプチドまたはタンパク質を細胞から分泌させることができる。そのような事例では、分泌シグナルペプチドコード配列は、２Ａまたは２Ａ様ペプチドと分泌されるポリペプチドまたはタンパク質との間に位置するように操作される。したがって、そのようなＲＲＶにおけるカセットは、ｅｎｖコード配列と３’ＬＲＴの間に位置し、一般構造：－－（ｅｎｖ）－－（２Ａ）－（ＳＳＰ）－（ポリペプチドまたはタンパク質）－（ＬＲＴ）を有することになる。前述の一般構造から分かるように、カセットをモジュラーのおよび様々な２Ａまたは２Ａ様配列と見なすことができ、ＳＳＰ配列およびポリペプチドまたはタンパク質配列を変化させる／シャッフルすることができる。
【0083】
モノクローナル抗体は、依然として、診断およびがん治療におけるヒト治療薬の主流である。それらは、長い血清半減期、二価性および免疫エフェクター機能を有する。免疫原性を最小限に押えるそれらの部分的または完全なヒトの性質にもかかわらず、モノクローナル抗体は、適切なジスルフィド結合形成およびグリコシル化プロセスを必要とする複数のドメインを有する複雑なタンパク質であり、したがって、その産生は真核生物細胞に制限され、このことによりスケーラビリティも制限されてきた。モノクローナル抗体のもう１つの重要な潜在的制限は、サイズ１５０ＫＤａの完全抗体も限定された組織浸透性および細胞内アクセシビリティーを有し得ると考えられることである。これらの制限の一部は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはＦａｂなどの断片化抗体の開発により克服された。さらなる開発は、軽鎖を欠く重鎖のみのアイソタイプを含む、ラクダ科動物および軟骨魚類の結合タンパク質も利用した。
【0084】
非免疫グロブリン（Ｉｇ）足場タンパク質は、抗原結合配列を同定するためにランダム化戦略を使用して、バイオ治療薬のために開発された（U.H Wiedle et al., Cancer Genomics & Proteomics 10:155-168, 2013；K.Skrlec et al., Trends in Biotechnology,33:408-418, 2015）。非Ｉｇ足場タンパク質は、ヒトおよび他の種からの天然タンパク質のドメイン由来サブユニットであり、または人工であり、６～２０ｋＤａのサイズ範囲であり、単一のポリペプチドから発現され得る。それらは、ランダム化、ファージディスプレイスクリーニングおよび親和性成熟プロセスによって、アンタゴニストまたはアゴニストとして機能することができる抗原結合足場タンパク質をもたらした、挿入、欠失および置換を許容し得る、表面に露出したループまたはアミノ酸をアルファ－ヘリックスまたはベータシートフレームワーク内に有する。現況では、足場結合剤として同定され、治療薬のために開発された、５０を超える異なるクラスの非Ｉｇ足場タンパク質がある。それらのサイズのために、これらのタンパク質が直面する１つの大きな課題は、循環における短い半減期につながる急速な腎クリアランスである。これらの非Ｉｇ足場タンパク質の半減期を向上させるための１つの一般的な解決策は、ＩｇＧのＦｃ領域に連結している足場タンパク質を含有する融合タンパク質の使用を伴う。もう１つの課題は、それらが、通常は、モノクローナル抗体より低い結合親和性（ＫＤ １～１００ｎＭ）を有し、速い解離速度を伴うことである。多量体化ドメインを含めるためのこれらの足場タンパク質の遺伝子改変は、ある特定のシグナル伝達経路では生体機能および治療効果をもたらすことができる、立体障害媒介遮断またはアビディティーを増加させ得る。ＩｇＧのＦｃ領域に連結した足場タンパク質を含有するかまたは二量体を生成するようにリンカーにより連結している足場タンパク質の２つの反復単位を含有する融合タンパク質を使用して、複数の方法が提案され、少なくとも一部は試験されている。リンカーペプチドおよびＩｇＧのＦｃ領域に加えて、二量体、三量体および五量体多量体化ドメインは、オリゴマー状態で天然に存在する所望のタンパク質の細胞外ドメインを発現させるために、またはタンパク質－タンパク質相互作用を強化するために利用されている。
【0085】
本開示は、足場ドメイン（例えば、アドヒロン足場；ヒトステフィンＡからの足場－その開示が参照により本明細書に組み入れられる、欧州特許第２２７９２０５８Ｂ１号およびＷＯ２０１９／００８３３５を参照されたい）により連結している重鎖および／または軽鎖ＣＤＲの組合せを含む結合ドメインを使用する組成物および方法を提供する。一部の実施形態では、結合ドメインのコード配列は、２Ａまたは２Ａ様ペプチドコード配列に作動可能に連結しており、２Ａまたは２Ａ様ペプチドコード配列の下流にある。別の実施形態では、結合ドメインのコード配列は、分泌シグナルペプチドのコード配列に作動可能に連結している。さらに別の実施形態では、結合ドメインのコード配列は、２Ａまたは２Ａ様ペプチドコード配列に作動可能に連結しており、２Ａまたは２Ａ様ペプチドコード配列の下流にあり、この２Ａまたは２Ａ様ペプチドコード配列は、今度は分泌シグナルペプチドコード配列に連結しており、したがって、核酸カセットは、一般構造：－－２Ａ－ＳＳＰ－結合ドメイン－－－を有する。他の実施形態では、本開示は、オリゴマー抗原結合足場タンパク質を形成するためのＩｇＧのＦｃ領域、ＩｇＡおよびＩｇＭのＦｃ領域の部分、グリシン－セリンリンカーならびに多量体化ドメインの組成物および使用を提供する。前述のいずれかを、配列最適化を有するＲＲＶと組み合わせて使用して、Ａｐｏｂｅｃ３媒介高頻度変異を最小限に抑えることができ、ひいてはタンパク質安定性および／またはアビディティーならびに可能性のあるより良好な生体機能および治療効果のための発現を増強することができる。本開示は、静脈内投与されたとき、血液循環におけるこれらの抗原結合性非Ｉｇ足場タンパク質の急速なクリアランスを相殺し、オフターゲット効果および毒性を最小限にするために、治療用ペイロードを腫瘍微小環境に送達するための、発現ベクターおよび使用方法、特に、高い腫瘍標的化特異性を有するウイルスベクターも提供する。表１、２、３、４および５は、本開示の組成物および方法において有用な配列を提供する。ＲＮＡが本開示により企図されるので、以下の核酸配列では「Ｔ」が「Ｕ」であり得ることに、留意されたい。
【0086】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0087】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【0088】
【表3】
【0089】
【表4】
【0090】
【表5-1】
【表5-2】
【0091】
【表6】
【0092】
【表7】
【0093】
本開示のＲＲＶをそれらの安定性および／または発現を改変するように操作することができる。例えば、発現の変化は、不活性化または弱毒化変異が、複製するレトロウイルスベクターに、それが腫瘍組織において漸進的に複製するにつれて蓄積する頻度に起因して、起こることがある。研究は、最も頻度の高い事象の１つがＧからＡへの変異（逆転写ステップにおける第１の複製ステップからのマイナス鎖一本鎖ＤＮＡのＡｐｏＢｅｃ媒介変異に特有のＣからＴに相当する）であることを示す。これは、ＲＲＶタンパク質のアミノ酸組成の変化、およびＴＧＧ（トリプトファン）から停止コドン（ＴＡＧまたはＴＧＡ）への壊滅的変化を引き起こし得る。一実施形態では、この不活性化変化は、トリプトファンコドンの代わりにフェニルアラニンまたはチロシンなどの、類似の化学的または構造的特性を有する他のアミノ酸のコドンを操作することにより回避される。
【0094】
したがって、２Ａ－ペプチド－ＳＳＰカセットに加えて、ＲＲＶは、宿主細胞における構造の発現および／または安定性を向上させる複数の追加の変異を含み得る。そのような変異は、ＧＡＧ、ＰＯＬおよび／またはＥＮＶドメインの生物活性を維持する許容されるコドンにトリプトファンコドンを変化させる、ＧＡＧ、ＰＯＬおよび／またはＥＮＶコード配列内の１つまたは複数のコドンの改変を含み得る。トリプトファンのコドンがＵＧＧ（ＤＮＡではＴＧＧ）であることは、当技術分野において公知である。さらに、「停止コドン」がＵＡＡ、ＵＡＧまたはＵＧＡ（ＤＮＡではＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）であることは、当技術分野において公知である。トリプトファンコドンの単一の点変異は、非天然停止コドンの原因となり得る（例えば、ＵＧＧ－＞ＵＡＧ、またはＵＧＧ－＞ＵＧＡ）。ヒトＡＰＯＢＥＣ３ＧＦ（ｈＡ３Ｇ／Ｆ）が、Ｇ－＞Ａ高頻度変異によってレトロウイルス複製を阻害することも公知である（Neogi et al., J. Int. AIDS Soc., 16(1):18472, Feb. 25, 2013）。さらに、下記で説明されるように、長期発現およびウイルス安定性は、コード配列におけるトリプトファンコドンの使用を回避することによって、ｈＡ３Ｇ／Ｆにより引き起こされる高頻度変異に起因する非天然停止コドンの組み入れを回避することにより、向上させることができる。例えば、一実施形態では、ＭＬＶ由来の核酸配列は、トリプトファンコドン内にある、表Ａ（配列番号２を基準とするヌクレオチド番号）で同定されるヌクレオチドを含有するコドンの改変を含み得るＧＡＧ、ＰＯＬおよびＥＮＶコードドメインを含み、ｈＡ３Ｇ／Ｆ耐性ＲＲＶを得ることができる。
【0095】
【表A】
【0096】
したがって、本開示の一実施形態では、変異がコドンをトリプトファン以外のアミノ酸のコドンに変化させる、トリプトファンのコドンの１つまたは複数の変異であって、生体適合性であるコドンを（すなわち、ベクターの機能を破壊しないコドン）をもたらす変異を含む、組換え複製可能レトロウイルスが、提供される。このベクターは、本明細書では、「ＡｐｏＢｅｃ不活性化耐性ベクター」または「ＡｐｏＢｅｃ耐性ベクター」と呼ばれることもある。組換えＡｐｏＢｅｃ不活性化耐性ベクターは、ＩＲＥＳカセット、プロモーターカセットおよび／または２Ａペプチド－ＳＳＰカセットを含み得る。
【0097】
上述の通り、ヒトＡＰＯＢＥＣ３ｇは、ＧをＡに変換するウイルスベクター配列の高頻度変異を引き起こす（Hogan et al., Can.Res., 2018）。したがって、２Ａ－ＳＳＰペプチドカセットに含有される異種ポリヌクレオチドにおけるトリプトファンコドンは、ｈＡＰＯＢＥＣ３により停止コドンに変換されやすい。そのような変異を回避するために、トリプトファンコドンを他のアミノ酸の生物学的に許容されるコドンに置き換えることができる。例えば、一実施形態では、本開示の２Ａ－ＳＳＰカセットは、シトシンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができ、このポリヌクレオチドは、配列：
（または「ｔ」が「ｕ」である上述のもの）を含む。
【化1】
【0098】
この配列は、２つのトリプトファンコドン（太字／下線付き）を含む。本開示の一実施形態では、これらのコドンは、独立して、Ｄ、Ｍ、Ｔ、Ｅ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ａ、Ｋ、Ｈ、Ｐ、Ｒ、Ｖ、Ｌ、Ｇ、ＩおよびＣからなる群より選択されるアミノ酸を提供するコドンへの変化を受ける。結果として得られるポリペプチドは、配列：
を含み、このポリペプリドは、シトシンデアミナーゼ活性を有し、ここでＸは、トリプトファンを除く任意のアミノ酸である。一実施形態では、配列番号２９におけるＸは、各々独立して、Ｆ、Ｄ、Ｍ、Ｌ、ＳまたはＲからなる群より選択される。
【化2】
【0099】
別の実施形態では、複製可能レトロウイルスベクターは、シトシンデアミナーゼを有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド（本明細書に記載されるような）を含むことができ、ウイルスプロモーターからの一次転写物の一部としての、または細胞型または組織特異的であり得るプロモーターに連結している、いずれかの、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子を含むポリヌクレオチドをさらに含むこともある。またさらなる実施形態では、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの前にｐｏｌ ＩＩＩプロモーターがあることもある。
【0100】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、小さい非コードＲＮＡである。それらは、コード遺伝子もしくは非コード遺伝子のイントロン内、非コード遺伝子のエクソン内、または遺伝子間領域に位置する。ｍｉＲＮＡコード配列は、一次ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる前駆体ポリヌクレオチドを生成するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより転写される。核内のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、リボヌクレアーゼＤｒｏｓｈａによりプロセシングされて、ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）を産生し、この前駆体が短ヘアピン構造を形成する。その後、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、エクスポーチン５によって細胞質に輸送され、ダイサーと呼ばれる別のリボヌクレアーゼによりさらにプロセシングされて、活性、成熟ｍｉＲＮＡを生成する。ｓｉＲＮＡ配列の前にＳＳＰコード配列がなく、むしろｓｉＲＮＡは、ウイルスベクター内の治療用カセットに存在する第２のカセットの一部である。
【0101】
成熟ｍｉＲＮＡは、およそ２１ヌクレオチド長である。それは、標的化された遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域に結合すること、およびｍＲＮＡのタンパク質翻訳の抑制または分解のいずれかによりタンパク質発現を抑制することによって、機能を発揮する。ｍｉＲＮＡは、発生、細胞増殖、分化およびがん進行を含む、生物学的プロセスに関与する。ｍｉＲＮＡプロファイリングの研究は、一部のｍｉＲＮＡ発現が組織特異的であり、ある特定の組織に濃縮されることを示す。例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１８１およびｍｉＲ－２２３発現は、ヒトおよびマウスにおける造血組織に濃縮されることが実証されている（Baskerville et al., 2005 RNA 11, 241-247；Chen et al., 2004 Science 303, 83-86）。
【0102】
一部のｍｉＲＮＡは、いくつかの腫瘍において上方調節される（発がん性ｍｉＲＮＡ）または下方調節される（リプレッサー）ことが観察されている（Spizzo et al., 2009 Cell 137, 586e1）。例えば、ｍｉＲ－２１は、神経膠芽腫、乳房、肺、前立腺、結腸、胃、食道および子宮頸がん、子宮平滑筋肉腫、ＤＬＢＣＬ、頭頸部がんにおいて過剰発現される。対照的に、ｌｅｔ－７のメンバーは、神経膠芽腫、肺、乳房、胃、卵巣、前立腺および結腸がんにおいて下方調節されることが報告されている。がんにおけるｍｉＲＮＡ発現の恒常性の再確立は、がん進行を阻害するまたは逆転させるために不可避の機序である。
【0103】
がんにおいて下方調節されるｍｉＲＮＡは、抗がん剤として有用であり得る。例としては、ｍｉｒ－１２８－１、ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－２６、ｍｉＲ－１２４およびｍｉＲ－１３７が挙げられる（Esquela-Kerscher et al., 2008 Cell Cycle 7, 759-764；Kumar et al., 2008 Proc Natl Acad Sci USA 105, 3903-3908；Kota et al., 2009 Cell 137, 1005-1017；Silber et al., 2008 BMC Medicine 6:14 1-17）。ｍｉＲ－１２８発現は、中枢神経系に濃縮されることが報告されており、神経膠芽腫において下方調節されることが観察されている（Sempere et al., 2004 Genome Biology 5:R13.5-11；Godlewski et al., 2008 Cancer Res 68: (22) 9125-9130）。ｍｉＲ－１２８は、ｍｉＲ－１２８－１およびｍｉＲ－１２８－２という２つの明確に異なる遺伝子によりコードされる。両方ともプロセシングされて、同一の成熟配列になる。Ｂｍｉ－１およびＥ２Ｆ３ａは、ｍｉＲ－１２８の直接的標的であることが報告されている（Godlewski et al., 2008 Cancer Res 68: (22) 9125-9130；Zhang et al., 2009 J. Mol Med 87:43-51）。加えて、Ｂｍｉ－１発現は、神経膠腫、マントル細胞リンパ腫、小細胞肺がん、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、乳房、大腸および前立腺がんを含む、様々なヒトがんにおいて上方調節されることが観察されている。さらに、Ｂｍｉ－１は、神経幹細胞をはじめとする多様な組織からの幹細胞ならびに神経膠腫における「幹様」細胞集団の自己複製に必要とされることが実証されている。
【0104】
ヘアピン二重鎖のステム長を設計するために好適な範囲は、２０～３０ヌクレオチド、３０～５０ヌクレオチド、５０～１００ヌクレオチド、１００～１５０ヌクレオチド、１５０～２００ヌクレオチド、２００～３００ヌクレオチド、３００～４００ヌクレオチド、４００～５００ヌクレオチド、５００～６００ヌクレオチド、および６００～７００ヌクレオチドのステム長を含む。ヘアピン二重鎖のループ長を設計するために好適な範囲は、４～２５ヌクレオチド、２５～５０ヌクレオチドのループ長、またはヘアピン二重鎖のステム長がかなりのものである場合にはそれより長いループ長を含む。ある特定の文脈では、２１ヌクレオチドより長い二重鎖領域を有するヘアピン構造は、ループの配列および長さに関係なく、有効なｓｉＲＮＡ依存性サイレンシングを促進することができる。
【0105】
さらに別のまたはさらなる実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、インターロイキン、インターフェロンガンマなどのようなサイトカインを含むことができる。本開示のレトロウイルスベクターから発現され得るサイトカインとしては、ＩＬ－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、１Ｌ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＩＬ－３６、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ－ガンマおよびＴＮＦ－アルファ、可溶性形態のＴＮＦ－アルファ、リンホトキシン－アルファ（ＬＴ－アルファ、ＴＮＦ－ベータとしても公知）、ＬＴ－ベータ（複合ヘテロ三量体ＬＴ－アルファ２－ベータに見られる）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ－ガンマ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３２８）、ＡＩＭ－Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、エンドカイン－アルファ（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＯＰＧ、およびニュートロカイン－アルファ（国際公開番号ＷＯ９８／１８９２１）、ＯＸ４０、および神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４－ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、およびＴＲ１２、ならびに可溶性形態のＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣＤ１５３が挙げられるが、これらに限定されない。血管新生タンパク質は、一部の実施形態では、特に、細胞系からのタンパク質産生に、有用であり得る。そのような血管新生因子としては、神経膠腫由来増殖因子（ＧＤＧＦ）、血小板由来増殖因子－Ａ（ＰＤＧＦ－Ａ）、血小板由来増殖因子－Ｂ（ＰＤＧＦ－Ｂ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、胎盤成長因子－２（ＰＩＧＦ－２）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮増殖因子－Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）、血管内皮増殖因子－２（ＶＥＧＦ－２）、血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ－３）、血管内皮増殖因子Ｂ－１ ８６（ＶＥＧＦ－Ｂ１８６）、血管内皮増殖因子－Ｄ（ＶＥＧＦ－Ｄ）、血管内皮増殖因子－Ｄ（ＶＥＧＦ－Ｄ）、および血管内皮増殖因子－Ｅ（ＶＥＧＦ－Ｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。線維芽細胞増殖因子は、本開示のベクターにより送達することができ、これらに限定されないが、ＦＧＦ－１、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－３、ＦＧＦ－４、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－８、ＦＧＦ－９、ＦＧＦ－１０、ＦＧＦ－１１、ＦＧＦ－１２、ＦＧＦ－１３、ＦＧＦ－１４、およびＦＧＦ－１５を含む。造血成長因子は、本開示のベクターを使用して送達することができ、そのような成長因子としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）（サルグラモスチム）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）（フィルグラスチム）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ、ＣＳＦ－１）、エリスロポエチン（エポエチンアルファ）、幹細胞因子（ＳＣＦ、ｃ－ｋｉｔリガンド、造血幹細胞因子）、巨核球コロニー刺激因子、ＰＩＸＹ３２１（ＧＭＣＳＦ／ＩＬ－３）融合タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0106】
異種核酸配列は、典型的に、ウイルスＬＴＲプロモーター－エンハンサーエレメントの制御下にある。したがって、本開示の組換えレトロウイルスベクター、所望の配列、遺伝子および／または遺伝子断片をいくつかの部位に、異なる調節配列のもとで挿入することができる。例えば、挿入部位は、ウイルスエンハンサー／プロモーター近位部位（すなわち、５’ＬＴＲ駆動遺伝子座）であり得る。
【0107】
一実施形態では、本開示のレトロウイルスゲノムは、ＳＳＰコード配列の上流に２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列を含有し、ＳＳＰコード配列には、下流に、所望の／異種ポリヌクレオチドの挿入のためのクローニング部位が続く。一実施形態では、２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列は、レトロウイルスベクター内のｅｎｖ遺伝子の３’側に、しかしＳＳＰコード配列および所望の異種ポリヌクレオチドの５’側に位置する。したがって、所望のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様－ＳＳＰコード配列に作動可能に連結している。
【0108】
別の実施形態では、標的化ポリヌクレオチド配列は、本開示の組換えレトロウイルスベクターの一部として含まれる。標的化ポリヌクレオチド配列は、標的化リガンド（例えば、ペプチドホルモン、例えば、ヘレグリン、一本鎖抗体、受容体もしくは受容体のリガンド）、組織特異的もしくは細胞型特異的調節エレメント（例えば、組織特異的もしくは細胞型特異的プロモーターもしくはエンハンサー）、または標的化リガンドと組織特異的／細胞型特異的調節エレメントの組合せである。好ましくは、標的化リガンドは、レトロウイルスのｅｎｖタンパク質に作動可能に連結し、またはレトロウイルスのｅｎｖタンパク質に存在し、キメラレトロウイルスｅｎｖタンパク質を生成する。ウイルスＧＡＧ、ウイルスＰＯＬおよびウイルスＥＮＶタンパク質は、任意の好適なレトロウイルスに由来し得る（例えば、ＭＬＶまたはレンチウイルス由来）。別の実施形態では、ウイルスＥＮＶタンパク質は、非レトロウイルス由来である（例えば、ＣＭＶまたはＶＳＶ）。
【0109】
一実施形態では、本開示の組換えレトロウイルスは、ウイルスが、特定の細胞型（例えば、平滑筋細胞、肝細胞、腎細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、間葉系幹細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、上皮細胞、腸細胞、乳腺細胞、新生物細胞、神経膠腫細胞、神経細胞および当技術分野において公知の他のもの）に標的化され、したがって、レトロウイルスベクターの組換えゲノムが、標的非分裂、標的分裂細胞、細胞増殖性障害を有する標的細胞に送達されるように、遺伝子改変される。
【0110】
一実施形態では、本開示は、非分裂細胞、分裂細胞、または細胞増殖性障害を有する細胞を感染させることができる組換えレトロウイルスを提供する。本開示の組換え複製可能レトロウイルスは、ウイルスＧＡＧ、ウイルスＰＯＬ、ウイルスＥＮＶをコードする、ポリヌクレオチド配列と、ウイルスＥＮＶ配列のすぐ下流（例えば、下流の１～５０の間（１～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、またはこれらの間の任意の整数）のヌクレオチド）の２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列と、異種遺伝子に作動可能に連結しており、ビリオン内にカプシド封入されているＳＳＰコード配列とを含む。
【0111】
「非分裂」細胞という句は、有糸分裂を経ていない細胞を指す。非分裂細胞は、細胞が活発に分裂しない限り、細胞周期の任意の時点（例えば、Ｇ０／Ｇ１、Ｇ１／Ｓ、Ｇ２／Ｍ）でブロックされ得る。ｅｘ ｖｉｖｏ感染のために、分裂細胞を、照射、アフィジコリン（aphidocolin）処置、血清飢餓、および接触阻害を含む、当業者により使用される標準的な技法によって処置して、細胞分裂をブロックすることができる。しかし、多くの細胞が既に停止されている（例えば、最終分化細胞）ので、ｅｘ ｖｉｖｏ感染は、細胞をブロックすることなく行われることが多いことは、理解されるはずである。例えば、組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞を感染させることができる。体内の既存の非分裂細胞の例としては、神経、筋肉、肝臓、皮膚、心臓、肺および骨髄細胞、ならびにこれらの派生物が挙げられる。分裂細胞については、ガンマレトロウイルスベクターを使用することができる。このタイプのレトロウイルスは、分裂細胞にのみ生産的に感染し、この特性は、このベクタークラスの腫瘍選択性に寄与するからである。
【0112】
「分裂」細胞とは、活発な有糸分裂、または減数分裂を経る細胞を意味する。そのような分裂細胞は、幹細胞、皮膚細胞（例えば、線維芽細胞およびケラチノサイト）、内皮細胞、配偶子、および当技術分野において公知の他の分裂細胞を含む。特に興味深く、用語分裂細胞により包含されるのは、新生物細胞などの細胞増殖性障害を有する細胞である。用語「細胞増殖性障害」は、異常な数の細胞分裂を特徴とする状態を指す。状態は、肥大性（組織内の細胞集団の過成長を生じさせる継続的細胞増殖）および発育不全（組織内の細胞の欠乏または欠損）細胞成長の両方、または身体部位への過剰な細胞流入または遊走を含む。細胞集団は、必ずしも形質転換された、腫瘍原性または悪性細胞ではなく、正常細胞も含み得る。細胞増殖性障害は、結合組織の過成長に関連する障害、例えば、強皮症、関節炎および肝硬変をはじめとする様々な線維性状態を含む。細胞増殖性障害は、新生物障害、例えば、頭頸部癌を含む。頭頸部癌は、例えば、口、食道、咽頭、喉頭、甲状腺、舌、唇、唾液腺、鼻、副鼻腔、上咽頭の癌腫、上方鼻背部（superior nasal vault）および洞の腫瘍、感覚神経芽細胞腫、扁平上皮がん、悪性黒色腫、副鼻腔未分化癌（ＳＮＵＣ）、脳（多形性神経膠芽腫を含む神経膠芽腫）または血液腫瘍を含む。頸部リンパ節、喉頭前リンパ節、肺食道傍リンパ節および顎下リンパ節を含む局所のリンパ節の癌腫も含まれる（eds., Isselbacher, et al., McGraw-Hill, Inc., 13th Edition, ppl850-1853, 1994）。他のがん型としては、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、前立腺がん、尿路がん、子宮がん、リンパ腫、口腔がん、膵臓がん、白血病、黒色腫、胃がん、皮膚がんおよび卵巣がんが挙げられるが、これらに限定されない。細胞増殖性疾患は、免疫系の細胞の不適切な増殖を、多くの場合、特徴とする、関節リウマチ（O'Dell NEJM 350:2591 2004）および他の自己免疫障害（Mackay et al NEJM 345:340 2001）も含む。
【0113】
一実施形態では、レトロウイルスベクターは、細胞の外表面に分子を有する細胞に結合することにより細胞に標的化される。レトロウイルスを標的化するこの方法は、レトロウイルスの表面での標的化リガンドの発現を利用して、レトロウイルスの表面の標的化リガンドと相互作用する受容体または結合分子を有する細胞または組織にウイルスを標的化するのを支援する。ウイルスによる細胞の感染後、ウイルスは、その核酸を細胞に送達し、逆転写の完了後、レトロウイルス遺伝物質が宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。
【0114】
例えば、特異的標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする別の遺伝子とともに、目的の異種ポリヌクレオチドを本開示のウイルスベクターに挿入することにより、ベクターは、今や標的特異的である。例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を結合させることにより、レトロウイルスベクターを標的特異的にすることができる。当業者は、目的の核酸配列を含有するウイルスベクターの標的特異的送達を可能にするためにウイルスエンベロープに結合することができる、ウイルスゲノムまたはタンパク質に挿入することができる特定のポリヌクレオチド配列が分かるであろう、またはそのような配列を容易に突き止めることができる。
【0115】
したがって、本開示は、一実施形態では、標的化ポリペプチドに作動可能に連結しているレトロウイルスＥＮＶタンパク質を含むキメラＥＮＶタンパク質を含む。標的化ポリペプチドは、細胞特異的受容体分子、細胞特異的受容体のリガンド、細胞特異的抗原性エピトープに対する抗体もしくは抗体断片、または標的細胞と結合もしくは相互作用することができる当技術分野において容易に同定される任意の他のリガンドであり得る。抗体、抗体断片またはキメラＥＮＶを形成する結合ドメインは、抗体、抗体断片または結合ドメインのコード配列を含み得るＳＳＰを伴うまたは伴わない２Ａまたは２Ａ様ペプチドコード配列の下流の異種遺伝子とは別であり、明確に異なることに、留意されたい。標的化ポリペプチドまたは分子の例としては、ビオチン－ストレプトアビジンをリンカーとして使用する二価抗体（Etienne-Julan et al., J. Of General Virol., 73, 3251-3255 (1992)；Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86, 9079-9083 (1989)）、ハプテンに対する一本鎖抗体可変領域をコードする配列をそのエンベロープに含有する組換えウイルス（Russell et al., Nucleic Acids Research, 21, 1081-1085 (1993)）、レトロウイルスエンベロープにペプチドホルモンリガンドのクローニング（Kasahara et al., Science, 266, 1373-1376 (1994)）、キメラＥＰＯ／ｅｎｖ構築物（Kasahara et al., 1994）、ＬＤＬ受容体を発現するＨｅＬａ細胞の特異的感染をもたらす、同種指向性ＭＬＶエンベロープにおける低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体に対する一本鎖抗体（Somia et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92, 7570-7574 (1995)）が挙げられ、同様に、インテグリンリガンドの組み入れによりＡＬＶの宿主範囲を変更することができ、それにより、ウイルスは、今や種を越えてラット神経膠芽腫細胞を特異的に感染させることが可能であり（Valsesia-Wittmann et al., J. Virol.68, 4609-4619 (1994)）、Ｄｏｒｎｂｅｒｇおよび共同研究者（Chu and Dornburg, J. Virol 69, 2659-2663 (1995)；M. Engelstadter et al.Gene Therapy 8,1202-1206 (2001)）は、腫瘍マーカーに対する一本鎖抗体を含有するエンベロープを使用する、トリレトロウイルスである、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）の組織特異的標的化を報告している。
【0116】
本開示は、標的細胞を感染させることができる組換えレトロウイルスを産生する方法であって、ウイルスｇａｇ、ウイルスｐｏｌおよびウイルスｅｎｖをコードするポリヌクレオチド配列と、ｅｎｖの下流にある２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列と、作動可能に連結しており、２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列と異種ポリヌクレオチドとの間にあるＳＳＰコード配列と、パッケージングおよびプサイ配列とを含むベクターを、好適な宿主細胞にトランスフェクトするステップ、および組換えウイルスを回収するステップを含む、方法を提供する。
【0117】
本開示のレトロウイルスおよび方法は、ビリオンを増殖および産生させるためにヘルパーウイルスも追加の核酸配列またはタンパク質も必要としない複製可能レトロウイルスを提供する。例えば、本開示のレトロウイルスの核酸配列は、上記で論じられたような、群特異的抗原および逆転写酵素（ならびに成熟および逆転写に必要なインテグラーゼおよびプロテアーゼ酵素）をそれぞれコードする。ウイルスｇａｇおよびｐｏｌは、レンチウイルス、例えばＨＩＶ、またはオンコレトロウイルスまたはガンマレトロウイルス、例えばＭｏＭＬＶに由来し得る。加えて、本開示のレトロウイルスの核酸ゲノムは、ウイルスエンベロープ（ＥＮＶ）タンパク質をコードする配列を含む。ｅｎｖ遺伝子は、任意のレトロウイルスに由来し得る。ｅｎｖは、ヒトおよび他の種の細胞の形質導入を可能にする両種指向性エンベロープタンパク質であることもあり、またはマウスおよびラット細胞のみに形質導入することができる同種指向性エンベロープタンパク質であることもある。さらに、エンベロープタンパク質と特定の細胞型の受容体への標的化のための抗体または特定のリガンドとの連結により、組換えウイルスを標的化することが望ましいこともある。上述のように、例えば、糖脂質またはタンパク質を挿入することにより、レトロウイルスベクターを標的特異的にすることができる。標的化は、特定の細胞型（例えば、ある特定の組織に見られる細胞型、またはがん細胞型）上の抗原にレトロウイルスベクターを標的化するために、抗体を使用して遂行されることが多い。当業者は、過度の実験をすることなく、特定の標的へのレトロウイルスベクターの送達を果たすための特定の方法が分かるであろう、またはそのような方法を容易に突き止めることができる。一実施形態では、ｅｎｖ遺伝子は、非レトロウイルス（例えば、ＣＭＶまたはＶＳＶ）に由来する。レトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の例としては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガサル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。他のｅｎｖ遺伝子、例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（プロテインＧ）、サイトメガロウイルスエンベロープ（ＣＭＶ）、またはインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）も、使用することができる。
【0118】
一実施形態では、レトロウイルスゲノムは、オンコ－レトロウイルス、より詳細には、哺乳動物オンコレトロウイルスに由来する。さらなる実施形態では、レトロウイルスゲノムは、ガンマレトロウイルス、より詳細には、哺乳動物ガンマレトロウイルスに由来する。「由来する」とは、親ポリヌクレオチド配列が、天然に存在する配列の挿入または除去（例えば、２Ａペプチドもしくは２Ａペプチド様コード配列、ＳＳＰコード配列、およびポリペプチドと必要に応じて１つもしくは複数のＩＲＥＳとをコードする異種ポリヌクレオチド、または別の異種ポリヌクレオチドもしくは目的の阻害性核酸に連結しているｐｏｌＩＩＩプロモーターそれぞれの挿入）により改変された野生型オンコウイルスであることを意味する。
【0119】
別の実施形態では、本開示は、調節配列を使用して標的化されるレトロウイルスベクターを提供する。細胞特異的または組織特異的調節配列（例えば、プロモーター）を利用して、特定の細胞集団における遺伝子配列の発現を標的化することができる。本開示に好適な哺乳動物およびウイルスプロモーターは、本明細書の他の箇所で説明される。したがって、一実施形態では、本開示は、レトロウイルスゲノムの５’末端に組織特異的プロモーターエレメントを有するレトロウイルスを提供する。典型的には、組織特異的調節エレメント／配列は、レトロウイルスゲノムのＬＴＲのＵ３領域に存在し、例えば、新生物細胞に対する細胞特異的または組織特異的プロモーターおよびエンハンサー（例えば、腫瘍細胞特異的エンハンサーおよびプロモーター）、および誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリン）を含む。
【0120】
本開示の転写制御配列は、スーパー抗原、サイトカインまたはケモカインをコードする遺伝子と天然で会合している、天然に存在する転写制御配列も含み得る。
【0121】
一部の環境では、発現を調節することが望ましいこともある。例えば、様々な活性強度を有する異なるウイルスプロモーターを、所望の発現レベルに依存して利用することができる。哺乳動物細胞では、ＣＭＶ最初期プロモーターが、強力な転写活性化をもたらすために使用されることが多い。作用強度が低いＣＭＶプロモーターの改変バージョンも、導入遺伝子の発現レベル低下が所望される場合に使用されている。造血細胞における導入遺伝子の発現が所望される場合、ＭＬＶまたはＭＭＴＶからのＬＴＲなどのレトロウイルスプロモーターを使用することができる。使用することができる他のウイルスプロモーターとしては、ＳＶ４０、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２ ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター、例えばＥ１Ａ、Ｅ２ＡもしくはＭＬＰ領域からのもの、ＡＡＶ ＬＴＲ、カリフラワーモザイクウイルス、ＨＳＶ－ＴＫ、ならびにトリ肉腫ウイルスが挙げられる。
【0122】
同様に、組織特異性または選択的プロモーターは、標的としない組織に対する潜在的毒性または望ましくない効果を低下させるために、特定の組織または細胞における転写を行うために使用され得る。例えば、前立腺における遺伝子発現を標的とするために、ＰＳＡ、プロバシン、前立腺酸性ホスファターゼまたは前立腺特異的腺性カリクレイン（ｈＫ２）などのプロモーターを使用することができる。乳清アクセサリータンパク質（ＷＡＰ）を乳房組織発現に使用することができる（Andres et al., PNAS 84:1299-1303, 1987）。使用することができる他のプロモーター／調節ドメインは、下記に示される。
【0123】
「組織特異的調節エレメント」は、ある組織では遺伝子の転写を駆動することができるが、他の組織型では主として「サイレント」なままである、調節エレメント（例えば、プロモーター）である。しかし、組織特異的プロモーターが、それらがサイレントであることが予想される組織において検出可能な量の「バックグラウンド」または「基礎」活性を有することもあることは、理解されるであろう。プロモーターが標的組織において選択的に活性化される程度は、選択性比（標的組織における活性／対照組織における活性）として表現することができる。このことに関して、典型的には、本開示の実施に有用な組織特異的プロモーターは、約５より大きい選択性比を有する。好ましくは、選択性比は、約１５より大きい。
【0124】
ある特定の適応症では、本開示の組換え複製可能レトロウイルス（ＲＲＶ）の投与後の特定の時点で転写を活性化することが望ましいことがある。これは、ホルモンまたはサイトカイン調節可能であるプロモーターを用いて行うことができる。例えば、適応症が、特定のステロイドが産生されるまたは送られる生殖腺組織である、治療適用では、アンドロゲンまたはエストロゲン調節プロモーターを使用することが有利であり得る。ホルモン調節可能であるそのようなプロモーターは、ＭＭＴＶ、ＭＴ－１、エクジソンおよびＲｕＢｉｓｃｏを含む。他のホルモン調節プロモーター、例えば、甲状腺、下垂体および副腎皮質ホルモンに応答性であるものを使用してもよい。使用することができるであろうサイトカインおよび炎症性タンパク質応答性プロモーターとしては、ＫおよびＴキニノーゲン（Kageyama et al., 1987)、ｃ－ｆｏｓ、ＴＮＦ－アルファ、Ｃ反応性タンパク質（Arcone et al., 1988)、ハプトグロビン（Oliviero et al., 1987）、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰアルファ、ＩＬ－１、ＩＬ－６（Poli and Cortese, 1989)、補体Ｃ３（Wilson et al., 1990)、ＩＬ－８、アルファ－１酸性糖タンパク質（Prowse and Baumann, 1988）、アルファ－１アンチトリプシン、リポタンパク質リパーゼ（Zechner et al., 1988)、アンジオテンシノーゲン（Ron et al., 1990）、フィブリノゲン、ｃ－ｊｕｎ（ホルボールエステル、ＴＮＦ－アルファ、ＵＶ照射、レチノイン酸および過酸化水素により誘導可能）、コラゲナーゼ（ホルボールエステルおよびレチノイン酸により誘導される）、メタロチオネイン（重金属およびグルココルチコイド誘導性）、ストロメライシン（ホルボールエステル、インターロイキン－１およびＥＧＦにより誘導可能）、アルファ－２マクログロブリンならびにアルファ－１アンチキモトリプシンが挙げられる。オステオカルシン、低酸素応答性エレメント（ＨＲＥ）、ＭＡＧＥ－４、ＣＥＡ、アルファ－フェトプロテイン、ＧＲＰ７８／ＢｉＰおよびチロシナーゼなどの腫瘍特異的プロモーターも、腫瘍細胞における遺伝子発現を調節するために使用することができる。
【0125】
加えて、プロモーターのこのリストを包括的または限定的であると見なすべきではなく、当業者は、本明細書で開示されるプロモーターおよび方法とともに使用することができる他のプロモーターが分かるであろう。
【表8】
【0126】
ある特定のプロモーターは、活性が単一の組織型には限定されないが、それでもやはり、それらが、組織のある群では活性であることがあり、別の群では活性がより低いかまたはサイレントであることがあることから、選択性を示すことがあることは、さらに理解されるであろう。そのようなプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれることもあり、本開示とともに使用されることが企図される。例えば、種々の中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンにおいて活性であるプロモーターは、脳の多くの異なる領域のいずれかを冒すことがある脳卒中に起因する損傷を防ぐ点で治療に有用であり得る。したがって、本開示で使用される組織特異的調節エレメントは、異種タンパク質の調節に適用可能であり、本レトロウイルスベクター中の標的化ポリヌクレオチド配列としても適用可能である。
【0127】
さらに別の実施形態では、本開示は、組換えレトロウイルス由来の構築物を含むプラスミドを提供する。プラスミドを標的細胞に、または細胞培養物、例えば、ＨＴ１０８０、ＮＩＨ ３Ｔ３もしくは他の組織培養細胞に、直接導入することができる。得られる細胞は、レトロウイルスベクターを培養培地に放出する。
【0128】
本開示は、５’から３’へ、転写を開始するのに有用なプロモーターまたは調節領域；プサイパッケージングシグナル；ｇａｇコード核酸配列、ｐｏｌコード核酸配列；ｅｎｖコード核酸配列；２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様コード配列；ＳＳＰコード配列；マーカーをコードする異種ポリヌクレオチド、治療用または診断用ポリペプチド；必要に応じたＩＲＥＳまたはｐｏｌＩＩＩカセット；およびＬＴＲ核酸配列を含む、ポリヌクレオチド構築物を提供する。上述の通り、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ核酸ドメインを、ＡｐｏＢｅｃ３により停止コドンに変換されるトリプトファンコドンを除去するように改変することができる。ある特定の他の実施形態では、ベクターは、異種ポリヌクレオチドの下流かつ３’ＬＴＲの上流にｐｏｌＩＩＩカセットまたはＩＲＥＳカセットをさらに含み得る。本明細書の他の箇所で説明されるように、および下記の通り、本開示のポリヌクレオチド構築物（例えば、組換え複製可能レトロウイルスポリヌクレオチド）の様々なセグメントは、一部は、所望の宿主細胞、発現のタイミングまたは量、および異種ポリヌクレオチドに依存して、操作される。本開示の複製可能レトロウイルス構築物を、当業者により個々に改変され得る多数のドメインに分けることができる。
【0129】
本開示の組換えレトロウイルスを産生するための例示的なＤＮＡ配列は、配列番号２で提供され、プロモーターは、配列番号２のヌクレオチド１～約ヌクレオチド５８２に記載の配列を有するＣＭＶプロモーターを含むことができ、１つまたは複数（例えば、２～５、５～１０、１０～２０、２０～３０、３０～５０、５０～１００またはそれより多くの核酸塩基）への改変を、改変されたプロモーターが転写を指示および開始することができるのであれば、含み得る。一実施形態では、プロモーターまたは調節領域は、ＣＭＶ－Ｒ－Ｕ５ドメインポリヌクレオチドを含む。ＣＭＶ－Ｒ－Ｕ５ドメインは、ＭＬＶ Ｒ－Ｕ５領域に連結しているヒトサイトメガロウイルスからの最初期プロモーターを含む。一実施形態では、ＣＭＶ－Ｒ－Ｕ５ドメインポリヌクレオチドは、配列番号２の約ヌクレオチド１～約ヌクレオチド１２０２に記載の配列、または配列番号２に記載の配列と少なくとも９５％同一である配列を含み、ポリヌクレオチドは、それに作動可能に連結している核酸分子の転写を促進する。ポリヌクレオチドのｇａｇドメインは、いずれの数のレトロウイルスに由来してもよいが、典型的には、オンコレトロウイルスに、より詳細には、ＭＬＶなどの哺乳動物オンコレトロウイルスに由来するであろう。一実施形態では、ｇａｇドメインは、配列番号２の約ヌクレオチド番号１２０３～約ヌクレオチド２８１９の配列、またはそれに対して（小数第１位に丸めて）少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは９９．８％の同一性を有する配列を含む。ポリヌクレオチドのｐｏｌドメインは、いずれの数のレトロウイルスに由来してもよいが、典型的には、ガンマレトロウイルスに、より詳細には、ＭＬＶなどの哺乳動物ガンマレトロウイルスに由来するであろう。一実施形態では、ｐｏｌドメインは、配列番号２の約ヌクレオチド番号２８２０～約ヌクレオチド６３５８の配列、またはそれに対して（小数第１位に丸めて）少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは９９．９％の同一性を有する配列を含む。ポリヌクレオチドのｅｎｖドメインは、いずれの数のレトロウイルスに由来してもよいが、典型的には、ガンマ－レトロウイルスに、より詳細には、ＭＬＶなどの哺乳動物ガンマ－レトロウイルスに由来するであろう。一部の実施形態では、ｅｎｖコードドメインは、両種指向性ｅｎｖドメインを含む。一実施形態では、ｅｎｖドメインは、配列番号２の約ヌクレオチド番号６３５９～約ヌクレオチド８３２３の配列、またはそれに対して（小数第１位に丸めて）少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは９９．８％の同一性を有する配列を含む。２Ａペプチドまたは２Ａペプチド様／ＳＳＰカセットは、ｅｎｖドメインの後に（例えば、約ヌクレオチド８３２４に）挿入され、異種ポリヌクレオチドの末端に続く。好適なＳＳＰペプチドの例は、表ＢおよびＣに提供される。異種ドメインの後に、ポリプリンリッチドメインが続くこともあり、またはＩＲＥＳカセットもしくはｐｏｌＩＩＩカセットが続くこともある。３’ＬＴＲは、任意の数のレトロウイルス、典型的には、ガンマレトロウイルス、より典型的には、ＭＬＶなどの哺乳動物ガンマレトロウイルスに由来し得る。一実施形態では、３’ＬＴＲは、Ｕ３－Ｒ－Ｕ５ドメインを含む。さらに別の実施形態では、ＬＴＲは、配列番号２の約ヌクレオチド９１１１～約１１６５４に記載の配列、またはそれと（小数第１位に丸めて）少なくとも９５％、９８％もしくは９９．５％同一である配列を含む。
【0130】
【表B-1】
【表B-2】
【表B-3】
【表B-4】
【0131】
【表C】
【0132】
レトロウイルスベクターを使用して、多数の細胞増殖性疾患および障害を含む、広範な疾患および障害を処置することができる（例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第４，４０５，７１２号および同第４，６５０，７６４号；Friedmann, 1989, Science, 244:1275-1281；Mulligan, 1993, Science, 260:926-932, R. Crystal, 1995, Science 270:404-410を参照されたい、また、各々が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、The Development of Human Gene Therapy, Theodore Friedmann, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999. ISBN 0-87969-528-5；Concepts in Genetic Medicine, ed. Boro Dropulic and Barrie Carter, Wiley, 2008, Hoboken, NJ.; Gene & Cell Therapy-Therapeutic Mechanism and Strategies, 3rd edition ed. Nancy Smyth Templeton, CRC Press, Boca Raton FL 2008；Xavier et al., Annu. Rev. Med. 70:273-88, 2019を参照されたい）。
【0133】
本開示は、細胞増殖性障害の処置のための遺伝子療法も提供する。そのような療法は、適切な治療用ポリヌクレオチド（例えば、抗原結合タンパク質／ポリペプチド、サイトカイン、リガンド、アンチセンス、リボザイム、プロドラッグ活性化酵素、ｓｉＲＮＡをコードする）の、増殖性障害を有する被験体の細胞への、または同種異系間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）もしくは炎症もしくは腫瘍部位を標的とすることができることが公知の他の細胞型への導入により、その治療効果を達成することになる。ポリヌクレオチド構築物の送達は、本開示の組換えレトロウイルスベクターを使用して、特に、それが、分裂細胞を感染させることができるＭＬＶまたは他のガンマレトロウイルスに基づく場合、達成することができる。
【0134】
加えて、本明細書に記載の治療方法（例えば、遺伝子療法または遺伝子送達方法）は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行うことができる。遺伝子療法の前に腫瘍の大部分を、例えば外科的にまたは放射線により、除去することが好ましいこともある。一部の態様では、レトロウイルス療法に先行してまたはその後に、手術、化学療法または放射線療法が行われることもある。
【0135】
したがって、本開示は、非分裂細胞、分裂細胞または新生物細胞を感染させることができる組換えレトロウイルスを提供し、その点で、組換えレトロウイルスは、ウイルスＧＡＧ；ウイルスＰＯＬ；ウイルスＥＮＶ；２Ａペプチドまたはペプチド様コード配列に作動可能に連結している異種核酸；およびパッケージング、逆転写および組み込みに必要なシス作用性核酸配列を含む。組換えレトロウイルスは、ＨＩＶなどのレンチウイルスであってもよく、またはガンマレトロウイルスであってもよい。
【0136】
本開示は、特定の核酸（例えば、異種配列）の発現をもたらすために標的細胞に核酸を移入する方法も提供する。したがって、別の実施形態では、本開示は、標的細胞内に異種核酸を導入し、それを発現させるための方法であって、標的細胞を本開示の組換えウイルスに感染させるステップ、および異種核酸を標的細胞に発現させるステップを含み、異種核酸が、ｅｎｖドメインの下流で組換えウイルスベクターに操作され、２Ａまたは２Ａ様ペプチド－ＳＳＰ構築物に作動可能に連結している、方法を提供する。上述の通り、標的細胞は、レトロウイルスによる感染が可能であるのであれば、当業者に認識されている分裂、非分裂、新生物、不死化、改変および他の細胞型を含む、いずれの細胞型であってもよい。
【0137】
生体応答修飾物質（例えば、サイトカイン）をコードする核酸を細胞または被験体に移入することが望ましいこともある。このカテゴリーには、「インターロイキン」として分類される多数のサイトカインをコードする核酸を含む免疫強化剤が含まれる。これらは、例えば、インターロイキン１から３８、ならびに本明細書の他の箇所で説明される他の応答修飾物質および因子を含む。このカテゴリーには、必ずしも同じ機序に従って作用するとは限らないが、インターフェロン、特にガンマインターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）も含まれる。他のポリペプチドとしては、例えば、血管新生因子および抗血管新生因子が挙げられる。酵素欠損症また免疫不全を処置するために、そのような核酸を骨髄細胞またはマクロファージに送達することが望ましいこともある。増殖因子、毒性ペプチド、リガンド、受容体または他の生理学的に重要なタンパク質をコードする核酸を、特定の標的細胞に導入することもできる。上述の生体応答修飾物質のいずれも、本開示のＲＲＶの２Ａまたは２Ａ様ペプチド－ＳＳＰ構築物の下流に操作され、２Ａまたは２Ａ様ペプチド－ＳＳＰ構築物に作動可能に連結している。
【0138】
本開示を、薬物特異的標的化および効果を促進する異種ポリヌクレオチドの送達のために使用することができる。例えば、ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーであるＨＥＲ２は、薬物トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の結合の標的である。トラツズマブは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のメディエーターである。活性は、１＋および非発現細胞ではなく、免疫組織化学により２＋および３＋の過剰発現レベルを有するＨＥＲ２発現細胞に優先的に標的化される（Herceptin prescribing information, Crommelin 2002）。ＨＥＲ２が少ない腫瘍ではＨＥＲ２または切断型ＨＥＲ２（細胞外および膜貫通ドメインのみに発現する）を発現するベクターを導入することによりＨＥＲ２の発現を増進することで、ＡＤＣＣの最適な誘発を助長し、臨床使用の際に観察されるＨｅｒｃｅｐｔｉｎに対する耐性の急速な発現を克服することができる。これらの事例では、異種遺伝子は、ＨＥＲ２をコードすることになる。
【0139】
別の例では、ＣＤ２０は、薬物リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の結合の標的である。リツキシマブは、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）およびＡＤＣＣのメディエーターである。フローサイトメトリーによってより高い平均蛍光強度を有する細胞は、リツキシマブに対する感受性増大を示す（van Meerten et al., Clin Cancer Res 2006; 12(13):4027-4035, 2006）。ＣＤ２０が少ないＢ細胞ではＣＤ２０を発現するベクターの導入によりＣＤ２０の発現を増進することで、ＡＤＣＣの最適な誘発を助長することができる。この事例では、異種遺伝子は、ＣＤ２０をコードする。
【0140】
本開示は、がんおよび新生物などの細胞増殖性障害を処置する方法であって、本開示のＲＲＶベクターを投与し、その後、化学療法剤または抗がん剤での処置を行うステップを含む方法を提供する。一実施形態では、ＲＲＶベクターは、ＲＲＶの感染および複製を可能にする化学療法剤または抗がん剤の投与の前に一定の期間、被験体に投与される。次いで、被験体は、化学療法剤または抗がん剤で、一定の期間、増殖を低減させるまたはがん細胞を死滅させるための投薬量で処置される。一実施形態では、化学療法剤または抗がん剤での処置が、がん／腫瘍を低減させるが、死滅させない場合（例えば、部分的寛解または一時的寛解）には、ＲＲＶからの細胞傷害性遺伝子（例えば、シトシンデアミナーゼ）の細胞発現時に毒性治療剤に変換される非毒性治療剤（例えば、５－ＦＣ）で被験体を処置することができる。
【0141】
そのような方法を使用して、本開示のＲＲＶベクターが腫瘍細胞の複製プロセス中に拡散され、次いで、そのような細胞を抗がん剤または化学療法剤での処置により死滅させることができ、本明細書に記載のＲＲＶ処置を使用してさらなる死滅を生じさせることができる。
【0142】
本開示のさらに別の実施形態では、異種遺伝子は、標的抗原（例えば、がん抗原）のコード配列を含むことができる。この実施形態では、細胞増殖性障害を有する細胞は、標的抗原の発現（例えば、がん抗原の過剰発現）をもたらすために標的抗原をコードする異種ポリヌクレオチドを含むＲＲＶに感染される。次いで、標的抗原と特異的に相互作用する標的化同族部分を含む抗がん剤が、被験体に投与される。標的化同族部分は、細胞傷害剤に作動可能に連結していることもあり、またはそれ自体が抗がん剤であることもある。したがって、標的化抗原コード配列を含むＲＲＶに感染したがん細胞は、そのがん細胞上の標的の発現を増加し、その結果、細胞傷害性標的化の効率／有効性が増大されることになる。
【0143】
さらに別の実施形態では、本開示のＲＲＶは、同族抗原またはリガンドと特異的に相互作用する結合ドメイン（例えば、抗体、抗体断片、抗体ドメイン、非抗体結合ドメインまたは受容体リガンド）を含むコード配列を含むことができる。したがって、結合ドメインのコード配列を含むＲＲＶを使用して、がん細胞または新生物細胞などの、細胞増殖性障害を有する被験体における細胞を感染させることができる。次いで、感染した細胞は、結合ドメインまたは抗体を発現することになる。したがって、細胞傷害剤に作動可能に連結している、またはそれ自体が細胞傷害性である、抗原または同族部分（ｃｏｇｎａｔｅ）を、被験体に投与することができる。次いで、細胞傷害性同族部分は、結合ドメインを発現する感染した細胞を選択的に死滅させることになる。あるいは、結合ドメイン自体が、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ－４などの、例えば免疫系と相互作用する、抗がん剤であることもある。
【0144】
本開示は、細胞増殖性障害を有する被験体を処置する方法を提供する。被験体は、ヒトを含む任意の哺乳動物であり得る。被験体を本開示の組換え複製可能レトロウイルスベクターと接触させる。接触は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏであり得る。本開示のレトロウイルスベクターを投与する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、全身投与、局所投与、腹腔内投与、筋肉内投与、頭蓋内、脳脊髄、ならびに腫瘍部位または細胞増殖性障害部位への直接投与を含む。当技術分野において公知の他の投与経路も利用することができる。
【0145】
したがって、本開示は、細胞増殖性障害を処置するのに有用な様々な医薬組成物を含む。本開示による医薬組成物は、本開示に従って細胞増殖性障害を処置またはモジュレートするのに有用な異種ポリヌクレオチド配列を含有するレトロウイルスベクターを、担体、賦形剤および添加剤または助剤を使用して被験体への投与に好適な形態にすることにより、調製される。よく使用される担体または助剤としては、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動物および植物油、ポリエチレングリコールならびに溶媒、例えば、滅菌水、アルコール、グリセロールおよび多価アルコールが、挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、体液および栄養補充液が挙げられる。保存薬としては、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスが挙げられる。他の薬学的に許容される担体としては、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed. Easton: Mack Publishing Co., 1405-1412, 1461-1487 (1975)およびThe National Formulary XIV., 14th ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975)に記載されているような、塩、保存薬、緩衝液などを含む、水溶液、非毒性賦形剤が挙げられ、前記参考文献の内容は、これにより参照により本明細書に組み入れられる。医薬組成物中の様々な成分のｐＨおよび正確な濃度は、当技術分野における通例の技術に従って調整される。Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics (7th ed.)を参照されたい。
【0146】
他の実施形態では、本開示の複製可能レトロウイルスベクターでトランスフェクトされる宿主細胞が提供される。宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、酵母細胞、昆虫細胞または動物細胞を含む。宿主細胞は、原核生物細胞、例えば、細菌細胞も含む。
【0147】
本明細書で提供されるベクター（例えば、複製可能レトロウイルスベクター）で形質導入される（形質転換またはトランスフェクト）される操作された宿主細胞も提供される。操作された宿主細胞を、プロモーターの活性化、形質転換体の選択またはコードするポリヌクレオチドの増幅のために必要に応じて改変された従来の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択される宿主細胞とともに以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろうし、例えば、Sambrook, Ausubel and Berger、ならびに例えば、Freshney (1994) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3rd ed. (Wiley-Liss, New York)およびそこに引用されている参考文献を含む、本明細書に引用される参考文献で明らかになる。
【0148】
適切な発現宿主の例としては、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；真菌細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ；昆虫細胞、例えば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ；哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＨＥＫ ２９３ ｂｒ Ｂｏｗｅｓ黒色腫；または植物細胞または外植片などが挙げられる。典型的には、ヒト細胞または細胞系が使用されることになるが、本開示のベクターおよびポリヌクレオチドをシークエンシング、増幅およびクローニングのために非ヒト宿主細胞にクローニングすることが望ましいこともある。
【0149】
以下の実施例は、本開示を例証するためのものであり、限定するためのものではない。そのような実施例は、使用され得るものの典型であるが、当業者に公知の他の手順をその代わりに利用してもよい。
【実施例】
【0150】
（実施例１）
ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ、ＲＲＶ－２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ｙＣＤ２の設計。
ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ、ＲＲＶ－２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ｙＣＤ２の設計。
【0151】
ＲＲＶ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＦＰは、両種指向性エンベロープ遺伝子および脳心筋炎ウイルス内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）－ｅｎｖ遺伝子の下流の導入遺伝子カセット－を有する、モロニーＭＬＶに基づくＲＲＶである（Perez et al, 2012）。ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰ（別名ｐＡＣ３－２Ａ－ＧＦＰ）およびＲＲＶ－２Ａ－ｙＣＤ２（ｐＡＣ３－２Ａ－ｙＣＤ２）ベクターは、ＲＲＶ－ＧＦＰおよびＲＲＶ－ｙＣＤ２に基づくが、ＩＲＥＳ領域が、両種指向性エンベロープタンパク質および導入遺伝子（ＧＦＰまたはｙＣＤ２）とインフレームの様々な異なる２Ａペプチドで置き換えられている。ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰおよびＲＲＶ－ｙＣＤ２ベクターのクローニングスキームは、以前に記載されている（Hofacre et al Hum. Gene Ther.29:437-451 2018）。手短に述べると、２つのＤＮＡ断片と、ＢｓｔＢ ＩおよびＮｏｔ Ｉ部位で消化されるｐＡＣ３－ｅｍｄ骨格とを含有する、ギブソンアセンブリクローニングキット（ＮＥＢ）を使用して、先ず、ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ構築物を生成した。最初に、両種指向性ｅｎｖの３’末端の配列、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルスからの２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）、およびＧＦＰの５’を５’から３’の順に含有する、１対のセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成し（ＩＤＴ）、ハイブリダイズして、ＤＮＡ断片２Ａ－Ｇを生成した。ギブソンアセンブリの第２のＤＮＡ断片は、ＦＰ断片であった。ＦＰ断片は、以下のプライマーを使用してＰＣＲにより生成した：ＧＦＰ－Ｆ－Ｇｉｂ（５’－ＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣ－３’（配列番号３０３））およびＧＦＰ－Ｒ－Ｇｉｂ（５’－ＴＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣ－３’（配列番号３０４））。
【0152】
２Ａ－Ｇ断片において、５’は、ｐＡＣ３骨格の両種指向性ｅｎｖのＢｓｔＢＩ部位と重複する配列を含有し、３’は、ＦＰ ＤＮＡ断片の５’と重複する配列を含有する。加えて、ＡｓｃＩ制限酵素部位を、第２の導入遺伝子であるＧＦＰの開始コドンのすぐ上流の、Ｔ２Ａの３’末端に配置した。ＡｓｃＩ部位を含めたのは、Ｔ２Ａペプチドの他の２Ａペプチドへのその後の置き換えのためである。ＡｓｃＩ部位の前に追加のヌクレオチドＴをＡｓｃＩ制限部位に含めることにより、結果として、Ｔ２Ａペプチドの最後のプロリン残基のＣ末端に追加の３つのアミノ酸（グリシン－アラニン－プロリン）を得た。共翻訳プロセス中の、Ｔ２Ａペプチドにより媒介されるエンベロープタンパク質からのＧＦＰタンパク質の分離によって、結果として、ＧＦＰのＮ末端に追加の４つのアミノ酸Ｐ、Ｇ、ＡおよびＰを得た。ＦＰ断片において、ＦＰ断片の５’末端は、２Ａ－Ｇ断片の３’末端と２４ヌクレオチド重複する配列を含有し、ＦＰ断片の３’末端は、Ｎｏｔ Ｉ部位に及ぶｐＡＣ３－ＧＦＰ骨格の５’末端に２６ヌクレオチド重複する。ギブソンアセンブリクローニングの結果として得たプラスミドＤＮＡをｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＧＦＰと名付けた。
【0153】
その後、ブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）およびウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）に由来する３つの他のよく使用される２Ａペプチドを２つの異なる構成で保有する追加のＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰベクターを、合成した（ＩＤＴ）。各ＤＮＡ断片は、両種指向性ｅｎｖ遺伝子の３’の配列と、ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ骨格のＴ２Ａの代わりに指定２ＡペプチドとをＢｓｔＢＩおよびＡｓｃＩ部位に含有した。結果として生じたプラスミドＤＮＡを、ｐＡＣ３－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、ｐＡＣ３－Ｆ２Ａ－ＧＦＰ、ｐＡＣ３－Ｅ２Ａ－ＧＦＰ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｆ２Ａ－ＧＦＰ、およびｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｅ２Ａ－ＧＦＰと名付けた。
【0154】
記載したＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰプラスミドＤＮＡ（ｐＡＣ３－Ｅ２Ａ－ＧＦＰ、ｐＡＣ３－Ｆ２Ａ－ＧＦＰ、ｐＡＣ３－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｅ２Ａ－ＧＦＰ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｆ２Ａ－ＧＦＰ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、およびｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ）全てが、ＧＦＰの３’末端に停止コドン変異を有することを、後に決定した。ＦＰ ＰＣＲ断片を生成する際に、変異をＧＦＰ－Ｒ－Ｇｉｂプライマー（５’－ＴＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣ－３’（配列番号４））に導入した。ＰＣＲから生じたＧＦＰの停止コドン変異は、停止コドンに到達する前に追加の１１アミノ酸（Ｃ－Ａ－Ａ－Ａ－Ｄ－Ｋ－Ｉ－Ｋ－Ｄ－Ｆ－Ｉ（配列番号５））のＧＦＰ ＯＲＦのリードスルーを生じさせる結果となった。これらのプラスミドＤＮＡを、ｐＡＣ３－Ｅ２Ａ－ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３－Ｆ２Ａ－ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３－Ｐ２Ａ－ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｅ２Ａ－ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｆ２Ａ－ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰｍ、およびｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰｍと再び名付けた。以後、２つの命名法ｐＡＣ３－Ｅ２Ａ－ＧＦＰ／ｐＡＣ３－Ｅ２Ａ－ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３－Ｆ２Ａ－ＧＦＰ／ｐＡＣ３－Ｆ２Ａ－ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ／ｐＡＣ３－Ｐ２Ａ－ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ／ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｅ２Ａ－ＧＦＰ／ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｅ２Ａ－ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｆ２Ａ－ＧＦＰ／ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｆ２Ａ－ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ／ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰｍ、およびｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ／ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰｍを互換的に使用する。
【0155】
４つのＲＲＶ－２Ａ－ｙＣＤ２ベクターの同等のセットは、ＧＦＰｍオープンリーディングフレームをｐＡＣ３－Ｐ２Ａ－ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰｍ、ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＧＦＰｍおよびｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰｍプラスミドＤＮＡのそれぞれの２ＡペプチドバージョンのｙＣＤ２ ＯＲＦで置き換えることにより生成した。以下のプライマーを使用して、ｐＡＣ３－ｙＣＤ２プラスミドＤＮＡからＡｓｃＩ－ｙＣＤ２－ＮｏｔＩ ＰＣＲ断片を生成した：ＡｓｃＩ－ｙＣＤ２－Ｆ（５’－ＧＡＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＡＴＧＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＴＧＧＣ－３’（配列番号６）および３－３７（５’－ＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡＡＡＴＡＡ－３’（配列番号７）。ＰＣＲ産物および４つのｐＡＣ３－２Ａ－ＧＦＰｍプラスミドＤＮＡの各々をＡｓｃＩおよびＮｏｔＩで制限酵素消化し、ＡｓｃＩ－ｙＣＤ２－ＮｏｔＩ消化ＰＣＲ産物をＧＦＰｍの代わりにサブクローニングして、ｐＡＣ３－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２、ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２、およびｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２を生成した（表Ｄ）。
【表D】
【0156】
（実施例２）
２９３Ｔ細胞から産生されたＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍベクターは、感染性であり、ＧＦＰタンパク質を発現する。
２９３Ｔ細胞から産生されたＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍベクターは、感染性であり、ＧＦＰタンパク質を発現する。
【0157】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの１８～２０時間前に、１０ｃｍプレート１枚当たり２×１０６細胞で播種した。翌日、ｐＡＣ３－２Ａ－ＧＦＰｍおよびｐＡＣ３－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍプラスミドを、細胞播種の２０時間後、リン酸カルシウム法を使用する２０μｇのプラスミドＤＮＡの一過性トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの１８時間後、細胞をＤＭＥＭ完全培地で３回洗浄し、新鮮な完全培養培地とインキュベートした。ウイルス上清をトランスフェクションのおよそ４２時間後に収集し、０．４５μｍシリンジフィルターに通して濾過した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションからのＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰのウイルス力価を、以前に記載された（Perez et al., 2012）ように決定した。手短に述べると、ベクター調製物の力価をＰＣ３細胞でベクターの単一サイクル感染により決定した。単一サイクル感染を、感染から２４時間後のアジドチミジン処理により保証し、続いて細胞ゲノム当たりのウイルスＤＮＡのコピー数を定量するための、感染から４８時間後のベクターＤＮＡに特異的な標的細胞ゲノムＤＮＡの定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）（ＭＬＶ ＬＴＲプライマーセット；５－ＭＬＶ－Ｕ３－Ｒ（５’－ＡＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣ－３’（配列番号２０））、３－ＭＬＶ－プサイ（５’－ＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＣＣＧＧＡＣＧＡ－３’（配列番号２１））、およびプローブ（５’－ＦＡＭ－ＣＣＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＣＧＣＴＧＡＣＧ－ＢＨＱ１－３’（配列番号２２）））を行った。１ミリリットル当たりの形質導入単位（ＴＵ）（ＴＵ／ｍＬ）で報告するウイルス力価は、プラスミドＤＮＡの２×１０７コピー～２×１０１コピーの範囲の標準曲線から導出する閾値サイクル（ＣＴ）値の計算により、ならびに既知のゲノムＤＮＡ投入量、細胞の数、および反応混合物当たりのウイルスストックの希釈から決定した。表Ｅは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生されたＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍの力価が、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰの力価と同等であったことを示す。
【表E】
【0158】
次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生されたＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍウイルスを使用して、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）でＵ８７－ＭＧを感染させた。Ｕ８７－ＭＧ細胞を初期感染のために６ウェルプレートに１×１０５細胞で播種した。細胞を６ウェルプレートの新しいウェルに各継代で１～４の希釈度で継代させ、各試料からの細胞の残部を回収して、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＧＦＰｍ発現細胞のパーセントおよびＧＦＰｍ平均蛍光強度を測定することによりウイルス拡散を評価した。各継代でのＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージをプロットした。アッセイの長さは、全てのＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰウイルスが最大感染力（約９５％またはそれより高いＧＦＰ陽性細胞）に達するまで行った。ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍとＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍ間のウイルス拡散の速度は、感染Ｕ８７－ＭＧ細胞において、遅滞を示したＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰｍ、ＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｆ２Ａ－ＧＦＰｍを除いて、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰと同様であった。それにもかかわらず、それらは、１８日以内に最大感染力に達した。また、ＧＦＰｍ発現レベルは、ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍベクターとＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍベクター間で異なったが、全て、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ感染Ｕ８７－ＭＧ細胞から発現されたもののおよそ２０～５０％であった。
【0159】
（実施例３）
ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍベクターはＵ８７－ＭＧ細胞で安定している。ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍ感染Ｕ８７－ＭＧ細胞におけるＧＦＰ発現の低減が、ウイルスゲノムにおけるＧＦＰ遺伝子の欠失に起因しないことを保証するために、プロウイルスＤＮＡの３’ｅｎｖおよび３’ＵＴＲ領域に及ぶプライマーセットを使用するエンドポイントＰＣＲにより２Ａ－ＧＦＰｍ領域の完全性を評価した。その後、Ｕ８７－ＭＧ細胞の最大感染力で、Ｔ７５フラスコにおいて細胞を培養してコンフルエンシーに達し、この時点で、培地を新鮮培地で置き換え、その後、ウイルス含有上清を回収し、培地交換後１８～２４時間の時点で、０．４５μＭ濾過を行った。回収した細胞上清をアリコートに分け、免疫ブロット実験および再感染実験に使用するまで－８０℃で保管した。同時に、細胞を２つの画分に分割した；ゲノムＤＮＡの単離のための１／１０、および全細胞溶解物の単離のための９／１０。４００μＬの１×ＰＢＳに再懸濁させることにより細胞ペレットからゲノムＤＮＡを抽出し、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｃｅｌｌ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して単離した。次いで、１００ナノグラムのゲノムＤＮＡを、次のプライマーセットを用いるＰＣＲの鋳型として使用した：ＩＲＥＳ－Ｆ（５’－ＣＴＧＡＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＣＴＴＧ－３’（配列番号２３））およびＩＲＥＳ－Ｒ（５’－ＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡＡＡＴＡＡ－３’（配列番号２４））。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分析した。データは、ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍベクターのプロウイルスＤＮＡにおける２Ａ－ＧＦＰｍおよび ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍ領域が、Ｕ８７－ＭＧ細胞においてウイルス複製の時間経過中、安定していることを示す。
ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍベクターはＵ８７－ＭＧ細胞で安定している。ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍ感染Ｕ８７－ＭＧ細胞におけるＧＦＰ発現の低減が、ウイルスゲノムにおけるＧＦＰ遺伝子の欠失に起因しないことを保証するために、プロウイルスＤＮＡの３’ｅｎｖおよび３’ＵＴＲ領域に及ぶプライマーセットを使用するエンドポイントＰＣＲにより２Ａ－ＧＦＰｍ領域の完全性を評価した。その後、Ｕ８７－ＭＧ細胞の最大感染力で、Ｔ７５フラスコにおいて細胞を培養してコンフルエンシーに達し、この時点で、培地を新鮮培地で置き換え、その後、ウイルス含有上清を回収し、培地交換後１８～２４時間の時点で、０．４５μＭ濾過を行った。回収した細胞上清をアリコートに分け、免疫ブロット実験および再感染実験に使用するまで－８０℃で保管した。同時に、細胞を２つの画分に分割した；ゲノムＤＮＡの単離のための１／１０、および全細胞溶解物の単離のための９／１０。４００μＬの１×ＰＢＳに再懸濁させることにより細胞ペレットからゲノムＤＮＡを抽出し、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｃｅｌｌ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して単離した。次いで、１００ナノグラムのゲノムＤＮＡを、次のプライマーセットを用いるＰＣＲの鋳型として使用した：ＩＲＥＳ－Ｆ（５’－ＣＴＧＡＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＣＴＴＧ－３’（配列番号２３））およびＩＲＥＳ－Ｒ（５’－ＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡＡＡＴＡＡ－３’（配列番号２４））。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分析した。データは、ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍベクターのプロウイルスＤＮＡにおける２Ａ－ＧＦＰｍおよび ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍ領域が、Ｕ８７－ＭＧ細胞においてウイルス複製の時間経過中、安定していることを示す。
【0160】
（実施例４）
最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から産生されたＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍは、その後の感染サイクルにおいて感染性のままである。長期感染力は、ＲＲＶによりもたらされる治療効果を維持するための多くの重要な判断基準の１つであるので、最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から産生されたＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍの感染力をナイーブＵ８７－ＭＧ細胞において追加の感染サイクルを行うことにより評価した。先ず、最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から回収したウイルス上清を記載の通り力価測定し、次いで、０．０１のＭＯＩでナイーブＵ８７－ＭＧ細胞に戻してこの細胞を再感染させた。最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から生じた力価は、一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得られた力価と同様であり、ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍベクターとＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰベクターの間で同等である。
最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から産生されたＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍは、その後の感染サイクルにおいて感染性のままである。長期感染力は、ＲＲＶによりもたらされる治療効果を維持するための多くの重要な判断基準の１つであるので、最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から産生されたＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍの感染力をナイーブＵ８７－ＭＧ細胞において追加の感染サイクルを行うことにより評価した。先ず、最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から回収したウイルス上清を記載の通り力価測定し、次いで、０．０１のＭＯＩでナイーブＵ８７－ＭＧ細胞に戻してこの細胞を再感染させた。最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から生じた力価は、一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得られた力価と同様であり、ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍベクターとＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰベクターの間で同等である。
【0161】
ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍのウイルス拡散を記載の通り各細胞継代でモニターした。一過性感染ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から生じたウイルス上清を使用して第１の感染サイクルで観察されたウイルス拡散速度とは対照的に、全てのベクターは、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰと同等の速度で拡散した。しかし、この感染サイクルでのＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍ感染Ｕ８７－ＭＧ細胞からのＧＦＰ発現レベルは、以前に観察されたような、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ細胞により発現されるレベルの２０～５０％に留まった。
【0162】
（実施例５）
ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍベクターのウイルスエンベロープおよびＧＦＰｍタンパク質は、感染Ｕ８７－ＭＧ細胞において異なる効率でプロセシングされる。
ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍベクターのウイルスエンベロープおよびＧＦＰｍタンパク質は、感染Ｕ８７－ＭＧ細胞において異なる効率でプロセシングされる。
【0163】
ＧＦＰｍ発現、ウイルスエンベロープタンパク質からのＧＦＰｍの分離効率、およびウイルスエンベロープタンパク質の適切なプロセシングを評価するために、感染Ｕ８７－ＭＧ細胞から細胞溶解物を生成した。最大感染力でのＵ８７－ＭＧ細胞、コンフルエント細胞単層を、１×ＰＢＳで１回洗浄し、ＴｒｐＺｅａｎ（Ｓｉｇｍａ）により解離させ、完全ＤＭＥＭに再懸濁させ、再び１×ＰＢＳで洗浄し、その後、２００μＬのＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、氷上で３０分間の細胞溶解を行った。溶解物を１４，０００ｒｐｍで１５分にわたり４℃での遠心分離によって細胞デブリについて清澄化し、上清を回収し、新しい管に移した。次いで、ＢＣＡ沈殿アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞溶解物をそれらのタンパク質濃度についてアッセイし、２０μｇのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに付した。タンパク質を４～１２％ＸＴ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ）で、２００ボルトで４５分間分解した。その後、ｉＢｌｏｔドライブロッティングシステムを使用して、２０ボルトで７分間、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に転写した。抗ｇｐ７０（ラット抗ｇｐ７０、クローン８３Ａ２５；１：５００希釈）および抗ＧＦＰ（ウサギ抗ＧＦＰ；１：１０００希釈）を使用して、膜をエンベロープタンパク質のｇｐ７０サブユニットおよびＧＦＰｍの発現についてアッセイした。ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした対応する二次抗体を使用して、タンパク質発現を検出した。結果は、抗ＧＦＰ抗体を使用して、約１２０ＫＤａのｅｎｖ－２Ａ－ＧＦＰｍ融合タンパク質の高い分子量により示されるように、ＲＲＶ－Ｆ２Ａ－ＧＦＰｍ、ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰｍ、ならびにＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰｍ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｆ２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｆ２Ａ－ＧＦＰｍからのＧＦＰｍタンパク質が、ウイルスエンベロープタンパク質から非効率的に分離されたことを示す。対照的に、ウイルスエンベロープタンパク質からのＧＦＰｍの分離は、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰからのものと比較して、ＲＲＶ－Ｅ２Ａ－ＧＦＰｍ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰｍベクターについて相対的に効率的であった。並行して、感染Ｕ８７－ＭＧにおけるウイルスエンベロープタンパク質のプロセシングを、抗ｇｐ７０抗体を使用して検査した。結果は、前駆体（Ｐｒ８５）またはプロセシングされた形態（ｇｐ７０）のいずれかのエンベロープを有するウイルスが、全てのＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍベクターにおいて検出されたことを示し、これは、抗ＧＦＰ免疫ブロットで明らかなようにＧＦＰｍからのウイルスエンベロープタンパク質の分離を示唆している。加えて、抗ｇｐ７０ブロットに見られる分離効率は、抗ＧＦＰ免疫ブロットに見られる分離効率とある程度一致している。融合ポリタンパク質であるＥｎｖ－ＧＦＰｍのタンパク質発現は、ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍベクターとＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍベクター間で異なっていたが、抗ＧＦＰ免疫ブロットと抗ｇｐ７０免疫ブロットの両方におけるウイルスエンベロープ－ＧＦＰｍ融合ポリタンパク質の検出の欠如により示されるように、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰｍは、最も効率的な分離を有するように見える。
【0164】
（実施例６）
適切にプロセシングされたウイルスエンベロープタンパク質の組み入れレベルは、ウイルスエンベロープタンパク質とＧＦＰｍタンパク質の間の分離効率と相関する。
適切にプロセシングされたウイルスエンベロープタンパク質の組み入れレベルは、ウイルスエンベロープタンパク質とＧＦＰｍタンパク質の間の分離効率と相関する。
【0165】
ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍで最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞からのウイルス上清を４℃で３０分にわたり１４０００ｒｐｍで２０％スクロース勾配によってペレット化し、その後、５％２－メルカプトエタノールを含有する２０μＬの１×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に再懸濁させ、４～２０％Ｔｒｉｓグリシンゲル（ＢｉｏＲａｄ）でのＳＤＳ ＰＡＧＥに付した。電気泳動およびタンパク質転写を記載の通りに行った。適切にプロセシングされたビリオン関連ウイルスエンベロープタンパク質発現を、抗ｇｐ７０（ラット産生抗ｇｐ７０、クローン８３Ａ２５；１：５００希釈）および抗ｐ１５Ｅ（マウス産生抗ＴＭ、クローン３７２；１：２５０希釈）を使用して検査した。ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした対応する二次抗体を使用して、タンパク質発現を検出した。データは、ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰｍベクターを除いて、ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍの適切にプロセシングされたエンベロープタンパク質、ｇｐ７０およびｐ１２Ｅ／ｐ１５Ｅが、ビリオンにおいてＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰのレベルと同等のレベルで検出されたことを示す。予想通り、ビリオン関連エンベロープタンパク質の最低レベルを示したＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰｍは、細胞溶解物中の融合ポリタンパク質の最高レベルを表した。公開されたデータと一致して、データは、プロセシングされていないエンベロープタンパク質前駆タンパク質Ｐｒ８５またはこの場合はウイルスエンベロープ－ＧＦＰｍ融合ポリタンパク質がビリオンに組み入れられないという表記を支持する。さらに、「融合性」ｐ１２Ｅに至る２Ａペプチドを有するＲペプチドの切断もまた、最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から生じた力価により示されるように、ビリオン成熟中に感染性ウイルス粒子を産生するのに十分であるように見える。ｐ１５Ｅ／ｐ１２Ｅ比の性質および感染中の膜融合におけるその役割は不明確である。要するに、データは、ウイルスエンベロープタンパク質組み入れのレベルが、標的細胞において測定される力価値と相関しないことを示唆している。ベクター、特に、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰｍおよびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰｍベクター間の力価値の差の予想外の欠如は、様々なエンベロープ発現レベルが、これらの細胞での力価に影響を与えることなく、ＲＲＶ粒子に関して許容されることを示唆している。
【0166】
（実施例７）
２９３Ｔ細胞から産生されたＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２ベクターは、感染性であり、ｙＣＤ２タンパク質を発現する。
２９３Ｔ細胞から産生されたＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２ベクターは、感染性であり、ｙＣＤ２タンパク質を発現する。
【0167】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの１８～２０時間前に、１０ｃｍプレート１枚当たり２×１０６細胞で播種した。翌日、ｐＡＣ３－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２、ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２プラスミドを、細胞播種の２０時間後、リン酸カルシウム法を使用する２０μｇのプラスミドＤＮＡの一過性トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの１８時間後、細胞をＤＭＥＭ完全培地で３回洗浄し、新鮮な完全培養培地とインキュベートした。ウイルス上清をトランスフェクションのおよそ４２時間後に収集し、０．４５μｍシリンジフィルターに通して濾過した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションからのＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２、ＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２、およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２のウイルス力価を、以前に記載された（Perez et al., 2012）ように決定した。手短に述べると、ベクター調製物の力価をＰＣ３細胞でベクターの単一サイクル感染により決定した。単一サイクル感染を、感染から２４時間後のアジドチミジン処理により保証し、続いて細胞ゲノム当たりのウイルスＤＮＡのコピー数を定量するための、感染から４８時間後のベクターＤＮＡに特異的な標的細胞ゲノムＤＮＡの定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）（ＭＬＶ ＬＴＲプライマーセット；５－ＭＬＶ－Ｕ３－Ｒ（５’－ＡＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣ－３’（配列番号２０））、３－ＭＬＶ－プサイ（５’－ＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＣＣＧＧＡＣＧＡ－３’（配列番号２１））、およびプローブ（５’－ＦＡＭ－ＣＣＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＣＧＣＴＧＡＣＧ－ＢＨＱ１－３’（配列番号２２）））を行った。１ミリリットル当たりの形質導入単位（ＴＵ）（ＴＵ／ｍＬ）で報告するウイルス力価は、プラスミドＤＮＡの２×１０７コピー～２×１０１コピーの範囲の標準曲線から導出する閾値サイクル（ＣＴ）値の計算により、ならびに既知のゲノムＤＮＡ投入量、細胞の数、および反応混合物当たりのウイルスストックの希釈度から決定した。表Ｆは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生されたＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２、ＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２の力価が、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２の力価と同等であったことを示す。
【0168】
【表F】
【0169】
加えて、最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から回収したウイルス上清を記載の通り力価測定して、それらが感染性のままであることを保証した。力価のために使用したプライマーセットは、５－ＭＬＶ－Ｕ３－Ｒ、３－ＭＬＶ－プサイプライマーおよびプローブを含有するプライマーセットと同様のプライミング効率を有する。感染Ｕ８７－ＭＧ細胞からのＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２、ＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２ベクターの力価測定に使用したプライマーセットは、Ｅｎｖ２ Ｆｏｒ：５’－ＡＣＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＣＣＴＡＣＡＡＧＴ－３’（配列番号２５）、Ｅｎｖ２ Ｒｅｖ：５’－ＧＴＴＡＡＧＣＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＣＴＣ－３’（配列番号２６）およびプローブ５’－ＦＡＭ－ＣＣＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＣＧＣＴＧＡＣＧ－ＢＨＱ１－３’（配列番号２７）である。最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から生じた力価は、一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得られた力価と同様であり、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２ベクターの間で同等であった。
【0170】
（実施例８）
感染Ｕ８７－ＭＧ細胞におけるＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２ベクターのウイルスエンベロープおよびｙＣＤ２タンパク質は、異なる効率でプロセシングされる。
感染Ｕ８７－ＭＧ細胞におけるＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２ベクターのウイルスエンベロープおよびｙＣＤ２タンパク質は、異なる効率でプロセシングされる。
【0171】
ｙＣＤ２発現、ウイルスエンベロープタンパク質からのｙＣＤ２の分離効率、およびウイルスエンベロープタンパク質の適切なプロセシングを評価するために、感染Ｕ８７－ＭＧ細胞から細胞溶解物を生成した。最大感染力でのＵ８７－ＭＧ細胞、コンフルエント細胞単層を、１×ＰＢＳで１回洗浄し、ＴｒｐＺｅａｎ（Ｓｉｇｍａ）により解離させ、完全ＤＭＥＭに再懸濁させ、再び１×ＰＢＳで洗浄し、その後、２００μＬのＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、氷上で３０分間の細胞溶解を行った。溶解物を１４，０００ｒｐｍで１５分間、４℃での遠心分離によって細胞デブリについて清澄化し、上清を回収し、新しい管に移した。次いで、ＢＣＡ沈殿アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞溶解物をそれらのタンパク質濃度についてアッセイし、２０μｇのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに付した。タンパク質を４～１２％ＸＴ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ）で、２００ボルトで４５分間分解した。その後、ｉＢｌｏｔドライブロッティングシステムを使用して、２０ボルトで７分間、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に転写した。抗ｇｐ７０（ラット抗ｇｐ７０、クローン８３Ａ２５；１：５００希釈）および抗ｙＣＤ２（マウス抗ｙＣＤ２；１：１０００希釈）を使用して、膜をエンベロープタンパク質のｇｐ７０サブユニットおよびｙＣＤ２の発現についてアッセイした。ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした対応する二次抗体を使用して、タンパク質発現を検出した。結果は、抗ｙＣＤ２抗体を使用して、約１１０ＫＤａのｅｎｖ－２Ａ－ｙＣＤ２融合ポリタンパク質の高い分子量により示されるように、ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２からのｙＣＤ２タンパク質が、ウイルスエンベロープタンパク質から非効率的に分離されたことを示す。対照的に、ウイルスエンベロープタンパク質からのｙＣＤ２の分離は、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２からのものと比較して、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２について相対的に効率的であった。並行して、感染Ｕ８７－ＭＧにおけるウイルスエンベロープタンパク質のプロセシングを、抗ｇｐ７０抗体を使用して検査した。結果は、前駆体（Ｐｒ８５）またはプロセシングされた形態（ｇｐ７０）のいずれかのエンベロープを有するウイルスが、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２ベクターにおいて、しかし、はるかに低いレベルでＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２ベクターにおいて、容易に検出可能であったことを示した。加えて、Ｐｒ８５／ｇｐ７０ウイルスエンベロープタンパク質のレベルは、抗ｙＣＤ２免疫ブロットで観察されたレベルとある程度一致している。しかし、ＲＲＶ－２Ａ－ＧＦＰｍまたはＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ＧＦＰｍベクターとは異なり、ウイルスエンベロープ－ｙＣＤ２融合ポリタンパク質は、抗ｇｐ７０抗体または抗２Ａ抗体（カタログ番号ＡＢＳ３１、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して検出することができなかった。４つのベクターの中で、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２ベクターは、抗ｙＣＤ２免疫ブロットにおけるウイルスエンベロープ－ｙＣＤ２融合ポリタンパク質の検出の欠如により示されるように、融合ポリタンパク質の最も効率的な分離を示した。要するに、データは、ＧＳＧ－Ｐ２ＡおよびＧＳＧ－Ｔ２Ａ構成が、ＲＲＶエンベロープタンパク質オープンリーディングフレームに関連して最も効率的なポリタンパク質分離を生じさせることを示唆している。
【0172】
（実施例９）
ＲＲＶ－Ｇ２Ｇ－Ｐ２Ａ－ＹＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２は、Ｕ８７－ＭＧ細胞において長期安定性を有する。Ｕ８７－ＭＧ細胞においてＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２の長期ベクター安定性を評価するために、連続感染を行った。６ウェルプレートに播種したおよそ１０５のナイーブＵ８７－ＭＧ細胞を０．１のＭＯＩでウイルスベクターに初期感染させ、１週間培養して単一感染サイクルを完了した。完全感染細胞からの２ｍｌのウイルス上清のうちの１００μＬを使用して、１０５のナイーブ細胞を感染させ、最大１６サイクル反復した。４００μＬの１×ＰＢＳに再懸濁させることにより小ペレットからゲノムＤＮＡを抽出し、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｃｅｌｌ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して単離した。次いで、１００ナノグラムのゲノムＤＮＡを、導入遺伝子カセットに及ぶ次のプライマーペアを用いるＰＣＲの鋳型として使用した；ＩＲＥＳ－Ｆ（５’－ＣＴＧＡＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＣＴＴＧ－３’（配列番号：２３））およびＩＲＥＳ－Ｒ（５’－ＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡＡＡＴＡＡ－３’（配列番号２４））。２Ａ－ｙＣＤ２領域のベクター安定性を感染細胞からの組み込まれたプロウイルスのＰＣＲ増幅により評価する。予想されるＰＣＲ産物のサイズは、およそ０．７３ｋｂである。０．７３ｋｂより小さい一切のバンドの出現が、２Ａ－ｙＣＤ２領域における欠失を示す。ＲＲＶ－ｙＣＤ２におけるＩＲＥＳ－ｙＣＤ２（１．２Ｋｂ）領域は、以前に報告された（Perez et al., 2012）ように感染サイクル１６まで安定している。同様に、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２両方の２Ａ－ｙＣＤ２領域も、感染サイクル１６まで安定したままである。しかし、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２における２Ａ－ｙＣＤ２領域は、欠失（０．４ｋｂ）欠失が感染サイクル１３で出現したのでＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２よりわずかに安定性が低いが、サイクル１６の間を通して安定したままである。
ＲＲＶ－Ｇ２Ｇ－Ｐ２Ａ－ＹＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２は、Ｕ８７－ＭＧ細胞において長期安定性を有する。Ｕ８７－ＭＧ細胞においてＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２の長期ベクター安定性を評価するために、連続感染を行った。６ウェルプレートに播種したおよそ１０５のナイーブＵ８７－ＭＧ細胞を０．１のＭＯＩでウイルスベクターに初期感染させ、１週間培養して単一感染サイクルを完了した。完全感染細胞からの２ｍｌのウイルス上清のうちの１００μＬを使用して、１０５のナイーブ細胞を感染させ、最大１６サイクル反復した。４００μＬの１×ＰＢＳに再懸濁させることにより小ペレットからゲノムＤＮＡを抽出し、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｃｅｌｌ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して単離した。次いで、１００ナノグラムのゲノムＤＮＡを、導入遺伝子カセットに及ぶ次のプライマーペアを用いるＰＣＲの鋳型として使用した；ＩＲＥＳ－Ｆ（５’－ＣＴＧＡＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＣＴＴＧ－３’（配列番号：２３））およびＩＲＥＳ－Ｒ（５’－ＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡＡＡＴＡＡ－３’（配列番号２４））。２Ａ－ｙＣＤ２領域のベクター安定性を感染細胞からの組み込まれたプロウイルスのＰＣＲ増幅により評価する。予想されるＰＣＲ産物のサイズは、およそ０．７３ｋｂである。０．７３ｋｂより小さい一切のバンドの出現が、２Ａ－ｙＣＤ２領域における欠失を示す。ＲＲＶ－ｙＣＤ２におけるＩＲＥＳ－ｙＣＤ２（１．２Ｋｂ）領域は、以前に報告された（Perez et al., 2012）ように感染サイクル１６まで安定している。同様に、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２両方の２Ａ－ｙＣＤ２領域も、感染サイクル１６まで安定したままである。しかし、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２における２Ａ－ｙＣＤ２領域は、欠失（０．４ｋｂ）欠失が感染サイクル１３で出現したのでＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２よりわずかに安定性が低いが、サイクル１６の間を通して安定したままである。
【0173】
（実施例１０）
適切にプロセシングされたウイルスエンベロープの組み入れは、ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２ベクターに感染させたＵ８７－ＭＧ細胞においてウイルスエンベロープタンパク質とｙＣＤ２タンパク質の間の分離効率と相関する。
適切にプロセシングされたウイルスエンベロープの組み入れは、ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２ベクターに感染させたＵ８７－ＭＧ細胞においてウイルスエンベロープタンパク質とｙＣＤ２タンパク質の間の分離効率と相関する。
【0174】
ＲＲＶ－２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－２Ａ－ｙＣＤ２で最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から産生されたウイルス上清を４℃、１４０００ｒｐｍで３０分間、２０％スクロース勾配によってペレット化し、その後、５％ ２－メルカプトエタノールを含有する２０ｕＬの１×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に再懸濁させ、４～２０％Ｔｒｉｓグリシンゲル（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）でのＳＤＳ ＰＡＧＥに付した。電気泳動およびタンパク質転写を記載の通りに行った。適切にプロセシングされたビリオンウイルスエンベロープタンパク質発現および成熟を、抗ｇｐ７０（ラット産生抗ｇｐ７０、クローン８３Ａ２５；１：５００希釈）および抗ｐ１５Ｅ（マウス産生抗ＴＭ、クローン３７２；１：２５０希釈）を使用してアッセイした。ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした対応する二次抗体を使用して、タンパク質発現を検出した。データは、ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２ではなく、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２の適切にプロセシングされたエンベロープタンパク質、ｇｐ７０が、ビリオンにおいてＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２のレベルと同等のレベルで検出されたことを示す。
【0175】
重要なことに、データは、適切にプロセシングされたウイルスエンベロープタンパク質の組み入れレベルが力価値と相関しないことを示唆している。
【0176】
（実施例１１）
ｙＣＤ２タンパク質発現レベルは、ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２感染Ｕ８７－ＭＧ細胞において様々であったが、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２感染Ｕ８７－ＭＧ細胞の５－ＦＣ感受性と同等の５－ＦＣ感受性を示した。
ｙＣＤ２タンパク質発現レベルは、ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２感染Ｕ８７－ＭＧ細胞において様々であったが、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２感染Ｕ８７－ＭＧ細胞の５－ＦＣ感受性と同等の５－ＦＣ感受性を示した。
【0177】
ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２の免疫ブロットが、感染Ｕ８７－ＭＧ細胞においてウイルスエンベロープタンパク質からの分離タンパク質としてまたは様々な融合ポリタンパク質として発現されたｙＣＤ２タンパク質の量を示したので、ＬＤ５０実験を行うことによりそれらの５－ＦＣ感受性を測定した。ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２ベクターに最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞を使用して、ＭＴＳアッセイによりそれらの５－ＦＣ ＬＤ５０を決定した。感染および非感染Ｕ８７－ＭＧ細胞系各々について、１×１０３細胞／ウェル／１００μＬ培養培地を、９６ウェルプレートに三連で播種した。細胞を、０．００００１ｍＭ～１ｍＭの範囲の一連の１：１０希釈で５－ＦＣ（カタログ番号Ｆ７１２９、Ｓｉｇｍａ）を用いて処理した。５－ＦＣ処理なしを対照として含めた。播種の１日後に５－ＦＣを添加し、次いで、２日ごとに、５－ＦＣに加えた完全培地を補充した。５－ＦＣの非５－ＦＵ媒介細胞傷害効果を決定するために、ナイーブＵ８７－ＭＧ細胞を対照として含めた。細胞を７日間のインキュベーション時間にわたってモニターし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することにより２日ごとに細胞死を測定した。ＭＴＳの添加の後、ＭＴＳインキュベーション後６０分の時点でＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（Ｔｅｃａｎ）プレートリーダーを使用して４９０ｎｍでＯＤ値を獲得した。三連の各試料からの平均ＯＤ値を、ＲＲＶに感染させたが未処置の細胞に対する細胞生存パーセンテージに変換した。その後、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｍを使用してそのパーセンテージ値を対数スケールで５－ＦＣ濃度に対してプロットして、ＬＤ５０グラフを生成した。ＬＤ５０値は、獲得したデータ点の非線形４パラメーターフィットを使用してソフトウェアにより計算した。データは、「分離」ｙＣＤ２タンパク質のレベルが、ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２感染Ｕ８７－ＭＧ細胞よりもＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２感染Ｕ８７－ＭＧ細胞においてより高いにもかかわらず、ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２感染Ｕ８７－ＭＧ細胞において観察されたウイルスエンベロープ－ｙＣＤ２融合ポリタンパク質は、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２のＬＣ５０濃度と同様のＬＣ５０濃度で５－ＦＣを５－ＦＵに変換することにおいて酵素的に活性であり、細胞傷害効果を達成することを示す。
【0178】
（実施例１２）
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２感染Ｔｕ２４４９細胞は、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２の５－ＦＣ感受性と同等の５－ＦＣ感受性を示した。
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２感染Ｔｕ２４４９細胞は、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２の５－ＦＣ感受性と同等の５－ＦＣ感受性を示した。
【0179】
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２に最大限感染させたＴｕ２４４９細胞を使用して、記載の通りにＭＴＳアッセイによりその５－ＦＣ ＬＤ５０を決定した。ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２を対照として含めた。０．００００１ｍＭ～１ｍＭの範囲の一連の１：１０希釈で５－ＦＣ（カタログ番号Ｆ７１２９、Ｓｉｇｍａ）を用いる処理を使用した。５－ＦＣ処理なしを対照として含めた。播種の１日後に５－ＦＣを添加し、次いで、２日ごとに、５－ＦＣに加えた完全培地を補充した。５－ＦＣの非５－ＦＵ媒介細胞傷害効果を決定するために、ナイーブＴｕ２４４９細胞を対照として含めた。細胞を７日間のインキュベーション時間にわたってモニターし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することにより２日ごとに細胞死を測定した。ＭＴＳの添加の後、ＭＴＳインキュベーション後６０分の時点でＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（Ｔｅｃａｎ）プレートリーダーを使用して４９０ｎｍでＯＤ値を獲得した。三連の各試料からの平均ＯＤ値を、ＲＲＶに感染させたが未処置の細胞に対する細胞生存パーセンテージに変換した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｍを使用してそのパーセンテージ値を対数スケールで５－ＦＣ濃度に対してプロットして、ＬＤ５０グラフを生成した。ＬＤ５０値は、獲得したデータ点の非線形４パラメーターフィットを使用してソフトウェアにより計算した。データは、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２感染Ｔｕ－２４４９細胞により発現されるｙＣＤ２タンパク質は、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２のＬＣ５０濃度と同様のＬＣ５０濃度で５－ＦＣを５－ＦＵに変換することにおいて酵素的に活性であり、細胞傷害効果を達成することを示す。
【0180】
（実施例１３）
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２で処置した皮下、同系神経膠腫マウスはＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２のものと同等の腫瘍成長遅延を示した。
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２で処置した皮下、同系神経膠腫マウスはＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２のものと同等の腫瘍成長遅延を示した。
【0181】
同系細胞系Ｔｕ－２４４９をＢ６Ｃ３Ｆ１マウス（Ostertag et al., 2012）における同所性腫瘍モデルとして使用した。Ｔｕ－２４４９細胞の亜系統（Ｔｕ－２４４９ＳＱ）を皮下腫瘍モデル化のために樹立した。９８％ナイーブＴｕ－２４４９ＳＱ細胞と２％ ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２感染Ｔｕ－２４４９ＳＱ細胞の混合物をｉｎ ｖｉｔｒｏｌで調製し、皮下腫瘍移植のためにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）に再懸濁させた。９８％ナイーブＴｕ－２４４９ＳＱ細胞と２％ ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２感染Ｔｕ－２４４９ＳＱ細胞の混合物を陽性対照ならびに比較対照として含めた。各群のＢ６Ｃ３Ｆ１マウス（１群当たりｎ＝１０）に、０日目に、１×１０６の腫瘍細胞を皮下移植した。腫瘍移植後１２日目に（腫瘍のおよそ＞７５％がＲＲＶに感染した時点で）、マウスにＰＢＳまたは５－ＦＣ（１用量当たり体重１ｋｇ当たり５００ｍｇ、ｉ．ｐ．、ｂ．ｉ．ｄ．）のいずれかを連続４５日間投与し、その後、２日間、薬物なしでベクターを残存感染細胞から拡散させた。５日オン、２日オフの薬物処置サイクルをさらに２回繰り返した。腫瘍容積測定を毎日行った。結果は、５－ＦＣ処置なしのＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２またはＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａを有する担腫瘍マウスが成長し続けることを示す。対照的に、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａを有する担腫瘍マウスであって、その後５－ＦＣ処置を施したマウスは、事前に確立された腫瘍の腫瘍成長を遅延させ、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２＋５－ＦＣで処置したマウスで同等である。データは、皮下、同系神経膠腫マウスモデルではＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２がＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２と同等の治療有効性を有することを示唆している。
【0182】
（実施例１４）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生されたＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＧＳＧ－ＰＳ２－ＧＭＣＳＦベクターは、ＧＭＣＳＦおよびｙＣＤ２タンパク質を発現し、感染性である。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生されたＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＧＳＧ－ＰＳ２－ＧＭＣＳＦベクターは、ＧＭＣＳＦおよびｙＣＤ２タンパク質を発現し、感染性である。
【0183】
ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦは、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限部位が５’および３’末端にそれぞれ存在する、化学的に合成された（Ｇｅｎｅｗｉｚ）ヒトＧＭＣＳＦ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびｙＣＤ２－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦカセットを、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化されたｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２骨格にクローニングすることにより生成した。結果として得られるＧＭＣＳＦ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびｙＣＤ２－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦカセットは、カセットのＮ末端（ＡｓｃＩ制限部位の５’上流）のＧＳＧ－Ｔ２Ａとインフレームである。
【0184】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションの１８～２０時間前に、１０ｃｍプレート１枚当たり２×１０６細胞で播種した。翌日、２０μｇのｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２またはｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦプラスミドを、細胞播種の２０時間後にリン酸カルシウム法を使用する一過性トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの１８時間後、細胞をＣＭＥＭ培地で３回洗浄し、新鮮な完全培地とインキュベートした。ウイルス上清をトランスフェクションのおよそ４２時間後に回収し、０．４５μｍシリンジフィルターに通して濾過した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する一過性トランスフェクションからのＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２のウイルス力価を、記載の通りに決定した。データは、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦの力価（約２×１０６ＴＵ／ｍＬ）がＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２の力価と同等であることを示す。
【0185】
ｙＣＤ２タンパク質発現を評価するために、細胞溶解物をｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２またはｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦ一過性トランスフェクト２９３Ｔ細胞から生成した。この実験では、ｐＡＣ３－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２およびｐＡＣ３－ＩＲＥＳ－ＧＭＣＳＦも対照として含めた。ＧＭＣＳＦ発現のために、一過性トランスフェクト２９３Ｔ細胞からの上清をＥＬＩＳＡ（カタログ番号ＤＧＭ００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）による測定のために回収した。全細胞溶解物を記載の通りにｙＣＤ２タンパク質発現についてアッセイした。抗ｙＣＤ２結果は、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２またはｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦからのｙＣＤ２タンパク質が、約１５ＫＤａバンドにより示されるように、ＧＭＣＳＦから効率的に分離されることを示す。しかし、両方の構成での２Ａペプチドにより媒介されるＧＭＣＳＦ（ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２）からの、またはウイルスエンベロープタンパク質（ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦ）からの、ｙＣＤ２の分離は、著しく異なり、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２からのｙＣＤ２と比較してｙＣＤ２のサイズにより示されるように、ｙＣＤ２タンパク質はＧＭＣＳＦからは適切に分離される。対照的に、ウイルスｅｎｖからのｙＣＤ２タンパク質分離は、わずかに高い分子量を有し、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２構築物のものと一致する。データは、ＥｎｖからのｙＣＤ２分離が、理論的に予想されるアミノ酸配列で正確に起こらないことがあることを示唆している。しかし、ｙＣＤ２を別の分泌タンパク質（すなわち、ＧＭＣＳＦ）の下流に配置した場合、ｙＣＤ２タンパク質の適切な分離が観察される。しかし、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２から発現される２Ａ－ｙＣＤ２タンパク質の酵素的活性がｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも５－ＦＣ感受性および細胞傷害効果に影響を与えないように見えることに留意することは重要である。
【0186】
ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２構築物中のウイルスエンベロープタンパク質からの、またはｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦ構築物中のｙＣＤ２からの、ＧＭＣＳＦタンパク質の分離効率は不確定であるが、ＧＭＣＳＦ ＥＬＩＳＡ結果は、分泌ＧＭＣＳＦの量が、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２については約５００ｎｇ／ｍＬであり、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦについては約７６０ｎｇ／ｍＬであることを示す。両方の場合、発現されるＧＭＣＳＦの量は、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＭＣＳＦの量（２５ｎｇ／ｍＬ）よりも約２０～３０倍多い。並行して、感染Ｕ８７－ＭＧにおけるウイルスエンベロープタンパク質のプロセシングを、抗ｇｐ７０抗体を使用して検査する。結果は、前駆体（Ｐｒ８５）またはプロセシングされた形態（ｇｐ７０）いずれかでのウイルスエンベロープタンパク質が容易に検出可能であることを示す。まとめると、データは、Ｅｎｖ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２ポリタンパク質構成とＥｎｖ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦポリタンパク質構成の両方が、ＧＭＣＳＦおよびｙＣＤ２タンパク質を発現することができることを示唆している。
【0187】
加えて、最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から回収したウイルス上清を記載の通りに力価測定して、ウイルスが感染性であるままであることを保証する。データは、最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から生じた力価（約３×１０６ＴＵ／ｍＬ）が、一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得られる力価と同様であり、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２と同等であることを示す。
【0188】
（実施例１５）
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦベクターは、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２感染Ｕ８７－ＭＧ細胞の５－ＦＣ感受性と同等の５－ＦＣ感受性を示す。
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦベクターは、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２感染Ｕ８７－ＭＧ細胞の５－ＦＣ感受性と同等の５－ＦＣ感受性を示す。
【0189】
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２またはＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＭＣＳＦに最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞を使用して、記載の通りにＭＴＳアッセイによりその５－ＦＣ ＬＤ５０を決定する。ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２を対照として含める。データは、感染Ｕ８７－ＭＧ細胞において検出される「分離」ｙＣＤ２タンパク質の量が、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２のものと同様である０．００８ｍＭのＬＤ５０濃度で細胞傷害効果を達成することができることを示す。
【0190】
（実施例１６）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞および最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から産生されるＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＲＳＶ－ｙＣＤ２ベクターは、感染性であり、ＧＭＣＳＦおよびｙＣＤ２タンパク質を発現する。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞および最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から産生されるＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＲＳＶ－ｙＣＤ２ベクターは、感染性であり、ＧＭＣＳＦおよびｙＣＤ２タンパク質を発現する。
【0191】
ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＲＳＶ－ｙＣＤ２は、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限部位が５’および３’末端にそれぞれ存在する、化学的に合成された（Ｇｅｎｅｗｉｚ）ヒトＧＭＣＳＦ－ＲＳＶ－ｙＣＤ２カセットを、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化されたｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２骨格にクローニングすることにより生成した。化学的に合成されたＧＭＣＳＦ－ＲＳＶ－ｙＣＤ２は、ＧＭＣＳＦ ＯＲＦの３’末端に停止コドンを含有する。
【0192】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションの１８～２０時間前に、１０ｃｍプレート１枚当たり２×１０６細胞で播種する。翌日、２０μｇのｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＲＳＶ－ｙＣＤ２プラスミドを、細胞播種の２０時間後に、リン酸カルシウム法を使用する一過性トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの１８時間後、細胞をＤＭＥＭ培地で３回洗浄し、新鮮な完全培養培地とインキュベートした。ウイルス上清をトランスフェクションのおよそ４２時間後に回収し、０．４５μｍシリンジフィルターに通して濾過した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する一過性トランスフェクションからのＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＲＳＶ－ｙＣＤ２のウイルス力価を、記載の通りに決定した。データは、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＲＳＶ－ｙＣＤ２の力価（約２×１０６ＴＵ／ｍＬ）がＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２の力価と同等であることを示す。
【0193】
加えて、最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から回収したウイルス上清を力価測定して、ウイルスが感染性であるままであることを保証する。データは、最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から生じた力価（約２×１０６ＴＵ／ｍＬ）が、一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得られる力価と同様であり、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２と同等であることを示す。
【0194】
ＧＭＣＳＦおよびｙＣＤ２タンパク質発現を評価するために、細胞溶解物をＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＲＳＶ－ｙＣＤ２感染Ｕ８７－ＭＧ細胞から生成する。この実験では、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＭＣＳＦも対照として含める。ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によりＧＭＣＳＦのタンパク質発現レベルを測定するために、最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から上清を回収する。全細胞溶解物を記載の通りにｙＣＤ２タンパク質発現についてアッセイする。抗ｙＣＤ２免疫ブロット結果は、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＲＳＶ－ｙＣＤ２感染Ｕ８７－ＭＧ細胞からｙＣＤ２タンパク質が、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２のレベルのおよそ２分の１～３分の１レベルで発現されることを示す。並行して、感染Ｕ８７－ＭＧにおけるウイルスエンベロープタンパク質のプロセシングを、抗ｇｐ７０抗体を使用して検査する。結果は、前駆体（Ｐｒ８５）またはプロセシングされた形態（ｇｐ７０）いずれかでのウイルスエンベロープタンパク質が容易に検出可能であることを示す。予想通り、ウイルスエンベロープ－ＧＭＣＳＦ融合ポリタンパク質も、抗ｇｐ７０抗体を使用して細胞溶解物から検出される。ウイルスエンベロープタンパク質からのＧＭＣＳＦタンパク質の分離は不確定であるが、ＧＭＣＳＦ ＥＬＩＳＡ結果は、分泌ＧＭＣＳＦの量が、約３００ｎｇ／ｍＬであり、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＭＣＳＦの量（３０ｎｇ／ｍＬ）より約１０倍多いことを示す。まとめると、データは、ウイルスエンベロープタンパク質－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＲＳＶ－ｙＣＤ２ポリタンパク質構成が、ＲＲＶに関連して感染性ウイルスならびにＧＭＣＳＦおよびｙＣＤ２タンパク質を産生することができることを示唆している。
【0195】
（実施例１７）
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＲＳＶ－ｙＣＤ２ベクターは、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２感染Ｕ８７－ＭＧ細胞の５－ＦＣ感受性と同等の５－ＦＣ感受性を示す。
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＲＳＶ－ｙＣＤ２ベクターは、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２感染Ｕ８７－ＭＧ細胞の５－ＦＣ感受性と同等の５－ＦＣ感受性を示す。
【0196】
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＲＳＶ－ｙＣＤ２ベクターに最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞を使用して、記載の通りにＭＴＳアッセイによりその５－ＦＣ ＬＤ５０を決定する。この実験では、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２を対照として含める。データは、感染Ｕ８７－ＭＧ細胞において発現されるｙＣＤ２タンパク質の量が、０．０１０ｍＭのＬＤ５０濃度で細胞傷害効果を達成することができ、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２のものと同等であることを示す。
【0197】
（実施例１８）
２９３Ｔ細胞および感染Ｕ８７－ＭＧ細胞から産生されるＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＹＣＤ２－ＲＳＶ－ＰＤＬ１ｍｉＲ３０ｓｈＲＮＡベクターは、感染性であり、ｙＣＤ２タンパク質を発現する。
２９３Ｔ細胞および感染Ｕ８７－ＭＧ細胞から産生されるＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＹＣＤ２－ＲＳＶ－ＰＤＬ１ｍｉＲ３０ｓｈＲＮＡベクターは、感染性であり、ｙＣＤ２タンパク質を発現する。
【0198】
ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＲＳＶ－ｍｉＲＰＤＬ１は、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限部位が５’および３’末端にそれぞれ存在する、化学的に合成された（Ｇｅｎｅｗｉｚ）ヒトｙＣＤ２－ＲＳＶ－ｍｉＲＰＤＬ１カセットを、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化されたｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２骨格にクローニングすることにより生成した。化学的に合成されたｙＣＤ２－ＲＳＶ－ｍｉＲＰＤＬ１カセットは、ｙＣＤ２ ＯＲＦの末端に停止コドンを含有する。
【0199】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションの１８～２０時間前に、１０ｃｍプレート１枚当たり２×１０６細胞で播種する。翌日、２０μｇのｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＲＳＶ－ｍｉＲＰＤＬ１プラスミドを、細胞播種の２０時間後に、リン酸カルシウム法を使用する一過性トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの１８時間後、細胞をＤＭＥＭ培地で３回洗浄し、新鮮な完全培養培地とインキュベートした。ウイルス上清をトランスフェクションのおよそ４２時間後に回収し、０．４５μｍシリンジフィルターに通して濾過した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する一過性トランスフェクションからのＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＲＳＶ－ｍｒＲＰＤＬ１のウイルス力価を、記載の通りに決定した。データは、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＲＳＶ－ｍｉＲＰＤＬ１の力価（約２×１０６ＴＵ／ｍＬ）がＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２の力価と同等であることを示す。
【0200】
加えて、最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から回収したウイルス上清を力価測定して、ウイルスが感染性であるままであることを保証する。データは、最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から生じた力価（約２×１０６ＴＵ／ｍＬ）が、一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得られる力価と同様であり、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２と同等であることを示す。
【0201】
ｙＣＤ２タンパク質の発現およびＰＤＬ１細胞表面発現を測定するために、最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞を回収し、全細胞溶解物を記載の通りにｙＣＤ２タンパク質発現についてアッセイする。抗ｙＣＤ２免疫ブロット結果は、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＲＳＶ－ｍｉＲＰＤＬ１感染Ｕ８７－ＭＧ細胞からのｙＣＤ２タンパク質が、抗ｙＣＤ２抗体を使用して約１５ＫＤａバンドにより示されるように、ウイルスエンベロープタンパク質から効率的に分離されることを示す。予想通り、ウイルスエンベロープ－ｙＣＤ２融合ポリタンパク質も、抗ｙＣＤ２抗体と抗ｇｐ７０抗体の両方を使用して細胞溶解物から検出される。並行して、感染Ｕ８７－ＭＧにおけるウイルスエンベロープタンパク質のプロセシングを、抗ｇｐ７０抗体を使用して検査する。結果は、前駆体（Ｐｒ８５）またはプロセシングされた形態（ｇｐ７０）いずれかでのウイルスエンベロープタンパク質が容易に検出可能であることを示す。加えて、抗ｙＣＤ２免疫ブロットで明らかなように、融合ポリタンパク質が検出される。
【0202】
（実施例１９）
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＲＳＶ－ｍｉＲＰＤＬ１感染Ｕ８７－ＭＧ細胞は、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２感染Ｕ８７－ＭＧ細胞の５－ＦＣ感受性と同等の５－ＦＣ感受性を示す。
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＲＳＶ－ｍｉＲＰＤＬ１感染Ｕ８７－ＭＧ細胞は、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２感染Ｕ８７－ＭＧ細胞の５－ＦＣ感受性と同等の５－ＦＣ感受性を示す。
【0203】
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＲＳＶ－ｍｉＲＰＤＬ１ベクターに最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞を使用して、記載の通りにＭＴＳアッセイによりその５－ＦＣ ＬＤ５０を決定する。この実験では、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２を対照として含める。データは、感染Ｕ８７－ＭＧ細胞において検出される「分離」ｙＣＤ２タンパク質の量が、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２のものと匹敵するＬＤ５０濃度（０．００８ｍＭ）で細胞傷害効果を達成することができることを示す。
【0204】
（実施例２０）
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２－ＲＳＶ－ｍｉＲＰＤＬ１感染ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞は、細胞表面で強力なＰＤ－Ｌ１ノックダウンを示す。
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２－ＲＳＶ－ｍｉＲＰＤＬ１感染ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞は、細胞表面で強力なＰＤ－Ｌ１ノックダウンを示す。
【0205】
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＲＳＶ－ｍｉＲＰＤＬ１のＰＤＬ１ノックダウン活性を評価するために、顕著なレベルのＰＤＬ１を発現することが示されているＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞を、０．１のＭＯＩを使用して感染させる。この実験では、ＲＲＶ－ＲＳＶ－ｍｉＲＰＤＬ１を、ＰＤＬ１ノックダウン活性を評価するための陽性対照として含める。感染後およそ１４日目に細胞を回収し、細胞表面染色を行ってＦＡＣＳによりＰＤＬ１タンパク質のレベルを測定した。データは、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＲＳＶ－ｍｉＲＰＤＬ１に感染させたＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞におけるＰＤＬ１の細胞表面発現が、およそ７５％減少され、ＲＲＶ－ＲＳＶ－ｍｉＲＰＤＬ１のものと同等であることを示す。まとめると、データは、ウイルスエンベロープタンパク質－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２－ＲＳＶ－ｍｉＲＰＤＬ１構成が、ＲＲＶに関連して感染性ウイルス、ｙＣＤ２タンパク質およびｍｉＲＰＤＬ１を産生することができることを示唆している。
【0206】
（実施例２１）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞および最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から産生されるＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯベクターは、感染性であり、ＴＫＯタンパク質を発現する。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞および最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から産生されるＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯベクターは、感染性であり、ＴＫＯタンパク質を発現する。
【0207】
ｐＡＣ３－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＴＫＯおよびｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯは、ヒトコドン最適化（ＴＫＯ）（参照により本明細書に組み入れられる、国際出願公開番号ＷＯ２０１４／０６６７００を参照されたい）カセットを有するＳｒ３９－ｔｋ（Black et al., Cancer Res., 61:3022-3026, 2001；Kokoris et al., Protein Science 11:2267-2272, 2002）をｐＡＣ３－２Ａ骨格にクローニングすることにより生成した。ＴＫＯの配列は、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化されたｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２またはｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２骨格に入れる、５’および３’末端にそれぞれ存在するＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限部位とともに化学的に合成された（Ｇｅｎｅｗｉｚ）。
【0208】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションの１８～２０時間前に、１０ｃｍプレート１枚当たり２×１０６細胞で播種した。翌日、２０μｇのｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯまたはｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯプラスミドを、細胞播種の２０時間後に、リン酸カルシウム法を使用する一過性トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの１８時間後、細胞をＤＭＥＭ培地で３回洗浄し、新鮮な完全培地とインキュベートした。ウイルス上清をトランスフェクションのおよそ４２時間後に回収し、０．４５μｍシリンジフィルターに通して濾過した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する一過性トランスフェクションからのＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯのウイルス力価を、記載の通りに決定した。データは、力価がＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２の力価と同等であることを示す（表Ｇ）。
【0209】
【表G】
【0210】
加えて、最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から回収したウイルス上清を記載の通りに力価測定して、ウイルスが感染性であるままであることを保証する。データは、最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から生じた力価が、一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得られる力価と同等であることを示す。
【0211】
ＴＫＯタンパク質発現を評価するために、細胞溶解物をＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯおよびＲＲＶ－ＧＳＧ１－Ｔ２Ａ－ＴＫＯ感染Ｕ８７－ＭＧ細胞から生成した。抗ＨＳＶ－ｔｋ抗体（カタログ番号ｓｃ２８０３７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ）を１：２００で使用して、全細胞溶解物をＴＫＯタンパク質発現についてアッセイした。結果は、ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯおよびＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯ感染Ｕ８７－ＭＧ細胞からのＴＫＯタンパク質が、ＧＦＰおよびｙＣＤ２導入遺伝子に関して以前に見られたように、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯより低い効率で分離されることを示す。
【0212】
（実施例２２）
ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯベクターは、Ｕ８７－ＭＧ細胞において安定している。
ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯベクターは、Ｕ８７－ＭＧ細胞において安定している。
【0213】
最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞におけるベクターの安定性を評価するために、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｃｅｌｌ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してゲノムＤＮＡを細胞から抽出した。次いで、１００ナノグラムのゲノムＤＮＡを、前に説明したように、導入遺伝子カセットに及ぶプライマーペア：ＩＲＥＳ－Ｆ（５’－ＣＴＧＡＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＣＴＴＧ－３’（配列番号２３））およびＩＲＥＳ－Ｒ（５’－ＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡＡＡＴＡＡ－３’（配列番号２４））を用いるＰＣＲの鋳型として使用した。全てのＲＲＶ－２Ａ－ＴＫＯ構築物についての予想されるＰＣＲ産物は、１．４ｋｂである。データは、プロウイルスＤＮＡ ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯベクターにおける２Ａ－ＴＫＯおよびＧＳＧ－２Ａ－ＴＫＯ領域が、Ｕ８７－ＭＧ細胞においてウイルス複製の時間経過中、安定していることを示す。
【0214】
（実施例２３）
ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯ感染Ｕ８７－ＭＧ細胞は、ＲＲＶ－Ｓ１－ＴＫＯよりも優れたＧＣＶ感受性を示した。
ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯ感染Ｕ８７－ＭＧ細胞は、ＲＲＶ－Ｓ１－ＴＫＯよりも優れたＧＣＶ感受性を示した。
【0215】
ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯに最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞を使用して、ＭＴＳアッセイによりそのＧＣＶ ＬＤ５０を決定した。ＴＫＯ発現が合成最小プロモーター（参照により本明細書に組み入れられる、国際特許公開番号ＷＯ２０１４／０６６７００を参照されたい）により駆動されるＲＲＶ－Ｓ１－ＴＫＯを、対照として含めた。ＧＣＶ（カタログ番号３４５７００－５０ＭＧ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）での処置は、０．０００１μＭ～０．５μＭの範囲の一連の１：２希釈で行った。ＧＣＶ処理なしを対照として含めた。播種の１日後にＧＣＶを添加し、次いで、２日ごとに、ＧＣＶを加えた完全培地を補充した。ＧＣＶの細胞傷害効果を決定するために、ナイーブＵ８７－ＭＧ細胞を対照として含めた。細胞を７日間のインキュベーション時間にわたってモニターし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することにより２日ごとに細胞死を測定した。ＭＴＳの添加の後、ＭＴＳインキュベーション後６０分の時点でＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（Ｔｅｃａｎ）プレートリーダーを使用して４９０ｎｍでＯＤ値を獲得した。三連の各試料からの平均ＯＤ値を、ＲＲＶに感染させたが未処置の細胞に対する細胞生存パーセンテージに変換した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｍを使用してそのパーセンテージ値を対数スケールでＧＣＶ濃度に対してプロットして、ＬＤ５０グラフを生成した。ＬＤ５０値は、獲得したデータ点の非線形４パラメーターフィットを使用してソフトウェアにより計算した。データは、ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯにより発現されるＴＫＯタンパク質が、１０分の１ミリモル濃度範囲でＧＣＶを細胞傷害性ＧＣＶに変換することにおいて酵素的に活性であり、細胞傷害効果を達成することを示す。ＲＲＶ－Ｓ１－ＴＫＯと比較して、ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯは、１２．５～２０倍高いＧＣＶ感受性を示す。加えて、Ｅｎｖ－ＴＫＯ融合ポリタンパク質からのＴＫＯ分離の差にもかかわらず、ＲＲＶ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯとＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ間にも、ＲＲＶ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯとＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯ間にも、ＧＣＶ ＬＤ５０に有意な差ははかった。２Ａ－ｙＣＤ２と同様に、データは、細胞に発現されるＴＫＯタンパク質の量がＧＣＶを細胞傷害性ＧＣＶに変換するのに十分であることを示唆している。
【0216】
（実施例２４）
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯで処置した皮下、同系神経膠腫マウスはＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２の腫瘍成長遅延と同等の腫瘍成長遅延を示す。
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯで処置した皮下、同系神経膠腫マウスはＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２の腫瘍成長遅延と同等の腫瘍成長遅延を示す。
【0217】
同系細胞系Ｔｕ－２４４９をＢ６Ｃ３Ｆ１マウス（Ostertag et al., 2012）における同所性腫瘍モデルとして使用した。皮下腫瘍モデルのためのＴｕ－２４４９細胞の亜系統（Ｔｕ－２４４９ＳＱ）をＴｏｃａｇｅｎで樹立した。９８％ナイーブＴｕ－２４４９ＳＱ細胞と２％ ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯまたはＲＲＶ－Ｓ１－ＴＫＯ感染Ｔｕ－２４４９ＳＱ細胞の混合物をｉｎ ｖｉｔｒｏで調製し、皮下腫瘍移植のためにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）に再懸濁させた。９８％ナイーブＴｕ－２４４９ＳＱ細胞と２％ ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２感染Ｔｕ－２４４９ＳＱ細胞の混合物を陽性対照ならびに比較対照として含めた。各群のＢ６Ｃ３Ｆ１マウス（１群当たりｎ＝１０）に、０日目に、１×１０６の腫瘍細胞を皮下移植した。腫瘍移植後１２日目に（腫瘍のおよそ＞７５％がＲＲＶに感染した時点で）、マウスにＰＢＳ、５－ＦＣ（１用量当たり体重１ｋｇ当たり５００ｍｇ、ｉ．ｐ．、ｂ．ｉ．ｄ．）またはＧＣＶ（１用量当たり体重１ｋｇ当たり５０ｍｇ、ｉ．ｐ．、ｂ．ｉ．ｄ．）を連続５日間投与し、その後、２日間、薬物なしでベクターを残存感染細胞から拡散させた。５日オン、２日オフの薬物処置サイクルをさらに２回繰り返した。腫瘍容積測定を毎日行った。結果は、ＧＣＶなしのＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯもしくはＲＲＶ－Ｓ１－ＴＫＯ、または５－ＦＣ処置なしのＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２を有する担腫瘍マウスが、成長し続けることを示す。対照的に、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯ＋ＧＣＶで処置した担腫瘍マウスは、事前に確立された腫瘍の腫瘍成長を遅延させる。さらに、ＲＲＶ－Ｓ１－ＴＫＯ＋ＧＣＶで処置した担腫瘍マウスも、恐らくＴＫＯ発現の低減に起因して、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯ＋ＧＣＶで処置した腫瘍よりも程度は低く、時間は長いが、腫瘍成長の遅延を示す。まとめると、データは、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯ＋ＧＣＶおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯ＋ＧＣＶの腫瘍成長の遅延が、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２＋５－ＦＣで処置したものと同等であることを示す。データは、皮下、同系神経膠腫マウスモデルではＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＴＫＯおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＴＫＯがＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２と同等の治療有効性を有することを示唆している。
【0218】
（実施例２５）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞および最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から産生されるＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃベクターは、感染性であり、ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖＦｃタンパク質を発現する。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞および最大限感染させたＵ８７－ＭＧ細胞から産生されるＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃベクターは、感染性であり、ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖＦｃタンパク質を発現する。
【0219】
ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ、ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ－タグ、ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃおよびｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ－タグを、ヒトおよびマウスＰＤＬ１に対する遮断一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）として機能するように生成した。ヒトＩｇＧ１の結晶性断片（Ｆｃ）領域を伴うまたは伴わないＰＤＬ１ｓｃＦｖカセットを設計した。加えて、ＨＡおよびＦｌａｇエピトープタグがｓｃＦｖまたはｓｃＦｖＦｃのＣ末端に組み入れられたマッチするカセットも、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖＦｃタンパク質発現の検出のために生成した。各カセットの配列（ＰＤＬ１ｓｃＦｖ、ＰＤＬ１ｓｃＦｖ－タグ、ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃおよびＰＤＬ１ｓｃＦｖＦＣ－タグ）は、５’および３’末端にそれぞれ存在するＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限部位とともに化学的に合成されたものであり（Ｇｅｎｅｗｉｚ）、それを、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化されたｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２骨格にクローニングした。
【0220】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションの１８～２０時間前に、１０ｃｍプレート１枚当たり２×１０６細胞で播種した。翌日、２０μｇのｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ、ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ－タグ、ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃおよびｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ－タグプラスミドを、細胞播種の２０時間後に、リン酸カルシウム法を使用する一過性トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの１８時間後、細胞をＤＭＥＭ培地で３回洗浄し、新鮮な完全培地とインキュベートした。ウイルス上清をトランスフェクションのおよそ４２時間後に回収し、０．４５μｍシリンジフィルターに通して濾過した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する一過性トランスフェクションからのＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＭＣＳＦ－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２のウイルス力価を、記載の通りに決定した。データは、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ－タグ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ－タグの力価値が、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２の力価値と同等であることを示す（表Ｈ）。
【0221】
【表H】
【0222】
ｓｃＦｖタンパク質発現を評価するために、細胞溶解物をＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から生成した。抗Ｆｌａｇおよび抗ＨＡ抗体（カタログ番号１８０４およびカタログ番号Ｈ３６６３、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を１：１，０００で使用して、全細胞溶解物をｓｃＦｖタンパク質発現についてアッセイした。結果は、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ－タグ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ－タグ一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのＰＤＬ１ｓｃＦｖ－タグおよびＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃ－タグタンパク質発現が、ＧＦＰおよびｙＣＤ２およびＴＫＯ導入遺伝子に関して以前に見られたように、Ｅｎｖ－ｓｃＦｖポリタンパク質から分離されることを示す（図４Ａ）。
【0223】
並行して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるウイルスエンベロープタンパク質のプロセシングを、抗２Ａ抗体を使用して検査した。結果は、２Ａペプチド配列を含有する前駆体（Ｐｒ８５）またはプロセシングされた形態（ｐ１５Ｅ）のいずれかのエンベロープを有するウイルスが、４つ全てのベクターにおいて検出されたことを示し（図４Ｂ）、これは、抗Ｆｌａｇおよび抗ＨＡ免疫ブロットで明らかなようにｓｃＦｖおよびｓｃＦｖＦｃタンパク質からのウイルスエンベロープタンパク質の分離を示唆している。融合ポリタンパク質であるＥｎｖ－ｓｃＦｖまたはＥｎｖ－ｓｃＦｖＦｃの発現が細胞溶解物において検出されるが、細胞溶解物および上清からの免疫ブロットにより示されるように、有意な量のＰＤＬ１ｓｃＦｖおよびＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃタンパク質が融合ポリタンパク質から分離される。
【0224】
同様に、大量に存在するｓｃＦｖ－タグおよびｓｃＦｖＦｃ－タグタンパク質発現も、抗Ｆｌａｇ抗体での免疫沈降、その後の抗ＨＡでの検出により、または逆に抗ＨＡ抗体での免疫沈降、その後の抗Ｆｌａｇでの検出により、一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの上清において検出される。さらに、上清ばかりでなく、細胞溶解物におけるｓｃＦｖ－タグおよびｓｃＦｖＦｃ－タグタンパク質発現もまた、一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのレベルのおよそ２分の１～３分の１のレベルで、最大限感染させたＭＤＡ－ＭＢ２３１（ヒト乳がん細胞系）およびＣＴ－２６（マウス大腸がん細胞系）から検出される。
【0225】
（実施例２６）
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＰＨＡ刺激Ｔ細胞活性化を回復させ、等価なＰＤＬ１遮断抗体を示す。ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖまたはＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃによる腫瘍細胞に対するＰＤＬ１遮断が、ＰＤＬ１媒介Ｔ細胞抑制を緩和し得るかどうかを決定するために、本発明者らは、ＰＤＬ１媒介トランス抑制共培養実験を行う。ここで、本発明者らは、ＩＦＮγの細胞内発現またはＩＦＮγの上清への放出により測定して、様々な腫瘍細胞系上でのＰＤＬ１発現のモジュレーションが、健康なドナーＰＢＭＣのＰＨＡ刺激活性化を変更し得るかどうかを評価する。トランス抑制共培養アッセイにおいてＩＦＮγ前処置の潜在的な多面的効果を排除するために、本発明者らは、高いＰＤＬ１基底細胞表面発現レベルを有するヒト乳がん細胞系ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を使用する共培養系を構築する。このアッセイへのＰＤＬ１関与の必要性を確認するために、抗ＰＤＬ１遮断抗体も含めた。ＰＤＬ１＋腫瘍細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、抗ＰＤＬ１遮断抗体の存在下では、ＩＦＮγ＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度増加により示されるようにＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を抑制することができない。同様に、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｃＦｖまたはＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｃＦｖＦｃに感染させたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を同様に回復させた。データは、ＰＤＬ１遮断ｓｃＦｖによる腫瘍細胞およびリンパ球のＰＤＬ１：ＰＤ１軸の破壊が、抗ＰＤＬ１遮断抗体と同等の活性を示し、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃからの実質的な免疫学的利益の証拠を提供することを示す。
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＰＨＡ刺激Ｔ細胞活性化を回復させ、等価なＰＤＬ１遮断抗体を示す。ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖまたはＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃによる腫瘍細胞に対するＰＤＬ１遮断が、ＰＤＬ１媒介Ｔ細胞抑制を緩和し得るかどうかを決定するために、本発明者らは、ＰＤＬ１媒介トランス抑制共培養実験を行う。ここで、本発明者らは、ＩＦＮγの細胞内発現またはＩＦＮγの上清への放出により測定して、様々な腫瘍細胞系上でのＰＤＬ１発現のモジュレーションが、健康なドナーＰＢＭＣのＰＨＡ刺激活性化を変更し得るかどうかを評価する。トランス抑制共培養アッセイにおいてＩＦＮγ前処置の潜在的な多面的効果を排除するために、本発明者らは、高いＰＤＬ１基底細胞表面発現レベルを有するヒト乳がん細胞系ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を使用する共培養系を構築する。このアッセイへのＰＤＬ１関与の必要性を確認するために、抗ＰＤＬ１遮断抗体も含めた。ＰＤＬ１＋腫瘍細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、抗ＰＤＬ１遮断抗体の存在下では、ＩＦＮγ＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度増加により示されるようにＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を抑制することができない。同様に、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｃＦｖまたはＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｃＦｖＦｃに感染させたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を同様に回復させた。データは、ＰＤＬ１遮断ｓｃＦｖによる腫瘍細胞およびリンパ球のＰＤＬ１：ＰＤ１軸の破壊が、抗ＰＤＬ１遮断抗体と同等の活性を示し、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＰＤＬ１ｓｃＦｖＦｃからの実質的な免疫学的利益の証拠を提供することを示す。
【0226】
（実施例２７）
ＲＲＶ、ＴＯＣＡ－５１１、変異プロファイリング。
ＲＲＶ、ＴＯＣＡ－５１１、変異プロファイリング。
【0227】
様々な腫瘍型は、迅速なＲＲＶ複製を可変的に支援することができ、この可変性は、異なる腫瘍のＲＲＶに基づく治療的処置、例えば、高悪性度神経膠腫のためのＲＲＶ Ｔｏｃａ ５１１（別名Ｔ５．０００２）およびプロドラッグＴｏｃａ ＦＣ処置に対する感受性を変更し得る（T.F. Cloughsey et al., Sci Transl Med., 8(341):341ra75, June 1, 2016, doi: 10.1126/scitranslmed. aad9784.）。この可変性は、様々な要因に起因するが、患者の血液または腫瘍から回収された改変酵母シトシンデアミナーゼをコードするＲＲＶの本発明者らのシークエンシングデータから、関連すると思われるのは、ＡＰＯＢＥＣ機能、特に、ＡＰＯＢＥＣ３ＢおよびＡＰＯＢＥＣ３Ｇによる改変である（B.P. Doehle et al., J.Virol. 79: 8201-8207, 2005）。発現の改変は、不活性化または弱毒化変異が、複製するレトロウイルスベクターに、それが腫瘍組織において漸進的に複製するにつれて蓄積する頻度から推定される。研究は、最も頻度の高い事象の１つがＧからＡへの変異であることを示し、この変異は、逆転写ステップにおける第１の複製ステップからのマイナス鎖一本鎖ＤＮＡにおけるＡＰＯＢＥＣ媒介変異に特有のＣからＴへの遷移に相当する。これらの変異は、ＲＲＶタンパク質のアミノ酸組成の変化、例えば、ＴＧＧ（トリプトファン）から停止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）への壊滅的変化を引き起こし得る。一部の腫瘍（特に、膀胱、子宮頸、肺（腺癌および扁平上皮癌）、頭頸部および乳がん、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ活性は、上方調節され、この上方調節は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ活性と一致する変化に伴う変異負荷量の増加と相関することが、示されている（MB. Burns et al., Nature Genetics 45: 977-83, 2013; doi: 10.1038/ng.2701）。この上方調節の背後にある駆動因子は、より高度な変異速度が腫瘍の進化ならびに腫瘍に有利な遺伝子型および表現型の選択に好都合であることであると、提案されている。一実施形態では、ウイルスの不活性化変化は、ＡＰＯＢＥＣにより変換されないであろうフェニルアラニンまたはチロシンなどの、類似の化学的または構造的特性を有する他のアミノ酸のためのコドンの置換により回避される。Ｔｏｃａ ５１１は、プロドラッグ５－ＦＣの細胞傷害性５－ＦＵへの変換を触媒する、ＩＲＥＳに連結されている熱安定性コドン最適化酵母シトシンデアミナーゼをコードする、ＭＬＶ由来のＲＲＶである。Ｔｏｃａ ５１１処置の過程で、Ｔｏｃａ ５１１は、逆転写のエラーおよび細胞の抗ウイルス防御機構、例えばＡＰＯＢＥＣ媒介シチジンデアミナーゼに起因して、変異を起こしやすい。ＡＰＯＢＥＣタンパク質は、主としてＴｏｃａ ５１１ ＲＮＡゲノムの逆転写中に、一本鎖ＤＮＡを標的とし、ＧからＡ点として顕在化する。
【0228】
Ｔｏｃａ ５１１配列変異スペクトルを、腫瘍および血液から単離した臨床試料からのＴｏｃａ ５１１のハイスループットシークエンシングによりプロファイリングすることができる。ＧからＡへの点変異は、ＡＰＯＢＥＣ活性と一致する、Ｔｏｃａ ５１１において最もよく見られる変異型である。これは、ハイスループットシークエンシングによるヒト試料からのガンマ－レトロウイルス遺伝子療法変異スペクトルの最初の特徴付けである。ＧからＡへの変異の分析は、これらがコード配列の非同義変化を通常はもたらすことを示す。シトシンデアミナーゼポリペプチドをコードする遺伝子内には、複数の患者からの試料中のＧからＡへの反復変異を有する位置が２カ所ある（表Ｉ）。これらの変異は、トリプトファンをコードするコドンＴＧＧをＴＧＡ、ＴＡＧまたはＴＡＡ停止コドンに変換し、結果として、９つのアミノ酸のみの後、ＣＤ翻訳を終結する。これらの結果は、トリプトファンコドンがレトロウイルス遺伝子療法の不活性化の潜在的原因であることを強調する。
【0229】
【表I】
【0230】
したがって、タンパク質機能に適合するアミノ酸をコードする代替コドンへのトリプトファンコドンの変化は、レトロウイルス遺伝子療法のＡＰＯＢＥＣ媒介不活性化を軽減することができる。
【0231】
安定性に対する変異の効果を試験するために、Ｔｏｃａ ５１１ゲノム配列（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第８，７２２，８６７号、‘８６７特許の配列番号１９、２０および２２を参照されたい）を、ＡｐｏＢｅｃ高頻度変異を示すコドンを、安定性および機能（例えば、トリプトファンのコドンを他の許容されるアミノ酸に変化させること）を保存する代替アミノ酸をコードするコドンへ変化させるように操作する。シトシンデアミナーゼ活性を有するＴｏｃａ ５１１ポリペプチド（配列番号２９を参照されたい）は、天然に存在する真菌シトシンデアミナーゼタンパク質と密接に関連しており、そのようなシトシンデアミナーゼの高分解構造を利用することができる。したがって、系統発生学的に多様な真菌ＣＤタンパク質からの構造的アラインメントと複数の配列アラインメントの組合せを利用して、例えば、ＲＯＳＥＴＴＡ、Ｐｒｏｖｅａｎ、ＰＳＩｐｒｅｄまたは類似のプログラムを使用して、生体機能に対して有害効果を及ぼさない可能性のあるアミノ酸置換を同定することが可能である。次いで、Ｔｏｃａ ５１１ゲノムを変更し、酵素および生体活性、溶解度、溶液中での熱安定性、細胞培養アッセイおよびマウス腫瘍モデル、例えば５－ＦＣから５－ＦＵへの変換、において機能する、細胞死を開始させる、および腫瘍に対する免疫応答を活性化して持続的奏効を達成する能力を測定することにより、一連の推定的アミノ酸置換を試験する。類似の分析を、ＧＡＧ、ＰＯＬおよびＥＮＶ配列に使用して、そのような配列を改変して、ＡｐｏＢｅｃ高頻度変異を起こしやすいコドンを除去することができる。
【0232】
（実施例２８）
ＡＰＯＢＥＣ耐性ｙＣＤウイルスベクターは、ヌードマウスにおいて頭蓋内ヒト異種移植片（Ｔ９８Ｇ）において治療的である。
ＡＰＯＢＥＣ耐性ｙＣＤウイルスベクターは、ヌードマウスにおいて頭蓋内ヒト異種移植片（Ｔ９８Ｇ）において治療的である。
【0233】
ＡＰＯＢＥＣを高度に発現しているＴ９８Ｇヒト神経膠腫細胞系を使用する頭蓋内の異種移植片モデルを樹立して、高ＡＰＯＢＥＣ活性条件下、ヌードマウス宿主において、ＲＲＶベクターの拡散および体内分布ならびにＡＰＯＢＥＣ耐性ＲＣＲベクター媒介シトシンデアミナーゼ自殺遺伝子療法の治療有効性を試験する。
【0234】
順化後、マウスを９つの処置群（下記の群を参照されたい）のうちの１つに無作為に割り当てる。０日目に、８つの群には、投与されるＴ９８Ｇ細胞１×１０５／マウスの右線条体への頭蓋内投与を施す。群９のマウスには腫瘍を移植しない。５日目に、マウスに製剤用緩衝液のみを注射するか、Ｔ５．０００２（ｙＣＤ発現ＡＰＯＢＥＣ感受性ＲＲＶ；群３）を９×１０５ＴＵ／５μｌで注射するか、またはＡＰＯＢＥＣ耐性ＲＣＲベクター（Ｔ５．００２Ａ）を９×１０５ＴＵ／５μｌ、９×１０４ＴＵ／５μｌ、もしくは９×１０３ＴＵ／５μｌで注射する。無作為化した５－ＦＣの投与を５００ｍｇ／ｋｇ／日で行い、１９日目から開始して単回ＩＰ注射として投与するか、または一部の群には５－ＦＣを投与しない（群１、４、８）。中間用量のベクターを投与するマウスには全て５－ＦＣを投与する（すなわち、この用量には別の対照群がない）。５－ＦＣ投与を連続７日間、毎日継続し、その後１５日間は処置をしない。薬物と休薬のサイクルを最大４サイクル繰り返す。群８を除いて各群からのマウス１０匹を、生存分析カテゴリーに無作為に割り当てる。所定のスケジュールに従って、残りのマウスを屠殺する。
【表9】
【0235】
静脈内投与は、尾静脈への注射によって行う。腹腔内投与は、膀胱を避けるように注意をして腹部への注射によって行う。頭蓋内注射のために、マウスをイソフルランで麻酔し、とがっていないイヤーバーを備えた定位固定デバイスに配置する。手術部位を準備するために、皮膚を剪毛し、ベタジンを使用して頭皮を処置する。動物を加温パッド上に置き、無菌条件下でメスを使用して、皮膚を通して正中切開を行う。切開部位における皮膚の退縮および筋膜の反射により、頭蓋の可視化が可能になる。３．５ｍｍの突起を有するキャップを取り付けた３ｍｍの突起を有するガイドカニューレを頭蓋内の小さい頭蓋穿孔経由で挿入し、頭蓋に歯科用セメントおよび３個の小さいネジを取り付ける。セメントの硬化後、皮膚を縫合糸で閉じる。投影定位座標は、ＡＰ＝０．５～１．０ｍｍ、ＭＬ＝１．８～２．０ｍｍ、ＤＶ＝３．０ｍｍである。動物のコホートの正確な定位座標は、パイロット実験（動物２～３匹）で染料を注射してその位置を決定することによって決定する。麻酔回復の間、動物をモニターする。鎮痛剤であるブプレノルフィンを手技の終了前に皮下（ＳＣ）に投与し、次いで、ブプレノルフィンを最大３日間、１２時間ごとに適切に投与する。動物を毎日モニターする。ガイドカニューレを通して挿入した３．５ｍｍの突起を有する注入カニューレによって、細胞またはベクターを頭蓋内注入する。ハミルトンシリンジと柔軟なチューブとを取り付けたシリンジポンプで速度を制御する。細胞注入については、１マイクロリットルの細胞を毎分０．２マイクロリットルの流量で（合計５分間）送達する。ベクター注入については、５マイクロリットルのベクターを毎分０．３３マイクロリットルの流量で（合計１５分間）送達する。
【0236】
ＡＰＯＢＥＣ耐性ベクターをマウスに送達し、脳重量１ｇ当たりの形質転換単位（ＴＵ）として計算する。このような計算を使用して、ヒトを含む他の哺乳動物用の用量変換を計算することができる。ＡＰＯＢＥＣ耐性ベクターは、有効な用量応答を示すが、ＡＰＯＢＥＣ活性に対して感受性のベクターは、有効な応答の減少を示す。同じ実験を、ヒトＡＰＯＢＥＣ３ＧまたはＡＰＯＢＥＣ３Ｂ用の発現ベクターをトランスフェクトしたＵ８７細胞系で行い、前記ベクターは、異種移植モデルに移植されたＵ８７の天然レベルより少なくとも３倍高いレベルでこれらのタンパク質を発現させる。これらの実験は、ＡＰＯＢＥＣ耐性になるように設計した改変コドンウイルスが、ＡＰＯＢＥＣレベルが増加したＵ８７系において、ＡＰＯＢＥＣ耐性用にコドン改変されていない元のＲＲＶよりも複製および／または治療応答の点で有利であることを示す。
【0237】
（実施例２９）
ＡＰＯＢＥＣ耐性ｙＣＤウイルスベクターは、脳がんの同系マウスモデルにおいて治療的である。
ＡＰＯＢＥＣ耐性ｙＣＤウイルスベクターは、脳がんの同系マウスモデルにおいて治療的である。
【0238】
同系の動物モデルにおいて本開示の方法および組成物を実証するための追加実験を行う。
【0239】
同系のＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてマウスＡＰＯＢＥＣ３を産生するように安定的にトランスフェクトしたＣＴ２６結腸直腸がん細胞系を使用する頭蓋内移植モデルを樹立して、ＡＰＯＢＥＣ耐性ＲＲＶベクターの拡散および体内分布、ならびにＲＲＶベクター媒介シトシンデアミナーゼ自殺遺伝子療法の治療有効性およびその免疫学的な影響を試験する。
【0240】
この研究は、動物１２９匹、雄０匹、雌１１９匹および予備動物１０匹（雌１０匹）を含む。順化後、マウスを９つの処置群（下記の群を参照されたい）のうちの１つに無作為に割り当てる。０日目に、８つの群には、投与されるＡＰＯＢＥＣ発現ＣＴ２６細胞１×１０４／マウスの右線条体への頭蓋内投与を施す。群９のマウスには腫瘍を移植しない。４日目に、マウスに製剤用緩衝液のみを注射するか、ＡＰＯＢＥＣに依然として感受性である対照ベクター（Ｔ５．０００２）を９×１０５ＴＵ／５μｌで注射するか、またはＡＰＯＢＥＣ耐性ベクター（Ｔ５．０００２Ａ）を９×１０５ＴＵ／５μｌ、９×１０４ＴＵ／５μｌ、もしくは９×１０３ＴＵ／５μｌで注射する。ベクターを施していないマウス、またはベクターを９×１０５ＴＵ／５μｌもしくは９×１０３ＴＵ／５μｌで施したマウスを無作為化して、１３日目から開始してＩＰ注射として投与される５－ＦＣ（５００ｍｇ／ｋｇ／ＢＩＤ）を与えるか、または示したように５－ＦＣを与えない（ＰＢＳ）。中間用量のベクターを施すマウスには、５－ＦＣを施す（すなわち、この用量には別の対照群がない）。５－ＦＣ投与を連続７日間、毎日継続し、その後１０日間は処置をしない。薬物と休薬のサイクルを最大４サイクル繰り返す。群９を除いて各群からのマウス１０匹を、生存分析カテゴリーに無作為に割り当てる。所定のスケジュールに従って、残りのマウスを屠殺する。
【0241】
ナイーブセンチネルマウスを計画屠殺動物と共に飼育し、同時点で屠殺して排出を介したベクター伝達を評価する。
【表10】
【0242】
静脈内投与は、尾静脈への注射によって行う。腹腔内投与は、膀胱を避けるように注意をして腹部への注射によって行う。頭蓋内投与のために、右線条体に移植した３．２ｍｍの突起を有し、３．７ｍｍの突起を有するキャップを取り付けたガイドカニューレを有するマウスを使用する。投影定位座標は、ＡＰ＝０．５～１．０ｍｍ、ＭＬ＝１．８～２．０ｍｍ、ＤＶ＝３．２ｍｍ（ブレグマから）である。ガイドカニューレを通して挿入した３．７ｍｍの突起を有する注入カニューレによって、細胞またはベクターを頭蓋内注入する。ハミルトンシリンジと柔軟なチューブとを取り付けたシリンジポンプで速度を制御する。
【0243】
細胞注入については、１マイクロリットルの細胞を毎分０．２マイクロリットルの流量で（合計５分間）送達する。ベクター注入については、５マイクロリットルのベクターを毎分０．３３マイクロリットルの流量で（合計１５分間）送達する。
【0244】
ベクターをマウスに送達し、脳重量１ｇ当たりの形質転換単位（ＴＵ）として計算する。このような計算を使用して、ヒトを含む他の動物用の用量変換を計算することができる。この研究の結果は、ＡＰＯＢＥＣ耐性ウイルスが、腫瘍全体にわたって拡散し、ｙＣＤの完全性を維持し、５ＦＣとの組合せで腫瘍の処置に対して、ＡＰＯＢＥＣ感受性ＲＲＶと比較して、より有効であることを示す。ＡＰＯＢＥＣ耐性ＲＲＶはまた、ナイーブなケージの仲間に水平拡散しない。
【0245】
上記の通り、ＲＲＶは、「２Ａカセット」を含有する。例えば、配列番号２、４３～５３および５４は、２Ａカセットを含有する一般的構築物を提供する。このカセットを多くの異なるカセットで置き換えることができる。例えば、以下のカセットを調製し、配列番号２、４３～５３または５４ベクター骨格のいずれか１つにクローニングし、特定の構築物におけるカセットを置き換えることができる。
【0246】
本明細書で提供する方法および配列を使用して、以下のような多くのベクターを設計した：
ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＧＦＰｍ（配列番号４３）
ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰｍ（配列番号４４）
ｐＡＣ３－Ｐ２Ａ－ＧＦＰｍ（配列番号４５）
ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰｍ（配列番号４６）
ｐＡＣ３－Ｅ２Ａ－ＧＦＰ（配列番号４７）
ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｅ２Ａ－ＧＦＰｍ（配列番号４８）
ｐＡＣ３－Ｆ２Ａ－ＧＦＰｍ（配列番号４９）
ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｆ２Ａ－ＧＦＰｍ（配列番号５０）
ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２（配列番号５１）
ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２（配列番号５２）
ｐＡＣ３－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２（配列番号５３）
ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２（配列番号５４）
ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ＧＦＰｍ（配列番号４３）
ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰｍ（配列番号４４）
ｐＡＣ３－Ｐ２Ａ－ＧＦＰｍ（配列番号４５）
ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰｍ（配列番号４６）
ｐＡＣ３－Ｅ２Ａ－ＧＦＰ（配列番号４７）
ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｅ２Ａ－ＧＦＰｍ（配列番号４８）
ｐＡＣ３－Ｆ２Ａ－ＧＦＰｍ（配列番号４９）
ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｆ２Ａ－ＧＦＰｍ（配列番号５０）
ｐＡＣ３－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２（配列番号５１）
ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２（配列番号５２）
ｐＡＣ３－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２（配列番号５３）
ｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｐ２Ａ－ｙＣＤ２（配列番号５４）
【0247】
（実施例３０）
シグナルペプチド配列を欠いているｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１の分泌を、Ｎ末端への異種シグナルペプチドの挿入により達成することができる。
シグナルペプチド配列を欠いているｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１の分泌を、Ｎ末端への異種シグナルペプチドの挿入により達成することができる。
【0248】
ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１プラスミドＤＮＡの構築。ＰＤ－Ｌ１に対する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の２対の異なる構成を設計した。一方の対は、ヒトＩｇＧ１からのＦｃを伴うｓｃＦｖおよび伴わないｓｃＦｖからなり、それぞれ、ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１およびｓｃＦｖＦｃ－ＰＤＬ１と名付けた。もう一方の対は、Ｃ末端に組み入れられたＨＡおよびＦｌａｇエピトープを有するｓｃＦｖ－ＰＤＬ１およびｓｃＦｖＦｃ－ＰＤＬ１からなり、ｓｃＦｖ－ＨＦ－ＰＤＬ１およびｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ－ＰＤＬ１と名付けた。各構成のコード配列は、ウイルスエンベロープ遺伝子の３’コード配列、続いてｇＴ２Ａペプチド配列を含有し、各構成のコード配列を、結果としてｐＡＣ３－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１、ｐＡＣ３－ｓｃＦｖＦｃ－ＰＤＬ１、ｐＡＣ３－ｓｃＦｖ－ＨＦ－ＰＤＬ１、ｐＡＣ３－ｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ－ＰＤＬ１が得られるｇ２Ａ－ｙＣＤ２導入遺伝子を置き換えるための対応する部位のｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－ｙＣＤ２へのサブクローニングのためにＡｓｃ ＩおよびＮｏｔ Ｉ制限部位を用いて合成した。全てのｓｃＦｖ－ＰＤＬ１バリアントについて、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１の分泌を可能にするためにヒトＩＬ－２からのシグナルペプチドをＮ末端に組み入れた。
【0249】
ＲＲＶ－２Ａ構成にコードされているｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１を発現させ、適切にプロセシングする。図３に示されているように、２Ａ配列以外のものにより、例えば、ＩＲＥＳ配列またはミニプロモーターを使用して、異種シグナルペプチドを有するｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１を発現させること、および分泌可能な形態のｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１を発現させるベクターを得ることが可能である。しかし、本発明者らは、導入遺伝子発現のためにウイルス由来の「自己切断」２Ａペプチドを利用するＲＲＶ構成は、ＲＲＶ－２Ａ構成が１．２ｋｂまでの導入遺伝子挿入を許容することができることを実証したことを、ここに記載する。この研究で、本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１に対する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の２つの異なる構成を設計した。一方は、単独のｓｃＦｖからなり、もう一方は、ヒトＩｇＧ１からのＦｃを伴うｓｃＦｖからなり、それぞれ、ｐＡＣ３－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１およびｐＡＣ３－ｓｃＦｖＦｃ－ＰＤＬ１と名付けた。ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する抗体の非存在に起因して、本発明者らは、ＨＡおよびＦｌａｇエピトープが導入遺伝子のＣ末端に組み入れられている、マッチする対の構築物を生成し、これらをｐＡＣ３－ｓｃＦｖ－ＨＦ－ＰＤＬ１およびｐＡＣ３－ｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ－ＰＤＬ１と名付けた（図３）。
【0250】
ＲＲＶ－２Ａ構成においてウイルスエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質とインフレームでコードされている異なる細胞区画に標的化された導入遺伝子は、Ｅｎｖ－導入遺伝子ポリタンパク質から効率的に分離される（Hofacre et al., 2018）。エピトープタグ付きのおよびエピトープタグが付いていないｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１タンパク質は両方とも、ウイルスＥｎｖタンパク質から分離され、細胞から分泌されるように設計されているので、本発明者らは、一過性トランスフェクション系を使用して導入遺伝子タンパク質を高度に過剰発現させて、エピトープタグ付きｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃタンパク質の検出を補助した。一過性トランスフェクト２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分解し、抗ＨＡおよび抗Ｆｌａｇ抗体で検出して、それぞれｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１の存在および２Ａペプチドにより媒介されるその分離効率を確認した。加えて、ポリタンパク質からのウイルスＥｎｖタンパク質の適切なプロセシングを確認するために抗２Ａ抗体も含めた。図５は、ｓｃＦｖ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１とｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１の両方が、予想通り、検出され、ポリタンパク質から分離されること、および１５Ｅ－２Ａの検出により示されるようにウイルスＥｎｖタンパク質がそのサブユニットへと適切にプロセシングされることを示す。検出される残留非分離ポリタンパク質も予想される。細胞溶解物は、タンパク質が高度に過剰発現される一過性にトランスフェクトされた系に由来し、そのような非分離ポリタンパク質はウイルス粒子に組み入れられないことは以前に示されているからである。さらに、ウェスタンによる細胞内エピトープタグ付きｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１の検出は、タンパク質が最大分泌に達しなかった可能性があることを示唆している。
【0251】
ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１およびＲＲＶ－ｓｃＦｖＦｃ－ＰＤＬ１感染細胞から分泌されるｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－Ｌ１結合についてＰＤ－１と競合する。ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１およびＲＲＶ－ｓｃＦｖＦｃ－ＰＤＬ１の導入遺伝子タンパク質発現およびウイルス機能が確認されたので、本発明者らは、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１の結合特性を評価した。ＰＤ－１とｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１またはｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１との共インキュベート後にＰＤ－Ｌ１に結合したままであるＨｉｓタグ付きＰＤ－１の量を定量するＥＬＩＳＡベースの競合アッセイを使用して、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断するｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１タンパク質の能力を評価した。上清中のｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１濃度は未定義であるが、それらは、用量依存的にヒトＰＤ－Ｌ１およびマウスＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。１００μＬの上清を使用する阻害のレベルは、遮断抗体対照のものと同等であり、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１とｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１間に有意差はなかった（図６Ａ）。マウスＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断におけるｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１の作用強度は、有効であるように見えるが、ヒト対応物でよりも作用強度がわずかに弱く、しかし抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体対照よりも有効性が高い（図６Ｂ）。本発明者らは、表面プラズモン共鳴系を使用して、ヒトおよびマウスＰＤ－Ｌ１に対するｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１の結合動態をさらに評価した。ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡを一過性トランスフェクションのためにＣＭＶ駆動発現ベクターにクローニングし、その後、精製して純度＞８５％を得た。組換えヒトＰＤ－Ｌ１およびマウスＰＤ－Ｌ１に対するｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１の平衡解離定数（ＫＤ）を、それぞれ、０．４２６ｎＭおよび４．７８ｎＭであると決定した、表Ｊ。より遅いＫＯｆｆの結果としての、ヒトＰＤ－Ｌ１に対するおよそ１０倍高い結合親和性は、ヒトＰＤ－Ｌ１とマウスＰＤ－Ｌ１が、それらのアミノ酸配列に関してほぼ８０％の相同性を共有するにもかかわらず競合ＥＬＩＳＡで観察される、ヒトＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断におけるｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１のより高い作用強度を説明することができた。
【0252】
【表J】
【0253】
（実施例３１）
ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１感染細胞から分泌されたｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１は、細胞表面のＰＤ－Ｌ１へのバイスタンダーのトランス結合活性を示す。ｉｎ ｓｉｔｕでの患者腫瘍細胞の１００％の感染は、現在のところ、ＲＲＶを含むいずれのウイルスに基づく治療アプローチによっても実現不可能であるので、本発明者らは、隣接する未感染細胞上のＰＤ－Ｌ１に結合する能力を有する分泌導入遺伝子産物を設計した。ここで、本発明者らは、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１またはｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１の抗原結合特異的結合をフローサイトメトリーにより確認するために、細胞に基づくアッセイを利用した。この実験では、細胞表面上の結合ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１の存在を検出するための抗体がなかったため、本発明者らは、検出のために、エピトープタグ付きｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１（ｓｃＦｖ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１）、続いて抗ＨＡ抗体を使用した。これらのデータは、抗ＨＡ抗体に伴う平均蛍光強度（ＭＦＩ）の著しいシフトにより示されるように、ｓｃＦｖ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１が、ヒトおよびマウス細胞系における細胞表面に発現されるＰＤ－Ｌ１に結合することを示す。試験したヒト細胞系とマウス細胞系の両方においてｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１に関して観察されるＭＦＩのより高度なシフトは、Ｆｃ領域間のジスルフィド結合形成による二量体形成によるｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１の二価二量体に起因する可能性が高く、したがって、ｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１がＥＬＩＳＡにおいてｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１ほど効率的に競合しない（図５）ので、結合親和性の増大ではなく細胞表面のｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１に結合したより多くの抗ＨＡ抗体の単なる反映である。さらに、抗ＨＡ抗体と共インキュベートしたときの細胞表面のＰＤ－Ｌ１への抗ＰＤ－Ｌ１遮断抗体の接近可能性を阻止することによって抗ＰＤ－Ｌ１抗体でのＭＦＩの顕著な減少が生じたことにより、抗原結合特異性を実証した。競合ＥＬＩＳＡで観察されたデータと一致して、ｓｃＦｖ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１は、細胞表面のＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ－Ｌ１への抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合を遮断し、これは、ｓｃＦｖ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１のエピトープが、重複しているかまたは抗ＰＤ－Ｌ１抗体のものの近位にあることを示唆している。加えて、抗ＰＤ－Ｌ１抗体でのＭＦＩの顕著な減少は、細胞表面の完全な受容体（ＰＤ－Ｌ１）占有も示唆している。
ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１感染細胞から分泌されたｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１は、細胞表面のＰＤ－Ｌ１へのバイスタンダーのトランス結合活性を示す。ｉｎ ｓｉｔｕでの患者腫瘍細胞の１００％の感染は、現在のところ、ＲＲＶを含むいずれのウイルスに基づく治療アプローチによっても実現不可能であるので、本発明者らは、隣接する未感染細胞上のＰＤ－Ｌ１に結合する能力を有する分泌導入遺伝子産物を設計した。ここで、本発明者らは、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１またはｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１の抗原結合特異的結合をフローサイトメトリーにより確認するために、細胞に基づくアッセイを利用した。この実験では、細胞表面上の結合ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１の存在を検出するための抗体がなかったため、本発明者らは、検出のために、エピトープタグ付きｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１（ｓｃＦｖ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１）、続いて抗ＨＡ抗体を使用した。これらのデータは、抗ＨＡ抗体に伴う平均蛍光強度（ＭＦＩ）の著しいシフトにより示されるように、ｓｃＦｖ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１が、ヒトおよびマウス細胞系における細胞表面に発現されるＰＤ－Ｌ１に結合することを示す。試験したヒト細胞系とマウス細胞系の両方においてｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１に関して観察されるＭＦＩのより高度なシフトは、Ｆｃ領域間のジスルフィド結合形成による二量体形成によるｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１の二価二量体に起因する可能性が高く、したがって、ｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１がＥＬＩＳＡにおいてｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１ほど効率的に競合しない（図５）ので、結合親和性の増大ではなく細胞表面のｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１に結合したより多くの抗ＨＡ抗体の単なる反映である。さらに、抗ＨＡ抗体と共インキュベートしたときの細胞表面のＰＤ－Ｌ１への抗ＰＤ－Ｌ１遮断抗体の接近可能性を阻止することによって抗ＰＤ－Ｌ１抗体でのＭＦＩの顕著な減少が生じたことにより、抗原結合特異性を実証した。競合ＥＬＩＳＡで観察されたデータと一致して、ｓｃＦｖ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１は、細胞表面のＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ－Ｌ１への抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合を遮断し、これは、ｓｃＦｖ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１のエピトープが、重複しているかまたは抗ＰＤ－Ｌ１抗体のものの近位にあることを示唆している。加えて、抗ＰＤ－Ｌ１抗体でのＭＦＩの顕著な減少は、細胞表面の完全な受容体（ＰＤ－Ｌ１）占有も示唆している。
【0254】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤ－Ｌ１のバイスタンダー効果を評価するために、本発明者らは、腫瘍細胞上の完全受容体占有を達成するために必要な最小形質導入レベルを試験した。この実験では、ＲＲＶ－ＧＦＰに最大限感染させたＥＭＴ６細胞と様々な比率で混合した、ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＨＦ－ＰＤ－Ｌ１に最大限感染させたＥＭＴ６マウス乳がん細胞を共培養して、抗ＨＡおよび抗ＰＤ－Ｌ１抗体を使用して細胞表面に結合したｓｃＦｖ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１および結合していないＰＤ－Ｌ１を測定した。本発明者らのデータは、細胞の５％しかｓｃＦｖ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１を発現しなかったときに、結合したｓｃＦｖ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１が全ての細胞表面においてを検出されたことを示す 図７Ａ。ＰＤ－Ｌ１の完全占有は、用量依存的に細胞表面のＰＤ－Ｌ１シグナルの減少と逆相関し（図７Ｂ）、これは、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１が、最小レベルの形質導入で１００％のバイスタンダー効果を達成することができることを示唆している。
【0255】
（実施例３２）
ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１処置は、同系腫瘍モデルにおいて、用量依存的に腫瘍成長阻害をもたらし、免疫記憶応答を惹起する。本発明者らは、５％程度の少ない事前形質導細胞から分泌されるｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１が、非ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１発現細胞の細胞表面の完全ＰＤ－Ｌ１占有をもたらすバイスタンダートランス結合活性を示すことを明らかにした。本発明者らは、次に、チェックポイント阻害剤に応答性であると報告されている同系同所性ＥＭＴ６乳がんモデルにおいてｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１の抗腫瘍活性の用量応答を評価した。より臨床的に意義のあるシナリオでｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１の抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１、ＲＲＶ－ｓｃＦｖＦｃ－ＰＤＬ１またはＲＲＶ－ＧＦＰベクターで最大限事前形質導入した異なる比率のＥＭＴ６細胞を使用して、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１が抗腫瘍活性を達成するために必要な最小形質導入レベルを決定しようとした。これらの細胞は、受容体下方調節に起因する、両種指向性エンベロープタンパク質により媒介される、さらなるＲＲＶ感染に対して耐性である。この実験では、ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１またはＲＲＶ－ＧＦＰで事前に形質導入したＥＭＴ６腫瘍細胞の示した比率での混合物を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの乳房脂肪体に移植した。生存を９０日間モニターし、カプラン・マイヤー生存分析を行って、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１の抗腫瘍活性を評価した。動物使用プロトコールに従って、壊死性腫瘍を担持するマウスを安楽死させ、分析を打ち切った（図６Ａでは１カウントとして示した；これらのマウスを死亡のため採点せず、グラフから除外しなかった）。生存分析のために、同じ比率のｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１またはｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１を発現する担腫瘍マウスを一緒に群分けした。これらのデータは、２％、３０％および１００％ ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１またはｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍細胞を有する担腫瘍マウスには、統計的に有意ではないが、未処置動物と比較して生存利益への傾向があることを示す（図８Ａ）（０％ ｓｃＦｖ／ｓｃＦｖＦｃ対抗ＰＤ－１についてｐ＝０．２５２９；０％対２％についてｐ＝０．２５２９；０％対３０％についてｐ＝０．０９１９；０％対１００％についてｐ＝０．１６７４）。本発明者らは、原発性腫瘍から生き残ったマウスが、側腹部へのナイーブＥＭＴ６腫瘍細胞での再チャレンジにより抗腫瘍免疫記憶応答を確立するかどうかを、さらに研究しようとした。図８Ｂは、原発性設定でのｓｃＦｖ／ｓｃＦｖＦｃ処置で腫瘍を排除したマウスが、再チャレンジ設定で腫瘍成長の中等度遅延を示したことを示し、これは、抗腫瘍免疫応答がこれらのマウスにおいて確立されたことを示唆している。まとめると、データは、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１またはｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞が、市販の抗体での処置より優れているように見える抗がん活性をもたらすことができることを示す。
ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１処置は、同系腫瘍モデルにおいて、用量依存的に腫瘍成長阻害をもたらし、免疫記憶応答を惹起する。本発明者らは、５％程度の少ない事前形質導細胞から分泌されるｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１が、非ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１発現細胞の細胞表面の完全ＰＤ－Ｌ１占有をもたらすバイスタンダートランス結合活性を示すことを明らかにした。本発明者らは、次に、チェックポイント阻害剤に応答性であると報告されている同系同所性ＥＭＴ６乳がんモデルにおいてｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１の抗腫瘍活性の用量応答を評価した。より臨床的に意義のあるシナリオでｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１およびｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１の抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１、ＲＲＶ－ｓｃＦｖＦｃ－ＰＤＬ１またはＲＲＶ－ＧＦＰベクターで最大限事前形質導入した異なる比率のＥＭＴ６細胞を使用して、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１が抗腫瘍活性を達成するために必要な最小形質導入レベルを決定しようとした。これらの細胞は、受容体下方調節に起因する、両種指向性エンベロープタンパク質により媒介される、さらなるＲＲＶ感染に対して耐性である。この実験では、ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１またはＲＲＶ－ＧＦＰで事前に形質導入したＥＭＴ６腫瘍細胞の示した比率での混合物を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの乳房脂肪体に移植した。生存を９０日間モニターし、カプラン・マイヤー生存分析を行って、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１の抗腫瘍活性を評価した。動物使用プロトコールに従って、壊死性腫瘍を担持するマウスを安楽死させ、分析を打ち切った（図６Ａでは１カウントとして示した；これらのマウスを死亡のため採点せず、グラフから除外しなかった）。生存分析のために、同じ比率のｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１またはｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１を発現する担腫瘍マウスを一緒に群分けした。これらのデータは、２％、３０％および１００％ ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１またはｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍細胞を有する担腫瘍マウスには、統計的に有意ではないが、未処置動物と比較して生存利益への傾向があることを示す（図８Ａ）（０％ ｓｃＦｖ／ｓｃＦｖＦｃ対抗ＰＤ－１についてｐ＝０．２５２９；０％対２％についてｐ＝０．２５２９；０％対３０％についてｐ＝０．０９１９；０％対１００％についてｐ＝０．１６７４）。本発明者らは、原発性腫瘍から生き残ったマウスが、側腹部へのナイーブＥＭＴ６腫瘍細胞での再チャレンジにより抗腫瘍免疫記憶応答を確立するかどうかを、さらに研究しようとした。図８Ｂは、原発性設定でのｓｃＦｖ／ｓｃＦｖＦｃ処置で腫瘍を排除したマウスが、再チャレンジ設定で腫瘍成長の中等度遅延を示したことを示し、これは、抗腫瘍免疫応答がこれらのマウスにおいて確立されたことを示唆している。まとめると、データは、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１またはｓｃＦｖＦｃ ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞が、市販の抗体での処置より優れているように見える抗がん活性をもたらすことができることを示す。
【0256】
Ｔｕ－２４４９ＳＣ腫瘍モデルをＢ６Ｃ３Ｆ１マウスにおいて試験して、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１が抗腫瘍活性を発揮するために必要な最小形質導入レベルを決定した。図８Ｃは、Ｔｕ－２４４９ＳＣ腫瘍モデルにおいて、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１を発現する２％程度の少ないＴｕ－２４４９ＳＣ細胞を有する担腫瘍マウスが、抗ＰＤ－１抗体処置と同等である腫瘍進行の遅延をもたらしたことを示し、対照マウスと比較して有利である方向の強い傾向を示す（図８Ｃ）。３０％事前形質導入細胞を用いて、１００％事前形質導入細胞を用いた担腫瘍マウスでも見られるように、腫瘍進行が完全に阻害された。
【0257】
（実施例３３）
ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１の頭蓋内注射は、同系同所神経膠腫モデルの生存を延長する。ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１抗腫瘍活性を、Ｔｏｃａ ５１１およびＴｏｃａ ＦＣ処置に応答すると以前に報告された同所性同系神経膠腫モデルにおいて研究した。以前に確立された腫瘍内ＲＲＶ送達手法（Ostertag et al., 2012）を利用した。最大限感染させたＴｕ－２４４９細胞においてＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１ウイルス機能およびゲノム安定性をｉｎ ｖｉｔｒｏで確認した。この実験では、２つの異なる用量（１×１０５および１×１０６ＴＵ）のＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１を、腫瘍移植の４日後に単回腫瘍内注射により送達した。データは、１×１０６ＴＵのＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１の単回投与が、対照としておよび比較対照として含めた、ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１で最大限に事前形質導入したＴｕ－２４４９細胞と、同様に有効であることを示す（図９Ａ）。前の実験で行った観察と一致して、原発腫瘍から遠隔部位へのＴｕ－２４４９ＳＣ腫瘍の皮下再チャレンジは、ナイーブマウスと比較して腫瘍成長の有意な遅延につながる全身性抗腫瘍免疫応答を示した（図９Ｂ）。まとめると、これらの知見は、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１が、神経膠腫腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を有すること、および単剤療法としてのチェックポイント阻害剤に応答する第２の神経膠腫マウスモデルを意味することを示す。
ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１の頭蓋内注射は、同系同所神経膠腫モデルの生存を延長する。ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１抗腫瘍活性を、Ｔｏｃａ ５１１およびＴｏｃａ ＦＣ処置に応答すると以前に報告された同所性同系神経膠腫モデルにおいて研究した。以前に確立された腫瘍内ＲＲＶ送達手法（Ostertag et al., 2012）を利用した。最大限感染させたＴｕ－２４４９細胞においてＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１ウイルス機能およびゲノム安定性をｉｎ ｖｉｔｒｏで確認した。この実験では、２つの異なる用量（１×１０５および１×１０６ＴＵ）のＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１を、腫瘍移植の４日後に単回腫瘍内注射により送達した。データは、１×１０６ＴＵのＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１の単回投与が、対照としておよび比較対照として含めた、ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１で最大限に事前形質導入したＴｕ－２４４９細胞と、同様に有効であることを示す（図９Ａ）。前の実験で行った観察と一致して、原発腫瘍から遠隔部位へのＴｕ－２４４９ＳＣ腫瘍の皮下再チャレンジは、ナイーブマウスと比較して腫瘍成長の有意な遅延につながる全身性抗腫瘍免疫応答を示した（図９Ｂ）。まとめると、これらの知見は、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１が、神経膠腫腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を有すること、および単剤療法としてのチェックポイント阻害剤に応答する第２の神経膠腫マウスモデルを意味することを示す。
【0258】
（実施例３４）
ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１にコードされているｓｃＦｖＰＤ－Ｌ１におけるＩＬ－２シグナルペプチドの、システインＳからのシグナルペプチドおよび人工シグナルペプチドＡＰ１での置き換えは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１タンパク質分泌を増加させ、複数のマウス腫瘍モデルにおいてバイスタンダー効果および腫瘍活性を増強する。
ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１にコードされているｓｃＦｖＰＤ－Ｌ１におけるＩＬ－２シグナルペプチドの、システインＳからのシグナルペプチドおよび人工シグナルペプチドＡＰ１での置き換えは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１タンパク質分泌を増加させ、複数のマウス腫瘍モデルにおいてバイスタンダー効果および腫瘍活性を増強する。
【0259】
増強された抗腫瘍有効性をもたらすことができるｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１のバイスタンダー効果をさらに増大させるために、ＩＬ－２シグナルペプチドを、システインＳからのシグナルペプチドで、または高い分泌レベルを有すると予測される人工シグナルペプチド（表ＢからのＡＳＰ１）で置き換えた。ｉｎ ｖｉｔｒｏバイスタンダー実験は、システインＳからのシグナルペプチド（ＲＲＶ－ＣＳｓｃＦｖ－ＰＤＬ１）およびＡＳＰ１（ＲＲＶ－ＡＰ１ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１）を有するエピトープタグ付きｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１を発現する感染細胞が、隣接バイスタンダー細胞上のＰＤ－Ｌ１へのより高度なトランス結合活性を示すことを明示する。バイスタンダー細胞の細胞表面ＰＤ－Ｌ１の全てを飽和させるために、５～１０％のＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１細胞が必要とされるが、バイスタンダー細胞上の完全ＰＤ－Ｌ１受容体占有を達成するために、わずか２～４％のＲＲＶ－ＣＳｓｃＦｖ－ＰＤＬ１感染またはＲＲＶ－ＡＰ１ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１感染細胞しか必要とされない。
【0260】
２％事前形質導入腫瘍を用いるＴｕ２４４９ＳＣ腫瘍モデルを使用して、ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤ－Ｌ１、ＲＲＶ－ＣＳｓｃＦｖ－ＰＤ－Ｌ１およびＲＲＶ－ＡＰ１ｓｃＦｖ－ＰＤ－Ｌ１に感染させた腫瘍間の抗腫瘍活性を比較した。２％形質導入レベルは、ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤ－Ｌ１に感染させた３０％事前形質導入腫瘍よりも有効性が低いことが以前に示されているので、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＲＶ－ＣＳｓｃＦｖ－ＰＤ－Ｌ１およびＲＲＶ－ＡＰ１ｓｃＦｖ－ＰＤ－Ｌ１で観察されるより大きいバイスタンダー効果が、２％事前形質導入設定でのより大きい抗腫瘍活性を示すことになると予想する。本発明者らのデータは、ＲＲＶ－ＣＳｓｃＦｖ－ＰＤ－Ｌ１およびＲＲＶ－ＡＰ１ｓｃＦｖ－ＰＤ－Ｌ１感染腫瘍から産生されるｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１の抗腫瘍効果が、ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１から産生されるｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１よりも有意に高いことを明示する。本発明者らのデータは、シグナルペプチドの選択が、増強された抗腫瘍活性をもたらすタンパク質分泌のレベルをモジュレートすることもできるという表記を支持する。
【0261】
（実施例３５）
足場タンパク質に由来する抗原特異的結合剤（ＡＳＢ）のＮ末端への強力なシグナルペプチドの組み入れもＲＲＶにより発現され得る。
足場タンパク質に由来する抗原特異的結合剤（ＡＳＢ）のＮ末端への強力なシグナルペプチドの組み入れもＲＲＶにより発現され得る。
【0262】
ＲＲＶ－ＡＳＢ－ＰＤＬ１プラスミドＤＮＡの構築。ＰＤ－Ｌ１に対するＡＳＢの１対の同じ構成を設計する。一方は、ＡＳＢからなり、もう一方は、Ｃ末端に組み入れられたＨＡおよびＦｌａｇエピトープを有するＡＳＢからなり、ＡＳＢ－ＨＦ－ＰＤＬ１およびＡＳＢ－ＨＦ－ＰＤＬ１と名付けた。各構成のコード配列は、ウイルスエンベロープ遺伝子の３’コード配列、続いてｇＴ２Ａペプチド配列を含有し、各構成のコード配列を、結果としてｐＡＣ３－ＡＳＢ－ＰＤＬ１およびｐＡＣ３－ＡＳＢ－ＨＦ－ＰＤＬ１が得られるｇ２Ａ－ｙＣＤ２導入遺伝子カセットを置き換えるための対応する部位のｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－ｙＣＤ２へのサブクローニングのためにＡｓｃ ＩおよびＮｏｔ Ｉ制限部位を用いて合成する。全てのＡＳＢ－ＰＤＬ１バリアントについて、ＡＳＢ ＰＤ－Ｌ１またはＡＳＢ－ＨＦ ＰＤ－Ｌ１の分泌を可能にするためにヒトＩＬ－２からのシグナルペプチドをＮ末端に組み入れる。
【0263】
バイスタンダー細胞の全ての細胞表面ＰＤ－Ｌ１を飽和させるために５％ ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１感染細胞または５％ ＲＲＶ－ＡＢＳ－ＰｄＬ１感染細胞が必要とされる、ｉｎ ｖｉｔｒｏバイスタンダー実験は、エピトープタグ付きＡＳＢ ＰＤ－Ｌ１を発現する感染細胞が、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１と同等の、隣接バイスタンダー細胞上のＰＤ－Ｌ１へのトランス結合活性を示すことを示す。
【0264】
その後、ＡＳＢ ＰＤ－Ｌ１の抗腫瘍活性の用量応答を、同系Ｔｕ２４４９ＳＣ皮下モデルにおいて、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１と並行して評価する。ｉｎ ｖｉｖｏデータは、ＡＳＢ ＰＤ－Ｌ１が抗腫瘍活性を有することを示す。ＡＳＢ ＰＤ－Ｌ１を発現する２％程度の少ないＴｕ－２４４９ＳＣ細胞を有する担腫瘍マウスは、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１または抗ＰＤ－１抗体処置を発現する２％ Ｔｕ－２４４９ＳＣ細胞と同等の、しかし対照マウスと比較して統計的に有意でない、腫瘍進行の遅延をもたらす。３０％事前形質導入細胞を用いて、１００％事前形質導入細胞を用いた担腫瘍マウスでも見られるように、腫瘍進行が完全に阻害される。
【0265】
（実施例３６）
ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１－ｙＣＤ２の頭蓋内注射は、同系同所神経膠腫モデルの生存を延長する。ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１抗腫瘍活性を同所性同系神経膠腫モデルにおいてｙＣＤ２および５－ＦＣと組み合わせて研究して、それらの相乗効果を評価する。ヒトＩＬ－２シグナルペプチド、ｇＰ２Ａ－ｙＣＤ２に連結されているｓｃＦｖ－ＰＤＬ１からなるカセットを用いて、二重ベクターを設計する。この断片を合成し、ＲＲＶ－ｇＴ２Ａ骨格のＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ部位にクローニングする。結果として得られるベクターをｐＡＣ３－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１－ｙＣＤ２と名付ける。ｉｎ ｖｉｔｒｏ特徴付けデータは、ｓｃＦｖ ＰＤＬ１およびｙＣＤ２タンパク質が、ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１－ｙＣＤ２感染細胞から発現され、それらの生体機能を保持する（すなわち、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１がＰＤ－Ｌ１に結合し、ｙＣＤ２が５－ＦＣを５－ＦＵに変換する）ことを示す。精製ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１およびＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１－ｙＣＤ２ベクターをｉｎ ｖｉｖｏ研究のために産生する。この実験では、単剤療法として準最適な抗腫瘍活性を示すＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１の１×１０５ＴＵ（図９Ａ）およびＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１－ｙＣＤ２の１×１０５ＴＵの用量を、腫瘍移植の４日後に単回腫瘍内注射により送達する。ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１のウイルス拡散および抗腫瘍活性を可能にするために１０日後に、マウスをＰＢＳまたは５－ＦＣ（５００ｍｇ／ｋｇ）のどちらかで１日１回、７日間オンおよび７日間オフでＩＰ処置する。本発明者らのデータは、５－ＦＣで処置する１×１０５ＴＵのＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ－ｙＣＤ２の単回投与が、ＰＢＳで処置するＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１およびＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ－ｙＣＤ２よりも優れていることを示す。前の実験で行った観察と一致して、原発腫瘍から遠隔部位へのＴｕ－２４４９ＳＣ腫瘍の皮下再チャレンジは、ナイーブマウスと比較して腫瘍成長の有意な遅延につながる全身性抗腫瘍免疫応答を示す。再チャレンジした一部のマウスは、最大９０日間、無腫瘍である。これらのデータは、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１とｙＣＤ２／５ＦＣの併用療法が、神経膠腫腫瘍モデルにおいてｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１単剤療法よりも優れた抗腫瘍活性を有することを示す。
ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１－ｙＣＤ２の頭蓋内注射は、同系同所神経膠腫モデルの生存を延長する。ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１抗腫瘍活性を同所性同系神経膠腫モデルにおいてｙＣＤ２および５－ＦＣと組み合わせて研究して、それらの相乗効果を評価する。ヒトＩＬ－２シグナルペプチド、ｇＰ２Ａ－ｙＣＤ２に連結されているｓｃＦｖ－ＰＤＬ１からなるカセットを用いて、二重ベクターを設計する。この断片を合成し、ＲＲＶ－ｇＴ２Ａ骨格のＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ部位にクローニングする。結果として得られるベクターをｐＡＣ３－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１－ｙＣＤ２と名付ける。ｉｎ ｖｉｔｒｏ特徴付けデータは、ｓｃＦｖ ＰＤＬ１およびｙＣＤ２タンパク質が、ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１－ｙＣＤ２感染細胞から発現され、それらの生体機能を保持する（すなわち、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１がＰＤ－Ｌ１に結合し、ｙＣＤ２が５－ＦＣを５－ＦＵに変換する）ことを示す。精製ＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１およびＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１－ｙＣＤ２ベクターをｉｎ ｖｉｖｏ研究のために産生する。この実験では、単剤療法として準最適な抗腫瘍活性を示すＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１の１×１０５ＴＵ（図９Ａ）およびＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１－ｙＣＤ２の１×１０５ＴＵの用量を、腫瘍移植の４日後に単回腫瘍内注射により送達する。ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１のウイルス拡散および抗腫瘍活性を可能にするために１０日後に、マウスをＰＢＳまたは５－ＦＣ（５００ｍｇ／ｋｇ）のどちらかで１日１回、７日間オンおよび７日間オフでＩＰ処置する。本発明者らのデータは、５－ＦＣで処置する１×１０５ＴＵのＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ－ｙＣＤ２の単回投与が、ＰＢＳで処置するＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ１およびＲＲＶ－ｓｃＦｖ－ＰＤＬ－ｙＣＤ２よりも優れていることを示す。前の実験で行った観察と一致して、原発腫瘍から遠隔部位へのＴｕ－２４４９ＳＣ腫瘍の皮下再チャレンジは、ナイーブマウスと比較して腫瘍成長の有意な遅延につながる全身性抗腫瘍免疫応答を示す。再チャレンジした一部のマウスは、最大９０日間、無腫瘍である。これらのデータは、ｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１とｙＣＤ２／５ＦＣの併用療法が、神経膠腫腫瘍モデルにおいてｓｃＦｖ ＰＤ－Ｌ１単剤療法よりも優れた抗腫瘍活性を有することを示す。
【0266】
（実施例３７）
２９３Ｔ細胞から産生されるＲＲＶ－ｇ Ｔ２Ａ－アフィマー－ＳＱＴは、感染性であり、分泌可能な形態のアフィマー－ＳＱＴタンパク質を発現する。
２９３Ｔ細胞から産生されるＲＲＶ－ｇ Ｔ２Ａ－アフィマー－ＳＱＴは、感染性であり、分泌可能な形態のアフィマー－ＳＱＴタンパク質を発現する。
【0267】
アフィマーのＳＱＴバリアントのコード領域は、Stadler et al.（Protein Engineering, Design and Selection, 24(9) 751-763, 2011）から得た。アフィマー－ＳＱＴタンパク質発現の検出のために、ＨＡ、ＡＵ１およびＭｙｃエピトープを、アフィマー－ＳＱＴのＮ末端（シグナルペプチドに先行する）、Ｌ１およびＬ２にそれぞれ挿入した。ヒトＩＬ－２に由来するシグナルペプチドを、アフィマー－ＳＱＴコード領域のＮ末端に配置した。ＤＮＡ断片を合成し、ＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格内のＡｓｃＩおよびＮｏｔ Ｉ部位にクローニングした。結果として得られた構築物をｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アフィマー－ＳＱＴと名付ける。
【0268】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクション前日に１０ｃｍプレート１枚当たり２×１０６細胞で播種した。翌日、２０μｇのプラスミドＤＮＡを使用してリン酸カルシウムトランスフェクションを行った。トランスフェクションの１８時間後、細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、完全培養培地で置き換えた。ウイルス上清を培地置き換えのおよそ２４時間後に回収し、０．４５μｍシリンジフィルターに通して濾過した。ＲＲＶ－ｇ Ｔ２Ａ－アフィマー－ＳＱＴのウイルス力価を、以前に記載された（Perez et al., 2012）ように決定した。表Ｋは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生されたＲＲＶ－ｇ Ｔ２Ａ－アフィマー－ＳＱＴの力価が、ＲＲＶ－ＧＦＰの力価と同等であったことを示す。
【0269】
ｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アフィマー－ＳＱＴにコードされているアフィマー－ＳＱＴタンパク質は、上清に分泌されるように設計する。上清中に存在する不確定のアフィマー－ＳＱＴタンパク質量のため、上清中のアフィマー－ＳＱＴタンパク質の検出は、抗ＨＡ抗体（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｈ６９０８、１：１０００）を使用する１５μｌの上清の直接免疫ブロット法、または１ｍＬの上清を１０μｇの抗ｍｙｃ抗体（Ａｂcam カタログ番号ａｂ２０６４８６）と１６ １８時間、４℃でインキュベートすることによる免疫沈降、続いて抗ＨＡ抗体およびＨＰＲコンジュゲート二次抗体での免疫ブロット法の両方により行った。図１０は、約１５ｋＤａの予想分子量を有するアフィマーＳＱＴが、上清中に豊富に発現されることを示す。
【0270】
【表K】
【0271】
（実施例３８）
２９３Ｔ細胞から産生されるＲＲＶ－ｇＴ２Ａ－ＨｃｋおよびＲＲＶ－ＩＲＥＳ－Ｈｃｋは、感染性であり、Ｈｃｋタンパク質を発現する。
２９３Ｔ細胞から産生されるＲＲＶ－ｇＴ２Ａ－ＨｃｋおよびＲＲＶ－ＩＲＥＳ－Ｈｃｋは、感染性であり、Ｈｃｋタンパク質を発現する。
【0272】
Ｈｃｋのコード領域は、特許ＷＯ２０１７００９５３３Ａ１から得た。Ｈｃｋタンパク質発現を検出するために、ＦｌａｇおよびＨｉｓエピトープタグをＨｃｋのＣ末端に挿入し、ヒトＩＬ－２に由来するシグナルペプチドをＨｃｋコード領域のＮ末端に配置した。ＡｓｃＩおよびＮｏｔ Ｉ部位を有するＤＮＡ断片を合成し、ＲＲＶ－ｇＴ２Ａ骨格のＡｓｃＩおよびＮｏｔ Ｉ部位にクローニングし、ＰｓｉＩおよびＮｏｔ Ｉ部位を有するＤＮＡ断片を合成し、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ骨格のＰｓｉＩおよびＮｏｔ Ｉ部位にクローニングし、結果として構築物を得、それらをｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－ＨｃｋおよびｐＡＣ３－ＩＲＥＳ－Ｈｃｋとそれぞれ名付けた。
【0273】
ＲＲＶウイルス上清およびＨｃｋタンパク質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞から記載の通りに産生した。表Ｌは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生されたＲＲＶ－ｇＴ２Ａ－Ｈｃｋの力価が、ＲＲＶ－ＧＦＰの力価と同等であったことを示す。
【0274】
【表L】
【0275】
ｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－ＨｃｋにコードされているＨｃｋタンパク質は、上清に分泌されるように設計する。上清中のＨｃｋタンパク質の検出は、抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｆ１８０４、１：１０００）およびＨＰＲコンジュゲート二次抗体を使用して１５μＬの上清の直接免疫ブロット法により行った。図１１は、約７ｋＤａの予想分子量を有するＨｃｋタンパク質が、上清中に豊富に発現されることを示す。
【0276】
（実施例３９）
２９３Ｔ細胞から産生されるＲＲＶ－ｇＴ２Ａ－アンチカリンは、感染性であり、アンチカリンタンパク質を発現する。
２９３Ｔ細胞から産生されるＲＲＶ－ｇＴ２Ａ－アンチカリンは、感染性であり、アンチカリンタンパク質を発現する。
【0277】
アンチカリン－Ｌｃｎ２のコード領域は、Gebauer et al., 2013 (JMB 425(4) 780-802)から得る。アンチカリン－Ｌｃｎ２タンパク質発現を検出するために、ＦｌａｇおよびＨｉｓエピトープタグをアンチカリン－Ｌｃｎ２のＣ末端に挿入し、ヒトＩＬ－２に由来するシグナルペプチドをアンチカリン－Ｌｃｎ２コード領域のＮ末端に配置する。ＤＮＡ断片を合成し、ＲＲＶ－ｇＴ２Ａ骨格内のＡｓｃＩおよびＮｏｔ Ｉ部位にクローニングする。結果として得られた構築物をｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アンチカリン－Ｌｃｎ２と名付ける。
【0278】
ｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アンチカリン－Ｌｃｎ２にコードされているアンチカリン－Ｌｃｎ２タンパク質は、上清に分泌されるように設計する。上清中のアンチカリン－Ｌｃｎ２タンパク質の検出は、抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｆ１８０４、１：１０００）およびＨＰＲコンジュゲート二次抗体を使用して１５μＬの上清の直接免疫ブロット法により行う。データは、約２０ｋＤａの予想分子量を有するアンチカリン－Ｌｃｎ２タンパク質が、上清中に豊富に発現されることを示す。
【0279】
（実施例４０）
抗原結合に関与する骨格フレームワークアミノ酸残基および表面露出アミノ酸残基、ならびにオリゴマー化ドメインにおけるアミノ酸残基を、Ａｐｏｂｅｃ耐性になるように最適化することができる。
抗原結合に関与する骨格フレームワークアミノ酸残基および表面露出アミノ酸残基、ならびにオリゴマー化ドメインにおけるアミノ酸残基を、Ａｐｏｂｅｃ耐性になるように最適化することができる。
【0280】
足場タンパク質の１つの重要な態様は、足場の全体的完全性および構造を維持することである。ウイルス感染中にナンセンス／停止コドン（核酸ＴＧＡ、ＴＡＡおよびＴＡＧ）をコードする結果となり得るＡｐｏｂｅｃ３媒介変異を回避するために、足場骨格フレームワークに存在する選択的もしくは全てのトリプトファン残基および／または抗原結合に関与する表面露出アミノ酸を、他の１９のアミノ酸で置換して、Ａｐｏｂｅｃ３により媒介されるナンセンス／停止コドン高頻度変異を回避することによる、治療用導入遺伝子コード配列をＡｐｏｂｅｃ３耐性にさせる核酸置換の導入を利用する。
【0281】
Ｌｃｎ２に由来するアンチカリン（Gebauer et al., 2012 J Mol Biol 425(4):780-802）は、一方がベータ鎖Ａ中に存在し、もう一方がベータ鎖Ｄ中に存在する、２つのトリプトファン残基を含有する。加えて、ＥＤ－Ｂ結合剤アンチカリンであるＮ７Ａは、ベータ鎖Ｄおよびループ３／ベータ鎖Ｆ中に３つの追加のトリプトファン残基を含有する。計算アルゴリズム（Parthiban et al., BMC Sturctural Biology 2007 7:54；Bywate, PLoS 2016 11(3):e150769）を利用し、選択されたトリプトファン残基のための１９のアミノ酸のコンビナトリアル変異ライブラリー Yahez et al.（Nucleic Acids Reseasrch 32(20)e158, 2004）を生成して、それらの発現、抗原結合親和性について評価し、試験する。本発明者らのデータは、骨格フレームワークにおよびアンチカリンＮ７Ａの抗原結合ループに存在する構造的完全性に関与するトリプトファン残基を、チロシンおよびフェニルアラニンなどの保存的アミノ酸残基により置き換えることができることを示す。Ａｐｏｂｅｃ耐性Ｎ７Ａバリアントは、ＲＲＶ－ｇＴ２Ａ骨格にコードされている場合、親Ｎ７Ａタンパク質のものと同等のタンパク質発現レベルを示す。最も重要なこととして、２９３Ｆ細胞においてｐｃＤＮＡ３．１ベクターから発現される精製Ａｐｏｂｅｃ耐性Ｎ７Ａタンパク質は、遠ＵＶ円偏光二色性分光測定により分析すると同等の二次構造を示し、ＳＰＲに基づくバイオセンサー分析によりＥＢ－Ｄと同様の結合親和性を示す。
【0282】
足場フレームワークにおけるトリプトファンのチロシンまたはフェニルアラニンでの置き換えの許容性は、ｓｒｃ－ループに隣接して存在する２つの連続するトリプトファン残基を、その発現を損なわせることなく、２つのフェニルアラニン（ＦＦ）、２つのチロシン（ＹＹ）、チロシン－フェニルアラニン（ＹＦ）またはフェニルアラニン－チロシン（ＦＹ）で置き換えることができる、Ｈｃｋタンパク質においても実証される。加えて、本発明者らは、Ｉ型脱ヨード酵素二量体化モチーフにおけるトリプトファン残基を、その二量体化機能を損なわせることなく、フェニルアラニンおよびチロシンで置換することができることも示す。
【0283】
（実施例４１）
エピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴを、ヒトＩｇＧのＦｃ領域を使用してＲＲＶ－ｇＴ２Ａ骨格からホモ二量体形態で発現させることができる。
エピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴを、ヒトＩｇＧのＦｃ領域を使用してＲＲＶ－ｇＴ２Ａ骨格からホモ二量体形態で発現させることができる。
【0284】
アフィマー－ＳＱＴのホモ二量体を発現させるために、Ｎ末端へのヒトＩＬ－２シグナルペプチドの組み入れに加えて、アフィマー－ＳＱＴのコード配列を、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域が後に続く（Ｇ４Ｓ）３グリシン－セリンリンカーと連結させる。このタイプの非ＩＧ結合タンパク質をコードするベクターの設計を、多量体の形成を可能にするまたは二重特異性抗体もしくは抗体様二重もしくは三重特異性分子を形成するための多重結合特異性を可能にする結合タンパク質をコードする遺伝子を含む他のタイプの改変とともに、図１２に示す。合成断片を、ＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格内のＡｓｃＩおよびＮｏｔ Ｉ部位にクローニングする。結果として得られる１つの構築物を、ｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アフィマー－ＳＱＴ－Ｆｃと名付ける。データは、非還元条件下で、約５０ｋＤａの予想分子サイズで、抗ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ抗体を使用して二量体形態のアフィマー－ＳＱＴが検出されることを示す。
【0285】
（実施例４２）
二量体化ドメインを使用してエピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴをホモ二量体形態で発現させることができる。
二量体化ドメインを使用してエピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴをホモ二量体形態で発現させることができる。
【0286】
アフィマー－ＳＱＴのホモ二量体を発現させるために、アフィマー－ＳＱＴのＮ末端へのヒトＩＬ－２シグナルペプチドの組み入れおよびアフィマー－ＳＱＴのＣ末端へのエピトープタグの組み入れに加えて、Ｎ末端とＣ末端両方にＧＧＧＧグリシンリンカーで連結されているＩ型脱ヨード酵素の二量体化ドメイン（表６）を、アフィマー－ＳＱＴが後に続くシグナルペプチドの下流に配置する。別の構成では、ヒトＩＬ－２シグナルペプチドおよびエピトープタグをアフィマー－ＳＱＴのＮ末端に配置し、Ｎ末端とＣ末端両方にＧＧＧＧグリシンリンカーで連結されている二量体化ドメインを、アフィマー－ＳＱＴのＣ末端に配置する。合成断片を、ＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格内のＡｓｃＩおよびＮｏｔ Ｉ部位にクローニングする。結果として得られる構築物を、ｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－２アフィマー－ＳＱＴおよびｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アフィマー－ＳＱＴ２とそれぞれ名付ける。
【0287】
タンパク質発現データは、非還元条件下で、２アフィマーＳＱＴおよびアフィマーＳＱＴ２タンパク質の８５％より多くが、約３２ｋＤａの予想分子サイズを有する二量体形態で検出されることを示す。
【0288】
（実施例４３）
三量体化ドメインを使用してエピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴをホモ三量体形態で発現させることができる。
三量体化ドメインを使用してエピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴをホモ三量体形態で発現させることができる。
【0289】
アフィマー－ＳＱＴのホモ三量体を発現させるために、アフィマー－ＳＱＴのＮ末端へのヒトＩＬ－２シグナルペプチドの組み入れおよびアフィマー－ＳＱＴのＣ末端へのエピトープタグの組み入れに加えて、Ｎ末端とＣ末端両方にＧＧＧＧグリシンリンカーを含むコロニン１ａの三量体化ドメイン（表６）を、アフィマー－ＳＱＴが後に続くシグナルペプチドの下流に配置する。別の構成では、ヒトＩＬ－２シグナルペプチドおよびエピトープタグをアフィマー－ＳＱＴのＮ末端に配置し、Ｎ末端とＣ末端両方にＧＧＧＧグリシンリンカーで連結されている三量体化ドメインを、アフィマー－ＳＱＴのＣ末端に配置する。合成断片を、ＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格内のＡｓｃＩおよびＮｏｔ Ｉ部位にクローニングする。結果として得られる構築物を、ｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－３アフィマー－ＳＱＴおよびｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アフィマー－ＳＱＴ３とそれぞれ名付ける。
【0290】
タンパク質発現データは、非還元条件下で、３アフィマーＳＱＴおよびアフィマーＳＱＴ３タンパク質の８５％より多くが、約５６ｋＤａの予想分子サイズを有する三量体形態で検出されることを示す。
【0291】
（実施例４４）
四量体ドメインを使用してエピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴをホモ四量体形態で発現させることができる。
四量体ドメインを使用してエピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴをホモ四量体形態で発現させることができる。
【0292】
アフィマー－ＳＱＴのホモ四量体を発現させるために、アフィマー－ＳＱＴのＮ末端へのヒトＩＬ－２シグナルペプチドの組み入れおよびアフィマー－ＳＱＴのＣ末端へのエピトープタグの組み入れに加えて、Ｎ末端とＣ末端両方にＧＧＧＧグリシンリンカーで連結されている軟骨マトリクスタンパク質（ＣＭＰ）ＣＭＰ（Ｒ２７Ｑ）四量体ドメイン（表６）を、アフィマー－ＳＱＴが後に続くシグナルペプチドの下流に配置する。別の構成では、ヒトＩＬ－２シグナルペプチドおよびエピトープタグをアフィマー－ＳＱＴのＮ末端に配置し、Ｎ末端とＣ末端両方にＧＧＧＧグリシンリンカーで連結されている四量体化ドメインを、アフィマー－ＳＱＴのＣ末端に配置する。合成断片を、ＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格内のＡｓｃＩおよびＮｏｔ Ｉ部位にクローニングする。結果として得られる構築物を、ｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－４アフィマー－ＳＱＴおよびｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アフィマー－ＳＱＴ４とそれぞれ名付ける。
【0293】
タンパク質発現データは、非還元条件下で、４アフィマーＳＱＴおよびアフィマーＳＱＴ４タンパク質の８５％より多くが、約５６ｋＤａの予想分子サイズを有する四量体形態で検出されることを示す。
【0294】
（実施例４５）
五量体化ドメインを使用してエピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴをホモ五量体形態で発現させることができる。
五量体化ドメインを使用してエピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴをホモ五量体形態で発現させることができる。
【0295】
アフィマー－ＳＱＴのホモ五量体を発現させるために、アフィマー－ＳＱＴのＮ末端へのヒトＩＬ－２シグナルペプチドの組み入れおよびアフィマー－ＳＱＴのＣ末端へのエピトープタグの組み入れに加えて、Ｎ末端とＣ末端両方にＧＧＧＧグリシンリンカーで連結されている軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質（ＣＯＭ Ｐ）五量体ドメイン（表６）を、アフィマー－ＳＱＴが後に続くシグナルペプチドの下流に配置する。別の構成では、ヒトＩＬ－２シグナルペプチドおよびエピトープタグをアフィマー－ＳＱＴのＮ末端に配置し、Ｎ末端とＣ末端両方にＧＧＧＧグリシンリンカーで連結されている五量体化ドメインを、アフィマー－ＳＱＴのＣ末端に配置する。合成断片を、ＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格内のＡｓｃＩおよびＮｏｔ Ｉ部位にクローニングする。結果として得られる構築物を、ｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－５アフィマー－ＳＱＴおよびｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アフィマー－ＳＱＴ５とそれぞれ名付ける。
【0296】
タンパク質発現データは、非還元条件下で、５アフィマーＳＱＴおよびアフィマーＳＱＴ５タンパク質の８５％より多くが、約１００ｋＤａの予想分子サイズを有する四量体形態で検出されることを示す。
【0297】
（実施例４６）
ＩｇＭに由来する六量体化ドメインを使用してエピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴをホモ六量体形態で発現させることができる。
ＩｇＭに由来する六量体化ドメインを使用してエピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴをホモ六量体形態で発現させることができる。
【0298】
アフィマー－ＳＱＴのホモ六量体を発現させるために、アフィマー－ＳＱＴのＮ末端へのヒトＩＬ－２シグナルペプチドの組み入れおよびアフィマー－ＳＱＴのＣ末端へのエピトープタグの組み入れに加えて、Ｎ末端とＣ末端両方にＧＧＧＧグリシンリンカーで連結されているヒトＩｇＭ Ｃμ４ｔｐ六量体化ドメイン（表４）を、アフィマー－ＳＱＴが後に続くシグナルペプチドの下流に配置する。別の構成では、ヒトＩＬ－２シグナルペプチドおよびエピトープタグをアフィマー－ＳＱＴのＮ末端に配置し、Ｎ末端とＣ末端両方にＧＧＧＧグリシンリンカーで連結されている六量体化ドメインを、アフィマー－ＳＱＴのＣ末端に配置する。合成断片を、ＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格内のＡｓｃＩおよびＮｏｔ Ｉ部位にクローニングする。結果として得られる構築物を、ｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－６アフィマー－ＳＱＴおよびｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アフィマー－ＳＱＴ６とそれぞれ名付ける。
【0299】
タンパク質発現データは、非還元条件下で、６アフィマーＳＱＴおよびアフィマーＳＱＴ６タンパク質の９５％より多くが、約１７５ｋＤａの予想分子サイズを有する四量体形態で検出されることを示す。
【0300】
（実施例４７）
（Ｇ４Ｓ）３グリシン－セリンリンカーを使用してＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格においてエピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴおよびＨｃｋをヘテロ二量体形態で発現させることができる。
（Ｇ４Ｓ）３グリシン－セリンリンカーを使用してＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格においてエピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴおよびＨｃｋをヘテロ二量体形態で発現させることができる。
【0301】
アフィマー－ＳＱＴおよびＨｃｋのヘテロ二量体を発現させるために、アフィマー－ＳＱＴおよびＨｃｋのコード配列を、「融合」タンパク質のＮ末端にヒトＩＬ－２シグナルペプチドが、Ｃ末端にエピトープタグが組み入れられている２つの可能な構成（アフィマー－ＳＱＴ－ｇ－ＨｃｋおよびＨｃｋ－ｇ－アフィマー－ＳＱＴ）で、（ＧＧＧＧＳ）３グリシン－リシンリンカーで連結させる。合成断片を、ＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格内のＡｓｃＩおよびＮｏｔ Ｉ部位にクローニングする。結果として得られる構築物を、ｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アフィマー－ＳＱＴ－ｇ－ＨｃｋおよびｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－Ｈｃｋ－ｇ－アフィマー－ＳＱＴとそれぞれ名付ける。
【0302】
タンパク質発現データは、約２３ｋＤａの予想分子サイズを有するアフィマー－ＳＱＴ－ｇ－ＨｃｋおよびＨｃｋ－ｇ－アフィマー－ＳＱＴのヘテロ二量体形態が検出されることを示す。
【0303】
（実施例４８）
（Ｇ４Ｓ）３グリシン－セリンリンカーを使用してＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格においてエピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴおよびアンチカリンをヘテロ二量体形態で発現させることができる。
（Ｇ４Ｓ）３グリシン－セリンリンカーを使用してＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格においてエピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴおよびアンチカリンをヘテロ二量体形態で発現させることができる。
【0304】
アフィマー－ＳＱＴおよびアンチカリンのヘテロ二量体を発現させるために、アフィマー－ＳＱＴおよびアンチカリンのコード配列を、「融合」タンパク質のＮ末端にヒトＩＬ－２シグナルペプチドが、Ｃ末端にエピトープタグが組み入れられている２つの可能な構成（アフィマー－ＳＱＴ－ｇ－アンチカリンおよびアンチカリン－ｇ－アフィマー－ＳＱＴ）で、（ＧＧＧＧＳ）３グリシン－リシンリンカーで連結させる。合成断片を、ＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格内のＡｓｃＩおよびＮｏｔ Ｉ部位にクローニングする。結果として得られる構築物を、ｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アフィマー－ＳＱＴ－ｇ－アンチカリンおよびｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アンチカリン－ｇ－アフィマー－ＳＱＴとそれぞれ名付ける。
【0305】
タンパク質発現データは、約３６ｋＤａの予想分子サイズを有するアフィマー－ＳＱＴ－ｇ－アンチカリンおよびアンチカリン－ｇ－アフィマー－ＳＱＴのヘテロ二量体形態が検出されることを示す。
【0306】
（実施例４９）
（Ｇ４Ｓ）３グリシン－セリンリンカーを使用してＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格においてエピトープタグ付きアンチカリンおよびＨｃｋをヘテロ二量体形態で発現させることができる。
（Ｇ４Ｓ）３グリシン－セリンリンカーを使用してＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格においてエピトープタグ付きアンチカリンおよびＨｃｋをヘテロ二量体形態で発現させることができる。
【0307】
Ｈｃｋおよびアンチカリンのヘテロ二量体を発現させるために、Ｈｃｋおよびアンチカリンのコード配列を、「融合」タンパク質のＮ末端にヒトＩＬ－２シグナルペプチドが、Ｃ末端にエピトープタグが組み入れられている２つの可能な構成（Ｈｃｋ－ｇ－アンチカリンおよびアンチカリン－ｇ－Ｈｃｋ）で、（ＧＧＧＧＳ）３グリシン－セリンリンカーで連結させる。合成断片を、ＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格内のＡｓｃＩおよびＮｏｔ Ｉ部位にクローニングする。結果として得られる構築物を、ｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－Ｈｃｋ－ｇ－アンチカリンおよびｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アンチカリン－ｇ－Ｈｃｋとそれぞれ名付ける。
【0308】
タンパク質発現データは、約２８ｋＤａの予想分子サイズを有するＨｃｋ－ｇ－アンチカリンおよびアンチカリン－ｇ－Ｈｃｋのヘテロ二量体形態が検出されることを示す。
【0309】
（実施例５０）
（Ｇ４Ｓ）３グリシン－セリンリンカーを使用してＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格においてエピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴ、Ｈｃｋおよびアンチカリンをヘテロ三量体形態で発現させることができる。
（Ｇ４Ｓ）３グリシン－セリンリンカーを使用してＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格においてエピトープタグ付きアフィマー－ＳＱＴ、Ｈｃｋおよびアンチカリンをヘテロ三量体形態で発現させることができる。
【0310】
アフィマー－ＳＱＴ、Ｈｃｋおよびアンチカリンのヘテロ三量体を発現させるために、アフィマー－ＳＱＴ、Ｈｃｋおよびアンチカリンのコード配列を（ＧＧＧＧＳ）３グリシン－リシンリンカーで連結させ、「融合」タンパク質のＮ末端にヒトＩＬ－２シグナルペプチドを、Ｃ末端にエピトープタグを組み入れる。６つの可能な組合せがある断片（Ｈｃｋ－ｇ－アフィマー－ＳＱＴ－ｇ－アンチカリン、Ｈｃｋ－ｇ－アンチカリン－ｇ－アフィマー－ＳＱＴ、アフィマー－ＳＱＴ－ｇ－Ｈｃｋ－ｇ－アンチカリン、アフィマー－ＳＱＴ－ｇ－アンチカリン－ｇ－Ｈｃｋ、アンチカリン－ｇ－Ｈｃｋ－ｇ－アフィマー－ＳＱＴ、およびアンチカリン－ｇ－アフィマー－ＳＱＴ－ｇ－Ｈｃｋ）を合成し、ＲＲＶ ｇＴ２Ａ骨格のＡｓｃＩおよびＮｏｔ Ｉ部位にクローニングする。結果として得られた構築物を、ｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－Ｈｃｋ－ｇ－アフィマー－ＳＱＴ－ｇ－アンチカリンおよびｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－Ｈｃｋ－ｇ－アンチカリン－ｇ－アフィマー－ＳＱＴ、ｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アフィマー－ＳＱＴ－ｇ－Ｈｃｋ－ｇ－アンチカリン、ｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アフィマー－ＳＱＴ－ｇ－アンチカリン－ｇ－Ｈｃｋ、ｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アンチカリン－ｇ－Ｈｃｋ－ｇ－アフィマー－ＳＱＴ、およびｐＡＣ３－ｇＴ２Ａ－アンチカリン－ｇ－アフィマー－ＳＱＴ－ｇ－Ｈｃｋと、それぞれ名付ける。
【0311】
タンパク質発現データは、約４３ｋＤａの予想分子サイズを有する、Ｈｃｋ－ｇ－アフィマー－ＳＱＴ－ｇ－アンチカリン、Ｈｃｋ－ｇ－アンチカリン－ｇ－アフィマー－ＳＱＴ、アフィマー－ＳＱＴ－ｇ－Ｈｃｋ－ｇ－アンチカリン、アフィマー－ＳＱＴ－ｇ－アンチカリン－ｇ－Ｈｃｋ、アンチカリン－ｇ－Ｈｃｋ－ｇ－アフィマー－ＳＱＴおよびアンチカリン－ｇ－アフィマー－ＳＱＴ－ｇ－Ｈｃｋからのヘテロ三量体が検出されることを示す。
【0312】
（実施例５１）
２９３Ｔ細胞から産生されるＲＲＶ－Ｓ１－アンチカリンは、感染性であり、コアプロモーターにより媒介されてアンチカリンタンパク質を発現する。
２９３Ｔ細胞から産生されるＲＲＶ－Ｓ１－アンチカリンは、感染性であり、コアプロモーターにより媒介されてアンチカリンタンパク質を発現する。
【0313】
アンチカリン－Ｌｃｎ２のコード領域は、Gebauer et al., 2013 (JMB 425(4) 780-802)から得る。アンチカリン－Ｌｃｎ２タンパク質発現を検出するために、ＦｌａｇおよびＨｉｓエピトープタグをアンチカリン－Ｌｃｎ２のＣ末端に挿入し、ヒトＩＬ－２に由来するシグナルペプチドをアンチカリン－Ｌｃｎ２コード領域のＮ末端かつコアプロモーターの下流に配置する。これらのコアプロモーターは、これらに限定されないが、アデノウイルス主要後期（ＡｄＭＬ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要最初期遺伝子、ならびに合成「スーパーコアプロモーター」ＳＣＰ１に基づく（その開示が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１５／０２７３０２９Ａ１号も参照されたい）。コアプロモーターＡｄＭＬ－アンチカリン－Ｌｃｎ２、ＣＭＶ－アンチカリン－Ｌｃｎ２およびＳＣＰ１－アンチカリン－Ｌｃｎ２を含有するＤＮＡ断片を合成し、ｐＡＣ３由来ＲＲＶ骨格内にクローニングし、結果として得られた構築物を、ｐＡＣ３－Ａ１－アンチカリン－Ｌｃｎ２、ｐＡＣ３－Ｃ１－アンチカリン－Ｌｃｎ２、およびｐＡＣ３－Ｓ１－アンチカリン－Ｌｃｎ２と、それぞれ名付ける。
【0314】
ｐＡＣ３－Ａ１－アンチカリン－Ｌｃｎ２、ｐＡＣ３－Ｃ１－アンチカリン－Ｌｃｎ２およびｐＡＣ３－Ｓ１－アンチカリン－Ｌｃｎ２にコードされているアンチカリン－Ｌｃｎ２タンパク質は、上清に分泌されるように設計する。上清中のアンチカリン－Ｌｃｎ２タンパク質の検出は、抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｆ１８０４、１：１０００）およびＨＰＲコンジュゲート二次抗体を使用して１５μＬの上清の直接免疫ブロット法により行う。本発明者らのデータは、約２０ｋＤａの予想分子量を有するアンチカリン－Ｌｃｎ２タンパク質が、上清中に豊富に発現されることを示す。
【0315】
（実施例５２）
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２（分泌改変酵母シトシンデアミナーゼ）に感染させたＴｕ２４４９－ＭＧ細胞は、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２のものと比較して５ ＦＵ細胞傷害の遅延、しかしより大きいバイスタンダー効果を示す。
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２（分泌改変酵母シトシンデアミナーゼ）に感染させたＴｕ２４４９－ＭＧ細胞は、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２のものと比較して５ ＦＵ細胞傷害の遅延、しかしより大きいバイスタンダー効果を示す。
【0316】
ｐＡＣ３－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２およびｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２を生成して、分泌ｙＣＤ２（ｓｙＣＤ２）を発現させる。非複製型アデノウイルスベクター内の細菌から前もって分泌されたシトシンデアミナーゼは、非分泌形態の場合、多くのバイスタンダーの死滅が生じる前に５－ＦＵの局所産生により形質導入細胞を死滅させることが危惧されたため、研究されている（Rehemtulla et al. antixcan Res., 23:1393-1400 2004）。Rehemtullaとここに記載の研究には、いくつかの有意な差がある。これらは、以下のことを含む：１）Rehemtullaは、５－ＦＣに対して野生型酵母シトシンと比較して２０分の１の親和性を有する細菌シトシンデアミナーゼ（ｂＣＤ）を研究している（Kievet et al.Can Res.59: 1417-1421 1999)；動物モデルデータは、分泌ｂＣＤと細胞質ｂＣＤの両方において酵母由来のｙＣＤ２と比較して不十分な腫瘍阻害を示す（Rhemtulla et al.; Ostertag et al NeuroOnc 2012）；Rehemtullaにより使用されたベクターは、細胞から細胞へと拡散するＲＲＶコードｙＣＤ２とは異なり非複製性型であった。したがって、細胞死滅およびバイスタンダー効果に対する効果はより複雑であり、RehemtullaのｂＣＤデータからはｙＣＤについて予測できない。
【0317】
ヒトＩＬ－２に由来するＳＳＰが、ｐＡＣ３－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２についてはｙＣＤ２のＮ末端にまたはｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２についてはＧＳＧ－Ｔ２ＡとｙＣＤ２の間にインフレームで配置されるように、ＩＲＥＳ－ｓｃｙＣＤ２およびＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２カセットを設計する。ｐＡＣ３－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２のためのＰｓｉＩおよびＮｏｔ Ｉ部位ならびにｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２のためのＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ部位を有するカセットが化学的に合成され（Ｇｅｎｅｗｉｚ）、これらのカセットをｐＡＣ３にｐＡＣ３－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２およびｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２骨格としてそれぞれクローニングしてｙＣＤ２を置き換える。抗ｙＣＤ２抗体を使用して、トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から収集した細胞溶解物と上清の両方からのｓｙＣＤ２タンパク質の発現を評価する。ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２およびＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２に由来するｙＣＤ２の細胞内発現とは対照的に、結果は、ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２およびＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２にヒトＩＬ ２ ＳＳＰを含めることにより、上清におけるｓｙＣＤ２の確固たる発現および細胞溶解物におけるより少ないもしくは検出不能な発現が検出されることになることを実証する。両方の構築物におけるｓｙＣＤ２の分泌は、免疫ブロットアッセイでの１０μＬの上清の最小投入量により示されるように効率的である。さらに、ｓｙＣＤ２の細胞外形態は、それらの親構築物（ｐＡＣ３－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２およびｐＡＣ３－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２）と比較して同様のサイズである。加えて、一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から回収したＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２ウイルス上清は、０．５～５×１０６ＴＵ／ｍＬの力価値を示し、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２の力価値（１．５×１０６ＴＵ／ｍＬ）およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２の力価値（２×１０６ＴＵ／ｍＬ）とそれぞれ同等である。
【0318】
Ｔｕ２４４９／ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２およびＴｕ２４４９／ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２に最大限感染させたＴｕ２４４９細胞における細胞外５－ＦＵ濃度を、Ｔｕ２４４４９／ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２およびＴｕ２４４９／ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２とそれぞれ比較した。データは、Ｔｕ２４４９／ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２およびＴｕ２４４９／ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２細胞からの上清への５－ＦＣの添加後に存在する５－ＦＵの濃度が、過剰な５－ＦＣとの１時間の反応後、培養培地において細胞成長時間にわたって増加し、初回細胞播種から２～６日目までに最大レベルに達することを示す。Ｔｕ２４４９／ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２およびＴｕ２４４９／ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２の上清に存在する５－ＦＵ濃度は、Ｔｕ２４４９／ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２およびＴｕ２４４９／ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２のものより最大４ｌｏｇ高い。その後、組織培養で、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰおよびＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰに感染させたＲＲＶ形質導入Ｔｕ２４４９細胞のマッチする対を３／９７、１５／８５、および３０／７０の比で生成し、培養物を５－ＦＣで処理することにより、５ ＦＵバイスタンダー効果の有効性を評価した。これらの実験では、ＧＦＰベクター感染細胞がさらに感染するのを阻止し、そのためＣＤコードベクターのさらなるウイルス拡散が起こらない。３／９７および１５／８５設定の比でのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞死滅データは、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２両方が、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２よりも大きいバイスタンダー媒介細胞傷害効果を有することを示す。ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２は、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２での細胞死滅およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２における細胞死滅とそれぞれ比較して、より効率的な細胞死滅を示す。
【0319】
（実施例５３）
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２またはＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２で処置したマウスにおける皮下、同系神経膠腫腫瘍は、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２またはＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２のものとそれぞれ同等の腫瘍成長遅延を示した。感染腫瘍細胞からのｓｙＣＤ２の分泌が、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答を向上させる結果となるかどうかを試験するために、Ｔｕ２４４９細胞を使用してＢ６Ｃ３Ｆ１マウスに同系同所性神経膠腫を確立させる。前に説明したように、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰおよびＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰに感染させたＲＲＶ形質導入Ｔｕ２４４９細胞のマッチする対を、３／９７、１５／８５、および３０／７０の比で生成する。５－ＦＣ処置を施していない動物と比較して用量依存性生存利益が、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰの各サブグループ内で観察される。しかし、９０日の期間にわたって生存データを、３／９７および１５／８５および３０／７０の比率で、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２群とＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２群間、およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２群とＲＲＶ＿ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２群間で比較したとき、データは、両方の場合、ｓｙＣＤ２バリアントで形質導入した担腫瘍マウスが、ｙＣＤ２バージョンで形質導入した担腫瘍マウスよりも有意に高い生存利益を受けることを示す。これは、ｓｙＣＤ感染細胞のより低い比率でより明確に見られる。本発明者のデータは、分泌プロドラッグ活性化酵素の発現が有利であることを示す。これは、以下のことを含むいくつかの要因に起因し得る：ウイルス産生細胞の早期枯渇につながり、ひいてはさらなるウイルス拡散を妨害する、細胞内５－ＦＣの急速な高濃度の回避；および／またはＣＤタンパク質のさらなる拡散、したがって致死濃度の５－ＦＵのさらなる拡散。
ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２またはＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２で処置したマウスにおける皮下、同系神経膠腫腫瘍は、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２またはＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２のものとそれぞれ同等の腫瘍成長遅延を示した。感染腫瘍細胞からのｓｙＣＤ２の分泌が、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答を向上させる結果となるかどうかを試験するために、Ｔｕ２４４９細胞を使用してＢ６Ｃ３Ｆ１マウスに同系同所性神経膠腫を確立させる。前に説明したように、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰおよびＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰに感染させたＲＲＶ形質導入Ｔｕ２４４９細胞のマッチする対を、３／９７、１５／８５、および３０／７０の比で生成する。５－ＦＣ処置を施していない動物と比較して用量依存性生存利益が、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰおよびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２／ＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰの各サブグループ内で観察される。しかし、９０日の期間にわたって生存データを、３／９７および１５／８５および３０／７０の比率で、ＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｙＣＤ２群とＲＲＶ－ＩＲＥＳ－ｓｙＣＤ２群間、およびＲＲＶ－ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｙＣＤ２群とＲＲＶ＿ＧＳＧ－Ｔ２Ａ－ｓｙＣＤ２群間で比較したとき、データは、両方の場合、ｓｙＣＤ２バリアントで形質導入した担腫瘍マウスが、ｙＣＤ２バージョンで形質導入した担腫瘍マウスよりも有意に高い生存利益を受けることを示す。これは、ｓｙＣＤ感染細胞のより低い比率でより明確に見られる。本発明者のデータは、分泌プロドラッグ活性化酵素の発現が有利であることを示す。これは、以下のことを含むいくつかの要因に起因し得る：ウイルス産生細胞の早期枯渇につながり、ひいてはさらなるウイルス拡散を妨害する、細胞内５－ＦＣの急速な高濃度の回避；および／またはＣＤタンパク質のさらなる拡散、したがって致死濃度の５－ＦＵのさらなる拡散。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】