(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-18
(54)【発明の名称】抗体の連続的製造のためのウイルス不活化方法
(51)【国際特許分類】
C12N 7/06 20060101AFI20220111BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220111BHJP
A61K 38/00 20060101ALI20220111BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220111BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20220111BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20220111BHJP
【ＦＩ】
C12N7/06
A61K45/00
A61K38/00
A61K39/395
A61K47/26
A61K47/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021526241
(86)(22)【出願日】2019-11-14
(85)【翻訳文提出日】2021-07-09
(86)【国際出願番号】 US2019061436
(87)【国際公開番号】W WO2020102505
(87)【国際公開日】2020-05-22
(31)【優先権主張番号】62/767,652
(32)【優先日】2018-11-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】507021757
【氏名又は名称】バイエル・ヘルスケア・エルエルシー
【氏名又は名称原語表記】Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ ＬＬＣ
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100202267
【弁理士】
【氏名又は名称】森山 正浩
(74)【代理人】
【識別番号】100182132
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】リー，ジャニス・シウ・メイ
(72)【発明者】
【氏名】リュウ，シェンジアン
(72)【発明者】
【氏名】ゾウ，ジュネ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065BA14
4B065BB06
4B065BB07
4B065BB12
4B065CA44
4C076AA11
4C076DD08F
4C076DD41Z
4C076DD67
4C076EE23F
4C076FF67
4C076GG43
4C084AA06
4C084AA17
4C084NA06
4C084NA07
4C085AA13
4C085BA01
4C085BB01
4C085DD33
4C085EE01
(57)【要約】
本発明は、生物製剤の連続製造におけるウイルス不活化のために使用される方法を含む。この方法はカラムを用いて生物学的ウイルスおよび活性ウイルスで溶出液を分離すること、活性ウイルスでの溶出液を低ｐＨの直交処理および非イオン性界面活性剤に同時に供してウイルスを不活化することを含み、溶出液のウイルス不活化のための時間は、低ｐＨまたは非イオン性界面活性剤を別々に用いた溶出液の処理時間と比較して短縮され、生物学的物質は保持される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）カラムを用いて生物学的物質および活性なウイルスを含む溶出液を分離し、（ｂ）前記活性ウイルスを含む前記溶出液を、低ｐＨおよびＭｅｇａ－１０非イオン性界面活性剤の直交処理に同時に供し、前記ウイルスを不活化する、
生物製剤の連続プロセス製造に使用するためのウイルス不活化方法であって、
ここで、溶出液のウイルス不活化のための時間は、低ｐＨまたはＭｅｇａ－１０非イオン性界面活性剤を使用する溶出液の個別の処理時間と比較して減少しており、前記生物学的物質が保持される、前記ウイルス不活化方法。
【請求項2】
ｐＨが３．０～４．０である、請求項１に記載のウイルス不活化方法。
【請求項3】
前記カラムがアフィニティーカラムを含む、請求項１に記載のウイルス不活化方法。
【請求項4】
前記アフィニティーカラムがプロテインＡカラムを含む、請求項３に記載のウイルス不活化方法。
【請求項5】
生物学的物質がタンパク質を含む、請求項１に記載のウイルス不活化方法。
【請求項6】
生物学的物質が抗体を含む、請求項１に記載のウイルス不活化方法。
【請求項7】
生物学的物質が抗体断片を含む、請求項１に記載のウイルス不活化方法。
【請求項8】
前記溶出液が、１～１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）の生物学的物質を含む、請求項１に記載のウイルス不活化方法。
【請求項9】
ウイルスが、レトロウイルス科、フラウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、ラブドウイルス科、ブニアウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、アレナウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科およびポックスウイルス科からなる群より選択されるファミリーにおけるエンベロープウイルスを含む、請求項１に記載のウイルス不活化方法。
【請求項10】
前記ウイルス不活化時間が６０～１２０分から３～４分に短縮される、請求項１に記載のウイルス不活化方法。
【請求項11】
レトロウイルスがＸ－ＭｕＬＶを含む、請求項９に記載のウイルス不活化方法。
【請求項12】
ヘルペスウイルス科がブタ仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）を含む、請求項９に記載のウイルス不活化方法。
【請求項13】
前記Ｍｅｇａ－１０非イオン性界面活性剤の濃度が、０．０５～１％（ｗ／ｖ）の範囲である、請求項１に記載のウイルス不活化方法。
【請求項14】
２～３０℃で行うことを特徴とする請求項１に記載のウイルス不活化方法。
【請求項15】
溶出液が、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００界面活性剤をさらに含む、請求項１に記載のウイルス不活化方法。
【請求項16】
溶出液のｐＨが４．５である、請求項１５に記載のウイルス不活化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
背景
本実施形態は、生物学的産物、特に抗体ベースの治療産物の連続製造中のウイルス不活化のための方法に関する。
本実施形態は、生物学的産物、特に抗体ベースの治療産物の連続製造中のウイルス不活化のための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
製造業者は規制当局に、それらの製造プロセスが、それらの生物学的治療製品中に存在し得るウイルス汚染物質の除去および／または不活化によって感染性ウイルスを除去する能力を有することを実証することを要求される。低ｐＨ処理による内因性または外因性の外来性エンベロープウイルスのいずれかの不活化は、単純で、低コストで、堅牢であるため、製造プロセスにおいて一般に実施される。低ｐＨウイルス不活化は典型的にはタンパク質アフィニティー捕捉カラムから収集されたプールされた溶出液に対して実施され、低ｐＨ条件はプールされた溶出液に対する弱酸の滴定によって達成される。しかしながら、全ての抗体がこの低ｐＨ条件下で非常に安定であるわけではなく、凝集体を形成するので、処理はより高いｐＨ範囲で行われなければならない。その結果、ウイルスの不活化はあまり強固でなくなり、ウイルス感染性の同じ対数減少を達成するためには、より長い処理時間が必要となる。
【0003】
低ｐＨウイルス不活化以外に、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびウイルス濾過が、抗体の製造におけるウイルス除去工程として一般に使用される。陰イオン交換クロマトグラフィーおよびウイルス濾過の両方が、エンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルスの両方の除去において非常に有効であることが示されている。しかしながら、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびウイルス濾過とは異なり、ウイルスの除去におけるプロテインＡ親和性の有効性は非常に限られている。したがって、検証されたウイルスクリアランス工程としてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを排除し、それをより単純かつより強固なウイルス不活化工程で置き換えることが望ましい。
【0004】
洗浄剤は、生物製剤の製造プロセスにおけるウイルス不活化のために以前から使用されている。清澄化された細胞培養上清への界面活性剤の添加はしばしば、エンベロープウイルスを不活化するために使用され、一方、抗体は、伝統的な溶媒または界面活性剤を介する低ｐＨ処理に対して不安定である。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００はエンベロープウイルスの不活化において非常に有効であり、強固であることが示されている。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００によるエンベロープウイルスの不活化のための一般的な条件も使用されている。しかし、Ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００の分解産物であるオクトリフェノールはヒト、魚類、および他の生物を害し、したがって環境に悪影響を及ぼす可能性を有する内分泌かく乱物質である。さらに、オクチルフェノール排出の定義された限界は０．０１～０．１ｐｐｂであり、このことにより、生物製剤製造業者がバイオプロセス廃棄物流から除去するのに極めて高費用を要するであろう。
【0005】
バイオ医薬品産業において、バイオ医薬品産業の将来の要件を満たすために、バッチモードでの操作から連続製造へと移行する関心が高まっている。製造プロセスは、その間のホールド容積がゼロまたは最小限で統合された（物理的に接続された）連続的なユニット操作で構成されている場合、完全に連続したプロセスと見なされる。現在、標準的な抗体製造のほとんど全ての単位操作は、バッチプロセスにおいて現在実施されている低ｐＨウイルス不活化工程を除いて、連続処理準備モードにある。一般に、プロテインＡアフィニティーカラム捕捉工程の溶出液プールは、プールされたプロテインＡ溶出液に対する弱酸の滴定によって所望のｐＨに調整され、６０～１２０分の必要な不活化時間の間、容器またはバッグに保持される。レトロウイルスの≧５．０ｌｏｇの有効な低ｐＨウイルス不活化はｐＨ≦３．６の条件下で、室温で、インキュベーション時間≧３０分間（ＡＳＴＭ，２０１２）、達成され得たが、全てのモノクローナル抗体がこの低ｐＨ条件下で非常に安定であるわけではなく、凝集体を形成する。従って、ウイルス不活化処理はより高いｐＨ（例えば、３．７～３．９）で行われなければならない。一般に、必要とされるｐＨが高く、不活化時間が長いほど、抗体の凝集による産物損失が高くなり、これは連続プロセスに適応する際の課題を表す。したがって、課題はフローモードでのウイルス不活化時間をバッチモードと同様に正確に制御しながら、バッチモードでの低ｐＨウイルス不活化を連続プロセスに変換することである。
【0006】
低ｐＨウイルス不活化および流出溶出液のための典型的な滞留時間（１～２時間）に適応するために、連続的な低ｐＨウイルス不活化のための単位操作を開発するために、長くて狭いパイプが必要とされる。しかし、このような単位操作は、高い背圧および広い滞留時間分布を生じ、その結果、管壁に近い抗体分子についてより長い滞留時間を生じる。これは、低ｐＨ処理のための無限に長い滞留時間に起因して、抗体凝集体の形成に有利なモノマーの劇的な減少を引き起こし得る。現在、これらの問題に対処するために、狭い滞留時間のヘリックスモジュールと９０度曲がりから成る「コイルドフローインバータ」（ＣＦＩ）が提案されている。必要とされているのは、連続的なウイルス不活化の操作のための狭い滞留時間分布を有するより正確な処理システムである。これらおよび他の問題は、本実施形態によって対処された。
【0007】
概要
実施形態は、生物製剤の連続製造におけるウイルス不活化のために使用される方法を含む。この方法はカラムを用いて生物学的ウイルスおよび活性ウイルスで溶出液を分離すること、活性ウイルスでの溶出液を低ｐＨの直交処理および非イオン性界面活性剤に同時に供してウイルスを不活化することを含み、溶出液のウイルス不活化のための時間は、低ｐＨまたは非イオン性界面活性剤を別々に用いた溶出液の処理時間と比較して短縮され、生物学的物質は保持される。
実施形態は、生物製剤の連続製造におけるウイルス不活化のために使用される方法を含む。この方法はカラムを用いて生物学的ウイルスおよび活性ウイルスで溶出液を分離すること、活性ウイルスでの溶出液を低ｐＨの直交処理および非イオン性界面活性剤に同時に供してウイルスを不活化することを含み、溶出液のウイルス不活化のための時間は、低ｐＨまたは非イオン性界面活性剤を別々に用いた溶出液の処理時間と比較して短縮され、生物学的物質は保持される。
【0008】
図面の簡単な説明
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみのためであることを理解するのであろう。図面は、本教示または特許請求の範囲をいかなる形でも限定することを意図していない。
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみのためであることを理解するのであろう。図面は、本教示または特許請求の範囲をいかなる形でも限定することを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【発明を実施するための形態】
【0010】
詳細説明
本開示は、ウイルス不活化に関する方法および組成物を提供する。
（定義）
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用される。
以下に記載される定義が、参照により本明細書に組み込まれる文書を含む他の文書中の当該語句の使用と矛盾する場合、以下に記載される定義は反義的な意味が明確に意図されない限り（例えば、用語が最初に使用される文書中）、本明細書およびその関連するクレームを解釈する目的で常に管理されるものとする。
本開示は、ウイルス不活化に関する方法および組成物を提供する。
（定義）
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用される。
以下に記載される定義が、参照により本明細書に組み込まれる文書を含む他の文書中の当該語句の使用と矛盾する場合、以下に記載される定義は反義的な意味が明確に意図されない限り（例えば、用語が最初に使用される文書中）、本明細書およびその関連するクレームを解釈する目的で常に管理されるものとする。
【0011】
必要に応じて、単数形で使用される用語には複数形も含まれ、その逆も同様である。ここでの「ａ」の使用は、特に明記されていない限り、または「１つ以上」の使用が明らかに不適切である場合を除き、「１つ以上」を意味する。「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。「含む」、「含む」、「含んでいる」、「含有する」、「含有している」、および「包含する」の使用は交換可能であり、限定的ではない。「など」、「たとえば」、「など」という用語もまた、制限することを意図していない。たとえば、「含む」という用語は、「含むがこれに限定されない」ことを意味する。
【0012】
本明細書中で使用される場合、用語「約」は、提供される単位値の＋／―１０％を意味する。
【0013】
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、関心のある特性または特性の全体的またはおおよその程度を示す定性的条件を指す。生物学的および化学的組成物および材料の試験、製造、および保管に影響を与える多くの変数のために、または、生物学的および化学的組成物および材料の試験、製造、および保管に使用される機器および機器に固有のエラーのために、生物学的および化学的現象が絶対的な結果を達成または回避することはめったにないことを、生物学技術の当業者は理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、本明細書では、多くの生物学的および化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捉えるために使用される。
【0014】
本明細書中で使用される場合、用語「直交」は、ウイルスを除去／不活化するための別個の機構を使用する、別個の同定可能な工程またはプロセスをいう。プロセス開発に関連するように、これは一般に、多段階精製手順が互いに異なる分離メカニズムを使用すべきであることを意味すると理解され、各段階はデカルト空間における軸を表す。陰イオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用する２工程プロセスは、直交すると理解される。
【0015】
１９８０年代以降、ドナーから採取されたプール血液中のウイルスを不活化するための必須のツールとして洗浄剤が使用されてきた。このプロセスは、血漿由来第ＶＩＩＩ因子（ｐｄＦＶＩＩＩ）のような、血液、血漿または血液／血漿由来成分を投与されている患者の安全性にとって重要である。さらに、この精製手段は、臨床検査室または血漿由来生物学的産物（ＰＤＢＰ）の製造施設における血液の処理に直接関与する職員の安全性を増加させる。より最近では、この実施はまた、動物由来材料を使用する生物学的治療剤またはワクチンのための生物医薬品製造プロセスに不可欠になっている。動物由来の原材料（すなわち、血液、血漿、組織）及び哺乳動物細胞で産生されるタンパク質は、内在性ウイルスを保有している可能性があるか、外来性ウイルスに容易に汚染される可能性がある。したがって、薬物製造プロセスは一連の有効なウイルス不活化（すなわち、溶媒－界面活性剤、低ｐＨ、および熱処理）および除去技術（すなわち、ウイルス濾過）を含み、患者がウイルスを含まないバイオ治療製品を確実に受けるようにする。これらのプロセスは、生物学的に誘導された治療またはワクチン製品の安全性にとって重要である。効率、堅牢性、および最も重要なことには、これらの製品の全体的な安全性を向上させるための新規な方法が非常に必要とされている。
【0016】
洗浄剤の種類
界面活性剤は、親水性（極性）頭部基および疎水性（非極性）尾部基からなる両親媒性分子である。このユニバーサル構造は洗浄剤と他の分子、最も顕著には水溶液中のタンパク質またはエンベロープウイルスとの相互作用を可能にする。基礎科学および応用技術において、界面活性剤は生物学的分子が凝集するのを防止するため、または細胞培養物もしくは組織懸濁液から膜タンパク質を可溶化するために、可溶化剤として、または安定化剤として使用され得る。タンパク質を可溶化するために使用される場合、以下の特性は特定の界面活性剤を他のものよりもより望ましいものにする：１）電荷を欠く界面活性剤（非イオン性界面活性剤）が目的のタンパク質の構造および活性を保持するのを助ける；２）低い臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する界面活性剤が透析を介して界面活性剤の容易な除去を可能にする；３）透明であり、したがって、タンパク質吸収読み取りに影響を及ぼさない界面活性剤；および４）高度に純粋であり、実験ごとの変動性を減少させる界面活性剤。同様に、これらの特性の大部分はタンパク質薬物を破壊しないこと、界面活性剤からの妨害なしにタンパク質濃度を検出すること、および界面活性剤が高度に純粋であり、そのためウイルス不活化が一貫して起こることを確実にすることが必要であるため、ウイルス不活化のための界面活性剤候補を選択する場合に適用可能である。
界面活性剤は、親水性（極性）頭部基および疎水性（非極性）尾部基からなる両親媒性分子である。このユニバーサル構造は洗浄剤と他の分子、最も顕著には水溶液中のタンパク質またはエンベロープウイルスとの相互作用を可能にする。基礎科学および応用技術において、界面活性剤は生物学的分子が凝集するのを防止するため、または細胞培養物もしくは組織懸濁液から膜タンパク質を可溶化するために、可溶化剤として、または安定化剤として使用され得る。タンパク質を可溶化するために使用される場合、以下の特性は特定の界面活性剤を他のものよりもより望ましいものにする：１）電荷を欠く界面活性剤（非イオン性界面活性剤）が目的のタンパク質の構造および活性を保持するのを助ける；２）低い臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する界面活性剤が透析を介して界面活性剤の容易な除去を可能にする；３）透明であり、したがって、タンパク質吸収読み取りに影響を及ぼさない界面活性剤；および４）高度に純粋であり、実験ごとの変動性を減少させる界面活性剤。同様に、これらの特性の大部分はタンパク質薬物を破壊しないこと、界面活性剤からの妨害なしにタンパク質濃度を検出すること、および界面活性剤が高度に純粋であり、そのためウイルス不活化が一貫して起こることを確実にすることが必要であるため、ウイルス不活化のための界面活性剤候補を選択する場合に適用可能である。
【0017】
一般に、エンベロープウイルス不活化は、両親媒性構造および特定の界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に依存する。ＣＭＣは、界面活性剤モノマーが凝集してミセル構造を形成する濃度を指す。水溶液中では、より多くの界面活性剤モノマーが接触することにつれて、親水性ヘッドが隣接して疎水性テールを水溶液から遮蔽し、最終的にミセル構造に組織化することができる。ＣＭＣは、特定の条件下で所定の界面活性剤についてウイルス不活化が起こる濃度に関連しているよう。ウイルス不活化の理論的メカニズムはモノマーが界面活性剤ＣＭＣの下のウイルスエンベロープに挿入されることであり、これはウイルスに有害であり得る。濃度がＣＭＣ以上になるとすぐに、膜中に存在する界面活性剤モノマーは、完全性を破壊するか、またはウイルスエンベロープを完全に剥ぎ取ることができるミセルを形成する。ウイルスのエンベロープがなければ、ウイルスはその宿主細胞の細胞膜上の受容体に結合できず、その複製と拡散を促進することができない。
【0018】
これまで、生体治療製造産業は、エンベロープウイルスを不活化するために少数の界面活性剤を使用してきた。一般的な非イオン性界面活性剤の１つＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、タンパク質薬物を破壊することなくエンベロープウイルスを不活化するのに有効であった。バイオ医薬品製造プロセスにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の使用後、それは、廃水処理プラントに処分されるか、または水生環境に直接放出される（Ｍａｄｓｅｎら、１９９６、ＪＡＯＣＳ，７３：９２９－９３３）。残念ながら、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００副産物は、多くの国によって環境に対して有毒な化学物質と見なされているオクチルフェノールを含有する。したがって、多くのバイオ医薬品産業は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００に匹敵する効力を有する環境的により安全な洗浄剤を探索することに専念してきた。例えば、いくつかの会社がそれぞれ、ラウリルジメチルアミンＮ－オキシド（ＬＤＡＯ）およびアルキルグルコシドを研究している（Ｃｏｎｌｅｙら、２０１４、米国特許第Ｗ０２０１４０２５７７１Ａ２号； Ｃｏｎｌｅｙら、２０１６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ； Ｆｉｓｈｅｒら、２０１６、米国特許第２０１６／０３３３０４６Ａ１号）。これらの会社は異なるクラスの新しい洗浄剤を区別することができたが、本実施形態はエンベロープウイルスの不活化に使用される完全に新規で非常に有効なクラスの非イオン性洗浄剤を定義する。
【0019】
糖ベースの洗剤は優れた物理的特性を有し、高度に生分解性であり、非毒性であり、これは、特に水生環境について、その安全性プロフィールに寄与する（Ｂｏｇｄａｎ，２００７、Ｓｔａｌｍａｎｓら、１９９３）。したがって、開示された実施形態は、生物活性薬物製造においてウイルスを不活化するための新しい方法として、糖ベースの洗浄剤、Ｎ－メチルグルカミドの使用に焦点を当てている。Ｎ－メチルグルカミドは、アミド結合によって連結された高度に親水性のグルコース部分および疎水性の脂肪酸鎖から構成される非イオン性界面活性剤である。これらの界面活性剤は約９５％の再生可能炭素指数で高度に生分解性であることが知られており、特に水生生物に対して無毒であると考えられているので、環境に優しい（Ｓｔａｌｍａｎｓら、１９９３、ＳＯＦＷ、１１９：７９４－８０８）。
【0020】
Ｍｅｇａ－１０は高度に親水性のグルコース部分と、アミド結合によって連結された疎水性の脂肪酸鎖とから構成され、約９５％の再生可能炭素指数で、水生環境に対する毒性なしに、高度に生分解性にする糖ベースの非イオン性洗浄剤である（Ｂｕｒｃｚｙｋ、Ｂ．、Ｗｉｌｋ、Ｋ．Ａ．、Ｓｏｋｏｌｏｗｓｋｉ、Ａ．、ａｎｄ Ｓｙｐｅｒ、Ｌ．，２００１）（Ｆｏｌｅｙ、Ｐ．、Ｐｏｕｒ、Ａ．Ｋ．、Ｂｅａｃｈ、Ｅ．Ｓ．、ａｎｄ Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、Ｊ．Ｂ．，２０１２）。さらに、Ｍｅｇａ－１０またはＴｗｅｅｎ８０またはＴｗｅｅｎ２０のような界面活性剤の存在下での低ｐＨの二重処理が、ウイルス感染性およびレトロウイルスを効果的に不活化するのに必要な時間の減少に相乗効果を有し得ることが、初めて観察された。ウイルス不活化のこれらの二重のメカニズムは、連続的なプロセシングによって製造されるモノクローナル抗体のウイルス不活化において潜在的な有用性を有し得る。
【0021】
ウイルス、タンパク質および洗剤
ウイルス不活化の評価に用いるモデルエンベロープウイルスは、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｅ、ＭＤ）から購入したＸｅｎｏｔｒｏｐｉｃ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ（Ｘ－ＭｕＬＶ）であった。Ｘ－ＭｕＬＶは、哺乳動物培養産生において一般に見出される内因性レトロウイルス様粒子（ＥＲＬＰ）に似ているので、低ｐＨおよび界面活性剤不活化研究のための特異的モデルウイルスとして選択された。
モデルタンパク質、ｍＡｂ１のサンプル（ＩｇＧ１）、ｍＡｂ２のサンプル（ＩｇＧ１）、およびｍＡｂ３のサンプル（ＩｇＧ２）を、それぞれの細胞培養物の清澄化に続いて、プロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーの溶出液プールとして収集した。これらのｍＡｂの等電点（ｐＩ）値は、それぞれ８．９、７．１および７．７であった。
Ｎ－メチルグルカミド（Ｍｅｇａ－１０）、Ｔｗｅｅｎ ２０およびＴｗｅｅｎ ８０は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＳｔＬｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。Ｍｅｇａ－１０粉末０．５ｇを１０ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に溶解することによって、５％のＭｅｇａ－１０ストック溶液（ｗ／ｖ）を調製した。Ｔｗｅｅｎ ２０またはＴｗｅｅｎ ８０界面活性剤のストック溶液を、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水により５％濃度（ｗ／ｖ）で調製した。
ウイルス不活化の評価に用いるモデルエンベロープウイルスは、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｅ、ＭＤ）から購入したＸｅｎｏｔｒｏｐｉｃ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ（Ｘ－ＭｕＬＶ）であった。Ｘ－ＭｕＬＶは、哺乳動物培養産生において一般に見出される内因性レトロウイルス様粒子（ＥＲＬＰ）に似ているので、低ｐＨおよび界面活性剤不活化研究のための特異的モデルウイルスとして選択された。
モデルタンパク質、ｍＡｂ１のサンプル（ＩｇＧ１）、ｍＡｂ２のサンプル（ＩｇＧ１）、およびｍＡｂ３のサンプル（ＩｇＧ２）を、それぞれの細胞培養物の清澄化に続いて、プロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーの溶出液プールとして収集した。これらのｍＡｂの等電点（ｐＩ）値は、それぞれ８．９、７．１および７．７であった。
Ｎ－メチルグルカミド（Ｍｅｇａ－１０）、Ｔｗｅｅｎ ２０およびＴｗｅｅｎ ８０は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＳｔＬｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。Ｍｅｇａ－１０粉末０．５ｇを１０ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に溶解することによって、５％のＭｅｇａ－１０ストック溶液（ｗ／ｖ）を調製した。Ｔｗｅｅｎ ２０またはＴｗｅｅｎ ８０界面活性剤のストック溶液を、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水により５％濃度（ｗ／ｖ）で調製した。
【0022】
ウイルス不活化実験
界面活性剤によるウイルス不活化
種々のプロテインＡ溶出液のｐＨを、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液で７．０に調整した。次に、ｐＨを調整した溶出液を０．２２ｕｍフィルターを通して濾過した。Ｍｅｇａ－１０、Ｔｗｅｅｎ ２０、またはＴｗｅｅｎ ８０の種々の容量の５％ストック溶液を、濾過した中和プロテインＡ溶出液に添加した。これは、様々な濃度の各界面活性剤を含有するプロテインＡ溶出液を調製するために行われた。次いで、Ｘ－ＭｕＬＶを、ウイルススパイキングの前に１６℃の水浴でプレインキュベートした種々の濃度のそれぞれの界面活性剤を含む中和プロテインＡ溶出液に対して１：２０の比率でスパイキングした。完全に混合した後、サンプルのアリコートを直ちに取り出し、希釈剤（３μｇ／ ｍＬのポリブレンを含有するＭｃＣｏｙ培地）で、Ｍｅｇａ－１０については１：１２で、またはＴｗｅｅｎ ２０およびＴｗｅｅｎ ８０については１：１００でクエンチし、不活化を停止させ、サンプルを時間ゼロサンプルとした。残りのスパイクされた溶出液を水浴に戻し、ウイルス不活化動態を評価するために、示された時間にサンプルを収集した。
界面活性剤によるウイルス不活化
種々のプロテインＡ溶出液のｐＨを、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液で７．０に調整した。次に、ｐＨを調整した溶出液を０．２２ｕｍフィルターを通して濾過した。Ｍｅｇａ－１０、Ｔｗｅｅｎ ２０、またはＴｗｅｅｎ ８０の種々の容量の５％ストック溶液を、濾過した中和プロテインＡ溶出液に添加した。これは、様々な濃度の各界面活性剤を含有するプロテインＡ溶出液を調製するために行われた。次いで、Ｘ－ＭｕＬＶを、ウイルススパイキングの前に１６℃の水浴でプレインキュベートした種々の濃度のそれぞれの界面活性剤を含む中和プロテインＡ溶出液に対して１：２０の比率でスパイキングした。完全に混合した後、サンプルのアリコートを直ちに取り出し、希釈剤（３μｇ／ ｍＬのポリブレンを含有するＭｃＣｏｙ培地）で、Ｍｅｇａ－１０については１：１２で、またはＴｗｅｅｎ ２０およびＴｗｅｅｎ ８０については１：１００でクエンチし、不活化を停止させ、サンプルを時間ゼロサンプルとした。残りのスパイクされた溶出液を水浴に戻し、ウイルス不活化動態を評価するために、示された時間にサンプルを収集した。
【0023】
低ｐＨによるウイルス不活化
ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、およびｍＡｂ３プロテインＡ溶出液のｐＨを、１Ｍ酢酸で３．９１、４．０５、または３．９７に調整した。次に、ｐＨ調整した溶出液を０．２２ｕｍフィルターで濾過した。濾過したプロテインＡ溶出液を、Ｘ－ＭｕＬＶを１：２０の比率でスパイクする前に、１６℃の水浴でプレインキュベートした。完全に混合した後、サンプルのアリコートを直ちに除去し、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液で中和して不活化をクエンチし、時間ゼロサンプルとした。残りのスパイクした溶出液を水浴に戻し、ウイルス不活化動態を評価するために、指示された時間にサンプルを収集した。
ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、およびｍＡｂ３プロテインＡ溶出液のｐＨを、１Ｍ酢酸で３．９１、４．０５、または３．９７に調整した。次に、ｐＨ調整した溶出液を０．２２ｕｍフィルターで濾過した。濾過したプロテインＡ溶出液を、Ｘ－ＭｕＬＶを１：２０の比率でスパイクする前に、１６℃の水浴でプレインキュベートした。完全に混合した後、サンプルのアリコートを直ちに除去し、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液で中和して不活化をクエンチし、時間ゼロサンプルとした。残りのスパイクした溶出液を水浴に戻し、ウイルス不活化動態を評価するために、指示された時間にサンプルを収集した。
【0024】
低ｐＨおよび洗浄剤による二重ウイルス不活化
ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、およびｍＡｂ３プロテインＡ溶出液のｐＨを、１Ｍ酢酸で３．９１、４．０５、または３．９７に調整した。次に、ｐＨを調整した溶出液を０．２２ ｕｍフィルターで濾過した。次いで、種々の容量の５％洗剤原液を濾過されたプロテインＡ溶出液に添加した。Ｍｅｇａ－１０、Ｔｗｅｅｎ ８０またはＴｗｅｅｎ ２０を含む低ｐＨプロテインＡ溶出液を、Ｘ－ＭｕＬＶを１：２０の比率でスパイクする前に、１６℃の水浴でプレインキュベートした。完全に混合した後、サンプルのアリコートを直ちに取り出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液で中和して低ｐＨウイルス不活化を停止させ、次いで直ちに希釈剤で１：１２（Ｍｅｇａ－１０）または１：１００（Ｔｗｅｅｎ ２０およびＴｗｅｅｎ ８０）でクエンチして界面活性剤によるウイルス不活化を停止させた。収集したサンプルを時間ゼロ基準とした。残りのスパイクした溶出液を水浴に戻し、ウイルス不活化動態を評価するために、指示された時間にサンプルを収集した。
ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、およびｍＡｂ３プロテインＡ溶出液のｐＨを、１Ｍ酢酸で３．９１、４．０５、または３．９７に調整した。次に、ｐＨを調整した溶出液を０．２２ ｕｍフィルターで濾過した。次いで、種々の容量の５％洗剤原液を濾過されたプロテインＡ溶出液に添加した。Ｍｅｇａ－１０、Ｔｗｅｅｎ ８０またはＴｗｅｅｎ ２０を含む低ｐＨプロテインＡ溶出液を、Ｘ－ＭｕＬＶを１：２０の比率でスパイクする前に、１６℃の水浴でプレインキュベートした。完全に混合した後、サンプルのアリコートを直ちに取り出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液で中和して低ｐＨウイルス不活化を停止させ、次いで直ちに希釈剤で１：１２（Ｍｅｇａ－１０）または１：１００（Ｔｗｅｅｎ ２０およびＴｗｅｅｎ ８０）でクエンチして界面活性剤によるウイルス不活化を停止させた。収集したサンプルを時間ゼロ基準とした。残りのスパイクした溶出液を水浴に戻し、ウイルス不活化動態を評価するために、指示された時間にサンプルを収集した。
【0025】
Ｘ－ＭｕＬＶ細胞ベースの感染能アッセイ
不活化処理後のサンプル中の残りのＸ－ＭｕＬＶ感染性を、接種した組織培養細胞の５０％において細胞変性作用を生じるのに必要なウィルスの量を定量するための終点希釈アッセイであるＴＣＩＤ５０ アッセイによって決定した。ウイルス力価を、スピアマン－カーバー法を使用して推定し、そして計算された９５％信頼区間（ＣＩ）でＴＣＩＤ５０／ｍＬとして報告した。簡潔には、ＰＧ－４（ネコＳ＋ Ｌ－、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－２０３２）細胞を有する充分な数の９６ウェルプレートを、ウイルス不活化実験を開始する前日に調製し、３７℃の加湿ＣＯ２インキュベーター中で一晩インキュベートした。希釈した陽性対照（１：１００）およびウイルス不活化サンプルの３．２倍希釈１０セットを希釈ブロック中で調製した。試料の１１の連続希釈物の各セットを、ＰＧ－４細胞を予め播種した９６ウェルプレート中の最初の１１カラムのウェル（ウェル当たり１００μＬ）に対応して接種した。同じ平板中の１２番目の列に対応する希釈剤を接種して、非ウイルス陰性対照とした。陽性対照は、濾過した中和プロテインＡ溶出液にＸ－ＭｕＬＶを１：２０の比でスパイクすることによって調製した。次に、接種したプレートを３７℃の加湿ＣＯ２インキュベーター中で約２時間インキュベートした。１００ ｕＬの容量の２Ｘアッセイ培地（９２％ ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地、４％ ＦＢＳ、２％ペニシリン／ストレプトマイシン、２％ Ｌ－グルタミン）を、インキュベーションの終わりにプレートの各ウェルに添加した。次いで、プレートを同じインキュベーターに戻し、６日間インキュベーションを続けた。プレートの各ウェルを、細胞変性効果（ＣＰＥ）の存在について顕微鏡下でスコアリングし、結果をスコアリングシートに記録した。次に、スピアマン－カーバー法を用いてウイルス力価を推定し、計算された９５％信頼区間（ＣＩ）でＴＣＩＤ５０／ｍＬとして報告した。
不活化処理後のサンプル中の残りのＸ－ＭｕＬＶ感染性を、接種した組織培養細胞の５０％において細胞変性作用を生じるのに必要なウィルスの量を定量するための終点希釈アッセイであるＴＣＩＤ５０ アッセイによって決定した。ウイルス力価を、スピアマン－カーバー法を使用して推定し、そして計算された９５％信頼区間（ＣＩ）でＴＣＩＤ５０／ｍＬとして報告した。簡潔には、ＰＧ－４（ネコＳ＋ Ｌ－、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－２０３２）細胞を有する充分な数の９６ウェルプレートを、ウイルス不活化実験を開始する前日に調製し、３７℃の加湿ＣＯ２インキュベーター中で一晩インキュベートした。希釈した陽性対照（１：１００）およびウイルス不活化サンプルの３．２倍希釈１０セットを希釈ブロック中で調製した。試料の１１の連続希釈物の各セットを、ＰＧ－４細胞を予め播種した９６ウェルプレート中の最初の１１カラムのウェル（ウェル当たり１００μＬ）に対応して接種した。同じ平板中の１２番目の列に対応する希釈剤を接種して、非ウイルス陰性対照とした。陽性対照は、濾過した中和プロテインＡ溶出液にＸ－ＭｕＬＶを１：２０の比でスパイクすることによって調製した。次に、接種したプレートを３７℃の加湿ＣＯ２インキュベーター中で約２時間インキュベートした。１００ ｕＬの容量の２Ｘアッセイ培地（９２％ ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地、４％ ＦＢＳ、２％ペニシリン／ストレプトマイシン、２％ Ｌ－グルタミン）を、インキュベーションの終わりにプレートの各ウェルに添加した。次いで、プレートを同じインキュベーターに戻し、６日間インキュベーションを続けた。プレートの各ウェルを、細胞変性効果（ＣＰＥ）の存在について顕微鏡下でスコアリングし、結果をスコアリングシートに記録した。次に、スピアマン－カーバー法を用いてウイルス力価を推定し、計算された９５％信頼区間（ＣＩ）でＴＣＩＤ５０／ｍＬとして報告した。
【0026】
ｍＡｂのプロテインＡ溶出液中のＭｅｇａ‐１０によるＸ‐ＭｕＬＶ不活化のロバスト性
ｍＡｂ１のプロテインＡ溶出液中のＭｅｇａ－１０によるＸ－ＭｕＬＶ不活化のロバスト性を評価するために、Ｘ－ＭｕＬＶを、０．１％、０．２％および０．３％のＭｅｇａ－１０を含有する中和されたｍＡｂ１プロテインＡ溶出液中に１：２０の比率でスパイクした。完全に混合した後、１６℃で培養してから０、２．５、５、１０、３０分後に試料を採取し、採取した試料中の残存ウィルス力価をＴＣＩＤ５０法で測定した。ＴＣＩＤ５０検定の結果は、０．２％および０．３％濃度のＭｅｇａ‐１０が２．５分の処理後に、検出限界未満のレベルまで急速にＸ‐ＭｕＬＶを不活化し（図１Ａ）、それぞれ≧５．５８±０．１９および≧５．５８±０．１９のＬＲＦ値を達成したことを示した（表１Ａ）。
ｍＡｂ１のプロテインＡ溶出液中のＭｅｇａ－１０によるＸ－ＭｕＬＶ不活化のロバスト性を評価するために、Ｘ－ＭｕＬＶを、０．１％、０．２％および０．３％のＭｅｇａ－１０を含有する中和されたｍＡｂ１プロテインＡ溶出液中に１：２０の比率でスパイクした。完全に混合した後、１６℃で培養してから０、２．５、５、１０、３０分後に試料を採取し、採取した試料中の残存ウィルス力価をＴＣＩＤ５０法で測定した。ＴＣＩＤ５０検定の結果は、０．２％および０．３％濃度のＭｅｇａ‐１０が２．５分の処理後に、検出限界未満のレベルまで急速にＸ‐ＭｕＬＶを不活化し（図１Ａ）、それぞれ≧５．５８±０．１９および≧５．５８±０．１９のＬＲＦ値を達成したことを示した（表１Ａ）。
【0027】
表１Ａ ｍＡｂ１プロテインＡ溶出液中のＭｅｇａ－１０によるＸ－ＭｕＬＶ不活化の影響
【0028】
ウイルスを不活化するためのＭｅｇａ－１０界面活性剤の有効性も、第２のｍＡｂ産物、ｍＡｂ２試料のプロテインＡ溶出液で評価した。Ｘ－ＭｕＬＶを０．１％、０．１５％、０．２％および０．３％のＭｅｇａ－１０（図１Ｂ）を含有する中和ｍＡｂ２プロテインＡ溶出液とインキュベートした場合、ウイルス不活化の同様の効果が観察された。０．３％濃度のＭｅｇａ－１０はＸ－ＭｕＬＶを２．５分の処理後に検出以下のレベルまで急速に不活化し、≧５．８１±０．１８のＬＲＦ値を達成したことが示された（表１Ｂ）。ＬＲＦ ５．３１±０．７５で２．５分処理後０．２％ Ｍｅｇａ－１０でも有意なウイルス不活化が得られた（表１Ｂ）。
【0029】
表１Ｂ ｍＡｂ２プロテインＡ溶出液中のＭｅｇａ－１０によるＸ－ＭｕＬＶ不活化の影響
【0030】
Ｘ－ＭｕＬＶの感染能低下に対する低ｐＨおよびＭｅｇａ－１０二重処理の相乗効果
エンベロープウイルスを不活化するために界面活性剤によって使用されるメカニズムは、界面活性剤とエンベロープウイルスの脂質膜との相互作用に起因している。この相互作用は膜を破壊し、そしてウイルスキャプシドタンパク質の崩壊を引き起こし、これは、次に、エンベロープウイルスの細胞への結合を妨げ、ウイルス感染性の損失を導く（Ｐａｍｐｈｉｌｏｎ，２０００）（Ｋｅｍｐｆ、Ｃ．、Ｓｔｕｃｋｉ、Ｍ．およびＢｏｓｃｈｅｔｔｉ、Ｎ．，２００７）。一方、低ｐＨ媒介ウイルス不活化は、別のメカニズムを介して作用すると考えられる。低ｐＨ環境はウイルス形態変化を誘導し、低ｐＨウイルス不活化のメカニズムとして関係するウイルス粒子凝集をもたらす（Ｇａｕｄｉｎ、Ｙ．、Ｒｕｉｇｒｏｋ、Ｒ．、Ｋｎｏｓｓｏｗ、Ｍ．およびＦｌａｍａｎｄ、Ａ．，１９９３）。
エンベロープウイルスを不活化するために界面活性剤によって使用されるメカニズムは、界面活性剤とエンベロープウイルスの脂質膜との相互作用に起因している。この相互作用は膜を破壊し、そしてウイルスキャプシドタンパク質の崩壊を引き起こし、これは、次に、エンベロープウイルスの細胞への結合を妨げ、ウイルス感染性の損失を導く（Ｐａｍｐｈｉｌｏｎ，２０００）（Ｋｅｍｐｆ、Ｃ．、Ｓｔｕｃｋｉ、Ｍ．およびＢｏｓｃｈｅｔｔｉ、Ｎ．，２００７）。一方、低ｐＨ媒介ウイルス不活化は、別のメカニズムを介して作用すると考えられる。低ｐＨ環境はウイルス形態変化を誘導し、低ｐＨウイルス不活化のメカニズムとして関係するウイルス粒子凝集をもたらす（Ｇａｕｄｉｎ、Ｙ．、Ｒｕｉｇｒｏｋ、Ｒ．、Ｋｎｏｓｓｏｗ、Ｍ．およびＦｌａｍａｎｄ、Ａ．，１９９３）。
【0031】
エンベロープウイルスを不活化するための界面活性剤および低ｐＨの基礎となるメカニズムは非常に異なるので、これらの処置を一緒に組み合わせることは直感的または自明ではない。
【0032】
Ｘ－ＭｕＬＶの不活化は、低ｐＨおよび界面活性剤媒介ウイルス不活化の両方に最適以下の条件下で実施した。驚くべきことに、Ｘ－ＭｕＬＶを、０．１％のＭｅｇａ－１０を含有するｍＡｂ１プロテインＡ溶出液のサンプルと共にｐＨ ３．９１でインキュベートした場合に、Ｘ－ＭｕＬＶの感染性の減少に対する相乗効果が観察された（図２および表２）。
【0033】
２．５分のインキュベーション後、０．１％のＭｅｇａ‐１０の試料はＸ‐ＭｕＬＶ不活化に影響を示さず、０．３３±０．２９のＬＲＦを生じた。ｐＨ ３．９１単独による処理は、同じインキュベーション時間後に２．６０±０．３３のＬＲＦでウイルス感染性の適度な減少を生じた。驚くべきことに、０．１％ Ｍｅｇａ‐１０およびｐＨ ３．９１の二重処理は検出限界未満のレベルまでＸ‐ＭｕＬＶを効果的に不活化し、同じインキュベーション時間後に≧５．４０±０．２１のＬＲＦを生じた。ｐＨ ４．０５で０．１５％のＭｅｇａ－１０を含有するｍＡｂ２プロテインＡ溶出液サンプルに対してＸ－ＭｕＬＶ不活化を行った場合にも同様の効果が観察された（図３および表３）。
【0034】
表２ ｍＡｂ１プロテインＡ溶出液における種々の処理により達成されたＬＲＦ
表３ ｍＡｂ２蛋白質Ａ溶出液中の種々の処理によって達成されたＬＲＦ
【0035】
５分間のインキュベーション後、０．１５％のＭｅｇａ‐１０のみが１．６８±０．３１のＬＲＦを生成し、ｐＨ ４．０５単独による処理は０．６１±０．１８のＬＲＦを生じた。しかし、０．１５％のＭｅｇａ‐１０とｐＨ ４．０５の二重処理は５．５０±０．８３のＬＲＦを生じ、これはそれらの個々の効果の合計よりはるかに大きかった。従って、界面活性剤の存在下での低ｐＨでのプロテインＡ溶出液の処理は、ウイルス不活化の二重の直交メカニズムに起因して、エンベロープウイルスの感染性を減少させる相乗効果を有すると推測され得る。
【0036】
Ｘ－ＭｕＬＶを不活化するのに必要な時間を検出以下のレベルまで短縮することに対する低ｐＨおよび界面活性剤二重処理の相乗効果
Ｘ－ＭｕＬＶの感染性の低下に対する低ｐＨおよびＭｅｇａ－１０二重処置の相乗効果に加えて、本発明者らはまた、Ｘ－ＭｕＬＶを検出限界未満のレベルまで不活化するか、またはＸ－ＭｕＬＶを完全に不活化するために必要な処置の期間を減少させることに対する、同時の低ｐＨおよびＭｅｇａ－１０処置の相乗効果を観察した。図４Ａに示すように、ｍＡｂ１プロテインＡ溶出液の試料をｐＨ ３．９１および１８℃でインキュベートした場合（図４Ａ）、検出限界未満のレベルまでＸ－ＭｕＬＶを不活化するのに２４０分かかったが、驚くべきことに、１６℃で追加の０．１％のＭｅｇａ－１０の存在下で同じプロテインＡ溶出液をｐＨ ３．９１でインキュベートした後、検出限界未満のレベルまでＸ－ＭｕＬＶを不活化するのに２．５分しかかからなかった（図４Ｂ）。同様に、ｐＨ４．０５および１６℃の温度で０．１５％のＭｅｇａ－１０を含む種々のｍＡｂ、ｍＡｂ２プロテインＡ溶出液の試料中でのＸ－ＭｕＬＶの二重処理も、Ｘ－ＭｕＬＶを不活化するのに必要な時間を、より低いｐＨ（ｐＨ４．０）およびより高い温度（１８℃）での１２０分間のインキュベーションから１０分（図４Ｄ）までの検知限度未満のレベルまで減少させることができた。
Ｘ－ＭｕＬＶの感染性の低下に対する低ｐＨおよびＭｅｇａ－１０二重処置の相乗効果に加えて、本発明者らはまた、Ｘ－ＭｕＬＶを検出限界未満のレベルまで不活化するか、またはＸ－ＭｕＬＶを完全に不活化するために必要な処置の期間を減少させることに対する、同時の低ｐＨおよびＭｅｇａ－１０処置の相乗効果を観察した。図４Ａに示すように、ｍＡｂ１プロテインＡ溶出液の試料をｐＨ ３．９１および１８℃でインキュベートした場合（図４Ａ）、検出限界未満のレベルまでＸ－ＭｕＬＶを不活化するのに２４０分かかったが、驚くべきことに、１６℃で追加の０．１％のＭｅｇａ－１０の存在下で同じプロテインＡ溶出液をｐＨ ３．９１でインキュベートした後、検出限界未満のレベルまでＸ－ＭｕＬＶを不活化するのに２．５分しかかからなかった（図４Ｂ）。同様に、ｐＨ４．０５および１６℃の温度で０．１５％のＭｅｇａ－１０を含む種々のｍＡｂ、ｍＡｂ２プロテインＡ溶出液の試料中でのＸ－ＭｕＬＶの二重処理も、Ｘ－ＭｕＬＶを不活化するのに必要な時間を、より低いｐＨ（ｐＨ４．０）およびより高い温度（１８℃）での１２０分間のインキュベーションから１０分（図４Ｄ）までの検知限度未満のレベルまで減少させることができた。
【0037】
我々はさらに、ウイルス不活化に対する二重処理の観察された相乗効果が、Ｍｅｇａ－１０界面活性剤のみに限定されるかどうかを調査した。Ｔｗｅｅｎ ８０またはＴｗｅｅｎ ２０などの他の非イオン性界面活性剤の存在下、低ｐＨでのＸ－ＭｕＬＶ不活化について実験を行った。ｐＨ ４．０５および１６℃の温度で０．５％のＴｗｅｅｎ ８０を含むｍＡｂ２プロテインＡ溶出液に対するＸ－ＭｕＬＶの二重処理はまた、Ｘ－ＭｕＬＶを不活化するために必要とされる時間を、ｐＨ ４．０およびより高い温度（１８℃）での１２０分間のインキュベーション（図５Ａ）から１０分間の検知限度未満の水準まで減少させることができた（図５Ｂ）。同様の相乗効果は、ｐＨ ３．９７で０．５％のＴｗｅｅｎ ８０（図６Ｂ）または０．５％のＴｗｅｅｎ ２０（図６Ｃ）を含有するｍＡｂ３（ＩｇＧ２）プロテインＡ溶出液の異なるサブタイプに対して二重ウイルス不活化を行った場合にも観察された。いずれの場合においても、検出限界未満のレベルまでのＸ－ＭｕＬＶの不活化に必要なインキュベーション時間は、低ｐＨ処理単独による１２０分（図６Ａ）から５分（図６Ｂおよび６Ｃ）に短縮された。
【0038】
本発明者らはさらに、ｐＨ３．９９でプロテインＡ溶出液に０．２％の最低濃度のＴｗｅｅｎ ８０を添加することは、必要な不活化時間を１２０分から５分に減少させるのに十分であり、Ｔｗｅｅｎ８０の濃度を０．３％または０．５％に増加させた間、さらなる時間の減少は観察されなかったことを実証した（図７Ａ）。一方、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０を含有するｍＡｂ３プロテインＡ溶出液のｐＨ値が４．０から３．９、３．８、次いで３．７に減少することにつれて、Ｘ－ＭｕＬＶ不活化に必要な時間は、それぞれ１０分から２．５分、１分、次いで０分に減少した（図７Ｂ）。これにより、同時二重処理によるＸ－ＭｕＬＶ不活化に必要な時間は界面活性剤の濃度が増加し、プロテインＡ溶出液のｐＨ値が減少することにつれて減少する。さらに、二重処理に必要なＴｗｅｅｎ ８０の最小有効濃度はｐＨ依存性であり、より低いｐＨ値にはより低い最小有効濃度が必要である。
【0039】
本発明者らはまた、低ｐＨおよび界面活性剤の同時処理が、４．３０の高いｐＨ値でさえ、低ｐＨによるＸ－ＭｕＬＶの完全不活化に必要な時間を減少させ得ることを実証した。１％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有するｐＨ４．１１、４．２０または４．３０のｍＡｂ４のプロテインＡ溶出液は１、３または４時間の処理後に、それぞれＸ－ＭｕＬＶを完全に不活化することができ、これにより、１％ Ｔｗｅｅｎ８０で４．３０未満のプロテインＡ溶出液のｐＨ値についてのｐＨ調整なしに、またはＴｗｅｅｎ２０またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００でｐＨ ４．５０ほどの高さで、抗体製造の低ｐＨウイルス不活化工程を実施することが可能になった。現在、低ｐＨウイルス不活化は、一般的に４．１０～４．５０のｐＨ値を有するプロテインＡ溶出液のｐＨを調節することによって、ｐＨ３．７０～３．９０で実施される。従って、プロテインＡ溶出液のｐＨを調節することなく低ｐＨウイルス不活化を実施することは、抗体精製プロセスをより迅速かつより効率的にし得る（図８）。
【0040】
議論されるように、本実施形態は、環境に優しい界面活性剤であるＭｅｇａ－１０がモノクローナル抗体の中和されたプロテインＡ溶出液上で、モデルエンベロープウイルスＸ－ＭｕＬＶを低濃度で効果的に不活化し得ることを実証する。従って、Ｍｅｇａ－１０によるエンベロープウイルスのための界面活性剤ウイルス不活化は、低ｐＨウイルス不活化後の強力なウイルス不活化工程としてモノクローナル抗体製造プロセスに組み込むことができる。ｐＨ ６．０～８．０のｍＡｂまたはＩｇＧ Ｆｃ融合蛋白質の無細胞中間体上で４．０以上のレトロウイルス不活化を達成するためには１５～２５℃の温度でＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００≧０．５％の濃度および６０分以上の保持時間が必要であるが、Ｍｅｇａ－１０では中和プロテインＡ溶出液（ｐＨ ７．０）上での５．８１以上のウイルス不活化を１６℃で３０分の保持時間後に０．２％の濃度で達成することができる。したがって、Ｍｅｇａ－１０はレトロウイルスの不活化に対してＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００よりも効果的であり、水環境に対する毒性を伴わずに高度に生分解性であることから、Ｍｅｇａ－１０はモノクローナル抗体製造におけるウイルス不活化界面活性剤として使用するためのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００に代わる生存可能な代替物となりうる。
【0041】
本発明者らはまた、低ｐＨおよび界面活性剤（例えば、Ｍｅｇａ－１０、またはＴｗｅｅｎ ８０、またはＴｗｅｅｎ ２０）の同時二重処理が、ウイルス感染性およびレトロウイルスを効果的に不活化するために必要な時間の減少に対して相乗効果を有し得ることを初めて観察した。例えば、試料の中和プロテインＡ溶出液上に存在する０．１％のＭｅｇａ－１０による、またはプロテインＡ溶出液のｐＨ ３．９１によるＸ－ＭｕＬＶの２．５分間の処理は、それぞれ０．３３±０．２９および２．５０±０．３３のＬＲＦを生じた。ｐＨ ３．９１プロテインＡ溶出液（同時低ｐＨおよび界面活性剤処理）中で２．５分間の０．１％ Ｍｅｇａ－１０によるＸ－ＭｕＬＶの二重処理は検出限界未満のレベルまでＸ－ＭｕＬＶを効果的に不活化し、≧５．４０±０．２１のＬＲＦを生じた。０．１５％のＭｅｇａ－１０を含有するｐＨ ４．０５のサンプルプロテインＡ溶出液中でＸ－ＭｕＬＶ不活化を行った場合にも同様の効果が観察された。中和されたプロテインＡ溶出液上に存在する０．１５％のＭｅｇａ－１０による、またはプロテインＡ溶出液のｐＨ ４．０５によるＸ－ＭｕＬＶの５分間の処理は、それぞれ１．６８±０．３１および０．６１±０．１８のＬＲＦを生じた。ｐＨ ４．０５のプロテインＡ溶出液の存在下での０．１５％ Ｍｅｇａ－１０によるＸ－ＭｕＬＶの二重処理（同時低ｐＨおよび界面活性剤処理）は５．５０±０．８３のＬＲＦを生じ、これはそれらの個々の効果の合計よりもはるかに大きかった。Ｍｅｇａ－１０および低ｐＨの二重処理によって観察された相乗効果は、エンベロープウイルスを不活化するために界面活性剤または低ｐＨ処理によって利用される異なるメカニズムに起因する。さらに、界面活性剤および低ｐＨの同時二重処理は、ウイルス感染性を減少させる相乗効果を有するだけでなく、エンベロープウイルスを不活化するために必要な時間を減少させる相乗効果も有する。我々は、Ｍｅｇａ－１０またはＴｗｅｅｎ－８０またはＴｗｅｅｎ ２０のような界面活性剤の存在下での低ｐＨプロテインＡ溶出液中での二重処理がＸ－ＭｕＬＶを不活化するために必要な時間を、検出限界未満のレベルまで、低ｐＨ処理単独で必要な１～２時間から、二重処理による２．５～１０分まで減少させ得ることを観察した。１６℃でのｐＨ≧３．９０での≧１２０分から１０分未満への低ｐＨ処理によってＬＲＦ≧５．０を達成するのに必要な時間を短縮する際の低ｐＨおよび界面活性剤の同時処理の相乗効果は、連続プロセシングによるモノクローナル抗体製造中のレトロウイルス不活化において潜在的有用性を有する。
【0042】
その低コスト、より少ない設備投資、より多くの柔軟性、より多くのプロセス制御、より容易なスケールアップおよびより良好な製品品質のために、連続処理は、バイオ医薬品会社の間でより一般的になっている。バイオ医薬品産業がバイオ医薬品産業の将来の要求を満たすために、バッチモードでの操作から連続製造に移行することに対する関心が高まっている。バイオ医薬品、特に抗体ベースのバイオ治療製品の市場は、２０を超える第１世代のブロックバスター生物製剤の特許が間もなく期限切れになっているので、過去１０年間に劇的に変化した。したがって、異なる体積で、安定または不安定な、異なる生体治療製品の生産を柔軟に切り替えることができる、費用効果の高い生産プロセスが必要とされている。製造プロセスは、その間のホールド容積がゼロまたは最小限の統合された（物理的に接続された）連続したユニット操作で構成されている場合、完全に連続したプロセスと見なされる。現在、標準的なモノクローナル抗体製造のほとんど全ての単位操作は、バッチプロセスにおいて現在実施されている低ｐＨウイルス不活化工程を除いて、連続的なプロセシングレディーモード（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｍｏｄｅ）にある。一般に、プロテインＡアフィニティーカラム捕捉工程の溶出液プールは、所望のｐＨに調節され、そしてプロセスパラメーターに依存して、６０～１２０分の必要とされる不活化時間の間、容器またはバッグ中に保持される。一般に、より高いｐＨでは、より長い不活化時間が必要とされ、抗体の凝集によるより高い産物損失がある。これは、連続プロセスに適応する際の課題を表す。バッチプロセスにおける現在の低ｐＨウイルス不活化を連続プロセスに変換する場合の重要な考慮事項は、フローモードにおけるウイルス不活化時間がバッチモードにおけるのと同じくらい正確であり、かつ制御されることを確実にすることである。低ｐＨウイルス不活化のための典型的な滞留時間（１～２時間）およびプロテインＡ連続クロマトグラフィー溶出液の流速（５０～３００Ｌ／時間）ならびに多数の溶出プールに適応させるために、連続低ｐＨウイルス不活化のための単位操作を開発するために非常に長く狭いパイプが必要である。しかしながら、このような単位操作は、高い背圧および広い滞留時間分布を生じ、凝集体の形成に対するモノマーの劇的な減少を引き起こすことに注意すべきである。現在、これらの問題に対処するために、ヘリックスモジュールおよび狭い滞留時間を有する９０度曲げからなる「コイルドフローインバータ」（ＣＦＩ）が提案されており（Ｋｌｕｔｚ、Ｓ．、Ｌｏｂｅｄａｎｎ、Ｍ．、Ｂｒａｍｓｉｅｐｅ、Ｃ．、ａｎｄ Ｓｃｈｅｍｂｅｃｋｅｒ、Ｇ．、２０１６）、現在、プルーフコンセプト段階にある。
【0043】
本実施形態はウイルス不活化に必要な時間を短縮するために、既存の処理プロセスを低ｐＨおよび界面活性剤の同時二重処理に置き換えることによって、低ｐＨウイルス不活化を現在のバッチプロセスから連続プロセスに変換することに関連する技術的課題に対処する。本実施形態および発見は、Ｍｅｇａ－１０またはＴｗｅｅｎ８０またはＴｗｅｅｎ２０などの低濃度の界面活性剤の添加による低ｐＨプロテインＡ溶出液の二重処理が低ｐＨ処理によるレトロウイルスの不活化に必要な時間を６０～１２０分から２．５～１０分に短縮することができることを著しくかつ予想外に実証する。したがって、低ｐＨおよび界面活性剤の同時二重処理を連続モノクローナル抗体製造プロセスに組み込むことにより、低ｐＨウイルス不活化に必要な時間を大幅に短縮することができ、したがって、低ｐＨウイルス活性化に必要な延長された時間に適応するための細長いパイプまたはＣＦＩの必要性を排除することができる。これは、より低いｐＨ条件および長い保持時間下で不安定である抗体についての改善された製造結果および収率を提供し得る。さらに、連続プロセスにおける低ｐＨおよび洗剤の同時二重処理の組み込みは、費用効果があり、ＣＦＩの高価なスケールダウンモデルの設計および使用の必要性を排除するのに役立つであろう。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【国際調査報告】