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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-19
(54)【発明の名称】抗ヒトＴＩＭ－３モノクローナル抗体およびその応用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20220112BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220112BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220112BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220112BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220112BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220112BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220112BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220112BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220112BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20220112BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220112BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20220112BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220112BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20220112BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C07K19/00
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P35/00
A61K47/68
A61K39/395 N
A61K35/15 Z
A61K35/17 Z
A61P37/02
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021531518
(86)(22)【出願日】2019-12-02
(85)【翻訳文提出日】2021-08-02
(86)【国際出願番号】 CN2019122471
(87)【国際公開番号】W WO2020108660
(87)【国際公開日】2020-06-04
(31)【優先権主張番号】201811459248.9
(32)【優先日】2018-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518419208
【氏名又は名称】シャンハイ ファーマエクスプローラー カンパニー，リミティド
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ２０２， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ４， Ｎｏ．５７６ Ｌｉｂｉｎｇ Ｒｏａｄ， Ｎｏ．５６ Ｆａｌａｄｉ Ｒｏａｄ， Ｃｈｉｎａ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｐｉｌｏｔ Ｆｒｅｅ Ｔｒａｄｅ Ｚｏｎｅ， Ｐｕｄｏｎｇ Ｎｅｗ Ａｒｅａ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２１０，Ｃｈｉｎａ
(71)【出願人】
【識別番号】518033554
【氏名又は名称】ファーマエクスプローラー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(72)【発明者】
【氏名】ソン，ニンニン
(72)【発明者】
【氏名】デュアン，チン
(72)【発明者】
【氏名】リウ，リル
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，タッチ テディ
(72)【発明者】
【氏名】シュー，リナ
(72)【発明者】
【氏名】リウ，フー
(72)【発明者】
【氏名】ウェイ，ペイペイ
(72)【発明者】
【氏名】ワン，キアン
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ユアンドン
(72)【発明者】
【氏名】シャオ，シャオフイ
(72)【発明者】
【氏名】フー，シャオピン
(72)【発明者】
【氏名】チャン，ユ
(72)【発明者】
【氏名】ウー，ジャン
(72)【発明者】
【氏名】ワン，メイリン
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ドンシュー
(72)【発明者】
【氏名】ダイ，チャオフイ
(72)【発明者】
【氏名】ワン，メンイン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C076AA95
4C076BB11
4C076BB13
4C076CC41
4C076EE59
4C085AA14
4C085BB11
4C085CC01
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG02
4C085GG06
4C087BB65
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB07
4C087ZB26
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
ＴＩＭ－３を高特異的に標的とする高親和性、完全ヒトモノクローナル抗体およびその調製方法を提供し、前記モノクローナル抗体は、有意な抗腫瘍活性を有し、関連する診断試薬またはＴＩＭ－３機能異常に関連する疾患を予防または治療するための医薬組成物の調製に使用されることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗体の重鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
各ｎは、独立して０、１、２、３、４、５または６であり、
前記アミノ酸配列のいずれか一つは、少なくとも一つのアミノ酸の任意選択的な付加、欠失、修飾および／または置換を通じて得られ、かつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む、前記抗体の重鎖可変領域。
【請求項2】
抗体の重鎖であって、前記重鎖は、請求項１に記載の重鎖可変領域を含む、前記抗体の重鎖。
【請求項3】
抗体の軽鎖可変領域であって、前記軽鎖可変領域は、、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋１０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
各ｎは、独立して０、１、２、３、４、５または６であり、
前記アミノ酸配列のいずれか一つは、少なくとも一つのアミノ酸の任意選択的な付加、欠失、修飾および／または置換を通じて得られ、かつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む、前記抗体の軽鎖可変領域。
【請求項4】
抗体の軽鎖であって、前記軽鎖は、請求項３に記載の軽鎖可変領域を含む、前記抗体の軽鎖。
【請求項5】
抗体であって、前記抗体は、（１）請求項１に記載の重鎖可変領域、および／または
（２）請求項３に記載の軽鎖可変領域を含むか、
または、前記抗体は、請求項２に記載の重鎖、および／または請求項４に記載の軽鎖を含み、
前記アミノ酸配列のいずれか一つは、少なくとも一つのアミノ酸の任意選択的な付加、欠失、修飾および／または置換を通じて得られ、かつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む、前記抗体。
【請求項6】
前記抗体が、請求項１に記載の重鎖可変領域および請求項３に記載の軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域が、以下：
【表1】
前記アミノ酸配列のいずれか一つが、少なくとも一つのアミノ酸の任意選択的な付加、欠失、修飾および／または置換を通じて得られ、かつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項7】
前記抗体の重鎖可変領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、１１、２１、３１、４１、５１または６１に示されるアミノ酸配列を含み、および／または前記抗体の軽鎖可変領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、１６、２６、３６、４６、５６または６６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項8】
以下：【表2】
【請求項9】
組換えタンパク質であって、前記組換えタンパク質は、（ｉ）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、または請求項５～８のいずれか一項に記載の抗体、および
（ｉｉ）発現および／または精製を支援する任意選択的なタグ配列を含む、前記組換えタンパク質。
【請求項10】
ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、（１）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、または請求項５～８のいずれか一項に記載の抗体、および
（２）請求項９に記載の組換えタンパク質
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
【請求項11】
前記重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、１２、２２、３２、４２、５２または６２に示され、および／または、前記軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、１７、２７、３７、４７、５７または６７に示される、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項12】
前記重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドおよび前記軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが、以下：【表3】
【請求項13】
ベクターであって、前記ベクターは、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、前記ベクター。
【請求項14】
遺伝子操作された宿主細胞であって、前記宿主細胞は、請求項１３に記載のベクターを含むか、またはそのゲノムは、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが組み込まれている、前記遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項15】
抗体コンジュゲートであって、前記抗体コンジュゲートは、（ａ）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、請求項５～８のいずれか一項に記載の抗体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される抗体部分、および
（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記抗体部分にカップリングされたカップリング部分
を含む、前記抗体コンジュゲート。
【請求項16】
請求項５～８のいずれか一項に記載の抗体を発現するか、または細胞膜の外側で請求項５～８のいずれか一項に記載の抗体に曝露される、免疫細胞。
【請求項17】
医薬組成物であって、前記医薬組成物は、（ｉ）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、および請求項５～８のいずれか一項に記載の抗体、請求項９に記載の組換えタンパク質、請求項１５に記載の抗体コンジュゲート、請求項１６に記載の免疫細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される活性成分、および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体
を含む、前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医学の分野に関し、具体的には、ＴＩＭ－３抗体ならびにその調製方法および応用に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３、ＨＡＶＣＲ２）は、３０１個のアミノ酸を有するＩ型膜タンパク質であり、知られている主な免疫チェックポイント（Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）の一つである。ＴＩＭ－３は、主に活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球、天然制御性Ｔ細胞、ＮＫ細胞および先天性細胞（マクロファージ、単球細胞および樹状細胞）で発現される。文献報告によると、ＴＩＭ－３のリガンドは、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）、がレクチン－９（Ｇａｌ－９）、高移動度群タンパク質１（ＨＭＧＢ１）および癌胎児性抗原細胞接着分子１（ＣＥＣＡＭ１）を含む。ＴＩＭ－３は、そのリガンドに結合することにより、免疫応答のすべての側面を調節する役割を果たす。ＴＩＭ－３とＣＥＣＡＭ１との相互作用は、Ｔ細胞の活性化を阻害し、Ｔ細胞の耐性および枯渇を促進する。制御性Ｔ細胞および多くの腫瘍細胞は、Ｇａｌ－９タンパク質を発現し、ＴＩＭ－３に結合してエフェクターＴ細胞の活性化を阻害する。ＨＭＧＢ１は、ＴＩＭ－３に結合して、抗原提示細胞および先天性細胞に作用し、損傷に関連する分子パターンによって媒介される炎症反応を軽減する。ＴＩＭ－３は、ホスファチジルセリンに結合してアポトーシス細胞のクリアランスを促進する。
【0003】
研究によると、ＴＩＭ－３発現の異常は、多くの疾患と密接に関連していることが示される。研究によると、ＨＩＶおよびＨＣＶに感染された患者および一部の腫瘍患者のＴ細胞のＴＩＭ－３発現が上昇し、Ｔエフェクター細胞のアポトーシスを媒介し、負の調節シグナルを伝達することにより、免疫系の障害および体の免疫機能の麻痺を引き起こす。さらに、様々なマウス腫瘍モデルにおける腫瘍浸潤リンパ球は、ＴＩＭ－３とＰＤ－１とを共発現し、機能の枯渇、いくつかのサイトカイン（ＩＬ－２、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ）を増殖および分泌する能力の喪失を示す。ＰＤ－１またはＴＩＭ－３のシグナル伝達経路のみを独自にブロックすることと比較して、ＰＤ－１とＴＩＭ－３とのシグナル伝達経路を同時にブロックすることは、腫瘍増殖を効果的に阻害することができる。多くのヒト腫瘍浸潤Ｔ細胞において、ＴＩＭ－３＋／ＰＤ－１＋二重陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＩＭ－３－／ＰＤ－１＋およびＴＩＭ－３－／ＰＤ－１－のＣＤ８＋Ｔ細胞よりも無秩序であり、サイトカインを分泌する能力も、もっと弱い。
【0004】
現在、国内外の臨床研究段階にあるＴＩＭ－３抗体は二つしかなく、他の抗体薬は、まだ発見および研究の段階にあり、ＴＩＭ－３抗体は、臨床応用に応用されておらず、良好な活性、幅広い適応症、および高い収量を備えたＴＩＭ－３抗体を開発する緊急の必要性がある。治療効果をさらに改善するために、より活性の高いＴＩＭ－３抗体を開発する緊急の必要性がある。抗体自体の活性は、可変領域の配列および定常領域の構造に影響される。抗体の可変領域の配列は、抗原を識別する決定因子、結合親和性および体内での代謝率を決定し、すべて体内の活性に、さらに様々な患者の臨床効果にも影響を及ぼす。
【0005】
現在、ＴＩＭ－３抗体の臨床研究段階は、主に悪性固形腫瘍およびリンパ腫の治療に使用され、主に他の治療法または標的薬との併用にも集中され、適用される臨床症状を拡大するために幅広い適応症の抗体を開発するには、患者の治療費を削減し、より多くの患者に利益をもたらすために、より高収量のＴＩＭ－３抗体を開発することが急務である。さらに、現在の腫瘍免疫治療法は、高価であり、コストを削減するために新しい抗体を発明しかつ生産することが急務である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
完全ヒトＴＩＭ－３抗体の現在の欠如および活性に関する既存のＴＩＭ－３抗体の欠点を克服するために、本発明は、高い親和性および強い特異性を有するＴＩＭ－３抗体ならびにその調製方法および用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の第１の態様は、抗体の重鎖可変領域を提供し、前記重鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
ここで、各ｎは、独立して０、１、２、３、４、５または６であり、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸が任意選択的に付加、欠失、修飾および／または置換されかつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
ここで、各ｎは、独立して０、１、２、３、４、５または６であり、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸が任意選択的に付加、欠失、修飾および／または置換されかつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む。
【0008】
別の好ましい例において、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋１に示されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｎは、０、１、２、３、４、５または６である。
本発明の第２の態様は、抗体の重鎖を提供し、前記重鎖は、本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域を有する。
別の好ましい例において、前記重鎖は、重鎖定常領域をさらに含む。
別の好ましい例において、前記重鎖定常領域は、ヒト由来である。
別の好ましい例において、前記重鎖定常領域は、ヒト由来の抗体重鎖ＩｇＧ４定常領域である。
本発明の第２の態様は、抗体の重鎖を提供し、前記重鎖は、本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域を有する。
別の好ましい例において、前記重鎖は、重鎖定常領域をさらに含む。
別の好ましい例において、前記重鎖定常領域は、ヒト由来である。
別の好ましい例において、前記重鎖定常領域は、ヒト由来の抗体重鎖ＩｇＧ４定常領域である。
【0009】
本発明の第３の態様は、抗体の軽鎖可変領域を提供し、前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、，
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋１０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
ここで、各ｎは、独立して０、１、２、３、４、５または６であり、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸が任意選択的に付加、欠失、修飾および／または置換されかつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、，
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋１０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
ここで、各ｎは、独立して０、１、２、３、４、５または６であり、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸が任意選択的に付加、欠失、修飾および／または置換されかつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む。
【0010】
別の好ましい例において、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋６に示されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｎは、０、１、２、３、４、５または６である。
本発明の第４の態様は、抗体の軽鎖を提供し、前記軽鎖は、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域を有する。
別の好ましい例において、前記軽鎖は、軽鎖定常領域をさらに含む。
別の好ましい例において、前記軽鎖定常領域は、ヒト由来である。
別の好ましい例において、前記軽鎖定常領域は、ヒト由来の抗体軽鎖カッパ（ｋａｐｐａ）定常領域である。
本発明の第４の態様は、抗体の軽鎖を提供し、前記軽鎖は、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域を有する。
別の好ましい例において、前記軽鎖は、軽鎖定常領域をさらに含む。
別の好ましい例において、前記軽鎖定常領域は、ヒト由来である。
別の好ましい例において、前記軽鎖定常領域は、ヒト由来の抗体軽鎖カッパ（ｋａｐｐａ）定常領域である。
【0011】
本発明の第５の態様は、抗体を提供し、前記抗体は、
（１）本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域、および／または
（２）本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域を有し、
または、前記抗体は、本発明の第２の態様に記載の重鎖、および／または本発明の第４の態様に記載の軽鎖を有し、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸が任意選択的に付加、欠失、修飾および／または置換されかつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む。
（１）本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域、および／または
（２）本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域を有し、
または、前記抗体は、本発明の第２の態様に記載の重鎖、および／または本発明の第４の態様に記載の軽鎖を有し、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸が任意選択的に付加、欠失、修飾および／または置換されかつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む。
【0012】
別の好ましい例において、上にＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列は、１、２または３個のアミノ酸が付加、欠失、修飾および／または置換される派生ＣＤＲ配列を含み、前記派生ＣＤＲ配列を含むＶＨおよびＶＬで構成される派生抗体が、ＴＩＭ－３結合親和性を保持するようにする。
別の好ましい例において、ＴＩＭ－３に結合する前記派生抗体の親和性Ｆ１とＴＩＭ－３に結合する非派生抗体の親和性Ｆ０との比率（Ｆ１／Ｆ０）は、０．５～２であり、好ましくは、０．７～１．５であり、およびより好ましくは、０．８～１．２である。
別の好ましい例において、ＴＩＭ－３に結合する前記派生抗体の親和性Ｆ１とＴＩＭ－３に結合する非派生抗体の親和性Ｆ０との比率（Ｆ１／Ｆ０）は、０．５～２であり、好ましくは、０．７～１．５であり、およびより好ましくは、０．８～１．２である。
【0013】
別の好ましい例において、前記付加、欠失、修飾および／または置換されるアミノ酸の数は、１～５個（例えば、１～３個、好ましくは、１～２個であり、より好ましくは、１個である）である。
別の好ましい例において、少なくとも一つのアミノ酸が前記付加、欠失、修飾および／または置換されかつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列は、少なくとも９６％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列である。
別の好ましい例において、少なくとも一つのアミノ酸が前記付加、欠失、修飾および／または置換されかつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列は、少なくとも９６％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列である。
【0014】
別の好ましい例において、前記抗体は、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域をさらに含む。
別の好ましい例において、前記重鎖定常領域は、ヒト由来であり、および／または前記軽鎖定常領域は、ヒト由来である。
別の好ましい例において、前記重鎖定常領域は、ヒト由来の抗体重鎖ＩｇＧ４定常領域であり、前記軽鎖定常領域は、ヒト由来の抗体軽鎖カッパ定常領域である。
別の好ましい例において、前記重鎖定常領域は、ヒト由来であり、および／または前記軽鎖定常領域は、ヒト由来である。
別の好ましい例において、前記重鎖定常領域は、ヒト由来の抗体重鎖ＩｇＧ４定常領域であり、前記軽鎖定常領域は、ヒト由来の抗体軽鎖カッパ定常領域である。
【0015】
別の好ましい例において、前記抗体は、動物由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、ヒトにおける前記キメラ抗体の免疫原性Ｚ１と人における非キメラ抗体（例えば、マウス抗体）の免疫原性Ｚ０との比率（Ｚ１／Ｚ０）は、０～０．５であり、好ましくは、０～０．２であり、より好ましくは、０～０．０５（例えば、０．００１～０．０５等）である。
別の好ましい例において、ヒトにおける前記キメラ抗体の免疫原性Ｚ１と人における非キメラ抗体（例えば、マウス抗体）の免疫原性Ｚ０との比率（Ｚ１／Ｚ０）は、０～０．５であり、好ましくは、０～０．２であり、より好ましくは、０～０．０５（例えば、０．００１～０．０５等）である。
【0016】
別の好ましい例において、前記抗体は、部分的あるいは完全にヒト化された、または完全ヒトのモノクローナル抗体である。
別の好ましい例において、前記抗体は、二本鎖抗体または一本鎖抗体である。
別の好ましい例において、前記抗体は、抗体全長タンパク質または抗原結合フラグメントである。
別の好ましい例において、前記抗体は、二重特異的抗体または多重特異的抗体である。
別の好ましい例において、前記抗体は、
（ａ）腫瘍細胞の遊走または転移の阻害、および
（ｂ）腫瘍成長の阻害からなる群から選択される一つまたは複数の特性を有する。
別の好ましい例において、前記抗体は、二本鎖抗体または一本鎖抗体である。
別の好ましい例において、前記抗体は、抗体全長タンパク質または抗原結合フラグメントである。
別の好ましい例において、前記抗体は、二重特異的抗体または多重特異的抗体である。
別の好ましい例において、前記抗体は、
（ａ）腫瘍細胞の遊走または転移の阻害、および
（ｂ）腫瘍成長の阻害からなる群から選択される一つまたは複数の特性を有する。
【0017】
別の好ましい例において、前記抗体は、本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域および本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域を有し、
ここで、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域は、次の群から選択されるＣＤＲを含み、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸が任意選択的に付加、欠失、修飾および／または置換されかつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む。
ここで、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域は、次の群から選択されるＣＤＲを含み、
【表1】
【0018】
別の好ましい例において、前記抗体は、本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域および本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域を有し、ここで、
前記重鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
または
前記重鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
または
前記重鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
または
前記重鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
または
前記重鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
または
前記重鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
または
前記重鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含む。
前記重鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
または
前記重鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
または
前記重鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
または
前記重鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
または
前記重鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
または
前記重鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
または
前記重鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含む。
【0019】
別の好ましい例において、前記抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、１１、２１、３１、４１、５１または６１に示されるアミノ酸配列を含み、および／または前記抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、１６、２６、３６、４６、５６または６６に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例において、前記抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例において、前記抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示されるアミノ酸配列を含む。
【0020】
別の好ましい例において、前記抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例において、前記抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域含有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例において、前記抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域含有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６に示されるアミノ酸配列を含む。
【0021】
別の好ましい例において、前記抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域含有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３６に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例において、前記抗体の重鎖可変領域は、含有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域含有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４６に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例において、前記抗体の重鎖可変領域は、含有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域含有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４６に示されるアミノ酸配列を含む。
【0022】
別の好ましい例において、前記抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域含有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例において、前記抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域含有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６６に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例において、前記抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域含有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６６に示されるアミノ酸配列を含む。
【0023】
別の好ましい例において、前記抗体は、次の群から選択される。
【表2】
【0024】
別の好ましい例において、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、１１、２１、３１、４１、５１または６１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性または配列同一性を有する。
【0025】
別の好ましい例において、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、１６、２６、３６、４６、５６または６６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性または配列同一性を有する。
【0026】
本発明の第６の態様は、組換えタンパク質を提供し、前記組換えタンパク質は、
（ｉ）本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域、本発明の第２の態様に記載の重鎖、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域、本発明の第４の態様に記載の軽鎖、または本発明の第５の態様に記載の抗体、および
（ｉｉ）発現および／または精製を支援するための任意選択のタグ配列を含む。
（ｉ）本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域、本発明の第２の態様に記載の重鎖、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域、本発明の第４の態様に記載の軽鎖、または本発明の第５の態様に記載の抗体、および
（ｉｉ）発現および／または精製を支援するための任意選択のタグ配列を含む。
【0027】
別の好ましい例において、前記タグ配列は、６Ｈｉｓタグを含む。
別の好ましい例において、前記組換えタンパク質（またはポリペプチド）は、融合タンパク質を含む。
別の好ましい例において、前記組換えタンパク質は、単量体、二量体、または多量体である。
別の好ましい例において、前記組換えタンパク質（またはポリペプチド）は、融合タンパク質を含む。
別の好ましい例において、前記組換えタンパク質は、単量体、二量体、または多量体である。
【0028】
別の好ましい例において、前記組換えタンパク質は、
（ｉ）次の群から選択される抗体、
および
（ｉｉ）発現および／または精製を支援するための任意選択的のタグ配列を含む。
（ｉ）次の群から選択される抗体、
【表3】
（ｉｉ）発現および／または精製を支援するための任意選択的のタグ配列を含む。
【0029】
本発明の第７の態様は、ポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、
（１）本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域、本発明の第２の態様に記載の重鎖、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域、本発明の第４の態様に記載の軽鎖、または本発明の第５の態様に記載の抗体、および
（２）本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質の群から選択されるポリペプチドをコードする。
（１）本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域、本発明の第２の態様に記載の重鎖、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域、本発明の第４の態様に記載の軽鎖、または本発明の第５の態様に記載の抗体、および
（２）本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質の群から選択されるポリペプチドをコードする。
【0030】
別の好ましい例において、前記重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、１２、２２、３２、４２、５２または６２に示され、および／または、前記軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、１７、２７、３７、４７、５７または６７に示される。
【0031】
別の好ましい例において、前記重鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチドおよび前記軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチドは、次の群から選択される。
【表4】
【0032】
本発明の第８の態様は、ベクターを提供し、前記ベクターは、本発明の第７の態様に記載のポリヌクレオチドを含む。
別の好ましい例において、前記ベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、例えば、アデノウイルスおよびレトロウイルスなどの哺乳動物細胞ウイルス、または他のベクターを含む。
本発明の第９の態様は、遺伝子操作された宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明の第８の態様に記載のベクターを含むか、またはゲノム中に本発明の第７の態様に記載のポリヌクレオチドが組み込まれる。
別の好ましい例において、前記ベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、例えば、アデノウイルスおよびレトロウイルスなどの哺乳動物細胞ウイルス、または他のベクターを含む。
本発明の第９の態様は、遺伝子操作された宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明の第８の態様に記載のベクターを含むか、またはゲノム中に本発明の第７の態様に記載のポリヌクレオチドが組み込まれる。
【0033】
本発明の第１０の態様は、抗体コンジュゲートを提供し、当該抗体コンジュゲートは、
（ａ）本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域、本発明の第２の態様に記載の重鎖、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域、本発明の第４の態様に記載の軽鎖、本発明の第５の態様に記載の抗体、またはその組み合わせからなる群から選択される抗体部分、および
（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはその組み合わせからなる群から選択される前記抗体部分にカップリングされるカップリング部分を含む。
（ａ）本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域、本発明の第２の態様に記載の重鎖、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域、本発明の第４の態様に記載の軽鎖、本発明の第５の態様に記載の抗体、またはその組み合わせからなる群から選択される抗体部分、および
（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはその組み合わせからなる群から選択される前記抗体部分にカップリングされるカップリング部分を含む。
【0034】
別の好ましい例において、前記抗体部分および前記カップリング部分は、化学結合またはリンカーを介してカップリングされる。
本発明の第１１の態様は、免疫細胞を提供し、前記免疫細胞は、本発明の第５の態様に記載の抗体を発現するか、または細胞膜の外側に曝露される。
別の好ましい例において、前記免疫細胞は、ＮＫ細胞およびＴ細胞を含む。
別の好ましい例において、前記免疫細胞は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス）に由来する。
本発明の第１１の態様は、免疫細胞を提供し、前記免疫細胞は、本発明の第５の態様に記載の抗体を発現するか、または細胞膜の外側に曝露される。
別の好ましい例において、前記免疫細胞は、ＮＫ細胞およびＴ細胞を含む。
別の好ましい例において、前記免疫細胞は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス）に由来する。
【0035】
発明の第１２の態様は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、
（ｉ）本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域、本発明の第２の態様に記載の重鎖、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域、本発明の第４の態様に記載の軽鎖、または本発明の第５の態様に記載の抗体、本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、本発明の第１０の態様に記載の抗体コンジュゲート、本発明の第１１の態様に記載の免疫細胞、またはその組み合わせからなる群から選択される活性成分、および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む。
（ｉ）本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域、本発明の第２の態様に記載の重鎖、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域、本発明の第４の態様に記載の軽鎖、または本発明の第５の態様に記載の抗体、本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、本発明の第１０の態様に記載の抗体コンジュゲート、本発明の第１１の態様に記載の免疫細胞、またはその組み合わせからなる群から選択される活性成分、および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む。
【0036】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、液体製剤である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、注射剤である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、０．０１～９９．９９％の本発明の第５の態様に記載の抗体、本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、本発明の第１０の態様に記載の抗体コンジュゲート、本発明の第１１の態様に記載の免疫細胞、またはその組み合わせと０．０１～９９．９９％の薬学的に許容される担体とを含み、前記パーセンテージは、前記医薬組成物の質量パーセンテージである。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、注射剤である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、０．０１～９９．９９％の本発明の第５の態様に記載の抗体、本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、本発明の第１０の態様に記載の抗体コンジュゲート、本発明の第１１の態様に記載の免疫細胞、またはその組み合わせと０．０１～９９．９９％の薬学的に許容される担体とを含み、前記パーセンテージは、前記医薬組成物の質量パーセンテージである。
【0037】
本発明の第１３の態様は、活性成分の用途を提供し、前記活性成分は、本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域、本発明の第２の態様に記載の重鎖、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域、本発明の第４の態様に記載の軽鎖、または本発明の第５の態様に記載の抗体、本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、本発明の第１０の態様に記載の抗体コンジュゲート、本発明の第１１の態様に記載の免疫細胞、またはその組み合わせからなる群から選択され、ここで、前記活性成分は、（ａ）診断試薬またはキットの調製、および／または（ｂ）ＴＩＭ－３発現または機能異常に関連する疾患を予防および／または治療する薬物の調製に使用される。
【0038】
別の好ましい例において、前記診断試薬は、検出シートまたは検出プレートである。
別の好ましい例において、前記ＴＩＭ－３発現または機能異常に関連する疾患は、腫瘍および自己免疫疾患からなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記腫瘍は、黒色腫、中皮腫、非小細胞肺がん、乳がん、肝臓がん、滑膜肉腫、転移性結腸がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、卵巣がん、慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染、進行性固形がん、消化器悪性腫瘍、子宮内膜がん、再発黒色腫、頭頚部扁平上皮がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、卵チューブがん、腹膜腫瘍、筋肉浸潤性膀胱がん、広範な病期の小細胞肺がん、成人急性骨髄性白血病、非定型慢性骨髄性白血病、卵巣上皮細胞がん、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、皮膚Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、眼内リンパ腫、精巣絨毛がん、神経芽細胞腫および食道がんからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記ＴＩＭ－３発現または機能異常に関連する疾患は、腫瘍および自己免疫疾患からなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記腫瘍は、黒色腫、中皮腫、非小細胞肺がん、乳がん、肝臓がん、滑膜肉腫、転移性結腸がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、卵巣がん、慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染、進行性固形がん、消化器悪性腫瘍、子宮内膜がん、再発黒色腫、頭頚部扁平上皮がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、卵チューブがん、腹膜腫瘍、筋肉浸潤性膀胱がん、広範な病期の小細胞肺がん、成人急性骨髄性白血病、非定型慢性骨髄性白血病、卵巣上皮細胞がん、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、皮膚Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、眼内リンパ腫、精巣絨毛がん、神経芽細胞腫および食道がんからなる群から選択される。
【0039】
別の好ましい例において、前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、アンキロス脊椎炎、強皮症、結節性多発動脈炎、ウェゲナー（Ｗｅｇｅｎｅｒ）肉芽腫症、甲状腺機能亢進症、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、ペンフィゴイド、移植拒絶反応からなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記診断試薬またはキットは、サンプル中のＴＩＭ－３タンパク質の検出に使用される。
別の好ましい例において、前記診断試薬またはキットは、ＴＩＭ－３関連疾患の診断に使用される。
別の好ましい例において、前記診断試薬またはキットは、サンプル中のＴＩＭ－３タンパク質の検出に使用される。
別の好ましい例において、前記診断試薬またはキットは、サンプル中のＴＩＭ－３タンパク質の検出に使用される。
別の好ましい例において、前記診断試薬またはキットは、ＴＩＭ－３関連疾患の診断に使用される。
別の好ましい例において、前記診断試薬またはキットは、サンプル中のＴＩＭ－３タンパク質の検出に使用される。
【0040】
本発明の第１４の態様は、サンプル中のＴＩＭ－３タンパク質のインビトロ検出（診断または非診断を含む）のための方法が提供され、前記方法は、
（１）インビトロで、前記サンプルを本発明の第５の態様に記載の抗体と接触される段階と、および
（２）抗原－抗体複合体が形成されるかどうかを検出し、ここで、複合体の形成は、サンプル中にＴＩＭ－３タンパク質が存在することを示す段階とを含む。
（１）インビトロで、前記サンプルを本発明の第５の態様に記載の抗体と接触される段階と、および
（２）抗原－抗体複合体が形成されるかどうかを検出し、ここで、複合体の形成は、サンプル中にＴＩＭ－３タンパク質が存在することを示す段階とを含む。
【0041】
本発明の第１５の態様は、本発明の第５の態様に記載の抗体、本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、本発明の第１０の態様に記載の抗体コンジュゲート、本発明の第１１の態様に記載の免疫細胞、またはその組み合わせを活性成分として含む、インビトロでサンプル中のＴＩＭ－３タンパク質を検出するための組成物を提供する。
【0042】
本発明の第１６の態様は、検出プレートを提供し、前記検出プレートは、基プレート（サポートボード）およびテストストリップを含み、前記テストストリップは、本発明の第５の態様に記載の抗体、本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、本発明の第１０の態様に記載の抗体コンジュゲート、本発明の第１１の態様に記載の免疫細胞、またはその組み合わせを含む。
【0043】
本発明の第１７の態様は、キットを提供し、前記キットは、
（１）本発明の抗体を含む第１の容器、および／または
（２）抗本発明の抗体の二次抗体を含む第２の容器を含み、
または、
前記キットは、本発明の第１６の態様に記載の検出プレートを含む。
（１）本発明の抗体を含む第１の容器、および／または
（２）抗本発明の抗体の二次抗体を含む第２の容器を含み、
または、
前記キットは、本発明の第１６の態様に記載の検出プレートを含む。
【0044】
本発明の第１８の態様は、組換えポリペプチドの調製方法を提供し、当該方法は、
（ａ）発現に適した条件下で、本発明の第９の態様に記載の宿主細胞を培養する段階と、および
（ｂ）培養物から本発明の第５の態様に記載の抗体または本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質である組換えタンパク質を単離する段階とを含む。
（ａ）発現に適した条件下で、本発明の第９の態様に記載の宿主細胞を培養する段階と、および
（ｂ）培養物から本発明の第５の態様に記載の抗体または本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質である組換えタンパク質を単離する段階とを含む。
【0045】
本発明の第１９の態様は、
（ｉ）本発明の第５の態様に記載の抗体１、または本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、または本発明の第１０の態様に記載の抗体コンジュゲート、または本発明の第１１の態様に記載の免疫細胞、または本発明の第１２の態様に記載の医薬組成物、またはその組み合わせを含む第１の活性成分、
（ｉｉ）二次抗体、または化学療法剤を含む第２の活性成分を含む薬物の組み合わせを提供する。
別の好ましい例において、前記二次抗体は、ＣＴＬＡ４抗体、ＰＤ－１抗体からなる群から選択される。
（ｉ）本発明の第５の態様に記載の抗体１、または本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、または本発明の第１０の態様に記載の抗体コンジュゲート、または本発明の第１１の態様に記載の免疫細胞、または本発明の第１２の態様に記載の医薬組成物、またはその組み合わせを含む第１の活性成分、
（ｉｉ）二次抗体、または化学療法剤を含む第２の活性成分を含む薬物の組み合わせを提供する。
別の好ましい例において、前記二次抗体は、ＣＴＬＡ４抗体、ＰＤ－１抗体からなる群から選択される。
【0046】
別の好ましい例において、前記二次抗体は、ＰＤ－１抗体である。
別の好ましい例において、前記化学療法剤は、ドセタキセル、カルボプラチン、またはその組み合わせからなる群から選択される。
本発明の第２０の態様は、ＴＩＭ－３発現または機能異常に関連する疾患を治療するための薬物の調製における、本発明の第５の態様に記載の抗体、または本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、または本発明の第１０の態様に記載の抗体コンジュゲート、または本発明の第１１の態様に記載の免疫細胞、および／または本発明の第１２の態様に記載の医薬組成物と二次抗体または化学療法剤との組み合わせの用途を提供する。
別の好ましい例において、前記化学療法剤は、ドセタキセル、カルボプラチン、またはその組み合わせからなる群から選択される。
本発明の第２０の態様は、ＴＩＭ－３発現または機能異常に関連する疾患を治療するための薬物の調製における、本発明の第５の態様に記載の抗体、または本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、または本発明の第１０の態様に記載の抗体コンジュゲート、または本発明の第１１の態様に記載の免疫細胞、および／または本発明の第１２の態様に記載の医薬組成物と二次抗体または化学療法剤との組み合わせの用途を提供する。
【0047】
別の好ましい例において、前記二次抗体は、ＣＴＬＡ４抗体、ＰＤ－１抗体からなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記二次抗体は、ＰＤ－１抗体である。
本発明の第２１の態様は、本発明の第５の態様に記載の抗体、または本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、または本発明の第１０の態様に記載の抗体コンジュゲート、または本発明の第１１の態様に記載の免疫細胞、または本発明の第１２の態様に記載の医薬組成物、またはその組み合わせの有効量を必要とする対象に投与する段階を含む、ＴＩＭ－３発現または機能異常に関連する疾患を治療するための方法を提供する。
別の好ましい例において、前記二次抗体は、ＰＤ－１抗体である。
本発明の第２１の態様は、本発明の第５の態様に記載の抗体、または本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、または本発明の第１０の態様に記載の抗体コンジュゲート、または本発明の第１１の態様に記載の免疫細胞、または本発明の第１２の態様に記載の医薬組成物、またはその組み合わせの有効量を必要とする対象に投与する段階を含む、ＴＩＭ－３発現または機能異常に関連する疾患を治療するための方法を提供する。
【0048】
別の好ましい例において、前記ＴＩＭ－３発現または機能異常に関連する疾患は、癌である。
別の好ましい例において、前記方法は、第１の活性成分を投与前、投与中、および／または投与後に、安全かつ有効な量の二次抗体を前記対象に投与する段階をさらに含む。
別の好ましい例において、前記二次抗体は、ＰＤ－１抗体、ＣＴＬＡ４抗体からなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記二次抗体は、ＰＤ－１抗体である。
別の好ましい例において、前記方法は、第１の活性成分を投与前、投与中、および／または投与後に、安全かつ有効な量の二次抗体を前記対象に投与する段階をさらに含む。
別の好ましい例において、前記二次抗体は、ＰＤ－１抗体、ＣＴＬＡ４抗体からなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記二次抗体は、ＰＤ－１抗体である。
【発明の効果】
【0049】
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1】ＴＩＭ－３－ｈＦｃタンパク質とその市販の抗体との結合活性を示す。
【図2】ＴＩＭ－３遺伝子がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のＦＡＣＳ検出結果を示す。
【図3】ＴＩＭ－３－ｈＦＣタンパク質免疫した後マウス血清抗体価のＥＬＩＳＡ検出を示す。
【0051】
【図4】酵素結合免疫吸着試験におけるＴＩＭ－３抗体とヒトＴＩＭ－３細胞外ドメインタンパク質との反応活性を示す。
【図5】酵素結合免疫吸着試験におけるＴＩＭ－３抗体とサルＴＩＭ－３細胞外ドメインタンパク質との反応活性を示す。
【図6】酵素結合免疫吸着試験におけるＴＩＭ－３抗体とマウスＴＩＭ－３細胞外ドメインタンパク質との反応活性を示す。
【0052】
【図7】ＴＩＭ－３抗体とＣＨＯＫ１－ｈＴＩＭ－３との間の結合反応のＦＡＣＳ検出を示す。
【図8】ＴＩＭ－３抗体とＣＨＯＫ１－ｃＴＩＭ－３との間の結合反応のＦＡＣＳ検出を示す。
【図9】ＯＫＴ３依存性ＰＢＭＣ活性化試験におけるＩＦＮ－γ分泌に対する抗体の影響を示す。
【0053】
【図10】酵素結合免疫吸着試験における完全ヒトＴＩＭ－３抗体とヒトＴＩＭ－３細胞外ドメインタンパク質との反応活性を示す。
【図11】酵素結合免疫吸着試験における完全ヒトＴＩＭ－３抗体とサルＴＩＭ－３細胞外ドメインタンパク質との反応活性を示す。
【図12】酵素結合免疫吸着試験における完全ヒトＴＩＭ－３抗体とマウスＴＩＭ－３細胞外ドメインタンパク質との反応活性を示す。
【0054】
【図13】完全ヒトＴＩＭ－３抗体とＣＨＯＫ１－ｈＴＩＭ－３との間の結合反応のＦＡＣＳ検出を示す。
【図14】完全ヒトＴＩＭ－３抗体とＣＨＯＫ１－ｃＴＩＭ－３との間の結合反応のＦＡＣＳ検出を示す。
【図15】完全ヒトＴＩＭ－３抗体がＴＩＭ－３タンパク質とその受容体ホスファチジルセリンとの結合をブロックすることを示す。
【0055】
【図16】リンパ球活性化試験（ドナーＸ）におけるＩＦＮ－γ分泌に対する完全ヒトＴＩＭ－３抗体の影響を示す。
【図17】リンパ球活性化試験（ドナーＹ）におけるＩＦＮ－γ分泌に対する完全ヒトＴＩＭ－３抗体の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【0056】
本発明者らは、広範囲にわたる詳細な研究を通じて、最適化されたハイブリドーマ技術を使用して、ヒト由来ＴＩＭ－３を免疫原とする、ＴＩＭ－３抗体を調製した。具体的には、本発明は、ヒト由来抗体トランスジェニックマウス技術を使用して、完全ヒト由来抗体を調製して、ＴＩＭ－３抗体のリード抗体を得、リード抗体の予備生産、精製および検証により、抗体親和性が高く、ヒト末梢血単核細胞の活性化反応におけるＩＦＮの発現レベルが大幅に増加する等の優れた生物学的特性を備えたＴＩＭ－３抗体を得、次に、分子生物学的方法によるシーケンシングにより、ＴＩＭ－３抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を得た。前記ＴＩＭ－３抗体は、ヒト由来およびサル由来の両方のＴＩＭ－３タンパク質と高い親和性を示し、ＯＫＴ３活性化によって誘導されるヒト末梢血単核細胞におけるＩＦＮの発現レベルを高めることができる。本発明は、ＴＩＭ－３およびそのリガンドに媒介されるシグナル伝達経路の負の調節の阻害、腫瘍特異的免疫反応の活性化、単独でまたは抗ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体または他の抗腫瘍薬の併用が腫瘍免疫治療に使用される、これらの抗体の用途をさらに提供する。これに基づいて本発明を完了した。
【0057】
用語
本発明において、「ＶＨ－ＣＤＲ１」と「ＣＤＲ－Ｈ１」とは、交換可能に使用され、両方とも重鎖可変領域のＣＤＲ１を指し、「ＶＨ－ＣＤＲ２」と「ＣＤＲ－Ｈ２」とは、交換可能に使用され、両方とも重鎖可変領域のＣＤＲ２を指し、「ＶＨ－ＣＤＲ３」と「ＣＤＲ－Ｈ３」とは、交換可能に使用され、両方とも重鎖可変領域のＣＤＲ３を指す。「ＶＬ－ＣＤＲ１」と「ＣＤＲ－Ｌ１」とは、交換可能に使用され、両方とも軽鎖可変領域のＣＤＲ１を指し、「ＶＬ－ＣＤＲ２」と「ＣＤＲ－Ｌ２」とは、交換可能に使用され、両方とも軽鎖可変領域のＣＤＲ２を指し、「ＶＬ－ＣＤＲ３」と「ＣＤＲ－Ｌ３」とは、交換可能に使用され、両方とも軽鎖可変領域のＣＤＲ３を指す。
本発明において、「ＶＨ－ＣＤＲ１」と「ＣＤＲ－Ｈ１」とは、交換可能に使用され、両方とも重鎖可変領域のＣＤＲ１を指し、「ＶＨ－ＣＤＲ２」と「ＣＤＲ－Ｈ２」とは、交換可能に使用され、両方とも重鎖可変領域のＣＤＲ２を指し、「ＶＨ－ＣＤＲ３」と「ＣＤＲ－Ｈ３」とは、交換可能に使用され、両方とも重鎖可変領域のＣＤＲ３を指す。「ＶＬ－ＣＤＲ１」と「ＣＤＲ－Ｌ１」とは、交換可能に使用され、両方とも軽鎖可変領域のＣＤＲ１を指し、「ＶＬ－ＣＤＲ２」と「ＣＤＲ－Ｌ２」とは、交換可能に使用され、両方とも軽鎖可変領域のＣＤＲ２を指し、「ＶＬ－ＣＤＲ３」と「ＣＤＲ－Ｌ３」とは、交換可能に使用され、両方とも軽鎖可変領域のＣＤＲ３を指す。
【0058】
抗体
本明細書に使用されるように、「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、同じ構造特徴を有する約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、二つの同じ軽鎖（Ｌ）および二つの同じ重鎖（Ｈ）から構成される。各軽鎖は、共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合され、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖および軽鎖も、規則的に間隔を置いた鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖の一端には、可変領域（ＶＨ）があり、その後には複数の定常領域が続く。各軽鎖の一端には、可変領域（ＶＬ）があり、他端には定常領域があり、軽鎖の定常領域は、重鎖の１番目の定常領域の反対側にあり、軽鎖の可変領域は、重鎖の可変領域の反対側にある。特殊なアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖との可変領域の間にインターフェースを形成する。
本明細書に使用されるように、「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、同じ構造特徴を有する約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、二つの同じ軽鎖（Ｌ）および二つの同じ重鎖（Ｈ）から構成される。各軽鎖は、共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合され、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖および軽鎖も、規則的に間隔を置いた鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖の一端には、可変領域（ＶＨ）があり、その後には複数の定常領域が続く。各軽鎖の一端には、可変領域（ＶＬ）があり、他端には定常領域があり、軽鎖の定常領域は、重鎖の１番目の定常領域の反対側にあり、軽鎖の可変領域は、重鎖の可変領域の反対側にある。特殊なアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖との可変領域の間にインターフェースを形成する。
【0059】
本明細書に使用されるように、「可変」という用語は、抗体の可変領域の特定の部分が配列において異なり、その特定の抗原に対する様々な特定の抗体の結合および特異性を形成することを意味する。しかしながら、可変性は、抗体の可変領域全体に均等に分布されていない。それは、軽鎖および重鎖の可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つのフラグメントに集中する。可変領域におけるより保存的な部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ四つのＦＲ領域をふくみ、それらは、大体β－折り畳み構成であり、連結リングを形成する三つのＣＤＲによって結合され、特定の場合によっては部分的なβ折り畳み構造を形成することができる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって緊密に保持されかつ別の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位を形成する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２、ＶｏｌｕｍｅＩ、６４７～６６９ページ（１９９１））。定常領域は、抗体と抗原との結合に直接関与しないが、それらは、抗体の抗体依存性細胞毒性に関与する等、異なるエフェクター機能を示す、
【0060】
脊椎動物の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常領域のアミノ酸配列に基づいて、明白に異なる二つのカテゴリー（κおよびλと呼ばれる）のいずれかに分類されることができる。その重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンは、異なるタイプに分類されることができる。免疫グロブリンは、主にＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの五つのクラスを有し、ここで、いくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２等のサブクラス（アイソタイプ）にさらに分類されることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構成は、当業者によく知られている。
【0061】
一般に、抗体の抗原結合特性は、可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、重鎖と軽鎖との可変領域にある三つの特定の領域によって説明されることができ、当該セグメントを四つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分割し、四つのＦＲのアミノ酸配列は、比較的に保存的であり、結合反応に直接関与しない。これらのＣＤＲは、円形構造を形成し、その間のＦＲによって形成されるβ折り畳みは、空間構造において互いに接近しており、重鎖上のＣＤＲおよび軽鎖上に対応するＣＤＲは、抗体の抗原結合部位を構成する。同じタイプの抗体のアミノ酸配列と比較して、どのアミノ酸がＦＲまたはＣＤＲ領域を構成するかを決定することができる。
本発明は、完全な抗体だけでなく、免疫活性を有する抗体のフラグメントまたは抗体および他の配列によって形成される融合タンパク質を含む。従って、本発明は、前記抗体のフラグメント、誘導体および類似体を含む。
本発明は、完全な抗体だけでなく、免疫活性を有する抗体のフラグメントまたは抗体および他の配列によって形成される融合タンパク質を含む。従って、本発明は、前記抗体のフラグメント、誘導体および類似体を含む。
【0062】
本発明において、抗体は、当業者に周知の技術によって調製されたマウス、キメラ、ヒト化または完全ヒトの抗体を含む。ヒトおよび非ヒト部分を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体等の組換え抗体は、標準的なＤＮＡ組換え技術によって得ることができ、それらは、すべて有意な抗体である。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物に由来する分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域、およびヒト免疫グロブリンに由来する定常領域を有するキメラ抗体である（例えば、米国特許４８１６５６７と米国特許４８１６３９７とを参照し、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ヒト化抗体とは、非ヒト種に由来する抗体分子を指し、非ヒト種に由来する一つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）およびヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する（米国特許５５８５０８９を参照し、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これらのキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で周知のＤＮＡ組換え技術を使用して調製されることができる。
【0063】
本発明において、抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはより多い多重特異性であり得る。
本発明において、本発明の抗体は、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較して、最大で１０個、好ましくは、最大で８個、より好ましくは、最大で５個であり、最も好ましくは、最大で３個のアミノ酸が類似または近似の特性を有するアミノ酸に置き換えられてポリペプチドを形成する、その保存的変異体をさらに含む。これらの保存的変異ポリペプチドは、表１９に示されるアミノ酸の置き換えによって生成される。
本発明において、本発明の抗体は、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較して、最大で１０個、好ましくは、最大で８個、より好ましくは、最大で５個であり、最も好ましくは、最大で３個のアミノ酸が類似または近似の特性を有するアミノ酸に置き換えられてポリペプチドを形成する、その保存的変異体をさらに含む。これらの保存的変異ポリペプチドは、表１９に示されるアミノ酸の置き換えによって生成される。
【0064】
【表5】
【0065】
抗ＴＩＭ－３抗体
本発明において、前記抗体は、抗ＴＩＭ－３抗体である。本発明は、重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を含む重鎖と軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、ＴＩＭ－３に対する高特異性および高親和性の抗体を提供する。
本発明において、前記抗体は、抗ＴＩＭ－３抗体である。本発明は、重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を含む重鎖と軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、ＴＩＭ－３に対する高特異性および高親和性の抗体を提供する。
【0066】
好ましくは、
前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３からなる群から選択される相補性決定領域ＣＤＲを有し、
ここで、各ｎは、独立して０、１、２、３、４、５または６であり、
前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋１０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３からなる群から選択される相補性決定領域ＣＤＲを有し、
ここで、各ｎは、独立して０、１、２、３、４、５または６であり、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸が任意選択的に付加、欠失、修飾および／または置換されかつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む。
前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３からなる群から選択される相補性決定領域ＣＤＲを有し、
ここで、各ｎは、独立して０、１、２、３、４、５または６であり、
前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋１０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３からなる群から選択される相補性決定領域ＣＤＲを有し、
ここで、各ｎは、独立して０、１、２、３、４、５または６であり、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸が任意選択的に付加、欠失、修飾および／または置換されかつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む。
【0067】
好ましくは、重鎖可変領域（ＶＨ）は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
軽鎖可変領域（ＶＬ）は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋１０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
各ｎは、独立して０、１、２、３、４、５または６であり、好ましくは、ｎは、０または１であり、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸が任意選択的に付加、欠失、修飾および／または置換されかつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
軽鎖可変領域（ＶＬ）は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋１０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
各ｎは、独立して０、１、２、３、４、５または６であり、好ましくは、ｎは、０または１であり、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸が任意選択的に付加、欠失、修飾および／または置換されかつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む。
【0068】
別の好ましい例において、前記少なくとも一つのアミノ酸配列の付加、欠失、修飾および／または置換によって形成される配列は、好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列である。
【0069】
当業者に周知の配列相同性または同一性を測定するための方法は、計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、レスク（Ｌｅｓｋ）、Ａ．Ｍ．編集、オックスフォード大学出版局、ニューヨーク、１９８８、バイオコンピューティング：情報学およびおよびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）、スミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｄ．Ｗ．編集、アカデミックプレス、ニューヨーク、１９９３、配列データのコンピュータ分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）、第１の部分、グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）、Ａ．Ｍ．およびグリフィン、Ｈ．Ｇ．編集、ヒューマンプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー、１９９４、分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、フォン・ハインジェ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ）、Ｇ．、アカデミックプレス、１９８７ならびに配列分析入門書（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）、グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）、Ｍ．およびデブレウクス（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）、Ｊ．編集、Ｍストックトンプレス（Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９１およびカーリロ（Ｃａｒｉｌｌｏ）、Ｈ．とリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）、Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）を含むが、これらに限定されない。同一性を測定するための好ましい方法は、試験された配列の間で最大のマッピングを得ることである。同一性を測定する方法は、公開されたコンピュータプログラムにまとめられている。二つの配列の間の同一性を測定するための好ましいコンピュータプログラム方法は、ＧＣＧパッケージ（デブレウクス、Ｊ．ら、１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、Ｓ，Ｆ．ら、１９９０）等を含むが、これらに限定されない。一般の人々は、ＮＣＢＩおよび他の情報源からＢＬＡＳＴＸプログラム（ＢＬＡＳＴハンドブック、アルツシュル、Ｓ．ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４、アルツシュル、Ｓ．ら、１９９０）等を得ることができる。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用しても、同一性の測定に使用されることができる。
【0070】
本発明における抗体は、全長タンパク質（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ２ｃ等）であり得、抗原抗体結合ドメインを含むタンパク質フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、ｓｄＡｂ、ＳｃＦｖフラグメント）でもあり得る。本発明における抗体は、野生型タンパク質であり得、抗体のエフェクター機能を排除するために突然変異を使用する等の特定の突然変異の後に特定の効果を達成した突然変異型タンパク質であり得る。
【0071】
好ましくは、本明細書に記載の抗体は、抗体全長タンパク質、抗原抗体結合ドメインタンパク質フラグメント、二重特異的抗体、多重特異的抗体、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ）および単一―ドメイン抗体（Ｓｉｇｎｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の一つまたは複数、ならびに前記抗体から調製されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術等を含む、様々な経路および技術で開発することができ、主流は、ハイブリドーマ技術を介して野生型またはトランスジェニックマウスからモノクローナル抗体を調製することである。
【0072】
前記抗体全長タンパク質は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含む、当技術分野における従来の抗体全長タンパク質である。前記タンパク質の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と、ヒト由来の重鎖定常領域およびヒト由来の軽鎖定常領域とは、完全ヒト由来の抗体全長タンパク質を構成する。好ましくは、前記抗体全長タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。
本発明の抗体は、二本鎖または一本鎖抗体であり得、動物由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体から選択されることができ、より好ましくは、ヒト化抗体、人－動物キメラ抗体であり、より好ましくは、完全ヒト化抗体である。
本発明の抗体は、二本鎖または一本鎖抗体であり得、動物由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体から選択されることができ、より好ましくは、ヒト化抗体、人－動物キメラ抗体であり、より好ましくは、完全ヒト化抗体である。
【0073】
本発明に記載の抗体誘導体は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２または当技術分野で知られている他の抗体誘導体等、ならびにＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体または他のサブタイプの抗体のいずれか一つまたは複数の、一本鎖抗体、および／または抗体フラグメントであり得る。
【0074】
前記一本鎖抗体は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域および１５～２０個のアミノ酸の短ペプチドを含む、当技術分野における従来の一本鎖抗体である。
ここで、前記動物は、好ましくは、マウス等の哺乳動物である。
本発明の抗体は、ＴＩＭ－３（例えば、ヒトＴＩＭ－３）を標的とするキメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲグラフト化および／または修飾抗体であり得る。
ここで、前記動物は、好ましくは、マウス等の哺乳動物である。
本発明の抗体は、ＴＩＭ－３（例えば、ヒトＴＩＭ－３）を標的とするキメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲグラフト化および／または修飾抗体であり得る。
【0075】
本発明の上記の内容において、前記付加、欠失、修飾および／または置換されたアミノ酸の数は、好ましくは、最初のアミノ酸配列のアミノ酸の総数の４０％以下、より好ましくは、３５％以下、より好ましくは、１～３３％、より好ましくは、５～３０％、より好ましくは、１０～２５％、より好ましくは、１５～２０％である。
本発明の上記の内容において、更好ましくは、前記付加、欠失、修飾および／または置換されたアミノ酸の数は、１～７個、より好ましくは、１～５個、より好ましくは、１～３個、より好ましくは、１～２個であり得る。
本発明の上記の内容において、更好ましくは、前記付加、欠失、修飾および／または置換されたアミノ酸の数は、１～７個、より好ましくは、１～５個、より好ましくは、１～３個、より好ましくは、１～２個であり得る。
【0076】
別の好ましい例において、前記抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、１１、２１、３１、４１、５１または６１に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例において、前記抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、１６、２６、３６、４６、５６または６６に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例において、前記ＴＩＭ－３を標的とする抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列、および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下の表２０に示される。
別の好ましい例において、前記抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、１６、２６、３６、４６、５６または６６に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例において、前記ＴＩＭ－３を標的とする抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列、および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下の表２０に示される。
【0077】
【表6】
【0078】
別の好ましい例において、前記ＴＩＭ－３を標的とする抗体は、７Ａ４Ｆ１０、１０Ｄ２Ｈ２、１３４Ｈ３Ｇ６、２１５Ａ８Ｆ２、３４Ｂ６Ｄ８、３９Ｅ５Ｈ１、５７Ｆ４Ｅ５である。
別の好ましい例において、前記ＴＩＭ－３を標的とする抗体は、７Ａ４Ｆ１０である。
別の好ましい例において、前記ＴＩＭ－３を標的とする抗体は、１０Ｄ２Ｈ２である。
別の好ましい例において、前記ＴＩＭ－３を標的とする抗体は、７Ａ４Ｆ１０である。
別の好ましい例において、前記ＴＩＭ－３を標的とする抗体は、１０Ｄ２Ｈ２である。
【0079】
組換えタンパク質
本発明は、ＴＩＭ－３抗体の重鎖ＣＤＲ１（ＶＨ－ＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＶＨ－ＣＤＲ２）および重鎖ＣＤＲ３（ＶＨ－ＣＤＲ３）の一つまたは複数、および／またはＴＩＭ－３抗体の軽鎖ＣＤＲ１（ＶＬ－ＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＶＬ－ＣＤＲ２）および軽鎖ＣＤＲ３（ＶＬ－ＣＤＲ３）の一つまたは複数を含む、組換えタンパク質を提供し、
前記重鎖ＣＤＲ１－３の配列は、次のとおりであり：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３、
前記軽鎖ＣＤＲ１－３の配列は、次のとおりであり：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋１０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３、
各ｎは、独立して０、１、２、３、４、５または６であり、好ましくは、ｎは、０または１であり、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸が任意選択的に付加、欠失、修飾および／または置換されかつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む。
本発明は、ＴＩＭ－３抗体の重鎖ＣＤＲ１（ＶＨ－ＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＶＨ－ＣＤＲ２）および重鎖ＣＤＲ３（ＶＨ－ＣＤＲ３）の一つまたは複数、および／またはＴＩＭ－３抗体の軽鎖ＣＤＲ１（ＶＬ－ＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＶＬ－ＣＤＲ２）および軽鎖ＣＤＲ３（ＶＬ－ＣＤＲ３）の一つまたは複数を含む、組換えタンパク質を提供し、
前記重鎖ＣＤＲ１－３の配列は、次のとおりであり：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋３に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋４に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋５に示されるＶＨ－ＣＤＲ３、
前記軽鎖ＣＤＲ１－３の配列は、次のとおりであり：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋８に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋９に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ｎ＋１０に示されるＶＬ－ＣＤＲ３、
各ｎは、独立して０、１、２、３、４、５または６であり、好ましくは、ｎは、０または１であり、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸が任意選択的に付加、欠失、修飾および／または置換されかつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む。
【0080】
別の好ましい例において、前記少なくとも一つのアミノ酸配列の付加、欠失、修飾および／または置換によって形成される配列は、好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列である。
【0081】
別の好ましい例において、本発明に記載の組換えタンパク質は、ＴＩＭ－３抗体の重鎖可変領域および／またはＴＩＭ－３抗体の軽鎖可変領域を含み、前記抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、１１、２１、３１、４１、５１または６１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、１６、２６、３６、４６、５６または６６に示されるアミノ酸配列を含む。
【0082】
別の好ましい例において、本発明に記載の組換えタンパク質は、ＴＩＭ－３抗体の重鎖可変領域およびＴＩＭ－３抗体の軽鎖可変領域を含み、前記抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、１１、２１、３１、４１、５１または６１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、１６、２６、３６、４６、５６または６６に示されるアミノ酸配列を含む。
【0083】
別の好ましい例において、前記組換えタンパク質および組み換えタンパク質に含まれる重鎖ＣＤＲ１－３、軽鎖ＣＤＲ１－３のアミノ酸配列の配列番号は、表２１に示され、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸が任意選択的に付加、欠失、修飾および／または置換されかつＴＩＭ－３結合親和性を保持することができる派生配列をさらに含む。
【表7】
【0084】
好ましくは、前記組換えタンパク質は、抗体重鎖定常領域および／または抗体軽鎖定常領域をさらに含み、前記抗体重鎖定常領域は、当技術分野における従来型であり、好ましくは、ラット由来の抗体重鎖定常領域またはヒト由来の抗体重鎖定常領域であり、より好ましくは、ヒト由来の抗体重鎖定常領域である。前記抗体軽鎖定常領域は、当技術分野における従来型であり、好ましくは、ラット由来の軽鎖抗体定常領域またはヒト由来の抗体軽鎖定常領域であり、より好ましくは、ヒト由来の抗体軽鎖定常領域である。
【0085】
前記組換えタンパク質は、当技術分野における従来のタンパク質であり、好ましくは、抗体全長タンパク質、抗原抗体結合ドメインタンパク質フラグメント、二重特異的抗体、多重特異的抗体、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ）および単一―ドメイン抗体（Ｓｉｇｎｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の一つまたは複数、ならびに前記抗体から調製されるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術等を含む、様々な経路および技術で開発することができ、主流は、ハイブリドーマ技術を介して野生型またはトランスジェニックマウスからモノクローナル抗体を調製することである。
【0086】
前記抗体全長タンパク質は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含む、当技術分野における従来の抗体全長タンパク質である。前記タンパク質の重鎖可変領域および軽鎖可変領域とヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域とは、完全ヒト抗体全長タンパク質を構成する。好ましくは、前記抗体全長タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。
【0087】
前記一本鎖抗体は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域および１５～２０個のアミノ酸の短ペプチドを含む、当技術分野における従来の一本鎖抗体である。
前記抗原抗体結合ドメインタンパク質フラグメントは、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域および重鎖定常領域のＦｄセグメントを含む、当技術分野における従来の抗原抗体結合ドメインタンパク質フラグメントである。。好ましくは、前記抗原抗体結合ドメインタンパク質フラグメントは、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）である。
前記抗原抗体結合ドメインタンパク質フラグメントは、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域および重鎖定常領域のＦｄセグメントを含む、当技術分野における従来の抗原抗体結合ドメインタンパク質フラグメントである。。好ましくは、前記抗原抗体結合ドメインタンパク質フラグメントは、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）である。
【0088】
前記単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む、当技術分野における従来の単一ドメイン抗体である。
前記単一―ドメイン抗体は、重鎖可変領域のみを含む、当技術分野における従来の単一―ドメイン抗体である。
ここで、前記組換えタンパク質の調製方法は、当技術分野における従来の調製方法である。前記調製方法は、好ましくは、当該タンパク質を組換え的に発現する発現形質転換体から単離されることによって得られるか、またはタンパク質配列を人工的に合成することによって得られる。前記当該タンパク質を組換え的に発現する発現形質転換体から単離されることによって得られる方法は、好ましくは、次のとおりである。前記タンパク質をコードしかつ点突然変異を有する核酸分子を組換えベクターにクローニングし、得られた組換えベクターを形質転換体に形質転換して、組換え発現形質転換体を得、得られた組換え発現形質転換体を培養することにより、前記組換えタンパク質を単離および精製することができる。
前記単一―ドメイン抗体は、重鎖可変領域のみを含む、当技術分野における従来の単一―ドメイン抗体である。
ここで、前記組換えタンパク質の調製方法は、当技術分野における従来の調製方法である。前記調製方法は、好ましくは、当該タンパク質を組換え的に発現する発現形質転換体から単離されることによって得られるか、またはタンパク質配列を人工的に合成することによって得られる。前記当該タンパク質を組換え的に発現する発現形質転換体から単離されることによって得られる方法は、好ましくは、次のとおりである。前記タンパク質をコードしかつ点突然変異を有する核酸分子を組換えベクターにクローニングし、得られた組換えベクターを形質転換体に形質転換して、組換え発現形質転換体を得、得られた組換え発現形質転換体を培養することにより、前記組換えタンパク質を単離および精製することができる。
【0089】
核酸
本発明は、前記抗体（例えば、抗ＴＩＭ－３抗体）または組換えタンパク質または抗ＴＩＭ－３抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードする、核酸をさらに提供する。
好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、１２、２２、３２、４２、５２または６２に示され、および／または前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、１７、２７、３７、４７、５７または６７に示される。
本発明は、前記抗体（例えば、抗ＴＩＭ－３抗体）または組換えタンパク質または抗ＴＩＭ－３抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードする、核酸をさらに提供する。
好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、１２、２２、３２、４２、５２または６２に示され、および／または前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、１７、２７、３７、４７、５７または６７に示される。
【0090】
より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、１２、２２、３２、４２、５２または６２に示され、前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、１７、２７、３７、４７、５７または６７に示される。
前記核酸の調製方法は、当技術分野における従来の調製方法であり、好ましくは、次の段階を含む。遺伝子クローニング技術を介して前記タンパク質をコードする核酸分子を得るか、または人工的な全配列合成の方法を介して前記タンパク質をコードする核酸分子を得る。
当業者は、前記タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を適切に置換、欠失、変更、挿入または追加して、ポリヌクレオチドのホモログーを提供することができることを知っている。本発明におけるポリヌクレオチドのホモログーは、抗体活性を維持する範囲内で当該タンパク質配列をコードする遺伝子の一つまたは複数の塩基を置換、欠失または追加することによって調製されることができる。
前記核酸の調製方法は、当技術分野における従来の調製方法であり、好ましくは、次の段階を含む。遺伝子クローニング技術を介して前記タンパク質をコードする核酸分子を得るか、または人工的な全配列合成の方法を介して前記タンパク質をコードする核酸分子を得る。
当業者は、前記タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を適切に置換、欠失、変更、挿入または追加して、ポリヌクレオチドのホモログーを提供することができることを知っている。本発明におけるポリヌクレオチドのホモログーは、抗体活性を維持する範囲内で当該タンパク質配列をコードする遺伝子の一つまたは複数の塩基を置換、欠失または追加することによって調製されることができる。
【0091】
ベクター
本発明は、前記核酸を含む組換え発現ベクターをさらに提供する。
ここで、前記組換え発現ベクターは、当技術分野における従来の方法によって得られることができ、即ち、本発明に記載の核酸分子を様々な発現ベクターに結合することによって構築される。前記発現ベクターは、前記核酸分子を保持することができる限り、当技術分野における従来の様々なベクターである。前記ベクターは、好ましくは、様々なプラスミド、コスミド、ファージまたはウイルスベクター等を含む。
本発明は、前記核酸を含む組換え発現ベクターをさらに提供する。
ここで、前記組換え発現ベクターは、当技術分野における従来の方法によって得られることができ、即ち、本発明に記載の核酸分子を様々な発現ベクターに結合することによって構築される。前記発現ベクターは、前記核酸分子を保持することができる限り、当技術分野における従来の様々なベクターである。前記ベクターは、好ましくは、様々なプラスミド、コスミド、ファージまたはウイルスベクター等を含む。
【0092】
本発明は、前記組換え発現ベクターを含む組換え発現形質転換体をさらに提供する。
ここで、前記組換え発現形質転換体の調製方法は、当技術分野における従来の調製方法であり、好ましくは、前記組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換することによって調製される。前記宿主細胞は、前記組換え発現ベクターがそれ自体を安定的に複製することを満たすことができ、運ばれる前記核酸を効果的に発現させることができる限り、当技術分野における様々な従来の宿主細胞である。好ましくは、前記宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１またはＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１細胞（一本鎖抗体またはＦａｂ抗体を発現する）、またはＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞（全長ＩｇＧ抗体を発現する）である。前記組換え発現プラスミドを宿主細胞に形質転換して、本発明の好ましい組換え発現形質転換体を得ることができる。ここで、前記形質転換方法は、当技術分野における従来の形質転換方法であり、好ましくは、化学形質転換法、熱ショック法または電気形質転換法である。
ここで、前記組換え発現形質転換体の調製方法は、当技術分野における従来の調製方法であり、好ましくは、前記組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換することによって調製される。前記宿主細胞は、前記組換え発現ベクターがそれ自体を安定的に複製することを満たすことができ、運ばれる前記核酸を効果的に発現させることができる限り、当技術分野における様々な従来の宿主細胞である。好ましくは、前記宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１またはＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１細胞（一本鎖抗体またはＦａｂ抗体を発現する）、またはＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞（全長ＩｇＧ抗体を発現する）である。前記組換え発現プラスミドを宿主細胞に形質転換して、本発明の好ましい組換え発現形質転換体を得ることができる。ここで、前記形質転換方法は、当技術分野における従来の形質転換方法であり、好ましくは、化学形質転換法、熱ショック法または電気形質転換法である。
【0093】
抗体の調製
本発明の抗体またはそのフラグメントのＤＮＡ分子の配列は、ＰＣＲ増幅またはゲノムライブラリースクリーニング等の従来の技術によって得られることができる。さらに、軽鎖と重鎖とのコード配列を融合させて、一本鎖抗体を形成することもできる。
関連する配列が得られたら、組換え法を使用して、関連する配列を大量に得ることができる。これは、通常、それをベクターにクローニングし、次に細胞に移し、次に従来の方法を介して増殖した後の宿主細胞から関連する配列を単離することによって得られる。
本発明の抗体またはそのフラグメントのＤＮＡ分子の配列は、ＰＣＲ増幅またはゲノムライブラリースクリーニング等の従来の技術によって得られることができる。さらに、軽鎖と重鎖とのコード配列を融合させて、一本鎖抗体を形成することもできる。
関連する配列が得られたら、組換え法を使用して、関連する配列を大量に得ることができる。これは、通常、それをベクターにクローニングし、次に細胞に移し、次に従来の方法を介して増殖した後の宿主細胞から関連する配列を単離することによって得られる。
【0094】
さらに、特にフラグメントの長さが短い場合、人工合成の方法を使用して、関連する配列を合成することもできる。通常、まず複数の小さなフラグメントを合成した後に連結することにより、配列が非常に長いフラグメントを得ることができる。
現在、科学合成によって前記本発明の抗体（またはそのフラグメント、またはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列を完全に得ることができる。次に、当該ＤＮＡ配列を当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（またはベクター等）および細胞に導入することができる。さらに、化学合成を介して本発明のタンパク質配列に導入することができる。
現在、科学合成によって前記本発明の抗体（またはそのフラグメント、またはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列を完全に得ることができる。次に、当該ＤＮＡ配列を当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（またはベクター等）および細胞に導入することができる。さらに、化学合成を介して本発明のタンパク質配列に導入することができる。
【0095】
本発明は、上記の適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターにさらに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現することができように、適切な宿主細胞に形質転換するために使用される。
宿主細胞は、細菌細胞等の原核細胞、または酵母細胞等の下等真核細胞、または哺乳動物細胞等の高等真核細胞であり得る，好ましい動物細胞は、ＣＨＯ－Ｓ、ＨＥＫ－２９３細胞を含む（これらに限定されない）。
宿主細胞は、細菌細胞等の原核細胞、または酵母細胞等の下等真核細胞、または哺乳動物細胞等の高等真核細胞であり得る，好ましい動物細胞は、ＣＨＯ－Ｓ、ＨＥＫ－２９３細胞を含む（これらに限定されない）。
【0096】
通常、本発明の抗体の発現に適した条件下で、形質転換された宿主細胞を培養する。次に、例えば、タンパク質Ａ－セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製段階等の、当業者に周知の従来の分離および精製手段によって本発明の抗体を精製する。
【0097】
得られたモノクローナル抗体は、従来の方法で同定することができる。例えば、モノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈殿またはインビトロ結合試験（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ））によって測定されることができる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばマンソン（Ｍｕｎｓｏｎ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析によって測定されることができる。
【0098】
本発明の抗体は、細胞内で、または細胞膜上で発現されることができるか、または細胞外に分泌することができる。必要に応じて、その物理的、化学的およびその他の特性を使用して、様々な分離方法で組換えタンパク質を分離および精製することができる。これらの方法は、当業者によく知られている。これらの方法の例としては、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧滅菌、超音波処理、超遠心分離、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着層分析、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、その他の様々な液体クロマトグラフィー技術およびこれらの方法の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【0099】
抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
本発明は、本発明の抗体に基づく抗体薬物コンジュゲート（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕＧｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）をさらに提供する。
典型的には、前記抗体薬物コンジュゲートは、前記抗体、およびエフェクター分子を含み、前記抗体は、前記エフェクター分子に結合され、好ましくは、科学的に結合される。ここで、前記エフェクター分子は、好ましくは、治療活性を有する薬物である。さらに、前記エフェクター分子は、毒性タンパク質、化学療法薬、小分子薬または放射性核種の中の一つまたは複数であり得る。
本発明は、本発明の抗体に基づく抗体薬物コンジュゲート（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕＧｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）をさらに提供する。
典型的には、前記抗体薬物コンジュゲートは、前記抗体、およびエフェクター分子を含み、前記抗体は、前記エフェクター分子に結合され、好ましくは、科学的に結合される。ここで、前記エフェクター分子は、好ましくは、治療活性を有する薬物である。さらに、前記エフェクター分子は、毒性タンパク質、化学療法薬、小分子薬または放射性核種の中の一つまたは複数であり得る。
【0100】
本発明の抗体と前記エフェクター分子との間は、カップリング剤を介してカップリングすることができる。前記カップリング剤の例としては、非選択的カップリング剤、カルボキシル基を使用するカップリング剤、ペプチド鎖、ジスルフィド結合を使用するカップリング剤のいずれか一つまたは複数であり得る。前記非選択的カップリング剤は、エフェクター分子と抗体とが、グルタルアルデヒド等の共有結合を形成するようにする化合物を指す。前記カルボキシル基を使用するカップリング剤は、シスアコニット酸無水物カップリング剤（シスアコニット酸無水物等）、アシルヒドラゾンカップリング剤（カップリング部位は、アシルヒドラゾン）のいずれか一つまたは複数であり得る。
【0101】
抗体の特定の残基（例えば、ＣｙｓまたはＬｙｓ等）は、例えば、イメージング試薬（例えば、発色基および蛍光基等）、診断試薬（例えば、ＭＲＩ造影剤および放射性同位元素等）、安定剤（例えば、グリコールポリマー等）および治療剤を含む、様々な官能基に結合するために使用される。抗体を機能剤にカップリングして、抗体－機能剤のコンジュゲートを形成することができる。機能剤（例えば、薬物、検出試薬、安定剤等）は、抗体にカップリング（共有結合）される。機能剤は、リンカーを介して抗体に直接的または間接的に連結されることができる。
【0102】
抗体を薬物とカップリングさせて、抗体薬コンジュゲート（ＡＤＣｓ）を形成することができる。典型的には、ＡＤＣは、薬物と抗体との間にリンカーを含む。リンカーは、分解性または非分解性リンカーであり得る。分解性リンカーは、典型的には細胞内環境で容易に分解され、例えば、リンカーは標的部位で分解され、その結果、薬物が抗体から放出される。適切な分解性リンカーは、細胞内プロテアーゼ（例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼ）によって分解されることができるペプチジル基を含むリンカー等の酵素分解性リンカー、またはグルクロニダーゼによって分解されることができるグルクロニドを含むリンカー等の糖リンカーを含む。ペプチジル基リンカーは、例えば、バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リジンまたはバリン－アラニン等のジペプチドを含むことができる。他の適切な分解性リンカーは、例えば、ｐＨ感受性リンカー（例えば、ヒドラゾンリンカー等、ｐＨが５．５未満の時に加水分解されるリンカー）および還元条件下で分解されるリンカー（例えば、ジスルフィド結合リンカー）を含む。非分解性リンカーは、典型的には、抗体がプロテアーゼによって加水分解される情感下で薬物を放出する。
【0103】
抗体に結合される前に、リンカーは、特定のアミノ酸残基と反応することができる反応性基を有し、結合は、反応性基を介して実現される。スルフヒドリル基の特異的反応性基は、好ましくは、マレイミド化合物、ハロゲン化アミド（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロゲン化エステル（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロゲン化メチルケトン（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロゲン化ベンジル（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ的）、ジニルスルホン、ピリジルジスルフィド、例えば、３，６－ビス－（水銀メチル）ジオキサン等の水銀誘導体を含み、対イオンは、酢酸塩、塩素イオンまたは硝酸塩、およびポリメチレンジメチルスルフィドチオスルホネートである。リンカーは、例えば、チオスクシンイミドを介して抗体に結合されるマレイミドを含むことができる。
【0104】
薬物は、任意の細胞毒性、細胞増殖の阻害または免疫阻害剤であり得る。実施形態において、リンカーは、抗体と薬物とを結合し、薬物は、リンカーと結合を形成することができる官能基を有することができる。例えば、薬物は、リンカーと結合を形成することができるアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基またはケトン基を有することができる。薬物がリンカーに直接結合される場合、薬物は、抗体に結合される前に反応性活性基を有する。
【0105】
有用な薬物クラスは、例えば、抗チューブリン薬、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化試薬、抗生物質、葉酸拮抗剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ、ビンカアルカロイド等を含む。特に有用な細胞毒性薬物クラスの例としては、例えば、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡアルキル化試薬、チューブリン阻害剤を含み、典型的な細胞毒性薬物は、例えばオーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ）、ドカルマイシン／デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎｓ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅｓ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅｓ）およびメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）（例えば、ＤＭ１およびＤＭ４）、タキサン（ｔａｘａｎｅｓ）、ベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）またはベンゾジアゼピンを含む薬物（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎＧｄｒｕｇｓ）（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤｓ）、インドリノベンゾジアゼピン（ｉｎｄｏｌｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ））およびビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄｓ）を含む。
【0106】
本発明において、薬物－リンカーは、一つの簡単な段階でＡＤＣを形成するために使用されることができる。他の実施形態において、二機能性リンカー化合物は、２段階または多段階方法でＡＤＣを形成するために使用されることができる。例えば、システイン残基は、第１の段階でリンカーの反応活性部分と反応し、次の段階で、リンカーの官能基が薬物と反応して、ＡＤＣを形成する。
【0107】
通常、薬物部分上の適切な反応性基との反応を促進するように、リンカー上の官能基を選択する。非限定的な例としては、アジド化合物ベースの部分は、薬物部分の反応性アルキニル基と特異的に反応させるために使用されることができる。薬物は、アジドとアルキニル基との間の１，３－双極子付加環化反応を介して、リンカーに共有結合する。他の有用な官能基は、例えば、ケトンおよびアルデヒド（ヒドラジドやアルコキシアミンとの反応に適する）、ホスフィン（アジドとの反応に適する）、イソシアネートおよびイソチオシアネート（アミンやアルコールとの反応に適する）、ならびにＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（アミンやアルコールとの反応に適する）等の活性化されたエステルを含む。。「バイオコンジュゲーションテクノロジー」、第２版（エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ））に記載されているものなど、これらおよび他の結合策略は、当業者によく知られている。当業者は、薬物部分とリンカーとの間の選択的反応について、反応性官能基の相補的対を選択する場合、相補的対の各メンバーがリンカーおよび薬物の両方に使用することができることを理解することができる。
【0108】
本発明は、抗体コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するのに十分な条件下で抗体を薬物－リンカー化合物と組み合わせる段階をさらに含むことができる、ＡＤＣを調製するための方法を提供する。
特定の実施形態において、本発明の方法は、抗体－リンカーコンジュゲートを形成するのに十分な条件下で、抗体を機能性リンカー化合物と組み合わせる段階を含む。これらの実施形態において、本発明の方法は、リンカーを介して薬物部分を後退に共有結合させるのに十分な条件下で、抗体リンカーコンジュゲートを薬物部分と組み合わせる段階をさらに含む。
特定の実施形態において、本発明の方法は、抗体－リンカーコンジュゲートを形成するのに十分な条件下で、抗体を機能性リンカー化合物と組み合わせる段階を含む。これらの実施形態において、本発明の方法は、リンカーを介して薬物部分を後退に共有結合させるのに十分な条件下で、抗体リンカーコンジュゲートを薬物部分と組み合わせる段階をさらに含む。
【0109】
いくつかの実施形態において、抗体薬物コンジュゲートＡＤＣは、以下の分子式に示される。
ここで、
Ａｂは、抗体であり、
ＬＵは、リンカーであり、
Ｄは、薬物であり、
下付きｐは、１～８から選択される値である。
【化1】
Ａｂは、抗体であり、
ＬＵは、リンカーであり、
Ｄは、薬物であり、
下付きｐは、１～８から選択される値である。
【0110】
応用
本発明は、診断用製剤の調製または医薬品を調製するための、本発明の抗体、抗体コンジュゲートＡＤＣ、組換えタンパク質、および／または免疫細胞の用途をさらに提供する。
好ましくは、前記薬物は、ＴＩＭ－３の発現または機能異常に関連する疾患を予防および／または治療するための薬物である。
本発明の抗体、ＡＤＣ、組換えタンパク質、および／または免疫細胞の用途は、以下を含む（これらに限定さない）。
本発明は、診断用製剤の調製または医薬品を調製するための、本発明の抗体、抗体コンジュゲートＡＤＣ、組換えタンパク質、および／または免疫細胞の用途をさらに提供する。
好ましくは、前記薬物は、ＴＩＭ－３の発現または機能異常に関連する疾患を予防および／または治療するための薬物である。
本発明の抗体、ＡＤＣ、組換えタンパク質、および／または免疫細胞の用途は、以下を含む（これらに限定さない）。
【0111】
（ｉ）腫瘍の発生、成長および／または転移、特にＴＩＭ－３高発現の腫瘍の診断、予防および／または治療する。前記腫瘍は、黒色腫、中皮腫、非小細胞肺がん、乳がん、肝臓がん、滑膜肉腫、転移性結腸がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、卵巣がん、慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染、進行性固形がん、消化器悪性腫瘍、子宮内膜がん、再発黒色腫、頭頚部扁平上皮がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、卵チューブがん、腹膜腫瘍、筋肉浸潤性膀胱がん、広範な病期の小細胞肺がん、成人急性骨髄性白血病、非定型慢性骨髄性白血病、卵巣上皮細胞がん、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、皮膚Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、眼内リンパ腫、精巣絨毛がん、神経芽細胞腫、食道がんを含む（これらに限定さる）。
【0112】
（ｉｉ）自己免疫疾患を診断、予防および／または治療し、前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、アンキロス脊椎炎、強皮症、結節性多発動脈炎、ウェゲナー（Ｗｅｇｅｎｅｒ）肉芽腫症、甲状腺機能亢進症、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、ペンフィゴイド、移植拒絶反応を含む（これらに限定さる）。
【0113】
検出用途およびキット
本発明の抗体またはそのＡＤＣは、サンプルを検出するための検出応用に使用されることにより、診断情報を提供する。
本発明において、使用されるサンプル（サンプル）は、細胞、組織サンプルおよび生検標本を含む。本発明に使用される「生検」という用語は、当業者に知られているすべての種類の政権を含むべきである。従って、本発明に使用される生検は、例えば、腫瘍の切除サンプル、内視鏡法またはまたは臓器の穿刺またはまたは針生検を介して調製された組織サンプルを含むことができる。
本発明の抗体またはそのＡＤＣは、サンプルを検出するための検出応用に使用されることにより、診断情報を提供する。
本発明において、使用されるサンプル（サンプル）は、細胞、組織サンプルおよび生検標本を含む。本発明に使用される「生検」という用語は、当業者に知られているすべての種類の政権を含むべきである。従って、本発明に使用される生検は、例えば、腫瘍の切除サンプル、内視鏡法またはまたは臓器の穿刺またはまたは針生検を介して調製された組織サンプルを含むことができる。
【0114】
本発明に使用されるサンプルは、固定または保存された細胞または組織サンプルを含む。
本発明は、本発明の抗体（またはそのフラグメント）を含むキットをさらに提供し、本発明の好ましい例において、前記キットは、容器、取扱説明書、緩衝液等をさらに含む。好ましい例において、本発明の抗体は、検出プレートに固定化することができる。
本発明は、本発明の抗体（またはそのフラグメント）を含むキットをさらに提供し、本発明の好ましい例において、前記キットは、容器、取扱説明書、緩衝液等をさらに含む。好ましい例において、本発明の抗体は、検出プレートに固定化することができる。
【0115】
医薬組成物
本発明は、組成物をさらに提供する。好ましい例において、前記組成物は、上記抗体またはその活性フラグメントまたはその融合タンパク質またはそのＡＤＣまたは対応する免疫細胞、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。通常、これらの物質は、非毒性、不活性、薬学的に許容される水性担体媒体中で調製されることができ、ここで、ｐＨは、通常、５～８、好ましくは、ｐＨは、約６～８であり、ｐＨ値は、調製される物質の性質および処理される条件下によって変化させることができる。
本発明は、組成物をさらに提供する。好ましい例において、前記組成物は、上記抗体またはその活性フラグメントまたはその融合タンパク質またはそのＡＤＣまたは対応する免疫細胞、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。通常、これらの物質は、非毒性、不活性、薬学的に許容される水性担体媒体中で調製されることができ、ここで、ｐＨは、通常、５～８、好ましくは、ｐＨは、約６～８であり、ｐＨ値は、調製される物質の性質および処理される条件下によって変化させることができる。
【0116】
調製された医薬組成物は、腫瘍内、腹腔内、静脈内、または局所投与を含む（これらに限定されない）、従来の経路によって投与することができる。典型的には、本発明に記載の医薬組成物の投与経路は、好ましくは、注射投与または経口投与である。前記注射投与は、好ましくは、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射、または皮下注射等の経路を含む。前記医薬組成物は、当技術分野における従来の様々な剤形であり、好ましくは、固体、半固体または液体の形態であり、水溶液、非水溶液または混濁液であり得、より好ましくは、錠剤、カプセル、顆粒剤、注射剤または注入剤等である。
【0117】
本発明の前記抗体は、細胞内でヌクレオチド配列を発現させることによる細胞治療に使用されることができ、例えば、前記抗体は、于キメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫療法（ＣＡＲ－Ｔ）等に使用される。
本発明に記載の医薬組成物は、ＴＩＭ－３発現または機能異常に関連する疾患を予防および／または治療するための医薬組成物である。
本発明の医薬組成物は、ＴＩＭ－３タンパク質分子を結合するために直接使用することができ、従って、腫瘍および他の疾患を予防および治療するために使用されることができる。
本発明に記載の医薬組成物は、ＴＩＭ－３発現または機能異常に関連する疾患を予防および／または治療するための医薬組成物である。
本発明の医薬組成物は、ＴＩＭ－３タンパク質分子を結合するために直接使用することができ、従って、腫瘍および他の疾患を予防および治療するために使用されることができる。
【0118】
本発明の医薬組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０．００１～９９重量％、好ましくは、０．０１～９０重量％、より好ましくは、０．１～８０重量％）の本発明の上記のモノクローナル抗体（またはそのコンジュゲート）および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。これらの担体は、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、及その組み合わせを含む（これらに限定されない）。薬物製剤は、投与方法と一致している必要がある。本発明の医薬組成物は、例えば、生理食塩水または従来の方法による調整のためのグルコースおよび他のアジュバントを含む水溶液を用いた注射の形態で調製することができる。注射剤、溶液等の医薬組成物は、滅菌条件下で製造することができる。活性成分の投与量は、治療上有効な量であり、例えば、１日当たり約１μｇ／ｋｇ体重から約５ｍｇ／ｋｇ体重である。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療剤と一緒に使用することができる。
【0119】
本発明において、好ましくは、本発明に記載の医薬組成物は、一つまたは複数の医薬担体をさらに含む。前記医薬担体は、当技術分野における従来の医薬担体であり、前記医薬担体は、任意の適切な生理学的または薬学的に許容される薬物助剤であり得る。前期薬物助剤は、当技術分野における従来の薬物助剤であり、好ましくは、薬学的に許容される賦形剤、充填剤または希釈剤等を含む。より好ましくは、前記医薬組成物は、０．０１～９９．９９％の前記タンパク質および０．０１～９９．９９％の薬学的に許容される担体を含み、前記パーセンテージは、前記医薬組成物の質量パーセンテージである。
【0120】
本発明において、好ましくは、前記医薬組成物の投与量は、有効量であり、前記有効量は、疾患、変性または外傷性状態の進行を緩和または遅延させることができる量である。前記有効量は、個別に決定することができ、治療すべき症状と求めされる結果を考慮して部分的に決定される。当業者は、個々の基礎等の前述の要因を使用し、従来の実験のみを使用することによって、有効量を決定することができる。
【0121】
医薬組成物を使用する場合、安全かつ有効な量の免疫コンジュゲートを哺乳動物に投与し、ここで、当該安全かつ有効な量は、通常少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重を超えず、好ましくは、当該投与量は、約１０μｇ／ｋｇ体重－約２０ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん、具体的な投与量は、投与経路、患者の健康状態等、熟練した医師のスキル範囲内にある要因も考慮する必要がある。
【0122】
本発明は、ＴＩＭ－３発現または機能異常に関連する疾患を予防および／または治療するための薬物の調製における上記医薬組成物の応用を提供する。好ましくは、前記ＴＩＭ－３発現または機能異常に関連する疾患は、癌および自己免疫疾患である。
【0123】
サンプル中のＴＩＭ－３タンパク質を検出するための方法および組成物
本発明は、上記の抗体をインビトロで試験されるサンプルと接触され、上記の抗体が試験されるサンプルに結合して抗原－抗体複合体を形成するかどうかを検出する段階を含む、サンプル中のＴＩＭ－３タンパク質（例えば、過剰発現ＴＩＭ－３細胞を検出する）を検出する方法をさらに提供する。
本発明は、上記の抗体をインビトロで試験されるサンプルと接触され、上記の抗体が試験されるサンプルに結合して抗原－抗体複合体を形成するかどうかを検出する段階を含む、サンプル中のＴＩＭ－３タンパク質（例えば、過剰発現ＴＩＭ－３細胞を検出する）を検出する方法をさらに提供する。
【0124】
前記過剰発現の意味は、当技術分野では慣習的であり、試験されるサンプル中のＴＩＭ－３タンパク質のＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現（転写の増加、転写後の加工、翻訳、翻訳語の加工およびタンパク質分解の変更）、ならびにタンパク質送達モード変更（核ポジショニングの増加）による局所的な過剰発現および機能的活性の増加（例えば、基質の酵素的加水分解が増加した場合）を指す。
【0125】
本発明において、結合して抗原－抗体複合体を形成するかどうかを検出するための検出方法は、当技術分野における従来の検出方法であり、好ましくは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）検出である。
本発明は、前記抗体、組換えタンパク質、抗体コンジュゲート、免疫細胞、またはその組み合わせを活性成分として含む、サンプル中のＴＩＭ－３タンパク質を検出するための組成物を提供する。好ましくは、前記抗体の機能的フラグメントからなる化合物を活性成分としてさらに含む。
当技術分野の常識に準拠することに基づいて、前記好ましい条件を任意に組み合わせて、本発明の好ましい各例を得ることができる。
本発明は、前記抗体、組換えタンパク質、抗体コンジュゲート、免疫細胞、またはその組み合わせを活性成分として含む、サンプル中のＴＩＭ－３タンパク質を検出するための組成物を提供する。好ましくは、前記抗体の機能的フラグメントからなる化合物を活性成分としてさらに含む。
当技術分野の常識に準拠することに基づいて、前記好ましい条件を任意に組み合わせて、本発明の好ましい各例を得ることができる。
【0126】
本発明の主な利点は、次のとおりである。
（１）本発明は、ラット－人キメラ抗体トランスジェニックマウスを用いて完全ヒト抗体を得、得られた抗体は、一連の優れた特徴を有する。
（１）可変領域配列は、既存の抗体と異なる（相同性＜９２％）。
（２）得られた抗体は、強い親和性を有する。
（３）得られた抗体は、Ｔ細胞活性化を刺激する活性を有する。
（１）本発明は、ラット－人キメラ抗体トランスジェニックマウスを用いて完全ヒト抗体を得、得られた抗体は、一連の優れた特徴を有する。
（１）可変領域配列は、既存の抗体と異なる（相同性＜９２％）。
（２）得られた抗体は、強い親和性を有する。
（３）得られた抗体は、Ｔ細胞活性化を刺激する活性を有する。
【0127】
（２）本発明で使用されるトランスジェニックマウスは、野生型マウスよりも容易に完全ヒト抗体を得ることができ、それにより、抗体の免疫原性を低下させ、完全ヒト抗体のトランスジェニックマウスと比較して、得られる抗体の数は多く、親和性が強く、配列多様性が良好で、活性芽高い。
【0128】
（３）本発明は、ハイブリドーマ技術を使用して抗体を得、ファージライブラリーから得られる抗体と比較して、抗体は、抗親和性および良好な配列発現を有する。
（４）本発明は、ＴＩＭ－３に特異的に結合することができ、その結合活性は、ナノモルよりも低く、Ｔ細胞活性化活性に対するＴＩＭ－３の阻害を逆転させることにより、Ｔ細胞を活性化してＩＦＮを分泌する、異なる配列を有する抗体を得る。
（４）本発明は、ＴＩＭ－３に特異的に結合することができ、その結合活性は、ナノモルよりも低く、Ｔ細胞活性化活性に対するＴＩＭ－３の阻害を逆転させることにより、Ｔ細胞を活性化してＩＦＮを分泌する、異なる配列を有する抗体を得る。
【0129】
以下、本発明は、具体的実施例と併せてされに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、具体的条件を示さない実験方法は、通常、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル」（Ｐｅｉｔａｎｇ Ｈｕａｎｇら、北京：Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ、２００２）に記載される条件等の従来の条件、またはメーカーによって提案された条件（例えば、製品の取扱説明書）に従う。特に明記されない限り、パーセンテージおよび部数は、重量で計算される。特に明記されない限り、以下の実施例で使用される実験材料または試薬は、商業チャネルから入手することができる。
実施例に記載の室温は、当技術分野における従来の室温であり、一般には、１０～３０℃である。
実施例に記載の室温は、当技術分野における従来の室温であり、一般には、１０～３０℃である。
【0130】
実施例１：ＴＩＭ－３特異的抗体の調製
（一）免疫原の調製
細胞外ドメインＴＩＭ－３タンパク質、ＴＩＭ－３組換え細胞株、ＴＩＭ－３ＤＮＡベクターを含む発現プラスミド等の免疫原を調製する。
免疫原１）ヒトＴＩＭ－３タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列２２－２００（配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７１に示される）をヒトＩｇＧＦｃフラグメント（ｈＦｃ）を含むｐＣｐＣベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入、Ｖ０４４－５０）にクローニングしかつ構築された標準的な分子生物学的方法に従ってプラスミドを調製し、具体的な方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．、ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．（１９８９）．分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏラットｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）（ニューヨーク州プレインビュー：コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎＧＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏラットｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））を参照する。ＨＥＫ２９３細胞（インビトロジェンから購入）を一過性トランスフェクトし（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）かつＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３（インビトロジェン）を使用して、３７℃下で増殖させる。四日後、細胞培養液を収集し、遠心分離によって細胞成分を除去し、ＴＩＭ－３タンパク質の細胞外ドメインを含む培養上清液を得る。培養上清液をタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＧＥヘルスケアから購入）にロードし、同時に、紫外線（ＵＶ）検出器は、紫外線吸収値（Ａ２８０ｎｍ）の変化を監視する。ロード後、ＰＢＳリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）を使用して、紫外線吸収値がベースラインに戻るまでタンパク質アフィニティークロマトグラフィーカラムを洗浄し、次に、０．１Ｍ塩酸グリシン（ｐＨ２．５）で溶出し、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出されたｈＦｃタグ付きＴＩＭ－３タンパク質（ＴＩＭ－３－ｈＦｃ）を収集し、４℃冷蔵庫でＰＢＳリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）で一晩透析する。透析したタンパク質を０．２２ミクロンのフィルターで滅菌した後－８０℃で保存し、即ち、精製された免疫原ヒトＴＩＭ－３－ｈＦｃタンパク質を得る。免疫原ＴＩＭ－３－ｈＦｃタンパク質は、タンパク質濃度、純度、分子量および生物活性の検出等、使用前に一連の品質チューブ理検出を行う必要がある。
（一）免疫原の調製
細胞外ドメインＴＩＭ－３タンパク質、ＴＩＭ－３組換え細胞株、ＴＩＭ－３ＤＮＡベクターを含む発現プラスミド等の免疫原を調製する。
免疫原１）ヒトＴＩＭ－３タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列２２－２００（配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７１に示される）をヒトＩｇＧＦｃフラグメント（ｈＦｃ）を含むｐＣｐＣベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入、Ｖ０４４－５０）にクローニングしかつ構築された標準的な分子生物学的方法に従ってプラスミドを調製し、具体的な方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．、ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．（１９８９）．分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏラットｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）（ニューヨーク州プレインビュー：コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎＧＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏラットｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））を参照する。ＨＥＫ２９３細胞（インビトロジェンから購入）を一過性トランスフェクトし（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）かつＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３（インビトロジェン）を使用して、３７℃下で増殖させる。四日後、細胞培養液を収集し、遠心分離によって細胞成分を除去し、ＴＩＭ－３タンパク質の細胞外ドメインを含む培養上清液を得る。培養上清液をタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＧＥヘルスケアから購入）にロードし、同時に、紫外線（ＵＶ）検出器は、紫外線吸収値（Ａ２８０ｎｍ）の変化を監視する。ロード後、ＰＢＳリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）を使用して、紫外線吸収値がベースラインに戻るまでタンパク質アフィニティークロマトグラフィーカラムを洗浄し、次に、０．１Ｍ塩酸グリシン（ｐＨ２．５）で溶出し、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出されたｈＦｃタグ付きＴＩＭ－３タンパク質（ＴＩＭ－３－ｈＦｃ）を収集し、４℃冷蔵庫でＰＢＳリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）で一晩透析する。透析したタンパク質を０．２２ミクロンのフィルターで滅菌した後－８０℃で保存し、即ち、精製された免疫原ヒトＴＩＭ－３－ｈＦｃタンパク質を得る。免疫原ＴＩＭ－３－ｈＦｃタンパク質は、タンパク質濃度、純度、分子量および生物活性の検出等、使用前に一連の品質チューブ理検出を行う必要がある。
【0131】
ここで、免疫原ＴＩＭ－３－ｈＦｃと市販の抗ＴＩＭ－３抗体との結合活性は、ＥＬＩＳＡによって検出され、具体的には、次のとおりである。
ｈＦｃタグ付きＴＩＭ－３タンパク質（ＴＩＭ－３－ｈＦｃ、即ち、免疫原）を、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡマイクロウェルプレートに加え、４℃下で一晩インキュベートする。ＥＬＩＳＡブロッキング溶液（１％ＢＳＡおよびｐＨ７．４のＰＢＳリン酸緩衝液を含み、前記パーセンテージは、質量パーセンテージである）で３７℃下で２時間ブロッキングした後、勾配希釈した市販の抗ＴＩＭ－３抗体を加え、３７℃下で１時間インキュベートする。前記市販の抗ＴＩＭ－３抗体は、Ｒ＆Ｄシステム（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）から購入され、製品番号は、ＭＡＢ２３６５である。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識の二次抗体を加え、室温で３０分間インキュベートした後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ発色溶液を加える。室温下で１５分間インキュベートした後、５０μｌの１Ｎ塩酸を加えて発色反応を停止し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーでＯＤ４５０ｎｍの読み取り値を読み取る。各段階の後、プレートを洗浄する必要がある。ここで、陰性対照抗体は、ラット（ｒａｔ）ＩｇＧであり、結果は、図１および表１に示される。
ｈＦｃタグ付きＴＩＭ－３タンパク質（ＴＩＭ－３－ｈＦｃ、即ち、免疫原）を、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡマイクロウェルプレートに加え、４℃下で一晩インキュベートする。ＥＬＩＳＡブロッキング溶液（１％ＢＳＡおよびｐＨ７．４のＰＢＳリン酸緩衝液を含み、前記パーセンテージは、質量パーセンテージである）で３７℃下で２時間ブロッキングした後、勾配希釈した市販の抗ＴＩＭ－３抗体を加え、３７℃下で１時間インキュベートする。前記市販の抗ＴＩＭ－３抗体は、Ｒ＆Ｄシステム（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）から購入され、製品番号は、ＭＡＢ２３６５である。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識の二次抗体を加え、室温で３０分間インキュベートした後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ発色溶液を加える。室温下で１５分間インキュベートした後、５０μｌの１Ｎ塩酸を加えて発色反応を停止し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーでＯＤ４５０ｎｍの読み取り値を読み取る。各段階の後、プレートを洗浄する必要がある。ここで、陰性対照抗体は、ラット（ｒａｔ）ＩｇＧであり、結果は、図１および表１に示される。
【0132】
【表8】
【0133】
結果から、タンパク質レベルでのＴＩＭ－３と市販の抗ＴＩＭ－３タンパク質の抗体との結合は、抗体の濃度の変化によって変化することを示す。
免疫原２）ヒトＴＩＭ－３全長アミノ酸配列をｐＩＲＥＳベクター（くロンテックから購入）にクローニングしかつプラスミドを調製する。ＨＥＫ２９３細胞株およびＣＨＯＫ１細胞株（均インビトロジェンから購入）に対してプラスミドトランスフェクト（トランスフェクションは、Ｘ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを使用し、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社から購入し、カタログ番号Ｃａｔ＃０６３６６２３６００１を使用しかつ取扱説明書に従って操作する）した後、０．５μｇ／ｍｌピューロマイシンと１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳとを含むＤＭＥＭ培地で２週間選択的に賠償し、限界希釈法を使用して、９６ウェル培養プレートでサブクローニングし、３７℃下に置いて、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で培養する。約２週間後、一部のモノクローナルウェルを選択し、６ウェルプレートに増幅する。増幅したクローンを既知のＴＩＭ－３抗体で染色し、フローサイトメトリーでスクリーニングする。より良好な増殖、より高い蛍光強度、およびモノクローナルを備えた細胞株を選択して、培養を拡大しかつ液体窒素で凍結保存し、即ち、免疫原ＴＩＭ－３組換え細胞株を得る。具体的な選択結果は、表２および図２に示され、表２において、陽性細胞（％）は、細胞の総数に占める陽性細胞のパーセンテージを指し、ＭＦＩは、測定された細胞集団の平均蛍光強度値である。図２は、ＨＥＫ２９３細胞がより高いレベルのＴＩＭ－３的発現を有することを示す。
免疫原２）ヒトＴＩＭ－３全長アミノ酸配列をｐＩＲＥＳベクター（くロンテックから購入）にクローニングしかつプラスミドを調製する。ＨＥＫ２９３細胞株およびＣＨＯＫ１細胞株（均インビトロジェンから購入）に対してプラスミドトランスフェクト（トランスフェクションは、Ｘ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを使用し、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社から購入し、カタログ番号Ｃａｔ＃０６３６６２３６００１を使用しかつ取扱説明書に従って操作する）した後、０．５μｇ／ｍｌピューロマイシンと１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳとを含むＤＭＥＭ培地で２週間選択的に賠償し、限界希釈法を使用して、９６ウェル培養プレートでサブクローニングし、３７℃下に置いて、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で培養する。約２週間後、一部のモノクローナルウェルを選択し、６ウェルプレートに増幅する。増幅したクローンを既知のＴＩＭ－３抗体で染色し、フローサイトメトリーでスクリーニングする。より良好な増殖、より高い蛍光強度、およびモノクローナルを備えた細胞株を選択して、培養を拡大しかつ液体窒素で凍結保存し、即ち、免疫原ＴＩＭ－３組換え細胞株を得る。具体的な選択結果は、表２および図２に示され、表２において、陽性細胞（％）は、細胞の総数に占める陽性細胞のパーセンテージを指し、ＭＦＩは、測定された細胞集団の平均蛍光強度値である。図２は、ＨＥＫ２９３細胞がより高いレベルのＴＩＭ－３的発現を有することを示す。
【0134】
【表9】
【0135】
免疫原３）ＴＩＭ－３全長アミノ酸配列ｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３．１ベクターにクローニングしかつ１．０ｕｍ金コロイド弾丸にコーティングし、ヘリオス遺伝子銃（Ｂｉｏ－ｒａｄ）で免疫する。詳細な方法は、ヘリオス（Ｈｅｌｉｏｓ）遺伝子銃の取扱説明書に従って決定する。
（二）ハイブリドーマ細胞の調製および抗体スクリーニング
ハーバー（Ｈａｒｂｏｕｒ）トランスジェニックマウスは、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子およびラット免疫グロブリン定常領域遺伝子を導入するが、マウス自体のＩｇ発現は、阻害される（Ｆ．Ｇ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ｅｔ ａｌ、特許（ｐａｔｅｎｔ）＃ＷＯ２０１０／０７０２６３Ａｌ）。当該トランスジェニックマウスは、抗原で免疫された後、正常なマウス（例えば、Ｂａｌｂ／ｃ）と同等の免疫応答と抗体価を生み出すことができる。
（二）ハイブリドーマ細胞の調製および抗体スクリーニング
ハーバー（Ｈａｒｂｏｕｒ）トランスジェニックマウスは、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子およびラット免疫グロブリン定常領域遺伝子を導入するが、マウス自体のＩｇ発現は、阻害される（Ｆ．Ｇ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ｅｔ ａｌ、特許（ｐａｔｅｎｔ）＃ＷＯ２０１０／０７０２６３Ａｌ）。当該トランスジェニックマウスは、抗原で免疫された後、正常なマウス（例えば、Ｂａｌｂ／ｃ）と同等の免疫応答と抗体価を生み出すことができる。
【0136】
Ａ．免疫原１）免疫化は、６～８週齢のハーバー（Ｈａｒｂｏｒ）ヒト抗体トランスジェニックマウスを使用し（北京Ｗｅｉｔｏｎｇ Ｌｉｈｕａ社から購入）、マウスをＳＰＦ条件下で飼育する。最初の免疫化の場合、免疫原ＴＩＭ－３－ｈＦｃタンパク質をフロイント完全アジュバントで乳化した後、０．２５ｍｌを腹腔内注射し、即ち、マウス１匹あたり１００μｇの免疫原タンパク質を注射する。免疫を強化する場合、免疫原タンパク質は、フロイントの不完全アジュバントで乳化された後、０．２５ｍｌを腹腔内注射し、即ち、マウス１匹あたり５０μｇの免疫原タンパク質を注射する。最初の免疫と１回目の免疫強化との間には、２週間の間隔があり、その後の各免疫強化の間には、３週間の間隔がある。各免疫強化の１週間後に採血し、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳで血清中の免疫原タンパク質の抗体価および特異性を検出し、結果は、図３および表３に示される。
【0137】
【表10】
【0138】
表３は、ＴＩＭ－３－ｈＦｃで免疫したマウスの免疫血清が免疫原への結合の程度が異なり、抗原抗体反応をしめし、ここで、最高希釈度が約１００００であることを示す。ここで、ブランク対照は、１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡであり、ここで、バッチは、２回目の免疫強化後７日目のマウス血清を指し、表のデータは、ＯＤ４５０ｎｍ値である。
【0139】
Ｂ．免疫原２）免疫は、６～８週齢のハーバーヒト抗体トランスジェニックマウス（北京Ｗｅｉｔｏｎｇ Ｌｉｈｕａ社から購入）を使用し、マウスをＳＰＦ条件下で飼育する。得られたヒトＴＩＭ－３を含むＨＥＫ２９３－ｈ ＴＩＭ－３安定細胞株を、Ｔ－７５細胞培養フラスコで９０％コンフルエンスまで増殖し、培地を完全に吸引する。ＤＭＥＭ基本培地（インビトロジェンから購入）で２回洗浄し、次に、細胞が培養皿の壁から剥がれるまで３７℃で酵素を含まない細胞解離溶液（インビトロジェンから購入）で処理し、細胞を収集する。ＤＭＥＭ基本培地で２回洗浄し、細胞をカウントした後、リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）で細胞を１ｍｌあたり２×１０７細胞に希釈する。各免疫の間、各マウスに０．５ｍｌの細胞懸濁液を腹腔内注射する。１回目と２回目との免疫の間には、２週間の間隔があり、その後の各免疫の間には、３週間の間隔がある。１回目の免疫を除いて、各免疫の１週間後に採血し、ＥＬＩＳＡを使用して血清中の抗体価および特異性を検出する。
【0140】
Ｃ．免疫原３）免疫は、６～８週齢のハーバーヒト抗体トランスジェニックマウス（北京Ｗｅｉｔｏｎｇ Ｌｉｈｕａ社から購入）を使用し、マウスをＳＰＦ条件下で飼育する。すべてのマウスを遺伝子銃で腹部から３～４回、毎回３～４ショット、および１ショットあたり１．０μｇのｃＤＮＡ量で免疫する。最初の免疫と１回目の免疫強化の間には、２週間の間隔があり、その後の各免疫の間には、３週間の間隔がある。各免疫強化の７日後に採血し、ＥＬＩＳＡを使用して血清中の抗体価を検出する。
【0141】
通常、ほとんどのマウスのＥＬＩＳＡ力価は、２～３課の免疫後に１：１０００以上に達することができる。表３および図３は、ＴＩＭ－３－ｈＦＣタンパク質免疫血清の抗体価のＥＬＩＳＡ検出の結果である。
結果によると、免疫原で免疫した後、ほとんどのマウスのＥＬＩＳＡ力価は、３回の免疫後に１：１０００以上に達することができ、マウスは、免疫原に対してより良い体液性免疫反応を示し、その脾臓細胞は、ハイブリドーマ細胞の調製に使用されることができることを示す。
結果によると、免疫原で免疫した後、ほとんどのマウスのＥＬＩＳＡ力価は、３回の免疫後に１：１０００以上に達することができ、マウスは、免疫原に対してより良い体液性免疫反応を示し、その脾臓細胞は、ハイブリドーマ細胞の調製に使用されることができることを示す。
【0142】
力価が要件を満たすマウスは、細胞融合およびハイブリドーマの調製を選択的に行うことができる。細胞融合の前、マウスの最後の免疫は、それぞれ５０～１００μｇの精製ＴＩＭ－３－ｈＦｃを腹腔内注射する。３～５日後、マウスを犠牲にし、脾臓細胞を収集する。ＤＭＥＭ基本培地で１０００ｒｐｍで３回遠心分離して細胞を洗浄し、次に生細胞数の５：１の比率でマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣから購入）と混合し、高効率の電気融合またはＰＥＧ方法（酵素学の方法（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）、第２２０巻）を使用して細胞融合を行う。融合した細胞は、２０％ウシ胎児血清と１×ＨＡＴとを含むＤＭＥＭ培地に希釈され、前記パーセンテージは、質量パーセンテージである。次に、９６ウェル細胞培養プレートにウェルあたり１×１０５／２００μｌを加え、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに入れ、前記パーセンテージは、体積パーセンテージである。１４日後、ＥＬＩＳＡおよびＡｃｕｍｅｎ（マイクロウェルプレート細胞検出法）を使用して、細胞融合プレートの上清をスクリーニングし、ＥＬＩＳＡ中のＯＤ４５０ｎｍ＞１．０およびＡｃｕｍｅｎ中のＭＦＩ値＞１００の陽性クローンを、２４ウェルプレートに増幅し、１０％（ｗ／ｗ）ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（インビトロジェン）培地で、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２条件下で増殖させる。３日間培養した後、２４ウェルプレートで増殖させた培養液を遠心分離し、上清液を収集し、上清液に対して抗体サブタイプ分析を行う。ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳを使用して、ＴＩＭ－３タンパク質およびＴＩＭ－３陽性細胞に対する抗体の結合活性を決定する。
【0143】
２４ウェルプレートスクリーニングの結果によると、ＥＬＩＳＡ中のＯＤ４５０ｎｍ＞１．０およびＦＡＣＳ実験中のＭＦＩ値＞１００を選択したハイブリドーマ細胞が条件に適した陽性クローンであることを示す。条件に適したハイブリドーマ細胞を選択して、限界希釈法により９６ウェルプレートでサブクローニングし、１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（インビトロジェンから購入）で、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２条件下で培養する。サブクローニングの１０日後、ＥＬＩＳＡおよびＡｃｕｍｅｎを使用して予備スクリーニングを実施し、陽性モノクローンを選択して２４ウェルプレートに増幅し、培養ｗ尾続ける。３日後、ＦＡＣＳを使用して、抗原結合陽性を決定し、生物学的活性（評価基準は、ＥＬＩＳＡ実験中のＯＤ４５０ｎｍ＞１．０およびＦＡＣＳ実験中のＭＦＩ値＞１００）を評価する。
【0144】
２４ウェルプレートサンプルの検出結果によると、１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（インビトロジェンから購入）培地で、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２条件下で、陽性クローンを増殖し、細胞を凍結保存溶液［２０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳおよび１０％（ｗ／ｗ）ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ］に懸濁し、従来の方法に従って液体窒素中で凍結保存することによって本発明のハイブリドーマ細胞を得ることができ、その後の抗体産生、精製およびアミノ酸配列の測定に使用されることができる。
【0145】
実施例２：キメラ抗体の同定
（一）抗体とＴＩＭ－３タンパク質との結合の酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）検出
実施例１の段階に記載のヒトＴＩＭ－３タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列２２－２００（配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７１に示される）をヒトＩｇＧＦｃフラグメント（ｈＦｃ）付きｐＣｐＣベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、細胞培養液を収集し、精製してｈＦｃタグ付きヒトＴＩＭ－３タンパク質（ここでは、ｈＴＩＭ－３－ｈＦｃタンパク質と呼ばれる）を得、サルＴＩＭ－３タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列２２－２０１（配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７２に示される）をヒトＩｇＧＦｃフラグメント（ｈＦｃ）付きｐＣｐＣベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、細胞培養液を収集し、精製してｈＦｃタグ付きサルＴＩＭ－３タンパク質（ここでは、ｃＴＩＭ－３－ｈＦｃタンパク質と呼ばれる）を得、マウスＴＩＭ－３タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列２２－１９１（配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７３に示される）をヒトＩｇＧＦｃフラグメント（ｈＦｃ）付きｐＣｐＣベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、細胞培養液を収集し、精製してｈＦｃタグ付きマウスＴＩＭ－３タンパク質（ここでは、ｍＴＩＭ－３－ｈＦｃタンパク質と呼ばれる）を得る。精製されたヒト、サル、マウスＴＩＭ－３細胞外ドメインのタンパク質（ｈＴＩＭ－３－ｈＦｃ、ｃＴＩＭ－３－ｈＦｃ、ｍＴＩＭ－３－ｈＦｃ）は、ＰＢＳで最終濃度１．０μｇ／ｍｌに希釈され、次に、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにウェルあたり１００μｌを加える。プラスチックフィルムで覆い、４℃で一晩インキュベートし、翌日、プレートをプレート洗浄液（ＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、ブロッキング溶液（ＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０＋１％ＢＳＡ）を加えて、室温下で１～２時間ブロッキングする。ブロッキング溶液を注ぎ出し、各ウェルに５０～１００μｌの測定される抗体サンプルを加え、３７℃下で１～２時間インキュベートした後、プレートをプレート洗浄液（ＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２～３回洗浄する。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識二次抗体を加え、３７℃下で１～２時間インキュベートした後、プレートをプレート洗浄液（ＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２～３回洗浄する。１００μｌのＴＭＢ基質を各ウェルに加え、室温下で１５～３０分間インキュベートした後、１００μｌの停止溶液（１．０Ｎ ＨＣｌ）を各ウェルに加える。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＴｉｔｅｒＭａｘ３８４ｐｌｕｓ、分子デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ））を使用してＡ４５０ｎｍ値を読み取る。結果は、図４、図５および図６ならびに表４、表５および表６に示され、測定される抗体は、ヒトおよびサルＴＩＭ－３細胞外ドメインのタンパク質に様々な程度で結合することができるが、マウスＴＩＭ－３タンパク質に結合することができない。ここで、ＩｇＧ対照は、ラットＩｇＧであり、表のデータは、Ａ４５０ｎｍ値である。
（一）抗体とＴＩＭ－３タンパク質との結合の酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）検出
実施例１の段階に記載のヒトＴＩＭ－３タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列２２－２００（配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７１に示される）をヒトＩｇＧＦｃフラグメント（ｈＦｃ）付きｐＣｐＣベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、細胞培養液を収集し、精製してｈＦｃタグ付きヒトＴＩＭ－３タンパク質（ここでは、ｈＴＩＭ－３－ｈＦｃタンパク質と呼ばれる）を得、サルＴＩＭ－３タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列２２－２０１（配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７２に示される）をヒトＩｇＧＦｃフラグメント（ｈＦｃ）付きｐＣｐＣベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、細胞培養液を収集し、精製してｈＦｃタグ付きサルＴＩＭ－３タンパク質（ここでは、ｃＴＩＭ－３－ｈＦｃタンパク質と呼ばれる）を得、マウスＴＩＭ－３タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列２２－１９１（配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７３に示される）をヒトＩｇＧＦｃフラグメント（ｈＦｃ）付きｐＣｐＣベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、細胞培養液を収集し、精製してｈＦｃタグ付きマウスＴＩＭ－３タンパク質（ここでは、ｍＴＩＭ－３－ｈＦｃタンパク質と呼ばれる）を得る。精製されたヒト、サル、マウスＴＩＭ－３細胞外ドメインのタンパク質（ｈＴＩＭ－３－ｈＦｃ、ｃＴＩＭ－３－ｈＦｃ、ｍＴＩＭ－３－ｈＦｃ）は、ＰＢＳで最終濃度１．０μｇ／ｍｌに希釈され、次に、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにウェルあたり１００μｌを加える。プラスチックフィルムで覆い、４℃で一晩インキュベートし、翌日、プレートをプレート洗浄液（ＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、ブロッキング溶液（ＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０＋１％ＢＳＡ）を加えて、室温下で１～２時間ブロッキングする。ブロッキング溶液を注ぎ出し、各ウェルに５０～１００μｌの測定される抗体サンプルを加え、３７℃下で１～２時間インキュベートした後、プレートをプレート洗浄液（ＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２～３回洗浄する。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識二次抗体を加え、３７℃下で１～２時間インキュベートした後、プレートをプレート洗浄液（ＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２～３回洗浄する。１００μｌのＴＭＢ基質を各ウェルに加え、室温下で１５～３０分間インキュベートした後、１００μｌの停止溶液（１．０Ｎ ＨＣｌ）を各ウェルに加える。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＴｉｔｅｒＭａｘ３８４ｐｌｕｓ、分子デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ））を使用してＡ４５０ｎｍ値を読み取る。結果は、図４、図５および図６ならびに表４、表５および表６に示され、測定される抗体は、ヒトおよびサルＴＩＭ－３細胞外ドメインのタンパク質に様々な程度で結合することができるが、マウスＴＩＭ－３タンパク質に結合することができない。ここで、ＩｇＧ対照は、ラットＩｇＧであり、表のデータは、Ａ４５０ｎｍ値である。
【0146】
【表11】
【0147】
【表12】
【0148】
【表13】
【0149】
（二）抗体とＴＩＭ－３発現細胞との結合のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）検出
実施例１に記載のヒト由来のＴＩＭ－３をコードする全長ヌクレオチド配列を含むｐＩＲＥＳプラスミドでＣＨＯＫ１細胞株をトランスフェクトして、ヒトＴＩＭ－３を含むＣＨＯＫ１を安定にトランスフェクトされた細胞株（ここでは、ＣＨＯＫ１－ｈＴＩＭ－３安定細胞株と呼ばれる）を得、サル由来のＴＩＭ－３全長遺伝子付きｐＩＲＥＳプラスミドを、ＣＨＯＫ１細胞株にトランスフェクトして、サルＴＩＭ－３を含むＣＨＯＫ１を安定にトランスフェクトされた細胞株（ここでは、ＣＨＯＫ１－ｃＴＩＭ－３安定細胞株と呼ばれる）を得る。Ｔ－７５細胞培養フラスコでＣＨＯＫ１－ｈＴＩＭ－３安定細胞株およびＣＨＯＫ１－ｃＴＩＭ－３安定細胞株を９０％のコンフルエンスまで増殖させ、培地を完全に吸収し、ＨＢＳＳ（ハンクスの平衡塩類溶液（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ））で１～２回洗浄し、次に、酵素を含まない細胞解離溶液（バーゼン溶液：ライフテクノロジー（Ｖｅｒｓｅｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））で細胞を処理および収集する。ＨＢＳＳ緩衝液で細胞を１～２回洗浄し、細胞をカウントした後、細胞をＨＢＳＳで１ｍｌあたり１～２ｘ１０６細胞に希釈し、１％のヤギ血清ブロッキング溶液を加え、氷上で２０～３０分間インキュベートし、次に、ＨＢＳＳで遠心分離して２回洗浄する。収集した細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＨＢＳＳ＋１％ＢＳＡ）で２ｘ１０６細胞／ｍｌに懸濁し、９６ウェルＦＡＣＳ反応プレートにウェルあたり１００μｌを加え、各ウェルに１００μｌの測定される抗体サンプルを加え、氷上で１～２時間インキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液で遠心分離して２回洗浄し、ウェルあたり１００μｌの蛍光（Ａｌｅｘａ４８８）標識二次抗体を加え、氷上で０．５～１．０時間インキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液で遠心分離して２～３回洗浄し、ウェルあたり１００μｌの固定液（４％パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ））を加えて細胞を懸濁し、５～１０分後、ＦＡＣＳ緩衝液で遠心分離して１～２回洗浄する。１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を懸濁し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ）を使用して、結果を検出および分析する。結果は、図７および図８ならびに表７および表８に示され、ここで、ＩｇＧ対照は、ラットＩｇＧであり、表のデータは、ＭＦＩによって測定された細胞集団の平均蛍光強度値である。結果によると、測定される抗体が細胞表面のヒトまたはサルＴＩＭ－３タンパク質に結合することができることを示す。
実施例１に記載のヒト由来のＴＩＭ－３をコードする全長ヌクレオチド配列を含むｐＩＲＥＳプラスミドでＣＨＯＫ１細胞株をトランスフェクトして、ヒトＴＩＭ－３を含むＣＨＯＫ１を安定にトランスフェクトされた細胞株（ここでは、ＣＨＯＫ１－ｈＴＩＭ－３安定細胞株と呼ばれる）を得、サル由来のＴＩＭ－３全長遺伝子付きｐＩＲＥＳプラスミドを、ＣＨＯＫ１細胞株にトランスフェクトして、サルＴＩＭ－３を含むＣＨＯＫ１を安定にトランスフェクトされた細胞株（ここでは、ＣＨＯＫ１－ｃＴＩＭ－３安定細胞株と呼ばれる）を得る。Ｔ－７５細胞培養フラスコでＣＨＯＫ１－ｈＴＩＭ－３安定細胞株およびＣＨＯＫ１－ｃＴＩＭ－３安定細胞株を９０％のコンフルエンスまで増殖させ、培地を完全に吸収し、ＨＢＳＳ（ハンクスの平衡塩類溶液（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ））で１～２回洗浄し、次に、酵素を含まない細胞解離溶液（バーゼン溶液：ライフテクノロジー（Ｖｅｒｓｅｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））で細胞を処理および収集する。ＨＢＳＳ緩衝液で細胞を１～２回洗浄し、細胞をカウントした後、細胞をＨＢＳＳで１ｍｌあたり１～２ｘ１０６細胞に希釈し、１％のヤギ血清ブロッキング溶液を加え、氷上で２０～３０分間インキュベートし、次に、ＨＢＳＳで遠心分離して２回洗浄する。収集した細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＨＢＳＳ＋１％ＢＳＡ）で２ｘ１０６細胞／ｍｌに懸濁し、９６ウェルＦＡＣＳ反応プレートにウェルあたり１００μｌを加え、各ウェルに１００μｌの測定される抗体サンプルを加え、氷上で１～２時間インキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液で遠心分離して２回洗浄し、ウェルあたり１００μｌの蛍光（Ａｌｅｘａ４８８）標識二次抗体を加え、氷上で０．５～１．０時間インキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液で遠心分離して２～３回洗浄し、ウェルあたり１００μｌの固定液（４％パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ））を加えて細胞を懸濁し、５～１０分後、ＦＡＣＳ緩衝液で遠心分離して１～２回洗浄する。１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を懸濁し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ）を使用して、結果を検出および分析する。結果は、図７および図８ならびに表７および表８に示され、ここで、ＩｇＧ対照は、ラットＩｇＧであり、表のデータは、ＭＦＩによって測定された細胞集団の平均蛍光強度値である。結果によると、測定される抗体が細胞表面のヒトまたはサルＴＩＭ－３タンパク質に結合することができることを示す。
【0150】
【表14】
【0151】
【表15】
【0152】
（三）リンパ球活性に対するＴＩＭ－３抗体の影響のリンパ球刺激実験検出
リンパ球刺激実験は、ＴＩＭ－３抗体がＴＩＭ－３タンパク質とその受容体の結合をブロックしてＴリンパ球活性の阻害を解除することにより、Ｔ細胞の増殖を刺激することを検出する。
リンパ球刺激実験は、ＴＩＭ－３抗体がＴＩＭ－３タンパク質とその受容体の結合をブロックしてＴリンパ球活性の阻害を解除することにより、Ｔ細胞の増殖を刺激することを検出する。
【0153】
１．フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）は、全血を分離して、末梢血単核リンパ球ＰＢＭＣを得る。
新たに得られた全血をリン酸緩衝液ＰＢＳで１：１の容量比で希釈して、希釈した全血を得、滅菌ピペットを使用して、希釈した全血をフィコールの溶液表面（ＧＥヘルスケアから購入）に静かに広げ、フィコールと希釈した全血の容量比は、３：４であり、振とうおよび混合を避け、４００ｇのｒｍｐ、室温、２０℃の勾配で３０分間遠心分離し、遠心分離した後の遠心分離チューブは、３層に分かれ、上層は、血漿であり、中間の乳白色の層は、単核リンパ球である。滅菌ピペットを使用して中間層の細胞を静かに吸取り、新しい遠心分離チューブに収集し、ＰＢＳリン酸緩衝液で３倍の体積に希釈し、室温下で１００ｇのｒｍｐで１０分間遠心分離し、上清を捨てる。リンパ球をＰＢＳリン酸緩衝液で１０ｍＬに再懸濁し、前の段階を繰り返して血小板を除去する。最後に、リンパ球を使用するための１０％ウシ胎児血清を含む１０ｍＬの複数の成分ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェンから購入）に再懸濁し、即ち、末梢血単核リンパ球ＰＢＭＣであり、前記パーセンテージは、質量パーセンテージである。
新たに得られた全血をリン酸緩衝液ＰＢＳで１：１の容量比で希釈して、希釈した全血を得、滅菌ピペットを使用して、希釈した全血をフィコールの溶液表面（ＧＥヘルスケアから購入）に静かに広げ、フィコールと希釈した全血の容量比は、３：４であり、振とうおよび混合を避け、４００ｇのｒｍｐ、室温、２０℃の勾配で３０分間遠心分離し、遠心分離した後の遠心分離チューブは、３層に分かれ、上層は、血漿であり、中間の乳白色の層は、単核リンパ球である。滅菌ピペットを使用して中間層の細胞を静かに吸取り、新しい遠心分離チューブに収集し、ＰＢＳリン酸緩衝液で３倍の体積に希釈し、室温下で１００ｇのｒｍｐで１０分間遠心分離し、上清を捨てる。リンパ球をＰＢＳリン酸緩衝液で１０ｍＬに再懸濁し、前の段階を繰り返して血小板を除去する。最後に、リンパ球を使用するための１０％ウシ胎児血清を含む１０ｍＬの複数の成分ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェンから購入）に再懸濁し、即ち、末梢血単核リンパ球ＰＢＭＣであり、前記パーセンテージは、質量パーセンテージである。
【0154】
２．ＯＫＴ３を媒介したＰＢＭＣ細胞の事前刺激実験
市販のＯＫＴ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃａｔ＃ １６－００３７－８１）をＰＢＳで最終濃度１．０μｇ／ｍｌに希釈し、次に、ウェルあたり２ｍｌを６ウェル細胞培養プレートに加える。プラスチックフィルムで覆い、４℃で一晩インキュベートし、翌日ＰＢＳで３回洗浄し、分離して得られたＰＢＭＣ細胞を６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで７２時間培養する。
市販のＯＫＴ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃａｔ＃ １６－００３７－８１）をＰＢＳで最終濃度１．０μｇ／ｍｌに希釈し、次に、ウェルあたり２ｍｌを６ウェル細胞培養プレートに加える。プラスチックフィルムで覆い、４℃で一晩インキュベートし、翌日ＰＢＳで３回洗浄し、分離して得られたＰＢＭＣ細胞を６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで７２時間培養する。
【0155】
３．ＣＨＯＫ１－ＯＳ８細胞のマイトマイシン処理
抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をマウスＣＤ８ａ Ｃ－末端ドメイン（１１３－２２０）に融合させて、膜錯定キメラ抗体（ＯＳ８）であるΤ細胞コンジュゲートを構築し、当該マウスＣＤ８ａのＣ末端ドメインは、ヒンジ、膜貫通および細胞質ドメインを含むことにより、抗ＣＤ３ｓｃＦｖフラグメントをＴ細胞活性化因子として細胞表面に錯定する。組換え融合タンパク質ＯＳ８を発現するプラスミドトをＣＨＯＫ１細胞株にランスフェクトして、細胞表面にＯＳ８（Ｔ細胞活性化分子）を発現するＣＨＯＫ１を安定にトランスフェクトされた細胞株（ここでは、ＣＨＯＫ１－ＯＳ８安定細胞株と呼ばれる）を得る。使用前に、ＣＨＯＫ１－ＯＳ８細胞を１０μｇ／ｍｌマイトマイシンで３７℃で２時間、ＰＢＳで３回洗浄して残留マイトマイシンを除去する。
抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をマウスＣＤ８ａ Ｃ－末端ドメイン（１１３－２２０）に融合させて、膜錯定キメラ抗体（ＯＳ８）であるΤ細胞コンジュゲートを構築し、当該マウスＣＤ８ａのＣ末端ドメインは、ヒンジ、膜貫通および細胞質ドメインを含むことにより、抗ＣＤ３ｓｃＦｖフラグメントをＴ細胞活性化因子として細胞表面に錯定する。組換え融合タンパク質ＯＳ８を発現するプラスミドトをＣＨＯＫ１細胞株にランスフェクトして、細胞表面にＯＳ８（Ｔ細胞活性化分子）を発現するＣＨＯＫ１を安定にトランスフェクトされた細胞株（ここでは、ＣＨＯＫ１－ＯＳ８安定細胞株と呼ばれる）を得る。使用前に、ＣＨＯＫ１－ＯＳ８細胞を１０μｇ／ｍｌマイトマイシンで３７℃で２時間、ＰＢＳで３回洗浄して残留マイトマイシンを除去する。
【0156】
４．ＣＨＯＫ１－ＯＳ８を媒介したＰＢＭＣ刺激実験
試験前に、測定されるＴＩＭ－３抗体を等量比に希釈して調製して、測定されるサンプル溶液を得る。
事前に刺激された末梢血単核リンパ球ＰＢＭＣをウェルあたり１００μｌの１×１０５細胞で９６ウェル細胞培養プレートに広げ、次に、前記測定されるサンプル溶液を培養プレートに加え、室温下で３０分間培養する。最後に、ＣＨＯＫ１－ＯＳ８細胞を加え、ウェルあたり５０μｌの２．５×１０４細胞で９６ウェル細胞培養プレートに広げて、各反応ウェルが２００μＬ体積になるようにし、反応プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２０時間培養した後上清を収集して、細胞上清液を得、－２０℃で凍結保存し、前記パーセンテージは、体積パーセンテージである。
試験前に、測定されるＴＩＭ－３抗体を等量比に希釈して調製して、測定されるサンプル溶液を得る。
事前に刺激された末梢血単核リンパ球ＰＢＭＣをウェルあたり１００μｌの１×１０５細胞で９６ウェル細胞培養プレートに広げ、次に、前記測定されるサンプル溶液を培養プレートに加え、室温下で３０分間培養する。最後に、ＣＨＯＫ１－ＯＳ８細胞を加え、ウェルあたり５０μｌの２．５×１０４細胞で９６ウェル細胞培養プレートに広げて、各反応ウェルが２００μＬ体積になるようにし、反応プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２０時間培養した後上清を収集して、細胞上清液を得、－２０℃で凍結保存し、前記パーセンテージは、体積パーセンテージである。
【0157】
５．細胞上清中のサイトカインインターロイキンＩＦＮ酵素結合免疫吸着試験
細胞上清中のサイトカインインターフェロンＩＦＮ－γ酵素結合免疫吸着試験は、Ｒ＆Ｄシステム関連の検出キットヒト（ｈｕｍａｎ）ＩＦＮ－γＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（ＤＹ２８５）を使用し、かつ取扱説明書に従って操作する。検出抗体を除くすべての検出試薬は、検出キットによって提供される。
細胞上清中のサイトカインインターフェロンＩＦＮ－γ酵素結合免疫吸着試験は、Ｒ＆Ｄシステム関連の検出キットヒト（ｈｕｍａｎ）ＩＦＮ－γＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（ＤＹ２８５）を使用し、かつ取扱説明書に従って操作する。検出抗体を除くすべての検出試薬は、検出キットによって提供される。
【0158】
細胞上清中のサイトカインＩＦＮ－γ含有量を測定する酵素結合免疫吸着試験は、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムから購入、ＩＦＮ－γ Ｃａｔ＃ ＤＹ２８５）を使用する。実験操作は、キットの取扱説明書の要件に従い、すべての検出試薬は、キットによって提供される。具体的な実験の簡単な説明は、次のとおりである。ＩＦＮ－γポリクローナル抗体をＥＬＩＳＡマイクロウェルプレートにコーティングし、プラスチックフィルムで覆い、４℃で一晩インキュベートし、翌日プレートをプレート洗浄液で４回洗浄し、ブロッキング溶液を加えて、室温下で１～２時間ブロッキングする。プレートをプレート洗浄液で４回洗浄し、段階４で得られた細胞上清液を測定されるサンプルとして使用し、標準品および測定されるサンプルを加えて、室温下で２時間インキュベートする。各ウェルに４００μｌの洗浄液を加え、プレート洗浄を４回繰り返し、抗ヒトＩＦＮ－γの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体を加え、室温下で２時間インキュベートし、マイクロウェルプレート上のＩＦＮ－γト免疫複合体を形成し、マイクロウェルを洗浄し、発色用の基質を加え、室温下で３０分間光を避け、最後に停止溶液を加え、マイクロプレートリーダーでＡ４５０ｎｍの吸光度を測定する。
【0159】
前記ＰＢＭＣ刺激実験におけるＩＦＮ－γ分泌に対するＴＩＭ－３抗体の影響を検出する。結果は、図９および表９に示される。ここで、ＩｇＧ対照は、ラットＩｇＧであり、表のデータは、ＩＦＮ－γ値（ｐｇ／ｍＬ）である。
結果によると、ＰＢＭＣリンパ球刺激試験において、測定される抗体がＰＢＭＣのＩＦＮ－γ分泌を増強することができることを示す。
【表16】
【0160】
実施例３．軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列の測定
全ＲＮＡの単離：実施例１のサブクローン培養から得られた上清液の抗原結合（即ち、実施例２の検証および活性の測定後）を検出した後、遠心分離により５×１０７ハイブリドーマ細胞を収集し、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌを加えて均等に混合しかつ１．５ｍＬの遠心分離チューブに移し、室温下で５分間静置する。０．２ｍＬのクロロホルムを加え、１５秒間振とうし、２分間静置した後、４℃、１２０００ｇで５分間遠心分離し、上清を取り、新しい１．５ｍＬ遠心分離チューブに移す。０．５ｍＬのイソプロパノールを加え、チューブ内の液体を穏やかに均等に混合し、室温下で１０分間静置した後、４℃、１２０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を捨てる。１ｍＬの７５％エタノール（前記パーセンテージは、体積パーセンテージであり）を加え、ペレットを穏やかに洗浄し、４℃、１２０００ｇで５分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿物を乾燥させ、ＤＥＰＣ処理したＨ２Ｏを加えて溶解し（５５℃の水浴は、溶解を１０分間促進する）、全ＲＮＡを得る。
全ＲＮＡの単離：実施例１のサブクローン培養から得られた上清液の抗原結合（即ち、実施例２の検証および活性の測定後）を検出した後、遠心分離により５×１０７ハイブリドーマ細胞を収集し、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌを加えて均等に混合しかつ１．５ｍＬの遠心分離チューブに移し、室温下で５分間静置する。０．２ｍＬのクロロホルムを加え、１５秒間振とうし、２分間静置した後、４℃、１２０００ｇで５分間遠心分離し、上清を取り、新しい１．５ｍＬ遠心分離チューブに移す。０．５ｍＬのイソプロパノールを加え、チューブ内の液体を穏やかに均等に混合し、室温下で１０分間静置した後、４℃、１２０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を捨てる。１ｍＬの７５％エタノール（前記パーセンテージは、体積パーセンテージであり）を加え、ペレットを穏やかに洗浄し、４℃、１２０００ｇで５分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿物を乾燥させ、ＤＥＰＣ処理したＨ２Ｏを加えて溶解し（５５℃の水浴は、溶解を１０分間促進する）、全ＲＮＡを得る。
【0161】
逆転写およびＰＣＲ：１μｇの全ＲＮＡを取り、２０μｌのシステムを構成し、逆転写酵素を加えた後、４２℃下で６０分間反応させ、７℃下で１０分間反応させて、反応を停止させる。１μｌのｃＤＮＡ、２５ｐｍｏｌの各プライマー、１μｌのＤＮＡポリメラーゼおよびマッチングされる緩和システム、２５０μｍｏｌのｄＮＴＰｓを含む、５０μｌのＰＣＲシステムを構成する。ＰＣＲプログラムを設定し、９５℃で３分間の前変性、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３５秒間の伸長、３５サイクル後、ＰＣＲ産物を得るために７２℃で５分間の伸長を追加する。ここで、逆転写に使用されるキットは、タカラ（Ｔａｋａｒａ）から購入したＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘであり、カタログ番号は、ＲＲ０３６であり、ＰＣＲに使用されるキットは、ＮＥＢから購入したＱ５超忠実度酵素であり、カタログ番号は、Ｍ０４９２である。
【0162】
クローニングおよびシーケンシング：５μｌのＰＣＲ産物を取ってアガロースゲル電気泳動検出し、カラム回収キットを使用して検出陽性サンプルを精製し、ここで、回収キットは、ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬから購入したＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） Ｇｅｌ ＆ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐであり、カタログ番号は、７４０６０９である。次のようなライゲーション反応を実行する。５０ｎｇのサンプル、５０ｎｇのＴベクター、０．５μｌのリガーゼ、１μｌの緩衝液、１０μｌの反応システムを１６℃下で、３０分間反応させてライゲーション産物を得、ここで、ライゲーションキットは、ＮＥＢから購入したＴ４ ＤＮＡリガーゼであり、カタログ番号は、Ｍ０４０２であり、５μｌのライゲーション産物を取り出し、１００μｌのコンピテント細胞（Ｅｃｏｓ １０１ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、Ｙｅａｓｔｅｒｎから購入し、カタログ番号は、ＦＹＥ６０７である）を加え、５分間氷浴する。次に、４２℃の水浴で１分間熱ショックし、氷上に１分間戻し、６５０μｌの抗生物質を含まないＳＯＣ培地を加え、３７℃下でシェーカーで２００ＲＰＭの速度で３０分間蘇生し、２００μｌを取り出し、抗生物質を含むＬＢ固体培地にコーティングし、３７℃でインキュベーターで一晩培養する。翌日、ＴベクターのプライマーＭ１３ＦおよびＭ１３Ｒを使用して、コロニーＰＣＲ用の３０μｌのＰＣＲシステムを構成し、ピペットチップを使用してコロニーをＰＣＲ反応システムに浸して吸引し、菌株を保存するために、１００ｎＭのアンピシリンを含む別のＬＢ固体培養皿に０．５μｌのスポットを吸引する。ＰＣＲ反応終了後、５μｌを取り出し、アガロースゲル電気泳動検出し、陽性サンプルをシーケンシングする。ここで、シーケンシングの段階は、Ｋａｂａｔら、免疫学的に関心のあるたんぱく質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、メリーランド州（Ｍｄ．）（１９９１）を参照する。
シーケンシング結果によると、本発明の配列情報の付録に示され、重鎖ＣＤＲ１－３および軽鎖ＣＤＲ１－３の七つのクローン配列情報は、表１８に示される。
シーケンシング結果によると、本発明の配列情報の付録に示され、重鎖ＣＤＲ１－３および軽鎖ＣＤＲ１－３の七つのクローン配列情報は、表１８に示される。
【0163】
実施例４：完全ヒト抗体ＩｇＧの形質転換および調製
（一）プラスミドの構築および調製：実施例２では、すでにハイブリドーマ細胞の培養上清液から精製ＴＩＭ－３抗体を得ており、実施例３のシーケンシング結果に基づいて、ＴＩＭ－３抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列を明らかにした。ＴＩＭ－３抗体の重鎖可変領域配列をシグナルペプチドおよびヒト重鎖抗体ＩｇＧ４定常領域を含む発現ベクター（ここで、発現ベクターは、インビトロジェンから購入）に組換え、ＴＩＭ－３抗体の軽鎖可変領域配列をシグナルペプチドおよびヒト抗体軽鎖カッパ（ｋａｐｐａ）定常領域を含む発現ベクターに組換えて、組換えプラスミドを得、かつシーケンシングによって検証される（シーケンシング方法は、実施例３のシーケンシング方法と同じである）。アルカリ溶解法キット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬから購入）を使用して、純度が向上された組換えプラスミドを中度の量でポンピングし、質量は、５００μｇ以上であり、０．２２μｍのフィルターメンブレン（ミロポア（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ）から購入）でろ過して、トランスフェクションに使用される。
（一）プラスミドの構築および調製：実施例２では、すでにハイブリドーマ細胞の培養上清液から精製ＴＩＭ－３抗体を得ており、実施例３のシーケンシング結果に基づいて、ＴＩＭ－３抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列を明らかにした。ＴＩＭ－３抗体の重鎖可変領域配列をシグナルペプチドおよびヒト重鎖抗体ＩｇＧ４定常領域を含む発現ベクター（ここで、発現ベクターは、インビトロジェンから購入）に組換え、ＴＩＭ－３抗体の軽鎖可変領域配列をシグナルペプチドおよびヒト抗体軽鎖カッパ（ｋａｐｐａ）定常領域を含む発現ベクターに組換えて、組換えプラスミドを得、かつシーケンシングによって検証される（シーケンシング方法は、実施例３のシーケンシング方法と同じである）。アルカリ溶解法キット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬから購入）を使用して、純度が向上された組換えプラスミドを中度の量でポンピングし、質量は、５００μｇ以上であり、０．２２μｍのフィルターメンブレン（ミロポア（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ）から購入）でろ過して、トランスフェクションに使用される。
【0164】
（二）細胞トランスフェクション：
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）（インビトロジェンから購入）で２９３Ｅ細胞（インビトロジェンから購入）を培養する。シェーカーは、３７℃、１３０ＲＰＭ、８％ＣＯ２（ｖ／ｖ）濃度に設定する。
トランスフェクションの場合、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地に、１０％（ｖ／ｖ）Ｆ６８（インビトロジェンから購入）を最終濃度０．１％（ｖ／ｖ）Ｆ６８まで添加して、０．１％（ｖ／ｖ）Ｆ６８を含むＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地、即ち、培地Ａを得る。
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）（インビトロジェンから購入）で２９３Ｅ細胞（インビトロジェンから購入）を培養する。シェーカーは、３７℃、１３０ＲＰＭ、８％ＣＯ２（ｖ／ｖ）濃度に設定する。
トランスフェクションの場合、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地に、１０％（ｖ／ｖ）Ｆ６８（インビトロジェンから購入）を最終濃度０．１％（ｖ／ｖ）Ｆ６８まで添加して、０．１％（ｖ／ｖ）Ｆ６８を含むＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地、即ち、培地Ａを得る。
【0165】
５ｍＬの培地Ａおよび２００μｇ／ｍＬのＰＥＩ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）から購入）を取り、均等に混合して培地Ｂを得る。５ｍＬ培地Ａおよび段階（１）で得られた１００μｇ／ｍＬの組換えプラスミドを取り、均等に混合して培地Ｃを得る。５分後、培地Ｂおよび培地Ｃを合わせて均等に混合し、１５分間静置して、混合液Ｄを得る。２９３Ｅの細胞密度が１．５×１０６／ｍＬになるまで、１０ｍＬの混合液Ｄを２９３Ｅ細胞を含む１００ｍＬの培地Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地にゆっくりと加え、ＰＥＩが過剰に濃縮されないように、加えながら浸透させ、シェーカーに入れて培養する。翌日、最終濃度が０．５％（ｗ／ｖ）になるまでにペプトンを加える。５～７日目に、培養液の抗体価を測定する。６～７日目に、遠心分離（３５００ＲＰＭ、３０分間）して上清を収集し、０．２２μｍのフィルターメンブレンでろ過して、精製用のろ過された細胞上清液を得る。
【0166】
（三）抗体の精製：エンドトキシンフリーのクロマトグラフィーカラムおよびタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ）Ａフィラー（ＧＥから購入）を連続生産するには、０．１Ｍ ＮａＯＨで３０分間処理するか、または五つのカラム体積の０．５Ｍ ＮａＯＨでリンスする。長期間使用されていないカラム材料およびクロマトグラフィーカラムの場合、１Ｍ ＮａＯＨを使用して少なくとも１時間浸し、エンドトキシンフリーの水で中性になるまでリンスし、１０倍のカラム体積の１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ×１００でカラム材料を洗浄する。五つのカラム体積のＰＢＳ（ＰＢＳリン酸緩衝液、ｐＨ７．２）使用して平衡化し、段階（２）で得られたろ過細胞上清液をカラムにロードし、必要に応じてフロースルー溶液を収集する。カラムにロードした後、５倍カラム体積のＰＢＳで洗浄する。５倍カラム体積の０．１Ｍ、ｐＨ３．０のグリシン－ＨＣｌで溶出し、溶出液を収集し、０．５倍カラム体積の溶出液のｐＨ８．５の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１．５Ｍ ＮａＣｌ）で中和し、完全ヒトＴＩＭ－３抗体を得る。前記使用されるすべての溶液は、新たに調製する必要がある。完全ヒトＴＩＭ－３抗体を得た後、エンドトキシン汚染を避けるために、１×ＰＢＳで４時間透析する。透析終了後、分光光度またはキットを使用して濃度を測定し、ＨＰＬＣ－ＳＥＣを使用して抗体の純度を測定し、エンドトキシン検出キット（ロンザ（Ｌｏｎｚａ）から購入）を使用して、抗体エンドトキシン含有量を検出する。
【0167】
実施例５．完全ヒトＴＩＭ－３抗体の同定
（一）抗体とＴＩＭ－３タンパク質との結合の酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）検出
結果は、図１０、図１１および図１２、ならびに表１０、表１１および表１２に示される。ここで、ＩｇＧ対照は、ヒトＩｇＧであり、表のデータは、Ａ４５０ｎｍ値である。
（一）抗体とＴＩＭ－３タンパク質との結合の酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）検出
結果は、図１０、図１１および図１２、ならびに表１０、表１１および表１２に示される。ここで、ＩｇＧ対照は、ヒトＩｇＧであり、表のデータは、Ａ４５０ｎｍ値である。
【0168】
【表17】
【0169】
【表18】
【0170】
【表19】
【0171】
結果によると、完全ヒトＴＩＭ－３抗体がヒトおよびサルＴＩＭ－３細胞外ドメインのタンパク質に結合することができるが、マウスＴＩＭ－３タンパク質には結合することができないことを示す。各抗体の活性は、同等であり、抗体がＴＩＭ－３に対して強い結合能力を備えていることを示す。
【0172】
（二）抗体とＴＩＭ－３発現細胞との結合のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）検出
結果は、図１３および図１４、ならびに表１３および表１４に示される。ここで、ＩｇＧ対照は、人ＩｇＧであり、表のデータは、ＭＦＩによって測定される細胞集団の平均蛍光強度値である。
結果は、図１３および図１４、ならびに表１３および表１４に示される。ここで、ＩｇＧ対照は、人ＩｇＧであり、表のデータは、ＭＦＩによって測定される細胞集団の平均蛍光強度値である。
【0173】
【表20】
【0174】
【表21】
【0175】
結果によると、完全ヒトＴＩＭ－３抗体は、細胞表面のヒトおよびサルＴＩＭ－３タンパク質に様々な程度で結合することができることを示す。
【0176】
（三）ＴＩＭ－３抗体がＴＩＭ－３とそのリガンドホスファチジルセリンとの結合をブロックするためのＴＩＭ－３受容体リガンド結合実験検出
細胞アポトーシスを誘導するために、１μＭのスタウロスポリンを使用して３７℃下でジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞を２時間処理する。アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ－ＦＩＴＣ細胞アポトーシス検出キットを使用して、ホスファチジルセリンの存在を検出する。ｈＴＩＭ－３－ｈＦｃは、スタウロスポリンで処理されたジャーカット細胞に強く結合するが、未処理のジャーカット細胞には結合しない。ＰＢＳ緩衝液で細胞を１～２回洗浄し、細胞をカウントした後、結合緩衝液で細胞を１ｍｌあたり１～２×１０６細胞に希釈し、９６ウェルＦＡＣＳ反応プレートにウェルあたり１００μｌを加える。測定される抗体サンプルおよび２μｇ／ｍｌのｈＴＩＭ－３－ｈＦｃタンパク質を結合緩衝液で調製し、等体積で混合する。混合物を室温下で３０分間インキュベートした後、アポトーシス細胞をインキュベートするためのＦＡＣＳ反応プレートを遠心分離して上清を捨て、上記混合物をウェルあたり１００μｌに従ってアポトーシス細胞に加え、室温下で１時間インキュベートする。結合緩衝液で遠心分離して２回洗浄し、ウェルあたり１００μｌの蛍光（Ａｌｅｘａ４８８）標識二次抗体を加え、０．５時間インキュベートする。結合緩衝液で遠心分離して２～３回洗浄し、ウェルあたり１００μｌのＰＢＳ懸濁細胞を加え、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ）を使用して結果を検出および分析する。結果は、表１５および図１５に示され、ここで、ＩｇＧ対照は、ヒトＩｇＧであり、表のデータは、阻害率（％）である。
細胞アポトーシスを誘導するために、１μＭのスタウロスポリンを使用して３７℃下でジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞を２時間処理する。アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ－ＦＩＴＣ細胞アポトーシス検出キットを使用して、ホスファチジルセリンの存在を検出する。ｈＴＩＭ－３－ｈＦｃは、スタウロスポリンで処理されたジャーカット細胞に強く結合するが、未処理のジャーカット細胞には結合しない。ＰＢＳ緩衝液で細胞を１～２回洗浄し、細胞をカウントした後、結合緩衝液で細胞を１ｍｌあたり１～２×１０６細胞に希釈し、９６ウェルＦＡＣＳ反応プレートにウェルあたり１００μｌを加える。測定される抗体サンプルおよび２μｇ／ｍｌのｈＴＩＭ－３－ｈＦｃタンパク質を結合緩衝液で調製し、等体積で混合する。混合物を室温下で３０分間インキュベートした後、アポトーシス細胞をインキュベートするためのＦＡＣＳ反応プレートを遠心分離して上清を捨て、上記混合物をウェルあたり１００μｌに従ってアポトーシス細胞に加え、室温下で１時間インキュベートする。結合緩衝液で遠心分離して２回洗浄し、ウェルあたり１００μｌの蛍光（Ａｌｅｘａ４８８）標識二次抗体を加え、０．５時間インキュベートする。結合緩衝液で遠心分離して２～３回洗浄し、ウェルあたり１００μｌのＰＢＳ懸濁細胞を加え、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ）を使用して結果を検出および分析する。結果は、表１５および図１５に示され、ここで、ＩｇＧ対照は、ヒトＩｇＧであり、表のデータは、阻害率（％）である。
【0177】
【表22】
【0178】
（四）リンパ球活性に対するＴＩＭ－３抗体の影響を検出するためのリンパ球刺激実験検出
リンパ球刺激実験は、ＴＩＭ－３抗体がＴＩＭ－３タンパク質とその受容体との結合をブロックしてＴリンパ球活性に対する阻害を解除することにより、Ｔ細胞の増殖を刺激することを検出する。
結果は、図１６および図１７、ならびに表１６および表１７に示され、本試験では、二人のドナーからのＰＢＭＣ細胞を使用し、結果は、基本的に一致している。ここで、ｈＩｇＧ対照は、ヒト人ＩｇＧであり、表のデータは、ＩＦＮ－γ値（ｐｇ／ｍＬ）である。
リンパ球刺激実験は、ＴＩＭ－３抗体がＴＩＭ－３タンパク質とその受容体との結合をブロックしてＴリンパ球活性に対する阻害を解除することにより、Ｔ細胞の増殖を刺激することを検出する。
結果は、図１６および図１７、ならびに表１６および表１７に示され、本試験では、二人のドナーからのＰＢＭＣ細胞を使用し、結果は、基本的に一致している。ここで、ｈＩｇＧ対照は、ヒト人ＩｇＧであり、表のデータは、ＩＦＮ－γ値（ｐｇ／ｍＬ）である。
【0179】
【表23】
【0180】
【表24】
【0181】
（五）抗体親和性の検出試験
まず、ＡＨＣセンサーを選択し、緩衝液でセンサーを１０分間平衡化し、次に緩衝液で測定される抗体を５μｇ／ｍｌに希釈し、センサーで抗体を３～５分間固定化させ、シグナル値は、１～２ｎｍである。次に、緩衝液でセンサーを３分間平衡化し、抗原タンパク質を１００ｎＭ（最高濃度は、１００ｎＭに暫定する）に希釈し、センサーにカップリングした抗体を結合および解離させる。十分なシグナル値を得られた場合、抗原タンパク質比をいくつかの濃度勾配で希釈し、抗体抗原の結合および解離を分析する。各サイクルが終わった後、センサー表面は、１０ｍＭ、ＰＨ１．５のグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）で再生される。動力学速度定数からブランク対照を差し引く必要があり、グローバルフィット（ｇｌｏｂａｌ ｆｉｔ）分析法１：１でモデルと組み合わせてデータをフィットする。解離平衡速度常数（ＫＤ）は、次の式で計算される。ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ。結果は、表１８に示される。
まず、ＡＨＣセンサーを選択し、緩衝液でセンサーを１０分間平衡化し、次に緩衝液で測定される抗体を５μｇ／ｍｌに希釈し、センサーで抗体を３～５分間固定化させ、シグナル値は、１～２ｎｍである。次に、緩衝液でセンサーを３分間平衡化し、抗原タンパク質を１００ｎＭ（最高濃度は、１００ｎＭに暫定する）に希釈し、センサーにカップリングした抗体を結合および解離させる。十分なシグナル値を得られた場合、抗原タンパク質比をいくつかの濃度勾配で希釈し、抗体抗原の結合および解離を分析する。各サイクルが終わった後、センサー表面は、１０ｍＭ、ＰＨ１．５のグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）で再生される。動力学速度定数からブランク対照を差し引く必要があり、グローバルフィット（ｇｌｏｂａｌ ｆｉｔ）分析法１：１でモデルと組み合わせてデータをフィットする。解離平衡速度常数（ＫＤ）は、次の式で計算される。ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ。結果は、表１８に示される。
【0182】
【表25】
【0183】
議論
完全ヒト抗体
モノクローナル抗体の応用は、過去２０年間で癌治療において最も成功した、最も変革的意味を有する治療の手段の一つである。従来の化学薬品と比較して、抗体薬は、より高い特異性およびより低い毒性を有する。モノクローナル抗体薬は、持続的な成功を収めてきたが、依然としていろんな課題に直面している。
完全ヒト抗体
モノクローナル抗体の応用は、過去２０年間で癌治療において最も成功した、最も変革的意味を有する治療の手段の一つである。従来の化学薬品と比較して、抗体薬は、より高い特異性およびより低い毒性を有する。モノクローナル抗体薬は、持続的な成功を収めてきたが、依然としていろんな課題に直面している。
【0184】
マウス由来モノクローナル抗体の最大の欠点は、それが誘発するＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）反応である。従って、マウスモノクローナル抗体は、腫瘍、臓器移植等の疾患の診断および治療に大きな制限があり、キメラ抗体は、依然として３０％のマウス由来配列を保持しており、様々な程度のＨＡＭＡ反応を引き起こす可能性がある。臨床において、異なるキメラ抗体は、様々な程度の免疫原性を有し、ヒト化抗体は、移植抗体とも呼ばれる。簡単なＣＤＲ移植は、常に抗原抗体親和性の低下を引き起こし、依然として少なくとも１０％の異種タンパク質を有するため、臨床応用では様々な程度に制限される。従って、より完全な治療用抗体-完全ヒト抗体をさらに開発する必要がある。
【0185】
１９９４年、米国ＡｂｇｅｎｉｘおよびＧｅｎｐｈａｍの両社は、トランスジェニックマウスを使用して完全ヒト抗体を調製したことを報告し、それにより人体を任意に免疫できないというヒト抗体調製研究の課題を解決した。それ以来、完全ヒト抗体の調製技術が発展および成熟し続けており、得られたヒトモノクローナル抗体は、すでにより去力な抗腫瘍活性を有する。Ｈ２Ｌ２トランスジェニックマウスは、ＨＡＲＢＯＵＲ医薬（上海）株式会社の許可によって提供され、ロッテルダム大学医療センター（ロッテルダム、オランダ）のＦｒａｎｋ Ｇｒｏｓｖｅｌｄ教授の実験室で開発されたトランスジェニックマウス技術は、完全ヒト可変領域の二つの重鎖および二つの軽鎖（Ｈ２Ｌ２）からなる従来の四量体抗体を有するマウスを産生する。産生された抗体は、成熟した親和性を有し、可変領域は、完全ヒト化され、優れた溶解性を有する。遺伝子操作されたマウス技術は、完全ヒト抗体を産生するための主要なツールの一つである。
【0186】
免疫治療
癌免疫治療とは、免疫系を利用して癌と闘うという目標を達成するための治療法のことを指す。最近、癌免疫治療が注目されており、手術、化学療法および放射線療法に加えて、新しい癌治療法となっている。免疫チェックポイントとは、免疫系で存在するいくつかの阻害性シグナル伝達経路を指し、末梢組織における免疫反応の持続性および強度を調節することによって組織の損傷を防ぎ、自己抗原に対する耐性の維持に関与する。免疫チェックポイントの阻害性シグナル伝達経路を使用して、Ｔ細胞活性を阻害することは、腫瘍が免疫殺傷を回避するための重要なメカニズムである。免疫チェックポイントをブロックすることは、抗腫瘍免疫を活性化するための効果的な策略の一つである。
癌免疫治療とは、免疫系を利用して癌と闘うという目標を達成するための治療法のことを指す。最近、癌免疫治療が注目されており、手術、化学療法および放射線療法に加えて、新しい癌治療法となっている。免疫チェックポイントとは、免疫系で存在するいくつかの阻害性シグナル伝達経路を指し、末梢組織における免疫反応の持続性および強度を調節することによって組織の損傷を防ぎ、自己抗原に対する耐性の維持に関与する。免疫チェックポイントの阻害性シグナル伝達経路を使用して、Ｔ細胞活性を阻害することは、腫瘍が免疫殺傷を回避するための重要なメカニズムである。免疫チェックポイントをブロックすることは、抗腫瘍免疫を活性化するための効果的な策略の一つである。
【0187】
免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤は、様々な種類の腫瘍（例えば、転移性黒色腫、肺がん、乳がんおよび腎細胞がん等）を治療する可能性がある。癌免疫治療の方法に関する最近の研究は、すでに、特に転移性癌の症例に対して、有望な結果を示している。さらに、癌免疫治療は、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群および非ホジキンリンパ腫等を含む、血液がんの治療に大きな可能性を秘めている。免疫チェックポイント阻害剤によって引き起こされるふくさようは、無視でき、可逆的で制御可能であり、効果的な免疫チェックポイント阻害剤は、癌患者の全生存を有意に改善することができる。免疫チェックポイント阻害剤は、標的治療または従来の放射線治療および化学療法と組み合わせて使用することができ、このような組み合わせ療法は、多くの種類の癌を効果的に治療することができ、様々な癌の治療または治癒の希望となる可能性がある。
【0188】
現在、ＴＩＭ－３抗体の臨床研究は、主に悪性固形腫瘍やリンパ腫の治療に使用されており、主に他の治療法または標的薬との併用にも集中しており、切除不能な転移性黒色腫、進行性固形がん、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、腎臓がん、膵臓がん、再発性神経膠芽細胞腫、頭頚部がん、膀胱がん、転移性結腸直腸がん、胃腸間質腫瘍、線細胞がん、高悪性度の固体腫瘍、非小細胞肺がん等を含む、適用可能な臨床症状を拡大するために幅広い適応症の抗体を開発する。
【0189】
本発明の技術的解決策の利点：
治療用モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローン技術等を含む、様々な技術およびアプローチによって開発することができる。しかし、ハイブリドーマ技術を介して野生型またはトランスジェニックマウスからモノクローナル抗体を調製するのは、依然として治療用モノクローナル抗体を調製する現在の方法の主流である。モノクローナル抗体技術の最新の進歩によれば、本発明は、最適化されたハイブリドーマ技術を使用して、所望の抗ＴＩＭ－３抗体を調製する。
治療用モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローン技術等を含む、様々な技術およびアプローチによって開発することができる。しかし、ハイブリドーマ技術を介して野生型またはトランスジェニックマウスからモノクローナル抗体を調製するのは、依然として治療用モノクローナル抗体を調製する現在の方法の主流である。モノクローナル抗体技術の最新の進歩によれば、本発明は、最適化されたハイブリドーマ技術を使用して、所望の抗ＴＩＭ－３抗体を調製する。
【0190】
（１）野生型マウスを免疫することで抗体を得ることができるが、ヒト化抗体を得るにはマウス抗体をヒト化する必要があり、欠点は、改変された抗体がより免疫原性であり、抗体の構造が変化することにより、活性が失われたり、調製性が低下したりする可能性がある。
（２）完全ヒトトランスジェニックマウスを免疫することで完全ヒト抗体を得ることができるが、得られる抗体の数または親和性が悪くなる。
（２）完全ヒトトランスジェニックマウスを免疫することで完全ヒト抗体を得ることができるが、得られる抗体の数または親和性が悪くなる。
【0191】
（３）免疫マウス抗体ライブラリー用ファージディスプレイ技術を構築することにより抗体に対して発現およびスクリーニングすることができるが、抗体の重鎖および軽鎖のランダムな組換えにより、形成された抗体の産生が低下する恐れがある。
（４）ヒト抗体ライブラリー用ファージディスプレイ技術を構築することにより、抗体に対して発現および活性スクリーニングすることができるが、免疫化されていないため、得られた抗体の親和性が低下する。
（４）ヒト抗体ライブラリー用ファージディスプレイ技術を構築することにより、抗体に対して発現および活性スクリーニングすることができるが、免疫化されていないため、得られた抗体の親和性が低下する。
【0192】
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。
【0193】
本発明の配列情報（本発明のＴＩＭ－３抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸配列およびその配列番号、本発明のＴＩＭ－３抗体の重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸および遺伝子配列およびその配列番号を含む）は、以下の表１８に示される。
【0194】
【表26】
【0195】
注：
１．ここで、ＶＨ－ＣＤＲ１は、重鎖可変領域－ＣＤＲ１であり、ＶＨ－ＣＤＲ２は、重鎖可変領域－ＣＤＲ２であり、ＶＨ－ＣＤＲ３は、重鎖可変領域－ＣＤＲ３であり、ここで、ＶＬ－ＣＤＲ１は、軽鎖可変領域－ＣＤＲ１であり、ＶＬ－ＣＤＲ２は、軽鎖可変領域－ＣＤＲ２であり、ＶＬ－ＣＤＲ３は、軽鎖可変領域－ＣＤＲ３である。
２．ＶＨ－ａａとは、重鎖可変領域アミノ酸配列を指し、ＶＨ－ｎｔとは、重鎖可変領域遺伝子配列を指し、ＶＬ－ａａとは、軽鎖可変領域アミノ酸配列を指し、ＶＬ－ｎｔとは、重鎖可変領域遺伝子配列を指す。
１．ここで、ＶＨ－ＣＤＲ１は、重鎖可変領域－ＣＤＲ１であり、ＶＨ－ＣＤＲ２は、重鎖可変領域－ＣＤＲ２であり、ＶＨ－ＣＤＲ３は、重鎖可変領域－ＣＤＲ３であり、ここで、ＶＬ－ＣＤＲ１は、軽鎖可変領域－ＣＤＲ１であり、ＶＬ－ＣＤＲ２は、軽鎖可変領域－ＣＤＲ２であり、ＶＬ－ＣＤＲ３は、軽鎖可変領域－ＣＤＲ３である。
２．ＶＨ－ａａとは、重鎖可変領域アミノ酸配列を指し、ＶＨ－ｎｔとは、重鎖可変領域遺伝子配列を指し、ＶＬ－ａａとは、軽鎖可変領域アミノ酸配列を指し、ＶＬ－ｎｔとは、重鎖可変領域遺伝子配列を指す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】