ホーム > 特許ランキング > 深▲せん▼華大生命科学研究院
特表2022-508776熱安定性が向上したＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体及びそのシーケンシングにおける応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-19
(54)【発明の名称】熱安定性が向上したＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体及びそのシーケンシングにおける応用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20220112BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220112BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20220112BHJP
C12Q 1/6874 20180101ALI20220112BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220112BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220112BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220112BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220112BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20220112BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20220112BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20220112BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54 ZNA
C12N15/63 Z
C12N9/10
C12Q1/6874 Z
C12N1/15
C12N1/21
C12N1/19
C12N5/10
C12N15/31
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6844 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021546026
(86)(22)【出願日】2018-10-11
(85)【翻訳文提出日】2021-04-12
(86)【国際出願番号】 CN2018109777
(87)【国際公開番号】W WO2020073266
(87)【国際公開日】2020-04-16
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521151692
【氏名又は名称】深▲せん▼華大生命科学研究院
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】張周剛
(72)【発明者】
【氏名】劉歓歓
(72)【発明者】
【氏名】鄭越
(72)【発明者】
【氏名】周玉君
(72)【発明者】
【氏名】夏軍
(72)【発明者】
【氏名】董宇亮
(72)【発明者】
【氏名】徐崇鈞
(72)【発明者】
【氏名】章文蔚
【テーマコード（参考）】
4B050
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC04
4B050CC05
4B050DD02
4B050FF05C
4B050FF11E
4B063QA01
4B063QA08
4B063QA17
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD17
4B065CA29
(57)【要約】
熱安定性が向上したＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体及びそのシーケンシングにおける応用を提供し、前記Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体は、下記Ａ）又はＢ）である。Ａ）で示されるＤＮＡポリメラーゼ突然変異体は、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２１７位、２２４位、５１５位及び４７４位の６つのうちの少なくとも１つのアミノ酸残基を修飾し、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質であり、Ｂ）で示されるＤＮＡポリメラーゼ突然変異体は、Ａ）で示されるタンパク質のアミノ酸配列の末端にタグ配列を付加するとともに、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するＡ）から誘導されたタンパク質である。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下のＡ）又はＢ）であるタンパク質。Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２１７位、２２４位、５１５位及び４７４位の６つのうちの少なくとも１つのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である。
Ｂ）で示されるタンパク質は、Ａ）で示されるタンパク質のアミノ酸配列の末端にタグ配列を付加するとともに、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するＡ）から誘導されたタンパク質である。
【請求項2】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２１７位、２２４位、５１５位及び４７４位の６つのうちの少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は少なくとも４つ、又は少なくとも５つ、又は全てのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である、ことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項3】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２１７位、２２４位及び５１５位の５つのうちの全てのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項4】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における２２４位、５１５位及び４７４位の３つのうちの全てのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項5】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２１７位及び５１５位の４つのうちの全てのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項6】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２２４位及び５１５位の４つのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項7】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における２２４位、４７４位の２つのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項8】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における２１７位、２２４位の２つのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項9】
前記修飾はアミノ酸置換である、ことを特徴とする請求項１～８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項10】
前記９７位、１２３位、２１７位、２２４位、５１５位及び４７４位の６つのサイトのアミノ酸置換方法は、それぞれ、９７位のメチオニンをアラニン又はヒスチジン又はリジン又はトレオニンに置換し、
１２３位のロイシンをリジン又はフェニルアラニン又はイソロイシン又はヒスチジンに置換し、
２１７位のグリシンをグルタミン酸に置換し、
２２４位のチロシンをリジンに置換し、
４７４位のイソロイシンをリジンに置換し、
５１５位のグルタミン酸をプロリン又はグリシンに置換することである、
ことを特徴とする請求項９に記載のタンパク質。
【請求項11】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位のアミノ酸残基をＭからＫに突然変異させ、１２３位をＬからＨに突然変異させ、５１５位をＥからＰに突然変異させ、２２４位をＹからＫに突然変異させ、２１７位をＧからＥに突然変異させ、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である、ことを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項12】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における２２４位のアミノ酸残基をＹからＫに突然変異させ、４７４位をＩからＫに突然変異させ、５１５位をＥからＰに突然変異させたものである、ことを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項13】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位のアミノ酸残基をＭからＴに突然変異させ、１２３位をＬからＨに突然変異させ、５１５位をＥからＰに突然変異させたものである、ことを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項14】
前記ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、（Ｉ）配列表の配列２で示されるタンパク質、
（ＩＩ）配列表の配列２で示されるタンパク質と９０％以上の同一性を有する枯草菌由来のタンパク質、
（ＩＩＩ）配列表の配列２で示されるタンパク質と９５％以上の同一性を有する枯草菌由来のタンパク質のうちのいずれか１つである、ことを特徴とする請求項１～１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項15】
前記タンパク質の安定性は前記ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼより高い、ことを特徴とする請求項１～１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項16】
前記安定性は熱安定性である、ことを特徴とする請求項１５に記載のタンパク質。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質をコーディングする核酸分子。
【請求項18】
請求項１７に記載の核酸分子を含む発現カセット、組み換えベクター、組み換え菌又はトランスジェニック細胞系。
【請求項19】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質の下記１）～１１）のうちの少なくとも１つにおける応用。１）ＤＮＡポリメラーゼとする。
２）ＤＮＡ複製を触媒するか、及び／又はＤＮＡ増幅を触媒する。
３）ローリングサークル増幅を触媒するか、及び／又は多重鎖置換増幅を触媒する。
４）ＤＮＡシーケンシング又はＲＮＡシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行う。
５）ＲＣＡによりライブラリを構築する。
６）ゲノム増幅の網羅率を検出する。
７）ＤＮＡ複製を触媒するか、及び／又はＤＮＡ増幅を触媒するためのキット製品を調製する。
８）ローリングサークル増幅を触媒するか、及び／又は多重鎖置換増幅を触媒するための製品を調製する。
９）ＤＮＡシーケンシング又はＲＮＡシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行うための製品を調製する。
１０）ＲＣＡによりライブラリを構築するための製品を調製する。
１１）ゲノム増幅の網羅率を検出するための製品を調製する。
【請求項20】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質をコーディングする核酸分子、前記核酸分子を含む発現カセット、前記核酸分子を含む組み換えベクター、前記核酸分子を含む組み換え菌又は前記核酸分子を含むトランスジェニック細胞系の下記１）－１０）のうちの少なくとも１つにおける応用。１）ＤＮＡ複製を触媒するか、及び／又はＤＮＡ増幅を触媒する。
２）ローリングサークル増幅を触媒するか、及び／又は多重鎖置換増幅を触媒する。
３）ＤＮＡシーケンシング又はＲＮＡシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行う。
４）ＲＣＡによりライブラリを構築する。
５）ゲノム増幅の網羅率を検出する。
６）ＤＮＡ複製を触媒するか、及び／又はＤＮＡ増幅を触媒するための製品を調製する。
７）ローリングサークル増幅を触媒するか、及び／又は多重鎖置換増幅を触媒するための製品を調製する。
８）ＤＮＡシーケンシング又はＲＮＡシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行うための製品を調製する。
９）ＲＣＡによりライブラリを構築するための製品を調製する。
１０）ゲノム増幅の網羅率を検出するための製品を調製する。
【請求項21】
ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２１７位、２２４位、５１５位及び４７４位の６つのうちの少なくとも１つのアミノ酸残基を、請求項１～１７のいずれか一項に記載の修飾方法により修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質を得るステップを含むｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの安定性向上方法。
【請求項22】
前記安定性は熱安定性である、ことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物技術の分野に属し、特に、熱安定性が向上したＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体及びそのシーケンシングにおける応用に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＰｈｉ２９ファージに由来するポリメラーゼであり、この酵素は、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼに属する。Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの結晶構造は、一般的なファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼの保守的なパーム（Ｐａｌｍ）、親指（Ｔｈｕｍｂ）、指（Ｆｉｎｇｅｒ）及びエキソドメイン（Ｅｘｏ ｄｏｍａｉｎ、３’→５’エキソヌクレアーゼ校正活性を有する）を有するだけではなく、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼが、ＴＰＲ１とＴＰＲ２ドメインという２つの特別なドメインをさらに有することを示している。ＴＰＲ２ドメインは、下流のＤＮＡ鋳型鎖を囲む狭い通路の形成に参与し、二本鎖ＤＮＡを強制的に乖離させる。これとともに、Ｐａｌｍ、Ｔｈｕｍｂ、ＴＰＲ１とＴＰＲ２ドメインは、円状の構造を形成し、上流の鋳型鎖が形成した二本鎖ＤＮＡに緊密に結合する。Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの構造特徴によって、特殊な高い持続的合成能、強い鎖置換機能と高い忠実度が付与される。微量の環状ＤＮＡのローリングサークル増幅（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＲＣＡ）やゲノムの多重鎖置換増幅などの等温増幅などの用途によく応用され、例えば、華大基因社の遺伝子シーケンサーのＤＮＡナノボール技術（ＤＮＡ Ｎａｎｏｂａｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と単細胞全ゲノムシーケンシング技術である。
【0003】
ＤＮＡナノボール技術（ＤＮＢ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、華大基因社の遺伝子シーケンサーの中核技術の１つである。ゲノムＤＮＡを物理的又は酵素的に断片化した後に、リンカーを加え、一本鎖環状ＤＮＡに環状化し、その後、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのような高忠実度の鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用い、一本鎖環状ＤＮＡに対してローリングサークル増幅（Ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＲＣＡ）を行い、増幅生成物はＤＮＡナノボール（ＤＮＡ ｎａｎｏｂａｌｌ、ＤＮＢ）と呼ばれる。ナノボールはＤＮＢ搭載技術によりアレイ化したシリコンチップ上に固定され、後続のオンマシンシーケンシングを行う。性質の異なるｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体は、基質ＤＮＡとの結合能が異なり、増幅したＤＮＡナノボール生成物の大きさ、均一性、分岐構造、緊密度などの特性も異なり、さらにＤＮＢがシリコンチップに搭載された後のシーケンシングの品質も異なる。Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの性質も同様にＭＤＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＭＤＡ）法で増幅した単細胞全ゲノムの増幅効果に影響し、さらに、例えば網羅率（Ｃｏｖｅｒａｇｅ）、マッピング率（Ｍａｐｐｉｎｇ Ｒａｔｅ）、変異検出の正確度及び特異性などの単細胞シーケンシングの品質に影響し、これらは、単細胞シーケンシングの科学的応用において十分に注目されているパラメータでもある。
【0004】
Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼは中温性ポリメラーゼであり、６５℃で１０ｍｉｎ加熱すれば、活性が失われる。市場での一部の商品化されたＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼは、安定性などの原因で、シーケンシングライブラリ増幅、単細胞全ゲノム増幅などの特殊な応用において、チップ上の有効なシグナルサイト、増幅好み性、網羅率、変異検出評価などの面の問題が存在するため、キット製品開発の要求を満たし難い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、タンパク質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明により提供されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体であり、下記Ａ）又はＢ）である。
【0007】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２１７位、２２４位、５１５位及び４７４位の６つのうちの少なくとも１つのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である。
【0008】
Ｂ）で示されるタンパク質は、Ａ）で示されるタンパク質のアミノ酸配列の末端にタグ配列を付加するとともに、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するＡ）から誘導されたタンパク質である。
【0009】
上記タンパク質において、Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２１７位、２２４位、５１５位及び４７４位の６つのうちの少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は少なくとも４つ、又は少なくとも５つ、又は全てのアミノ酸残基を修飾することで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である。
【0010】
上記修飾は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２１７位、２２４位、５１５位及び４７４位の６つのみに対して、上記した修飾が必要なサイトを修飾したものであり、この６つ以外のアミノ酸残基は変わらない。
【0011】
上記タンパク質において、Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２１７位、２２４位及び５１５位の５つのうちの全てのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質であり、具体的には、実施例におけるｐｈｉ２９－３３７である。
【0012】
上記タンパク質において、Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における２２４位、５１５位及び４７４位の３つのうちの全てのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質であり、具体的には、実施例におけるｐｈｉ２９－４６４である。
【0013】
上記タンパク質において、Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位及び５１５位の３つのうちの全てのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質であり、具体的には、実施例におけるｐｈｉ２９－４１４である。
【0014】
上記タンパク質において、Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２１７位及び５１５位の４つのうちの全てのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質であり、具体的には、実施例におけるｐｈｉ２９－４５８である。
【0015】
上記タンパク質において、Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２２４位及び５１５位の４つのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質であり、具体的には、実施例におけるｐｈｉ２９－４５９である。
【0016】
上記タンパク質において、Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における２２４位、４７４位の２つのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質であり、具体的には、実施例におけるｐｈｉ２９－４６３である。
【0017】
上記タンパク質において、Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における２１７位、２２４位の２つのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質であり、具体的には、実施例におけるｐｈｉ２９－３３５である。
【0018】
上記タンパク質において、前記修飾はアミノ酸置換である。
【0019】
上記タンパク質において、前記９７位、１２３位、２１７位、２２４位、５１５位及び４７４位の６つのサイトのアミノ酸置換方法は、それぞれ、
９７位のメチオニンをアラニン又はヒスチジン又はリジン又はトレオニンに置換し、
１２３位のロイシンをリジン又はフェニルアラニン又はイソロイシン又はヒスチジンに置換し、
２１７位のグリシンをグルタミン酸に置換し、
２２４位のチロシンをリジンに置換し、
４７４位のイソロイシンをリジンに置換し、
５１５位のグルタミン酸をプロリン又はグリシンに置換することである。
９７位のメチオニンをアラニン又はヒスチジン又はリジン又はトレオニンに置換し、
１２３位のロイシンをリジン又はフェニルアラニン又はイソロイシン又はヒスチジンに置換し、
２１７位のグリシンをグルタミン酸に置換し、
２２４位のチロシンをリジンに置換し、
４７４位のイソロイシンをリジンに置換し、
５１５位のグルタミン酸をプロリン又はグリシンに置換することである。
【0020】
上記タンパク質において、Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位のアミノ酸残基をＭからＫに突然変異させ、１２３位をＬからＨに突然変異させ、５１５位をＥからＰに突然変異させ、２２４位をＹからＫに突然変異させ、２１７位をＧからＥに突然変異させ、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である。
【0021】
上記タンパク質において、Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における２２４位のアミノ酸残基をＹからＫに突然変異させ、４７４位をＩからＫに突然変異させ、５１５位をＥからＰに突然変異させたものである。
【0022】
上記タンパク質において、Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位のアミノ酸残基をＭからＴに突然変異させ、１２３位をＬからＨに突然変異させ、５１５位をＥからＰに突然変異させたものである。
【0023】
上記タンパク質において、前記ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、下記（Ｉ）又は（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の通りである。
【0024】
（Ｉ）配列表の配列２、
（ＩＩ）配列表の配列２で示されるタンパク質と９０％以上の同一性を有する枯草菌由来のタンパク質のアミノ酸残基配列、
（ＩＩＩ）配列表の配列２で示されるタンパク質と９５％以上の同一性を有する枯草菌由来のタンパク質のアミノ酸残基配列。
（ＩＩ）配列表の配列２で示されるタンパク質と９０％以上の同一性を有する枯草菌由来のタンパク質のアミノ酸残基配列、
（ＩＩＩ）配列表の配列２で示されるタンパク質と９５％以上の同一性を有する枯草菌由来のタンパク質のアミノ酸残基配列。
【0025】
上記タンパク質において、前記タンパク質の安定性は前記ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼより高い。
【0026】
上記タンパク質において、前記安定性は熱安定性である。
【0027】
上記タンパク質をコーディングする核酸分子も、本発明の保護範囲である。
【0028】
上記核酸分子を含む発現カセット、組み換えベクター、組み換え菌又はトランスジェニック細胞系も、本発明の保護範囲である。
【0029】
上記タンパク質の下記１）－１１）のうちの少なくとも１つにおける応用も、本発明の保護範囲である。
１）ＤＮＡポリメラーゼとする。
２）ＤＮＡ複製を触媒するか、及び／又はＤＮＡ増幅を触媒する。
３）ローリングサークル増幅を触媒するか、及び／又は多重鎖置換増幅を触媒する。
４）ＤＮＡシーケンシング又はＲＮＡシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行う。
５）ＲＣＡによりライブラリを構築する（ＤＮＡナノボール搭載）。
６）ゲノム増幅の網羅率を検出する。
７）ＤＮＡ複製を触媒するか、及び／又はＤＮＡ増幅を触媒するためのキット製品を調製する。
８）ローリングサークル増幅を触媒するか、及び／又は多重鎖置換増幅を触媒するための製品を調製する。
９）ＤＮＡシーケンシング又はＲＮＡシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行うための製品を調製する。
１０）ＲＣＡによりライブラリを構築するための製品を調製する。
１１）ゲノム増幅の網羅率を検出するための製品を調製する。
１）ＤＮＡポリメラーゼとする。
２）ＤＮＡ複製を触媒するか、及び／又はＤＮＡ増幅を触媒する。
３）ローリングサークル増幅を触媒するか、及び／又は多重鎖置換増幅を触媒する。
４）ＤＮＡシーケンシング又はＲＮＡシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行う。
５）ＲＣＡによりライブラリを構築する（ＤＮＡナノボール搭載）。
６）ゲノム増幅の網羅率を検出する。
７）ＤＮＡ複製を触媒するか、及び／又はＤＮＡ増幅を触媒するためのキット製品を調製する。
８）ローリングサークル増幅を触媒するか、及び／又は多重鎖置換増幅を触媒するための製品を調製する。
９）ＤＮＡシーケンシング又はＲＮＡシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行うための製品を調製する。
１０）ＲＣＡによりライブラリを構築するための製品を調製する。
１１）ゲノム増幅の網羅率を検出するための製品を調製する。
【0030】
上記タンパク質をコーディングする核酸分子、前記核酸分子を含む発現カセット、前記核酸分子を含む組み換えベクター、前記核酸分子を含む組み換え菌又は前記核酸分子を含むトランスジェニック細胞系の下記１）－１０）の少なくとも１つにおける応用も、本発明の保護範囲である。
１）ＤＮＡ複製を触媒するか、及び／又はＤＮＡ増幅を触媒する。
２）ローリングサークル増幅を触媒するか、及び／又は多重鎖置換増幅を触媒する。
３）ＤＮＡシーケンシング又はＲＮＡシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行う。
４）ＲＣＡによりライブラリを構築する。
５）ゲノム増幅の網羅率を検出する。
６）ＤＮＡ複製を触媒するか、及び／又はＤＮＡ増幅を触媒するための製品を調製する。
７）ローリングサークル増幅を触媒するか、及び／又は多重鎖置換増幅を触媒するための製品を調製する。
８）ＤＮＡシーケンシング又はＲＮＡシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行うための製品を調製する。
９）ＲＣＡによりライブラリを構築するための製品を調製する。
１０）ゲノム増幅の網羅率を検出するための製品を調製する。
本発明のもう１つの目的は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの安定性向上方法を提供することである。
１）ＤＮＡ複製を触媒するか、及び／又はＤＮＡ増幅を触媒する。
２）ローリングサークル増幅を触媒するか、及び／又は多重鎖置換増幅を触媒する。
３）ＤＮＡシーケンシング又はＲＮＡシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行う。
４）ＲＣＡによりライブラリを構築する。
５）ゲノム増幅の網羅率を検出する。
６）ＤＮＡ複製を触媒するか、及び／又はＤＮＡ増幅を触媒するための製品を調製する。
７）ローリングサークル増幅を触媒するか、及び／又は多重鎖置換増幅を触媒するための製品を調製する。
８）ＤＮＡシーケンシング又はＲＮＡシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行うための製品を調製する。
９）ＲＣＡによりライブラリを構築するための製品を調製する。
１０）ゲノム増幅の網羅率を検出するための製品を調製する。
本発明のもう１つの目的は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの安定性向上方法を提供することである。
【0031】
本発明により提供される方法は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２１７位、２２４位、５１５位及び４７４位の６つのうちの少なくとも１つのアミノ酸残基を上記した修飾方法により修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質を得るステップを含む。
【0032】
上記方法において、前記安定性は熱安定性である。
【発明の効果】
【0033】
本発明の前記Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼは、独立して包装されるＤＮＡポリメラーゼ製品の形で存在してもよく、ＤＮＡ増幅キット又はＤＮＡシーケンシングキットに包装されてもよい。本発明は、部位特異的突然変異と選別技術によって、熱安定性が大幅に向上した突然変異体が得られる。その中のいくつかの突然変異体は、単細胞全ゲノム増幅において増幅網羅率が大幅に向上し、変異検出の正確度及び感度がある程度向上し、ＱＩＡＧＥＮの同類商品と同等のレベルに達している。本発明の他のいくつかの突然変異体は、ＲＣＡライブラリ増幅の応用においてＤＮＢの搭載効果に対して良好な改善効果を奏する。
【0034】
前記組み換えベクターは、発現ベクターに前記核酸分子を挿入して得られたものである。
【0035】
前記発現ベクターは、具体的にｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターであり得る。
【0036】
前記組み換え菌は、前記組み換えベクターを原株に導入して得られた菌である。
【0037】
前記原株は、大腸菌であり得る。
【0038】
前記大腸菌は、具体的に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であり得る。
【0039】
前記トランスジェニック細胞系は、前記組み換えベクターを受容体細胞に形質転換して得られたものであり得る。前記トランスジェニック細胞系は、非植物繁殖材料である。
【0040】
前記安定性は具体的に熱安定性であり得る。前記熱安定性は、具体的に３７℃での熱安定性であり得る。
【0041】
前記ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼは、具体的に下記（Ｉ）又は（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）であり得る。
（Ｉ）配列表の配列２で示されるタンパク質、
（ＩＩ）配列表の配列２で示されるタンパク質と９０％以上の同一性を有する枯草菌由来のタンパク質、
（ＩＩＩ）配列表の配列２で示されるタンパク質と９５％以上の同一性を有する枯草菌由来のタンパク質。
（Ｉ）配列表の配列２で示されるタンパク質、
（ＩＩ）配列表の配列２で示されるタンパク質と９０％以上の同一性を有する枯草菌由来のタンパク質、
（ＩＩＩ）配列表の配列２で示されるタンパク質と９５％以上の同一性を有する枯草菌由来のタンパク質。
【図面の簡単な説明】
【0042】
【図1】Ｐｈｉ２９遺伝子発現ベクターの構築模式図である。
【図2】多重ＰＣＲにより検出したＭＤＡ生成物におけるハウスキーピング遺伝子の網羅率である。
【図3】ＲＣＡによりライブラリを構築してオンマシン測定を行って得られたデータの分析である。
【発明を実施するための形態】
【0043】
以下の実施例は、本発明に対する理解を容易にするが、本発明を限定するものではない。後述の実施例における実験方法は、特に説明がない限り、通常の方法である。後述の実施例で使用される試験材料は、特に説明がない限り、通常の生化学試薬商店で購入したものである。以下の実施例における定量実験は、いずれも３回の反復実験を設け、結果として平均値を取る。後述の実施例における各溶液又は緩衝液は、特に説明がない限り、いずれも溶剤が水である。
【0044】
ｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター：Ｎｏｖａｇｅｎ社。
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）：ＴＩＡＮＧＥＮ、ＣＢ１０５－０２。
保存緩衝液：１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ （登録商標） ２０、０．５％（ｖ／ｖ）のＮＰ－４０、５０％（ｖ／ｖ）のグリセリン、２５℃でのｐＨ ７．４。
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）：ＴＩＡＮＧＥＮ、ＣＢ１０５－０２。
保存緩衝液：１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ （登録商標） ２０、０．５％（ｖ／ｖ）のＮＰ－４０、５０％（ｖ／ｖ）のグリセリン、２５℃でのｐＨ ７．４。
【0045】
後述の実施例における１４１ ＲＣＡ Ｐｒｉｍｅｒ：ＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＧＡＣＴ。
【0046】
後述の実施例における１４１Ａｄ ｓｓＤＮＡ：ＢＧＩ社により自主的に調製され、一定の大きさ範囲の一本鎖環状ライブラリであり、固定した配列がない（Ａ／Ｔ／Ｃ／Ｇの４つのヌクレオチドからなるランダムライブラリであり、主バンドの長さが２００～３００ｂｐである）。
【0047】
後述の実施例において、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子は、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのコード遺伝子であり、その発現配列表の配列２で示されるタンパク質は、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴで表す）である。
【0048】
実施例１、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の調製
Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体は、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の９７位、１２３位、２１７位、２２４位、４７４位及び５１５位のうちの少なくとも１つを突然変異させたものであり、具体的な単一点突然変異の形は、表１に示され、多点組み合わせ突然変異の形は、表２に示される。
Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体は、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の９７位、１２３位、２１７位、２２４位、４７４位及び５１５位のうちの少なくとも１つを突然変異させたものであり、具体的な単一点突然変異の形は、表１に示され、多点組み合わせ突然変異の形は、表２に示される。
【0049】
一、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を発現する組み換えベクターの構築
１、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ単一点突然変異体を発現する組み換えベクター
配列表の配列２で示されるＤＮＡ分子をｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター（図１）のＮｄｅＩとＢａｍＨＩ酵素切断サイトの間に挿入し、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを発現する組み換えベクターＷＴが得られる。
１、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ単一点突然変異体を発現する組み換えベクター
配列表の配列２で示されるＤＮＡ分子をｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター（図１）のＮｄｅＩとＢａｍＨＩ酵素切断サイトの間に挿入し、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを発現する組み換えベクターＷＴが得られる。
【0050】
組み換えベクターＷＴを出発ベクターとし、表１に示される各プライマー対を用いて点突然変異を導入し、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を発現する各組み換えベクターが得られる。
【0051】
上記した表１に示される各プライマー対を用いて点突然変異を導入する方法は、以下の通りである。
【0052】
組み換えベクターＷＴを鋳型として、２．５ｕｌ １０ｘ Ｐｆｕ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ｗｉｔｈ Ｍｇ２＋、２ｕｌ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）、２５ｎｇ ｐＥＴ２８ａ－Ｐｈｉ２９ ｐｌａｓｍｉｄ、０．５ｕｌ Ｐｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む部位特異的突然変異ＰＣＲ反応系（２５ｕｌ）に、それぞれ突然変異サイトの突然変異プライマー（表１）加えて、ＰＣＲ増幅を行う。
【0053】
ＰＣＲ条件は、９５℃ ３ｍｉｎ、１９ ｃｙｃｌｅ ｆｏｒ［９５℃ ３０ｓ、５３℃ ３０ｓ、６８℃ ８ｍｉｎ］、６８℃ １０ｍｉｎ、４℃ ｆｏｒｅｖｅｒである。反応生成物は、ＤｐｎＩで消化した後に、ＤＨ５ａコンピテントセルに形質転換し、カナマイシン耐性のＬＢプレートに塗布し、３７℃で、インキュベーターで一晩培養した後に、単クローン株を選択してプラスミドを単離し、シーケンシングを行い、特定のアミノ酸サイトの突然変異が成功したか否かを検証する。
【0054】
【0055】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｍ９７Ｈを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の２８９～２９１位のヌクレオチドを「ＡＴＧ」から「ＣＡＴ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｍ９７Ｈをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｍ９７Ｈの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の９７位のアミノ酸残基をＭからＨに突然変異させたことのみにある。
【0056】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｍ９７Ａを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の２８９～２９１位のヌクレオチドを「ＡＴＧ」から「ＧＣＧ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｍ９７Ａをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｍ９７Ａの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の９７位のアミノ酸残基をＭからＡに突然変異させたことのみにある。
【0057】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｍ９７Ｋを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の２８９～２９１位のヌクレオチドを「ＡＴＧ」から「ＡＡＡ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｍ９７Ｋをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｍ９７Ｋの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の９７位のアミノ酸残基をＭからＫに突然変異させたことのみにある。
【0058】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｌ１２３Ｋを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の３６７～３６９位のヌクレオチドを「ＣＴＧ」から「ＡＡＡ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｌ１２３Ｋをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｌ１２３Ｋの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の１２３位のアミノ酸残基をＬからＫに突然変異させたことのみにある。
【0059】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｌ１２３Ｆを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の３６７～３６９位のヌクレオチドを「ＣＴＧ」から「ＴＴＴ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｌ１２３Ｆをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｌ１２３Ｆの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の１２３位のアミノ酸残基をＬからＦに突然変異させたことのみにある。
【0060】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｌ１２３Ｉを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の３６７～３６９位のヌクレオチドを「ＣＴＧ」から「ＡＴＴ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｌ１２３Ｉをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｌ１２３Ｉの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の１２３位のアミノ酸残基をＬからＩに突然変異させたことのみにある。
【0061】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｌ１２３Ｈを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の３６７～３６９位のヌクレオチドを「ＣＴＧ」から「ＣＡＴ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｌ１２３Ｈをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｌ１２３Ｈの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の１２３位のアミノ酸残基をＬからＨに突然変異させたことのみにある。
【0062】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｅ５１５Ｐを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の１５４３～１５４５位のヌクレオチドを「ＧＡＡ」から「ＣＣＧ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｅ５１５Ｐをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｅ５１５Ｐの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の５１５位のアミノ酸残基をＥからＰに突然変異させたことのみにある。
【0063】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｙ２２４Ｋを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の６７０～６７２位のヌクレオチドを「ＴＡＴ」から「ＡＡＡ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｙ２２４Ｋをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｙ２２４Ｋの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の２２４位のアミノ酸残基をＥからＫに突然変異させたことのみにある。
【0064】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｇ２１７Ｅを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の６４９～６５１位のヌクレオチドを「ＧＧＣ」から「ＧＡＡ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｇ２１７Ｅをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｇ２１７Ｅの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の２１７位のアミノ酸残基をＧからＥに突然変異させたことのみにある。
【0065】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｉ４７４Ｋを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の１４２０～１４２２位のヌクレオチドを「ＡＴＴ」から「ＴＴＴ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｉ４７４Ｋをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｉ４７４Ｋの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の４７４位のアミノ酸残基をＩからＫに突然変異させたことのみにある。
【0066】
２、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ多点突然変異体を発現する組み換えベクターの構築
組み換えベクターＷＴを出発ベクターとし、表１に示す各プライマー対を用いて点突然変異を順に導入し、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を発現する各組み換えベクターが得られる。具体的な突然変異の形は、表２に示す通りである。
組み換えベクターＷＴを出発ベクターとし、表１に示す各プライマー対を用いて点突然変異を順に導入し、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を発現する各組み換えベクターが得られる。具体的な突然変異の形は、表２に示す通りである。
【0067】
【0068】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｍ９７Ｋ－Ｌ１２３Ｈ－Ｅ５１５Ｐ－Ｙ２２４Ｋ－Ｇ２１７Ｅを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の２８９～２９１位のヌクレオチドを「ＡＴＧ」から「ＡＡＡ」に突然変異させ、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の３６７～３６９位のヌクレオチドを「ＣＴＧ」から「ＣＡＴ」に突然変異させ、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の１５４３～１５４５位のヌクレオチドを「ＧＡＡ」から「ＣＣＧ」に突然変異させ、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の６７０～６７２位のヌクレオチドを「ＴＡＴ」から「ＡＡＡ」に突然変異させ、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の６４９～６５１位のヌクレオチドを「ＧＧＣ」から「ＧＡＡ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｍ９７Ｋ－Ｌ１２３Ｈ－Ｅ５１５Ｐ－Ｙ２２４Ｋ－Ｇ２１７Ｅをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｍ９７Ｋ－Ｌ１２３Ｈ－Ｅ５１５Ｐ－Ｙ２２４Ｋ－Ｇ２１７Ｅの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の９７位のアミノ酸残基をＭからＫに突然変異させ、１２３位をＬからＨに突然変異させ、５１５位をＥからＰに突然変異させ、２２４位をＹからＫに突然変異させ、２１７位をＧからＥに突然変異させたことのみにある。
【0069】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｍ９７Ｔ－Ｌ１２３Ｋ－Ｅ５１５Ｐを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の２８９～２９１位のヌクレオチドを「ＡＴＧ」から「ＡＣＣ」に突然変異させ、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の３６７～３６９位のヌクレオチドを「ＣＴＧ」から「ＡＡＡ」に突然変異させ、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の１５４３～１５４５位のヌクレオチドを「ＧＡＡ」から「ＣＣＧ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｍ９７Ｔ－Ｌ１２３Ｋ－Ｅ５１５Ｐをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｍ９７Ｔ－Ｌ１２３Ｋ－Ｅ５１５Ｐの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の９７位のアミノ酸残基をＭからＴに突然変異させ、１２３位をＬからＫに突然変異させ、５１５位をＥからＰに突然変異させたことのみにある。
【0070】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｍ９７Ｋ－Ｌ１２３Ｈ－Ｅ５１５Ｐを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の２８９～２９１位のヌクレオチドを「ＡＴＧ」から「ＡＡＡ」に突然変異させ、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の３６７～３６９位のヌクレオチドを「ＣＴＧ」から「ＣＡＴ」に突然変異させ、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の１５４３～１５４５位のヌクレオチドを「ＧＡＡ」から「ＣＣＧ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｍ９７Ｔ－Ｌ１２３Ｈ－Ｅ５１５Ｐをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｍ９７Ｋ－Ｌ１２３Ｈ－Ｅ５１５Ｐの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の９７位のアミノ酸残基をＭからＴに突然変異させ、１２３位をＬからＨに突然変異させ、５１５位をＥからＰに突然変異させたことのみにある。
【0071】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｙ２２４Ｋ－Ｉ４７４Ｋ－Ｅ５１５Ｐを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の６７０～６７２位のヌクレオチドを「ＴＡＴ」から「ＡＡＡ」に突然変異させ、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の１４２０～１４２２位のヌクレオチドを「ＡＴＴ」から「ＴＴＴ」に突然変異させ、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の１５４３～１５４５位のヌクレオチドを「ＧＡＡ」から「ＣＣＧ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｙ２２４Ｋ－Ｉ４７４Ｋ－Ｅ５１５Ｐをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｙ２２４Ｋ－Ｉ４７４Ｋ－Ｅ５１５Ｐの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の２２４位のアミノ酸残基をＹからＫに突然変異させ、４７４位をＩからＫに突然変異させ、５１５位をＥからＰに突然変異させたことのみにある。
【0072】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｍ９７Ｋ－Ｌ１２３Ｈ－Ｅ５１５Ｐ－Ｇ２１７Ｅを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の２８９～２９１位のヌクレオチドを「ＡＴＧ」から「ＡＡＡ」に突然変異させ、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の３６７～３６９位のヌクレオチドを「ＣＴＧ」から「ＣＡＴ」に突然変異させ、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の１５４３～１５４５位のヌクレオチドを「ＧＡＡ」から「ＣＣＧ」に突然変異させ、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の６４９～６５１位のヌクレオチドを「ＧＧＣ」から「ＧＡＡ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｍ９７Ｋ－Ｌ１２３Ｈ－Ｅ５１５Ｐ－Ｇ２１７Ｅをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｍ９７Ｋ－Ｌ１２３Ｈ－Ｅ５１５Ｐ－Ｇ２１７Ｅの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の９７位のアミノ酸残基をＭからＫに突然変異させ、１２３位をＬからＨに突然変異させ、５１５位をＥからＰに突然変異させ、２１７位をＧからＥに突然変異させたことのみにある。
【0073】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｍ９７Ｋ－Ｌ１２３Ｈ－Ｅ５１５Ｐ－Ｙ２２４Ｋを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の２８９～２９１位のヌクレオチドを「ＡＴＧ」から「ＡＡＡ」に突然変異させ、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の３６７～３６９位のヌクレオチドを「ＣＴＧ」から「ＣＡＴ」に突然変異させ、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の１５４３～１５４５位のヌクレオチドを「ＧＡＡ」から「ＣＣＧ」に突然変異させ、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の６７０～６７２位のヌクレオチドを「ＴＡＴ」から「ＡＡＡ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｍ９７Ｋ－Ｌ１２３Ｈ－Ｅ５１５Ｐ－Ｇ２１７Ｅをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｍ９７Ｋ－Ｌ１２３Ｈ－Ｅ５１５Ｐ－Ｇ２１７Ｅの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の９７位のアミノ酸残基をＭからＫに突然変異させ、１２３位をＬからＨに突然変異させ、５１５位をＥからＰに突然変異させ、２２４位をＹからＫに突然変異させたことのみにある。
【0074】
組み換えベクターＷＴと比較すれば、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｙ２２４Ｋ－Ｉ４７４Ｋを発現する組み換えベクターの違いは、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の６７０～６７２位のヌクレオチドを「ＴＡＴ」から「ＡＡＡ」に突然変異させ、配列表の配列１で示されるＤＮＡ分子の１４２０～１４２２位のヌクレオチドを「ＡＴＴ」から「ＴＴＴ」に突然変異させたことのみにある。突然変異後のＤＮＡ分子は突然変異体Ｙ２２４Ｋ－Ｉ４７４Ｋをコーディングする。野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較すれば、突然変異体Ｙ２２４Ｋ－Ｉ４７４Ｋの違いは、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の２２４位のアミノ酸残基をＹからＫに突然変異させ、４７４位のアミノ酸残基をＩからＫに突然変異させたことのみにある。
【0075】
二、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を発現する組み換え菌の構築
それぞれステップ一で構築した組み換えベクターＷＴとＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を発現する各組み換えベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを発現する組み換え菌とＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を発現する各組み換え菌が得られる。
それぞれステップ一で構築した組み換えベクターＷＴとＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を発現する各組み換えベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを発現する組み換え菌とＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を発現する各組み換え菌が得られる。
【0076】
三、組み換え菌の誘導発現
ステップ二で得られた野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを発現する組み換え菌とＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を発現する各組み換え菌を取り、誘導と純化を順に行い、Ｎ末端にＨｉｓ６タグを融合した野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼとＮ末端にＨｉｓ６タグを融合した各Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を獲得する。
ステップ二で得られた野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを発現する組み換え菌とＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を発現する各組み換え菌を取り、誘導と純化を順に行い、Ｎ末端にＨｉｓ６タグを融合した野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼとＮ末端にＨｉｓ６タグを融合した各Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を獲得する。
【0077】
Ｎ末端にＨｉｓ６タグを融合した野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ及びＮ末端にＨｉｓ６タグを融合した各Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体は、Ｈｉｓ６タグを有する野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｍ９７Ｈ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｍ９７Ａ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｍ９７Ｋ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｌ１２３Ｋ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｌ１２３Ｆ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡ突然変異体Ｌ１２３Ｉ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｌ１２３Ｈ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｅ５１５Ｐ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｅ５１５Ｇ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｙ２２４Ｋ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｇ２１７Ｅ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｉ４７４Ｋ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｍ９７Ｋ－Ｌ１２３Ｈ－Ｅ５１５Ｐ－Ｙ２２４Ｋ－Ｇ２１７Ｅ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｍ９７Ｔ－Ｌ１２３Ｋ－Ｅ５１５Ｐ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｍ９７Ｋ－Ｌ１２３Ｈ－Ｅ５１５Ｐ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｙ２２４Ｋ－Ｉ４７４Ｋ－Ｅ５１５Ｐ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｍ９７Ｋ－Ｌ１２３Ｈ－Ｅ５１５Ｐ－Ｇ２１７Ｅ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｍ９７Ｋ－Ｌ１２３Ｈ－Ｅ５１５Ｐ－Ｙ２２４Ｋ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｙ２２４Ｋ－Ｉ４７４Ｋ、Ｈｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体Ｙ２２４Ｋ－Ｇ２１７Ｅと順に命名される。
【0078】
１、誘導の具体的なステップは以下の通りである。
（１）生菌
組み換え菌を３ｍｌのＫａｎａ耐性を有する液体ＬＢ培地に接種し、一晩培養する。
（２）接種
ステップ（１）を完成した後、１／１００体積で以上の菌液を２ｍｌのＫａｎａ耐性を有する液体ＬＢ培地に接種し、３７℃で、２２０ｒｐｍで振動しながら、ＯＤ６００ｎｍ＝０．６になるまで（実際の応用では、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４～０．８であってもよい）培養する。
（３）誘導
ステップ（２）を完成した後、システムに最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを加え、１６℃で、２２０ｒｐｍで振動しながら、１２ｈ培養する。
（４）菌体の収集
ステップ（３）を完成した後、４℃で、８０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、菌体を収集する。
（１）生菌
組み換え菌を３ｍｌのＫａｎａ耐性を有する液体ＬＢ培地に接種し、一晩培養する。
（２）接種
ステップ（１）を完成した後、１／１００体積で以上の菌液を２ｍｌのＫａｎａ耐性を有する液体ＬＢ培地に接種し、３７℃で、２２０ｒｐｍで振動しながら、ＯＤ６００ｎｍ＝０．６になるまで（実際の応用では、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４～０．８であってもよい）培養する。
（３）誘導
ステップ（２）を完成した後、システムに最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを加え、１６℃で、２２０ｒｐｍで振動しながら、１２ｈ培養する。
（４）菌体の収集
ステップ（３）を完成した後、４℃で、８０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、菌体を収集する。
【0079】
２、ＧＥ社のＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ純化システムを用いて、純化を行う。具体的なステップは以下の通りである。
【0080】
（１）ステップ１で得た菌体を取り、再懸濁緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、５％のグリセリン、２５℃でのｐＨ ７．９）で振動して均一に混合した後、氷上に置いて超音波破砕を行い、続いて、４℃で、１２０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心分離し、上澄み液を収集する。
（２）ステップ（１）で得た上澄み液を取り、ニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ ５ｍｌプレパックカラム）で純化を行う。具体的なステップとしては、まず、１０カラム容量のＢｕｆｆｅｒ Ａで平衡させ、続いて、サンプルローディングを行い、続いて、２０カラム容量のＢｕｆｆｅｒ Ａで洗い流し、続いて、１５カラム容量の溶出液で溶出し、目的タンパク質を有するポストカラム溶液を収集する（溶出液はＢｕｆｆｅｒ ＡとＢｕｆｆｅｒ Ｂからなり、溶出過程でＢｕｆｆｅｒ Ｂの体積分率は０％から１００％に線形上昇し、それに応じて、Ｂｕｆｆｅｒ Ａの体積分率は１００％から０％に線形降下する）。
Ｂｕｆｆｅｒ Ａ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、５％（ｖ／ｖ）のグリセリン、２５℃でのｐＨ ７．９。
Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、５％（ｖ／ｖ）のグリセリン、２５℃でのｐＨ ７．９。
（３）ステップ（２）で得たポストカラム溶液を取り、強陰イオンカラムクロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ ５ｍｌプレパックカラム）で純化を行う。具体的なステップとしては、まず、１０カラム容量の体積分率５９％のＢｕｆｆｅｒ Ａと体積分率４１％のＢｕｆｆｅｒ Ｂからなる混合緩衝液で平衡させ、続いて、サンプルローディングを行い、タンパク質ピックが現れた後に、素通り画分を収集する（ＵＶ検出値が２０ｍＡｕまで上昇すると収集し、ＵＶ検出値が５０ｍＡｕまで低下した後に収集を中止する）。
Ｂｕｆｆｅｒ Ａ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）のグリセリン、２５℃でのｐＨ７．５。
Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）のグリセリン、２５℃でのｐＨ７．５。
（４）ステップ（３）で得た素通り画分を取り、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰプレパックカラム）で純化を行い、純度が９５％より大きいタンパク質サンプル溶液が得られる。具体的なステップとしては、まず、１０カラム容量のＢｕｆｆｅｒ Ａで平衡させ、続いて、サンプルローディングを行い、１５カラム容量のＢｕｆｆｅｒ Ａで洗い流し、続いて、１０カラム容量の溶出液で溶出し（溶出液はＢｕｆｆｅｒ ＡとＢｕｆｆｅｒ Ｂからなり、溶出過程でＢｕｆｆｅｒ Ｂの体積分率は０％から５０％に線形上昇し、それに応じて、Ｂｕｆｆｅｒ Ａの体積分率は１００％から５０％に線形下降する）、目的タンパク質を有するポストカラム溶液を収集する（ＵＶ検出値が５０ｍＡｕまで上昇すると収集し、ＵＶ検出値が１００ｍＡｕまで低下した後に収集を中止する）。
Ｂｕｆｆｅｒ Ａ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）のグリセリン、２５℃でのｐＨ７．５。
Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）のグリセリン、２５℃でのｐＨ７．５。
（５）ステップ（４）で収集した目的タンパク質を透析バッグに移し、透析緩衝液で一晩透析した後に、透析バッグ内のタンパク質溶液を収集し、他の試薬を加え、タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌの目的タンパク質溶液が得られる。目的タンパク質溶液における他の成分の濃度は、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（２５℃でのｐＨ ７．４）、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）のＮＰ－４０、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０、５０％（ｖ／ｖ）のグリセリンである。
透析緩衝液：２３．７５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（２５℃でのｐＨ ７．４）、２３７．５ｍＭのＫＣｌ、２．３７５ｍＭのＤＴＴ、０．２３７５ｍＭのＥＤＴＡ、５％（ｖ／ｖ）のグリセリン。
（２）ステップ（１）で得た上澄み液を取り、ニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ ５ｍｌプレパックカラム）で純化を行う。具体的なステップとしては、まず、１０カラム容量のＢｕｆｆｅｒ Ａで平衡させ、続いて、サンプルローディングを行い、続いて、２０カラム容量のＢｕｆｆｅｒ Ａで洗い流し、続いて、１５カラム容量の溶出液で溶出し、目的タンパク質を有するポストカラム溶液を収集する（溶出液はＢｕｆｆｅｒ ＡとＢｕｆｆｅｒ Ｂからなり、溶出過程でＢｕｆｆｅｒ Ｂの体積分率は０％から１００％に線形上昇し、それに応じて、Ｂｕｆｆｅｒ Ａの体積分率は１００％から０％に線形降下する）。
Ｂｕｆｆｅｒ Ａ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、５％（ｖ／ｖ）のグリセリン、２５℃でのｐＨ ７．９。
Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、５％（ｖ／ｖ）のグリセリン、２５℃でのｐＨ ７．９。
（３）ステップ（２）で得たポストカラム溶液を取り、強陰イオンカラムクロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ ５ｍｌプレパックカラム）で純化を行う。具体的なステップとしては、まず、１０カラム容量の体積分率５９％のＢｕｆｆｅｒ Ａと体積分率４１％のＢｕｆｆｅｒ Ｂからなる混合緩衝液で平衡させ、続いて、サンプルローディングを行い、タンパク質ピックが現れた後に、素通り画分を収集する（ＵＶ検出値が２０ｍＡｕまで上昇すると収集し、ＵＶ検出値が５０ｍＡｕまで低下した後に収集を中止する）。
Ｂｕｆｆｅｒ Ａ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）のグリセリン、２５℃でのｐＨ７．５。
Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）のグリセリン、２５℃でのｐＨ７．５。
（４）ステップ（３）で得た素通り画分を取り、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰプレパックカラム）で純化を行い、純度が９５％より大きいタンパク質サンプル溶液が得られる。具体的なステップとしては、まず、１０カラム容量のＢｕｆｆｅｒ Ａで平衡させ、続いて、サンプルローディングを行い、１５カラム容量のＢｕｆｆｅｒ Ａで洗い流し、続いて、１０カラム容量の溶出液で溶出し（溶出液はＢｕｆｆｅｒ ＡとＢｕｆｆｅｒ Ｂからなり、溶出過程でＢｕｆｆｅｒ Ｂの体積分率は０％から５０％に線形上昇し、それに応じて、Ｂｕｆｆｅｒ Ａの体積分率は１００％から５０％に線形下降する）、目的タンパク質を有するポストカラム溶液を収集する（ＵＶ検出値が５０ｍＡｕまで上昇すると収集し、ＵＶ検出値が１００ｍＡｕまで低下した後に収集を中止する）。
Ｂｕｆｆｅｒ Ａ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）のグリセリン、２５℃でのｐＨ７．５。
Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）のグリセリン、２５℃でのｐＨ７．５。
（５）ステップ（４）で収集した目的タンパク質を透析バッグに移し、透析緩衝液で一晩透析した後に、透析バッグ内のタンパク質溶液を収集し、他の試薬を加え、タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌの目的タンパク質溶液が得られる。目的タンパク質溶液における他の成分の濃度は、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（２５℃でのｐＨ ７．４）、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）のＮＰ－４０、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０、５０％（ｖ／ｖ）のグリセリンである。
透析緩衝液：２３．７５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（２５℃でのｐＨ ７．４）、２３７．５ｍＭのＫＣｌ、２．３７５ｍＭのＤＴＴ、０．２３７５ｍＭのＥＤＴＡ、５％（ｖ／ｖ）のグリセリン。
【0081】
実施例２、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの野生型と突然変異体の重合活性テスト
実施例１で調製したＨｉｓ６タグを有する野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ溶液及びＨｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体溶液を取って、被検酵素液とする。
実施例１で調製したＨｉｓ６タグを有する野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ溶液及びＨｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体溶液を取って、被検酵素液とする。
【0082】
１、各被検酵素液を貯蔵緩衝液で５０００倍勾配希釈し、渦発振器により十分に均一に混合し、氷上で５ｍｉｎ静置し、各被検溶液を獲得する。
予備反応系をＰＣＲチューブで均一に混合し、ＰＣＲ装置に置き、９５℃ １ｍｉｎ、６５℃ １ｍｉｎ、４０℃ １ｍｉｎのプロセスを行い、ヒートリッド温度を１０２℃に設定する。
予備反応系（８０．８μｌ）：５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｎＭのｄＮＴＰ混合物、２ｐＭの１４１ ＲＣＡプライマー及び１８ｎｇの一本鎖環状ＤＮＡ鋳型１４１ Ａｄ ｓｓＤＮＡ。
予備反応系をＰＣＲチューブで均一に混合し、ＰＣＲ装置に置き、９５℃ １ｍｉｎ、６５℃ １ｍｉｎ、４０℃ １ｍｉｎのプロセスを行い、ヒートリッド温度を１０２℃に設定する。
予備反応系（８０．８μｌ）：５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｎＭのｄＮＴＰ混合物、２ｐＭの１４１ ＲＣＡプライマー及び１８ｎｇの一本鎖環状ＤＮＡ鋳型１４１ Ａｄ ｓｓＤＮＡ。
【0083】
２、ステップ１を完成した後に、温度が４℃になると、ＰＣＲチューブを取り出して、氷上に置く。試験グループはそれぞれ１μｌの各被検溶液を加え、陰性対照グループは１μｌの貯蔵緩衝液を加える。続いて、渦発振器を用いて振動して均一に混合し、遠心機で５ｓ短時間遠心分離した後、ＰＣＲ装置に置き、３０℃ ６０ｍｉｎのプロセスを行い、ヒートリッド温度を６５℃に設定する。
【0084】
３、ステップ２を完成した後、５μｌの０．５ＭのＥＤＴＡ溶液を加えて反応を中止させ、振動して均一に混合する。
【0085】
４、Ｑｕｂｉｔ ｓｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｑ１０２１２、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）を採用し、マニュアルに従って操作し、Ｑｕｂｉｔ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ ３．０を使用して、反応生成物におけるＤＮＢ（ＤＮＡナノボール）濃度を検出する。
被検酵素液の酵素活性＝ΔＤＮＢ×５０００÷３７．３８。
被検酵素液の酵素活性＝ΔＤＮＢ×５０００÷３７．３８。
【0086】
説明：ΔＤＮＢは、試験グループと陰性対照グループの反応中止後のシステムにおける反応生成物の濃度平均値の差であり、５０００は希釈倍数であり、３７．３８は酵素活性とΔＤＮＢとの関数関係の傾きである。
【0087】
一部の被検酵素液の酵素活性結果は表３に示す通りである。
【0088】
実施例３、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの野生型と突然変異体の熱安定性テスト
３７℃ １０ｍｉｎ実験：
実施例１で調製した目的タンパク質溶液（Ｈｉｓ６タグを有する野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ溶液及びＨｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体溶液）を取って、２つに分けて、それぞれ以下のように処理する。
３７℃ １０ｍｉｎ実験：
実施例１で調製した目的タンパク質溶液（Ｈｉｓ６タグを有する野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ溶液及びＨｉｓ６タグを有するＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体溶液）を取って、２つに分けて、それぞれ以下のように処理する。
【0089】
一つ目：３７℃に予熱した金属浴で１０ｍｉｎ置き、４℃で、１３０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離し、上澄み液を収集し、続いて、前記上澄み液を取り、貯蔵緩衝液で１０００倍希釈し、渦発振器により十分に均一に混合し、続いて氷上で５ｍｉｎ静置し、被検溶液１を獲得する。
【0090】
二つ目：貯蔵緩衝液で５０００倍希釈し、渦発振器により十分に均一に混合し、続いて氷上で５ｍｉｎ静置し、被検溶液２を獲得する。
【0091】
実施例２のステップ１～４に従って行う。
【0092】
非熱処理の酵素活性（Ｕ１）＝ΔＤＮＢ×５０００÷３７．３８であり、ΔＤＮＢは試験グループ（二つ目）と陰性対照グループの反応終了後のシステムにおける反応生成物の濃度平均値の差である。
【0093】
熱処理後の酵素活性（Ｕ２）＝ΔＤＮＢ×１０００÷３７．３８であり、ΔＤＮＢは試験グループ（一つ目）と陰性対照グループの反応終了後のシステムにおける反応生成物の濃度平均値の差である。
【0094】
５０００と１０００はそれぞれ希釈倍数であり、３７．３８は酵素活性とΔＤＮＢとの関数関係の傾きである。
【0095】
非熱処理と熱処理された酵素液の活性に基づいて、酵素活性損失率を計算する。
【0096】
酵素活性損失率（％）＝（Ｕ１－Ｕ２）÷Ｕ１×１００％である。
【0097】
Ｕ１は非熱処理の酵素液の活性であり、Ｕ２は熱処理された酵素液の活性である。
－２０℃実験：３７℃ １０ｍｉｎ実験との違いは、３７℃の金属浴で１０ｍｉｎ置くことを－２０℃の冷蔵庫で１０ｍｉｎ置くことに置き換えるだけである。
－２０℃実験：３７℃ １０ｍｉｎ実験との違いは、３７℃の金属浴で１０ｍｉｎ置くことを－２０℃の冷蔵庫で１０ｍｉｎ置くことに置き換えるだけである。
【0098】
各突然変異体の比酵素活性と酵素活性損失率は、表４に示す通りである。野生型（ＷＴ）と比較すれば、示された突然変異体の酵素活性損失率は、全てある程度上昇する。酵素活性損失率の値が大きいほど、酵素が不安定になり、熱安定性が悪くなる。
【0099】
【0100】
前記表において、ＮＣはバックグラウンド値であり、空白所はデータの計算処理がないからである。
【0101】
実施例４、ゲノム増幅の網羅率の検出
オンマシンシーケンシングの前に、サンプルによって広げた網羅率を検出するために、多重ＰＣＲ法を用いてＭＤＡ生成物の中の複数のハウスキーピング遺伝子を増幅する。
オンマシンシーケンシングの前に、サンプルによって広げた網羅率を検出するために、多重ＰＣＲ法を用いてＭＤＡ生成物の中の複数のハウスキーピング遺伝子を増幅する。
【0102】
具体的な操作ステップとしては、２００ｕｌのＰＣＲチューブにＮＡ１２８７８参照ゲノムサンプル（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を加え、全体積を４ｕｌとし、足りなければＰＢＳを加えて４ｕｌまで補足する。ＰＣＲチューブに３ｕｌのＢｕｆｆｅｒ Ｄ２（ＱＩＡＧＥＮ ＲＥＰＬＩ－ｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ）を加えて、ピペットチップを液面下には入れず、管壁に接する必要があって、遠心分離し、振動は要らない。遠心分離をした後にＰＣＲ装置に置き、６５℃で１０ｍｉｎ静置する。終了後、氷上に置き、ＰＣＲチューブに３ｕｌの中和ｂｕｆｆｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ ＲＥＰＬＩ－ｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ）を加えて、ピペットチップを液面下には入れず、管壁に接する必要があって、遠心分離し、振動は要らない。ＰＣＲチューブに３９ｕｌのＭＤＡ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｘ ｐｈｉ２９ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ５ｕｌ、２５ｍＭのｄＮＴＰ ２ｕｌ、１ｍＭのＮ８プライマー ２ｕｌ、１００ｘ ＢＳＡ ０．５ｕｌ、１０％のＦ６８ ０．０５ｕｌ、Ｈ２Ｏ ２９．７５ｕｌ）を加えた後に、１ｕｌの実施例１で調製したｐｈｉ２９－３３７、ｐｈｉ２９－４５６、ｐｈｉ２９－４５８、ｐｈｉ２９－３６、ｐｈｉ２９－３３５、ｐｈｉ２９－４１４、ｐｈｉ２９－４６４と１ｕｌのＱＩＡＧＥＮ ＲＥＰＬＩ－ｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔに付されたＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼをそれぞれ加える。ピペットチップを液面下はに入れず、管壁に接する必要があって、遠心分離し、振動は要らない。遠心分離をした後にＰＣＲ装置に置き、３０℃で８ｈ、６５℃で３ｍｉｎ静置する。反応後に振動して遠心分離し、Ｑｕｂｉｔ ＢＲで濃度を検出する。濃度を検出した後に多重ハウスキーピング遺伝子のＰＣＲ検出を行う。ＤＮＡ量は５０～２００ｎｇとし、陰性対照（Ｎ）と陽性対照（Ｐ）を設け、陰性は水であり、陽性は増幅していないＮＡ１２８７８参照ゲノムであり、実験グループとしては３つの異なるサンプルを設ける。多重ＰＣＲプライマー及びプロセスは下記表５に示す通りである。
ＰＣＲプロセス：９５℃ ５ｍｉｎ、３５ｃｙｃｌｅｓ ｘ［９４℃ ３０ｓ、６０℃ ５０ｓ、７２℃ １ｍｉｎ］、７２℃ ５ｍｉｎ、１２℃ ｈｏｌｄｅｒ。
【0103】
結果は図２に示す通りであり、ｐｈｉ２９－３３７、ｐｈｉ２９－４５６、ｐｈｉ２９－４５８、ｐｈｉ２９－３６、ｐｈｉ２９－４１４は、野生型ＷＴと比較すれば、増幅網羅率が大幅に向上し、８本のハウスキーピング遺伝子が少なくとも６本以上増幅できる。増幅生成物の濃度では、ｐｈｉ２９－３３７、ｐｈｉ２９－４５６、ｐｈｉ２９－４５８、ｐｈｉ２９－３６、ｐｈｉ２９－４１４は、野生型ＷＴとＥｎｚｙｍａｔｉｃｓ社のｐｈｉ２９製品より高い。
【0104】
実施例５、野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼとＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の単細胞全ゲノムシーケンシングにおける応用効果
Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの野生型と突然変異体の単細胞ゲノムシーケンシングにおける効果を検出するために、ＮＡ１２８７８微量ｇＤＮＡ（２００ｐｇ）をそれぞれ実施例１で調製した野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼとＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体で増幅し、得られた生成物に対してライブラリを構築し、その後に、高深度シーケンシングを行うとともに、商品化されたＱｉａｇｅｎ単細胞増幅キットで同じＮＡ１２８７８微量ｇＤＮＡ（２００ｐｇ）を増幅したものを対照とする。
Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの野生型と突然変異体の単細胞ゲノムシーケンシングにおける効果を検出するために、ＮＡ１２８７８微量ｇＤＮＡ（２００ｐｇ）をそれぞれ実施例１で調製した野生型Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼとＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体で増幅し、得られた生成物に対してライブラリを構築し、その後に、高深度シーケンシングを行うとともに、商品化されたＱｉａｇｅｎ単細胞増幅キットで同じＮＡ１２８７８微量ｇＤＮＡ（２００ｐｇ）を増幅したものを対照とする。
【0105】
シーケンシングデータに分析及び変異検出分析を行い、ＮＡ１２８７８標準変異データセットで評価を行い、各突然変異体とＱｉａｇｅｎキットとの差異を比較する。具体的なデータ分析結果を表６と表７に示す。
【0106】
表から分かるように、突然変異体Ｐｈｉ２９－３３７、Ｐｈｉ２９－４５６、Ｐｈｉ２９－３３５、Ｐｈｉ２９－４１４は、マッピング率、網羅率の面で野生型ＷＴ及びＱＩＡＧＥＮキットと同程度であるが、複製率パラメータの面で野生型ＷＴが最も悪く、表に示されている突然変異体がいずれも野生型よりやや良く、そのうち３３７突然変異体が最も良く、ＱＩＡＧＥＮ（ＲＥＰＬＩ－ｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ）キットと同程度である。同時に、変異検出評価パラメータのｓｎｐ＿Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、ｓｎｐ＿Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ、ｓｎｐ＿Ｆ－ｍｅａｓｕｒｅの面で、３３７突然変異体が最も良く、ＱＩＡＧＥＮキットよりやや良く、野生型ＷＴと４５６、３３５、４１４突然変異体はいずれもＱＩＡＧＥＮキットより悪い。ｉｎｄｅｌ＿Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、ｉｎｄｅｌ＿Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙとｉｎｄｅｌ＿Ｆ－ｍｅａｓｕｒｅパラメータの面でも、３３７突然変異体が最も良く、ＱＩＡＧＥＮキットよりデータがやや良い。
【0107】
【0108】
実施例６、ＲＣＡによりライブラリを構築してオンマシン測定を行った効果の分析
表４の熱安定性結果を総合し、本実施例は複数の熱安定性が向上した突然変異体を選び、ＢＧＩＳＥＱ－５００シーケンサーによりオンマシン測定を行い、異なる突然変異体のＤＮＡシーケンシングにおける応用効果を検出し、ＢＧＩＳＥＱ－５００シーケンサーの標準を参照する。測定全体に使用される試薬はＢＧＩ製のＰＥ５０ Ｖ２．０キットセットの全体とＢＧＩ製のＥ．ｃｏｉｌ Ａｄ１５３スタンダードライブラリとＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＱｕｂｉｔ ｓｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ試薬である。以下に使用される試薬は、ライブラリ及びＱｕｂｉｔ ｓｓＤＮＡ Ａｓｓａｙを除き、全てＰＥ５０ Ｖ２．０キットに含まれているが、以下に記載されるＰＥ５０ Ｖ２．０試薬リザーバーはオンマシン測定に使用される試薬のみを指す。
表４の熱安定性結果を総合し、本実施例は複数の熱安定性が向上した突然変異体を選び、ＢＧＩＳＥＱ－５００シーケンサーによりオンマシン測定を行い、異なる突然変異体のＤＮＡシーケンシングにおける応用効果を検出し、ＢＧＩＳＥＱ－５００シーケンサーの標準を参照する。測定全体に使用される試薬はＢＧＩ製のＰＥ５０ Ｖ２．０キットセットの全体とＢＧＩ製のＥ．ｃｏｉｌ Ａｄ１５３スタンダードライブラリとＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＱｕｂｉｔ ｓｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ試薬である。以下に使用される試薬は、ライブラリ及びＱｕｂｉｔ ｓｓＤＮＡ Ａｓｓａｙを除き、全てＰＥ５０ Ｖ２．０キットに含まれているが、以下に記載されるＰＥ５０ Ｖ２．０試薬リザーバーはオンマシン測定に使用される試薬のみを指す。
【0109】
１、ＤＮＢの調製
－２０℃の冷蔵庫からＤＮＢ調製緩衝液、スタンダードライブラリ、ＤＮＢポリメラーゼ混合液とＤＮＢポリメラーゼ混合液ＩＩを取り出し、アイスボックスで溶解させ、完全に溶解した後に、渦発振器に置いて５ｓ持続的に振動して均一に混合し、且つハンドヘルド遠心機で３ｓしばらく遠心分離し、アイスボックスに置いて使用に備える。４℃の冷蔵庫から分子レベル水とＤＮＢ中止緩衝液を取り出し、アイスボックスに置いて使用に備える。マークされた８連チューブに順に２０ｕｌのＤＮＢ調製緩衝液と６ｎｇのｓｓＤＮＡ（Ｅ．ｃｏｌｉスタンダードライブラリ）を加え、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで４０ｕｌまで補足する。８連チューブを渦発振器に置いて５ｓ持続的に振動して均一に混合し、且つハンドヘルド遠心機で３ｓしばらく遠心分離する。上記８連チューブをＰＣＲ装置に置き、９５℃ １ｍｉｎ、６５℃ １ｍｉｎ、４０℃ １ｍｉｎ、４℃で保持する（ヒートリッド温度を１０３℃に設定）という反応条件を設定又は点検する。反応が完了した後に、ＰＣＲ ８連チューブを取り出し、アイスボックスに置き、８連チューブのリッド温度が室温まで下った後に、それをハンドヘルド遠心機で３ｓしばらく遠心分離してから、直ちにアイスボックスに置く。８連チューブに、順に４０ｕｌの変性後の８連チューブ内の反応液、４０ｕｌのＤＮＢポリメラーゼ混合液、４ｕｌのＤＮＢポリメラーゼ混合液ＩＩを加える。８連チューブを渦発振器に置いて５ｓ持続的に振動して均一に混合し、且つハンドヘルド遠心機で３ｓしばらく遠心分離する。直ちにＰＣＲ装置又は水浴に置いて反応し始める。３０℃ ２０ｍｉｎ、４℃で保持する（ヒートリッドの設置は不要である）という反応条件を設定又は点検する。上記ＲＣＡ反応が終了した後に、８連チューブを取り外してアイスボックスに置き、直ちに２０μｌのＤＮＢ中止緩衝液を加える。１００μｌ広口ピペットチップ付きのピペットを用い、ゆっくり５～８回（１吸入と１吹きは１回とする）均一に吹き付け、均一に混合した後に、４℃に置いて保存して使用に備える。Ｑｕｂｉｔ（登録商標） ｓｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ ＫｉｔとＱｕｂｉｔ（登録商標） Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ装置を用い、上記ＤＮＢ調製生成物に濃度測定を行い、濃度が８ｎｇ／ｕｌ～４０ｎｇ／ｕｌの場合に、合格であると判定し、後続の実験での使用に備える。
－２０℃の冷蔵庫からＤＮＢ調製緩衝液、スタンダードライブラリ、ＤＮＢポリメラーゼ混合液とＤＮＢポリメラーゼ混合液ＩＩを取り出し、アイスボックスで溶解させ、完全に溶解した後に、渦発振器に置いて５ｓ持続的に振動して均一に混合し、且つハンドヘルド遠心機で３ｓしばらく遠心分離し、アイスボックスに置いて使用に備える。４℃の冷蔵庫から分子レベル水とＤＮＢ中止緩衝液を取り出し、アイスボックスに置いて使用に備える。マークされた８連チューブに順に２０ｕｌのＤＮＢ調製緩衝液と６ｎｇのｓｓＤＮＡ（Ｅ．ｃｏｌｉスタンダードライブラリ）を加え、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで４０ｕｌまで補足する。８連チューブを渦発振器に置いて５ｓ持続的に振動して均一に混合し、且つハンドヘルド遠心機で３ｓしばらく遠心分離する。上記８連チューブをＰＣＲ装置に置き、９５℃ １ｍｉｎ、６５℃ １ｍｉｎ、４０℃ １ｍｉｎ、４℃で保持する（ヒートリッド温度を１０３℃に設定）という反応条件を設定又は点検する。反応が完了した後に、ＰＣＲ ８連チューブを取り出し、アイスボックスに置き、８連チューブのリッド温度が室温まで下った後に、それをハンドヘルド遠心機で３ｓしばらく遠心分離してから、直ちにアイスボックスに置く。８連チューブに、順に４０ｕｌの変性後の８連チューブ内の反応液、４０ｕｌのＤＮＢポリメラーゼ混合液、４ｕｌのＤＮＢポリメラーゼ混合液ＩＩを加える。８連チューブを渦発振器に置いて５ｓ持続的に振動して均一に混合し、且つハンドヘルド遠心機で３ｓしばらく遠心分離する。直ちにＰＣＲ装置又は水浴に置いて反応し始める。３０℃ ２０ｍｉｎ、４℃で保持する（ヒートリッドの設置は不要である）という反応条件を設定又は点検する。上記ＲＣＡ反応が終了した後に、８連チューブを取り外してアイスボックスに置き、直ちに２０μｌのＤＮＢ中止緩衝液を加える。１００μｌ広口ピペットチップ付きのピペットを用い、ゆっくり５～８回（１吸入と１吹きは１回とする）均一に吹き付け、均一に混合した後に、４℃に置いて保存して使用に備える。Ｑｕｂｉｔ（登録商標） ｓｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ ＫｉｔとＱｕｂｉｔ（登録商標） Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ装置を用い、上記ＤＮＢ調製生成物に濃度測定を行い、濃度が８ｎｇ／ｕｌ～４０ｎｇ／ｕｌの場合に、合格であると判定し、後続の実験での使用に備える。
【0110】
２、ＤＮＢロード
ＤＮＢを調製した後、ＤＮＢをチップ（ｃｈｉｐ）にロードする必要があり、即ち、ＤＮＢロードである。
ＤＮＢを調製した後、ＤＮＢをチップ（ｃｈｉｐ）にロードする必要があり、即ち、ＤＮＢロードである。
【0111】
サンプルロード試薬プレートＶ２．１を取り出し、室温で融けさせ、振動して均一に混合し、しばらく遠心分離した後に、アイスボックスに置いて使用に備える。ＤＮＢロード緩衝液ＩＩを取り出し、振動して均一に混合し、しばらく遠心分離した後に、アイスボックスに置いて使用に備える。まず、チップ（ｃｈｉｐ）とサンプルロード試薬プレートＶ２．１をＢＧＩＤＬ－５０上に置く。次に、３５μｌのＤＮＢロード緩衝液ＩＩを取って、１００μｌのＤＮＢを含むＰＣＲチューブに加え、広口型吸込みヘッドで軽く１５回混合して均一にする。続いて、上記混合液をロードシステムの指定したＤＮＢ配置領域に置き、ＤＮＢロードプロセス（Ｓａｍｐｌｅ ｌｏａｄ ２．０）を選択し、ロードを開始する。最後に、ロードが完了してから、室温で３０ｍｉｎインキュベートし、その後に２～８℃に置いて使用に備える。
【0112】
３、オンマシン測定
被検ｐｈｉ２９ポリメラーゼ突然変異体又は野生型に対して、一枚のチップ（ｃｈｉｐ）と１つのＢＧＩＳＥＱ‐５００ＲＳハイスループットシーケンシング試薬リザーバー（ＰＥ５０Ｖ２．０）を用い、ＢＧＩＳＥＱ‐５００シーケンサーでオンマシンシーケンシングを行う。オンマシン測定前に、まずシーケンシング試薬リザーバーＩＩ、ｄＮＴＰｓ混合液（Ｖ３．０）、ｄＮＴＰｓ混合液ＩＩ（Ｖ２．０）を解凍して融けさせ、続いて４℃の冷蔵庫又はアイスボックスに置いて使用に備え、且つ振動してシーケンシング酵素を均一に混合し、アイスボックスに置いて使用に備える。まず、５番目のウェルの試薬を配置し、即ち、１ｍｌのピペットを用いて１１５０μｌのＤＮＡポリメラーゼ混合液を取って、５番目のウェルに移し、かつ、１１５０μｌのｄＮＴＰｓ混合液（Ｖ３．０）を５番目のウェルに移し、ピペットを用いて１０～１５回吹き付けて均一にする。次に、６番目のウェルの試薬を配置し、即ち、１ｍｌのピペットを用いて８９０μｌのＤＮＡポリメラーゼ混合液を６番目のウェルに移し、かつ、８９０μｌのｄＮＴＰｓ混合液ＩＩ（Ｖ２．０）を６番目のウェルに移し、ピペットを用いて１０～１５回吹き付けて均一にする。続いて、１４番目の試薬を配置し、即ち、５ｍｌのピペットを用いて１４番目のウェルのための全ての試薬を移し、そのうちの２．８ｍｌの１４番目のウェルの試薬を取って、４００μｌのｐｈｉ２９ポリメラーゼ突然変異体と均一に混合してから、１４番目のウェルに加える。そして配置した試薬リザーバーを組み立てる。最後に、オンマシン測定を行い、即ち、シーケンサーを起動して洗浄し、試薬リザーバーをシーケンサーの指定場所に入れ、操作プロセスに従って実際のプリロードを行い、プリロードが終了した後に、上記ステップ（２）で調製したチップ（ｃｈｉｐ）を取り付け、関連するシーケンシング情報を記入し、シーケンシングを開始し、終了後にチップと試薬リザーバーと洗浄機器を取り出す。この実施例では、１つのループだけ測定する。
被検ｐｈｉ２９ポリメラーゼ突然変異体又は野生型に対して、一枚のチップ（ｃｈｉｐ）と１つのＢＧＩＳＥＱ‐５００ＲＳハイスループットシーケンシング試薬リザーバー（ＰＥ５０Ｖ２．０）を用い、ＢＧＩＳＥＱ‐５００シーケンサーでオンマシンシーケンシングを行う。オンマシン測定前に、まずシーケンシング試薬リザーバーＩＩ、ｄＮＴＰｓ混合液（Ｖ３．０）、ｄＮＴＰｓ混合液ＩＩ（Ｖ２．０）を解凍して融けさせ、続いて４℃の冷蔵庫又はアイスボックスに置いて使用に備え、且つ振動してシーケンシング酵素を均一に混合し、アイスボックスに置いて使用に備える。まず、５番目のウェルの試薬を配置し、即ち、１ｍｌのピペットを用いて１１５０μｌのＤＮＡポリメラーゼ混合液を取って、５番目のウェルに移し、かつ、１１５０μｌのｄＮＴＰｓ混合液（Ｖ３．０）を５番目のウェルに移し、ピペットを用いて１０～１５回吹き付けて均一にする。次に、６番目のウェルの試薬を配置し、即ち、１ｍｌのピペットを用いて８９０μｌのＤＮＡポリメラーゼ混合液を６番目のウェルに移し、かつ、８９０μｌのｄＮＴＰｓ混合液ＩＩ（Ｖ２．０）を６番目のウェルに移し、ピペットを用いて１０～１５回吹き付けて均一にする。続いて、１４番目の試薬を配置し、即ち、５ｍｌのピペットを用いて１４番目のウェルのための全ての試薬を移し、そのうちの２．８ｍｌの１４番目のウェルの試薬を取って、４００μｌのｐｈｉ２９ポリメラーゼ突然変異体と均一に混合してから、１４番目のウェルに加える。そして配置した試薬リザーバーを組み立てる。最後に、オンマシン測定を行い、即ち、シーケンサーを起動して洗浄し、試薬リザーバーをシーケンサーの指定場所に入れ、操作プロセスに従って実際のプリロードを行い、プリロードが終了した後に、上記ステップ（２）で調製したチップ（ｃｈｉｐ）を取り付け、関連するシーケンシング情報を記入し、シーケンシングを開始し、終了後にチップと試薬リザーバーと洗浄機器を取り出す。この実施例では、１つのループだけ測定する。
【0113】
４、データ分析
シーケンシング終了後、分析報告書をダウンロードし、従来指定した基準と照合し、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の性能を判断する。
シーケンシング終了後、分析報告書をダウンロードし、従来指定した基準と照合し、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の性能を判断する。
【0114】
比較された各パラメータについて、次のように説明する。ＥＳＲ（ＥｆｆｅｃｔｉｖｅＳｐｏｔｓ Ｒａｔｅｓ）は、有効なスポット数の割合であり、Ｂｉｃ（ｂａｓｅｃａｌｌ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ）は、ベースコールに用いられるＤＮＢの割合であり、ｆｉｔ（ｃｒｏｓｓｔａｌｋ ｆｉｔ ｓｃｏｒｅ）は、クロストークの状況を反映し、補正後の各ベースの強度分布が集中するほど、そのｆｉｔ値が高くなり、ＳＮＲ（Ｓｉｇｎａｌ ｔｏ Ｎｏｉｓｅ Ｒａｔｉｏ）は、信号対雑音比であり、１つのＤＮＢのＳＮＲの計算を例として、ｂａｓｅ Ａ（ｍａｘ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を信号とすれば、ＣＧＴが背景となり、ＣＧＴの強度の分散（ｖａｒｉａｎｃｅ）が雑音となり、ＲＨＯ（Ｒｈｏ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は、補正強度から標準化された強度値を引いたものであり、直観的にはｄｙｅの一次強度が補正された強度値であると解釈される。
その結果は図３に示す通りであり（図Ａは各突然変異体のＢＩＣ、ＦＩＴ、ＥＳＲパラメータの比較であり、図Ｂは各突然変異体のＳＮＲパラメータの比較であり、図Ｃは各突然変異体のＲＨＯパラメータの比較である）、上記各パラメータメトリクス分析をまとめてみれば、測定した突然変異体の中で、最も優れたのは４６４であり、その次ぎは４６３であることが分かる。
その結果は図３に示す通りであり（図Ａは各突然変異体のＢＩＣ、ＦＩＴ、ＥＳＲパラメータの比較であり、図Ｂは各突然変異体のＳＮＲパラメータの比較であり、図Ｃは各突然変異体のＲＨＯパラメータの比較である）、上記各パラメータメトリクス分析をまとめてみれば、測定した突然変異体の中で、最も優れたのは４６４であり、その次ぎは４６３であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【0115】
本発明に基づき、本発明の前記突然変異サイトのアミノ酸に飽和突然変異を行うことによって、さらに効果が良好な突然変異体を選別し、又は、本発明の前記突然変異体に基づき、さらに本発明に含まれるアミノ酸サイト以外の他のアミノ酸に突然変異を行い、類似する効果を得ることができる。本発明は、さらに食品検出、ウイルス検出、ＲＮＡ検出、単細胞シーケンシングなどを含む技術分野に適用する可能性があり、第３、４世代のシーケンサー技術の開発に適用する可能性もある。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-04-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下のＡ）又はＢ）であるタンパク質。Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２１７位、２２４位、５１５位及び４７４位の６つのうちの少なくとも１つのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である。
Ｂ）で示されるタンパク質は、Ａ）で示されるタンパク質のアミノ酸配列の末端にタグ配列を付加するとともに、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するＡ）から誘導されたタンパク質である。
【請求項2】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２１７位、２２４位、５１５位及び４７４位の６つのうちの少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は少なくとも４つ、又は少なくとも５つ、又は全てのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である、ことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項3】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２１７位、２２４位及び５１５位の５つのうちの全てのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項4】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における２２４位、５１５位及び４７４位の３つのうちの全てのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項5】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２１７位及び５１５位の４つのうちの全てのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項6】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２２４位及び５１５位の４つのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項7】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における２２４位、４７４位の２つのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項8】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における２１７位、２２４位の２つのアミノ酸残基を修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項9】
前記修飾はアミノ酸置換である、ことを特徴とする請求項１～８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項10】
前記９７位、１２３位、２１７位、２２４位、５１５位及び４７４位の６つのサイトのアミノ酸置換方法は、それぞれ、９７位のメチオニンをアラニン又はヒスチジン又はリジン又はトレオニンに置換し、
１２３位のロイシンをリジン又はフェニルアラニン又はイソロイシン又はヒスチジンに置換し、
２１７位のグリシンをグルタミン酸に置換し、
２２４位のチロシンをリジンに置換し、
４７４位のイソロイシンをリジンに置換し、
５１５位のグルタミン酸をプロリン又はグリシンに置換することである、
ことを特徴とする請求項９に記載のタンパク質。
【請求項11】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位のアミノ酸残基をＭからＫに突然変異させ、１２３位をＬからＨに突然変異させ、５１５位をＥからＰに突然変異させ、２２４位をＹからＫに突然変異させ、２１７位をＧからＥに突然変異させ、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質である、ことを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項12】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における２２４位のアミノ酸残基をＹからＫに突然変異させ、４７４位をＩからＫに突然変異させ、５１５位をＥからＰに突然変異させたものである、ことを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項13】
Ａ）で示されるタンパク質は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位のアミノ酸残基をＭからＴに突然変異させ、１２３位をＬからＨに突然変異させ、５１５位をＥからＰに突然変異させたものである、ことを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項14】
前記ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、（Ｉ）配列表の配列２で示されるタンパク質、
（ＩＩ）配列表の配列２で示されるタンパク質と９０％以上の同一性を有する枯草菌由来のタンパク質、
（ＩＩＩ）配列表の配列２で示されるタンパク質と９５％以上の同一性を有する枯草菌由来のタンパク質のうちのいずれか１つである、ことを特徴とする請求項１～１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項15】
前記タンパク質の安定性は前記ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼより高い、ことを特徴とする請求項１～１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項16】
前記安定性は熱安定性である、ことを特徴とする請求項１５に記載のタンパク質。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質をコーディングする核酸分子。
【請求項18】
請求項１７に記載の核酸分子を含む発現カセット、組み換えベクター、組み換え菌又はトランスジェニック細胞系。
【請求項19】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質の下記１）～１１）のうちの少なくとも１つにおける応用。１）ＤＮＡポリメラーゼとする。
２）ＤＮＡ複製を触媒するか、及び／又はＤＮＡ増幅を触媒する。
３）ローリングサークル増幅を触媒するか、及び／又は多重鎖置換増幅を触媒する。
４）ＤＮＡシーケンシング又はＲＮＡシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行う。
５）ＲＣＡによりライブラリを構築する。
６）ゲノム増幅の網羅率を検出する。
７）ＤＮＡ複製を触媒するか、及び／又はＤＮＡ増幅を触媒するためのキット製品を調製する。
８）ローリングサークル増幅を触媒するか、及び／又は多重鎖置換増幅を触媒するための製品を調製する。
９）ＤＮＡシーケンシング又はＲＮＡシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行うための製品を調製する。
１０）ＲＣＡによりライブラリを構築するための製品を調製する。
１１）ゲノム増幅の網羅率を検出するための製品を調製する。
【請求項20】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質をコーディングする核酸分子、前記核酸分子を含む発現カセット、前記核酸分子を含む組み換えベクター、前記核酸分子を含む組み換え菌又は前記核酸分子を含むトランスジェニック細胞系の下記１）－１０）のうちの少なくとも１つにおける応用。１）ＤＮＡ複製を触媒するか、及び／又はＤＮＡ増幅を触媒する。
２）ローリングサークル増幅を触媒するか、及び／又は多重鎖置換増幅を触媒する。
３）ＤＮＡシーケンシング又はＲＮＡシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行う。
４）ＲＣＡによりライブラリを構築する。
５）ゲノム増幅の網羅率を検出する。
６）ＤＮＡ複製を触媒するか、及び／又はＤＮＡ増幅を触媒するための製品を調製する。
７）ローリングサークル増幅を触媒するか、及び／又は多重鎖置換増幅を触媒するための製品を調製する。
８）ＤＮＡシーケンシング又はＲＮＡシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行うための製品を調製する。
９）ＲＣＡによりライブラリを構築するための製品を調製する。
１０）ゲノム増幅の網羅率を検出するための製品を調製する。
【請求項21】
ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における９７位、１２３位、２１７位、２２４位、５１５位及び４７４位の６つのうちの少なくとも１つのアミノ酸残基を、請求項１～１７のいずれか一項に記載の修飾方法により修飾し、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質を得るステップを含むｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの安定性向上方法。
【請求項22】
前記安定性は熱安定性である、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【国際調査報告】