2022-508926 抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片、及びこれを含むキメラ抗原受容体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-19

(54)【発明の名称】抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片、及びこれを含むキメラ抗原受容体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20220112BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20220112BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20220112BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20220112BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220112BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220112BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220112BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20220112BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALI20220112BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220112BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220112BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20220112BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220112BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220112BHJP

   A61K 51/10 20060101ALI20220112BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28

C12N15/13 ZNA

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C07K19/00

C12N5/10

C12N5/0783

C12N5/0784

A61P35/00

A61P29/00

A61P1/04

A61K39/395 T

A61K39/395 N

A61K35/17 Z

A61K51/10

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021547023

(86)(22)【出願日】2019-10-21

(85)【翻訳文提出日】2021-04-19

(86)【国際出願番号】 KR2019013820

(87)【国際公開番号】W WO2020080908

(87)【国際公開日】2020-04-23

(31)【優先権主張番号】10-2018-0125538

(32)【優先日】2018-10-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521168531

【氏名又は名称】カーテクセル インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】チェ，ジン－ア

(72)【発明者】

【氏名】ジョン，ジェ－ギュン

(72)【発明者】

【氏名】キム，デ ヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ユ ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ユ，ビン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB31

4C085CC22

4C085CC23

4C085EE01

4C085KA05

4C085KB82

4C085LL05

4C085LL18

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB43

4C087BB65

4C087CA16

4C087NA14

4C087ZA68

4C087ZB11

4C087ZB26

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、Ｌ１ＣＡＭ抗原に特異的に結合する抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片、これを含むキメラ抗原受容体、及びそれらの用途に関する。本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、Ｌ１ＣＡＭに対する特異性及び親和性に優れているので、Ｌ１ＣＡＭの高発現に関連した様々な癌及び炎症性疾患に関連した疾病の治療及び診断に用いることができる。特に、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体を含むキメラ抗原受容体をＴリンパ球などの効果器細胞に発現させる場合、Ｌ１ＣＡＭに関連した様々な癌及び炎症性疾患の免疫治療方法として有用に用いることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

次のｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）を含む重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＨ）及び次のｖｉ）、ｖ）、及びｖｉ）を含む軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＬ）を含む抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片：
ｉ）次のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）：
Ｘ_１ＹＡＭＸ_５
ここで、互いに独立に、
Ｘ_１は、Ｄ、Ｓ、又はＮであり；
Ｘ_５は、Ｎ、Ｈ、又はＳであり；
ｉｉ）配列番号１２、配列番号１３、又は次のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ２ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）：
ＡＩＳＳＸ_５ＧＸ_７Ｘ_８Ｘ_９ＹＹＡＤＳＶＫＧ
ここで、互いに独立に、
Ｘ_５は、Ｓ又はＴであり；
Ｘ_７は、Ｓ、又はＧであり；
Ｘ_８は、Ｓ、又はＴであり；
Ｘ_９はＩ、Ｔ、又はＫであり；
ｉｉｉ）配列番号１５～配列番号２３から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ３ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）；
ｉｖ）次のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）：
ＲＡＳＱＳＩＸ_７Ｘ_８Ｘ_９ＬＮ
ここで、互いに独立に、
Ｘ_７は、Ｓ又はＧであり；
Ｘ_８は、Ｒ、Ｎ、又はＳであり；
Ｘ_９は、Ｄ又はＹであり；
ｖ）次のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ２ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）：
ＡＸ_２ＳＸ_４ＬＱＳ
ここで、互いに独立に、
Ｘ_２は、Ａ、又はＴであり；
Ｘ_４は、Ｓ、Ｎ、Ｒ、又はＴであり；
ｖｉ）次のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ３ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）：
ＱＱＳＸ_４ＳＸ_６ＰＸ_８Ｔ
ここで、互いに独立に、
Ｘ_４は、Ｙ、又はＥであり；
Ｘ_６は、Ｔ、Ｆ、又はＹであり；
Ｘ_８は、Ｙ、Ｗ、Ｌ、又はＦである。

【請求項2】

前記ＣＤＲＨ１は、配列番号１～７から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。

【請求項3】

前記ＣＤＲＨ２は、配列番号８～１４から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含むる、請求項１に記載の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。

【請求項4】

前記ＣＤＲＬ１は、配列番号３２～３６から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。

【請求項5】

前記ＣＤＲＬ２は、配列番号３７～４２から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。

【請求項6】

前記ＣＤＲＬ３は、配列番号４３～４７から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。

【請求項7】

前記ＶＨは、配列番号２４～２６から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含むＦＲＨ１（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を含む、請求項１に記載の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。

【請求項8】

前記ＶＨは、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＦＲＨ２（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ ２ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を含む、請求項１に記載の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。

【請求項9】

前記ＶＨは、配列番号２８又は２９のアミノ酸配列を含むＦＲＨ３（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ ３ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を含む、請求項１に記載の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。

【請求項10】

前記ＶＨは、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＦＲＨ４（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ ４ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を含む、請求項１に記載の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。

【請求項11】

前記ＶＬは、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＦＲＬ１（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）を含む、請求項１に記載の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。

【請求項12】

前記ＶＬは、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＦＲＬ２（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ ２ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）を含む、請求項１に記載の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。

【請求項13】

前記ＶＬは、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＦＲＬ３（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ ３ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）を含む、請求項１に記載の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。

【請求項14】

前記ＶＬは、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＦＲＬ４（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ ４ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）を含む、請求項１に記載の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片。

【請求項15】

請求項１の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片を含む融合タンパク質。

【請求項16】

次を含むキメラ抗原受容体ポリペプチド：
（ａ）Ｌ１ＣＡＭ結合ドメイン（Ｌ１ＣＡＭ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；
（ｂ）膜横断ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ，ＴＭ）；
（ｃ）共同刺激ドメイン（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ）；及び
（ｄ）細胞内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ，ＩＣＤ）。

【請求項17】

前記Ｌ１ＣＡＭ結合ドメインは、請求項１～１４のいずれか一項の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチド。

【請求項18】

前記膜横断ドメインは、Ｔ－細胞受容体のアルファ、ベータ又はゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４からなる群から選ばれるタンパク質の膜横断ドメインを含む、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチド。

【請求項19】

前記共同刺激ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、イムノグロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、信号伝達リンパ球性活性化分子（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＳＬＡＭ）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ（Ｂ ａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）、トル様リガンド受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選ばれるタンパク質から得られた機能的信号伝達ドメインである、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチド。

【請求項20】

前記細胞内信号伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ３ゼータの機能的信号伝達ドメイン、又はそれらの組合せを含む、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチド。

【請求項21】

請求項１６～２０のいずれか一項のキメラ抗原受容体ポリペプチドをエンコードする核酸分子。

【請求項22】

前記核酸分子は、配列番号６０～６３から選ばれるいずれか一つのヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の核酸分子。

【請求項23】

請求項２１の核酸分子を含む組換えベクター。

【請求項24】

請求項１６～２０のいずれか一項のキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現させる効果器細胞。

【請求項25】

前記効果器細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、自然殺害細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、大食細胞及びそれらの前駆細胞からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２４に記載の効果器細胞。

【請求項26】

前記Ｔリンパ球は、炎症性Ｔリンパ球、細胞毒性Ｔリンパ球、調節Ｔリンパ球又はヘルパーＴリンパ球からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２５に記載の効果器細胞。

【請求項27】

請求項１の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片を含む、癌又は炎症性疾患の治療又は診断用薬剤学的組成物。

【請求項28】

請求項１６のキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現させる効果器細胞を含む、癌又は炎症性疾患の治療用薬剤学的組成物。

【請求項29】

前記癌は、固形癌である、請求項２７又は２８に記載の薬剤学的組成物。

【請求項30】

前記固形癌は、胃癌、乳癌、膵癌、子宮頸癌、子宮内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、消化管間質腫瘍（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｕｍｅｒ）、卵巣癌、黒色腫、胆嚢癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌｏａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆管癌（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膵管腺癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、食道癌、腎細胞癌（ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、直膓癌、結腸癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、甲状腺癌、神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）、膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）及び星状細胞腫（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）からなる群から選ばれる、請求項２９に記載の薬剤学的組成物。

【請求項31】

前記炎症性疾患は、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）である、請求項２７又は２８に記載の薬剤学的組成物。

【請求項32】

請求項１６のキメラ抗原受容体を発現させる効果器細胞を、治療が必要な対象体に投与する段階を含む、癌又は炎症性疾患の治療方法。

【請求項33】

前記癌は、固形癌である、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記固形癌は、胃癌、乳癌、膵癌、子宮頸癌、子宮内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、消化管間質腫瘍（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｕｍｅｒ）、卵巣癌、黒色腫、胆嚢癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌｏａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆管癌（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膵管腺癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、食道癌、腎細胞癌（ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、直膓癌、結腸癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、甲状腺癌、神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）、膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）及び星状細胞腫（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）からなる群から選ばれる、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記炎症性疾患は、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）である、請求項３２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

〔技術分野〕
本発明は、大韓民国未来創造科学部の支援下で課題番号第２０１６Ｍ３Ａ９Ｄ３０２１３４０号によってなされたものであり、この課題の研究管理専門機関は韓国研究財団、研究事業名は“バイオ医療技術開発事業（次世代バイオ）免疫機転制御技術開発”、研究課題名は“キメラ抗原受容体及びＢ細胞を用いた多機能融合Ｔ細胞治療法研究”、主管機関はソウル大学校産学協力団、研究期間は２０１６．０５．０１～２０２１．０１．３１である。

【0002】

本特許出願は、２０１８年１０月１９日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０１８－０１２５５３８号に対して優先権を主張し、この特許出願の開示事項は、本明細書に参照によって組み込まれる。

【0003】

本発明は、Ｌ１ＣＡＭ抗原に特異的に結合する抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片、これを含むキメラ抗原受容体、及びそれらの用途に関する。

【0004】

〔背景技術〕
卵巣癌は最も致命的な婦人科悪性腫瘍で、婦人科腫瘍による主要死因の一つである。手術的な接近方法及び細胞毒性治療剤の併行治療法が相当発展してきているにもかかわらず、診断当時にステージが多く進行していた大多数の患者では結局再発する場合が多い。このため、卵巣癌に対する新しい治療方法が切実に要求されている。卵巣癌の発生が免疫的原因によるものであり得る点と、卵巣癌が免疫系によって認識され攻撃され得るという点が次第に明らかにされることにより、免疫療法に基づく様々な治療方法が活発に研究されている。実際に多数のペプチドワクチン、樹状細胞ワクチン及び養子細胞治療療法が臨床実験中にある。

【0005】

特に、最近では、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）を発現させるＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）を用いた血液癌を対象にした養子療法（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ）の治療的可能性が立証され、市販されたことがある。また、新しく発表されている研究結果は、ＣＡＲ－Ｔが固形癌でも類似の効果を示す可能性があることを暗示している。ＣＡＲは、Ｔ細胞にＨＬＡ－非制限的方式で細胞毒性効果器機能を付与するという点で独特であり、特に、卵巣癌の進行がＨＬＡの下向き調節と相関関係があるという点で非常に重要である。実際に卵巣癌に関連した因子として知られたメソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＭＵＣ１６、葉酸受容体（ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に特異的なＣＡＲ－Ｔを用いた卵巣癌治療が試みられているが、治療効果が十分でないのが現状である。

【0006】

一方、Ｌ１－細胞接着分子（Ｌ１－ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｌ１－ＣＡＭ，Ｌ１ＣＡＭ）は、卵巣癌をはじめとする様々な癌腫で高く発現すると知られており、このようなＬ１ＣＡＭの高発現は、否定的な臨床的治療結果と関連している。以前の研究によれば、Ｌ１ＣＡＭに特異的に結合する単一クローン抗体を、ヒト卵巣癌細胞であるＳＫＯＶ３細胞株にインビトロ及びこれを移植した動物モデル（ｈｕｍａｎ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ）に直接処理した結果、腫瘍細胞の成長を抑制する結果を導出したことがある。本発明者らは、このようなＬ１ＣＡＭの様々な癌腫に対する関連性及び卵巣癌などに対する治療可能性に着眼して本発明を完成するに至った。

【0007】

〔先行技術文献〕
〔非特許文献〕
Ｈａｏ Ｈｏｎｇ．Ｌ１ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｈｉｂｉｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｈｕｍａｎ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ ｉｎ Ｍｉｃｅ．（２０１６）。ＰＬｏＳ ＯＮＥ １１（１）：ｅ０１４６８８５
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明者らは、Ｌ１ＣＡＭに結合する抗体又はその抗原結合断片及びこれを含むキメラ抗原受容体を開発しようと鋭意研究努力した。その結果、開発された抗Ｌ１ＣＡＭ抗体がヒト及びマウスＬ１ＣＡＭ抗原分子に非常に特異的に結合し、これを含むキメラ抗原受容体及びＣＡＲ－ＴがＳＫＯＶ３卵巣癌細胞株、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞株及びＨｅｌａ子宮頸癌細胞株に対して高い抗癌活性を示すことを糾明し、本発明を完成するに至った。

【0008】

したがって、本発明の目的は、Ｌ１ＣＡＭ抗原に特異的に結合する抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片を提供することである。

【0009】

本発明の他の目的は、抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体及びこれを発現させる効果器細胞を提供することである。

【0010】

本発明のさらに他の目的は、前記抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片、又は前記キメラ抗原受容体を発現させる効果器細胞を含む薬剤学的組成物を提供することである。

【0011】

本発明のさらに他の目的は、前記キメラ抗原受容体を発現させる効果器細胞を対象体に投与してＬ１ＣＡＭの高発現に関連した疾患の治療方法を提供することである。

【0012】

〔課題を解決するための手段〕
本明細書において、本発明の一様態による抗体は、Ｌ１ＣＡＭに特異的に結合する抗体及び親和度成熟を経たそれらの変形抗体である。

【0013】

本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、従来の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体と同様にＬ１ＣＡＭ抗原に対して特異的な結合能を有する。

【0014】

本明細書において、用語“抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は、Ｌ１ＣＡＭ抗原に対する特異抗体であり、完全な抗体形態の他、抗体分子の抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）も含む。

【0015】

完全な抗体は、２本の全長の軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）及び２本の全長の重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を有する構造であり、各軽鎖は重鎖とジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｄ ｂｏｎｄ）で連結されている。用語“重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）”は、その天然発生立体形態で抗体分子に存在し、抗体の属するクラスを一般に決定する、ポリペプチド鎖の２種類のうち相対的に大きいものを意味する。前記“重鎖”は、抗原に特異性を付与するための十分の可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）ドメインＶＨと３個の重鎖定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３とを含む全長重鎖及びその断片のいずれをも意味する。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）のタイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。

【0016】

用語“軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）”は、その天然発生立体形態で抗体分子に存在するポリペプチド鎖の２種類のうち相対的小さいものを意味する。前記“軽鎖”は、抗原に特異性を付与するための十分の可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）ドメインＶＬと軽鎖定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）ドメインＣＬとを含む全長軽鎖及びその断片のいずれをも意味する。軽鎖の定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）は、カッパ及びラムダタイプを有する（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｏｎｓｉｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｊ．，Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ４５，ｐｐ．４１－５０，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９１）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ４，ｐｐ．４５－６５，ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８４））。

【0017】

用語“抗原（ａｎｔｉｇｅｎ又はＡｇ）”は、免疫反応を誘発する分子を意味する。前記免疫反応は、抗体生産、又は特異的免疫適格細胞の活性化、又は両方を伴うことができる。

【0018】

本明細書において、用語“ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）”は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））。重鎖（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び軽鎖（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）にはそれぞれ３個のＣＤＲが含まれている。ＣＤＲは、抗体が抗原又はエピトープに結合する際に主要な接触残基を提供する。

【0019】

本明細書において、用語“抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）”は、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうちＦａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）は、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の定常領域及び重鎖の最初の定常領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと相違する。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位だけを有する最小の抗体断片であり、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は、当業界に公知である。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｓｃＦｖ）は、一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域とが共有結合で連結されたり、或いはＣ末端で直接連結されているので、二重鎖Ｆｖと同様にダイマーのような構造を有することができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断すればＦａｂが得られ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片が得られる。）、或いは遺伝子組換え技術によって作製することができる。

【0020】

また、本発明の抗体は、単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド－結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、そしてこれら抗体のエピトープ結合断片などを含むが、これに限定されるものではない。

【0021】

本明細書において、用語“フレームワーク（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）”又は“ＦＲ”は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を示す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４個のＦＲドメインＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（又はＶＬ／Ｖｋ）において次の順序で示される：
（ａ）ＦＲＨ１（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）－ＣＤＲＨ１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）－ＦＲＨ２－ＣＤＲＨ２－ＦＲＨ３－ＣＤＲＨ３－ＦＲＨ４；及び
（ｂ）ＦＲＬ１（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）－ＣＤＲＬ１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）－ＦＲＬ２－ＣＤＲＬ２－ＦＲＬ３－ＣＤＲＬ３－ＦＲＬ４。

【0022】

本明細書において、用語“特異的に結合する”又はこのようなものは、抗体又はその抗原結合断片、又はｓｃＦｖのような異なる構成物が生理的条件下で比較的安定な抗原と複合体を形成するということを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０－６Ｍ以下の平衡解離定数（例えば、これよりも小さいＫＤは、より強固な結合を示す。）で特性化し得る。２個の分子が特異的に結合するか否かを決定する方法は、当業界によく知られており、例えば、平衡透析、表面プラスモン共鳴などを含む。

【0023】

本明細書において、用語“親和度（Ａｆｆｉｎｉｔｙ）”とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）間の非共有相互作用の総和の強度を意味する。別に断りのない限り、“結合親和力（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）”は、結合対（例えば、抗体及び抗原）の構成員間の１：１相互作用を反映する内因性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）結合親和力を示す。分子ＹとそのパートナーＹの親和度は、一般に解離定数（Ｋｄ）で示すことができる。親和度は、本願に記述のものを含めて当業界に公知の通常の方法によって測定可能である。

【0024】

また、本明細書において用語、“ヒト抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は、ヒト又はヒト細胞によって生成された抗体、又はヒト抗体レパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ）又は他のヒト抗体コーディング配列を用いる非ヒト根源から由来した抗体のアミノ酸配列に相応するアミノ酸配列を保有する。ヒト抗体のこのような定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を排除する。

【0025】

本明細書において用語、“キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体”は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定根源（ｓｏｕｒｃｅ）又は種（ｓｐｅｃｉｅｓ）から由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが他の根源又は種に由来した抗体を意味する。

【0026】

本明細書において用語“ヒト化抗体”とは、非ヒト（例えば、マウス）抗体の非ヒト免疫グロブリンから由来した最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖又は断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合下位配列）である。大部分の場合に、ヒト化抗体は、受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、目的とする特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（供与者抗体）、例えば、マウス、ラット又はウサギのＣＤＲの残基によって代替されたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。一部の場合に、前記ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ，ＦＲ）残基は、相応する非ヒト残基によって代替される。また、ヒト化抗体は、受容者抗体からも或いは取り込まれたＣＤＲ又はフレームワーク配列からも発見されない残基を含むことができる。このような変形は、抗体性能をさらに改善及び最適化するためになされる。一般に、前記ヒト化された抗体は、少なくとも１つ、及び典型的に２つの実質的に全ての可変ドメインを含むはずであり、前記ドメインにおいて前記ＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相応し、前記ＦＲ領域の全部又は実質的に全部は、ヒト免疫グロブリンのＦＲ領域の配列を有する。前記ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ）の少なくとも一部又は実質的なヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ）配列を含む。

【0027】

本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、通常の技術者が認知するように、Ｌ１ＣＡＭを特異的に認識可能な範囲内でアミノ酸配列の変異体を含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他生物学的特性を改善させるために、抗体のアミノ酸配列に変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。

【0028】

このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいてなされる。アミノ酸側鎖置換体のサイズ、形状及び種類に対する分析によって、アルギニン、リジン（ｌｙｓｉｎｅ）及びヒスチジンはいずれも陽電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシン及びセリンは類似のサイズを有し；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは類似の形状を有する、ということがわかる。したがって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リジン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、生物学的に機能均等物であるといえる。

【0029】

変異を導入するに当たって、アミノ酸の疎水性インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）を考慮することができる。それぞれのアミノ酸は、疎水性と電荷によって疎水性インデックスが与えられている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスタイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；トレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタメート（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；及びアルギニン（－４．５）。

【0030】

タンパク質の相互的な生物学的機能（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を付与する上で疎水性アミノ酸インデックスは非常に重要である。類似の疎水性インデックスを有するアミノ酸に置換してこそ類似の生物学的活性が保有できるということは公知の事実である。疎水性インデックスを参照して変異を導入させる場合、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、さらに好ましくは±０．５以内の疎水性インデックス差を示すアミノ酸間において置換をする。

【0031】

一方、類似の親水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ ｖａｌｕｅ）を有するアミノ酸間の置換が、均等な生物学的活性を有するタンパク質をもたらすということもよく知られている。米国特許第４，５５４，１０１号に開示されている通り、次の親水性値がそれぞれのアミノ酸残基に与えられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；トリプトファン（－３．４）。

【0032】

親水性値を参照して変異を導入させる場合、好ましくは、±２以内、より好ましくは±１以内、より好ましくは±０．５以内の親水性値差を示すアミノ酸間で置換をする。

【0033】

分子の活性を全体的に変更させないタンパク質におけるアミノ酸交換は、当該分野に公知されている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も一般的に起きる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。

【0034】

本発明の一態様によれば、本発明は、次のｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）を含む重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，Ｖ_Ｈ）及び次のｖｉ）、ｖ）、及びｖｉ）を含む軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，Ｖ_Ｌ）を含む抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片を提供する：
ｉ）次のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）：
Ｘ_１ＹＡＭＸ_５
ここで、互いに独立に、
Ｘ_１は、Ｄ、Ｓ、又はＮであり；
Ｘ_５は、Ｎ、Ｈ、又はＳであり；
ｉｉ）配列番号１２、配列番号１３、又は次のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ２ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）：
ＡＩＳＳＸ_５ＧＸ_７Ｘ_８Ｘ_９ＹＹＡＤＳＶＫＧ
ここで、互いに独立に、
Ｘ_５は、Ｓ又はＴであり；
Ｘ_７は、Ｓ、又はＧであり；
Ｘ_８は、Ｓ、又はＴであり；
Ｘ_９は、Ｉ、Ｔ、又はＫであり；
ｉｉｉ）配列番号１５～配列番号２３から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ３ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）；
ｉｖ）次のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）：
ＲＡＳＱＳＩＸ_７Ｘ_８Ｘ_９ＬＮ
ここで、互いに独立に、
Ｘ_７は、Ｓ又はＧであり；
Ｘ_８は、Ｒ、Ｎ、又は、Ｓであり；
Ｘ_９は、Ｄ又はＹであり；
ｖ）次のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ２ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）：
ＡＸ_２ＳＸ_４ＬＱＳ
ここで、互いに独立に、
Ｘ_２は、Ａ、又はＴであり；
Ｘ_４は、Ｓ、Ｎ、Ｒ、又はＴであり；
ｖｉ）次のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ３ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）：
ＱＱＳＸ_４ＳＸ_６ＰＸ_８Ｔ
ここで、互いに独立に、
Ｘ_４は、Ｙ、又はＥであり；
Ｘ_６は、Ｔ、Ｆ、又はＹであり；
Ｘ_８は、Ｙ、Ｗ、Ｌ、又はＦである。

【0035】

本明細書において使われた“Ｘ_ｎ”及び“Ｘ_ｍ”などの記号は、上記定義された一般式において位置ｎ及びｍのアミノ酸を表示するために使用したものである。ここで、ｎ及びｍは、前記配列のＮ末端から計算される前記配列内のアミノ酸位置を表示する整数である。例えば、Ｘ_１及びＸ_５は、前記配列のＮ末端からそれぞれ１番目及び５番目の位置のアミノ酸を表示する。

【0036】

本発明の一具現例において、前記一般式中のＸ_ｎ又はＸ_ｍになり得る可能なアミノ酸残基のグループから独立に選ばれる。通常の技術者は、Ｘ_ｎが、可能な残基の羅列されたグループのいずれか一つから選ばれ得るということと、このような選択がＸ_ｍのアミノ酸の選択とは独立してなされ、ここで、ｎとｍが異なるということ、が理解できよう。したがって、前記一般式においてＸ_ｎ位置で羅列された可能なアミノ酸残基のいかなるものも、他の様々な位置（Ｘ_ｍ位置）で羅列された可能なアミノ酸残基のいかなる他のものと独立に組み合わせられてよい。

【0037】

下記実施例で詳細に記載される通り、本発明のＬ１ＣＡＭに特異的に結合する抗Ｌ１ＣＡＭ抗体、その変形抗体、又はそれらの抗原結合断片のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ、前記ｉ）、ｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、及びｖｉ）で表示され、前記一般式は、数多くのランダム変形抗体を統計的に分析した結果に基づいて作成されたものである。前記Ｌ１ＣＡＭに特異的に結合する抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又は抗原結合断片とそれらの変形抗体は、反復の選抜試験によってＬ１ＣＡＭとの相互作用が確認され、選択された。

【0038】

本発明の一具現例において、互いに独立に、前記ＣＤＲＨ１のＸ_１は、Ｄ又はＳであり；前記Ｘ_５は、Ｎ、Ｈ、又はＳである。

【0039】

本発明の実施例において、前記一般式で表されたＣＤＲＨ１のアミノ酸配列は、配列番号１～７から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列に対応する。

【0040】

本発明の具体的な実施例によれば、前記一般式で表されたＣＤＲＨ１のアミノ酸配列は、配列番号１～３、及び７から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列に対応し、それらは、本発明において最終選別された４種の抗体のＣＤＲＨ１に対応する。

【0041】

本発明の他の具現例において、互いに独立に、
前記ＣＤＲＨ２のＸ_５は、Ｔ、又はＳであり；
前記ＣＤＲＨ２のＸ_７は、Ｓ、又はＧであり；
前記ＣＤＲＨ２のＸ_８は、Ｓ、又はＴであり；及び
前記ＣＤＲＨ２のＸ_９は、Ｉ、又はＴである。

【0042】

本発明の実施例において、前記一般式で表されたＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は、配列番号８～１４から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列に対応する。

【0043】

本発明の具体的な実施例によれば、前記一般式で表されたＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は、配列番号８～１０から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列に対応し、それらは、本発明において最終選別された４種の抗体のＣＤＲＨ２に対応する。

【0044】

また、本発明の具体的な具現例によれば、前記ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は、配列番号１５～１７、及び２２から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列に対応し、それらは、本発明において最終選別された４種の抗体のＣＤＲＨ３に対応する。

【0045】

本発明の一具現例において、前記ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列は、配列番号３２～３６から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列に対応する。

【0046】

本発明の具体的な具現例によれば、前記ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列は、配列番号３２～３４、及び３６から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列に対応し、それらは、本発明において最終選別された４種の抗体のＣＤＲＬ１に対応する。

【0047】

本発明の他の具現例において、互いに独立に、前記ＣＤＲＬ２のＸ_２は、Ａ、又はＴであり；Ｘ_４は、Ｓ、又はＮである。

【0048】

本発明の実施例において、前記一般式で表されたＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は、配列番号３７～４２から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列に対応する。

【0049】

また、本発明の具体的な実施例によれば、前記一般式で表されたＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は、配列番号３７、３８、及び４２から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列に対応し、それらは、本発明において最終選別された４種の抗体のＣＤＲＬ２に対応する。

【0050】

本発明のさらに他の具現例において、互いに独立に、
前記ＣＤＲＬ３のＸ_４は、Ｙであり；
前記ＣＤＲＬ３のＸ_６は、Ｔ又はＦであり；及び
前記ＣＤＲＬ３のＸ_８は、Ｙ又はＷである。

【0051】

本発明の一実施例において、前記一般式で表されたＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は、配列番号４３～４７から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列に対応する。

【0052】

本発明の具体的な実施例によれば、前記一般式で表されたＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は、配列番号４３又は４４のアミノ酸配列に対応し、それらは、本発明において最終選別された４種抗体のＣＤＲＬ３に対応する。

【0053】

本発明のさらに他の具現例によれば、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片において、前記Ｖ_Ｈは、配列番号２４～２６から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含むＦＲＨ１（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を含む。

【0054】

本発明の具体的な具現例によれば、前記前記Ｖ_Ｈは、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＦＲＨ１（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を含む。

【0055】

また、前記Ｖ_Ｈは、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＦＲＨ２（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ ２ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を含む。

【0056】

また、前記Ｖ_Ｈは、配列番号２８又は２９のアミノ酸配列を含むＦＲＨ３（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ ３ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を含む。

【0057】

また、前記Ｖ_Ｈは、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＦＲＨ４（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ ４ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を含む。

【0058】

本発明の他の具現例において、前記Ｖ_Ｈは、次のｖｉｉ）のアミノ酸配列を含む：
ｖｉｉ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＸ_ａＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ［ＣＤＲＨ１］ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ［ＣＤＲＨ２］ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＸ_ｂＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ［ＣＤＲＨ３］ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ここで、互いに独立に、
前記［ＣＤＲＨ１］、［ＣＤＲＨ２］、及び［ＣＤＲＨ３]は、上記で定義されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列であり；
前記Ｘ_ａは、Ｖ、Ｌ、又はＡであり；及び
前記Ｘ_ｂは、Ｍ又はＩである。

【0059】

本発明の具体的な具現例において、ｖｉｉ）において、前記Ｘ_ａはＶであり、前記Ｘ_ｂはＭである。

【0060】

本発明の一実施例によれば、前記Ｖ_Ｈのアミノ酸配列は、配列番号５２～５５から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列に対応する。

【0061】

本発明の具体的な具現例によれば、前記Ｖ_Ｌは、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＦＲＬ１（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）を含む。

【0062】

また、前記Ｖ_Ｌは、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＦＲＬ２（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ ２ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）を含む。

【0063】

また、前記Ｖ_Ｌは、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＦＲＬ３（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ ３ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）を含む。

【0064】

また、前記Ｖ_Ｌは、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＦＲＬ４（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ ４ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）を含む。

【0065】

本発明の他の具現例において、前記Ｖ_Ｌは、次のｖｉｉｉ）のアミノ酸配列を含む：
ｖｉｉｉ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ［ＣＤＲＬ１］ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ［ＣＤＲＬ２］ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ［ＣＤＲＬ３］ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ここで、互いに独立に、前記［ＣＤＲＬ１］、［ＣＤＲＬ２］、及び［ＣＤＲＬ３］は、上記で定義したＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列である。

【0066】

本発明の一実施例によれば、前記Ｖ_Ｌのアミノ酸配列は、配列番号５６～５９から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列に対応する。

【0067】

一方、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、上述したアミノ酸配列に対して小幅の変化、すなわち、３次構造及び抗体の機能にほとんど影響を及ぼさない変形を含む抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片を含む。したがって、ある具現例において、上述した配列と一致しなくても、少なくとも９０％、９３％、９５％又は９８％以上の類似性を有することができる。

【0068】

また、本発明において、前記抗体又はその抗原結合断片に含まれる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、一般式（Ｇ_ｎＳ_ｍ）_ｐ又は（Ｓ_ｍＧ_ｎ）_ｐで表示されるアミノ酸配列からなるリンカーによって連結されてよい。

【0069】

ここで、前記ｎ、ｍ及びｐは独立に、
ｎは、１～７の整数であり；
ｍは、０～７の整数であり；
ｎとｍの和は、８以下の整数であり；及び
ｐは、１～７の整数である。

【0070】

本発明の具体的な具現例によれば、前記リンカーは、ｎ＝１～５、ｍ＝０～５である。より具体的な具現例において、ｎ＝４、ｍ＝１である。より具体的な具現例において、前記リンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_３又は（Ｓ_４Ｇ）_３である。

【0071】

他の具現例において、前記リンカーはＶＤＧＳであり、さらに他の具現例において、前記リンカーはＡＳＧＳである。

【0072】

また、本発明に係る抗体又は抗原結合断片の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、次の配向で存在してよい：
軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域；又は
重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域。

【0073】

本発明の最も具体的な具現例によれば、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６４～６７から選ばれるアミノ酸配列を含むが、これに限定されるものではない。

【0074】

本発明の他の態様によれば、本発明は、抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片を含む融合タンパク質を提供する。

【0075】

本発明において、前記融合タンパク質は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片の生産性、精製効率、生物学的活性の向上、融合タンパク質の安定性増加、フォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）の向上及び／又は追加の機能性を持つ機能的モイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）との結合のために製造される。前記融合タンパク質は、２以上のポリペプチド鎖が組換え融合タンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｕｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）として発現することにより共有結合によって連結されたり、或いは化学的コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によって２以上のポリペプチド鎖が連結されたコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の形態として具現されてよい。

【0076】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、次のを含むキメラ抗原受容体ポリペプチドを提供する：
（ａ）Ｌ１ＣＡＭ結合ドメイン（Ｌ１ＣＡＭ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；
（ｂ）膜横断ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ，ＴＭ）；
（ｃ）共同刺激ドメイン（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ）；及び
（ｄ）細胞内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ，ＩＣＤ）。

【0077】

本明細書において、用語“キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）”は、効果器細胞信号伝達又は効果器細胞活性化ドメイン（例えば、Ｔ－細胞信号伝達又はＴ－細胞活性化ドメイン）に連結されたターゲット結合ドメイン（例えば、単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含む人工的に作製されたハイブリッドタンパク質（融合タンパク質）又はポリペプチドである。キメラ抗原受容体は一般に、単一クローン抗体の抗原結合性質を用いて非ＭＨＣ－制限方式により、選択された標的に対するＴ－細胞特異性及び反応性を再誘導する能力を有する。非ＭＨＣ－制限された抗原認識は、ＣＡＲを発現させるＴ－細胞に、抗原処理に関係なく抗原を認識する能力を提供し、腫瘍逃避の主要メカニズムを回避させる。また、ＣＡＲは、Ｔ－細胞に発現するとき、有利には内在性Ｔ－細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖と二量体化しない。

【0078】

本発明のキメラ抗原受容体は、上述した抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片を細胞外抗原結合ドメインとして含む。したがって、本発明のキメラ抗原受容体は、抗Ｌ１ＣＡＭキメラ抗原受容体（ａｎｔｉ－Ｌ１ＣＡＭ ＣＡＲ）、抗Ｌ１ＣＡＭ ＣＡＲなどと表現される。

【0079】

本発明の実施例で使われた“Ｌ１－ＣＡＲ”、“Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ”、“Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ”などの用語は、本発明者らが発明した抗Ｌ１ＣＡＭキメラ抗原受容体のコード名であり、上述したＬ１ＣＡＭに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体のことを指す。

【0080】

本発明の一具現例によれば、本発明のキメラ抗原受容体は、本発明において上述した抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片を含むＬ１ＣＡＭ結合ドメインを含むので、Ｌ１ＣＡＭ抗原を認識し、細胞の表面において発現する。

【0081】

本発明のキメラ抗原受容体は、細胞の表面に発現するので、膜横断ドメインを含む。前記膜横断ドメインは、Ｔ－細胞受容体のアルファ、ベータ又はゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４からなる群から選ばれるタンパク質の膜横断ドメイン、又はそれらの全部又は一部の配列の組合せであるが、これに限定されるものではない。

【0082】

本発明の具体的な具現例によれば、前記膜横断ドメインは、ＣＤ８、又はＣＤ２８の膜横断ドメインであり、最も具体的には、配列番号７８のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤ２８の膜横断ドメイン、又は配列番号１１９のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤ８アルファの膜横断ドメインである。

【0083】

本発明のキメラ抗原受容体の前記共同刺激ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、イムノグロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、信号伝達リンパ球性活性化分子（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＳＬＡＭ）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ（Ｂ ａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）、トル様リガンド受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選ばれるタンパク質から得られた機能的信号伝達ドメインであるが、これに限定されるものではない。

【0084】

本発明の具体的な具現例によれば、前記共同刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、及びＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）からなる群から選ばれるタンパク質から得られた機能的信号伝達ドメインでよく、より具体的には、配列番号７９のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤ２８の機能的信号伝達ドメイン、配列番号８０のヌクレオチド配列によってコードされるＯＸ４０の機能的信号伝達ドメイン、配列番号１０１又は配列番号１２０のヌクレオチド配列によってコードされる４－１ＢＢの機能的信号伝達ドメイン、配列番号１０２のヌクレオチド配列によってコードされるＩＣＯＳの機能的信号伝達ドメイン、又はそれらの全部又は一部の配列の組合せである。

【0085】

本発明の他の具現例によれば、前記細胞内信号伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ３ゼータの機能的信号伝達ドメイン、又はそれらの組合せである。前記細胞内信号伝達ドメインは、最も具体的には、ＣＤ３ゼータの機能的信号伝達ドメインである。

【0086】

本発明の一実施例によれば、前記細胞内信号伝達ドメインは、配列番号８１のヌクレオチド配列によってエンコードされるＣＤ３ゼータの機能的信号伝達ドメイン、配列番号１２１のヌクレオチド配列によってエンコードされるＣＤ３ ｚｅｔａ－ｉｓｏ２Ｍ、配列番号１２６のヌクレオチド配列によってエンコードされるＣＤ３ ｚｅｔａ－ｉｓｏ２であるが、これに限定されるものではない。

【0087】

本発明の一具現例において、前記キメラ抗原受容体は、先導配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＬＳ）を選択的にさらに含む。前記先導配列は、キメラ抗原受容体を構成する組換えポリペプチドのアミノ末端（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ）に位置する。前記先導配列は、キメラ抗原受容体の細胞内プロセス及び細胞膜に局在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）しながら抗原結合ドメインから任意に切断される。

【0088】

本発明の具体的な具現例において、前記先導配列は、ｈＣＤ８ ａｌｐｈａの先導配列、ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎの先導配列、又は３Ｅ８抗体の先導配列でよい。

【0089】

本発明のより具体的な具現例において、前記先導配列は、配列番号１２８～１３０の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含む先導配列である。

【0090】

本発明のキメラ抗原受容体の前記Ｌ１ＣＡＭ結合ドメインは、ヒンジドメイン（又は、スぺーサ）によって前記膜横断ドメインに連結される。

【0091】

本発明の他の具現例によれば、前記ヒンジドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、又はＩｇＤに由来したヒンジ、ＣＤ８又はＣＤ２８に由来したヒンジ、ＣＤ２８に由来した細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はそれらの組合せである。

【0092】

本発明の一実施例によれば、前記ヒンジドメインは、配列番号７７のヌクレオチド配列によってエンコードされるＩｇＤヒンジ、配列番号８５のヌクレオチド配列によってエンコードされるＩｇＧ１ヒンジ、配列番号８６のヌクレオチド配列によってエンコードされるＩｇＧ１ ＣＨ３ヒンジ、配列番号１１８のヌクレオチド配列によってエンコードされるｈＣＤ８ ａｌｐｈａヒンジ、配列番号１２４のヌクレオチド配列によってエンコードされるヒンジ、配列番号１２５のヌクレオチド配列によってコードされるｈＣＤ２８細胞外ドメイン又はそれらの全部又は一部の配列の組合せであるが、これに限定されるものではない。

【0093】

本発明の一態様によれば、本発明は、上述した抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片をエンコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。

【0094】

本発明の他の一態様によれば、本発明は、上述した抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片を含む融合タンパク質をエンコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。

【0095】

本発明のさらに他の一態様によれば、本発明は、上述したキメラ抗原受容体ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。

【0096】

本明細書において用語“核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）”は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドの他、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３－５８４（１９９０））。

【0097】

本発明の一具現例において、本発明の前記キメラ抗原受容体ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列は、前記キメラ抗原受容体分子を構成するアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列であればよく、いずれかの特定ヌクレオチド配列に限定されないということは、当業者にとって明らかである。

【0098】

これは、ヌクレオチド配列の変異が発生しても、変異されたヌクレオチド配列をタンパク質で発現すれば、タンパク質配列において変化をもたらさない場合もあるためである。これをコドンの縮退性という。したがって、前記ヌクレオチド配列は、機能的に均等なコドン又は同一のアミノ酸をコードするコドン（例えば、コドンの縮退性により、アルギニン又はセリンに対するコドンは６個である。）、又は生物学的に均等なアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列を含む。

【0099】

ただし、本発明の具体的な具現例によれば、前記キメラ抗原受容体のＬ１ＣＡＭ結合ドメインポリペプチドをエンコードする前記核酸分子は、配列番号６０～６３から選ばれるいずれか一つのヌクレオチド配列を含む。

【0100】

上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すると、本発明のキメラ抗原受容体ポリペプチドをエンコードする核酸分子は、配列目録に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、上記の本発明の配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアラインし、当業界で一般に用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、最小で６１％の相同性、より好ましくは７０％の相同性、より好ましくは８０％の相同性、最も好ましくは９０％の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は、当業界に公知である。アラインメントに対する様々な方法及びアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４８：４４３（１９７０）；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３１（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３：２３７－４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ５：１５１－３（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１－９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．８：１５５－６５（１９９２）ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３１（１９９４）に開示されている。ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０（１９９０））は、ＮＢＣＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などで接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して用いることができる。ＢＬＡＳＴは、ｎｃｂｉウェブサイトのＢＬＡＳＴページから接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、ｎｃｂｉウェブサイトのＢＬＡＳＴ ｈｅｌｐページから確認できる。

【0101】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、上記の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片；又は上記のキメラ抗原受容体ポリペプチドをエンコードする核酸分子を含む組換えベクターを提供する。

【0102】

本明細書において用語“ベクター”は、伝達ベクターと発現ベクターを含む。

【0103】

本明細書において用語“伝達ベクター”は、断離された核酸を含み、断離された核酸を細胞内部に伝達する上で使用可能な物質の組成のことを指す。線形ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物と連結されたポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスを含むが、これに限定されるものではない。より具体的に、前記伝達ベクターは、自己複製性プラスミド又はウイルスを含む。前記用語は、細胞内への核酸の転移を促進させる非プラスミド及び非ウイルス性化合物、例えばポリリシン化合物、リポソームなどをさらに含み得るものと解釈される必要がある。ウイルス性伝達ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ連関ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターを含むが、これに限定されるものではない。

【0104】

本発明の一具現例において、前記ベクターはレンチウイルスベクターである。本発明の具体的な一具現例において、前記ベクターはプロモーターをさらに含む。前記プロモーターは、例えば、ＥＦ－１プロモーターであるが、これに限定されるものではない。

【0105】

本発明の他の具現例において、前記ベクターは、レトロウイルスベクターでよい。レトロウイルスは、遺伝子伝達システムのための便利なプラットホームを提供する。遺伝子伝達のために選択された遺伝子は、レトロウイルスベクター内に挿入され、レトロウイルス粒子内にパッケージングされてよい。次いで、組み換えられたレトロウイルスは、インビボ又はインビトロで目的とする宿主細胞に伝達されてよい。多くのレトロウイルスベクターが関連技術分野に知られており、本発明の具体的な具現例において、前記レトロウイルスベクターは、ＭＬＶ－ベースのレトロウイルスベクターであるｐＭＴレトロウイルスベクターであるが、これに限定されるものではない。

【0106】

本明細書において用語“発現ベクター”は、宿主細胞において目的遺伝子を発現させるために、発現させるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えヌクレオチドを含むベクターのことを指す。発現ベクターは、発現のための十分のシス作用因子（ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞又は試験管内発現システムによって提供されてよい。前記発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドを含むプラスミドベクター；コスミドベクター；そしてバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルス、レトロウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。本発明の具体的な具現例によれば、本発明のベクターにおいて前記スイッチ分子をコードする核酸分子は、前記ベクターのプロモーターと作動的に結合（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）されている。本明細書において、用語“作動的に結合され”とは、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との機能的な結合を意味し、これによって前記調節配列は前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節する。

【0107】

本発明の組換えベクターシステムは、当業界に公知の様々な方法によって構築されてよく、これに対する具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に開示されており、この文献は本明細書に参照によって組み込まれる。

【0108】

本発明のベクターは、遺伝子クローニングのためのベクター、タンパク質の発現のためのベクター、又は遺伝子の伝達のためのベクターとして構築されてよい。また、本発明のベクターは、原核細胞又は真核細胞を宿主にして構築されてよい。

【0109】

例えば、本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター、ｂｅｔａ－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が用いられてよく、それらは一般に転写終結配列としてポリアデニル化配列を有する。

【0110】

本発明のベクターは、それから発現するポリペプチド又はタンパク質の精製を容易にするために、他の配列と融合されてもよい。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。一方、本発明の発現ベクターは、本発明の抗体又はその抗原結合断片、及びこれを含むＣＡＲポリペプチドの発現を評価するための選択標識として選択可能マーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子を含むことができる。選択可能マーカー遺伝子としては、当業界において通常用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子を含む。

【0111】

本発明の組換えベクターを細胞内に導入して発現させる方法は、関連技術分野によく知られている。ベクターは、当業界に公知の方法によって宿主細胞、例えば、哺乳動物、バクテリア、酵母、又は昆虫細胞内に容易に導入可能である。例えば、ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞内に伝達されてよい。前記物理的手段は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子爆撃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、微細注入、電気穿孔などを含む。前記化学的手段は、コロイド分散液システム、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズ、及び水中油エマルジョン、マイセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、混合したマイセル、及びリポソームを含む脂質ベースシステムを含む。また、前記生物学的手段は、上述したレンチウイルス、レトロウイルスなど、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターの使用を含む。

【0112】

本発明の他の一態様によれば、本発明は、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを発現させる効果器細胞を提供する。

【0113】

本発明の一具現例において、前記効果器細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、自然殺害細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、大食細胞及びそれらの前駆細胞からなる群から選ばれるが、これに限定されるものではない。ここで、前記Ｔリンパ球は、炎症性Ｔリンパ球、細胞毒性Ｔリンパ球、調節Ｔリンパ球又はヘルパーＴリンパ球からなる群から選ばれる。

【0114】

本発明において前記効果器細胞は、自己細胞又は同種異型細胞の集団を含む。すなわち、前記効果器細胞は、本抗Ｌ１ＣＡＭ ＣＡＲポリペプチドを発現させる自己細胞又は同種異型細胞の集団を含む。

【0115】

本明細書において、用語“自己”とは、個体に再導入される予定である、同じ個体から由来した任意の物質のことを指す。本明細書において、用語“同種”とは、物質が導入される個体と同じ種の異なる動物から由来した任意の物質のことを指す。

【0116】

また、本発明の一具現例によれば、前記効果器細胞は、抗Ｌ１ＣＡＭ ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターで形質感染又は形質導入された細胞の集団を含む。前記形質感染又は形質導入は、上述したように、当業界に知られた様々な手段によって制限なく行われてよい。

【0117】

したがって、本発明の具体的な具現例によれば、本発明の効果器細胞、例えば、Ｔリンパ球、又は自然殺害細胞に伝達され、抗Ｌ１ＣＡＭ ＣＡＲコーディング核酸分子はｍＲＮＡに転写され、前記ｍＲＮＡから抗Ｌ１ＣＡＭ ＣＡＲポリペプチドが翻訳されて効果器細胞の表面に発現する。

【0118】

本発明の実施例で立証された通り、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ＣＡＲを発現させる効果器細胞は、表面にＬ１ＣＡＭを発現させる癌細胞株であるＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞株）、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ（神経芽細胞腫細胞株）、ＨｅＬａ（子宮頸癌細胞株）を効果的に死滅させる。したがって、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ＣＡＲを発現させる効果器細胞は、様々な癌腫に対する治療用組成物の有効成分として有用に使用可能である。

【0119】

本発明の他の一態様によれば、本発明は上述した抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片を含む、癌又は炎症性疾患の治療又は診断用薬剤学的組成物を提供する。

【0120】

本発明のさらに他の一態様によれば、本発明は、上述したキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現させる効果器細胞を含む、癌又は炎症性疾患の治療用薬剤学的組成物を提供する。

【0121】

前記薬剤学的組成物は、上記の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片、又はキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現させる効果器細胞を含む免疫治療用薬剤学的組成物である。

【0122】

本明細書において“免疫治療（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）”とは、兔疫体系が癌を除去するように手伝う癌の治療方法である。免疫治療は、能動的免疫治療と受動的免疫治療とに区別される。能動的免疫治療は、ｉ）癌細胞又は癌細胞によって生成された物質を人体に注入して兔疫体系を活性化させる癌ワクチン治療（ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）、ｉｉ）サイトカイン（インターフェロン、インターロイキンなど）、成長因子など免疫調節剤（ｉｍｍｕｎｅ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）を投与して特定白血球を活性化させる免疫調節治療を含む。受動的免疫治療は、特定癌細胞に結合する治療的抗体（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と免疫細胞治療（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）を含む。免疫細胞治療は、具体的に、樹状細胞ワクチン治療（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）とＣＡＲ－Ｔ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ）治療、ＮＫ細胞治療（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）、ＣＴＬ治療（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｔｈｅｒａｐｙ）、養子細胞転移（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）などを含むが、これに限定されるものではない。本発明において免疫治療は、主に、上述した免疫細胞治療を意味する。

【0123】

本発明の薬剤学的組成物は、標的細胞のＬ１ＣＡＭ抗原に結合する抗体又は抗原結合断片、又はこれを含むキメラ抗原受容体を発現させる効果器細胞を含むので、Ｌ１ＣＡＭの高発現に関連した疾患の診断又は治療に効果的である。前記Ｌ１ＣＡＭの高発現に関連した疾患には癌と炎症性疾患がある。

【0124】

特に、前記Ｌ１ＣＡＭの高発現に関連した癌は、固形癌であり、該固形癌は、胃癌、乳癌、膵癌、子宮頸癌、子宮内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、消化管間質腫瘍（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｕｍｅｒ）、卵巣癌、黒色腫、胆嚢癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌｏａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆管癌（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膵管腺癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、食道癌、腎細胞癌（ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、直膓癌、結腸癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、甲状腺癌、神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）、膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）及び星状細胞腫（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）からなる群から選ばれる。

【0125】

また、前記Ｌ１ＣＡＭの高発現に関連した炎症性疾患は、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）であるが、これに限定されるものではない。

【0126】

本発明の薬剤学的組成物は、上述したＣＡＲ発現効果器細胞、例えば、複数のＣＡＲ発現効果器細胞を一つ以上の製薬的又は生理学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて含むことができる。前記薬剤学的組成物は、緩衝剤、例えば、中性緩衝塩水、ホスフェート緩衝塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチド又はアミノ酸、例えば、グリシン；抗酸化剤；キレーティング剤、例えば、ＥＤＴＡ又はグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含むことができる。本発明の一具現例において、前記薬剤学的組成物は静脈内投与のために製剤化される。

【0127】

本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、例えば、静脈内投与、皮下投与、血内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、脳内投与、頭蓋骨内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できるが、これに限定されるものではない。

【0128】

本発明の効果器細胞を含む薬剤学的組成物は、皮膚内又は皮下注射によって患者に投与される。一具現例において、本発明の薬剤学的組成物は、静脈内注射によって投与される。他の具現例において、本発明の薬剤学的組成物は、腫瘍、リンパ節、又は感染部位内に直接投与されてもよい。

【0129】

本発明を必要とする対象体は、末梢血液幹細胞移植後に高容量化学療法を用いた標準治療を受けることができる。本発明の一具現例において、本発明を必要とする対象体には、前記末梢血液幹細胞移植後に又は移植と同時に、本発明の拡張されたＣＡＲ Ｔ細胞が投与されてよい。他の具現例において、拡張された細胞は、手術前又は手術後に投与される。

【0130】

本発明の薬剤学的組成物の“免疫学的有効量”、“抗腫瘍有効量”、“腫瘍抑制有効量”、又は“治療量”に適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって決定され、熟練した通常の医者は所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方でき、適切な投与量は臨床試験によって決定されるだろう。本明細書において用語“治療”は、疾患状態の減少、抑制、鎮静又は根絶を意味する。本明細書において用語“抗腫瘍”は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、期待寿命の増加、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存の減少、又は癌的病態と関連した様々な生理学的症状の改善を含むが、これに制限されない。

【0131】

本願に記載されたＴ細胞を含む薬剤学的組成物は、通常、１０^４～１０^９細胞／ｋｇ体重、いくつかの場合に１０^５～１０^６細胞／ｋｇ体重（前記範囲内の全ての整数値を含む。）の投与量で投与できるといえよう。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で多回投与されてもよい。細胞は、免疫療法において通常知られた注入技術を用いて投与できる（例えば、［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８］参照）。

【0132】

本発明の薬剤学的組成物はまた、上述した有効成分の他、他の薬剤学的活性薬剤及び療法も組み合わせて用いられてもよい。前記“組合せ”は、同時又は併用投与で表現されてもよい。本願に記載のＣＡＲ発現効果器細胞及び少なくとも一つの追加の治療剤は同時に、同一の組成物内に又は別個の組成物内に、又は順次に投与されてよい。順次投与のために、本願に記載のＣＡＲ発現細胞が最初に投与され、追加の作用剤は２番目に投与されてもよく、その逆の順序で投与されてもよい。

【0133】

上記本発明の薬剤学的組成物と組み合わせて使用可能な治療剤には、当業界に公知の１以上の化学治療剤（例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなど）、１以上の標的治療剤（例えば、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、オラパリブ（ｏｌａｐａｒｉｂ）など）、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１特異的な免疫関門抑制剤（例えば、オプジーボ、キイトルーダ）があるが、これに限定されるものではない。

【0134】

本発明のさらに他の一態様によれば、本発明は、前記のキメラ抗原受容体を発現させる効果器細胞を、治療が必要な対象体に投与する段階を含む、癌又は炎症性疾患の治療方法を提供する。

【0135】

本発明の治療方法の対象疾病である前記癌及び炎症性疾患は、薬学的組成物の治療対象疾病と関連して定義した通りである。

【0136】

本発明の一具現例において、前記対象体は、哺乳動物又はヒトである。

【0137】

本発明の癌又は炎症性疾患の治療方法は、有効成分として上述したキメラ抗原受容体を発現させる効果器細胞を共通に使用する方法であるので、重複する内容については本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

【0138】

〔発明の効果〕
本発明は、Ｌ１ＣＡＭ抗原に特異的に結合する抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片、これを含むキメラ抗原受容体、及びそれらの用途を提供する。本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体又はその抗原結合断片は、Ｌ１ＣＡＭに対する特異性及び親和性に優れるので、Ｌ１ＣＡＭの高発現に関連した様々な癌及び炎症性疾患に関連した疾病の治療及び診断に用いることができる。特に、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体を含むキメラ抗原受容体をＴリンパ球などの効果器細胞に発現させる場合、Ｌ１ＣＡＭに関連した様々な癌及び炎症性疾患の免疫治療方法として有用に用いることができる。

【0139】

〔図面の簡単な説明〕
図１は、ファージディスプレイライブラリーパンニング過程を図式化したものである。

【0140】

図２は、ファージパンニングラウンドによる抗原ｍＬ１ＣＡＭのファージの増幅（ｅｎｒｉｃｈｉｍｅｎｔ）程度を示すグラフである（上：ファージ出力力価（ｐｈａｇｅ ｏｕｔｐｕｔ ｔｉｔｅｒ）、下：溶出力価率（Ｅｌｕｔｉｏｎ ｔｉｔｅｒ ｒａｔｉｏ））。

【0141】

図３Ａ～図３Ｃは、ファージパンニングラウンド別抗原ｍＬ１ＣＡＭに対して特異的に結合するファージクローンを選別するために単一クローンファージＥＬＩＳＡ（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｐｈａｇｅ ＥＬＩＳＡ）を行った結果を示す。

【0142】

図４は、本発明の選別された９種のｓｃＦｖクローンの選別頻度を示す図である。

【0143】

図５は、ヒトＬ１ＣＡＭとマウスＬ１ＣＡＭに交差結合する抗体発掘のために本発明で選別したマウスＬ１ＣＡＭに結合するユニークな（ｕｎｉｑｕｅ）抗ｍＬ１ＣＡＭ ｓｃＦｖクローンの９種を対象にしてｈＬ１ＣＡＭに対して単一クローンファージＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。

【0144】

図６は、精製された抗ｍＬ１ＣＡＭ ｓｃＦｖクローンのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。

【0145】

図７Ａ～図７Ｃは、図５の可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）ＥＬＩＳＡ結果による本発明の４種の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体のｍＬ１ＣＡＭ及びｈＬ１ＣＡＭ抗原に対する親和性を示す図である。

【0146】

図７Ｄ～図７Ｅは、オクテットシステム結果による本発明の４種の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体のｍＬ１ＣＡＭ及びｈＬ１ＣＡＭ抗原に対する親和性を示す図である。

【0147】

図８は、本発明の選別された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するために用いられたｐＭＴ－ＣＡＲプラスミドのベクターマップを示す図である。

【0148】

図９は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【0149】

図１０Ａ及び図１０Ｂは、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－ＣＡＲ－００１、Ｌ１－ＣＡＲ－００２、Ｌ１－ＣＡＲ－００３、及びＬ１－ＣＡＲ－００４）の構造を示す図である。

【0150】

図１１Ａ及び図１１Ｂは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含む４種のＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－ＣＡＲ－００１、Ｌ１－ＣＡＲ－００２、Ｌ１－ＣＡＲ－００３、及びＬ１－ＣＡＲ－００４）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【0151】

図１２は、ＳＫＯＶ３細胞と２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【0152】

図１３Ａ及び図１３Ｂは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＳＫＯＶ３細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現、図１３Ａ）及び２９３Ｔ細胞（Ｌ１ＣＡＭ低発現、図１３Ｂ）に対する抗癌活性を示す図である。

【0153】

図１４は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ＣＡＲ（抗Ｌ１－ＣＡＲ）発現Ｔ細胞の生体内抗癌活性能を示す図である。

【0154】

図１５は、本発明の選別された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するために用いられたｐＭＴ－ＣＡＲ－００２プラスミドのベクターマップを示す図である。

【0155】

図１６は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【0156】

図１７は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００２）の構造を示す図である。

【0157】

図１８は、本発明の選別された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するために用いられたｐＭＴ－ＣＡＲ－００３プラスミドのベクターマップを示す図である。

【0158】

図１９は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【0159】

図２０は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００３）の構造を示す図である。

【0160】

図２１は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【0161】

図２２は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００４）の構造を示す図である。

【0162】

図２３Ａ～図２３Ｄは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含む４種のＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００２、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００３、及びＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００４）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【0163】

図２４Ａ～図２４Ｇは、ＳＫＯＶ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【0164】

図２５は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＳＫＯＶ３細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【0165】

図２６は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の２９３Ｔ細胞（Ｌ１ＣＡＭ低発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【0166】

図２７Ａ及び図２７Ｂは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【0167】

図２８Ａ及び図２８Ｂは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＨｅｌａ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【0168】

図２９は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ＣＡＲ（抗Ｌ１－ＣＡＲ）発現Ｔ細胞の生体内抗癌活性能を示す図である。

【0169】

図３０は、本発明の選別された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するために用いられたｐＭＴ－ＣＡＲ－００４プラスミドのベクターマップを示す図である。

【0170】

図３１は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【0171】

図３２は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８ＢＢ）の構造を示す図である。

【0172】

図３３は、本発明の選別された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するために用いられたｐＢＨＡ－ＩＣＯＳ ＴＭ＋ＩＣＤプラスミドのベクターマップを示す図である。

【0173】

図３４は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【0174】

図３５は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８ＩＣＯＳ）の構造を示す図である。

【0175】

図３６は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【0176】

図３７は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８）の構造を示す図である。

【0177】

図３８は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【0178】

図３９は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＯＸ）の構造を示す図である。

【0179】

図４０は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【0180】

図４１は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＢＢ）の構造を示す図である。

【0181】

図４２は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【0182】

図４３は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＩＣＯＳ）の構造を示す図である。

【0183】

図４４Ａ～図４４Ｆは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含む６種のＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８ＢＢ、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８ＩＣＯＳ、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＯＸ、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＢＢ、及びＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＩＣＯＳ）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【0184】

図４５Ａ～図４５Ｉは、ＳＫＯＶ３細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【0185】

図４６は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＳＫＯＶ３細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【0186】

図４７は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の２９３Ｔ細胞（Ｌ１ＣＡＭ低発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【0187】

図４８Ａ～図４８Ｃは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【0188】

図４９Ａ～４９Ｃは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＨｅｌａ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【0189】

図５０は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ＣＡＲ（抗Ｌ１－ＣＡＲ）発現Ｔ細胞の生体内抗癌活性能を示す図である。

【0190】

図５１は、本発明の選別された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するために用いられたｐＢＨＡ－３Ｅ８ＬＳ－Ｈ８Ｒｅｖプラスミドのベクターマップを示す図である。

【0191】

図５２は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【0192】

図５３は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００５）の構造を示す図である。

【0193】

図５４は、本発明の選別された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するために用いられたｐＭＴ－ＣＡＲ－００５プラスミドのベクターマップを示す図である。

【0194】

図５５は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【0195】

図５６は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００６）の構造を示す図である。

【0196】

図５７は、本発明の選別された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するために用いられたｐＭＴ－ＣＡＲ－００６プラスミドのベクターマップを示す図である。

【0197】

図５８は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【0198】

図５９は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００７）の構造を示す図である。

【0199】

図６０Ａ～図６０Ｃは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含む３種のＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００５、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００６、及びＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００７）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【0200】

図６１Ａ～図６１Ｆは、ＳＫＯＶ３細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【0201】

図６２は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＳＫＯＶ３細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【0202】

図６３は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【0203】

図６４は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＨｅｌａ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【0204】

図６５は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の２９３Ｔ細胞（Ｌ１ＣＡＭ低発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【0205】

〔発明を実施するための形態〕
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。

【0206】

〔実施例〕
本明細書全体を通じて、特定物質の濃度を表すために使われる“％”は、特に言及しない限り、固体／固体は（重量／重量）％、固体／液体は（重量／体積）％、そして液体／液体は（体積／体積）％である。

【0207】

〔実施例１：Ｌ１ＣＡＭ抗原に対するｓｃＦｖ抗体選別〕
１．１．ヒト合成ｓｃＦｖファージディスプレイ抗体ライブラリーパンニング
マウスＬ１ＣＡＭ（ｍｏｕｓｅ Ｌ１ＣＡＭ，ｍＬ１ＣＡＭ）抗原に結合する抗ｍＬ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体を選別するために、ヒト合成ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリー（ＫｓｃＦｖ－１、ＫＢＩＯ ＨＥＡＬＴＨ）を用いて、抗原ｍＬ１ＣＡＭタンパク質に対するファージパンニングを４ラウンドまで行った（図１）。抗原ｍＬ１ＣＡＭタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｃａｔ Ｎｏ．５６７４－ＮＣ）を免疫チューブに添加し、４℃で一晩インキュベーションした後、５％スキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）が含まれたＰＢＳ（ＭＰＢＳ）で常温で１時間反応してブロッキング過程を行った。ＫｓｃＦｖ－１にＭＰＢＳを添加後、常温で１時間反応して、ブロッキングされたファージ（ｂｌｏｃｋｅｄ ｐｈａｇｅ）を準備した。ブロッキングされたファージ（Ｂｌｏｃｋｅｄ ｐｈａｇｅ）を抗原ｍＬ１ＣＡＭタンパク質がコーティングされた免疫チューブに添加し、３７℃で９０分間反応した。０．０５％ ｔｗｅｅｎ２０が含まれたＰＢＳで洗浄した後、１００ｍＭトリメチルアミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）を添加し、免疫チューブに付着されたファージ（ｐｈａｇｅ）を収穫（ｅｌｕｔｉｏｎ）した。収穫したファージ（ｐｈａｇｅ）に１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加して中和（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）させた後、対数中期（ｍｉｄ－ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）（ＯＤ_６００＝０．５～１．０）状態で培養したＴＧ１ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｌｕｃｉｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．６０５０２－２）を添加し、３７℃で１時間培養した。培養後に細胞ペレット（ｃｅｌｌ ｐｅｌｌｅｔ）を集めて、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）と２％グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）が含まれたＴＢ培地プレートに接種した。培養されたコロニーを集めて５０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を添加し、－８０℃で保管した。抗原ｍＬ１ＣＡＭタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｃａｔ Ｎｏ．５６７４－ＮＣ）がＦｃドメインと融合されているので、パンニング段階でＦｃ除去（Ｆｃ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）するＦｃ対照群（Ｆｃ ｃｏｎｔｒｏｌ）パンニングも併行し、それぞれの出力力価（ｏｕｔｐｕｔ ｔｉｔｅｒ）を毎ラウンドごとに比較することによって、溶出力価率（ｅｌｕｔｉｏｎ ｔｉｔｅｒ ｒａｔｉｏ）からファージの濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）をモニタリングした。前記溶出力価率は、ファージ出力力価（ａｎｔｉｇｅｎ ｍＬ１ＣＡＭ）値をＦｃ対照群出力力価（Ｆｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｕｔｐｕｔ ｔｉｔｅｒ）（ｎｏ ａｎｔｉｇｅｎ ｍＬ１ＣＡＭ）で割った値である。図２に示すように、ファージパンニング２ラウンドからＦｃ対照群（Ｆｃ ｃｏｎｔｒｏｌ）と出力力価（ｏｕｔｐｕｔ ｔｉｔｅｒ）において大きな差を示し、ファージパンニング２ラウンドから濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）が始まってファージパンニング２ラウンドでは抗原ｍＬ１ＣＡＭに対して対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて約２３．９倍、ファージパンニング３ラウンドでは６６．１倍、ファージパンニング４ラウンドでは１４１．４倍の差を示した。

【0208】

１．２．ファージＥＬＩＳＡスクリーニング（Ｐｈａｇｅ ＥＬＩＳＡ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）
ファージパンニングから得たファージのうち、抗原ｍＬ１ＣＡＭタンパク質に特異的に付着するクローンを選別するために、パンニング２、３、４ラウンドで得たそれぞれ９５個のクローンを対象に単一クローンファージＥＬＩＳＡ（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｐｈａｇｅ ＥＬＩＳＡ）を行った。

【0209】

具体的に、９６ウェルプレートに抗原ｍＬ１ＣＡＭタンパク質を添加して４℃で一晩インキュベーションした後、２％ ＭＰＢＳで３７℃で２時間ブロッキングした。抗原ｍＬ１ＣＡＭタンパク質がＦｃドメインと融合されているため、Ｆｃ対照群としてＦｃも９６ウェルプレートに添加して４℃で一晩インキュベーションした後、２％ ＭＰＢＳで３７℃で２時間ブロッキングした。次に、前記９６ウェルプレートにファージ（～１０１１ｃｆｕ）を添加した。常温で９０分間反応した後、ＨＲＰ－ａｎｔｉ－Ｍ１３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｔ Ｎｏ．１１９７３－ＭＭ０５）をＰＢＳに１：５０００に希釈して９６ウェルプレートに添加した。常温で１時間反応した後、ＴＭＢ基質（ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｔ０４４０）と２Ｎ濃度のＨ_２ＳＯ_４（Ｍｅｒｃｋ、Ｃａｔ Ｎｏ．１００７３１）を順次に添加し、４５０ｎｍで吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）（ＯＤ）を測定した。その結果、抗原ｍＬ１ＣＡＭに対して吸光度（Ａ４５０ｎｍ）カットオフ（ｃｕｔ－ｏｆｆ）をそれぞれ０．４以上に決めて選別したとき、２ラウンドで１個、３ラウンドで総２６個、４ラウンドで総９個のクローンが、抗原ｍＬ１ＣＡＭに対して特異的に結合すること（陽性）がＥＬＩＳＡから確認された（図３）。

【0210】

１．３．本発明のｍＬ１ＣＡＭ抗原に対するユニークなｓｃＦｖクローンの配列分析
単一クローンファージＥＬＩＳＡ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｐｈａｇｅ ＥＬＩＳＡ）において陽性反応を示した抗原ｍＬ１ＣＡＭに対する３６種のｓｃＦｖクローンを配列分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）した後、カバットナンバリング（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）によって配列を整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）してグループ化（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）した結果、総９種のユニークな抗ｍＬ１ＣＡＭ ｓｃＦｖクローンが得られた（表１及び表２）。抗原ｍＬ１ＣＡＭに対して得られたｓｃＦｖクローンの選別頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を見ると、３ラウンドクローン（ｍＬ１ＣＡＭ－３Ｒ－Ｈ８、ｍＬ１ＣＡＭ－３Ｒ－Ｅ１、ｍＬ１ＣＡＭ－３Ｒ－Ｃ９）がそれぞれ３３％、２６％、１６％であって、多数クローンとして選別され、残りのクローンが３～１０％範囲であって、少数クローンとして選別された（図４）。

【0211】

【表1】

【0212】

ここで、前記太字で表示したクローンＩＤは、各グループを代表するクローンＩＤを意味する。

【0213】

【表2】

【0214】

ここで、前記太字で表示したクローンＩＤは、各グループを代表するクローンＩＤを意味する。

【0215】

１．４．ヒトＬ１ＣＡＭ（ｈＬ１ＣＡＭ）及びマウスＬ１ＣＡＭ（ｍＬ１ＣＡＭ）に交差結合するｓｃＦｖ抗体の発掘
ヒトＬ１ＣＡＭ（ｈＬ１ＣＡＭ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｃａｔ Ｎｏ．７７７－ＮＣ）とマウスＬ１ＣＡＭに交差結合する抗体発掘のために、抗原ｈＬ１ＣＡＭに対するユニークな抗ｍＬ１ＣＡＭ ｓｃＦｖクローンの総９種を対象に単一クローンファージＥＬＩＳＡ（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｐｈａｇｅ ＥＬＩＳＡ）を行った。その結果、抗原ｈＬ１ＣＡＭに対して吸光度（Ａ４５０ｎｍ）カットオフをそれぞれ０．４以上に決めて選別したとき、総４個のクローン（ｍＬ１ＣＡＭ－３Ｒ－Ｈ８、ｍＬ１ＣＡＭ－３Ｒ－Ｃ９、ｍＬ１ＣＡＭ－３Ｒ－Ｅ１、ｍＬ１ＣＡＭ－３Ｒ－Ｅ９）がｈＬ１ＣＡＭに交差結合することが確認された（図５）（表３及び表４）。

【0216】

【表3】

【0217】

ここで、前記太字で表示したクローンＩＤは、各グループを代表するクローンＩＤを意味する。

【0218】

【表4】

【0219】

ここで、前記太字で表示したクローンＩＤは、各グループを代表するクローンＩＤを意味する。

【0220】

１．５．本発明のヒトＬ１ＣＡＭ及びマウスＬ１ＣＡＭに交差結合する４種のユニークなｓｃＦｖクローンの大腸菌発現及び精製
交差結合性評価及び単一クローンファージＥＬＩＳＡから得られた総４種のユニークな抗ｍＬ１ＣＡＭ ｓｃＦｖクローンを、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクター（ｐＫＦＡＢ、ＫＢＩＯ ＨＥＡＬＴＨ）にクローニングした後、ＴＢ培地２００ｍＬで０．５μＭ ＩＰＴＧによって発現を誘導し、３０℃で一晩培養した後、ペリプラズムタンパク質抽出（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）によって可溶性タンパク質を得た後、ｓｔｒｅｐ ｔａｇ ＩＩカラムを用いた親和性クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で精製を行った。精製された各クローンの発現は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から確認した（図６）。

【0221】

１．６．親和性（Ａｆｆｉｎｉｔｙ）分析
本発明で選別及び精製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ（４種）抗体タンパク質を用いた可溶性ＥＬＩＳＡ（ｓｏｌｕｂｌｅ ＥＬＩＳＡ）によって、Ｌ１ＣＡＭタンパク質に結合する各クローンの親和性を比較分析した。

【0222】

具体的に、９６ウェルプレートに抗原ｍＬ１ＣＡＭタンパク質又は抗原ｈＬ１ＣＡＭタンパク質を添加し、４℃で一晩インキュベーションした後、２％ ＭＰＢＳで常温で１時間ブロッキングした。次に、精製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体タンパク質を添加した。常温で９０分間反応した後、ＨＲＰ－ａｎｔｉ－ＳｔｒｅｐＭＡＢ（ＩＢＡ、Ｃａｔ Ｎｏ．２－１５０９－００１）を２％ ＭＰＢＳに１：５０００に希釈して添加した。常温で１時間反応した後、ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｔ０４４０）及び２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４（Ｍｅｒｃｋ、Ｃａｔ Ｎｏ．１００７３１）を順次に添加し、４５０ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定した。その結果、本発明の各クローンは、５ｎＭ（ｍＬ１ＣＡＭ－３Ｒ－Ｃ９）～５０ｎＭ（ｍＬ１ＣＡＭ－３Ｒ－Ｅ１）の範囲の親和性で抗原ｍＬ１ＣＡＭに結合することが見られた。また、ｈＬ１ＣＡＭタンパク質に対する親和性を比較分析した結果、本発明の各クローンは、２ｎＭ（ｍＬ１ＣＡＭ－３Ｒ－Ｈ８）～２０．８７μＭ（ｍＬ１ＣＡＭ－３Ｒ－Ｅ９）の範囲の親和性で抗原ｈＬ１ＣＡＭに結合することが見られた（図７Ａ～図７Ｃ）。本発明の４種の交差結合クローンの結合力を各Ｌ１ＣＡＭに対して総合的に比較したとき、Ｈ８＞Ｅ１＞Ｃ９＞Ｅ９の順に高いことが確認された。

【0223】

４種のａｎｔｉ－Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖのうち、最高の結合力を示した３Ｒ－Ｈ８クローンに対して変換（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）過程を経て全（ｗｈｏｌｅ）ＩｇＧ１抗体を確保した。精製された全ＩｇＧ１抗体を用いたオクテットシステム（Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ、Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．ＱＫ３８４）によって抗原ｈＬ１ＣＡＭ（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｔ Ｎｏ．１０１４０－Ｈ０８Ｈ）タンパク質又はｍＬ１ＣＡＭ（Ｒ＆Ｄ、Ｃａｔ Ｎｏ．５６７４－ＮＣ）タンパク質との抗原－抗体親和度を分析した。その結果、抗原ｈＬ１ＣＡＭタンパク質とは４．１４Ｅ－０９ＫＤ（Ｍ）、抗原ｍＬ１ＣＡＭタンパク質とは２．０５Ｅ－０８ＫＤ（Ｍ）の結合力を有することを確認した（図７Ｄ～図７Ｅ）。

【0224】

〔実施例２．抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞作製及び効能確認〕
２．１．抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ遺伝子確保
２．１．１．抗ｍＬ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体遺伝子の確保
本発明で選別された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖのクローンを含んでいるァージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）からＬａｃプロモーター－正方向プライマー（Ｌａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）を用いた配列分析によって抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖクローンの塩基配列を確保した（表５）。分析された塩基配列に基づいて正方向プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）と逆方向プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を作製し、前記ァージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）を鋳型にしてＰＣＲ方法で増幅してＰＣＲ生成物を確保した。確保した抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体のＰＣＲ生成物を鋳型にして配列番号６８（表６）のプライマーと配列番号６９（表６）のプライマーを用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ；ＶＨ）の５’部位に結合するプライマーは、マウスの単一クローンＩｇＧである３Ｅ８抗体の先導配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＬＳ）の１２個の塩基配列を有し、抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ；ＶＬ）の３’部位に結合するプライマーは、ＩｇＤ ｈｉｎｇｅの１２個の塩基配列を有する。したがって、前記プライマーによって増幅されたＰＣＲ生成物は、３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ塩基配列を有する。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0225】

【表5】

【0226】

【表6】

【0227】

２．１．２． ３Ｅ８抗体の先導配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）遺伝子確保
３Ｅ８抗体の先導配列を含むｐＭＴ－ＣＡＲプラスミド（図８）を鋳型にして配列番号７０（表６）のプライマーと配列番号７１（表６）のプライマーを用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーは、Ｍｌｕ Ｉ制限酵素塩基配列を有し、３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の３’部位に結合するプライマーは、抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖の１２個の塩基配列を有する。したがって、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖの塩基配列を有することになる。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0228】

２．１．３．ヒトＩｇＤのヒンジ領域、膜横断ドメイン、細胞内信号伝達ドメイン、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζの遺伝子確保
本発明のＣＡＲコンストラクトを作製するために、次のような方法でヒトＩｇＤのヒンジ（Ｈｉｎｇｅ）領域、ＣＤ２８の膜横断ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ，ＴＭ）と細胞内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ，ＩＣＤ）、共同刺激ドメイン（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ）であるＯＸ４０及びＣＤ３ζ遺伝子を確保した。

【0229】

まず、ｐＭＴ－ＣＡＲプラスミド（図８）を鋳型にして配列番号７２（表６）のプライマーと配列番号７３（表６）のプライマーを用いてＰＣＲ方法で増幅した。このとき、ヒトＩｇＤ ｈｉｎｇｅ領域の５’部位に結合するプライマーは、抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖の１２個の塩基配列を含み、ＣＤ３ζの３’部位に結合するプライマーは、ＸｈｏＩ制限酵素塩基配列を含む。したがって、前記プライマーによって増幅されたＰＣＲ生成物は、ｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有することになる（表７）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0230】

【表7】

【0231】

２．１．４．ｐＧｅｍＴ－Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲベクター製造
前記２．１．２で増幅したＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖと、前記２．１．１で増幅したＰＣＲ生成物である３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅを鋳型にして配列番号７０（表６）のプライマーと配列番号６９（表６）のプライマーを用いてＯＥ－ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）方法で増幅した。

【0232】

その結果として増幅されたＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅと前記２．１．３で増幅したＰＣＲ生成物であるｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－Ｘｈｏ Ｉを鋳型にして配列番号７０（表６）のプライマーと配列番号７３（表６）のプライマーを用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図９）。その結果として増幅されたＰＣＲ生成物は、ＭｌｕＩ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ＸｈｏＩの塩基配列を有する。増幅したＰＣＲ生成物を直線型ＤＮＡの両端に多重Ｔ配列を有するｐＧｅｍＴ ＥＡＳＹベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、ＵＳＡ）に結紮し、ＣＡＲコンストラクトｐＧｅｍＴ－Ｌ１－ＣＡＲ－００１、ｐＧｅｍＴ－Ｌ１－ＣＡＲ－００２、ｐＧｅｍＴ－Ｌ１－ＣＡＲ－００３、及びｐＧｅｍＴ－Ｌ１－ＣＡＲ－００４を獲得した。獲得したＣＡＲコンストラクト配列分析から原本配列と同一であることを確認した（図１０）。前記配列分析には、配列番号７４及び７５（表６）のプライマー対を使用した。

【0233】

２．１．５．ｐＭＴ－Ｌ１－ＣＡＲレトロウイルスベクター製造
４種のｐＧｅｍＴ－Ｌ１－ＣＡＲベクターにＭｌｕ ＩとＸｈｏ Ｉ制限酵素処理してＤＮＡ切片を獲得した。獲得したＤＮＡ切片を、あらかじめＭｌｕ ＩとＸｈｏ Ｉ制限酵素で処理されたｐＭＴレトロウイルスベクター（米国登録特許第ＵＳ７，０４９，１４３号）に結紮し、４種のｐＭＴ－Ｌ１－ＣＡＲレトロウイルスベクターを作製した（図１１）。こうして製造されたｐＭＴ－Ｌ１－ＣＡＲレトロウイルスベクターは、ＭＬＶ ＬＴＲプロモーターの調節下で抗Ｌ１－ＣＡＲをコードする配列を含む。

【0234】

２．２．抗Ｌ１－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞製造
２．２．１．抗Ｌ１－ＣＡＲ遺伝子発現レトロウイルス（抗Ｌ１－ＣＡＲレトロウイルス）製造
抗Ｌ１－ＣＡＲ遺伝子の伝達のためのレトロウイルスは、プラスミドＤＮＡ形質転換法を用いて作製した（Ｓｏｎｅｏｋａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。ＴｒａｎｓＩＴ ２９３形質転換システム（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用い、メーカーのプロトコルにしたがって行った。前日に６０ｍｍ皿に１×１０^６個で播種した２９３Ｔ細胞株に、前記２．１で作製した各ｐＭＴ－Ｌ１－ＣＡＲレトロウイルスベクター（ｐＭＴ－Ｌ１－ＣＡＲ－００１、ｐＭＴ－Ｌ１－ＣＡＲ－００２、ｐＭＴ－Ｌ１－ＣＡＲ－００３、及びｐＭＴ－Ｌ１－ＣＡＲ－００４）、ｇａｇ－ｐｏｌ発現ベクター及びＲＤ１１４ ｅｎｖ発現ベクターを形質転換後に、細胞を約４８時間培養した。培養完了後に細胞培養液を全て収穫し、０．４５μｍフィルターを用いて濾過した。生産された４種の抗Ｌ１－ＣＡＲレトロウイルスは、レトロウイルス力価測定キット（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｔｉｔｅｒ ｓｅｔ）（ＴａＫａＲａ，ＪＡＰＡＮ）を用いて実時間ＰＣＲで力価を測定した後、使用するまで－８０℃に冷凍保管した。

【0235】

２．２．２．抗Ｌ１－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞製造
供与されたヒト血液をＳｅｐＭａｔｅ^ＴＭ－５０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）とＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて単核細胞を獲得した。単核細胞は、５％ヒト血清が含まれたＡＩＭＶ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培養液として使用し、１００ｍｍ皿に１Ｘ１０^７個で分注した後、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）抗体をｍＬ当たり５０ｎｇ添加してＴ細胞を活性化した。Ｔ細胞の成長のために、培養液にヒトＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ）をｍＬ当たり３００Ｕ添加して培養した。４８時間培養後に、活性化されたＴ細胞を収穫し、４種の抗Ｌ１－ＣＡＲレトロウイルス伝達に使用した。

【0236】

６ウェルプレートに１０μｇ／ｍＬ濃度で準備したレトロネクチン（ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ、ＴａＫａＲａ、Ｊａｐａｎ）をウェル当たり２ｍＬ添加した後、常温で２時間反応してプレートにコーティングした。反応後、残余レトロネクチンは除去し、２．５％ ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）が含まれたＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）を、ウェル当たり２ｍＬ添加し、常温で３０分反応してブロッキングした。反応後、ブロッキングに使用した溶液を除去し、１Ｍ ＨＥＰＥＳが２．５％含まれたＨＢＳＳをウェル当たり３ｍＬ添加して洗浄した。抗Ｌ１－ＣＡＲレトロウイルスをウェル当たり３×１０^１０ｃｏｐｉｅｓで５％ヒト血清が含まれたＡＩＭＶ培地で希釈して４ｍＬ添加後に、２０００ｘｇ、３２℃条件で２時間遠心分離してレトロウイルスをレトロネクチンに固定した。対照群として使用するウェルには、レトロウイルス希釈に使用した培地を同量添加した。反応後、残余レトロウイルスを除去し、活性化されたＴ細胞をウェル当たり２×１０^６個で添加後に、１０００ｘｇで１５分間遠心分離し、Ｔ細胞に抗Ｌ１－ＣＡＲレトロウイルスを伝達した。伝達効率を高めるためには、翌日、伝達過程を１回さらに反復して総２回進行した。伝達２４時間後に、Ｔ細胞を全て収穫し、５％ヒト血清とヒトＩＬ－２が３００Ｕ／ｍＬ含まれたＡＩＭＶ培地でｍＬ当たり５×１０^５個でＴフラスコに継代培養した。３～４日間隔でｍＬ当たり５×１０^５個で継代培養し、ｍＬ当たり２×１０^６個を超えないように維持した。

【0237】

抗Ｌ１－ＣＡＲレトロウイルスを伝達した活性化Ｔ細胞（抗Ｌ１－ＣＡＲ発現Ｔ）において抗Ｌ１－ＣＡＲが発現するかどうか確認しようとした。培養８日目と２０日目に１×１０^６個の細胞を準備し、ビオチン付着のｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｍ０００９７）と４℃で４５分間反応した。反応後、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）付着のストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）（ＢＤ、Ｃａｔ Ｎｏ．５５４０６１）と４℃で３０分間反応し、流細胞分析法（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて抗Ｌ１－ＣＡＲ発現率を確認した。その結果、供与者によって差異があるが、培養８日目には約１９．９％～６７．２％の抗Ｌ１－ＣＡＲ発現率を確認し、培養２０日目には約３４．５％～９４．９％の抗Ｌ１－ＣＡＲ発現率を確認した（表８）。

【0238】

【表8】

【0239】

２．３．抗Ｌ１－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞の抗癌活性能確認
２．３．１．ターゲット細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率確認
ヒト卵巣腺癌細胞株であるＳＫＯＶ３は、本発明の抗原であるＬ１ＣＡＭを高く発現させることが知られており、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗癌活性能を確認するのに適している細胞株である。これを確認するために、ＳＫＯＶ３細胞株をＰＢＳ １００μＬに５×１０^５個で準備し、ａｎｔｉ－ｈＣＤ１７１－ＰＥ（５Ｇ３ ｃｌｏｎｅ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ Ｎｏ．１２－１７１９－４２）抗体を０．２５μｇ添加した後、４℃で３０分間反応した。反応後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、流動細胞分析法を用いてＬ１ＣＡＭ発現を確認した。その結果、ＳＫＯＶ３癌細胞において約７４％のＬ１ＣＡＭ発現率を確認した。これに対し、同一の方法により、ヒト胚芽腎臓細胞株である２９３ＴでＬ１ＣＡＭの発現を確認した結果、約３％の発現率を確認した（図１２）。

【0240】

２．３．２．ターゲット細胞に対するＬ１ＣＡＭ発現Ｔ細胞の抗癌活性能確認
ターゲット細胞（ｔａｒｇｅｔ細胞、Ｔ）に対する本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ（抗Ｌ１－ＣＡＲ）発現Ｔ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞、Ｅ）の抗癌活性能を確認するために、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ（Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ）分析法を用いた。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ分析法は、ゴールドマイクロ電極バイオセンサー（ｇｏｌｄ ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）がコーティングされたプレートに電気伝導性溶液（例えば、培養培地）を含む場合、電子流れがインデックス値に数値化して示され、ターゲット細胞がプレートに付着する場合、電子流れを妨害し、インデックス値が変化する。ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）添加時に細胞殺傷能によって付着したターゲット細胞はプレートから落ち、インデックス値の変化を分析することによって抗癌活性能（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）が確認できる。ターゲット細胞を培養培地５０μＬに１×１０^４個で準備し、分析用プレートに添加した。２１時間後、抗Ｌ１－ＣＡＲ発現Ｔ細胞を、ヒト血清とヒトＩＬ－２が含まれたＡＩＭＶ培地５０μＬに１×１０^４個、５×１０^４個、１×１０^５個（Ｅ：Ｔ比率＝１、５、１０）で準備し、ターゲット細胞を含むウェルに添加して５０時間実時間で細胞インデックス（ｃｅｌｌ ｉｎｄｅｘ）値を確認した。また、ターゲット細胞だけを含むウェルを準備し、抗Ｌ１－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗癌活性能を下記のように計算した。
（式）
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ(％)＝{(ターゲット細胞ウェルのインデックス値)－(ターゲット細胞とＴ細胞反応ウェルのインデックス値)}／(ターゲット細胞ウェルのインデックス値)×１００
。

【0241】

その結果、本発明の４種の抗Ｌ１－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のうち、Ｌ１－ＣＡＲ－００４は、ＣＡＲを発現しないＴ細胞（対照群）に比べてＳＫＯＶ３細胞において高い細胞殺傷能を示した。Ｌ１－ＣＡＲ－００１は、供与者によって差異があったが、対照群に比べてＳＫＯＶ３細胞において細胞殺傷能を示した（図１３Ａ）。また、低いＬ１ＣＡＭ発現率を示す２９３Ｔ細胞では４種ともに対照群に比べて低い細胞殺傷能を示した（図１３Ｂ）。したがって、本発明の抗Ｌ１－ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、Ｌ１ＣＡＭ抗原を高いレベルに発現するターゲット癌細胞に対して抗癌活性を示すので、抗癌用途の細胞治療剤として有用に用いることができる。

【0242】

〔実施例３．生体内における抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞の効能確認（Ｉｎ ｖｉｖｏ）〕
生体内における抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞の抗癌活性能を確認するために、癌発生動物モデルを用いた。Ｔ細胞、Ｂ細胞、自然殺害細胞（ＮＫ細胞）が欠損したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（７週齢、雌）の右側横腹皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ，ＳＣ）にマトリゲルと１：１に混ぜたＳＫＯＶ３癌細胞（Ｔａｒｇｅｔ，Ｔ）３×１０^６個を投与して癌を発生させた。Ｉｎ ｖｉｔｒｏで効能が確認された抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の２種であるＬ１－ＣＡＲ－００２とＬ１－ＣＡＲ－００４、対照群Ｔ細胞を癌細胞投与３日後にそれぞれのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに１日１回で総３回投与した。１回投与当たりに２×１０^７個のＴ細胞を尾静脈（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ，ＩＶ）に投与し、癌のサイズを２５日まで測定した。その結果、対照群Ｔ細胞投与群に比べて、抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の２種ともに癌成長速度が阻害されたことを確認した（図１４）。特に、Ｌ１－ＣＡＲ－００２と比較してＬ１－ＣＡＲ－００４において癌成長速度が大きく阻害されたことから、生体内でＬ１－ＣＡＲ－００４の効能がより高いことを確認した。

【0243】

〔実施例４．様々なスぺーサドメイン（ｓｐａｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ）構造の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞作製及び効能確認〕
４．１．様々なスぺーサドメイン構造のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ遺伝子確保
４．１．１．ａｎｔｉ－ｍＬ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体遺伝子選定
実施例３で先行された抗癌活性能確認実験から、Ｌ１－ＣＡＲ－００４の癌成長速度阻害効果が最も優れることが確認された。Ｌ１－ＣＡＲ－００４（図１０）のＬ１ＣＡＭ特異的抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を確保し、それを次の遺伝子を確保するために使用し、その後、ｐＭＴ－Ｌ１－ＣＡＲ－００４をｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１と表記した。

【0244】

４．１．２．Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００２遺伝子確保
４．１．２．１． ３Ｅ８抗体の先導配列（ＬＳ）、ａｎｔｉ－ｍＬ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体遺伝子確保
ｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１を鋳型にしてプライマー配列番号７０（表９）と配列番号６９（表９）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーは、Ｍｌｕ Ｉ制限酵素塩基配列と３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の１８個の塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖの３’部位に結合するプライマーは、ｈＩｇＤヒンジの１２個の塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅの塩基配列を有することになる（表１０）。増幅した生成物は、次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0245】

【表9】

【0246】

【表10】

【0247】

４．１．２．２．ヒンジ、ＣＨ３、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
ヒトＩｇＤのヒンジとＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ３、ＣＤ２８のＴＭとＩＣＤ、共同刺激ドメインであるＯＸ４０及びＣＤ３ζ－ｉｓｏ１を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００２プラスミド（図１５）を鋳型にしてプライマー配列番号７２（表９）と配列番号７３（表９）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅの５’部位に結合するプライマーはＬ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ＶＬ）の１２個の塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の３’部位に結合するプライマーはＸｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＨ３－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有することになる（表１０）。増幅したＰＣＲ生成物は、次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0248】

４．１．２．３． ３Ｅ８ ＬＳ、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＣＨ３、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
増幅したＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅとＬ１－Ｈ８－ｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＨ３－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉを鋳型にしてプライマー配列番号７０（表９）と配列番号７３（表９）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ）で増幅した（図１６）。増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＨ３－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００２の構造を有する（図１７）。

【0249】

４．１．３． Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００３遺伝子確保
４．１．３．１． ３Ｅ８抗体の先導配列（ＬＳ）、ａｎｔｉ－ｍＬ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体遺伝子確保
ｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１を鋳型にしてプライマー配列番号７０（表９）と配列番号６９（表９）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーは、Ｍｌｕ Ｉ制限酵素塩基配列と３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の１８個の塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖの３’部位に結合するプライマーはｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅの１２個の塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅの塩基配列を有することになる（表１０）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0250】

４．１．３．２．ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
ヒトＩｇＤのヒンジとＩｇＧ１のヒンジ、ＣＤ２８のＴＭとＩＣＤ、共同刺激ドメインであるＯＸ４０及びＣＤ３ζ－ｉｓｏ１を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００３プラスミド（図１８）を鋳型にしてプライマー配列番号７２（表９）と配列番号７３（表９）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅの５’部位に結合するプライマーはＬ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ＶＬ）の１２個の塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の３’部位に結合するプライマーはＸｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有することになる（表１０）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0251】

４．１．３．３． ３Ｅ８ ＬＳ、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
増幅したＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅとＬ１－Ｈ８－ｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉを鋳型にしてプライマー配列番号７０（表９）と配列番号７３（表９）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図１９）。増幅されたＰＣＲ生成物はＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００３の構造を有する（図２０）。

【0252】

４．１．４． Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００４遺伝子確保
４．１．４．１． ３Ｅ８抗体の先導配列（ＬＳ）、ａｎｔｉ－ｍＬ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体遺伝子確保
ｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１を鋳型にしてプライマー配列番号７０（表９）と配列番号８３（表９）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーはＭｌｕ Ｉ制限酵素塩基配列と３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の１８個の塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖの３’部位に結合するプライマーはｈＩｇＧ１ヒンジの１２個の塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＧ１ヒンジの塩基配列を有することになる（表１０）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0253】

４．１．４．２．ヒンジ、ＣＨ３、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ３、ＣＤ２８のＴＭとＩＣＤ、共同刺激ドメインであるＯＸ４０及びＣＤ３ζ－ｉｓｏ１を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００２プラスミド（図１５）を鋳型にしてプライマー配列番号８４（表９）と配列番号７３（表９）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ｈＩｇＧ１ヒンジの５’部位に結合するプライマーはＬ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ＶＬ）の１２個の塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の３’部位に結合するプライマーはＸｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有することになる（表１０）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0254】

４．１．４．３． ３Ｅ８ ＬＳ、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＣＨ３、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
増幅したＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ＩｇＧ１ヒンジとＬ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉを鋳型にしてプライマー配列番号７０（表９）と配列番号７３（表９）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図２１）。増幅されたＰＣＲ生成物はＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００４の構造を有することになる（図２２）。

【0255】

４．１．５． ｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルスベクター製造
３種の増幅したＰＣＲ生成物をＭｌｕ ＩとＸｈｏ Ｉ制限酵素処理してＤＮＡ切片を獲得した。獲得したＤＮＡ切片を、あらかじめＭｌｕ ＩとＸｈｏ Ｉ制限酵素で処理されたｐＭＴレトロウイルスベクター（米国登録特許第ＵＳ６，４５１，５９５号）に結紮して３種のｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルスベクターを作製した（図２３）。こうして製造されたｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルスベクターは、ＭＬＶ ＬＴＲプロモーターの調節下でＬ１－Ｈ８－ＣＡＲをコードする配列を含む。

【0256】

４．２．様々なスぺーサドメイン構造のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ遺伝子発現レトロウイルス（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルス）製造
Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ遺伝子の伝達のためのレトロウイルスは、プラスミドＤＮＡ形質転換法を用いて作製した（Ｓｏｎｅｏｋａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。ＴｒａｎｓＩＴ ２９３形質転換システム（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ，ＷＩ，ＵＳＡ）用い、メーカーのプロトコルにしたがって行った。前日に６０ｍｍ皿に１×１０^６個で播種した２９３Ｔ細胞株に、４種のｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルスベクター、ｇａｇ－ｐｏｌ発現ベクター及びＲＤ１１４ ｅｎｖ発現ベクターを形質転換後、細胞を約４８時間培養した。培養完了後、細胞培養液を全て収穫し、０．４５μｍフィルターで濾過した。生産された４種のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルスは、レトロウイルス力価測定キット（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｔｉｔｅｒ ｓｅｔ ｋｉｔ）（ＴａＫａＲａ，ＪＡＰＡＮ）用いて実時間ＰＣＲで力価を測定した後、使用するまで－８０℃に冷凍保管した。

【0257】

４．３．様々なスぺーサドメイン構造のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞製造
供与されたヒト血液をＳｅｐＭａｔｅ^ＴＭ－５０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）とＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて単核細胞を獲得した。単核細胞は、５％ヒト血清が含まれたＡＩＭＶ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培養液として使用し、１００ｍｍ皿に１×１０^７個で分注した後、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）抗体をｍＬ当たり５０ｎｇ添加してＴ細胞を活性化させた。Ｔ細胞の成長のために培養液にヒトＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ）をｍＬ当たり３００Ｕ添加し、培養した。４８時間培養後に、活性化されたＴ細胞を収穫し、４種のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルス伝達に使用した。

【0258】

６ウェルプレートに１０ｕｇ／ｍＬ濃度で準備されたレトロネクチン（ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ、ＴａＫａＲａ、Ｊａｐａｎ）をウェル当たり２ｍＬ添加した後、常温で２時間反応してプレートにコーティングした。反応後、レトロネクチンは除去し、２．５％ヒトアルブミンが含まれたＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）をウェル当たり２ｍＬ添加し、常温で３０分反応してブロッキングした。反応後、ブロッキングに使用した溶液を除去し、１Ｍ ＨＥＰＥＳが２．５％含まれたＨＢＳＳをウェル当たり３ｍＬ添加して洗浄した。Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルスをウェル当たり３×１０^１０ｃｏｐｉｅｓで５％ヒト血清が含まれたＡＩＭＶ培地に希釈して４ｍＬ添加後、２０００ｘｇ、３２℃条件で２時間遠心分離してレトロウイルスをレトロネクチンに固定した。対照群として使用するウェルには、レトロウイルス希釈に使用した培地を同量添加した。反応後、レトロウイルスを除去し、活性化されたＴ細胞をウェル当たり２×１０^６個で添加後に、１０００ｘｇで１５分間遠心分離し、Ｔ細胞にＬ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルスを伝達した。伝達効率を高めるために、翌日に伝達過程を１回さらに反復して総２回進行した。伝達２４時間後、Ｔ細胞を全て収穫し、５％ヒト血清とヒトＩＬ－２が３００Ｕ／ｍＬ含まれたＡＩＭＶ培地でｍＬ当たり５×１０^５個でＴフラスコに継代培養した。３～４日間隔でｍＬ当たり５×１０^５個で継代培養し、ｍＬ当たり２×１０^６個を超えないように維持した。

【0259】

Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルスを伝達した活性化Ｔ細胞（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現Ｔ）においてＬ１－Ｈ８－ＣＡＲが発現するかどうか確認しようとした。培養１週目と２週目に１×１０^６個の細胞を準備し、ＦＩＴＣ付着のｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＲＰＬ－ＰＦ１４１）と４℃で３０分間反応し、流動細胞分析法（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いてＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現率を確認した。その結果、供与者によって差異があるが、培養８日目には約１６．４％～５２．４％のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現率を確認し、培養１５日又は１８日目には約２９．６％～６９．２％のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現率を確認した（表１１）。

【0260】

【表11】

【0261】

４．４．様々なスぺーサドメイン構造のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞の抗癌活性能確認（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
４．４．１．ターゲット細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率確認
ヒト卵巣腺癌細胞株であるＳＫＯＶ３はＬ１ＣＡＭを高く発現させることが知られており、抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗癌活性能を確認するのに適した細胞株である。これを確認するために、ＳＫＯＶ３細胞株をＰＢＳ１００ｕＬに５×１０^５個で準備し、ａｎｔｉ－ｈＣＤ１７１－ＰＥ（５Ｇ３クローン）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ Ｎｏ．１２－１７１９－４２）抗体を０．２５ｕｇ添加した後、４℃で３０分間反応した。反応後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、流動細胞分析法を用いてＬ１ＣＡＭ発現を確認した。その結果、ＳＫＯＶ３癌細胞で約９３．４～９９．２％のＬ１ＣＡＭ発現率を確認した（図２４Ａ～図２４Ｃ）。同一の方法を用いて、ヒト子宮頸癌細胞株であるＨｅＬａとヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＨ－ＳＹ５Ｙ、ヒト胚腎臓細胞株である２９３ＴにおいてＬ１ＣＡＭの発現を確認した結果、ＨｅＬａでは約９９．９％（図２４Ｆ）、ＳＨ－ＳＹ５Ｙでは約８９．６％（図２４Ｇ）、２９３Ｔでは約０．５７～０．６１％（図２４Ｄ～図２４Ｅ）の発現率を確認した。

【0262】

４．４．２．ターゲット細胞に対するＬ１ＣＡＭ発現Ｔ細胞の抗癌活性能確認（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
４．４．２．１．ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅアッセイを用いた抗癌活性能確認
ターゲット細胞（ｔａｒｇｅｔ細胞、Ｔ）に対する抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ）発現Ｔ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞、Ｅ）の抗癌活性能を確認するために、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ（Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ）分析法を用いた。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ分析法は、ゴールドマイクロ電極バイオセンサーがコーティングされたプレートに電気伝導性溶液（例えば、培養培地）を含む場合、電子流れがインデックス値で数値化して示され、ターゲット細胞がプレートに付着する場合、電子流れを妨害し、インデックス値が変化する。ＣＡＲ発現Ｔ細胞添加時に、細胞殺傷能によって付着したターゲット細胞はプレートから落ち、インデックス値の変化を分析することによって抗癌活性能（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）が確認できる。ターゲット細胞を培養培地５０ｕＬに１×１０^４個で準備し、分析用プレートに添加した。約２１時間後に、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現Ｔ細胞を、ヒト血清とヒトＩＬ－２が含まれたＡＩＭＶ培地５０ｕＬに１×１０^４個、５×１０^４個、１×１０^５個（Ｅ：Ｔ比率＝１、５、１０）で準備し、ターゲット細胞を含むウェルに添加して、約３０時間の間に実時間で細胞インデックス値を確認した。また、ターゲット細胞だけを含むウェルを準備し、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗癌活性能を下記のように計算した。
（式）Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（％）＝｛（ターゲット細胞ウェルのインデックス値）－（ターゲット細胞とＴ細胞反応ウェルのインデックス値）｝／（ターゲット細胞ウェルのインデックス値）×１００
。

【0263】

その結果、４種のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１、－００２、－００３、－００４発現Ｔ細胞は、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲを発現しないＴ細胞（対照群）に比べて、ＳＫＯＶ３細胞に対して高い細胞殺傷能を示した（図２５）。

【0264】

同一の実験方法を用いて２９３Ｔ細胞に対する殺傷能を確認した。ターゲット細胞を培養培地５０ｕＬに２．５×１０^４個で添加し、約２１時間後、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現Ｔ細胞を、ヒト血清とヒトＩＬ－２が含まれたＡＩＭＶ培地５０ｕＬに２．５×１０^４個、１．２５ｘ１０５個、２．５×１０^５個（Ｅ：Ｔ比率＝１、５、１０）で準備し、ターゲット細胞を含んでいるウェルに添加し、約３０時間の間に実時間で細胞インデックス値を確認した。また、ターゲット細胞だけを含んでいるウェルを準備し、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗癌活性能を上の実験と同一に計算した。その結果、低いＬ１ＣＡＭ発現率を示す２９３Ｔ細胞では４種ともに、対照群と類似の細胞殺傷能を示した（図２６）。

【0265】

４．４．２．２． ＣｅｌｌＴｏｘ^ＴＭグリーン色素（Ｇｒｅｅｎ ｄｙｅ）を用いた抗癌活性能確認
ターゲット細胞（ｔａｒｇｅｔ細胞、Ｔ）に対する抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ）発現Ｔ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞、Ｅ）の抗癌活性能を確認するために、ＣｅｌｌＴｏｘ^ＴＭグリーン色素を使用した。ＣｅｌｌＴｏｘ^ＴＭグリーン色素は、死んだ細胞から放出されるＤＮＡに付着して蛍光を示す染料であり、抗癌活性能（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を確認するために用いられる。ターゲット細胞を培養培地５０ｕＬに１×１０^４個で準備し、ＣｅｌｌＴｏｘ^ＴＭグリーン色素を０．２ｕＬ添加して黒色９６ウェルプレートに添加した。Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現Ｔ細胞を、ヒト血清とヒトＩＬ－２が含まれたＡＩＭＶ培地５０ｕＬに５×１０^３個、１×１０^４個、５×１０^４個、１×１０^５（Ｅ：Ｔ比率＝０．５、１、５、１０）で準備し、ターゲット細胞を含んでいるウェルに添加して３７℃ ＣＯ_２培養器で２４時間反応した。ＣｅｌｌＴｏｘ^ＴＭグリーン色素とターゲット細胞の培養培地を含んでいるウェルにＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現Ｔ細胞だけを添加した群を準備し、これを反応時間中に死ぬＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現Ｔ細胞から放出されるＤＮＡに付着し、発生する染料の反応値から除外した。また、ターゲット細胞だけを含んでいるウェルを準備し、ｌｏｗ ｃｏｎｔｒｏｌ（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ＤＮＡ ｒｅｌｅａｓｅ）値を補正し、ターゲット細胞だけを含んでいるウェルに溶菌液（ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加してｈｉｇｈ ｃｏｎｔｒｏｌ（ｍａｘｉｍｕｍ ＤＮＡ ｒｅｌｅａｓｅ）値を補正した。ターゲット細胞に対する殺傷能は、下の方法で計算した。
（式２）
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ(％)＝{(ターゲット細胞と効果器細胞の反応値)－(効果器細胞の反応値)}－(Ｌｏｗ ｃｏｎｔｒｏｌ)／(Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｒｏｌ－Ｌｏｗ ｃｏｎｔｒｏｌ)×１００
。

【0266】

その結果、４種のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１、－００２、－００３、－００４発現Ｔ細胞は、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲを発現しないＴ細胞（対照群）に比べてＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に対して高い細胞殺傷能を示した（図２７Ａ～図２７Ｂ）。

【0267】

同一の実験方法を用いてＨｅＬａ癌細胞に対する殺傷能を確認した。ターゲット細胞を培養培地５０ｕＬに３．５×１０^３個で準備し、ＣｅｌｌＴｏｘ^ＴＭグリーン色素を０．２ｕＬ添加して黒色９６ウェルプレートに添加した。Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現Ｔ細胞を、ヒト血清とヒトＩＬ－２が含まれているＡＩＭＶ培地５０ｕＬに１．７５×１０^３個、３．５×１０^３個、１．７５×１０^４個、３．５×１０^４個（Ｅ：Ｔ比率＝０．５、１、５、１０）で準備し、ターゲット細胞を含んでいるウェルに添加し、３７℃、ＣＯ_２培養器で２４時間反応した。ターゲット細胞に対する殺傷能は、同一の方法で補正して計算した。その結果、４種のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１、－００２、－００３、－００４発現Ｔ細胞は、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲを発現しないＴ細胞（対照群）に比べて、ＨｅＬａ細胞に対して高い細胞殺傷能を示した（図２８Ａ及び図２８Ｂ）。

【0268】

４．５．様々なスぺーサドメイン構造のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞の抗癌活性能確認（Ｉｎ ｖｉｖｏ）
生体内ににおける抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ）遺伝子発現Ｔ細胞の抗癌活性能を確認するために癌発生動物モデルを用いた。Ｔ細胞、Ｂ細胞、自然殺害細胞（ＮＫ細胞）が欠損したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（７週齢、雌）の右側横腹皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ，ＳＣ）に、マトリゲルと１：１に混ぜたＳＫＯＶ３癌細胞（Ｔａｒｇｅｔ，Ｔ）３×１０^６個を投与して癌を発生させた。Ｉｎ ｖｉｔｒｏで効能が確認されたＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の４種と対照群Ｔ細胞を、癌細胞投与して３日後と５日後にそれぞれのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに１日１回で総２回投与した。投与回当たり２×１０^７個のＴ細胞を尾静脈（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ，ＩＶ）に投与し、癌のサイズを２５日まで測定した。その結果、対照群Ｔ細胞投与群に比べて、抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞投与群の２種ともに癌成長速度が阻害されたことを確認した。特に、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００３の癌成長阻害効能が最も優れていることを確認した（図２９）。

【0269】

〔実施例５．様々な共同刺激ドメイン（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ）構造の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞作製及び効能確認〕
５．１．様々な共同刺激ドメイン構造のＬ１ＣＭＡ－ＣＡＲ遺伝子確保
５．１．１． Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８ＢＢ遺伝子確保
５．１．１．１． ３Ｅ８抗体の先導配列（ＬＳ）、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ遺伝子確保
ｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１を鋳型にしてプライマー配列番号７０（表１２）と配列番号８７（表１２）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーは、Ｍｌｕ Ｉ制限酵素塩基配列と３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の１８個の塩基配列を有し、ＣＤ２８ ＩＣＤの３’部位に結合するプライマーは、４－１ＢＢの１２個の塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－４－１ＢＢの塩基配列を有することになる（表１３）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0270】

【表12】

【0271】

【表13】

【0272】

５．１．１．２．共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
共同刺激ドメインである４－１ＢＢとＣＤ３ζ－ｉｓｏ１を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００４プラスミド（図３０）を鋳型にしてプライマー配列番号８８（表１２）と配列番号７３（表１２）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、４－１ＢＢの５’部位に結合するプライマーは、ＣＤ２８ ＩＣＤの１２個の塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の３’部位に結合するプライマーは、Ｘｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、ＣＤ２８ ＩＣＤ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有することになる（表１３）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0273】

５．１．１．３． ３Ｅ８ ＬＳ、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
増幅したＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－４－１ＢＢとＣＤ２８ ＩＣＤ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉを鋳型にしてプライマー配列番号７０（表１２）と配列番号７３（表１２）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図３１）。増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８ＢＢの構造を有することになる（図３２）。

【0274】

５．１．２．Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８ＩＣＯＳ遺伝子確保
５．１．２．１． ３Ｅ８抗体の先導配列（ＬＳ）、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ遺伝子確保
ｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１を鋳型にしてプライマー配列番号７０（表１２）と配列番号８９（表１２）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーはＭｌｕ Ｉ制限酵素塩基配列と３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の１８個の塩基配列を有し、ＣＤ２８ ＩＣＤの３’部位に結合するプライマーはＩＣＯＳの１２個の塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＩＣＯＳ ＩＣＤの塩基配列を有することになる（表１３）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0275】

５．１．２．２．共同刺激ドメインＩＣＯＳ遺伝子確保
共同刺激ドメインであるＩＣＯＳのＴＭとＩＣＤ構造を合成した。遺伝子合成によって確保されたｐＢＨＡ－ＩＣＯＳ ＴＭ＋ＩＣＤ（図３３）を鋳型にしてプライマー配列番号９０（表１２）と配列番号９１（表１２）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ＩＣＯＳ ＩＣＤの５’部位に結合するプライマーはＣＤ２８ ＩＣＤの１２個の塩基配列を有し、ＩＣＯＳ ＩＣＤの３’部位に結合するプライマーはＣＤ３ζ－ｉｓｏ１塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＩＣＯＳ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１塩基配列を有することになる（表１３）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0276】

５．１．２．３． ＣＤ３ζ遺伝子確保
ｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１を鋳型にしてプライマー配列番号９２（表１２）と配列番号７３（表１２）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の５’部位に結合するプライマーはＩＣＯＳ ＩＣＤの１２個の塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の３’部位に結合するプライマーはＸｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、ＩＣＯＳ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有することになる（表１３）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0277】

５．１．２．４． ３Ｅ８ ＬＳ、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン遺伝子確保
増幅したＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＩＣＯＳ ＩＣＤとＣＤ２８ ＩＣＤ－ＩＣＯＳ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１を鋳型にしてプライマー配列番号７０（表１２）と配列番号９１（表１２）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図３４）。増幅されたＰＣＲ生成物はＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＩＣＯＳ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１塩基配列を有することになる（表１３）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0278】

５．１．２．５． ３Ｅ８ ＬＳ、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
増幅したＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＩＣＯＳ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１とＩＣＯＳ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉを鋳型にしてプライマー配列番号７０（表１２）と配列番号７３（表１２）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図３４）。増幅されたＰＣＲ生成物はＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＩＣＯＳ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８ＩＣＯＳの構造を有することになる（図３５）。

【0279】

５．１．３．Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８遺伝子確保
５．１．３．１． ３Ｅ８抗体の先導配列（ＬＳ）、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ遺伝子確保
ｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１を鋳型にしてプライマー配列番号７０（表１２）と配列番号９３（表１２）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーはＭｌｕ Ｉ制限酵素塩基配列と３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の１８個の塩基配列を有し、ＣＤ２８ ＩＣＤの３’部位に結合するプライマーはＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の１２個の塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の塩基配列を有することになる（表１３）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0280】

５．１．３．２．ＣＤ３ζ遺伝子確保
ｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１を鋳型にしてプライマー配列番号９４（表１２）と配列番号７３（表１２）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の５’部位に結合するプライマーはＣＤ２８ ＩＣＤの１２個の塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の３’部位に結合するプライマーはＸｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有することになる（表１３）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0281】

５．１．３．３． ３Ｅ８ ＬＳ、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
増幅したＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１とＣＤ２８ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉを鋳型にしてプライマー配列番号７０（表１２）と配列番号７３（表１２）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図３６）。増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８の構造を有することになる（図３７）。

【0282】

５．１．４．Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＯＸ遺伝子確保
５．１．４．１． ３Ｅ８抗体の先導配列（ＬＳ）、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＴＭ遺伝子確保
ｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１を鋳型にしてプライマー配列番号７０（表１２）と配列番号９５（表１２）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーはＭｌｕ Ｉ制限酵素塩基配列と３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の１８個の塩基配列を有し、ＣＤ２８ ＴＭの３’部位に結合するプライマーはＯＸ４０の１２個の塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＯＸ４０の塩基配列を有することになる（表１３）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0283】

５．１．４．２．共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
ｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１を鋳型にしてプライマー配列番号９６（表１２）と配列番号７３（表１２）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ＯＸ４０の５’部位に結合するプライマーはＣＤ２８ ＴＭの１２個の塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の３’部位に結合するプライマーはＸｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、ＣＤ２８ ＴＭ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有することになる（表１３）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0284】

５．１．４．３． ３Ｅ８ ＬＳ、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＴＭ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
増幅したＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＯＸ４０とＣＤ２８ ＴＭ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉを鋳型にしてプライマー配列番号７０（表１２）と配列番号７３（表１２）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図３８）。増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＯＸの構造を有することになる（図３９）。

【0285】

５．１．５． Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＢＢ遺伝子確保
５．１．５．１． ３Ｅ８抗体の先導配列（ＬＳ）、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＴＭ遺伝子確保
ｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１を鋳型にしてプライマー配列番号７０（表１２）と配列番号９７（表１２）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーはＭｌｕ Ｉ制限酵素塩基配列と３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の１８個の塩基配列を有し、ＣＤ２８ ＴＭの３’部位に結合するプライマーは４－１ＢＢの１２個の塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－４－１ＢＢの塩基配列を有することになる（表１３）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0286】

５．１．５．２．共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
ｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００４（図３０）を鋳型にしてプライマー配列番号９８（表１２）と配列番号７３（表１２）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、４－１ＢＢの５’部位に結合するプライマーはＣＤ２８ ＴＭの１２個の塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の３’部位に結合するプライマーはＸｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、ＣＤ２８ ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有することになる（表１３）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0287】

５．１．５．３． ３Ｅ８ ＬＳ、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＴＭ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
増幅したＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－４－１ＢＢとＣＤ２８ ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉを鋳型にしてプライマー配列番号７０（表１２）と配列番号７３（表１２）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図４０）。増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＢＢの構造を有することになる（図４１）。

【0288】

５．１．６．Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＩＣＯＳ遺伝子確保
５．１．６．１． ３Ｅ８抗体の先導配列（ＬＳ）、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＴＭ遺伝子確保
ｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１を鋳型にしてプライマー配列番号７０（表１２）と配列番号９９（表１２）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーはＭｌｕ Ｉ制限酵素塩基配列と３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の１８個の塩基配列を有し、ＣＤ２８ ＴＭの３’部位に結合するプライマーはＩＣＯＳ－ＩＣＤの１３個の塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＩＣＯＳ ＩＣＤの塩基配列を有することになる（表１３）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0289】

５．１．６．２．共同刺激ドメインＩＣＯＳ遺伝子確保
ｐＢＨＡ－ＩＣＯＳ ＴＭ＋ＩＣＤ（図３３）を鋳型にしてプライマー配列番号１００（表１２）と配列番号９１（表１２）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ＩＣＯＳ ＩＣＤの５’部位に結合するプライマーはＣＤ２８ ＴＭの１２個の塩基配列を有し、ＩＣＯＳ ＩＣＤの３’部位に結合するプライマーはＣＤ３ζ－ｉｓｏ１塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、ＣＤ２８ ＴＭ－ＩＣＯＳ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１塩基配列を有することになる（表１３）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0290】

５．１．６．３． ＣＤ３ζ遺伝子確保
ｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１を鋳型にしてプライマー配列番号９２（表１２）と配列番号７３（表１２）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の５’部位に結合するプライマーはＩＣＯＳ ＩＣＤの１２個の塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の３’部位に結合するプライマーはＸｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、ＩＣＯＳ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有することになる（表１３）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0291】

５．１．６．４． ３Ｅ８ ＬＳ、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＴＭ、共同刺激ドメイン遺伝子確保
増幅したＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＩＣＯＳ ＩＣＤとＣＤ２８ ＴＭ－ＩＣＯＳ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１を鋳型にしてプライマー配列番号７０（表１２）と配列番号９１（表１２）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図４２）。増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＩＣＯＳ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１塩基配列を有することになる（表１３）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0292】

５．１．６．５． ３Ｅ８ ＬＳ、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
増幅したＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＩＣＯＳ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１とＩＣＯＳ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉを鋳型にしてプライマー配列番号７０（表１２）と配列番号７３（表１２）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図４２）。増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＩＣＯＳ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＩＣＯＳの構造を有することになる（図４３）。

【0293】

５．１．７．ｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルスベクター製造
６種の増幅したＰＣＲ生成物をＭｌｕ ＩとＸｈｏ Ｉ制限酵素処理してＤＮＡ切片を獲得した。獲得したＤＮＡ切片を、あらかじめＭｌｕ ＩとＸｈｏ Ｉ制限酵素で処理されたｐＭＴレトロウイルスベクター（米国登録特許第ＵＳ６，４５１，５９５号）に結紮し、６種のｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルスベクターを作製した（図４４）。こうして製造されたｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルスベクターは、ＭＬＶ ＬＴＲプロモーターの調節下でＬ１－Ｈ８－ＣＡＲをコードする配列を含む。

【0294】

５．２．様々な共同刺激ドメイン構造のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ遺伝子発現レトロウイルス（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルス）製造
実施例４．２と同じ方法で７種のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１とＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８ＢＢ、－２８ＩＣＯＳ、－２８、－ＯＸ、－ＢＢ、－ＩＣＯＳ遺伝子発現レトロウイルスを製造した
５．３．様々な共同刺激ドメイン構造のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞製造
実施例４．３．と同じ方法で７種のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－Ｔを製造した。その結果、供与者によって差異があるが、培養７日又は８日目には約７．７％～８８．４％、培養１１日目には約９．０％～８２．４％、１５日目又は１７日目には約６．７％～８９．８％のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現率を確認した（表１４）。

【0295】

【表14】

【0296】

５．４．様々なスぺーサドメイン構造のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞の抗癌活性能確認（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
５．４．１．ターゲット細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率確認
実施例４．４．１．と同じ方法でターゲット細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した。その結果、ＳＫＯＶ３癌細胞において約８０．４～９８．５％のＬ１ＣＡＭ発現率を確認した（図４５Ａ～図４５Ｃ）。同一の方法を用いて、ヒト子宮頸癌細胞株であるＨｅＬａとヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＨ－ＳＹ５Ｙ、ヒト胚腎臓細胞株である２９３ＴにおいてＬ１ＣＡＭの発現を確認した結果、ＨｅＬａでは約９９．６～９９．９％（図４５Ｆ及び図４５Ｇ）、ＳＨ－ＳＹ５Ｙでは約５２．１～９８．１％（図４５Ｈ及び図４５Ｉ）、２９３Ｔでは約０．０２３～４．７２％の発現率を確認した（図４５Ｄ及び図４５Ｅ）。

【0297】

５．４．２．ターゲット細胞に対するＬ１ＣＡＭ発現Ｔ細胞の抗癌活性能確認（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
５．４．２．１．ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅアッセイを用いた抗癌活性能確認
実施例４．４．２．１と同じ方法でＳＫＯＶ３に対する７種Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲの効能を確認した。その結果、７種のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１とＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８ＢＢ、－２８ＩＣＯＳ、－２８、－ＯＸ、－ＢＢ、－ＩＣＯＳ発現Ｔ細胞は、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲを発現しないＴ細胞（対照群）に比べて、ＳＫＯＶ３細胞に対して高い細胞殺傷能を示した（図４６）。

【0298】

実施例４．４．２．１と同じ実験方法を用いて２９３Ｔ細胞に対する殺傷能を確認した。その結果、低いＬ１ＣＡＭ発現率を示す２９３Ｔ細胞では７種ともに、対照群と類似の細胞殺傷能を示した（図４７）。

【0299】

５．４．２．２． ＣｅｌｌＴｏｘ^ＴＭグリーン色素を用いた抗癌活性能確認
実施例４．４．２．２と同じ実験方法を用いてＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に対する殺傷能を確認した。その結果、７種のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１とＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８ＢＢ、－２８ＩＣＯＳ、－２８、－ＯＸ、－ＢＢ、－ＩＣＯＳ発現Ｔ細胞は、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲを発現しないＴ細胞（対照群）に比べて、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に対して高い細胞殺傷能を示した（図４８Ａ～図４８Ｃ）。

【0300】

実施例４．４．２．２と同じ実験方法を用いてＨｅＬａ細胞に対する殺傷能を確認した。その結果、７種のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１とＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８ＢＢ、－２８ＩＣＯＳ、－２８、－ＯＸ、－ＢＢ、－ＩＣＯＳ発現Ｔ細胞は、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲを発現しないＴ細胞（対照群）に比べて、ＨｅＬａ細胞に対して高い細胞殺傷能を示した（図４９Ａ～図４９Ｃ）。

【0301】

５．５．様々な共同刺激ドメイン構造のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞の抗癌活性能確認（Ｉｎ ｖｉｖｏ）
生体内における抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ）遺伝子発現Ｔ細胞の抗癌活性能を確認するために癌発生動物モデルを用いた。Ｔ細胞、Ｂ細胞、自然殺害細胞（ＮＫ細胞）が欠損したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（７週齢、雌）の右側横腹皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ，ＳＣ）にマトリゲルと１：１に混ぜたＳＫＯＶ３癌細胞（Ｔａｒｇｅｔ，Ｔ）３×１０^６個を投与して癌を発生させた。Ｉｎ ｖｉｔｒｏで効能が確認されたＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現Ｔ細胞７種と対照群Ｔ細胞を、癌細胞投与して３日後と５日後にそれぞれのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに１日１回で総２回投与した。投与回当たり２×１０^７個のＴ細胞を尾静脈（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ，ＩＶ）に投与し、癌のサイズを２５日まで測定した。その結果、対照群Ｔ細胞投与群に比べて抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞の７種の投与群の全てにおいて癌成長速度が阻害されたことを確認した。特に、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８ＩＣＯＳの癌成長阻害効能が最も優れていることを確認した（図５０）。

【0302】

〔実施例６．様々な構造の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞作製及び効能確認〕
６．１．様々な構造のＬ１ＣＭＡ－ＣＡＲ遺伝子確保
６．１．１． Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００５遺伝子確保
６．１．１．１． ３Ｅ８抗体の先導配列（ＬＳ）、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ＿ｒｅｖｅｒｓｅ遺伝子確保
３Ｅ８ ＬＳとＬ１－Ｈ８ ｓｃＦｖの抗体可変軽鎖（ＶＬ）、リンカー、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖの抗体可変重鎖（ＶＨ）の構造を合成した。遺伝子合成によって確保されたｐＢＨＡ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｈ８Ｒｅｖ（図５１）を鋳型にしてプライマー配列番号７０（表１５）と配列番号１０３（表１５）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーは、Ｍｌｕ Ｉ制限酵素塩基配列と３Ｅ８先導配列（ＬＳ）の１８個の塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－Ｒｅｖｅｒｓｅの３’部位に結合するプライマーは、ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅの１２個の塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－Ｒｅｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅの塩基配列を有することになる（表１６）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0303】

【表15】

【0304】

【表16】

【0305】

６．１．１．２．ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
ヒトＩｇＤのヒンジとＩｇＧ１のヒンジ、ＣＤ２８のＴＭとＩＣＤ、共同刺激ドメインであるＯＸ４０及びＣＤ３ζ－ｉｓｏ１を含むｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００３（図２３）プラスミドを鋳型にしてプライマー配列番号１０４（表１５）と配列番号７３（表１５）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅの５’部位に結合するプライマーは、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ＶＨ）の１２個の塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の３’部位に結合するプライマーは、Ｘｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－Ｒｅｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有することになる（表１６）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0306】

６．１．１．３． ３Ｅ８ ＬＳ、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－Ｒｅｖ、ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
増幅したＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－Ｒｅｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅとＬ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－Ｒｅｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉを鋳型にしてプライマー配列番号７０（表１５）と配列番号７３（表１５）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図５２）。増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－３Ｅ８－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－Ｒｅｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００５の構造を有することになる（図５３）。

【0307】

６．１．２． Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００６遺伝子確保
６．１．２．１． ＣＤ８ ａｌｐｈａの先導配列（ＬＳ）遺伝子確保
ＣＤ８ ａｌｐｈａのＬＳを含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００５（図５４）プラスミドを鋳型にしてプライマー配列番号１０５（表１５）と配列番号１０６（表１５）を用いてＰＣＲ方法で増幅した。このとき、ＣＤ８ ａｌｐｈａ先導配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーは、Ｍｌｕ Ｉ制限酵素塩基配列とＣＤ８ ａｌｐｈａ先導配列（ＬＳ）の１８個の塩基配列を有し、ＣＤ８ ａｌｐｈａ先導配列（ＬＳ）の３’部位に結合するプライマーは、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ＶＨ）の１２個の塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－ｈＣＤ８α ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖの塩基配列を有することになる（表１７）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0308】

【表17】

【0309】

６．１．２．２． Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ遺伝子確保
Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖを含むｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１（図５３）プラスミドを鋳型にしてプライマー配列番号１０７（表１５）と配列番号１０８（表１５）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖの５’部位に結合するプライマーは、ＣＤ８ ａｌｐｈａ ＬＳの１２個の塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ３’部位に結合するプライマーは、ｈＣＤ８ ａｌｐｈａ ヒンジの１２個の塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、ｈＣＤ８α ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＣＤ８αヒンジ塩基配列を有することになる（表１７）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0310】

６．１．２．３．ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
ヒトＣＤ８ ａｌｐｈａのヒンジとＴＭ、共同刺激ドメインである４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ－ｉｓｏ２Ｍを含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００５（図５４）プラスミドを鋳型にしてプライマー配列番号１０９（表１５）と配列番号１１０（表５）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ｈＣＤ８αヒンジの５’部位に結合するプライマーは、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ＶＬ）の１２個の塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２Ｍの３’部位に結合するプライマーは、Ｘｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＣＤ８α ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２Ｍ－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有することになる（表１７）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0311】

６．１．２．４．ＣＤ８α ＬＳ、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ遺伝子確保
増幅したＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－ｈＣＤ８α ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖとｈＣＤ８α ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＣＤ８α ｈｉｎｇｅを鋳型にしてプライマー配列番号１０５（表１５）と配列番号１０８（表１５）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図５５）。増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－ｈＣＤ８α ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ ｈｉｎｇｅ塩基配列を有することになる。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0312】

６．１．２．５． ＣＤ８α ＬＳ、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
増幅したＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－ｈＣＤ８α ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＣＤ８α ｈｉｎｇｅとＬ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＣＤ８α ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２Ｍ－Ｘｈｏ Ｉを鋳型にしてプライマー配列番号１０５（表１５）と配列番号１１０（表１５）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図５５）。増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－ｈＣＤ８αＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈＣＤ８α ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２Ｍ－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００６の構造を有することになる（図５６）。

【0313】

６．１．３． Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００７遺伝子確保
６．１．３．１． ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎの信号配列遺伝子確保
ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．αの信号配列を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００６プラスミド（図５７）を鋳型にしてプライマー配列番号１１１（表１５）と配列番号１１２（表１５）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．αの５’部位に結合するプライマーは、Ｍｌｕ Ｉ制限酵素塩基配列を有し、ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．αの３’部位に結合するプライマーは、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ可変重鎖（ＶＨ）の１２個の塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖの塩基配列を有することになる（表１８）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0314】

【表18】

【0315】

６．１．３．２． Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ遺伝子確保
Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖを含むｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１（図２３）プラスミドを鋳型にしてプライマー配列番号１１３（表１５）と配列番号１１４（表１５）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖの５’部位に結合するプライマーは、ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α ＬＳの１２個の塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ３’部位に結合するプライマーは、ヒンジの９個の塩基配列とｈＣＤ２８ｐＥＣＤの３個の塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ｐＥＣＤ塩基配列を有することになる（表１８）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0316】

６．１．３．３．ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
ヒンジ、ｈＣＤ２８のｐＥＣＤとＴＭ、ＩＣＤ及びｈＣＤ３ζ－ｉｓｏ２を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００６プラスミド（図５７）を鋳型にしてプライマー配列番号１１５（表１３）と配列番号１１６（表１３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ヒンジの５’部位に結合するプライマーは、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ可変軽鎖（ＶＬ）の１２個の塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２の３’部位に結合するプライマーは、Ｘｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有するので、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ｐＥＣＤ－ｈＣＤ２８ ＴＭ－ｈＣＤ２８ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有することになる（表１６）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0317】

６．１．３．４． ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎの信号配列、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ遺伝子確保
増幅したＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖとｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α ＬＳ－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ｐＥＣＤを鋳型にしてプライマー配列番号１１１（表１５）と配列番号１１４（表１５）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図５８）。増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ｐＥＣＤ塩基配列を有することになる。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

【0318】

６．１．３．５．ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎの信号配列、Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子確保
増幅したＰＣＲ生成物であるＭｌｕ Ｉ－ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ｐＥＣＤとＬ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ｐＥＣＤ－ｈＣＤ２８ ＴＭ－ｈＣＤ２８ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２－Ｘｈｏ Ｉを鋳型にしてプライマー配列番号１１１（表１５）と配列番号１１６（表１５）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図５８）。増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ－ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α－Ｌ１－Ｈ８ ｓｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ｐＥＣＤ－ｈＣＤ２８ ＴＭ－ｈＣＤ２８ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００７の構造を有することになる（図５９）。

【0319】

６．１．４．ｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルスベクター製造
３種の増幅したＰＣＲ生成物をＭｌｕ ＩとＸｈｏ Ｉ制限酵素処理してＤＮＡ切片を獲得した。獲得したＤＮＡ切片を、あらかじめＭｌｕ ＩとＸｈｏ Ｉ制限酵素で処理されたｐＭＴレトロウイルスベクター（米国登録特許第ＵＳ６，４５１，５９５号）に結紮し、３種のｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルスベクターを作製した（図６０）。こうして製造されたｐＭＴ－Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルスベクターは、ＭＬＶ ＬＴＲプロモーターの調節下でＬ１－Ｈ８－ＣＡＲをコードする配列を含む。

【0320】

６．２．様々な構造のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ遺伝子発現レトロウイルス（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲレトロウイルス）製造
実施例４．２．と同じ方法で４種のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００３、－００５、－００６、－００７遺伝子発現レトロウイルスを製造した。

【0321】

６．３．様々な構造のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞製造
実施例４．３．と同じ方法で４種のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－Ｔを製造した。その結果、供与者によって差異があるが、培養８日目には約２２．１％～７４．１％、培養１１日目には約２７．１％～７７．１％、１４日目には約２４．６％～７６．６％、培養１６日目には約２９．８％～８１．９％のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現率を確認した（表１９）。

【0322】

【表19】

【0323】

６．４．様々な構造のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞の抗癌活性能確認（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
６．４．１．ターゲット細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率確認
実施例４．４．１．と同じ方法でターゲット細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した。その結果、ＳＫＯＶ３癌細胞で約６７．１％～８７．０％のＬ１ＣＡＭ発現率を確認した。同一の方法を用いて、ヒト子宮頸癌細胞株であるＨｅＬａとヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＨ－ＳＹ５Ｙ、ヒト胚腎臓細胞株である２９３ＴでＬ１ＣＡＭの発現を確認した結果、ＨｅＬａでは約９８．４％、ＳＨ－ＳＹ５Ｙでは約６５．０～７０．９％、２９３Ｔでは約０．０８２％の発現率を確認した（図６１ａ－６１ｆ）。

【0324】

６．４．２．ターゲット細胞に対するＬ１ＣＡＭ発現Ｔ細胞の抗癌活性能確認（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
６．４．２．１．ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅアッセイを用いた抗癌活性能確認
実施例４．４．２．１と同じ方法でＳＫＯＶ３に対する４種Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲの効能を確認した。その結果、４種のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００３とＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００５、－００６、－００７発現Ｔ細胞は、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲを発現しないＴ細胞（対照群）に比べて、ＳＫＯＶ３細胞に対して高い細胞殺傷能を示した（図６２）。

【0325】

実施例４．４．２．１．と同じ実験方法を用いてＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に対する殺傷能を確認した。ターゲット細胞を培養培地５０ｕＬに１．０ｘ１０^５個で添加し、約２１時間後に、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現Ｔ細胞を、ヒト血清とヒトＩＬ－２が含まれているＡＩＭＶ培地５０ｕＬに５．０×１０^４個、１．０ｘ１０^５個、５．０×１０^５個（Ｅ：Ｔ比率＝０．５、１、５）で準備し、ターゲット細胞を含んでいるウェルに添加した後、約３０時間の間に実時間で細胞インデックス値を確認した。また、ターゲット細胞だけを含んでいるウェルを準備し、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗癌活性能を上の実験と同一に計算した。その結果、４種のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００３とＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００５、－００６、－００７発現Ｔ細胞は、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲを発現しないＴ細胞（対照群）に比べてＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に対して高い細胞殺傷能を示した（図６３）。

【0326】

６．４．２．２． ＣｅｌｌＴｏｘ^ＴＭグリーン色素を用いた抗癌活性能確認
実施例４．４．２．２．と同じ方法でＨｅＬａ細胞に対する４種Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲの効能を確認した。その結果、４種のＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００３とＬ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００５、－００６、－００７発現Ｔ細胞は、Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲを発現しないＴ細胞（対照群）に比べてＨｅＬａ細胞に対して高い細胞殺傷能を示した（図６４）。

【0327】

実施例４．４．２．２．と同じ実験方法を用いて２９３Ｔ癌細胞に対する殺傷能を確認した。ターゲット細胞を培養培地５０ｕＬに１．０×１０^４個で準備し、ＣｅｌｌＴｏｘ^ＴＭグリーン色素を０．２ｕＬ添加して黒色９６ウェルプレートに添加した。Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ発現Ｔ細胞を、ヒト血清とヒトＩＬ－２が含まれているＡＩＭＶ培地５０ｕＬに５．０×１０^３個、１．０×１０^４個、５．０×１０^４個、１．０×１０^５個（Ｅ：Ｔ比率＝０．５、１、５、１０）で準備し、ターゲット細胞を含んでいるウェルに添加し、３７℃、ＣＯ_２培養器で２４時間反応した。ターゲット細胞に対する殺傷能は、同一の方法で補正して計算した。

【0328】

その結果、低いＬ１ＣＡＭ発現率を示す２９３Ｔ細胞では４種ともに、対照群と類似するか或いはより低い細胞殺傷能を示した（図６５）。

【図面の簡単な説明】

【0329】

【図1】図１は、ファージディスプレイライブラリーパンニング過程を図式化したものである。

【図2】図２は、ファージパンニングラウンドによる抗原ｍＬ１ＣＡＭのファージの増幅（ｅｎｒｉｃｈｉｍｅｎｔ）程度を示すグラフである（上：ファージ出力力価（ｐｈａｇｅ ｏｕｔｐｕｔ ｔｉｔｅｒ）、下：溶出力価率（Ｅｌｕｔｉｏｎ ｔｉｔｅｒ ｒａｔｉｏ））。

【図3A】図３Ａは、ファージパンニングラウンド別抗原ｍＬ１ＣＡＭに対して特異的に結合するファージクローンを選別するために単一クローンファージＥＬＩＳＡ（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｐｈａｇｅ ＥＬＩＳＡ）を行った結果を示す。

【図3B】図３Ｂは、ファージパンニングラウンド別抗原ｍＬ１ＣＡＭに対して特異的に結合するファージクローンを選別するために単一クローンファージＥＬＩＳＡ（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｐｈａｇｅ ＥＬＩＳＡ）を行った結果を示す。

【図3C】図３Ｃは、ファージパンニングラウンド別抗原ｍＬ１ＣＡＭに対して特異的に結合するファージクローンを選別するために単一クローンファージＥＬＩＳＡ（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｐｈａｇｅ ＥＬＩＳＡ）を行った結果を示す。

【図4】図４は、本発明の選別された９種のｓｃＦｖクローンの選別頻度を示す図である。

【図5】図５は、ヒトＬ１ＣＡＭとマウスＬ１ＣＡＭに交差結合する抗体発掘のために本発明で選別したマウスＬ１ＣＡＭに結合するユニークな（ｕｎｉｑｕｅ）抗ｍＬ１ＣＡＭ ｓｃＦｖクローンの９種を対象にしてｈＬ１ＣＡＭに対して単一クローンファージＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。

【図6】図６は、精製された抗ｍＬ１ＣＡＭ ｓｃＦｖクローンのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。

【図7A】図７Ａは、図５の可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）ＥＬＩＳＡ結果による本発明の４種の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体のｍＬ１ＣＡＭ及びｈＬ１ＣＡＭ抗原に対する親和性を示す図である。

【図7B】図７Ｂは、図５の可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）ＥＬＩＳＡ結果による本発明の４種の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体のｍＬ１ＣＡＭ及びｈＬ１ＣＡＭ抗原に対する親和性を示す図である。

【図7C】図７Ｃは、図５の可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）ＥＬＩＳＡ結果による本発明の４種の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体のｍＬ１ＣＡＭ及びｈＬ１ＣＡＭ抗原に対する親和性を示す図である。

【図7D】図７Ｄは、オクテットシステム結果による本発明の４種の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体のｍＬ１ＣＡＭ及びｈＬ１ＣＡＭ抗原に対する親和性を示す図である。

【図7E】図７Ｅは、オクテットシステム結果による本発明の４種の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖ抗体のｍＬ１ＣＡＭ及びｈＬ１ＣＡＭ抗原に対する親和性を示す図である。

【図8】図８は、本発明の選別された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するために用いられたｐＭＴ－ＣＡＲプラスミドのベクターマップを示す図である。

【図9】図９は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【図10A】図１０Ａは、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－ＣＡＲ－００１、Ｌ１－ＣＡＲ－００２、Ｌ１－ＣＡＲ－００３、及びＬ１－ＣＡＲ－００４）の構造を示す図である。

【図10B】図１０Ｂは、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－ＣＡＲ－００１、Ｌ１－ＣＡＲ－００２、Ｌ１－ＣＡＲ－００３、及びＬ１－ＣＡＲ－００４）の構造を示す図である。

【図11A】図１１Ａは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含む２種のＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－ＣＡＲ－００１及びＬ１－ＣＡＲ－００２）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【図11B】図１１Ｂは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含む２種のＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－ＣＡＲ－００３及びＬ１－ＣＡＲ－００４）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【図12】図１２は、ＳＫＯＶ３細胞と２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図13A】図１３Ａは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＳＫＯＶ３細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図13B】図１３Ｂは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の２９３Ｔ細胞（Ｌ１ＣＡＭ低発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図14】図１４は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ＣＡＲ（抗Ｌ１－ＣＡＲ）発現Ｔ細胞の生体内抗癌活性能を示す図である。

【図15】図１５は、本発明の選別された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するために用いられたｐＭＴ－ＣＡＲ－００２プラスミドのベクターマップを示す図である。

【図16】図１６は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【図17】図１７は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００２）の構造を示す図である。

【図18】図１８は、本発明の選別された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するために用いられたｐＭＴ－ＣＡＲ－００３プラスミドのベクターマップを示す図である。

【図19】図１９は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【図20】図２０は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００３）の構造を示す図である。

【図21】図２１は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【図22】図２２は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００４）の構造を示す図である。

【図23A】図２３Ａは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【図23B】図２３Ｂは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００２）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【図23C】図２３Ｃは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００３）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【図23D】図２３Ｄは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００４）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【図24A】図２４Ａは、ＳＫＯＶ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図24B】図２４Ｂは、ＳＫＯＶ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図24C】図２４Ｃは、ＳＫＯＶ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図24D】図２４Ｄは、ＳＫＯＶ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図24E】図２４Ｅは、ＳＫＯＶ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図24F】図２４Ｆは、ＳＫＯＶ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図24G】図２４Ｇは、ＳＫＯＶ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図25】図２５は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＳＫＯＶ３細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図26】図２６は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の２９３Ｔ細胞（Ｌ１ＣＡＭ低発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図27A】図２７Ａは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図27B】図２７Ｂは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図28A】図２８Ａは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＨｅｌａ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図28B】図２８Ｂは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＨｅｌａ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図29】図２９は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ＣＡＲ（抗Ｌ１－ＣＡＲ）発現Ｔ細胞の生体内抗癌活性能を示す図である。

【図30】図３０は、本発明の選別された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するために用いられたｐＭＴ－ＣＡＲ－００４プラスミドのベクターマップを示す図である。

【図31】図３１は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【図32】図３２は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８ＢＢ）の構造を示す図である。

【図33】図３３は、本発明の選別された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するために用いられたｐＢＨＡ－ＩＣＯＳ ＴＭ＋ＩＣＤプラスミドのベクターマップを示す図である。

【図34】図３４は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【図35】図３５は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８ＩＣＯＳ）の構造を示す図である。

【図36】図３６は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【図37】図３７は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８）の構造を示す図である。

【図38】図３８は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【図39】図３９は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＯＸ）の構造を示す図である。

【図40】図４０は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【図41】図４１は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＢＢ）の構造を示す図である。

【図42】図４２は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【図43】図４３は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＩＣＯＳ）の構造を示す図である。

【図44A】図４４Ａは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８ＢＢ）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【図44B】図４４Ｂは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８ＩＣＯＳ）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【図44C】図４４Ｃは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－２８）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【図44D】図４４Ｄは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＯＸ）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【図44E】図４４Ｅは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＢＢ）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【図44F】図４４Ｆは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００１－ＩＣＯＳ）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【図45A】図４５Ａは、ＳＫＯＶ３細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図45B】図４５Ｂは、ＳＫＯＶ３細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図45C】図４５Ｃは、ＳＫＯＶ３細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図45D】図４５Ｄは、ＳＫＯＶ３細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図45E】図４５Ｅは、ＳＫＯＶ３細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図45F】図４５Ｆは、ＳＫＯＶ３細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図45G】図４５Ｇは、ＳＫＯＶ３細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図45H】図４５Ｈは、ＳＫＯＶ３細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図45I】図４５Ｉは、ＳＫＯＶ３細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図46】図４６は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＳＫＯＶ３細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図47】図４７は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の２９３Ｔ細胞（Ｌ１ＣＡＭ低発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図48A】図４８Ａは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図48B】図４８Ｂは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図48C】図４８Ｃは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図49A】図４９Ａは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＨｅｌａ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図49B】図４９Ｂは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＨｅｌａ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図49C】図４９Ｃは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＨｅｌａ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図50】図５０は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ＣＡＲ（抗Ｌ１－ＣＡＲ）発現Ｔ細胞の生体内抗癌活性能を示す図である。

【図51】図５１は、本発明の選別された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するために用いられたｐＢＨＡ－３Ｅ８ＬＳ－Ｈ８Ｒｅｖプラスミドのベクターマップを示す図である。

【図52】図５２は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【図53】図５３は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００５）の構造を示す図である。

【図54】図５４は、本発明の選別された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するために用いられたｐＭＴ－ＣＡＲ－００５プラスミドのベクターマップを示す図である。

【図55】図５５は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【図56】図５６は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００６）の構造を示す図である。

【図57】図５７は、本発明の選別された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するために用いられたｐＭＴ－ＣＡＲ－００６プラスミドのベクターマップを示す図である。

【図58】図５８は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを作製するための、一連のＰＣＲ増幅過程を示す模式図である。

【図59】図５９は、本発明の実施例で作製された抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００７）の構造を示す図である。

【図60A】図６０Ａは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００５）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【図60B】図６０Ｂは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００６）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【図60C】図６０Ｃは、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ ｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクト（Ｌ１－Ｈ８－ＣＡＲ－００７）を導入したレトロウイルスベクターを示す図である。

【図61A】図６１Ａは、ＳＫＯＶ３細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図61B】図６１Ｂは、ＳＫＯＶ３細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図61C】図６１Ｃは、ＳＫＯＶ３細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図61D】図６１Ｄは、ＳＫＯＶ３細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図61E】図６１Ｅは、ＳＫＯＶ３細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図61F】図６１Ｆは、ＳＫＯＶ３細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２９３Ｔ細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現率を確認した図である。

【図62】図６２は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＳＫＯＶ３細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図63】図６３は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図64】図６４は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＨｅｌａ細胞（Ｌ１ＣＡＭ高発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図65】図６５は、本発明の抗Ｌ１ＣＡＭ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の２９３Ｔ細胞（Ｌ１ＣＡＭ低発現）に対する抗癌活性を示す図である。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23a】

【図23b】

【図23c】

【図23d】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図24D】

【図24E】

【図24F】

【図24G】

【図25】

【図26】

【図27A】

【図27B】

【図28A】

【図28B】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44a】

【図44b】

【図44c】

【図44d】

【図44e】

【図44f】

【図45A】

【図45B】

【図45C】

【図45D】

【図45E】

【図45F】

【図45G】

【図45H】

【図45I】

【図46】

【図47】

【図48A】

【図48B】

【図48C】

【図49A】

【図49B】

【図49C】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60a】

【図60b】

【図60c】

【図61A】

【図61B】

【図61C】

【図61D】

【図61E】

【図61F】

【図62】

【図63】

【図64】

【図65】

【配列表】

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【国際調査報告】