▶ アイセルキーレクス セラピューティクス エルエルシーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-19
(54)【発明の名称】変異ワクシニア・ウイルスおよびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 7/01 20060101AFI20220112BHJP
C12N 15/39 20060101ALI20220112BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220112BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220112BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220112BHJP
C07K 14/07 20060101ALI20220112BHJP
C40B 40/08 20060101ALI20220112BHJP
C40B 40/10 20060101ALI20220112BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220112BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220112BHJP
【ＦＩ】
C12N7/01 ZNA
C12N15/39
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/62 Z
C07K14/07
C40B40/08
C40B40/10
A61P35/00
A61K35/76
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021547043
(86)(22)【出願日】2019-10-21
(85)【翻訳文提出日】2021-06-16
(86)【国際出願番号】 US2019057134
(87)【国際公開番号】W WO2020086423
(87)【国際公開日】2020-04-30
(31)【優先権主張番号】62/749,102
(32)【優先日】2018-10-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/912,344
(32)【優先日】2019-10-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521169022
【氏名又は名称】アイセルキーレクス セラピューティクス エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ソン， シャオトン
(72)【発明者】
【氏名】ヴィスコブスカ， マリヤ
(72)【発明者】
【氏名】ゴメス メダグリア， マリア ルイーザ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA46
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087MA55
4C087MA57
4C087MA59
4C087MA60
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045EA60
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、抗ウイルス防御に抵抗性であり、抗腫瘍活性が増強された組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを開示する。一実施形態では、組換えＶＶは、１または複数の中和抗体エピトープに突然変異を有する１または複数のバリアントＶＶタンパク質を含み、これにより中和抗体からのウイルスエスケープがもたらされる。もう一つの実施形態では、組換えＶＶは、補体活性化の調節因子（例えば、ＣＤ５５）の発現に起因して、補体に媒介される中和に抵抗性である。もう一つの実施形態では、組換えＶＶは、癌細胞および免疫エフェクター細胞を同時標的化する二重特異性抗体の発現、またはＰＤ－１経路を遮断するポリペプチドの発現に起因して、抗腫瘍活性が増強されている。組換えワクシニア・ウイルス・ビリオンは、対象の癌を処置するために使用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）配列番号１と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；ｂ）配列番号２と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質；
ｃ）配列番号３と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ａ２７Ｌタンパク質；
ｄ）配列番号４と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｌ１Ｒタンパク質；
ｅ）配列番号５と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；
ｆ）配列番号６または配列番号１７４と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質；
ｇ）配列番号１７０と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；および
ｈ）配列番号１７２と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質
の１または複数を含む、分離された感染性組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項2】
前記バリアントＶＶ Ｈ３Ｌタンパク質が、配列番号１の１４、１５、１６、３３、３４、３５、３８、４０、４４、４５、５２、１３１、１３４、１３５、１３６、１３７、１５４、１５５、１５６、１６１、１６６、１６７、１６８、１９８、２２７、２５０、２５３、２５４、２５５、および２５６からなる群から選択される１または複数のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む、請求項１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項3】
前記バリアントＶＶ Ｄ８Ｌタンパク質が、配列番号２の４４、４８、９８、１０８、１１７、および２２０からなる群から選択される１または複数のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む、請求項１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項4】
前記バリアントＶＶ Ａ２７Ｌタンパク質が、配列番号３の２７、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３９、４０、１０７、１０８、および１０９からなる群から選択される１または複数のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む、請求項１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項5】
前記バリアントＶＶ Ｌ１Ｒタンパク質が、配列番号４の２５、２７、３１、３２、３３、３５、５８、６０、６２、１２５、および１２７からなる群から選択される１または複数のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む、請求項１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項6】
前記バリアントＶＶ Ｈ３Ｌタンパク質が、配列番号１７０の１４、１５、１６、３３、３４、３５、３８、４０、４４、４５、５２、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３７、１５４、１５５、１５６、１６１、１６６、１６７、１６８、１９５、１９８、１９９、２２７、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６４、２６６、２６８、２７２、２７３、２７５、および２７７からなる群から選択される１または複数のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む、請求項１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項7】
前記バリアントＶＶ Ｄ８Ｌタンパク質が、配列番号１７２の４３、４４、４８、５３、５４、５５、９８、１０８、１０９、１４４、１６８、１７７、１９６、１９９、２０３、２０７、２１２、２１８、２２０、２２２、および２２７からなる群から選択される１または複数のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む、請求項１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項8】
前記異種核酸が、補体活性化の調節因子のドメインをコードする、請求項１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項9】
前記補体活性化の調節因子が、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４６、ＣＤ３５、補体Ｈ因子、およびＣ４結合タンパク質からなる群から選択される、請求項８に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項10】
前記異種核酸が、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤ５５ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項11】
前記異種核酸が、免疫細胞上の第１の抗原と腫瘍細胞上の第２の抗原とに結合する二重特異性ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項12】
前記免疫細胞上の第１の抗原が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される、請求項１１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項13】
前記腫瘍細胞上の第２の抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、および多発性骨髄腫腫瘍抗原からなる群から選択される、請求項１１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項14】
前記二重特異性ポリペプチドが二重特異性ｓｃＦｖであり、前記第１の抗原がヒトＣＤ３ｅであり、前記第２の抗原がヒトＦＡＰであり、前記二重特異性ポリペプチドが配列番号８のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項15】
前記多発性骨髄腫の腫瘍抗原が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ２６、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、インテグリンベータ７、ＣＤ１３８、ＫＩＲ、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１、ＴＧＩＴ、ＣＤ５６、ＣＳ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＡＣＩ、およびＣＤ４４ｖ６からなる群から選択される、請求項１３に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項16】
前記二重特異性ポリペプチドが二重特異性ｓｃＦｖであり、前記第１の抗原がヒトＣＤ３ｅであり、前記第２の抗原がヒトＢＣＭＡであり、前記二重特異性ポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項17】
前記異種核酸が、免疫チェックポイント分子を含む融合ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項18】
前記免疫チェックポイント分子が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ４７、ＣＸＣＲ４、ＣＳＦ１Ｒ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＨＨＬＡ２、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ１６０、２Ｂ４、およびＣＤ７３からなる群から選択される、請求項１７に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項19】
前記異種核酸が、ヒトＰＤ－１細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む融合ポリペプチドをコードし、前記融合ポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項20】
前記ＶＶが、野生型ＶＶに示される耐性と比較して、中和抗体に対する耐性を示す、請求項１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項21】
前記ＶＶが、野生型ＶＶによる哺乳動物細胞の形質導入と比較して、ＶＶ中和抗体の存在下で哺乳動物細胞の形質導入の増加を示す、請求項１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項22】
有効量の請求項１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを対象に投与することを含む、遺伝子産物をそれを必要とする対象に送達する方法であって、前記遺伝子産物が前記異種核酸によってコードされている、方法。
【請求項23】
請求項１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンと、薬学的に許容され得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項24】
有効量の請求項２３に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象の癌を処置する方法。
【請求項25】
前記医薬組成物が、全身に、静脈内に、あるいは注射、吸入、注入、移植、非経口投与、または経腸投与によって前記対象に投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記対象がヒトまたは動物である、請求項２４に記載の方法。
【請求項27】
１または複数のバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを含むライブラリーであって、前記１または複数のバリアントＶＶビリオンの各々は、１または複数のバリアントＶＶタンパク質を含み、前記バリアントＶＶタンパク質の少なくとも１つが、対応する野生型ＶＶタンパク質のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失を有するアミノ酸配列を含む、ライブラリー。
【請求項28】
前記１または複数のバリアントＶＶタンパク質の少なくとも１つが、Ｈ３Ｌタンパク質、Ｄ８Ｌタンパク質、Ａ２７Ｌタンパク質、およびＬ１Ｒタンパク質からなる群から選択される、請求項２７に記載のライブラリー。
【請求項29】
前記１または複数のバリアントＶＶタンパク質の少なくとも１つが、配列番号５、配列番号６、または配列番号１７４のうちの１つの前記アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失を有するアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のライブラリー。
【請求項30】
異種核酸および１または複数のバリアントＶＶタンパク質を含む、請求項２７に記載のライブラリーに由来する組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンであって、前記バリアントＶＶタンパク質の少なくとも１つが、対応する野生型ＶＶタンパク質の前記アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失を有するアミノ酸配列を含む、組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項31】
前記異種核酸が、補体活性化の調節因子のドメインをコードする、請求項３０に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項32】
前記補体活性化の調節因子が、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４６、ＣＤ３５、補体Ｈ因子、およびＣ４結合タンパク質からなる群から選択される、請求項３１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項33】
前記異種核酸が、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤ５５ポリペプチドをコードする、請求項３１に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項34】
前記異種核酸が、免疫細胞上の第１の抗原と腫瘍細胞上の第２の抗原とに結合する二重特異性ポリペプチドをコードする、請求項３０に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項35】
前記免疫細胞上の第１の抗原が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される、請求項３４に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項36】
前記腫瘍細胞上の第２の抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、および多発性骨髄腫腫瘍抗原からなる群から選択される、請求項３４に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項37】
前記二重特異性ポリペプチドが二重特異性ｓｃＦｖであり、前記第１の抗原がヒトＣＤ３ｅであり、前記第２の抗原がヒトＦＡＰであり、前記二重特異性ポリペプチドが配列番号８のアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項38】
前記多発性骨髄腫の腫瘍抗原が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ２６、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、インテグリンベータ７、ＣＤ１３８、ＫＩＲ、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１、ＴＧＩＴ、ＣＤ５６、ＣＳ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＡＣＩ、およびＣＤ４４ｖ６からなる群から選択される、請求項３６に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項39】
前記二重特異性ポリペプチドが二重特異性ｓｃＦｖであり、前記第１の抗原がヒトＣＤ３ｅであり、前記第２の抗原がヒトＢＣＭＡであり、前記二重特異性ポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項40】
前記異種核酸が、免疫チェックポイント分子を含む融合ポリペプチドをコードする、請求項３０に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項41】
前記免疫チェックポイント分子が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ４７、ＣＸＣＲ４、ＣＳＦ１Ｒ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＨＨＬＡ２、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ１６０、２Ｂ４、およびＣＤ７３からなる群から選択される、請求項４０に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項42】
前記異種核酸が、ヒトＰＤ－１細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む融合ポリペプチドをコードし、前記融合ポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸配列を有する、請求項４０に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項43】
前記ＶＶビリオンが、野生型ＶＶと比較して、中和抗体に対する耐性を示す、請求項３０に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項44】
前記ＶＶビリオンが、野生型ＶＶによる哺乳動物細胞の形質導入と比較して、ＶＶ中和抗体の存在下で哺乳動物細胞の形質導入の増加を示す、請求項３０に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン。
【請求項45】
有効量の請求項３０に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを前記個体に投与することを含む、遺伝子産物をそれを必要とする対象に送達する方法であって、前記遺伝子産物が、前記バリアントＶＶビリオンが有する異種核酸によってコードされている、方法。
【請求項46】
請求項３０に記載の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンと、薬学的に許容され得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項47】
有効量の請求項４６に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象の癌を治処置する方法。
【請求項48】
前記医薬組成物が、全身に、静脈内に、あるいは注射、吸入、注入、移植、非経口投与、または経腸投与によって前記対象に投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記対象がヒトまたは動物である、請求項４７に記載の方法。
【請求項50】
配列番号１、５または１７０の１つと少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有する組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質。
【請求項51】
配列番号６、１７２または１７４の１つと少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有する組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
この特許協力条約出願は、２０１８年１０月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／７４９，１０２号および２０１９年１０月８日に出願された米国仮特許出願第６２／９１２，３４４号の優先権の利益を主張する。さらなる詳細は発明の概要を参照されたい。
この特許協力条約出願は、２０１８年１０月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／７４９，１０２号および２０１９年１０月８日に出願された米国仮特許出願第６２／９１２，３４４号の優先権の利益を主張する。さらなる詳細は発明の概要を参照されたい。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
腫瘍溶解性ウイルスは、正常細胞に損傷を与えずに、腫瘍細胞に特異的に感染し、複製し、死滅させる。この形質転換細胞を好むという点により、腫瘍溶解性ウイルスは新しい癌治療法の開発のための理想的な候補と判断される。様々な腫瘍溶解性ウイルスが、直接的機構（例えば、ウイルス複製および免疫介在性細胞毒性による細胞溶解）と間接的機構（例えば、バイスタンダー細胞の死滅の刺激、細胞毒性の誘導など）の両方により、腫瘍特異的殺傷活性を用いるために利用されてきた。腫瘍溶解性ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）は、現在の処置選択肢に追加される魅力的な選択肢であり、動物モデルおよび初期の臨床研究で有効性と安全性を示している。ＶＶは、腫瘍細胞に直接感染して死滅させるだけでなく、腫瘍抗原に対するＴ細胞応答を誘発し、殺傷効率を高めることもできる。一部のウイルスでは、癌細胞に対するこの特異性は自然に存在するが（例えば、水疱性口内炎ウイルス、レオウイルス、ムンプス・ウイルス）、他のウイルスは、腫瘍特異性を改善したり、抗ウイルス免疫応答を誘導する能力を低下させたりするために遺伝子を改変することができる（例えば、アデノウイルス、麻疹ウイルス、ポリオ、およびワクシニア・ウイルス）。さらに、これらのウイルスは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴ細胞の動員によって抗腫瘍免疫を増強する遺伝子を発現するように操作することができる。
腫瘍溶解性ウイルスは、正常細胞に損傷を与えずに、腫瘍細胞に特異的に感染し、複製し、死滅させる。この形質転換細胞を好むという点により、腫瘍溶解性ウイルスは新しい癌治療法の開発のための理想的な候補と判断される。様々な腫瘍溶解性ウイルスが、直接的機構（例えば、ウイルス複製および免疫介在性細胞毒性による細胞溶解）と間接的機構（例えば、バイスタンダー細胞の死滅の刺激、細胞毒性の誘導など）の両方により、腫瘍特異的殺傷活性を用いるために利用されてきた。腫瘍溶解性ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）は、現在の処置選択肢に追加される魅力的な選択肢であり、動物モデルおよび初期の臨床研究で有効性と安全性を示している。ＶＶは、腫瘍細胞に直接感染して死滅させるだけでなく、腫瘍抗原に対するＴ細胞応答を誘発し、殺傷効率を高めることもできる。一部のウイルスでは、癌細胞に対するこの特異性は自然に存在するが（例えば、水疱性口内炎ウイルス、レオウイルス、ムンプス・ウイルス）、他のウイルスは、腫瘍特異性を改善したり、抗ウイルス免疫応答を誘導する能力を低下させたりするために遺伝子を改変することができる（例えば、アデノウイルス、麻疹ウイルス、ポリオ、およびワクシニア・ウイルス）。さらに、これらのウイルスは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴ細胞の動員によって抗腫瘍免疫を増強する遺伝子を発現するように操作することができる。
【0003】
しかし、腫瘍溶解性ウイルスの有効性は、ウイルスによって誘発される強力な免疫応答によって妨げられる。抗体などの免疫因子は、ウイルスに直接結合して細胞の感染の成功を防ぐことによるか、あるいは補体または他の免疫細胞が破壊のマークを付けることによって、ウイルスを中和する。その後、ウイルスを投与するごとに、免疫応答はより速く、より強くなり、ウイルスが腫瘍に到達するのに十分な時間持続する能力を大幅に制限する。ウイルスを腫瘍に直接注入すると、この制限が克服され、すべてのウイルス粒子が癌細胞に直接送達される。しかし、このアプローチは一部の腫瘍には適さない場合があり、腫瘍が他の場所に転移した可能性があるケースは考慮されていない。より望ましいウイルスの全身投与は、潜在的な病原体を認識して排除する能力のある宿主免疫系にウイルスを曝す。中和抗体（ＮＡｂ）などの免疫因子は、ウイルス糖タンパク質を高い親和性で認識および結合し、ウイルスの宿主細胞受容体との相互作用を防ぎ、ウイルスの中和を引き起こす。アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、および水疱性口内炎ウイルスなどのいくつかの腫瘍溶解性ウイルスは、抗ウイルス防御を誘導し、腫瘍特異性を改善する能力を弱めているように遺伝的に弱毒化されている。
【0004】
腫瘍溶解性ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）は、ポックスウイルス科の最も研究されているメンバーであり、エンベロープを有する大型のｄｓＤＮＡウイルスである。腫瘍細胞に非常に特異的な株が報告されている。ＶＶの迅速な複製能力は、感染した細胞の効率的な溶解をもたらし、連続した複製の際に他の腫瘍細胞に広がり、腫瘍の深刻な局所的破壊を導く。ＶＶゲノムは約２５０の遺伝子をコードし、最大２０ｋｂの外来ＤＮＡを受け入れることができるため、遺伝子送達媒体として理想的である。組換えＶＶベクターは、腫瘍関連抗原などの真核生物遺伝子を腫瘍に送達するように、したがって癌細胞を死滅させるために作られた宿主免疫系の誘導を促進するように開発されている。しかし、ＶＶを癌処置送達ベクターとして使用する際の制限要因は、ＶＶの血流への注射によって誘発される強いＮＡｂ応答であり、これはウイルスが持続および拡散する能力を制限し、ベクターの再投与を妨げる。ＮＡｂは、ＶＶエンベロープに埋め込まれたウイルス糖タンパク質を認識して結合するため、ウイルスと宿主細胞受容体との相互作用を妨げる。宿主細胞の受容体認識に関与する多くのＶＶ糖タンパク質が識別されている。その中でも、タンパク質Ｈ３Ｌ、Ｌ１Ｒ、Ａ２７Ｌ、Ｄ８Ｌ、Ａ３３Ｒ、およびＢ５ＲはＮＡｂの標的となることが示されており、Ａ２７Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｄ８Ｌ、およびＬ１Ｒは成熟ウイルス粒子の表面に提示される主なＮＡｂ抗原である。Ａ２７Ｌ、Ｈ３Ｌ、およびＤ８Ｌは、宿主グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）（Ａ２７ＬおよびＨ３Ｌ）およびコンドロイチン硫酸（ＣＳ）（Ｄ８Ｌ）に結合し、ウイルスの宿主細胞へのエンドサイトーシスを媒介する接着分子である。Ｌ１Ｒタンパク質はウイルスの成熟に関与している。
【0005】
ワクシニア・ウイルスは、ポックスウイルス科のオルソポックスウイルス属のプロトタイプウイルスであり、細胞の細胞質で複製し、１９０ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムに２００を超えるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする。ワクシニア・ウイルス感染は、感染性粒子の複数の形態、すなわち、細胞内成熟ビリオン（ＩＭＶ）、細胞内エンベロープビリオン（ＩＥＶ）、細胞関連エンベロープビリオン（ＣＥＶ）、および細胞外エンベロープビリオン（ＥＥＶ）を生成する。ＩＭＶは最も豊富なビリオンであり、細胞内に単一の膜がある。ＩＭＶは、細胞溶解中にのみ放出される。放出されると、ＩＭＶは細胞受容体と、ＩＭＶ膜に埋め込まれたウイルス糖タンパク質との間の相互作用を介して隣接する細胞を効率的に感染させる。その後、ＩＭＶの一部は２層のゴルジ膜で包まれてＩＥＶを形成し、これは微小管を通って細胞周辺部に運ばれ、ビリオンが放出される時に膜を１枚失ってＣＥＶとなる。ＩＭＶのごく一部（約５％）が細胞の周辺に向かって移動し、そこでＩＭＶは細胞原形質膜との融合によって外被を獲得し、その後ＥＥＶとして細胞外空間に放出される。したがって、ＥＥＶは、ウイルスＤＮＡコア、中間ＩＭＶ、および最外膜で構成される。この外膜は壊れやすく、容易に失われる可能性があるため、ＥＥＶはＩＭＶに容易に変換され、ＩＭＶに埋め込まれた抗原が露出する。ＩＭＶは堅牢で、環境的変化および物理的変化に抵抗性であることが公知であるが、ＣＥＶおよびＥＥＶは非常に壊れやすく、精製手順中に外膜の完全性が損なわれる可能性がある。
【0006】
ワクシニア・ウイルスの異なる株のゲノムをはじめとする、ポックスウイルスゲノムの多くが配列決定されている。ワクシニア・ウイルス・ウエスタン・リザーブ（ＷＲ）株のゲノムは、２１８の潜在的なＯＲＦを含む。ＩＭＶのタンパク質の分析により、構造タンパク質、酵素、転写因子などをはじめとする８１のウイルスタンパク質が含まれていることが示された。ＩＭＶ中の８１のウイルスタンパク質は、Ａ２．５Ｌ、Ａ３Ｌ、Ａ４Ｌ、Ａ５Ｒ、Ａ６Ｌ、Ａ７Ｌ、Ａ９Ｌ、Ａ１０Ｌ、Ａ１２Ｌ、Ａ１３Ｌ、Ａ１４Ｌ、Ａ１４．５Ｌ、Ａ１５Ｌ、Ａ１６Ｌ、Ａ１７Ｌ、Ａ１８Ｒ、Ａ２１Ｌ、Ａ２２Ｒ、Ａ２４Ｒ、Ａ２５Ｌ、Ａ２６Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ２８Ｌ、Ａ２９Ｌ、Ａ３０Ｌ、Ａ３１Ｒ、Ａ３２Ｌ、Ａ４２Ｒ、Ａ４５Ｒ、Ａ４６Ｒ、Ｂ１Ｒ、Ｃ６Ｌ、Ｄ１Ｒ、Ｄ２Ｒ、Ｄ６Ｒ、Ｄ７Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｄ１１Ｌ、Ｄ１２Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｅ１Ｌ、Ｅ４Ｌ、Ｅ６Ｒ、Ｅ８Ｒ、Ｅ１０Ｒ、Ｅ１１Ｌ、Ｆ８Ｌ、Ｆ９Ｌ、Ｆ１０Ｌ、Ｆ１７Ｒ、Ｇ１Ｌ、Ｇ３Ｌ、Ｇ４Ｌ、Ｇ５Ｒ、Ｇ５．５Ｒ、Ｇ７Ｌ、Ｇ９Ｒ、Ｈ１Ｌ、Ｈ２Ｒ、Ｈ３Ｌ、Ｈ４Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ｈ６Ｒ、Ｉ１Ｌ、Ｉ２Ｌ、Ｉ３Ｌ、Ｉ５Ｌ、Ｉ６Ｌ、Ｉ７Ｌ、Ｉ８Ｒ、Ｊ１Ｒ、Ｊ３Ｒ、Ｊ４Ｒ、Ｋ４Ｌ、Ｌ１Ｒ、Ｌ３Ｌ、Ｌ４Ｒ、Ｌ５Ｒ、Ｏ２Ｌである。これらのタンパク質の中で、Ａ２７Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｌ１Ｒ、およびＤ８Ｌが主要な免疫原性タンパク質として識別されている。ＩＭＶタンパク質のＡ２７Ｌ、Ｈ３Ｌ、およびＤ８Ｌは、宿主グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）およびコンドロイチン硫酸（ＣＳ）（Ｄ８Ｌ）に結合し、ウイルスの宿主細胞へのエンドサイトーシスを媒介する接着分子である。ＩＭＶのＬ１Ｒタンパク質はウイルスの成熟に関与している。これらのタンパク質は、ＩＭＶの主要な免疫優性抗原である。
【0007】
ＶＶ Ｈ３Ｌは、Ｃ末端のその疎水性領域を介して翻訳後に成熟ウイルス粒子の膜に繋がれた膜タンパク質である。感染後期に発現し、Ａ２７Ｌとともに、ＨＳ細胞表面受容体を認識し、細胞へのＶＶ接着に主要な役割を果たす。Ｈ３Ｌは、抗ＶＶ Ａｂ応答における免疫優性抗原であり、天然痘ワクチンで免疫されたヒトにではＮＡｂの直接の標的である。Ｈ３Ｌに対する強い免疫応答は、マウスおよびウサギでも示されている。現在まで、ＮＡｂが認識するＨ３Ｌの正確なエピトープは解明されていない。
【0008】
Ｄ８Ｌは、感染の初期に発現するＶＶエンベロープタンパク質であり、宿主細胞へのウイルスの接着に関与している。Ａ２７ＬおよびＨ３ＬはＨＳ宿主細胞受容体と相互作用するが、Ｄ８ＬはそのＮ末端ドメイン（残基１～２３４の間）を介してＣＳ受容体に結合する。主要なウイルス抗原の１つとして、Ｄ８Ｌは強力なＮＡｂ応答を誘発し、ＮＡｂはＤ８ＬのＣＳ結合領域を標的とし、細胞へのウイルスの接着をブロックする。Ｄ８Ｌタンパク質を標的とするＡｂがいくつか報告されている。これらのＡｂの１つは、補体の存在下でＶＶを中和し、Ｄ８上の立体構造エピトープ（残基４１～２２０の間）を標的とした。Ｄ８ＬのＣＳ結合部位に隣接する領域である残基Ｒ４４、Ｋ４８、Ｋ９８、Ｋ１０８、およびＲ２２０もＡｂ結合に重要である。さらに、Ｎ９、Ｅ３０、Ｔ３４、Ｔ３５、Ｎ４６、Ｆ４７、Ｋ４８、Ｇ４９、Ｇ５０、Ｙ５１、Ｎ５９、Ｅ６０、Ｌ６３、Ｓ６４、Ｄ７５、Ｙ７６、Ｈ９５、Ｗ９６、Ｎ９７、Ｋ９９、Ｙ１０１、Ｓ１０２、Ｓ１０３、Ｙ１０４、Ｅ１０５、Ｅ１０６、Ｋ１０８、Ｈ１１０、Ｄ１１２、Ｑ１２２、Ｌ１２４、Ｄ１２６、Ｋ１６３、Ｔ１８７、Ｐ１８８、およびＮ１９０はＤ８抗体結合部位として識別されている。これらの残基の突然変異が中和抗体からの十分な回避をもたらすかどうかは不明である。さらに、細胞侵入におけるＤ８Ｌの役割のために、これらの残基の突然変異が、ウイルスのパッケージングおよび細胞侵入を阻害するかどうかはまだ決定されていない。
【0009】
Ｌ１Ｒは、成熟したＶＶ粒子の表面に見出される膜貫通タンパク質である。その膜貫通ドメインは、タンパク質のＣ末端領域の残基１８６と２０４の間にある。Ｌ１Ｒは、Ｌ１Ｒ ＯＲＦによってコードされ、高度に保存されており、ウイルスの侵入および成熟に不可欠な役割を果たす。抗ＶＶ ＮＡｂの主な標的の一つとして、Ｌ１Ｒはポックスウイルスのタンパク質サブユニットおよびＤＮＡワクチンの成分として含まれている。Ｌ１Ｒタンパク質のＮＡｂ結合エピトープは特徴づけられている。以前の研究で、残基１１８～１２８にまたがる線状エピトープと、線状ペプチドと部分的に重なる立体構造エピトープ、具体的には残基Ｋ１２５およびＫ１２７を認識する強力なＮＡｂが識別された。さらに最近の研究で、アイソタイプおよび補体に依存しない方法でＶＶを強力に中和する３つの抗Ｌ１ＲモノクローナルＡｂが識別された。これらのＮＡｂは、Ｄ３５を重要な残基とする立体構造エピトープを認識した。残基Ｄ３５に単一のアミノ酸変異（Ｄ３５ＮまたはＤ３５Ｙ置換のいずれか）を含むウイルスクローンは、すべてのＡｂによる中和に対して完全に抵抗性であり、Ｄ３５がＮＡｂによるＬ１Ｒの認識および結合に必須であることを示す。しかし、Ｄ３５Ｎが３５Ｎに対する新たな中和抗体応答を誘発するかどうかは不明である。Ｄ３５に加えて、残基Ｅ２５、Ｎ２７、Ｑ３１、Ｔ３２、Ｋ３３、Ｓ５８、Ｄ６０、およびＤ６２が、Ａｂとの結合に直接関与していることが識別された。細胞侵入におけるＬ１Ｒの役割のために、これらの残基の突然変異が中和抗体を十分に回避し、ウイルスのパッケージングおよび細胞侵入を阻害するかどうかは不明である。
【0010】
Ａ２７Ｌは、細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）のエンベロープにある１４ｋＤａのタンパク質であり、ウイルスの宿主細胞の認識および侵入に機能する。これは、そのＮ末端ドメイン（残基２１～３０）を介して宿主細胞表面のＨＳ受容体に結合し、そのＣ末端ドメインを通してエンベロープタンパク質Ａ１７と相互作用することによりＶＶエンベロープに結合する。最近の研究では、抗Ａ２７Ｌ Ａｂによって認識されるＡ２７Ｌ上のいくつかの線状エピトープが識別されている。Ａｂは４つの異なるグループに分類され、グループＩのＡｂは、ＨＳ結合部位に隣接するペプチド（残基３１から４０）に結合し、補体の存在下で強力なウイルス中和を示した。これらのＡｂとの複合体における全長Ａ２７Ｌの結晶構造より、結合に重要である残基Ｅ３３、Ｉ３５、Ｖ３６、Ｋ３７、およびＤ３９が識別された。これらの残基のアラニン置換は、ペプチドに結合するＡｂの能力の低下をもたらした。構造のさらなる分析により、残基Ｋ２７、Ａ３０、Ｒ３２、Ａ３４、Ｅ４０、Ｒ１０７、Ｐ１０８、およびＹ１０９も、重要ではないが、Ａ２７Ｌ－Ａｂ結合に寄与することが示された。
【0011】
以上のことから、抗ウイルス防御を誘導する能力が低下し、抗腫瘍活性が増強された、改善型または遺伝的に弱毒化されたワクシニア・ウイルスが必要とされている。例えば、抗ウイルス防御の誘導を減らして抗腫瘍活性を高める方法としては、中和抗体に抵抗するための戦略、補体媒介性のウイルス中和を克服するための戦略、ワクシニア・ウイルスを二重特異性ポリペプチドで武装させてウイルス治療を増強するための戦略、および／または免疫チェックポイント分子を組み込んでウイルス治療を増強するための戦略が挙げられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0012】
発明の要旨
一実施形態では、本発明は、ウイルスベクターおよびワクチンとして有用な変異ワクシニア・ウイルスを提供する。
一実施形態では、本発明は、ウイルスベクターおよびワクチンとして有用な変異ワクシニア・ウイルスを提供する。
【0013】
本明細書では、配列番号１７０および１７２のものを含む、バリアントＨ３Ｌ、Ｄ８Ｌ、Ａ２７Ｌおよび／またはＬ１Ｒウイルスタンパク質を含む組換えワクシニア・ウイルスが開示される。さらに、本明細書では、以下のポリペプチド：ＣＤ５５タンパク質のドメイン、ＣＤ３ｅおよびＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）に結合する二重特異性ポリペプチド、ＣＤ３ｅおよびＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）に結合する二重特異性ポリペプチド、およびヒトＰＤ－１細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドの１つをコードする異種核酸を含む組換えワクシニア・ウイルスが開示される。
【0014】
一実施形態では、本発明は、変異ワクシニア・ウイルスおよびその使用を提供する。一実施形態では、中和抗体またはＴ細胞の結合に関与するタンパク質をコードする遺伝子に１または複数の突然変異がある変異ワクシニア・ウイルスが提供される。これらの突然変異は、野生型ウイルスと比較した場合、ワクシニア・ウイルスに特異的な中和抗体またはＴ細胞を回避する能力を有する変異ワクシニア・ウイルスをもたらす。
【0015】
一実施形態では、本発明は、分離された感染性組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを提供し、この組換えＶＶビリオンは、異種核酸と、以下の：
（ａ）配列番号１と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；
（ｂ）配列番号２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質；
（ｃ）配列番号３と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）のＡ２７Ｌタンパク質；
（ｄ）配列番号４と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｌ１Ｒタンパク質；
（ｅ）配列番号５と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；
（ｆ）配列番号６または配列番号１７４と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質；
（ｇ）配列番号１７０と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；および
（ｈ）配列番号１７２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質
の１または複数を含む。
（ａ）配列番号１と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；
（ｂ）配列番号２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質；
（ｃ）配列番号３と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）のＡ２７Ｌタンパク質；
（ｄ）配列番号４と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｌ１Ｒタンパク質；
（ｅ）配列番号５と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；
（ｆ）配列番号６または配列番号１７４と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質；
（ｇ）配列番号１７０と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；および
（ｈ）配列番号１７２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質
の１または複数を含む。
【0016】
一実施形態では、本発明は、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４６、ＣＤ３５、補体Ｈ因子、およびＣ４結合タンパク質などの一部または全部などの補体活性化調節因子をコードする核酸を含む組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン、およびその使用を提供する。補体活性化調節因子の発現により、野生型ウイルスと比較した場合に、補体活性化を調節し、補体に媒介されるウイルスの中和を減少させる能力を有する、組換えワクシニア・ウイルスが得られる。一実施形態では、ＣＤ５５タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
【0017】
一実施形態では、本発明は、配列番号８の配列を有するアミノ酸配列を含む二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ３ ｓｃＦｖを含む組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを提供する。
【0018】
一実施形態では、本発明は、配列番号９の配列を有するアミノ酸配列を含む二重特異性ＢＣＭＡ－ＣＤ３ ｓｃＦｖを含む組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを提供する。
【0019】
一実施形態では、本発明は、配列番号１０の配列を有するアミノ酸配列を含むＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ融合ペプチドを含む組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを提供する。
【0020】
もう一つの実施形態では、本発明は、遺伝子産物をそれを必要とする個体に送達する方法を提供し、この方法は、本明細書に開示される有効量の感染性組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを個体に投与することを含み、該遺伝子産物は、組換えＶＶビリオンが有する異種核酸にコードされている。
【0021】
一実施形態では、本明細書に開示される組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを含む医薬組成物、およびそのような組成物を使用して癌を処置する方法が提供される。
【0022】
一実施形態では、１または複数のバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを含むライブラリーが提供され、前記バリアントＶＶビリオンの各々は、１または複数のバリアントＶＶタンパク質を含み、バリアントＶＶタンパク質は、対応する野生型ＶＶタンパク質のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
【0023】
もう一つの実施形態では、本発明は、遺伝子産物をそれを必要とする個体に送達する方法を提供し、この方法は、上記ライブラリーに由来する有効量の感染性バリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを個体に投与することを含み、該遺伝子産物は、このようなバリアントＶＶビリオンが有する核酸にコードされている。
【0024】
もう一つの実施形態では、上記ライブラリーに由来する有効量の感染性バリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを含む医薬組成物、およびそのような組成物を使用して癌を処置する方法が提供される。
【0025】
一実施形態では、配列番号１、５または１７０と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有する組換えワクシニア・ウイルスＨ３Ｌタンパク質が提供される。もう一つの実施形態では、配列番号６、１７２または１７４と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有する組換えワクシニア・ウイルスＤ８Ｌタンパク質が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【0027】
【0028】
【図2A】図２Ａ～Ｂは、直鎖状ペプチドＥＬＩＳＡによるＨ３ＬのＮＡｂエピトープマッピングを示す。図２Ａは、Ｈ３Ｌペプチド１～４のＥＬＩＳＡ結果を示す。図２Ｂは、Ｈ３Ｌペプチド５～９のＥＬＩＳＡ結果を示す。矢印は、抗体（Ａｂ）結合に影響を与えるアラニン置換残基のいくつかの例を示す。アラニンスキャンにより、Ａｂ結合に陽性の残基が合計２９個識別された：Ｉ１４Ａ、Ｄ１５Ａ、Ｒ１６Ａ、Ｋ３３Ａ、Ｆ３４Ａ、Ｄ３５Ａ、Ｋ３８Ａ、Ｎ４０Ａ、Ｅ４５Ａ、Ｖ５２Ａ、Ｅ１３１Ａ、Ｔ１３４Ａ、Ｆ１３５Ａ、Ｌ１３６Ａ、Ｒ１３７Ａ、Ｒ１５４Ａ、Ｅ１５５Ａ、Ｉ１５６Ａ、Ｋ１６１Ａ、Ｌ１６６Ａ、Ｖ１６７Ａ、Ｍ１６８Ａ、Ｉ１９８Ａ、Ｒ２２７Ａ、Ｅ２５０Ａ、Ｋ２５３Ａ、Ｐ２５４Ａ、Ｎ２５５Ａ、およびＦ２５６Ａ。光学濃度（ＯＤ）が低いほど、Ａｂとともにプレインキュベートしたアラニン置換ペプチドが、プレートに結合したネイティブペプチドとＡｂの結合を妨げるほど十分に結合していることを示す。ＯＤ値（矢印）が高いほど、変異ペプチドがＡｂと相互作用する能力が低下していることを示し、変異した残基がＨ３ＬとＡｂの結合に重要であることを示している。
【0029】
【図2B】図２Ａ～Ｂは、直鎖状ペプチドＥＬＩＳＡによるＨ３ＬのＮＡｂエピトープマッピングを示す。図２Ａは、Ｈ３Ｌペプチド１～４のＥＬＩＳＡ結果を示す。図２Ｂは、Ｈ３Ｌペプチド５～９のＥＬＩＳＡ結果を示す。矢印は、抗体（Ａｂ）結合に影響を与えるアラニン置換残基のいくつかの例を示す。アラニンスキャンにより、Ａｂ結合に陽性の残基が合計２９個識別された：Ｉ１４Ａ、Ｄ１５Ａ、Ｒ１６Ａ、Ｋ３３Ａ、Ｆ３４Ａ、Ｄ３５Ａ、Ｋ３８Ａ、Ｎ４０Ａ、Ｅ４５Ａ、Ｖ５２Ａ、Ｅ１３１Ａ、Ｔ１３４Ａ、Ｆ１３５Ａ、Ｌ１３６Ａ、Ｒ１３７Ａ、Ｒ１５４Ａ、Ｅ１５５Ａ、Ｉ１５６Ａ、Ｋ１６１Ａ、Ｌ１６６Ａ、Ｖ１６７Ａ、Ｍ１６８Ａ、Ｉ１９８Ａ、Ｒ２２７Ａ、Ｅ２５０Ａ、Ｋ２５３Ａ、Ｐ２５４Ａ、Ｎ２５５Ａ、およびＦ２５６Ａ。光学濃度（ＯＤ）が低いほど、Ａｂとともにプレインキュベートしたアラニン置換ペプチドが、プレートに結合したネイティブペプチドとＡｂの結合を妨げるほど十分に結合していることを示す。ＯＤ値（矢印）が高いほど、変異ペプチドがＡｂと相互作用する能力が低下していることを示し、変異した残基がＨ３ＬとＡｂの結合に重要であることを示している。
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【図5】図５は、ポリクローナル抗ＶＶ Ａｂを使用するプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）を示す。ａｂ３５２１９（Ａｂｃａｍ）－ＶＶに対するウサギポリクローナル（免疫原：ネイティブウイルス、リスター株）、ａｂ２１０３９（Ａｂｃａｍ）－ＶＶに対するウサギポリクローナル（免疫原：リスター株（ビリオンと感染細胞ポリペプチドの混合物））、ａｂ２６８５３（Ａｂｃａｍ）－ＶＶに対するウサギポリクローナル（免疫原：ＶＶのＡ２７Ｌの予測されるＮ末端のアミノ酸を含有する合成ペプチド）、９５０３－２０５７（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）－ＶＶに対するウサギポリクローナルＡｂ（免疫原：ワクシニア・ウイルス、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＹＣＢＯＨ）株）、およびＰＡ１－７２５８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）－ＶＶに対するウサギポリクローナル（免疫原：ＮＹＣＢＯＨ株およびリスター株）からなる５つの抗ＶＶポリクローナル抗体のパネルを使用して、インビトロでの中和回避について試験した。ウサギポリクローナルＩｇＧ ａｂ３７４１５をコントロールとして使用した。Ａｂを、滅菌子ウサギ補体の存在下、エスケープバリアントかまたは野生型ＶＶウイルス（コントロール）のいずれかとともにプレインキュベートした。次に、混合物をＣＶ－１細胞に添加し、４８時間後に細胞を染色し、プラークを計数した。コントロールＶＶウイルスはパネル全体で８３．３～９５．５％が中和されたのに対し、エスケープバリアント（ＦＡＰ－ＶＶＮＥＶ）は、Ａｂによる中和が大幅に低いことが示され（７．８８～６６．１％）。エラーバーは、サンプルあたり２または３のデータポイントに基づいている。
【0036】
【図6】図６は、抗ＶＶポリクローナルＡｂによるＶＶＥＭ（ワクシニア・ウイルス・エスケープ変異株）のインビトロプラーク減少中和試験を示す。ＶＶＥＭは、抗ＶＶポリクローナル抗体の存在下、変異ＶＶライブラリープールから分離された。ａｂ３５２１９、ａｂ２１０３９、ａｂ２６８５３、９５０３－２０５７、およびＰＡ１－７２５８からなる５つの抗ＶＶポリクローナル抗体のパネルを使用して、インビトロでの中和回避についてＶＶＥＭを試験した。ウサギポリクローナルＩｇＧ ａｂ３７４１５をコントロールとして使用した。Ａｂを、滅菌子ウサギ補体の存在下、ＶＶＥＭかまたは野生型ＶＶウイルス（コントロール）のいずれかとともにプレインキュベートした。コントロールＶＶウイルスはパネル全体で７７．７～９６．４％が中和されたのに対し、ＶＶＥＭは、Ａｂによる中和が大幅に低いことが示され（３０．７～６６．９％）。エラーバーは、サンプルあたり２または３のデータポイントに基づいている。ＶＶＥＭをさらに配列決定して、ＮＡｂの回避の原因となる可能性のあるＨ３、Ｌ１、Ａ２７、またはＤ８内の突然変異を識別した。
【0037】
【0038】
【図8】図８は、組換えウイルスの抗腫瘍効率を示す。組換えウイルスおよびコントロールＶＶを、Ａｂ９５０３－２０５７（上記参照）とともにプレインキュベートし、ＭＯＩ＝１で形質転換細胞を感染させるために使用した。細胞を４８時間インキュベートし、ＭＴＳアッセイ（細胞の代謝活性の比色評価）により細胞の生存率を測定した。手短に言えば、４８時間で回収した細胞をＰＢＳＴで１回洗浄し、完全ＤＭＥＭに１×１０５細胞／ｍＬで再懸濁した。各細胞の懸濁液１００μＬを９６ウェルに添加した（３通り）。２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ３５８Ｃ）を、１００μｌの培地にサンプルを含む９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに添加した。このプレートを３７℃で２時間インキュベートした（５％ＣＯ２）。ＭＴＳの細胞還元によって生成された可溶性ホルマザンの量を測定するために、９６ウェルプレートリーダーを使用して各ウェルの吸光度を４９０ｎｍで記録したＡｂの存在下で、組換えウイルスは細胞を効率的に死滅させることができた。
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
【0048】
【0049】
【0050】
【0051】
【0052】
【図22】図２２は、ｐＥ／Ｌプロモーター、ＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ、ｌｏｘＰ隣接ＧＦＰタグ、およびＴＫＬ（左隣接領域）とＴＫＲ（右隣接領域）を含む隣接領域を含むＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ－ＶＶコンストラクトを示す。ｐＥ／Ｌプロモーター、ＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ、Ｆ１７Ｒプロモーター、ＦＡＰ－ＣＤ３ ｓｃＦｖ、ｌｏｘＰ隣接ＧＦＰタグ、およびＴＫＬ（左隣接領域）とＴＫＲ（右隣接領域）を含む隣接領域を含むＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ－ＦＡＰ－ＴＥＡ－ＮＥＶコンストラクトも示される。ＯＲＦ配列はＧＥＮＥＷＩＺによって合成され、ｐＵＣ５７－Ａｍｐプラスミドにクローニングされた。
【0053】
【0054】
【0055】
【発明を実施するための形態】
【0056】
発明の詳細な説明
本発明は、抗ウイルス防御を誘導する能力が低下し、抗腫瘍活性が増強されたバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンの作製および使用を開示する。
中和抗体に対する抵抗性の強化
本発明は、抗ウイルス防御を誘導する能力が低下し、抗腫瘍活性が増強されたバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンの作製および使用を開示する。
中和抗体に対する抵抗性の強化
【0057】
一実施形態では、本発明のバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンは、抗ＶＶ中和抗体に対する抵抗性が増加している。例えば、本発明のバリアント・ワクシニア・ウイルスビリオンは、１または複数の中和抗体エピトープに突然変異を有する１または複数のバリアントＶＶタンパク質（Ｈ３Ｌタンパク質、Ｄ８Ｌタンパク質、Ａ２７Ｌタンパク質、およびＬ１Ｒタンパク質など）を含み、これにより中和抗体からのウイルスエスケープがもたらされる。
【0058】
本明細書は、バリアントＶＶタンパク質Ｈ３Ｌを研究する実験を開示する。同じ実験設定を使用して、Ｄ８Ｌタンパク質、Ａ２７Ｌタンパク質、Ｌ１Ｒタンパク質などの他のワクシニア・ウイルスのウイルスタンパク質を研究することができる。中和抗体と相互作用するウイルスタンパク質上の可能な領域を識別するために、全長ウイルスタンパク質を含むペプチドアレイを合成し、抗ＶＶ中和抗体に結合するペプチドについてスクリーニングした。このように識別されたペプチドをさらに調べて、中和抗体エピトープを解明した。一実施形態では、ペプチドアレイによって識別されたペプチドのバリアントは、アラニン置換によって合成され、中和抗体エピトープは、一連のＥＬＩＳＡ結合アッセイを使用してマッピングされた。中和抗体エピトープが識別されると、これらのエピトープを破壊する変異を遺伝子工学によってＶＶゲノムに導入することができる。
【0059】
本発明は、ワクシニア・ウイルスＨ３Ｌタンパク質、Ｄ８Ｌタンパク質、Ａ２７Ｌタンパク質、およびＬ１Ｒタンパク質のそれぞれの中和抗体エピトープをいくつか開示する。これらの中和抗体エピトープで１または複数のアミノ酸を変異または置換すると、中和抗体からのウイルスエスケープがもたらされることになる。同様に、これらの中和抗体エピトープで１または複数のアミノ酸を欠失させると、中和抗体からのウイルスエスケープがもたらされることも予想される。したがって、Ｈ３Ｌ、Ｄ２８Ｌ、Ａ２７Ｌ、またはＬ１Ｒウイルスタンパク質内の１または複数のアミノ酸の欠失、あるいはＨ３Ｌ、Ｄ２８Ｌ、Ａ２７Ｌ、またはＬ１Ｒウイルスタンパク質全体の欠失も、中和抗体との結合を回避することがあり得ると予想される。Ｈ３Ｌ欠失突然変異株が報告されており、たとえＨ３Ｌ欠失がウイルス変異株の感染性と複製能力を損なったとしても、１または複数のアミノ酸欠失または全タンパク質欠失ウイルス変異株が生成される可能性が示される。
【0060】
一実施形態では、本発明は、分離された感染性組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを提供し、この組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンは、異種核酸と、以下の：
ａ）配列番号１と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；
ｂ）配列番号２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質；
ｃ）配列番号３と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）のＡ２７Ｌタンパク質；
ｄ）配列番号４と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｌ１Ｒタンパク質；
ｅ）配列番号５と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；
ｆ）配列番号６または配列番号１７４と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質；
ｇ）配列番号１７０と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；および
ｈ）配列番号１７２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質
の１または複数を含む。
ａ）配列番号１と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；
ｂ）配列番号２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質；
ｃ）配列番号３と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）のＡ２７Ｌタンパク質；
ｄ）配列番号４と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｌ１Ｒタンパク質；
ｅ）配列番号５と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；
ｆ）配列番号６または配列番号１７４と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質；
ｇ）配列番号１７０と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；および
ｈ）配列番号１７２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質
の１または複数を含む。
【0061】
一実施形態では、上記のバリアントＶＶのＨ３Ｌタンパク質は、１または複数の以下のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む：配列番号１の１４、１５、１６、３３、３４、３５、３８、４０、４４、４５、５２、１３１、１３４、１３５、１３６、１３７、１５４、１５５、１５６、１６１、１６６、１６７、１６８、１９８、２２７、２５０、２５３、２５４、２５５、および２５６。任意の適したアミノ酸を置換に使用することができる。例えば、バリアントペプチドは、置換によって合成することができる。
【0062】
一実施形態では、上記のバリアントＶＶのＤ８Ｌタンパク質は、１または複数の以下のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む：配列番号２の４４、４８、９８、１０８、１１７、および２２０。任意の適したアミノ酸を置換に使用することができる。例えば、バリアントペプチドは、置換によって合成することができる。
【0063】
一実施形態では、上記のバリアントＶＶのＡ２７Ｌタンパク質は、１または複数の以下のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む：配列番号３の２７、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３９、４０、１０７、１０８、および１０９。任意の適したアミノ酸を置換に使用することができる。例えば、バリアントペプチドは、置換によって合成することができる。
【0064】
一実施形態では、上記のバリアントＶＶのＬ１Ｒタンパク質は、１または複数の以下のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む：配列番号４の２５、２７、３１、３２、３３、３５、５８、６０、６２、１２５、および１２７。任意の適したアミノ酸を置換に使用することができる。例えば、バリアントペプチドは、置換によって合成することができる。
【0065】
一実施形態では、上記のバリアントＶＶのＨ３Ｌタンパク質は、１または複数の以下のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む：配列番号１７０の１４、１５、１６、３３、３４、３５、３８、４０、４４、４５、５２、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３７、１５４、１５５、１５６、１６１、１６６、１６７、１６８、１９５、１９８、１９９、２２７、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６４、２６６、２６８、２７２、２７３、２７５、および２７７。任意の適したアミノ酸を置換に使用することができる。
【0066】
一実施形態では、上記のバリアントＶＶのＤ８Ｌタンパク質は、１または複数の以下のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む：配列番号１７２の４３、４４、４８、５３、５４、５５、９８、１０８、１０９、１４４、１６８、１７７、１９６、１９９、２０３、２０７、２１２、２１８、２２０、２２２、および２２７。任意の適したアミノ酸を置換に使用することができる。
補体に媒介されるウイルス中和の克服
補体に媒介されるウイルス中和の克服
【0067】
補体は自然免疫系の重要な構成要素であり、中和および循環器系からのクリアランスのためにウイルスを標的とする。補体は中和抗体の中和効力を高める可能性があり、天然痘ワクチン接種により誘発される抗体媒介防御免役は、補体の不在下ではインビトロで大きく低下し、ワクシニア・ウイルスの中和における補体の重要な役割を示している。補体活性化は、Ｃ３の切断と活性化、および表面でのオプソニンＣ３フラグメントの付着をもたらす。その後のＣ５の切断は、膜侵襲複合体（Ｃ５ｂ、６、７、８、９）の集合を導き、これは脂質二重層を破壊する。
【0068】
補体活性化は、いくつかの補体活性化の膜調節因子（ＲＣＡ）によって負に調節される可能性がある。ＲＣＡは様々なステップで補体活性化をダウンレギュレートする。第１に、ＣＤ３５（補体受容体１）およびＣＤ５５（崩壊促進因子）が、Ｃ３コンバターゼ（Ｃ３活性化酵素）の形成を阻害し、崩壊を加速する。第２に、ＣＤ３５およびＣＤ４６（膜補因子タンパク質）がＣ４ｂおよびＣ３ｂを異化し、Ｃ３コンバターゼ、Ｃ４ｂ２ａおよびＣ３ｂＢｂの形成を阻害する。第３に、ＣＤ５９が膜侵襲複合体の形成を防ぐ。研究により、細胞外エンベロープワクシニア・ウイルス（ＥＥＶ）は、宿主ＲＣＡがエンベロープに組み込まれているため、補体に対して抵抗性であることが示されている。しかし、ＣＤ５５および／または他のＲＣＡが、ウイルスのパッケージングおよび複製に影響を与えることなく、補体に媒介される中和を克服する能力を備えたＶＶのＩＭＶの表面でうまく発現することができるかどうかは不明である。
【0069】
一実施形態では、本発明は、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４６、ＣＤ３５、補体Ｈ因子、Ｃ４結合タンパク質、またはその他の識別された補体活性化調節因子などの補体活性化調節因子をコードする異種核酸を含む組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオン、およびその使用を提供する。補体活性化調節因子を発現することにより、野生型ウイルスと比較して、補体活性化を調節し、補体に媒介されるウイルスの中和を減少させる能力を有する、組換えワクシニア・ウイルスが得られる。一実施形態では、上記の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンが有する異種核酸は、ヒトＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４６、ＣＤ３５、補体Ｈ因子、Ｃ４結合タンパク質、または他の識別された補体活性化調節因子のドメインをコードする。もう一つの実施形態では、異種核酸は、配列番号７の配列を有するアミノ酸配列を含むＣＤ５５タンパク質をコードする。本明細書に示される開示を考慮すると、当業者であれば、本明細書に示される組換えワクシニア・ウイルスにその他の補体活性化調節因子（例えば、ＣＤ５９、ＣＤ４６、ＣＤ３５、補体Ｈ因子、Ｃ４結合タンパク質など）を容易に採用するであろう。
ウイルス治療を後押しするための二重特異性抗体の組み込み
ウイルス治療を後押しするための二重特異性抗体の組み込み
【0070】
腫瘍溶解性ウイルスは、免疫細胞上の第１の抗原と腫瘍細胞上の第２の抗原に結合する二重特異性抗体を発現するように武装させることができる。免疫細胞上の第１の抗原の例としては、限定されるものではないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄなどが挙げられる。腫瘍細胞上の第２の抗原の例としては、限定されるものではないが、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、グリピカン３、５Ｔ４、８Ｈ９、ａｖｂ６インテグリン、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＢＣＭＡ、ＣＡＤＣ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖ１１１、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、葉酸受容体ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａｌ、ＨＬＡ－Ａ２、ＩＬ１１Ｒａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、ラムダ、ルイス－Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃｌ、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣｌ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲＩ、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＡＧ７２、ＴＥＭｌ、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、癌胎児性抗原、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＶＥＧＦ受容体、および、フィブロネクチンの癌胎児性バリアント、テネイシン、または腫瘍の壊死領域など、腫瘍の細胞外マトリックス内に存在する他の例示的な抗原が挙げられる。
多発性骨髄腫を処置するためのＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）の標的化
多発性骨髄腫を処置するためのＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）の標的化
【0071】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、Ｂリンパ球系統に由来するクローン性形質細胞の悪性腫瘍であり、意義不明の単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）から形質細胞白血病までの範囲の一連の疾患の一部である。これは、米国で２番目に多い血液癌であり、２０１９年には新たに診断される症例が３２，１１０、死亡例が１２，９６０と推定されている。ＭＭは現在、血液悪性腫瘍の１０％、すべての癌関連死の２．１％を占めている。現在、ＭＭのいくつかの治療法が利用可能であるが、根治療法は定義されておらず、治療計画または処置に対する初期応答に関わらず、ほとんどの患者は最終的に再発し、生存期間中央値は３～５年である。したがって、薬剤耐性ＭＭを処置するために、新しい作用機構をもつ治療薬が緊急に必要である。
【0072】
腫瘍溶解性ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）は、ＭＭの処置に大きな可能性をもつ有望な新しいクラスの薬剤として登場した。生のＶＶは、天然痘を根絶するためにＷＨＯが２億人以上に投与しており、ＶＶのヒトでの安全性には優れた歴史がある。野生型ＶＶには腫瘍選択性はないが、チミジンキナーゼ（ＴＫ）およびワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）などの正常細胞でのウイルス複製に必須のウイルス遺伝子の二重欠失により、厳密なＶＶ腫瘍特異性がもたらされている。固形腫瘍に対するＶＶの最近の臨床試験は、有望な結果を報告している。ＴＫとＶＧＦを二重に欠失した株を利用するインビトロ研究により、ＭＭ細胞株がＶＶによる殺傷を受けやすいことが示された。これらの研究では、ウイルス複製は初代ＭＭ細胞で観察されたが、正常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）では観察されなかった。二重欠失株はまた、ＭＭのマウス異種移植モデルにおいて腫瘍体積を減少させ、生存を増加させた。さらに、最近、２つの抗腫瘍因子であるｍｉＲ－３４ａとＳｍａｃ（ＭＭで頻繁に調節不全になる）を過剰発現するＴＫ欠失ＶＶ株は、親ウイルスであるＶＶ－ｍｉＲ－３４ａ、またはＶＶ－Ｓｍａｃによる個別の処置と比較して、インビトロおよびインビボの両方でＭＭに対する有効性の増加を示した。しかし、現在の臨床試験におけるＶＶ治療の有効性は最適化されておらず、ＶＶ治療のさらなる改善の必要性が示されている。
【0073】
ＶＶは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２６、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＣＳ１、ＥＧＦＲ、インテグリンベータ７、ＫＩＲ、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＣＩ、およびＴＧＩＴなどのＭＭ抗原を標的化または同時標的化するＴ細胞エンゲージャーを発現させることができる。Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）の膜貫通糖タンパク質であり、すべての患者のＭＭ細胞で有意に高いレベルで発現しているが、形質細胞（ＰＣ）を除く正常組織では発現していないことから、ＭＭ治療の有望な標的となっている。最近の臨床研究で、ＢＣＭＡを標的化したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、プロテアソーム阻害剤および免疫調節剤を含む少なくとも３回の前処置を受けた、再発した難治性多発性骨髄腫（ＲＲＭＭ）患者において有意な臨床活性を示した。抗ＢＣＭＡ抗体薬物複合体（ＡＤＣ）も、少なくとも３つの前治療ラインに失敗した患者において有意な臨床応答を達成した。ＢＣＭＡを標的としたＣＡＲ－ＴとＡＤＣはいずれも、２０１７年１１月にＦＤＡからＲＲＭＭ患者に対する画期的なステータスが付与された。これらの２つの治療法は有望であるが、ＢＣＭＡを標的とするにはいくつかの複雑な要因がある。最初に、抗ＢＣＭＡ処置は、長寿命のＰＣの数を減らす可能性があり、長寿命のＰＣは体液性免疫の維持に重要な役割を果たしているため、免疫機能に対する抗ＢＣＭＡ治療の影響を注意深く連続的に評価する必要がある。二番目に、γセクレターゼによってＢＣＭＡから切断されたｓＢＣＭＡの高い血清レベルが、特に進行性疾患の状況のＭＭ患者において検出されている。したがって、ＢＣＭＡを標的とした処置をＢＣＭＡ＋ＭＭ細胞に直接送達するための治療戦略を開発する必要がある。
【0074】
本明細書に記載されるように、本発明は、ＢＣＭＡ－ＣＤ３ ＢｉＴＥの発現が、ＢＣＭＡ＋ＰＣおよびｓＢＣＭＡを回避しながらＭＭ周辺領域内に制限されることになるため、上記の制限を克服する組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）、ＢＣＭＡ－ＴＥＡ－ＮＥＶを提供する。ＴＥＡ－ＮＥＶは、ＶＶに感染していない腫瘍細胞を認識して殺傷（バイスタンダー殺傷）するようにＴ細胞に指示する二重特異性ｓｃＦｖをコードし、その結果、腫瘍溶解が促進される。さらに、ＣＤ３－ｓｃＦｖは、腫瘍へのＴ細胞浸潤とそれらの活性化を促進し、活性化の際にそれらが放出するサイトカインは、腫瘍成長を阻害する炎症促進性の微小環境を作り出す。さらに、ＴＥＡ－ＮＥＶは、全身性の副作用を低減すると同時に、標的部位でより高いＴ細胞濃度を可能にするＴ細胞エンゲージャーの局所産生を誘導する。このように、腫瘍溶解性ＶＶを二重特異性ｓｃＦｖで武装させることは、Ｔ細胞を癌治療に関与させ、バイスタンダー殺傷を誘発することによって現在のＶＶの抗腫瘍活性の望ましい増加を生成するために重要である。
【0075】
一実施形態では、上記の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンが有する異種核酸は、免疫細胞上の第１の抗原と、多発性骨髄腫（ＭＭ）上の第２の抗原、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する二重特異性ポリペプチドをコードする。例えば、二重特異性ポリペプチドは二重特異性ｓｃＦｖであり、第１の抗原はヒトＣＤ３ｅであり、第２の抗原はヒトＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）であり、二重特異性ｓｃＦｖは配列番号９のアミノ酸配列を含む。
【0076】
もう一つの実施形態では、ＶＶは、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ２６、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、インテグリンベータ７、ＣＤ１３８、ＫＩＲ、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１、ＴＧＩＴ、ＣＤ５６、ＣＳ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＡＣＩ、およびＣＤ４４ｖ６などのその他のＭＭ抗原を標的化または同時標的化するＴ細胞エンゲージャーを発現させることができる。
【0077】
もう一つの実施形態では、二重特異性ポリペプチドは二重特異性ｓｃＦｖであり、第１の抗原はヒトＣＤ３ｅであり、第２の抗原はほとんどの上皮癌で過剰発現するヒトＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）である。一実施形態では、二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ３ ｓｃＦｖは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
ウイルス治療を後押しするための免疫チェックポイント分子の組み込み
ウイルス治療を後押しするための免疫チェックポイント分子の組み込み
【0078】
Ｔ細胞免疫療法が癌患者において腫瘍の成長を制御し、生存を延長する能力を有することを示す証拠は増加している。しかし、おそらく腫瘍細胞の様々な免疫回避機構の制限のために、腫瘍特異的Ｔ細胞応答を達成して維持することは困難である。免疫チェックポイント分子は、免疫応答を開始するために、例えば、体内の腫瘍細胞などの異常な細胞を攻撃するために活性化するかまたは阻害する必要のある、特定の免疫細胞で発現するタンパク質である。「免疫回避」には、刺激性免疫チェックポイント分子などの共刺激分子発現のダウンレギュレーション、および抑制性免疫チェックポイント分子などの抑制性分子発現のアップレギュレーションなど、腫瘍細胞によるいくつかの活性が含まれる場合がある。これらの抑制性免疫チェックポイント分子の遮断は、癌の処置の前臨床および臨床試験で非常に有望な結果を示している。しかし、場合によってはいくつかの望ましくない副作用がある。例えば、これらの抑制性免疫チェックポイント分子（受容体またはリガンド）を遮断することにより、免疫恒常性および自己寛容が破壊され、自己免疫／自己炎症性の副作用が生じる可能性がある。
【0079】
免疫チェックポイント分子 は当技術分野で周知である。例えば、ＰＤ－１（プログラム細胞死－１）受容体は活性化Ｔ細胞の表面に発現する。そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２は、一般的に樹状細胞または腫瘍細胞の表面に発現する。ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２は、Ｔ細胞応答の発生を停止または制限することができる抑制性免疫チェックポイントタンパク質のファミリーに属している。腫瘍細胞に発現したＰＤ－Ｌ１は、活性化Ｔ細胞のＰＤ－１受容体に結合し、これにより細胞傷害性Ｔ細胞の阻害がもたらされることがあり得る。したがって、抗腫瘍免疫応答は、ＰＤ－１とそのリガンド間の相互作用を遮断することによって増強されることになる。
【0080】
一実施形態では、本発明は、抑制性ＰＤ－１経路を遮断することになる組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを提供する。一実施形態では、本発明は、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）－Ｇ１（ＩｇＧ１）の定常（Ｆｃ）ドメインに融合したＰＤ－１の細胞外ドメインをコードする異種核酸を含む組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを提供する。一実施形態では、ＰＤ－１融合タンパク質（ＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ）は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。本明細書に示される開示を考慮すると、その他の免疫チェックポイント分子は、本明細書に示される組換えワクシニア・ウイルスに容易に組み込むことができる。本明細書に示される組換えワクシニア・ウイルスは、限定されるものではないが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ４７、ＣＸＣＲ４、ＣＳＦ１Ｒ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＨＨＬＡ２、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ１６０、２Ｂ４、およびＣＤ７３をはじめとする免疫チェックポイント分子を含むことがある。
【0081】
一実施形態では、本発明は、分離された感染性組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを提供し、このビリオンは、異種核酸と、以下の：
ａ）配列番号１と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；
ｂ）配列番号２と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質；
ｃ）配列番号３と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ａ２７Ｌタンパク質；
ｄ）配列番号４と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｌ１Ｒタンパク質；
ｅ）配列番号５と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；
ｆ）配列番号６または配列番号１７４と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質；
ｇ）配列番号１７０と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；および
ｈ）配列番号１７２と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質；
の１または複数を含む。
ａ）配列番号１と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；
ｂ）配列番号２と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質；
ｃ）配列番号３と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ａ２７Ｌタンパク質；
ｄ）配列番号４と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｌ１Ｒタンパク質；
ｅ）配列番号５と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；
ｆ）配列番号６または配列番号１７４と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質；
ｇ）配列番号１７０と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質；および
ｈ）配列番号１７２と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質；
の１または複数を含む。
【0082】
一実施形態では、バリアントＶＶのＨ３Ｌタンパク質は、１または複数の以下のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む：配列番号１の１４、１５、１６、３３、３４、３５、３８、４０、４４、４５、５２、１３１、１３４、１３５、１３６、１３７、１５４、１５５、１５６、１６１、１６６、１６７、１６８、１９８、２２７、２５０、２５３、２５４、２５５、および２５６。
【0083】
一実施形態では、バリアントＶＶのＤ８Ｌタンパク質は、１または複数の以下のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む：配列番号２の４４、４８、９８、１０８、１１７、および２２０。
【0084】
一実施形態では、バリアントＶＶのＡ２７Ｌタンパク質は、１または複数の以下のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む：配列番号３の２７、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３９、４０、１０７、１０８、および１０９。
【0085】
一実施形態では、バリアントＶＶのＬ１Ｒタンパク質は、１または複数の以下のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む：配列番号４の２５、２７、３１、３２、３３、３５、５８、６０、６２、１２５、および１２７。
【0086】
一実施形態では、バリアントＶＶのＨ３Ｌタンパク質は、１または複数の以下のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む：配列番号１７０の１４、１５、１６、３３、３４、３５、３８、４０、４４、４５、５２、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３７、１５４、１５５、１５６、１６１、１６６、１６７、１６８、１９５、１９８、１９９、２２７、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６４、２６６、２６８、２７２、２７３、２７５、および２７７。
【0087】
一実施形態では、バリアントＶＶのＤ８Ｌタンパク質は、１または複数の以下のアミノ酸残基でのアミノ酸置換または欠失を含む：配列番号１７２の４３、４４、４８、５３、５４、５５、９８、１０８、１０９、１４４、１６８、１７７、１９６、１９９、２０３、２０７、２１２、２１８、２２０、２２２、および２２７。
【0088】
一実施形態では、組換えＶＶが有する異種核酸は、補体活性化の調節因子のドメインをコードする。補体活性化の調節因子の例としては、限定されるものではないが、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４６、ＣＤ３５、補体Ｈ因子、およびＣ４結合タンパク質が挙げられる。一実施形態では、異種核酸は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤ５５ポリペプチドをコードする。
【0089】
もう一つの実施形態では、組換えＶＶが有する異種核酸は、免疫細胞上の第１の抗原と腫瘍細胞上の第２の抗原に結合する二重特異性ポリペプチドをコードする。一実施形態では、免疫細胞上の第１の抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＮＫｐ４６、またはＮＫＧ２Ｄであり得る。一実施形態では、腫瘍細胞上の第２の抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、または多発性骨髄腫の腫瘍抗原であり得る。
【0090】
一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは二重特異性ｓｃＦｖであり、第１の抗原はヒトＣＤ３ｅであり、第２の抗原はヒトＦＡＰである。例えば、この二重特異性ポリペプチド配列番号８のアミノ酸配列を有する。
【0091】
もう一つの実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、多発性骨髄腫の腫瘍抗原、例えば、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ２６、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、インテグリンベータ７、ＣＤ１３８、ＫＩＲ、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１、ＴＧＩＴ、ＣＤ５６、ＣＳ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＡＣＩ、またはＣＤ４４ｖ６を標的とすることができる。一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは二重特異性ｓｃＦｖであり、第１の抗原はヒトＣＤ３ｅであり、第２の抗原はヒトＢＣＭＡである。例えば、この二重特異性ポリペプチド配列番号９のアミノ酸配列を有する。
【0092】
もう一つの実施形態では、組換えＶＶが有する異種核酸は、免疫チェックポイント分子を含む融合ポリペプチドをコードする。免疫チェックポイント分子の例としては、限定されるものではないが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ４７、ＣＸＣＲ４、ＣＳＦ１Ｒ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＨＨＬＡ２、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ１６０、２Ｂ４、およびＣＤ７３が挙げられる。一実施形態では、組換えＶＶが有する異種核酸は、ヒトＰＤ－１細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む融合ポリペプチドをコードし、例えば、この融合ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を有する。
【0093】
一実施形態では、本明細書に開示される組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンは、野生型ＶＶに示される耐性と比較して、中和抗体に対する耐性を示す。もう一つの実施形態では、本明細書に開示される組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンは、野生型ＶＶによる哺乳動物細胞の形質導入と比較して、抗ＶＶ中和抗体の存在下で哺乳動物細胞の形質導入の増加を示す。
【0094】
もう一つの実施形態では、遺伝子産物を、それを必要とする対象（ヒトまたは動物）に送達する方法が提供される。この方法は、有効量の本明細書に開示される組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを対象に投与することを含み、該遺伝子産物は組換えＶＶビリオンが有する異種核酸によってコードされている。
【0095】
もう一つの実施形態では、本明細書に開示される組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物が提供される。もう一つの実施形態では、対象の癌を処置するためにそのような医薬組成物を使用する方法が提供される。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内に、または注射、吸入、注入、移植、非経口投与、経腸投与（例えば、胃腸管からの投与）によって、あるいは当技術分野で一般に公知のその他の全身投与手法によって、対象に投与することができる。一実施形態では、対象はヒトである。あるいは、本発明は、動物対象への投与および動物対象の処置に使用してもよい。
【0096】
もう一つの実施形態では、１または複数のバリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを含むライブラリーが提供され、バリアントＶＶビリオンの各々は、１または複数のバリアントＶＶタンパク質を含む。バリアントＶＶタンパク質は、対応する野生型ＶＶタンパク質のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、バリアントＶＶタンパク質は、バリアントＨ３Ｌタンパク質、バリアントＤ８Ｌタンパク質、バリアントＬ１Ｒタンパク質、および／またはバリアントＡ２７Ｌタンパク質であり得る。もう一つの実施形態では、バリアントＶＶタンパク質は、配列番号５、６または１７４のいずれか記載されるアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失を有するアミノ酸配列を含む。
【0097】
もう一つの実施形態では、上記ライブラリーに由来する有効量の感染性バリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンが提供され、該ビリオンは、異種核酸および１または複数のバリアントＶＶタンパク質を含み、該バリアントＶＶタンパク質の少なくとも１つは、対応する野生型ＶＶタンパク質のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなバリアントＶＶビリオンが有する異種核酸は、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４６、ＣＤ３５、補体Ｈ因子、またはＣ４結合タンパク質などの補体活性化の調節因子のドメインをコードする。例えば、異種核酸は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤ５５タンパク質をコードする。もう一つの実施形態では、異種核酸は、免疫細胞上の第１の抗原と腫瘍細胞上の第２の抗原に結合する二重特異性ポリペプチドをコードする。そのような第１の抗原と第２の抗原の例は、上記で考察されている。一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは二重特異性ｓｃＦｖであり、第１の抗原はヒトＣＤ３ｅであり、第２の抗原はヒトＦＡＰであり、例えば、この二重特異性ｓｃＦｖは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。もう一つの実施形態では、二重特異性ポリペプチドは二重特異性ｓｃＦｖであり、第１の抗原はヒトＣＤ３ｅであり、第２の抗原はヒトＢＣＭＡであり、例えば、この二重特異性ｓｃＦｖは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。さらにもう一つの実施形態では、異種核酸は、上記で考察されるような免疫チェックポイント分子を含む融合ポリペプチドをコードする。一実施形態では、融合ポリペプチドはヒトＰＤ－１細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み、融合ポリペプチドは配列番号１０のアミノ酸配列を有する。
【0098】
一実施形態では、上記のライブラリーに由来するバリアントＶＶビリオンは、野生型ＶＶに示される耐性と比較して、中和抗体に対する耐性を示す。もう一つの実施形態では、これらのバリアントＶＶビリオンは、野生型ＶＶによる哺乳動物細胞の形質導入と比較して、抗ＶＶ中和抗体の存在下で哺乳動物細胞の形質導入の増加を示す。
【0099】
もう一つの実施形態では、上記のライブラリーに由来する有効量の組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンを使用して、遺伝子産物をそれを必要とする対象（ヒトまたは動物）に送達する方法が提供され、該遺伝子産物は、それらのバリアントＶＶビリオンが有する核酸によってコードされている。
【0100】
もう一つの実施形態では、上記ライブラリーに由来する有効量の感染性バリアント・ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）ビリオンおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物が提供される。もう一つの実施形態では、対象の癌を処置するためにそのような医薬組成物を使用する方法が提供される。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内に、または注射、吸入、注入、移植、非経口投与、経腸投与（例えば、胃腸管からの投与）によって、あるいは当技術分野で一般に公知のその他の全身投与手法によって、対象に投与することができる。一実施形態では、対象はヒトであるが、この技術は動物対象への投与および動物対象の処置にも使用することができる。
【0101】
もう一つの実施形態では、配列番号１、５または１７０と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有する組換えワクシニア・ウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質が提供される。もう一つの実施形態では、配列番号２、６、１７２または１７４のいずれかと少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有する組換えワクシニア・ウイルスＤ８Ｌタンパク質が提供される。これらの組換えＨ３ＬまたはＤ８Ｌタンパク質は、抗ＶＶ中和抗体に対するウイルス耐性を付与することがあり得る。
【0102】
一般的に説明されている本発明は、本発明の特定の側面および実施形態を説明する目的でのみ含まれていて本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
【実施例】
【0103】
実施例１
材料および方法
材料
ｐＵＣ５７－Ａｍｐ Ａ２７Ｌ、ｐＵＣ５７－Ａｍｐ Ｌ１Ｒ、ｐＵＣ５７－Ａｍｐ Ｄ８Ｌ、ｐＵＣ５７－Ａｍｐ Ｈ３Ｌ、（ＧＥＮＥＷＩＺ）。ＣＶ－１細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ－７０）。ｖＳＣ２０ワクシニア・ウイルス・ストック。ＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号２７０３８７０）。ＤＭＥＭ培地（ＧＥヘルスケア、カタログ番号ＳＨ３００８１．０１）、ＦＢＳ（ＧＥヘルスケア、カタログ番号ＳＨ３００７０．０３）、ＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号８５３７）。ドライアイス／エタノール浴、６ウェルの組織培養プレート、１２×７５ｍｍポリスチレンチューブ、１ｍｌシリンジの使い捨てスクレーパーまたはプランジャー、滅菌２ｍｌの滅菌マイクロ遠心チューブ。
細胞の調製および野生型ワクシニア・ウイルスによる感染
材料および方法
材料
ｐＵＣ５７－Ａｍｐ Ａ２７Ｌ、ｐＵＣ５７－Ａｍｐ Ｌ１Ｒ、ｐＵＣ５７－Ａｍｐ Ｄ８Ｌ、ｐＵＣ５７－Ａｍｐ Ｈ３Ｌ、（ＧＥＮＥＷＩＺ）。ＣＶ－１細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ－７０）。ｖＳＣ２０ワクシニア・ウイルス・ストック。ＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号２７０３８７０）。ＤＭＥＭ培地（ＧＥヘルスケア、カタログ番号ＳＨ３００８１．０１）、ＦＢＳ（ＧＥヘルスケア、カタログ番号ＳＨ３００７０．０３）、ＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号８５３７）。ドライアイス／エタノール浴、６ウェルの組織培養プレート、１２×７５ｍｍポリスチレンチューブ、１ｍｌシリンジの使い捨てスクレーパーまたはプランジャー、滅菌２ｍｌの滅菌マイクロ遠心チューブ。
細胞の調製および野生型ワクシニア・ウイルスによる感染
【0104】
ＣＶ－１細胞（２×１０５／ウェル）を、６ウェル組織培養プレートのウェルの完全ＤＭＥＭ培地に播種し、５０～８０％のコンフルエンシーになるまでインキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２で一晩）。親ウイルスのアリコートを解凍し、氷水中で数回超音波処理して（３０秒）、凝集塊を除去した（各超音波処理の間に氷上で冷却）。ウイルスを完全ＤＭＥＭで０．５×１０５ｐｆｕ／ｍｌに希釈した。コンフルエントな細胞の単層から培地を除去し、細胞を０．５ｍｌの希釈ワクシニア・ウイルス（０．０５ｐｆｕ／細胞）に感染させ、３７℃で２時間インキュベートした。
ｐＵＣ５７－Ａｍｐプラスミドによるトランスフェクション
ｐＵＣ５７－Ａｍｐプラスミドによるトランスフェクション
【0105】
トランスフェクトする各ウェルに、１００μｌの無血清培地を滅菌チューブに加えた。次に、３μｌのＧｅｎｅＪｕｉｃｅを無血清培地に直接滴下し、ボルテックスによって完全に混合し、室温で５分間インキュベートした。１μｇのＤＮＡを各チューブに加え、穏やかなピペッティング（ボルテックスは行わない）によって混合した後、室温で５～１５分間インキュベートした。次に、ウイルス接種物を単層の細胞から取り出し、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、０．５ｍＬの新鮮な完全ＤＭＥＭ培地を細胞に加えた。次に、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ／ＤＮＡ混合物の全量を、完全ＤＭＥＭ培地の細胞に滴下した。皿を穏やかに揺り動かして、均一に分散させた。インキュベーションの４～８時間後にトランスフェクション混合物を除去し、完全ＤＭＥＭ培地に交換した後、３７℃（５％ＣＯ２）で２４～７２時間インキュベートした。２４～７２時間後、細胞をウェルから取り出し、２ｍｌの滅菌マイクロ遠心チューブに移した。次に、ドライアイス／エタノール浴中の凍結、３７℃水浴中の解凍、およびボルテックスを各回行うことによる、３回の凍結融解サイクルを行うことによって、細胞懸濁液を溶解した。細胞ライセートは必要になるまで－８０℃で貯蔵した。
組換えウイルスプラークのスクリーニング
組換えウイルスプラークのスクリーニング
【0106】
ＣＶ１細胞（５×１０５／ウェル）を、６ウェル組織培養プレートの完全ＤＭＥＭ培地（２ｍＬ／ウェル）に播種し、９０％超のコンフルエンシーになるまでインキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２、２４時間）。１００、１０、１、または０．１μｌのライセートを、１ｍｌの完全ＤＭＥＭ培地を含む二連のウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。次に、ウイルス接種物を感染細胞から取り出した。２．５％メチルセルロースを含む完全ＤＭＥＭ培地２ｍｌを各ウェルに加え、２日間インキュベートした。２日後、十分に分離されたプラークをピペットチップでこすり、吸引することにより取り出した。蛍光顕微鏡を使用してＧＦＰ＋プラークを選択し、０．５ｍｌの完全ＤＭＥＭ培地を含むチューブに移した。各ウイルス含有チューブをボルテックスした後、ドライアイス／エタノール浴中の凍結、３７℃水浴中の解凍、およびボルテックスを各回行うことによる、３回の凍結融解サイクルを行った。
数ラウンドのＧＦＰ＋プラーク精製
数ラウンドのＧＦＰ＋プラーク精製
【0107】
６ウェル組織培養プレートのウェルで、５×１０５個のＣＶ１細胞／ウェルを完全ＤＭＥＭ培地（２ｍＬ／ウェル）に播種した。細胞を、９０％超のコンフルエンシーになるまでインキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２、２４時間）。プラーク分離株ごとに１枚の６ウェルプレートが必要である。各プラークからの１００、１０、１、または０．１μｌのライセートを、１ｍｌの完全ＤＭＥＭ培地を含む二連のウェルに加え、２時間インキュベートした。培地を細胞単層から除去し、２．５％メチルセルロースを含む完全ＤＭＥＭで覆った。上記のステップを３またはそれを超える回数繰り返してプラーク精製し、クローン的に純粋な組換えウイルスを確保した。
単一プラーク精製プロトコル
単一プラーク精製プロトコル
【0108】
約３００万～４００万のＣＶ－１細胞を播種し、２４ウェルプレートで１００％コンフルエンスまで増殖させた。濃縮されたウイルスストックを、ＤＭＥＭ感染培地で１０倍系列希釈に希釈し、各ウェルに加えた。インキュベーションの３６～７２時間後、単一のプラークを含むウェルに印を付け、ウェル全体が感染するまでインキュベーター内に保持した（初期感染から約４～５日要する）。感染細胞を回収し、ＰＣＲアッセイにより組換えを確認した。各反応のＰＣＲ条件を以下に列挙する。
実施例２
Ｈ３Ｌでの中和抗体（ＮＡｂ）エピトープの決定－ペプチドアレイ配列分析
【表1】
【表2】
Ｈ３Ｌでの中和抗体（ＮＡｂ）エピトープの決定－ペプチドアレイ配列分析
【0109】
ＮＡｂ相互作用に関与するＨ３Ｌ上の可能な領域を識別するために、全長Ｈ３Ｌを含むペプチドアレイを合成し、抗ＶＶ ＮＡｂに結合するペプチドについてスクリーニングした。アレイはＨ３ＬのＮ末端から始まってタンパク質配列の全長にまたがっており、配列に沿って１２アミノ酸を含む連続する各スポットは、Ｃ末端に向かって４アミノ酸だけシフトした。つまり、アレイ内の各スポットは８残基が前のスポットと重なっていた。次に、合成したＨ３Ｌペプチドアレイを含むセルロース膜をスクリーニングして、抗ＶＶ ポリクローナルＮＡｂ（Ａｂｃａｍ、ａｂ３５２１９）に結合したペプチドを識別した。手短に言えば、膜をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈ２Ｏで５分間３回洗浄し、５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ミルク－ＰＢＳ（ＭＰＢＳ）を用いて４℃で一晩ブロックグした。４μｇ／ｍＬのＮＡｂを、ＭＰＢＳ中の膜とともに、穏やかにかき混ぜながら室温で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加したＰＢＳ（ＰＢＳＴ）２０ｍＬで膜を５分間６回洗浄した。ペプチドに結合したＮＡｂは、この膜をＭＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌのウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）とともに、穏やかに攪拌しながら４℃で４時間インキュベートすることにより検出された。次に、膜をＰＢＳＴで５分間３回洗浄し、５ｍｌの強化化学発光（ＥＣＬ）現像液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃３２１０９）中でインキュベートした。結合が陽性のペプチドは、膜上にスポットとして現れる（図１Ｂ）。信号を視覚化し、各スポットの強度をＣＣＤカメラ（ＧＥヘルスケア、Ａｍｅｒｓｈａｍ（商標）Ｉｍａｇｅｒ ６００）で測定した。スポットの過飽和は検出されず、積分後、スポットの強度をプロットした（図１Ｃ）。１１００００以下の信号はバックグラウンドと考え（膜の分析によって決定）、１１０００００よりも高い信号を示すスポットは陽性結合を表すと考えた。２６のスポットが、カットオフ強度よりも高い値でａｂ３５２１９との結合を示した。一部の陽性の信号が非特異的結合を表す可能性を考慮して、１１０００００以上の結合強度を示した少なくとも２つのスポットに存在していた残基のみを有意とみなした。合計９個のペプチド配列が、Ａｂ結合に対して陽性であると識別された（配列は陽性結合信号をもつ複数のスポットに現れ、以下に示す下線付きの配列である）。
ペプチドアレイによって識別されたＨ３Ｌペプチドの配列（対応する残基番号付き）
【表3-1】
【表3-2】
【0110】
ＰＶＩＤＲＬＰ（ａａ １１～１８）（配列番号８９）、ＮＤＱＫＦＤＤＶＫＤＮ（ａａ ３０～４０）（配列番号９０）、ＰＥＲＫＮＶＶＶＶ（ａａ ４４～５２）（配列番号９１）、ＮＶＩＥＤＩＴＦＬＲ（ａａ １２８～１３７）（配列番号９２）、ＱＭＲＥＩ（ａａ １５２～１５６）（配列番号９３）、ＫＶＫＴＥＬＶＭ（ａａ １６１～１６８）（配列番号９４）、ＮＩＶＤＥＩＩＫ（ａａ １９７～２０４）（配列番号９５）、ＫＩＮＲＱＩ（ａａ ２２４～２２９）（配列番号９６）、ＦＥＮＭＫＰＮＦ（ａａ ２４９～２６５）（配列番号９７）。
【0111】
Ｈ３ＬのＮ末端ドメイン（ａａ １１～５２）、中央（ａａ １２８～１６８）、およびＣ末端部分（ａａ １９８～２５６）に局在するＡｂ結合部位。興味深いことに、タンパク質の最もＣ末端のドメイン（ａａ ２６０～３２４）は、Ａｂとの結合を示さなかった。Ｈ３Ｌのこの疎水性領域は翻訳後にＶＶ膜に挿入され、成熟したウイルス粒子の状況下ではＡｂ結合に利用できないのであろう。Ｎ末端ドメインは、Ｈ３Ｌと細胞表面との結合に関与している可能性が最も高いため、Ａｂとこの領域の結合は、ウイルスが細胞を感染させる能力を妨害し、この領域がＡｂ結合に関与しているというアレイの結果を裏付ける。さらに、以前の研究により、Ｈ３Ｌがグリコシルトランスフェラーゼであることが示された。一部のウイルスは、宿主の免疫応答回避を助けるために独自のグリコシルトランスフェラーゼをコードしている。Ｈ３Ｌは、中央ドメインのＤ／ＥｘＤモチーフを介してＵＤＰ－Ｇｌｃに結合し、このモチーフ（具体的には、ａａ １２５および１２７）を変異させることにより結合が阻害された。ペプチドアレイは、Ｄ／ＥｘＤモチーフ（ペプチドＮＶＩＥＤＩＴＦＬＲ、ａａ １２８～１３７（配列番号９２））の近くに可能性のあるＡｂ結合部位を示した。この領域でのＡｂの結合は、Ａｂによるウイルス中和のもう１つの考えられる機構であるＨ３Ｌのグリコシルトランスフェラーゼ活性を妨害する。
実施例３
Ｈ３ＬのＮＡｂエピトープ測定－識別されたペプチドのアラニンスキャン
実施例３
Ｈ３ＬのＮＡｂエピトープ測定－識別されたペプチドのアラニンスキャン
【0112】
ＮＡｂエピトープをさらにマッピングし、本発明者らのペプチドアレイ研究によって識別されたＨ３Ｌペプチドの主要な残基を解明するために、９個の識別されたペプチドとそれらのアラニン置換バリアントを用いて一連のＥＬＩＳＡを行った（図２）。ペプチドアレイによって識別された９個のペプチドのバリアントは、アラニン置換で合成された（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．ＮＪ、ＵＳＡ）。
【表4】
【0113】
天然ペプチド（上記で太字で示した非変異型、配列番号８９～９７）をビオチンでタグ付けした（Ｎ末端）。９６ウェルのＰｉｅｒｃｅ（商標）ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１５５０７）をＰＢＳＴですすぎ、ＭＰＢＳ（ブロッキングバッファー、１００μＬ／ウェル）中で４℃で一晩インキュベートした。ブロッキングバッファーを捨て、１００μＬのビオチン化ペプチドを２００ｎｇ／ｍｌでプレートに加え、４℃で９０分間インキュベートした。同時に、抗ＶＶウサギポリクローナルＮＡｂ（Ａｂｃａｍ、ａｂ３５２１９）をバリアントペプチドとともにインキュベートした。本発明者らは８００ｎｇ／ｍｌのＡｂを３０μＬ／ウェル使用し、それを１００μｇ／ｍｌのアラニン修飾ペプチド３０μＬ／ウェルとともに４℃で９０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄した後、５０μＬのＡｂ／アラニンペプチドミックスをプレートに結合したペプチドに加え（二連のウェル）、４℃で６０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、ＭＰＢＳに１：１０００に希釈した抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次Ａｂ（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）１００μＬ／ウェルを加えた。次に、プレートを４℃で９０分間インキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、３，３’，５，５’，－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０－１００ＭＬ）を用いて現像した。６５０ｎｍのＯＤをパーキンエルマーのマルチモードプレートリーダー（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で読み取った。それぞれの信号の強度を測定し、Ｋａｌｅｉｄｏ（商標）１．２ソフトウェアを使用してプロットした。変異ペプチドの各セットに対して、そのセットのネイティブコントロールよりも高い信号を陽性とみなした（図２）。セット３のペプチドのコントロールペプチド（ＥＫＲＮＶＶＶＶ（配列番号１６９））は、セット内の残りのペプチドよりも高い信号を示し、このセット内の他の２つのペプチドのみが０．０７を超える信号を示した。スキャンにより、Ａｂ結合に陽性の残基が合計２９個識別された：Ｉ１４、Ｄ１５、Ｒ１６、Ｋ３３、Ｆ３４、Ｄ３５、Ｋ３８、Ｎ４０、Ｅ４５、Ｖ５２、Ｅ１３１、Ｔ１３４、Ｆ１３５、Ｌ１３６、Ｒ１３７、Ｒ１５４、Ｅ１５５、Ｉ１５６、Ｋ１６１、Ｌ１６６、Ｖ１６７、Ｍ１６８、Ｉ１９８、Ｒ２２７、Ｅ２５０、Ｋ２５３、Ｐ２５４、Ｎ２５５、およびＦ２５６（図２）。ペプチドアレイは線状ペプチドを含むため、３Ｄタンパク質構造の状況において残基の生理学的確認を表していない可能性がある。全長Ｈ３Ｌタンパク質の状況において識別された各残基を分析するために、本発明者らは以前に決定されたＨ３Ｌの結晶構造にそれらをマッピングした。２つの残基（Ｎ４０およびＦ１３５）を除くすべての残基がタンパク質の表面にマッピングされているため、Ａｂｓとの相互作用に利用可能である可能性がある。Ｎ４０とＦ１３５はタンパク質の内側の折り畳みにマッピングされているため、Ａｂｓと相互作用する見込みはないであろう。さらなる残基Ｐ４４が別の実験（以下を参照）で識別されたため、これも本発明者らの設計にも含めた。最後に、アラニンスキャンにより、カットオフよりも低いがそれぞれのコントロールよりも高い信号を示した８個のさらなる残基が識別され、これらの残基もＡｂの結合に役割を果たしている可能性が示唆された：Ｋ３３、Ｆ３４、Ｄ３５、Ｋ１６１、Ｌ１６６、Ｖ１６７、およびＲ２２７（図２参照）。
【0114】
一実施形態では、変異Ｈ３Ｌタンパク質は、以下の突然変異を含む：Ｉ１４Ａ、Ｄ１５Ａ、Ｒ１６Ａ、Ｋ３３Ａ、Ｆ３４Ａ、Ｄ３５Ａ、Ｋ３８Ａ、Ｎ４０Ａ、Ｅ４５Ａ、Ｖ５２Ａ、Ｅ１３１Ａ、Ｔ１３４Ａ、Ｆ１３５Ａ、Ｌ１３６Ａ、Ｒ１３７Ａ、Ｒ１５４Ａ、Ｅ１５５Ａ、Ｉ１５６Ａ、Ｋ１６１Ａ、Ｌ１６６Ａ、Ｖ１６７Ａ、Ｍ１６８Ａ、Ｉ１９８Ａ、Ｒ２２７Ａ、Ｅ２５０Ａ、Ｋ２５３Ａ、Ｐ２５４Ａ、Ｎ２５５Ａ、およびＦ２５６Ａ。変異Ｈ３Ｌアミノ酸配列の例は、配列番号１に示される。
実施例４
修飾されたＨ３Ｌ、Ｄ８Ｌ、Ｌ１Ｒ、およびＡ２７Ｌ遺伝子をＶＶゲノムに導入するための相同組換え
実施例４
修飾されたＨ３Ｌ、Ｄ８Ｌ、Ｌ１Ｒ、およびＡ２７Ｌ遺伝子をＶＶゲノムに導入するための相同組換え
【0115】
各修飾タンパク質について、そのタンパク質のネイティブプロモーター、ＯＲＦ（変異が配置されている）、およびＶＶゲノム内の適切な遺伝子への相同組換えのための約２５０ｂｐの隣接領域を含むＤＮＡ断片をＧＥＮＥＷＩＺによって合成し、ｐＵＣ５７－Ａｍｐプラスミドにクローニングした。４つすべてのコンストラクトについて、ＶＶ ｐ７．５プロモーターの制御下にあり、ＬｏｘＰ部位に隣接する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現カセットを、右隣接配列の前の終止コドンのすぐ下流に挿入した（図３）。ＧＦＰカセットから発現した蛍光マーカーを使用して相同組換えを受けたクローンをスクリーニングし、ＬｏｘＰ部位を使用してＧＦＰを除去した。ｐＵＣ５７－ＡｍｐプラスミドをＣＶ－１細胞にトランスフェクトし、ＶＶゲノムと組換えさせた。ＧＦＰカセットから発現した蛍光マーカーを使用して相同組換え（ＨＲ）を受けたクローンをスクリーニングし、ＬｏｘＰ部位を使用してＧＦＰを除去した。ＶＶゲノムへの正しい遺伝子挿入をＰＣＲによって検証した。ＶＶに感染させたＣＶ－１細胞に、Ｌ１Ｒプラスミドから始めて、Ａ２７Ｌ、Ｄ８Ｌ、最後にＨ３Ｌの順で１つずつプラスミドをトランスフェクトした。各プラスミドの追加とともに、スクリーニングと精製のラウンドを行い、続いてＰＣＲとシーケンシングを行って、正しい変異が存在することを確認した。ＧＦＰは、次のプラスミドとの組換えの前に除去された。最終的なバリアントには、４つすべてのタンパク質の修飾が含まれている。
【0116】
合成されたＨ３Ｌコンストラクトのヌクレオチド置換により、以下のアミノ酸変異が生じる：Ｉ１４Ａ、Ｄ１５Ａ、Ｒ１６Ａ、Ｋ３８Ａ、Ｐ４４Ａ、Ｅ４５Ａ、Ｖ５２Ａ、Ｅ１３１Ａ、Ｔ１３４Ａ、Ｌ１３６Ａ、Ｒ１３７Ａ、Ｒ１５４Ａ、Ｅ１５５Ａ、Ｉ１５６Ａ、Ｍ１６８Ａ、Ｉ１９８Ａ、Ｅ２５０Ａ、Ｋ２５３Ａ、Ｐ２５４Ａ、Ｎ２５５Ａ、およびＦ２５６Ａ。変異Ｈ３Ｌアミノ酸配列は、配列番号１１に示される。左隣接領域、プロモーター領域、ｐ７．５プロモーター、ＬｏｘＰ、ＧＦＰ、ＬｏｘＰ、および右隣接領域を含む、そのような変異Ｈ３Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１２に示される。
【0117】
合成されたＤ８Ｌコンストラクトのヌクレオチド置換により、以下のアミノ酸変異が生じる：Ｒ４４Ａ、Ｋ４８Ａ、Ｋ９８Ａ、Ｋ１０８Ａ、Ｋ１１７Ａ、およびＲ２２０Ａ。変異Ｄ８Ｌアミノ酸配列は、配列番号２に示される。左隣接領域、プロモーター領域、ｐ７．５プロモーター、ＬｏｘＰ、ＧＦＰ、ＬｏｘＰ、および右隣接領域を含む、そのような変異Ｄ８Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１３に示される。
【0118】
合成されたＡ２７Ｌコンストラクトのヌクレオチド置換により、以下のアミノ酸変異が生じる：Ｋ２７Ａ、Ａ３０Ｄ、Ｒ３２Ａ、Ｅ３３Ａ、Ａ３４Ｄ、Ｉ３５Ａ、Ｖ３６Ａ、Ｋ３７Ａ、Ｄ３９Ａ、Ｅ４０Ａ、Ｒ１０７Ａ、Ｐ１０８Ａ、およびＹ１０９Ａ。変異Ａ２７Ｌアミノ酸配列は、配列番号３に示される。左隣接領域、プロモーター領域、ｐ７．５プロモーター、ＬｏｘＰ、ＧＦＰ、ＬｏｘＰ、および右隣接領域を含む、そのような変異Ａ２７Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１４に示される。
【0119】
合成されたＬ１Ｒコンストラクトのヌクレオチド置換により、以下のアミノ酸変異が生じる：Ｅ２５Ａ、Ｎ２７Ａ、Ｑ３１Ａ、Ｔ３２Ａ、Ｋ３３Ａ、Ｄ３５Ａ、Ｓ５８Ａ、Ｄ６０Ａ、Ｄ６２Ａ、Ｋ１２５Ａ、およびＫ１２７Ａ。変異Ｌ１Ｒアミノ酸配列は、配列番号４に示される。左隣接領域、プロモーター領域、ｐ７．５プロモーター、ＬｏｘＰ、ＧＦＰ、ＬｏｘＰ、および右隣接領域を含む、そのような変異Ｌ１Ｒ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１５に示される。
実施例５
抗ＶＶポリクローナル抗体を用いるインビトロ中和アッセイ
実施例５
抗ＶＶポリクローナル抗体を用いるインビトロ中和アッセイ
【0120】
抗ＶＶポリクローナルＡｂがエスケープバリアントを中和する能力を調査した。ａｂ３５２１９（Ａｂｃａｍ）、ａｂ２１０３９（Ａｂｃａｍ）、ａｂ２６８５３（Ａｂｃａｍ）、９５０３－２０５７（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、およびＰＡ１－７２５８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる抗ＶＶ Ａｂのパネルを使用してインビトロでの中和回避を試験した。ウサギポリクローナルＩｇＧ ａｂ３７４１５（Ａｂｃａｍ）をコントロールとして使用した。ＣＶ－１細胞を１２ウェルプレートに播種し、コンフルエンスに達してから２日以内に使用した。４０μｇ／ｍｌのＡｂを、１×１０３ｐｆｕ／サンプルのエスケープバリアントまたはコントロールＶＶのいずれかとともに、２％の滅菌子ウサギ補体の存在下、３７℃で１時間プレインキュベートした。次に、混合物をＣＶ－１細胞に加え、３００μＬの無血清培地中３７℃／５％ＣＯ２で２時間置いて付着させた。２時間後、接種物を取り出し、１ｍＬの完全ＤＭＥＭ培地を細胞に添加した。次に、細胞を３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。４８時間後、細胞を固定し、１％クリスタルバイオレット／２０％ＥｔＯＨ溶液で室温で２０分間染色し、プラークを計数した。５つすべてのＡｂがコントロールＶＶプラーク数を劇的に減少させ、強い中和能力を示した（図５）。パネル全体で平均８３．３～９５．５％のコントロールＶＶウイルスが中和された。対照的に、Ｌ１Ｒ＋Ａ２７Ｌ＋Ｄ８Ｌ＋Ｈ３エスケープバリアントは、Ａｂによる中和率が大幅に低く、平均１７．８～６６．２％の中和率を示した。興味深いことに、ａｂ２６８５３はコントロールＶＶの７８％を中和したが、ＮＥＶバリアントをほぼ完全に中和できなかった（図５参照）。これらの結果に基づいて、本明細書に示されるエスケープバリアントは、インビトロでの抗ＶＶ Ａｂによる中和を効率的に回避することができると結論付けられる。
【0121】
組換えウイルス複製アッセイを実行した（図７）。２４ウェルプレートで、ＣＶ－１細胞を二連のＶＶコントロール、ＶＶＮＥＶ、およびＶＶＥＭにＭＯＩ＝．０５で感染させた。感染前に、ウイルスをＡｂ９５０３－２０５７（４０μｇ／ｍＬ）とともに３７℃で１時間プレインキュベートした。サンプルを２４、４８、および７２時間後に回収し、各時点の力価を決定した。ほぼ完全に不活化されていたコントロールＡｂと比較して、組換えウイルスはＡｂの存在下での複製において有意に効率的であった。
【0122】
組換えウイルスの抗腫瘍効率を評価した（図８）。組換えウイルスおよびコントロールＶＶを、Ａｂ９５０３－２０５７（上記参照）とともにプレインキュベートし、ＭＯＩ＝１で形質転換細胞を感染させるために使用した。細胞を４８時間インキュベートし、ＭＴＳアッセイ（細胞の代謝活性の比色評価）により細胞の生存率を測定した。手短に言えば、４８時間で回収した細胞をＰＢＳＴで１回洗浄し、完全ＤＭＥＭに１×１０５細胞／ｍＬで再懸濁した。各細胞の懸濁液１００μＬを９６ウェルに添加した（３通り）。２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ３５８Ｃ）を、１００μｌの培地にサンプルを含む９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに添加した。このプレートを３７℃で２時間インキュベートした（５％ＣＯ２）。ＭＴＳの細胞還元によって生成された可溶性ホルマザンの量を測定するために、９６ウェルプレートリーダーを使用して各ウェルの吸光度を４９０ｎｍで記録したＡｂの存在下で、組換えウイルスは細胞を効率的に死滅させることができた。
実施例６
中和エスケープ変異株（ＶＶＥＭ）の分離
実施例６
中和エスケープ変異株（ＶＶＥＭ）の分離
【0123】
さらなる主要なＮＡｂエピトープ残基を識別するために、ａｂ３５２１９およびａｂ２１０３９による中和に抵抗するＶＶ変異株を選択した。手短に言えば、ウイルスＤＮＡに塩基転位型突然変異を誘発するために、変異ＶＶのストックは、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）の存在下でＶＶのウエスタン・リザーブ株を感染させたＣＶ－１細胞から調製した。次に、ポリクローナル抗ＶＶ ａｂ３５２１９およびａｂ２１０３９を使用して変異したウイルスを中和した。ＥＭＳは培地に５００μμｇ／ｍＬで存在していた。変異ウイルスストックを、２種類のポリクローナルＡｂの混合物と各５０μｇ／ｍｌ（総濃度１００μｇ／ｍｌ）で１時間インキュベートした後、１２ウェルプレートに蒔いたＣＶ－１細胞を感染させるために使用した。２時間後、接種物を取り出し、新鮮な完全ＤＭＥＭを細胞に加えた。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。感染の第１ラウンドの間に、変異ウイルスの力価はＡｂによって大幅に低下した。一定のＡｂ濃度で、前のラウンドよりもさらに精製されたウイルスによる複数ラウンドの感染後、継代されたウイルスストックは、もはやＡｂｓによってほとんど中和されなかった。エスケープ変異株（ＶＶＥＭ）のクローンをプラーク精製すると、上記の５つの抗ＶＶ Ａｂのパネルによる中和の有意な回避が示された（図６）。コントロールＶＶウイルスはパネル全体で７７．７～９６．４％が中和されたのに対し、ＶＶＥＭは、平均３０．７～６６．９％のＡｂによる中和を示し、コントロールよりも大幅に低いことが示された。純粋なウイルスからウイルスＤＮＡを分離し、ＰＣＲを使用してＶＶの主要なＡｂ抗原であるＡ２７Ｌ、Ｌ１Ｒ、Ｈ３Ｌ、およびＤ８Ｌ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物を配列決定し、Ａ２７Ｌ、Ｄ８Ｌ、およびＨ３Ｌをコードする遺伝子に変異が存在することが示された。Ｄ８Ｌコード配列は、以下の変異を含む：Ｖ４３Ｆ／Ｌ、Ｒ４４Ｗ、Ｇ５５Ｗ、Ａ１４４Ｔ、Ｔ１６８Ｓ、Ｓ１７７Ｙ、Ｆ１９９Ｙ、Ｌ２０３Ｓ、Ｐ２１２Ｔ、Ｎ２１８Ｃ、Ｐ２２２Ｌ、およびＤ２２７Ｇ。Ａ２７Ｌコード配列は、Ａ２７ＬとのＮＡｂ相互作用に関与すると以前に決定され、本発明者らのＡ２７Ｌプラスミド設計に含められていた、残基Ｉ３５およびＤ３９に２つの変異を示した。Ｈ３Ｌ配列は、Ａｂ結合ペプチド（ペプチド３；図２Ａ）の一部としてペプチドアレイによって識別されたＥ４５残基に直接隣接する残基である残基Ｐ４４でアミノ酸置換を示したため、これもＨ３Ｌ組換えプラスミドの設計に含められた。Ｈ３遺伝子において識別されたその他の変異は以下の通りである：Ｅ２５０Ｇ、Ｎ２５５Ｗ（これら２つの残基はアラニンスキャンによっても識別された）、Ｓ２５８Ｆ、Ｔ２６２Ｐ、Ａ２６４Ｔ、Ｔ２６５Ｖ、Ｋ２６６Ｉ、Ｙ２６８Ｃ、Ｍ２７２Ｋ、Ｙ２７３Ｎ、Ｆ２７５Ｎ、およびＴ２７７Ａ。これらの変異はすべて、タンパク質の柔軟なＣ末端領域に集まっている。配列番号５は、変異Ｈ３Ｌアミノ酸配列を示す。配列番号６または配列番号１７４は、変異Ｄ８Ｌアミノ酸配列を示す。配列番号６と１７４の両方は、親出願である米国特許仮出願第６２／７４９，１０２号に配列番号７として開示された。
実施例７
修飾されたＨ３Ｌ、Ｄ８Ｌ、Ｌ１Ｒ、およびＡ２７Ｌ遺伝子をＶＶゲノムに導入するための相同組換え
実施例７
修飾されたＨ３Ｌ、Ｄ８Ｌ、Ｌ１Ｒ、およびＡ２７Ｌ遺伝子をＶＶゲノムに導入するための相同組換え
【0124】
上記のように識別された変異を組み込むための新しい組換えＶＶを作製した。さらに、タンパク質の構造解析により、ペプチドアレイまたはＥＭシーケンシングのいずれによっても識別されなかったが、識別された残基に隣接しており、Ａｂの相互作用に役割を果たす可能性のある追加の残基も識別された。これらの残基も設計に含められた。各修飾タンパク質について、そのタンパク質のネイティブプロモーター、ＯＲＦ（変異が配置されている）、およびＶＶゲノム内の適切な遺伝子への相同組換えのための約２５０ｂｐの隣接領域を含むＤＮＡ断片をＧＥＮＥＷＩＺによって合成し、ｐＵＣ５７－Ａｍｐプラスミドにクローニングした。４つすべてのコンストラクトについて、ＶＶ ｐ７．５プロモーターの制御下にあり、ＬｏｘＰ部位に隣接する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現カセットを、右隣接配列の前の終止コドンのすぐ下流に挿入した（図３）。ＧＦＰカセットから発現した蛍光マーカーを使用して相同組換えを受けたクローンをスクリーニングし、ＬｏｘＰ部位を使用してＧＦＰを除去した。ｐＵＣ５７－ＡｍｐプラスミドをＣＶ－１細胞にトランスフェクトし、ＶＶゲノムと組換えさせた。ＧＦＰカセットから発現した蛍光マーカーを使用して相同組換え（ＨＲ）を受けたクローンをスクリーニングし、ＬｏｘＰ部位を使用してＧＦＰを除去した。ＶＶゲノムへの正しい遺伝子挿入をＰＣＲによって検証した。ＶＶに感染させたＣＶ－１細胞に、Ｌ１Ｒプラスミドから始めて、Ａ２７Ｌ、Ｄ８Ｌ、最後にＨ３Ｌの順で１つずつプラスミドをトランスフェクトした。各プラスミドの追加とともに、スクリーニングと精製のラウンドを行い、続いてＰＣＲとシーケンシングを行って、正しい変異が存在することを確認した。ＧＦＰは、次のプラスミドとの組換えの前に除去された。最終的なバリアントには、４つすべてのタンパク質の修飾が含まれている。
【0125】
合成されたＨ３Ｌコンストラクトのヌクレオチド置換により、以下のアミノ酸変異が生じる：Ｉ１４Ａ、Ｄ１５Ａ、Ｒ１６Ａ、Ｋ３３Ａ、Ｆ３４Ａ、Ｄ３５Ａ、Ｋ３８Ａ、Ｎ４０Ａ、Ｐ４４Ａ、Ｅ４５Ａ、Ｖ５２Ａ、Ｅ１３１Ａ、Ｄ１３２Ａ、Ｔ１３４Ａ、Ｆ１３５Ａ、Ｌ１３６Ａ、Ｒ１３７Ａ、Ｒ１５４Ａ、Ｅ１５５Ａ、Ｉ１５６Ａ、Ｋ１６１Ａ、Ｌ１６６Ａ、Ｖ１６７Ａ、Ｍ１６８Ａ、Ｅ１９５Ａ、Ｉ１９８Ａ、Ｖ１９９Ａ、Ｒ２２７Ａ、Ｅ２５０Ａ、Ｎ２５１Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｋ２５３Ａ、Ｐ２５４Ａ、Ｎ２５５Ａ、Ｆ２５６Ａ、Ｓ２５８Ａ、Ｔ２６２Ｐ、Ａ２６４Ｔ、Ｋ２６６Ｉ、Ｙ２６８Ｃ、Ｍ２７２Ｋ、Ｙ２７３Ｎ、Ｆ２７５Ｎ、およびＴ２７７Ａ。変異Ｈ３Ｌアミノ酸配列は、配列番号１７０に示される。左隣接領域、プロモーター領域、ｐ７．５プロモーター、ＬｏｘＰ、ＧＦＰ、ＬｏｘＰ、および右隣接領域を含む、そのような変異Ｈ３Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１７１に示される。
【0126】
合成されたＤ８Ｌコンストラクトのヌクレオチド置換により、以下のアミノ酸変異が生じる：Ｖ４３Ａ、Ｒ４４Ａ、Ｋ４８Ａ、Ｓ５３Ａ、Ｇ５４Ａ、Ｇ５５Ａ、Ｋ９８Ａ、Ｋ１０８Ａ、Ｋ１０９Ａ、Ａ１４４Ｇ、Ｔ１６８Ａ、Ｓ１７７Ａ、Ｌ１９６Ａ、Ｆ１９９Ａ、Ｌ２０３Ａ、Ｎ２０７Ａ、Ｐ２１２Ａ、Ｎ２１８Ａ、Ｒ２２０Ａ、Ｐ２２２Ａ、およびＤ２２７Ａ。変異Ｄ８Ｌアミノ酸配列は、配列番号１７２に示される。左隣接領域、プロモーター領域、ｐ７．５プロモーター、ＬｏｘＰ、ＧＦＰ、ＬｏｘＰ、および右隣接領域を含む、そのような変異Ｄ８Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１７３に示される。
【0127】
合成されたＡ２７Ｌコンストラクトのヌクレオチド置換により、以下のアミノ酸変異が生じる：Ｋ２７Ａ、Ａ３０Ｄ、Ｒ３２Ａ、Ｅ３３Ａ、Ａ３４Ｄ、Ｉ３５Ａ、Ｖ３６Ａ、Ｋ３７Ａ、Ｄ３９Ａ、Ｅ４０Ａ、Ｒ１０７Ａ、Ｐ１０８Ａ、およびＹ１０９Ａ。変異Ａ２７Ｌアミノ酸配列は、配列番号３に示される。左隣接領域、プロモーター領域、ｐ７．５プロモーター、ＬｏｘＰ、ＧＦＰ、ＬｏｘＰ、および右隣接領域を含む、そのような変異Ａ２７Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１４に示される。
【0128】
合成されたＬ１Ｒコンストラクトのヌクレオチド置換により、以下のアミノ酸変異が生じる：Ｅ２５Ａ、Ｎ２７Ａ、Ｑ３１Ａ、Ｔ３２Ａ、Ｋ３３Ａ、Ｄ３５Ａ、Ｓ５８Ａ、Ｄ６０Ａ、Ｄ６２Ａ、Ｋ１２５Ａ、およびＫ１２７Ａ。変異Ｌ１Ｒアミノ酸配列は、配列番号４に示される。左隣接領域、プロモーター領域、ｐ７．５プロモーター、ＬｏｘＰ、ＧＦＰ、ＬｏｘＰ、および右隣接領域を含む、そのような変異Ｌ１Ｒ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１５に示される。
実施例８
抗ＶＶポリクローナル抗体を用いるインビトロ中和アッセイ
実施例８
抗ＶＶポリクローナル抗体を用いるインビトロ中和アッセイ
【0129】
抗ＶＶポリクローナルＡｂがエスケープバリアントを中和する能力を調査した。抗ＶＶ Ａｂ９５０３－２０５７（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびＰＡ１－７２５８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、インビトロでの中和回避を試験した。ウサギポリクローナルＩｇＧ ａｂ３７４１５（Ａｂｃａｍ）をコントロールとして使用した。ＣＶ－１細胞を１２ウェルプレートに播種し、コンフルエンスに達してから２日以内に使用した。４０μｇ／ｍｌのＡｂを、１×１０３ｐｆｕ／サンプルのエスケープバリアントまたはコントロールＶＶのいずれかとともに、２％の滅菌子ウサギ補体の存在下、３７℃で１時間プレインキュベートした。次に、混合物をＣＶ－１細胞に加え、３００μＬの無血清培地中３７℃／５％ＣＯ２で２時間置いて付着させた。２時間後、接種物を取り出し、１ｍＬの完全ＤＭＥＭ培地を細胞に添加した。次に、細胞を３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。４８時間後、細胞を固定し、１％クリスタルバイオレット／２０％ＥｔＯＨ溶液で室温で２０分間染色し、プラークを計数した。ＮＡｂがコントロールＶＶプラーク数を劇的に減少させ、強い中和能力を示した（図９）。パネル全体で平均８６．１～９２．１％のコントロールＶＶウイルスが中和された。対照的に、エスケープバリアントは、Ａｂによる中和率が大幅に低く、平均２０．８～２３％の中和率を示した。これらの結果に基づいて、本明細書に示されるエスケープバリアントは、インビトロでの抗ＶＶ Ａｂによる中和を効率的に回避することができると結論付けられる。また、エスケープバリアント（３つの単一ウイルスクローン）と野生型ＶＶの複製を中和抗体の不在下で比較した。その結果、エスケープバリアントが野生型ウイルスと比較して同様の複製能力を持っていることが示唆され、突然変異がウイルスの侵入および複製能力を損わないことが示された（図１０）。
実施例９
ＣＤ５５を発現するＶＶの構築
実施例９
ＣＤ５５を発現するＶＶの構築
【0130】
腫瘍溶解性ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）コンストラクトである、ＣＤ５５－ＮＥＶは、ヒトＣＤ５５細胞外ドメインに対して作製された。ＶＶ Ａ２７に融合したヒトＣＤ５５細胞外ドメインを最適化し、合成し、ｐＭＳシャトルプラスミドにクローニングした（図１１）。ＣＤ５５－Ａ２７を発現するワクシニア・ウイルス（ウエスタン・リザーブ）は、あるバージョンのｐＭＳシャトルプラスミドをＷＲワクシニア・ウイルス（ＷＲ ＶＶ）またはＮＥＶのＴＫ遺伝子に組換えることによって作製された。挿入されたＣＤ５５およびＡ２７は、元のＡ２７プロモーターの転写制御下で発現した。組換えウイルスＣＤ５５－ＮＥＶを構築するために、シャトルベクターｐＭＳをＣＶ－１または２９３細胞にトランスフェクトした。次に、細胞をＷＲ ＶＶまたはＮＥＶに０．１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。プラークの選択および増幅を３ラウンド行ってＣＤ５５の発現を確認した後、対応するクローンの１つを増幅および精製のために選択した。
【0131】
一実施形態では、ＣＤ５５－Ａ２７融合体を含むアミノ酸配列は、配列番号７に示される。シグナルペプチド、ＣＤ５５、Ａ２７およびリンカー配列を含む、ＣＤ５５－Ａ２７の最適化されたヌクレオチド配列の例は、配列番号１６に示される。
実施例１０
補体または補体／抗ＶＶポリクローナル抗体を用いるインビトロ中和アッセイ
実施例１０
補体または補体／抗ＶＶポリクローナル抗体を用いるインビトロ中和アッセイ
【0132】
ＣＤ５５－ＶＶの補体に媒介される中和を回避する能力を最初に調査した。これを行うため、ＣＶ－１細胞を１２ウェルプレートに播種し、コンフルエンスに達してから２日以内に使用した。１×１０３ｐｆｕ／サンプルのＣＤ５５－ＮＥＶまたはＮＥＶコントロールを、１：１０ヒト補体の存在下、３７℃／５％ＣＯ２で３００μＬの培地中のＣＶ－１細胞に加えた。熱活性化された補体をコントロールとして使用して、回避率を計算した。４８時間後、細胞を固定し、１％クリスタルバイオレット／２０％ＥｔＯＨ溶液で室温で２０分間染色し、プラークを計数した。ＣＤ５５－ＮＥＶは、ＮＥＶよりも効果的に補体に媒介される中和を回避した（図１２）。ＣＤ５５－ＮＥＶの約５９％が補体に媒介される中和を回避したのに対し、ＮＥＶの約１８％のみが補体に媒介される中和を回避した。
【0133】
補体の中和を回避するＣＤ５５－ＮＥＶの能力を抗ＶＶポリクローナルＡｂを用いてさらに調査した。２つの抗ＶＶ Ａｂ、９５０３－２０５７（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびＰＡ１－７２５８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、インビトロでの中和回避を試験した。ＣＶ－１細胞を１２ウェルプレートに播種し、コンフルエンスに達してから２日以内に使用した。４０μｇ／ｍｌのＡｂを、１×１０３ｐｆｕ／サンプルのＣＤ５５－ＮＥＶまたはコントロールＶＶのいずれかとともに、１：１０希釈のヒト補体の存在下、３７℃で１時間プレインキュベートした。次に、混合物をＣＶ－１細胞に加え、３００μＬの無血清培地中３７℃／５％ＣＯ２で２時間置いて付着させた。２時間後、接種物を取り出し、１ｍＬの完全ＤＭＥＭ培地を細胞に添加した。次に、細胞を３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。４８時間後、細胞を固定し、１％クリスタルバイオレット／２０％ＥｔＯＨ溶液で室温で２０分間染色し、プラークを計数した。結果は、補体の不在下または存在下で、ＣＤ５５－ＮＥＶがＮＥＶおよびＶＶよりも効果的に中和を回避したことを示唆した（図１３）。これらの結果に基づいて、本明細書に開示されるＣＤ５５－ＶＶは、インビトロでの補体／ＮＡｂに媒介される中和を効率的に回避することができると結論付けられる。
実施例１１
ＦＡＰ－ＴＥＡ－ＮＥＶの構築
実施例１１
ＦＡＰ－ＴＥＡ－ＮＥＶの構築
【0134】
腫瘍溶解性ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）コンストラクトである、ＦＡＰ－ＴＥＡ－ＮＥＶは、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）上のＦＡＰおよびＴ細胞上のＣＤ３を標的とする二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ３ ｓｃＦｖを発現するように作製された。二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ３ ｓｃＦｖを最適化し、合成し、ｐＭＳシャトルプラスミドにクローニングした（図１４）。ｍｈＦＡＰ交差反応性一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ ＭＯ３６）は、以前、免疫化されたＦＡＰ／ノックアウトマウスからファージディスプレイによって作製されたものである。ヒトＣＤ３ ｓｃＦｖはＯＫＴ３クローンに由来するものであった。分泌性二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ３ ｓｃＦｖ（ＦＡＰ－ＴＥＡ－ＮＥＶ）を発現するワクシニア・ウイルス（ウエスタン・リザーブ株）は、あるバージョンのｐＭＳシャトルプラスミドをＷＲ ＶＶまたはＮＥＶのＴＫ遺伝子に組換えることによって作製された。挿入された二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ３ ｓｃＦｖは、Ｆ１７Ｒ後期プロモーターの転写制御下で発現し、Ｔ細胞の活性化前に十分なウイルス複製を可能にした。組換えウイルスＢＣＭＡ－ＴＥＡ－ＮＥＶを構築するために、シャトルベクターｐＭＳをＣＶ－１または２９３細胞にトランスフェクトした。次に、細胞をＷＲ ＶＶまたはＮＥＶに０．１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。プラークの選択および増幅を３ラウンド行ってＦＡＰ－ＣＤ３の発現を確認した後、対応するクローンの１つを増幅および精製のために選択した。
【0135】
一実施形態では、ＦＡＰ－ＣＤ３ポリペプチドを含むアミノ酸配列は、配列番号８に示される。シグナルペプチド、ＦＡＰ ｓｃＦｖ、ＣＤ３ ｓｃＦｖおよびリンカー配列を含む、ＦＡＰ－ＣＤ３ポリペプチドのために最適化されたヌクレオチド配列の例は、配列番号１７に示される。
実施例１２
インビトロでのＦＡＰ－ＴＥＡ－ＮＥＶの評価
実施例１２
インビトロでのＦＡＰ－ＴＥＡ－ＮＥＶの評価
【0136】
ＦＡＰ－ＴＥＡ－ＮＥＶの腫瘍溶解能力を調査した。ＦＡＰ陽性Ｕ８７腫瘍細胞を９６ウェルプレートにウェルあたり５ｘ１０ｅ４の細胞数で播種した。次に、Ｕ８７腫瘍細胞をＦＡＰ－ＴＥＡ－ＮＥＶまたはＮＥＶにＭＯＩ１で感染させ、ヒトＴ細胞とＵ８７：Ｔ＝１：５の比で共培養した。４８時間後、細胞を顕微鏡で観察した。顕微鏡写真により、ＦＡＰ－ＴＥＡ－ＶＶが、ＮＥＶと比較して、Ｕ８７腫瘍細胞溶解およびヒトＴ細胞の増殖を効果的に誘導することが示された（図１５）。細胞をアポトーシスマーカー、ＰＩで染色し、フロー分析の結果、ＦＡＰ－ＴＥＡ－ＶＶがＮＥＶよりも効果的にＵ８７腫瘍アポトーシスを誘発することが示唆された（図１６）。図１７は、ゲートされたＵ８７腫瘍細胞のＰＩ染色のＭＦＩを示した。
【0137】
ＦＡＰ－ＴＥＡ－ＮＥＶがバイスタンダー腫瘍溶解を誘発する能力も調査した。ＣＶ－１細胞をＦＡＰ－ＴＥＡ－ＶＶにＭＯＩ１で感染させ、細胞培養培地を２４時間で回収し、Ｕ８７：Ｔ＝１：５の比のＦＡＰ陽性Ｕ８７腫瘍細胞とヒトＴ細胞の共培養に加えた。Ｕ８７腫瘍細胞を９６ウェルプレートにウェルあたり５ｘ１０ｅ４の細胞数で播種した。４８時間後、細胞を顕微鏡で観察した。顕微鏡写真により、ＦＡＰ－ＴＥＡ－ＶＶが、ＮＥＶと比較して、Ｕ８７腫瘍細胞溶解およびヒトＴ細胞の増殖を効果的に誘導することが示された（図１８）。
実施例１３
ＢＣＭＡ－ＴＥＡ－ＮＥＶの構築
実施例１３
ＢＣＭＡ－ＴＥＡ－ＮＥＶの構築
【0138】
腫瘍溶解性ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）コンストラクトである、ＢＣＭＡ－ＴＥＡ－ＮＥＶは、多発性骨髄腫上のＢＣＭＡとＴ細胞上のＣＤ３を標的とする二重特異性ＢＣＭＡ－ＣＤ３ ｓｃＦｖを発現するように作製された。二重特異性ＢＣＭＡ－ＣＤ３ ｓｃＦｖを最適化し、合成し、ｐＭＳシャトルプラスミドにクローニングした（図１９）。ＢＣＭＡ ｓｃＦＶは、Ｃ１１Ｄ５．３クローンに由来するものであった（米国特許第９０３４３２４（Ｂ２）号）。ヒトＣＤ３ ｓｃＦｖはＯＫＴ３クローンに由来するものであった。分泌性二重特異性ＢＣＭＡ－ＣＤ３ ｓｃＦｖ（ＢＣＭＡ－ＴＥＡ－ＮＥＶ）を発現するワクシニア・ウイルス（ウエスタン・リザーブ株）は、あるバージョンのｐＭＳシャトルプラスミドをＷＲワクシニア・ウイルス（ＷＲ ＶＶ）またはＮＥＶのＴＫ遺伝子に組換えることによって作製された。挿入された二重特異性ＢＣＭＡ－ＣＤ３ ｓｃＦｖは、Ｆ１７Ｒ後期プロモーターの転写制御下で発現し、Ｔ細胞の活性化前に十分なウイルス複製を可能にした。組換えウイルスＢＣＭＡ－ＴＥＡ－ＮＥＶを構築するために、シャトルベクターｐＭＳをＣＶ－１または２９３細胞にトランスフェクトした。次に、細胞をＷＲ ＶＶまたはＮＥＶに０．１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。プラークの選択および増幅を３ラウンド行ってＢＣＭＡ－ＣＤ３の発現を確認した後、対応するクローンの１つを増幅および精製のために選択した。
【0139】
一実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むアミノ酸配列は、配列番号９に示される。シグナルペプチド、ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、ＣＤ３ ｓｃＦｖおよびリンカー配列を含む、ＢＣＭＡ－ＣＤ３ ｓｃＦｖのために最適化されたヌクレオチド配列の例は、配列番号１８に示される。
実施例１４
インビトロでのＢＣＭＡ－ＴＥＡ－ＮＥＶの評価
実施例１４
インビトロでのＢＣＭＡ－ＴＥＡ－ＮＥＶの評価
【0140】
ＢＣＭＡ陽性ＲＰＭＩ－８２２６ＭＭ細胞株を、ＢＣＭＡ－ＴＥＡ－ＮＥＶまたはコントロールＮＥＶにＭＯＩ２で感染させた。２４時間後、ウイルスを感染させたＲＰＭＩ－８２２６細胞を、ジャーカットＴ細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）とともにジャーカットＴ：ＲＰＭＩ－８２２６＝２：１の比で共培養した。２４時間のインキュベーションの後、細胞数の計数および細胞集団のフロー分析のために細胞を収集した。細胞集団のフロー分析により、ジャーカットＴ細胞がＢＣＭＡ－ＣＤ３によって有意に活性化されたことが示唆された（図２０Ａ）。図２０Ｂは、ＲＰＭＩ－８２６６ＭＭ細胞および活性化ジャーカットＴ細胞の細胞数を示す。結果は、ＢＣＭＡ－ＴＥＡ－ＮＥＶが、ＮＥＶコントロールと比較して、ジャーカットＴ細胞の活性およびＲＰＭＩ－８２６６ＭＭ細胞溶解を有意に誘導したことを示唆した。
【0141】
上記の実験では、２４時間のインキュベーションの後、ＥＬＩＳＡによるサイトカインＩＦＮγ（図２１Ａ）およびＩＬ２（図２１Ｂ）分泌の測定のために細胞を収集した。結果は、ＢＣＭＡ－ＴＥＡ－ＮＥＶが、ＮＥＶコントロールと比較して、ジャーカットＴ細胞によるＩＦＮγおよびＩＬ２の発現を有意に誘発することを示唆した。
実施例１５
ＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ－ＮＥＶの構築
実施例１５
ＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ－ＮＥＶの構築
【0142】
腫瘍溶解性ワクシニア・ウイルス（ＶＶ）コンストラクトである、ＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ－ＮＥＶは、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）－Ｇ１（ＩｇＧ１）の定常（Ｆｃ）ドメインに融合したＰＤ－１の細胞外ドメインを有する組換えタンパク質を発現させるために作製された。ＦＡＰ－ＣＤ３は、癌関連線維芽細胞の線維芽細胞活性化タンパク質とＴ細胞のＣＤ３を標的とする二重特異性分子である。ＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃを最適化し、合成し、ｐＭＳシャトルプラスミドにクローニングした（図２２）。分泌性ＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ（ＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ－ＮＥＶ）を発現するか、または分泌性ＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－ＦｃとＦＡＰ－ＣＤ３（ＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ－ＦＡＰ－ＴＥＡ－ＮＥＶ）を共発現するワクシニア・ウイルス（ウエスタン・リザーブ株）は、あるバージョンのｐＭＳシャトルプラスミドをＷＲワクシニア・ウイルス（ＷＲ ＶＶ）またはＮＥＶのＴＫ遺伝子に組換えることによって作製された。挿入されたＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ７は、ｐＳＥ／Ｌプロモーターの転写制御下で発現した。挿入されたＦＡＰ－ＣＤ３は、Ｆ１７Ｒ後期プロモーターの転写制御下で発現し、Ｔ細胞の活性化前に十分なウイルス複製を可能にした。組換えウイルスＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ－ＮＥＶまたはＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ－ＦＡＰ－ＴＥＡ－ＮＥＶを構築するために、シャトルベクターｐＭＳをＣＶ－１または２９３細胞にトランスフェクトした。次に、細胞をＷＲ ＶＶまたはＮＥＶに０．１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。プラークの選択および増幅を３ラウンド行ってＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－ＦｃまたはＦＡＰ－ＣＤ３の発現を確認した後、対応するクローンの１つを増幅および精製のために選択した。
【0143】
一実施形態では、ＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃを含むアミノ酸配列は、配列番号１０に示される。シグナルペプチド、ＰＤ－１ 細胞外ドメイン、ヒトＩｇＧ１ヒンジおよびＦｃドメインを含む、ＰＤ－１－ＥＤ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃの最適化されたヌクレオチド配列の例は、配列番号１９に示される。
実施例１６
インビトロでのＰＤ１ＥＤ－ＮＥＶの評価
実施例１６
インビトロでのＰＤ１ＥＤ－ＮＥＶの評価
【0144】
安定したＰＤ－Ｌ１－Ｒａｊｉ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）細胞株を、ＰＤ１ＥＤ－ＮＥＶまたはコントロールＮＥＶにＭＯＩ２で感染させた。２４時間後、ウイルスを感染させたＰＤ－Ｌ１－Ｒａｊｉ細胞を、ＮＦＡＴ－ＣＤ１６－ＬｕｃレポータージャーカットＴ細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）とともにジャーカットＴ：ＰＤ－Ｌ１－Ｒａｊｉ＝２：１の比で共培養した。分泌されたＰＤ－１－ＥＤ－Ｆｃの役割を調べるために、ＣＶ－１細胞をＢＣＭＡ－ＴＥＡ－ＮＥＶにＭＯＩ２で感染させ、２４時間後に細胞培養培地を回収し、ＲａｊｉとジャーカットＴ細胞の共培養に加えた。２４時間のインキュベーションの後、フロー分析（図２３Ａ）および計数（図２３Ｂ）のために細胞を収集した。結果により、分泌されたＰＤ－１－ＥＤ－Ｆｃがコントロール群と比較してＲａｊｉ細胞溶解を効果的に誘発したことが示唆された。ＰＤ－１－ＥＤ－Ｆｃは、著しいジャーカットＴ細胞の枯渇も誘発した（図１９Ｂ）。ＲａｊｉはＶＶ感染の影響を受けにくいため、ＲａｊｉのＮＥＶ感染は効果がない可能性がある。上記の実験では、２４時間のインキュベーションの後、ＥＬＩＳＡによるサイトカインＩＦＮγ（図２４Ａ）およびＩＬ２（図２４Ｂ）分泌の測定のために細胞を収集した。結果は、分泌されたＰＤ１ＥＤが、ＮＥＶコントロールと比較して、ジャーカットＴ細胞によるＩＦＮγおよびＩＬ２の発現を有意に誘発することを示唆した。
【0145】
別の実験では、安定したＰＤ－Ｌ１－Ｒａｊｉ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）細胞株を、ＰＤ１ＥＤ－ＮＥＶまたはコントロールＮＥＶにＭＯＩ２で感染させた。２４時間後、ウイルスを感染させたＰＤ－Ｌ１－Ｒａｊｉ細胞を、ＮＦＡＴ－ＣＤ１６－ＬｕｃレポータージャーカットＴ細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）とともにジャーカットＴ：ＰＤ－Ｌ１－Ｒａｊｉ＝２：１の比で共培養した。分泌されたＰＤ－１－ＥＤ－Ｆｃの役割を調べるために、ＣＶ－１細胞をＢＣＭＡ－ＴＥＡ－ＮＥＶにＭＯＩ２で感染させ、２４時間後に細胞培養培地を回収し、ＲａｊｉとジャーカットＴ細胞の共培養に加えた。６時間のインキュベーションの後、ルシフェラーゼ測定のために上清を回収した（図２５）。結果により、分泌されたＰＤ－１－ＥＤ－ＦｃがコントロールＮＥＶまたは培地と比較してジャーカットＴ細胞を効果的に活性化したことが示唆された。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図21A】
【図21B】
【図22】
【図23A】
【図23B】
【図24A】
【図24B】
【図25】
【配列表】
【国際調査報告】