▶ クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフトの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-20
(54)【発明の名称】抗ＰＴＫ７免疫細胞癌療法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20220113BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220113BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220113BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220113BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220113BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20220113BHJP
C12N 15/90 20060101ALI20220113BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220113BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220113BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220113BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220113BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783 ZNA
C12N5/10
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/62 Z
C12N15/09 100
C12N15/09 110
C12N15/90 Z
A61K35/17 Z
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 E
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021523752
(86)(22)【出願日】2019-11-07
(85)【翻訳文提出日】2021-06-21
(86)【国際出願番号】 IB2019059585
(87)【国際公開番号】W WO2020095248
(87)【国際公開日】2020-05-14
(31)【優先権主張番号】62/756,638
(32)【優先日】2018-11-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/910,586
(32)【優先日】2019-10-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518370079
【氏名又は名称】クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100166165
【弁理士】
【氏名又は名称】津田 英直
(72)【発明者】
【氏名】ジョナサン アレクサンダー テレット
(72)【発明者】
【氏名】ジェイソン サガート
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085BB01
4C085CC03
4C085DD62
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
(57)【要約】
本明細書で提供されるのは、いくつかの実施形態において、癌、例えばＰＴＫ７＋悪性腫瘍の処置のための方法及び組成物（例えば、細胞組成物）である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む操作されたＴ細胞であって、前記ＣＡＲは、ＰＴＫ７に特異的に結合する外部ドメインを含む、操作されたＴ細胞。
【請求項2】
破壊されたＴ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項3】
破壊されたベータ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子をさらに含む、請求項１又は２に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項4】
前記ＣＡＲの前記外部ドメインは、抗ＰＴＫ７抗体を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項5】
前記抗ＰＴＫ７抗体は、抗ＰＴＫ７一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項４に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項6】
前記抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、参照抗体と同じ重鎖可変ドメイン（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲを含み、前記参照抗体は、（ｉ）配列番号５５に記載のＶＨ及び配列番号５６に記載のＶＬ、（ｉｉ）配列番号６９に記載のＶＨ及び配列番号７０に記載のＶＬ、（ｉｉｉ）配列番号７６に記載のＶＨ及び配列番号７７に記載のＶＬ、又は（ｉｖ）配列番号８３に記載のＶＨ及び配列番号８４に記載のＶＬを含む、請求項５に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項7】
前記抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、前記参照抗体と同じＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む、請求項６に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項8】
前記抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、配列番号５４、６８、７５又は８２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項9】
前記ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は４１ＢＢ共刺激ドメインをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項10】
前記ＣＡＲは、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項９に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項11】
前記ＣＡＲは、配列番号４９、５１、６５、７２、７９若しくは１１２のいずれか１つのヌクレオチド配列又は配列番号４９、５１、６５、７２、７９若しくは１１２と少なくとも９０％同一である核酸配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項12】
前記ＣＡＲをコードする前記核酸は、前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子に挿入される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項13】
前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号６３、６４、７１、７８若しくは９１のいずれか１つ内のＬＡＨ及び／若しくはＲＨＡをコードするヌクレオチド配列、配列番号９２若しくは１００のヌクレオチド配列並びに／又は配列番号６３、６４、７１、７８若しくは９１のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項２～１２のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項14】
前記破壊されたβ２Ｍ遺伝子は、配列番号９～１４のいずれか１つから選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項15】
操作されたＴ細胞であって、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）抗ＰＴＫ７抗原結合断片を含むＣＡＲをコードする核酸
を含む操作されたＴ細胞。
【請求項16】
前記ＣＡＲは、（ａ）抗ＰＴＫ７抗原結合断片を含む外部ドメインと、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメインと、（ｃ）ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む内部ドメインとを含む、請求項１５に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項17】
前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、前記ＣＡＲをコードする前記核酸を含む、請求項１５又は１６に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項18】
操作されたＴ細胞であって、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、（ａ）抗ＰＴＫ７抗原結合断片を含む外部ドメインと、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメインと、（ｃ）ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む内部ドメインとを含むＣＡＲをコードする核酸を含む、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子
を含む操作されたＴ細胞。
【請求項19】
操作されたＴ細胞であって、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、配列番号５０、５２、６６、７３又は８０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子
を含む操作されたＴ細胞。
【請求項20】
操作されたＴ細胞であって、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、ＣＡＲをコードする核酸を含み、核酸配列は、配列番号４９、５１、６５、７２、７９又は１１２と少なくとも９０％同一であり、且つ配列番号５０、５２、６６、７３又は８０のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子
を含む操作されたＴ細胞。
【請求項21】
ヒトＴ細胞である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項22】
請求項１～２１のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、前記集団の操作されたＴ細胞の少なくとも２５％又は少なくとも５０％は、前記ＣＡＲを発現する、細胞の集団。
【請求項23】
前記集団の操作されたＴ細胞の少なくとも７０％は、前記ＣＡＲを発現する、請求項２２に記載の集団。
【請求項24】
前記集団の操作されたＴ細胞の少なくとも２５％は、少なくとも７日間又は少なくとも１４日間のインビトロでの増殖後に前記ＣＡＲを発現する、実施形態２２に記載の集団。
【請求項25】
前記集団の操作されたＴ細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質を発現しない、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の集団。
【請求項26】
前記集団の操作されたＴ細胞の少なくとも９０％は、検出可能なレベルのＴＣＲタンパク質を発現しない、請求項２５に記載の集団。
【請求項27】
前記集団の操作されたＴ細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのβ２Ｍタンパク質を発現しない、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の集団。
【請求項28】
前記集団の操作されたＴ細胞の少なくとも７０％は、検出可能なレベルのβ２Ｍタンパク質を発現しない、請求項２７に記載の集団。
【請求項29】
前記集団の操作されたＴ細胞は、ＰＴＫ７を発現する癌細胞の集団とインビトロで共培養された場合、前記集団の前記癌細胞の少なくとも１０％、少なくとも２５％又は少なくとも５０％の細胞溶解を誘発する、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の集団。
【請求項30】
前記集団の操作されたＴ細胞は、ＰＴＫ７を発現する癌細胞の集団とインビトロで共培養された場合、前記癌細胞の集団の少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の細胞溶解を誘発する、請求項２９に記載の集団。
【請求項31】
前記集団の操作されたＴ細胞は、癌細胞の集団とインビトロで共培養された場合、ＩＦＮγを分泌する、請求項２９又は３０に記載の集団。
【請求項32】
操作されたＴ細胞対癌細胞の比は、１：１～２：１である、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の集団。
【請求項33】
前記癌細胞は、肉腫細胞を含む、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の集団。
【請求項34】
前記癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、小細胞肺癌細胞及び／又は結腸癌細胞を含む、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の集団。
【請求項35】
対象にインビボで投与された場合、前記対象中で毒性を誘発しない、請求項２２～３４のいずれか一項に記載の集団。
【請求項36】
操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、前記操作されたＴ細胞は、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）抗ＰＴＫ７抗原結合断片を含むＣＡＲをコードする核酸
を含む、細胞の集団。
【請求項37】
前記ＣＡＲは、（ａ）抗ＰＴＫ７抗原結合断片を含む外部ドメインと、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメインと、（ｃ）ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む内部ドメインとを含む、請求項３６に記載の細胞の集団。
【請求項38】
前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、前記ＣＡＲをコードする前記核酸を含む、請求項３６又は３７に記載の細胞の集団。
【請求項39】
操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、前記操作されたＴ細胞は、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、（ａ）抗ＰＴＫ７抗原結合断片を含む外部ドメインと、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメインと、（ｃ）ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む内部ドメインとを含むＣＡＲをコードする核酸を含む、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子
を含む、細胞の集団。
【請求項40】
操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、前記操作されたＴ細胞は、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、ＣＡＲをコードする核酸を含み、核酸配列は、配列番号４９、５１、６５、７２、７９又は１１２と少なくとも９０％同一であり、且つ配列番号５０、５２、６６、７３又は８０のＣＡＲをコードする、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子
を含む、細胞の集団。
【請求項41】
請求項２２～４０のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞の集団を対象に投与することを含む方法。
【請求項42】
前記対象は、ヒト対象である、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記対象は、癌を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記癌は、膵癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫、神経細胞、軟部肉腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、結腸癌、結腸腺癌、脳膠芽腫、肝細胞癌、肝臓胆管癌、骨肉腫、胃癌、食道扁平上皮癌、進行期の膵癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺小細胞癌、腎癌及び肝内胆道癌からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記癌は、ＰＴＫ７を発現する癌細胞を含む、請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項46】
操作されたＴ細胞を作製する方法であって、（ａ）Ｔ細胞に、
（ｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、
（ｉｉ）ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと、
（ｉｉｉ）ＰＴＫ７に特異的に結合する外部ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターと
を送達すること、及び
（ｂ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を有し、且つ前記ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞を作製すること
を含む方法。
【請求項47】
前記ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡは、配列番号１８若しくは１９のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号４０のヌクレオチド配列を標的とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記Ｔ細胞に、β２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡを送達することをさらに含む、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項49】
前記β２Ｍ遺伝子を標的とする前記ｇＲＮＡは、配列番号２０若しくは２１のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号４１のヌクレオチド配列を標的とする、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記ＣＡＲの前記外部ドメインは、抗ＰＴＫ７抗体を含む、請求項４６～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記抗ＰＴＫ７抗体は、抗ＰＴＫ７一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、参照抗体と同じ重鎖可変ドメイン（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲを含み、前記参照抗体は、（ｉ）配列番号５５に記載のＶＨ及び配列番号５６に記載のＶＬ、（ｉｉ）配列番号６９に記載のＶＨ及び配列番号７０に記載のＶＬ、（ｉｉｉ）配列番号７６に記載のＶＨ及び配列番号７７に記載のＶＬ、又は（ｉｖ）配列番号８３に記載のＶＨ及び配列番号８４に記載のＶＬを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、前記参照抗体と同じＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む、請求項５２の方法。
【請求項54】
前記抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、配列番号５４、６８、７５又は８２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項55】
前記ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は４１ＢＢ共刺激ドメインをさらに含む、請求項４６～５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
前記ＣＡＲは、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
前記ＣＡＲは、配列番号４９、５１、６５、７２、７９若しくは１１２のいずれか１つのヌクレオチド配列又は配列番号４９、５１、６５、７２、７９若しくは１１２と少なくとも９０％同一である核酸配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項４６～５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
前記ＣＡＲをコードする前記核酸は、前記ＴＲＡＣ遺伝子に対する左及び右の相同アームと隣接する、請求項４６～５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
前記ドナー鋳型は、配列番号６３、６４、７１、７８又は９１のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項４６～５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、任意選択的にＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項４６～５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項61】
請求項４６～６０のいずれか一項に記載の方法によって作製される操作されたＴ細胞。
【請求項62】
請求項６１に記載の操作されたＴ細胞を含む細胞の集団。
【請求項63】
対象の癌を処置する方法であって、前記対象に、請求項２２～４０又は６２のいずれか一項に記載の細胞の集団を投与することを含む方法。
【請求項64】
前記癌は、膵癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫、神経細胞、軟部肉腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、結腸癌、結腸腺癌、脳膠芽腫、肝細胞癌、肝臓胆管癌、骨肉腫、胃癌、食道扁平上皮癌、進行期の膵癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺小細胞癌、腎癌及び肝内胆道癌からなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
前記癌は、ＰＴＫ７を発現する癌細胞を含む、請求項６３又は６４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０１８年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６２／７５６，６３８号明細書及び２０１９年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６２／９１０，５８６号明細書の利益を主張し、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６２／７５６，６３８号明細書及び２０１９年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６２／９１０，５８６号明細書の利益を主張し、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本開示の一部である配列表は、テキストファイルとして本明細書と同時に提出されている。この配列表を含むテキストファイルの名称は、「ＣＴ１１１＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」であり、このテキストファイルは、２０１９年１１月７に作成されており、且つ１１９，７７６バイトのサイズである。この配列表の主題は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の一部である配列表は、テキストファイルとして本明細書と同時に提出されている。この配列表を含むテキストファイルの名称は、「ＣＴ１１１＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」であり、このテキストファイルは、２０１９年１１月７に作成されており、且つ１１９，７７６バイトのサイズである。この配列表の主題は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、遺伝的に改変されたＴ細胞を使用して、癌細胞をより特異的且つ効率的に標的化して死滅させる。Ｔ細胞が血液から回収された後、この細胞は、その表面上にＣＡＲを含むように操作される。ＣＡＲは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用してＴ細胞に導入され得る。これらの異質遺伝子型のＣＡＲ Ｔ細胞が患者に注射されると、受容体は、Ｔ細胞が癌細胞を死滅させることを可能にする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
複数の腫瘍関連抗原標的が臨床試験に進んでおり、毒性を避けるために、癌組織中での発現が正常組織よりも選択的であるべきであるという論理を主に使用して選択されている（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ｂｌｏｏｄ ２０１３；１２２（２）：３３９２－３３９４）。しかしながら、ＰＴＫ７は、肺、平滑筋、胃、腎臓及び膀胱等の正常組織で過剰に発現されることが明らかであることから、この基準を満たしていない。そのため、ＰＴＫ７は、実行可能なＣＡＲ Ｔ細胞標的とみなされていない。それにも関わらず、本明細書で提供されるデータは、実際には動物が抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞による治療に耐えることと、これらの抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＰＴＫ７を発現する細胞を効率的且つ選択的に死滅させることとを予想外にも実証している。
【0005】
本開示のいくつかの態様は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む操作されたＴ細胞であって、このＣＡＲは、ＰＴＫ７に特異的に結合する外部ドメインを含む、操作されたＴ細胞を提供する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子をさらに含む。例えば、ＴＲＡＣ遺伝子は、ＣＡＲをコードする核酸の挿入によって破壊され得る。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたベータ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子をさらに含む。
【0006】
ＣＡＲの外部ドメインは、いくつかの実施形態では、抗ＰＴＫ７抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＴＫ７抗体は、抗ＰＴＫ７一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、いくつかの実施形態では、配列番号５４、６８、７５又は８２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、配列番号５５、６９、７６若しくは８３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨ及び／又は配列番号５６、７０、７７若しくは８４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、配列番号５７、配列番号５８及び／若しくは配列番号５９のＣＤＲアミノ酸配列を含むＶＨを含み、且つ／又は抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、配列番号６０、配列番号６１及び／若しくは配列番号６２のＣＤＲアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、配列番号８５、配列番号８６及び／若しくは配列番号８７のＣＤＲアミノ酸配列を含むＶＨを含み、且つ／又は抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、配列番号８８、配列番号８９及び／若しくは配列番号９０のＣＤＲアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含む。
【0007】
ＣＡＲは、いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は４１ＢＢ共刺激ドメインを含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号６３、６４、７１、７８若しくは９１のいずれか１つ内の左の相同アーム（ＬＨＡ）及び／若しくは右の相同アーム（ＲＨＡ）をコードするヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号９２若しくは１００のヌクレオチド配列を含み、且つ／或いはＣＡＲは、配列番号４９、５１、６５、７２、７９若しくは１１２のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、破壊されたβ２Ｍ遺伝子は、配列番号９～１４のいずれか１つから選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。
【0009】
同様に本明細書で提供されるのは、いくつかの態様では、操作されたＴ細胞であって、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び（ｉｉｉ）抗ＰＴＫ７抗原結合断片を含むＣＡＲをコードする核酸を含む操作されたＴ細胞である。
【0010】
同様に本明細書で提供されるのは、いくつかの態様では、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、この操作されたＴ細胞は、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び（ｉｉｉ）抗ＰＴＫ７抗原結合断片を含むＣＡＲをコードする核酸を含む、細胞の集団である。他の態様では、本明細書で提供されるのは、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、この操作されたＴ細胞は、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、この破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、ＣＡＲをコードする核酸を含み、核酸配列は、配列番号４９、５１、６５、７２、７９又は１１２と少なくとも９０％同一であり、且つ配列番号５０、５２、６６、７３又は８０のＣＡＲをコードする、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む、細胞の集団である。
【0011】
同様に本明細書で提供されるのは、いくつかの態様では、（例えば、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲをコードする核酸を含む）操作されたＴ細胞の集団であって、この集団の操作されたＴ細胞の少なくとも２５％又は少なくとも５０％は、ＣＡＲを発現する、Ｔ細胞の集団である。例えば、集団の操作されたＴ細胞の少なくとも７０％は、ＣＡＲを発現する。
【0012】
いくつかの実施形態では、集団の操作されたＴ細胞の少なくとも２５％は、少なくとも７日間又は少なくとも１４日間のインビトロでの増殖後にＣＡＲを発現する。
【0013】
いくつかの実施形態では、集団の操作されたＴ細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質を発現しない。例えば、集団の操作されたＴ細胞の少なくとも９０％は、検出可能なレベルのＴＣＲタンパク質を発現し得ない。
【0014】
いくつかの実施形態では、集団の操作されたＴ細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのβ２Ｍタンパク質を発現しない。例えば、集団の操作されたＴ細胞の少なくとも７０％は、検出可能なレベルのβ２Ｍタンパク質を発現し得ない。
【0015】
いくつかの実施形態では、集団の操作されたＴ細胞は、ＰＴＫ７を発現する癌細胞の集団とインビトロで共培養された場合、この集団の癌細胞の少なくとも５０％の細胞溶解を誘発する。例えば、集団の操作されたＴ細胞は、集団の癌細胞の少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の細胞溶解を誘発し得る。いくつかの実施形態では、集団の操作されたＴ細胞は、ＰＴＫ７を発現する癌細胞の集団とインビトロで共培養された場合、この集団の癌細胞の少なくとも１０％、少なくとも２５％又は少なくとも５０％の細胞溶解を誘発する。いくつかの実施形態では、集団の操作されたＴ細胞は、癌細胞の集団とインビトロで共培養された場合、ＩＦＮγを分泌する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞対癌細胞の比は、１：１～２：１である。癌細胞は、例えば、肉腫細胞又は乳癌細胞であり得る。他の癌細胞が標的とされ得る。いくつかの実施形態では、癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、小細胞肺癌細胞及び／又は結腸癌細胞であり得る。
【0016】
いくつかの実施形態では、集団の操作されたＴ細胞の増殖能は、対照細胞の増殖能の１０％以内である。さらに他の実施形態では、Ｔ細胞の集団は、対象にインビボで投与された場合、この対象中で毒性を誘発しない。
【0017】
本開示の他の態様は、本明細書で説明されている操作されたＴ細胞の集団を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象の体重のパーセントは、投与の５～１０日後、対象の最初の体重の１０％内であり、この対象の最初の体重は、投与時の対象の体重である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト対象である。いくつかの態様では、対象は、癌を有する。この癌は、例えば、ＰＴＫ７を発現し得る。様々な実施形態では、この癌は、膵癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫、神経細胞、軟部肉腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、結腸癌、結腸腺癌、脳膠芽腫、肝細胞癌、肝臓胆管癌、骨肉腫、胃癌、食道扁平上皮癌、進行期の膵癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺小細胞癌、腎癌及び肝内胆道癌からなる群から選択される。
【0018】
本開示のさらなる態様は、操作されたＴ細胞を作製する方法であって、（ａ）Ｔ細胞に、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと、ＰＴＫ７に特異的に結合する外部ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターとを送達することであって、ＣＡＲをコードする核酸は、ＴＲＡＣ遺伝子に対する左及び右の相同アームと隣接する、送達すること、及び（ｂ）操作されたＴ細胞を作製することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡは、配列番号１８若しくは１９のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号４０のヌクレオチド配列を標的とする。関連する一実施形態では、方法であって、ＣＡＲをコードする核酸は、ＴＲＡＣ遺伝子に対する左及び右の相同アームに隣接する、方法が提供される。
【0019】
いくつかの実施形態では、この方法は、Ｔ細胞に、β２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡを送達することをさらに含む。いくつかの実施形態では、β２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡは、配列番号２０若しくは２１のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号４１のヌクレオチド配列を標的とする。
【0020】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、任意選択的にＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態体では、ＣＡＲの外部ドメインは、抗ＰＴＫ７抗体、任意選択的に抗ＰＴＫ７一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
【0021】
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号６３、６４、７１、７８又は９１のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号５０、５２、６６、７３又は８０のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、作製する方法であって、抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、参照抗体と同じ重鎖可変ドメイン（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲを含み、参照抗体は、（ｉ）配列番号５５に記載のＶＨ及び配列番号５６に記載のＶＬ、（ｉｉ）配列番号６９に記載のＶＨ及び配列番号７０に記載のＶＬ、（ｉｉｉ）配列番号７６に記載のＶＨ及び配列番号７７に記載のＶＬ、又は（ｉｖ）配列番号８３に記載のＶＨ及び配列番号８４に記載のＶＬを含む、方法が提供される。一実施形態では、方法であって、抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、参照抗体と同じＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む、方法が提供される。さらに別の実施形態では、抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、配列番号５４、６８、７５又は８２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【0024】
一実施形態では、上述した作製する方法であって、ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は４１ＢＢ共刺激ドメインを含む、方法が提供される。関連する実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、上述した作製する方法であって、ドナー鋳型は、配列番号６３、６４、７１、７８又は９１のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、方法が提供される。さらに他の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４９、５１、６５、７２、７９又は１１２のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされる。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】正常なヒト組織でのＰＴＫ７発現を示す。
【図2A】ヒトの罹患組織及び正常組織でのＰＴＫ７発現を示す。
【図2B】ヒトの罹患組織及び正常組織でのＰＴＫ７発現を示す。
【図3】固形腫瘍での免疫組織化学（ＩＨＣ）によるＰＴＫ７患者罹患率を示す。
【図4】ヒト細胞系統及びマウス細胞系統でのＰＴＫ７／ＣＴＸ１８１ Ａｂの結合親和性を示す。
【図6】凍結したマウス胚発生アレイでのＰＴＫ７発現を示す。
【図7】ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ＋Ｔ細胞での高効率の複数の遺伝子編集を示すグラフを含む。４種の異なる抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ＋コンストラクト（ＰＴＫ７－４、ＰＴＫ７－７、ＰＴＫ７－１３及びＰＴＫ７－１７）に関して、ＦＡＣＳにより測定された表現型の編集（左側のグラフ）及び免疫組織化学により測定された抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ＋発現が示されている。
【図8】ＣＤ２８共刺激ドメインを有するＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＰＴＫ７－４）は、４－１ＢＢ共刺激ドメインを有するＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＰＴＫ７－４ｂ）よりも有効性が高かったことを示すグラフを含む。
【図9A-B】接着性肉腫細胞系統Ａ－２０４（図９Ａ）及びＳａｏｓ－２（図９Ｂ）並びに乳癌細胞系統ＭＣＦ７（図９Ｃ）に対するＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞死滅効果を示すグラフを含む。２：１及び１：１の細胞比（ＣＡＴ Ｔ細胞：標的癌細胞）を使用した。
【図9C】接着性肉腫細胞系統Ａ－２０４（図９Ａ）及びＳａｏｓ－２（図９Ｂ）並びに乳癌細胞系統ＭＣＦ７（図９Ｃ）に対するＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞死滅効果を示すグラフを含む。２：１及び１：１の細胞比（ＣＡＴ Ｔ細胞：標的癌細胞）を使用した。
【図10A】ＰＴＫ７－ＫＯ Ｓａｏｓ２細胞（図１０Ａ）及びＰＴＫ７を過剰発現するＡ４９８細胞（図１０Ｂ）でのＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞の特異性を示す。図１０Ｃは、Ｓａｏｓ２細胞、ＰＴＫ７－ＫＯ Ｓａｏｓ２細胞、Ａ４９８細胞及びＰＴＫ７を過剰発現するＡ４９８細胞でのＰＴＫ７細胞表面発現を示す。
【図10B-C】ＰＴＫ７－ＫＯ Ｓａｏｓ２細胞（図１０Ａ）及びＰＴＫ７を過剰発現するＡ４９８細胞（図１０Ｂ）でのＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞の特異性を示す。図１０Ｃは、Ｓａｏｓ２細胞、ＰＴＫ７－ＫＯ Ｓａｏｓ２細胞、Ａ４９８細胞及びＰＴＫ７を過剰発現するＡ４９８細胞でのＰＴＫ７細胞表面発現を示す。
【図12】対照と比較した、遺伝子編集後のＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞増殖を示すグラフを含む。
【図14A-B】ＭＣＦ７細胞（図１４Ａ～図１４Ｃ）及びＳａｏｓ－２細胞（図１４Ｄ～図１４Ｆ）と接触させた場合、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比べて細胞死滅に効果的であり、且つ高いレベルのＩＦＮγを分泌することを示すグラフを含む。
【図14C-D】ＭＣＦ７細胞（図１４Ａ～図１４Ｃ）及びＳａｏｓ－２細胞（図１４Ｄ～図１４Ｆ）と接触させた場合、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比べて細胞死滅に効果的であり、且つ高いレベルのＩＦＮγを分泌することを示すグラフを含む。
【図14E-F】ＭＣＦ７細胞（図１４Ａ～図１４Ｃ）及びＳａｏｓ－２細胞（図１４Ｄ～図１４Ｆ）と接触させた場合、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比べて細胞死滅に効果的であり、且つ高いレベルのＩＦＮγを分泌することを示すグラフを含む。
【図15】抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞がヒト及びネズミの細胞系統においてインビトロで等しく有効であったことを示す。
【図16】ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞で処置したマウスは、処置／注射から最大１０日にわたり体重減少が最小限であったことを示すグラフを含む。
【図17】ヒト癌細胞系統中でのＰＴＫ７細胞表面発現レベルを示す。
【図18A】様々なインビボ異種移植モデルにおける抗ＰＴＫ７－ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を示す。
【図18B】様々なインビボ異種移植モデルにおける抗ＰＴＫ７－ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を示す。
【図18C】様々なインビボ異種移植モデルにおける抗ＰＴＫ７－ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を示す。
【図20】Ｈｓ－７６６Ｔ膵臓腫瘍異種移植マウスモデルにおける体重へのＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞処置の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0027】
ＰＴＫ７癌抗原
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＰＴＫ７を標的とするように設計されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）により操作されている。タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）（結腸癌キナーゼ４（ＣＣＫ４）としても既知である）は、非標準のＷｎｔシグナル伝達に関与し、且つ細胞外ドメインを含む受容体タンパク質チロシンキナーゼである。ＰＴＫ７は、検出可能な触媒チロシンキナーゼ活性を欠いているが、シグナル伝達活性を含み、細胞付着で機能すると推定されている。さらに、ＰＴＫ７は、癌細胞系統（例えば、結腸癌細胞系統及び乳癌細胞系統）で発現されることから、癌での腫瘍進行のマーカーであると考えられている。
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＰＴＫ７を標的とするように設計されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）により操作されている。タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）（結腸癌キナーゼ４（ＣＣＫ４）としても既知である）は、非標準のＷｎｔシグナル伝達に関与し、且つ細胞外ドメインを含む受容体タンパク質チロシンキナーゼである。ＰＴＫ７は、検出可能な触媒チロシンキナーゼ活性を欠いているが、シグナル伝達活性を含み、細胞付着で機能すると推定されている。さらに、ＰＴＫ７は、癌細胞系統（例えば、結腸癌細胞系統及び乳癌細胞系統）で発現されることから、癌での腫瘍進行のマーカーであると考えられている。
【0028】
そのため、いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、抗ＰＴＫ７抗体（例えば、抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖ）を含むＣＡＲを発現するように操作されている。いくつかの実施形態では、この抗ＰＴＫ７抗体は、配列番号５３、６７、７４又は８１のいずれか１つの配列によってコードされる抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、この抗ＰＴＫ７抗体は、配列番号１１３のいずれか１つの配列によってコードされる抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、この抗ＰＴＫ７抗体は、配列番号５４、６８、７５又は８２のいずれか１つの配列を含む抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、この抗ＰＴＫ７抗体は、配列番号５５、６９、７６又は８３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、この抗ＰＴＫ７抗体は、配列番号５６、７０、７７又は８４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＰＴＫ７抗体を含むＣＡＲは、配列番号４９、５１、６５、７２又は７９のいずれか１つの配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＰＴＫ７抗体を含むＣＡＲは、配列番号４９、５１、６５、７２、７９又は１１２と少なくとも９０％同一である核酸を含む配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＰＴＫ７抗体を含むＣＡＲは、配列番号１１２のいずれか１つの配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＰＴＫ７抗体を含むＣＡＲは、配列番号５０、５２、６６、７３又は８０のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＴＫ７抗体を含むＣＡＲは、米国特許第９，１０２，７３８号明細書又は同第９，４０９，９９５号明細書で説明されているような抗ＰＴＫ７抗体を含む。
【0029】
多重遺伝子編集
本開示の操作されたＴ細胞は、いくつかの実施形態では、例えば複数の遺伝子において複数の遺伝子編集を含む。例えば、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子、破壊されたベータ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子、破壊されたプログラム細胞死－１（ＰＤ－１若しくはＰＤＣＤ１）遺伝子、破壊されたＣＤ７０遺伝子又は前述の破壊された遺伝子の２つ以上の任意の組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子及び破壊されたＰＤ－１遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、破壊されたＣＤ７０遺伝子及び破壊されたＰＤ－１遺伝子を含む。
本開示の操作されたＴ細胞は、いくつかの実施形態では、例えば複数の遺伝子において複数の遺伝子編集を含む。例えば、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子、破壊されたベータ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子、破壊されたプログラム細胞死－１（ＰＤ－１若しくはＰＤＣＤ１）遺伝子、破壊されたＣＤ７０遺伝子又は前述の破壊された遺伝子の２つ以上の任意の組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子及び破壊されたＰＤ－１遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、破壊されたＣＤ７０遺伝子及び破壊されたＰＤ－１遺伝子を含む。
【0030】
遺伝子破壊は、遺伝子編集（例えば、１つ又は複数のヌクレオチドを挿入するか又は欠失させるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集を使用する）を介した遺伝子改変を包含することを理解すべきである。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子とは、機能性タンパク質をコードしない遺伝子である。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子を含む細胞は、この遺伝子によってコードされる検出可能なレベル（例えば、抗体による、例えばフローサイトメトリーによる）のタンパク質を（例えば、細胞表面で）発現しない。検出可能なレベルのタンパク質を発現しない細胞は、ノックアウト細胞と呼ばれ得る。例えば、β２Ｍ遺伝子編集を有する細胞は、β２Ｍタンパク質が、β２Ｍタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して細胞表面で検出され得ない場合、β２Ｍノックアウト細胞とみなされ得る。
【0031】
本明細書で提供されるのは、いくつかの実施形態では、一定のパーセンテージの細胞が編集されており（例えば、β２Ｍ遺伝子が編集されており）、結果として特定の遺伝子及び／又はタンパク質を発現しない一定のパーセンテージの細胞がもたらされる細胞の集団である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集された細胞の集団の少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は８５％）の細胞は、β２Ｍノックアウト細胞である。いくつかの実施形態では、この集団の少なくとも５０％の細胞（例えば、Ｔ細胞）は、検出可能なレベルのβ２Ｍタンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、遺伝子編集された細胞の集団の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の細胞は、β２Ｍノックアウト細胞であり得る。
【0032】
細胞においてゲノム欠失をもたらす（例えば、細胞において遺伝子をノックアウトする）ためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集技術を使用する方法は、既知である（Ｂａｕｅｒ ＤＥ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１５；９５；ｅ５２１１８）。
【0033】
ＴＲＡＣ遺伝子編集
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含む。この破壊は、ＴＣＲの機能喪失をもたらし、且つこの操作されたＴ細胞に同種移植への非アロ反応性及び適合性を与え、移植片対宿主疾患のリスクを最小化する。いくつかの実施形態では、内在性のＴＲＡＣ遺伝子の発現は、移植片対宿主反応を予防するために除去される。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及びドナー鋳型を使用して）ＴＲＡＣ遺伝子にノックインすることによりもたらされる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、ＴＲＡＣゲノム領域を標的とするｇＲＮＡによりもたらされる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現におけるゲノム欠失は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を（例えば、ＡＡＶベクター及びドナー鋳型を使用して）ＴＲＡＣ遺伝子にノックインすることによりもたらされる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、ＴＲＡＣゲノム領域を標的とするｇＲＮＡ及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴＲＡＣ遺伝子にノックインすることによりもたらされる。
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含む。この破壊は、ＴＣＲの機能喪失をもたらし、且つこの操作されたＴ細胞に同種移植への非アロ反応性及び適合性を与え、移植片対宿主疾患のリスクを最小化する。いくつかの実施形態では、内在性のＴＲＡＣ遺伝子の発現は、移植片対宿主反応を予防するために除去される。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及びドナー鋳型を使用して）ＴＲＡＣ遺伝子にノックインすることによりもたらされる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、ＴＲＡＣゲノム領域を標的とするｇＲＮＡによりもたらされる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現におけるゲノム欠失は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を（例えば、ＡＡＶベクター及びドナー鋳型を使用して）ＴＲＡＣ遺伝子にノックインすることによりもたらされる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、ＴＲＡＣゲノム領域を標的とするｇＲＮＡ及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴＲＡＣ遺伝子にノックインすることによりもたらされる。
【0034】
ＴＲＡＣ遺伝子においてゲノム破壊をもたらすために本明細書に記載されているように使用され得る改変及び未改変のＴＲＡＣ ｇＲＮＡ配列の非限定的な例を表４に列挙する（例えば、配列番号１８及び１９）。また、参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年５月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０３２３３４号明細書も参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１４番染色体上に位置するＴＲＡＣ遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８：１４番染色体：２２，５４７，５０６～２２，５５２，１５４；．Ｅｎｓｅｍｂｌ；ＥＮＳＧ０００００２７７７３４）。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的とするｇＲＮＡにより、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を破棄する、ＴＲＡＣ遺伝子におけるインデルが生じる。
【0035】
いくつかの実施形態では、集団の少なくとも５０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）表面タンパク質を発現しない。例えば、集団の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現し得ない。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞の集団の５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％又は９０％～１００％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない。
【0036】
いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的とするｇＲＮＡにより、下記の表１の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、ＴＲＡＣ遺伝子におけるインデルが生じる。
【0037】
【表1】
【0038】
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子における欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子において、１５～３０個の塩基対の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子において、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個の塩基対の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子において、３０個超の塩基対の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子において、２０個の塩基対の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子において、配列番号１０４（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ）の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子において、配列番号１０４（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ）を含む欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子において、配列番号４０の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子において、配列番号４０を含む欠失を含む。
【0039】
β２Ｍ遺伝子編集
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む。β２Ｍは、ＭＨＣ Ｉ複合体の共通の（不変の）構成要素である。遺伝子編集によりβ２Ｍ遺伝子の発現が破壊されると、宿主対治療用異質遺伝子型Ｔ細胞反応が予防され、異質遺伝子型Ｔ細胞の持続の増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、内在性のβ２Ｍ遺伝子の発現は、宿主対移植片反応を予防するために除去される。
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む。β２Ｍは、ＭＨＣ Ｉ複合体の共通の（不変の）構成要素である。遺伝子編集によりβ２Ｍ遺伝子の発現が破壊されると、宿主対治療用異質遺伝子型Ｔ細胞反応が予防され、異質遺伝子型Ｔ細胞の持続の増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、内在性のβ２Ｍ遺伝子の発現は、宿主対移植片反応を予防するために除去される。
【0040】
β２Ｍ遺伝子においてゲノム破壊をもたらすために本明細書に記載されているように使用され得る改変及び未改変のβ２Ｍ ｇＲＮＡ配列の非限定的な例を表４に列挙する（例えば、配列番号２０及び２１）。また、参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年５月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０３２３３４号明細書も参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１５番染色体上に位置するβ２Ｍ遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８の座標：１５番染色体：４４，７１１，４７７－４４，７１８，８７７；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６６７１０）。
【0041】
いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的とするｇＲＮＡにより、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を破壊する、β２Ｍ遺伝子におけるインデルがもたらされる。
【0042】
いくつかの実施形態では、集団の少なくとも５０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。例えば、集団の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現し得ない。いくつかの実施形態では、集団の５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％又は９０％～１００％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。
【0043】
いくつかの実施形態では、編集されたβ２Ｍ遺伝子は、下記の表２の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。
【0044】
【表2】
【0045】
ＰＤ－１遺伝子編集
ＰＤ－１は、活性化Ｔ細胞において下方制御される免疫チェックポイント分子であり、Ｔ細胞応答を弱めるか又は止める役割を果たす。遺伝子編集によりＰＤ－１が破壊されると、より多くの持続的な及び／若しくは強力な治療的Ｔ細胞応答がもたらされ、且つ／又は対象における免疫抑制が低減される可能性がある。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＰＤ－１遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、内在性のＰＤ－１遺伝子の発現は、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増強するめに除去される。
ＰＤ－１は、活性化Ｔ細胞において下方制御される免疫チェックポイント分子であり、Ｔ細胞応答を弱めるか又は止める役割を果たす。遺伝子編集によりＰＤ－１が破壊されると、より多くの持続的な及び／若しくは強力な治療的Ｔ細胞応答がもたらされ、且つ／又は対象における免疫抑制が低減される可能性がある。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＰＤ－１遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、内在性のＰＤ－１遺伝子の発現は、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増強するめに除去される。
【0046】
ＰＤ－１遺伝子においてゲノム欠失をもたらすために本明細書に記載されているように使用され得る改変及び未改変のＰＤ－１ ｇＲＮＡ配列の非限定的な例を表４に列挙する（例えば、配列番号２２及び２３）。また、参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年５月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０３２３３４号明細書も参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、２番染色体上に位置するＰＤ－１遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８の座標：２番染色体：２４１，８４９，８８１～２４１，８５８，９０８；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８８３８９）。
【0047】
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ゲノム領域を標的とするｇＲＮＡにより、ＰＤ－１ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を破壊する、ＰＤ－１遺伝子におけるインデルがもたらされる。
【0048】
いくつかの実施形態では、集団の少なくとも５０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＰＤ－１表面タンパク質を発現しない。例えば、集団の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＰＤ－１表面タンパク質を発現し得ない。いくつかの実施形態では、集団の５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％又は９０％～１００％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＰＤ－１表面タンパク質を発現しない。
【0049】
ＣＤ７０遺伝子編集
表面抗原分類７０（ＣＤ７０）は、腫瘍壊死因子スーパーファミリのメンバーであり、且つその発現は、活性化Ｔ及びＢリンパ球並びに成熟樹状細胞に限定される。ＣＤ７０は、血液腫瘍上及び癌腫上でも検出されている。ＣＤ７０は、そのリガンドであるＣＤ２７との相互作用を通して、腫瘍細胞及び制御性Ｔ細胞の生存に関与している。遺伝子編集によりＣＤ７０が破壊されると、細胞増殖が増加し、且つ細胞枯渇が減少する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、内在性のＣＤ７０遺伝子の発現は、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増強するめに除去される。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０ゲノム領域を標的とするｇＲＮＡにより、ＣＤ７０ ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現を破壊する、ＣＤ７０遺伝子の部又は周囲におけるインデルがもたらされる。
表面抗原分類７０（ＣＤ７０）は、腫瘍壊死因子スーパーファミリのメンバーであり、且つその発現は、活性化Ｔ及びＢリンパ球並びに成熟樹状細胞に限定される。ＣＤ７０は、血液腫瘍上及び癌腫上でも検出されている。ＣＤ７０は、そのリガンドであるＣＤ２７との相互作用を通して、腫瘍細胞及び制御性Ｔ細胞の生存に関与している。遺伝子編集によりＣＤ７０が破壊されると、細胞増殖が増加し、且つ細胞枯渇が減少する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、内在性のＣＤ７０遺伝子の発現は、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増強するめに除去される。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０ゲノム領域を標的とするｇＲＮＡにより、ＣＤ７０ ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現を破壊する、ＣＤ７０遺伝子の部又は周囲におけるインデルがもたらされる。
【0050】
ＣＤ７０遺伝子においてゲノム欠失をもたらすために本明細書に記載されているように使用され得る改変及び未改変のＣＤ７０ ｇＲＮＡ配列の非限定的な例を表４に列挙する（例えば、配列番号２４～２７）。他のｇＲＮＡ配列は、１９番染色体上に位置するＣＤ７０遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８の座標：１９番染色体：６，５８３，１８３～６，６０４，１０３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１２５７２６）。
【0051】
いくつかの実施形態では、集団の少なくとも５０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現しない。例えば、集団の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現し得ない。いくつかの実施形態では、集団の５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％又は９０％～１００％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現しない。
【0052】
細胞表現型
いくつかの実施形態では、細胞の集団内の１つ又は複数の遺伝子編集により、細胞の増殖能、細胞の枯渇、細胞の生存能、細胞溶解能（例えば、サイトカイン産生及び／若しくは放出を増加させる）又はこれらの任意の組合せにおける変化と関連する表現型がもたらされる。
いくつかの実施形態では、細胞の集団内の１つ又は複数の遺伝子編集により、細胞の増殖能、細胞の枯渇、細胞の生存能、細胞溶解能（例えば、サイトカイン産生及び／若しくは放出を増加させる）又はこれらの任意の組合せにおける変化と関連する表現型がもたらされる。
【0053】
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも２０％高い細胞増殖能を示す。例えば、操作されたＴ細胞は、対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％高い細胞増殖能を示し得る。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照Ｔ細胞と比較して、２０％～１００％、２０％～９０％、２０％～８０％、２０％～７０％、２０％～６０％、２０％～５０％、３０％～１００％、３０％～９０％、３０％～８０％、３０％～７０％、３０％～６０％、３０％～５０％、４０％～１００％、４０％～９０％、４０％～８０％、４０％～７０％、４０％～６０％、４０％～５０％、５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％又は５０％～６０％高い細胞増殖能を示す。
【0054】
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞生存能において少なくとも２０％の増加を示す。例えば、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞生存能において少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の増加を示し得る。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞生存能において２０％～１００％、２０％～９０％、２０％～８０％、２０％～７０％、２０％～６０％、２０％～５０％、３０％～１００％、３０％～９０％、３０％～８０％、３０％～７０％、３０％～６０％、３０％～５０％、４０％～１００％、４０％～９０％、４０％～８０％、４０％～７０％、４０％～６０％、４０％～５０％、５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％又は５０％～６０％の増加を示す。
【0055】
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞溶解能において少なくとも２０％の増加（少なくとも２０％多く標的細胞を死滅させる）を示す。例えば、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞溶解能において少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の増加を示し得る。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞溶解能において２０％～１００％、２０％～９０％、２０％～８０％、２０％～７０％、２０％～６０％、２０％～５０％、３０％～１００％、３０％～９０％、３０％～８０％、３０％～７０％、３０％～６０％、３０％～５０％、４０％～１００％、４０％～９０％、４０％～８０％、４０％～７０％、４０％～６０％、４０％～５０％、５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％又は５０％～６０％の増加を示す。例えば、操作されたＴ細胞により分泌されるサイトカイン（例えば、ＩＬ－２及び／又はＩＦＮ－ガンマ）のレベルは、対照Ｔ細胞により分泌されるサイトカインのレベルと比べて少なくとも２倍（例えば、少なくとも３倍、少なくとも４倍又は少なくとも５倍）高い場合がある。
【0056】
対照Ｔ細胞は、いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞（例えば、遺伝子編集されたＴ細胞）である。いくつかの実施形態では、対照Ｔ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、このＴＲＡＣ遺伝子に挿入されるＣＡＲ（例えば、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ）をコードする核酸及び／又は破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む操作されたＴ細胞である。いくつかの実施形態では、対照Ｔ細胞は、未編集のＴ細胞である。
【0057】
遺伝子編集方法
遺伝子編集（ゲノム編集を含む）は、ヌクレオチド／核酸がＤＮＡ配列中（例えば、標的化された細胞のゲノム中）で挿入、欠失及び／又は置換される一種の遺伝子操作である。標的化された遺伝子編集により、標的化された細胞のゲノム中（例えば、標的化された遺伝子中又は標的化されたＤＮＡ配列中）の予め選択された部位での挿入、欠失及び／又は置換が可能になる。内在性の遺伝子の配列が例えばヌクレオチド／核酸の欠失、挿入又は置換により編集される場合、影響を受けた配列を含む内在性の遺伝子は、配列改変に起因してノックアウトされ得るか又はノックダウンされ得る。従って、標的化された編集を使用して、内在性の遺伝子発現を破壊し得る。「標的化された組込み」は、挿入部位での在性の配列の欠失の有無に関わらず、１つ又は複数の外来性の配列の挿入を含むプロセスを指す。標的化された組込みは、外来性の配列を含むドナー鋳型が存在する場合、標的化された遺伝子編集から生じ得る。
遺伝子編集（ゲノム編集を含む）は、ヌクレオチド／核酸がＤＮＡ配列中（例えば、標的化された細胞のゲノム中）で挿入、欠失及び／又は置換される一種の遺伝子操作である。標的化された遺伝子編集により、標的化された細胞のゲノム中（例えば、標的化された遺伝子中又は標的化されたＤＮＡ配列中）の予め選択された部位での挿入、欠失及び／又は置換が可能になる。内在性の遺伝子の配列が例えばヌクレオチド／核酸の欠失、挿入又は置換により編集される場合、影響を受けた配列を含む内在性の遺伝子は、配列改変に起因してノックアウトされ得るか又はノックダウンされ得る。従って、標的化された編集を使用して、内在性の遺伝子発現を破壊し得る。「標的化された組込み」は、挿入部位での在性の配列の欠失の有無に関わらず、１つ又は複数の外来性の配列の挿入を含むプロセスを指す。標的化された組込みは、外来性の配列を含むドナー鋳型が存在する場合、標的化された遺伝子編集から生じ得る。
【0058】
標的化された編集を、ヌクレアーゼ非依存的な手法又はヌクレアーゼ依存的な手法のいずれかを介して達成し得る。ヌクレアーゼ非依存的な標的化された編集手法において、相同組換えは、宿主細胞の酵素機構を介して内在性の配列に導入される外来性のポリヌクレオチドに隣接する相同配列により誘導される。この外来性のポリヌクレオチドは、この在性の配列中においてヌクレオチドの欠失、挿入又は置換を導入し得る。
【0059】
代わりに、ヌクレアーゼ依存的な手法は、特異的なレアカッティングヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）による二重鎖切断（ＤＳＢ）の特異的な導入を介して、比較的高い頻度で、標的化された編集を達成し得る。そのようなヌクレアーゼ依存的な標的化された編集は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＤＳＢに応答して生じる非相同末端連結（ＮＨＥＪ））も利用する。ＮＨＥＪによるＤＮＡ修復は、少数の在性のヌクレオチドのランダムな挿入又は欠失（インデル）を引き起こす場合が多い。ＮＨＥＪに媒介される修復とは対照的に、修復は、相同組換え修復（ＨＤＲ）によっても生じ得る。相同性アームの対に隣接する外来性の遺伝子材料を含むドナー鋳型が存在する場合、この外来性の遺伝子材料を、この外来性の遺伝子材料の標的化された組込みをもたらすＨＤＲによりゲノムに導入し得る。
【0060】
特異的な且つ標的化されたＤＳＢを導入し得る利用可能なエンドヌクレアーゼとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連９）。加えて、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ及びＢｘｂ１インテグラーゼを利用するＤＩＣＥ（二重インテグラーゼカセット交換）システムも、標的化された組込みのために使用され得る。
【0061】
ＺＦＮは、１つ又は複数のジンクフィンガーを介して配列特異的な様式でＤＮＡに結合するポリペプチドドメインであるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＢＤ）に融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。ジンクフィンガーは、構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化されているジンクフィンガー結合ドメイン内の約３０個のアミノ酸のドメインである。ジンクフィンガーの例として、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー、Ｃ３Ｈジンクフィンガー及びＣ４ジンクフィンガーが挙げられるが、これらに限定されない。設計されたジンクフィンガードメインは、設計／組成が合理的な基準（例えば、既存のＺＦＰ設計及び結合データの情報を保管するデータベース中の情報を処理するための置換規則及びコンピューター処理されたアルゴリズムの適用）から主にもたらされる、天然に存在しないドメインである。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書；同第６，４５３，２４２号明細書；及び同第６，５３４，２６１号明細書を参照されたく；国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；同第９８／５３０５９号パンフレット；同第９８／５３０６０号パンフレット；同第０２／０１６５３６号パンフレット；及び同第０３／０１６４９６号パンフレットも参照されたい。選択されたジンクフィンガードメインは、ファージディスプレイ、相互作用トラップ又はハイブリッド選択等の実験的なプロセスから主にもたらされる、天然に存在しないドメインである。ＺＦＮは、米国特許第７，８８８，１２１号明細書及び同第７，９７２，８５４号明細書においてより詳細に説明されている。ＺＦＮの最も認知されている例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼとジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとの融合物である。
【0062】
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、「ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン」又は「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＴＡＬエフェクタータンパク質のＤＮＡへの結合に関与するＴＡＬエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインである。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の植物病原体により、感染中に分泌される。このタンパク質は、植物細胞の核に入り、このタンパク質のＤＮＡ結合ドメインを介してエフェクター特異的なＤＮＡ配列に結合し、且つこのタンパク質の転写活性化ドメインを介してこの配列で遺伝子転写を活性化する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインの特異性は、２アミノ酸残基からなる可変領域（ＲＶＤ）と呼ばれる選択反復位置で多型を含む、エフェクターにより可変の数の不完全な３４個のアミノ酸の反復に依存する。ＴＡＬＥＮは、米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号明細書においてより詳細に説明されている。当技術分野におけるＴＡＬＥＮの最も認知された例は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに対するＦｏｋＩヌクレアーゼの融合ポリペプチドである。
【0063】
本明細書で提供される使用に好適な標的化ヌクレアーゼのさらなる例として、個別に使用されるか組み合わせて使用されるかに関わらず、Ｂｘｂ１、ｐｈｉＣ３１、Ｒ４、ＰｈｉＢＴ１及びＷβ／ＳＰＢｃ／ＴＰ９０１－１が挙げられるが、これらに限定されない。
【0064】
標的化ヌクレアーゼの他の非限定的な例として、天然に存在するヌクレアーゼ及び組換えヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼホーミングエンドヌクレアーゼ及び同様のものが挙げられる。
【0065】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、遺伝子編集のために使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されている、原核生物において天然に存在する防御機構である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＤＮＡの切断を標的化するＤＮＡヌクレアーゼＣａｓ９並びに２つの非コードＲＮＡであるｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に依拠する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、遺伝子編集のために使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されている、原核生物において天然に存在する防御機構である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＤＮＡの切断を標的化するＤＮＡヌクレアーゼＣａｓ９並びに２つの非コードＲＮＡであるｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に依拠する。
【0066】
ｃｒＲＮＡは、典型的には標的ＤＮＡ中の２０個のヌクレオチド（ｎｔ）の配列とのワトソン－クリック塩基対形成を介して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の配列認識及び特異性を促進する。ｃｒＲＮＡ中の５’２０ｎｔの配列の変化は、特定の座位へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の標的化を可能にする。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は、標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる特定の短いＤＮＡモチーフ（配列ＮＧＧを有する）に続いている場合、ｃｒＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の最初の２０ｎｔに一致する配列を含むＤＮＡ配列に結合するのみである。
【0067】
ＴｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端とハイブリダイズしてＲＮＡ二重鎖構造を形成し、このＲＮＡ二重鎖構造にＣａｓ９エンドヌクレアーゼが結合して、触媒活性のあるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が形成され、次いで、このＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は、標的ＤＮＡを切断し得る。
【0068】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が標的部位でＤＮＡに結合すると、Ｃａｓ９酵素内の２つの独立したヌクレアーゼドメインがそれぞれＰＡＭ部位の上流でＤＮＡ鎖の一方を切断し、ＤＮＡの両鎖が塩基対（平滑末端）で終結する二本鎖切断（ＤＳＢ）を残す。
【0069】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が特定の標的部位でＤＮＡに結合し、部位特異的なＤＳＢが形成された後、次の重要なステップは、ＤＳＢの修復である。細胞は、ＤＳＢを修復するために、下記の２つの主要なＤＮＡ修復経路を使用する：非相同末端連結（ＮＨＥＪ）及び相同組換え修復（ＨＤＲ）。
【0070】
ＮＨＥＪは、非分裂細胞を含む大多数の細胞型において高度に活性であるように見える堅固な修復機構である。ＮＨＥＪは、誤りがちであり、多くの場合、ＤＳＢの部位において１～数百のヌクレオチド間で除去又は付加をもたらす可能性があるが、そのような改変は、典型的には＜２０ｎｔである。得られた挿入及び欠失（インデル）は、遺伝子のコード領域又は非コード領域を破壊する可能性がある。代わりに、ＨＤＲは、内在的又は外因的に提供される長い一続きの相同性ドナーＤＮＡを使用して、高い忠実度でＤＳＢを修復する。ＨＤＲは、分裂細胞においてのみ活性であり、大部分の細胞型において相対的に低い頻度で生じる。本開示の多くの実施形態では、ＮＨＥＪが修復オペラントとして利用される。
【0071】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）エンドヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するが、他のＣａｓ９相同体が使用され得る。本明細書に記載されているように、野生型Ｃａｓ９が使用され得るか、又はＣａｓ９の改変されたバージョンが使用され得る（例えば、Ｃａｓ９の発展させたバージョン又はＣａｓ９オルソログ若しくは変異体）ことを理解すべきである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、（クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの）Ｃｐｆ１等の別のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと置き換えられ得る。
【0072】
ガイドＲＮＡ
本開示は、会合したポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の標的核酸内の特定の標的配列に対する活性を誘導し得るゲノム標的化核酸を提供する。このゲノム標的化核酸は、ＲＮＡであり得る。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書では「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列及びＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列を含む。ＩＩ型システムにおいて、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして、二重鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ｃｒＲＮＡは、二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は、部位特異的ポリペプチドに結合し、その結果、ガイドＲＮＡ及び部位特異的ポリペプチドは、複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、その部位特異的ポリペプチドとの会合により、複合体に標的特異性をもたらす。そのため、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を誘導する。
本開示は、会合したポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の標的核酸内の特定の標的配列に対する活性を誘導し得るゲノム標的化核酸を提供する。このゲノム標的化核酸は、ＲＮＡであり得る。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書では「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列及びＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列を含む。ＩＩ型システムにおいて、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして、二重鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ｃｒＲＮＡは、二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は、部位特異的ポリペプチドに結合し、その結果、ガイドＲＮＡ及び部位特異的ポリペプチドは、複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、その部位特異的ポリペプチドとの会合により、複合体に標的特異性をもたらす。そのため、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を誘導する。
【0073】
当業者に理解されているように、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサー配列を含むように設計されている。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６－８２１（２０１２）及びＤｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２－６０７（２０１１）を参照されたい。
【0074】
いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、単一分子ガイドＲＮＡである。
【0075】
二重分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの２つの鎖を含む。第１の鎖は、５’から３’の方向に、任意選択的なスペーサー延長配列、スペーサー配列及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択的なｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。
【0076】
ＩＩ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’の方向に、任意選択的なスペーサー延長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択的なｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。任意選択的なｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、ガイドＲＮＡに追加の機能性（例えば、安定性）に付与する要素を含み得る。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結して、ヘアピン構造を形成する。任意選択的なｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、１つ又は複数のヘアピンを含む。
【0077】
Ｖ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と称される）は、５’から３’の方向に、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びスペーサー配列を含む。
【0078】
ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個未満のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個超のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に１７～３０個のヌクレオチドを有する可変長スペーサー配列を含み得る（表３を参照されたい）。
【0079】
ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含み得ない。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１個又は複数のウラシルを含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１個のウラシル（Ｕ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に２個のウラシル（ＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に３個のウラシル（ＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に４個のウラシル（ＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に５個のウラシル（ＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に６個のウラシル（ＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に７個のウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に８個のウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。
【0080】
ｓｇＲＮＡは、改変され得ないか又は改変され得る。例えば、改変されたｓｇＲＮＡは、１つ又は複数の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。
【0081】
【表3】
【0082】
実例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／Ｃｐｆ１システムで使用されるガイドＲＮＡ又は他のより小さいＲＮＡは、下記で説明されており且つ当技術分野で説明されているように、化学的手段により容易に合成され得る。化学合成方法が拡大し続けている一方、ポリヌクレオチドの長さが百数十ヌクレオチドを超えて大幅に長くなると、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＰＡＧＥ等のゲルの使用を回避する）等の方法によるそのようなＲＮＡの精製は、より難しくなる傾向がある。比較的長いＲＮＡを生成するために使用される１つの手法は、一緒に連結される２つ以上の分子を生成することである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするもの等のはるかに長いＲＮＡは、より容易に酵素的に生成される。当技術分野で説明されているように、様々な種類のＲＮＡ改変（例えば、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性若しくは程度を低減し、且つ／又は他の特質を増強する改変）がＲＮＡの化学合成及び／又は酵素的生成中又は後に導入され得る。
【0083】
スペーサー配列
ｇＲＮＡは、スペーサー配列を含む。スペーサー配列は、目的の標的核酸の標的配列（例えば、ゲノム標的配列等のＤＮＡ標的配列）を定義する配列（例えば、２０個のヌクレオチドの配列）である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１５～３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０個のヌクレオチドである。
ｇＲＮＡは、スペーサー配列を含む。スペーサー配列は、目的の標的核酸の標的配列（例えば、ゲノム標的配列等のＤＮＡ標的配列）を定義する配列（例えば、２０個のヌクレオチドの配列）である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１５～３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０個のヌクレオチドである。
【0084】
「標的配列」は、ＰＡＭ配列に隣接しており、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）により改変された配列である。「標的核酸」は、下記の二重鎖分子である：一方の鎖は、標的配列を含み且つ「ＰＡＭ鎖」と呼ばれ、他方の相補鎖は、「非ＰＡＭ鎖」と呼ばれる。当業者は、ｇＲＮＡスペーサー配列が、目的の標的核酸の非ＰＡＭ鎖に位置する標的配列の逆相補鎖にハイブリダイズすることを認識している。そのため、ｇＲＮＡスペーサー配列は、標的配列のＲＮＡ均等物である。例えば、標的配列が５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ－３’（配列番号１０４）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ－３’（配列番号１０５）である。ｇＲＮＡのスペーサーは、ハイブリダイゼーション（即ち塩基対形成）を介して配列特異的な様式で目的の標的核酸と相互作用する。そのため、スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の標的配列に依存して変化する。
【0085】
本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、スペーサー配列は、このシステムで使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの５’に位置する標的核酸の領域にハイブリダイズするように設計されている。このスペーサーは、標的配列と完全に一致し得るか、又はミスマッチを有し得る。各Ｃａｓ９酵素は、標的ＤＮＡ中で認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、標的核酸において、配列５’－ＮＲＧ－３’（ここで、Ｒは、Ａ又はＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列により標的化される標的核酸配列の３’の直近にある）を含むＰＡＭを認識する。
【0086】
いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、２０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個超のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はより多くのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はより多くのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドの５’の直近に２０個の塩基を含む。例えば、
を含む配列において、標的核酸は、Ｎ（複数）（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、下線が引かれたＮＲＧ配列は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＰＡＭである）に対応する配列を含む。
【化1】
【0087】
本明細書に記載されているように使用され得るｇＲＮＡの非限定的な例は、表４及び２０１８年５月１１日に出願されたＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０３２３３４号明細書に示されている。
【0088】
【表4】
【0089】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞
キメラ抗原受容体は、腫瘍細胞により発現された抗原を認識して結合するように操作されている人工の免疫細胞受容体を指す。一般に、ＣＡＲは、Ｔ細胞用に設計されており、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のシグナル伝達ドメイン及び抗原認識ドメイン（例えば、抗体の一本鎖断片（ｓｃＦｖ）又は他の抗体断片）のキメラである（Ｅｎｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；２６（８）：４９８－５０５）。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞と呼ばれている。ＣＡＲは、ＭＨＣに制限されない様式において、選択された標的に対するＴ細胞の特異性及び反応性を再指示する能力を有する。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングに非依存的な抗原を認識する能力を与え、それにより腫瘍エスケープの主要な機構をバイパスする。さらに、Ｔ細胞中で発現される場合、ＣＡＲは、内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖及びベータ鎖と有利に二量体化しない。
キメラ抗原受容体は、腫瘍細胞により発現された抗原を認識して結合するように操作されている人工の免疫細胞受容体を指す。一般に、ＣＡＲは、Ｔ細胞用に設計されており、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のシグナル伝達ドメイン及び抗原認識ドメイン（例えば、抗体の一本鎖断片（ｓｃＦｖ）又は他の抗体断片）のキメラである（Ｅｎｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；２６（８）：４９８－５０５）。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞と呼ばれている。ＣＡＲは、ＭＨＣに制限されない様式において、選択された標的に対するＴ細胞の特異性及び反応性を再指示する能力を有する。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングに非依存的な抗原を認識する能力を与え、それにより腫瘍エスケープの主要な機構をバイパスする。さらに、Ｔ細胞中で発現される場合、ＣＡＲは、内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖及びベータ鎖と有利に二量体化しない。
【0090】
４つの世代のＣＡＲが存在し、その各々は、異なる構成要素を含む。第一世代のＣＡＲは、抗体に由来するｓｃＦｖを、ヒンジ及び膜貫通ドメインを介してＴ細胞受容体のＣＤ３ゼータ（ζ又はｚ）細胞内シグナル伝達ドメインに連結する。第二世代のＣＡＲは、追加のドメイン（例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）又はＩＣＯＳ）を組み込んで、共刺激シグナルを供給する。第三世代のＣＡＲは、ＴＣＲ ＣＤ３ζ鎖と融合した２つの共刺激ドメインを含む。第三世代の共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ又はＯＸ４０の組合せを含み得る。ＣＡＲは、いくつかの実施形態では、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に一般に由来する外部ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）、ヒンジ、膜貫通ドメイン並びにＣＤ３ζ及び／又は共刺激分子に由来する１つ（第一世代）、２つ（第二世代）又は３つ（第三世代）のシグナル伝達ドメインを有する内部ドメインを含む（Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２５（２６）：４０１７－４０２３；Ｋａｋａｒｌａ ａｎｄ Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１４；２０（２）：１５１－１５５）。
【0091】
ＣＡＲは、典型的には、その機能特性が異なる。Ｔ細胞受容体のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、結合される場合、Ｔ細胞の増殖を活性化及び誘発するが、アネルギー（身体の防御機構による反応の欠如、末梢リンパ球寛容の直接的な誘発をもたらす）を引き起こす可能性がある。リンパ球は、特定の抗原に応答できない場合、アネルギー性であるとみなされる。第二世代のＣＡＲにおける共刺激ドメインの付加は、改変Ｔ細胞の複製能及び持続を向上させた。同様の抗腫瘍効果は、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ ＣＡＲによりインビトロで観察されるが、前臨床インビボ研究は、４－１ＢＢ ＣＡＲが優れた増殖及び／又は持続をもたらし得ることを示唆する。臨床試験は、これらの第二世代のＣＡＲの両方がインビボで実質的なＴ細胞増殖を誘発し得ることを示唆するが、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含むＣＡＲは、より長く持続するように見える。第三世代のＣＡＲは、効力を増強する複数のシグナル伝達ドメイン（共刺激）を組み合わせる。
【0092】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、第一世代のＣＡＲである。他の実施形態では、キメラ抗原受容体は、第二世代のＣＡＲである。さらに他の実施形態では、キメラ抗原受容体は、第三世代のＣＡＲである。
【0093】
ＣＡＲは、いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ等の抗体）、膜貫通ドメイン及び細胞質（内）ドメインを含む細胞外（外部）ドメインを含む。
【0094】
外部ドメイン
外部ドメインは、細胞外の体液に曝されるＣＡＲの領域であり、且ついくつかの実施形態では抗原結合ドメイン並びに任意選択的なシグナルペプチド、スペーサードメイン及び／又はヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、短いリンカーペプチドと連結した免疫グロブリンのＶＬ及びＶＨを含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。リンカーは、いくつかの実施形態では、可動性のための一続きのグリシン及びセリン並びに可溶性を加えるための一続きのグルタミン酸塩及びリシンと共に親水性残基を含む。一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、実際には抗体の断片ではないが、代わりに、１０～約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドと連結した免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可動性のためにグリシンに富み、溶解性のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか又はその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖを生成するために使用され得るＶＨタンパク質配列及びＶＬタンパク質配列の非限定的な例として、配列番号５５、６９、７６又は８３のアミノ酸配列（ＶＨ）及び配列番号５６、７０、７７又は８３のアミノ酸配列（ＶＬ）が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、本開示のｓｃＦｖは、ヒト化されている。他の実施形態では、ｓｃＦｖは、完全ヒトである。さらに他の実施形態では、ｓｃＦｖは、キメラ（例えば、マウス及びヒト配列）である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖである（ＰＴＫ７に特異的に結合する）。本明細書に記載されているように使用され得る抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖタンパク質の非限定的な例として、配列番号５４、６８、７５、８２のいずれか１つのアミノ酸配列が挙げられ得る。他のｓｃＦｖタンパク質が使用され得る。
外部ドメインは、細胞外の体液に曝されるＣＡＲの領域であり、且ついくつかの実施形態では抗原結合ドメイン並びに任意選択的なシグナルペプチド、スペーサードメイン及び／又はヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、短いリンカーペプチドと連結した免疫グロブリンのＶＬ及びＶＨを含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。リンカーは、いくつかの実施形態では、可動性のための一続きのグリシン及びセリン並びに可溶性を加えるための一続きのグルタミン酸塩及びリシンと共に親水性残基を含む。一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、実際には抗体の断片ではないが、代わりに、１０～約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドと連結した免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可動性のためにグリシンに富み、溶解性のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか又はその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖを生成するために使用され得るＶＨタンパク質配列及びＶＬタンパク質配列の非限定的な例として、配列番号５５、６９、７６又は８３のアミノ酸配列（ＶＨ）及び配列番号５６、７０、７７又は８３のアミノ酸配列（ＶＬ）が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、本開示のｓｃＦｖは、ヒト化されている。他の実施形態では、ｓｃＦｖは、完全ヒトである。さらに他の実施形態では、ｓｃＦｖは、キメラ（例えば、マウス及びヒト配列）である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖである（ＰＴＫ７に特異的に結合する）。本明細書に記載されているように使用され得る抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖタンパク質の非限定的な例として、配列番号５４、６８、７５、８２のいずれか１つのアミノ酸配列が挙げられ得る。他のｓｃＦｖタンパク質が使用され得る。
【0095】
シグナルペプチドは、ＣＡＲ結合の抗原特異性を増強し得る。シグナルペプチドは、抗体（例えば、限定されないが、ＣＤ８）及びエピトープタグ（例えば、限定されないが、ＧＳＴ又はＦＬＡＧ）に由来し得る。シグナルペプチドの例として、ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１０６）及びＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号９３）が挙げられる。他のシグナルペプチドが使用され得る。
【0096】
いくつかの実施形態では、スペーサードメイン又はヒンジドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメイン（抗原結合ドメインを含む）と膜貫通ドメインとの間に位置するか、又はＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する。スペーサードメインは、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖中の細胞外ドメイン及び／又は細胞質ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドである。ヒンジドメインは、ＣＡＲ若しくはそのドメインに可動性をもたらすか、又はＣＡＲ若しくはそのドメインの立体障害を妨げるように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドである。いくつかの実施形態では、スペーサードメイン又はヒンジドメインは、最大で３００個のアミノ酸（例えば、１０～１００個のアミノ酸又は５～２０個のアミノ酸）を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のスペーサードメインがＣＡＲの他の領域に含まれ得る。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインである。他のヒンジドメインが使用され得る。
【0097】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜をまたがる疎水性アルファヘリックスである。膜貫通ドメインは、ＣＡＲの安定性をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。さらに他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン及びＣＤ２８膜貫通ドメインのキメラである。他の膜貫通ドメインが、本明細書に記載されているように使用され得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン：
である。他の膜貫通ドメインが使用され得る。
膜貫通ドメインは、膜をまたがる疎水性アルファヘリックスである。膜貫通ドメインは、ＣＡＲの安定性をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。さらに他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン及びＣＤ２８膜貫通ドメインのキメラである。他の膜貫通ドメインが、本明細書に記載されているように使用され得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン：
【化2】
【0098】
内部ドメイン
内部ドメインは、受容体の機能的な末端である。抗原認識後、受容体クラスター及びシグナルは、細胞に伝達される。最も一般的に使用される内部ドメインの構成要素は、ＣＤ３－ゼータであり、このＣＤ３－ゼータは、３つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。これは、抗原が結合した後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。多くの場合、ＣＤ３－ゼータは、十分に能力のある活性化シグナルをもたらさない場合があり、そのため、共刺激シグナル伝達が使用される。例えば、ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢが、ＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ζ）と共に使用されて、増殖／生存シグナルを伝達し得る。そのため、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲの共刺激分子は、ＣＤ２８共刺激分子である。他の実施形態では、この共刺激分子は、４－１ＢＢ共刺激分子である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８を含む。他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３－ゼータ及び４－１ＢＢを含む。さらに他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８及び４－１ＢＢを含む。表５には、本明細書に記載されているように使用され得るシグナル伝達分子の例が記載されている。
内部ドメインは、受容体の機能的な末端である。抗原認識後、受容体クラスター及びシグナルは、細胞に伝達される。最も一般的に使用される内部ドメインの構成要素は、ＣＤ３－ゼータであり、このＣＤ３－ゼータは、３つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。これは、抗原が結合した後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。多くの場合、ＣＤ３－ゼータは、十分に能力のある活性化シグナルをもたらさない場合があり、そのため、共刺激シグナル伝達が使用される。例えば、ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢが、ＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ζ）と共に使用されて、増殖／生存シグナルを伝達し得る。そのため、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲの共刺激分子は、ＣＤ２８共刺激分子である。他の実施形態では、この共刺激分子は、４－１ＢＢ共刺激分子である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８を含む。他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３－ゼータ及び４－１ＢＢを含む。さらに他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８及び４－１ＢＢを含む。表５には、本明細書に記載されているように使用され得るシグナル伝達分子の例が記載されている。
【0099】
【表5】
【0100】
抗体
抗体（複数の形態で互換的に使用される）は、免疫グロブリン分子であって、この免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合し得る免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、インタクトな（即ち完全長）モノクローナル抗体だけでなく、抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダＶＨＨ抗体又はラマＶＨＨ抗体）、多重特異性抗体（例えば、二重特性抗体）並びに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント及び共有結合的に修飾された抗体等、要求される特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された配置も包含する。
抗体（複数の形態で互換的に使用される）は、免疫グロブリン分子であって、この免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合し得る免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、インタクトな（即ち完全長）モノクローナル抗体だけでなく、抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダＶＨＨ抗体又はラマＶＨＨ抗体）、多重特異性抗体（例えば、二重特性抗体）並びに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント及び共有結合的に修飾された抗体等、要求される特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された配置も包含する。
【0101】
典型的な抗体分子は、抗原結合に通常関与する重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。抗原結合に関与するこれらの領域／残基は、当技術分野で既知の方法により、参照抗体（例えば、本明細書で説明されている抗ＰＴＫ７抗体）のＶＨ／ＶＬ配列のアミノ酸配列から同定され得る。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）として既知である、より保存されている領域が挿入された、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）としても既知である超可変領域にさらに細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、典型的には、下記の順でアミノ末端からカルボキシ末端に整列された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、当技術分野で既知の方法論を使用して、例えば全てが当技術分野で公知であるＫａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義及び／又はｃｏｎｔａｃｔ定義により、正確に同定され得る。本明細書で使用される場合、ＣＤＲは、当技術分野で既知の任意の方法により定義されたＣＤＲを指し得る。同一のＣＤＲを有する２つの抗体は、これら２つの抗体が、同一の方法により決定されたＣＤＲと同じアミノ酸配列を有することを意味する。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７，Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８；及びＡｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２－１４３（２００４）を参照されたい。ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ及びｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓも参照されたい。
【0102】
いくつかの実施形態では、抗体は、抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖ等のｓｃＦｖである。抗体は、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ若しくはＩｇＭ（又はこれらのサブクラス）等の任意のクラスの抗体を含み、且つ抗体は、いずれかの特定のクラスのものである必要はない。重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、各種クラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには、下記の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）にさらに分類され得、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。免疫グロブリンの各種クラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ及びミューと呼ばれる。免疫グロブリンの各種クラスのサブユニット構造及び三次元配置は、公知である。
【0103】
本明細書に記載されているように使用される抗体は、マウス、ラット、ヒト又は任意の他の起源（キメラ抗体若しくはヒト化抗体を含む）であり得る。いくつかの例では、抗体は、免疫学的に不活性である（例えば、補体に媒介される溶解を誘発しないか、又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない）定常領域等の改変された定常領域を含む。
【0104】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はこれらの抗原結合断片である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する、マウス、ラット又はウサギ等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基に置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見出されないが、抗体性能をさらに洗練させ且つ最適化するために含まれる残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、且つ全て又は実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである少なくとも１つ（典型的には２つ）の可変ドメインを実質的に全て含むことになる。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域又はドメイン（Ｆｃ））の少なくとも一部も含むことになる。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体からの１つ又は複数のＣＤＲに「由来する」１つ又は複数のＣＤＲとも呼ばれる、元の抗体に関して改変されている１つ又は複数のＣＤＲ（１、２、３、４、５又は６つ）を有する。ヒト化抗体は、親和性成熟も伴い得る。
【0105】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒト抗体由来の重定常領域及び軽定常領域を含み得るキメラ抗体である。キメラ抗体は、第１の種に由来する可変領域又は可変領域の部分と、第２の種に由来する定常領域とを有する抗体を指す。典型的には、このキメラ抗体において、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ及びラット等の非ヒト哺乳動物）の１つの種に由来する抗体の可変領域を模倣するが、定常部分は、ヒト等の別の哺乳動物に由来する抗体における配列と相同である。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、可変領域及び／又は定常領域においてなされ得る。
【0106】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒトＰＴＫ７等の標的抗原に特異的に結合する。標的又はエピトープに「特異的に結合する」（本明細書では互換的に使用される）抗体は、当技術分野でよく理解されている用語であり、そのような特異的な結合を決定する方法も当技術分野でよく知られている。分子は、代替の標的よりも特定の標的抗原とより頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、且つ／又はより高い親和性で反応又は会合する場合、「特異的な結合」を示すと言われる。抗体は、他の基質に結合するよりも、より高い親和性で、より高い結合活性で、より迅速に、且つ／又はより長い持続時間で結合する場合、標的抗原に「特異的に結合する」。例えば、ＰＴＫ７エピトープに特異的に（又は優先的に）結合する抗体は、他のＰＴＫ７エピトープ又は非ＰＴＫ７エピトープに結合するよりも、より高い親和性で、より高い結合活性で、より迅速に、且つ／又はより長い持続時間でこのＰＴＫ７エピトープに結合する抗体である。これは、例えば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体が、第２の標的抗原に特異的又は優先的に結合し得るか又はし得ないというこの定義を読むことによっても理解される。そのため、「特異的な結合」又は「優先的な結合」は、必ずしも排他的結合を（含むことはできるが）必要とするものではない。一般に、必ずしもそうではないが、結合への参照は、優先的な結合を意味する。
【0107】
いくつかの実施形態では、抗体とＰＴＫ７との間の平衡解離定数（ＫＤ）は、１００ｐＭ～１μＭである。いくつかの実施形態では、抗体とＰＴＫ７との間のＫＤは、１ｎＭ～１００ｎＭである。
【0108】
本明細書で開示されている例示的な抗体のいずれかの機能的バリアントも本開示の範囲内である。機能的バリアントは、参照抗体を基準として、ＶＨ及び／若しくはＶＬにおいて又はＶＨ ＣＤＲの１つ若しくは複数及び／又はＶＬ ＣＤＲの１つ若しくは複数において、１つ又は複数のアミノ酸残基の変異を含み得るが、この参照抗体と実質的に同様の結合活性及び生物学的活性（例えば、実質的に同様の結合親和性、結合特異性、阻害活性、抗腫瘍活性又はこれらの組合せ）を保持している。
【0109】
いくつかの例では、本明細書で開示されている抗体は、抗体Ａ（ＶＨ：配列番号５５；ＶＬ：配列番号５６）等の参照抗体のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３と比較して、１０個以下のアミノ酸変異（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は１個以下のアミノ酸変異）を合わせて含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含む。「合わせて」は、３つのＶＨ ＣＤＲの全てにおけるアミノ酸変異の総数が、既定の範囲内であることを意味する。代わりに又は加えて、抗体は、参照抗体のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３と比較して、１０個以下のアミノ酸変異（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸変異）を合わせて含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含み得る。
【0110】
いくつかの例では、本明細書で開示されている抗体は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含み得、これらの少なくとも１つは、抗体Ａ（ＶＨ：配列番号５５；ＶＬ：配列番号５６）等の参照抗体の対応物のＶＨ ＣＤＲのように、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２又は１個以下のアミノ酸変異）を含む。特定の例では、抗体は、抗体Ａ（ＶＨ：配列番号５５；ＶＬ：配列番号５６）等の参照抗体のＶＨ ＣＤＲ３のように、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２又は１個以下のアミノ酸変異）を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む。代わりに又は加えて、抗体は、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含み得、これらの少なくとも１つは、参照抗体の対応物のＶＬ ＣＤＲのように、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２又は１個以下のアミノ酸変異）を含む。特定の例では、抗体は、参照抗体のＶＬ ＣＤＲ３のように、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２又は１個以下のアミノ酸変異）を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0111】
場合により、アミノ酸残基の変異は、保存的なアミノ酸残基置換であり得る。本明細書で使用される場合、「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされるタンパク質の相対的な電荷又はサイズの特徴を変えないアミノ酸置換を指す。バリアントは、そのような方法をまとめた参考文献、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出されるような、当業者に既知のポリペプチド配列を改変するための方法に従って調製され得る。アミノ酸の保存的置換として、下記の群内のアミノ酸の中でなされる置換が挙げられる：（ａ）Ａ→Ｇ、Ｓ；（ｂ）Ｒ→Ｋ、Ｈ；（ｃ）Ｎ→Ｑ、Ｈ；（ｄ）Ｄ→Ｅ、Ｎ；（ｅ）Ｃ→Ｓ、Ａ；（ｆ）Ｑ→Ｎ；（ｇ）Ｅ→Ｄ、Ｑ；（ｈ）Ｇ→Ａ；（ｉ）Ｈ→Ｎ、Ｑ；（ｊ）Ｉ→Ｌ、Ｖ；（ｋ）Ｌ→Ｉ、Ｖ；（ｌ）Ｋ→Ｒ、Ｈ；（ｍ）Ｍ→Ｌ、Ｉ、Ｙ；（ｎ）Ｆ→Ｙ、Ｍ、Ｌ；（ｏ）Ｐ→Ａ；（ｐ）Ｓ→Ｔ；（ｑ）Ｔ→Ｓ；（ｒ）Ｗ→Ｙ、Ｆ；（ｓ）Ｙ→Ｗ、Ｆ；及び（ｔ）Ｖ→Ｉ、Ｌ。
【0112】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている抗体は、抗体Ａ（ＶＨ：配列番号５５；ＶＬ：配列番号５６）等の参照抗体のＶＨ ＣＤＲと合わせて少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％又は９８％）同一であるＶＨ ＣＤＲを含み得る。代わりに又は加えて、抗体は、参照抗体のＶＬ ＣＤＲと合わせて少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％又は９８％）同一であるＶＬ ＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体Ａ（ＶＨ：配列番号５５；ＶＬ：配列番号５６）等の参照抗体のＶＨと少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％若しくは９８％）同一であるＶＨ及び／又は参照抗体のＶＬと少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％若しくは９８％）同一であるＶＬを含み得る。
【0113】
ドナー鋳型
ＣＡＲをコードする核酸は、ドナー鋳型と本明細書で呼ばれる（ドナーポリヌクレオチドとも呼ばれる）ものを含むＴ細胞に送達され得る。ドナー鋳型は、目的のゲノム位置で効率的なＨＤＲを可能にする２つの相同な領域に隣接した、ＣＡＲをコードする核酸等の非相同配列を含み得る。いくつかの実施形態では、相同な領域は、配列番号９２又は１００のヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、非相同配列には、配列番号９２のヌクレオチド配列及び配列番号１００のヌクレオチド配列が隣接している。代わりに、ドナー鋳型は、ＤＮＡ中の標的化された位置と相同な領域を有しない場合があり、標的部位での切断後のＮＨＥＪ依存的末端連結により組み込まれ得る。
ＣＡＲをコードする核酸は、ドナー鋳型と本明細書で呼ばれる（ドナーポリヌクレオチドとも呼ばれる）ものを含むＴ細胞に送達され得る。ドナー鋳型は、目的のゲノム位置で効率的なＨＤＲを可能にする２つの相同な領域に隣接した、ＣＡＲをコードする核酸等の非相同配列を含み得る。いくつかの実施形態では、相同な領域は、配列番号９２又は１００のヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、非相同配列には、配列番号９２のヌクレオチド配列及び配列番号１００のヌクレオチド配列が隣接している。代わりに、ドナー鋳型は、ＤＮＡ中の標的化された位置と相同な領域を有しない場合があり、標的部位での切断後のＮＨＥＪ依存的末端連結により組み込まれ得る。
【0114】
ドナー鋳型は、一本鎖及び／又は二重鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであり得、直鎖状又は環状の形態で細胞に導入され得る。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法により（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つ又は複数のジデオキシヌクレオチド残基が直鎖状分子の３’末端に付加され、且つ／又は自己相補的オリゴヌクレオチドが一方又は両方の末端に連結される。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３；Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外来性のポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法として、末端アミノ基の付加並びに例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデート及びＯ－メチルリボース又はデオキシリボース残基等の修飾されたヌクレオチド間結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【0115】
ドナー鋳型は、例えば、複製開始点、プロモーター及び抗生物質耐性をコードする遺伝子等の追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナー鋳型は、裸の核酸として、リポソーム若しくはポロクサマー等の薬剤と複合体を形成した核酸として導入され得るか、又はウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））により送達され得る。
【0116】
ドナー鋳型は、いくつかの実施形態では、その発現が、組込み部位での在性プロモーター（即ちこのドナーが挿入される内在性遺伝子の発現を駆動するプロモーター）により駆動されるように挿入される。しかしながら、いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、外来性プロモーター及び／又はエンハンサー（例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーター）を含む。いくつかの実施形態では、内在性プロモーターは、配列番号１０１の配列を含むＥＦ１αプロモーターである。他のプロモーターが使用され得る。
【0117】
さらに、外来性配列は、転写制御配列又は翻訳制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列及び／又はポリアデニル化シグナル）も含み得る。
【0118】
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号６３、６４、７１、７８又は９１のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
【0119】
送達方法及びコンストラクト
ヌクレアーゼ及び／又はドナー鋳型は、ベクター系を使用して送達され得、このベクター系として、プラスミドベクター、ＤＮＡ小環、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター並びにこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
ヌクレアーゼ及び／又はドナー鋳型は、ベクター系を使用して送達され得、このベクター系として、プラスミドベクター、ＤＮＡ小環、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター並びにこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【0120】
従来のウイルス及び非ウイルス系遺伝子導入方法を使用して、細胞（例えば、Ｔ細胞）においてヌクレアーゼをコードする核酸及びドナー鋳型を導入し得る。非ウイルスベクター送達系として、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡ小環、裸の核酸及びリポソーム又はポロクサマー等の送達媒体と複合体を形成した核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系として、細胞に送達された後にエピソーム又は組込みゲノムのいずれかを有するＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスが挙げられる。
【0121】
核酸の非ウイルス送達の方法として、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、キャップ付きＲＮＡ、人工ビリオン及び薬剤で増強されたＤＮＡの取込みが挙げられる。例えば、ソニトロン２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも核酸の送達に使用され得る。
【0122】
アデノ随伴ウイルス送達
ＣＡＲコンストラクトをコードするドナー核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して細胞に送達され得る。ＡＡＶは、宿主ゲノムに部位特異的に組み込み、従ってＣＡＲ等の導入遺伝子を送達し得る小型のウイルスである。逆位末端配列（ＩＴＲ）は、ＡＡＶゲノム及び／又は目的の導入遺伝子に隣接して存在し、複製開始点として機能する。また、ＡＡＶゲノムには、転写された場合にＡＡＶゲノムをカプセル化して標的細胞に送達するためのカプシドを形成するｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質も存在する。これらのカプシド上の表面受容体は、ＡＡＶに血清型を付与し、カプシドが主にどの標的臓器に結合するかを決定し、そのため、ＡＡＶが最も効率的に感染することになる細胞を決定する。現在知られているヒトＡＡＶの血清型は、１２種類である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）である。
ＣＡＲコンストラクトをコードするドナー核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して細胞に送達され得る。ＡＡＶは、宿主ゲノムに部位特異的に組み込み、従ってＣＡＲ等の導入遺伝子を送達し得る小型のウイルスである。逆位末端配列（ＩＴＲ）は、ＡＡＶゲノム及び／又は目的の導入遺伝子に隣接して存在し、複製開始点として機能する。また、ＡＡＶゲノムには、転写された場合にＡＡＶゲノムをカプセル化して標的細胞に送達するためのカプシドを形成するｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質も存在する。これらのカプシド上の表面受容体は、ＡＡＶに血清型を付与し、カプシドが主にどの標的臓器に結合するかを決定し、そのため、ＡＡＶが最も効率的に感染することになる細胞を決定する。現在知られているヒトＡＡＶの血清型は、１２種類である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）である。
【0123】
アデノ随伴ウイルスは、いくつかの理由のために遺伝子療法に最も頻繁に使用されるウイルスの１つである。第一に、ＡＡＶは、ヒトを含む哺乳動物への投与時に免疫応答を誘発しない。第二に、ＡＡＶは、特に適切なＡＡＶ血清型を選択することを考慮する場合、標的細胞に効率的に送達される。最後に、ＡＡＶは、ゲノムが組込みを伴わずに宿主細胞において存続し得ることから、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力を有する。この形質により、ＡＡＶは、遺伝子療法の理想的な候補となる。
【0124】
相同組換え修復（ＨＤＲ）
ＣＡＲをコードするドナー核酸は、相同組換え修復（ＨＤＲ）により標的遺伝子座位に挿入される。標的座位でのＤＮＡの両方の鎖がＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素により切断される。次いで、ＨＤＲが発生して、二重鎖切断（ＤＳＢ）を修復し、ドナーＤＮＡを挿入する。これが正しく発生させるために、ドナー配列は、標的遺伝子のＤＳＢ部位を取り囲む配列に相補的な隣接している残基（以下では「相同性アーム」）を有するように設計されている。これらの相同性アームは、ＤＳＢ修復のための鋳型として機能し、本質的に誤りのない機構であるＨＤＲを可能にする。相同組換え修復（ＨＤＲ）の割合は、変異部位と切断部位との間の距離の関数であり、そのため、重複しているか又は近くの標的部位を選択することが重要である。鋳型は、相同領域に隣接した余分な配列を含み得るか、又はゲノム配列と異なる配列を含み得、そのため、配列編集が可能になる。
ＣＡＲをコードするドナー核酸は、相同組換え修復（ＨＤＲ）により標的遺伝子座位に挿入される。標的座位でのＤＮＡの両方の鎖がＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素により切断される。次いで、ＨＤＲが発生して、二重鎖切断（ＤＳＢ）を修復し、ドナーＤＮＡを挿入する。これが正しく発生させるために、ドナー配列は、標的遺伝子のＤＳＢ部位を取り囲む配列に相補的な隣接している残基（以下では「相同性アーム」）を有するように設計されている。これらの相同性アームは、ＤＳＢ修復のための鋳型として機能し、本質的に誤りのない機構であるＨＤＲを可能にする。相同組換え修復（ＨＤＲ）の割合は、変異部位と切断部位との間の距離の関数であり、そのため、重複しているか又は近くの標的部位を選択することが重要である。鋳型は、相同領域に隣接した余分な配列を含み得るか、又はゲノム配列と異なる配列を含み得、そのため、配列編集が可能になる。
【0125】
標的遺伝子は、対象での免疫応答と関連し得、ここで、標的遺伝子の少なくとも一部を持続的に欠失させることは、免疫応答を調節することになる。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために、標的遺伝子は、ＴＣＲα定常領域（ＴＲＡＣ）であり得る。ＴＲＡＣの破壊は、内在性ＴＣＲの機能の喪失をもたらす。
【0126】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、セーフハーバー座位に存在する。
【0127】
操作されたＴ細胞
本開示の操作された（遺伝子編集された）ＣＡＲ Ｔ細胞は、自己由来（「自己」）又は非自己由来（「非自己」、例えば異質遺伝子型、同一遺伝子又は異種）であり得る。「自己由来」は、同じ対象からの細胞を指す。「異質遺伝子型」は、対象と同じ種であるが、対象中の細胞と遺伝的に異なる細胞を指す。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、哺乳動物対象から得られる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ヒト対象から得られる。
本開示の操作された（遺伝子編集された）ＣＡＲ Ｔ細胞は、自己由来（「自己」）又は非自己由来（「非自己」、例えば異質遺伝子型、同一遺伝子又は異種）であり得る。「自己由来」は、同じ対象からの細胞を指す。「異質遺伝子型」は、対象と同じ種であるが、対象中の細胞と遺伝的に異なる細胞を指す。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、哺乳動物対象から得られる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ヒト対象から得られる。
【0128】
Ｔ細胞を、いくつかの供給源から得ることができ、この供給源として、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態では、Ｔ細胞を、遠心沈降（例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離）等の当業者に既知の任意の数の技術を使用して、対象から回収される血液の単位から得ることができる。
【0129】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の単離された集団が使用される。いくつかの実施形態では、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離後、細胞傷害性及びヘルパーＴリンパ球の両方は、活性化、増殖及び／又は遺伝的改変前又は後のいずれかでナイーブ、メモリー及びエフェクターＴ細胞亜集団に分別され得る。
【0130】
下記の細胞表面マーカー：ＴＣＲａｂ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１２２、ＣＤ９５、ＣＤ１９７、ＣＣＲ７、ＫＬＲＧ１、ＭＣＨ－Ｉタンパク質及び／又はＭＣＨ－ＩＩタンパク質の１つ又は複数を発現するＴ細胞の特定の亜集団が陽性又は陰性選択手法によってさらに単離され得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲａｂ、ＣＤ４及び／又はＣＤ８からなる群から選択されるマーカーの１つ又は複数を発現するＴ細胞の特定の亜集団は、陽性又は陰性選択手法によりさらに単離される。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞集団は、下記のマーカー：ＣＤ７０、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＨΜ３及びＬＡＧ３の１つ又は複数を発現しないか又は実質的に発現しない。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の亜集団は、遺伝子操作前及び／又は遺伝子操作後に陽性又は陰性選択により単離され得る。
【0131】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の単離された集団は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されないマーカーの１つ又は複数を発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、対象から単離され、遺伝子編集を受ける前に、最初に活性化されてインビトロで増殖するように刺激される。
【0132】
Ｔ細胞組成物の十分な治療用量を実現するために、Ｔ細胞は、１回又は複数回の刺激、活性化及び／又は増殖にかけられる場合が多い。Ｔ細胞は、一般に、例えば米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；及び同第６，８６７，０４１号明細書で説明されているような方法を使用して、活性化されて増殖され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ゲノム編集組成物のＴ細胞への導入前に約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約３日、約２日～約４日、約３日～約４日又は約１日、約２日、約３日若しくは約４日にわたり活性化されて増殖される。
【0133】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、遺伝子編集組成物のＴ細胞への導入前に約４時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間又は約７２時間にわたり活性化されて増殖される。
【0134】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ゲノム編集組成物がＴ細胞に導入されるのと同時に活性化される。
【0135】
同様に提供されるのは、本明細書で説明されている操作されたＴ細胞の集団である。いくつかの実施形態では、この集団の操作されたＴ細胞の少なくとも２５％～１００％は、ＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、この集団の操作されたＴ細胞の少なくとも２５％又は少なくとも５０％は、ＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、この集団の操作されたＴ細胞の少なくとも７０％は、ＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、この集団の操作されたＴ細胞の少なくとも２５％は、少なくとも７日間又は少なくとも１４日間のインビトロでの増殖後にＣＡＲを発現する。
【0136】
処置方法及び組成物
本明細書で提供されるのは、いくつかの実施形態では、癌（例えば、固形腫瘍）を処置する方法である。本明細書に記載されているように処置され得る固形腫瘍の非限定的な例として、下記が挙げられる：膵癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫、神経細胞、軟部肉腫及び／又は黒色腫。いくつかの実施形態では、この癌は、下記からなる群から選択される：膵癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫、神経細胞、軟部肉腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、結腸癌、結腸腺癌、脳膠芽腫、肝細胞癌、肝臓胆管癌、骨肉腫、胃癌、食道扁平上皮癌、進行期の膵癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺小細胞癌、腎癌及び肝内胆道癌。いくつかの実施形態では、この方法は、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、抗Ｐｔｋ７ ＣＡＲ Ｔ細胞）を、癌（例えば、固形腫瘍）を有する対象に送達することであって、この癌として、膵癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫及び／又は黒色腫が挙げられる、送達することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、本開示のＣＡＴ Ｔ細胞（例えば、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞）を、白血病又はリンパ腫（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞の白血病又はリンパ腫）を有する対象に送達することを含む。白血病の非限定的な例として、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が挙げられる。
本明細書で提供されるのは、いくつかの実施形態では、癌（例えば、固形腫瘍）を処置する方法である。本明細書に記載されているように処置され得る固形腫瘍の非限定的な例として、下記が挙げられる：膵癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫、神経細胞、軟部肉腫及び／又は黒色腫。いくつかの実施形態では、この癌は、下記からなる群から選択される：膵癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫、神経細胞、軟部肉腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、結腸癌、結腸腺癌、脳膠芽腫、肝細胞癌、肝臓胆管癌、骨肉腫、胃癌、食道扁平上皮癌、進行期の膵癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺小細胞癌、腎癌及び肝内胆道癌。いくつかの実施形態では、この方法は、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、抗Ｐｔｋ７ ＣＡＲ Ｔ細胞）を、癌（例えば、固形腫瘍）を有する対象に送達することであって、この癌として、膵癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫及び／又は黒色腫が挙げられる、送達することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、本開示のＣＡＴ Ｔ細胞（例えば、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞）を、白血病又はリンパ腫（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞の白血病又はリンパ腫）を有する対象に送達することを含む。白血病の非限定的な例として、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が挙げられる。
【0137】
投与する工程は、所望の効果がもたらされるように、腫瘍等の所望の部位での導入細胞の少なくとも部分的な局在をもたらす方法又は経路による、対象への細胞（例えば、操作されたＴ細胞）の配置（例えば、移植）を含み得る。操作されたＴ細胞を、移植された細胞又はこの細胞の構成要素の少なくとも一部が生存したままである対象における所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路により投与し得る。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間（例えば、２４時間）という短い期間から、数日、数年又はさらに対象の寿命（即ち長期の生着）までであり得る。例えば、本明細書で説明されているいくつかの態様では、有効量の操作されたＴ細胞を、腹腔内又は静脈内経路等の全身性の投与経路を介して投与する。
【0138】
対象は、診断、処置又は治療が望まれている任意の対象であり得る。いくつかの実施形態では、この対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、この対象は、ヒトである。
【0139】
ドナーは、処置されている対象ではない個体である。ドナーは、患者ではない個体である。いくつかの実施形態では、ドナーは、治療される癌を有しないか又は有すると疑われていない個体である。いくつかの実施形態では、複数のドナー（例えば、２例以上のドナー）が使用される。
【0140】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されている方法に従って投与される操作されたＴ細胞集団は、１つ又は複数のドナーから得られた異質遺伝子型のＴ細胞を含む。異質遺伝子型は、１つ又は複数の座位での遺伝子がレシピエントと同一ではない細胞、細胞集団又は同じ種の１つ又は複数の異なるドナーから得られた細胞を含む生体サンプルを指す。例えば、対象に投与される操作されたＴ細胞集団は、１つ若しくは複数の血縁ではないドナー又は１つ若しくは複数の同一ではない同胞に由来し得る。いくつかの実施形態では、遺伝的に同一のドナー（例えば、同一の双子）から得られたもの等の同一遺伝子の細胞集団が使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、自己細胞であり、即ち、操作されたＴ細胞は、対象から得られるか又は単離されて同じ対象に投与され、即ち、ドナー及びレシピエントは、同じである。
【0141】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されている方法に従って投与される操作されたＴ細胞集団は、対象中で毒性を誘発せず、例えば、この操作されたＴ細胞は、非癌細胞中で毒性を誘発しない。いくつかの実施形態では、投与される操作されたＴ細胞集団は、補体に媒介される溶解を誘発しないか、又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない。
【0142】
有効量は、医学的状態（例えば、癌）の少なくとも１つ又は複数の徴候又は症状を予防又は軽減するのに必要な操作されたＴ細胞の集団の量を指し、所望の効果をもたらすのに（例えば、医学的状態を有する対象を処置するのに）十分な量の組成物に関する。有効量として、疾患の症状の発症を予防するか若しくは遅らせるか、疾患の症状の経過を変える（例えば、限定されないが、疾患の症状の進行を遅くする）か、又は疾患の症状を逆転させるのに十分な量も挙げられる。任意の所与の場合に関して、適切な有効量は、当業者により通常の実験を使用して決定され得ることが理解される。
【0143】
本明細書で説明されている様々な態様での使用に関して、有効量の細胞（例えば、操作されたＴ細胞）は、少なくとも１０２個の細胞、少なくとも５×１０２個の細胞、少なくとも１０３個の細胞、少なくとも５×１０３個の細胞、少なくとも１０４個の細胞、少なくとも５×１０４個の細胞、少なくとも１０５個の細胞、少なくとも２×１０５個の細胞、少なくとも３×１０５個の細胞、少なくとも４×１０５個の細胞、少なくとも５×１０５個の細胞、少なくとも６×１０５個の細胞、少なくとも７×１０５個の細胞、少なくとも８×１０５個の細胞、少なくとも９×１０５個の細胞、少なくとも１×１０６個の細胞、少なくとも２×１０６個の細胞、少なくとも３×１０６個の細胞、少なくとも４×１０６個の細胞、少なくとも５×１０６個の細胞、少なくとも６×１０６個の細胞、少なくとも７×１０６個の細胞、少なくとも８×１０６個の細胞、少なくとも９×１０６個の細胞又はこれらの複合を含む。細胞は、１つ若しくは複数のドナーに由来するか、又は自己の供給源から得られる。本明細書で説明されているいくつかの例において、細胞は、それを必要とする対象への投与前に培養で増殖される。
【0144】
投与の様式として、注射、注入、点眼又は経口摂取が挙げられる。注射として、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内及び胸骨内注射及び注入が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、経路は、静脈内である。
【0145】
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞を、全身的に投与し、これは、標的の部位、組織又は臓器に直接的ではなく、代わりに対象の循環系に入り、それにより代謝及び他の同様の過程にかけられるような細胞の集団の投与を指す。
【0146】
医学的状態の処置のための組成物を含む処置の有効性は、熟達した臨床医により判定され得る。処置は、一例ではあるが、任意の１つ又は全ての徴候又は症状の機能的標的のレベルが有利な様式で変えられる（例えば、少なくとも１０％増加する）か、又は疾患（例えば、癌）の他の臨床的に認められている症状又はマーカーが改善されるか又は緩和される場合、「有効な処置」とみなされる。有効性は、入院又は医学的介入の必要性により評価された場合、対象が悪化しないことによっても測定され得る（例えば、疾患の進行が止まるか又は少なくとも遅くなる）。これらの指標を測定する方法は、当業者に既知であり、且つ／又は本明細書で説明されている。処置は、対象における疾患の任意の処置を含み、且つ（１）疾患を阻害すること、例えば症状の進行を止めるか若しくは遅くすること；又は（２）疾患を軽減すること、例えば症状の退行をもたらすこと；及び（３）症状の発症の可能性を予防するか若しくは減少させることを含む。
【0147】
本開示を下記の実施形態により例示する。
【0148】
実施形態１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む操作されたＴ細胞であって、ＣＡＲは、ＰＴＫ７に特異的に結合する外部ドメインを含む、操作されたＴ細胞。
【0149】
実施形態２．破壊されたＴ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子をさらに含む、実施形態１に記載の操作されたＴ細胞。
【0150】
実施形態３．ＣＡＲをコードする核酸は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子に挿入される、実施形態２に記載の操作されたＴ細胞。
【0151】
実施形態４．破壊されたベータ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子をさらに含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【0152】
実施形態５．ＣＡＲの外部ドメインは、抗ＰＴＫ７抗体を含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【0153】
実施形態６．抗ＰＴＫ７抗体は、抗ＰＴＫ７一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態５に記載の操作されたＴ細胞。
【0154】
実施形態７．抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、参照抗体と同じ重鎖可変ドメイン（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲを含み、参照抗体は、（ｉ）配列番号５５に記載のＶＨ及び配列番号５６に記載のＶＬ、（ｉｉ）配列番号６９に記載のＶＨ及び配列番号７０に記載のＶＬ、（ｉｉｉ）配列番号７６に記載のＶＨ及び配列番号７７に記載のＶＬ、又は（ｉｖ）配列番号８３に記載のＶＨ及び配列番号８４に記載のＶＬを含む、実施形態６に記載の操作されたＴ細胞。
【0155】
実施形態８．抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、参照抗体と同じＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む、実施形態７に記載の操作されたＴ細胞。
【0156】
実施形態９．抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、配列番号５４、６８、７５又は８２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態７に記載の操作されたＴ細胞。
【0157】
実施形態１０．ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は４１ＢＢ共刺激ドメインを含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【0158】
実施形態１１．ＣＡＲは、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含む、実施形態１０に記載の操作されたＴ細胞。
【0159】
実施形態１２．ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号６３、６４、７１、７８若しくは９１のいずれか１つ内のＬＨＡ及び／若しくはＲＨＡをコードするヌクレオチド配列又は配列番号９２若しくは１００のヌクレオチド配列を含み、且つ／或いはＣＡＲは、配列番号４９、５１、６５、７２、７９又は１１２のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３～１１のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【0160】
実施形態１３．破壊されたβ２Ｍ遺伝子は、配列番号９～１４のいずれか１つから選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態４～１２のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【0161】
実施形態１４．実施形態１～１３のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞の集団であって、集団の操作されたＴ細胞の少なくとも２５％又は少なくとも５０％は、ＣＡＲを発現する、操作されたＴ細胞の集団。
【0162】
実施形態１５．集団の操作されたＴ細胞の少なくとも７０％は、ＣＡＲを発現する、実施形態１４に記載の集団。
【0163】
実施形態１６．集団の操作されたＴ細胞の少なくとも２５％は、少なくとも７日間又は少なくとも１４日間のインビトロでの増殖後にＣＡＲを発現する、実施形態１４又は１５に記載の集団。
【0164】
実施形態１７．集団の操作されたＴ細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質を発現しない、実施形態１４～１６のいずれか１つに記載の集団。
【0165】
実施形態１８．集団の操作されたＴ細胞の少なくとも９０％は、検出可能なレベルのＴＣＲタンパク質を発現しない、実施形態１７に記載の集団。
【0166】
実施形態１９．集団の操作されたＴ細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのβ２Ｍタンパク質を発現しない、実施形態１４～１８のいずれか１つに記載の集団。
【0167】
実施形態２０．集団の操作されたＴ細胞の少なくとも７０％は、検出可能なレベルのβ２Ｍタンパク質を発現しない、実施形態１９に記載の集団。
【0168】
実施形態２１．集団の操作されたＴ細胞は、ＰＴＫ７を発現する癌細胞の集団とインビトロで共培養された場合、集団の癌細胞の少なくとも１０％、少なくとも２５％又は少なくとも５０％の細胞溶解を誘発する、実施形態１４～２０のいずれか１つに記載の集団。
【0169】
実施形態２２．集団の操作されたＴ細胞は、ＰＴＫ７を発現する癌細胞の集団とインビトロで共培養された場合、癌細胞の集団の少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の細胞溶解を誘発する、実施形態２１に記載の集団。
【0170】
実施形態２３．集団の操作されたＴ細胞は、癌細胞の集団とインビトロで共培養された場合、ＩＦＮγを分泌する、実施形態２１又は２２に記載の集団。
【0171】
実施形態２４．操作されたＴ細胞対癌細胞の比は、１：１～２：１である、実施形態２１～２３のいずれか１つに記載の集団。
【0172】
実施形態２５．癌細胞は、肉腫細胞を含む、実施形態２１～２４のいずれか１つに記載の集団。
【0173】
実施形態２６．癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、小細胞肺癌細胞及び／又は結腸癌細胞を含む、実施形態２１～２４のいずれか１つに記載の集団。
【0174】
実施形態２８．対象にインビボで投与された場合、対象中で毒性を誘発しない、実施形態１４～２７のいずれか１つに記載の集団。
【0175】
実施形態２９．実施形態１４～２８のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞の集団を対象に投与することを含む方法。
【0176】
実施形態３０．対象は、ヒト対象である、実施形態２９に記載の方法。
【0177】
実施形態３１．対象は、癌を有する、実施形態３０に記載の方法。
【0178】
実施形態３２．癌は、膵癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫、神経細胞、軟部肉腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、結腸癌、結腸腺癌、脳膠芽腫、肝細胞癌、肝臓胆管癌、骨肉腫、胃癌、食道扁平上皮癌、進行期の膵癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺小細胞癌、腎癌及び肝内胆道癌からなる群から選択される、実施形態３１に記載の方法。
【0179】
実施形態３３．癌は、ＰＴＫ７を発現する癌細胞を含む、実施形態３１又は３２に記載の方法。
【0180】
実施形態３４．操作されたＴ細胞を作製する方法であって、（ａ）Ｔ細胞に、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと、ＰＴＫ７に特異的に結合する外部ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターとを送達すること、及び（ｂ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を有し、且つＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞を作製することを含む方法。
【0181】
実施形態３５．ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡは、配列番号１８若しくは１９のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号４０のヌクレオチド配列を標的とする、実施形態３４に記載の方法。
【0182】
実施形態３６．ＣＡＲをコードする核酸は、ＴＲＡＣ遺伝子に対する左及び右の相同アームと隣接する、実施形態３４又は３５に記載の方法。
【0183】
実施形態３７．Ｔ細胞に、β２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡを送達することをさらに含む、実施形態３４～３６のいずれか１つに記載の方法。
【0184】
実施形態３８．β２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡは、配列番号２０若しくは２１のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号４１のヌクレオチド配列を標的とする、実施形態３７に記載の方法。
【0185】
実施形態３９．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、任意選択的にＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態３４～３８のいずれか１つに記載の方法。
【0186】
実施形態４０．ＣＡＲの外部ドメインは、抗ＰＴＫ７抗体である、実施形態３４～３９のいずれか１つに記載の方法。
【0187】
実施形態４１．抗ＰＴＫ７抗体は、抗ＰＴＫ７一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態４０に記載の方法。
【0188】
実施形態４２．抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、参照抗体と同じ重鎖可変ドメイン（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲを含み、参照抗体は、（ｉ）配列番号５５に記載のＶＨ及び配列番号５６に記載のＶＬ、（ｉｉ）配列番号６９に記載のＶＨ及び配列番号７０に記載のＶＬ、（ｉｉｉ）配列番号７６に記載のＶＨ及び配列番号７７に記載のＶＬ、又は（ｉｖ）配列番号８３に記載のＶＨ及び配列番号８４に記載のＶＬを含む、実施形態４１に記載の方法。
【0189】
実施形態４３．抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、参照抗体と同じＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む、実施形態４２の方法。
【0190】
実施形態４４．抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、配列番号５４、６８、７５又は８２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態４２に記載の方法。
【0191】
実施形態４５．ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は４１ＢＢ共刺激ドメインを含む、実施形態３４～４４のいずれか１つに記載の方法。
【0192】
実施形態４６．ＣＡＲは、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含む、実施形態４５に記載の方法。
【0193】
実施形態４７．ドナー鋳型は、配列番号６３、６４、７１、７８又は９１のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態３４～４６のいずれか１つに記載の方法。
【0194】
実施形態４８．ＣＡＲは、配列番号４９、５１、６５、７２、７９又は１１２のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３４～４７のいずれか１つに記載の方法。
【0195】
本開示を下記の実施形態によりさらに例示する。
【0196】
実施形態Ａ１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む操作されたＴ細胞であって、ＣＡＲは、ＰＴＫ７に特異的に結合する外部ドメインを含む、操作されたＴ細胞。
【0197】
実施形態Ａ２．破壊されたＴ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子をさらに含む、実施形態Ａ１に記載の操作されたＴ細胞。
【0198】
実施形態Ａ３．破壊されたベータ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子をさらに含む、実施形態Ａ１又はＡ２に記載の操作されたＴ細胞。
【0199】
実施形態Ａ４．ＣＡＲの外部ドメインは、抗ＰＴＫ７抗体を含む、実施形態Ａ１～Ａ３のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【0200】
実施形態Ａ５．抗ＰＴＫ７抗体は、抗ＰＴＫ７一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態Ａ４に記載の操作されたＴ細胞。
【0201】
実施形態Ａ６．抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、参照抗体と同じ重鎖可変ドメイン（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲを含み、参照抗体は、（ｉ）配列番号５５に記載のＶＨ及び配列番号５６に記載のＶＬ、（ｉｉ）配列番号６９に記載のＶＨ及び配列番号７０に記載のＶＬ、（ｉｉｉ）配列番号７６に記載のＶＨ及び配列番号７７に記載のＶＬ、又は（ｉｖ）配列番号８３に記載のＶＨ及び配列番号８４に記載のＶＬを含む、実施形態Ａ５に記載の操作されたＴ細胞。
【0202】
実施形態Ａ７．抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、参照抗体と同じＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む、実施形態Ａ６に記載の操作されたＴ細胞。
【0203】
実施形態Ａ８．抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、配列番号５４、６８、７５又は８２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ６に記載の操作されたＴ細胞。
【0204】
実施形態Ａ９．ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は４１ＢＢ共刺激ドメインをさらに含む、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【0205】
実施形態Ａ１０．ＣＡＲは、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含む、実施形態Ａ９に記載の操作されたＴ細胞。
【0206】
実施形態Ａ１１．ＣＡＲは、配列番号４９、５１、６５、７２、７９若しくは１１２のいずれか１つのヌクレオチド配列又は配列番号４９、５１、６５、７２、７９若しくは１１２と少なくとも９０％同一である核酸配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態Ａ１～Ａ１０のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【0207】
実施形態Ａ１２．ＣＡＲをコードする核酸は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子に挿入される、実施形態Ａ１～Ａ１１のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【0208】
実施形態Ａ１３．破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号６３、６４、７１、７８若しくは９１のいずれか１つ内のＬＨＡ及び／若しくはＲＨＡをコードするヌクレオチド配列、配列番号９２若しくは１００のヌクレオチド配列並びに／又は配列番号６３、６４、７１、７８若しくは９１のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態Ａ２～Ａ１２のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【0209】
実施形態Ａ１４．破壊されたβ２Ｍ遺伝子は、配列番号９～１４のいずれか１つから選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態Ａ１～Ａ１３のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【0210】
実施形態Ａ１５．操作されたＴ細胞であって、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び（ｉｉｉ）抗ＰＴＫ７抗原結合断片を含むＣＡＲをコードする核酸を含む操作されたＴ細胞。
【0211】
実施形態Ａ１６．ＣＡＲは、（ａ）抗ＰＴＫ７抗原結合断片を含む外部ドメインと、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメインと、（ｃ）ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む内部ドメインとを含む、実施形態Ａ１５に記載の操作されたＴ細胞。
【0212】
実施形態Ａ１７．破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、ＣＡＲをコードする核酸を含む、実施形態Ａ１５又はＡ１６に記載の操作されたＴ細胞。
【0213】
実施形態Ａ１８．操作されたＴ細胞であって、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、（ａ）抗ＰＴＫ７抗原結合断片を含む外部ドメインと、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメインと、（ｃ）ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む内部ドメインとを含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む操作されたＴ細胞。
【0214】
実施形態Ａ１９．操作されたＴ細胞であって、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、配列番号５０、５２、６６、７３又は８０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む操作されたＴ細胞。
【0215】
実施形態Ａ２０．操作されたＴ細胞であって、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、ＣＡＲをコードする核酸を含み、核酸配列は、配列番号４９、５１、６５、７２、７９又は１１２と少なくとも９０％同一であり、且つ配列番号５０、５２、６６、７３又は８０のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む操作されたＴ細胞。
【0216】
実施形態Ａ２１．ヒトＴ細胞である、実施形態Ａ１～Ａ２０のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【0217】
実施形態Ａ２２．実施形態Ａ１～Ａ２１のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、集団の操作されたＴ細胞の少なくとも２５％又は少なくとも５０％は、ＣＡＲを発現する、細胞の集団。
【0218】
実施形態Ａ２３．集団の操作されたＴ細胞の少なくとも７０％は、ＣＡＲを発現する、実施形態Ａ２２に記載の集団。
【0219】
実施形態Ａ２４．集団の操作されたＴ細胞の少なくとも２５％は、少なくとも７日間又は少なくとも１４日間のインビトロでの増殖後にＣＡＲを発現する、実施形態Ａ２２に記載の集団。
【0220】
実施形態Ａ２５．集団の操作されたＴ細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質を発現しない、実施形態Ａ２２～Ａ２４のいずれか１つに記載の集団。
【0221】
実施形態Ａ２６．集団の操作されたＴ細胞の少なくとも９０％は、検出可能なレベルのＴＣＲタンパク質を発現しない、実施形態Ａ２５に記載の集団。
【0222】
実施形態Ａ２７．集団の操作されたＴ細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのβ２Ｍタンパク質を発現しない、実施形態Ａ２２～Ａ２６のいずれか１つに記載の集団。
【0223】
実施形態Ａ２８．集団の操作されたＴ細胞の少なくとも７０％は、検出可能なレベルのβ２Ｍタンパク質を発現しない、実施形態Ａ２７に記載の集団。
【0224】
実施形態Ａ２９．集団の操作されたＴ細胞は、ＰＴＫ７を発現する癌細胞の集団とインビトロで共培養された場合、集団の癌細胞の少なくとも１０％、少なくとも２５％又は少なくとも５０％の細胞溶解を誘発する、実施形態Ａ２２～Ａ２８のいずれか１つに記載の集団。
【0225】
実施形態Ａ３０．集団の操作されたＴ細胞は、ＰＴＫ７を発現する癌細胞の集団とインビトロで共培養された場合、癌細胞の集団の少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の細胞溶解を誘発する、実施形態Ａ２９に記載の集団。
【0226】
実施形態Ａ３１．集団の操作されたＴ細胞は、癌細胞の集団とインビトロで共培養された場合、ＩＦＮγを分泌する、実施形態Ａ２９又はＡ３０に記載の集団。
【0227】
実施形態Ａ３２．操作されたＴ細胞対癌細胞の比は、１：１～２：１である、実施形態Ａ２９～Ａ３１のいずれか１つに記載の集団。
【0228】
実施形態Ａ３３．癌細胞は、肉腫細胞を含む、実施形態Ａ２９～Ａ３２のいずれか１つに記載の集団。
【0229】
実施形態Ａ３４．癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、小細胞肺癌細胞及び／又は結腸癌細胞を含む、実施形態Ａ２９～３Ａ２のいずれか１つに記載の集団。
【0230】
実施形態Ａ３５．対象にインビボで投与された場合、対象中で毒性を誘発しない、実施形態Ａ２２～Ａ３４のいずれか１つに記載の集団。
【0231】
実施形態Ａ３６．操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞は、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び（ｉｉｉ）抗ＰＴＫ７抗原結合断片を含むＣＡＲをコードする核酸を含む、細胞の集団。
【0232】
実施形態Ａ３７．ＣＡＲは、（ａ）抗ＰＴＫ７抗原結合断片を含む外部ドメインと、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメインと、（ｃ）ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む内部ドメインとを含む、実施形態３６に記載の細胞の集団。
【0233】
実施形態Ａ３８．破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、ＣＡＲをコードする核酸を含む、実施形態Ａ３６又はＡ３７に記載の細胞の集団。
【0234】
実施形態Ａ３９．操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞は、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、（ａ）抗ＰＴＫ７抗原結合断片を含む外部ドメインと、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメインと、（ｃ）ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む内部ドメインとを含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む、細胞の集団。
【0235】
実施形態Ａ４０．操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞は、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、ＣＡＲをコードする核酸を含み、核酸配列は、配列番号４９、５１、６５、７２、７９又は１１２と少なくとも９０％同一であり、且つ配列番号５０、５２、６６、７３又は８０のＣＡＲをコードする、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む、細胞の集団。
【0236】
実施形態Ａ４１．実施形態Ａ２２～Ａ４０のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞の集団を対象に投与することを含む方法。
【0237】
実施形態Ａ４２．対象は、ヒト対象である、実施形態４１に記載の方法。
【0238】
実施形態Ａ４３．対象は、癌を有する、実施形態Ａ４２に記載の方法。
【0239】
実施形態Ａ４４．癌は、膵癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫、神経細胞、軟部肉腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、結腸癌、結腸腺癌、脳膠芽腫、肝細胞癌、肝臓胆管癌、骨肉腫、胃癌、食道扁平上皮癌、進行期の膵癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺小細胞癌、腎癌及び肝内胆道癌からなる群から選択される、実施形態Ａ４３に記載の方法。
【0240】
実施形態Ａ４５．癌は、ＰＴＫ７を発現する癌細胞を含む、実施形態Ａ４３又はＡ４４に記載の方法。
【0241】
実施形態Ａ４６．操作されたＴ細胞を作製する方法であって、（ａ）Ｔ細胞に、（ｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、（ｉｉ）ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと、（ｉｉｉ）ＰＴＫ７に特異的に結合する外部ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターとを送達すること、及び（ｂ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を有し、且つＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞を作製することを含む方法。
【0242】
実施形態Ａ４７．ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｇＲＮＡは、配列番号１８若しくは１９のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号４０のヌクレオチド配列を標的とする、実施形態Ａ４６に記載の方法。
【0243】
実施形態Ａ４８．Ｔ細胞に、β２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡを送達することをさらに含む、実施形態Ａ４６又はＡ４７に記載の方法。
【0244】
実施形態Ａ４９．β２Ｍ遺伝子を標的とするｇＲＮＡは、配列番号２０若しくは２１のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号４１のヌクレオチド配列を標的とする、実施形態Ａ４８に記載の方法。
【0245】
実施形態Ａ５０．ＣＡＲの外部ドメインは、抗ＰＴＫ７抗体を含む、実施形態Ａ４６～Ａ４９のいずれか１つに記載の方法。
【0246】
実施形態Ａ５１．抗ＰＴＫ７抗体は、抗ＰＴＫ７一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態Ａ５０に記載の方法。
【0247】
実施形態Ａ５２．抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、参照抗体と同じ重鎖可変ドメイン（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲを含み、参照抗体は、（ｉ）配列番号５５に記載のＶＨ及び配列番号５６に記載のＶＬ、（ｉｉ）配列番号６９に記載のＶＨ及び配列番号７０に記載のＶＬ、（ｉｉｉ）配列番号７６に記載のＶＨ及び配列番号７７に記載のＶＬ、又は（ｉｖ）配列番号８３に記載のＶＨ及び配列番号８４に記載のＶＬを含む、実施形態Ａ５１に記載の方法。
【0248】
実施形態Ａ５３．抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、参照抗体と同じＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む、実施形態Ａ５２に記載の方法。
【0249】
実施形態Ａ５４．抗ＰＴＫ７ ｓｃＦｖは、配列番号５４、６８、７５又は８２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ５２に記載の方法。
【0250】
実施形態Ａ５５．ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は４１ＢＢ共刺激ドメインをさらに含む、実施形態Ａ４６～Ａ５４のいずれか１つに記載の方法。
【0251】
実施形態Ａ５６．ＣＡＲは、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含む、実施形態Ａ５５に記載の方法。
【0252】
実施形態Ａ５７．ＣＡＲは、配列番号４９、５１、６５、７２、７９若しくは１１２のいずれか１つのヌクレオチド配列又は配列番号４９、５１、６５、７２、７９若しくは１１２と少なくとも９０％同一である核酸配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態Ａ４６～Ａ５６のいずれか１つに記載の方法。
【0253】
実施形態Ａ５８．ＣＡＲをコードする核酸は、ＴＲＡＣ遺伝子に対する左及び右の相同アームと隣接する、実施形態Ａ４６～Ａ５７のいずれか１つに記載の方法。
【0254】
実施形態Ａ５９．ドナー鋳型は、配列番号６３、６４、７１、７８又は９１のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態Ａ４６～Ａ５８のいずれか１つに記載の方法。
【0255】
実施形態Ａ６０．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、任意選択的にＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態Ａ４６～Ａ５９のいずれか１つに記載の方法。
【0256】
実施形態Ａ６１．実施形態Ａ４６～Ａ６０のいずれか１つに記載の方法によって作製される操作されたＴ細胞。
【0257】
実施形態Ａ６２．実施形態Ａ６１に記載の操作されたＴ細胞を含む細胞の集団。
【0258】
実施形態Ａ６３．対象の癌を処置する方法であって、実施形態Ａ２２～Ａ４０のいずれか１つ又は実施形態Ａ６２に記載の細胞の集団を対象に投与することを含む方法。
【0259】
実施形態Ａ６４．癌は、膵癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫、神経細胞、軟部肉腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、結腸癌、結腸腺癌、脳膠芽腫、肝細胞癌、肝臓胆管癌、骨肉腫、胃癌、食道扁平上皮癌、進行期の膵癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺小細胞癌、腎癌及び肝内胆道癌からなる群から選択される、実施形態Ａ６３に記載の方法。
【0260】
実施形態Ａ６５．癌は、ＰＴＫ７を発現する癌細胞を含む、実施形態Ａ６３又はＡ６４に記載の方法。
【実施例】
【0261】
実施例１．正常なヒト組織でのＰＴＫ７発現
ＰＴＫ７発現を、ＰＴＫ７ ＣＡＲコンストラクト又はビオチン化マウスアイソタイプ対照（Ｎｏｖｕｓ、ＮＢＰ２－２１９４８）に特異的なカスタム組換えモノクローナルビオチン化抗体（ＣＴＸ１８１ ｍＡｂ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ、１ｍｇ／ｍｌ、配列番号１０８及び配列番号１０９）を使用して、凍結した正常なヒト組織パネル（ＦＤＡ Ｓｔａｎｄａｒｄ、Ｂｉｏｃｈａｉｎ）で評価した。スライドを周囲温度において１０分にわたり－２０℃のアセトンで固定し、続いて周囲温度において手動により免疫組織化学染色を行った。非特異的染色を最小限に抑えるためのブロッキングを順次の工程でＰｅｒｏｘｉｄａｓｅｄ １，Ａｖｉｄｉｎ ａｎｄ Ｂｉｏｔｉｎ ａｎｄ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｓｎｉｐｅｒ（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、ＰＸ９６８Ｍ、ＡＢ９７２Ｌ、ＢＳ９６６Ｍ）により実施した。スライドを３０分にわたりビオチン化ＣＴＸ１８１一次モノクローナル抗体（１：６００）で染色し、続いてそれぞれ１５分にわたり４ｐｌｕｓ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ Ｌａｂｅｌ（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）試薬と共にインキュベートした。標的抗原をＤＡＢ（褐色）基質色素原（Ｄａｋｏ、Ｋ３４６８）で可視化した。Ｍａｙｅｒ’ｓ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｄａｋｏ、Ｓ３３０９）を使用して、細胞核を対比染色した。図１は、正常なヒト組織ではＰＴＫ７が広く発現しなかったことを示す。
ＰＴＫ７発現を、ＰＴＫ７ ＣＡＲコンストラクト又はビオチン化マウスアイソタイプ対照（Ｎｏｖｕｓ、ＮＢＰ２－２１９４８）に特異的なカスタム組換えモノクローナルビオチン化抗体（ＣＴＸ１８１ ｍＡｂ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ、１ｍｇ／ｍｌ、配列番号１０８及び配列番号１０９）を使用して、凍結した正常なヒト組織パネル（ＦＤＡ Ｓｔａｎｄａｒｄ、Ｂｉｏｃｈａｉｎ）で評価した。スライドを周囲温度において１０分にわたり－２０℃のアセトンで固定し、続いて周囲温度において手動により免疫組織化学染色を行った。非特異的染色を最小限に抑えるためのブロッキングを順次の工程でＰｅｒｏｘｉｄａｓｅｄ １，Ａｖｉｄｉｎ ａｎｄ Ｂｉｏｔｉｎ ａｎｄ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｓｎｉｐｅｒ（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、ＰＸ９６８Ｍ、ＡＢ９７２Ｌ、ＢＳ９６６Ｍ）により実施した。スライドを３０分にわたりビオチン化ＣＴＸ１８１一次モノクローナル抗体（１：６００）で染色し、続いてそれぞれ１５分にわたり４ｐｌｕｓ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ Ｌａｂｅｌ（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）試薬と共にインキュベートした。標的抗原をＤＡＢ（褐色）基質色素原（Ｄａｋｏ、Ｋ３４６８）で可視化した。Ｍａｙｅｒ’ｓ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｄａｋｏ、Ｓ３３０９）を使用して、細胞核を対比染色した。図１は、正常なヒト組織ではＰＴＫ７が広く発現しなかったことを示す。
【0262】
ＣＴＸ１８１ ｍＡｂの配列：
＞１８１＿ＨＣ（配列番号１０８）
＞１８１＿ＬＣ（配列番号１０９）
＞１８１＿ＨＣ（配列番号１０８）
【化3】
【化4】
【0263】
実施例２．罹患したヒト組織でのＰＴＫ７発現
ＰＴＫ７発現を、マウスモノクローナル抗ヒトＰＴＫ７抗体、クローン４Ｆ９（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢＮ７２１）を使用して、ホルマリンで固定されパラフィンに包埋された（ＦＦＰＥ）罹患した患者及び正常な患者の腫瘍マイクロアレイで評価した（図２Ａ及び図２Ｂ）。表６は、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ，Ｉｎｃ．から使用したＦＦＰＥ組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を列挙する。ＦＦＰＥ切片を６０℃において３０分にわたり焼き、脱パラフィンさせて再水和させた。抗原賦活化（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を、Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用して、１×Ｒｅｖｅａｌ Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ溶液中において９５℃において４０分にわたり実施した。残りの工程を周囲温度で実施した。非特異的染色を最小限に抑えるためのブロッキングをＰｅｒｏｘｉｄａｓｅｄ １（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、ＰＸ９６８Ｍ）及びＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｓｎｉｐｅｒ（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、ＢＳ９６６Ｍ）で実施した。スライドを一次モノクローナル抗ＰＴＫ７抗体又はマウスＩｇＧアイソタイプ対照（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＬＬＣ）で６０分にわたり染色し、洗浄し、次いで二次ＥｎＶｉｓｉｏｎヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体（Ｄａｋｏ、Ｋ４００１１１－２）で３０分にわたり染色した。標的抗原をＤＡＢ（褐色）基質色素原（Ｄａｋｏ、Ｋ３４６８）で可視化した。Ｍａｙｅｒ’ｓ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｄａｋｏ、Ｓ３３０９）を使用して、細胞核を対比染色した。スライドをＰａｎｎｏｒａｍｉｃ ＭＩＤＩ ＩＩスキャナ（３ＤＨｉｓｔｅｃｈ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でスキャンし、染色強度（１＋～３＋、１＋は、低い抗原発現を表す）及び染色された切片の割合（１～１００％）の両方を評価する半定量的スコアリングシステムを使用してスコア化した。結果を表にまとめて、患者の罹患率の概要データを確立した（図３）。ＰＴＫ７が固形腫瘍癌の広範囲で発現されることが分かった。
ＰＴＫ７発現を、マウスモノクローナル抗ヒトＰＴＫ７抗体、クローン４Ｆ９（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢＮ７２１）を使用して、ホルマリンで固定されパラフィンに包埋された（ＦＦＰＥ）罹患した患者及び正常な患者の腫瘍マイクロアレイで評価した（図２Ａ及び図２Ｂ）。表６は、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ，Ｉｎｃ．から使用したＦＦＰＥ組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を列挙する。ＦＦＰＥ切片を６０℃において３０分にわたり焼き、脱パラフィンさせて再水和させた。抗原賦活化（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を、Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用して、１×Ｒｅｖｅａｌ Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ溶液中において９５℃において４０分にわたり実施した。残りの工程を周囲温度で実施した。非特異的染色を最小限に抑えるためのブロッキングをＰｅｒｏｘｉｄａｓｅｄ １（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、ＰＸ９６８Ｍ）及びＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｓｎｉｐｅｒ（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、ＢＳ９６６Ｍ）で実施した。スライドを一次モノクローナル抗ＰＴＫ７抗体又はマウスＩｇＧアイソタイプ対照（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＬＬＣ）で６０分にわたり染色し、洗浄し、次いで二次ＥｎＶｉｓｉｏｎヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体（Ｄａｋｏ、Ｋ４００１１１－２）で３０分にわたり染色した。標的抗原をＤＡＢ（褐色）基質色素原（Ｄａｋｏ、Ｋ３４６８）で可視化した。Ｍａｙｅｒ’ｓ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｄａｋｏ、Ｓ３３０９）を使用して、細胞核を対比染色した。スライドをＰａｎｎｏｒａｍｉｃ ＭＩＤＩ ＩＩスキャナ（３ＤＨｉｓｔｅｃｈ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でスキャンし、染色強度（１＋～３＋、１＋は、低い抗原発現を表す）及び染色された切片の割合（１～１００％）の両方を評価する半定量的スコアリングシステムを使用してスコア化した。結果を表にまとめて、患者の罹患率の概要データを確立した（図３）。ＰＴＫ７が固形腫瘍癌の広範囲で発現されることが分かった。
【0264】
【表6】
【0265】
実施例３．抗ＰＴＫ７ ＣＴＸ１８１のヒト／マウス交差反応性
カスタムＣＴＸ１８１抗体の種間反応性を評価するために、この抗体の結合親和性をマウス３Ｔ３Ｌ１線維芽細胞系統及びマウスＭ１５８乳癌細胞系統で評価し、この抗体のヒトＳａｏｓ２（骨肉腫）細胞系統、Ａ４９８（腎癌）細胞系統及びＨＣＣ７０（乳癌）細胞系統での結合親和性と比較した。各細胞系統に関して、用量滴定結合アッセイ（２００ｎＭ～０．００３２ｎＭの最終ＣＴＸ１８１抗体）を各濃度において２×１０６個の細胞で実行した。細胞をＣＴＸ１８１抗体で氷上において３０分間染色し、続いて洗浄し、二次ＡＰＣフルオロフォアコンジュゲートヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体でＲＴにおいて１５分間染色した。細胞をＮｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーター（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色に関して評価した。図４は、マウス細胞系統及びヒト細胞系統でのＣＴＸ１８１抗体の同等の結合親和性を示す。
カスタムＣＴＸ１８１抗体の種間反応性を評価するために、この抗体の結合親和性をマウス３Ｔ３Ｌ１線維芽細胞系統及びマウスＭ１５８乳癌細胞系統で評価し、この抗体のヒトＳａｏｓ２（骨肉腫）細胞系統、Ａ４９８（腎癌）細胞系統及びＨＣＣ７０（乳癌）細胞系統での結合親和性と比較した。各細胞系統に関して、用量滴定結合アッセイ（２００ｎＭ～０．００３２ｎＭの最終ＣＴＸ１８１抗体）を各濃度において２×１０６個の細胞で実行した。細胞をＣＴＸ１８１抗体で氷上において３０分間染色し、続いて洗浄し、二次ＡＰＣフルオロフォアコンジュゲートヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体でＲＴにおいて１５分間染色した。細胞をＮｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーター（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色に関して評価した。図４は、マウス細胞系統及びヒト細胞系統でのＣＴＸ１８１抗体の同等の結合親和性を示す。
【0266】
実施例４．正常なヒト組織及びマウス組織でのＰＴＫ７発現
ＰＴＫ７発現を、ＰＴＫ７ ＣＡＲコンストラクト又はビオチン化マウスアイソタイプ対照（Ｎｏｖｕｓ、ＮＢＰ２－２１９４８）に特異的なＣＴＸ１８１を使用して、凍結した正常なマウス組織パネル（ＦＤＡ Ｓｔａｎｄａｒｄ，Ｂｉｏｃｈａｉｎ；図５Ａ及び図５Ｂ）並びに凍結したマウス胚発生アレイ（Ｚｙａｇｅｎ；図６）で評価した。スライドを周囲温度において１０分にわたり－２０℃のアセトンで固定し、続いて周囲温度において手動により免疫組織化学染色を行った。非特異的染色を最小限に抑えるためのブロッキングを順次の工程でＰｅｒｏｘｉｄａｓｅｄ １，Ａｖｉｄｉｎ ａｎｄ Ｂｉｏｔｉｎ ａｎｄ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｓｎｉｐｅｒ（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、ＰＸ９６８Ｍ、ＡＢ９７２Ｌ、ＢＳ９６６Ｍ）により実施した。スライドを３０分にわたりビオチン化ＣＴＸ１８１一次モノクローナル抗体（ヒトの場合には１：３００；マウスの場合には１：６００）で染色し、続いてそれぞれ１５分にわたり４ｐｌｕｓ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ Ｌａｂｅｌ（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）試薬と共にインキュベートした。標的抗原をＤＡＢ（褐色）基質色素原（Ｄａｋｏ、Ｋ３４６８）で可視化した。Ｍａｙｅｒ’ｓ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｄａｋｏ、Ｓ３３０９）を使用して、細胞核を対比染色した。
ＰＴＫ７発現を、ＰＴＫ７ ＣＡＲコンストラクト又はビオチン化マウスアイソタイプ対照（Ｎｏｖｕｓ、ＮＢＰ２－２１９４８）に特異的なＣＴＸ１８１を使用して、凍結した正常なマウス組織パネル（ＦＤＡ Ｓｔａｎｄａｒｄ，Ｂｉｏｃｈａｉｎ；図５Ａ及び図５Ｂ）並びに凍結したマウス胚発生アレイ（Ｚｙａｇｅｎ；図６）で評価した。スライドを周囲温度において１０分にわたり－２０℃のアセトンで固定し、続いて周囲温度において手動により免疫組織化学染色を行った。非特異的染色を最小限に抑えるためのブロッキングを順次の工程でＰｅｒｏｘｉｄａｓｅｄ １，Ａｖｉｄｉｎ ａｎｄ Ｂｉｏｔｉｎ ａｎｄ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｓｎｉｐｅｒ（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、ＰＸ９６８Ｍ、ＡＢ９７２Ｌ、ＢＳ９６６Ｍ）により実施した。スライドを３０分にわたりビオチン化ＣＴＸ１８１一次モノクローナル抗体（ヒトの場合には１：３００；マウスの場合には１：６００）で染色し、続いてそれぞれ１５分にわたり４ｐｌｕｓ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ Ｌａｂｅｌ（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）試薬と共にインキュベートした。標的抗原をＤＡＢ（褐色）基質色素原（Ｄａｋｏ、Ｋ３４６８）で可視化した。Ｍａｙｅｒ’ｓ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｄａｋｏ、Ｓ３３０９）を使用して、細胞核を対比染色した。
【0267】
実施例５．ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の生成
この実施例は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子（ＴＣＲアルファコン定常（ＴＲＡＣ）領域で編集された遺伝子）、β２－マイクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子の発現を欠き、且つプロテインチロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）及びＰＴＫ７＋癌を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する同種ヒトＴ細胞の作製を説明する。ＣＤ２８共刺激ドメインを含む４種の特有の抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ（ＰＴＫ７－４、ＰＴＫ７－７、ＰＴＫ７－１３及びＰＴＫ７－１７）を実験及び評価のためにＴＲＡＣ－／β２Ｍ－ Ｔ細胞中で別々に発現させた。ＣＤ２８の代わりに４１ＢＢ共刺激ドメインを有するＰＴＫ７－４（ＰＴＫ７－４ｂ）も生成した。表７は、ＰＴＫ７ ＣＡＲ構造を列挙する。表１１は、ＰＴＫ７ ＣＡＲ構成要素の配列を列挙する。表１２は、ドナー構成要素を列挙する。
この実施例は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子（ＴＣＲアルファコン定常（ＴＲＡＣ）領域で編集された遺伝子）、β２－マイクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子の発現を欠き、且つプロテインチロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）及びＰＴＫ７＋癌を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する同種ヒトＴ細胞の作製を説明する。ＣＤ２８共刺激ドメインを含む４種の特有の抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ（ＰＴＫ７－４、ＰＴＫ７－７、ＰＴＫ７－１３及びＰＴＫ７－１７）を実験及び評価のためにＴＲＡＣ－／β２Ｍ－ Ｔ細胞中で別々に発現させた。ＣＤ２８の代わりに４１ＢＢ共刺激ドメインを有するＰＴＫ７－４（ＰＴＫ７－４ｂ）も生成した。表７は、ＰＴＫ７ ＣＡＲ構造を列挙する。表１１は、ＰＴＫ７ ＣＡＲ構成要素の配列を列挙する。表１２は、ドナー構成要素を列挙する。
【0268】
【表7】
【0269】
活性化された初代ヒトＴ細胞にＣａｓ９：ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体及びアデノ随伴アデノウイルスベクター（ＡＡＶ）をエレクトロポレートして、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を生成した。活性化された同種ヒトＴ細胞に、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列（配列番号４９、５１、６５、７２、７９又は１１２）の１つを含む組換えＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）をＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ（１μＭ Ｃａｓ９、５μＭ ｇＲＮＡ）と共に送達した。下記のｓｇＲＮＡを使用した：ＴＲＡＣ（配列番号２８）及びβ２Ｍ（配列番号３０）。ｇＲＮＡの未改変バージョン（又は他の改変バージョン）も使用し得る（例えば、配列番号１８又は配列番号２０）。表４も参照されたい。
【0270】
エレクトロポレーションの約１週間後、細胞をフローサイトメトリーのために処理して、編集された細胞集団の細胞表面でのＴＲＡＣ、β２Ｍ及び抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ発現レベルを評価した（図７）。表８は、使用した抗体を列挙する。全ての抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞及びＴＲＡＣ－／β２Ｍ－対照細胞に関して、生存細胞の９０％超がＴＣＲの発現を欠いており、６０％超がβ２Ｍの発現を欠いていた。ＰＴＫ７－４ ＣＡＲをコードするコンストラクトで処理された細胞は、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ＋を発現する生存細胞の割合が最も高かった（＞７０％）。ｓｃＦＶでのＶＨ配列及びＶＬ配列の配向は、ＣＡＲの発現に影響を及ぼしているように見える。ＰＴＫ７－４ ＣＡＲは、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の配向がＰＴＫ７－７ ＣＡＲと異なるが、ＰＴＫ７－７は、生存細胞集団の５０％未満でのみ発現した。ＣＤ２８共刺激ドメイン（ＰＴＫ７－４）を有するＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、４－１ＢＢ共刺激ドメイン（ＰＴＫ７－４ｂ）よりも有効であった（図８）。
【0271】
【表8】
【0272】
細胞死滅アッセイ。次いで、細胞死滅（細胞毒性）アッセイを使用して、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の、ＰＴＫ７を発現する接着性肉腫細胞系統（Ａ－２０４及びＳａｏｓ－２）並びにＰＴＫ７を発現する乳癌細胞系統（ＭＣＦ７）で細胞溶解を引き起こす能力を評価した。接着細胞を１つのウェル当たり５０，０００個の細胞で９６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩放置した。翌日、標的細胞を含むウェルにＴ細胞を２：１又は１：１のＴ細胞：標的細胞の比で添加した。陰性対照として、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－ Ｔ細胞を使用した。約２０時間後、Ｔ細胞を吸引により培養物から除去し、このプレートの各ウェルに１００μＬのＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して、残存する生存細胞の数を評価した。次いで、各ウェルから放出された光の量を、プレートリーダーを使用して定量した。抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞（特にＰＴＫ７－４コンストラクト、ＰＴＫ７－７コンストラクト及びＰＴＫ７－１３コンストラクトを発現するもの）は、Ａ－２０４細胞系統（図９Ａ）及びＳａｏｓ細胞系統（図９Ｂ）に対して強力な細胞毒性を示した。さらに、ＰＴＫ７－４ ＣＡＲを発現する抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、試験した肉腫細胞系統と比べてＰＴＫ７ ｍＲＮＡの発現が低いことが知られているＭＣＦ７細胞系統に対して最も高い細胞毒性活性を示した（図９Ｃ）。
【0273】
ＰＴＫ７－４ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞特異性を、ＰＴＫ７ノックアウト（ＫＯ）Ｓａｏｓ２細胞（図１０Ａ）及びＰＴＫ７を過剰発現するＡ４９８細胞（図１０Ｂ）を使用して例示した。ＰＴＫ７ ＫＯ Ｓａｏｓ－２細胞を、確立された方法に従うリボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）複合体（１μＭ Ｃａｓ９及び５μＭ ＰＴＫ７ ｇＲＮＡ（配列番号１１１；表９を参照されたい））のエレクトロポレーションにより生成した。細胞を、ＣＴＸ１８１ ｍＡｂを使用するフローサイトメトリーによるＰＴＫ７細胞表面発現の欠失に関して分析し（図１０Ｃ）、続いて拡大させた。フローサイトメトリー分析により、タンパク質発現が８８．６％減少することが分かり、これは、遺伝子編集の効率が高いことを示す。ＰＴＫ７ ＫＯ Ｓａｏｓ－２細胞のインビトロでの有効性を、Ｓａｏｓ－２ ＷＴ細胞と比較した細胞毒性アッセイで評価した。図１０Ａは、ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞により溶解されるＳａｏｓ２ ＰＴＫ７ ＫＯ細胞の有効性の減少を示し、これは、ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＰＴＫ７を発現する標的細胞に特異的であったことを示す。
【0274】
【表9】
【0275】
ＰＴＫ７を過剰発現するＡ４９８細胞を下記のように生成した：Ａ４９８腎細胞癌細胞を、１０μｇ／ｍｌポリブレンを補充したＭＥＭ１α＋１０％ＦＢＳ培地に６０～７０％の培養密度で蒔いた。翌日、所望の感染多重度（ＭＯＩ）に基づいて、Ａ４９８細胞に、ｈｕｍＰＴＫ７ ｃＤＮＡを発現するレンチウイルス（ＬＰＰ－Ａ６３８１－Ｌｖ２２５－２００、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を形質導入した。２４～４８時間のレンチウイルス感染後、４μｇ／ｍｌピューロマイシン選択を含む新鮮な培地に交換した。ピューロマイシン処理を、形質導入されていない細胞の全てが培養物から除去されるまで、形質導入後５～７日にわたり継続した。ｈｕｍＰＴＫ７ｃＤＮＡレンチウイルスコンストラクトの発現を、ＣＴＸ１８１ ｍＡｂを使用するフローサイトメトリー（図１０Ｃ）により評価した。ｈｕｍＰＴＫ７ ｃＤＮＡを発現するＡ４９８細胞のインビトロでの有効性を、Ａ４９８ ＷＴ細胞と比較した細胞毒性アッセイで評価した。図１０Ｂは、Ａ４９８ ＷＴ細胞と比較した、ｈｕｍＰＴＫ７ ｃＤＮＡを発現するＡ４９８細胞の溶解でのＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性の増加を示し、これは、ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞がＰＴＫ７抗原発現標的細胞に特異的であったことを示す。
【0276】
実施例６．固形腫瘍細胞系統でのＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロでの効力
細胞死滅アッセイ。さらなる腫瘍細胞系統での有効性を調べるために、乳癌、膵癌及びＮＳＣＬ癌の高ＰＴＫ７発現細胞系統、中ＰＴＫ７発現細胞系統、低ＰＴＫ７発現細胞系統をＢｒｏａｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅデータベースから選択した。細胞死滅（細胞毒性）アッセイを使用して、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の、ＰＴＫ７を発現する接着性肉腫細胞系統（Ｓａｏｓ－２）、様々な程度までＰＴＫ７を発現する乳癌細胞系統（ＨＣＣ１３９５、ＭＣＦ７、ＨＣＣ１４１９）、様々な程度までＰＴＫ７を発現する膵臓細胞系統（Ｐａｎｃ－１、Ｈｓ７６６Ｔ、Ａｓｐｃ１）及び様々な程度までＰＴＫ７を発現する非小細胞肺癌細胞系統（ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＮＣＩ－Ｈ４６０）で細胞溶解を引き起こす能力を評価した。接着細胞を１つのウェル当たり５０，０００個の細胞で９６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩放置した。翌日、標的細胞を含むウェルにＴ細胞を０．１２５：１、０．２５：１、１：１又は４：１のエフェクターＴ細胞：標的細胞の比で添加した。陰性対照として、ＴＲＡＣ－β２Ｍ－Ｔ細胞を使用した。約２４時間後、Ｔ細胞を吸引により培養物から除去し、このプレートの各ウェルに１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して、残存する生存細胞の数を評価した。次いで、各ウェルから放出された光の量を、プレートリーダーを使用して定量した。標的細胞をＣＴＸ１８１抗体で氷上において３０分間染色し、続いて洗浄し、二次ＡＰＣフルオロフォアコンジュゲートヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体でＲＴにおいて１５分間染色することにより、ＰＴＫ７タンパク質の発現を評価した。標的細胞をＮｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーター（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色に関して評価した。図１１Ａ～１１Ｃは、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞が、試験した全ての細胞系統に対して細胞毒性を示し、このインビトロでの効力がこれらの腫瘍細胞系統でのＰＴＫ７発現のレベルと同じ傾向であったことを示す。
細胞死滅アッセイ。さらなる腫瘍細胞系統での有効性を調べるために、乳癌、膵癌及びＮＳＣＬ癌の高ＰＴＫ７発現細胞系統、中ＰＴＫ７発現細胞系統、低ＰＴＫ７発現細胞系統をＢｒｏａｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅデータベースから選択した。細胞死滅（細胞毒性）アッセイを使用して、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の、ＰＴＫ７を発現する接着性肉腫細胞系統（Ｓａｏｓ－２）、様々な程度までＰＴＫ７を発現する乳癌細胞系統（ＨＣＣ１３９５、ＭＣＦ７、ＨＣＣ１４１９）、様々な程度までＰＴＫ７を発現する膵臓細胞系統（Ｐａｎｃ－１、Ｈｓ７６６Ｔ、Ａｓｐｃ１）及び様々な程度までＰＴＫ７を発現する非小細胞肺癌細胞系統（ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＮＣＩ－Ｈ５２０、ＮＣＩ－Ｈ４６０）で細胞溶解を引き起こす能力を評価した。接着細胞を１つのウェル当たり５０，０００個の細胞で９６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩放置した。翌日、標的細胞を含むウェルにＴ細胞を０．１２５：１、０．２５：１、１：１又は４：１のエフェクターＴ細胞：標的細胞の比で添加した。陰性対照として、ＴＲＡＣ－β２Ｍ－Ｔ細胞を使用した。約２４時間後、Ｔ細胞を吸引により培養物から除去し、このプレートの各ウェルに１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して、残存する生存細胞の数を評価した。次いで、各ウェルから放出された光の量を、プレートリーダーを使用して定量した。標的細胞をＣＴＸ１８１抗体で氷上において３０分間染色し、続いて洗浄し、二次ＡＰＣフルオロフォアコンジュゲートヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体でＲＴにおいて１５分間染色することにより、ＰＴＫ７タンパク質の発現を評価した。標的細胞をＮｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーター（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色に関して評価した。図１１Ａ～１１Ｃは、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞が、試験した全ての細胞系統に対して細胞毒性を示し、このインビトロでの効力がこれらの腫瘍細胞系統でのＰＴＫ７発現のレベルと同じ傾向であったことを示す。
【0277】
ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞の機能的活性を、インターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）及びインターロイキン－２（ＩＬ２）に関するサイトカイン放出アッセイを使用してさらに評価した。試験した全ての遺伝子型のＴ細胞を、上記で示した細胞比で２４時間にわたり標的細胞と共にインキュベートした。２４時間後、細胞サンプルを囲む上清培地を採取し、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＩＦＮｇ及びＩＬ２のレベルを測定した。ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、４：１又は１：１のＴ細胞：標的細胞の比で使用した場合、ＰＴＫ７を発現する癌細胞系統（Ｓａｏｓ２、ＨＣＣ１３９５、ＭＣＦ７、Ｐａｎｃ１、Ｈｓ７６６Ｔ、ＮＣＩ－Ｈ５２０及びＮＣＩ－Ｈ１９７５）の存在下でＩＦＮｇ及びＩＬ２を分泌した。対照細胞（ＴＣＲ－／β２Ｍ－（ＡＡＶなし）及び非編集（ＲＮＰなし））は、列挙された癌細胞系統のいずれの存在下でも特異的なＩＦＮｇ又はＩＬ２分泌反応を示さなかった。まとめると、これらの機能的アッセイから、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＰＴＫ７を発現している細胞に対して細胞毒性であり、且つこの細胞の存在下でＩＦＮｇ及びＩＬ２を分泌することが実証された。
【0278】
実施例７．抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞の機能的能力
ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７－４ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞（ＰＴＫ７－４ ＣＡＲ Ｔ細胞とも称される）を、実施例５で説明したように生成した。ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞及びＴＲＡＣ－／β２Ｍ－ Ｔ細胞の集団を、対照として使用するために同様に生成した。トランスフェクションによる、編集されたＴ細胞の調製後、編集された全ての細胞型及び編集されていないＴ細胞の７日間にわたる増殖能力を試験した。Ｔ細胞の各遺伝子型に関して、５×１０６個の細胞を蒔いた。注目すべきことに、図１２に示すように、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７－４ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、全ての対照実験と同等の速度及びレベルで増殖し得た。７日間の細胞増殖後、マウスモデルに注射する各遺伝子型のサンプルをｃｙｒｏｓｔｏｒ１０中で凍結させ、液体窒素中で保存した。各遺伝子型の残余の細胞を編集後１４日目まで増殖させ続けた。注目すべきことに、図１３Ａ～１３Ｂに示すように、ＴＣＲ、β２Ｍ及びＣＡＲの遺伝子編集を有する生存細胞の割合は、編集後７日目～１４日目まで一致したままであった。図１３Ｃ～１３Ｄは、その後の実験において、細胞の７０．９％がＰＴＫ７－４ ＣＡＲコンストラクトを発現したが、細胞の９８％がＴＲＡＣ ＫＯを有しており、且つ細胞の９７％がβ２Ｍ ＫＯを有したことを示す。抗ＣＤＲ１９ ＣＡＲの発現を、ビオチン化ポリクローナル抗マウスＦＡＢ一次を使用し、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣコンジュゲートを使用して検出し、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲの発現を、抗ＰＴＫ７抗体－ＰＥコンジュゲート（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｃａｔ＃：１３０－０９１－３６４）を使用して検出した（図１４Ａ及び図１４Ｄ）。
ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７－４ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞（ＰＴＫ７－４ ＣＡＲ Ｔ細胞とも称される）を、実施例５で説明したように生成した。ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞及びＴＲＡＣ－／β２Ｍ－ Ｔ細胞の集団を、対照として使用するために同様に生成した。トランスフェクションによる、編集されたＴ細胞の調製後、編集された全ての細胞型及び編集されていないＴ細胞の７日間にわたる増殖能力を試験した。Ｔ細胞の各遺伝子型に関して、５×１０６個の細胞を蒔いた。注目すべきことに、図１２に示すように、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７－４ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、全ての対照実験と同等の速度及びレベルで増殖し得た。７日間の細胞増殖後、マウスモデルに注射する各遺伝子型のサンプルをｃｙｒｏｓｔｏｒ１０中で凍結させ、液体窒素中で保存した。各遺伝子型の残余の細胞を編集後１４日目まで増殖させ続けた。注目すべきことに、図１３Ａ～１３Ｂに示すように、ＴＣＲ、β２Ｍ及びＣＡＲの遺伝子編集を有する生存細胞の割合は、編集後７日目～１４日目まで一致したままであった。図１３Ｃ～１３Ｄは、その後の実験において、細胞の７０．９％がＰＴＫ７－４ ＣＡＲコンストラクトを発現したが、細胞の９８％がＴＲＡＣ ＫＯを有しており、且つ細胞の９７％がβ２Ｍ ＫＯを有したことを示す。抗ＣＤＲ１９ ＣＡＲの発現を、ビオチン化ポリクローナル抗マウスＦＡＢ一次を使用し、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣコンジュゲートを使用して検出し、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲの発現を、抗ＰＴＫ７抗体－ＰＥコンジュゲート（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｃａｔ＃：１３０－０９１－３６４）を使用して検出した（図１４Ａ及び図１４Ｄ）。
【0279】
ＰＴＫ７－４ ＣＡＲ Ｔ細胞の機能的活性を、実施例５で説明した接着性細胞毒性アッセイを使用して検証した。ＰＴＫ７－４ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＰＴＫ７ ＣＡＲ）は、１：１又は２：１のＴ細胞：標的細胞の比で使用した場合、ＰＴＫ７を発現するＳａｏｓ－２細胞及びＭＣＦ７細胞の細胞毒性を引き起こし得た。対照細胞（ＴＣＲ－／β２Ｍ－（ＡＡＶ）なし；ＴＣＲ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（ＣＤ１９ ＣＡＲ）；及び非編集（ＲＮＰなし））は、Ｓａｏｓ－２細胞又はＭＣＦ７細胞のいずれに対しても特異的な細胞毒性を示さなかった（図１４Ｂ及び図１４Ｅ）。
【0280】
ＰＴＫ７－４ ＣＡＲ Ｔ細胞の機能的活性を、サイトカイン（インターフェロンガンマ／ＩＦＮγ）放出アッセイを使用してさらに評価した。試験した全ての遺伝子型のＴ細胞を１：１及び２：１の細胞比で２４時間にわたり標的細胞（Ｓａｏｓ－２細胞及びＭＣＦ７細胞）と共にインキュベートした。２４時間後、細胞サンプルを囲む上清培地を採取し、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＩＦＮγのレベルを測定した。ＰＴＫ７－４ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＰＴＫ７ ＣＡＲ）は、１：１又は２：１のＴ細胞：標的細胞の比で使用した場合、ＰＴＫ７を発現するＳａｏｓ－２細胞及びＭＣＦ７細胞の存在下でＩＦＮγを分泌した。対照細胞（ＴＣＲ－／β２Ｍ－（ＡＡＶなし）；ＴＣＲ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋（ＣＤ１９ ＣＡＲ）；及び非編集（ＲＮＰなし））は、Ｓａｏｓ－２細胞又はＭＣＦ７細胞のいずれの存在下でも特異的なＩＦＮγ分泌反応を示さなかった（図１４Ｃ及び図１４Ｆ）。
【0281】
まとめると、これらの機能的アッセイから、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＰＴＫ７を発現している細胞に対して細胞毒性であり、且つこの細胞の存在下でＩＦＮγを分泌することが実証された。
【0282】
実施例８．インビトロでの細胞毒性アッセイ
マウス細胞、３Ｔ３Ｌ１繊維芽細胞及びＭ１５８乳癌細胞に対する抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロでの有効性を評価するために、２４時間の細胞毒性アッセイを実施した。結果を、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞がヒトＳａｏｓ２骨肉腫及びヒトＡ４９８腎細胞癌細胞系統を溶解させる効力と比較した。接着細胞を１つのウェル当たり５０，０００個の細胞で９６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩放置した。翌日、０．１２５：１、０．２５：１、１：１又は４：１のエフェクターＴ細胞：標的細胞の比で、標的細胞を含むウェルにＴ細胞を添加した。陰性対照として、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－ Ｔ細胞を使用した。約２４時間後、Ｔ細胞を吸引により培養物から除去し、このプレートの各ウェルに１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して、残存する生存細胞の数を評価した。次いで、各ウェルから放出された光の量を、プレートリーダーを使用して定量した。抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ヒトＳａｏｓ２細胞系統及びマウス３Ｔ３Ｌ１細胞系統に対して同等に良好な細胞毒性を示した（図１５）。逆に、ヒトＡ４９８細胞及びマウスＭ１５８細胞は、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞の存在下で溶解せず、なぜなら、これら２つの細胞系統では、ＰＴＫ７の発現レベルが低いからである。
マウス細胞、３Ｔ３Ｌ１繊維芽細胞及びＭ１５８乳癌細胞に対する抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロでの有効性を評価するために、２４時間の細胞毒性アッセイを実施した。結果を、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞がヒトＳａｏｓ２骨肉腫及びヒトＡ４９８腎細胞癌細胞系統を溶解させる効力と比較した。接着細胞を１つのウェル当たり５０，０００個の細胞で９６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩放置した。翌日、０．１２５：１、０．２５：１、１：１又は４：１のエフェクターＴ細胞：標的細胞の比で、標的細胞を含むウェルにＴ細胞を添加した。陰性対照として、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－ Ｔ細胞を使用した。約２４時間後、Ｔ細胞を吸引により培養物から除去し、このプレートの各ウェルに１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して、残存する生存細胞の数を評価した。次いで、各ウェルから放出された光の量を、プレートリーダーを使用して定量した。抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ヒトＳａｏｓ２細胞系統及びマウス３Ｔ３Ｌ１細胞系統に対して同等に良好な細胞毒性を示した（図１５）。逆に、ヒトＡ４９８細胞及びマウスＭ１５８細胞は、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞の存在下で溶解せず、なぜなら、これら２つの細胞系統では、ＰＴＫ７の発現レベルが低いからである。
【0283】
実施例９．マウスモデルでの抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞の許容性
ＮＯＧマウスの、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７－４ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の注射による処置を許容する能力を試験した。２匹のＮＯＧマウスに１０００万個のＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７－４ ＣＡＲ Ｔ細胞（上記で既に説明したように生成した）を投与し、２匹の追加のマウスに１０００万個の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与した。全てのＣＡＲ Ｔ細胞を尾静脈注射により投与した。
ＮＯＧマウスの、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７－４ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の注射による処置を許容する能力を試験した。２匹のＮＯＧマウスに１０００万個のＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７－４ ＣＡＲ Ｔ細胞（上記で既に説明したように生成した）を投与し、２匹の追加のマウスに１０００万個の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与した。全てのＣＡＲ Ｔ細胞を尾静脈注射により投与した。
【0284】
マウスを毎日秤量し、苦痛又は瀕死に関してモニタリングした。抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスと同様に、最小限の体重減少を示した（図１６）。注射から１０日の期間後、動物を屠殺し、脾臓及び血液サンプルをヒトＴ細胞（ヒトＣＤ４５＋細胞）の存在に関して分析した。脾臓及び血液の両方において、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔで処置したマウスは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスと比べて、編集されたＣＡＲ Ｔ細胞（ｈｕＣＤ４５＋細胞）のレベルが高く（表１０）、これは、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞はマウス抗原の存在下で拡大するであろうことを示唆する。
【0285】
【表10】
【0286】
まとめると、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ処置マウスでの一過性の体重減少及び比較的高いレベルのＣＡＲ Ｔ細胞は、抗ＰＴＫ７ ＣＡＲがマウス中の抗原を認識し、その結果、ＣＡＲ Ｔ細胞が増殖することを示唆した。有意な毒性が全体的に欠如していたことは、驚くべきことであり、ＰＴＫ７の標的化と関連する既知のオン標的／オフ組織毒性がマウスで許容され、さらにヒトで許容される可能性があることを示す。
【0287】
実施例１０．異種移植マウスモデルにおける抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボでの有効性
抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性をＳＫＯＶ－３ヒト卵巣異種移植マウスモデル、ＨＣＩ－Ｈ１９７５ヒト非小細胞肺癌異種移植マウスモデル及びヒト膵臓Ｈｓ７６６Ｔ腫瘍異種移植マウスモデルにおいてインビボで試験した。図１７は、ＣＴＸ１８１ Ａｂを使用するヒト癌細胞系統でのＰＴＫ７細胞表面発現レベルを示す。各異種移植モデルに関して、５匹の雌（５～８週齢）のＮＯＧマウスに単一時点のＩＶ単回用量（５×１０７個の細胞／ｍｌ）のＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞（上記で既に説明したように生成した）を投与した。体重（２×１週間）及び腫瘍体積は、この研究を通じて測定するエンドポイントであった。腫瘍（右脇腹に皮下注射した細胞系統）が５０ｍｍに達した場合、マウスに抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与した。腫瘍がエンドポイントサイズ（ＳＫＯＶ３（卵巣）の場合には１０００ｍｍ、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（ＮＳＣＬＣ）及びＨｓ７６６Ｔ（膵臓）の場合には２０００ｍｍ）に達した場合又は９０日（いずれか早い方）において研究を終了した。マウスを病原体フリー条件及びＩＡＣＵＣ基準下で飼育してモニタリングした。抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、３種全ての異種移植モデル（ＮＣＩ－Ｈ１９７５非小細胞肺癌異種移植モデル（図１８Ａ）、ＳＫＯＶ３卵巣癌異種移植モデル（図１８Ｂ）及びＨｓ７６６Ｔ膵癌異種移植モデル（図１８Ｃ）において有効であった。
抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性をＳＫＯＶ－３ヒト卵巣異種移植マウスモデル、ＨＣＩ－Ｈ１９７５ヒト非小細胞肺癌異種移植マウスモデル及びヒト膵臓Ｈｓ７６６Ｔ腫瘍異種移植マウスモデルにおいてインビボで試験した。図１７は、ＣＴＸ１８１ Ａｂを使用するヒト癌細胞系統でのＰＴＫ７細胞表面発現レベルを示す。各異種移植モデルに関して、５匹の雌（５～８週齢）のＮＯＧマウスに単一時点のＩＶ単回用量（５×１０７個の細胞／ｍｌ）のＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞（上記で既に説明したように生成した）を投与した。体重（２×１週間）及び腫瘍体積は、この研究を通じて測定するエンドポイントであった。腫瘍（右脇腹に皮下注射した細胞系統）が５０ｍｍに達した場合、マウスに抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与した。腫瘍がエンドポイントサイズ（ＳＫＯＶ３（卵巣）の場合には１０００ｍｍ、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（ＮＳＣＬＣ）及びＨｓ７６６Ｔ（膵臓）の場合には２０００ｍｍ）に達した場合又は９０日（いずれか早い方）において研究を終了した。マウスを病原体フリー条件及びＩＡＣＵＣ基準下で飼育してモニタリングした。抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、３種全ての異種移植モデル（ＮＣＩ－Ｈ１９７５非小細胞肺癌異種移植モデル（図１８Ａ）、ＳＫＯＶ３卵巣癌異種移植モデル（図１８Ｂ）及びＨｓ７６６Ｔ膵癌異種移植モデル（図１８Ｃ）において有効であった。
【0288】
実施例１１．異種移植マウスモデルにおける抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボでの有効性
抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性をＯＶ９０腫瘍異種移植マウスモデル、ＯＶＣＡＲ３腫瘍異種移植マウスモデル、Ａ２７８０ヒト卵巣腫瘍異種移植マウスモデル、ＭＣＦ７腫瘍異種移植マウスモデル、ＨＣＣ７０ヒト乳房腫瘍異種移植マウスモデル、ＨＣＴ１１６ヒト結腸腫瘍異種移植マウスモデル及びＨ２０９ヒト小細胞肺癌腫瘍異種移植マウスモデルにおいてインビボで試験した。各異種移植モデルに関して、５匹の雌（５～８週齢）のＮＯＧマウスに単一時点のＩＶ単回用量（５×１０７個の細胞／ｍｌ）のＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞（上記で既に説明したように生成した）を投与した。体重（２×１週間）及び腫瘍体積は、この研究を通じて測定するエンドポイントであった。腫瘍（右脇腹に皮下注射した細胞系統）が５０ｍｍに達した場合、マウスに抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与した。腫瘍がエンドポイントサイズ（２０００ｍｍ）に達した場合又は９０日（いずれか早い方）において研究を終了した。マウスを病原体フリー条件及びＩＡＣＵＣ基準下で飼育してモニタリングした。図１９Ａは、ＯＶ９０卵巣腫瘍異種胃移植モデルに対する抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を示す。図１９Ｂは、ＨＣＴ１１６結腸腫瘍異種移植モデルに対する抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を示す。図１９Ｃは、ＭＣＦ７腫瘍異種移植モデルでは抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞が特に有効であったことを示す。図２０は、ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したＨｓ－７６６Ｔ膵臓腫瘍異種移植モデルの体重変化の割合を示す。測定した全ての異種移植研究において、均等な割合の体重変化を観察した。異種移植モデルでは、潜在的な毒性にばらつきが見られた。
抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性をＯＶ９０腫瘍異種移植マウスモデル、ＯＶＣＡＲ３腫瘍異種移植マウスモデル、Ａ２７８０ヒト卵巣腫瘍異種移植マウスモデル、ＭＣＦ７腫瘍異種移植マウスモデル、ＨＣＣ７０ヒト乳房腫瘍異種移植マウスモデル、ＨＣＴ１１６ヒト結腸腫瘍異種移植マウスモデル及びＨ２０９ヒト小細胞肺癌腫瘍異種移植マウスモデルにおいてインビボで試験した。各異種移植モデルに関して、５匹の雌（５～８週齢）のＮＯＧマウスに単一時点のＩＶ単回用量（５×１０７個の細胞／ｍｌ）のＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞（上記で既に説明したように生成した）を投与した。体重（２×１週間）及び腫瘍体積は、この研究を通じて測定するエンドポイントであった。腫瘍（右脇腹に皮下注射した細胞系統）が５０ｍｍに達した場合、マウスに抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与した。腫瘍がエンドポイントサイズ（２０００ｍｍ）に達した場合又は９０日（いずれか早い方）において研究を終了した。マウスを病原体フリー条件及びＩＡＣＵＣ基準下で飼育してモニタリングした。図１９Ａは、ＯＶ９０卵巣腫瘍異種胃移植モデルに対する抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を示す。図１９Ｂは、ＨＣＴ１１６結腸腫瘍異種移植モデルに対する抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を示す。図１９Ｃは、ＭＣＦ７腫瘍異種移植モデルでは抗ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞が特に有効であったことを示す。図２０は、ＰＴＫ７ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したＨｓ－７６６Ｔ膵臓腫瘍異種移植モデルの体重変化の割合を示す。測定した全ての異種移植研究において、均等な割合の体重変化を観察した。異種移植モデルでは、潜在的な毒性にばらつきが見られた。
【0289】
【表11】
【0290】
【表12】
【0291】
【表13】
【0292】
【表14】
【0293】
【表15】
【0294】
【表16】
【0295】
【表17】
【0296】
【表18】
【0297】
【表19】
【0298】
【表20】
【0299】
【表21】
【0300】
【表22】
【0301】
【表23】
【0302】
【表24】
【0303】
【表25】
【0304】
【表26】
【0305】
【表27】
【0306】
【表28】
【0307】
【表29】
【0308】
【表30】
【0309】
【表31】
【0310】
【表32】
【0311】
【表33】
【0312】
本明細書で開示されている全ての参考文献、特許及び特許出願は、それぞれ引用されている主題に関して参照により組み込まれており、場合により文献の全体を包含する場合がある。
【0313】
不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。
【0314】
同様に、反対に明確に示されない限り、複数の工程又は行為を含む、本明細書で特許請求されている任意の方法において、この方法の工程又は行為の順序は、必ずしもこの方法の工程又は行為が列挙される順序に限定されないことも理解されるべきである。
【0315】
特許請求の範囲及び上記明細書において、「含む」、「包含する」、「保有する」、「有する」、「含有する」、「関与する」、「保持する」、「構成する」等の全ての移行句は、オープンエンド、即ち含むが、限定されないことを意味するものと理解される。「からなる」及び「本質的にからなる」という移行句のみが、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ２１１１．０３に規定されるとおり、それぞれクローズド移行句又はセミクローズド移行句となるものとする。
【0316】
数値に先行する「約」及び「実質的に」という用語は、列挙された数値の±１０％を意味する。
【0317】
値の範囲が提供される場合、この範囲の上限と下限との間の各値は、本明細書において具体的に企図及び記載されている。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A-B】
【図9C】
【図10A】
【図10B-C】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図14A-B】
【図14C-D】
【図14E-F】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19A】
【図19B-C】
【図20】
【配列表】
【国際調査報告】