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特表2022-509153患者の試料中のバイオマーカーとしてのラミニンおよび／またはガレクチンの発現レベルを測定することによって、癌に罹患している疑いのある患者の腫瘍溶解性パルボウイルス（ＰＡＲＶＯＶＩＲＵＳ）Ｈ１（Ｈ－１ＰＶ）治療の臨床応答を予測する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-20
(54)【発明の名称】患者の試料中のバイオマーカーとしてのラミニンおよび／またはガレクチンの発現レベルを測定することによって、癌に罹患している疑いのある患者の腫瘍溶解性パルボウイルス（ＰＡＲＶＯＶＩＲＵＳ）Ｈ１（Ｈ－１ＰＶ）治療の臨床応答を予測する方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20220113BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D ZNA
G01N33/53 S
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021528896
(86)(22)【出願日】2019-11-14
(85)【翻訳文提出日】2021-07-14
(86)【国際出願番号】 EP2019081368
(87)【国際公開番号】W WO2020104294
(87)【国際公開日】2020-05-28
(31)【優先権主張番号】18207749.5
(32)【優先日】2018-11-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】512151403
【氏名又は名称】ドイッチェス・クレープスフォルシュングスツェントルム
【氏名又は名称原語表記】ＤＥＵＴＳＣＨＥＳ ＫＲＥＢＳＦＯＲＳＣＨＵＮＧＳＺＥＮＴＲＵＭ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】マルキーニ、アントーニオ
(72)【発明者】
【氏名】クルカルニ、アミット
(72)【発明者】
【氏名】グレベニヒ、アナベル
(72)【発明者】
【氏名】ロンメレーレ、ジャン
(72)【発明者】
【氏名】マルティラ、ティーナ
(72)【発明者】
【氏名】フェレイラ、ティアゴ
(57)【要約】
本発明は、癌患者における腫瘍溶解性パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）Ｈ１（Ｈ－１ＰＶ）による治療の結果を予測するためのバイオマーカーとしてのラミニンおよび／またはガレクチンの使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
癌に罹患している疑いのある患者の、パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）Ｈ１（Ｈ－１ＰＶ）による治療の結果を予測するための、ラミニンおよび／またはガレクチンからなる群から選択されるバイオマーカーの使用。
【請求項2】
前記ラミニンが、ＬＡＭＢ１および／またはＬＡＭＣ１である、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記ガレクチンがＬＧＡＬＳ１である、請求項１に記載の使用。
【請求項4】
癌に罹患している疑いのある患者が、前記癌のＨ－１ＰＶ療法の候補であるかどうかを決定する方法であって、患者の生体試料を少なくとも１つのアッセイに供して、ラミニンおよび／またはガレクチンからなる群から選択されるバイオマーカーの存在を測定する工程を含む方法。
【請求項5】
前記ラミニンが、ＬＡＭＢ１および／またはＬＡＭＣ１である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ガレクチンがＬＧＡＬＳ１である、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記生体試料が、生検材料、血液、血清または血漿である、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記癌が固形腫瘍である、請求項４から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記固形腫瘍が、脳癌、肺癌、乳癌、皮膚癌、結腸癌、膵癌または肝細胞癌である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記脳癌が神経膠芽腫であり、前記肺癌が非小細胞肺癌であり、前記膵癌が膵管腺癌であり、前記乳癌が浸潤性乳管癌であり、前記皮膚癌が黒色腫であり、前記結腸癌が結腸腺癌である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記非小細胞肺癌が、肺腺癌または肺扁平上皮癌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
癌に罹患している疑いのある患者がＨ－１ＰＶ療法の候補であるかどうかを予測するためのキットの使用であって、このキットが、（ａ）ラミニンおよび／またはガレクチンからなる群から選択されるバイオマーカーのレベルを測定するための手段と、
ｂ）場合により、癌に罹患している疑いのある患者がＨ－１ＰＶ療法の候補であるかどうかを予測する際の前記キットの前記使用のための指示を与えるラベルとを含む使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、癌患者における腫瘍溶解性パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）Ｈ１（Ｈ－１ＰＶ）による治療の結果を予測するためのバイオマーカーとしてのラミニンおよび／またはガレクチンの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍溶解性ウイルスは、導入遺伝子のための周知の発現ベクターである。数年前に、パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）ハイブリッドベクターを使用した形質転換細胞内の導入遺伝子発現の増大が報告されている３３。
【0003】
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、正常な健康な組織を害することなく、腫瘍細胞内で選択的に複製し、腫瘍細胞を破壊する１、２。それらは多様に作用する。ウイルス癌細胞の感染および増殖に続いて、腫瘍微小環境への子孫ウイルス粒子の放出に関連する腫瘍崩壊が起こる。これらの粒子は、隣接する癌細胞に感染し、２回目の溶菌感染を引き起こし、局所抗腫瘍効果の自己増幅をもたらすことができる。さらに、直接殺傷活性であるＯＶは、抗癌免疫を誘導することもできる３、４。実際、ウイルスが介在する癌細胞の殺傷は免疫原性であることが多く、腫瘍関連抗原、損傷関連分子パターンおよび病原体パターン（ｐａｔｈｏｇｅｎ ｐａｔｔｅｒｎ）（ＤＡＭＰおよびＰＡＭＰ）の放出を伴い、これにより、腫瘍床への免疫細胞の動員を刺激し、腫瘍微小環境の免疫変換（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）をもたらす。活性化された免疫細胞は、ＯＶに直接感染していない癌細胞（例えば、小さな播種性転移）の排除に関与する５。それらの抗癌活性の結果として、少なくとも９つの異なるウイルスファミリーに属する４０以上の異なる腫瘍溶解性ウイルスが、現在、様々な悪性腫瘍に対する臨床試験の初期または後期段階で試験されている。悪性転移性黒色腫に対するＧＭ－ＣＳＦをコードする遺伝子操作された単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶ）（タリモジーン・ラハーパレプベック、Ｔ－Ｖｅｃ、Ｉｍｌｙｇｉｃ（商標））について、米国および欧州で認められた販売承認により、２０１５年に１つの重要な画期的事項が達成された６。他のＯＶが他の癌の治療のために近い将来に承認され得るという理にかなった最適性が存在する７。ただし、独立した療法としてのＯＶは、腫瘍の完全な退縮を誘導することはほとんど報告されていない。ＯＶの臨床転帰を改善するための主な取組みは、毒性副作用を被ることなく癌細胞を死滅させる点でＯＶと相乗作用する他の抗癌様式を探索することに向けられている。１つの非常に有望な手段は、ＯＶと他の形態の免疫療法（例えば、チェックポイント遮断）との組合せである５。一方、腫瘍の遺伝的特徴がウイルス生活環に有利であるためにＯＶ治療から最も利益を得る可能性が高い患者を選択することも、臨床転帰を改善し、臨床コストおよび承認時間を削減する「スマート」臨床試験のデザインにつながる。ウイルス感染の様々な段階を調節する細胞決定因子を同定することによってウイルス生活環をさらによく理解することは、併用治療の合理的な設計と、患者層別化に使用されるバイオマーカーの同定とをともに導くために重要である。
【0004】
臨床的に意義のある腫瘍溶解性ウイルスの中には、ラットパルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）Ｈ－１ＰＶがある８。その抗癌能は、いくつかのインビトロ細胞系および動物モデルでは前臨床レベルで実証されている。例えば、髄芽腫細胞株では、パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）Ｈ－１の腫瘍溶解効果が報告されている３４。さらに、再発性神経膠芽腫に罹患している患者を対象とした最初の第Ｉ／ＩＩａ相試験の最近の完了により、独立型療法としてのＨ－１ＰＶ治療が安全であり、忍容性が良好であり、（ｉ）静脈内送達後に血液脳（腫瘍）関門を通過する能力（ｉｉ）広範囲の腫瘍内分布および発現（ｉｉｉ）腫瘍微小環境の免疫変換、ならびに（ｉｖ）既存対照と比較して、無増悪／総生存期間の中央値の延長を含む有効性の最初の証拠と関連することが実証された９。膵癌患者を対象としたもう１つの臨床試験が、現在、その評価段階にある。
【0005】
Ｈ－１ＰＶは、小さな無エンベロープ一本鎖ＤＮＡウイルスである。５．１ｋｂのそのゲノムは、その発現がそれぞれＰ４およびＰ３８プロモーターによって調節される非構造（ＮＳ）単位および構造（ＶＰ）単位の２つの遺伝子単位に編成される。ＮＳ遺伝子単位はＮＳ１、ＮＳ２非構造タンパク質をコードし、ＶＰ単位はＶＰ１およびＶＰ２カプシドタンパク質ならびに非構造ＳＡＴタンパク質をコードする。ＮＳ１は、ウイルスＤＮＡ複製および遺伝子転写を調節する多機能タンパク質であり、Ｈ－１ＰＶ腫瘍崩壊の主要な作用因子である１０。
【0006】
ＰＶの小さいゲノムサイズはタンパク質コード能力を制限し、これは、ウイルスＤＮＡ複製および遺伝子発現が宿主細胞因子に厳密に依存していることを暗示する。例えば、Ｈ－１ＰＶ複製は、急速に増殖する癌細胞に通常過剰発現するため、ウイルス腫瘍親和性（ｖｉｒｕｓ ｏｎｃｏｔｒｏｐｉｓｍ）の重要な決定因子であるＥ２Ｆ、ＣＲＥＢ、ＡＴＦおよびサイクリンＡ８、１０などの細胞因子に依存することが知られている。さらに、ＮＳ１の活性は、リン酸化およびアセチル化などの翻訳後修飾によって調節される１０、１１。これらの修飾はまた、関与する細胞因子の一部が癌細胞内でアップレギュレートされるか変化するため（例えば、ＮＳ１リン酸化１２に関与するＰＲＫＣＨ／ＰＫＣη）、ウイルス腫瘍親和性に寄与する。ただし、Ｈ－１ＰＶ生活環に何らかの役割を果たす細胞因子の多くは、依然として同定されていない。例えば、一部の癌細胞株がＨ－１ＰＶ感染に対して非常に感受性であるのに対して、同じ腫瘍実体に由来する他の癌細胞株は感受性が低いか、完全に抵抗性でさえある理由はほとんど分かっていない。細胞－宿主相互作用は、許容性のこれらの差を調節すると考えられている。例えば、いずれもウイルスの複製および感染性を支配する事象である、ウイルス細胞膜の付着および侵入、またはウイルスのサイトゾル輸送および核への移行のレベルで制限が起こり得る。
【0007】
ウイルスと宿主細胞との最初の遭遇は、宿主細胞膜上に露出した単一の受容体または受容体複合体への結合によって起こる。細胞表面分子の認識は、ウイルス感染を開始させるため、ウイル親和性および感染性の根底にある重要な決定因子である。パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科のメンバーの一部では機能性受容体が同定されているが（例えば、イヌおよびネコパルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）ではトランスフェリン受容体；いくつかのアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）血清型ではラミニン受容体を含むいくつかの受容体および付着因子３２、３５～３８）、Ｈ－１ＰＶ細胞膜認識に関与する受容体（複合体）は依然として分かっていない。細胞膜上に提示され、Ｈ－１ＰＶ細胞付着に必要な必須成分は、ＳＡ相互作用に関与するウイルスカプシド上にマッピングされた２つの残基を有するシアル酸（ＳＡ）であることが以前に同定された１７。ただし、ＳＡを介した細胞への最初の付着がＨ－１ＰＶ細胞膜の認識および侵入を媒介するのに十分であるかどうか、またはウイルスが、これらの事象のために、ＳＡを有するかＳＡを有しないタンパク質受容体との追加の相互作用を必要とするかどうかは分かっていない。ウイルス細胞膜結合後、Ｈ－１ＰＶ細胞の侵入は、その属に属する他のメンバーとの相同性に基づいて、クラスリン媒介性エンドサイトーシスを介して起こると推定されている１８。ただし、Ｈ－１ＰＶ細胞の侵入の特異的な機構は依然として把握されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
したがって、本発明の目的は、Ｈ－１ＰＶ細胞（共）受容体の同定に特に注目して、Ｈ－１ＰＶ生活環に関与する新規な細胞因子を同定することである。実際、ウイルス感染の成功のために存在する必要があるこれらの因子は、Ｈ－１ＰＶ治療に対する癌患者の応答を予測するためのバイオマーカーとして使用することができる。
【0009】
現在までのところ、Ｈ－１ＰＶに対する治療転帰と相関する有効な予測バイオマーカーは同定されていない。
【0010】
臨床試験に関与する患者に由来する生体試料のプロファイリング、ならびにそれらのゲノム／プロテオミクスおよび臨床データのその後の分析は、予測バイオマーカーの発見および潜在的検証を可能にする可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
この目的は、独立請求項の主題によって解決されている。好ましい実施形態は、従属請求項の主題である。
【0012】
一態様では、本発明は、患者の生体試料を少なくとも１つのアッセイに供して、ラミニンおよび／またはガレクチンから選択されるバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定する工程を含む、癌に罹患している疑いのある患者が上記癌のためのＨ－１ＰＶ療法の候補であるかどうかを決定する方法であって、生体試料中にバイオマーカーが存在する場合、患者がＨ－１ＰＶによる癌療法の候補として同定される方法を提供する。これらの因子（ラミニンおよび／またはガレクチン）が存在しないことはＨ－１ＰＶ治療に低感受性の腫瘍を示し得るため、それらが腫瘍内で発現することを検証することが重要である。これらの因子が存在しない場合、ウイルスは癌細胞の外側に留まり得る。
【0013】
本発明者らは、ラミニンおよびガレクチンファミリーのメンバーが、ウイルス細胞表面認識および侵入のレベルでＨ－１ＰＶ生活環の初期段階に中心的役割を果たすことを示す。さらに、本発明者らは、Ｈ－１ＰＶ感染性に対して異なる感受性を有する５３の異なる癌細胞株を使用することによって、ラミニンおよび／またはガラクチン、特に、ラミニンβ鎖、ラミニンγ鎖およびガレクチン－１をそれぞれコードするＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１の発現レベルとＨ－１ＰＶ腫瘍溶解活性との間に統計的に有意な正の相関を見出した。これらの結果は、ラミニンおよびガレクチンが、Ｈ－１ＰＶ感染の転帰を決定するための予後マーカーまたは予測マーカーとして役立ち得るという明確な証拠を提供する。
【0014】
上記のように、ラットプロトパルボウイルス（ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）Ｈ－１ＰＶは、現在臨床試験で評価されている腫瘍溶解性ウイルスである。再発性神経膠芽腫に罹患している患者を対象とした最初の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験では、Ｈ－１ＰＶ治療が安全であり、忍容性が良好であり、腫瘍微小環境の免疫変換、および有効性の代替証拠に関連することが示された。ウイルス感染性および腫瘍崩壊に必要な細胞決定因子の同定によるＨ－１ＰＶ生活環の機構的な理解は、臨床環境でウイルスをさらに効率的に適用するために絶対的に必要である。この改善された知見は、併用戦略の合理的なデザインを導き、さらに強力で効果的なウイルスの操作を助けるだけでなく、治療に応答する可能性が最も高い患者の選択に必要なバイオマーカーの同定にも寄与し得る。本発明では、本発明者らは、いくつかの異なるアプローチ（例えば、ｓｉＲＮＡライブラリースクリーニング、機能獲得および喪失実験、競合実験など）を使用することによって、ラミニンおよびガレクチンファミリーのメンバーがＨ－１ＰＶ細胞表面認識および侵入に関与することを示す。ラミニンおよびガレクチンがＨ－１ＰＶ感染の決定に重要な役割を果たすという発見は、Ｈ－１ＰＶの臨床使用にとって重要な意味を有する。例えば、本発明者らは、抗凝固剤として臨床診療で使用され、ラミニンに結合することが知られているヘパリンがＨ－１ＰＶ侵入を阻止し、それによってウイルス細胞感染および腫瘍崩壊を減少させ得ることを見出した。したがって、ウイルス治療とのヘパリンの同時使用および／または併用は慎重に考慮されるべきである。さらに、同定された遺伝子は、発癌に関与しており、低グレード脳グリオーマ（ｂｒａｉｎ ｌｏｗｅｒ ｇｒａｄｅ ｇｌｉｏｍａ）を含むいくつかの腫瘍型の予後不良のマーカーである。本発明者らは、これらの遺伝子の発現パターンがウイルス腫瘍親和性の決定因子の１つであり得ることから、これらの遺伝子がＨ－１ＰＶ治療の臨床応答を予測するためのバイオマーカーとして役立つことを想定した。本発明者らは、ラミニンおよびガレクチンの発現レベルとＨ－１ＰＶ感染に対する感受性が異なる５３の癌細胞株に対してＨ－１ＰＶが腫瘍崩壊を誘導する能力との間の直接的な相関を示すことによって、それに関する重要な証拠を提供する。
【0015】
高レベルのラミニンおよびガレクチンを発現する肺癌、ＣＮＳ癌、乳癌、膵臓および黒色腫に由来する癌細胞株は、Ｈ－１ＰＶ感染に対して最も感受性であった。対照的に、ラミニンおよびガレクチンのレベルが低い結腸癌および卵巣癌に由来する細胞株は、Ｈ－１ＰＶ感染に対して最も耐性であった。
【0016】
本発明者らは、「Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ」（ＴＧＣＡ、ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から得られたデータを使用して、特定の腫瘍について、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１発現レベルと患者生存率との間の反比例相関、すなわち、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１発現レベルが最も高ければ、生存率が最も不良であることを観察した。したがって、ＬＡＭＣ１過剰発現は、腎臓の乳頭状腎細胞癌（ｋｉｄｎｅｙ ｒｅｎａｌ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＫＩＲＰ）、低グレード脳グリオーマ（ＬＧＧ）、胃腺癌（ＳＴＡＤ）、膀胱尿路上皮癌（ＢＬＣＡ）、子宮頸部扁平上皮癌および子宮頸部腺癌（ＣＥＳＣ）、直腸腺癌（ＲＥＡＤ）ならびに肺腺癌（ＬＵＡＤ）の予後不良のマーカーと考えられ得る。一方、ＬＧＡＬＳ１過剰発現は、ＬＧＧ、腎臓腎明細胞癌（ＫＩＲＣ）、急性骨髄性白血病（ＬＡＭＬ）およびＢＬＣＡの予後不良と関連している（Ｐ値＜０．０５）（図１Ｃ）。ＬＡＭＣ１過剰発現および／またはＬＧＡＬＳ１過剰発現に起因して、普通であれば予後不良である上記の腫瘍は、Ｈ－１ＰＶ感染の理想的な候補であり、予後不良は、Ｈ－１ＰＶ感染に対するそれらの感受性に起因して、良好な予後に逆転される可能性がある。予後不良から良好またはさらに良好な予後への逆転は、患者の総生存期間および／または無増悪生存期間が、Ｈ－１ＰＶに基づく治療によって改善または増強され得ることを意味する。以下にさらに詳細に示すように、肺癌、ＣＮＳ癌、乳癌および黒色腫に由来する癌細胞株は、Ｈ－１ＰＶ感染に対して最も感受性であった。さらに、以前の結果と一致して、Ｈ－１ＰＶ感染に対して感受性の高い２つの遺伝子を比較的高レベルに発現する細胞株である神経膠芽腫細胞株では、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１ ｍＲＮＡレベルとＨ－１ＰＶ腫瘍崩壊との間の正の相関が見出された。
【0017】
Ｈ－１ＰＶは癌併用療法に特に適しているため、本発明はまた、それらの併用療法の治療効果を高めることにも寄与する。これに関して、Ｈ－１ ＰＶを使用した癌併用療法が記載されているいくつかの特許および特許出願、例えば、欧州特許第２０８２７４５号明細書、欧州特許第２４３１０４５号明細書、欧州特許第２２２７２４０号明細書、国際公開第２０１０／１３９４０１号パンフレット、国際公開第２０１１／１１３６００号パンフレット、欧州特許第３０２４４９１号明細書、国際公開第２０１６／１２８１４６号パンフレット、国際公開第２０１７／１６７６２６号パンフレットを参照されたい。
【0018】
用語「ラミニン」は、細胞外マトリックスの高分子量（約４００～約９００ｋＤａ）タンパク質を意味する。ラミニンは、ほとんどの細胞および器官のためのタンパク質ネットワークの基礎である基底層（基底膜の層のうちの１つ）の主要成分である。ラミニンは、細胞の分化、遊走および接着に影響を及ぼす、基底層の重要かつ生物学的に活性な部分である。ラミニンは、それぞれ５つ、４つおよび３つの遺伝的変異体に見出されるα鎖、β鎖およびγ鎖を含むヘテロ三量体タンパク質である。ラミニン分子は、その鎖組成に従って命名される。したがって、ラミニン５１１は、α５、β１およびγ１鎖を含む。１５の他の鎖の組合せが組織では同定されている。この三量体タンパク質は交差して、他の細胞膜および細胞外マトリックス分子に結合することができる交差様構造を形成する。３つの比較的短いアームは、他のラミニン分子に結合する点で特に優れており、これにより、それらがシートを形成することが可能になる。長いアームは細胞に結合することができ、これにより、組織化された組織細胞を膜に固定するのを助ける。糖タンパク質のラミニンファミリーは、生物のほぼすべての組織内の構造的足場の不可欠な部分である。それらは分泌され、細胞関連細胞外マトリックスに組み込まれる。ラミニンは、組織の維持および生存に不可欠である。例えば、正常な結腸直腸組織および乳房組織では、ＬＮ１１１が通常見出される。ヒト胃粘膜では、ＬＮα鎖２、３、６がさらに豊富である。他のラミニン鎖は、異なる発現パターンを有する。癌腫では、ラミニンの異常な発現も見出され得る１９。欠損したラミニンは、筋肉の不適切な形成を引き起こし、筋ジストロフィー、致死的な皮膚水疱症（接合部型表皮水疱症）、および腎臓濾過の欠損（ネフローゼ症候群）の形態をもたらし得る。１６のラミニン三量体が同定されている。ラミニンは、異なるα鎖、β鎖およびγ鎖の組合せである。
・α鎖の５つの形態は、ＬＡＭＡ１、ＬＡＭＡ２、ＬＡＭＡ３（３つのスプライス形態を有する）、ＬＡＭＡ４、ＬＡＭＡ５である。
・β鎖には、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＢ２、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＢ４が含まれる。
・γ鎖は、ＬＡＭＣ１、ＬＡＭＣ２、ＬＡＭＣ３である。
・α鎖の５つの形態は、ＬＡＭＡ１、ＬＡＭＡ２、ＬＡＭＡ３（３つのスプライス形態を有する）、ＬＡＭＡ４、ＬＡＭＡ５である。
・β鎖には、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＢ２、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＢ４が含まれる。
・γ鎖は、ＬＡＭＣ１、ＬＡＭＣ２、ＬＡＭＣ３である。
【0019】
用語「ガレクチン」は、Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化のいずれかによってタンパク質に結合することができるＮ－アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ）などのβ－ガラクトシド糖に特異的に結合するタンパク質のクラスを意味する。それらは、安定性のためのジスルフィド結合、および炭水化物結合に対する依存性のために、Ｓ型レクチンとも呼ばれる。哺乳動物では、ＬＧＡＬＳ遺伝子によってコードされる１５のガレクチンが発見されており、これらは連続的に番号付けされている。ヒトでは、ガレクチン－１、－２、－３、－４、－７、－８、－９、－１０および－１２のみが同定されている。齧歯類では、ガレクチン－５および－６が見られるが、ガレクチン－１１、－１４および－１５はヒツジおよびヤギに固有に見られる。大部分のレクチンとは異なり、それらは膜結合ではなく、細胞内および細胞外の両方の機能を有する可溶性タンパク質である。それらは、独特であるが重複する分布を有するが、主にサイトゾル、核、細胞外マトリックスまたは循環中に見出される。癌に果たすガレクチンの役割は、Ｅｂｒａｈｉｍらによる概説論文に要約されている２７。ガレクチンは、ラクトースなどのβ－ガラクトシドと相互作用する能力を有する保存された炭水化物認識ドメインを含むレクチンのファミリーを構成する。例えば、β－ラクトースがガレクチン－１に結合し、このタンパク質の機能性に影響を及ぼす配座変化を誘導することが見出された２８。本発明では、本発明者らは、ガレクチン－１と相互作用することによって、β－ラクトースがＨ－１ＰＶ感染／形質導入を減少させることを示した。
【0020】
用語「療法」、「治療薬」、「治療」および「治療する」は、本明細書では、（１）そのような用語が適用される疾患状態または状態の症状の進行、増悪または悪化を減速または停止させること、（２）そのような用語が適用される疾患状態または状態の症状を緩和するか、その改善をもたらすこと、および／または（３）そのような用語が適用される疾患状態または状態を逆転させるか、治癒させることを目的とする治療方法またはプロセスを特徴付けるために使用される。
【0021】
用語「総生存期間（ＯＳ）」は、治療中および治療後に患者が生存する時間の長さを指す。当業者が理解するように、患者が、患者の別のサブグループと比較して統計的に有意に長い平均生存時間を有する患者のサブグループに属する場合、患者の総生存期間が改善または増強される。
【0022】
用語「無増悪生存期間（ＰＦＳ）」は、治療医師または治験責任医師の評価によれば、その間、患者の疾患は悪化しない、すなわち進行しない、治療中および治療後の時間の長さを指す。当業者が理解するように、患者が、同様の状態にある患者の対照群の平均無増悪生存期間よりも、疾患が進行しない長い期間を有する患者のサブグループに属する場合、患者の無増悪生存期間が改善または増強される。
【0023】
本明細書では、用語「基準レベル」は、所定の値を指す。当業者が理解するように、基準レベルは予め決定され、例えば、特異性および／または感度に関して要件を満たすように設定される。これらの要件は、例えば、規制機関ごとに異なり得る。例えば、アッセイの感度または特異性をそれぞれ特定の限界、例えば、８０％、９０％または９５％に設定しなければならないことであり得る。これらの要件はまた、陽性または陰性の予測値に関して定義され得る。とはいえ、本発明で与えられる教示に基づいて、それらの要件を満たす基準レベルに到達することは常に可能である。一実施形態では、基準レベルは、健康な個体を対象に決定される。一実施形態では、基準値は、患者が属する疾病を対象に予め決定されている。特定の実施形態では、基準レベルは、例えば、検討される疾病における値の全体的な分布の２５％～７５％の任意の割合に設定され得る。他の実施形態では、基準レベルは、例えば、検討される疾病における値の全体的な分布から決定される中央値、三分位値または四分位値に設定され得る。一実施形態では、基準レベルは、検討される疾病における値の全体的な分布から決定される中央値に設定される。
【0024】
用語「予後」は、疾患の起こり得る転帰、ならびに症例の性質および症状によって示される疾患からの回復の見込みに関する予測を指す。したがって、負の予後または予後不良は、治療後生存期間または生存率の低下によって定義される。逆に、正の予後または良好な予後は、治療後生存期間または生存率の上昇によって定義される。通常、予後は、無増悪生存期間または総生存期間として提供される。
【0025】
用語「療法の監視」は、本発明の目的では、癌療法を受ける対象の疾患進行を観察することを意味する。換言すれば、治療中の対象は、適用された療法の効果について定期的に監視され、これにより、医師は、治療中の初期段階で、処方された治療が有効であるかどうかを推定することができ、したがって、それに応じて治療計画を調整することができる。
【0026】
本明細書で使用される場合、用語「対象」または「患者」は、限定するものではないが、特定の治療のレシピエントとなるヒト、非ヒト霊長類、齧歯類などを含む任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。典型的には、用語「対象」および「患者」は、本明細書では、ヒト患者に関して区別なく使用される。本明細書で使用される場合、用語「癌を有する疑いのある対象」は、癌（例えば、顕著な塊または腫瘤）を示す１つ以上の症状を呈する対象を指す。「癌を有する（疑いのある）対象」は、初期診断（例えば、腫瘤を示すＣＴスキャン）を受けたが、癌のサブタイプまたはステージが分からない個体を包含する。この用語にはさらに、以前に癌を有した人（例えば、寛解状態の個体）、および癌を有し、原発性腫瘍の転移拡散を有する疑いのある人が含まれる。
【0027】
用語「癌」および「癌細胞」は、多細胞生物の組織または器官内で、制御されない増殖を示す任意の細胞を指す。本発明に関連して特に好ましい癌は、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、皮膚癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、腎癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）、尿路の癌、甲状腺癌、腎癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、黒色腫、白血病、頭頸部癌、多発性骨髄腫または脳癌である。好ましい実施形態では、脳癌は神経膠芽腫であり、肺癌は非小細胞肺癌であり、膵癌は膵管腺癌であり、乳癌は浸潤性乳管癌であり、皮膚癌は黒色腫であり、結腸癌は結腸腺癌である。
【0028】
本明細書で使用される用語「生体試料」は、取得され、本発明によって開示されるラミニンおよび／またはガレクチンのいずれか１つ、またはそれらの遺伝子発現についてアッセイされ得る試料を指す。生体試料には、生体液（例えば、血液、脳脊髄液、尿、血漿、血清）、組織生検材料などが含まれ得る。いくつかの実施形態では、試料は、組織試料、例えば、腫瘍組織であり、新鮮、凍結または保管パラフィン包埋組織であり得る。特定の組織、器官または局所領域に由来する特定の生体液、および特定の他の生体液は、対象または生物学的供給源では比較的全体的または全身的に位置し得る。生体液の例には、血液、血清、血漿、リンパ液、尿、脳脊髄液、唾液、分泌組織および器官の粘膜分泌物、膣分泌物、腹水液、例えば、非固形腫瘍に関連するもの、胸膜、心膜、腹膜、腹腔および他の体腔の液などが挙げられる。生体液にはまた、対象または生物学的供給源と接触した液体溶液、例えば、細胞または器官馴化培地を含む細胞および器官培養培地、洗浄液などが含まれ得る。特定の非常に好ましい実施形態では、生体試料は血清であり、特定の他の非常に好ましい実施形態では、生体試料は生検材料である。
【0029】
本発明はさらに、癌に罹患している疑いのある患者がＨ－１ＰＶ療法の候補であるかどうかを予測するためのキットに関し、このキットは、
（ａ）ラミニンおよび／またはガレクチンからなる群から選択されるバイオマーカーのレベルを測定するための手段と、
ｂ）場合により、癌に罹患している疑いのある患者がＨ－１ＰＶ療法の候補であるかどうかを予測する際の上記キットの使用のための指示を与えるラベルとを含む。
（ａ）ラミニンおよび／またはガレクチンからなる群から選択されるバイオマーカーのレベルを測定するための手段と、
ｂ）場合により、癌に罹患している疑いのある患者がＨ－１ＰＶ療法の候補であるかどうかを予測する際の上記キットの使用のための指示を与えるラベルとを含む。
【0030】
本発明の上記の方法および使用は、例えば、インビトロまたはエクスビボの方法および使用であり得る。
【0031】
ラミニンおよび／またはガレクチンタンパク質の発現レベルを測定するための手段は、当技術分野で周知であり、ＥＬＩＳＡアッセイなどのイムノアッセイを含む。この方法は、ラミニンまたはガレクチンタンパク質に結合する抗体、例えば、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、抗体変異体もしくは断片、例えば、一本鎖抗体、ダイアボディ、ミニボディ、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃ（Ｆｖ））、Ｓｃ（Ｆｖ）２抗体、Ｆａｂ断片もしくはＦ（ａｂ’）２断片、または単一ドメイン抗体を含む。そのような抗体、例えば、マウスモノクローナル抗ラミニンγ－１、マウスモノクローナル抗ラミニンβ－１またはウサギポリクローナル抗ガレクチン－１は、当技術分野で周知であり、市販されている。それらはまた、ラミニンまたはガレクチンタンパク質による動物（例えば、ウサギ、ラットまたはマウス）の免疫化によって特に得られ得る。抗体は、ウエスタンブロッティング、免疫組織化学／免疫蛍光（すなわち、固定細胞または組織に対するタンパク質検出）、ＲＩＡ（放射－結合イムノアッセイ（ｒａｄｉｏ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））などのラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、例えば、ＦＩＡ（蛍光－結合イムノアッセイ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、化学発光イムノアッセイ、ＥＣＬＩＡ（電気化学発光イムノアッセイ）およびプロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用する競合アッセイ系および非競合アッセイ系を含む様々な免疫学的アッセイにおいてタンパク質発現を決定するために使用され得る。そのようなアッセイは常用的であり、当業者に周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａ／（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ｌｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【0032】
ラミニンまたはガレクチンのタンパク質発現は、質量分析アッセイ（ＬＣ－ＭＳまたはＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）などのプロテオーム法によって決定され得る。当技術分野では、定性的および定量的質量分析技術が公知であり、使用される。この目的のために、マーカータンパク質に特異的な標的ペプチドが選択され、安定同位体によって標識された合成ペプチドを用いて確立された較正曲線に基づいて定量される。規定された量の同位体標識標的ペプチドを添加した酵素消化物を、質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィーにより分析する。標識標的ペプチドと非標識標的ペプチドとの間の比を測定して、標的ペプチド濃度、したがってタンパク質マーカー濃度を評価する。
【0033】
ラミニンまたはガレクチンの発現レベルを測定するための手段はまた、例えば、反応緩衝液および／または洗浄緩衝液などの試薬を含み得る。手段は、例えば、バイアルまたはマイクロタイタープレートに存在していても、プライマーおよびプローブの場合のようにマイクロアレイなどの固体支持体に結合されていてもよい。
【0034】
ラミニンおよびガレクチンの遺伝子発現レベルを測定するための他の方法はまた、核酸分析、すなわち、限定するものではないが、ＲＴ－ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、ナノストリング技術、マイクロアレイ、ＦＩＳＨおよびノーザンブロットを含むｍＲＮＡレベルに基づいてもよい。
【0035】
ここで、以下の例では、添付の図面を参照して本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】ｓｉＲＮＡライブラリースクリーニングは、Ｈ－１ＰＶ生活環の調節因子としてＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１を明らかにする。 Ａ、プロトコルデザイン。６，９６１のｓｉＲＮＡプール（４つのｓｉＲＮＡ／プール／遺伝子）からなる完全なｓｉＲＮＡヒトドラッガブルゲノムライブラリー（Ｑｉａｇｅｎ）を９６ウェルプレートに３連でスポットし（１つのプール／ウェル）、次いでＨｅＬａ細胞に逆トランスフェクトした。４８時間後、ＥＧＦＰレポーター遺伝子を有する組換えＨ－１ＰＶ（ｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ）に細胞を感染させた。Ｈ－１ＰＶ形質導入効果の測定として、感染の２４時間後にＥＧＦＰシグナルを定量した。内部陽性対照および内部陰性対照を各プレートに加えて、材料および方法に記載されているようにプレート間および日ごとの変動性を確認した。 Ｂ、ｓｉＲＮＡライブラリースクリーニングにより、Ｈ－１ＰＶ生活環の活性化因子としてＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１を同定した、 Ｃ、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１は、様々な異なる癌でアップレギュレートされ、予後不良のマーカーである。Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ、ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から得られた遺伝子発現データおよび臨床情報を検討して、２１の癌型におけるＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１の遺伝子発現と患者生存率との関連を調査した。視覚化を容易にするために、各癌型（Ｙ軸）について、（Ｃｏｘ検定）ｐ値の－ｌｏｇ１０をＸ軸に示す。黒点線は、ｐ＝０．０５の位置を示す。ＬＡＭＬ：急性骨髄性白血病；ＢＬＣＡ：膀胱尿路上皮癌；ＬＧＧ：低グレード脳グリオーマ；ＢＲＣＡ：浸潤性乳癌；ＣＥＳＣ：子宮頸部扁平上皮癌および子宮頸部腺癌；ＣＯＡＤ：結腸腺癌；ＥＳＣＡ：食道癌；ＧＢＭ：多形神経膠芽腫；ＨＮＳＣ：頭頸部扁平上皮癌；ＫＩＲＣ：腎臓腎明細胞癌；ＫＩＲＰ：腎臓の乳頭状腎細胞癌；ＬＩＨＣ：肝細胞癌；ＬＵＡＤ：肺腺癌；ＬＵＳＣ：肺扁平上皮癌；ＯＶ：卵巣漿液性嚢胞腺癌；ＰＡＡＤ：膵腺癌；ＲＥＡＤ：直腸腺癌；ＳＡＲＣ：肉腫；ＳＫＣＭ：皮膚黒色腫（ｓｋｉｎ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍｅｌａｎｏｍａ）；ＳＴＡＤ：胃腺癌、ＵＣＥＣ：子宮体部子宮内膜癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｏｒｐｕｓ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）。
【図2】ラミニンγ１はＨ－１ＰＶの細胞受容体である。 Ａ、ＬＡＭＣ１のサイレンシングはＨ－１ＰＶ細胞取り込みを減少させる。ＨｅＬａ細胞に、対照ｓｉＲＮＡ、またはＬＡＭＣ１の２つの別個の領域を標的とする２つの異なるｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの４６時間後、細胞をＨ－１ＰＶ（ＭＯＩ１、ｐｆｕ／細胞）に３７℃で４時間かけて感染させた。細胞を回収し、ウイルスＤＮＡを、ＱｉＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎキットを使用して抽出し、次いで、材料および方法に記載されているようにｑＰＣＲを使用して定量した。結果は、対照ｓｉＲＮＡに対して正規化された細胞関連ウイルスゲノムの％として示される。列の上部の数字は、３連の実験からの相対標準偏差バーとともに、平均Ｈ－１ＰＶ取り込み値を示す。ウエスタンブロット分析により、ローディング対照としてβ－チューブリンを使用して、ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞内のＬＡＭＣ１のダウンレギュレーションを確認した。 Ｂ、ＬＡＭＣ１のサイレンシングはＨ－１ＰＶ形質導入を減少させる。ＨｅＬａ細胞に、パネルＡに使用したのと同じｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの４６時間後、細胞をｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（１ＴＵ、ＧＦＰ／細胞）に感染させ、さらに２４時間増殖させた。次いで、細胞を固定し、透過処理し、ＤＡＰＩを用いて染色した。ＢＺ－９０００蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて２０倍対物レンズを使用して画像を取得した。数字は、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞で得られたものに対して正規化されたＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を示す。
【図3】ＬＡＭＣ１のサイレンシングはＨ－１ＰＶ腫瘍毒性（ｏｎｃｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）から細胞を保護する。ＨｅＬａ細胞に対照またはＬＡＭＣ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞をＨ－１ＰＶ（ＭＯＩ０．２５、ｐｆｕ／細胞）に感染させ、またはＨ－１ＰＶに感染させずに、さらに７２時間増殖させた後、材料および方法に記載されているようにＣｅｌｌＴｉｔｒｅ－Ｇｌｏ ２．０アッセイによって細胞生存率の測定を行った。列の上部の数字は、非感染細胞に対して正規化された細胞生存率の％を表す。
【図4】ＬＡＭＣ１抗体はＨ－１ＰＶ細胞取り込みを損なう。 ＨｅＬａ細胞を、ＩｇＧアイソタイプ（対照）、無関係なエフリンＢ型受容体（ＥＰＨＢ２）またはラミニンγ１（ＬＡＭＣ１）抗体のいずれかと氷上で４５分間インキュベートした。細胞をＨ－１ＰＶ（ＭＯＩ０．２５ ｐｆｕ／細胞）を用いて最初に氷中で３０分間処理し、次いで無血清培地中３７℃で６０分間処理することによって、Ｈ－１ＰＶ細胞膜結合／侵入アッセイを行った。次いで、図２Ａの凡例に記載されているように細胞を処理した。
【図5】ＬＡＭＣ１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性ノックダウンは、外因性ＬＡＭＣ１の再導入によって救済されるＨ－１ＰＶ取り込みを損なう。親ＨｅＬａおよびＬＡＭＣ１ ＫＤ（ＣＲＩＳＰＲ（商標）Ｃａｓ９技術を使用して構築されたＬＡＭＣ１ノックダウンＨｅＬａ細胞株）に、空ベクター（＋ベクター単独）、またはＬＡＭＣ１を発現するベクター（＋ＬＡＭＣ１）のいずれかをトランスフェクトしたかトランスフェクトしなかった。トランスフェクションの４８時間後、ウイルス取り込みアッセイのために、細胞をＨ－１ＰＶ（ＭＯＩ１００ ｐｆｕ／細胞）に３７℃で４時間かけて感染させた。次いで、図２Ａの凡例に記載されているように細胞を処理した。
【図6】ＬＡＭＣ１の過剰発現はＨ－１ＰＶ細胞取り込みを増強する。 Ａ、ＨｅＬａ細胞に、空ベクター（＋ベクター単独）、またはＬＡＭＣ１を有するベクターのいずれかをトランスフェクトした。次いで、図２Ａに記載されているように細胞を処理した。Ｂ、ＨｅＬａにおけるＬＡＭＣ１の過剰発現はＨ－１ＰＶ形質導入を増強する。ＨｅＬａ細胞に、ベクター単独、またはＬＡＭＣ１を発現するベクターのいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクションの４６時間後、細胞をｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（０．２５ＴＵ、ＧＦＰ／細胞）に感染させ、さらに２４時間増殖させ、図２Ｂの凡例に記載されているように処理した。統計学的有意性は、対応のない両側スチューデントｔ検定によって計算し、＊＜ｐ－０．０５；＊＊＜ｐ－０．０１；＊＊＊＜ｐ－０．００１であった。
【図7】ヘパリンによる処理はＨ－１ＰＶ細胞取り込みを減少させる。 Ａ、ヘパリナーゼＩＩＩによる細胞表面ヘパラン硫酸の除去ではなくヘパリンによる処理は、Ｈ－１ＰＶ取り込みを損なう。ＨｅＬａ細胞をヘパリナーゼＩＩＩ（０．１Ｕ／ｍｌ）またはヘパリン（５０μｇ／ｍｌ）を用いて１８時間前処理した後、Ｈ－１ＰＶ（ＭＯＩ１、ｐｆｕ／細胞）に３７℃で４時間かけて感染させた。次いで、図２Ａに記載されているように細胞を処理した。 Ｂ、ヘパリンは濃度依存的にＨ－１ＰＶ取り込みを損なう。ＨｅＬａ細胞を漸増量のヘパリン（μｇ／ｍｌ）と２４時間プレインキュベートし、次いで、Ｈ－１ＰＶ（ＭＯＩ１、ｐｆｕ／細胞）に３７℃で４時間かけて感染させた。ウイルス細胞結合／侵入を阻止するための陽性対照として、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）［０．１Ｕ／ｍｌ］を使用した。インキュベーションの終了時に、図２Ａに記載されているように細胞を処理した。結果は、ＨｅＬａ未処理細胞と比較した細胞関連ウイルスゲノム（％）として示される。 Ｃ、ヘパリンによる処理はＨ－１ＰＶ形質導入を損なう。ＨｅＬａ細胞をヘパリン（１００μｇ／ｍｌ）と１８時間プレインキュベートし、次いで、さらに２４時間かけてｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（ＴＵ０．５、ＧＦＰ／細胞）に感染させた。次いで、図２Ｂに記載されているように細胞を処理した。 Ｄ、ヘパリンによる処理は、Ｈ－１ＰＶ腫瘍毒性から細胞を保護する。ＨｅＬａ細胞をヘパリン（１００μｇ／ｍｌ）またはＮＡ（０．１Ｕ／ｍｌ）を用いて１８時間前処理し、次いで、Ｈ－１ＰＶ（ＭＯＩ１、ｐｆｕ／細胞）に９６時間かけて感染させた。ＣｅｌｌＴｉｔｒｅ－Ｇｌｏ ２．０アッセイによって細胞生存率を評価した。結果は、未処理細胞に対して正規化された細胞生存率％として示される。未処理細胞または処理細胞の代表的な位相差顕微鏡画像も示す（Ｅ）。
【図8】γ１鎖を含む可溶性ラミニンによる処理はＨ－１ＰＶ形質導入を損なう。 ＨｅＬａ細胞を２μｇ／ｍｌの示したラミニンまたはフィブロネクチンと２４時間プレインキュベートし、次いで、ｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（ＴＵ０．５、ＧＦＰ／細胞）にさらに２７時間かけて感染させた。ウイルス感染を阻止するための陽性対照として、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）［０．１Ｕ／ｍｌ］を使用した。次いで、図２Ｂの凡例に記載されているように細胞を処理した。
【図9】ＬＡＭＢ１はＨ－１ＰＶ細胞侵入に何らかの役割を果たす。 Ａ、ＬＡＭＢ１のサイレンシングはＨ－１ＰＶ感染性を低下させる。ＨｅＬａ細胞に、対照ｓｉＲＮＡ、または遺伝子の異なる領域を標的とする２つのＬＡＭＢ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの４６時間後、細胞をＨ－１ＰＶ（ＭＯＩ１、ｐｆｕ／細胞）に感染させた。細胞結合／侵入アッセイを３７℃で４時間行い、次いで、細胞を図２Ａに記載されているように処理した。ウエスタンブロット分析により、ＬＡＭＢ１のｓｉＲＮＡ媒介性ダウンレギュレーションを確認した。ローディング対照としてβ－チューブリンを使用した。 Ｂ、ｓｉＲＮＡによるＬＡＭＢ１のダウンレギュレーションはＨ－１ＰＶ形質導入を減少させる。ＨｅＬａ細胞に対照ｓｉＲＮＡまたはＬＡＭＢ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの４６時間後、細胞をｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（ＴＵ０．５ ＧＦＰ／細胞）に２４時間かけて感染させた。次いで、図２Ｂに記載されているように細胞を処理した。
【図10】ガレクチン－１はＨ－１ＰＶ侵入にも関与する。 Ａ、ＬＧＡＬＳ１のサイレンシングはＨ－１ＰＶ細胞取り込みを減少させる。ＬＧＡＬＳ１の２つの異なる領域を標的とする２つのｓｉＲＮＡを使用して、図２Ａに記載されているように実験を行った。ＬＧＡＬＳ１サイレンシング効率を制御するために、ウエスタンブロット分析を行った。 Ｂ、ＬＧＡＬＳ１のｓｉＲＮＡ媒介性ダウンレギュレーションはＨ－１ＰＶ形質導入を減少させる。図２Ｂに記載されているように実験を行った。
【図11】ＬＡＭＣ１、ＬＡＭＢ１およびＬＧＡＬＳ１のダウンレギュレーションはＨ－１ＰＶ腫瘍毒性から細胞を保護する。 ＨｅＬａ細胞に、対照ｓｉＲＮＡ、またはＬＡＭＣ１、ＬＡＭＢ１もしくはＬＧＡＬＳ１を標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞をＨ－１ＰＶ（ＭＯＩ０．２５ ｐｆｕ／細胞）に感染させた。ウイルス細胞膜結合／侵入を阻止するための対照として、０．１Ｕ／ｍｌの濃度のノイラミニダーゼ（ＮＡ）を使用した。感染の７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｒｅ－Ｇｌｏ ２．０アッセイによって細胞生存率を評価した。結果は、非感染細胞と比較した細胞生存率の割合（％）として示される。列の上部の数字は、相対標準偏差バーとともに、６回の生物学的複製から得られた平均細胞生存率値を示す。統計学的有意性は、対応のない両側スチューデントｔ検定によって計算し、＊＜ｐ－０．０５；＊＊＜ｐ－０．０１；＊＊＊＜ｐ－０．００１であった。
【図12】ＬＡＭＣ１、ＬＡＭＢ１およびＬＧＡＬＳ１はＨ－１ＰＶウイルス細胞膜結合／侵入に関与する。 ＨＣＴ１１６（Ａ）およびＡ５４９（Ｂ）癌細胞株を使用して、ＬＡＭＣ１、ＬＡＭＢ１およびＬＧＡＬＳ１がＨ－１ＰＶ細胞取り込みに関与することを示す、ＨｅＬａ細胞で得られた結果を確認した。細胞に、示したｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、図２Ａに記載されているように処理した。結果は、対照ｓｉＲＮＡに対して正規化された細胞関連ウイルスゲノム（％）として示される。ウエスタンブロット分析－βチューブリンをローディング対照として使用した、タンパク質レベルでの３つの遺伝子の対照ｓｉＲＮＡ媒介性ダウンレギュレーション。
【図13】ＮＣＩ－６０癌細胞株のスクリーニングは、Ｈ－１ＰＶ腫瘍毒性の重要な決定因子としてのＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１を明らかにする。 Ａ、細胞増殖分析。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）を使用することによって、Ｈ－１ＰＶ感染に対する感受性について、ＮＣＩ６０パネルに属する５３の癌細胞株を試験した。癌細胞株を未処理のままにしたか、示したＨ－１ＰＶ感染多重度（ＭＯＩ、プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞）に感染させた。細胞増殖を合計１６８時間にわたりリアルタイムで監視し、正規化細胞指数（ＣＩ）として表した。１つのＨ－１ＰＶ感受性（ＳＮＢ－７５）および１つのＨ－１ＰＶ耐性（ＣＯＬＯ２０５）癌細胞株の速度論的応答プロファイルを代表例として示す。 Ｂ、ＥＣ５０値の計算。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ分析によって得られたＣＩ値を使用して、感染後の４つの時点（２４、４８、７２および９６時間、補足図２も参照）でのＥＣ５０値（細胞集団の５０％を死滅させるウイルスＭＯＩ）を計算した。７２時間に対応するＥＣ５０値に基づいて、示した６つの群に癌細胞株を分類した。 Ｃ、比較遺伝子発現分析。利用可能な遺伝子発現プロファイルデータセットを使用してＨ－１ＰＶ感受性癌細胞株対非感受性［ＭＯＩ（ｐｆｕ／細胞）５０に耐性］癌細胞株の遺伝子発現プロファイルを比較したＤＴＰ－ＣＯＭＰＡＲＥ分析［ｈｔｔｐｓ：／／ｄｔｐ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｄａｔａｂａｓｅｓ＿ｔｏｏｌｓ／ｃｏｍｐａｒｅ．ｈｔｍ］のインプットとして、ＥＣ５０値（７２時間）を使用した。この方法によって、推定Ｈ－１ＰＶ抑制因子（Ｈ－１ＰＶ耐性癌細胞株でアップレギュレートされ、および／または感受性癌細胞株でダウンレギュレートされる遺伝子）および活性化因子（感受性癌細胞株でアップレギュレートされ、および／または耐性癌細胞株でダウンレギュレートされる遺伝子）を同定した。 Ｄ、示差的発現分析。ＣｅｌｌＭｉｎｅｒ生物情報学ツール［ｈｔｔｐｓ：／／ｄｉｓｃｏｖｅｒ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｅｌｌｍｉｎｅｒ／］を利用して、ＮＣＩ－６０癌細胞株のパネルから得られた遺伝子発現データを検索した。次いで、検索したデータを調整し、前処理し、６つの非感受性［ＭＯＩ（ｐｆｕ／細胞）５０に耐性］と４７のＨ－１ＰＶ感染感受性とを比較することによって得られた遺伝子発現データを統合することによって変換した。次いで、Ｈ－１ＰＶ生活環に関与する候補遺伝子の同定に、Ｌｉｍｍａ＋Ｂ＆Ｈ補正に基づく示差的発現分析を適用した（ｐ＜０．０５）。 Ｅ、ベン図。共通のＨ－１ＰＶ活性化因子を同定するために、ＤＴＰ－ＣＯＭＰＡＲＥおよび示差的発現分析から得られた推定活性化因子の一覧を統合した。
【図14】Ｈ－１ＰＶ生活環の共通の活性化因子を同定するためのデータセット統合。 ａ、ベン図。ｓｉＲＮＡライブラリー（図１）およびＮＣＩ－６０癌細胞株（図１３）スクリーニングから得られた２つのデータセットの統合により、Ｈ－１ＰＶ生活環の強力な活性化因子としてＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１を同定した。
【図15】ＬＧＡＬＳ１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性ノックアウトは、外因性ＬＧＡＬＳ１の再導入によって救済されるＨ－１ＰＶ形質導入を損なう。ウエスタンブロット分析により、ＮＣＨ１２５－ＬＧＡＬＳ１ＫＯ細胞におけるＬＧＡＬＳ１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性ノックアウトを確認した。ガレクチン－１をコードするプラスミド（ｐＬＧＡＬＳ１－ｍＣｈｅｒｒｙ）の一過性トランスフェクション後に、これらの細胞ではＬＧＡＬＳ１発現が再確立された。ローディング対照としてβ－チューブリンを使用した。ＮＣＨ１２５－ＬＧＡＬＳ１ＫＯ細胞（ＬＧＡＬＳ１ＫＯ）に、ｐＬＧＡＬＳ１－ｍＣｈｅｒｒｙをトランスフェクトしたかトランスフェクトしなかった。トランスフェクションの４８時間後、細胞をｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（０．３ＴＵ、ＧＦＰ／細胞）に感染させ、さらに２４時間増殖させた。数字は、ＮＣＨ１２５－対照で得られたものに対して正規化されたＥＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を示す。統計学的有意性は、対応のない両側スチューデントｔ検定によって計算した＊＜ｐ－０．０５、＊＊ｐ－０．０１、＊＊＊ｐ－０．００１。
【図16】神経膠芽腫細胞株では、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１ ｍＲＮＡ発現レベルは、細胞溶解を誘導するＨ－１ＰＶ有効性と相関する。 Ａ、示した神経膠腫由来細胞株をＨ－１ＰＶ（ＭＯＩ１０、ｐｆｕ／細胞）に７２時間かけて感染させた後、ＬＤＨアッセイのために処理して、Ｈ－１ＰＶ誘導性細胞溶解を測定した。 Ｂ、全ＲＮＡの単離後、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析によって、６つの神経膠芽腫細胞株のＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１ ｍＲＮＡ発現レベルを測定した。値は、ハウスキーピング遺伝子としてＡＴＣＢ１、ＲＰＬ１９およびＧＡＰＤＨを使用して正規化した。列の上部の数字は、Ｈ－１ＰＶ高感受性癌細胞株（ＮＣＨ１２５またはＮＣＨ３７）と低感受性癌細胞株（Ｕ２５１、ＬＮ３０８、Ｔ９８ＧおよびＡ１７２－ＭＧ）との間の遺伝子発現倍数変化を示す。
【0037】
例
例１：材料および方法
細胞株
子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞株は、Ａｎｇｅｌ Ａｌｏｎｓｏ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から寄贈された。形質転換されたヒト胎児腎ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、ＡＴＣＣ（ＬＧＳ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＧｍＢＨ、Ｗｅｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。結腸直腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）由来ＨＣＴ１１６、および肺腺癌由来Ａ５４９細胞株は、国立癌研究所（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ＵＳ）により入手した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地中で、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３ＴおよびＬＡＭＣ１－ＫＤ（ＬＡＭＣ１発現がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術によってダウンレギュレートされた、本試験で確立された操作されたＨｅＬａ細胞株）を増殖させた。ＬＡＭＣ１－ＫＤの場合、クローン選択、増殖および維持のために、２μｇ／ｍｌピューロマイシンを培地に加えた。１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミンを加えたＲＰＭＩ培地中で、ＨＣＴ１１６およびＡ５４９癌株を増殖させた。この試験で使用したＮＣＩ ６０パネルに属する５３の癌株はいずれも、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミンを加えたＲＰＭＩ培地中で増殖させた。全細胞株を３７℃、５％ＣＯ２および９０％湿度中で増殖させた。細胞株については、ヒト細胞認証試験（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｏｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によってその同一性を検証し、頻繁に試験し、ＶｅｎｏｒＧＥＭ ＯｎｅＳｔｅｐマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）汚染キット（Ｍｉｎｅｒｖａ ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してマイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）汚染がないことを確認した。
例１：材料および方法
細胞株
子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞株は、Ａｎｇｅｌ Ａｌｏｎｓｏ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から寄贈された。形質転換されたヒト胎児腎ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、ＡＴＣＣ（ＬＧＳ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＧｍＢＨ、Ｗｅｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。結腸直腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）由来ＨＣＴ１１６、および肺腺癌由来Ａ５４９細胞株は、国立癌研究所（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ＵＳ）により入手した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地中で、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３ＴおよびＬＡＭＣ１－ＫＤ（ＬＡＭＣ１発現がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術によってダウンレギュレートされた、本試験で確立された操作されたＨｅＬａ細胞株）を増殖させた。ＬＡＭＣ１－ＫＤの場合、クローン選択、増殖および維持のために、２μｇ／ｍｌピューロマイシンを培地に加えた。１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミンを加えたＲＰＭＩ培地中で、ＨＣＴ１１６およびＡ５４９癌株を増殖させた。この試験で使用したＮＣＩ ６０パネルに属する５３の癌株はいずれも、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミンを加えたＲＰＭＩ培地中で増殖させた。全細胞株を３７℃、５％ＣＯ２および９０％湿度中で増殖させた。細胞株については、ヒト細胞認証試験（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｏｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によってその同一性を検証し、頻繁に試験し、ＶｅｎｏｒＧＥＭ ＯｎｅＳｔｅｐマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）汚染キット（Ｍｉｎｅｒｖａ ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してマイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）汚染がないことを確認した。
【0038】
Ｈ－１ＰＶ形質導入の高含有量ｓｉＲＮＡベースのスクリーニング
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から、６，９６１個の細胞遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡプール（４つのｓｉＲＮＡ／プール）を含むヒトドラッガブルゲノムｓｉＲＮＡ Ｓｅｔ ４．０ライブラリーを購入した。ライブラリーをスポットし、次いで、ＩＮＴＥＲＦＥＲｉｎ試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、Ｇｒｅｉｎｅｒ μＣｌｅａｒ ９６ウェルマイクロプレートで増殖させたＨｅＬａ細胞に逆トランスフェクトした。最小の毒性で９０～９５％のトランスフェクション効率に達するようにハイスループットトランスフェクションプロトコルを最適化した。スクリーニングは、技術的な３連で行った。同じ細胞継代（ｎ＝３、解凍後）、血清およびトランスフェクション剤バッチを全プレートに使用して、生物学的変動性を制限した。各マイクロプレートに、以下の内部対照ｓｉＲＮＡを使用して、プレート間および日ごとの変動を制御した：（ｉ）ＮＳ１－ｓｉＲＮＡ５：５’ＧＡＡＴＧＧＴＴＡＣＣＡＡＴＣＴＡＣＣ３’、ＮＳ１コード領域を標的とするｓｉＲＮＡ、ＮＳ１タンパク質がウイルス形質導入に必須であることから陽性対照として使用、（ｉｉ）スクランブルｓｉＲＮＡ：５’ＡＡＴＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＧＴ３’、非標的化ｓｉＲＮＡ、陰性対照として使用（Ｑｉａｇｅｎ）、および（ｉｉｉ）ポロ様キナーゼ１遺伝子（ＰＬＫ１）ｓｉＲＮＡ：ＰＬＫ１遺伝子のサイレンシングが細胞死をもたらすことから、この遺伝子を標的とする５’ＣＡＡＣＣＡＡＡＧＴＣＧＡＡＴＡＴＧＡ３’をトランスフェクション効率制御として使用。トランスフェクションの２日後、細胞をｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（ＥＧＦＰを発現する組換えＨ－１ＰＶ）２０にＭＯＩ０．３５ ｐｆｕ／細胞で感染させ、さらに２４時間増殖させた。次いで、プレートを固定し、ＤＡＰＩを用いて染色し、蛍光イメージングに供して、ＧＦＰ陽性細胞の割合を決定することによってＨ－１ＰＶ形質導入効率を定量した。ｓｉＲＮＡ、トランスフェクション試薬、細胞およびウイルスのプレート分配に、ＴＥＣＡＮ Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ液体処理ワークステーションを使用した。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＩＮＣＥＬＬ１０００ ＨＣＳ落射蛍光顕微鏡（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてハイスループット細胞イメージングを行い、１マイクロウェル当たり平均２５，０００個の細胞を分析した。Ｍｕｌｔｉ Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳ）を使用して、細胞核を可視化し（ＤＡＰＩ染色）、ＧＦＰ共局在を定量して、形質導入された細胞の割合を決定した。次いで、本発明者らの細胞セグメント化プロトコルを適用して、分析したＤＡＰＩ染色細胞１個当たりのＧＦＰシグナル強度を決定した。ＲＲｅｐｏｒｔＧｅｎｅｒａｔｏｒソフトウェアを用いて単一細胞データを分析し、統計学的有意性を決定した２１。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から、６，９６１個の細胞遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡプール（４つのｓｉＲＮＡ／プール）を含むヒトドラッガブルゲノムｓｉＲＮＡ Ｓｅｔ ４．０ライブラリーを購入した。ライブラリーをスポットし、次いで、ＩＮＴＥＲＦＥＲｉｎ試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、Ｇｒｅｉｎｅｒ μＣｌｅａｒ ９６ウェルマイクロプレートで増殖させたＨｅＬａ細胞に逆トランスフェクトした。最小の毒性で９０～９５％のトランスフェクション効率に達するようにハイスループットトランスフェクションプロトコルを最適化した。スクリーニングは、技術的な３連で行った。同じ細胞継代（ｎ＝３、解凍後）、血清およびトランスフェクション剤バッチを全プレートに使用して、生物学的変動性を制限した。各マイクロプレートに、以下の内部対照ｓｉＲＮＡを使用して、プレート間および日ごとの変動を制御した：（ｉ）ＮＳ１－ｓｉＲＮＡ５：５’ＧＡＡＴＧＧＴＴＡＣＣＡＡＴＣＴＡＣＣ３’、ＮＳ１コード領域を標的とするｓｉＲＮＡ、ＮＳ１タンパク質がウイルス形質導入に必須であることから陽性対照として使用、（ｉｉ）スクランブルｓｉＲＮＡ：５’ＡＡＴＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＧＴ３’、非標的化ｓｉＲＮＡ、陰性対照として使用（Ｑｉａｇｅｎ）、および（ｉｉｉ）ポロ様キナーゼ１遺伝子（ＰＬＫ１）ｓｉＲＮＡ：ＰＬＫ１遺伝子のサイレンシングが細胞死をもたらすことから、この遺伝子を標的とする５’ＣＡＡＣＣＡＡＡＧＴＣＧＡＡＴＡＴＧＡ３’をトランスフェクション効率制御として使用。トランスフェクションの２日後、細胞をｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（ＥＧＦＰを発現する組換えＨ－１ＰＶ）２０にＭＯＩ０．３５ ｐｆｕ／細胞で感染させ、さらに２４時間増殖させた。次いで、プレートを固定し、ＤＡＰＩを用いて染色し、蛍光イメージングに供して、ＧＦＰ陽性細胞の割合を決定することによってＨ－１ＰＶ形質導入効率を定量した。ｓｉＲＮＡ、トランスフェクション試薬、細胞およびウイルスのプレート分配に、ＴＥＣＡＮ Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ液体処理ワークステーションを使用した。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＩＮＣＥＬＬ１０００ ＨＣＳ落射蛍光顕微鏡（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてハイスループット細胞イメージングを行い、１マイクロウェル当たり平均２５，０００個の細胞を分析した。Ｍｕｌｔｉ Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳ）を使用して、細胞核を可視化し（ＤＡＰＩ染色）、ＧＦＰ共局在を定量して、形質導入された細胞の割合を決定した。次いで、本発明者らの細胞セグメント化プロトコルを適用して、分析したＤＡＰＩ染色細胞１個当たりのＧＦＰシグナル強度を決定した。ＲＲｅｐｏｒｔＧｅｎｅｒａｔｏｒソフトウェアを用いて単一細胞データを分析し、統計学的有意性を決定した２１。
【0039】
プラスミド構築
Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳ）からｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１プラスミド２２を購入した。ＬＡＭＣ１特異的ｓｇＲＮＡ ＧＡＴＧＧＡＣＧＡＧＴＧＣＡＣＧＧＡＣＧＡをオンライン設計ツール（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｇｅｎｏｍｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／）を使用して設計し、次いで、ＢｓｍＢＩ消化ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１プラスミドにクローニングした。Ｕ６プロモーターによる効率的な認識のために、Ｇヌクレオチド（太字）をｓｇＲＮＡに付加した。ＬＡＭＣ１特異的ガイドＲＮＡを発現する得られた組換えレンチウイルスをｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１－ｓｇＬＡＭＣ１と命名した。機能獲得実験のために、ｐＣＡＧ－ＬＡＭＣ１－Ｓ／ＭＡＲ発現ベクターを作製した。ｐＴｒｉＥＸ－１（Ｗｉｎｆｒｉｅｄ Ｓｔｏｃｋｅｒ（ＥｕｒｏＩｍｍｕｎ、Ｌｕｅｂｅｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の厚意により寄贈）にクローニングされた、ラミニンγ－１をコードする全長ＬＡＭＣ１遺伝子をＰＣＲの鋳型として使用した。ＰＣＲ増幅は、以下のプライマーを用いて行った：ＣｌｏｎｅＡｍｐ ＨｉＦｉ ＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ ＵＳ）とともに、ＬＡＭＣ１．ＦＯＲ ５’－ＡＡＧＡＡＴＡＴＣＡＡＧＡＴＣＡＴＧＡＧＡＧＧＧＡＧＣＣＡＴＣＧＧＧ－３’およびＬＡＭＣ１．ＲＥＶ ５’－ＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＡＧＡＴＣＣＴＡＧＧＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＧＧＡＣＧＧＧ－３’。次いで、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ－Ｅｕｒｏｐｅ、Ｓａｉｎｔ－Ｇｅｒｍａｉｎ－ｅｎ－Ｌａｙｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、ＢｇｌＩＩ消化ｐＣＡＧ－Ｓ／ＭＡＲ（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｈａｒｂｏｔｔｌｅ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の厚意により提供）にＰＣＲ断片をクローニングした。
Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳ）からｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１プラスミド２２を購入した。ＬＡＭＣ１特異的ｓｇＲＮＡ ＧＡＴＧＧＡＣＧＡＧＴＧＣＡＣＧＧＡＣＧＡをオンライン設計ツール（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｇｅｎｏｍｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／）を使用して設計し、次いで、ＢｓｍＢＩ消化ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１プラスミドにクローニングした。Ｕ６プロモーターによる効率的な認識のために、Ｇヌクレオチド（太字）をｓｇＲＮＡに付加した。ＬＡＭＣ１特異的ガイドＲＮＡを発現する得られた組換えレンチウイルスをｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１－ｓｇＬＡＭＣ１と命名した。機能獲得実験のために、ｐＣＡＧ－ＬＡＭＣ１－Ｓ／ＭＡＲ発現ベクターを作製した。ｐＴｒｉＥＸ－１（Ｗｉｎｆｒｉｅｄ Ｓｔｏｃｋｅｒ（ＥｕｒｏＩｍｍｕｎ、Ｌｕｅｂｅｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の厚意により寄贈）にクローニングされた、ラミニンγ－１をコードする全長ＬＡＭＣ１遺伝子をＰＣＲの鋳型として使用した。ＰＣＲ増幅は、以下のプライマーを用いて行った：ＣｌｏｎｅＡｍｐ ＨｉＦｉ ＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ ＵＳ）とともに、ＬＡＭＣ１．ＦＯＲ ５’－ＡＡＧＡＡＴＡＴＣＡＡＧＡＴＣＡＴＧＡＧＡＧＧＧＡＧＣＣＡＴＣＧＧＧ－３’およびＬＡＭＣ１．ＲＥＶ ５’－ＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＡＧＡＴＣＣＴＡＧＧＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＧＧＡＣＧＧＧ－３’。次いで、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ－Ｅｕｒｏｐｅ、Ｓａｉｎｔ－Ｇｅｒｍａｉｎ－ｅｎ－Ｌａｙｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、ＢｇｌＩＩ消化ｐＣＡＧ－Ｓ／ＭＡＲ（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｈａｒｂｏｔｔｌｅ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の厚意により提供）にＰＣＲ断片をクローニングした。
【0040】
ウイルス作製
以前に記載されているように１７、野生型Ｈ－１パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）（Ｈ－１ＰＶ）を作製し、精製し、滴定した。Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら２０に記載されているプロトコルに従って、緑色蛍光タンパク質コード遺伝子を内包する組換えＨ－１ＰＶ（ｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ）を作製した。以前に記載されているように２２、ＬＡＭＣ１特異的ガイドＲＮＡを発現するレンチウイルス（ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１－ｓｇＬＡＭＣ１）を作製した。要約すると、製造業者のプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸおよびＰｌｕｓ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ｂｖ、Ｂｌｅｉｓｗｉｊｋ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、２９３Ｔ細胞に、比（２：１．５：１）でプラスミドｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１－ｓｇＬＡＭＣ１、ｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）およびｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの７０時間後、レンチウイルス粒子を含有する培養培地を除去し、遠心分離し、細胞片を廃棄した。０．４５μＭフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ ＨＶ／ＰＶＤＦ）（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を通して上清を濾過し、ＰＥＧ－ｉｔ（ＢｉｏＣａｔ Ｇｍｂｈ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１００倍濃縮し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび１％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ細胞培養培地に再懸濁した。レンチウイルスのアリコートを－８０℃で保存した。Ｇｌｏｂａｌ ＵｌｔｒａＲａｐｉｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｉｔｅｒキット（ＳＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、レンチウイルス滴定を行った。
以前に記載されているように１７、野生型Ｈ－１パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）（Ｈ－１ＰＶ）を作製し、精製し、滴定した。Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら２０に記載されているプロトコルに従って、緑色蛍光タンパク質コード遺伝子を内包する組換えＨ－１ＰＶ（ｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ）を作製した。以前に記載されているように２２、ＬＡＭＣ１特異的ガイドＲＮＡを発現するレンチウイルス（ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１－ｓｇＬＡＭＣ１）を作製した。要約すると、製造業者のプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸおよびＰｌｕｓ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ｂｖ、Ｂｌｅｉｓｗｉｊｋ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、２９３Ｔ細胞に、比（２：１．５：１）でプラスミドｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１－ｓｇＬＡＭＣ１、ｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）およびｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの７０時間後、レンチウイルス粒子を含有する培養培地を除去し、遠心分離し、細胞片を廃棄した。０．４５μＭフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ ＨＶ／ＰＶＤＦ）（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を通して上清を濾過し、ＰＥＧ－ｉｔ（ＢｉｏＣａｔ Ｇｍｂｈ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１００倍濃縮し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび１％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ細胞培養培地に再懸濁した。レンチウイルスのアリコートを－８０℃で保存した。Ｇｌｏｂａｌ ＵｌｔｒａＲａｐｉｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｉｔｅｒキット（ＳＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、レンチウイルス滴定を行った。
【0041】
ＬＡＭＣ１－ＫＤ細胞株の作製
ＬＡＭＣ１－ＫＤ細胞を作製するために、５×１０４のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種し、ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１－ｓｇＬＡＭＣ１ ＤＮＡを内包する９．５×１０６ＩＦＵ（１００μｌ）のレンチウイルス粒子に感染させた。２４時間後、同じ量のレンチウイルスを用いて感染を繰り返し、細胞をさらに２４時間増殖させた。感染細胞の選択のために、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％ＢＳＡおよび２μｇ／ｍｌピューロマイシンを添加したＤＭＥＭ細胞培養培地を加えた。単一細胞クローンを増殖させ、ウエスタンブロット分析によってＬＡＭＣ１ノックアウト／ダウンを確認した。
ＬＡＭＣ１－ＫＤ細胞を作製するために、５×１０４のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種し、ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１－ｓｇＬＡＭＣ１ ＤＮＡを内包する９．５×１０６ＩＦＵ（１００μｌ）のレンチウイルス粒子に感染させた。２４時間後、同じ量のレンチウイルスを用いて感染を繰り返し、細胞をさらに２４時間増殖させた。感染細胞の選択のために、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％ＢＳＡおよび２μｇ／ｍｌピューロマイシンを添加したＤＭＥＭ細胞培養培地を加えた。単一細胞クローンを増殖させ、ウエスタンブロット分析によってＬＡＭＣ１ノックアウト／ダウンを確認した。
【0042】
タンパク質の抽出および分析
培養培地中でラバーポリスマンを用いて直接穏やかに掻き取ることによって、細胞をディッシュから回収した。遠心分離によって細胞を収集し、氷冷ＰＢＳを用いて洗浄した。遠心分離後、プロテアーゼ阻害剤（完全ＥＤＴＡフリー；Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する５体積の溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ－４０、１ｍＭジチオスレイトール［ＤＴＴ］）に細胞ペレットを懸濁し、氷上で３０分間溶解させた。遠心分離（４℃で１５分間にわたり１３，０００ｒｐｍ）によって細胞片を除去し、製造業者の指示に従ってビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって、細胞溶解物中のタンパク質濃度を測定した。２５～５０μｇの総タンパク質抽出物に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。分離後、タンパク質をＨｙｂｏｎｄ－Ｐメンブレン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。以下の抗体を用いてイムノブロッティングを行った：１：２０００希釈で使用したマウスモノクローナル抗β－チューブリン（クローンＴＵＢ ２．１；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、１：５００希釈でマウスモノクローナル抗ラミニンγ－１（クローンＢ－４；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１：５００希釈でマウスモノクローナル抗ラミニンβ－１（クローンＤ－９；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および１：５００希釈でウサギポリクローナル抗ガレクチン－１（クローンＨ－４５；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とのインキュベーション後、メンブレンをＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳ）とインキュベーションし、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（商標）ＥＣＬ放射線撮影フィルム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に曝露した。
培養培地中でラバーポリスマンを用いて直接穏やかに掻き取ることによって、細胞をディッシュから回収した。遠心分離によって細胞を収集し、氷冷ＰＢＳを用いて洗浄した。遠心分離後、プロテアーゼ阻害剤（完全ＥＤＴＡフリー；Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する５体積の溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ－４０、１ｍＭジチオスレイトール［ＤＴＴ］）に細胞ペレットを懸濁し、氷上で３０分間溶解させた。遠心分離（４℃で１５分間にわたり１３，０００ｒｐｍ）によって細胞片を除去し、製造業者の指示に従ってビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって、細胞溶解物中のタンパク質濃度を測定した。２５～５０μｇの総タンパク質抽出物に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。分離後、タンパク質をＨｙｂｏｎｄ－Ｐメンブレン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。以下の抗体を用いてイムノブロッティングを行った：１：２０００希釈で使用したマウスモノクローナル抗β－チューブリン（クローンＴＵＢ ２．１；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、１：５００希釈でマウスモノクローナル抗ラミニンγ－１（クローンＢ－４；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１：５００希釈でマウスモノクローナル抗ラミニンβ－１（クローンＤ－９；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および１：５００希釈でウサギポリクローナル抗ガレクチン－１（クローンＨ－４５；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とのインキュベーション後、メンブレンをＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳ）とインキュベーションし、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（商標）ＥＣＬ放射線撮影フィルム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に曝露した。
【0043】
ウイルス細胞取り込みアッセイ
以下に記載するように処理した細胞を３回のスナップ凍結解凍サイクルに供して、細胞関連ウイルス粒子を放出させた。製造業者の指示に従ってＱｉＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、接種材料として使用したウイルスのアリコート、および細胞溶解物の両方からウイルスＤＮＡを精製した。以前に記載されているように１７、パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）特異的ｑＰＣＲを使用してウイルスゲノムを定量した。試験された全条件について、少なくとも２つの独立した実験（それぞれ３連で実施）を行った。
以下に記載するように処理した細胞を３回のスナップ凍結解凍サイクルに供して、細胞関連ウイルス粒子を放出させた。製造業者の指示に従ってＱｉＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、接種材料として使用したウイルスのアリコート、および細胞溶解物の両方からウイルスＤＮＡを精製した。以前に記載されているように１７、パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）特異的ｑＰＣＲを使用してウイルスゲノムを定量した。試験された全条件について、少なくとも２つの独立した実験（それぞれ３連で実施）を行った。
【0044】
ｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウン実験
ＨｅＬａ、ＨＣＴ１１６およびＡ５４９細胞株を２４ウェルプレートに４×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、抗生物質を含まない５００μｌの完全細胞培地中で増殖させた。２４時間後、製造業者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、無血清培地中でｓｉＲＮＡ（５～１０ｎＭ）を細胞にトランスフェクトした。以下のｓｉＲＮＡを使用した：ＬＡＭＣ１＿１（ＳＩ０００３５７４２）、ＬＡＭＣ１＿５（ＳＩ０２７５７４７５）、ＬＡＭＢ１＿４（ＳＩ０００３５７０７）、ＬＡＭＢ１＿９（ＳＩ０５１０９１７４）、ＬＧＡＬＳ１＿７（ＳＩ０３０８５４５３）、ＬＧＡＬＳ１＿８（ＳＩ０４９９８５５３）、および陰性対照として使用したＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡ（ＳＩ０３６５０３１８）（いずれもＱｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入）。２４時間後、培地を交換し、細胞をさらに２４時間増殖させて、効率的な遺伝子サイレンシングを可能にした。次いで、培養培地を除去し、ＭＯＩ１（ｐｆｕ／細胞）で、Ｈ－１ＰＶを含有する０．２ｍｌ無血清培地と交換した。感染を３７℃で４時間かけて行って、細胞表面結合とウイルス粒子の内在化とを最終的に可能にした。
ＨｅＬａ、ＨＣＴ１１６およびＡ５４９細胞株を２４ウェルプレートに４×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、抗生物質を含まない５００μｌの完全細胞培地中で増殖させた。２４時間後、製造業者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、無血清培地中でｓｉＲＮＡ（５～１０ｎＭ）を細胞にトランスフェクトした。以下のｓｉＲＮＡを使用した：ＬＡＭＣ１＿１（ＳＩ０００３５７４２）、ＬＡＭＣ１＿５（ＳＩ０２７５７４７５）、ＬＡＭＢ１＿４（ＳＩ０００３５７０７）、ＬＡＭＢ１＿９（ＳＩ０５１０９１７４）、ＬＧＡＬＳ１＿７（ＳＩ０３０８５４５３）、ＬＧＡＬＳ１＿８（ＳＩ０４９９８５５３）、および陰性対照として使用したＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡ（ＳＩ０３６５０３１８）（いずれもＱｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入）。２４時間後、培地を交換し、細胞をさらに２４時間増殖させて、効率的な遺伝子サイレンシングを可能にした。次いで、培養培地を除去し、ＭＯＩ１（ｐｆｕ／細胞）で、Ｈ－１ＰＶを含有する０．２ｍｌ無血清培地と交換した。感染を３７℃で４時間かけて行って、細胞表面結合とウイルス粒子の内在化とを最終的に可能にした。
【0045】
薬物／酵素感染前細胞処理
ヘパリン（カタログ番号Ｈ４７８４）、ノイラミニダーゼ（カタログ番号Ｎ２８７６）およびヘパリナーゼＩＩＩ（カタログ番号Ｈ８８９１）はいずれも、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ヘパリン原液を新たに調製し、同日に使用した。ノイラミニダーゼおよびヘパリナーゼＩＩＩ原液を調製し、分取し、使用前に－２０℃で保存した。４×１０４のＨｅＬａ細胞を２４ウェル／プレートに播種し、次いで、漸増量（１０、２５、５０、１００μｇ／ｍｌ）のヘパリン、またはノイラミニダーゼ（０．１Ｕ／ｍｌ）もしくはヘパリナーゼＩＩＩ（０．１Ｕ／ｍｌ）を用いて２４時間前処理した。感染に使用する前に、Ｈ－１ＰＶ（ＭＯＩ１、ｐｆｕ／細胞）も同じ濃度のヘパリン、ノイラミニダーゼまたはヘパリナーゼＩＩＩと室温で１５分間プレインキュベートし、次いで感染に使用した。細胞結合／侵入アッセイを３７℃で４時間行った。
ヘパリン（カタログ番号Ｈ４７８４）、ノイラミニダーゼ（カタログ番号Ｎ２８７６）およびヘパリナーゼＩＩＩ（カタログ番号Ｈ８８９１）はいずれも、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ヘパリン原液を新たに調製し、同日に使用した。ノイラミニダーゼおよびヘパリナーゼＩＩＩ原液を調製し、分取し、使用前に－２０℃で保存した。４×１０４のＨｅＬａ細胞を２４ウェル／プレートに播種し、次いで、漸増量（１０、２５、５０、１００μｇ／ｍｌ）のヘパリン、またはノイラミニダーゼ（０．１Ｕ／ｍｌ）もしくはヘパリナーゼＩＩＩ（０．１Ｕ／ｍｌ）を用いて２４時間前処理した。感染に使用する前に、Ｈ－１ＰＶ（ＭＯＩ１、ｐｆｕ／細胞）も同じ濃度のヘパリン、ノイラミニダーゼまたはヘパリナーゼＩＩＩと室温で１５分間プレインキュベートし、次いで感染に使用した。細胞結合／侵入アッセイを３７℃で４時間行った。
【0046】
抗体競合アッセイ
抗生物質を含まない５００μｌの完全細胞培地中で、２４ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルの密度で播種したＨｅＬａ細胞を増殖させた。２４時間後、細胞を氷上で４５分間、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地中１０μｇ／ｍｌのマウスモノクローナル対照抗ＩｇＧ（アイソタイプ対照）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、マウスモノクローナル抗ＥＰＨＢ２（Ａｂｎｏｖａ、Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）またはマウスモノクローナル抗ラミニンγ－１（クローンＢ－４；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とインキュベートした。インキュベーションの終了時に、培地を除去し、Ｈ－１ＰＶ（ＭＯＩ０．２５、ｐｆｕ／細胞）を含有する０．１ｍｌの無血清培地と交換した。ウイルス結合アッセイを氷上で３０分間最初に行った。次いで、ＰＢＳを用いて細胞を２回洗浄して未結合ウイルス粒子を除去し、新鮮な完全細胞培地中で３７℃で１時間さらにインキュベートしてウイルス粒子の内在化を可能にした。
抗生物質を含まない５００μｌの完全細胞培地中で、２４ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルの密度で播種したＨｅＬａ細胞を増殖させた。２４時間後、細胞を氷上で４５分間、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地中１０μｇ／ｍｌのマウスモノクローナル対照抗ＩｇＧ（アイソタイプ対照）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、マウスモノクローナル抗ＥＰＨＢ２（Ａｂｎｏｖａ、Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）またはマウスモノクローナル抗ラミニンγ－１（クローンＢ－４；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とインキュベートした。インキュベーションの終了時に、培地を除去し、Ｈ－１ＰＶ（ＭＯＩ０．２５、ｐｆｕ／細胞）を含有する０．１ｍｌの無血清培地と交換した。ウイルス結合アッセイを氷上で３０分間最初に行った。次いで、ＰＢＳを用いて細胞を２回洗浄して未結合ウイルス粒子を除去し、新鮮な完全細胞培地中で３７℃で１時間さらにインキュベートしてウイルス粒子の内在化を可能にした。
【0047】
機能獲得実験
製造業者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用することによって、２４ウェルプレートに播種したＨｅＬａおよびＬＡＭＣ１－ＫＤ細胞株に、無血清培地中でプラスミド単独、またはＬＡＭＣ１遺伝子を有するプラスミドのいずれかを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、培地を完全細胞培地と交換し、細胞をさらに４４時間増殖させた。細胞をＨ－１ＰＶ（ＭＯＩ１００、ｐｆｕ／細胞）に３７℃で４時間かけて感染させて、ウイルス細胞取り込みを行った。
製造業者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用することによって、２４ウェルプレートに播種したＨｅＬａおよびＬＡＭＣ１－ＫＤ細胞株に、無血清培地中でプラスミド単独、またはＬＡＭＣ１遺伝子を有するプラスミドのいずれかを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、培地を完全細胞培地と交換し、細胞をさらに４４時間増殖させた。細胞をＨ－１ＰＶ（ＭＯＩ１００、ｐｆｕ／細胞）に３７℃で４時間かけて感染させて、ウイルス細胞取り込みを行った。
【0048】
細胞形質導入アッセイ
ｓｉＲＮＡ媒介性遺伝子ノックダウン実験
２×１０４ＨｅＬａ細胞／ウェルを２４ウェルプレートに播種し、抗生物質を含まない５００μｌの完全細胞培地中で増殖させた。ＳｉＲＮＡトランスフェクションを上記のように行った。トランスフェクションの４６時間後、細胞をｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（１ＴＵ、ＧＦＰ／細胞）に感染させ、さらに２４時間増殖させた。次いで、ＰＢＳを用いて細胞を１回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒド中で５分間固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて１０分間透過処理し、ＤＡＰＩを用いて２分間染色した。図の凡例に記載されているように、１０倍または２０倍の対物レンズを備えたＢＺ－９０００蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ，Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ＥＧＦＰ陽性細胞の蛍光画像を取得した。４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色を使用して、核（細胞）の数を可視化した。ＧＦＰ陽性細胞の割合は、少なくとも１５００個の細胞を計数することによって計算した。試験した条件ごとに、少なくとも２つの独立した実験（それぞれ２連で実施）を行った。
ｓｉＲＮＡ媒介性遺伝子ノックダウン実験
２×１０４ＨｅＬａ細胞／ウェルを２４ウェルプレートに播種し、抗生物質を含まない５００μｌの完全細胞培地中で増殖させた。ＳｉＲＮＡトランスフェクションを上記のように行った。トランスフェクションの４６時間後、細胞をｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（１ＴＵ、ＧＦＰ／細胞）に感染させ、さらに２４時間増殖させた。次いで、ＰＢＳを用いて細胞を１回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒド中で５分間固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて１０分間透過処理し、ＤＡＰＩを用いて２分間染色した。図の凡例に記載されているように、１０倍または２０倍の対物レンズを備えたＢＺ－９０００蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ，Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ＥＧＦＰ陽性細胞の蛍光画像を取得した。４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色を使用して、核（細胞）の数を可視化した。ＧＦＰ陽性細胞の割合は、少なくとも１５００個の細胞を計数することによって計算した。試験した条件ごとに、少なくとも２つの独立した実験（それぞれ２連で実施）を行った。
【0049】
薬物処理
４×１０４のＨｅＬａ細胞を２４ウェル／プレートに播種し、次いで、ヘパリン（１００μｇ／ｍｌ）と１８時間プレインキュベートした後、ｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（ＴＵ０．５、ＧＦＰ／細胞）に感染させた。感染の２４時間後、細胞を上記のように処理した。
４×１０４のＨｅＬａ細胞を２４ウェル／プレートに播種し、次いで、ヘパリン（１００μｇ／ｍｌ）と１８時間プレインキュベートした後、ｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（ＴＵ０．５、ＧＦＰ／細胞）に感染させた。感染の２４時間後、細胞を上記のように処理した。
【0050】
可溶性ラミニンまたはフィブロネクチンによる処理。
ノイラミニダーゼはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、フィブロネクチンはＭｅｒｃｋ ＫＧａＡ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ラミニン（ＬＮ１１１、ＬＮ１２１、ＬＮ２１１、ＬＮ２２１、ＬＮ４１１、ＬＮ４２１、ＬＮ５１１、ＬＮ５２１およびＬＮ３３２）はいずれも、ＢｉｏＬａｍｉｎａ ＡＢ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。２×１０３／ウェルでＨｅＬａ細胞を９６ウェル／プレートに播種し、次いで２４時間後、１０％ＦＢＳを含有する１００μｌのＤＭＥＭ培地中、ノイラミニダーゼ（０．２Ｕ／ｍｌ）またはフィブロネクチン（２μｇ／ｍｌ）またはラミニン（２μｇ／ｍｌ）を用いて前処理した。処理の２４時間後、細胞をｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（０．５ＴＵ、ＧＦＰ／細胞）に感染させ、さらに２７時間増殖させた。次いで、ＰＢＳを用いて細胞を１回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒド中で５分間固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて１０分間透過処理し、ＤＡＰＩを用いて２分間染色した。１０倍の対物レンズを備えたＫｅｙｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）製のＢＺ－９０００蛍光顕微鏡を用いて、ＧＦＰ陽性細胞の蛍光画像を取得した。
ノイラミニダーゼはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、フィブロネクチンはＭｅｒｃｋ ＫＧａＡ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ラミニン（ＬＮ１１１、ＬＮ１２１、ＬＮ２１１、ＬＮ２２１、ＬＮ４１１、ＬＮ４２１、ＬＮ５１１、ＬＮ５２１およびＬＮ３３２）はいずれも、ＢｉｏＬａｍｉｎａ ＡＢ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。２×１０３／ウェルでＨｅＬａ細胞を９６ウェル／プレートに播種し、次いで２４時間後、１０％ＦＢＳを含有する１００μｌのＤＭＥＭ培地中、ノイラミニダーゼ（０．２Ｕ／ｍｌ）またはフィブロネクチン（２μｇ／ｍｌ）またはラミニン（２μｇ／ｍｌ）を用いて前処理した。処理の２４時間後、細胞をｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（０．５ＴＵ、ＧＦＰ／細胞）に感染させ、さらに２７時間増殖させた。次いで、ＰＢＳを用いて細胞を１回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒド中で５分間固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて１０分間透過処理し、ＤＡＰＩを用いて２分間染色した。１０倍の対物レンズを備えたＫｅｙｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）製のＢＺ－９０００蛍光顕微鏡を用いて、ＧＦＰ陽性細胞の蛍光画像を取得した。
【0051】
機能獲得実験
２×１０４のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種し、次いで、ベクター単独、またはＬＡＭＣ１を発現するベクターのいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクションの４６時間後、細胞をｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（０．２５ＴＵ、ＧＦＰ／細胞）に感染させ、さらに２４時間増殖させた後、上記のように処理した。
２×１０４のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種し、次いで、ベクター単独、またはＬＡＭＣ１を発現するベクターのいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクションの４６時間後、細胞をｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（０．２５ＴＵ、ＧＦＰ／細胞）に感染させ、さらに２４時間増殖させた後、上記のように処理した。
【0052】
細胞生存率アッセイ
ｓｉＲＮＡノックダウン実験では、上記のｓｉＲＮＡを９６ウェルプレート（１つのｓｉＲＮＡ／ウェル）に３連でスポットし、次いで、２．５×１０３のＨｅＬａ細胞に逆トランスフェクトした。２４時間後、細胞培地を交換し、細胞をさらに４８時間増殖させた後、Ｈ－１ＰＶ（ＭＯＩ０．２５ ｐｆｕ／細胞）に感染させた。感染の７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用して細胞生存率を測定した。要約すると、細胞を室温にし、培養培地を１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０試薬（細胞培地中で１：２に希釈）と交換した。プレートをオービタルシェーカー上に２分間置いた後、溶液と１０分間インキュベートした。ＬＢ ９４３ Ｍｉｔｈｒａｓ２プレートマルチモードリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて発光を読み取った。ヘパリン処理実験のために、ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートに２．５×１０３細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間後、ヘパリン（１００μｇ／ｍｌ）を培地に加え、細胞をさらに２４時間増殖させた後、予めヘパリンと室温で１５分間プレインキュベートしたＨ－１ＰＶ（ＭＯＩ１、ｐｆｕ／細胞）に感染させた。感染の９６時間後、上記のようにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）を使用して細胞生存率を測定した。
ｓｉＲＮＡノックダウン実験では、上記のｓｉＲＮＡを９６ウェルプレート（１つのｓｉＲＮＡ／ウェル）に３連でスポットし、次いで、２．５×１０３のＨｅＬａ細胞に逆トランスフェクトした。２４時間後、細胞培地を交換し、細胞をさらに４８時間増殖させた後、Ｈ－１ＰＶ（ＭＯＩ０．２５ ｐｆｕ／細胞）に感染させた。感染の７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用して細胞生存率を測定した。要約すると、細胞を室温にし、培養培地を１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０試薬（細胞培地中で１：２に希釈）と交換した。プレートをオービタルシェーカー上に２分間置いた後、溶液と１０分間インキュベートした。ＬＢ ９４３ Ｍｉｔｈｒａｓ２プレートマルチモードリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて発光を読み取った。ヘパリン処理実験のために、ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートに２．５×１０３細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間後、ヘパリン（１００μｇ／ｍｌ）を培地に加え、細胞をさらに２４時間増殖させた後、予めヘパリンと室温で１５分間プレインキュベートしたＨ－１ＰＶ（ＭＯＩ１、ｐｆｕ／細胞）に感染させた。感染の９６時間後、上記のようにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）を使用して細胞生存率を測定した。
【0053】
統計分析
データセットに関する統計は、特に明記しない限り、Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰｒｉｓｍソフトウェアまたはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１６を使用して、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて計算した。結果は、代表的な実験の３連±ｓ．ｄの平均値、または少なくとも２回の反復実験の平均値として示される。
データセットに関する統計は、特に明記しない限り、Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰｒｉｓｍソフトウェアまたはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１６を使用して、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて計算した。結果は、代表的な実験の３連±ｓ．ｄの平均値、または少なくとも２回の反復実験の平均値として示される。
【0054】
細胞増殖アッセイ：ＮＣＩ－６０癌細胞株スクリーニング
６×９６ウェル電子マイクロタイタープレートモジュールを含むＲＴＣＡ－ＭＴ ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳ）を使用することによって、細胞増殖をリアルタイムで監視した。４，０００～１６，０００細胞／ウェル（細胞倍加速度による）の密度で、細胞を９６ウェルＥプレートに播種した。２４時間～７２時間後、０．０５～５０ｐｆｕ／細胞（０、０．０５、０．２５、０．５、１、５、１０および５０）の感染多重度（ＭＯＩ＝ｐｆｕ／細胞）に及ぶ漸増量のＨ－１ＰＶ野生型を細胞に感染させた。未処理細胞およびＨ－１ＰＶ感染細胞の増殖を３０分ごとに５～７日間リアルタイムで監視し、正規化細胞指数（ＣＩ）、すなわち付着細胞数／ウェルに比例し、したがって細胞増殖速度と厳密に相関するパラメーターとして表した。各条件について少なくとも３回の反復を行った。ＮＣＩ ６０細胞株パネルに属する懸濁増殖性白血病細胞株に該当する６つは、接着細胞株の増殖を監視することしかできないｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムに適合しないため、スクリーニングから除外した。
６×９６ウェル電子マイクロタイタープレートモジュールを含むＲＴＣＡ－ＭＴ ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳ）を使用することによって、細胞増殖をリアルタイムで監視した。４，０００～１６，０００細胞／ウェル（細胞倍加速度による）の密度で、細胞を９６ウェルＥプレートに播種した。２４時間～７２時間後、０．０５～５０ｐｆｕ／細胞（０、０．０５、０．２５、０．５、１、５、１０および５０）の感染多重度（ＭＯＩ＝ｐｆｕ／細胞）に及ぶ漸増量のＨ－１ＰＶ野生型を細胞に感染させた。未処理細胞およびＨ－１ＰＶ感染細胞の増殖を３０分ごとに５～７日間リアルタイムで監視し、正規化細胞指数（ＣＩ）、すなわち付着細胞数／ウェルに比例し、したがって細胞増殖速度と厳密に相関するパラメーターとして表した。各条件について少なくとも３回の反復を行った。ＮＣＩ ６０細胞株パネルに属する懸濁増殖性白血病細胞株に該当する６つは、接着細胞株の増殖を監視することしかできないｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムに適合しないため、スクリーニングから除外した。
【0055】
ＮＣＩ－６０癌細胞株スクリーニングにおけるＨ－１ＰＶ感染に対するＥＣ５０値の決定
二段階データ分析アプローチ２３を適用して、各ＮＣＩ－６０細胞株について、４つの感染後時点２４、４８、７２および９６時間のＥＣ５０値（細胞の５０％を死滅させるウイルス濃度）を導出した。アプローチの段階１では、Ｈ－１ＰＶ量が正規化細胞指数に対して一定した効果を有するかどうかを評価するために、一元配置ＡＮＯＶＡと、それに続く対比「ＭＯＩ０対ＭＯＩ５０」のｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｄｕｎｎｅｔｔ対比試験（Ｄｕｎｎｅｔｔ １９５５）を行った。（ａ）ＡＮＯＶＡが、正規化細胞指数に対するＨ－１ＰＶ量の全体的な効果を実証することができなかった場合（ｐ＞０．０５）、または（ｂ）全体的であるが一定していない効果が、ＡＮＯＶＡ（ｐ≦０．０５）と、それに続くｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｄｕｎｎｅｔｔ対比試験（ｐ＞０．０５）によって明らかにされた場合、一定した効果は結論付けられなかった。事例（ａ）については、Ｄｕｎｎｅｔｔ対比試験は必要とされず、したがって行わなかった。段階１で一定した効果が見られなかった場合、ＮＣＩ－６０癌細胞株と感染後時点とのそれぞれの組合せについてＥＣ５０値は報告されなかった。そうでなければ、アプローチの段階２では、ＮＣＩ－６０癌細胞株と感染後時点とのそれぞれの組合せについて得られた濃度応答データ（濃度：Ｈ－１ＰＶ量、応答：正規化細胞指数）に４パラメーターログロジスティックモデルを適合させることによってＥＣ５０値を計算した。正規化細胞指数の負の値は生物学的に意味がないことから、４パラメーターログロジスティックモデル関数の下方漸近線を≧０に制限した。４つの状況ではＥＣ５０値は報告されなかった：（１）推定ＥＣ５０値が試験された最大Ｈ－１ＰＶ量（例えば、ＭＯＩ５０）を超えた場合、得られたＥＣ５０推定値は信頼性がないと考えられたため、報告されなかった；（２）適合された濃度－応答曲線の下方漸近線ｃと上方漸近線ｄとの間の距離が小さすぎる場合（例えば、ｃ＞０．７＊ｄの場合）、正規化細胞指数に対するＨ－１ＰＶ量の観察された効果は無関係であると考えられたため、ＥＣ５０推定値は報告されなかった；（３）生物学的観点から解釈できない濃度－応答曲線の増加がログロジスティックモデルの適合から得られた場合；（４）４パラメーターログロジスティックモデル関数が濃度－応答データに適合しない場合。オープンソース統計ソフトウェア環境Ｒ、バージョン２．１４．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を用いてＥＣ５０計算を行った。
二段階データ分析アプローチ２３を適用して、各ＮＣＩ－６０細胞株について、４つの感染後時点２４、４８、７２および９６時間のＥＣ５０値（細胞の５０％を死滅させるウイルス濃度）を導出した。アプローチの段階１では、Ｈ－１ＰＶ量が正規化細胞指数に対して一定した効果を有するかどうかを評価するために、一元配置ＡＮＯＶＡと、それに続く対比「ＭＯＩ０対ＭＯＩ５０」のｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｄｕｎｎｅｔｔ対比試験（Ｄｕｎｎｅｔｔ １９５５）を行った。（ａ）ＡＮＯＶＡが、正規化細胞指数に対するＨ－１ＰＶ量の全体的な効果を実証することができなかった場合（ｐ＞０．０５）、または（ｂ）全体的であるが一定していない効果が、ＡＮＯＶＡ（ｐ≦０．０５）と、それに続くｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｄｕｎｎｅｔｔ対比試験（ｐ＞０．０５）によって明らかにされた場合、一定した効果は結論付けられなかった。事例（ａ）については、Ｄｕｎｎｅｔｔ対比試験は必要とされず、したがって行わなかった。段階１で一定した効果が見られなかった場合、ＮＣＩ－６０癌細胞株と感染後時点とのそれぞれの組合せについてＥＣ５０値は報告されなかった。そうでなければ、アプローチの段階２では、ＮＣＩ－６０癌細胞株と感染後時点とのそれぞれの組合せについて得られた濃度応答データ（濃度：Ｈ－１ＰＶ量、応答：正規化細胞指数）に４パラメーターログロジスティックモデルを適合させることによってＥＣ５０値を計算した。正規化細胞指数の負の値は生物学的に意味がないことから、４パラメーターログロジスティックモデル関数の下方漸近線を≧０に制限した。４つの状況ではＥＣ５０値は報告されなかった：（１）推定ＥＣ５０値が試験された最大Ｈ－１ＰＶ量（例えば、ＭＯＩ５０）を超えた場合、得られたＥＣ５０推定値は信頼性がないと考えられたため、報告されなかった；（２）適合された濃度－応答曲線の下方漸近線ｃと上方漸近線ｄとの間の距離が小さすぎる場合（例えば、ｃ＞０．７＊ｄの場合）、正規化細胞指数に対するＨ－１ＰＶ量の観察された効果は無関係であると考えられたため、ＥＣ５０推定値は報告されなかった；（３）生物学的観点から解釈できない濃度－応答曲線の増加がログロジスティックモデルの適合から得られた場合；（４）４パラメーターログロジスティックモデル関数が濃度－応答データに適合しない場合。オープンソース統計ソフトウェア環境Ｒ、バージョン２．１４．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を用いてＥＣ５０計算を行った。
【0056】
ＬＤＨアッセイ
癌細胞株を９６ウェルプレートに４，０００細胞／ウェルの密度で播種し、２４時間増殖させた。次いで、細胞をＨ－１ＰＶに感染させ、５％の熱不活性化ウシ血清（１００μｌ／ウェル）を添加したＤＭＥＭ培地中でさらに７２時間増殖させた。以前に記載されているように２９、Ｃｙｔｏｔｏｘ ９６非放射性細胞傷害性アッセイキット（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製）を使用して、培養培地中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の量によってウイルス誘導性細胞溶解を決定した。
癌細胞株を９６ウェルプレートに４，０００細胞／ウェルの密度で播種し、２４時間増殖させた。次いで、細胞をＨ－１ＰＶに感染させ、５％の熱不活性化ウシ血清（１００μｌ／ウェル）を添加したＤＭＥＭ培地中でさらに７２時間増殖させた。以前に記載されているように２９、Ｃｙｔｏｔｏｘ ９６非放射性細胞傷害性アッセイキット（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製）を使用して、培養培地中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の量によってウイルス誘導性細胞溶解を決定した。
【0057】
ＲＮＡ単離
５０，０００細胞／ウェルの密度で、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加したＤＭＥＭ培地中、６ウェルプレート内で神経膠芽腫由来細胞株を増殖させた。２０時間後、細胞を回収し、製造業者の指示に従ってＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＯＲＰ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、細胞ペレットから全ＲＮＡを単離した。
５０，０００細胞／ウェルの密度で、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加したＤＭＥＭ培地中、６ウェルプレート内で神経膠芽腫由来細胞株を増殖させた。２０時間後、細胞を回収し、製造業者の指示に従ってＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＯＲＰ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、細胞ペレットから全ＲＮＡを単離した。
【0058】
ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現分析
ｎａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）の推奨に従って、ｎＣｏｕｎｔｅｒ標的遺伝子発現分析を行った。ｎＣｏｕｎｔｅｒ技術は、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブの同時ハイブリダイゼーションおよびデジタル定量に基づく多重遺伝子発現分析を可能にする３０。分析に使用したプローブセットを表１に示す。Ｑｕｂｉｔ（商標）ＲＮＡ ＨＳアッセイキットを使用することによって全ＲＮＡ試料を定量し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒシステム上でＡｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ６０００ Ｎａｎｏｋｉｔを使用して品質管理を行った。試料を一晩ハイブリダイゼーションに供した。要約すると、６５℃でのプローブセットハイブリダイゼーションのためのインプット材料として５０ｎｇの全ＲＮＡを使用した。１５μｌの総反応体積について、最大７μｌの全ＲＮＡ試料と、２μｌのｎＣｏｕｎｔｅｒカスタマイズＴａｇＳｅｔ、５μｌのハイブリダイゼーション緩衝液および０．５μｌのプローブＡ＋０．５μｌのプローブＢとを組み合わせた。試料を２０時間インキュベートし、４℃に冷却し、次いで精製し、カートリッジに固定した。ｎａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）製のＳＰＲＩＮＴ（商標）Ｐｒｏｆｉｌｅｒを使用して、実験の読み出しを行った。ｎａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｎａｌｙｓｉｓ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｎｓｏｌｖｅｒ）によって提供されるｎＳｏｌｖｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン４．０）を使用して、データの正規化および評価を行った。Ｎｏｒｍｆｉｎｄｅｒ法に基づいて、正規化のために、安定に発現した参照遺伝子を選択した３１。
ｎａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）の推奨に従って、ｎＣｏｕｎｔｅｒ標的遺伝子発現分析を行った。ｎＣｏｕｎｔｅｒ技術は、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブの同時ハイブリダイゼーションおよびデジタル定量に基づく多重遺伝子発現分析を可能にする３０。分析に使用したプローブセットを表１に示す。Ｑｕｂｉｔ（商標）ＲＮＡ ＨＳアッセイキットを使用することによって全ＲＮＡ試料を定量し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒシステム上でＡｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ６０００ Ｎａｎｏｋｉｔを使用して品質管理を行った。試料を一晩ハイブリダイゼーションに供した。要約すると、６５℃でのプローブセットハイブリダイゼーションのためのインプット材料として５０ｎｇの全ＲＮＡを使用した。１５μｌの総反応体積について、最大７μｌの全ＲＮＡ試料と、２μｌのｎＣｏｕｎｔｅｒカスタマイズＴａｇＳｅｔ、５μｌのハイブリダイゼーション緩衝液および０．５μｌのプローブＡ＋０．５μｌのプローブＢとを組み合わせた。試料を２０時間インキュベートし、４℃に冷却し、次いで精製し、カートリッジに固定した。ｎａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）製のＳＰＲＩＮＴ（商標）Ｐｒｏｆｉｌｅｒを使用して、実験の読み出しを行った。ｎａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｎａｌｙｓｉｓ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｎｓｏｌｖｅｒ）によって提供されるｎＳｏｌｖｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン４．０）を使用して、データの正規化および評価を行った。Ｎｏｒｍｆｉｎｄｅｒ法に基づいて、正規化のために、安定に発現した参照遺伝子を選択した３１。
【0059】
【表1】
【0060】
ＮＣＨ１２５－ＬＧＡＬＳ１ＫＯおよびＮＣＨ１２５－対照細胞株の作製
ＮＣＨ１２５－ＬＧＡＬＳ１ＫＯ安定細胞の作製のために、２００，０００個の細胞を６ウェルプレートに播種し、翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、２μｇのガレクチン－１ Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋａｓｅ Ｐｌａｓｍｉｄ（［ｈ］ｓｃ－４００９４１－ＮＩＣ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をトランスフェクトした。１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％ＢＳＡを添加し、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを加えたＤＭＥＭ細胞培養培地中で、陽性クローンの選択を７２時間かけて行った。単一細胞クローンを増殖させ、ウエスタンブロット分析によってＬＧＡＬＳ１ノックアウトを確認した。ＮＣＨ１２５－対照細胞株を作製するために、いかなるヒト遺伝子も標的としない対照プラスミドｐＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクランブルｇＲＮＡ（ｓｃ－４１８９２２；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をトランスフェクションに使用した。
ＮＣＨ１２５－ＬＧＡＬＳ１ＫＯ安定細胞の作製のために、２００，０００個の細胞を６ウェルプレートに播種し、翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、２μｇのガレクチン－１ Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋａｓｅ Ｐｌａｓｍｉｄ（［ｈ］ｓｃ－４００９４１－ＮＩＣ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をトランスフェクトした。１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％ＢＳＡを添加し、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを加えたＤＭＥＭ細胞培養培地中で、陽性クローンの選択を７２時間かけて行った。単一細胞クローンを増殖させ、ウエスタンブロット分析によってＬＧＡＬＳ１ノックアウトを確認した。ＮＣＨ１２５－対照細胞株を作製するために、いかなるヒト遺伝子も標的としない対照プラスミドｐＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクランブルｇＲＮＡ（ｓｃ－４１８９２２；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をトランスフェクションに使用した。
【0061】
ＮＣＨ１２５－ＬＧＡＬＳ１ＫＯ細胞株における機能獲得
３００，０００細胞／ウェルの密度で、ＮＣＨ１２５－対照およびＮＣＨ１２５－ＬＧＡＬＳ１ＫＯの両方を６ウェルプレートに播種した。翌日、製造業者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｇａｌｅｃｔｉｎ－Ｃ－１８、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｄａｖｉｄｓｏｎから寄贈；Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６２７４５）に融合したＬＧＡＬＳ１遺伝子を有する２．５μｇのプラスミドを細胞にトランスフェクトした。翌日、培地を完全細胞培地と交換し、細胞をさらに２４時間増殖させた。細胞をｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（０．３ＴＵ、ＧＦＰ／細胞）に２４時間かけて感染させることによって、ウイルス形質導入を行った。次いで、３．７％ホルムアルデヒドを用いて細胞を１０分間固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて５分間透過処理した。ＤＡＰＩを用いて細胞核を染色した。ＢＺ－９０００蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いてＥＧＦＰ陽性細胞を分析した。ＥＧＦＰシグナルについて少なくとも１，０００個の細胞を分析した。
３００，０００細胞／ウェルの密度で、ＮＣＨ１２５－対照およびＮＣＨ１２５－ＬＧＡＬＳ１ＫＯの両方を６ウェルプレートに播種した。翌日、製造業者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｇａｌｅｃｔｉｎ－Ｃ－１８、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｄａｖｉｄｓｏｎから寄贈；Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６２７４５）に融合したＬＧＡＬＳ１遺伝子を有する２．５μｇのプラスミドを細胞にトランスフェクトした。翌日、培地を完全細胞培地と交換し、細胞をさらに２４時間増殖させた。細胞をｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（０．３ＴＵ、ＧＦＰ／細胞）に２４時間かけて感染させることによって、ウイルス形質導入を行った。次いで、３．７％ホルムアルデヒドを用いて細胞を１０分間固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて５分間透過処理した。ＤＡＰＩを用いて細胞核を染色した。ＢＺ－９０００蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いてＥＧＦＰ陽性細胞を分析した。ＥＧＦＰシグナルについて少なくとも１，０００個の細胞を分析した。
【0062】
β－ラクトース処理
４０，０００個のＨｅＬａ細胞を２４ウェル／プレートに播種し、次いで、２００ｍＭのβ－ラクトース（＃Ｌ３７５０、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と３０分間プレインキュベートした後、ｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（０．３ＴＵ、ＧＦＰ／細胞）に感染させた。感染の４時間後、培地をβ－ラクトースを添加した完全細胞培地と交換し、細胞をさらに２０時間増殖させた。次いで、３．７％ホルムアルデヒドを用いて細胞を１０分間固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて５分間透過処理し、ＤＡＰＩを用いて細胞核を染色した。ＢＺ－９０００蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて細胞を分析した。ＥＧＦＰ陽性細胞の割合の計算のために、少なくとも１，０００個の細胞を分析した。
４０，０００個のＨｅＬａ細胞を２４ウェル／プレートに播種し、次いで、２００ｍＭのβ－ラクトース（＃Ｌ３７５０、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と３０分間プレインキュベートした後、ｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰ（０．３ＴＵ、ＧＦＰ／細胞）に感染させた。感染の４時間後、培地をβ－ラクトースを添加した完全細胞培地と交換し、細胞をさらに２０時間増殖させた。次いで、３．７％ホルムアルデヒドを用いて細胞を１０分間固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて５分間透過処理し、ＤＡＰＩを用いて細胞核を染色した。ＢＺ－９０００蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて細胞を分析した。ＥＧＦＰ陽性細胞の割合の計算のために、少なくとも１，０００個の細胞を分析した。
【0063】
例２：ｓｉＲＮＡライブラリースクリーニング
本発明者らは、子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞株を使用してｓｉＲＮＡライブラリースクリーニングを行った（図１）。２組の細胞に、対照ｓｉＲＮＡ、または合計６，９６１個の異なる遺伝子（ドラッガブルゲノム、４つのｓｉＲＮＡ／プール、１つのプール／遺伝子）を標的とするｓｉＲＮＡプールを含むドラッガブルｓｉＲＮＡライブラリーを逆トランスフェクトし、次いで、効率的な遺伝子サイレンシングを可能にするために４８時間増殖させた。次いで、１組の細胞を未処理のままにして、すべてのトランスフェクトｓｉＲＮＡプールの固有の細胞傷害性を制御し、他方の組の細胞をｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰに感染させた。この複製欠損組換えパルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）は、野生型ウイルスと同じカプシドを共有するが、天然ＰＶ Ｐ３８プロモーターの制御下でＥＧＦＰレポーター遺伝子を有する２４。このプロモーターは、ＰＶ ＮＳ１タンパク質によって特異的に活性化されるため、ＥＧＦＰシグナルと相関するその発現は、ウイルス形質導入能力の尺度である。感染の２４時間後、細胞を固定し、ＥＧＦＰシグナルおよび細胞生存率を測定した（図１Ａ）。対照スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞で得られたＥＧＦＰシグナルをベースラインとして使用して、６，９６１個の標的遺伝子のそれぞれについてｓｉＲＮＡプールを個別にトランスフェクトした細胞で得られたＥＧＦＰシグナルの割合を正規化した。２つの遺伝子、すなわちＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１は、Ｈ－１ＰＶ生活環を調節するための上位候補として同定された（図１Ｂ）。両遺伝子のサイレンシングは、Ｈ－１ＰＶ形質導入を７０％超減少させ、この２つの遺伝子がＨ－１ＰＶ生活環の強力な活性化因子であるという最初の証拠を提供した。本発明者らは、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ、ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を分析することによって、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１が正のＣｏｘ回帰係数を示すことを見出し（ＬＡＭＣ１の範囲：０．１９～０．８６；ＬＧＡＬＳ１の範囲：０．１９～０．３９）、これは、特定の腫瘍型に罹患している患者では、それらの過剰発現が総生存期間中央値の短縮に関連することを示している（図１Ｃ）。特に、本発明者らの分析によれば、ＬＡＭＣ１過剰発現は、腎臓の乳頭状腎細胞癌（ＫＩＲＰ）、低グレード脳グリオーマ（ＬＧＧ）、胃腺癌（ＳＴＡＤ）、膀胱尿路上皮癌（ＢＬＣＡ）、子宮頸部扁平上皮癌および子宮頸部腺癌（ＣＥＳＣ）、直腸腺癌（ＲＥＡＤ）ならびに肺腺癌（ＬＵＡＤ）の予後不良のマーカーと考えられ得る。一方、ＬＧＡＬＳ１過剰発現は、ＬＧＧ、腎臓腎明細胞癌（ＫＩＲＣ）、急性骨髄性白血病（ＬＡＭＬ）およびＢＬＣＡの予後不良と関連している（Ｐ値＜０．０５）（図１Ｃ）。
本発明者らは、子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞株を使用してｓｉＲＮＡライブラリースクリーニングを行った（図１）。２組の細胞に、対照ｓｉＲＮＡ、または合計６，９６１個の異なる遺伝子（ドラッガブルゲノム、４つのｓｉＲＮＡ／プール、１つのプール／遺伝子）を標的とするｓｉＲＮＡプールを含むドラッガブルｓｉＲＮＡライブラリーを逆トランスフェクトし、次いで、効率的な遺伝子サイレンシングを可能にするために４８時間増殖させた。次いで、１組の細胞を未処理のままにして、すべてのトランスフェクトｓｉＲＮＡプールの固有の細胞傷害性を制御し、他方の組の細胞をｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰに感染させた。この複製欠損組換えパルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）は、野生型ウイルスと同じカプシドを共有するが、天然ＰＶ Ｐ３８プロモーターの制御下でＥＧＦＰレポーター遺伝子を有する２４。このプロモーターは、ＰＶ ＮＳ１タンパク質によって特異的に活性化されるため、ＥＧＦＰシグナルと相関するその発現は、ウイルス形質導入能力の尺度である。感染の２４時間後、細胞を固定し、ＥＧＦＰシグナルおよび細胞生存率を測定した（図１Ａ）。対照スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞で得られたＥＧＦＰシグナルをベースラインとして使用して、６，９６１個の標的遺伝子のそれぞれについてｓｉＲＮＡプールを個別にトランスフェクトした細胞で得られたＥＧＦＰシグナルの割合を正規化した。２つの遺伝子、すなわちＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１は、Ｈ－１ＰＶ生活環を調節するための上位候補として同定された（図１Ｂ）。両遺伝子のサイレンシングは、Ｈ－１ＰＶ形質導入を７０％超減少させ、この２つの遺伝子がＨ－１ＰＶ生活環の強力な活性化因子であるという最初の証拠を提供した。本発明者らは、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ、ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を分析することによって、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１が正のＣｏｘ回帰係数を示すことを見出し（ＬＡＭＣ１の範囲：０．１９～０．８６；ＬＧＡＬＳ１の範囲：０．１９～０．３９）、これは、特定の腫瘍型に罹患している患者では、それらの過剰発現が総生存期間中央値の短縮に関連することを示している（図１Ｃ）。特に、本発明者らの分析によれば、ＬＡＭＣ１過剰発現は、腎臓の乳頭状腎細胞癌（ＫＩＲＰ）、低グレード脳グリオーマ（ＬＧＧ）、胃腺癌（ＳＴＡＤ）、膀胱尿路上皮癌（ＢＬＣＡ）、子宮頸部扁平上皮癌および子宮頸部腺癌（ＣＥＳＣ）、直腸腺癌（ＲＥＡＤ）ならびに肺腺癌（ＬＵＡＤ）の予後不良のマーカーと考えられ得る。一方、ＬＧＡＬＳ１過剰発現は、ＬＧＧ、腎臓腎明細胞癌（ＫＩＲＣ）、急性骨髄性白血病（ＬＡＭＬ）およびＢＬＣＡの予後不良と関連している（Ｐ値＜０．０５）（図１Ｃ）。
【0064】
例３：ラミニン－γ１鎖は、Ｈ－１ＰＶ細胞表面結合および侵入に関与する。
ライブラリースクリーニングにより、Ｈ－１ＰＶ生活環の初期段階に関与する強力な候補としてＬＡＭＣ１遺伝子が同定された。ＬＡＭＣ１は、細胞外マトリックスの合計１６個のヘテロ三量体糖タンパク質のファミリーであるラミニンをαおよびβ鎖と一緒になって形成するラミニンγ１鎖をコードする。ラミニンは、基底膜の主要成分であり、細胞外アダプタータンパク質、硫酸化糖脂質および受容体タンパク質、例えば、インテグリンまたはジストログリカン糖タンパク質複合体によって細胞表面に連結されている。本発明者らは、ラミニンγ１鎖を含むラミニンが、Ｈ－１ＰＶ細胞表面結合および侵入を媒介するポリペプチド複合体の一部であり得ると仮定している。この仮説をさらに裏付けるのは、細胞表面へのラミニン接着には末端シアル酸を有するグリカン鎖が必要であるという事実である。実際、糖タンパク質からシアル酸基を切断するノイラミニダーゼ処理がＨ－１ＰＶ感染性を劇的に阻止したことから１７、Ｈ－１ＰＶ細胞表面結合／侵入はシアル酸依存性であることが示された１７。Ｈ－１ＰＶ細胞膜認識および侵入に果たすラミニンγ１鎖の生物学的役割に関する追加の証拠を提供するために、本発明者らは、第１のアプローチとして、遺伝子の２つの異なる領域を標的とする２つのｓｉＲＮＡを使用してＬＡＭＣ１の発現をサイレンシングし、細胞に結合し細胞内に浸透するＨ－１ＰＶの能力を確認した（ウイルス細胞取り込みアッセイ）。この目的のために、Ｈｅｌａ細胞にＬＡＭＣ１および対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、４６時間後にＨ－１ＰＶに感染させた。４時間後、細胞を洗浄して未結合ウイルス粒子を除去し、細胞に関連するものをｑＰＣＲによって分析した。対照ｓｉＲＮＡと比較して、ＬＡＭＣ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞では、ウイルス細胞取り込みの強力な減少が観察された（図２Ａ）。上記のようにｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞を、ｓｉＲＮＡライブラリースクリーニングに先に使用されたのと同じ組換えウイルスであるｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰを細胞に感染させるウイルス形質導入アッセイにも使用した。４つのＬＡＭＣ１ ｓｉＲＮＡのプールを使用したｓｉＲＮＡライブラリースクリーニングから得られた結果と一致して、個々のＬＡＭＣ１ ｓｉＲＮＡもＨ－１ＰＶ形質導入を強力に減少させた（図２Ｂ）。
ライブラリースクリーニングにより、Ｈ－１ＰＶ生活環の初期段階に関与する強力な候補としてＬＡＭＣ１遺伝子が同定された。ＬＡＭＣ１は、細胞外マトリックスの合計１６個のヘテロ三量体糖タンパク質のファミリーであるラミニンをαおよびβ鎖と一緒になって形成するラミニンγ１鎖をコードする。ラミニンは、基底膜の主要成分であり、細胞外アダプタータンパク質、硫酸化糖脂質および受容体タンパク質、例えば、インテグリンまたはジストログリカン糖タンパク質複合体によって細胞表面に連結されている。本発明者らは、ラミニンγ１鎖を含むラミニンが、Ｈ－１ＰＶ細胞表面結合および侵入を媒介するポリペプチド複合体の一部であり得ると仮定している。この仮説をさらに裏付けるのは、細胞表面へのラミニン接着には末端シアル酸を有するグリカン鎖が必要であるという事実である。実際、糖タンパク質からシアル酸基を切断するノイラミニダーゼ処理がＨ－１ＰＶ感染性を劇的に阻止したことから１７、Ｈ－１ＰＶ細胞表面結合／侵入はシアル酸依存性であることが示された１７。Ｈ－１ＰＶ細胞膜認識および侵入に果たすラミニンγ１鎖の生物学的役割に関する追加の証拠を提供するために、本発明者らは、第１のアプローチとして、遺伝子の２つの異なる領域を標的とする２つのｓｉＲＮＡを使用してＬＡＭＣ１の発現をサイレンシングし、細胞に結合し細胞内に浸透するＨ－１ＰＶの能力を確認した（ウイルス細胞取り込みアッセイ）。この目的のために、Ｈｅｌａ細胞にＬＡＭＣ１および対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、４６時間後にＨ－１ＰＶに感染させた。４時間後、細胞を洗浄して未結合ウイルス粒子を除去し、細胞に関連するものをｑＰＣＲによって分析した。対照ｓｉＲＮＡと比較して、ＬＡＭＣ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞では、ウイルス細胞取り込みの強力な減少が観察された（図２Ａ）。上記のようにｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞を、ｓｉＲＮＡライブラリースクリーニングに先に使用されたのと同じ組換えウイルスであるｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰを細胞に感染させるウイルス形質導入アッセイにも使用した。４つのＬＡＭＣ１ ｓｉＲＮＡのプールを使用したｓｉＲＮＡライブラリースクリーニングから得られた結果と一致して、個々のＬＡＭＣ１ ｓｉＲＮＡもＨ－１ＰＶ形質導入を強力に減少させた（図２Ｂ）。
【0065】
例４：ＬＡＭＣ１のサイレンシングはＨ－１ＰＶ腫瘍崩壊からＨｅＬａ細胞を保護する
本発明者らは、ｓｉＲＮＡトランスフェクトＨｅＬａ細胞における細胞生存率を測定することによって、Ｈ－１ＰＶ誘導性腫瘍毒性に対するｓｉＲＮＡ特異的ＬＡＭＣ１ノックダウンの影響を評価した。感染から７２時間後、非トランスフェクト細胞またはｓｉＲＮＡ対照トランスフェクト細胞は、Ｈ－１ＰＶによって効率的に死滅した（それぞれ細胞生存率の７７．２％および７１．７％の低下）。対照的に、ＬＡＭＣ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞では、Ｈ－１ＰＶ誘導性細胞傷害性に対して有意に耐性が高かった（図３）。
本発明者らは、ｓｉＲＮＡトランスフェクトＨｅＬａ細胞における細胞生存率を測定することによって、Ｈ－１ＰＶ誘導性腫瘍毒性に対するｓｉＲＮＡ特異的ＬＡＭＣ１ノックダウンの影響を評価した。感染から７２時間後、非トランスフェクト細胞またはｓｉＲＮＡ対照トランスフェクト細胞は、Ｈ－１ＰＶによって効率的に死滅した（それぞれ細胞生存率の７７．２％および７１．７％の低下）。対照的に、ＬＡＭＣ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞では、Ｈ－１ＰＶ誘導性細胞傷害性に対して有意に耐性が高かった（図３）。
【0066】
例５：ラミニンγ１に対する抗体を用いた競合実験により、Ｈ－１ＰＶ細胞膜認識および侵入におけるこのタンパク質の関与が確認される。
本発明者らは、Ｈ－１ＰＶ細胞侵入を阻止するために、特異的抗ラミニンγ１抗体を使用して競合実験を行った。ラミニンγ１抗体とプレインキュベートしたＨｅＬａ細胞では、受容体チロシンキナーゼ膜貫通糖タンパク質である無関係なエフリンＢ型受容体（ＥＰＨＢ２）に対する対照ＩｇＧアイソタイプまたは対照抗体とプレインキュベートした細胞と比較して、Ｈ－１ＰＶ感染に対する感受性が有意に低かった（図４）。
本発明者らは、Ｈ－１ＰＶ細胞侵入を阻止するために、特異的抗ラミニンγ１抗体を使用して競合実験を行った。ラミニンγ１抗体とプレインキュベートしたＨｅＬａ細胞では、受容体チロシンキナーゼ膜貫通糖タンパク質である無関係なエフリンＢ型受容体（ＥＰＨＢ２）に対する対照ＩｇＧアイソタイプまたは対照抗体とプレインキュベートした細胞と比較して、Ｈ－１ＰＶ感染に対する感受性が有意に低かった（図４）。
【0067】
例６：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＬＡＭＣ１遺伝子ノックダウンはＨ－１ＰＶウイルス侵入を減少させる
本発明者らは、ＬＡＭＣ１遺伝子発現がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術によってノックダウンされた安定なＬＡＭＣ１ ＫＤ ＨｅＬａ細胞株を作製した。ＬＡＭＣ１ ＫＤ細胞では、親ＨｅＬａ細胞と比較して、Ｈ－１ＰＶ感染の強力な減少が観察された。Ｈ－１ＰＶ感染性のこの低下は、プラスミドトランスフェクションによるこれらの細胞へのＬＡＭＣ１遺伝子の再導入によって救済された（図５）。
本発明者らは、ＬＡＭＣ１遺伝子発現がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術によってノックダウンされた安定なＬＡＭＣ１ ＫＤ ＨｅＬａ細胞株を作製した。ＬＡＭＣ１ ＫＤ細胞では、親ＨｅＬａ細胞と比較して、Ｈ－１ＰＶ感染の強力な減少が観察された。Ｈ－１ＰＶ感染性のこの低下は、プラスミドトランスフェクションによるこれらの細胞へのＬＡＭＣ１遺伝子の再導入によって救済された（図５）。
【0068】
例７：ＬＡＭＣ１遺伝子の過剰発現はＨ－１ＰＶ感染性を増加させる。
本発明者らは次に、親ＨｅＬａ細胞に外因性ＬＡＭＣ１を過剰発現させることによって機能獲得実験を行った。ベクター単独と比較して、ＬＡＭＣ１を過剰発現させることによって、Ｈ－１ＰＶ細胞取り込みの６２％の増加が観察された（図６Ａ）。同様の条件下で、本発明者らは、Ｈ－１ＰＶ形質導入のためにＬＡＭＣ１発現プラスミドを一過性にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を評価した。ベクター単独と比較して、ＬＡＭＣ１プラスミドをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞では、Ｈ－１ＰＶ形質導入の有意な（２．２倍）増加が観察された（１２０．６％）（図６Ｂ）。
本発明者らは次に、親ＨｅＬａ細胞に外因性ＬＡＭＣ１を過剰発現させることによって機能獲得実験を行った。ベクター単独と比較して、ＬＡＭＣ１を過剰発現させることによって、Ｈ－１ＰＶ細胞取り込みの６２％の増加が観察された（図６Ａ）。同様の条件下で、本発明者らは、Ｈ－１ＰＶ形質導入のためにＬＡＭＣ１発現プラスミドを一過性にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を評価した。ベクター単独と比較して、ＬＡＭＣ１プラスミドをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞では、Ｈ－１ＰＶ形質導入の有意な（２．２倍）増加が観察された（１２０．６％）（図６Ｂ）。
【0069】
例８：ヘパリン処理はＨ－１ＰＶ感染性を損なう。
ラミニンは、臨床では抗凝固剤として使用されるヘパリン２５、２６に対するいくつかの結合部位を含む。本発明者らは、ヘパリンによる処理が、ラミニンへの結合についてウイルスと競合することによってＨ－１ＰＶ感染性を妨害し得ると仮定している。この仮説を試験するために、様々な濃度の可溶性ヘパリンを用いてＨｅＬａ細胞を前処理した後、Ｈ－１ＰＶに感染させた。表面シアル酸を切断することによってＨ－１ＰＶ細胞結合／侵入を防ぐ能力のために、ノイラミニダーゼを陽性対照として使用した。さらに、本発明者らはまた、細胞表面および細胞外マトリックスの豊富な成分であるヘパリン硫酸（ＨＳ）グリコサミノグリカン鎖を分解することが知られている酵素であるヘパリナーゼＩＩＩを用いて細胞を前処理した。予測通り、ノイラミニダーゼによる処理はＨ－１ＰＶ感染性を強力に阻害し、Ｈ－１ＰＶ侵入のためのシアル酸の重要性が確認された。ヘパリナーゼＩＩＩではなくヘパリンとのインキュベーションも、Ｈ－１ＰＶが細胞に浸透する能力を低下させた（図７Ａ）。阻害効果は、使用したヘパリンの濃度に比例した（図７Ｂ）。これらの結果と一致して、ヘパリン処理はまた、Ｈ－１ＰＶ形質導入効果を低下させ（図７Ｃ）、Ｈ－１ＰＶ誘導性腫瘍崩壊から細胞を保護した（図７Ｄ）。これらの結果は、ラミニンがウイルス細胞侵入レベルでＨ－１ＰＶ感染性に必須の役割を果たすという追加の証拠を提供する。
ラミニンは、臨床では抗凝固剤として使用されるヘパリン２５、２６に対するいくつかの結合部位を含む。本発明者らは、ヘパリンによる処理が、ラミニンへの結合についてウイルスと競合することによってＨ－１ＰＶ感染性を妨害し得ると仮定している。この仮説を試験するために、様々な濃度の可溶性ヘパリンを用いてＨｅＬａ細胞を前処理した後、Ｈ－１ＰＶに感染させた。表面シアル酸を切断することによってＨ－１ＰＶ細胞結合／侵入を防ぐ能力のために、ノイラミニダーゼを陽性対照として使用した。さらに、本発明者らはまた、細胞表面および細胞外マトリックスの豊富な成分であるヘパリン硫酸（ＨＳ）グリコサミノグリカン鎖を分解することが知られている酵素であるヘパリナーゼＩＩＩを用いて細胞を前処理した。予測通り、ノイラミニダーゼによる処理はＨ－１ＰＶ感染性を強力に阻害し、Ｈ－１ＰＶ侵入のためのシアル酸の重要性が確認された。ヘパリナーゼＩＩＩではなくヘパリンとのインキュベーションも、Ｈ－１ＰＶが細胞に浸透する能力を低下させた（図７Ａ）。阻害効果は、使用したヘパリンの濃度に比例した（図７Ｂ）。これらの結果と一致して、ヘパリン処理はまた、Ｈ－１ＰＶ形質導入効果を低下させ（図７Ｃ）、Ｈ－１ＰＶ誘導性腫瘍崩壊から細胞を保護した（図７Ｄ）。これらの結果は、ラミニンがウイルス細胞侵入レベルでＨ－１ＰＶ感染性に必須の役割を果たすという追加の証拠を提供する。
【0070】
例９：可溶性ラミニンによる処理はＨ－１ＰＶ細胞取り込みを阻止する。
ラミニンは、十字構造（１）を形成するジスルフィド結合を介して一緒に組み立てられた１つのα、１つのβおよび１つのγ鎖から構成される。１６の公知のラミニン三量体アイソフォーム（ラミニン１～１６）を構成する５つのα鎖（α１～５）、３つのβ鎖（β１～３）および３つのγ鎖（γ１～３）がこれまでに記載されている。ラミニンγ１の同定は、どの他のラミニン鎖がＨ－１ＰＶ細胞結合／侵入に関与するラミニンの一部であり得るかという疑問を提起した。この問題に対処するために、本発明者らは、市販の精製された可溶性三量体ラミニン、すなわち、いずれもγ１鎖を含むラミニン１１１、１２１、２１１、２２１、４１１、４２１、５１１および５２１、ならびにα３鎖、β３鎖、γ２鎖を含むラミニン３３２のパネルを使用して競合実験を行った。本発明者らは、対照として、細胞外マトリックスの別の一般的な構成成分である可溶性フィブロネクチンを使用した。細胞をラミニンまたはフィブロネクチンとプレインキュベートした後、ｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰウイルスに感染させた。γ１鎖を含むあらゆるラミニンを用いて前処理した細胞では、ウイルス形質導入の有意な強力な減少が観察されたが、ラミニン３３２（わずかな減少）またはフィブロネクチンでは観察されず、γ１鎖がラミニンへのＨ－１ＰＶ結合に必要であり、様々なラミニンポリペプチドがウイルス細胞結合／侵入プロセスに関与し得ることが示唆された。
ラミニンは、十字構造（１）を形成するジスルフィド結合を介して一緒に組み立てられた１つのα、１つのβおよび１つのγ鎖から構成される。１６の公知のラミニン三量体アイソフォーム（ラミニン１～１６）を構成する５つのα鎖（α１～５）、３つのβ鎖（β１～３）および３つのγ鎖（γ１～３）がこれまでに記載されている。ラミニンγ１の同定は、どの他のラミニン鎖がＨ－１ＰＶ細胞結合／侵入に関与するラミニンの一部であり得るかという疑問を提起した。この問題に対処するために、本発明者らは、市販の精製された可溶性三量体ラミニン、すなわち、いずれもγ１鎖を含むラミニン１１１、１２１、２１１、２２１、４１１、４２１、５１１および５２１、ならびにα３鎖、β３鎖、γ２鎖を含むラミニン３３２のパネルを使用して競合実験を行った。本発明者らは、対照として、細胞外マトリックスの別の一般的な構成成分である可溶性フィブロネクチンを使用した。細胞をラミニンまたはフィブロネクチンとプレインキュベートした後、ｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰウイルスに感染させた。γ１鎖を含むあらゆるラミニンを用いて前処理した細胞では、ウイルス形質導入の有意な強力な減少が観察されたが、ラミニン３３２（わずかな減少）またはフィブロネクチンでは観察されず、γ１鎖がラミニンへのＨ－１ＰＶ結合に必要であり、様々なラミニンポリペプチドがウイルス細胞結合／侵入プロセスに関与し得ることが示唆された。
【0071】
例１０：ＬＡＭＢ１のサイレンシングはＨ－１ＰＶ感染性を損なう。
Ｈ－１ＰＶ細胞結合／侵入におけるラミニンの関与を確認するために、本発明者らは、ラミニン遺伝子ファミリーの別のメンバーである、ラミニンβ１鎖をコードするＬＡＭＢ１遺伝子の発現をサイレンシングすることにした。ＬＡＭＢ１遺伝子の選択は、本発明者らのｓｉＲＮＡライブラリースクリーニングでは、ｓｉＲＮＡプールによるそのサイレンシングもＨ－１ＰＶ形質導入効率の強力な低下に関連しており（対照ｓｉＲＮＡと比較して約６０％、例１３を参照）、ライブラリーに表されるラミニン鎖をコードするものの中でＬＡＭＣ１に次いで最良の遺伝子としてスコアリングされたという事実によって示唆された（データは示さず）。
Ｈ－１ＰＶ細胞結合／侵入におけるラミニンの関与を確認するために、本発明者らは、ラミニン遺伝子ファミリーの別のメンバーである、ラミニンβ１鎖をコードするＬＡＭＢ１遺伝子の発現をサイレンシングすることにした。ＬＡＭＢ１遺伝子の選択は、本発明者らのｓｉＲＮＡライブラリースクリーニングでは、ｓｉＲＮＡプールによるそのサイレンシングもＨ－１ＰＶ形質導入効率の強力な低下に関連しており（対照ｓｉＲＮＡと比較して約６０％、例１３を参照）、ライブラリーに表されるラミニン鎖をコードするものの中でＬＡＭＣ１に次いで最良の遺伝子としてスコアリングされたという事実によって示唆された（データは示さず）。
【0072】
ＬＡＭＣ１によって得られた結果と同様に、ＬＡＭＢ１遺伝子の２つの異なる領域を標的とする２つの異なるｓｉＲＮＡの使用も、Ｈ－１ＰＶ細胞結合／侵入および形質導入を強力に減少させた（図９ＡおよびＢ）。これらの結果は、ラミニンがＨ－１ＰＶ細胞膜認識および侵入を媒介するという追加の証拠を提供する。
【0073】
例１１：ガレクチン－１はＨ－１ＰＶ侵入にも関与する。
レクチンガラクトシド結合可溶性１タンパク質（別名ガレクチン－１）をコードするＬＧＡＬＳ１遺伝子は、Ｈ－１ＰＶ生活環の上位活性化因子として本発明者らのｓｉＲＮＡライブラリースクリーニングによって同定された別の遺伝子であった（図１）。これらの結果を検証するために、ＬＡＭＣ１およびＬＡＭＢ１について先に示されたように、本発明者らは、ＬＧＡＬＳ１のサイレンシングのために２つの独立したｓｉＲＮＡを使用した。ＬＧＡＬＳ１サイレンシングは、対照ｓｉＲＮＡと比較して、Ｈ－１ＰＶ細胞取り込み（図１０Ａ）および形質導入（図１０Ｂ）の有意な減少と関連していた。これらの結果は、ガレクチン－１がＨ－１ＰＶ細胞侵入経路に重要な役割を果たし得るという証拠を提供する。
レクチンガラクトシド結合可溶性１タンパク質（別名ガレクチン－１）をコードするＬＧＡＬＳ１遺伝子は、Ｈ－１ＰＶ生活環の上位活性化因子として本発明者らのｓｉＲＮＡライブラリースクリーニングによって同定された別の遺伝子であった（図１）。これらの結果を検証するために、ＬＡＭＣ１およびＬＡＭＢ１について先に示されたように、本発明者らは、ＬＧＡＬＳ１のサイレンシングのために２つの独立したｓｉＲＮＡを使用した。ＬＧＡＬＳ１サイレンシングは、対照ｓｉＲＮＡと比較して、Ｈ－１ＰＶ細胞取り込み（図１０Ａ）および形質導入（図１０Ｂ）の有意な減少と関連していた。これらの結果は、ガレクチン－１がＨ－１ＰＶ細胞侵入経路に重要な役割を果たし得るという証拠を提供する。
【0074】
例１２：ＬＡＭＣ１、ＬＡＭＢ１およびＬＧＡＬＳ１遺伝子のサイレンシングは、Ｈ－１ＰＶ腫瘍崩壊からＨｅＬａ細胞を保護した。
本発明者らの結果は、ＬＡＭＣ１のｓｉＲＮＡ媒介性サイレンシングが、Ｈ－１ＰＶ誘導性腫瘍毒性からＨｅＬａ細胞を保護することを示す（図３）。この結果に基づいて、本発明者らは、ｓｉＲＮＡトランスフェクトＨｅＬａ細胞における細胞生存率を測定することによって、Ｈ－１ＰＶ誘導性腫瘍毒性に対するｓｉＲＮＡ媒介性ＬＡＭＢ１およびＬＧＡＬＳ１サイレンシングの影響を評価した。ＬＡＭＣ１ ｓｉＲＮＡによる処理を陽性対照として使用した。図３に上述したのと同じ実験条件下で、非トランスフェクト細胞またはｓｉＲＮＡ対照トランスフェクト細胞は、Ｈ－１ＰＶによって効率的に死滅した（それぞれ細胞生存率の７７．７％および６９．５％の低下）。対照的に、ＬＡＭＣ１、ＬＡＭＢ１またはＬＧＡＬＳ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞では、Ｈ－１ＰＶ誘導性細胞傷害性に対して有意に耐性が高かった（図１１）。
本発明者らの結果は、ＬＡＭＣ１のｓｉＲＮＡ媒介性サイレンシングが、Ｈ－１ＰＶ誘導性腫瘍毒性からＨｅＬａ細胞を保護することを示す（図３）。この結果に基づいて、本発明者らは、ｓｉＲＮＡトランスフェクトＨｅＬａ細胞における細胞生存率を測定することによって、Ｈ－１ＰＶ誘導性腫瘍毒性に対するｓｉＲＮＡ媒介性ＬＡＭＢ１およびＬＧＡＬＳ１サイレンシングの影響を評価した。ＬＡＭＣ１ ｓｉＲＮＡによる処理を陽性対照として使用した。図３に上述したのと同じ実験条件下で、非トランスフェクト細胞またはｓｉＲＮＡ対照トランスフェクト細胞は、Ｈ－１ＰＶによって効率的に死滅した（それぞれ細胞生存率の７７．７％および６９．５％の低下）。対照的に、ＬＡＭＣ１、ＬＡＭＢ１またはＬＧＡＬＳ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞では、Ｈ－１ＰＶ誘導性細胞傷害性に対して有意に耐性が高かった（図１１）。
【0075】
例１３：ＬＡＭＣ１、ＬＡＭＢ１およびＬＧＡＬＳ１が他の癌細胞株におけるＨ－１ＰＶ細胞表面結合／侵入に関与することの確認。
本発明者らは、２つの他の癌細胞株、すなわち、ＨＣＴ１１６（結腸直腸癌）およびＡ５４９（肺腺癌）におけるＨ－１ＰＶ細胞取り込みに果たすＬＡＭＣ１、ＬＡＭＢ１およびＬＧＡＬＳ１の役割を評価した。ＨｅＬａ細胞について先に示されたように（図２）、ＬＡＭＣ１、ＬＡＭＢ１およびＬＧＡＬＳ１の特異的サイレンシングは、対照ｓｉＲＮＡと比較して両細胞株においてＨ－１ＰＶ細胞取り込みを有意に減少させた（図１２ＡおよびＢ）。これらの結果は、この３つの遺伝子が、ウイルス侵入レベルでＨ－１ＰＶ生活環に関与しているという追加の証拠を提供する。
本発明者らは、２つの他の癌細胞株、すなわち、ＨＣＴ１１６（結腸直腸癌）およびＡ５４９（肺腺癌）におけるＨ－１ＰＶ細胞取り込みに果たすＬＡＭＣ１、ＬＡＭＢ１およびＬＧＡＬＳ１の役割を評価した。ＨｅＬａ細胞について先に示されたように（図２）、ＬＡＭＣ１、ＬＡＭＢ１およびＬＧＡＬＳ１の特異的サイレンシングは、対照ｓｉＲＮＡと比較して両細胞株においてＨ－１ＰＶ細胞取り込みを有意に減少させた（図１２ＡおよびＢ）。これらの結果は、この３つの遺伝子が、ウイルス侵入レベルでＨ－１ＰＶ生活環に関与しているという追加の証拠を提供する。
【0076】
例１４：ＬＡＭＣ１の発現レベルは、Ｈ－１ＰＶの腫瘍溶解活性と直接相関する。
Ｈ－１ＰＶは、様々な腫瘍実体に由来する広範囲の癌細胞株に感染し、それらを死滅させることができる８。ただし、あらゆる癌細胞がこのウイルスによって効率的に死滅するわけではなく、それらの一部はＨ－１ＰＶ感染に対して感受性が低いか、完全に抵抗性でさえある。パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）生活環は宿主細胞因子に厳密に依存することから、許容性の差は、これらの重要な調節因子のいくつかの欠如または機能的欠陥に起因し得る。
Ｈ－１ＰＶは、様々な腫瘍実体に由来する広範囲の癌細胞株に感染し、それらを死滅させることができる８。ただし、あらゆる癌細胞がこのウイルスによって効率的に死滅するわけではなく、それらの一部はＨ－１ＰＶ感染に対して感受性が低いか、完全に抵抗性でさえある。パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）生活環は宿主細胞因子に厳密に依存することから、許容性の差は、これらの重要な調節因子のいくつかの欠如または機能的欠陥に起因し得る。
【0077】
ＮＣＩ－６０癌細胞株スクリーニングは、特定のウイルス生活環に関与する許容性因子（例えば、細胞受容体）の同定に使用される強力なアプローチである１３、１６。この方法は、候補の同定のための許容癌細胞と耐性癌細胞との遺伝子発現プロファイリングの比較に依存している。
【0078】
したがって、Ｈ－１ＰＶ生活環の調節因子を同定するために、本発明者らは、本発明者らのｓｉＲＮＡライブラリースクリーニングに対する独立した相補的アプローチとして、Ｈ－１ＰＶ誘導性腫瘍崩壊に対する感受性について、ＮＣＩ－６０細胞株パネルに属する５３の癌細胞株をスクリーニングした。
【0079】
ＮＣＩ ６０細胞株パネルには、様々な腫瘍型、すなわち、肺、中枢神経系（ＣＮＳ）、黒色腫、乳房、腎臓、卵巣、結腸、前立腺および白血病に由来する癌細胞株が含まれる。スクリーニングは、細胞増殖のリアルタイムの監視を可能にするＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを使用して行った。細胞を９６ウェルＥプレートに播種し、未処理のままにするか、０．０５～５０のＭＯＩに及ぶ漸増量のＨ－１ＰＶに感染させた（図１３Ａ）。未処理細胞およびＨ－１ＰＶ感染細胞の増殖を３０分ごとに合計１６８時間監視し、ウェルに存在する細胞の数の直接的な尺度である正規化細胞指数（ＣＩ）として表した。懸濁増殖性白血病癌細胞株に該当する６つは、接着増殖細胞株の増殖を監視することしかできないＸｃｅｌｌＩｇｅｎｃｅシステムと適合しないため、スクリーニングから除外した。次いで、感染の２４、４８、７２および９６時間後に、５０％の細胞死（ＥＣ５０）を引き起こすウイルス濃度を計算した。様々な起源の３６の癌細胞株が、Ｈ－１ＰＶ感染性に対して非常に感受性であることが見出された（ＭＯＩ≦１０で細胞増殖抑制効果および細胞傷害効果が観察された）。１１の癌細胞株は、低感受性をもたらした（ＭＯＩ≧１０～５０でウイルスを使用した場合にのみ死滅した）が、合計６つの癌細胞株は、使用した最高Ｈ－１ＰＶ濃度（ＭＯＩ５０）に対して耐性であった（図１３Ｂ）。肺癌、ＣＮＳ癌、乳癌および黒色腫に由来する癌細胞株は、使用した最高ウイルス濃度（ＭＯＩ５０）に対して抵抗性であったＬＯＸ ＩＭＶＩ（黒色腫）およびＭＣＦ７（乳癌）のみを除いて、Ｈ－１ＰＶ感染に対して最も感受性が高かった。対照的に、結腸癌および卵巣癌に由来する細胞株は、Ｈ－１ＰＶ感染に最も耐性が高く（データは示さず）、ＨＣＴ－１５、ＨＣＣ－２９９８、ＣＯＬＯ ２０５（結腸癌）およびＯＶＣＡＲ－３（卵巣癌）は、使用した最高濃度のウイルスに耐性であった。
【0080】
Ｈ－１ＰＶ生活環を調節する候補遺伝子を同定するために、２つの生物情報学的後分析を行った。まず、本発明者らは、インプット（シードファイル）としてＥＣ５０値（７２時間）を使用して、ＤＴＰ－ＣＯＭＰＡＲＥ分析［ｈｔｔｐｓ：／／ｄｔｐ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｄａｔａｂａｓｅｓ＿ｔｏｏｌｓ／ｃｏｍｐａｒｅ．ｈｔｍ］を行った。この分析により、Ｈ－１ＰＶ感受性対低感受性または耐性癌細胞株の遺伝子発現プロファイル（公的に利用可能なデータベースに存在するマイクロアレイ結果に基づく）を比較し、ＥＣ５０値のあらゆる勾配を考慮してＨ－１ＰＶ感染に対するそれらの感受性と相関させた。３８８個の遺伝子が推定抑制因子（Ｈ－１ＰＶ低感受性／耐性癌細胞株ではアップレギュレートされ、高／中感受性癌細胞株ではダウンレギュレートされる）として同定され、４１７個の遺伝子が潜在的活性化因子として同定された（ｐ＜０．０５）（図１３Ｃ）。第２のさらにストリンジェントな分析では、ＣｅｌｌＭｉｎｅｒ生物情報学ツール［ｈｔｔｐｓ：／／ｄｉｓｃｏｖｅｒ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｅｌｌｍｉｎｅｒ／］を利用して、ＮＣＩ－６０癌細胞株から得られた遺伝子発現マイクロアレイデータを最初に検索した。次いで、検索したデータを調整し、前処理し、Ｈ－１ＰＶ感染に耐性の６つのみの癌細胞株（０としてスコア付けされた）と感受性の４７の癌細胞株（１としてスコア付けされた）とを比較することによって得られた遺伝子発現データを統合することによって変換した。次いで、Ｈ－１ＰＶ生活環に関与する候補遺伝子の同定に、Ｌｉｍｍａ＋Ｂ＆Ｈ補正に基づく示差的発現分析を適用した（ｐ＜０．０５）。この分析により、８２の推定活性化因子が得られた（図１３Ｄ）。ＤＴＰ－ＣＯＭＰＡＲＥおよび示差的発現分析から得られた活性化因子の２つの一覧を統合し、これにより、スクリーニングされた５３の癌細胞株を死滅させるＨ－１ＰＶの能力と有意に相関する５７の共通のＨ－１ＰＶ活性化因子を同定した（図１３Ｅ）。本発明者らは、これらの因子の中で、ラミニンおよびガレクチンファミリーの２つのメンバーであるＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１を見出した。
【0081】
例１５：データセット統合により、Ｈ－１ＰＶ生活環の活性化因子としてＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１が同定された。
本発明者らは、ｓｉＲＮＡライブラリースクリーニング（図１）から同定された１５１の活性化因子と、ＮＣＩ－６０癌細胞株スクリーニング（図１３）によって得られた５７の活性化因子とをさらに統合した。後者のうち、スクリーニングに使用したｓｉＲＮＡライブラリーでは２３のみが示された。２つの異なるデータセットの統合から共通して同定された２つのみの遺伝子が、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１であり（図１４）、Ｈ－１ＰＶ生活環に果たすこれらの２つの遺伝子の重要な役割が確認された。
本発明者らは、ｓｉＲＮＡライブラリースクリーニング（図１）から同定された１５１の活性化因子と、ＮＣＩ－６０癌細胞株スクリーニング（図１３）によって得られた５７の活性化因子とをさらに統合した。後者のうち、スクリーニングに使用したｓｉＲＮＡライブラリーでは２３のみが示された。２つの異なるデータセットの統合から共通して同定された２つのみの遺伝子が、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１であり（図１４）、Ｈ－１ＰＶ生活環に果たすこれらの２つの遺伝子の重要な役割が確認された。
【0082】
例１６：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ＬＧＡＬＳ１遺伝子ノックアウトは、ＬＧＡＬＳ１遺伝子の再導入によって救済されるＨ－１ＰＶ形質導入を損なう
Ｈ－１ＰＶ感染におけるＬＧＡＬＳ１の関与を確認するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術によってＬＧＡＬＳ１遺伝子発現がノックアウトされた安定なＬＧＡＬＳ１ＫＯ ＮＣＨ１２５神経膠腫細胞株を作製した（図１５）。ＥＧＦＰ遺伝子を有するｒｅｃＨ－１ＰＶに細胞を感染させた。ＮＣＨ１２５－対照（Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、その配列がいかなるヒト遺伝子も認識しない非特異的スクランブル２０ｎｔガイドＲＮＡとをコードする対照ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドを使用することによって確立された）と比較して、ＬＧＡＬＳ１ＫＯ細胞では、Ｈ－１ＰＶ形質導入の強力な減少が観察された。Ｈ－１ＰＶ形質導入のこの減少は、プラスミドトランスフェクションによるこれらの細胞へのＬＧＡＬＳ１遺伝子の再導入によって救済された（図１５）。これらの結果は、ガレクチン－１をコードするＬＧＡＬＳ１遺伝子が、Ｈ－１ＰＶ感染に必須の役割を果たすという追加の証拠を提供する。
Ｈ－１ＰＶ感染におけるＬＧＡＬＳ１の関与を確認するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術によってＬＧＡＬＳ１遺伝子発現がノックアウトされた安定なＬＧＡＬＳ１ＫＯ ＮＣＨ１２５神経膠腫細胞株を作製した（図１５）。ＥＧＦＰ遺伝子を有するｒｅｃＨ－１ＰＶに細胞を感染させた。ＮＣＨ１２５－対照（Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、その配列がいかなるヒト遺伝子も認識しない非特異的スクランブル２０ｎｔガイドＲＮＡとをコードする対照ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドを使用することによって確立された）と比較して、ＬＧＡＬＳ１ＫＯ細胞では、Ｈ－１ＰＶ形質導入の強力な減少が観察された。Ｈ－１ＰＶ形質導入のこの減少は、プラスミドトランスフェクションによるこれらの細胞へのＬＧＡＬＳ１遺伝子の再導入によって救済された（図１５）。これらの結果は、ガレクチン－１をコードするＬＧＡＬＳ１遺伝子が、Ｈ－１ＰＶ感染に必須の役割を果たすという追加の証拠を提供する。
【0083】
例１７：ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１ ｍＲＮＡ発現レベルは、神経膠芽腫患者由来細胞株において腫瘍崩壊を誘導するＨ－１ＰＶの能力と相関する
本発明者らは、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１がＨ－１ＰＶ感染に必須の役割を果たすことを示した。Ｈ－１ＰＶ腫瘍崩壊に対する感受性について５３の癌細胞株（ＮＣＩ－６０癌細胞株パネル）をスクリーニングすることにより、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１遺伝子の発現レベルと、このウイルスが癌細胞を死滅させる能力との間の統計的に有意な正の相関が明らかにされ、この２つの遺伝子が、ウイルス治療の成功を予測するためのバイオマーカーとして使用され得るという強力な証拠が提供された。これらの結果に基づいて、本発明者らはさらに、Ｈ－１ＰＶ腫瘍崩壊に対する感受性について、６つの神経膠芽腫由来細胞株を分析した。７２時間かけてＭＯＩ１０で細胞をＨ－１ＰＶに感染させた。２つの細胞株、すなわちＮＣＨ１２５、ＮＣＨ３７は、ウイルスによって６０％超死滅した。対照的に、Ｕ２５１、ＬＮ３０８、Ｔ９８ＧおよびＡ１７２－ＭＧは、Ｈ－１ＰＶ腫瘍崩壊に対して感受性が低く、３０％未満死滅した。（図１６Ａ）。これらの細胞株から全ＲＮＡを単離し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析に供して、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１遺伝子発現レベルを測定した。以前の結果と一致して、Ｈ－１ＰＶ感染に対して感受性の高い２つの遺伝子を比較的高レベルに発現する細胞株である神経膠芽腫細胞株では、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１ ｍＲＮＡレベルとＨ－１ＰＶ腫瘍崩壊との間の正の相関が見出された（図１６Ｂ）。
本発明者らは、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１がＨ－１ＰＶ感染に必須の役割を果たすことを示した。Ｈ－１ＰＶ腫瘍崩壊に対する感受性について５３の癌細胞株（ＮＣＩ－６０癌細胞株パネル）をスクリーニングすることにより、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１遺伝子の発現レベルと、このウイルスが癌細胞を死滅させる能力との間の統計的に有意な正の相関が明らかにされ、この２つの遺伝子が、ウイルス治療の成功を予測するためのバイオマーカーとして使用され得るという強力な証拠が提供された。これらの結果に基づいて、本発明者らはさらに、Ｈ－１ＰＶ腫瘍崩壊に対する感受性について、６つの神経膠芽腫由来細胞株を分析した。７２時間かけてＭＯＩ１０で細胞をＨ－１ＰＶに感染させた。２つの細胞株、すなわちＮＣＨ１２５、ＮＣＨ３７は、ウイルスによって６０％超死滅した。対照的に、Ｕ２５１、ＬＮ３０８、Ｔ９８ＧおよびＡ１７２－ＭＧは、Ｈ－１ＰＶ腫瘍崩壊に対して感受性が低く、３０％未満死滅した。（図１６Ａ）。これらの細胞株から全ＲＮＡを単離し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析に供して、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１遺伝子発現レベルを測定した。以前の結果と一致して、Ｈ－１ＰＶ感染に対して感受性の高い２つの遺伝子を比較的高レベルに発現する細胞株である神経膠芽腫細胞株では、ＬＡＭＣ１およびＬＧＡＬＳ１ ｍＲＮＡレベルとＨ－１ＰＶ腫瘍崩壊との間の正の相関が見出された（図１６Ｂ）。
【0084】
例１８：β－ラクトース処理はＨ－１ＰＶ形質導入を損なう
ガレクチンは、ラクトースなどのβ－ガラクトシドと相互作用する能力を有する保存された炭水化物認識ドメインを含むレクチンのファミリーを構成する。例えば、β－ラクトースがガレクチン－１に結合し、このタンパク質の機能性に影響を及ぼす配座変化を誘導することが見出された２８。本発明者らは、ガレクチン－１と相互作用することによって、β－ラクトースがＨ－１ＰＶ感染／形質導入を減少させ得ると考えている。２００ｍＭのβ－ラクトースを用いてＨｅＬａ細胞を前処理した後、ｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰに感染させた。それらの考察と一致して、β－ラクトースによる前処理は、Ｈ－１ＰＶ形質導入効果を有意に低下させた（図１７）。
ガレクチンは、ラクトースなどのβ－ガラクトシドと相互作用する能力を有する保存された炭水化物認識ドメインを含むレクチンのファミリーを構成する。例えば、β－ラクトースがガレクチン－１に結合し、このタンパク質の機能性に影響を及ぼす配座変化を誘導することが見出された２８。本発明者らは、ガレクチン－１と相互作用することによって、β－ラクトースがＨ－１ＰＶ感染／形質導入を減少させ得ると考えている。２００ｍＭのβ－ラクトースを用いてＨｅＬａ細胞を前処理した後、ｒｅｃＨ－１ＰＶ－ＥＧＦＰに感染させた。それらの考察と一致して、β－ラクトースによる前処理は、Ｈ－１ＰＶ形質導入効果を有意に低下させた（図１７）。
【0085】
参考文献
【数1】
【配列表フリーテキスト】
【0086】
配列表５～６ ＜２２３＞プライマー
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A-C】
【図7D-E】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B-C】
【図13D-E】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】