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特表2022-509180腫瘍周囲細胞による瘢痕形成を誘発する為の組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-20
(54)【発明の名称】腫瘍周囲細胞による瘢痕形成を誘発する為の組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20220113BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20220113BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20220113BHJP
A61K 47/59 20170101ALI20220113BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20220113BHJP
A61K 31/716 20060101ALI20220113BHJP
A61K 38/21 20060101ALI20220113BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20220113BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20220113BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220113BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220113BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20220113BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61K9/51
A61K47/60
A61K47/59
A61K38/02
A61K31/716
A61K38/21
A61K38/20
A61K31/7105
A61K48/00
A61P35/00
A61K47/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021529374
(86)(22)【出願日】2019-11-26
(85)【翻訳文提出日】2021-07-08
(86)【国際出願番号】 US2019063462
(87)【国際公開番号】W WO2020112913
(87)【国際公開日】2020-06-04
(31)【優先権主張番号】62/771,309
(32)【優先日】2018-11-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507189666
【氏名又は名称】デューク ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100107364
【弁理士】
【氏名又は名称】斉藤 達也
(72)【発明者】
【氏名】サクセナ，タルン
(72)【発明者】
【氏名】ベラコンダ，ラヴィ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA65
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076DD21
4C076EE17
4C076EE23
4C076EE49
4C076EE59
4C076FF68
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA17
4C084BA03
4C084BA44
4C084DA14
4C084DA22
4C084DA24
4C084DA25
4C084MA43
4C084NA05
4C084NA13
4C084ZB26
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086EA20
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA43
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB26
(57)【要約】
【解決手段】 組成物が提供され、前記組成物は（１）ナノ粒子；（２）任意で、リンカー及び／若しくはマスキング剤；及び（３）腫瘍周囲細胞を活性化して前記腫瘍周囲細胞による瘢痕形成を誘発するように構成されたリガンドを含む。
【効果】 幾つかの態様では、前記組成物の被験者への投与は、浸潤性の腫瘍を遮断し及び封じ込めることが可能な環境を生成し得る。
【効果】 幾つかの態様では、前記組成物の被験者への投与は、浸潤性の腫瘍を遮断し及び封じ込めることが可能な環境を生成し得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組成物であって、前記組成物は抱合体を含み、前記抱合体は（１）ナノ粒子；（２）任意で、リンカー及び／若しくはマスキング剤；及び（３）リガンドを含み、前記リガンドは、腫瘍周囲細胞における以下の実体の少なくとも１つを標的化し：（ｉ）Ｔｏｌｌ様受容体２；（ｉｉ）Ｔｏｌｌ様受容体４；（ｉｉｉ）ＣＳＦ－１受容体；（ｉｖ）ＩＦＮ－γ受容体１；（ｖ）ＩＦＮ－γ受容体２；（ｖｉ）キシロシルトランスフェラーゼ；及び（ｖｉｉ）ＴＮＦ－α受容体；及び（ｖｉｉｉ）ＩＬ－２受容体、及びそれによって前記腫瘍周囲細胞による瘢痕形成を誘発するように構成され、及び前記抱合体は約５０ｎｍ～約２００ｎｍの平均直径を有する、組成物。
【請求項2】
前記ナノ粒子は金ナノ粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記リンカー及び／若しくはマスキング剤は、ＰＥＧ、ＰＥＧ誘導体、若しくは親水性ポリカーボネートを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記リガンドは、腫瘍周囲細胞におけるＴｏｌｌ様受容体２及びＴｏｌｌ様受容体４の少なくとも１つを標的とするように構成されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記リガンドは、ペプチドグリカン、ＬＰＳ、ザイモサン、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、アミロイド－ベータペプチド、リポテイコ酸、ＨＭＧＢ１、熱ショックタンパク質、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤、ＬＰＳ＋ＩＦＮ－γ、キシロシド、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、リポカリン２、及びｍｉＲＮＡ－１５５のうちの１以上、それらの組み合わせ、又はそれらの何れか１つ若しくは組み合わせからの抽出物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
前記抱合体は、（１）金ナノ粒子；（２）ＰＥＧ；及び（３）ザイモサン抽出物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
組成物であって、前記組成物は（１）ナノ粒子；及び（２）リガンドを含み、前記リガンドは、腫瘍周囲細胞における以下の実体のうちの少なくとも１つを標的化するように構成され：（ｉ）Ｔｏｌｌ様受容体２；（ｉｉ）Ｔｏｌｌ様受容体４；（ｉｉｉ）ＣＳＦ－１受容体；（ｉｖ）ＩＦＮ－γ受容体１；（ｖ）ＩＦＮ－γ受容体２；（ｖｉ）キシロシルトランスフェラーゼ；（ｖｉｉ）ＴＮＦ－α受容体；及び（ｖｉｉｉ）ＩＬ－２受容体、及び前記ナノ粒子は、（ａ）前記リガンドと共に抱合体を形成する；及び（ｂ）前記リガンドを被包する、のうちの少なくとも１つであり、及び前記抱合体及び／若しくは被包体は向上された透過性及び保持性効果を示すのに十分な平均直径を有する、組成物。
【請求項8】
ＰＥＧ、ＰＥＧ誘導体、親水性ポリカーボネート、若しくはその誘導体を更に含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記ナノ粒子は金ナノ粒子を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項10】
前記抱合体及び／若しくは被包体は約５０ｎｍ～約２００ｎｍの平均直径を有する、請求項７に記載の組成物。
【請求項11】
前記リガンドは、ペプチドグリカン、ＬＰＳ、ザイモサン、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、アミロイド－ベータペプチド、リポテイコ酸、ＨＭＧＢ１、熱ショックタンパク質、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤、ＬＰＳ＋ＩＦＮ－γ、キシロシド、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、リポカリン２、及びｍｉＲＮＡ－１５５のうちの１以上、それらの組み合わせ、又はそれらの何れか１つ若しくは組み合わせからの抽出物を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項12】
前記組成物は抱合体を含み、前記ナノ粒子は金ナノ粒子を含み、及び前記リガンドはザイモサン抽出物を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項13】
腫瘍周囲細胞を活性化して前記腫瘍周囲細胞による瘢痕形成を誘発する方法であって、前記方法は、有効量の組成物をそれを必要とする被験者に投与することを含み、前記組成物は抱合体を含み、前記抱合体は（１）ナノ粒子；（２）任意で、前記ナノ粒子の循環時間を向上し及び前記ナノ粒子の前記被験者の血流からのクリアランスを防止するように構成されたリンカー及び／若しくはマスキング剤；及び（３）リガンドを含み、前記リガンドは腫瘍周囲細胞における以下の実体の少なくとも１つを標的化し：（ｉ）Ｔｏｌｌ様受容体２；（ｉｉ）Ｔｏｌｌ様受容体４；（ｉｉｉ）ＣＳＦ－１受容体；（ｉｖ）ＩＦＮ－γ受容体１；（ｖ）ＩＦＮ－γ受容体２；（ｖｉ）キシロシルトランスフェラーゼ；及び（ｖｉｉ）ＴＮＦ－α受容体、及びそれによって前記腫瘍周囲細胞による瘢痕形成を誘発するように構成されている、方法。
【請求項14】
前記抱合体はＥＰＲ効果を示すのに十分な平均直径を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記ナノ粒子は金ナノ粒子を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記抱合体は約５０ｎｍ～約２００ｎｍの平均直径を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項17】
前記リガンドは、ペプチドグリカン、ＬＰＳ、ザイモサン、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、アミロイド－ベータペプチド、リポテイコ酸、ＨＭＧＢ１、熱ショックタンパク質、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤、ＬＰＳ＋ＩＦＮ－γ、キシロシド、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、リポカリン２、及びｍｉＲＮＡ－１５５のうちの１以上、それらの組み合わせ、又はそれらの何れか１つ若しくは組み合わせからの抽出物を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項18】
前記ナノ粒子は金ナノ粒子を含み、及び前記リガンドはザイモサン抽出物を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項19】
前記実体は、ＧＢＭ腫瘍に隣接した腫瘍周囲間質細胞におけるＴｏｌｌ様受容体２である、請求項１９に記載の方法。
【請求項20】
前記投与は間質性ＣＳＰＧ発現を刺激する、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連の米国出願データ
本出願は、２０１８年１１月２６日出願の米国特許仮出願番号第６２／７７１，３０９号の優先権を主張するものであり、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年１１月２６日出願の米国特許仮出願番号第６２／７７１，３０９号の優先権を主張するものであり、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、腫瘍周囲細胞による瘢痕形成を誘発する為の組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【0003】
腫瘍の処置及び転移の防止は未だに課題となっている。このことは特に、その腫瘍が従来の手段ではアクセスし難い場合に言えることである。一例として、原発性脳腫瘍は、それらが脳の外側に転移することは滅多にないという点で他に類を見ない。それにもかかわらず、脳腫瘍は、高い罹患率及び、部分的にはそれらの局在性及び局所的に浸潤性であることが多い増殖に起因する、高い死亡率を特徴とする。神経膠細胞から生ずる腫瘍である神経膠腫は、全ての原発性脳腫瘍のほぼ３０％、及び全ての悪性のものの８０％を占め、原発性脳腫瘍による死亡原因の大部分を占める。ＷＨＯグレードＩＶ神経膠腫－多型神経膠芽腫（ＧＢＭ）－は、最も悪性の且つ頻繁に発生する神経膠腫である。新たにＧＢＭと診断された患者にとって、最適治療計画は、最大限に安全且つ実行可能な腫瘍塊の切除と、それに続く同時併用的及び補助的テモゾロミド（ＴＭＺ）プラス放射線療法と、それに続くＴＭＺ単独である。これらの方策にもかかわらず、ＧＢＭ患者の生存率は低迷が続いており、ここ５０年に渡りほとんど改善していない。このことの重大な理由は、ＧＢＭが高度に浸潤性であり、深く及び脳の雄弁な領域内に浸潤して、切除を極めて危険にし得るということである。従って、脳腫瘍を処置する為の、及び具体的には神経膠腫を処置する為の、改善された方法が必要とされている。
【0004】
脳腫瘍浸潤の極めて重要な決定因子は、その細胞外基質（ＥＣＭ）である。一般に、ＥＣＭは神経系損傷の病態生理学において鍵を握る成分である。外傷性の脳若しくは脊髄損傷後に形成される神経膠瘢痕のＥＣＭは、軸索再生に対して抑制的である。神経膠瘢痕ＥＣＭは、共有結合されたタンパク質－コンドロイチン硫酸（ＣＳ）グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）多糖複合体の多様なファミリーであるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン類（ＣＳＰＧ類）に富む。ＣＳＰＧ類の成長促進若しくは抑制／忌避効果は主に、ＣＳＰＧ類を形成する種々のＣＳ－ＧＡＧ類によって発揮される。外傷性の脳若しくは脊髄損傷の部位の周りのＣＳＰＧに富む神経膠瘢痕の形成は、極めて重要な障壁を提供して、炎症を鎮め、及び傷害部位を「遮断する（walling-off）」ことによって組織損傷の広範な広がりを防止する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
このことを念頭に置いて、必要とされるものは、外傷性ＣＮＳ（中枢神経系）傷害の続発症を再現する刺激を介して腫瘍周囲細胞を標的化し及び活性化して、腫瘍周囲細胞による瘢痕形成の誘発によって浸潤性の腫瘍成長若しくは広がりを遮断する及び封じ込めることのできる環境を生成する為の、組成物及び方法である。
【課題を解決するための手段】
【0006】
この概要は、発明を実施するための形態において更に後述する概念の選択を導入する為に提供される。この概要は、特許請求された主題の鍵となる若しくは必須の特徴を特定することを意図せず、この概要はまた、特許請求された主題の範囲を限定することの補助として用いられることも意図しない。
【0007】
本技術は、腫瘍周囲細胞の瘢痕形成を誘発して、癌細胞の成長を遅延させ、癌細胞を封じ込め、及び／若しくは処置位置からの癌細胞の広がりを実質的に防止する為の、組成物及び方法に関する。本技術の幾つかの態様は、外傷性ＣＮＳ傷害の続発症を再現する刺激をもって腫瘍周囲細胞を標的化し及び活性化することによって、腫瘍周囲細胞の瘢痕形成を誘発する為の組成物及び方法に関する。腫瘍周囲細胞のこのような活性化は、腫瘍細胞に対して少なくとも部分的に不透過性である既存の腫瘍を包囲する障壁若しくは壁を作り出し、それによって浸潤性の腫瘍の成長若しくは広がりを妨害する。
【0008】
一態様では、本技術は、（１）ナノ粒子；（２）任意で、リンカー及び／若しくはマスキング剤；及び（３）腫瘍周囲細胞を活性化してその腫瘍周囲細胞による瘢痕形成を誘発するように構成されたリガンド、を含む（compromising）組成物に関する。
【0009】
一態様では、本技術は、抱合体、被包体、若しくは両方を含む組成物に関する。前記抱合体、被包体、若しくは両方は、（１）ナノ粒子；（２）任意で、循環時間を増大させ及びナノ粒子の血流からのクリアランスを防止するように構成されたリンカー及び／若しくはマスキング剤；及び（３）リガンドを含んで（compromise）よく、前記リガンドは、腫瘍周囲細胞における以下の実体のうちの少なくとも１つを標的化するように構成される：（ｉ）Ｔｏｌｌ様受容体２；（ｉｉ）Ｔｏｌｌ様受容体４；（ｉｉｉ）ＣＳＦ－１受容体；（ｉｖ）ＩＦＮ－γ受容体１；（ｖ）ＩＦＮ－γ受容体２；（ｖｉ）キシロシルトランスフェラーゼ；（ｖｉｉ）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）受容体；及び（ｖｉｉｉ）ＩＬ－２受容体。前述の態様の幾つかにおいて、前記リンカー及び／若しくはマスキング剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ誘導体、若しくは親水性ポリカーボネートを含んでよい。追加的に若しくは代替的に、前述の態様の幾つかにおいて、前記抱合体、被包体、若しくは両方は約５０ｎｍ～約２００ｎｍの平均直径を有する。
【0010】
一態様では、組成物が提供され、前記組成物は、（１）ナノ粒子、及び（２）リガンド含み、前記リガンドは、腫瘍周囲細胞における以下の実体の少なくとも１つを標的化するように構成され：（ｉ）Ｔｏｌｌ様受容体２；（ｉｉ）Ｔｏｌｌ様受容体４；（ｉｉｉ）ＣＳＦ－１受容体；（ｉｖ）ＩＦＮ－γ受容体１；（ｖ）ＩＦＮ－γ受容体２；（ｖｉ）キシロシルトランスフェラーゼ；（ｖｉｉ）ＴＮＦ－α受容体；及び／若しくは（ｖｉｉｉ）ＩＬ－２受容体、及び前記ナノ粒子は、（ａ）リガンドと共に抱合体を形成する；及び（ｂ）前記リガンドを被包する、の少なくとも１つであり、及び前記抱合体及び／若しくは被包体は、静脈内に導入された場合に、向上された透過性及び保持性（enhanced permeability and retention：ＥＰＲ）効果を示し及び腫瘍周囲空間に局在化するのに十分な平均直径を有してよい。一態様では、前記組成物はＰＥＧ、ＰＥＧ誘導体、親水性ポリカーボネート、若しくはその誘導体を更に含む。
【0011】
前述の態様の幾つかを包含する本技術の幾つかの態様によると、前記ナノ粒子は約５ｎｍ～２００ｎｍの間の平均直径を有する金ナノ粒子を含んでよい。幾つかの態様では、前記ナノ粒子は約５０ｎｍ～２００ｎｍの間の平均直径を有するリポソームである。
【0012】
前述の態様の何れかを包含する本技術の幾つかの態様によると、前記リガンドは、ペプチドグリカン、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ザイモサン、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、アミロイド－ベータペプチド、リポテイコ酸、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）、熱ショックタンパク質、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤、ＬＰＳ＋ＩＦＮ－γ、キシロシド、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、リポカリン２、及びｍｉＲＮＡ－１５５のうちの１以上、それらの組み合わせ、又はそれらの何れか１つ若しくは組み合わせから抽出若しくは誘導されるペプチド若しくは他の混合物を含んでよい。一態様では、前記リガンドは本明細書においては「Ｚｐｅｐ」と称するザイモサン抽出物である。
【0013】
一態様では、抱合体を含む組成物が提供され、前記抱合体は、（１）金ナノ粒子；（２）リンカー及び／若しくはマスキング剤；及び（３）Ｚｐｅｐを含む。
【0014】
別の態様では、本明細書において提供される抱合体及び被包体の調製の為の方法が提供される。
【0015】
本技術の幾つかの態様によると、腫瘍周囲細胞を活性化して瘢痕形成を誘発する為の方法が提供される。一態様では、この活性化は、前記腫瘍周囲細胞による、神経及び神経膠の移動に対して抑制的であるＥＣＭ分子の産生のようなプロセスによって定義され得る。一態様では、前記方法は、ナノ粒子組成物を腫瘍の極近いところにある標的細胞に、その細胞を活性化し及び瘢痕形成を刺激する為に投与することを含む。一態様では、前記方法は、ポリペプチドでコーティングされた金ナノ粒子をＧＢＭ腫瘍の極近いところにある標的間質細胞に、その細胞を活性化し及び間質性コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）発現を刺激する為に投与すること含む。
【0016】
本技術の幾つかの態様は、腫瘍周囲組織の瘢痕形成を誘発することによって腫瘍成長若しくは腫瘍の広がりを遅延させる若しくは実質的に防止する為の方法を包含する。幾つかの態様では、瘢痕形成を誘発することは、腫瘍の極近くにある細胞を標的とする組成物を、その細胞を活性化し及び瘢痕形成を刺激する為に、患者に投与することを含む。幾つかの態様では、前記組成物は、１以上のナノ粒子と、腫瘍周囲細胞を活性化し及びそれらの瘢痕形成を誘発するように構成された前記ナノ粒子によって保持された１以上のリガンドとを含む。
【図面の簡単な説明】
【0017】
本明細書及び特許請求の範囲は下記の図面を参照することによってより容易に理解され得る。
【図1a】乃至
【図1e】神経膠瘢痕形成の確立されたインビトロモデルにおける、腫瘍細胞の忌避に対するＣＳＰＧ類の効果を示す図である。
【図2a】乃至
【図2f】神経膠細胞活性化に対するＺｐｅｐの効果を示す図である。
【図3a】乃至
【図3c】生体内での腫瘍周囲のＣＳＰＧの発現を刺激する為に、金ナノ粒子、ＰＥＧ、及びＺｐｅｐを含む抱合体（この抱合体は本明細書では「ＡｕＮＰ－Ｚ」と称する）を用いることの効果を示す図である。
【図4a】乃至
【図4b】生体内で腫瘍を拘束する為にＡｕＮＰ－Ｚを用いることの効果を示す図である。
【図5a】乃至
【図5c】腫瘍の成長を縮小する為にＡｕＮＰ－Ｚを用いることの効果を示す図である。
【図6a】乃至
【図6c】ＡｕＮＰ－Ｚに対する生体内応答のプロテオーム解析の結果を示す図である。
【図7】ＡｕＮＰ－Ｚ処置動物の、対照に対する、遺伝子セットエンリッチメント解析の結果を示す図である。
【図8】ＡｕＮＰ－Ｚ処置動物の、対照に対する、過剰発現解析の結果を示す図である。
【図9】ＡｕＮＰ、ＡｕＮＰ－ＰＥＧ、及びＡｕＮＰ－Ｚ処置動物におけるアストロサイト活性化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本技術は、腫瘍周囲細胞の瘢痕形成を誘発して、癌細胞の成長を遅延させ、癌細胞を封じ込め、及び／若しくは処置位置からの癌細胞の広がりを実質的に防止する為の、組成物及び方法に関する。本技術の幾つかの態様は、外傷性ＣＮＳ傷害の続発症を再現する刺激を用いて腫瘍周囲細胞を標的化し及び活性化することにより、腫瘍周囲細胞の瘢痕形成を誘発する為の組成物及び方法に関する。腫瘍周囲細胞のこのような活性化は、既存の腫瘍の周りに腫瘍細胞に対して不透過性である局所的な障壁若しくは壁を作り出し、それによって浸潤性の腫瘍の成長若しくは広がりを少なくとも部分的に制限する。
【0019】
本技術の幾つかの態様は、（１）ナノ粒子；（２）任意で、リンカー及び／若しくはマスキング剤；及び（３）腫瘍周囲細胞を活性化してその腫瘍周囲細胞による瘢痕形成を誘発するように構成されたリガンド、を含む（compromises）組成物を包含する。幾つかの態様では、前記組成物はリンカー及び／若しくはマスキング剤を含まず、及び前記ナノ粒子及び前記リガンドのみを含む。
【0020】
幾つかの態様では、前記組成物は、共有結合されたタンパク質－コンドロイチン硫酸（ＣＳ）グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）多糖複合体類の多様なファミリーであるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン類（ＣＳＰＧ類）の産生を活性化するように構成されてよい。ＣＳＰＧの産生を活性化することは、脳癌（ＧＢＭ等）の広がりを遅延させ若しくは防止する為に特に有益であり得る。脳腫瘍浸潤の極めて重要な決定因子は、その細胞外基質（ＥＣＭ）である。一般に、ＥＣＭは神経系損傷の病態生理学において鍵を握る成分である。外傷性脳若しくは脊髄損傷後に形成される神経膠瘢痕のＥＣＭは軸索再生に対して抑制的である。ＣＳＰＧ類の成長促進若しくは抑制／忌避効果は主に、ＣＳＰＧ類を形成する種々のＣＳ－ＧＡＧによって発揮される。外傷性脳若しくは脊髄損傷の部位の周りのＣＳＰＧに富む神経膠瘢痕形成は、極めて重要な障壁を提供して、炎症を鎮め、及び傷害部位を「遮断する（walling-off）」ことによって組織損傷の広範な広がりを防止する。以下に、本技術の組成物及び方法に関する更なる詳細を記載する。
【0021】
ナノ粒子
幾つかの態様では、好適なナノ粒子は約５０ｎｍ～２００ｎｍの間の平均直径を有することとなる。一部の実施形態では、好適なナノ粒子は、ＥＰＲ効果を利用してＧＢＭ等の血管形成された腫瘍の腫瘍周辺を標的とし及びそこに蓄積するように構成されることとなる。
幾つかの態様では、好適なナノ粒子は約５０ｎｍ～２００ｎｍの間の平均直径を有することとなる。一部の実施形態では、好適なナノ粒子は、ＥＰＲ効果を利用してＧＢＭ等の血管形成された腫瘍の腫瘍周辺を標的とし及びそこに蓄積するように構成されることとなる。
【0022】
幾つかの態様では、前記ナノ粒子は金ナノ粒子である。金ナノ粒子は、ペイロード送達を改善し及び標的化する為に、薬物の体内分布を病的な臓器、組織、及び細胞に対して最適化することが知られている。ナノ粒子は困難な送達部位（脳、網膜、腫瘍、細胞内小器官）の為に特に有用である。ナノ粒子の性能は、粒子の大きさ及び表面官能性に依存する。好適な金ナノ粒子は広く知られており、テッドペラ社（Ted Pella, Inc.）製のコロイド状金製品番号１５７０１－１～１５７１４－２０が挙げられる。具体的な態様では、好適な金ナノ粒子として、テッドペラ社（Ted Pella, Inc.）から購入される製品番号１５７０８（６０ｎｍ直径）を挙げてよい。他の態様では、任意の好適な鉄、シリカ、若しくは乳酸グリコール酸共重合体（poly(lactic-co-glycolic acid):ＰＬＧＡ）ナノ粒子を、金ナノ粒子と組み合わせて若しくは金ナノ粒子に替えて使用してよい。例えば、好適な酸化鉄ナノ粒子としては、シグマアルドリッチ社（Sigma Alrdrich, Inc.）製の製品番号７４７３２７、７４７４２４、７４７２５４、７４７３４３、７４７６３１９、７４７３００、７４７４０８、７４７４１６、７９０５０８、７４７３３５、７４７４３２、７４７４５９、７４７４６７、及び７４７４４０、並びにポリ（ビニルアルコール）ナノ粒子を挙げてよい。好適なシリカミクロスフィアとしては、例えば、ポリサイエンス社（Polysciences, Inc.）製の製品番号２４３２０－１５、２４２９８－１０、２４０４０－１０、及び２４０４１－１０を挙げてよい。好適なＰＬＧＡナノ粒子としては、例えば、シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich, Inc.）製のデグラデクス（Degradex）（登録商標）製品番号８０５０９２及び８０５１０６を挙げてよい。
【0023】
別の態様では、前記ナノ粒子はリポソームを含んでよい。「リポソーム」とは、本明細書で使用する場合、一般に、内部空洞を含有する球状の若しくは概して球状の粒子をいう。リポソームの壁は脂質の二重層を含み得る。これらの脂質はリン脂質であり得る。多数の脂質及び／若しくはリン脂質を使用してリポソームを作製してよい。一例は、疎水性の及び極性の頭部基部分を有する両親媒性脂質であり、これらは、リン脂質に例示されるように、水中で自発的に二重層ビヒクルを形成してよく、又はこれらは、それらの疎水性部分を二重層膜の内側の疎水性領域と接触させ、及びそれらの極性頭部基部分を前記膜の外側の極性表面に配向させて、安定的に脂質二重層に組み込まれてもよい。幾つかの態様では、好適なリポソームとしては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７８５，５６８号に開示されるものを挙げてよい。
【0024】
リンカー及びマスキング剤
前記リンカーは、前記ナノ粒子を前記標的化リガンドと関連付けることになる任意の化合物であってよい。幾つかの態様では、前記リンカーは前記ナノ粒子、前記リガンド、若しくは両方に対する共有結合を形成してよい。幾つかの態様では、前記リンカーと、前記ナノ粒子、リガンドの何れかとの、若しくは両方との相互作用は非共有結合的（例えば、ハイドロゲル結合、親和力等）である。より一般には、前記リンカーは、各端部に官能基を有する分子であってよく、その端部によってリンカーはリガンドをナノ粒子の本体に結合させる。前記リンカーは切断可能であっても切断可能でなくてもよい。前記リンカーはまた、前記リガンドの一部であってよく、その場合には、前記リガンドは直接前記ナノ粒子に接続されてよい。
前記リンカーは、前記ナノ粒子を前記標的化リガンドと関連付けることになる任意の化合物であってよい。幾つかの態様では、前記リンカーは前記ナノ粒子、前記リガンド、若しくは両方に対する共有結合を形成してよい。幾つかの態様では、前記リンカーと、前記ナノ粒子、リガンドの何れかとの、若しくは両方との相互作用は非共有結合的（例えば、ハイドロゲル結合、親和力等）である。より一般には、前記リンカーは、各端部に官能基を有する分子であってよく、その端部によってリンカーはリガンドをナノ粒子の本体に結合させる。前記リンカーは切断可能であっても切断可能でなくてもよい。前記リンカーはまた、前記リガンドの一部であってよく、その場合には、前記リガンドは直接前記ナノ粒子に接続されてよい。
【0025】
幾つかの態様では、前記抱合体は、前記ナノ粒子及びリガンドに結び付くだけでなく、免疫系によって除去されることから前記粒子を保護するマスキング剤を含んでよい。幾つかの態様では、前記リンカー及び／若しくはマスキング剤はポリマーであってよい。具体的な態様では、前記リンカー及び／若しくはマスキング剤はＰＥＧ、ＰＥＧ誘導体、若しくは親水性ポリカーボネートであってよい。前記ポリマーは、様々な分子量の何れかを有することができる。一例では、前記ポリマーはＰＥＧを有し、及びこのＰＥＧ鎖は約１，０００～１０，０００Ｄａの間の分子量を有する。
【0026】
リガンド
幾つかの態様では、好適なリガンドは、（ｉ）前記ナノ粒子と抱合体を形成し、前記ナノ粒子により被包され、若しくは他の態様で前記ナノ粒子と関連付けられることになり；及び（ｉｉ）腫瘍周囲細胞を活性化してその腫瘍周囲細胞による瘢痕の付着（scar deposition）を誘発するように構成される、任意のリガンドを包含する。
幾つかの態様では、好適なリガンドは、（ｉ）前記ナノ粒子と抱合体を形成し、前記ナノ粒子により被包され、若しくは他の態様で前記ナノ粒子と関連付けられることになり；及び（ｉｉ）腫瘍周囲細胞を活性化してその腫瘍周囲細胞による瘢痕の付着（scar deposition）を誘発するように構成される、任意のリガンドを包含する。
【0027】
一態様では、好適なリガンドは、腫瘍周囲細胞における下記の実体のうちの少なくとも１つを標的化するように構成されたものを包含する：（ｉ）Ｔｏｌｌ様受容体２；（ｉｉ）Ｔｏｌｌ様受容体４；（ｉｉｉ）ＣＳＦ－１受容体；（ｉｖ）ＩＦＮ－γ受容体１；（ｖ）ＩＦＮ－γ受容体２；（ｖｉ）キシロシルトランスフェラーゼ；（ｖｉｉ）ＴＮＦ－α受容体；及び（ｖｉｉｉ）ＩＬ－２受容体。
【0028】
なお別の態様では、前記リガンドは、ペプチドグリカン、ＬＰＳ、ザイモサン、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、アミロイド－ベータペプチド、リポテイコ酸、ＨＭＧＢ１、熱ショックタンパク質、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤、ＬＰＳ＋ＩＦＮ－γ、キシロシド、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、リポカリン２、及びｍｉＲＮＡ－１５５の１つ以上から選択される。用語「リガンド」は更にそれらの抽出物を包含する。例えば、前記リガンドは水溶性であり且つタンパク質画分を含むザイモサン抽出物（Ｚｐｅｐ）を含んでよい。好ましくは、前記抽出物はタンパク質画分を、適用時に約２５μｇ／ｍＬの濃度を提供するのに十分な量で含む。前記タンパク質画分は、ザイモサン中に日常的に見られる任意のタンパク質を含んでよい。前記タンパク質画分は、タンパク質、タンパク質断片、ポリペプチド、若しくはそれらの組み合わせを含んでよい。
【0029】
酵母細胞壁調製物であるザイモサンは、脳に直接注入された場合にミクログリア及びアストロサイトを特異的に活性化し、物理的傷害の続発症をその非存在下で再現する。ミクログリア条件培地はアストロサイトを活性化し及びＺｐｅｐの直接添加はアストロサイトを活性化せず、Ｚｐｅｐが生体内のマクロファージ及び恐らくは他の骨髄系細胞を介してその炎症効果を発揮したことを示した。故に、用語「誘発する」は、直接的に引き起こすことを意味してよく、及び内在性のプロセスを活性化し、それがひいては所望の効果を引き起こすことを意味してもよい。
【0030】
「標的化分子」は、前記リガンドを特定の場所若しくは細胞の種類に標的化する若しくは向けるように働く化合物を意味する。一般に、標的化分子は、特異的な標的エピトープ若しくは受容体に特異的に結合する。「特異的に結合する」とは、非標的細胞は前記リガンドと特異的に相互作用しないか又は前記リガンドによって極弱くしか認識されないということを意味する。幾つかの態様では、標的化分子は、細胞表面受容体に対するリガンドの全て若しくは一部（例えば、結合部分）である。好適なリガンドとしては、細胞表面受容体に結合するリガンド類の全て若しくは官能基部分が挙げられるが、それらに限定されない。
【0031】
腫瘍周囲細胞における「実体」とは、細胞の表面内若しくは表面上の任意の部分を意味する。前記実体は細胞表面受容体であるか、又は適切なリガンドと相互作用する任意の分子であってよい。或いは、前記実体は腫瘍周囲細胞上と記載されてもよく、並びに腫瘍周囲細胞の細胞膜内に埋め込まれていてもよい。
【0032】
「腫瘍周囲の」とは、腫瘍に近接している任意の細胞を意味する。前記細胞は腫瘍に直接隣接していてもよく、腫瘍と接触していてもよく、又は腫瘍の近くにあってもよい。
【0033】
「腫瘍周囲細胞による瘢痕形成を誘発する」若しくはその反復により、任意の腫瘍周囲細胞の本明細書に記載される組成物への暴露が或るプロセスを開始させ、それによって瘢痕形成プロセスが生ずるということが意味される。このプロセスは結果として腫瘍と健康な組織との間に壁をもたらす。この壁はその誘発された腫瘍周囲細胞により生成され、及びその腫瘍周囲細胞及び他の成分を包含し得る。
【0034】
向上された透過性及び保持性（enhanced permeability and retention：ＥＰＲ）効果とは、腫瘍の漏出性の脈管構造（向上された透過性）及び不十分なリンパ排出（保持性）に起因する、腫瘍内でのナノ粒子の優先的な蓄積を描写している。免疫系から遮蔽されたナノ粒子が血流を進む場合、それらが前記漏出性の腫瘍脈管構造を通過する度に、それらは血管から腫瘍中へと漏出し、及び複数回の通過により経時的に、それらは腫瘍中に蓄積する。前記粒子は、腫瘍の不十分なリンパ排出及び血管排出に起因して、それらが他の貪食性の細胞によって貪食される、若しくは溶解され／崩壊されるまで、又は腫瘍中の成熟した脈管構造若しくはリンパ排出が確立されるまで、腫瘍中に保持される。
【0035】
別の態様では、本明細書中に提供される抱合体及び被包体の調製の為の方法が提供される。
【0036】
なお別の態様では、腫瘍周囲細胞を活性化してその腫瘍周囲細胞による瘢痕形成を誘発する為の方法が提供される。一態様では、前記方法は、腫瘍の極近くにある標的細胞に、その細胞を活性化し及び瘢痕形成を刺激する為に、ナノ粒子組成物を投与することを含む。一態様では、前記方法は、ＧＢＭ腫瘍に近接した標的間質細胞に、その細胞を活性化し及び間質のＣＳＰＧ発現を刺激する為に、ポリペプチドでコーティングされた金ナノ粒子を投与することを含む。
【0037】
一態様では、瘢痕形成の内在機構を活用し、腫瘍の細胞以外の細胞の挙動を調節することによって腫瘍の成長を緩やかにする為の、組成物及び方法が提供される。具体的な態様においては、金ナノ粒子を介したＥＰＲ効果を用いて間質空間における抑制性ＣＳＰＧ発現を誘発する為の内在機構を標的化する為の組成物及び方法が提供される。
【0038】
一態様では、腫瘍拘束の為の方法が提供される。具体的な態様では、腫瘍拘束の為の前記方法は部分的に、アストロサイト、ミクログリア、及び／若しくは、ＣＳＰＧの産生、の活性化に頼る。
【0039】
本開示の原理の理解を促進する目的で、具体的な、可能な態様を参照してきた。例えば、本明細書に記載された態様は主に、ＧＢＭ腫瘍に近接する標的間質細胞への、その細胞を活性化し及び間質性ＣＳＰＧ発現を刺激する為の、Ｚｐｅｐでコーティングされた金ナノ粒子の投与を対象とする。しかしながら、本開示の範囲をこれらに制限することは意図されていない。むしろ、本発明者らは、本明細書に開示されたナノ粒子－リガンドの組み合わせの各々の、瘢痕形成を誘発し及び従って腫瘍の拘束を誘発するように任意の腫瘍周囲細胞に標的化する為の使用を企図している。
【0040】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、当該冠詞の文法上の目的語の１つ若しくは２つ以上（即ち、少なくとも１つ）を参照する為に使用される。例として、「an element」は、少なくとも１つの要素を意味し及び２つ以上の要素を包含することができる。
【0041】
「約」は、所望の結果に影響を及ぼすことなく所与の値がその終点を「僅かに上回る」若しくは「僅かに下回る」場合があるということを提供することによって、数値範囲の終点に対して柔軟性（flexibility）を提供する為に使用される。
【0042】
用語「包含する、含む（including）」、「含む（comprising）」、若しくは「有する（having）」、及びそれらの変型形態の本明細書における使用は、その後に挙げられる要素、及びそれらの等価物、並びに追加の要素を包含することを意味する。特定の要素を「包含する、含む（including）」、「含む（comprising）」、若しくは「有する（having）」として記載される態様はまた、それらの特定の要素「から本質的に成る（consisting essentially of）」及び「から成る（consisting of）」としても企図される。本明細書で使用する場合、「及び／若しくは、及び／又は（and/or）」は、関連の列挙事項の１以上の任意の及び全ての可能な組み合わせ、並びに選択肢（alternative）（「or」）において解釈される場合の組み合わせの欠如を指す及び包含する。
【0043】
本明細書で使用する場合、伝統的な語句「から本質的に成る（consisting essentially of）」（及び文法上の変形形態）は、特許請求された発明の記載された材料若しくは工程「及び基本的な及び新規な特徴（類）に実質的な影響を及ぼさない材料若しくは工程」を包含するとして解釈されるべきである。ハーツ（Herz）の件、５３７Ｆ．２ｄ５４９、５５１－５２、１９０、米国特許審判決録（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ）４６１、４６３（関税特許控訴裁（ＣＣＰＡ）、１９７６年）（強調は原文中）を参照のこと。米国特許審査基準（ＭＰＥＰ）§２１１１．０３も併せて参照のこと。このように、用語「から本質的になる」は、「含む（comprising）」と等価であると解釈すべきではない。
【0044】
更に、本開示は、幾つかの態様では、任意の特徴若しくは特徴の組み合わせが除外され若しくは省略されることが可能であるということを企図している。例えば、複合物が成分Ａ、Ｂ、及びＣを含むと明細書に記載されている場合、Ａ、Ｂ、若しくはＣ、又はそれらの組み合わせの何れかが単独で若しくは任意の組み合わせにおいて省略され及び権利放棄されることが可能であるということが明確に意図される。
【0045】
値の範囲の記載は単に、別途記述しない限り、その範囲内の各別個の値に個々に言及する簡単な方法としての役割を果たすことが意図されており、及び各別個の値は、それがあたかも個々に記載されたかのように本明細書に組み込まれる。例えば、濃度範囲が１％～５０％と記載された場合、２％～４０％、１０％～３０％、若しくは１％～３％等の値が、本明細書中に明確に列挙されているということが意図されている。これらは具体的に意図されているものの単なる例であり、及び列挙された下限値及び上限値の間及びそれらを包含する数値の全ての可能な組み合わせが本開示において明確に記述されているものとみなされる。
【0046】
別途規定しない限り、全ての技術的用語は本開示が属する技術分野の当業者に共通に理解される意味と同じ意味を有する。
【0047】
本明細書で使用する場合、「処置」、「療法」、及び「治療計画」は、患者により呈示される若しくは患者が影響を受けやすい場合がある疾病、障害、若しくは生理的状態に対応して行われる臨床的介入を指す。処置の狙いは、症状の緩和若しくは予防、疾病、障害、若しくは状態の進行若しくは悪化の遅延若しくは停止、及び／又は疾病、障害、若しくは状態の寛解を包含する。処置の狙いは、癌組織の進行を遅延させること、癌組織のより従来的な処置に対する感受性を増進させること、又は癌組織に向けた化学療法及び／若しくは放射線療法の副作用を低減させることを包含し得る。用語「効果的な量」若しくは「治療上効果的な量」とは、有益な若しくは望ましい生物学的及び／若しくは臨床的結果をもたらすのに十分な量をいう。
【0048】
用語「疾病」は、本明細書で使用する場合、有機体の一部に影響を及ぼす構造若しくは機能の任意の異常状態及び／若しくは障害を包含するがこれらに限定されない。それは、伝染病等の外的因子によって、若しくは癌、癌転移等のような内的機能障害によって引き起こされ得る。
【0049】
「投与」は、ヒト、霊長動物、哺乳動物、哺乳類被験者、動物、獣医学の被験者、プラセボ被験者、研究被験者、実験被験者、細胞、組織、臓器、若しくは生物体液に適用される場合、外因性のリガンド、試薬、プラセボ、小分子、医薬品、治療薬、診断薬、若しくは組成物（例えば、本明細書において提供されるような、金ナノ粒子：リンカー：リガンド抱合体）の被験者、細胞、組織、臓器、若しくは生物体液等への接触を指すが、それに限定されない。
【0050】
当該技術分野で既知であるように、癌は一般に、制御されない細胞成長とみなされる。本態様の方法は、任意の癌を包囲する腫瘍周囲組織に影響を及ぼし、及びその任意の転移／移動を妨害する若しくは防止する為に使用することができる。幾つかの態様では、前記癌は固形腫瘍を含む。例としては、限定されないが、原発性及び転移性の両方を包含する、乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌（cervical cancer）、胃腸癌、膵癌、神経膠芽腫、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮頸癌（uterine cervical cancer）、子宮内膜癌、唾液腺癌、中皮腫、腎癌、外陰癌、膵癌、甲状腺癌、肝細胞癌、皮膚癌、黒色腫、ぶどう膜黒色腫、脳癌（例えば、ＧＢＭ）、神経芽細胞腫、種々のタイプの頭部及び頸部癌、ユーイング肉腫、末梢性神経上皮種、副腎皮質癌、直腸癌、食道癌、甲状腺癌、胃癌、中皮腫、精巣癌等が挙げられる。
【0051】
本明細書で使用する場合、用語「被験者」及び「患者」は本明細書において交換可能に使用され、及びヒト及び非ヒト動物の両方を指す。本開示の用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物、及び、例えば非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等の非哺乳動物を包含する。
【0052】
本明細書に記載される組成物は、単独で若しくは薬剤的に許容される賦形剤と組み合わせて、適切な応答を誘発するのに十分な量で被験者に投与されることができる。前記応答は、限定されないが、特異的免疫応答、非特異的免疫応答、特異的及び非特異的の両方の応答、先天性の応答、原発性免疫応答、適応免疫、二次免疫応答、記憶免疫応答、免疫細胞活性化、免疫細胞増殖、免疫細胞分化、及びサイトカインの発現を含むことができる。幾つかの態様では、前記応答は、ＣＳＰＧ類を産生する為の間質細胞の活性化を含む。
【0053】
幾つかの態様では、本開示は、被験者に有効量のプロテオグリカンを投与することにより前記被験者における処置を提供する為の方法を提供する。「有効量」は本明細書で使用する場合、治療上若しくは予防上の利益を提供する量を意味する。本明細書において提供されるような抱合体若しくは被包体の有効量は、医師が、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染若しくは転移の程度、及び患者（被験者）の状態における個々の違いを考慮して、決定することができる。一般に、本明細書に記載される抱合体若しくは被包体を含む医薬組成物は、１～１０１１粒子／ｋｇ体重、好ましくは２～１０１０粒子／ｋｇ体重（これらの範囲内の全ての整数値を包含）の用量（dosage）において投与されてよいと記述することができる。抱合体若しくは被包体はそれらの用量で複数回投与されてもよい。前記抱合体若しくは被包体は、静脈内、腫瘍内、皮下、及び腹腔内投与を包含する当該技術分野において一般に知られた技術を用いて投与されることができる。特定の患者に対する最適な用量及び処置計画は、疾病の兆候に対して患者を観察し、及びそれに応じて処置を調節することによって医学の当業者により容易に決定されることができる。
【0054】
本明細書に記載される抱合体若しくは被包体の有効量は、１回の投薬量（dose）において与えられ得るが、１回の投薬量に制限されない。故に、前記投与は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、又はそれ以上の、前記組成物の投与とすることができる。本方法において２回以上の投与が存在する場合、前記投与は、１分、２分、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくはそれより多い分数の時間間隔によって、約１時間、２時間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間等の間隔によって、離間されることができる。時間数の文脈において、用語「約」は、プラス若しくはマイナス、３０分以内の任意時間の間隔を意味する。前記投与はまた、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、及びそれらの組み合わせの時間間隔により離間されることができ、投与間の数週間若しくは数ヶ月間さえも包含する。本発明は、時間において等しく離間された投薬間隔に限定されず、１日、４日、７日、及び２５日における投与からなるプライミングスケジュール（単に非限定例を提供）等の、等しくない間隔における投薬（doses）を包含する。
【0055】
「薬剤的に許容される賦形剤」若しくは「診断上許容可能な賦形剤」としては、限定されないが、滅菌蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液、アミノ酸系緩衝剤、若しくは重炭酸緩衝液が挙げられる。選択される賦形剤及び使用される賦形剤の量は、投与の様式に依存することになる。投与は注射、点滴、若しくはそれらの組み合わせを含む。
【0056】
特定の被験者／患者の為の有効量は、処置されている状態、患者の健康全般、投与の経路及び投薬量、及び副作用の重篤度等の要因に依存して変わり得る。処置及び診断の方法の為のガイダンスが入手可能である（例えば、メイナード（Maynard）ら（１９９６年）「よき臨床診療の為の標準操作手順の手引き（A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice）」、インターファームプレス（Interpharm Press）、フロリダ州、ボカラトン（Boca Raton）;デント（Dent）（２００１年）「よき研究室及びよき臨床診療（Good Laboratory and Good Clinical Practice）」、アーチパブリッシング（Urch Publ.）、英国、ロンドンを参照のこと）。
【0057】
本開示の抱合体及び被包体は、投薬量（dose）若しくは用量（dosages）において投与されることができ、各投薬量は少なくとも１００抱合体若しくは被包体／ｋｇ体重以上；ある態様においては１０００抱合体若しくは被包体／ｋｇ体重以上；通常は少なくとも１０，０００抱合体若しくは被包体；より通常は少なくとも１００，０００抱合体若しくは被包体；最も通常は少なくとも１，０００，０００抱合体若しくは被包体；しばしば少なくとも１０，０００，０００抱合体若しくは被包体；よりしばしば少なくとも１００，０００，０００抱合体若しくは被包体；典型的には少なくとも１，０００，０００，０００抱合体若しくは被包体；普通には少なくとも１０，０００，０００，０００抱合体若しくは被包体；便利には少なくとも１００，０００，０００，０００抱合体若しくは被包体；及び時には少なくとも１，０００，０００，０００，０００抱合体若しくは被包体／ｋｇ体重を含む。
【0058】
例えば、１回／週、２回／週、３回／週、４回／週、５回／週、６回／週、７回／週、２週に１回、３週に１回、４週に１回、５週に１回等の投薬スケジュールが、本発明の為に利用可能である。前記投薬スケジュールは、例えば、１週、２週、３週、４週、５週、６週、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、及び１２ヶ月の全期間に渡る投薬を包含する。
【0059】
上記投薬スケジュールのサイクルが提供される。このサイクルは約、例えば、７日毎；１４日毎；２１日毎；２８日毎；３５日毎；４２日；４９日毎；５６日毎；６３日毎；７０日毎；等で反復されることが可能である。サイクル間に非投薬の間隔が発生することも可能であり、その間隔は約、例えば、７日；１４日；２１日；２８日；３５日；４２日；４９日；５６日；６３日；７０日；等とすることができる。この文脈では、用語「約」は、プラス若しくマイナス１日、プラス若しくはマイナス２日、プラス若しくはマイナス３日、プラス若しくはマイナス４日、プラス若しくはマイナス５日、プラス若しくはマイナス６日、又はプラス若しくはマイナス７日を意味する。
【0060】
本開示による抱合体及び被包体は、１以上の治療／抗癌剤／療法と併用して投与されてもよい。治療／抗癌剤／療法との併用投与の為の方法は当該技術分野において周知されている（ハードマン（Hardman）ら（編）（２００１年）グッドマン及びギルマンの治療学の薬理学的基礎（Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics）、第１０版、ニューヨーク州、ニューヨーク、マグロウヒル（McGraw-Hill）；プール（Poole）及びパターソン（Peterson）（編）（２００１年）「高度診療の為の薬物治療学：実践的アプローチ」（Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach）、リッピンコット（Lippincott）、ウィリアムス アンド ウィルキンス（Williams & Wilkins）、ペンシルベニア州、フィラデルフィア；チャブナー（Chabner）及びロンゴ（Longo）（編）（２００１年）「癌化学療法及び生物学療法（Cancer Chemotherapy and Biotherapy）」リッピンコット（Lippincott）、ウィリアムス アンド ウィルキンス（Williams & Wilkins）、ペンシルベニア州、フィラデルフィア）。
【0061】
併用投与は、或る個人における同時の投与を指す必要はなく、むしろ、複数の治療薬の投与が単一の処置計画の結果である限りにおいて、数時間、又は更には数日、数週、若しくはより長く、離間された投与を包含してよい。前記併用投与は、本開示の抱合体及び被包体を代替の剤／療法の前、後、若しくはそれと同時に投与することを含んでよい。一処置スケジュールにおいては、本開示の抱合体及び被包体が、複数日数プロトコルにおける最初の投薬（dose）として与えられ、代替の剤／療法がその後の投与日に与えられてもよく；又は、代替の剤／療法が複数日数プロトコルにおける最初の投薬として与えられて、本開示の抱合体若しくは被包体がその後の投与日に与えられてもよい。他方で、代替の剤／療法及び本開示の抱合体及び被包体が、複数日数プロトコルにおける交互の日に投与されてもよい。これは、可能な投与プロトコルの限定的なリストを意味するものではない。
【0062】
本開示の更に別の態様は、被験者における癌の移動を減少させる及び／若しくは防止する方法であって、前記癌の移動が減少され及び／若しくは防止されるように、本明細書において提供される抱合体若しくは被包体の治療上有効な量を前記被験者に投与することを、含む、から成る、若しくはから本質的に成る方法を提供する。
【0063】
幾つかの態様では、前記方法は更に前記被験者に抗癌療法を投与することを含む。幾つかの態様では、前記抗癌療法は放射線、化学療法、免疫療法、手術、ホルモン療法、標的療法、合成致死、誘発腫瘍移動、免疫療法、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される。
【0064】
幾つかの態様では、かかる組成物及び方法は、浸潤性ＧＢＭ等の浸潤性の腫瘍の為の、放射線、化学療法、手術、ホルモン療法、標的療法、合成致死、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願番号第１３／８１４，００９号及び同第１６／４３２，４７５号に記載されるもののような設計された腫瘍移動、免疫療法、及びそれらの組み合わせ等のアジュバント介入を補完し得る。
【0065】
以下の実施例は例示の為に提供され及び限定の為ではない。
【実施例】
【0066】
当業者は、本明細書に開示されたこの及び他のプロセス及び方法に関して、そのプロセス及び方法において実施される機能は異なる順番で実施されてもよいことを理解するであろう。更に、概説された工程及び操作は単に例として提供され、及び開示された態様の本質を損なわない限り、それらの工程及び操作の幾つかは任意であってよく、組み合わされてより少ない数の工程及び操作となされてもよく、又は追加の工程及び操作へと拡張されてもよい。
【0067】
方法
細胞株及び培養手順：
Ｕ８７細胞（ヒトグリオーマ、ＨＴＢ－１４）、Ｆ９８細胞（フィッシャーラットグリオーマ、ＣＲＬ－２３９７）、ＥＯＣ細胞（マウスミクログリア、ＣＲＬ－２４６９）、ＬＡＤＭＡＣ細胞（マウスマクロファージ／単球、ＣＲＬ－２４２０）、及びＣ８Ｄ１Ａ細胞（マウス小脳アストロサイト、ＣＲＬ－２５４１）をＡＴＣＣから購入し、及び各細胞株に特化した指示に従い維持した。ＣＲＬ－２４６９細胞株は、３０ｎｇ・ｍｌ－１リコンビナントマウスＣＳＦ－１（４１６－ＭＬ－０１０、Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems））若しくはＬＡＤＭＡＣ細胞からの条件培地の何れかを有する、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）（ＤＭＥＭ；コーニング（Corning））及び１０％ＦＢＳ中で培養した。全ての細胞を、別途注記しない限り、３７℃で５％ＣＯ２を用いて成長させ、トリプシン－ＥＤＴＡ０．０５％を用いて継代し、及びそれぞれの完全細胞培養培地（ＡＴＣＣ推奨）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ギブコ（Gibco））中に維持した。幾つかの実験について注記するように、Ｕ８７細胞は、エフェクテントランスフェクション試薬（Effectene Transfection Reagent（クイアゲン（Qiagen））を用いたｅＧＦＰ発現プラスミドによるトランスフェクション、及び更に、Ｇ４１８サルフェート（Gemini）による安定なトランスフェクタントの選択を介して、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を安定に発現するようにした。
細胞株及び培養手順：
Ｕ８７細胞（ヒトグリオーマ、ＨＴＢ－１４）、Ｆ９８細胞（フィッシャーラットグリオーマ、ＣＲＬ－２３９７）、ＥＯＣ細胞（マウスミクログリア、ＣＲＬ－２４６９）、ＬＡＤＭＡＣ細胞（マウスマクロファージ／単球、ＣＲＬ－２４２０）、及びＣ８Ｄ１Ａ細胞（マウス小脳アストロサイト、ＣＲＬ－２５４１）をＡＴＣＣから購入し、及び各細胞株に特化した指示に従い維持した。ＣＲＬ－２４６９細胞株は、３０ｎｇ・ｍｌ－１リコンビナントマウスＣＳＦ－１（４１６－ＭＬ－０１０、Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems））若しくはＬＡＤＭＡＣ細胞からの条件培地の何れかを有する、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）（ＤＭＥＭ；コーニング（Corning））及び１０％ＦＢＳ中で培養した。全ての細胞を、別途注記しない限り、３７℃で５％ＣＯ２を用いて成長させ、トリプシン－ＥＤＴＡ０．０５％を用いて継代し、及びそれぞれの完全細胞培養培地（ＡＴＣＣ推奨）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ギブコ（Gibco））中に維持した。幾つかの実験について注記するように、Ｕ８７細胞は、エフェクテントランスフェクション試薬（Effectene Transfection Reagent（クイアゲン（Qiagen））を用いたｅＧＦＰ発現プラスミドによるトランスフェクション、及び更に、Ｇ４１８サルフェート（Gemini）による安定なトランスフェクタントの選択を介して、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を安定に発現するようにした。
【0068】
スポットアッセイ：
１４ｍｍガラス底ペトリ皿（インビトロサンエンティフィック（In vitro Scientific）、カリフォルニア州、サニーベール（Sunnyvale））の調製を、既知の方法をほとんど改変せずに用いて行った。短く言うと、表面をポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ、超純水中１：１０希釈）（シグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich））でコーティングし及び３７℃にて一晩インキュベートした。翌日に、その表面を滅菌水で３度すすぎ、及び完全に乾燥させた。種々の濃度のアグリカン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び、テキサスレッド（Texas Red）（インビトロゲン（Invitrogen））を有するフィブロネクチンを、前記調製表面上に２μＬの量でスポッティングし、完全に乾燥させた。標準成長培地中に懸濁された８０，０００のＵ８７ｍｇ細胞（ｅＧＦＰを安定的に発現）をチャンバに注意深く加えた。２４時間後、その細胞を４％パラフォルムアルデヒド及び０．４Ｍスクロース溶液で１５分間固定し、ＣＳ－５６（シグマ（Sigma）Ｃ８０３５、１：２５０）について免疫染色した。ＧＡＧ側鎖の効果を判定する為に、アグリカンスポットを広範囲に渡りｃＡＢＣで処理した（１Ｕ／ｍＬ；３～５時間、３７℃；シグマ（Sigma））。ｃＡＢＣを吸引し、ＰＢＳで濯いだ後、８０，０００のｅＧＦＰ＋Ｕ８７ｍｇ細胞を上述と同様に蒔いた。２４時間後、細胞を固定し、２Ｂ６（生化学工業（Seikagaku）、１：２５０）及びＣＳ－５６（１：２００）について免疫染色した。
１４ｍｍガラス底ペトリ皿（インビトロサンエンティフィック（In vitro Scientific）、カリフォルニア州、サニーベール（Sunnyvale））の調製を、既知の方法をほとんど改変せずに用いて行った。短く言うと、表面をポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ、超純水中１：１０希釈）（シグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich））でコーティングし及び３７℃にて一晩インキュベートした。翌日に、その表面を滅菌水で３度すすぎ、及び完全に乾燥させた。種々の濃度のアグリカン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び、テキサスレッド（Texas Red）（インビトロゲン（Invitrogen））を有するフィブロネクチンを、前記調製表面上に２μＬの量でスポッティングし、完全に乾燥させた。標準成長培地中に懸濁された８０，０００のＵ８７ｍｇ細胞（ｅＧＦＰを安定的に発現）をチャンバに注意深く加えた。２４時間後、その細胞を４％パラフォルムアルデヒド及び０．４Ｍスクロース溶液で１５分間固定し、ＣＳ－５６（シグマ（Sigma）Ｃ８０３５、１：２５０）について免疫染色した。ＧＡＧ側鎖の効果を判定する為に、アグリカンスポットを広範囲に渡りｃＡＢＣで処理した（１Ｕ／ｍＬ；３～５時間、３７℃；シグマ（Sigma））。ｃＡＢＣを吸引し、ＰＢＳで濯いだ後、８０，０００のｅＧＦＰ＋Ｕ８７ｍｇ細胞を上述と同様に蒔いた。２４時間後、細胞を固定し、２Ｂ６（生化学工業（Seikagaku）、１：２５０）及びＣＳ－５６（１：２００）について免疫染色した。
【0069】
Ｚｐｅｐ抽出：
ザイモサン（シグマアルドリッチ（Sigma Aldrich）、２５０ｍｇ）を液体窒素中で急速冷凍し、乳鉢と乳棒を用いて微細な粉末へと粉砕した。この粉砕したザイモサンをＴＲＩＳ－ＨＣｌ（０．５Ｍ）、ＣＨＡＰＳ（１％）、ＤＴＴ（１％）、及びＰＭＳＦを含有する抽出緩衝剤（１０ｍＬ）に加えた。抽出プロセスを、室温（ｒｔ）にて穏やかな撹拌下で一晩続けた。翌日、この試料を５０００×ｇで１０分間遠心分離して上清を回収した後、洗浄し、濃縮し、及び１０ｋＤａ遠心スピンカラム（ＥＭＤミリポア（EMD Millipore）、アミコンウルトラ（Amicon Ultra）－１５）を用いメーカーの指示に従って透析した（３×）。ナノドロップ（NanoDrop）デバイスを用いてタンパク質濃度を決定した。Ｚｐｅｐアリコートは更なる使用まで－２０℃にて保存した。
ザイモサン（シグマアルドリッチ（Sigma Aldrich）、２５０ｍｇ）を液体窒素中で急速冷凍し、乳鉢と乳棒を用いて微細な粉末へと粉砕した。この粉砕したザイモサンをＴＲＩＳ－ＨＣｌ（０．５Ｍ）、ＣＨＡＰＳ（１％）、ＤＴＴ（１％）、及びＰＭＳＦを含有する抽出緩衝剤（１０ｍＬ）に加えた。抽出プロセスを、室温（ｒｔ）にて穏やかな撹拌下で一晩続けた。翌日、この試料を５０００×ｇで１０分間遠心分離して上清を回収した後、洗浄し、濃縮し、及び１０ｋＤａ遠心スピンカラム（ＥＭＤミリポア（EMD Millipore）、アミコンウルトラ（Amicon Ultra）－１５）を用いメーカーの指示に従って透析した（３×）。ナノドロップ（NanoDrop）デバイスを用いてタンパク質濃度を決定した。Ｚｐｅｐアリコートは更なる使用まで－２０℃にて保存した。
【0070】
インビトロ実験：
Ｚｐｅｐをインビトロにて２５μｇ／ｍＬの濃度で用いた。（図の凡例に指示された）時点における亜硝酸塩の生成をグリース（Griess）試薬システム（Ｇ２９３０、プロメガ（Promega））を用いて評価した。当該技術分野で既知の通りにＴＬＲ２遮断実験を行った。抗ＴＮＦ－α酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）キットをメーカーの指示（ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences）、レイバイオテック（RayBiotech））の通りに用いてＴＮＦ－αのレベルを評価した。多重フリューダイムシステム（multiplexed Fluidigm system）にて定量リアルタイムＰＣＲを行い、データを既知の方法に従い解析した。プライマーはフリューダイム社（Fluidigm Inc.）から購入した。
Ｚｐｅｐをインビトロにて２５μｇ／ｍＬの濃度で用いた。（図の凡例に指示された）時点における亜硝酸塩の生成をグリース（Griess）試薬システム（Ｇ２９３０、プロメガ（Promega））を用いて評価した。当該技術分野で既知の通りにＴＬＲ２遮断実験を行った。抗ＴＮＦ－α酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）キットをメーカーの指示（ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences）、レイバイオテック（RayBiotech））の通りに用いてＴＮＦ－αのレベルを評価した。多重フリューダイムシステム（multiplexed Fluidigm system）にて定量リアルタイムＰＣＲを行い、データを既知の方法に従い解析した。プライマーはフリューダイム社（Fluidigm Inc.）から購入した。
【0071】
金ナノ粒子抱合体（ＡｕＮＰ－Ｚ）：
金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）をテッドペラ社（Ted Pella, Inc.）から購入した（６０ｎｍ直径、１５７０８－６）。ＰＥＧ－チオール（ＭＰＥＧ－ＳＨ－２０Ｋ－１ｇ）をレイサンバイオ（Laysan Bio）から購入した。全ての反応は超純ＤＩ水（１８ＭΩｃｍ－１）中で行った。各動物が投薬量当たりに受容したＡｕＮＰの量は、５７マイクログラム（＝１ｍｌの６０ｎｍＡｕＮＰ、２．６×１０ｅ１０粒子／ｍｌの濃度）であった。各ＡｕＮＰが３０，０００のＰＥＧ－ＳＨ分子を受容するようなＰＥＧ－ＳＨ濃度を算出した。Ｚｐｅｐ及びＰＥＧ－ＳＨを、以下のようにしてＡｕＮＰへと抱合させた：ＰＥＧを超純ＤＤＩ水中に溶解した。Ｚｐｅｐを１ｍｇ／ｍｌにて再構成して、各動物が１００マイクログラムの最終投薬量を受容し得るようにした（ザイモサンの初期濃度に基づく、及び１００％抱合効率を想定）。Ｚｐｅｐを３ｍＭのトリス塩基バッファ中に懸濁させた。ＡｕＮＰを遠心分離にかけ（１２０００×ｇ、２０分）及び超純ＤＤＩ水中に再懸濁させた。このＡｕＮＰ、ＰＥＧ－ＳＨ、及びＺｐｅｐを組み合わせ、ｒｔにて一晩、回転試験管ホルダー上に静置した。粒子を個々の投薬量へと等分し及び遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分）によって２度洗浄した後、生体内尾静脈注射用に滅菌生理食塩水中に、若しくは物性決定用に超純ＤＤＩ水中に再懸濁させた。既知の手法により、動的光散乱法及び紫外可視分光法を行った。
金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）をテッドペラ社（Ted Pella, Inc.）から購入した（６０ｎｍ直径、１５７０８－６）。ＰＥＧ－チオール（ＭＰＥＧ－ＳＨ－２０Ｋ－１ｇ）をレイサンバイオ（Laysan Bio）から購入した。全ての反応は超純ＤＩ水（１８ＭΩｃｍ－１）中で行った。各動物が投薬量当たりに受容したＡｕＮＰの量は、５７マイクログラム（＝１ｍｌの６０ｎｍＡｕＮＰ、２．６×１０ｅ１０粒子／ｍｌの濃度）であった。各ＡｕＮＰが３０，０００のＰＥＧ－ＳＨ分子を受容するようなＰＥＧ－ＳＨ濃度を算出した。Ｚｐｅｐ及びＰＥＧ－ＳＨを、以下のようにしてＡｕＮＰへと抱合させた：ＰＥＧを超純ＤＤＩ水中に溶解した。Ｚｐｅｐを１ｍｇ／ｍｌにて再構成して、各動物が１００マイクログラムの最終投薬量を受容し得るようにした（ザイモサンの初期濃度に基づく、及び１００％抱合効率を想定）。Ｚｐｅｐを３ｍＭのトリス塩基バッファ中に懸濁させた。ＡｕＮＰを遠心分離にかけ（１２０００×ｇ、２０分）及び超純ＤＤＩ水中に再懸濁させた。このＡｕＮＰ、ＰＥＧ－ＳＨ、及びＺｐｅｐを組み合わせ、ｒｔにて一晩、回転試験管ホルダー上に静置した。粒子を個々の投薬量へと等分し及び遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分）によって２度洗浄した後、生体内尾静脈注射用に滅菌生理食塩水中に、若しくは物性決定用に超純ＤＤＩ水中に再懸濁させた。既知の手法により、動的光散乱法及び紫外可視分光法を行った。
【0072】
腫瘍接種：
全ての実験はジョージア工科大学（the Georgia Institute of Technology）及びデューク大学（Duke University）における動物実験委員会（the Institutional Animal Care and Use Committee）により承認された。ローウィット（Rowett）ヌードラット若しくはフィッシャー（Fischer）ラット（１７５～２００ｇ、雄、チャールズリバーラボラトリーズ（Charles River Laboratories））にＵ８７ｍｇ（８０，０００細胞）若しくはＦ９８腫瘍細胞（１０，０００細胞）をそれぞれ接種した。これらの動物を５％イソフルランを用いて麻酔し、外科手技の間２～３％イソフルランで維持した。これらの動物を定位固定装置に配置した。頭部に１ｃｍの切り込みを入れた。頭蓋から骨膜を切断除去した。頭蓋中、ブレグマから２ｍｍ側方及び２ｍｍ後方に穴を開けた。１０μＬのハミルトンシリンジに取り付けた２６ゲージ針を脳の表面から２ｍｍの深さに挿入し及び０．５ｍｍ後退させた。５μＬのＤＭＥＭ（血清を含まない）中の腫瘍細胞を自動シリンジポンプを用いて１ｕＬ／分の速度で注入した。追加で２分間、針を所定位置に保った後、除去し及び閉合した。神経膠芽腫による苦痛の症状を呈している動物をケタミン（１ｍＬ／ｋｇ）、キシラジン（０．１７ｍＬ／ｋｇ）、及びアセプロマジン（０．３７ｍＬ／ｋｇ）で麻酔し、生理的ＰＢＳ、その後４％パラフォルムアルデヒドを経心腔的に灌流した。これらの脳を解剖し及び４％パラフォルムアルデヒド中で一晩インキュベートし、及び０．０１％のアジ化ナトリウムを含有する３０％スクロース中に保存した。プロテオミクス及び組織学に指定されたコホート用には、麻酔した動物に生理的ＰＢＳ、その後生理的１０％ホルマリンを経心腔的に灌流し、及びｒｔ（即ち室温）にて１０％ホルマリン中に保存した。
全ての実験はジョージア工科大学（the Georgia Institute of Technology）及びデューク大学（Duke University）における動物実験委員会（the Institutional Animal Care and Use Committee）により承認された。ローウィット（Rowett）ヌードラット若しくはフィッシャー（Fischer）ラット（１７５～２００ｇ、雄、チャールズリバーラボラトリーズ（Charles River Laboratories））にＵ８７ｍｇ（８０，０００細胞）若しくはＦ９８腫瘍細胞（１０，０００細胞）をそれぞれ接種した。これらの動物を５％イソフルランを用いて麻酔し、外科手技の間２～３％イソフルランで維持した。これらの動物を定位固定装置に配置した。頭部に１ｃｍの切り込みを入れた。頭蓋から骨膜を切断除去した。頭蓋中、ブレグマから２ｍｍ側方及び２ｍｍ後方に穴を開けた。１０μＬのハミルトンシリンジに取り付けた２６ゲージ針を脳の表面から２ｍｍの深さに挿入し及び０．５ｍｍ後退させた。５μＬのＤＭＥＭ（血清を含まない）中の腫瘍細胞を自動シリンジポンプを用いて１ｕＬ／分の速度で注入した。追加で２分間、針を所定位置に保った後、除去し及び閉合した。神経膠芽腫による苦痛の症状を呈している動物をケタミン（１ｍＬ／ｋｇ）、キシラジン（０．１７ｍＬ／ｋｇ）、及びアセプロマジン（０．３７ｍＬ／ｋｇ）で麻酔し、生理的ＰＢＳ、その後４％パラフォルムアルデヒドを経心腔的に灌流した。これらの脳を解剖し及び４％パラフォルムアルデヒド中で一晩インキュベートし、及び０．０１％のアジ化ナトリウムを含有する３０％スクロース中に保存した。プロテオミクス及び組織学に指定されたコホート用には、麻酔した動物に生理的ＰＢＳ、その後生理的１０％ホルマリンを経心腔的に灌流し、及びｒｔ（即ち室温）にて１０％ホルマリン中に保存した。
【0073】
ＭＲＩイメージング：
ラットを麻酔して、パラビジョン（ParaVision）ソフトウェアにより動作するブルーカーファーマスキャン（Bruker Pharmascan）７－Ｔ（ブルーカーバイオスピンＭＲＩ（Bruker BioSpin MRI））中に配置し、頭部コイルとして３８ｍｍクワドラチャ検波ボリュームコイルを用いた。これらの動物を２％イソフルランを用いて麻酔し、自作の揺りかご中に配置して、動物頭部をＭＲＩコイル内に容易に配置できるようにした。リフォーカスエコー（ＲＡＲＥ）シーケンス（ＲＡＲＥファクター、６；有効エコー時間、３６ミリ秒；繰り返し時間［ＴＲ］、４，２００秒；スキャン当たりのアベレージ数、２；全取得時間、６分）による急速イメージングを用いて、高品質Ｔ２強調画像の急速な取得が達成された。２５６×２５６マトリックス及び０．５ｍｍのスライス厚さを有する４０ｍｍ×４０ｍｍの視野を用いて、４０の横方向スライスのスラブを記録した。ＲＡＲＥ画像取得の直前に記録されたパイロットスキャンを用いて、腫瘍細胞の注入部位をカバーするようにこのスラブを配列した。腫瘍の移植後ほぼ毎週ＭＲ画像を取得して、腫瘍の成長若しくは退縮をチェックした。更なる画像加工及び腫瘍体積計算の為に、イメージＪ（ImageJ）ソフトウェア（ＦＩＪＩ、バージョン２．０）を用いた。Ｔ２強調画像中に腫瘍境界に続く関心領域（ＲＯＩ）を手動で描いた。全ての画像スライスのＲＯＩ内のボクセル体積を足し合わせることによって全腫瘍体積を算出した。安楽死の日にＭＲＩができなかった場合には、直線状の腫瘍成長率を想定して死亡時の腫瘍体積を外挿した。
ラットを麻酔して、パラビジョン（ParaVision）ソフトウェアにより動作するブルーカーファーマスキャン（Bruker Pharmascan）７－Ｔ（ブルーカーバイオスピンＭＲＩ（Bruker BioSpin MRI））中に配置し、頭部コイルとして３８ｍｍクワドラチャ検波ボリュームコイルを用いた。これらの動物を２％イソフルランを用いて麻酔し、自作の揺りかご中に配置して、動物頭部をＭＲＩコイル内に容易に配置できるようにした。リフォーカスエコー（ＲＡＲＥ）シーケンス（ＲＡＲＥファクター、６；有効エコー時間、３６ミリ秒；繰り返し時間［ＴＲ］、４，２００秒；スキャン当たりのアベレージ数、２；全取得時間、６分）による急速イメージングを用いて、高品質Ｔ２強調画像の急速な取得が達成された。２５６×２５６マトリックス及び０．５ｍｍのスライス厚さを有する４０ｍｍ×４０ｍｍの視野を用いて、４０の横方向スライスのスラブを記録した。ＲＡＲＥ画像取得の直前に記録されたパイロットスキャンを用いて、腫瘍細胞の注入部位をカバーするようにこのスラブを配列した。腫瘍の移植後ほぼ毎週ＭＲ画像を取得して、腫瘍の成長若しくは退縮をチェックした。更なる画像加工及び腫瘍体積計算の為に、イメージＪ（ImageJ）ソフトウェア（ＦＩＪＩ、バージョン２．０）を用いた。Ｔ２強調画像中に腫瘍境界に続く関心領域（ＲＯＩ）を手動で描いた。全ての画像スライスのＲＯＩ内のボクセル体積を足し合わせることによって全腫瘍体積を算出した。安楽死の日にＭＲＩができなかった場合には、直線状の腫瘍成長率を想定して死亡時の腫瘍体積を外挿した。
【0074】
デューク（Duke）プロテオミクスでのプロテオミクス及びメタボロミクスの共有供給源：
９匹のラット：グループ当たり３匹の異なる動物、全部で３グループ、の脳からの、予めホルマリン中で固定しておいたＵ８７ｍｇ腫瘍を、周囲正常組織からマクロ解剖した。各々の湿潤重量を注記した。１ｍＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＡｍＢｉｃ）を各腫瘍に加え、７５０ｒｐｍで振盪しながら８０℃で５５分間加熱した。ＡｍＢｉｃを除去し、２回目の濯ぎの為に別の１ｍＬのＡｍＢｉｃを加えた。次いでこの２回目の濯ぎをピペット除去し、及び前記腫瘍を室温で完全に放冷した（＜５分）。各腫瘍を遠心分離管に移し、及び５０ｍＭのＡｍＢｉｃ中８Ｍの尿素を湿潤重量ｍｇ当たり１０μＬ加えた。次いでこの組織を、目に見える組織片がなくなるまで、ティッシュティアリングを通して採取し（taken through tissue tearing）、及びこの試料をホモジナイズした。次いでこの試料を、氷上で、動力レベル３、５秒バースト、各３バーストでプローブ超音波処理した。各ホモジネートについてブラッドフォードアッセイ（Bradford assay）により濃度を決定した。各試料から５０μｇを取り出し、及び濃度を５０ｍＭのＡｍＢｉｃ中８Ｍ尿素中で標準化した。その後、続く溶液中トリプシン消化の為に、１．８Ｍ尿素を得るのに十分なＡｍＢｉｃを各々に加えた。試料を１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）中で３２℃で４５分間還元し、２５ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）中で暗所でｒｔにて３０分間アルキル化し、及び各々にトリプシンを１：５０の酵素対タンパク質の比率で加えて７５０ｒｐｍで振盪しながら３２℃で一晩消化させた。翌朝、トリフルオロ酢酸を用いて試料を酸性化し、０．５％ＴＦＡ最終濃度（0.5% TFA final）を得、及びＣ１８ＳＰＥクリーンアップ（ウォーターズ（Waters）Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｖａｃ、５０ｍｇカートリッジ、製品番号ＷＡＴ０５４９５５）を通して採取した。アセトニトリルの一部をスピードバキューム（Speed Vac）によりエバポレートした後、残存する抽出物を一晩の凍結乾燥により乾燥状態とした。その後試料を２５ｆｍｏｌ／μＬの酵母アルコール脱水素酵素サロゲートスタンダードを含有する１％ＴＦＡ／２％ＡＣＮ、２００μＬ中で再構築した。等体積の全ての試料を混合することによってＱＣプールを調製した。
９匹のラット：グループ当たり３匹の異なる動物、全部で３グループ、の脳からの、予めホルマリン中で固定しておいたＵ８７ｍｇ腫瘍を、周囲正常組織からマクロ解剖した。各々の湿潤重量を注記した。１ｍＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＡｍＢｉｃ）を各腫瘍に加え、７５０ｒｐｍで振盪しながら８０℃で５５分間加熱した。ＡｍＢｉｃを除去し、２回目の濯ぎの為に別の１ｍＬのＡｍＢｉｃを加えた。次いでこの２回目の濯ぎをピペット除去し、及び前記腫瘍を室温で完全に放冷した（＜５分）。各腫瘍を遠心分離管に移し、及び５０ｍＭのＡｍＢｉｃ中８Ｍの尿素を湿潤重量ｍｇ当たり１０μＬ加えた。次いでこの組織を、目に見える組織片がなくなるまで、ティッシュティアリングを通して採取し（taken through tissue tearing）、及びこの試料をホモジナイズした。次いでこの試料を、氷上で、動力レベル３、５秒バースト、各３バーストでプローブ超音波処理した。各ホモジネートについてブラッドフォードアッセイ（Bradford assay）により濃度を決定した。各試料から５０μｇを取り出し、及び濃度を５０ｍＭのＡｍＢｉｃ中８Ｍ尿素中で標準化した。その後、続く溶液中トリプシン消化の為に、１．８Ｍ尿素を得るのに十分なＡｍＢｉｃを各々に加えた。試料を１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）中で３２℃で４５分間還元し、２５ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）中で暗所でｒｔにて３０分間アルキル化し、及び各々にトリプシンを１：５０の酵素対タンパク質の比率で加えて７５０ｒｐｍで振盪しながら３２℃で一晩消化させた。翌朝、トリフルオロ酢酸を用いて試料を酸性化し、０．５％ＴＦＡ最終濃度（0.5% TFA final）を得、及びＣ１８ＳＰＥクリーンアップ（ウォーターズ（Waters）Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｖａｃ、５０ｍｇカートリッジ、製品番号ＷＡＴ０５４９５５）を通して採取した。アセトニトリルの一部をスピードバキューム（Speed Vac）によりエバポレートした後、残存する抽出物を一晩の凍結乾燥により乾燥状態とした。その後試料を２５ｆｍｏｌ／μＬの酵母アルコール脱水素酵素サロゲートスタンダードを含有する１％ＴＦＡ／２％ＡＣＮ、２００μＬ中で再構築した。等体積の全ての試料を混合することによってＱＣプールを調製した。
【0075】
定量質量分析：
試料当たりのペプチド消化物について、定量一次元液体クロマトグラフィ、タンデム質量分析法（１Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を行い、加えて、コンディショニングラン及びＱＣプールの分析も行った。ナノエレクトロスプレーイオン化源を介してＱイグザクティブプラス（QExactive Plus）高解像度精密質量タンデム質量分析装置（サーモ（Thermo））に連結されたナノアクイティＵＰＬＣシステム（nanoACQUITY UPLC system）（ウォーターズ（Waters））を用いて、試料を分析した。シンメトリー（Symmetry）Ｃ１８ １８０μｍ×２０ｍｍトラッピングカラム（９９．９／０．１ｖ／ｖＨ２Ｏ／ＭｅＣＮにて、５μＬ／分）上に試料を捕捉し、次いで１．７μｍのアクイティ（Acquity）ＨＳＳ Ｔ３ Ｃ１８ ７５μｍ×２５０ｍｍカラム（ウォーターズ（Waters））を用い、０．１％ギ酸を有する５～４０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの９０分グラジエントを用いて、４００ｎＬ／分の流量及び５５℃のカラム温度で分析的分離を行った。ＱイグザクティブプラスＭＳ（QExactive Plus MS）上でのデータ収集を、ｍ／ｚ３７５から１６００までの７０，０００解像度（＠ｍ／ｚ２００）フルＭＳスキャンを用いたデータ依存型取得モードにおいてターゲットＡＧＣ値１ｅ６イオンで行い、その後１７，５００解像度（＠ｍ／ｚ２００）における１０ＭＳ／ＭＳスキャンを用いてターゲットＡＧＣ値５ｅ４イオンで行った。２０－ｓダイナミックエクスクルージョンを採用した。試料注入当たりの全分析サイクル時間は、およそ２時間であった。１２回の全ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析（３回の反復ＱＣ注入を含め）の後、データをロゼッタエルシデータ（Rosetta Elucidator）ｖ４．０（ロゼッタバイオソフトウェア社（Rosetta Biosoftware、Inc.））にインポートし、及び分析値を、（エルシデータ（Elucidator））におけるピークテラー（PeakTeller）アルゴリズムを用いて、検出されたイオンの精密質量及び保持時間（「特徴」）に基づき整列させた。全てのランに渡る整列された特徴の選択されたイオンクロマトグラムの曲線下面積（ＡＵＣ）に基づき、相対的なペプチドの豊富さを算出した。エルシデータ（Elucidator）を利用してフラグメントイオンスペクトルを生成し、及びマスコットサーバー（Mascot Server）（ｖ２．５、マトリクスサイエンス（Matrix Sciences））によりデータベース検索を行った。２つのデータベース：ホモサピエンス分類学を用いたスイスプロット（Swissprot）データベース及びラット分類学を用いたＮＣＢＩレファレンス配列（ｒｅｆｓｅｑ）データベース（両方とも２０１６年８月ダウンロード）に対してＭＳ／ＭＳデータを検索し、酵母ＡＤＨ１、ウシ血清アルブミン、及びウシアルファカゼインを含む内部標準として一般に使用される追加のタンパク質を用い、並びに偽陽性率の決定の為に等数の逆シーケンス（「デコイ」）を用いた。データベース検索パラメータとして、Ｃｙｓにおける固定修飾（カルバミドメチル）及びＡｓｎとＧｌｎにおける可変修飾（脱アミド）及びＭｅｔにおける可変修飾（酸化）、ミスクリーベージ数２、前駆体許容差５ｐｐｍ、及び生成物許容差０．２Ｄａ、並びに酵素特異性としてのトリプシンが含まれた。エルシデータ（Elucidator）におけるペプチドプロフェット（Peptide Prophet）アルゴリズムを用いた個々のペプチドスコアリングの後、データを０．９％ペプチド偽陽性率にて注解した。
試料当たりのペプチド消化物について、定量一次元液体クロマトグラフィ、タンデム質量分析法（１Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を行い、加えて、コンディショニングラン及びＱＣプールの分析も行った。ナノエレクトロスプレーイオン化源を介してＱイグザクティブプラス（QExactive Plus）高解像度精密質量タンデム質量分析装置（サーモ（Thermo））に連結されたナノアクイティＵＰＬＣシステム（nanoACQUITY UPLC system）（ウォーターズ（Waters））を用いて、試料を分析した。シンメトリー（Symmetry）Ｃ１８ １８０μｍ×２０ｍｍトラッピングカラム（９９．９／０．１ｖ／ｖＨ２Ｏ／ＭｅＣＮにて、５μＬ／分）上に試料を捕捉し、次いで１．７μｍのアクイティ（Acquity）ＨＳＳ Ｔ３ Ｃ１８ ７５μｍ×２５０ｍｍカラム（ウォーターズ（Waters））を用い、０．１％ギ酸を有する５～４０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの９０分グラジエントを用いて、４００ｎＬ／分の流量及び５５℃のカラム温度で分析的分離を行った。ＱイグザクティブプラスＭＳ（QExactive Plus MS）上でのデータ収集を、ｍ／ｚ３７５から１６００までの７０，０００解像度（＠ｍ／ｚ２００）フルＭＳスキャンを用いたデータ依存型取得モードにおいてターゲットＡＧＣ値１ｅ６イオンで行い、その後１７，５００解像度（＠ｍ／ｚ２００）における１０ＭＳ／ＭＳスキャンを用いてターゲットＡＧＣ値５ｅ４イオンで行った。２０－ｓダイナミックエクスクルージョンを採用した。試料注入当たりの全分析サイクル時間は、およそ２時間であった。１２回の全ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析（３回の反復ＱＣ注入を含め）の後、データをロゼッタエルシデータ（Rosetta Elucidator）ｖ４．０（ロゼッタバイオソフトウェア社（Rosetta Biosoftware、Inc.））にインポートし、及び分析値を、（エルシデータ（Elucidator））におけるピークテラー（PeakTeller）アルゴリズムを用いて、検出されたイオンの精密質量及び保持時間（「特徴」）に基づき整列させた。全てのランに渡る整列された特徴の選択されたイオンクロマトグラムの曲線下面積（ＡＵＣ）に基づき、相対的なペプチドの豊富さを算出した。エルシデータ（Elucidator）を利用してフラグメントイオンスペクトルを生成し、及びマスコットサーバー（Mascot Server）（ｖ２．５、マトリクスサイエンス（Matrix Sciences））によりデータベース検索を行った。２つのデータベース：ホモサピエンス分類学を用いたスイスプロット（Swissprot）データベース及びラット分類学を用いたＮＣＢＩレファレンス配列（ｒｅｆｓｅｑ）データベース（両方とも２０１６年８月ダウンロード）に対してＭＳ／ＭＳデータを検索し、酵母ＡＤＨ１、ウシ血清アルブミン、及びウシアルファカゼインを含む内部標準として一般に使用される追加のタンパク質を用い、並びに偽陽性率の決定の為に等数の逆シーケンス（「デコイ」）を用いた。データベース検索パラメータとして、Ｃｙｓにおける固定修飾（カルバミドメチル）及びＡｓｎとＧｌｎにおける可変修飾（脱アミド）及びＭｅｔにおける可変修飾（酸化）、ミスクリーベージ数２、前駆体許容差５ｐｐｍ、及び生成物許容差０．２Ｄａ、並びに酵素特異性としてのトリプシンが含まれた。エルシデータ（Elucidator）におけるペプチドプロフェット（Peptide Prophet）アルゴリズムを用いた個々のペプチドスコアリングの後、データを０．９％ペプチド偽陽性率にて注解した。
【0076】
プロテオミクス差次的発現：
プロテオミクスについて、タンパク質レベル強度（ＰＬＩ）の倍率変化間の比較を用いて、条件（Ｚ：ＡｕＮＰ－Ｚ；Ｐ：ＡｕＮＰ－Ｐ；Ｃ：対照、ＡｕＮＰなし；ｎ＝３）間で差次的に発現された（ＤＥ）タンパク質を決定した。統計的比較ツールＱＰＲＯＴ（ｖ１．３．３）７２（ｎｂｕｒｎｉｎ：２，０００；ｎｉｔｅｒｓ：１０，０００；ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ：ｔｒｕｅ）を使用して、条件間で対にして比較された各同定されたタンパク質についてのｚ統計及びＦＤＲを算出した。このｚ統計から、パイソン（Python）（バージョン２．７．１１、アナコンダ（Anaconda）２．２．０；https://www.python.org/）を用いてｐ値を得た。特定の条件間倍率変化比較についてＦＤＲ＜０．０５となったタンパク質を、統計的に有意であるとみなし、その条件対についてＤＥであるとして処理した。
プロテオミクスについて、タンパク質レベル強度（ＰＬＩ）の倍率変化間の比較を用いて、条件（Ｚ：ＡｕＮＰ－Ｚ；Ｐ：ＡｕＮＰ－Ｐ；Ｃ：対照、ＡｕＮＰなし；ｎ＝３）間で差次的に発現された（ＤＥ）タンパク質を決定した。統計的比較ツールＱＰＲＯＴ（ｖ１．３．３）７２（ｎｂｕｒｎｉｎ：２，０００；ｎｉｔｅｒｓ：１０，０００；ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ：ｔｒｕｅ）を使用して、条件間で対にして比較された各同定されたタンパク質についてのｚ統計及びＦＤＲを算出した。このｚ統計から、パイソン（Python）（バージョン２．７．１１、アナコンダ（Anaconda）２．２．０；https://www.python.org/）を用いてｐ値を得た。特定の条件間倍率変化比較についてＦＤＲ＜０．０５となったタンパク質を、統計的に有意であるとみなし、その条件対についてＤＥであるとして処理した。
【0077】
パスウェイ過剰発現解析：
このＤＥタンパク質をプレフィルターにかけ、絶対倍率変化が２倍未満であるタンパク質を除去した。各条件対について、ｇ：プロファイラー（profiler）バージョン：ｒ１７３０＿ｅ８８＿ｅｇ３５（http://biit.cs.ut.ee/gprofiler/）を用いて遺伝子オントロジーを行った。ラット及びホモサピエンスの両方のデータセットを使用した。厳密に相同性のタンパク質に関しては種の簡潔な（parsimonious）帰属（assignment）は当てにならないので、ラット若しくはヒトの何れかと同定されたタンパク質のサブセットだけでなく、全てのタンパク質について（種に関係なく）各々の種のデータセットを実行した。検索は遺伝子オントロジー、ＫＥＧＧ、リアクトーム（Reactome）、及びレギュラトリーモチーフデータベース（Regulatory Motif databases）を含み、及び有意性については内蔵のｇ：ＳＣＳ閾値を用いた。デフォルトの設定を用いた。パイソン（Python）による視覚化の為の追加の遺伝子オントロジー情報を得る為に、クイックＧＯ（QuickGO）（https://www.ebi.ac.uk/QuickGO）ウェブサービスを使用した。
このＤＥタンパク質をプレフィルターにかけ、絶対倍率変化が２倍未満であるタンパク質を除去した。各条件対について、ｇ：プロファイラー（profiler）バージョン：ｒ１７３０＿ｅ８８＿ｅｇ３５（http://biit.cs.ut.ee/gprofiler/）を用いて遺伝子オントロジーを行った。ラット及びホモサピエンスの両方のデータセットを使用した。厳密に相同性のタンパク質に関しては種の簡潔な（parsimonious）帰属（assignment）は当てにならないので、ラット若しくはヒトの何れかと同定されたタンパク質のサブセットだけでなく、全てのタンパク質について（種に関係なく）各々の種のデータセットを実行した。検索は遺伝子オントロジー、ＫＥＧＧ、リアクトーム（Reactome）、及びレギュラトリーモチーフデータベース（Regulatory Motif databases）を含み、及び有意性については内蔵のｇ：ＳＣＳ閾値を用いた。デフォルトの設定を用いた。パイソン（Python）による視覚化の為の追加の遺伝子オントロジー情報を得る為に、クイックＧＯ（QuickGO）（https://www.ebi.ac.uk/QuickGO）ウェブサービスを使用した。
【0078】
パスウェイエンリッチメント解析：
遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）リリース（Release）３．０（http://www.broadinstitute.org/gsea）を使用してパスウェイエンリッチメント解析を行った。精選された（ｃ２．ａｌｌ．ｖ６．０）及び遺伝子オントロジー（ｃ５．ａｌｌ．ｖ６．０）データセットに対して、各条件対についてのランク付けスキームとして倍率変化方向に従って符号付けされたＱＰＲＯＴ ｐ値の負対数を用いて、プレランク（pre-ranked）解析を行った。遺伝子記号衝突（collision）の場合には最も低いｐ値を有するアイソフォームを選択した。最大及び最小パスウェイサイズ除外基準をそれぞれ１，０００及び５に設定したこと以外は、デフォルトの設定を使用した。
遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）リリース（Release）３．０（http://www.broadinstitute.org/gsea）を使用してパスウェイエンリッチメント解析を行った。精選された（ｃ２．ａｌｌ．ｖ６．０）及び遺伝子オントロジー（ｃ５．ａｌｌ．ｖ６．０）データセットに対して、各条件対についてのランク付けスキームとして倍率変化方向に従って符号付けされたＱＰＲＯＴ ｐ値の負対数を用いて、プレランク（pre-ranked）解析を行った。遺伝子記号衝突（collision）の場合には最も低いｐ値を有するアイソフォームを選択した。最大及び最小パスウェイサイズ除外基準をそれぞれ１，０００及び５に設定したこと以外は、デフォルトの設定を使用した。
【0079】
免疫組織化学、免疫蛍光法、及び顕微鏡法：
ＩＨＣ及びＩＦに使用した全ての抗体は図の説明中に列挙した。固定され凍結された脳組織を厚さ１４μｍの薄片に切断し、既知の方法を用いて免疫蛍光用に調製した。ツァイスアキシビジョン（Zeiss Axiovision）倒立顕微鏡にて切片を撮像した。ＩＨＣについては、エモリーウィンシップパソロジーコアラボ（the Emory Winship Pathology Core Lab）にて既知の方法を用いて組織を加工した。パラフィン埋設ブロックからの組織を厚さ５μｍの薄片に切断した。ＤＡＢ染色キット（Wako（現・富士フィルム和光純薬株式会社））を用いメーカーのプロトコルに従ってＩＨＣを行った。ハママツナノズーマー（Hamamatsu Nanozoomer）２．０ＨＴを用いて全スライドスキャニングを行った。
ＩＨＣ及びＩＦに使用した全ての抗体は図の説明中に列挙した。固定され凍結された脳組織を厚さ１４μｍの薄片に切断し、既知の方法を用いて免疫蛍光用に調製した。ツァイスアキシビジョン（Zeiss Axiovision）倒立顕微鏡にて切片を撮像した。ＩＨＣについては、エモリーウィンシップパソロジーコアラボ（the Emory Winship Pathology Core Lab）にて既知の方法を用いて組織を加工した。パラフィン埋設ブロックからの組織を厚さ５μｍの薄片に切断した。ＤＡＢ染色キット（Wako（現・富士フィルム和光純薬株式会社））を用いメーカーのプロトコルに従ってＩＨＣを行った。ハママツナノズーマー（Hamamatsu Nanozoomer）２．０ＨＴを用いて全スライドスキャニングを行った。
【0080】
グラフ作成及び統計学：
全てのグラフはプリズム（Prism）７（グラフパッド社（Graphpad Inc.））、パイソン（Python）、若しくはＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（バージョン９、マスワークス（Mathworks）、マサチューセッツ州）において作成した。図のパネルのレイアウトはイラストレーター（Illustrator）（アドビ社（Adobe Inc.））を用いて行った。グラブズ検定（Grubb’s test）により示された場合、異常値は省略した。適切な場合には、プリズム（Prism）7において、スチューデントｔ検定（Student’s t-tests）若しくは一元配置分散分析（one-way ANOVA）（図の凡例に記載の通り）とその後の事後検定を実施した。生存分析もプリズム（Prism）７において行い、及びマンテルコックスログランク検定（Mantel-Cox log rank test）を用いて有意性を評価した。
全てのグラフはプリズム（Prism）７（グラフパッド社（Graphpad Inc.））、パイソン（Python）、若しくはＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（バージョン９、マスワークス（Mathworks）、マサチューセッツ州）において作成した。図のパネルのレイアウトはイラストレーター（Illustrator）（アドビ社（Adobe Inc.））を用いて行った。グラブズ検定（Grubb’s test）により示された場合、異常値は省略した。適切な場合には、プリズム（Prism）7において、スチューデントｔ検定（Student’s t-tests）若しくは一元配置分散分析（one-way ANOVA）（図の凡例に記載の通り）とその後の事後検定を実施した。生存分析もプリズム（Prism）７において行い、及びマンテルコックスログランク検定（Mantel-Cox log rank test）を用いて有意性を評価した。
【0081】
実施例１：ＣＳＰＧ類を使用したＧＢＭ細胞の忌避（図１（ａ）～（ｅ））
腫瘍細胞の忌避におけるＣＳＰＧ類の効果を判定する為に、神経膠瘢痕形成の確立されたインビトロモデル、即ち、プロトタイプの抑制性ＣＳＰＧ、アグリカンを用いたスポットアッセイを使用した。アグリカンは神経膠瘢痕の構成成分であり、及びＣＳ－ＧＡＧのファミリーの全てにより硫酸化される為に、アグリカンを選択した。結果を図１（ａ）に示す（スケールバーは５０μｍである）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＵ８７ｍｇＧＢＭ細胞を使用した。「ＤＡＰＩ」は、核染色４’，６－ジアミジノ－２－フェニリンドールを示し、及び「ＣＳ５６」は無傷のＣＳＰＧ類を染色する抗体である。ＣＳ５６＋アグリカンのスポット（１ｍｇ／ｍｌ、２ｕｌスポット）は腫瘍細胞を忌避している：点線（「マージ」）は、右端のズームされた領域（スケールバーは２００μｍ）を特定し、腫瘍細胞がアグリカンによりもたらされた境界を超えることが少なくとも部分的に妨げられるということが確認された。
腫瘍細胞の忌避におけるＣＳＰＧ類の効果を判定する為に、神経膠瘢痕形成の確立されたインビトロモデル、即ち、プロトタイプの抑制性ＣＳＰＧ、アグリカンを用いたスポットアッセイを使用した。アグリカンは神経膠瘢痕の構成成分であり、及びＣＳ－ＧＡＧのファミリーの全てにより硫酸化される為に、アグリカンを選択した。結果を図１（ａ）に示す（スケールバーは５０μｍである）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＵ８７ｍｇＧＢＭ細胞を使用した。「ＤＡＰＩ」は、核染色４’，６－ジアミジノ－２－フェニリンドールを示し、及び「ＣＳ５６」は無傷のＣＳＰＧ類を染色する抗体である。ＣＳ５６＋アグリカンのスポット（１ｍｇ／ｍｌ、２ｕｌスポット）は腫瘍細胞を忌避している：点線（「マージ」）は、右端のズームされた領域（スケールバーは２００μｍ）を特定し、腫瘍細胞がアグリカンによりもたらされた境界を超えることが少なくとも部分的に妨げられるということが確認された。
【0082】
ＣＳＰＧ類はそれらの抑制効果を主にＣＳ－ＧＡＧ側鎖を介して発揮する為、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ｃＡＢＣ）を使用してＣＳ－ＧＡＧ鎖を酵素的に消化して切断し、前記境界がＣＳ－ＧＡＧ側鎖の非存在下で維持されるか否かを判定した。結果を図１（ｂ）に示す。２Ｂ６は、アグリカンのコンドロイチナーゼＡＢＣ（ｃｈＡＢＣ）による酵素消化後のＧＡＧ断片（stub）を染色する抗体である。腫瘍細胞はｃｈＡＢＣ消化時にアグリカンによってもたらされたスポット境界を超えることができ、ＣＳＰＧ類がそれらの忌避効果をＣＳ－ＧＡＧを介して媒介するということが示され、また神経膠瘢痕の主要な抑制性構成成分であるＣＳＰＧ類が、インビトロでのＧＢＭ細胞の浸潤に対する生化学的障壁に寄与したということが確認された。
【0083】
ＣＳＰＧ類の腫瘍周囲発現を刺激する為に、フィッシャーラットに高度に運動性の同系Ｆ９８ＧＢＭ細胞及びザイモサンを同時注入した。図１（ｃ）は、ザイモサンビーズ／穿刺（stab）注入部位及びＦ９８腫瘍接種部位を示す。腫瘍接種の２１日後に動物を犠牲にした。
【0084】
図１（ｄ）に示すように、Ｆ９８腫瘍細胞を対照穿刺の領域から除外した。神経膠細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）は各アストロサイトについての免疫蛍光染色である。穿刺創傷（白い矢頭により示す）は腫瘍の成長を部分的に忌避したが、腫瘍のマイクロサテライト移動（赤い矢頭により示す）を防ぐことはできなかった。それに対して、ザイモサンビーズは、図１（ｅ）（ズームされた切片（section）、スケールバーは２００μｍ）に示されるように、劇症性のグリオーシス及び空洞形成（白い矢頭）を引き起こし及び腫瘍をコンパクトな塊として残存させた。対照動物では、腫瘍は穿刺部位から離れたマイクロサテライトを形成し、及びザイモサンビーズで処理された動物では、腫瘍細胞は、ビーズ注入部位の境界内に拘束された。ザイモサン注入は、堅牢なアストログリアの活性化を引き起こし、アストログリア瘢痕形成が生体内で腫瘍細胞移動を大いに封じ込め及び拘束したことを示した。
【0085】
実施例２：Ｚｐｅｐを用いたＴＬＲ２の活性化（図２（ａ）～（ｆ））
ザイモサンの脳腫瘍への直接注入は複数の理由、例えば、頭蓋内注入に起因する傷害のリスク及び腫瘍周辺の不完全な被覆に起因して、実用的ではない。ナノ粒子はＥＰＲ効果を行使してＧＢＭ等の血管形成された腫瘍を標的化し、及び腫瘍を拘束する為に理想的な場所である腫瘍周辺に蓄積するので、ザイモサンを有するナノ粒子はこれらの課題を排除する為には理想的である。故に、ザイモサンポリペプチド（Ｚｐｅｐ）を含む水溶性の混合物をザイモサンビーズから抽出した。ＺｐｅｐのＥＯＣマウスミクロ神経膠細胞への添加は、時間と共に増大する一酸化窒素の生成（窒化物アッセイにより分析）（グリース（Griess）アッセイ、図２（ａ））、及びＴＮＦ－αの生成（図２（ｂ））を引き起こした。ザイモサンはＴＬＲ２刺激である為、ＴＬＲ２関連パスウェイのＺｐｅｐ活性化を判定した。哺乳動物細胞によるザイモサン認識はＴＬＲ２及びβグルカン受容体デクチンにより媒介される。ＥＯＣ細胞をＺｐｅｐへの暴露前にラミナリン（デクチンが媒介する認識を遮断することができる可溶性βグルカン）若しくはＴＬＲ２遮断抗体により処理した。ＴＬＲ２の遮断は、ＥＯＣ細胞による一酸化窒素生成の減少をもたらしたが、デクチンの遮断ではそうならず、ＺｐｅｐがザイモサンのＴＬＲ２活性化特性を維持するということ（図２（ｃ））、及びＺｐｅｐ抽出物が何れの水不溶性βグルカン類も含有していなかったということを示した。ＺｐｅｐのＥＯＣ細胞への添加は、ミクログリアの活性化に関連する遺伝子、即ち、炎症性遺伝子転写物の堅牢な上方制御を引き起こした（図２（ｄ））。加えて、Ｚｐｅｐはザイモサンのアストロサイトに対する予期される応答－即ち、ザイモサンはアストロサイトを直接活性化することができないが、ザイモサンに暴露されたミクログリアの分泌因子を通してアストロサイトを活性化する－を模倣する。これらの性質は下記により確認された：Ｚｐｅｐの直接添加は古典的にＣ８Ｄ１Ａアストロサイトを活性化することはできなかった（図２（ｅ）、（ｆ））ものの、Ｚｐｅｐに暴露されたＥＯＣ細胞からの条件培地は、一酸化窒素の生成及び炎症性遺伝子の上方制御によって評価された通り（図２（ｅ）、（ｆ））、堅牢なアストロサイト活性化を誘発した（「ＣＭ」はＥＯＣ条件培地を示す）。総合すれば、これらのデータは、Ｚｐｅｐがザイモサンに類似した生物学的性質を現し及び神経膠細胞において堅牢な炎症を引き起こすことを示している。
ザイモサンの脳腫瘍への直接注入は複数の理由、例えば、頭蓋内注入に起因する傷害のリスク及び腫瘍周辺の不完全な被覆に起因して、実用的ではない。ナノ粒子はＥＰＲ効果を行使してＧＢＭ等の血管形成された腫瘍を標的化し、及び腫瘍を拘束する為に理想的な場所である腫瘍周辺に蓄積するので、ザイモサンを有するナノ粒子はこれらの課題を排除する為には理想的である。故に、ザイモサンポリペプチド（Ｚｐｅｐ）を含む水溶性の混合物をザイモサンビーズから抽出した。ＺｐｅｐのＥＯＣマウスミクロ神経膠細胞への添加は、時間と共に増大する一酸化窒素の生成（窒化物アッセイにより分析）（グリース（Griess）アッセイ、図２（ａ））、及びＴＮＦ－αの生成（図２（ｂ））を引き起こした。ザイモサンはＴＬＲ２刺激である為、ＴＬＲ２関連パスウェイのＺｐｅｐ活性化を判定した。哺乳動物細胞によるザイモサン認識はＴＬＲ２及びβグルカン受容体デクチンにより媒介される。ＥＯＣ細胞をＺｐｅｐへの暴露前にラミナリン（デクチンが媒介する認識を遮断することができる可溶性βグルカン）若しくはＴＬＲ２遮断抗体により処理した。ＴＬＲ２の遮断は、ＥＯＣ細胞による一酸化窒素生成の減少をもたらしたが、デクチンの遮断ではそうならず、ＺｐｅｐがザイモサンのＴＬＲ２活性化特性を維持するということ（図２（ｃ））、及びＺｐｅｐ抽出物が何れの水不溶性βグルカン類も含有していなかったということを示した。ＺｐｅｐのＥＯＣ細胞への添加は、ミクログリアの活性化に関連する遺伝子、即ち、炎症性遺伝子転写物の堅牢な上方制御を引き起こした（図２（ｄ））。加えて、Ｚｐｅｐはザイモサンのアストロサイトに対する予期される応答－即ち、ザイモサンはアストロサイトを直接活性化することができないが、ザイモサンに暴露されたミクログリアの分泌因子を通してアストロサイトを活性化する－を模倣する。これらの性質は下記により確認された：Ｚｐｅｐの直接添加は古典的にＣ８Ｄ１Ａアストロサイトを活性化することはできなかった（図２（ｅ）、（ｆ））ものの、Ｚｐｅｐに暴露されたＥＯＣ細胞からの条件培地は、一酸化窒素の生成及び炎症性遺伝子の上方制御によって評価された通り（図２（ｅ）、（ｆ））、堅牢なアストロサイト活性化を誘発した（「ＣＭ」はＥＯＣ条件培地を示す）。総合すれば、これらのデータは、Ｚｐｅｐがザイモサンに類似した生物学的性質を現し及び神経膠細胞において堅牢な炎症を引き起こすことを示している。
【0086】
実施例３：ＡｕＮＰＺを用いた生体内での腫瘍周囲ＣＳＰＧ発現の刺激（図３（ａ）～（ｃ））
本明細書に記載するように、ＡｕＮＰ（直径６０ｎｍ）の表面をＺｐｅｐ及び２０ｋＤａＰＥＧで修飾して炎症性ナノ粒子（ＡｕＮＰ－Ｚ）を作製した。ポリペプチドのＡｕＮＰ表面への抱合を紫外可視分光法により評価した。図３（ａ）に示されるように、ＰＥＧの単独添加はレッドシフトをもたらさなかった（ネイキッドＡｕＮＰ及びＡｕＮＰ－Ｐについての５３５ｎｍにおけるピーク吸光度）。しかしながら、Ｚｐｅｐの添加は４～５ｎｍの小さなレッドシフトを引き起こした（ＡｕＮＰ－Ｚについての５４０ｎｍにおけるピーク吸光度）。ＡｕＮＰ（直径６０ｎｍコア）の動的光散乱が、ＰＥＧ添加時（直径１００ｎｍ）及びＺｐｅｐ添加時（直径９０ｎｍ）にＡｕＮＰの流体力学的半径の増大を示した。
本明細書に記載するように、ＡｕＮＰ（直径６０ｎｍ）の表面をＺｐｅｐ及び２０ｋＤａＰＥＧで修飾して炎症性ナノ粒子（ＡｕＮＰ－Ｚ）を作製した。ポリペプチドのＡｕＮＰ表面への抱合を紫外可視分光法により評価した。図３（ａ）に示されるように、ＰＥＧの単独添加はレッドシフトをもたらさなかった（ネイキッドＡｕＮＰ及びＡｕＮＰ－Ｐについての５３５ｎｍにおけるピーク吸光度）。しかしながら、Ｚｐｅｐの添加は４～５ｎｍの小さなレッドシフトを引き起こした（ＡｕＮＰ－Ｚについての５４０ｎｍにおけるピーク吸光度）。ＡｕＮＰ（直径６０ｎｍコア）の動的光散乱が、ＰＥＧ添加時（直径１００ｎｍ）及びＺｐｅｐ添加時（直径９０ｎｍ）にＡｕＮＰの流体力学的半径の増大を示した。
【0087】
生体内で腫瘍周囲ＣＳＰＧ発現を引き起こす為のＡｕＮＰ抱合体の容量を試験する為に、Ｆ９８神経膠腫を有するフィッシャーラットに、腫瘍接種６日後（６ＤＰＩ）にＺｐｅｐ付きＡｕＮＰ（１００μｇのＺｐｅｐ）を静脈内注射し、２０ＤＰＩにラットを犠牲にした。図３（ｂ）に示すように、Ｆ９８腫瘍を有するが何れの処置も受けていない動物からの対照組織切片（ｂ）は、低いアストロサイト活性化（ＧＦＡＰ染色）及び低いＣＳＰＧ産生（ＣＳ５６染色）を示した。逆に、図３（ｃ）に示しように、Ｚｐｅｐ処置動物からの切片は堅牢なアストロサイト活性化及びＣＳＰＧ産生を示した。（スケールバー：５０μｍ）
【0088】
実施例４：ＡｕＮＰ－Ｚを用いた生体内での腫瘍の拘束（図４（ａ）～（ｂ））
Ｆ９８神経膠腫を有するフィッシャーラットに、腫瘍接種の６日後（６ＤＰＩ）にＡｕＮＰを静脈内注射し、２０ＤＰＩにラットを犠牲にした。図４（ａ）に示されるように、Ｆ９８腫瘍を有し及びＰＥＧ付きＡｕＮＰのみを受けた動物からの組織切片は、低いアストロサイト活性化（ＧＦＡＰ染色）及び低いＣＳＰＧ産生（ＣＳ５６染色）を現した。図４（ｂ）の全スライドスキャンに示されるように、ＡｕＮＰ－Ｚを受けた動物は、より小さく及びより拘束された腫瘍を有していた。腫瘍は紅い点線の丸で輪郭を描かれている。拘束は腫瘍細胞がどのくらい密に充填されているかの定量アセスメントとして判定される。（スケールバーは図４（ａ）では１００μｍ、図４（ｂ）では２ｍｍである。）
Ｆ９８神経膠腫を有するフィッシャーラットに、腫瘍接種の６日後（６ＤＰＩ）にＡｕＮＰを静脈内注射し、２０ＤＰＩにラットを犠牲にした。図４（ａ）に示されるように、Ｆ９８腫瘍を有し及びＰＥＧ付きＡｕＮＰのみを受けた動物からの組織切片は、低いアストロサイト活性化（ＧＦＡＰ染色）及び低いＣＳＰＧ産生（ＣＳ５６染色）を現した。図４（ｂ）の全スライドスキャンに示されるように、ＡｕＮＰ－Ｚを受けた動物は、より小さく及びより拘束された腫瘍を有していた。腫瘍は紅い点線の丸で輪郭を描かれている。拘束は腫瘍細胞がどのくらい密に充填されているかの定量アセスメントとして判定される。（スケールバーは図４（ａ）では１００μｍ、図４（ｂ）では２ｍｍである。）
【0089】
このように、ＡｕＮＰ－Ｚを与えられた動物は、ザイモサンビーズの直接注入で観察されたもの（図１（ｅ））と同様に、より小さなコンパクトな腫瘍を示した（図４（ｂ））。反応性アストロサイトのマーカーである神経膠細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の、及びＣＳＰＧ類（ＣＳ５６抗体）の免疫蛍光染色は、対照及びＡｕＮＰ－Ｐグループにおいては弱かった（図３（ｂ）及び図４（ａ））。しかしながら、ＣＳ５６及びＧＦＡＰ免疫反応性はＡｕＮＰ－Ｚグループにおいては強く（図３（ｃ））、腫瘍内及び腫瘍周辺における高い反応性を有したが、これは非移動性の神経膠腫を思わせる現象である。総合すれば、これらのデータは、ＡｕＮＰ－Ｚ粒子の全身投与が生体内における脳腫瘍周辺のＣＳＰＧ及びＧＦＡＰ発現の向上を誘発し、このようにしてそれらの腫瘍を拘束したことを示している。
【0090】
実施例５：ＡｕＮＰ－Ｚを用いた腫瘍成長の遅延及び封じ込め（図５（ａ）～（ｃ））
異種Ｕ８７腫瘍を有するローウィット（Rowett）ヌード（ＲＮＵ）ラットに、９ＤＰＩに開始する単一投薬（ＳＤ）若しくは二重投薬（ＤＤ）で、ＡｕＮＰ、ＡｕＮＰ－ＰＥＧ、及びＡｕＮＰ－Ｚを静脈内注射した。図５（ａ）に示すように、５つの実験グループ全てについて腫瘍体積を縦軸にプロットした。９ＤＰＩに開始され死亡するまでほぼ毎週撮像を行った動物のＭＲＩ画像から、腫瘍体積を計算した。腫瘍を有するラットの脳に渡る０．５ｍｍスライス上の腫瘍の輪郭を描きその体積（ｍｍ３）を算出することによって、ＭＲＩ画像を成長について解析した。ＳＤ及びＤＤグループについて投薬計画のタイムラインが示されている。点線は対照グループにおける動物の死亡時点でのメジアン体積を示す。成長曲線における各ドットは、腫瘍体積が算出されたＭＲＩセッションを示している。ＡｕＮＰ－Ｚ投与はより遅い腫瘍成長に繋がり、ＡｕＮＰ－Ｚを受けた動物における体積は有意に小さかった（ＡｕＮＰ－Ｚ ＳＤにおける１３４±１００ｍｍ３ 対 対照グループにおける３１１±１０９ｍｍ３）（図５（ａ））。ＡｕＮＰ投与の２、３日後、腫瘍は成長率において上向いたように見えた（図５（ａ））為、初期投薬量を等しく半分に分けて、９ＤＰＩ及び１３ＤＰＩに動物に注射した。この投薬計画は、単一投薬コホートと比較して、更により小さな及びより遅い腫瘍成長に繋がった（ＡｕＮＰ－Ｚ ＤＤにおいて８６±３５ｍｍ３）（図５（ｂ）及び５（ｃ））。図５（ｂ）は、図５（ａ）における５つの実験グループの末期の体積をまとめた箱ひげ図を示す。ＡｕＮＰ－Ｚ投与は他のグループと比較して有意に腫瘍の成長を縮小した。図５（ｃ）は、腫瘍注射部位における実験グループの代表的なＴ２重み付けＭＲＩ画像を示している。同じ動物についての９、１６、及び２３ＤＰＩにおける画像が示されている。（＊ｐ＜０．０５；一元配置分散分析（one-way ANOVA）（クラスカル・ウォルス（Kruskal-Wallis）検定）と、その後の未修正のダンポストホック検定（the Uncorrected Dunn’s post-hoc test））
異種Ｕ８７腫瘍を有するローウィット（Rowett）ヌード（ＲＮＵ）ラットに、９ＤＰＩに開始する単一投薬（ＳＤ）若しくは二重投薬（ＤＤ）で、ＡｕＮＰ、ＡｕＮＰ－ＰＥＧ、及びＡｕＮＰ－Ｚを静脈内注射した。図５（ａ）に示すように、５つの実験グループ全てについて腫瘍体積を縦軸にプロットした。９ＤＰＩに開始され死亡するまでほぼ毎週撮像を行った動物のＭＲＩ画像から、腫瘍体積を計算した。腫瘍を有するラットの脳に渡る０．５ｍｍスライス上の腫瘍の輪郭を描きその体積（ｍｍ３）を算出することによって、ＭＲＩ画像を成長について解析した。ＳＤ及びＤＤグループについて投薬計画のタイムラインが示されている。点線は対照グループにおける動物の死亡時点でのメジアン体積を示す。成長曲線における各ドットは、腫瘍体積が算出されたＭＲＩセッションを示している。ＡｕＮＰ－Ｚ投与はより遅い腫瘍成長に繋がり、ＡｕＮＰ－Ｚを受けた動物における体積は有意に小さかった（ＡｕＮＰ－Ｚ ＳＤにおける１３４±１００ｍｍ３ 対 対照グループにおける３１１±１０９ｍｍ３）（図５（ａ））。ＡｕＮＰ投与の２、３日後、腫瘍は成長率において上向いたように見えた（図５（ａ））為、初期投薬量を等しく半分に分けて、９ＤＰＩ及び１３ＤＰＩに動物に注射した。この投薬計画は、単一投薬コホートと比較して、更により小さな及びより遅い腫瘍成長に繋がった（ＡｕＮＰ－Ｚ ＤＤにおいて８６±３５ｍｍ３）（図５（ｂ）及び５（ｃ））。図５（ｂ）は、図５（ａ）における５つの実験グループの末期の体積をまとめた箱ひげ図を示す。ＡｕＮＰ－Ｚ投与は他のグループと比較して有意に腫瘍の成長を縮小した。図５（ｃ）は、腫瘍注射部位における実験グループの代表的なＴ２重み付けＭＲＩ画像を示している。同じ動物についての９、１６、及び２３ＤＰＩにおける画像が示されている。（＊ｐ＜０．０５；一元配置分散分析（one-way ANOVA）（クラスカル・ウォルス（Kruskal-Wallis）検定）と、その後の未修正のダンポストホック検定（the Uncorrected Dunn’s post-hoc test））
【0091】
実施例６：ＡｕＮＰ－Ｚに対する生体内応答のプロテオーム解析（図６（ａ）～（ｃ））
腫瘍生検のプロテオーム解析により、ＡｕＮＰ－Ｚ投与が、細胞接着、エキソサイトーシス、抗原プロセッシング、白血球媒介免疫、及び細胞外細胞構造に関与するタンパク質の増加に繋がったことが示された（図６、７、及び８）。全く対照的に、ＡｕＮＰ－ＰＥＧ粒子の投与は、連続した腫瘍増殖を示す、代謝物の生成、エネルギー導出、細胞輸送、及びＣＮＳ成長に関与するタンパク質の上方制御に繋がった。総合すれば、これらのデータは、ＡｕＮＰ－Ｚ投与がより小さな悪性神経膠腫に繋がり、これは部分的には炎症及び細胞クラスター形成に関連するパスウェイの制御により媒介されたということを示している。
腫瘍生検のプロテオーム解析により、ＡｕＮＰ－Ｚ投与が、細胞接着、エキソサイトーシス、抗原プロセッシング、白血球媒介免疫、及び細胞外細胞構造に関与するタンパク質の増加に繋がったことが示された（図６、７、及び８）。全く対照的に、ＡｕＮＰ－ＰＥＧ粒子の投与は、連続した腫瘍増殖を示す、代謝物の生成、エネルギー導出、細胞輸送、及びＣＮＳ成長に関与するタンパク質の上方制御に繋がった。総合すれば、これらのデータは、ＡｕＮＰ－Ｚ投与がより小さな悪性神経膠腫に繋がり、これは部分的には炎症及び細胞クラスター形成に関連するパスウェイの制御により媒介されたということを示している。
【0092】
図６（ａ）は、ＡｕＮＰ－Ｚ処置動物における、対照に対する、タンパク質の差時的発現を示すボルケーノプロットを示している（有意に差時的に発現されたタンパク質は赤いドットによって示されている）。各ドットは独自に同定されたタンパク質の目録（accession）を表している。有意性閾値（Significance threshold）を＜０．０５の偽陽性率（ＦＤＲ）及び±２倍よりも大きな倍率変化に設定した。これらのタンパク質は、図６（ｂ）及び（ｃ）に列挙されたパスウェイに関与する。図６（ｂ）は、ＡｕＮＰ－Ｚグループにおいて、対照に対して有意に大きな比率を占めるパスウェイの選択リストである。図６（ｃ）は、ＧＳＥＡ分析からの、ＡｕＮＰ－Ｚグループにおける全ての有意に強化された（enriched）パスウェイのリストである。ＤＥは差次的発現を指し、ＯＲＡは過剰発現解析を指し、及びＮＥＳは正規化エンリッチメントスコアを指す。
【0093】
実施例７：プロテオミクスデータのＧＳＥＡ（図７及び８）
プロテオミクスデータのＧＳＥＡは細胞増殖抑制性の非移動性挙動に関連するパスウェイの強化（enrichment）を示していた。図７は、ＡｕＮＰ－Ｚ処置動物の対照に対する遺伝子セットエンリッチメント解析の結果を示している。パスウェイ及び有意に強化されたコア遺伝子が示されている。図８はＡｕＮＰ－Ｚ処置動物の対照に対する過剰発現解析の結果を示している。パスウェイ及び有意に差次的に発現されたコア遺伝子が示されている。例えば、Ｅ－カドヘリン及びＭＨＣクラスパスウェイが生体内でのＡｕＮＰ－Ｚ投与時に上方制御された。ＡｕＮＰ－Ｚ投与は、Ｅ－カドヘリン発現に関連しているタンパク質の強化を引き起こした。ＡｕＮＰ－Ｚ投与は、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩの上方制御に関連したパスウェイ、並びに補体シグナリング及びＦｃ－受容体に媒介された食作用に関連したパスウェイの強化に繋がった。ミクログリアの細胞毒性機能及び食作用機能に関連するパスウェイは、ミクログリアに対して、補体受容体及びＦｃγ受容体の発現の上方制御を要求する。それに対して、ＡＵＮＰ－ＰＥＧを投薬された動物は、腫瘍成長を許容する静止状態の微小環境を思わせる、神経細胞間情報伝達及びシナプス伝達に関連するパスウェイの強化を示した。全体として、プロテオーム解析は、細胞接着、移動、及び免疫活性化の制御に関与するＺｐｅｐの作用様式の方向を指している。
プロテオミクスデータのＧＳＥＡは細胞増殖抑制性の非移動性挙動に関連するパスウェイの強化（enrichment）を示していた。図７は、ＡｕＮＰ－Ｚ処置動物の対照に対する遺伝子セットエンリッチメント解析の結果を示している。パスウェイ及び有意に強化されたコア遺伝子が示されている。図８はＡｕＮＰ－Ｚ処置動物の対照に対する過剰発現解析の結果を示している。パスウェイ及び有意に差次的に発現されたコア遺伝子が示されている。例えば、Ｅ－カドヘリン及びＭＨＣクラスパスウェイが生体内でのＡｕＮＰ－Ｚ投与時に上方制御された。ＡｕＮＰ－Ｚ投与は、Ｅ－カドヘリン発現に関連しているタンパク質の強化を引き起こした。ＡｕＮＰ－Ｚ投与は、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩの上方制御に関連したパスウェイ、並びに補体シグナリング及びＦｃ－受容体に媒介された食作用に関連したパスウェイの強化に繋がった。ミクログリアの細胞毒性機能及び食作用機能に関連するパスウェイは、ミクログリアに対して、補体受容体及びＦｃγ受容体の発現の上方制御を要求する。それに対して、ＡＵＮＰ－ＰＥＧを投薬された動物は、腫瘍成長を許容する静止状態の微小環境を思わせる、神経細胞間情報伝達及びシナプス伝達に関連するパスウェイの強化を示した。全体として、プロテオーム解析は、細胞接着、移動、及び免疫活性化の制御に関与するＺｐｅｐの作用様式の方向を指している。
【0094】
実施例８：金ナノ粒子及びＡｕＮＰ－Ｚ処置動物におけるアストロサイト活性化（図９）
図９は、ＡｕＮＰ、ＡｕＮＰ－ＰＥＧ、及びＡｕＮＰ－Ｚ処置動物におけるアストロサイト活性化を示している。特に、図９は、正常の脳組織と腫瘍塊との間の境界におけるアストロサイト活性化を示している。個々のカラーマイクログラフは固有の動物を表している。各カラーマイクログラフの下の偽色茶色チャネル画像は、ＧＦＡＰ反応性によって評価された場合のアストロサイト活性化を示している。全てのグループに活性化されたアストロサイトが存在している一方で、ＡｕＮＰ－Ｚ処置動物は、腫瘍塊の内部及び外側の両方でアストロサイトの活性化を示しており、他のグループと比べてより緻密なＧＦＡＰ染色を有する。（スケールバーは２００μｍである。）
図９は、ＡｕＮＰ、ＡｕＮＰ－ＰＥＧ、及びＡｕＮＰ－Ｚ処置動物におけるアストロサイト活性化を示している。特に、図９は、正常の脳組織と腫瘍塊との間の境界におけるアストロサイト活性化を示している。個々のカラーマイクログラフは固有の動物を表している。各カラーマイクログラフの下の偽色茶色チャネル画像は、ＧＦＡＰ反応性によって評価された場合のアストロサイト活性化を示している。全てのグループに活性化されたアストロサイトが存在している一方で、ＡｕＮＰ－Ｚ処置動物は、腫瘍塊の内部及び外側の両方でアストロサイトの活性化を示しており、他のグループと比べてより緻密なＧＦＡＰ染色を有する。（スケールバーは２００μｍである。）
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【国際調査報告】