特表 2022-509200 反応性ペプチド標識付け

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-20

(54)【発明の名称】反応性ペプチド標識付け

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/13 20060101AFI20220113BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20220113BHJP

   G01N 33/532 20060101ALI20220113BHJP

【ＦＩ】

C07K1/13 ZNA

C07K7/06

G01N33/532 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021529774

(86)(22)【出願日】2019-11-27

(85)【翻訳文提出日】2021-05-26

(86)【国際出願番号】 US2019063652

(87)【国際公開番号】W WO2020113036

(87)【国際公開日】2020-06-04

(31)【優先権主張番号】62/772,448

(32)【優先日】2018-11-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】593089149

【氏名又は名称】プロメガ コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100183379

【弁理士】

【氏名又は名称】藤代 昌彦

(72)【発明者】

【氏名】ワン フ

(72)【発明者】

【氏名】ナス ニディー

(72)【発明者】

【氏名】フレミング ロッド

(72)【発明者】

【氏名】ゴダット ベッキー

(72)【発明者】

【氏名】チョウ ウェンフイ

(72)【発明者】

【氏名】キンケイド バージニア

(72)【発明者】

【氏名】ダート メラニー

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA13

4H045BA14

4H045BA15

4H045BA16

4H045BA17

4H045BA18

4H045BA19

4H045BA70

4H045DA76

4H045EA50

4H045FA10

(57)【要約】

スルホｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（スルホ－ＳＥ）連結型ペプチド、その合成方法、及びそのようなペプチドを生体分子の標識付けのために使用する方法を本明細書に示す。詳しくは、非アルキル基を含むペプチド、例えば、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸はスルホ－ＳＥ基で安定的に（例えば自然反応性を伴わずに）修飾され、生体分子に対する標識付けあるいは修飾を行うために使用される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

スルホｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（スルホ－ＳＥ）基に連結されたペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドがシステイン残基もリジン残基も含まない、前記組成物。

【請求項2】

前記スルホ－ＳＥが前記ペプチドのＮ末端に連結されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記スルホ－ＳＥが前記ペプチドのＣ末端に連結されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記スルホ－ＳＥが前記ペプチドのアミノ酸側鎖に連結されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記ペプチドが、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン及びアスパラギン酸から選択される少なくとも１つの非アルキルアミノ酸を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記少なくとも１つの反応性非アルキルアミノ酸がａまたはチロシンである、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

前記少なくとも１つの反応性求核性アミノ酸がアルギニンである、請求項５に記載の組成物。

【請求項8】

前記スルホ－ＳＥ基が非ペプチドリンカー基によって前記ペプチドに連結されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

前記リンカー基がアルキルまたはヘテロアルキル鎖を含む、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

前記リンカーが１つ以上の側鎖置換基を含む、請求項８に記載の組成物。

【請求項11】

前記ペプチドの長さが４～５０アミノ酸である、請求項１に記載の組成物。

【請求項12】

前記ペプチドの長さが８～２０アミノ酸である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記スルホ－ＳＥが前記ペプチドのＮ末端に結合している、請求項１に記載の組成物。

【請求項14】

前記スルホ－ＳＥがリンカー基を介して前記ペプチドのＮ末端に結合している、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記ペプチドが蛍光団結合体または発色団結合体を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項16】

前記ペプチドが生体分子複合体の構成要素である、請求項１に記載の組成物。

【請求項17】

前記ペプチドが生体分子複合体の構成要素である、請求項１４に記載の組成物。

【請求項18】

配列番号１０（ＳｍＢｉＴ）と比較して前記ペプチドが５個以下の置換基を含む、請求項１７に記載の組成物。

【請求項19】

配列番号１の１つ以上のリジンがアルギニンに置き換わっている、請求項１７に記載の組成物。

【請求項20】

前記ペプチドがＰｅｐ６９１（配列番号２３）を含む、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

前記ペプチドがＳｍＢｉＴ（配列番号１０）を含む、請求項１９に記載の組成物。

【請求項22】

前記ペプチドが蛍光団と結合体化されている、請求項１８に記載の組成物。

【請求項23】

前記ペプチドが、アルギニンに結合体化された蛍光団を含む、請求項２２に記載の組成物。

【請求項24】

前記ペプチドが、配列番号２３に結合体化された蛍光団を含む、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

前記ペプチドが、配列番号１０に結合体化された蛍光団を含む、請求項２３に記載の組成物。

【請求項26】

生体分子にペプチドで標識付けする方法であって、
前記スルホ－ＳＥ基と前記生体分子上のアミンとが反応するような条件の下で前記生体分子を請求項１～２５のうちの１項に記載の組成物に接触させること
を含む、前記方法。

【請求項27】

前記スルホ－ＳＥ基と前記生体分子上のアミンとが反応するような条件の下で請求項１４に記載のペプチド組成物が前記生体分子に接触する、請求項２４に記載の方法。

【請求項28】

前記アミンが第一級アミンである、請求項２６または請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記生体分子が、抗原、抗体、抗体断片、ナノボディ、ｄａｒｐｉｎ、非抗体タンパク質、受容体、リガンド、毒素、サイトカイン、核酸、核タンパク質複合体、ペプチド、アミノ酸、糖、薬物及びストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。

【請求項30】

ペプチドにスルホ－ＳＥ部分で標識付けする方法であって、
スルホ－ＮＨＳ化合物のヒドロキシと前記ペプチドの末端アミンとが反応するような条件の下で前記ペプチドを前記スルホ－ＮＨＳ化合物に接触させること
を含み、前記ペプチドがシステイン残基もリジン残基も含まない、前記方法。

【請求項31】

前記ペプチドが少なくとも１つの反応性求核性アミノ酸を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項32】

請求項１～２５のうちの１項に記載のペプチドで標識付けされた生体分子を含む、組成物。

【請求項33】

請求項３２に記載の組成物を被分析物に接触させることを含む方法。

【請求項34】

前記被分析物が、抗原、抗体、抗体断片、ナノボディ、ｄａｒｐｉｎ、非抗体タンパク質、受容体、リガンド、毒素、サイトカイン、核酸、核タンパク質複合体、ペプチド、アミノ酸、糖、薬物及びストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記被分析物が、前記生体分子上の前記ペプチドとの生物発光複合体を形成できる相補性ポリペプチドに連結されている、請求項３５に記載の方法。

【請求項36】

前記生物発光複合体を前記生物発光複合体の基質に接触させること、及び発光を検出することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

請求項１～２５のうちの１項に記載のペプチドで標識付けされた被分析物を含む組成物。

【請求項38】

請求項３７に記載の組成物を生体分子に接触させることを含む方法。

【請求項39】

前記生体分子が、前記被分析物上の前記ペプチドとの生物発光複合体を形成できる相補性ポリペプチドに連結されている、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記生物発光複合体を前記生物発光複合体の基質に接触させること、ならびに発光、蛍光及び／またはＢＲＥＴを検出することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

請求項１～２５のうちの１項に記載の第１のペプチドで標識付けされた被分析物と、請求項１～２５のうちの１項に記載の第２のペプチドで標識付けされた生体分子とを含む組成物であって、前記第１及び第２のペプチドが、相補性ポリペプチドの存在下で生物発光複合体を形成できるものである、前記組成物。

【請求項42】

請求項４１に記載の前記被分析物及び前記生体分子を前記相補性ポリペプチドに接触させること、ならびに前記生物発光複合体を形成することを含む、方法。

【請求項43】

前記生物発光複合体を前記生物発光複合体の基質に接触させること、及び発光を検出することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記ペプチドの１つ以上が蛍光団結合体化ペプチドまたは発色団結合体化ペプチドである、請求項２６～３１、請求項３３～３６、請求項３８～４０及び請求項４２～４３のうちの１項に記載の方法。

【請求項45】

前記生物発光複合体から前記蛍光団または発色団への蛍光／光及び／またはＢＲＥＴを検出することをさらに含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

生体分子１つあたりの標識付け数が生体分子１つあたりの蛍光団分子または発色団分子の数によって算出される、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記蛍光団分子が、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ｓｉｌｏローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、ＴＯＭ、Ｄｙｏｍｉｃｓ染料または炭素ローダミンであるが、それらの蛍光団に限定されない、請求項４４に記載の方法。

【請求項48】

（ａ）配列番号１（ＳｍＢｉＴ）標識被分析物生体分子とＬｇＢｉＴ標識被分析物生体分子特異抗体との生物発光複合体を形成すること、
（ｂ）前記生物発光複合体を前記被分析物に接触させること、
（ｃ）前記生物発光複合体を前記生物発光複合体の基質に接触させること、及び
（ｄ）前記生物発光複合体から発せられた光を検出すること
を含む方法。

【請求項49】

（ａ）被分析物を、配列番号１（ＳｍＢｉＴ）標識被分析物特異抗体、及びＬｇＢｉＴ標識被分析物特異抗体に接触させ、生物発光複合体を形成すること、
（ｂ）前記生物発光複合体を前記生物発光複合体の基質に接触させること、ならびに
（ｃ）前記生物発光複合体から発せられた光を検出すること
を含む方法。

【請求項50】

（ａ）被分析物を、
配列番号１（ＳｍＢｉＴ）標識被分析物特異抗体、
配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）標識被分析物特異抗体、ならびに
ＨｉＢｉＴ及びＳｍＢｉＴとの生物発光複合体を形成できるポリペプチド
に接触させること、
（ｂ）前記生物発光複合体を前記生物発光複合体の基質に接触させること、ならびに
（ｃ）前記生物発光複合体から発せられた光を検出すること
を含む方法。

【請求項50】

（ａ）被分析物を、
配列番号１（ＳｍＢｉＴ）標識被分析物特異抗体、
配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）標識被分析物特異抗体、ならびに
ＨｉＢｉＴ及びＳｍＢｉＴとの生物発光複合体を形成できるポリペプチド
に接触させること、
（ｂ）前記生物発光複合体を前記生物発光複合体の基質に接触させること、ならびに
（ｃ）前記生物発光複合体から発せられた光を検出すること
を含む方法。

【請求項51】

請求項１～２５のうちの１項に記載の組成物で標識付けされた生体分子を被分析物に接触させることを含む方法。

【請求項52】

前記被分析物が、抗原、抗体、非抗体タンパク質、受容体、リガンド、毒素、サイトカイン、核酸、ペプチド、アミノ酸、糖、薬物、核タンパク質複合体、ビオチン及びストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記被分析物生体分子が配列番号１（ＳｍＢｉＴ）で標識付けされている、請求項５１に記載の方法。

【請求項54】

（ａ）生物発光複合体を、配列番号１（ＳｍＢｉＴ）標識被分析物生体分子、及びＬｇＢｉＴ標識被分析物生体分子特異抗体から形成する；
（ｂ）前記生物発光複合体を前記被分析物に接触させる；
（ｃ）前記生物発光複合体を前記生物発光複合体の基質に接触させる；ならびに
（ｄ）前記生物発光複合体から発せられた光を検出する、
請求項５１に記載の方法。

【請求項55】

（ａ）配列番号１（ＳｍＢｉＴ）標識被分析物特異抗体とＬｇＢｉＴ標識被分析物特異抗体とから生物発光複合体を形成する；
（ｂ）前記生物発光複合体を前記被分析物に接触させる；
（ｃ）前記生物発光複合体を前記生物発光複合体の基質に接触させる；ならびに
（ｄ）前記生物発光複合体から発せられた光を検出する、
請求項５１に記載の方法。

【請求項56】

（ａ）配列番号１０（ＳｍＢｉＴ）標識抗体または受容体、及び配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）標識抗体または受容体に被分析物を接触させる；
（ｂ）前記被分析物をＬｇＢｉＴに接触させて生物発光複合体を形成する；
（ｃ）前記生物発光複合体を前記生物発光複合体の基質に接触させる；ならびに
（ｄ）前記生物発光複合体から発せられた光を検出する、
請求項５１に記載の方法。

【請求項57】

ａ）ＳｍＢｉＴまたはＨｉＢｉＴ標識被分析物生体分子をＨｉＢｉＴまたはＳｍＢｉＴ標識被分析物生体分子特異抗体に接触させる；
（ｂ）ＬｇＢｉＴに接触させて生物発光複合体を形成する；
（ｃ）被分析物に接触させる、
（ｄ）前記生物発光複合体を前記生物発光複合体の基質に接触させる；ならびに
（ｅ）前記生物発光複合体から発せられた光を検出する、
請求項５１に記載の方法。

【請求項58】

前記ペプチドが蛍光団結合体化ペプチドまたは発色団結合体化ペプチドである、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

生体分子１つあたりの標識付け数が生体分子１つあたりの蛍光団分子または発色団分子の数によって算出される、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記蛍光団分子が、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ｓｉｌｏローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、ＴＯＭ、Ｄｙｏｍｉｃｓ染料または炭素ローダミンであるが、それらの蛍光団に限定されない、請求項５８に記載の方法。

【請求項61】

（ａ）蛍光団結合体化配列番号１（ＳｍＢｉＴ）標識被分析物生体分子とＬｇＢｉＴ標識被分析物生体分子特異抗体とから生物発光複合体を形成する；
（ｂ）前記生物発光複合体を前記被分析物に接触させる；
（ｃ）前記生物発光複合体を前記生物発光複合体の基質に接触させる；ならびに
（ｄ）前記生物発光複合体から発せられた光を検出する、
請求項５１に記載の方法。

【請求項62】

（ａ）蛍光団結合体化配列番号１（ＳｍＢｉＴ）標識被分析物特異抗体とＬｇＢｉＴ標識被分析物特異抗体との両方に被分析物を接触させて生物発光複合体を形成する、
（ｂ）前記生物発光複合体を前記生物発光複合体の基質に接触させる；及び
（ｃ）前記生物発光複合体から発せられた光を検出する、
請求項５１に記載の方法。

【請求項63】

（ａ）配列番号１０（ＳｍＢｉＴ）ペプチド及び配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）ペプチドのうちの１つが蛍光団結合体化ペプチドであり；
（ｂ）配列番号１０（ＳｍＢｉＴ）及び配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）で標識付けされた抗体もしくは受容体または組合せに前記被分析物が接触し、前記ペプチドの１つが蛍光団結合体化ペプチドであり；
（ｂ）ＬｇＢｉＴに接触させて生物発光複合体を形成し；
（ｃ）前記生物発光複合体を前記生物発光複合体の基質に接触させ；
（ｄ）前記生物発光複合体から発せられた光を検出する、
請求項５１に記載の方法。

【請求項64】

蛍光団と結合体化された配列番号１０（ＳｍＢｉＴ）または配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）で被分析物生体分子または被分析物特異抗体が標識付けされており、
（ａ）配列番号１０（ＳｍＢｉＴ）または配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）で標識付けされた被分析物生体分子が、配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）または配列番号１０（ＳｍＢｉＴ）で標識付けされた被分析物生体分子特異抗体に接触し、前記ペプチドの１つが、前記蛍光団と結合体化されたペプチドであり、
（ｂ）ＬｇＢｉＴに接触させて生物発光複合体を形成し、
（ｃ）前記被分析物に接触させ、
（ｄ）前記生物発光複合体を前記生物発光複合体の基質に接触させ、
（ｅ）前記生物発光複合体から発せられた光を検出する、
方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／７７２，４４８号に基づく優先権を主張するものであり、これをもって参照によりその全体を援用する。

【0002】

分野
スルホｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（スルホ－ＳＥ）連結型ペプチド、その合成方法、及びそのようなペプチドを生体分子の標識付けのために使用する方法を本明細書に示す。詳しくは、非アルキル基、例えば、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸を含むペプチドはスルホ－ＳＥ基で安定的に（例えば自然反応性を伴わずに）修飾され、生体分子に対する標識付けあるいは修飾を行うために使用される。

【背景技術】

【0003】

リジンアミノ酸の第一級アミンは、生体分子に対して広く利用されている反応性部分であり、様々な薬剤、例えば、ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＳＥ）基と速やかに反応する。生体分子上の第一級アミンと蛍光染料、ビオチン、薬物などを含有するＳＥとの反応は、様々な用途での使用のためにタンパク質、抗体などに標識付けするために用いられてきた。ＳＥ基は、求核性アミノ酸側鎖、例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン、システイン、セリン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸などと反応するものであり、それゆえ、後に生体分子にペプチド標識付けするためのＳＥ含有ペプチドを作ることは回避されてきた。

【発明の概要】

【0004】

スルホｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（スルホ－ＳＥ）連結型ペプチド、その合成方法、及びそのようなペプチドを生体分子の標識付けのために使用する方法を本明細書に示す。詳しくは、非アルキル基、例えば、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸を含むペプチドはスルホ－ＳＥ基で安定的に（例えば自然反応性を伴わずに）修飾され、生体分子に対する標識付けあるいは修飾を行うために使用される。

【0005】

いくつかの実施形態では、スルホｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（スルホ－ＳＥ）基に連結されたペプチドを含む組成物であって、ペプチドがシステイン残基もリジン残基も含まない、当該組成物を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥはペプチドのＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥはペプチドのＣ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥはペプチドのアミノ酸側鎖に連結されている。いくつかの実施形態では、ペプチドは、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン及びアスパラギン酸から選択される少なくとも１つの非アルキルアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの反応性非アルキルアミノ酸はａまたはチロシンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの反応性求核性アミノ酸はアルギニンである。いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥ基は非ペプチドリンカー基によってペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、リンカー基はアルキルまたはヘテロアルキル鎖を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは１つ以上の側鎖置換基を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは４～５０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは８～２０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥはペプチドのＮ末端に結合している。いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥはリンカー基を介してペプチドのＮ末端に結合している。いくつかの実施形態では、ペプチドは蛍光団結合体または発色団結合体を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは生体分子複合体の構成要素である。いくつかの実施形態では、ペプチドは生体分子複合体の構成要素である。いくつかの実施形態では、配列番号１（ＳｍＢｉｔ）と比較してペプチドは５個以下の置換基を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のリジンがアルギニンに置き換わっている。いくつかの実施形態では、配列番号１の１つ以上のリジンがアルギニンに置き換わっている。いくつかの実施形態では、ペプチドはＰｅｐ６９１（配列番号２３）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドはＳｍＢｉＴ（配列番号１０）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは蛍光団と結合体化されている。いくつかの実施形態では、ペプチドは、アルギニンに結合体化された蛍光団を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号２３に結合体化された蛍光団を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１０に結合体化された蛍光団を含む。

【0006】

いくつかの実施形態では、生体分子にペプチドで標識付けする方法であって、スルホ－ＳＥ基と生体分子上のアミンとが反応するような条件の下で生体分子を本明細書に記載のスルホ－ＳＥ連結型ペプチドに接触させることを含む、当該方法を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥ基と生体分子上のアミンとが反応するような条件の下でペプチド組成物が生体分子に接触する。いくつかの実施形態では、アミンは第一級アミンである。いくつかの実施形態では、生体分子は、抗原、抗体、抗体断片、ナノボディ、ｄａｒｐｉｎ、非抗体タンパク質、受容体、リガンド、毒素、サイトカイン、核酸、核タンパク質複合体、ペプチド、アミノ酸、糖、薬物及びストレプトアビジンからなる群から選択される。

【0007】

いくつかの実施形態では、ペプチドにスルホ－ＳＥ部分で標識付けする方法であって、スルホ－ＮＨＳ化合物のヒドロキシとペプチドの末端アミンとが反応するような条件の下でペプチドをスルホ－ＮＨＳ化合物に接触させることを含み、ペプチドがシステイン残基もリジン残基も含まない、当該方法を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、ペプチドは少なくとも１つの反応性求核性アミノ酸を含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスルホ－ＳＥ連結型ペプチドで標識付けされた生体分子を含む、組成物を本明細書に示す。

【0009】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスルホ－ＳＥ連結型ペプチドで標識付けされた生体分子を被分析物に接触させることを含む方法を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、被分析物は、抗原、抗体、抗体断片、ナノボディ、ｄａｒｐｉｎ、非抗体タンパク質、受容体、リガンド、毒素、サイトカイン、核酸、核タンパク質複合体、ペプチド、アミノ酸、糖、薬物及びストレプトアビジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、被分析物は、生体分子上のペプチドとの生物発光複合体を形成できる相補性ポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、方法は、生物発光複合体を生物発光複合体の基質に接触させること、及び発光を検出することをさらに含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスルホ－ＳＥ連結型ペプチドで標識付けされた被分析物を含む組成物を本明細書に示す。

【0011】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスルホ－ＳＥ連結型ペプチドで標識付けされた被分析物を生体分子に接触させることを含む方法を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、生体分子は、被分析物上のペプチドとの生物発光複合体を形成できる相補性ポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、方法は、生物発光複合体を生物発光複合体の基質に接触させること、ならびに発光、蛍光及び／またはＢＲＥＴを検出することをさらに含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第１のスルホ－ＳＥ連結型ペプチドで標識付けされた被分析物と、本明細書に記載の第２のスルホ－ＳＥ連結型ペプチドで標識付けされた生体分子とを含む組成物であって、第１及び第２のペプチドが、相補性ポリペプチドの存在下で生物発光複合体を形成できるものである、当該組成物を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、方法は、被分析物及び生体分子を相補性ポリペプチドに接触させること、ならびに生物発光複合体を形成することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、生物発光複合体を生物発光複合体の基質に接触させること、及び発光を検出することをさらに含む。

【0013】

本明細書のいくつかの方法では、ペプチドの１つ以上は蛍光団結合体化ペプチドまたは発色団結合体化ペプチドである。これらの方法は、生物発光複合体から蛍光団または発色団への蛍光／光及び／またはＢＲＥＴを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、生体分子１つあたりの標識付け数は生体分子１つあたりの蛍光団分子または発色団分子の数によって算出される。いくつかの実施形態では、蛍光団分子は、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ｓｉｌｏローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、ＴＯＭ、Ｄｙｏｍｉｃｓ染料または炭素ローダミンであるが、それらの蛍光団に限定されない。

【0014】

いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１（ＳｍＢｉＴ）標識被分析物生体分子とＬｇＢｉＴ標識被分析物生体分子特異抗体との生物発光複合体を形成すること、（ｂ）生物発光複合体を被分析物に接触させること、（ｃ）生物発光複合体を生物発光複合体の基質に接触させること、及び（ｄ）生物発光複合体から発せられた光を検出することを含む方法を本明細書に示す。

【0015】

いくつかの実施形態では、（ａ）被分析物を、配列番号１（ＳｍＢｉＴ）標識被分析物特異抗体、及びＬｇＢｉＴ標識被分析物特異抗体に接触させ、生物発光複合体を形成すること、（ｂ）生物発光複合体を生物発光複合体の基質に接触させること、ならびに（ｃ）生物発光複合体から発せられた光を検出することを含む方法を本明細書に示す。

【0016】

いくつかの実施形態では、（ａ）被分析物を、配列番号１（ＳｍＢｉＴ）標識被分析物特異抗体、配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）標識被分析物特異抗体、ならびにＨｉＢｉＴ及びＳｍＢｉＴとの生物発光複合体を形成できるポリペプチドに接触させること、（ｂ）生物発光複合体を生物発光複合体の基質に接触させること、ならびに（ｃ）生物発光複合体から発せられた光を検出することを含む方法を本明細書に示す。

【0017】

いくつかの実施形態では、（ａ）被分析物を、配列番号１（ＳｍＢｉＴ）標識被分析物特異抗体、配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）標識被分析物特異抗体、ならびにＨｉＢｉＴ及びＳｍＢｉＴとの生物発光複合体を形成できるポリペプチドに接触させること、（ｂ）生物発光複合体を生物発光複合体の基質に接触させること、ならびに（ｃ）生物発光複合体から発せられた光を検出することを含む方法を本明細書に示す。

【0018】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスルホ－ＳＥ連結型ペプチドで標識付けされた生体分子に被分析物を接触させることを含む方法を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、被分析物は、抗原、抗体、非抗体タンパク質、受容体、リガンド、毒素、サイトカイン、核酸、ペプチド、アミノ酸、糖、薬物、核タンパク質複合体、ビオチン及びストレプトアビジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、被分析物生体分子は配列番号１（ＳｍＢｉＴ）で標識付けされている。

【0019】

いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）生物発光複合体を、配列番号１（ＳｍＢｉＴ）標識被分析物生体分子、及びＬｇＢｉＴ標識被分析物生体分子特異抗体から形成すること、（ｂ）生物発光複合体を被分析物に接触させること、（ｃ）生物発光複合体を生物発光複合体の基質に接触させること、ならびに（ｄ）生物発光複合体から発せられた光を検出することを含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）配列番号１（ＳｍＢｉＴ）標識被分析物特異抗体とＬｇＢｉＴ標識被分析物特異抗体とから生物発光複合体を形成すること、（ｂ）生物発光複合体を被分析物に接触させること、（ｃ）生物発光複合体を生物発光複合体の基質に接触させること、ならびに（ｄ）生物発光複合体から発せられた光を検出することを含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）配列番号１０（ＳｍＢｉＴ）標識抗体または受容体、及び配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）標識抗体または受容体に被分析物を接触させること、（ｂ）被分析物をＬｇＢｉＴに接触させて生物発光複合体を形成すること、（ｃ）生物発光複合体を生物発光複合体の基質に接触させること、ならびに（ｄ）生物発光複合体から発せられた光を検出することを含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ＳｍＢｉＴまたはＨｉＢｉＴ標識被分析物生体分子をＨｉＢｉＴまたはＳｍＢｉＴ標識被分析物生体分子特異抗体に接触させること、（ｂ）ＬｇＢｉＴに接触させて生物発光複合体を形成すること、（ｃ）被分析物に接触させること、（ｄ）生物発光複合体を生物発光複合体の基質に接触させること、ならびに（ｅ）生物発光複合体から発せられた光を検出することを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは蛍光団結合体化ペプチドまたは発色団結合体化ペプチドである。いくつかの実施形態では、生体分子１つあたりの標識付け数は生体分子１つあたりの蛍光団分子または発色団分子の数によって算出される。いくつかの実施形態では、蛍光団分子は、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ｓｉｌｏローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、ＴＯＭ、Ｄｙｏｍｉｃｓ染料または炭素ローダミンであるが、それらの蛍光団に限定されない。

【0023】

いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）蛍光団結合体化配列番号１（ＳｍＢｉＴ）標識被分析物生体分子とＬｇＢｉＴ標識被分析物生体分子特異抗体とから生物発光複合体を形成すること、（ｂ）生物発光複合体を被分析物に接触させること、（ｃ）生物発光複合体を生物発光複合体の基質に接触させること、ならびに（ｄ）生物発光複合体から発せられた光を検出することを含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）蛍光団結合体化配列番号１（ＳｍＢｉＴ）標識被分析物特異抗体とＬｇＢｉＴ標識被分析物特異抗体との両方に被分析物を接触させて生物発光複合体を形成すること、（ｂ）生物発光複合体を生物発光複合体の基質に接触させること、及び（ｃ）生物発光複合体から発せられた光を検出することを含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）配列番号１０（ＳｍＢｉＴ）ペプチド及び配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）ペプチドのうちの１つが蛍光団結合体化ペプチドであること、（ｂ）配列番号１０（ＳｍＢｉＴ）及び配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）で標識付けされた抗体もしくは受容体または組合せに被分析物が接触し、ペプチドの１つが蛍光団結合体化ペプチドである、こと、（ｂ）ＬｇＢｉＴに接触させて生物発光複合体を形成すること、（ｃ）生物発光複合体を生物発光複合体の基質に接触させること、（ｄ）生物発光複合体から発せられた光を検出することを含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、蛍光団と結合体化された配列番号１０（ＳｍＢｉＴ）または配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）で被分析物生体分子または被分析物特異抗体が標識付けされており、（ａ）配列番号１０（ＳｍＢｉＴ）または配列番号１１ ＨｉＢｉＴで標識付けされた被分析物生体分子が、配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）または配列番号１０（ＳｍＢｉＴ）で標識付けされた被分析物生体分子特異抗体に接触し、ペプチドの１つが、蛍光団で結合体化されたペプチドであり、（ｂ）ＬｇＢｉＴに接触させて生物発光複合体を形成し、（ｃ）被分析物に接触させ、（ｄ）生物発光複合体を生物発光複合体の基質に接触させ、（ｅ）生物発光複合体から発せられた光を検出する、方法を本明細書に示す。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1A】一般的なスルホ－ＳＥ基を一般的なペプチドに結合させる合成スキーム。標的ペプチドをビス－スルホ－ＳＥと直接反応させた。片方のスルホ－ＳＥはＮ末端、Ｃ末端または側鎖の遊離アミンと反応するが、もう片方のスルホ－ＳＥは完全なまま残る。

【図1B】一般的なスルホ－ＳＥ基を一般的なペプチドに結合させる合成スキーム。まず、樹脂上の保護されたペプチドをＮ末端か側鎖かのどちらかでビス－スルホＳＥに連結し、その後、得られたペプチドをトリフルオロ酢酸中で樹脂から切り離した。

【図2】スルホ－ＳＥペプチドを一般的な生体分子に結合させるための合成スキーム。

【図3】（Ａ）ＨａｌｏＴａｇ及び（Ｂ）ビオチン／ストレプトアビジン系を介したＳｍＢｉＴペプチドと関心対象の標的との結合。

【図4】抗原のＳｍＢｉＴ－スルホ－ＳＥ標識付け。

【図5】直接的イムノアッセイにおけるＳＥ－ＳｍＢｉＴ標識ヤギ抗マウス抗体の評価。

【図6】ＩＦＮγ間接的イムノアッセイにおけるＳＥ－ＳｍＢｉＴ標識ストレプトアビジンの評価。

【図7】フモニシン競合的イムノアッセイにおけるＳＥ－ＳｍＢｉＴ標識ストレプトアビジンの評価。

【図8】ＦｃＲｎ結合アッセイにおけるＳＥ－ＳｍＢｉＴ標識ストレプトアビジンの評価。

【図9】本明細書に記載の構成要素及び試薬を使用した例示的な生物発光イムノアッセイを描写する模式図。

【図10】スルホ－ＳＥ－ＳｍＴｒｉｐ９（８２４）（配列番号２５）及びスルホ－ＳＥ－ＳｍＴｒｉｐ１０（６９１）（配列番号２３）で直接標識付けされたモノクローナル抗体の対をＬｇＴｒｉｐ（３５４６）（配列番号１２）及びフリマジンと組み合わせて溶液ベース均一系アッセイに使用した、ヒト組換えＩＬ－６の生物発光定量を描写するグラフ。Ａ）原ＲＬＵ値、及びＢ）信号対ノイズ計算値。

【図11】スルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（６９３）（配列番号１６）またはスルファ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（８４０）（配列番号１７）、及びスルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ１０（６９１）（配列番号２３）で直接標識付けされたモノクローナル抗体の対をＬｇＴｒｉｐ（３５４６）（配列番号１２）及びフリマジンと組み合わせて溶液ベース均一系アッセイに使用した、ヒト組換えＩＬ－６の生物発光定量を描写するグラフ。Ａ）原ＲＬＵ値、及びＢ）信号対ノイズ計算値。

【図12】本明細書に記載の構成要素及び試薬を使用するＮａｎｏＴｒｉｐシステムの補完によって生じる供与体光生成を用いた、例示的な生物発光共鳴エネルギー移動（ＮａｎｏＢＲＥＴ）イムノアッセイを描写する模式図。

【図13】スルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（９３８）－ＴＡＭＲＡ（配列番号３８）及びスルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ１０（６９１）（配列番号２３）で直接標識付けされたモノクローナル抗体の対をＬｇＴｒｉｐ（３５４６）（配列番号１２）及びフリマジンと組み合わせて溶液ベース均一系アッセイに使用した、ＮａｎｏＢＲＥＴに基づくヒト組換えＩＬ－６の定量の即時結合動態を描写するグラフ。

【図14】直接標識付けされた抗ヒトＩＬ－６モノクローナル抗体のＳＤＳ ＰＡＧＥゲル。Ａ）全タンパク質を捉えた明視野画像、及びＢ）スルホ－ＳＥ－ペプチド－ＴＡＭＲＡ（標識抗体及び余剰の標識）を捉えた蛍光画像。

【図15】例示的なスルホ－ＳＥペプチド。

【発明を実施するための形態】

【0028】

定義
本明細書に記載されているのと類似した、または等価な任意の方法及び材料を本明細書に記載の実施形態の実施及び試験に用いることはできるが、いくつかの好ましい方法、組成物、装置及び材料を本明細書に記載する。しかしながら、本発明の材料及び方法について記載する前に、本明細書に記載される特定の分子、組成物、方法論またはプロトコールによって本発明が限定されないことは理解されるべきである、というのも、これらは慣例的な実験及び最適化によって様々であり得るからである。説明の中で使用される専門用語が、特定の形態または実施形態を説明する目的のためのものであるにすぎず、本明細書に記載の実施形態の範囲の限定を意図したものではないことも、理解されるべきである。

【0029】

特に規定がない限り、本明細書中で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。しかしながら、対立がある場合には、定義を含めた本明細書が優先されよう。したがって、本明細書に記載の実施形態に関して以下の定義が適用される。

【0030】

本明細書及び別記の特許請求の範囲の中で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数形での意味を含んでおり、但し、そうでないことが文脈から明らかである場合を除く。したがって、例えば、「ペプチド」への言及は、１つ以上のペプチド及び当業者に知られているその均等物などへの言及である。

【0031】

本明細書中で使用する場合、「及び／または」という用語は、列挙された項目のありとあらゆる組合せを含むものであり、列挙された項目のいずれかを個別に含むものでもある。例えば、「Ａ、Ｂ及び／またはＣ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ及びＡＢＣを包含し、これらの各々は、「Ａ、Ｂ及び／またはＣ」と述べたことによって別個に記載されたとみなされるべきである。

【0032】

本明細書中で使用する場合、「含む」という用語及びその言語学的変化形は、付加的な特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などの存在を排除することなく、挙げられた特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などの存在を表す。反対に、「からなる」という用語及びその言語学的変化形は、挙げられた特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などの存在を表すものであり、通常伴う不純物は別として、挙げられていない特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などはどれも排除される。「から本質的になる」という語句は、挙げられた特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）など、及び組成物、システムまたは方法の基本的性質に実質的な影響を及ぼさない任意の付加的な特徴（複数可）、要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などを表す。本明細書において多くの実施形態は、開放形式の「含む」という用語を使用して記載される。そのような実施形態は、複数の閉鎖形式の「からなる」及び／または「から本質的になる」の実施形態を包含するが、これらは代わりにそのような用語を使用して特許請求または記載されている場合がある。

【0033】

本明細書中で使用する場合、「実質的に」という用語は、挙げられた特質、パラメータ及び／または値が厳密に達成される必要はなく、例えば公差、測定誤差、測定精度限界及び当業者に知られている他の因子を含めた偏差または変動が、特質がもたらす意図した効果を妨げない量で起こり得ることを意味する。実質的に存在しない特質または特徴（例えば、実質的な非発光性）は、ノイズの範囲内に入るもの、バックグラウンド未満のもの、用いるアッセイの検出性能を下回るもの、または重要な特質（例えば、生物発光タンパク質または生物発光複合体の発光強度）のほんの一部（例えば、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満、０．００００１％未満、０．０００００１％未満、０．００００００１％未満）であり得る。

【0034】

本明細書中で使用する場合、「スルホｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル」（「スルホ－ＳＥ」）は、化学構造：

〔式中、Ｒは化学物質または生体分子（例えばペプチド）であり、Ｌは、スルホ－ＳＥ基を化学物質または生体分子（例えばペプチド）に繋げている（本明細書に記載の）任意の好適なリンカーである〕
を有する化学物質上または生体分子上の部分を指す。

【0035】

「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸及びアミノ酸類縁体を指し、特に示されていない限りこれらはどれもそのＤ型及びＬ型立体異性体をその構造によって許容される場合に採るものである。

【0036】

天然アミノ酸としては、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、及びバリン（ＶａｌまたはＶ）が挙げられる。

【0037】

非天然アミノ酸としては、ペンタフルオロフェニルアラニン（「Ｚ」）、アゼチジンカルボン酸、２－アミノａｄｉｐｉｃ ａｃｉｄ、３－アミノアジピン酸、ベータ－アラニン、ナフチルアラニン（「ｎａｐｈ」）、アミノプロピオン酸、２－アミノ酪酸、４－アミノ酪酸、６－アミノカプロン酸、２－アミノヘプタン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノイソ酪酸、２－アミノピメリン酸、第三ブチルグリシン（「ｔＢｕＧ」）、２，４－ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’－ジアミノピメリン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ホモプロリン（「ｈＰｒｏ」または「ｈｏｍｏＰ」）、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、３－ヒドロキシプロリン（「３Ｈｙｐ」）、４－ヒドロキシプロリン（「４Ｈｙｐ」）、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ－メチルアラニン（「ＭｅＡｌａ」または「Ｎｉｍｅ」）、Ｎ－アルキルグリシン（「ＮＡＧ」）、例えば、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－アルキルペンチルグリシン（「ＮＡＰＧ」）、例えば、Ｎ－メチルペンチルグリシン．Ｎ－メチルバリン、ナフチルアラニン、ノルバリン（「Ｎｏｒｖａｌ」）、ノルロイシン（「Ｎｏｒｌｅｕ」）、オクチルグリシン（「ＯｃｔＧ」）、オルニチン（「Ｏｒｎ」）、ペンチルグリシン（「ｐＧ」または「ＰＧｌｙ」）、ピペコリン酸、チオプロリン（「ＴｈｉｏＰ」または「ｔＰｒｏ」）、ホモリジン（「ｈＬｙｓ」）、シトルリン、ハロ置換チロシン、及びホモアルギニン（「ｈＡｒｇ」）が挙げられるが、これらに限定されない。非天然反応性アミノ酸は、例えば、Ｂｏｕｔｕｒｅｉｒａ，Ｏ．ａｎｄ Ｇ．Ｊ．Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ（２０１５）“Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．”Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ １１５（５）：２１７４－２１９５に記載されており、参照によりこの全体を本明細書に援用する。

【0038】

「アミノ酸類縁体」という用語は、Ｃ末端カルボキシ基、Ｎ末端アミノ基及び側鎖生物活性基のうちの１つ以上が可逆的または不可逆的に化学的にブロッキングされた、あるいは別の生物活性基に改変された天然または非天然アミノ酸を指す。例えば、アスパラギン酸－（ベータ－メチルエステル）はアスパラギン酸のアミノ酸類縁体であり、Ｎ－エチルグリシンはグリシンのアミノ酸類縁体であり、またはアラニンカルボキサミドはアラニンのアミノ酸類縁体である。他のアミノ酸類縁体としては、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ－（カルボキシメチル）－システイン、Ｓ－（カルボキシメチル）－システインスルホキシド、及びＳ－（カルボキシメチル）－システインスルホンが挙げられる。アミノ酸類縁体は、様々な保護基を有するアミノ酸を含み得る（Ｉｓｉｄｒｏ－Ｌｌｏｂｅｔ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）．“Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ－Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ．”Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １０９（６）：２４５５－２５０４；参照によりこの全体を本明細書に援用する）。

【0039】

本明細書中で使用する場合、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、特に指定されない限り、ペプチドアミド結合（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）によって主鎖で継ぎ合わされた２つ以上のアミノ酸のポリマー化合物を指す。「ペプチド」という用語が典型的には短いアミノ酸ポリマー（例えば、５０個未満のアミノ酸を有する鎖）を指すのに対して、「ポリペプチド」という用語は典型的にはより長いアミノ酸ポリマー（例えば、５０個より多いアミノ酸を有する鎖）を指す。

【0040】

本明細書中で使用する場合、「ペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」及び「ペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ）」という用語は、タンパク質またはペプチドに由来する配列を模倣したペプチド様またはポリペプチド様分子を指す。ペプチドミメティックは、アミノ酸類縁体、ペプトイドアミノ酸及び／または非アミノ酸成分を排他的に、あるいはアミノ酸（例えば天然または非天然アミノ酸）と組み合わせて含有し得る。ペプチドミメティックの例としては、化学修飾ペプチド／ポリペプチド、ペプトイド（α炭素ではなくペプチド主鎖の窒素に側鎖が付加されている）、βペプチド（α炭素ではなくβ炭素にアミノ基が結合している）などが挙げられる。

【0041】

本明細書中で使用する場合、「ペプトイド」という用語は、α炭素ではなくペプチド主鎖の窒素原子において側鎖が官能化されているペプチドミメティックの部類を指す。

【0042】

本明細書中で使用する場合、「人工」という用語は、人間の手で設計または作製され天然には存在していない組成物及びシステムを指す。例えば、人工のペプチド、ペプトイドまたは核酸は、非天然配列を含んだもの（例えば、天然に存在するタンパク質またはその断片との１００％の同一性がないペプチド）である。

【0043】

本明細書中で使用する場合、「保存的」アミノ酸置換は、ペプチドまたはポリペプチドにおけるアミノ酸に対する、類似した化学特性、例えばサイズまたは電荷を有する別のアミノ酸による置換を意味する。本開示の目的において、以下の８つの群の各々は、互いに保存的な置換基であるアミノ酸を含んでいる：
１）アラニン（Ａ）及びグリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）及びスレオニン（Ｔ）；ならびに
８）システイン（Ｃ）及びメチオニン（Ｍ）

【0044】

天然に存在する残基は、共通する側鎖特性に基づく部類、例えば、極性で正（または塩基性）（ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ））；極性で陰性（または酸性）（アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ））；極性で中性（セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ））；非極性脂肪族（アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ））；非極性芳香族（フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ））；プロリン及びグリシン；ならびにシステインに分けられ得る。本明細書中で使用する場合、「半保存的」アミノ酸置換は、ペプチドまたはポリペプチドにおけるアミノ酸に対する、同じ部類に入る別のアミノ酸による置換を意味する。

【0045】

いくつかの実施形態では、特に指定されない限り、保存的または半保存的アミノ酸置換は、天然の残基に類似した化学特性を有する天然に存在しないアミノ酸残基も包含し得る。これらの非天然残基は、典型的には生物学的システムでの合成によってではなく化学的ペプチド合成によって組み込まれる。これらは、限定されないが、ペプチドミメティック及び他の逆または反転形態のアミノ酸部分を含む。本明細書の実施形態は、いくつかの実施形態では天然アミノ酸、非天然アミノ酸及び／またはアミノ酸類縁体に限定される場合がある。

【0046】

非保存的置換は、１つの部類の構成員が別の部類の構成員で交換されることを伴い得る。

【0047】

本明細書中で使用する場合、「配列同一性」という用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が単量体サブユニットの同じ配列組成を有している度合いを指す。「配列類似性」という用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が類似したポリマー配列を有する度合いを指す。例えば、類似したアミノ酸は、同じ生物物理学的特質を共有しておりファミリー、例えば、酸性（例えば、アスパルテート、グルタメート）、塩基性（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）及び非荷電性で極性（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）に分類され得るものである。「同一性パーセント」（または「配列類似性パーセント」）は、（１）比較適用枠（例えば、長い方の配列の長さ、短い方の配列の長さ、指定の適用枠）にわたって２つの最適に整列させた配列を比較すること、（２）同一の（または類似する）単量体を含有する（例えば、同じアミノ酸が両配列に出現する、類似したアミノ酸が両配列に出現する）位置の数を決定して一致位置数を得ること、（３）一致位置数を比較適用枠（例えば、長い方の配列の長さ、短い方の配列の長さ、特定の適用枠）内の全位置数で除すること、及び（４）結果に１００を乗じて配列同一性パーセントまたは配列類似性パーセントを得ることによって算出される。例えば、ペプチドＡ及びＢがどちらも２０アミノ酸の長さを有し、１つの位置を除く全ての位置において同一のアミノ酸を有する場合、ペプチドＡとペプチドＢとが９５％の配列同一性を有する。非同一位置にあるアミノ酸同士が同じ生物物理学的特質を共有している（例えば両者ともに酸性であった）場合、ペプチドＡ及びペプチドＢは１００％の配列類似性を有するであろう。別の例を挙げると、ペプチドＣの長さが２０アミノ酸であり、ペプチドＤの長さが１５アミノ酸であり、ペプチドＤの１５個中１４個のアミノ酸がペプチドＣの一部分のそれらと同一である場合、ペプチドＣ及びＤは７０％の配列同一性を有するが、ペプチドＤはペプチドＣの最適比較適用枠との９３．３％の配列同一性を有する。本明細書において「配列同一性パーセント」（または「配列類似性パーセント」）を算出する目的では、整列させた配列においていかなるギャップもその位置での不一致として取り扱われる。

【0048】

基準配列番号との特定の（例えば少なくとも７０％の）配列同一性または類似性のパーセントを有する本明細書に記載の任意のペプチド／ポリペプチドは、その基準配列に関して最大数の置換（または末端欠失）を有するとも表現され得る。例えば、配列番号Ｚ（例えば１００アミノ酸）との少なくともＹ％（例えば９０％）の配列同一性を有する配列は、配列番号Ｚと比較してＸ個（例えば１０個）以下の置換を有し得、したがって、「配列番号Ｚと比較してＸ個（例えば１０個）以下の置換を有する」とも表現され得る。

【0049】

本明細書中で使用する場合、「試料」という用語は、その最も広義な意味で使用される。ある意味では、任意の供給源から得られた検体または培養物、ならびに生物及び環境の試料がそれに含まれることを意図する。生物試料は、動物（ヒトを含む）から得られ得、流体、固体、組織及び気体を包含する。生物試料には、血液産物、例えば、血漿、血清などが含まれる。試料はまた、細胞溶解物、または本明細書に記載の酵素、ペプチド及び／またはポリペプチドの精製形態も意味し得る。細胞溶解物には、溶解剤によって溶解した細胞、またはウサギ網状赤血球溶解物もしくはコムギ胚芽溶解物のような溶解物が含まれ得る。試料には無細胞発現系も含まれ得る。環境試料としては、環境物質、例えば、表面物質、土壌、水、結晶及び工業試料が挙げられる。しかしながら、そのような例は、本発明に適用できる試料の種類を限定しているとみなされるべきでない。

【0050】

本明細書中で使用する場合、「生理学的条件」という用語は、生細胞に適合する任意の条件、例えば、生細胞に適合する温度、ｐＨ、塩分、化学構成などを有する主として水性の条件を包含する。

【0051】

本明細書中で使用する場合、「結合体化された」及び「結合体化」という用語は、（例えば、合成後、及び／または合成製造中に）２つの分子実体を共有結合によって結合させることを意味する。タンパク質または小分子にペプチドまたは小分子タグを化学的に（例えば「化学的に」結合体化される）または酵素的に結合させることは、結合体化の一例である。ＳＥ－ペプチドと生体分子上のアミンとの反応は、ペプチドと生体分子との結合体化をもたらす。

【0052】

「結合部分」という用語は、異なるエピトープまたは抗原結合ドメインとは無関係に、抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインを指す。結合部分は、抗体、抗体断片、標的リガンドに結合する受容体ドメイン、免疫グロブリンに結合するタンパク質（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、プロテインＭ）、免疫グロブリンに結合するタンパク質（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、プロテインＭ）の結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製タンパク質（被分析物自体か、被分析物に結合するタンパク質かのどちらか）、及びタンパク質の被分析物結合ドメイン（複数可）などであり得る。表Ａは、本明細書の方法、システム及びアッセイ（例えばイムノアッセイ）において単独で、または様々な組合せで使用され得る例示的な結合部分の一覧を示す。
表Ａ．例示的な結合部分

【0053】

本明細書中で使用する場合、「抗体」という用語は、全抗体分子またはその断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）₂、可変軽鎖、可変重鎖、Ｆｖのような断片）を指し、それは、ポリクローナルもしくはモノクローナルまたは組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などであり得る。本明細書中で使用する場合、抗体または他の実体が抗原またはエピトープを「特異的に認識する」またはそれに「特異的に結合する」場合、それはタンパク質及び／または巨大分子の複雑な混合物の中で抗原を優先的に認識し、抗原またはエピトープを提示していない他の実体に比べて実質的により高い親和性で抗原またはエピトープに結合する。これに関して、「実質的により高い親和性」は、所望のアッセイまたは測定装置を用いて実体とは区別される抗原またはエピトープの検出を可能にするのに十分に高い親和性を意味する。典型的には、それは、少なくとも１０⁷Ｍ^-1（例えば、１０⁷Ｍ^-1超、１０⁸Ｍ^-1超、１０⁹Ｍ^-1超、１０¹⁰Ｍ^-1超、１０¹¹Ｍ^-1超、１０¹²Ｍ^-1超、１０¹³Ｍ^-1超など）の結合定数（Ｋ_a）を有する結合親和性を意味する。特定のそのような実施形態では、抗体は、その特定のエピトープを異なる抗原が含んでいる限り、異なる抗原に結合することができる。場合によっては、例えば、異なる種からの相同タンパク質が同じエピトープを含み得る。

【0054】

本明細書中で使用する場合、「抗体断片」という用語は、抗原結合領域または可変領域の少なくとも一部を含む、完全長抗体の一部を指す。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、可変軽鎖、可変重鎖、ダイアボディ、及び完全抗体の可変領域の少なくとも一部を保持している他の抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４を参照されたく、参照によりこの全体を本明細書に援用する。特定の実施形態では、抗体断片は、組換えＤＮＡ技術または化学的ポリペプチド合成によって製造される完全抗体の酵素的または化学的切断（例えば、抗体のパパイン消化及びペプシン消化）によって製造される。例えば、「Ｆａｂ」断片は、１本の軽鎖と、１本の重鎖のＣ_H1及び可変領域とを含む。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Ｆａｂ」断片は、１本の軽鎖、及びＣ_H1ドメインとＣ_H2ドメインとの間に延在する付加的な定常領域を含む１本の重鎖を含む。Ｆａｂ’断片の２本の重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されて「Ｆ（ａｂ’）₂」分子が形成され得る。「Ｆｖ」断片は、重軽鎖両方からの可変領域を含むが、定常領域が欠損している。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片は、柔軟なリンカーによって繋げられた重軽鎖可変領域を含んで結果的に、抗原結合領域を有する１本のポリペプチド鎖を形成している。例示的な一本鎖抗体は、ＷＯ８８／０１６４９及び米国特許第４，９４６，７７８号及び第５，２６０，２０３号の中で詳しく記述されており、参照によりこれらの全体を本明細書に援用する。場合によっては、単一の可変領域（例えば重鎖可変領域または軽鎖可変領域）が、抗原を認識する及びそれに結合する能力を有し得る。他の抗体断片は当業者によって理解されよう。

【0055】

本明細書中で使用する場合、「ペプチドタグ」という用語は、別の実体（例えば生体分子）に（例えば合成後または合成製造中に）結合または融合され得るペプチドを指す。本明細書の典型的な実施形態では、ペプチドタグは、（例えばペプチドを生体分子と結合体化するための）スルホ－ＳＥ基を提示している（それに連結されている）。本明細書の特定の実施形態では、ペプチドタグは、適切な条件の下で（ｉ）ポリペプチド及び／または（ｉｉ）別のペプチドタグ及びポリペプチドとの生物発光複合体を形成することができる。

【0056】

本明細書中で使用する場合、「生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）」または「生体分子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、生物中に存在し細胞分裂、形態形成または発達などの生物学的プロセス（複数可）にとって必須である分子及びイオンを指す。［１］生体分子には大型の巨大分子（またはポリアニオン）、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質及び核酸、ならびに小分子、例えば、一次代謝産物、二次代謝産物及び天然物が含まれる。この類の物質のより一般的な名称は、生体物質である。生体分子は大抵は内在性のものであるが、外来性のものであることもある。例えば、医薬は天然物または半合成物質（バイオ医薬）であってもよいし、またはそれらは完全に合成物質であってもよい。

【0057】

本明細書中で使用する場合、「生物発光」という用語は、酵素、タンパク質、タンパク質複合体または他の生体分子（例えば生物発光複合体）によって触媒されるまたは可能にされる化学反応による光の生成及び放射を指す。典型的な実施形態では、生物発光実体（例えば生物発光タンパク質または生物発光複合体）の基質は、生物発光実体によって不安定な形態に変換され、その後に基質は光を発する。本明細書中で使用する場合、「非発光性」という用語は、検出可能な量の可視スペクトルの光を（例えば基質の存在下で）放射しない特質を呈する実体（例えば、ペプチド、ポリペプチド、複合体、タンパク質など）を意味する。例えば、実体は、それが所与のアッセイにおいて検出可能な発光を呈しない場合に非発光性と呼称され得る。本明細書中で使用する場合、「非発光性」という用語は、「実質的に非発光性」という用語と同義である。いくつかの実施形態では、実体は、特定のアッセイの妨害となるバックグラウンドを作り出さないようにいかなる発光も十分に最低限に抑えられている場合に「非発光性」とみなされる。

【0058】

本明細書中で使用する場合、「非発光ペプチド」及び「非発光ポリペプチド」という用語は、標準的条件（例えば、生理学的条件、アッセイ条件など）の下で典型的な機器（例えば発光光度計など）を使用した有意な信号（例えば生物発光複合体）と比較した場合に（例えば基質の存在下で）実質的に発光を呈しない、またはノイズを下回る（例えば、１００分の１、２００分の１、５００分の１、１×１０³分の１、１×１０⁴分の１、１×１０⁵分の１、１×１０⁶分の１、１×１０⁷分の１などの）量を呈する、ペプチド及びポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、そのような非発光ペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載の基準に準じた集合をして、生物発光複合体を形成する。

【0059】

本明細書中で使用する場合、「Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ」（「ＯｇＬｕｃ」）という用語は、深海エビＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓによって産生されるまたはそれに由来するルシフェラーゼに関する有意な配列同一性、構造保存及び／または機能活性を有する発光ポリペプチドを指す。詳しくは、ＯｇＬｕｃポリペプチドは、１０個のβストランド（β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β８、β９、β１０）を含みセレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体もしくは類縁体などの基質を利用して発光を引き起こすものであるＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼタンパク質複合体の（例えばシグナル配列を有さない）成熟１９ｋＤａサブユニット、例えば配列番号１（ＷＴ ＯｇＬｕｃ）及び配列番号３（ＮａｎｏＬｕｃ）に関する有意な配列同一性、構造保存及び／または機能活性を有する発光ポリペプチドを指す。

【0060】

本明細書中で使用する場合、「相補的」という用語は、２つ以上の構造的要素（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子など）の、互いにハイブリダイズする、二量体化する、あるいは複合体を形成できる特質を意味する。例えば、「相補的ペプチド及びポリペプチド」は、寄り集まって複合体を形成することができる。相補的要素は、複合体を（例えば相互作用要素から）形成すること、例えば、要素を相補性に適した配座で配置すること、要素を相補性に適した近傍に配置すること、相補的要素を共局在化させること、相補性のための相互作用エネルギーを下げること、互いに対する不十分な親和性を克服することなどのために補助（促進）を必要とする場合がある。

【0061】

本明細書中で使用する場合、「複合体」という用語は、互いに直接的及び／または間接的に接触している分子（例えば、ペプチド、ポリペプチドなど）の集合体または会合体を指す。一態様において、「接触」またはより詳しくは「直接的接触」は、２つ以上の分子が、分子の相互作用において非共有結合による引力相互作用、例えば、ファンデルワールス力、水素結合、イオン性及び疎水性相互作用などが優勢を占めるように十分に近接していることを意味する。そのような態様では、分子（例えばペプチド及びポリペプチド）の複合体は、（例えばその構成要素分子の非会合状態または非複合体化状態に比べて）複合体の方が熱力学的に有利になるようなアッセイ条件の下で形成される。本明細書中で使用する場合、「複合体」という用語は、特に記載がない限り、２つ以上の分子（例えば、ペプチド、ポリペプチドまたはその組合せ）の集合体を指す。

【0062】

本明細書中で使用する場合、「β９様ペプチド」という用語は、ＯｇＬｕｃポリペプチドのβ（ベータ）９ストランドに関する有意な配列同一性、構造保存及び／または機能活性を含むペプチド（またはペプチドタグ）を指す。詳しくは、β９様ペプチドは、β９ストランドが欠損しているＯｇＬｕｃポリペプチドを構造的に補完することができて結果的に、β９様ペプチドの非存在下のＯｇＬｕｃポリペプチドと比較して複合体の発光の増強をもたらすことができる、ペプチドである。他の「βＸ様ペプチド」は同様に命名され得る（例えば、β１様、β２様、β３様、β４様、β５様、β６様、β７様、β８様、β９様）。いくつかの実施形態では、β９様ペプチドは、生体分子との結合体化のためのスルホ－ＳＥ基に連結される。

【0063】

本明細書中で使用する場合、「β１０様ペプチド」という用語は、ＯｇＬｕｃポリペプチドのβ（ベータ）１０ストランドに関する有意な配列同一性、構造保存及び／または機能活性を含むペプチド（またはペプチドタグ）を指す。詳しくは、β１０様ペプチドは、β１０ストランドが欠損しているＯｇＬｕｃポリペプチドを構造的に補完することができて結果的に、β１０様ペプチドの非存在下のＯｇＬｕｃポリペプチドと比較して複合体の発光の増強をもたらすことができる、ペプチドである。他の「βＸ様ペプチド」は同様に命名され得る（例えば、β１様、β２様、β３様、β４様、β５様、β６様、β７様、β８様、β９様）。いくつかの実施形態では、β１０様ペプチドは、生体分子との結合体化のためのスルホ－ＳＥ基に連結される。

【0064】

本明細書中で使用する場合、「β_1-8様ポリペプチド」という用語は、ＯｇＬｕｃポリペプチドのβ（ベータ）ストランド１～８との配列及び構造の類似性を保有するがβ（ベータ）ストランド９及び１０が欠損しているポリペプチドを指す。他の「β_Y-Z様ポリペプチド」は同様に命名され得る（例えば、β_1-4様ポリペプチド、β_2-8様ポリペプチド、β_5-10様ポリペプチドなど）。

【0065】

本明細書中で使用する場合、「ＮＡＮＯＬＵＣ」という用語は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって商業的に生産された人工ルシフェラーゼまたは生物発光ポリペプチド、及び対応する配列番号３を指す。

【0066】

本明細書中で使用する場合、「ＬｇＢｉＴ」という用語は、例えば生物発光複合体を形成するための二元補完に利用される、β_1-9様ポリペプチドに対応するポリペプチドを指し、配列番号１１に対応する。

【0067】

本明細書中で使用する場合、「ＳｍＢｉＴ」という用語は、例えば生物発光複合体を形成するための二元補完に利用されるがＬｇＢｉＴに対する低い親和性を有する（例えば、複合体形成のためには促進を必要とする）、β₁₀様ペプチドに対応するペプチドを指し、配列番号１３に対応する。いくつかの実施形態では、ＳｍＢｉｔまたはその変異体は、生体分子との結合体化のためのスルホ－ＳＥに連結される。

【0068】

本明細書中で使用する場合、「ＨｉＢｉＴ」という用語は、例えば生物発光複合体を形成するための二元補完に利用されるがＬｇＢｉＴに対する低い親和性を有する（例えば、複合体形成のためには促進を必要とする）、β₁₀様ペプチドに対応するペプチドを指す。例示的なＨｉＢｉＴペプチドは配列番号１５に対応する。ＨｉＢｉＴは、「ＳｍＨｉＴｒｉｐ１０」（配列番号１１）及び「ｐｅｐ８６」と同じ配列を有するが、これらは交換可能に使用され得る用語である（ＳｍＴｒｉｐ１０ｐｅｐ８６なども）。いくつかの実施形態では、システイン及びリジン残基が欠損しているＨｉＢｉｔは、生体分子との結合体化のためのスルホ－ＳＥに連結される。

【0069】

本明細書中で使用する場合、「ＬｇＴｒｉｐ」という用語は、β_1-8様ポリペプチドに対応するポリペプチドを指す。例示的なＬｇＴｒｉｐは配列番号１７に対応し、例えば、生物発光複合体を形成するためのβ₉様ペプチド及びβ₁₀様ペプチドとの三元補完、または生物発光複合体を形成するためのβ_9-10様ジペプチドとの二元補完に利用される。ＬｇＴｒｉｐ変異体としては、ＬｇＴｒｉｐ２０９８（ｗ／ Ｈｉｓタグ：配列番号３１、ｗ／ｏ Ｈｉｓタグ：配列番号３０４）、及びＬｇＴｒｉｐ３５４６（ｗ／ Ｈｉｓタグ：配列番号５１、ｗ／ｏ Ｈｉｓタグ：配列番号３０２）が挙げられる。

【0070】

本明細書中で使用する場合、「ＳｍＴｒｉｐ１０」という用語は、例えば生物発光複合体を形成するための三元補完に利用される、β₁₀様ペプチドに対応するペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＳｍＴｒｉｐ１０またはその変異体は、生体分子との結合体化のためのスルホ－ＳＥに連結される。

【0071】

本明細書中で使用する場合、「ＳｍＴｒｉｐ９」という用語は、例えば生物発光複合体を形成するための三元補完に利用される、β₉様ペプチドに対応するペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＳｍＴｒｉｐ９またはその変異体は、生体分子との結合体化のためのスルホ－ＳＥに連結される。

【0072】

本明細書の特定の実施形態に利用される様々なペプチド及びポリペプチド配列は、米国特許第９，７９７，８８９号（参照によりこの全体を本明細書に援用する）、及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／３６８４４号（参照によりこの全体を本明細書に援用する）に記載されている。

【0073】

詳細な説明
本明細書では、スルホｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（スルホ－ＳＥ）連結型ペプチド、その合成方法、及びそのようなペプチドを生体分子の標識付けのために使用する方法を提供する。詳しくは、非アルキル基（複数可）、例えば、セリン、スレオニン、アルギニン、チロシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸を含むペプチドがスルホ－ＳＥ基で安定的に（例えば自然反応性を伴わずに）修飾され、生体分子に対する標識付けあるいは修飾を行うために使用される。

【0074】

スルホ－ＳＥペプチド（例えば、スルホ－ＳＥ基を提示しているペプチド）を合成することは、ＳＥ基とそれに結合させるペプチドとの自然反応性の可能性が高いことゆえに些細なことではない。例えば、接近可能な求核性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン、システイン、セリン、チロシンなど）がペプチド上に存在することは、ＳＥ基とそのような残基との自然反応性を招く可能性があることが当技術分野で理解されている。このため、生体分子上にアミンが露出した状態でＳＥ反応によってペプチドを生体分子に結合させることは探究されてこなかった。しかしながら、本明細書の実施形態の開発中に行った実験は、リジン及びシステイン残基が欠損している（が、他の求核性残基を含有している）ペプチドにＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）を結合させることに成功して結果的に、スルホ－ＳＥ基とペプチドとの自然反応性を後に伴うことなくペプチドのＮ末端にスルホｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（スルホ－ＳＥ）が形成されたことを実証した。スルホ－ＳＥ標識ペプチドは後に、スルホ－ＳＥ基と生体分子上の第一級アミンとの反応によって生体分子（例えば、ストレプトアビジン、抗体など）にペプチドで標識付けするために使用された。これらの実験は、スルホ－ＮＨＳとペプチド（例えば、リジン及びシステインアミノ酸が欠損しているペプチド）との反応によって安定なスルホ－ＳＥペプチドが生成して生体分子のペプチド標識付けに有用な試薬が製造され得ることを実証している。

【0075】

いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥペプチドの合成方法（図１）を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、ペプチドを（例えば適切な反応条件下（例えば、ｐＨ７．６のＰＢＳ緩衝液中）で）ビス－スルホ－ＳＥと化合させてスルホ－ＳＥ－ペプチド（例えば、スルホ－ＳＥ／ペプチド結合体）を生成させる。いくつかの実施形態では、ビス－スルホ－ＳＥは樹脂上のペプチドのＮ末端アミンと反応して樹脂上の末端標識ペプチドをもたらし、それはトリフルオロ酢酸によって樹脂から切り離された。本明細書の実施形態の開発中に行った実験は、ペプチドにおけるリジン及びシステイン残基の非存在下でスルホ－ＳＥ基がペプチドの側鎖との自然反応をしないものであることを実証している。

【0076】

いくつかの実施形態では、Ｎ末端スルホ－ＳＥ標識に対する付加に適するペプチドは、例えば、長さが４～５０（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれらの間の範囲の）アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドはシステイン残基が欠損している。いくつかの実施形態では、ペプチドはリジン残基が欠損している。いくつかの実施形態では、ペプチドは、非アルキル基を有するアミノ酸、例えば、ヒスチジン、アルギニン、セリン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸を１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくはそれより多く、またはそれらの間の範囲で）含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、チロシン、アルギニン、及び／またはグルタミン酸アミノ酸を１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくはそれより多く、またはそれらの間の範囲で）含む。

【0077】

いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥ部分を好適なペプチドに結合させるための組成物を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、ビス－スルホ－ＳＥ化合物が提供される。いくつかの実施形態では、

〔式中、Ｌは（本明細書に記載の）任意の好適なリンカーである〕
の化学構造を有する化合物を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、Ｌは、直鎖型アルキル鎖（例えば炭素数１～２０）、分岐型アルキル鎖（例えば炭素数１～２０）、直鎖型ヘテロアルキル（例えば、アルキル中にＯ、ＮまたはＳ原子を有するもの）、分岐型ヘテロアルキル、置換アルキル（例えば、好適な官能基がアルキル鎖に沿って存在するもの）、置換ヘテロアルキルなどから選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは、１～２０個の非水素原子（例えば、Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｏ及びＳ）を有する直鎖型または分岐型で環式または複素環式の飽和または不飽和構造を含み、アルキル、エーテル、チオエーテル、イミン、カルボン酸、アミン、エステル、カルボキサミド、スルホンアミド、ヒドラジン結合、カルバメート、及び芳香族または複素芳香族結合の任意の組合せからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、非水素原子２０個よりも長い（例えば、非水素原子２１個、非水素原子２５個、非水素原子３０個、非水素原子４０個、非水素原子５０個、非水素原子１００個などである）。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｏ及びＳの群から選択される１～５０個の非水素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０，４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個の非水素原子）を（水素原子に加えて）含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＣＨ₂、（ＣＨ₂）₂Ｏ及びカルバメート基の組合せを含む。例えば、連結部は、－ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ₂）₆Ｃ（Ｏ）－、または他の、本明細書に記載の官能基の任意の好適な組合せを含み得る。

【0078】

いくつかの実施形態では、（Ｒリンカー基を有するまたは有さない）スルホ－ＮＨＳ、及びそれとの反応に適したペプチド（例えば、リジン及びシステイン残基が欠損しているが任意選択的に他の１つ以上の反応性求核性アミノ酸を含有するペプチド）を含む、反応物質または反応混合物を本明細書に示す。

【0079】

いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥペプチドを本明細書に示す。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ペプチドのＮ末端上でスルホ－ＳＥ基を提示している。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ペプチドのＣ末端上でスルホ－ＳＥ基を提示している。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ペプチドの側鎖上でスルホ－ＳＥ基を提示している。いくつかの実施形態では、ペプチドは、リジン及びシステイン残基が欠損しているが任意選択的に他の１つ以上の反応性求核性アミノ酸を含有する。いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥペプチドは、ペプチドを関心対象の標的（例えば生体分子）に結合体化するための汎用試薬である。

【0080】

いくつかの実施形態では、生体分子にペプチドタグで標識付けする方法を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、生体分子は、１つ以上のアミン基（例えば第一級アミン）を提示している任意のタンパク質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、生体分子複合体、天然物、合成巨大分子などを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミン基は、生体分子の表面及び／または溶媒接近可能領域において提示されている。いくつかの実施形態では、生体分子は、１～１００個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個またはそれらの間の範囲）のアミン（例えば第一級アミン）基（例えば接近可能なアミン基）を含む。いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥペプチドの標的とするための生体分子は、タンパク質、酵素、受容体、抗体、抗体断片、ポリペプチド、毒素、サイトカイン、ポリヌクレオチド、薬物、小分子、リガンド、阻害剤、生体分子複合体（例えば、タンパク質（複数可）、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、炭水化物、脂質、小分子などから選択される１つ以上の構成要素を含むもの）、一次代謝産物、二次代謝産物及び天然物、外来生体分子、例えば医薬などである。

【0081】

いくつかの実施形態では、生体分子に反応性スルホ－ＳＥペプチドで標識付けする方法（図２）を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、（例えば、スルホ－ＳＥ基と生体分子上（例えば、生体分子の表面上、溶媒接近可能アミンなど）のアミン（例えば第一級アミン）との反応によってペプチド標識生体分子を生成させるのに適した反応条件（例えば、ｐＨ４～９、ｐＨ７～８．５（例えばＮａＨＣＯ₃溶液（ｐＨ８．５）））の下で）生体分子をスルホ－ＳＥペプチドと化合させる。

【0082】

本明細書のいくつかの実施形態は、生物発光ペプチドもしくはポリペプチド、または生物発光複合体の構成要素（例えば、１つ以上の他のペプチド／ポリペプチド構成要素との複合体を形成できるペプチド）を関心対象の生体分子に結合させる際に利用される。いくつかの実施形態では、そのような標識付けされた生体分子は、生物発光に基づくアッセイ及びプラットフォームに利用される。本明細書のいくつかの実施形態は、ＮａｎｏＬｕｃに基づく生物発光プラットフォーム、またはＮａｎｏＬｕｃに基づく生物発光補完プラットフォームを利用する（例えば、ＷＯ／２０１４／１５１７３６（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２６３５４号）及び米国仮出願第６２／６８４，０１４号を参照されたく、参照によりこれらの全体を本明細書に援用する）。

【0083】

ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）Ｂｉｎａｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮａｎｏＢｉＴ）は、生体分子相互作用研究のために設計された構造補完レポーターである。ＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）システムは、安定性及び最小限に抑えられた自己会合に関して最適化された２つの小さな非発光性サブユニットであるＬａｒｇｅ ＢｉＴ（ＬｇＢｉＴ、１８ｋＤａ）及びＳｍａｌｌ ＢｉＴ（ＳｍＢｉＴ、１１アミノ酸ペプチド）からなる。これらのサブユニットで標識付けされた２つの生体分子構成要素が近接すると、サブユニットは一緒になって活性酵素を形成し、明るい発光信号を発生させる。ＮａｎｏＢｉＴ補完パートナーのサブユニットのサイズが小さいことで、タンパク質官能性との干渉が最小限に抑えられ、明るい信号は感度のよい検出を可能にする。ＨａｌｏＴａｇ及びビオチン／ストレプトアビジンシステムは、ＮａｎｏＢｉＴ構成要素を関心対象の標的に連結するための最も一般的な方法であった（図３）。しかしながら、どちらの方法も、関心対象の標的に小さなペプチドで標識付けするのに著しい複雑さを課すものであり、また、最適な補完活性酵素を形成する上で及び明るい発光信号を生成する上でリンケージとしてのＨａｌｏＴａｇまたはストレプトアビジンの大きなサイズによる制限を受ける。

【0084】

本明細書の実施形態の開発中に行った実験は、安定な（例えば自然反応性でない）スルホ－ＳＥ／ペプチド結合体の（例えばＳｍＢｉＴペプチドを使用した）合成を実証している。１段階ＳＥタンパク質標識付けプロトコールによる生体分子（例えば、抗体、ストレプトアビジン）の第一級アミンにおけるペプチド（スルホ－ＳＥ－ＳｍＢｉＴ）でのペプチド標識付けを実証する実験も行った（図４）。

【0085】

本明細書の実施形態は、反応性スルホ－ＳＥ基をペプチドまたはポリペプチドに結合させることに利用される。スルホ－ＳＥ基は、接近可能なアミン基（例えば第一級アミン）を提示している好適な生体分子にペプチドまたはポリペプチドを結合体化することを可能にする。いくつかの実施形態では、リジン及びシステインアミノ酸が欠損している（接近可能なリジン及びシステインアミノ酸が欠損している）任意のペプチドが、本明細書に記載の方法によるスルホ－ＳＥ標識付けに適している。いくつかの実施形態では、反応性求核性アミノ酸（例えば、セリン、スレオニン、アルギニン、チロシン、グルタミン酸、アスパラギン酸）を１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多く）含むペプチドでさえ、本明細書に記載の方法によるスルホ－ＳＥ標識付けを受けることができる。

【0086】

いくつかの実施形態では、ペプチド上のＳＥ－スルホ基は、生物発光補完システムに用いるべくペプチドを生体分子または他の被分析物に結合させるために利用される。いくつかの実施形態では、ペプチド及びポリペプチド構成要素が補完の非存在下で非発光性である、及び／またはペプチドまたはポリペプチド構成要素の生物発光が補完によって増強される。いくつかの実施形態では、標的被分析物結合剤（例えば、抗体、抗体断片など）を、本明細書に記載の生物発光複合体のスルホ－ＳＥタグ付きペプチド構成要素で標識付けする。例えば、本開示の実施形態は、ＮａｎｏＬｕｃに基づく技術（例えば、ＮａｎｏＢｉｔ、ＮａｎｏＴｒｉｐ、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ、ＮａｎｏＢＲＥＴなど）を標的被分析物検出アッセイに組み込むためにスルホ－ＳＥ標識付けを利用する。

【0087】

いくつかの実施形態では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓのルシフェラーゼ、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；米国特許第８，５５７，９７０号、米国特許第８，６６９，１０３号；参照によりこれらの全体を本明細書に援用する）、及び／またはＮａｎｏＢｉＴ（Ｕ．Ｓ．９，７９７，８８９；参照によりこの全体を本明細書に援用する）もしくはＮａｎｏＴｒｉｐ（米国仮出願第６２／６８４，０１４；参照によりこの全体を本明細書に援用する）に（例えば、構造的に、機能的になど）基づく（ペプチド（複数可）及び／またはポリペプチド構成要素の）生物発光ポリペプチド及び／または生物発光複合体を組み込むためにスルホ－ＳＥペプチドを使用するアッセイ及びプラットフォームを本明細書に示す。以下に記載されるように、いくつかの実施形態では本明細書のアッセイ、装置及びシステムは市販のＮａｎｏＬｕｃに基づく技術（例えば、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ、ＮａｎｏＢＲＥＴ、ＮａｎｏＢｉＴ、ＮａｎｏＴｒｉｐ、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏなど）を組み込んでいるが、他の実施形態では市販のＮａｎｏＬｕｃに基づく技術からの様々な組合せ、変形形態または派生形態を採用する。

【0088】

ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３３４４９号、米国特許第８，５５７，９７０号、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／２０１１／０５９０１８号及び米国特許第８，６６９，１０３号（参照によりこれらの各々の全体をあらゆる目的のために本明細書に援用する）には、生物発光ポリペプチドを含む組成物及び方法が記載されており、そのようなポリペプチドは本明細書の実施形態に利用され、本明細書に記載のアッセイ及び方法と共に使用され得る。

【0089】

ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／２６３５４号及び米国特許第９，７９７，８８９号（参照によりこれらの各々の全体をあらゆる目的のために本明細書に援用する）には、生物発光複合体を（例えばＮａｎｏＢｉＴシステムによって）組み立てるための組成物及び方法が記載されており、そのような複合体、ならびにそのペプチド及びポリペプチド構成要素は本明細書の実施形態に利用され、本明細書に記載のアッセイ及び方法と共に使用され得る。いくつかの実施形態では、関心対象の生体分子に連結させるための反応性ペプチドを作り出すために、ペプチドのスルホ－ＳＥタグ付けを用いる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて任意のＮａｎｏＢｉＴ系ペプチドまたはポリペプチドを、結合要素、または他の本明細書に記載のアッセイ及びシステムの構成要素に連結する（例えば、融合させる、化学的に連結するなど）。

【0090】

いくつかの実施形態では、配列番号１０（ＳｍＢｉＴ）との少なくとも６０％（例えば、０６％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有するが配列番号１、配列番号４、配列番号５及び配列番号８との１００％未満（例えば、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満）の配列同一性を有するペプチドを本明細書に示す。いくつかの実施形態では、そのようなペプチドをビス－スルホ－ＳＥと反応させてスルホ－ＳＥペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、配列番号１０（ＳｍＢｉＴ）との少なくとも６０％（例えば、０６％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれらの間の範囲）の配列同一性を含むが配列番号１、配列番号４、配列番号５及び配列番号８との１００％未満（例えば、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満）の配列同一性を含む（Ｎ末端で標識付けする）スルホ－ＳＥペプチドであって、リジンもシステインも含まない当該ペプチドを本明細書に示す。いくつかの実施形態では、配列番号１０（ＳｍＢｉＴ）を含むスルホ－ＳＥペプチドであって、リジンもシステインも含まない当該ペプチドを本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、生体分子上に提示されているアミンにそのようなペプチドを結合体化する方法を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、ペプチド上のスルホ－ＳＥ基と生体分子上のアミンとの反応の後にそのようなペプチドを提示している生体分子を本明細書に示す。本明細書に記載の方法を用いる、本明細書に記載のアッセイ及びシステム。

【0091】

いくつかの実施形態では、配列番号９（ＬｇＢｉＴ）との少なくとも６０％（例えば、０６％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有するが配列番号１、配列番号２、配列番号５及び配列番号６との１００％未満（例えば、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満）の配列同一性を有するポリペプチドを本明細書に示す。いくつかの実施形態では、生物発光のためのそのようなポリペプチドは、（ペプチド上のスルホ－ＳＥ基と生体分子上のアミンとの反応の後に）生体分子上に提示されている相補体ペプチドと複合体化する。

【0092】

参照により全体があらゆる目的のために本明細書に援用される米国仮出願第６２／６８４，０１４号には、生物発光複合体を（例えばＮａｎｏＴｒｉｐシステムによって）組み立てるための組成物及び方法が記載されており、そのような複合体、ならびにそのペプチド及びポリペプチド構成要素は本明細書の実施形態に利用され、本明細書に記載のアッセイ及び方法と共に使用され得る。いくつかの実施形態では、関心対象の生体分子に連結させるための反応性ペプチドを作り出すために、ペプチドにスルホ－ＳＥを結合させることを用いる。いくつかの実施形態では、上記ＮａｎｏＴｒｉｐ系ペプチドまたはポリペプチドのいずれかを、結合要素、または他の本明細書に記載のアッセイ及びシステムの構成要素に連結する（例えば、融合させる、化学的に連結するなど）。

【0093】

いくつかの実施形態では、配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）との少なくとも６０％（例えば、０６％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有するが配列番号１、配列番号４、配列番号５及び配列番号８との１００％未満（例えば、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満）の配列同一性を有するペプチドを本明細書に示す。いくつかの実施形態では、そのようなペプチドをビス－スルホ－ＳＥと反応させてスルホ－ＳＥペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）との少なくとも６０％（例えば、０６％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれらの間の範囲）の配列同一性を含むが配列番号１、配列番号４、配列番号５及び配列番号８との１００％未満（例えば、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満）の配列同一性を含む（Ｎ末端で標識付けする）スルホ－ＳＥペプチドであって、リジンもシステインも含まない当該ペプチドを本明細書に示す。いくつかの実施形態では、リジン及びシステインを含まない配列番号１１（ＨｉＢｉＴ）の変異体を含むスルホ－ＳＥペプチドであって、リジンもシステインも含まない（例えば、任意のＣまたはＫ残基が保存的に置換されている）当該ペプチドを本明細書に示す。いくつかの実施形態では、生体分子上に提示されているアミンにそのようなペプチドを結合体化する方法を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、ペプチド上のスルホ－ＳＥ基と生体分子上のアミンとの反応の後にそのようなペプチドを提示している生体分子を本明細書に示す。

【0094】

いくつかの実施形態では、配列番号１３（ＳｍＴｒｉｐ９）との少なくとも６０％（例えば、０６％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有するが配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号７との１００％未満（例えば、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満）の配列同一性を有するペプチドを本明細書に示す。いくつかの実施形態では、そのようなペプチドをビス－スルホ－ＳＥと反応させてスルホ－ＳＥペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、配列番号１３（ＳｍＴｒｉｐ９）との少なくとも６０％（例えば、０６％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれらの間の範囲）の配列同一性を含むが配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号７との１００％未満（例えば、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満）の配列同一性を含む（Ｎ末端で標識付けする）スルホ－ＳＥペプチドであって、リジンもシステインも含まない当該ペプチドを本明細書に示す。いくつかの実施形態では、配列番号１３（ＳｍＴｒｉｐ９）を含むスルホ－ＳＥペプチドであって、リジンもシステインも含まない（例えば、任意のＣまたはＫ残基が保存的に置換されている）当該ペプチドを本明細書に示す。いくつかの実施形態では、生体分子上に提示されているアミンにそのようなペプチドを結合体化する方法を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、ペプチド上のスルホ－ＳＥ基と生体分子上のアミンとの反応の後にそのようなペプチドを提示している生体分子を本明細書に示す。

【0095】

いくつかの実施形態では、配列番号１４（β９／β１０ジペプチド）との少なくとも６０％（例えば、０６％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有するが配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７及び配列番号８との１００％未満（例えば、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満）の配列同一性を有するペプチドを本明細書に示す。いくつかの実施形態では、そのようなペプチドをスルホ－ＮＨＳと反応させてスルホ－ＳＥペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、配列番号１４（β９／β１０ジペプチド）との少なくとも６０％（例えば、０６％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれらの間の範囲）の配列同一性を含むが配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７及び配列番号８との１００％未満（例えば、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満）の配列同一性を含む（Ｎ末端で標識付けする）スルホ－ＳＥペプチドであって、リジンもシステインも含まない当該ペプチドを本明細書に示す。いくつかの実施形態では、配列番号１４（β９／β１０ジペプチド）を含むスルホ－ＳＥペプチドであって、リジンもシステインも含まない（例えば、任意のＣまたはＫ残基が保存的に置換されている）当該ペプチドを本明細書に示す。いくつかの実施形態では、生体分子上に提示されているアミンにそのようなペプチドを結合体化する方法を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、ペプチド上のスルホ－ＳＥ基と生体分子上のアミンとの反応の後にそのようなペプチドを提示している生体分子を本明細書に示す。

【0096】

いくつかの実施形態では、リジン及びシステインを含まない配列番号１２（ＬｇＴｒｉｐ）の変異体との少なくとも６０％（例えば、０６％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有するが配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６及び配列番号９との１００％未満（例えば、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満）の配列同一性を有するポリペプチドを本明細書に示す。いくつかの実施形態では、生物発光のためのそのようなポリペプチドは、（ペプチド上のスルホ－ＳＥ基と生体分子上のアミンとの反応の後に）生体分子上に提示されている相補体ペプチドと複合体化する。

【0097】

いくつかの実施形態では、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６のうちの１つ以上との少なくとも６０％（例えば、０６％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有するペプチドを本明細書に示す。いくつかの実施形態では、ペプチドは、本明細書で提供される任意の天然に存在する配列（例えば配列番号１～４）または市販されている配列（例えば配列番号５～８）との１００％未満（例えば、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満）の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、そのようなペプチドをビス－スルホ－ＳＥと反応させてスルホ－ＳＥペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６のうちの１つ以上との少なくとも６０％（例えば、０６％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれらの間の範囲）の配列同一性を含むが配列番号１、配列番号４、配列番号５及び配列番号８との１００％未満（例えば、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満）の配列同一性を含む（Ｎ末端で標識付けする）スルホ－ＳＥペプチドであって、リジンもシステインも含まない当該ペプチドを本明細書に示す。いくつかの実施形態では、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６を含むスルホ－ＳＥペプチドであって、リジンもシステインも含まない当該ペプチドを本明細書に示す。いくつかの実施形態では、生体分子上に提示されているアミンにそのようなペプチドを結合体化する方法を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、ペプチド上のスルホ－ＳＥ基と生体分子上のアミンとの反応の後にそのようなペプチドを提示している生体分子を本明細書に示す。

【0098】

生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システム及び方法（例えばＮａｎｏＬｕｃに基づく技術を組み込んだもの）について記載しているＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／７４７６５号及び米国特許出願第１５／２６３，４１６号（参照によりこれらの全体をあらゆる目的のために本明細書に援用する）に開示されているように、これらのシステム及び方法、ならびに生物発光ポリペプチド及びその蛍光団結合体化構成要素は本明細書の実施形態に利用され、本明細書に記載のアッセイ及び方法と共に使用され得る。

【0099】

いくつかの実施形態では、ＮａｎｏＬｕｃ系、ＮａｎｏＢｉＴ系及び／またはＮａｎｏＴｒｉｐ系ペプチド（例えば、スルホ－ＳＥペプチド、生体分子結合体化ペプチドなど）、ポリペプチド、複合体、融合体及び結合体のいずれかは、本明細書に記載のアッセイ、方法、装置及びシステムに関するＢＲＥＴに基づく用途に利用され得る。例えば、本明細書に記載のスルホ－ＳＥ技術によってＳｍＢｉＴペプチド（または他の本明細書に記載のＮａｎｏＢｉＴ系またはＮａｎｏＴｒｉｐ系ペプチド）を生体分子に連結し；ペプチドをシステムの他の１つ以上の構成要素に接触または近接させたとき（例えば、何らかの関心対象の標的に連結したとき、結合剤に連結したとき）に生物発光複合体が形成され；生物発光複合体を蛍光分子に近接または接触させたとき（例えば、何らかの関心対象の標的に連結したとき、結合剤に連結したとき）にＢＲＥＴが検出される。いくつかの実施形態では、ＮａｎｏＬｕｃ系、ＮａｎｏＢｉＴ系及び／またはＮａｎｏＴｒｉｐ系ポリペプチド、ペプチドまたは複合体の発光スペクトルは、蛍光分子（例えば蛍光団）の励起スペクトルと重複する。いくつかの実施形態では、蛍光分子（例えば蛍光団）はエネルギー受容体である。本明細書中で使用する場合、「エネルギー受容体」という用語は、任意の小分子（例えば発色団）、巨大分子（例えば自家蛍光タンパク質、フィコビリタンパク質、ナノ粒子、表面など）、またはエネルギー吸収（例えば共鳴エネルギー移動）に応答して容易に検出できる信号を生成する分子複合体を指す。特定の実施形態では、エネルギー受容体は、蛍光団または他の検出可能な発色団である。好適な蛍光団としては、キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオジン、テキサスレッドなど）、シアニン誘導体（例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニンなど）、ナフタレン誘導体（例えば、ダンシル及びプロダン誘導体）、オキサジアゾール誘導体（例えば、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾールなど）、ピレン誘導体（例えばカスケードブルー）、オキサジン誘導体（例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、クリスタルバイオレット、オキサジン１７０など）、アクリジン誘導体（例えば、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエローなど）、アリールメチン誘導体（例えば、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーンなど）、テトラピロール誘導体（例えば、ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビンなど）、ＣＦ染料（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＬＥＸＡ ＦＬｕｏＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＹＬＩＧＨＴ ＦＬＵＯＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｅｒｃｅ）、ＡＴＴＯ及びＴＲＡＣＹ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）、ＤＹ及びＭＥＧＡＳＴＯＫＥＳ（Ｄｙｏｍｉｃｓ）、ＳＵＬＦＯ ＣＹ染料（ＣＹＡＮＤＹＥ、ＬＬＣ）、ＳＥＴＡＵ ＡＮＤ ＳＱＵＡＲＥ ＤＹＥＳ（ＳＥＴＡ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ）、ＱＵＡＳＡＲ、及びＣＡＬ ＦＬＵＯＲ染料（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳＵＲＥＬＩＧＨＴ ＤＹＥＳ（ＡＰＣ、ＲＰＥ、ＰｅｒＣＰ、Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｓｏｍｅｓ）（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ、ＡＰＣＸＬ、ＲＰＥ、ＢＰＥ（Ｐｈｙｃｏ－Ｂｉｏｔｅｃｈ）、自家蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ）、量子ドットナノ結晶などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、蛍光団は、ローダミン類縁体（例えばカルボキシローダミン類縁体）、例えば、参照により全体が本明細書に援用される米国特許出願第１３／６８２，５８９号に記載されているものである。

【0100】

上記のとおり、本明細書に記載の標識付け技術は生物発光ペプチド、ポリペプチド及び複合体に関する用途に限定されない。むしろ、本明細書の組成物、方法及びシステムは、ペプチド（例えば、リジン及びシステイン残基が欠損しているペプチド）を生体分子または材料に結合させるための全般的システムとして利用される。本明細書において生成されるペプチド結合体化生体分子は、様々なシステム、反応、試薬、プラットフォーム及びアッセイに利用される。

【0101】

本明細書に記載の技術の特定の用途は、リガンド結合及び／またはイムノアッセイに使用するためにペプチドを生体分子（例えば、抗体、抗体断片、抗原など）に連結することである。いくつかの実施形態では、本明細書の組成物及び方法は、イムノアッセイのペプチド構成要素（例えば、抗原、生物発光複合体の構成要素など）を他のイムノアッセイ構成要素（例えば、抗体、抗体断片、抗原など）に結合させることに利用される。本明細書の実施形態は、様々なイムノアッセイ、例えば、競合的イムノアッセイ、直接的イムノアッセイ、間接的イムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチイムノアッセイ、併行的イムノアッセイ（例えば米国出願第１５／５８９，５５７号を参照されたい；参照によりこの全体を本明細書に援用する）などのための試薬の調製に利用され、及び／またはそれらのステップに含められる。様々な実施形態において、スルホ－ＳＥペプチドタグ（例えば、β９様（例えばＳｍＴｒｉｐ９）及びβ１０様（例えばＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、β９／β１０様ジペプチドなど）は一次または二次抗体と（例えば第一級アミンにおいて）係留／融合されて特定の被分析物の検出方法を提供する。別の例を挙げると、スルホ－ＳＥペプチドタグは抗体結合タンパク質（例えばプロテインＡまたはプロテインＧ）と係留／融合され、特定の被分析物に結合した特異抗体（例えば、被分析物が相補ペプチドタグに結合しているもの）を検出するために使用される。別の例を挙げると、スルホ－ＳＥペプチドタグは、ストレプトアビジンと係留／融合され、特定の被分析物に結合したビオチン化特異抗体（例えば、被分析物が相補ペプチドタグに結合しているもの）を検出するために使用される。さらに別の例を挙げると、スルホ－ＳＥペプチドタグは一次または二次抗体と係留／融合されており、一次抗体が特定の被分析物を認識し、二次抗体が一次抗体を認識する。さらに別の例を挙げると、スルホ－ＳＥペプチドタグは、被分析物と係留／融合され、競合的サンドイッチＥＬＩＳＡ形式に使用される。被分析物と係留／融合され結合体化されたスルホ－ＳＥペプチドタグは、被分析物に結合できる抗体を検出するためにも使用され得る。

【0102】

本明細書の様々な実施形態は、イムノアッセイによる小分子または他の生体分子の検出に利用される。例示的な実施形態は、本明細書に記載の第１のスルホ－ＳＥペプチドタグ（例えば、生物発光複合体の第１のペプチド構成要素）で直接標識付けされた（例えば標的小分子と同一のまたは類似した）小分子または他の生体分子の使用を含み、標的小分子または生体分子との結合部分は、本明細書に記載の第２のスルホ－ＳＥペプチドタグ（例えば、生物発光複合体の第２のペプチド構成要素）と融合または連結される。検出試薬（例えば、生物発光複合体のポリペプチド構成要素、及び基質（例えばセレンテラジンまたはセレンテラジン類縁体））の存在下では生物発光信号がシステムによって生成される。システムを試料（例えば、生物試料、環境試料など）に曝露したとき、小分子または生体分子標的が試料中に存在する場合には生物発光信号が減少することになる（標識付けされた小分子または生体分子が競合によって複合体から排除されることになり、場合によって、小分子または生体分子標的の定量が可能となる）。そのようなアッセイの代替構成（例えば、単一のスルホ－ＳＥ構成要素を含んでいる生体分子複合体）も本明細書の範囲に含まれる。

【0103】

いくつかの実施形態では、イムノアッセイの被分析物は、毒素（例えばマイコトキシンなど）、代謝産物（例えば、アミノ酸、グルコース分子、脂肪酸、ヌクレオチド、コレステロール、ステロイドなど）、ビタミン（例えば、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＨまたはビタミンＫなど）、補酵素または補因子（例えば、補酵素Ａ、補酵素Ｂ、補酵素Ｍ、補酵素Ｑ、シチジン三リン酸、アセチル補酵素Ａ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニン（ＮＡＤ＋）、ヌクレオチドアデノシン一リン酸、ヌクレオチドアデノシン三リン酸、グルタチオン、ヘム、リポアミド、モリブドプテリン、３’－ホスホアデノシン－５’－ホスホ硫酸、ピロロキノリンキノン、テトラヒドロビオプテリンなど）、バイオマーカーまたは抗原（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、フェリチン、葉酸、ヘモグロビン、アルカリホスファターゼ、トランスフェリン、アポリポタンパク質Ｅ、ＣＫ、ＣＫＭＢ、副甲状腺ホルモン、インスリン、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）、サイトカイン、シトクロムＣ、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩ、アポリポタンパク質ＢＩ、アポリポタンパク質Ｂ－１００、アポリポタンパク質Ｂ４８、アポリポタンパク質ＣＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、トリグリセリド、ＨＤコレステロール、ＬＤＬコレステロール、レシチンコレステリルアシルトランスフェラーゼ、パラキソナーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ＣＥＡ、ＨＥＲ－２、膀胱腫瘍抗原、サイログロブリン、アルファフェトタンパク質、ＰＳＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１９．９、ＣＡ１５．３、レプチン、プロラクチン、オステオポンチン、ＣＤ９８、ファシン、トロポニンＩ、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＣＤ３３、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＡなど）、薬物（カンナビノイド（例えば、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、カンナビジオール（ＣＢＤ）及びカンナビノール（ＣＢＮ）など）、オピオイド（例えば、ヘロイン、オピウム、フェンタニルなど）、興奮薬（例えば、コカイン、アンフェタミン、メタンフェタミンなど）、クラブドラッグ（例えば、ＭＤＭＡ、フルニトラゼパム、ガンマ－ヒドロキシブチレートなど）、解離性薬物（例えば、ケタミン、フェンサイクリジン、サルビア、デキストロメトルファンなど）、幻覚剤（例えば、ＬＳＤ、メスカリン、シロシビンなど）など）、爆薬（例えば、２，４，６－トリニトロトルエン（ＴＮＴ）及びヘキサヒドロ－１，３，５－トリニトロ－１，３，５－トリアジン（ＲＤＸ）、四硝酸ペンタエリスリトール（ＰＥＴＮ）など）、毒性化学物質（例えば、タブン（ＧＡ）、サリン（ＧＢ）、ソマン（ＧＤ）、シクロサリン（ＧＦ）、２－（ジメチルアミノ）エチルＮ，Ｎ－ジメチルホスホルアミドフルロイデート（ＧＶ）、ＶＥ、ＶＧ、ＶＭ、ＶＰ，ＶＲ、ＶＳまたはＶＸ神経剤）などである。

【0104】

いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥペプチドを被分析物に結合させる。いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥペプチドを被分析物に対する抗体または抗体断片に結合させる。いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥペプチドをストレプトアビジンに結合させる。いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥペプチドをＨａｌｏＴａｇに結合させる。いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥペプチドを固体表面に結合させる。様々なイムノアッセイまたは他のアッセイが、そのような試薬を使用して行われ得、本明細書の範囲に含まれる。

【0105】

本明細書のスルホ－ＳＥペプチド、及びスルホ－ＳＥペプチドで標識付けされた生体分子（及びそれらの調製方法）は、多様な用途及び形式に利用される。以下は、本明細書に記載のシステムを利用する方法及び形式の非網羅的で例示的な例である：
・従来のトランスフェクションによって融合体として発現したペプチド標識タンパク質、またはＣＲＩＳＰＲによって内因的にタグ付けされたタンパク質を使用する、動的タンパク質間相互作用分析のための細胞内２タンパク質システム；
・従来のトランスフェクションによって融合体として発現した、またはＣＲＩＳＰＲによって生成した内因的にタグ付けされたタンパク質として発現したペプチド標識タンパク質を使用する、動的タンパク質間相互作用分析のための細胞内３タンパク質システム；
・信号の増加による被分析物測定（例えば、診断検査、非細胞的など）のための標的特異的アッセイ；
・信号の減少による被分析物測定（例えば、診断検査、非細胞的など）のための標的特異的競合アッセイ；
・ペプチドタグで標識付けされた認識要素を使用する、単一の被分析物または複数の被分析物の検出／定量のための均一系アッセイ；
・液体／液相または固相における被分析物（複数可）の検出。
・表面（例えば、プレート（例えばマイクロタイタープレート）、紙（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓａｖｅｒ ９０３カード）、プラスチック、スワブ、キュベット、膜（例えば、ＰＶＤＦ、ニトロセルロースなど））に基づくアッセイなど；
・側方流動及び他の毛細管駆動に基づく方法；
・液相のためのプレートに基づくアッセイ（例えば、多重化されたドットブロット／スポットアレイアッセイ形式で実施されるもの）；
・エアロゾルに基づく検出；
・核酸の等温増幅；
・核酸の高速周期的ＰＣＲ検出；
・タンパク質間相互作用の検出；
・不均一溶液における非変性タンパク質の検出；
・ペプチドタグ付き相補認識要素は核酸標的配列と縦並びにハイブリダイズする；
・検出／定量のための生物発光またはＢＲＥＴを利用するＦＩＳＨに似た用途；
・核酸（例えば、一本鎖及び／または二本鎖ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）の検出；
・ラボオンチップ及び／またはマイクロ流体用途；
・不均一系アッセイ、例えばイムノアッセイ（例えば、均一系イムノアッセイ分析と組み合わせたＰＣＲ増幅）；
・その他

【0106】

本明細書の実施形態は、スルホ－ＳＥペプチド及びそれで標識付けされた生体分子の最終的用途に限定されない。

【0107】

本明細書の実施形態は、（例えばスルホ－ＳＥ基で標識付けされた）ペプチドを様々な生体分子に連結するのに有用なものとして記載されているが、本明細書の実施形態はそのように限定されない。いくつかの実施形態では、スルホ－ＳＥペプチドを他の分子、分子実体、材料などと反応させることを、それに対する当該ペプチドの連結及び／または固定のために行う。例えば、本明細書に記載の化学及び試薬を用いて、アミン基を提示している固体表面（例えば、ビーズ（例えば磁気ビーズ）、チップ、チューブ、プレート、粒子、膜、紙など）にスルホ－ＳＥペプチドを結合させてもよい。

【実施例】

【0108】

スルホ－ＳＥ ＳｍＢｉＴペプチドの合成、スルホＳＥとペプチドとの種々のリンカーによる結合体化、ならびにスルホ－ＳＥ－ＳｍＢｉＴと他の部分、例えば蛍光団との結合体化を実証して、様々な抗原のペプチド－スルホ－ＳＥ標識付けの実用性、及び様々な標的抗原を使用する様々なアッセイ形式におけるそのような標識抗原の有用性、直接的ペプチド標識付けの有用性などを実証するために、本明細書の実施形態の開発中に実験を行った。これらの実験は、本発明の技術の有用な用途の幅の一部を実証しているが、本明細書の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。

【0109】

実施例１
スルホＳＥ－ＳｍＢｉＴペプチド（７６４９）

Ｓｍａｌｌ Ｂｉｔペプチド（ＶＴＧＹＲＬＦＥＥＩＬ、６ｍｇ、０．００４５ｍｍｏｌ）を最小限の量のＤＭＦに溶解させ、その後、ＢＳ３（ビス（スルホスクシンイミジルスベレート）（１３ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）のリン酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ＝７．４）溶液に添加した。反応混合物を１時間撹拌し、そのまま分取ＨＰＬＣによって精製した。計算値：ｍ／ｚ＝１６７２．７９［Ｍ＋Ｈ］⁺、測定値（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝１６７２．７５。

【0110】

実施例２
スルホＳＥ－ＳｍＴｒｉｐ９（６９１）（７９６２）

７６４９と同じ方法によって７９６２を合成した。計算値：ｍ／ｚ＝１７０７．８５［Ｍ＋Ｈ］⁺、測定値（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝１７０７．７５。

【0111】

実施例３
スルホＳＥ－ＳｍＴｒｉｐ９（８２４）（８０８４）

７６４９と同じ方法によって８０８４を合成した。計算値：ｍ／ｚ＝１００６．９９［Ｍ＋２Ｈ］²⁺、測定値（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝１００６．３２［Ｍ＋２Ｈ］²⁺。

【0112】

実施例４
スルホＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（６９３）（８１３４）
ＰＥＧ３ビススルホ－ＳＥ

３，３’－（（オキシビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（オキシ））ジプロピオン酸（５５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦに溶解させ、その後、ジイソプロピルエチルアミン（１２０ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（１７６ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を５分間撹拌した。その間に、Ｎ－ヒドロキシ－２，５－ジオキソピロリジン－３－スルホン酸（９０ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を５ｍｌのＤＭＳＯに溶解させ、その後、先の溶液に滴加した。ＬＣ－ＭＳが酸の消失を示すまで、混合物をもう１時間撹拌した。溶液をそのまま次のステップに使用した。計算値：ｍ／ｚ＝６０３．０５［Ｍ^-］、測定値（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝６０３．０４［Ｍ^-］。

【0113】

スルホＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（６９３）（８１３４）

ＳｍＴｒｉｐ９（６９３）ペプチドＴｒｉｐ５２１（ＧＲＭＬＦＲＶＴＩＮＳＷＲ、２７ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解させた。その後、溶液を先のＰＥＧ３ビススルホ－ＳＥ溶液に添加した。その後、混合物をもう１時間撹拌し、そのまま分取ＨＰＬＣによって精製した。計算値：ｍ／ｚ＝１０２２．９８［Ｍ＋２Ｈ］²⁺、測定値（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝１０２３．０９［Ｍ＋２Ｈ］²⁺。

【0114】

実施例５
スルホＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（６９１）（８１１８）

８１３４と同じ方法によって８０８４を合成した。計算値：ｍ／ｚ＝８９２．９３［Ｍ＋２Ｈ］²⁺、測定値（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝８９３．６１［Ｍ＋２Ｈ］²⁺。

【0115】

実施例６
スルホＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（８９５）－ＴＡＭＲＡ（８１６０）

８１３４と同じ方法によって８１６０を合成した。計算値：ｍ／ｚ＝１０１６．５１［Ｍ＋２Ｈ］²⁺、測定値（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝１０１６．９２［Ｍ＋２Ｈ］²⁺。

【0116】

実施例７
スルホＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（９３８）－ＴＡＭＲＡ（８１３６）
ＴＡＭＲＡ－マレイミド

５－ＴＡＭＲＡ（５０ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン（４５ｍｇ、０．１２８ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＴＳＴＵ（３８ｍｇ、０．１２８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２０分間撹拌し、１－（２－アミノエチル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン（１８ｍｇ、０．１２８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物をもう１時間撹拌し、そのまま分取ＨＰＬＣによって精製した。計算値：ｍ／ｚ＝５５３．２０［Ｍ＋Ｈ］⁺、測定値（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝５５３．４０。

【0117】

ＳｍＴｒｉｐ９（９３８）－ＴＡＭＲＡ

ＴＡＭＲＡ－マレイミド（８ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解させた。ＳｍＴｒｉｐ９（９３８）（ＧＲＭＬＦＲＶＴＩＮＳＷＲＣ、２５ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、２００ｍＭ）溶液を添加した。反応混合物を２時間撹拌し、そのまま分取ＨＰＬＣによって精製した。計算値：ｍ／ｚ＝１１４６．０５［Ｍ＋２Ｈ］²⁺、測定値（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝１１４６．３３［Ｍ＋２Ｈ］²⁺。

【0118】

スルホＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（９３８）－ＴＡＭＲＡ（８１３６）

ＳｍＴｒｉｐ９（９３８）－ＴＡＭＲＡ（８．５ｍｇ、０．００３８ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解させた。その後、溶液を、実施例２に示すとおりに調製されたＰＥＧ３ビスＳｕｌｆｏ－ＳＥに添加した。反応混合物を２時間撹拌し、そのまま分取ＨＰＬＣによって精製した。計算値：ｍ／ｚ＝９０１．０５［Ｍ＋３Ｈ］³⁺、測定値（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝９０１．２０［Ｍ＋３Ｈ］³⁺。

【0119】

実施例８
スルホＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（９３７）－ＴＡＭＲＡ（８１３５）

８１３６と同じ方法によって８１３５を合成した。計算値：ｍ／ｚ＝８１４．０３［Ｍ＋３Ｈ］³⁺、測定値（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝８１４．４０［Ｍ＋３Ｈ］³⁺。

【0120】

実施例９
スルホＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（９３９）－ＴＡＭＲＡ（８１６１）

８１３６と同じ方法によって８１６１を合成した。計算値：ｍ／ｚ＝８９６．６１［Ｍ＋３Ｈ］³⁺、測定値（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝８９７．１１［Ｍ＋３Ｈ］³⁺。

【0121】

実施例１０
例示的な標的被分析物とのスルホ－ＳＥ－ＳｍＢｉＴ結合体化
スルホ－ＳＥ－ＳｍＢｉＴ（７６４９）を６ｍＭの濃度でＤＭＦに溶解させた。２０倍のモル比の量を、１ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧのｐＨ８．２ ホウ酸塩緩衝液溶液に添加した。反応物を室温で１時間混合した。未反応のスルホ－ＳＥ－ＳｍＢｉＴを脱塩カラムによって除去した。

【0122】

実施例１１
直接的イムノアッセイ：マウスＩｇＧの検出
１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング剤を含有するＰＢＳの中に抗マウスＩｇＧ－スルホ－ＳＥ－ＳｍＢｉＴ結合体を含んだ溶液を調製した。これを、等濃度の抗マウスＩｇＧ－ＨＴ－ＬｇＢｉＴ結合体を含んだ等体積の同じく１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング剤を含有するＰＢＳに添加した。混合物を白色の非結合性９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに分注した。１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング剤を含有するＰＢＳでマウスＩｇＧを段階希釈し、抗マウスＩｇＧ－スルホ－ＳＥ－ＳｍＢｉＴ結合体と等しい体積でプレートのウェルに加えた。プレートをプレート振盪台上に３０分間置いた。ＬＣＳ Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）検出試薬を添加し、発光を読み取った。比較目的のために、このアッセイは、抗マウスＩｇＧ－スルホ－ＳＥ－ＳｍＢｉＴ結合体の代わりとしての抗マウスＨＴ－ＳｍＢｉｔも含んでいた。

【0123】

実施例１２
間接的イムノアッセイ：ＩＦＮγの検出
間接的イムノアッセイを用いてＩＦＮγを検出した。ＩＦＮγに対する抗体の対を使用した。片方の抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であったが、もう片方はビオチン化ポリクローナル抗体（ｐＡｂ－ビオチン）であった。抗体の対を抗マウスＩｇＧ－ＬｇＢｉＴ及びＳａｖ－ＳｍＢｉＴ（ＨａｌｏＴａｇ、またはスルホ－ＳＥ－ＳｍＢｉＴ）と混合して検出試薬を作った。検出試薬をＩＦＮγに添加し、３０～６０分間インキュベートした。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）基質を添加し、プレートをＧｌｏｍａｘ（登録商標）発光光度計で読み取った。

【0124】

実施例１３
競合的イムノアッセイ：フモニシン
Ｓａｖ－ＳｍＢｉＴ（ＨａｌｏＴａｇ、またはスルホ－ＳＥ－ＳｍＢｉＴ）とビオチン化フモニシンとを化合させてフモニシン－ＳＡｖ－ＳｍＢｉＴ結合体を生成することによってフモニシン「追跡子」を調製した。この「追跡子」を、１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング剤を含有するＰＢＳで１ｕｇ／ｍｌに希釈し、白色の非結合性９６ウェルマイクロタイタープレートに添加した。標識付けされていないフモニシンを、１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング剤を含有するＰＢＳで段階希釈し、等しい体積でプレートのウェルに加えた。１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング剤を含有するＰＢＳの中に抗フモニシン－ＬｇＢｉＴを含んだものを調製し、等しい体積でプレートのウェルに加えた。プレートをプレート振盪台上に３０分間置いた。ＬＣＳ Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）検出試薬を添加し、発光を読み取った。

【0125】

実施例１４
ＦｃＲｎ結合アッセイ
ＦｃＲｎ－ＡｖｉｔａｇとＳａｖ－ＳｍＢｉＴ（ＨａｌｏＴａｇ、またはスルホ－ＳＥ－ＳｍＢｉＴ）とを混合してＦｃＲｎ－ＳｍＢｉＴ試薬を作った。２５ｕｌのヒトＩｇＧ１－ＬｇＢｉＴ追跡子、２５ｕｌのヒトＩｇＧ試料、及び５０ｕｌのＦｃＲｎ－ＳｍＢｉＴを一緒に３０分間、室温でインキュベートした。試薬及び試料を、１０％のｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋを含有するｐＨ６．０のＰＢＳで希釈した。ｐＨ６．０の希釈用緩衝液で希釈したＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）基質を添加し、プレートをＧｌｏｍａｘ（登録商標）発光光度計で読み取った。

【0126】

実施例１５
リンカーを組み込まずにスルホ－ＳＥペプチド部分を有するＮａｎｏＴｒｉｐで直接標識付けされた抗体の対を使用するヒト組換えＩＬ－６の生物発光定量
ヒトＩＬ－６の定量のための、直接ＮａｎｏＴｒｉｐペプチドに化学的に結合体化されたモノクローナル抗体の対の使用を実証するために、本明細書の実施形態の開発中に実験を行った。このモデルシステムは、異なるエピトープでＩＬ－６を認識する２つのモノクローナルマウス抗体から構成される。スルホ－ＳＥ－ＳｍＴｒｉｐ９（８２４）（配列番号２５）を片方の抗体に化学的に結合体化し、スルホ－ＳＥ－ＳｍＴｒｉｐ１０（６９１）（配列番号２３）をもう片方の抗体に化学的に結合体化した。ＩＬ－６の存在下で２つの抗体はＩＬ－６に結合し、かくして２つのタグを近接させる。ＬｇＴｒｉｐ（３５４６）（配列番号１２）の添加によって補完が完遂され、発光信号が生成される。

【0127】

スルホ－ＳＥ－ＳｍＴｒｉｐ９（８２４）（配列番号２５）及びスルホ－ＳＥ－ＳｍＴｒｉｐ１０（６９１）（配列番号２３）を作出した。抗ＩＬ－６マウスモノクローナル抗体クローン５０５Ｅ９Ａ１２Ａ３（Ｔｈｅｒｍｏ）にはスルホ－ＳＥ－ＳｍＴｒｉｐ１０（６９１）（配列番号２３）で標識付けし、抗ＩＬ－６マウスモノクローナル抗体クローン５ＩＬ６（Ｔｈｅｒｍｏ）にはスルホ－ＳＥ－ＳｍＴｒｉｐ９（８２４）－Ｒ（配列番号２５）で標識付けした。標識付けされていない抗体を、Ｚｅｂａカラムを使用して２回実施される１０ｍＭのＮａＨＣＯ₃（ｐＨ８．５）による緩衝液交換を最初に行うことによって前処理した。その後、抗体に直接、２０倍過剰なそれぞれの反応性ペプチドで標識付けし、１０００ｒｐｍで２時間振盪しながら室温でインキュベートした。Ｚｅｂａカラムを使用して緩衝液交換を２回行って遊離リンカーを除去した。

【0128】

アッセイ用緩衝液で２×の組換えヒトＩＬ－６原液を生成し、用量応答を生み出すために１：２に段階希釈し、５０ｕｌ／ウェルを、非結合表面処理された９６ウェル固体白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６００）に加えた。精製ＬｇＴｒｉｐ（３５４６）（配列番号１２）（終濃度１ｕＭ）と、スルホ－ＳＥ－ＳｍＴｒｉｐ９（８２４）（配列番号２５）で標識付けされた５ＩＬ６クローン（最終１０ｎｇ／ｍｌ）と、スルホ－ＳＥ－ＳｍＴｒｉｐ１０（６９１）配列番号２３）で標識付けされた５０５Ｅクローン（最終１０ｎｇ／ｍｌ）との２×のマスターミックスをアッセイ用緩衝液で作り、５０ｕｌ／ウェルを加えた。プレートを９０分間インキュベートし、その後、アッセイ用緩衝液中５×のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質原液を添加し、１０ｕＭの終濃度とするために２５ｕｌ／ウェルをプレートに加え、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒを使用して発光を測定した。アッセイ用緩衝液は、Ｂｌｏｃｋｅｒ ＢＳＡ（１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ）をＰＢＳ（ｐＨ７．０）で希釈して最終０．０１％としたＢＳＡを含んだＰＢＳから構成されていた。試料は３反復で試験した。

【0129】

結果は図１０に、原ＲＬＵ（１０Ａ）として、または算出された信号対ノイズ（１０Ｂ）として描写され、ここで、信号対ノイズ＝（原ＲＬＵ－バックグラウンドＲＬＵ）／バックグラウンドの標準偏差である。

【0130】

実施例１６
リンカーを組み込んでスルホ－ＳＥペプチド部分を有するＮａｎｏＴｒｉｐで直接標識付けされた抗体の対を使用するヒト組換えＩＬ－６の生物発光定量
ヒトＩＬ－６の定量のための、直接ＮａｎｏＴｒｉｐペプチドに化学的に結合体化されたモノクローナル抗体の対の使用を実証するために、本明細書の実施形態の開発中に実験を行った。このモデルシステムは、異なるエピトープでＩＬ－６を認識する２つのモノクローナルマウス抗体から構成される。スルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（６９３）（配列番号１６）またはスルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（８９５）（配列番号１８）を片方の抗体に化学的に結合体化し、スルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ１０（６９１）（配列番号２３）をもう片方の抗体に化学的に結合体化した。ＩＬ－６の存在下で２つの抗体はＩＬ－６に結合し、かくして２つのタグを近接させる。ＬｇＴｒｉｐ（３５４６）（配列番号１２）の添加によって補完が完遂され、発光信号が生成される。

【0131】

スルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（６９３）（配列番号１６）、スルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（８９５）（配列番号１８）、及びスルホ－ＳＥ－ＳｍＴｒｉｐ１０（６９１）（配列番号２３）を作出した。抗ＩＬ－６マウスモノクローナル抗体クローン５０５Ｅ９Ａ１２Ａ３（Ｔｈｅｒｍｏ）にはスルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ１０（６９１）（配列番号２３）で標識付けし、抗ＩＬ－６マウスモノクローナル抗体クローン５ＩＬ６（Ｔｈｅｒｍｏ）にはスルホ－ＳＥ－ＳｍＴｒｉｐ９（８２４）（配列番号２５）またはスルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（８９５）（配列番号１８）で標識付けした。標識付けされていない抗体を、Ｚｅｂａカラムを使用して２回実施される１０ｍＭのＮａＨＣＯ₃（ｐＨ８．５）による緩衝液交換を最初に行うことによって前処理した。その後、抗体に直接、２００ｕＭの固定濃度のそれぞれの反応性ペプチドで標識付けし、１０００ｒｐｍで２時間振盪しながら室温でインキュベートした。Ｚｅｂａカラムを使用して緩衝液交換を２回行って遊離リンカーを除去した。試料をＳＤＳ ＰＡＧＥ全タンパク質用ゲルに流し、図１４Ａに示すように、明視野撮像によって解析して抗体の標識付けを示し、どれだけ多くの未反応ペプチドが残っているかを決定した。

【0132】

アッセイ用緩衝液で２×の組換えヒトＩＬ－６原液を生成し、用量応答を生み出すために１：２に段階希釈し、５０ｕｌ／ウェルを、非結合表面処理された９６ウェル固体白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６００）に加えた。精製ＬｇＴｒｉｐ（３５４６）（配列番号１２）（終濃度１ｕＭ）と、スルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（６９３）（配列番号１６）で標識付けされた５ＩＬ６クローン（最終１０ｎｇ／ｍｌ）、またはスルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（８９５）（配列番号１８）で標識付けされた５ＩＬ６クローン（最終１０ｎｇ／ｍｌ）と、スルホ－ＳＥＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ１０（６９１）（配列番号２３）で標識付けされた５０５Ｅクローン（最終１０ｎｇ／ｍｌ）との２×のマスターミックスをアッセイ用緩衝液で作り、５０ｕｌ／ウェルを加えた。プレートを９０分間インキュベートし、その後、アッセイ用緩衝液中５×のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質原液を添加し、１０ｕＭの終濃度とするために２５ｕｌ／ウェルをプレートに加え、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒを使用して発光を測定した。アッセイ用緩衝液は、Ｂｌｏｃｋｅｒ ＢＳＡ（１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ）をＰＢＳ（ｐＨ７．０）で希釈して最終０．０１％としたＢＳＡを含んだＰＢＳから構成されていた。試料は３反復で試験した。

【0133】

結果は図１１に、原ＲＬＵ（１１Ａ）として、または算出された信号対ノイズ（１１Ｂ）として描写され、ここで、信号対ノイズ＝（原ＲＬＵ－バックグラウンドＲＬＵ）／バックグラウンドの標準偏差である。

【0134】

実施例１７
リンカーを組み込んでスルホ－ＳＥペプチド部分を有するＮａｎｏＴｒｉｐで直接標識付けされた抗体の対を使用するヒト組換えＩＬ－６のＮａｎｏＢＲＥＴ定量
ヒトＩＬ－６の定量のための、直接ＮａｎｏＴｒｉｐペプチドに化学的に結合体化されたモノクローナル抗体の対の使用を実証するために、本明細書の実施形態の開発中に実験を行った。このモデルシステムは、異なるエピトープでＩＬ－６を認識する２つのモノクローナルマウス抗体から構成される。スルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（９３８）－ＴＡＭＲＡ（配列番号３８）を片方の抗体に化学的に結合体化し、スルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ１０（９３７）－ＴＡＭＲＡ（配列番号３７）をもう片方の抗体に化学的に結合体化した。ＩＬ－６の存在下で２つの抗体はＩＬ－６に結合し、かくして２つのタグを近接させる。ＬｇＴｒｉｐ（３５４６）（配列番号１２）の添加によって補完が完遂され、発光信号が生成され、これが今度はＴＡＭＲＡ受容体蛍光団を励起してそれに５８０ｎｍの光を発せしむ。受容体信号／供与体信号のＮａｎｏＢＲＥＴ比の算出を用いて供与体発光信号及び受容体蛍光団信号を解析する。

【0135】

スルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（９３８）－ＴＡＭＲＡ（配列番号３８）、及びスルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ１０（９３７）－ＴＡＭＲＡ（配列番号３７）を作出した。抗ＩＬ－６マウスモノクローナル抗体クローン５０５Ｅ９Ａ１２Ａ３（Ｔｈｅｒｍｏ）にはスルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ１０－ＴＡＭＲＡ（配列番号１１）で標識付けし、抗ＩＬ－６マウスモノクローナル抗体クローン５ＩＬ６（Ｔｈｅｒｍｏ）にはスルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（５２１）－ＴＡＭＲＡ（配列番号２６）またはスルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（８９５）（配列番号１８）で標識付けした。標識付けされていない抗体を、Ｚｅｂａカラムを使用して２回実施される１０ｍＭのＮａＨＣＯ₃（ｐＨ８．５）による緩衝液交換を最初に行うことによって前処理した。その後、抗体に直接、２００ｕＭの固定濃度のそれぞれの反応性ペプチドで標識付けし、１０００ｒｐｍで２時間振盪しながら室温でインキュベートした。Ｚｅｂａカラムを使用して緩衝液交換を２回行って遊離リンカーを除去した。試料をＳＤＳ ＰＡＧＥ全タンパク質用ゲルに流し、明視野撮像（図１４のＡ）または蛍光撮像（図１４のＢ）によって解析して抗体の標識付けを示し、どれだけ多くの余剰の未反応ペプチドが残っているかを決定した。

【0136】

アッセイ用緩衝液で２×の組換えヒトＩＬ－６原液を生成し、５０ｕｌ／ウェルを、非結合表面処理された９６ウェル固体白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６００）に加えた（終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）。精製ＬｇＴｒｉｐ（３５４６）（配列番号１２）（終濃度１ｕＭ）と、スルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ９（９３８）－ＴＡＭＲＡ（配列番号３８）で標識付けされた５ＩＬ６クローン（最終１０ｎｇ／ｍｌ）５ＩＬ６クローン（最終１０ｎｇ／ｍｌ）と、スルホ－ＳＥ－ＰＥＧ３－ＳｍＴｒｉｐ１０（９３７）－ＴＡＭＲＡ（配列番号３７）で標識付けされた５０５Ｅクローン（最終１０ｎｇ／ｍｌ）との２×のマスターミックスをアッセイ用緩衝液で作り、５０ｕｌ／ウェルを加えた。アッセイ用緩衝液中５×のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質原液を、１０ｕＭの終濃度とするために２５ｕｌ／ウェルをプレートに加え、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒを使用して即時にＢＲＥＴを測定した。アッセイ用緩衝液は、Ｂｌｏｃｋｅｒ ＢＳＡ（１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ）をＰＢＳ（ｐＨ７．０）で希釈して最終０．０１％としたＢＳＡを含んだＰＢＳから構成されていた。試料は３反復で試験した。結果は図１３に経時的な原ＲＬＵとして描写される。

【0137】

上記の詳細な説明及びそれに付帯する実施例が単なる例示にすぎず、別記の特許請求の範囲及びその均等物によってのみ画定されるものである本開示の範囲に対する限定とみなされるべきでないことは、理解される。

【0138】

開示される実施形態に対する様々な変更及び改変が当業者には明らかであろう。そのような変更及び改変は、限定されないが本開示の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、配合組成または使用方法に関するものを含めて、その趣旨及び範囲から逸脱せずになされ得る。

【0139】

配列
ＷＴ ＯｇＬｕｃ（配列番号１）
ＭＦＴＬＡＤＦＶＧＤＷＱＱＴＡＧＹＮＱＤＱＶＬＥＱＧＧＬＳＳＬＦＱＡＬＧＶＳＶＴＰＩＱＫＶＶＬＳＧＥＮＧＬＫＡＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＦＱＭＧＬＩＥＭＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＩＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＰＧＩＡＶＦＤＧＫＱＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＹＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＮＩＬＡ
ＷＴ ＯｇＬｕｃ Ｌｇ（配列番号２）
ＭＦＴＬＡＤＦＶＧＤＷＱＱＴＡＧＹＮＱＤＱＶＬＥＱＧＧＬＳＳＬＦＱＡＬＧＶＳＶＴＰＩＱＫＶＶＬＳＧＥＮＧＬＫＡＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＦＱＭＧＬＩＥＭＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＩＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＰＧＩＡＶＦＤＧＫＱＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＹＤＥＲＬＩＮＰＤ
ＷＴ ＯｇＬｕｃ β９（配列番号３）
ＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮ
ＷＴ ＯｇＬｕｃ β１０（配列番号４）
ＧＶＴＧＷＲＬＣＥＮＩＬＡ
ＮａｎｏＬｕｃ（配列番号５）
ＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ
ＮａｎｏＬｕｃ Ｌｇ（配列番号６）
ＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤ
ＮａｎｏＬｕｃ β９（配列番号７）
ＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＶ
ＮａｎｏＬｕｃ β１０（配列番号８）
ＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ
ＬｇＢｉＴ（配列番号９）
ＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮ
ＳｍＢｉＴ（配列番号１０）
ＶＴＧＹＲＬＦＥＥＩＬ
ＨｉＢｉＴ（ｐｅｐ８６）（配列番号１１）
ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ
ＬｇＴｒｉｐ（３５４６）（配列番号１２）
ＭＫＨＨＨＨＨＨＶＦＴＬＤＤＦＶＧＤＷＥＱＴＡＡＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＬＱＮＬＡＶＳＶＴＰＩＭＲＩＶＲＳＧＥＮＡＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＡＤＱＭＡＱＩＥＥＶＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＰＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＫＬＮＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＴＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤ
ＳｍＴｒｉｐ９（配列番号１３）
ＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳ
β９／β１０ジペプチド（配列番号１４）
ＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ
Ｐｅｐ５２１（配列番号１５）
ＧＫＭＬＦＲＶＴＩＮＳＷＫ
Ｐｅｐ６９３（配列番号１６）
ＧＲＭＬＦＲＶＴＩＮＳＷＲ
Ｐｅｐ８４０（配列番号１７）
ＧＫＬＬＦＶＶＶＩＥＫＹＫ
Ｐｅｐ８９５（配列番号１８）
ＧＲＬＬＦＶＶＶＩＥＲＹＲ
Ｐｅｐ７６０（配列番号１９）
ＫＫＭＬＦＲＶＴＩＱＫＷＫ
Ｐｅｐ９２９（配列番号２０）
ＲＲＭＬＦＲＶＴＩＱＲＷＲ
ＶＳ－ＨｉＢｉＴ（Ｐｅｐ２８９）（配列番号２１）
ＶＳＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ
Ｐｅｐ６９２（配列番号２２）
ＶＳＶＳＧＷＲＬＦＲＲＩＳ
Ｐｅｐ６９１（配列番号２３）
ＶＳＧＷＲＬＦＲＲＩＳ
Ｐｅｐ７５９（配列番号２４）
ＤＫＬＬＦＴＶＴＩＥＫＹＫ
Ｐｅｐ８２４（配列番号２５）
ＤＲＬＬＦＴＶＴＩＥＲＹＲ
Ｐｅｐ５２１－Ｃ（配列番号２６）
ＧＫＭＬＦＲＶＴＩＮＳＷＫＣ
Ｐｅｐ６９３－Ｃ（配列番号２７）
ＧＲＭＬＦＲＶＴＩＮＳＷＲＣ
Ｐｅｐ８４０－Ｃ（配列番号２８）
ＧＫＬＬＦＴＶＴＩＥＫＹＫＣ
Ｐｅｐ８９５－Ｃ（配列番号２９）
ＧＲＬＬＦＴＶＴＩＥＲＹＲＣ
Ｐｅｐ７６０－Ｃ（配列番号３０）
ＫＫＭＬＦＲＶＴＩＱＫＷＫＣ
Ｐｅｐ９２９－Ｃ（配列番号３１）
ＲＲＭＬＦＲＶＴＩＱＲＷＲＣ
ＶＳ－ＨｉＢｉＴ－Ｃ（Ｐｅｐ２８９）（配列番号３２）
ＶＳＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳＣ
Ｐｅｐ６９２－Ｃ（配列番号３３）
ＶＳＶＳＧＷＲＬＦＲＲＩＳＣ
Ｐｅｐ６９１－Ｃ（配列番号３４）
ＶＳＧＷＲＬＦＲＲＩＳＣ
Ｐｅｐ７５９－Ｃ（配列番号３５）
ＤＫＬＬＦＴＶＴＩＥＫＹＫＣ
Ｐｅｐ８２４－Ｃ（配列番号３６）
ＤＲＬＬＦＴＶＴＩＥＲＹＲＣ
Ｐｅｐ９３７（配列番号３７）
ＶＳＧＷＲＬＦＲＲＩＳＣ
Ｐｅｐ９３８（配列番号３８）
ＧＲＭＬＦＲＶＴＩＮＳＷＲＣ
Ｐｅｐ９３９（配列番号３９）
ＧＲＬＬＦＴＶＴＩＥＲＹＲＣ

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

2022509200000001.app

【国際調査報告】