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特表2022-509239固相キレート材、その製造方法およびタンパク質の精製におけるその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-20
(54)【発明の名称】固相キレート材、その製造方法およびタンパク質の精製におけるその使用
(51)【国際特許分類】
B01J 20/281 20060101AFI20220113BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20220113BHJP
B01J 20/285 20060101ALI20220113BHJP
B01J 20/286 20060101ALI20220113BHJP
B01J 20/282 20060101ALI20220113BHJP
B01J 20/30 20060101ALI20220113BHJP
B01J 20/34 20060101ALI20220113BHJP
B01D 15/38 20060101ALI20220113BHJP
【ＦＩ】
B01J20/22 D
C07K1/22
B01J20/281 R
B01J20/281 X
B01J20/285 T
B01J20/285 N
B01J20/286
B01J20/282 E
B01J20/30
B01J20/34 G
B01D15/38
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021530306
(86)(22)【出願日】2019-11-22
(85)【翻訳文提出日】2021-06-03
(86)【国際出願番号】 EP2019082224
(87)【国際公開番号】W WO2020109162
(87)【国際公開日】2020-06-04
(31)【優先権主張番号】62/772,206
(32)【優先日】2018-11-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521229762
【氏名又は名称】キューブ バイオテック ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100104282
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 康仁
(72)【発明者】
【氏名】ファビス，ローランド
【テーマコード（参考）】
4D017
4G066
4H045
【Ｆターム（参考）】
4D017AA09
4D017BA07
4D017CA11
4D017CB01
4D017DA03
4D017DB02
4D017EA03
4G066AB07D
4G066AB13D
4G066AB24B
4G066AC01C
4G066AC02C
4G066BA03
4G066BA09
4G066CA54
4G066DA07
4G066EA02
4G066FA01
4G066FA11
4G066FA38
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、固相キレート材、とりわけタンパク質の精製に有用な固相キレート材に関する。当該固相キレート材は、固相と、該固相に結合されたポリアミン基と、該ポリアミン基に結合されたキレート基とを含む。前記ポリアミン基の少なくとも一部はポリアミン基毎に少なくとも２つのキレート基と結合している。各キレート基は１つまたは数個のアミノポリカルボン酸基（ＡＰＡ基）を含み、少なくとも２つのキレート基と結合したポリアミン基毎のＡＰＡ基の数は少なくとも３である。一部のＡＰＡは、直鎖状キレート鎖を形成してもよく、前記ＡＰＡ基が二官能性リンカもしくは三官能性リンカによって相互に結合された分岐状キレート鎖を形成してもよい。本発明に係る金属イオンを担持した固相キレート材は、強い金属結合、キレート剤、還元剤およびアルカリ溶液に対する高い安定性、タンパク質に対する高親和性、ならびに非常に高い結合能力を示す。さらに、本発明は、前記固相キレート材を製造する方法、ならびに金属イオンを担持した固相キレート材を用いた、ヒスチジンタグ付きの組換えポリペプチドおよびタンパク質、リンタンパク質および金属配位タンパク質を精製するための方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
固相と、前記固相に結合されたポリアミン基と、前記ポリアミン基に結合されたキレート基とを含む固相キレート材であって、少なくとも一部のポリアミン基がポリアミン基ごとに少なくとも２つのキレート基が結合しており、各キレート基は１つまたは数個のアミノポリカルボン酸基（ＡＰＡ基）を含み、少なくとも２つのキレート基に結合されたポリアミン基毎のＡＰＡ基の数は少なくとも３つである固相キレート材。
【請求項2】
請求項１に記載の固相キレート材であって、前記キレート基は、単独のＡＰＡ基、二官能性リンカ部位Ｋを介してそれぞれと結合した２つ以上のＡＰＡ基により形成された直鎖状キレート鎖、三官能性リンカ部位Ｌを介してそれぞれと結合した３つ以上のＡＰＡ基により形成された分岐状キレート鎖、および少なくとも１つの二官能性リンカ部位Ｋと少なくとも１つの三官能性リンカ部位Ｌを介してそれぞれと結合した４つ以上のＡＰＡ基により形成された混合キレート鎖からなる群から選択されたものである固相キレート材。
【請求項3】
請求項１または２のいずれか一項に記載の固相キレート材であって、ポリアミン基に結合されたキレート基の数は、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、および／または少なくとも２つのキレート基と結合した１つのポリアミン基に結合するＡＰＡの数は、３から２０の範囲内であり、好ましくは４から１５の範囲内である固相キレート材。
【請求項4】
請求項１ないし３のいずれか一項に記載の固相キレート材であって、前記ポリアミン基は、ペンタエリトリトールコアに基づいて、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタアミン、ペンタエチレンヘキサアミン、直鎖および分岐ポリエチレンイミン、ポリリシン、ポリプロピレンイミン、サイクラム、サイクレンおよび１，４，７－トリアザシクロノナンなどのマクロ環状ポリアミン類、１，１，１－トリス（アミノメチル）エタン、トリスアミノエチルアミン、トリスアミノプロピルアミン、テトラキスエチルアミノアミン、テトラキスアミノプロピルアミンなどの分岐ポリアミン類、およびアミン官能化四官能性分岐ＰＥＧからなる群から選択されたポリアミン類、好ましくはジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタアミン、およびペンタエチレンヘキサアミンからなる群から選択されたポリアミン類、より好ましくはトリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタアミン、およびペンタエチレンヘキサアミンからなる群から選択されたポリアミン類から誘導されたものである固相キレート材。
【請求項5】
請求項１ないし４のいずれか一項に記載の固相キレート材であって、ＡＰＡ基は、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、トリエチレンテトラアミン六酢酸、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－二コハク酸、エチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０四酢酸、および１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－トリ酢酸からなる群から選択されたＡＰＡから誘導されたものである固相キレート材。
【請求項6】
請求項１ないし５のいずれか一項に記載の固相キレート材であって、キレート基の少なくとも一部または全てが一般式－（ＡＰＡ１－Ｋ）ｎ－ＡＰＡ２で示されるものであり、式中、ＡＰＡ１およびＡＰＡ２は、同じまたは異なるものであり、ｎは１から５０までの整数であり、Ｋは二官能性直鎖部位である固相キレート材。
【請求項7】
請求項１ないし６のいずれか一項に記載の固相キレート材であって、キレート基の少なくとも一部または全てが、一般式：【化1】
【化2】
式中、ＡＰＡ１，ＡＰＡ２，およびＡＰＡ３は、同じまたは異なるアミノポリカルボン酸であり、Ｌは三官能性リンカ部位である固相キレート材。
【請求項8】
請求項１ないし７のいずれか一項に記載の固相キレート材であって、前記ＡＰＡと前記リンカ部位、および／またはキレート基とポリアミン基とはアミド部位を介してお互いと結合している固相キレート材。
【請求項9】
請求項１ないし８のいずれか一項に記載の固相キレート材であって、－ 前記二官能性リンカ部位ＫはＡ－（ＣＨ２）ｎ－Ｂ、Ａ－Ｑ－Ｂ、およびＡ－（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｍ－（ＣＨ２）ｏ－Ｂからなる群から選択されたものであり、
式中、ＡおよびＢはＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＭ、ＯＴ、Ｎ３などのカルボキシ基と反応可能な官能基であり、Ｒは一般式ＣｎＨ２ｎ＋１で示される炭化水素基であり、ｎは１から６の整数であり、ｍは１から１２の整数であり、ｏは２から１２の整数であり、Ｑは２から１００の原子からなる直鎖または分岐構造であり、Ｃ、Ｈ、Ｎ、ＯおよびＳを任意で含み、炭水化物などの環状化合物を含み、好ましくはジアミンＮＨ２またはＮＨＲであり、より好ましくはエチレンジアミン、１,４－ジアミノブタン、１，６－ジアミノへキサン、１，８－ジアミノオクタン、およびジェファーミンＥＤ－６００（ＪｅｆｆａｍｉｎｅＥＤ－６００）からなる群から選択されたものであり、
－ 前記三官能性リンカ部位Ｌは、一般式
【化3】
【化4】
式中、Ａ、Ｄ、およびＥは好ましくは－ＮＨ２または－ＮＨＲであるカルボキシ基と反応可能な官能基であり、Ｂは好ましくはＣまたはＮの分岐原子であって少なくとも３つの安定した結合により好ましくは炭素原子と結合して官能基と結合しており、ｎ、ｍ、およびｏは２から３０の整数であり、好ましくはトリアミン、より好ましくは、グリセロールコアに基づいてジエチレントリアミン、トリス（２－アミノエチル）アミン、トリス（２－アミノプロピル）アミン、およびアミノ官能化三官能性分岐ＰＥＧからなる群から選択されたものである固相キレート材。
【請求項10】
請求項１ないし９のいずれか一項に記載の固相キレート材であって、スペーサ部位が前記固相と前記ポリアミド基の間に挿入されており、好ましくは、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、１，２－エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル、アリルグリシジルエーテル、および臭化アリルからなる群から誘導されたものである固相キレート材。
【請求項11】
請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の固相キレート材であって、前記固相は、アガロース、セルロース、寒天、デキストラン、キトサン、アルジネート、ゲラン、好ましくはアガロース、および／または
シリカ、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、二酸化アルミニウム、その他の金属または半金属の酸化物、金、ガラス、および／または
アクリレート類、メタアクリレート類、アクリルアミド類、スチレン誘導体、ビニルエステル類、ビニルアミド類、およびビニルアルコール、および／または
多孔質クロマトグラフィ担体、無孔質クロマトグラフィ担体、膜、塗布表面、塗布チューブ、センサ表面、マイクロアレイ表面、塗布ミクロタイタプレート、および／または
磁性アガロース、磁性シリカ、および磁性ポリマー、好ましくは磁性アガロース、および／または、
デキストラン修飾された金チップおよび磁性ビーズからなる群から選択されたものである固相キレート材。
【請求項12】
Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｍｎ２＋、およびＣａ２＋からなる群から選択された金属イオンを担持した請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の固相キレート材を含む金属イオン添加固相キレート材。
【請求項13】
請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の固相キレート材の製造方法であって、－ ポリアミン基が結合した固相に少なくとも３つの単量体ＡＰＡを共有結合して、アミド基を介して少なくとも３つの単量体ＡＰＡ基が結合したポリアミン基を形成する工程、または
－ ポリアミン基が結合した固相に少なくとも２つの単量体ＡＰＡを共有結合して、アミド基を介して少なくとも２つの単量体ＡＰＡ基が結合したポリアミン基を有する固相材を形成する工程と、二官能性リンカKまたは三官能性リンカLを前記固相材に添加する工程と、前記結合したリンカと第２のＡＰＡのカルボキシ基とを反応させ、前記固相に結合した前記ポリアミン基に結合したＡＰＡ基の直鎖状キレート鎖または分岐状キレート鎖を有する固相キレート材を形成する工程と、任意で、リンカの添加とその他のＡＰＡの添加を繰り返して前記直鎖状キレート鎖または分岐状キレート鎖の長さを延長する工程、または
－ 少なくとも２つの単量体ＡＰＡと二官能性リンカＫまたは少なくとも３つの単量体ＡＰＡと三官能性リンカＬとを反応させ、直鎖状キレート鎖または分岐状キレート鎖を有する多量体ＡＰＡキレートを形成する工程と、少なくとも２つの多量体ＡＰＡキレートをポリアミン基が結合した固相に共有結合して、アミド基を介して少なくとも２つの直鎖状および／または分岐状キレート鎖が結合したポリアミン基を形成する工程、とを含む固相キレート材の製造方法。
【請求項14】
請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の、二官能性リンカを介してＡＰＡ基が結合された直鎖状キレート基を有する固相キレート材の製造方法であって、ａ）ＡＰＡと、ポリアミン基が結合した固相と、を準備する工程と、
ｂ）前記ＡＰＡの１つのカルボキシ基が固相と反応して、前記ＡＰＡを前記固相と結合し、前記ＡＰＡと前記固相とを凝縮剤の存在下にて結合する工程と、
ｃ）工程ｂ）において得られた固相材を二官能性リンカＫと混合する工程と、
ｄ）二官能性リンカＫの１つの反応性基を前記結合したＡＰＡと反応させ、前記二官能性リンカＫとＡＰＡカルボキシ基とを凝縮剤の存在下にて結合する工程と、
ｅ）工程ｄ）にて得られた固相材とさらなるＡＰＡと混合する工程と、
ｆ）前記さらなるＡＰＡの１つのカルボキシ基と、前記固相材に結合した二官能性リンカＫのさらなる反応性基とを反応させ、前記その他のＡＰＡと前記二官能性リンカを凝縮剤の存在下にて結合する工程と、
ｇ）任意で工程ｃ）からｆ）まで少なくとも１回繰り返す工程と、を含む固相キレート材の製造方法。
【請求項15】
請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の、二官能性リンカを介してＡＰＡ基が結合された直鎖状キレート基を有する固相キレート材の製造方法であって、ａ）ＡＰＡ二無水物と、ポリアミン基が結合した固相材とを準備する工程と、
ｂ）各ＡＰＡ二無水物の１つの無水物基がアミノ部位と反応し、その他の無水物基が変化しないように前記ＡＰＡ二無水物と前記固相材を、結合したポリアミンのアミノ基を介して結合する工程と、
ｃ）工程ｂ）において得られた前記固相材を無水溶媒にて洗浄し、前記結合していない二無水物を取り除く工程と、
ｄ）工程ｃ）において得られた前記固相材と、二官能性リンカＫとを準備する工程と、
ｅ）前記二官能性リンカＫの１つのアミン基と前記ＡＰＡ無水物基とを反応させ、前記二官能性リンカＫのその他の官能基を変化させずに、前記二官能性リンカＫと前記ＡＰＡ無水物基とを結合する工程と、
ｆ）前記固相を無水溶媒にて洗浄し、前記結合していないリンカ分子を取り除く工程と、
ｇ）工程ｆ）にて得られた前記固相材と、追加のＡＰＡ二無水物とを準備する工程と、
ｈ）各ＡＰＡの１つのカルボキシ基を前記二官能性リンカＫの残りの官能基と反応させて、前記ＡＰＡ二無水物を前記二官能性リンカＫに結合する工程と、
ｉ）任意に、工程ｃ）からｈ）までを少なくとも１回繰り返す工程と、を含む固相キレート材の製造方法。
【請求項16】
請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の、二官能性リンカを介してＡＰＡ基が結合された直鎖状キレート基を有する固相キレート材の製造方法であって、ａ）ＡＰＡ二無水物と二官能性リンカＫを２：１から１：１の割合で、好ましくは２：１から１．２５：１の割合で準備する工程と、
ｂ）前記二官能性リンカＫと２つの異なる二無水物と反応させて、化合物ＡＰＡ１－Ｋ－（ＡＰＡ２－Ｋ）ｎ－ＡＰＡ３（式中、ＡＰＡ１は１つの無水物基と１つのアミド官能基を有するＡＰＡ、ＡＰＡ２は２つのアミド官能基を有するＡＰＡ、ＡＰＡ３は１つの無水物基を有するＡＰＡであり、ｎは０から５０、好ましくは０から１０の数字であり、Ｋは二官能性リンカ部位である）を形成して、前記ＡＰＡ二無水物を前記二官能性リンカＫにアミンを介して、または前記リンカの水酸基を介して結合する工程と、
ｃ）ポリアミン基が結合した固相を準備する工程と、
ｄ）各ＡＰＡの１つのカルボキシ基をアミン部位と反応させ、その他の無水物基を変化させずに、前記リンカが結合した二無水物を前記担持体に、前記固相に結合したポリアミン基のアミノ基を介して結合する工程と、
ｅ）水または水性バッファーを加えて前記残りの無水物基を加水分解する工程と、を含む固相キレート材の製造方法。
【請求項17】
請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の、三官能性リンカを介して結合されたＡＰＡ基を有する分岐状キレート基を有する固相キレート材の製造方法であって、ａ）３：１から９：４の割合、好ましくは３：１から５：２の割合のＡＰＡ二無水物および三官能性リンカＬと、ポリアミン基が結合した固相とを混合する工程と、
ｂ）前記リンカを３つの異なる二無水物と反応させ、以下の式の内の１つの反応物を得て
【化5】
ｃ）ポリアミン基を有する固相を準備する工程と、
ｄ）各アミノポリカルボン酸の１つのカルボキシ基を前記アミン部位と反応させ、他の無水物基を変化させずに、前記リンカが結合したＡＰＡを、アミド基を介して前記担持体に結合して前記ポリアミン修飾された固相に結合する工程と、
ｅ）水または水性バッファーを加えて前記残りの無水物基を加水分解する工程と、を含む固相キレート材の製造方法。
【請求項18】
金属イオンを担持した固相キレート材の製造方法であって、固相キレート材を製造するために請求項１３ないし１７に記載の方法のうちの１つを実行する工程と、前記固相キレート材を、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇａ３＋＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋からなる群から選択された金属イオンの溶液と前記固相キレート材とを接触させることで、前記金属イオンを固定する工程とを含む金属イオンを担持した固相キレート材の製造方法。
【請求項19】
請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の固相キレート材または請求項１２に記載の金属イオンを担持した固相キレート材または請求項１３ないし１７のいずれか一項に記載の方法により製造された固相キレート材または請求項１８に記載の方法で製造された金属イオンを担持した固相キレート材の、分子生物学の分野における、複数のヒスチジン残基を有するタンパク質の精製、複数のヒスチジン残基を有する膜タンパク質の精製、複数のヒスチジン残基を有するGPCRの精製、複数のヒスチジン残基を有するトランスポータタンパク質の精製、治療用タンパク質の精製、複数のヒスチジン部位を有する遺伝子組み換えタンパク質またはポリペプチドの精製、リンタンパク質の精製、金属タンパク質の精製、核酸の精製および／または金属固定化アフィニティ・クロマトグラフィのための使用。
【請求項20】
生体分子、特に遺伝子組み換えタンパク質またはポリペプチドの精製方法であって、ａ）請求項１２に記載の金属を担持した固相キレート材または、請求項１８に記載の方法で製造された金属を担持した固相キレート材を準備する工程と、
ｂ）前記生体分子、特に複数のヒスチジン部位を有するタンパク質またはペプチドを含む試料を準備する工程と、
ｃ）前記試料を、前記金属を担持した固相キレート材に接触させる工程と、
ｄ）前記結合したポリペプチドまたはタンパク質を前記溶液から分離する工程と、
e）前記遺伝子組み換えタンパク質またはポリペプチドを前記固相から溶出させる工程と、を含む精製方法。
【請求項21】
請求項２０に記載の精製方法であって、前記タンパク質は膜タンパク質、ＧＰＣＲ、および抗原からなる群から選択されたものである精製方法。
【請求項22】
請求項２０および２１のいずれか一項に記載の精製方法であって、前記金属の結合とタンパク質の収率に干渉せずに、ＥＤＴＡとイミダゾールとを前記結合バッファーに添加して少なくとも２０ｍＭの濃度とし、ＤＴＴを添加して少なくとも１０ｍＭの濃度とする精製方法。
【請求項23】
請求項２０ないし２２のいずれか一項に記載の精製方法であって、請求項２０ないし２２のいずれか一項に記載の前記固相に固定したアミノポリカルボン酸化合物は、水酸化ナトリウム溶液にて洗浄して汚染物質や付着したタンパク質を取り除いて前記固相キレート材をさらなる生体分子精製用に再生することが可能であり、依然少なくとも１ｍｌ当たり５０ｍｇのタンパク質結合力を有する精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、固相キレート材と固相キレート材の製造方法に関する。また、本発明は、ポリペプチドやタンパク質を、金属を担持した固相キレート材を用いて精製する方法、および、とりわけタンパク質の金属固定化アフィニティ精製のための金属を担持した固相キレート材の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ポラス（Ｐｏｒａｔｈ）により開発された金属固定化アフィニティ・クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）（Ｎａｔｕｒｅ ２５８：５９８, １９７５）は、遺伝子組み換えタンパク質の精製の標準的な方法として採用されており、現在でも多量の遺伝子組み換えタンパク質の精製を行う際には最も好まれる方法の一つである。
【0003】
本方法の原理は複数のヒスチジン基をタンパク質のアミノ酸側の鎖に導入し、これにより固定化された金属イオンに対して高い親和性を得ることに基づいている。このいわゆる「Ｈｉｓタグ」は、ヒスチジンの他にも他のアミノ酸とも結合しているヒスチジン残基からなり、通常６から１０個のヒスチジンからなる。この「Ｈｉｓタグ」は、固定化された金属イオンに対して天然のタンパク質よりも高い親和性を示し、特にＨｉｓタグがないタンパク質の非特異的な干渉を下げるために少量のイミダゾールが結合および洗浄バッファに添加された際に高度の精製が可能となる。
【0004】
また、ＩＭＡＣは金属イオンが直接リン酸基に直接結合しているリンタンパク質の精製にも使用可能である。この方法により、リン酸基がなく、金属イオンに対して結合しない、もしくは結合が弱いタンパク質からリンタンパク質を分離することができる。
【0005】
亜鉛や銅などの金属と組み合わせて、ＩＭＡＣ樹脂をジンクフィンガタンパク質やクプレドキシンやヘモシアニンなど銅と相互作用するタンパク質などの金属共役タンパク質を可逆的に結合するために使用することも可能である。キレートは、アミンやカルボキシ、リン酸などの金属イオン結合基を３つ得た時、三座配位子と呼ばれる。四座配位子のキレートは金属イオンの４つの位置で配位結合することができ、五座配位子のキレートは５つの配位有する。
【0006】
２０年以上前から、三座配位子のキレートである固相固定化イミノ二酢酸（ＩＤＡ）と四座配位子のキレートのニトロ三酢酸（ＮＴＡ）はＩＭＡＣ用の標準的な物質として確立されている。市販のその他のキレートとしては四座配位子の「タロン（Ｔａｌｏｎ）」リガンドや、トリスカルボキシメチルエチレンジアミン（ＴＥＤ）などの五座配位子のキレートがある。最近では、Ｈｉｓタグレジン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）やＮｉセファローズエクセル（Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｅｘｃｅｌ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの五座配位子のキレート系の樹脂も市場に登場している。
【0007】
ＩＭＡＣ向けには、様々な金属が成功裏に使用されており、例えば、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｃａ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｅｕ、Ｇａ、Ｓｃが検討されている。リンタンパク質の精製においては、ＡｌとＩＤＡとの組み合わせやＦｅ、Ｇａ、ＥｕなどとＮＴＡとの組み合わせがよく用いられている。
【0008】
なお、特に、非常に簡単に安価で取得できるイミノ二酢酸は、金属イオンが３つの官能化によってのみ固相に固定されるという欠点があり、金属イオンがバッファに漏出し、タンパク質結合力が下がり、溶出バッファが微量の金属イオンを含む場合があることが知られている。そして、金属イオンにおけるこのタンパク質にほぼ３つの配位が空位であるので、Ｈｉｓタグがないタンパク質には樹脂に結合するものもあり、精製後に汚染された溶出物が得られる。
【0009】
ＮＴＡなどの四座配位子キレートは、金属漏出に関してはより安定しているが、ＥＤＴＡなどの他のキレートやＤＴＴなどの還元剤が溶解バッファ中に含まれている場合は精製時に金属イオンを失ってしまう。ＥＤＴＡはキレートとしてより強力であり、膜の安定させるマグネシウムイオンを取り除いて溶解バッファ中のメタロプロテアーゼを抑制するのに必要とされ、濃度が２ｍＭを超える場合にはＮＴＡ樹脂からほとんどすべての金属イオンを取り除く。タンパク質のＳＨ基を安定化し、酸化してジスルフィド類になったり、タンパク質の二量体化したりするのを防止するのを助けるＤＴＴ（ジチオトレイトール）を添加すると、ニッケルなどの金属イオンを酸化して金属を非帯電化するので、タンパク質結合親和性が大幅に低くなる。
【0010】
これらの欠点は、ＥＤＴＡ含有バッファによっても取り除けないほど金属イオンと強く結合する安定的な５価のキレートを使用すれば緩和される。さらに、５座配位子キレートとニッケルなどの錯体は、ＤＴＴなどの還元剤に対しても顕著に安定的である。
【0011】
［先行技術］
Ｈｉｓタグされた遺伝子組み換えタンパク質の精製のための金属アフィニティ・クロマトグラフィは、ポラス（Ｐｏｒａｔｈ）らにより紹介された（Ｎａｔｕｒｅ２５８，５９８－５９９，１９７５）。この新しい技術は、キレートを介して固相に結合したＣｕ２＋やＺｎ２＋などの金属イオンがタンパク質側鎖のヒスチジンアミノ酸の供与基と相互作用するという発見を利用したものである。この相互作用は、ヒスチジンがプロトン化されていない状態であるｐＨが高い時に効果的であるが、ヒスチジンがプロトン化されるｐＨが低い時には、タンパク質が金属イオンで修飾された固相から溶出してしまうことがある。金属イオンの固定に用いられるリガンドはイミノ二酢酸であるが、ニッケルを金属として使用する場合、ＩＤＡは３つの配位基でニッケルと結合するが、ニッケル－キレート錯体の安定性はｐＨの変化、溶液内のキレート化剤や還元剤に対して低すぎ、表面からの金属の漏出が観察される。
Ｈｉｓタグされた遺伝子組み換えタンパク質の精製のための金属アフィニティ・クロマトグラフィは、ポラス（Ｐｏｒａｔｈ）らにより紹介された（Ｎａｔｕｒｅ２５８，５９８－５９９，１９７５）。この新しい技術は、キレートを介して固相に結合したＣｕ２＋やＺｎ２＋などの金属イオンがタンパク質側鎖のヒスチジンアミノ酸の供与基と相互作用するという発見を利用したものである。この相互作用は、ヒスチジンがプロトン化されていない状態であるｐＨが高い時に効果的であるが、ヒスチジンがプロトン化されるｐＨが低い時には、タンパク質が金属イオンで修飾された固相から溶出してしまうことがある。金属イオンの固定に用いられるリガンドはイミノ二酢酸であるが、ニッケルを金属として使用する場合、ＩＤＡは３つの配位基でニッケルと結合するが、ニッケル－キレート錯体の安定性はｐＨの変化、溶液内のキレート化剤や還元剤に対して低すぎ、表面からの金属の漏出が観察される。
【0012】
ＨｏｃｈｕｌｉらによるＥＰ ０ ２５３ ３０３ Ａ２は、ｚ－ε－リシンのカルボキシメチル化、脱保護、エポキシ活性化アガロースへの結合、そしてニッケルでの帯電により作成される置換ニトリロ三酢酸に基づく４座配位子リガンドに関する。この材料により、イミノ二酢酸と比較して改善が得られ、金属の漏出が画期的に抑制されたが、ＥＤＴＡなどのキレートや還元剤に対する安定性に関する制限は残っている。
【0013】
ＥＰ １ ２７６ ７１６において、Ｋａｐｐｅｌらはチオエーテルが結合したＮＴＡリガンドを記載している。制限についてはアミノ結合のニトリロ三酢酸と同じである。
【0014】
ＵＳ ６，４４１，１４６において、Ｍｉｎｈは、窒素とその結果生ずるカルボキシメチル化をブロックしつつ、リシンのエポキシ官能化結合によって五価のキレート樹脂を合成することを記載している。この化合物は、例えば、カルボジイミドの化学的性質などによる共有結合固定を行うための材料として使用することができる。
【0015】
Ｔａｌａｎｔａ １９８９，３６，３４１－３４６において、ＭｃＣｕｒｌｅｙらは、エチレンジアミンとカルボキシメチル化の生成物とを結合させることによる固定化トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）に基づいてＩＭＡＣ樹脂を開発した。しかし、本論文のエビデンスによれば、ＴＥＤとエチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－二酢酸との混合物が得られたにすぎない。
【0016】
Ｈａｎｅｒらは、カルボイミドの化学的性質によるＥＤＴＡの活性化とアミン官能性のアガロースに結合することにより合成されたコバルト五座配位子キレートをカルシウムイオンの除去に使用した。
【0017】
ＥＰ２ ０２２ ５６１において、Ｇｏｅｒｌｉｃｈらは、ＥＤＴＡやＤＴＰＡなどのポリカルボン酸を、過剰な凝縮剤の存在下でアミン修飾された固相に結合する方法を記載し、例えば、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が存在する。更に、１つのカルボキシ基のみを介してポリカルボン酸塩に結合することについて請求項に記載している。
【0018】
ＧｏｅｒｌｉｃｈらによるＥＰ ２ １８３０４９には少なくとも６つの配位基を有するキレートが記載されている。このキレートは、１つのカルボキシ基を介してカルボキサミド結合により固定され、複数のヒスチジン残基を有する遺伝子組み換えタンパク質の精製における金属固定化アフィニティ・クロマトグラフィに供されるものである。
【0019】
ＷＯ ２００９/００８８０２において、Ａｎｄｅｒｓｏｎらは、酸無水物を介してアミド官能化アガロースにカルボン酸無水物を結合することによる五座配位子の合成と、その製品が遺伝子組み換えタンパク質の検出や精製に公的である旨を記載している
【0020】
ＥＤＴＡやＤＴＰＡを二官能性リンカに結合させる例もある。ＵＳ ５，２８１，７０４の実施例６において、アミド結合により結合した２つのＤＴＰＡ分子からなる化合物が、ジシクロへキシルカルボジイミドによる活性化の後エチレンとＤＴＰＡテトラメチルエステルを結合させ、続いて水酸化ナトリウム溶液で加水分解することにより生成する。また、ＤＯＴＡやＥＤＴＡ，ＴＴＨＡなどの他のキレートも、リンカが結合された二量体キレートの一部として挙げられ、エステルまたはアミド官能基を介してリンカに結合されている。
【0021】
「反応性および官能性ポリマー」（Ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、２９（１９９６）２９－３９において、Ｂｒｏｓｓｅらは、ＥＤＴＡおよびＤＴＰＡ無水物をエチレングリコール、Ｎ－メチルジエタノールアミン、エチレンジアミン、およびその他多数のジオール類やジアミン類と結合させている。ＴｕｅｌｕｅとＧｅｃｋｅｌｅｒは、キレート無水物類とジオール類の一段反応によりＥＤＴＡおよびＤＴＰＡとポリエチレングリコールとの重縮合物を生成した。
【0022】
Ｇｅｃｋｅｌｅｒらによるマクロモレキュラー・ラピッド・コミュニケーション（Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ）,２００１,２２,８５５±８５８において、生分解性で金属と錯体を形成するペンダントカルボキシ基による水溶性糖コポリマーの合成を出版している。しかし、リンカが結合されたキレートが１つのカルボキシ基を介して固相に固定され、固相固定化キレート鎖を形成することは、これまで出版されていない。
【0023】
ＡｌｇｏｔｓｓｏｎらによるＵＳ２０１３／００７２６３８では、金属イオンと強く結合し、スキャフォールドを介して結合され、スキャフォールドに結合された基により炭水化物に結合する二量体五座配位子キレートが生成されている。ここでは、二量体キレートが２つ隣接して固定された金属イオンの結合により、総合的な結合効果を奏し、単量体の五価キレートと比較してより強くタンパク質と結合する。しかし、２つのキレート可能基を有する分岐状リンカの立体的要求により、この発明による材料は、キレート基密度において限界があり、よって、タンパク質結合力にも限界がある。
【0024】
ＷＯ２０１７／０４６６２５Ａ１は、Ｈｉｓタグされたタンパク質に対して高い結合力を有するキレート鎖を有するキレートの合成を記載している。
【0025】
本発明の目的は、性質が向上した、遺伝子組み換えタンパク質のアフィニティ精製において、特にキレート材が金属を担持しているものの場合に好適に使用可能である向上した固相キレート材を提供することである。
【発明の概要】
【0026】
本発明は、とりわけアルカリ溶液に対して高い安定性を示す固相キレート材と金属を担持した固相キレート材とを提供するものである。
【0027】
さらに、本発明は、上記固相キレート材の簡便な製造方法を提供するものである。
【0028】
さらに、本発明は、タンパク質の精製方法と、タンパク質、特に遺伝子組み換えタンパク質の精製のための固相キレート材の使用を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【0029】
本発明の第１態様によれば、固相と、該固相に結合されたポリアミン基と、該ポリアミン基に結合されたキレート基とを含む固相キレート材であって、少なくとも一部のポリアミン基がポリアミン基ごとに少なくとも２つのキレート基が結合しており、各キレート基は１つまたは数個のアミノポリカルボン酸基（ＡＰＡ基）を含み、少なくとも２つのキレート基に結合されたポリアミン基毎のＡＰＡ基の数は少なくとも３つである固相キレート材を提供する。
【0030】
本発明において、ポリアミン基とはポリアミン由来の基である。ポリアミンは、第１または第２アミノ基を有する有機分子であり、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つの第１および／または第２アミノ基を有する。これらのアミノ基の少なくとも一部は、もしくは好ましい実施形態において、これらのアミノ基の全ては、上記固相キレート材の合成において上記固相上の反応基および／または上記キレート基と反応する。これらアミノ基の反応は、第２または第３アミノ基やアミド基の形成につながってもよい。上記ポリアミンは、例えば水酸基など上記ポリアミンを固相に共有結合させるのに利用できる官能基をさらに有していてもよい。
【0031】
本発明におけるキレート基とは、キレート基前駆体由来の基である。キレート基前駆体は、例えばＥＤＴＡ分子などの１つのキレート分子またはキレート、もしくはお互いに共有結合により、好ましくはリンカ部位により結合した少なくとも２つまたは３つのキレート分子の組み合わせである。キレート基前駆体は、非活性でもよいし、例えば有機酸無水物基により活性となっていてもよい。
【0032】
上記に記した「ポリアミド基の少なくとも一部」とは、全てのポリアミン基が、ポリアミン基毎に少なくとも２つのキレート基と結合している状態、またはそのポリアミン基の一部のみがポリアミン基毎に少なくとも２つのキレート基と結合している状態を示す。少なくとも２つのキレート基に結合されたポリアミン基毎のＡＰＡ基の量は、特に、本発明の固相キレート材の合成における様々な反応相手の量により制御することができる。ポリアミン基の大部分もしくはすべてが少なくとも２つのキレート基と結合しているのが好ましい。
【0033】
上記キレート基は、単独のＡＰＡ基、二官能性リンカ部位Ｋを介してそれぞれと結合した２つ以上のＡＰＡ基により形成された直鎖状キレート鎖、三官能性リンカ部位Ｌを介してそれぞれと結合した３つ以上のＡＰＡ基により形成された分岐状キレート鎖、および少なくとも１つの二官能性リンカ部位Ｋと少なくとも１つの三官能性リンカ部位Ｌを介してそれぞれと結合した４つ以上のＡＰＡ基により形成された混合キレート鎖からなる群から選択されたものであることが好ましい。
【0034】
ポリアミン基に結合しているキレート基の数は好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つである。
【0035】
少なくとも２つのキレート基と結合した１つのポリアミン基に結合したＡＰＡ基の数は好ましくは、３から２０の範囲内であり、より好ましくは４から１５の範囲内である。上記少なくとも３つのＡＰＡ基は、それぞれ該ポリアミン基に結合した少なくとも３つの単量体ＡＰＡ基またはキレート基であってもよく、または、直鎖状および／または分岐状キレート鎖となって、二量体、三量体、四量体、….多量体キレート基を形成してもよい。
【0036】
ＩＵＰＡＣの定義によれば、「キレート」とは少なくとも２つの配位結合を形成することができる多座配位子リガンドを意味する。
【0037】
本発明において、キレートはアミノポリカルボン酸（ＡＰＡ）である。ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラアミン六酢酸）、ＥＤＤＳ（エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－二コハク酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン三酢酸からなる群から選択されたＡＰＡが使用されることが好ましい。
【0038】
第１のキレートの１つのカルボキシ基はアミド結合により上記固相に結合している。第１キレートの他のカルボキシ基はアミドを介してリンカに結合し、そのリンカは第２キレート、または第３キレートに共有結合して、該キレートが直鎖状鎖または分岐状鎖で固相に結合し、分子当たり１つだけのキレートの１つのカルボキシ基を介して固相へ結合している状態となる。よって、鎖毎に１つの修飾キレートのみが固相に結合するので、キレート鎖の立体的要求はキレートが１つの場合と同等となる。これにより、固相上のキレートが高密度となり、隣接するキレート基からの効果と共に高い結合力につながり、Ｈｉｓ-タグがないタンパク質と比較してＨｉｓタグタンパク質に対して高い親和性が得られる。
【0039】
本発明において、カルボン酸基は酸として記載されているが、遺伝子組み換えタンパク質のアフィニティ精製では一般的なｐＨが６から８．５の範囲では、カルボン酸基の大部分はカルボン酸塩状であり、アミノ基にはプロトン化しているものもある。記載を簡潔かつ明確に保つために、本文と請求項ではこれらの基は「ＣＯＯＨ」およびＮＨ２と記載する。
【0040】
好ましくは、上記ポリアミン基は、ペンタエリトリトールコアに基づいて、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタアミン、ペンタエチレンヘキサアミン、直鎖および分岐ポリエチレンイミン、ポリリシン、ポリプロピレンイミン、サイクラム、サイクレン、および１，４，７－トリアザシクロノナンなどのマクロ環状ポリアミン類、１，１，１－トリス（アミノメチル）エタン、トリスアミノエチルアミン、トリスアミノプロピルアミン、テトラキスエチルアミノアミン、テトラキスアミノプロピルアミンなどの分岐ポリアミン類、およびアミン官能化四官能性分岐ＰＥＧからなる群から選択されたポリアミン類から誘導されたものである。
【0041】
より好ましくは、上記ポリアミン基は、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタアミン、およびペンタエチレンヘキサアミンからなる群から選択されたポリアミン類から誘導されたものである。
【0042】
さらに好ましくは、上記ポリアミン基は、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタアミン、およびペンタエチレンヘキサアミンからなる群から選択されたポリアミン類から誘導されたものである。
【0043】
上記ポリアミン基は、官能性に影響しない限り、カルボン酸、水酸基など他の官能基を含んでいてもよい。
【0044】
本発明の好ましい実施形態において、キレート基は一般式：
（式中、式中、ＡＰＡ１およびＡＰＡ２は、同じまたは異なるものであり、ｎは１から５０までの整数であり、Ｋは二官能性直鎖部位である）、および／または一般式：
および／または一般式：
（式中、ＡＰＡ１，ＡＰＡ２，およびＡＰＡ３は、同じまたは異なるアミノポリカルボン酸であり、Ｌは三官能性リンカ部位）で示されるものであってもよい。
【化1】
【化2】
【化3】
【0045】
よって、本発明の好ましい固相キレート材において、上記キレート基は単独のＡＰＡ基、二官能性リンカ部位Ｋを介して結合した２つ以上のＡＰＡ基を有する直鎖状キレート鎖、三官能性リンカ部位Ｌを介して結合した３つ以上のＡＰＡ基を有する分岐状キレート鎖、または上記異なるタイプのキレート基の組み合わせであってもよい。
【0046】
さらに、上記ＡＰＡと上記リンカ部位とはアミド部位を介してお互いと結合している、および／またはキレート基とポリアミン基とはアミド部位を介してお互いと結合していることが好ましい。
【0047】
本発明の固相キレート材の上記キレート基は、１つまたは数個の二官能性リンカ部位Ｋおよび／または１つまたは数個の三官能性リンカ部位Ｌを有する構成であってもよい。
【0048】
本発明によれば、二官能性リンカ部位Ｋは、上記二官能性リンカ部位ＫはＡ－（ＣＨ２）ｎ－Ｂ、Ａ－Ｑ－Ｂ、および A－（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｍ－（ＣＨ２）ｎ－Ｂからなる群から選択されたものであってもよい。式中、ＡおよびＢはＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＭ、ＯＴ、Ｎ３などのカルボキシ基と反応可能な官能基である。ＮＨ２およびＮＨＲから選択されたものであることが好ましい。Ｒは一般式ＣｎＨ２ｎ＋１で示される炭化水素基であり、ｎは１から６の整数であり、ｍは１から１２の整数であり、ｎは２から１２の整数である。Ｑは２から１００の分子からなる直鎖または分岐構造であり、Ｃ、Ｈ、Ｎ、ＯおよびＳを任意で含み、炭水化物などの環状化合物を含む。
【0049】
二官能性リンカＫは、特にジアミンであってもよい。二官能性リンカＫは、エチレンジアミン、１,４－ジアミノブタン、１，６－ジアミノへキサン、１，８－ジアミノオクタン、および、ジェファーミンＥＤ－６００（Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ ＥＤ－６００、Ｈｕｎｓｔｓｍａｎ, アメリカ、テキサス、ザ・ウッドランズ）などのα,ω-アミノ官能性ポリプロピレングリコール化合物などのポリエーテルアミン類からなる群から選択されたものであることが好ましい。
【0050】
上記三官能性リンカ部位Ｌは、一般式
および
のいずれか１つにより示されるものであることが好ましく、式中Ａ、Ｄ、およびＥは好ましくは－ＮＨ２または－ＮＨＲであるカルボキシ基と反応可能な官能基であり、Ｂは好ましくはＣまたはＮの分岐原子であって少なくとも３つの安定した結合により好ましくは炭素原子と結合して官能基と結合しており、ｎ、ｍ、およびｏは２から３０の整数である。上記三官能性リンカ部位Ｌは、トリアミンであることが好ましい。上記三官能性リンカ部位Ｌは、グリセロールコアに基づいて、ジエチレントリアミン、１，１，１－トリス（２－アミノエチル）アミン、トリス（３－アミノプロピル）アミン、およびアミノ官能化三官能性分岐ＰＥＧからなる群から選択されたものであることがより好ましい。
【化4】
【化5】
【0051】
多価アミノポリカルボン酸樹脂の合成に使用されるリンカは、エチレンジアミン、１，３－ジアミンプロパントリス（３－アミノプロピル）－アミン、トリス（２－アミノエチル）アミン、および／またはジエチレントリアミンから選択されたものであることが好ましい。
【0052】
本発明の固相キレート材は、上記固相と上記ポリアミド基の間に挿入されたスペーサ部位Ｓを有する構成であってもよい。上記スペーサ部位は、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、１，２－エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル、アリルグリシジルエーテル、および臭化アリルからなる群から選択された化合物から誘導されたものであることが好ましい。上記スペーサ部位は、エーテル結合を介して固相に結合され、アミド結合を介して隣接するアミノポリカルボン酸と結合している構成であってもよい。
【0053】
好ましくは、固相は、クロマトグラフィの担持体であるアガロース、セルロース、寒天、デキストラン、キトサン、アルジネート、ゲラン、好ましくはアガロースから選択される。キレート基の最適な共有結合のためには、固相はポリアミン官能性であることが好ましい。
【0054】
または、固相は多孔質または無孔質のシリカ、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、その他の金属または半金属の酸化物を含むものであってもよく、シリカであることが好ましい。その他の固相としては、金層、ガラス、ポリスチレン、メタアクリレート類、アクリレート類、アクリルアミド類、ビニルアセテート、ビニルアルコールなどを含むものであってもよい。
【0055】
上記固相は、多孔質または無孔質の粒子、磁性シリカ、アガロース、ポリスチレン、スチレン誘導体、アクリレート、メタアクリレート、またはポリビニルアルコール粒子であってもよいが、これらに限定されない。
【0056】
上記固相は、好ましくは、センサ表面、膜、無孔質クロマトグラフィ担持体、多孔質クロマトグラフィ担持体、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆやｆａｌｃｏｎポリプロピレンチューブの塗布プラスチック表面などの塗布チューブ、塗布表面、塗布マイクロタイタプレート、アレイプレート、マイクロアレイ表面などであってもよい。
【0057】
本発明によれば、上記固相は、好ましくは、磁性アガロース、磁性シリカ、および磁性ポリマーであってもよい。より好ましくは上記固相は、磁性アガロースであってもよい。
【0058】
本発明によれば、上記固相は、好ましくは、デキストラン修飾された金チップおよび磁性ビーズからなる群から選択されたものであってもよい。
【0059】
当業者にとって、アミン修飾アガロースを生成する方法は多数あり、例えば、エピクロロヒドリンとの反応や、ポリアミンとの化学反応などがある。その他、クロロ酢酸ナトリウムとの反応により得られたカルボキシメチル化されたアガロースをポリアミン類との反応によりアミン類に修飾する。アミノ基のキレートのカルボキシ官能基との化学反応は、ＥＤＣなどの凝縮剤による活性化や、キレートの無水物をポリアミンと直接接触させることで行うことができる。第３のものとしては、アリル官能化を、アガロースをアリルグリシジルエーテルまたはアリルブロミドと反応させることで行うことができる。二重結合の臭素化ののち、該ハロゲン化物をポリアミンと反応させてもよい。
【0060】
アミン修飾のシリカ、ガラス、その他の金属酸化物は、例えば、３－グリシジルトリエトキシシランを塗布し、ポリアミン類と反応させることで生成することができる。金表面は、ポリアミン官能性であってもよい、いわゆる「自己組織化単分子膜」と呼ばれる長い、チオール官能性の直鎖分子を塗布することで修飾することができる。
【0061】
本発明による固相キレート材は、固相に共有結合している、キレートの鎖または分岐状のキレート分子からなるアミノポリカルボン酸分子を有する物質であってもよい。キレート鎖はリンカ分子によりキレートを結合して形成され、その鎖長は制御することが可能である。
【0062】
第２の態様によれば、本発明は金属イオン担持固相キレート材に関する。本金属イオンキレート剤は、上記の固相キレート材のいずれか１つを含み、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｍｎ２＋、およびＣａ２＋からなる群から選択された金属イオンを担持している。
【0063】
第３の態様によれば、本発明は上記固相キレート材の製造方法に関する。
【0064】
本発明の方法の第１形態は、ポリアミン基が結合した固相に少なくとも３つの単量体ＡＰＡを共有結合して、アミド基を介して少なくとも３つの単量体ＡＰＡ基が結合したポリアミン基を形成する工程を含む。
【0065】
本発明の方法の第２形態は、ポリアミン基が結合した固相に少なくとも２つの単量体ＡＰＡを共有結合して、アミド基を介して少なくとも２つの単量体ＡＰＡ基が結合したポリアミン基を有する固相材を形成する工程と、二官能性リンカＫまたは三官能性リンカＬを上記固相材に添加する工程と上記結合したリンカと第２のＡＰＡのカルボキシ基とを反応させる工程と、上記ポリアミン基に結合したＡＰＡ基の固相キレート材を形成する工程とを含む。上記ポリアミン基は固相に結合しており、任意でリンカの添加とその他のＡＰＡの添加を繰り返して上記直鎖状キレート鎖または分岐状キレート鎖の長さを延長する。この様にして製造した上記キレート基は直鎖状キレート鎖または分岐状キレート鎖の形となる。
【0066】
本発明の方法の第３形態は、少なくとも２つの単量体ＡＰＡと二官能性リンカＫまたは少なくとも３つの単量体ＡＰＡと三官能性リンカＬとを反応させ、直鎖状キレート鎖または分岐状キレート鎖を有する多量体ＡＰＡキレートを形成する工程と、少なくとも２つの多量体ＡＰＡキレートをポリアミン基が結合した固相に共有結合して、アミド基を介して少なくとも２つの直鎖状および／または分岐状キレート鎖が結合したポリアミン基を形成する工程、とを含む。
【0067】
ａ）好ましくは、二官能性リンカを介してＡＰＡ基が結合された直鎖状キレート基を有する固相キレート材の製造方法は、ＡＰＡと、ポリアミン基が結合した固相と、を準備する工程と、
ｂ）上記ＡＰＡの１つのカルボキシ基が固相と反応して、上記ＡＰＡを上記固相と結合し、上記ＡＰＡと上記固相とを凝縮剤の存在下にて結合する工程と、
ｃ）工程ｂ）において得られた固相材を二官能性リンカＫと混合する工程と、
ｄ）二官能性リンカＫの１つの反応性基を上記結合したＡＰＡと反応させ、上記二官能性リンカＫとＡＰＡカルボキシ基とを凝縮剤の存在下にて結合する工程と、
ｅ）工程ｄ）にて得られた固相材とその他のＡＰＡと混合する工程と、
ｆ）上記その他のＡＰＡの１つのカルボキシ基と、上記固相材に結合した官能性リンカＫの他の反応性基とを反応させ、上記その他のＡＰＡと上記二官能性リンカを凝縮剤の存在下にて結合する工程と、
ｇ）任意で工程ｃ）からｆ）まで少なくとも１回繰り返す工程と、を含む。
ｂ）上記ＡＰＡの１つのカルボキシ基が固相と反応して、上記ＡＰＡを上記固相と結合し、上記ＡＰＡと上記固相とを凝縮剤の存在下にて結合する工程と、
ｃ）工程ｂ）において得られた固相材を二官能性リンカＫと混合する工程と、
ｄ）二官能性リンカＫの１つの反応性基を上記結合したＡＰＡと反応させ、上記二官能性リンカＫとＡＰＡカルボキシ基とを凝縮剤の存在下にて結合する工程と、
ｅ）工程ｄ）にて得られた固相材とその他のＡＰＡと混合する工程と、
ｆ）上記その他のＡＰＡの１つのカルボキシ基と、上記固相材に結合した官能性リンカＫの他の反応性基とを反応させ、上記その他のＡＰＡと上記二官能性リンカを凝縮剤の存在下にて結合する工程と、
ｇ）任意で工程ｃ）からｆ）まで少なくとも１回繰り返す工程と、を含む。
【0068】
好ましくは、二官能性リンカを介してＡＰＡ基が結合された直鎖状キレート基を有する固相キレート材の製造方法は、
ａ）ＡＰＡ二無水物と、ポリアミン基が結合した固相材とを準備する工程と、
ｂ）各ＡＰＡ二無水物の１つの無水物基がアミノ部位と反応し、その他の無水物基が変化しないように上記ＡＰＡ二無水物と上記固相材を、結合したポリアミンのアミノ基を介して結合する工程と
ｃ）工程ｂ）において得られた上記固相材を無水溶媒にて洗浄し、上記結合していない二無水物を取り除く工程と、
ｄ）工程ｃ）において得られた上記固相材と、二官能性リンカＫとを準備する工程と、
ｅ）上記二官能性リンカＫの１つのアミン基と上記ＡＰＡ無水物基とを反応させ、上記二感応性リンカＫのその他の官能基を変化させずに、上記二官能性リンカＫと上記ＡＰＡ無水物基とを結合する工程と、
ｆ）上記固相を無水溶媒にて洗浄し、上記結合していないリンカ分子を取り除く工程と、
ｇ）工程ｆ）にて得られた上記固相材と、他のＡＰＡ二無水物とを準備する工程と、
ｈ）各ＡＰＡの１つのカルボキシ基を上記二官能性リンカＫの残りの官能基と反応させて、上記ＡＰＡ二無水物を上記二官能性リンカＫに結合する工程と、
ｉ）任意に、工程ｃ）からｈ）までを少なくとも１回繰り返す工程と、を含む。
ａ）ＡＰＡ二無水物と、ポリアミン基が結合した固相材とを準備する工程と、
ｂ）各ＡＰＡ二無水物の１つの無水物基がアミノ部位と反応し、その他の無水物基が変化しないように上記ＡＰＡ二無水物と上記固相材を、結合したポリアミンのアミノ基を介して結合する工程と
ｃ）工程ｂ）において得られた上記固相材を無水溶媒にて洗浄し、上記結合していない二無水物を取り除く工程と、
ｄ）工程ｃ）において得られた上記固相材と、二官能性リンカＫとを準備する工程と、
ｅ）上記二官能性リンカＫの１つのアミン基と上記ＡＰＡ無水物基とを反応させ、上記二感応性リンカＫのその他の官能基を変化させずに、上記二官能性リンカＫと上記ＡＰＡ無水物基とを結合する工程と、
ｆ）上記固相を無水溶媒にて洗浄し、上記結合していないリンカ分子を取り除く工程と、
ｇ）工程ｆ）にて得られた上記固相材と、他のＡＰＡ二無水物とを準備する工程と、
ｈ）各ＡＰＡの１つのカルボキシ基を上記二官能性リンカＫの残りの官能基と反応させて、上記ＡＰＡ二無水物を上記二官能性リンカＫに結合する工程と、
ｉ）任意に、工程ｃ）からｈ）までを少なくとも１回繰り返す工程と、を含む。
【0069】
本発明の上記の方法において、水または水性バッファを残った無水物基を加水分解する最後の工程で添加してもよい。
【0070】
好ましくは、二官能性リンカを介してＡＰＡ基が結合された直鎖状キレート基を有する固相キレート材の製造方法は、
ａ）ＡＰＡ二無水物と二官能性リンカＫを２：１から１：１の割合で、好ましくは２：１から１．２５：１の割合で準備する工程と、
ｂ）上記二官能性リンカＫと２つの異なる二無水物と反応させて、化合物ＡＰＡ１－Ｋ－（ＡＰＡ２－Ｋ）ｎ－ＡＰＡ３（式中、ＡＰＡ１は１つの無水物基と１つのアミド官能基を有するＡＰＡ、ＡＰＡ２は２つのアミド官能基を有するＡＰＡ、ＡＰＡ３は１つの無水物基を有するＡＰＡであり、ｎは０から５０、好ましくは０から１０の数字であり、Ｋは二官能性リンカ部位である）を形成して、上記ＡＰＡ二無水物を上記二官能性リンカＫにアミンを介して、または該リンカの水酸基を介して結合する工程と、
ｃ）ポリアミン基が結合した固相を準備する工程と、
ｄ）各ＡＰＡの１つのカルボキシ基をアミン部位と反応させ、その他の無水物基を変化させずに、上記リンカが結合した二無水物を上記担持体に上記固相に結合したポリアミン基のアミノ基を介して結合する工程と、
ｅ）水または水性バッファーを加えて上記残りの無水物基を加水分解する工程と、を含む。
ａ）ＡＰＡ二無水物と二官能性リンカＫを２：１から１：１の割合で、好ましくは２：１から１．２５：１の割合で準備する工程と、
ｂ）上記二官能性リンカＫと２つの異なる二無水物と反応させて、化合物ＡＰＡ１－Ｋ－（ＡＰＡ２－Ｋ）ｎ－ＡＰＡ３（式中、ＡＰＡ１は１つの無水物基と１つのアミド官能基を有するＡＰＡ、ＡＰＡ２は２つのアミド官能基を有するＡＰＡ、ＡＰＡ３は１つの無水物基を有するＡＰＡであり、ｎは０から５０、好ましくは０から１０の数字であり、Ｋは二官能性リンカ部位である）を形成して、上記ＡＰＡ二無水物を上記二官能性リンカＫにアミンを介して、または該リンカの水酸基を介して結合する工程と、
ｃ）ポリアミン基が結合した固相を準備する工程と、
ｄ）各ＡＰＡの１つのカルボキシ基をアミン部位と反応させ、その他の無水物基を変化させずに、上記リンカが結合した二無水物を上記担持体に上記固相に結合したポリアミン基のアミノ基を介して結合する工程と、
ｅ）水または水性バッファーを加えて上記残りの無水物基を加水分解する工程と、を含む。
【0071】
好ましくは、三官能性リンカを介して結合されたＡＰＡ基を有する分岐状キレート基を有する固相キレート材の製造方法は、
ａ）３：１から９：４の割合、好ましくは３：１から５：２の割合のＡＰＡ二無水物および三官能性リンカＬと、ポリアミン基が結合した固相とを混合する工程と、
ｂ）上記リンカを３つの異なる二無水物と反応させ、以下の式の内の１つの反応物を得て
（式中、ＡＰＡ１は、１つの無水物基を有するＡＰＡ基であり、ＡＰＡ２は２つのアミド基を有するＡＰＡであり、Ｌは三官能性リンカ部位である）、上記ＡＰＡ二無水物をアミン基を介して固相担持体に結合させて上記リンカに結合する工程と、
ｃ）ポリアミン基を有する固相を準備する工程と、
ｄ）各アミノポリカルボン酸の１つのカルボキシ基を上記アミン部位と反応させ、他の無水物基を変化させずに、上記リンカが結合したＡＰＡを、アミド基を介して上記担持体に結合して上記ポリアミン修飾された固相に結合する工程と、
ｅ）水または水性バッファーを加えて上記残りの無水物基を加水分解する工程と、を含む。
ａ）３：１から９：４の割合、好ましくは３：１から５：２の割合のＡＰＡ二無水物および三官能性リンカＬと、ポリアミン基が結合した固相とを混合する工程と、
ｂ）上記リンカを３つの異なる二無水物と反応させ、以下の式の内の１つの反応物を得て
【化6】
ｃ）ポリアミン基を有する固相を準備する工程と、
ｄ）各アミノポリカルボン酸の１つのカルボキシ基を上記アミン部位と反応させ、他の無水物基を変化させずに、上記リンカが結合したＡＰＡを、アミド基を介して上記担持体に結合して上記ポリアミン修飾された固相に結合する工程と、
ｅ）水または水性バッファーを加えて上記残りの無水物基を加水分解する工程と、を含む。
【0072】
さらに、本発明は、複数のアミノプロピルカルボン酸分子がアミド基を介して結合しているタンパク質のアフィニティ精製に使用可能な固相結合剤の生成方法を包含する。アミノプロピルカルボン酸は、二または三官能性リンカを介して他のキレートと接続しているキレートからなる。この発明の例は一般式：
で示され、式中Ｚは固相であり、Ｓは固相とキレートの両方に結合可能な任意のスペーサ分子であり、ｎは０または１であり、ＰＡはポリアミンであり、ＡＰＡはアミノプロピルカルボン酸、または二官能性リンカＫおよび／または三官能性リンカＬにてそれぞれと結合したＡＰＡ基の直鎖または分岐鎖である。
【化7】
【0073】
式中、３つおよび４つのアミノプロピルカルボン酸分子が１つのポリアミンに結合しているが、ポリアミンやポリアミン分子毎の既存のアミノ基の数によりアミノプロピルカルボン酸分子の数はそれよりも多くてもよく、５つ、６つ、またはそれ以上でもよい。
【0074】
第４の態様によれば、本発明は金属イオンを担持した固相キレート材の製造方法に関する。本方法は固相キレート材を製造するために上記の方法のうちの１つを実行する工程と、上記固相キレート材を、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇａ３＋＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋からなる群から選択された金属イオンの溶液と上記固相キレート材とを接触させることで、該金属イオンを固定する工程とを含む。
【0075】
第５態様によれば、本発明は、上記の固相キレート材または上記の方法の１つにより製造された固相キレート材の、分子生物学の分野における、複数のヒスチジン残基を有するタンパク質の精製、複数のヒスチジン残基を有する膜タンパク質の精製、複数のヒスチジン残基を有するＧＰＣＲの精製、複数のヒスチジン残基を有するトランスポータタンパク質の精製、および／または治療用タンパク質の精製のための使用に関する。
【0076】
第６の態様によれば、本発明は組み換えタンパク質またはポリペプチドの精製方法に関し、本精製方法は、
ａ）上記の金属を担持した固相キレート材または、上記の方法で製造された金属を担持した固相キレート材を準備する工程と、
ｂ）複数のヒスチジン部位を有するタンパク質またはペプチドを含む試料を準備する工程と、
ｃ）上記試料を、上記金属を担持した固相キレート材に接触させる工程と、
ｄ）上記結合したポリペプチドまたはタンパク質を上記溶液から分離する工程と、
e）上記遺伝子組み換えタンパク質またはポリペプチドを上記固相から溶出させる工程と、を含む。
ａ）上記の金属を担持した固相キレート材または、上記の方法で製造された金属を担持した固相キレート材を準備する工程と、
ｂ）複数のヒスチジン部位を有するタンパク質またはペプチドを含む試料を準備する工程と、
ｃ）上記試料を、上記金属を担持した固相キレート材に接触させる工程と、
ｄ）上記結合したポリペプチドまたはタンパク質を上記溶液から分離する工程と、
e）上記遺伝子組み換えタンパク質またはポリペプチドを上記固相から溶出させる工程と、を含む。
【0077】
好ましくは、上記方法において、上記タンパク質は上記タンパク質は膜タンパク質、ＧＰＣＲ、および抗原からなる群から選択されたものである。
【0078】
上記方法において、上記金属の結合とタンパク質の収率に干渉せず、ＥＤＴＡとイミダゾールとを上記結合バッファに添加して少なくとも２０ｍＭの濃度とし、ＤＴＴを添加して少なくとも１０ｍＭの濃度とすることが好ましい。
【0079】
上記方法において、上記固相に固定したアミノポリカルボン酸化合物は、水酸化ナトリウム溶液にて洗浄して汚染物質や付着したタンパク質を取り除いて上記固相キレート材を次回の生体分子生成用に再生することが可能であり、依然少なくとも１ｍｌ当たり５０ｍｇのタンパク質結合力を有する構成であることが好ましい。
【0080】
上述したように、本発明による物質を生成する方法は、基本的に２つある。
ａ） まず、第１キレートをポリアミド修飾された固相に共有結合し、そして二または三官能性リンカの一端をキレートに結合し、このリンカと第２キレートのカルボキシ基と反応させ、任意でカルボン酸官能基を介して第２リンカを第２キレートに結合し、第２リンカと反応する第３キレートを添加し、と続くもの、
ｂ）少なくとも２つの単量体キレートを二または三官能性リンカと反応させ、続いて１つのカルボン酸官能基を介して多量体キレートをポリアミド修飾された固相に結合するというもの。
ａ） まず、第１キレートをポリアミド修飾された固相に共有結合し、そして二または三官能性リンカの一端をキレートに結合し、このリンカと第２キレートのカルボキシ基と反応させ、任意でカルボン酸官能基を介して第２リンカを第２キレートに結合し、第２リンカと反応する第３キレートを添加し、と続くもの、
ｂ）少なくとも２つの単量体キレートを二または三官能性リンカと反応させ、続いて１つのカルボン酸官能基を介して多量体キレートをポリアミド修飾された固相に結合するというもの。
【0081】
結合したキレートの数は両方の方法について別々のアプローチで決定することができるのは、当業者にとって自明であろう。
ａ） キレートとリンカ分子を結合する工程を繰り返す回数は、方法ａ）においてキレート鎖の長さを制御する。よって、キレートとリンカ、そしてキレートと連続して結合することで、二量体キレートが得られ、キレート、リンカ、キレート、リンカ、そしてキレートと連続して結合することで、三量体キレートが生成される。
ｂ）方法ｂ）においてリンカとキレートの比率はキレート－リンカ鎖の鎖長さに影響する。よって、例えば、比率１：２でリンカを徐々にキレートの溶液に添加すると、一般式Ｃｈ－Ｌ－Ｃｈの分子が得られ、リンカをキレートに比率２：３で添加すると、一般式Ｃｈ－Ｌ－Ｃｈ－Ｌ－Ｃｈを有する物質が生成される（Ｌはリンカを意味し、Ｃｈはキレートを意味する）。リンカをキレートに比率１：１で添加すると、Ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ, ２９ （１９９６） ２９－３９（Ｂｒｏｓｓｅら）に示すように、長鎖（Ｃｈ－Ｌ）ｎが形成される。
ａ） キレートとリンカ分子を結合する工程を繰り返す回数は、方法ａ）においてキレート鎖の長さを制御する。よって、キレートとリンカ、そしてキレートと連続して結合することで、二量体キレートが得られ、キレート、リンカ、キレート、リンカ、そしてキレートと連続して結合することで、三量体キレートが生成される。
ｂ）方法ｂ）においてリンカとキレートの比率はキレート－リンカ鎖の鎖長さに影響する。よって、例えば、比率１：２でリンカを徐々にキレートの溶液に添加すると、一般式Ｃｈ－Ｌ－Ｃｈの分子が得られ、リンカをキレートに比率２：３で添加すると、一般式Ｃｈ－Ｌ－Ｃｈ－Ｌ－Ｃｈを有する物質が生成される（Ｌはリンカを意味し、Ｃｈはキレートを意味する）。リンカをキレートに比率１：１で添加すると、Ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ, ２９ （１９９６） ２９－３９（Ｂｒｏｓｓｅら）に示すように、長鎖（Ｃｈ－Ｌ）ｎが形成される。
【0082】
固相またはリンカにキレートを結合する１つの方法は、例えばＥＤＣや、カルボニルイミダゾール、ジスクシンイミジル炭酸塩などの他の凝縮剤、ＰｙＢＯＰやＨＢＴＵなどのその他のペプチド結合形成剤などを用いてカルボジイミド化学性質によってキレートを活性することと、反応物質を混合することを含む。また、リンカを活性化したキレートに添加したり、活性化したキレートをリンカに添加したりすることも好適である。また、リンカを活性化して、トシル官能基、トリフラート官能基、メシル官能基などを介してカルボキシ基に結合させてもよい。ＨｅｒｍａｎｓｏｎらによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第３版， ＩＳＢＮ： ９７８－０－１２－３８２２３９－０に一般的な方法の概略が記載されている。
【0083】
キレート鎖の形成の他の方法は、好ましくは１，４－ジオキサン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフォキシド、ジエチルエーテル、またはテトラヒドロフランなどの非プロトン性溶媒中のキレート二無水物の溶液にリンカや固相を添加することに基づいている。これら無水物の例としては、ＥＤＴＡ無水物、ＤＴＰＡ無水物およびＴＴＨＡ無水物が挙げられる。アミノ基を無水物に結合することにより、アミド結合が形成される。
【0084】
キレート鎖の合成と結合の後、反応生成物は、所望の目的タンパク質と結合可能な金属イオンで帯電させてもよい。Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｆｅ、Ｅｕ、Ｓｃは、可逆的なタンパク質の結合に好適であり、ニッケルとコバルトがＨｉｓタグされたタンパク質の精製に好ましいが、鉄とアルミナがリンタンパク質の単離に好ましい。例えば、ポリＨｉｓタンパク質のＩＭＡＣに関し、金属のアフィニティの順番はＣｕ＞Ｎｉ＞Ｚｎ＞Ｃｏであり、精製の特異性については、Ｃｕ＜Ｎｉ＜Ｚｎ＜Ｃｏの順番である。
【0085】
ポリヒスチジンタグは分子生物学において一般的であり、遺伝子組み換えタンパク質の分離に使用可能であり、大腸菌や酵母、哺乳類で表現される。よって、Ｈｉｓタグタンパク質は、ヒスチジン基が非プロトン化状態であるｐＨの値において金属担持キレートと結合し、残りのタンパク質の大部分は金属イオンとは相互作用しない。ｐＨの値が低くなり、ヒスチジンがプロトン化されると、タンパク質の金属イオンに対する相互作用が除かれ、タンパク質がカラムから溶出可能となる。あるいは、溶出は、金属イオンと結合し添加し、Ｈｉｓタグと置き換わりタンパク質を溶出させるイミダゾールを高濃度で添加することでも行うことができる。この方法では、１００から３００ｍＭの濃度のイミダゾールが一般的に使用される。
【0086】
上述したように、例えばＣｕ－ＩＤＡやＮｉ－ＮＴＡがクロマトグラフィ材として、生体化合物の混合物から遺伝子組み換えＨｉｓタグタンパク質を精製するのに用いられている。本発明による固相に固定されたアミノポリカルボン酸化合物もＨｉｓタグタンパク質の精製に用いることができる。キレートがリンカにより鎖状分子に結合し、固相とは１つだけの結合で結合しているので、立体的要求はモノＥＤＴＡと同等であるが、固定化されたキレートの数は大幅に多い。よって、Ｃｕ２＋に基づく金属結合力は非常に高い値となり、５０－８０μモル／ｍｌに達することができる。また、本発明による物質を用いて非常に多量のＨｉｓタグタンパク質を精製することができる。よって、以下の実施例では、１ｍｌ当たり８０ｍｇのタンパク質というキャパシティを得ることができる。
【0087】
また、キレートと、隣接する金属イオンとの距離が短いので、金属イオンは協力してＨｉｓタグタンパク質と結合することができ、単量体キレートと比較して親和性が高くなる。また、四座配位子（カルボン酸の代わりに２つのアミノ官能基を有するＥＤＴＡなどの六座配位子）と五座配位子（カルボン酸の代わりに１つのアミノ官能基を有するＥＤＴＡなどの六座配位子）の混合物を使用しても、親和性結合が強いため、本発明による物質は溶液ベースのキレート剤や還元剤に対して非常に良好な耐性を示す。よって、例えば、２０ｍＭのイミダゾール、２０ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのＤＴＴを結合バッファに添加する場合などの厳しい条件でもこの非常に高いタンパク質結合力が維持される。
【0088】
キレートと還元剤に対する耐性が高いので、本発明による物質は特に膜タンパク質の精製、特にＧＰＣＲの精製に好適である。多くの場合、膜タンパク質の精製においては、ドデシルマルトシドやｎ－テトラデシルホスホコリン（ＦＯＳ－１４）などの界面活性剤が、沈殿や変性に対して水溶液中のタンパク質を安定化するのに使用される。実験では、本発明による物質を膜タンパク質の精製についてテストしたが、高い結合力と界面活性剤に対する良好な耐性を示した。
【0089】
特に充填したカラムを使用する場合など経済的な精製手順で作業するため、次回の精製から汚染物を取り除くことができる溶液で再生し、汚染物がない状態で次の精製に樹脂を使用することを可能にする精製樹脂を開発することが望まれている。一般に当業者は、沈殿し非特異的に結合したタンパク質を、アフィニティカラムから効果的に除去できる１００ｍＭから５００ｍＭの濃度の水酸化ナトリウム溶液を使用する。本発明による物質の合成時に、タンパク質の精製や水酸化物溶液での処理の後でもこの樹脂の結合力は依然高く、他の比較対象の物質よりも大幅に高かった。０．５ＭのＮａＯＨで５分間繰り返し処理した後でも少なくとも樹脂１ｍｌ当たり５０μｍのタンパク質結合力が維持できた。
【0090】
セリン残基、トレオニン残基、またはチロシン残基の特異的なリン酸化反応は、細胞タンパク質活動の制御を行う上で最も一般的なメカニズムである。キナーゼが各アミノ酸の水酸基にリン酸部位を加えることを触媒する。タンパク質キナーゼの活動は、例えば環状ＡＭＰやＣａ２＋などの様々な細胞内の重要なシグナルにより制御される。ホスファターゼがタンパク質の特異的な脱リン酸化を触媒し、酵母がリン酸化状態と脱リン酸化状態間を切り替えることを可能にする。
【0091】
可逆的なタンパク質のリン酸化は、経膜シグナル伝達、信号の細胞内増幅、細胞サイクル制御など、幅広い細胞プロセスや細胞活動を制御することが長年知られている。そのようなリン酸化残基の分析は、シグナル変換の研究の中核をなすものである。アルミニウムイオン、鉄イオン、ガリウムイオンまたはユーロピウムイオンを担持した本物質により、非リン酸化細胞タンパク質画分からリン酸化画分を完全に分離することが可能である。リン酸化タンパク質がカラムに結合し、非リン酸化タンパク質が通過画分で回収されるアフィニティ・クロマトグラフィは、煩雑さを低減し、リン酸化プロファイルの研究を大いに資する。両方の画分との生物学的活動を完全に保持し、所望される場合さらに精製することができる。
【0092】
リン酸基をいずれかのアミノ酸に担持するタンパク質は固相に高い特異性を持って結合するが、リン酸基を有していないタンパク質はこの樹脂に結合せず、よって通過画分にて観察できることになる。
【0093】
精製については、ＣＨＡＰＳ、両性イオン界面活性剤、タプロテアーゼ抑制剤、そして任意でベンゾナーゼやその他のＤＮアーゼやＲＮアーゼを含むｐＨ６．０の２５ｍＭのＭＥＳバッファにて行い、タンパク質－核酸錯体を取り除く。洗浄工程を溶解バッファを用いて行い、精製したリンタンパク質をｐＨ７．５のリン酸カリウムバッファで溶出する。この手順により、本発明の物質は、強力なキレートや還元剤が存在していても効果的な精製を行うことができる。
【0094】
また、金属結合タンパク質は、好適な金属カチオンが固定化されている限り、ＩＭＡＣ樹脂に親和性を示す。よって、亜鉛フィンガ部位に対して様々な固定化金属イオンの親和性をｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ.２０１１,７９（１）：８８－９５にて実験し、結果、元素により異なる親和性を観察することができた。銅結合タンパク質は、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ, ２００６，５月号；６（９）：２７４６－２７５８に記載されるようにＣｕ－ＩＭＡＣカラムとＺｎＩＭＡＣカラムを用いて精製することができる。高いリガンド密度と金属カチオンへの強い結合により本発明の物質はこの応用について高い可能性を有する。
【0095】
また、金属イオンを担持したキレート樹脂は、核酸精製について好適である。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００５，２１，１４７２－１４７７において、一本鎖または二本鎖の核酸の分離方法が提示されている。この手順の原理は、固定化された金属イオンにイミダジル部位の可逆的吸着に基づいている。よって、部分的に変性されたゲノムＤＮＡをＩＭＡＣ樹脂に結合することができるが、アクセス可能なプリンベースのイミダジル基を有さない二本鎖プラスミドＤＮＡは固定化することができない。この方法により、ＣｕのＩＤＡアガロースを使って、１，０００，０００倍の除去を達成することができる。さらなる応用例としては、Ｐｌｏｓ ＯＮＥ，２０１１，６，１，ｅ１５４１２に記載されているような、ＰＣＲエラー生成物の除去が挙げられる。本発明の物質の非常に高い安定性と親和性によりこの物質はこの応用について好適である。
【0096】
本発明の物質のその他の応用例としては、溶液からの金属イオンの除去である。ＥＤＴＡは、約１４から２５の安定度定数を有する金属錯体を形成する（Ｍａｒｔｅｌｌ Ａ．Ｅ．＆Ｓｍｉｔｈ Ｒ．Ｍ．（１９８２），Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ，Ｖｏｌ．５：Ｆｉｒｓｔ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、アミノポリカルボン酸鎖修飾固相は、Ｎｉ２＋，Ｃｏ２＋，Ｍｎ２＋，Ｃｒ３＋，Ｐｂ２＋などの金属イオンを結合するのに効果的に使用可能であり、このキレート結合樹脂を液体に接触させるだけで溶液中のこれらの濃度を大幅に下げるのに使用可能である。一例として、カートリッジに充填可能なキレート修飾アガロース粒子の使用が挙げられ、カラムを通る際に液体の重金属の濃度を下げることができる。さらに、キレート鎖は、溶液に添加、混合され、金属イオンの結合の後に磁性分離機で分離することができる磁性アガロース粒子に結合させてもよい。
【0097】
本発明の他の一態様によれば、固相濃い手かアミノポリカルボン酸化合物は、固相、スペーサ分子、スペーサ分子に結合したポリアミン類、およびポリアミン類に結合した複数のアミノポリカルボン酸類からなる。
【0098】
上記アミノポリカルボキシ化合物において、上記スペーサがエーテル結合を開始って上記固相に結合され、隣接するアミノポリカルボン酸にアミドを介して結合されているのが好ましい。
【0099】
上記アミノポリカルボン酸化合物において、上記隣接するアミノポリカルボン酸は、アミド結合により上記固相に固定されているのが好ましい。
【0100】
上記アミノポリカルボキシ化合物において、ポリアミンに結合しているアミノポリカルボン酸の数は３から２０の範囲であることが好ましい。
【0101】
上記アミノポリカルボキシ化合物において、ポリアミンに結合しているアミノポリカルボン酸の数は４から１５の範囲であることが好ましい。
【0102】
上記アミノポリカルボキシ化合物において、上記スペーサは、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、１，２－エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテルをアガロースに結合して生成されたものである。
【0103】
上記アミノポリカルボキシ化合物において、上記スペーサは、アリルグリシジルエーテルまたは臭化アリルをアガロースに結合させ、続いて臭素化することで生成されたものであることが好ましい。
【0104】
上記アミノポリカルボキシ化合物において、上記アミノポリカルボン酸は一般式、
（ＡＰＡ１－Ｌ）ｎ－ＡＰＡ２
で示されるものであることが好ましく、
式中、ＡＰＡ１は２つのアミド官能基で接続された六座配位子キレート、ＡＰＡ２は六座配位子キレート、ＬはＡＰＡ１およびＡＰＡ２とアミド官能基を介して接続したリンカ分子、ｎは１から５０までの数である。
（ＡＰＡ１－Ｌ）ｎ－ＡＰＡ２
で示されるものであることが好ましく、
式中、ＡＰＡ１は２つのアミド官能基で接続された六座配位子キレート、ＡＰＡ２は六座配位子キレート、ＬはＡＰＡ１およびＡＰＡ２とアミド官能基を介して接続したリンカ分子、ｎは１から５０までの数である。
【0105】
上記アミノポリカルボキシ化合物において、リンカ分子はジアミンであることが好ましい。
【0106】
上記アミノポリカルボキシ化合物において、上記リンカ分子はエチレンジアミン、１,４－ジアミノブタン、１，６－ジアミノへキサン、１，８－ジアミノオクタン、およびジェファーミンＥＤ－６００（ＪｅｆｆａｍｉｎｅＥＤ－６００）からなる群から選択されたものであることが好ましい。
【0107】
上記アミノポリカルボキシ化合物において、上記アミノプロピルカルボン酸は、一般式：
にて示されるものであることが好ましく、
式中、ＡＰＡ１は、固相とリンカに２つのアミド官能基を介して結合した六座配位子キレートであり、ＡＰＡ２およびＡＰＡ３はアミド官能基を介してリンカに結合した六座配位子キレートであり、Ｌはリンカ分子である。
【化8】
式中、ＡＰＡ１は、固相とリンカに２つのアミド官能基を介して結合した六座配位子キレートであり、ＡＰＡ２およびＡＰＡ３はアミド官能基を介してリンカに結合した六座配位子キレートであり、Ｌはリンカ分子である。
【0108】
上記アミノポリカルボキシ化合物において、上記アミノプロピルカルボン酸は、一般式：
にて示されるものであり、
式中、ＡＰＡ１は、固相とリンカに２つのアミド官能基を介して結合した六座配位子キレートであり、ＡＰＡ２は２つのアミド官能基を介してリンカに結合した六座配位子キレートであり、ＡＰＡ３はアミド官能基を介してリンカに結合した六座配位子キレートであ、Ｌはリンカ分子である。
【化9】
式中、ＡＰＡ１は、固相とリンカに２つのアミド官能基を介して結合した六座配位子キレートであり、ＡＰＡ２は２つのアミド官能基を介してリンカに結合した六座配位子キレートであり、ＡＰＡ３はアミド官能基を介してリンカに結合した六座配位子キレートであ、Ｌはリンカ分子である。
【0109】
上記アミノポリカルボキシ化合物において、リンカ分子はトリアミンであることが好ましい。
【0110】
上記アミノポリカルボキシ化合物において、上記リンカ分子は、グリセロールコアに基づいて、エチレンジアミン、トリス（２－アミノエチル）アミン、トリス（２－アミノプロピル）アミン、またはアミノ官能化三官能性分岐ＰＥＧ
ジエチレントリアミンから選択されたものであることが好ましい。
ジエチレントリアミンから選択されたものであることが好ましい。
【0111】
上記アミノポリカルボキシ化合物において、上記アミノプロピルカルボン酸は一般式：
で示されるものであることが好ましく、式中、ＡＰＡ１およびＡＰＡ２は、アミド基を介して上記固相または上記リンカに結合したＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＴＴＨＡ、ＥＤＤＳ、ＥＧＴＡ、ＤＯＴＡ、およびＮＯＴＡから選択されたものであり、Ｌは二官能性分子である。
【化10】
【0112】
上記アミノポリカルボキシ化合物において、上記アミノプロピルカルボン酸は一般式：
で示されるものであることが好ましく、式中、ＡＰＡ１、ＡＰＡ２およびＡＰＡ３は、アミド基を介して上記固相または上記リンカに結合したＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＴＴＨＡ、ＥＤＤＳ、ＥＧＴＡ、ＤＯＴＡおよびＮＯＴＡから選択されたものであり、Ｌはリンカ分子である。
【化11】
【0113】
上記アミノポリカルボキシ化合物において、上記ポリアミンは、ペンタエリトリトールコアに基づいて、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタアミン、ペンタエチレンヘキサアミン、直鎖および分岐ポリエチレンイミン、ポリリシン、ポリプロピレンイミン、サイクラム、サイクレン、および１，４，７－トリアザシクロノナンなどのマクロ環状ポリアミン類、１，１，１－トリス（アミノメチル）エタン、トリスアミノエチルアミン、トリスアミノプロピルアミン、テトラキスエチルアミノアミン、テトラキスアミノプロピルアミンなどの分岐ポリアミン類、およびアミン官能化四官能性分岐ＰＥＧの群から選択されたものであることが好ましい。
【0114】
上記アミノポリカルボキシ化合物において、上記ポリアミンは、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタアミン、およびペンタエチレンヘキサアミンの群から選択されたものであることが好ましい。
【0115】
上記固相に固定化されたアミノポリカルボン酸化合物において、好ましくは、上記固相は、アガロース、セルロース、寒天、デキストラン、キトサン、アルジネート、ゲラン、好ましくはアガロースである。
【0116】
上記固相に固定化されたアミノポリカルボン酸化合物において、上記固相は、シリカ、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、二酸化アルミニウム、その他の金属または半金属の酸化物、金、ガラス、または、アクリレート類、メタアクリレート類、アクリルアミド類、スチレン誘導体、ビニルエステル類、ビニルアミド類、およびビニルアルコール類の群からのポリマーであることが好ましい。
【0117】
上記固相に固定化されたアミノポリカルボン酸化合物において、上記固相は、多孔質クロマトグラフィ担体、無孔質クロマトグラフィ担体、膜、塗布表面、塗布チューブ、センサ表面、マイクロアレイ表面、および塗布ミクロタイタプレートであることが好ましい。
【0118】
上記固相に固定化されたアミノポリカルボン酸化合物において、上記固相は、磁性アガロース、磁性シリカ、または磁性ポリマー、好ましくは磁性アガロースであることが好ましい。
【0119】
上記固相に固定化されたアミノポリカルボン酸化合物において、上記アミノポリカルボン酸は、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋から選択された金属イオンと接触する構成であることが好ましい。
【0120】
本発明の他の一態様によれば、固相、スペーサ分子、スペーサ分子に結合したポリアミンおよびポリアミンに共有結合した複数のアミノポリカルボン酸からなる上記固相固定化アミノポリカルボン酸化合物の合成は、以下の工程を含む：
ａ）ＥＤＴＡと、ポリアミン分子を有する固相とを準備する工程と、
ｂ）ＥＤＴＡを、ＥＤＴＡの１つの基を上記固相と反応させて、凝縮剤の存在下で上記固相と結合する工程と、
ｃ）工程ｂ）からの上記固相に固定されたＥＤＴＡと二官能性リンカを準備する工程と、
ｄ）上記リンカの１つの基をＥＤＴＡと反応させて、上記リンカを凝縮剤の存在下でＥＤＴＡのカルボキシ基と結合させる工程と、
ｅ）工程ｄ）からのリンカが共有結合して結合している状態の上記固相に固定化されたＥＤＴＡと、第２ＥＤＴＡ分子を準備する工程と、
ｆ）上記第２ＥＤＴＡの１つの基と上記固相とを反応させて、上記第２ＥＤＴＡを凝縮剤の存在下で上記リンカと結合する工程と、
ｇ）任意で、工程ｃ）からｆ）までを少なくとも１回繰り返す工程と、
ｈ）上記固相に固定されたアミノプロピルカルボン酸化合物を、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋から選択された金属イオンの溶液に接触させることで金属イオンを固定する工程。
ａ）ＥＤＴＡと、ポリアミン分子を有する固相とを準備する工程と、
ｂ）ＥＤＴＡを、ＥＤＴＡの１つの基を上記固相と反応させて、凝縮剤の存在下で上記固相と結合する工程と、
ｃ）工程ｂ）からの上記固相に固定されたＥＤＴＡと二官能性リンカを準備する工程と、
ｄ）上記リンカの１つの基をＥＤＴＡと反応させて、上記リンカを凝縮剤の存在下でＥＤＴＡのカルボキシ基と結合させる工程と、
ｅ）工程ｄ）からのリンカが共有結合して結合している状態の上記固相に固定化されたＥＤＴＡと、第２ＥＤＴＡ分子を準備する工程と、
ｆ）上記第２ＥＤＴＡの１つの基と上記固相とを反応させて、上記第２ＥＤＴＡを凝縮剤の存在下で上記リンカと結合する工程と、
ｇ）任意で、工程ｃ）からｆ）までを少なくとも１回繰り返す工程と、
ｈ）上記固相に固定されたアミノプロピルカルボン酸化合物を、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋から選択された金属イオンの溶液に接触させることで金属イオンを固定する工程。
【0121】
本発明の他の一態様によれば、固相、スペーサ分子、スペーサ分子に結合したポリアミンおよびポリアミンに共有結合した複数のアミノポリカルボン酸からなる上記固相固定化アミノポリカルボン酸化合物の合成は、以下の工程を含む：
ａ）ＥＤＴＡ二無水物と、ポリアミン分子を有する固相とを準備する工程と、
ｂ）各ＥＤＴＡの１つの無水物基をアミン部位と反応させ、その他の無水物を変化させずに、上記二無水物をアミノ基を介して上記担持体に結合させて、上記固相に結合する工程と、
ｃ）無水溶媒で上記固相を洗浄して、非結合二無水物を取り除く工程と、
ｄ）工程ｃ）からの固相に固定されたＥＤＴＡと、二官能性リンカ分子を準備する工程と、
ｅ）上記リンカの１つのアミン基をＥＤＴＡ無水物と反応させ、その他の官能基を変化させずに、上記リンカをＥＤＴＡ無水物基と結合させる工程と、
ｆ）上記固相を無水溶媒で洗浄し、上記非結合リンカ分子を取り除く工程と、
ｇ）工程ｆ）からのリンカが共有結合した、上記固相に固定されたＥＤＴＡと、追加のＥＤＴＡ二無水物とを準備する工程と、
ｈ）各アミノポリカルボン酸の１つのカルボキシ基と上記アミン部位とを反応させ、上記無水物を上記リンカに結合する工程と、
ｉ）任意で、工程ｃ）からｈ）までを少なくとも１回繰り返す工程と、
ｊ）上記固相に固定されたアミノポリカルボン酸化合物を、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇａ３＋＋、Ｍｎ2+、Ｃａ２＋から選択した金属イオンの溶液と接触させることで金属イオンを固定する工程。
ａ）ＥＤＴＡ二無水物と、ポリアミン分子を有する固相とを準備する工程と、
ｂ）各ＥＤＴＡの１つの無水物基をアミン部位と反応させ、その他の無水物を変化させずに、上記二無水物をアミノ基を介して上記担持体に結合させて、上記固相に結合する工程と、
ｃ）無水溶媒で上記固相を洗浄して、非結合二無水物を取り除く工程と、
ｄ）工程ｃ）からの固相に固定されたＥＤＴＡと、二官能性リンカ分子を準備する工程と、
ｅ）上記リンカの１つのアミン基をＥＤＴＡ無水物と反応させ、その他の官能基を変化させずに、上記リンカをＥＤＴＡ無水物基と結合させる工程と、
ｆ）上記固相を無水溶媒で洗浄し、上記非結合リンカ分子を取り除く工程と、
ｇ）工程ｆ）からのリンカが共有結合した、上記固相に固定されたＥＤＴＡと、追加のＥＤＴＡ二無水物とを準備する工程と、
ｈ）各アミノポリカルボン酸の１つのカルボキシ基と上記アミン部位とを反応させ、上記無水物を上記リンカに結合する工程と、
ｉ）任意で、工程ｃ）からｈ）までを少なくとも１回繰り返す工程と、
ｊ）上記固相に固定されたアミノポリカルボン酸化合物を、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇａ３＋＋、Ｍｎ2+、Ｃａ２＋から選択した金属イオンの溶液と接触させることで金属イオンを固定する工程。
【0122】
本発明の他の一態様によれば、固相、スペーサ分子、上記スペーサ分子に結合したポリアミンおよび上記ポリアミンに共有結合した複数のアミノポリカルボン酸からなる上記固相固定化アミノポリカルボン酸化合物の合成は以下の工程を含む：
ａ）ＥＤＴＡ二無水物と二官能性リンカを２：１から１：１の割合で、好ましくは２：１から１．２５：１の割合で準備する工程と、
ｂ）上記二官能性リンカと２つの異なる二無水物と反応させて、化合物ＡＰＡ１－Ｌ－（ＡＰＡ２－Ｌ）ｎ－ＡＰＡ３（式中、ＡＰＡ１は１つの無水物基と１つのアミド官能基を有するＥＤＴＡ、ＡＰＡ２は２つのアミド官能基を有するＥＤＴＡ、ＡＰＡ３は１つの無水物基を有するＥＤＴＡであり、ｎは０から５０、好ましくは０から１０の数字である）を形成して、上記二無水物を上記リンカにアミンまたは水酸基を介して結合する工程と、
ｃ）ポリアミン基を有する固相を準備する工程と、
ｄ）各アミノポリカルボン酸の１つのカルボキシ基をアミン部位と反応させ、その他の無水物基を変化させずに、上記リンカが結合した二無水物を上記担持体にアミノ基を介して固相に結合する工程と、
ｅ）水または水性バッファーを加えて上記残りの無水物基を加水分解する工程と、
ｆ）上記固相に固定されたアミノポリカルボン酸化合物を、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇａ３＋＋、Ｍｎ2+、Ｃａ２＋から選択した金属イオンの溶液と接触させることで金属イオンを固定する工程。
ａ）ＥＤＴＡ二無水物と二官能性リンカを２：１から１：１の割合で、好ましくは２：１から１．２５：１の割合で準備する工程と、
ｂ）上記二官能性リンカと２つの異なる二無水物と反応させて、化合物ＡＰＡ１－Ｌ－（ＡＰＡ２－Ｌ）ｎ－ＡＰＡ３（式中、ＡＰＡ１は１つの無水物基と１つのアミド官能基を有するＥＤＴＡ、ＡＰＡ２は２つのアミド官能基を有するＥＤＴＡ、ＡＰＡ３は１つの無水物基を有するＥＤＴＡであり、ｎは０から５０、好ましくは０から１０の数字である）を形成して、上記二無水物を上記リンカにアミンまたは水酸基を介して結合する工程と、
ｃ）ポリアミン基を有する固相を準備する工程と、
ｄ）各アミノポリカルボン酸の１つのカルボキシ基をアミン部位と反応させ、その他の無水物基を変化させずに、上記リンカが結合した二無水物を上記担持体にアミノ基を介して固相に結合する工程と、
ｅ）水または水性バッファーを加えて上記残りの無水物基を加水分解する工程と、
ｆ）上記固相に固定されたアミノポリカルボン酸化合物を、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇａ３＋＋、Ｍｎ2+、Ｃａ２＋から選択した金属イオンの溶液と接触させることで金属イオンを固定する工程。
【0123】
本発明の他の一態様によれば、固相、スペーサ分子、上記スペーサ分子に結合したポリアミンおよび上記ポリアミンに共有結合した複数のアミノポリカルボン酸からなる上記固相固定化アミノポリカルボン酸化合物の合成は以下の工程を含む：
ａ）ＥＤＴＡ二無水物と三官能性リンカを３：１から９：４の割合で、好ましくは３：１から５：２の割合で準備する工程と、
ｂ）上記リンカを３つの異なる二無水物と反応させ、以下の式の内の１つの反応物を得て
上記ＥＤＴＡ二無水物をアミン基を介して固相担持体に結合させて上記リンカに結合する工程と、
ｃ）式中、ＡＰＡ１は、１つの無水物基を有するＥＤＴＡであり、ＡＰＡ２は２つのアミド基を有するＥＤＴＡである、
ｄ）ポリアミン基を有する固相を準備する工程と、
ｅ）各アミノポリカルボン酸の１つのカルボキシ基を上記アミン部位と反応させ、他の無水物基を変化させずに、上記リンカが結合したＥＤＴＡを、アミド基を介して上記担持体に結合して上記ポリアミン修飾された固相に結合する工程と、
ｆ）水または水性バッファーを加えて上記残りの無水物基を加水分解する工程と
ｇ）上記固相に固定されたアミノポリカルボン酸化合物を、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇａ３＋＋、Ｍｎ2+、Ｃａ２＋から選択した金属イオンの溶液と接触させることで金属イオンを固定する工程。
ａ）ＥＤＴＡ二無水物と三官能性リンカを３：１から９：４の割合で、好ましくは３：１から５：２の割合で準備する工程と、
ｂ）上記リンカを３つの異なる二無水物と反応させ、以下の式の内の１つの反応物を得て
【化12】
ｃ）式中、ＡＰＡ１は、１つの無水物基を有するＥＤＴＡであり、ＡＰＡ２は２つのアミド基を有するＥＤＴＡである、
ｄ）ポリアミン基を有する固相を準備する工程と、
ｅ）各アミノポリカルボン酸の１つのカルボキシ基を上記アミン部位と反応させ、他の無水物基を変化させずに、上記リンカが結合したＥＤＴＡを、アミド基を介して上記担持体に結合して上記ポリアミン修飾された固相に結合する工程と、
ｆ）水または水性バッファーを加えて上記残りの無水物基を加水分解する工程と
ｇ）上記固相に固定されたアミノポリカルボン酸化合物を、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇａ３＋＋、Ｍｎ2+、Ｃａ２＋から選択した金属イオンの溶液と接触させることで金属イオンを固定する工程。
【0124】
上記固相固定化アミノポリカルボン酸化合物の合成において、上記アミノポリカルボン酸化合物、ＡＰＡ１、ＡＰＡ２、およびＡＰＡ３は、固相またはリンカにアミド基を介して結合したＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＴＴＨＡ、ＥＤＤＳ、ＥＧＴＡ、ＤＯＴＡ、およびＮＯＴＡから選択されたものであることが好ましい。
【0125】
上記固相固定化アミノポリカルボン酸化合物の合成において、上記二官能性リンカは、以下の一般式：
Ａ－（ＣＨ２）ｎ－ＢまたはＡ－Ｌ－ＢまたはＡ－（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ－（ＣＨ２）ｍ－Ｂ
（式中、ＡおよびＢはカルボン酸基と反応可能な官能基であり、－ＮＨ２、ＮＨＲから選択され、ｍおよびｎは２から２０の数字であり、Ｌは直鎖状または分岐状の原子２個から１００個からなる構造であり、Ｃ、Ｈ、Ｎ、ＯおよびＳを含んでいてもよく、炭水化物などの環状化合物を含む）のいずれか１つで示される二官能性分子であることが好ましい。
Ａ－（ＣＨ２）ｎ－ＢまたはＡ－Ｌ－ＢまたはＡ－（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ－（ＣＨ２）ｍ－Ｂ
（式中、ＡおよびＢはカルボン酸基と反応可能な官能基であり、－ＮＨ２、ＮＨＲから選択され、ｍおよびｎは２から２０の数字であり、Ｌは直鎖状または分岐状の原子２個から１００個からなる構造であり、Ｃ、Ｈ、Ｎ、ＯおよびＳを含んでいてもよく、炭水化物などの環状化合物を含む）のいずれか１つで示される二官能性分子であることが好ましい。
【0126】
上記固相固定化アミノポリカルボン酸化合物の合成において、上記二官能性リンカ分子は、エチレンジアミン、１,４－ジアミノブタン、１，６－ジアミノへキサン、１，８－ジアミノオクタン、およびジェファーミンＥＤ－６００（ＪｅｆｆａｍｉｎｅＥＤ－６００）の群から選択されたものであることが好ましい。
【0127】
上記固相固定化アミノポリカルボン酸化合物の合成において、上記三官能性リンカ分子は、グリセロールコアに基づいて、ジエチレントリアミン、トリス（２－アミノエチル）アミン、トリス（２－アミノプロピル）アミン、およびアミノ官能化三官能性分岐ＰＥＧの群から選択されたものであることが好ましい。
【0128】
他の一態様によれば、本発明は、上記上記固相固定化アミノポリカルボン酸化合物の分子生物の分野における使用に関する。
【0129】
他の一態様によれば、本発明は上記上記固相固定化アミノポリカルボン酸化合物の複数のヒスチジン残基を有するタンパク質の精製のための使用に関する。
【0130】
他の一態様によれば、本発明は上記上記固相固定化アミノポリカルボン酸化合物の複数のヒスチジン残基を有する膜タンパク質の精製のための使用に関する。
【0131】
他の一態様によれば、本発明は、上記固相固定化アミノポリカルボン酸化合物の複数のヒスチジン残基を有するＧＰＣＲの精製のための使用に関する。
【0132】
他の一態様によれば、本発明は、上記固相固定化アミノポリカルボン酸化合物の複数のヒスチジン残基を有するトランスポータタンパク質の精製のための使用に関する。
【0133】
他の一態様によれば、本発明は、上記固相固定化アミノポリカルボン酸化合物の治療用タタンパク質の精製のための使用に関する。
【0134】
他の一態様によれば、本発明は、遺伝子組み換えタンパク質の精製方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
a）Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇａ３＋＋、Ｍｎ２＋から選択された金属イオンを担持した、上記請求のいずれか一項に記載の固相固定化アミノポリカルボン酸を準備する工程と、
b)複数のヒスチジン部位を有するタンパク質またはポリペプチドを含む試料を準備する工程と、
ｃ）上記試料を上記固相固定化アミノポリカルボン酸と接触させる工程と、
ｄ）上記結合したポリペプチドまたはタンパク質を溶液から分離する工程と、
ｅ）上記遺伝子組み換えタンパク質またはポリペプチドを上記固相から溶出する工程。
a）Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｇａ３＋＋、Ｍｎ２＋から選択された金属イオンを担持した、上記請求のいずれか一項に記載の固相固定化アミノポリカルボン酸を準備する工程と、
b)複数のヒスチジン部位を有するタンパク質またはポリペプチドを含む試料を準備する工程と、
ｃ）上記試料を上記固相固定化アミノポリカルボン酸と接触させる工程と、
ｄ）上記結合したポリペプチドまたはタンパク質を溶液から分離する工程と、
ｅ）上記遺伝子組み換えタンパク質またはポリペプチドを上記固相から溶出する工程。
【0135】
好ましくは、上記方法において、上記タンパク質は膜タンパク質である。
【0136】
好ましくは、上記方法において、上記タンパク質はＧＰＣＲである。
【0137】
好ましくは、上記方法において、上記タンパク質は抗原である。
【0138】
上記方法において、上記金属の結合とタンパク質の収率に干渉せずに、ＥＤＴＡとイミダゾールとを上記結合バッファに添加して少なくとも２０ｍＭの濃度とし、ＤＴＴを添加して少なくとも１０ｍＭの濃度とすることが好ましい。
【0139】
他の一態様によれば、本発明は、上記に定義した金属担持固相固定化アミノポリカルボン酸の、複数のヒスチジン部位を有する遺伝子組み換えタンパク質またはポリペプチドの精製における金属固定化アフィニティ・クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）のための使用に関する。
【0140】
他の一態様によれば、本発明は、上記に定義した固相固定化アミノポリカルボン酸化合物の、リンタンパク質の精製のための使用に関する。
【0141】
他の一態様によれば、本発明は、上記に定義した固相固定化アミノポリカルボン酸化合物の、金属タンパク質の精製のための使用に関する。
【0142】
他の一態様によれば、本発明は、上記に定義した固相固定化アミノポリカルボン酸化合物の、核酸の精製のための使用に関する。
【0143】
上記の生体分子の精製方法において、上記に定義した固相固定化アミノポリカルボン酸化合物を水酸化ナトリウム溶液にて洗浄して汚染物質や付着したタンパク質を取り除いて上記固相キレート材を次回の生体分子生成用に再生することが可能であり、依然少なくとも１ｍｌ当たり５０ｍｇのタンパク質結合力を有する構成であることが好ましい。
【0144】
以下に、本発明の好ましい実施形態を説明する。実施例１ないし６は好ましい固相キレート材の製造についての合成の完全な指示を含む。比較例は従来技術のキレート材の合成に関する。また、レジンの金属の担持や、水酸化ナトリウム処理後のアミノポリカルボン酸樹脂６ｘＨｉｓ-ＧＦＰを説明する。
【図面の簡単な説明】
【0145】
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【0146】
実施例：固相結合キレート鎖の合成
実施例１：ジエチレントリアミンアガロースの生成、ＥＤＴＡのエチレンジアミンとの反応、ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡのアガロースへの共有結合による新規のキレートの合成
ジエチレントリアミンアガロースの生成
１０ｍｌのアガロース粒子（ＷｏｒｋＢｅａｄｓ ４０ ＳＥＣ， ＢｉｏＷｏｒｋｓ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ）を１０ｍｌの１Ｍ苛性ソーダ溶液に再懸濁し、サーモシェイカで２時間保温する。その後、５ｍｌエピクロロヒドリンを加え、懸濁液を３０℃で４時間加熱する。懸濁液を吸引ろ過でろ過し、脱イオン蒸留水で６回洗浄する。その後、アガロースを２０ｍｌの５％ジエチルトリアミン溶液（ｐＨ１０．５）に再懸濁し、６５℃で２０時間保温する。アガロースを吸引乾燥し、脱イオン蒸留水で４回、リン酸バッファした塩化ナトリウム水溶液で４回洗浄し、無水ジメチルホルムアミド内に保存する。
実施例１：ジエチレントリアミンアガロースの生成、ＥＤＴＡのエチレンジアミンとの反応、ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡのアガロースへの共有結合による新規のキレートの合成
ジエチレントリアミンアガロースの生成
１０ｍｌのアガロース粒子（ＷｏｒｋＢｅａｄｓ ４０ ＳＥＣ， ＢｉｏＷｏｒｋｓ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ）を１０ｍｌの１Ｍ苛性ソーダ溶液に再懸濁し、サーモシェイカで２時間保温する。その後、５ｍｌエピクロロヒドリンを加え、懸濁液を３０℃で４時間加熱する。懸濁液を吸引ろ過でろ過し、脱イオン蒸留水で６回洗浄する。その後、アガロースを２０ｍｌの５％ジエチルトリアミン溶液（ｐＨ１０．５）に再懸濁し、６５℃で２０時間保温する。アガロースを吸引乾燥し、脱イオン蒸留水で４回、リン酸バッファした塩化ナトリウム水溶液で４回洗浄し、無水ジメチルホルムアミド内に保存する。
【0147】
ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡの合成
８５３ｍｇのＥＤＴＡ二無水物（３．３３モル）を１５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、１００ｍｇのエチレンジアミン（１．６７ミリモル）を５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を激しく攪拌しながら、少量ずつ添加する。反応混合液を室温で１時間攪拌し、そして６０℃で４時間攪拌する。得られた生成物をさらに生成せずに直接アガロースに加えることができる。
８５３ｍｇのＥＤＴＡ二無水物（３．３３モル）を１５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、１００ｍｇのエチレンジアミン（１．６７ミリモル）を５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を激しく攪拌しながら、少量ずつ添加する。反応混合液を室温で１時間攪拌し、そして６０℃で４時間攪拌する。得られた生成物をさらに生成せずに直接アガロースに加えることができる。
【0148】
トリアミンアガロースへの結合
１０ｍｌのトリアミンアガロースを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、６００ｍｇのＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで６回洗浄する。
１０ｍｌのトリアミンアガロースを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、６００ｍｇのＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで６回洗浄する。
【0149】
実施例２：ペンタエチレンヘキサアミンアガロースの生成、ＥＤＴＡのエチレンジアミンとの反応、ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡのアガロースへの共有結合による新規のキレートの合成
ジエチレントリアミンアガロースの生成
１０ｍｌのアガロース粒子（ＷｏｒｋＢｅａｄｓ ４０ ＳＥＣ， ＢｉｏＷｏｒｋｓ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ）を１０ｍｌの１Ｍ苛性ソーダ溶液に再懸濁し、サーモシェイカで２時間保温する。その後、５ｍｌエピクロロヒドリンを加え、懸濁液を３０℃で４時間加熱する。懸濁液を吸引ろ過でろ過し、脱イオン蒸留水で６回洗浄する。その後、アガロースを２０ｍｌの５％ペンタエチレンヘキサアミン溶液（ｐＨ１０．５）に再懸濁し、６５℃で２０時間保温する。アガロースを吸引乾燥し、脱イオン蒸留水で４回、リン酸バッファした塩化ナトリウム水溶液で４回洗浄し、無水ジメチルホルムアミド内に保存する。
ジエチレントリアミンアガロースの生成
１０ｍｌのアガロース粒子（ＷｏｒｋＢｅａｄｓ ４０ ＳＥＣ， ＢｉｏＷｏｒｋｓ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ）を１０ｍｌの１Ｍ苛性ソーダ溶液に再懸濁し、サーモシェイカで２時間保温する。その後、５ｍｌエピクロロヒドリンを加え、懸濁液を３０℃で４時間加熱する。懸濁液を吸引ろ過でろ過し、脱イオン蒸留水で６回洗浄する。その後、アガロースを２０ｍｌの５％ペンタエチレンヘキサアミン溶液（ｐＨ１０．５）に再懸濁し、６５℃で２０時間保温する。アガロースを吸引乾燥し、脱イオン蒸留水で４回、リン酸バッファした塩化ナトリウム水溶液で４回洗浄し、無水ジメチルホルムアミド内に保存する。
【0150】
ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡの合成
８５３ｍｇのＥＤＴＡ二無水物（３．３３モル）を１５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、１００ｍｇのエチレンジアミン（１．６７ミリモル）を５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を激しく攪拌しながら、少量ずつ添加する。反応混合液を室温で１時間攪拌し、そして６０℃で４時間攪拌する。得られた生成物をさらに精製せずに直接アガロースに加えることができる。
８５３ｍｇのＥＤＴＡ二無水物（３．３３モル）を１５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、１００ｍｇのエチレンジアミン（１．６７ミリモル）を５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を激しく攪拌しながら、少量ずつ添加する。反応混合液を室温で１時間攪拌し、そして６０℃で４時間攪拌する。得られた生成物をさらに精製せずに直接アガロースに加えることができる。
【0151】
ヘキサアミンアガロースへの結合
１０ｍｌのヘキサアミンアガロースを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、６００ｍｇのＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで６回洗浄する。
１０ｍｌのヘキサアミンアガロースを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、６００ｍｇのＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで６回洗浄する。
【0152】
実施例３：ＥＤＴＡ、エチレンジアミン、ＥＤＴＡと順番に結合することによる二量体ＥＤＴＡ鎖の形成
ジエチルトリアミンアガロースの合成
１０ｍｌのアガロース粒子（ＷｏｒｋＢｅａｄｓ ４０ ＳＥＣ， ＢｉｏＷｏｒｋｓ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ）を１０ｍｌの１Ｍ苛性ソーダ溶液に再懸濁し、サーモシェイカで２時間保温する。その後、５ｍｌエピクロロヒドリンを加え、懸濁液を３０℃で４時間加熱する。懸濁液を吸引ろ過でろ過し、脱イオン蒸留水で６回洗浄する。その後、アガロースを２０ｍｌの５％ペンタエチレンヘキサアミン溶液（ｐＨ１０．５）に再懸濁し、６５℃で２０時間保温する。アガロースを吸引乾燥し、脱イオン蒸留水で４回、リン酸バッファした塩化ナトリウム水溶液で４回洗浄し、無水ジメチルホルムアミド内に保存する。
ジエチルトリアミンアガロースの合成
１０ｍｌのアガロース粒子（ＷｏｒｋＢｅａｄｓ ４０ ＳＥＣ， ＢｉｏＷｏｒｋｓ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ）を１０ｍｌの１Ｍ苛性ソーダ溶液に再懸濁し、サーモシェイカで２時間保温する。その後、５ｍｌエピクロロヒドリンを加え、懸濁液を３０℃で４時間加熱する。懸濁液を吸引ろ過でろ過し、脱イオン蒸留水で６回洗浄する。その後、アガロースを２０ｍｌの５％ペンタエチレンヘキサアミン溶液（ｐＨ１０．５）に再懸濁し、６５℃で２０時間保温する。アガロースを吸引乾燥し、脱イオン蒸留水で４回、リン酸バッファした塩化ナトリウム水溶液で４回洗浄し、無水ジメチルホルムアミド内に保存する。
【0153】
ＥＤＴＡ－アガロース（ＮＨ２）の合成
１０ｍｌのアミノアガロースを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、１５００ｍｇの４，４’－エチレンビス（２，６－モルホリンジオン）を１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物を乾燥したジメチルホルムアミドで６回洗浄する。
１０ｍｌのアミノアガロースを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、１５００ｍｇの４，４’－エチレンビス（２，６－モルホリンジオン）を１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物を乾燥したジメチルホルムアミドで６回洗浄する。
【0154】
ＥＤＴＡアガロースのエチレンジアミンでの修飾
１０ｍｌのＥＤＴＡアガロースを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、２ｍｌのエチレンジアミンを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。サーモシェイカで十分に混合した後、懸濁液を６５℃で６時間反応させる。その後、反応生成物を吸引ろ過し、乾燥したジメチルホルムアミドで６回洗浄し、ジメチルホルムアミドで再懸濁する。
１０ｍｌのＥＤＴＡアガロースを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、２ｍｌのエチレンジアミンを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。サーモシェイカで十分に混合した後、懸濁液を６５℃で６時間反応させる。その後、反応生成物を吸引ろ過し、乾燥したジメチルホルムアミドで６回洗浄し、ジメチルホルムアミドで再懸濁する。
【0155】
ＥＤＴＡ無水物との反応
１０ｍｌのＥＤＴＡ－ＥＤＡアガロースを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、５００ｍｇの４，４’－エチレンビス（２，６－モルホリンジオンを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで３回、脱イオン蒸留水で３回、リン酸バッファされた塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄し、さらにもう一度脱イオン蒸留水で洗浄する。
１０ｍｌのＥＤＴＡ－ＥＤＡアガロースを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、５００ｍｇの４，４’－エチレンビス（２，６－モルホリンジオンを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで３回、脱イオン蒸留水で３回、リン酸バッファされた塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄し、さらにもう一度脱イオン蒸留水で洗浄する。
【0156】
実施例４：ジェファーミン架橋したＥＤＴＡの合成と固相への結合による二量体ＥＤＴＡ鎖の形成
ＥＤＴＡ－ジェファーミン－ＥＤＴＡの合成
８５３ｍｇのＥＤＴＡ二無水物（３．３３ミリモル）を１５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、１０００ｍｇのジェファーミンＥＤ－６００（Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ ＥＤ－６００、Ｏ,Ｏ－ビス（２－アミノプロピル）ポリプロピレングリコール－ブロック－ポリエチレングリコール－ブロック－ポリプロピレングリコール、１．６７ミリモル）を１０ｍｌジメチルホルムアミドに溶解した溶液を激しく攪拌しながら少量ずつ加える。反応混合液を室温で１時間攪拌し、そして６０℃で４時間攪拌する。得られた生成物はさらなる精製をすることなく直接アガロースに加えることができる。
ＥＤＴＡ－ジェファーミン－ＥＤＴＡの合成
８５３ｍｇのＥＤＴＡ二無水物（３．３３ミリモル）を１５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、１０００ｍｇのジェファーミンＥＤ－６００（Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ ＥＤ－６００、Ｏ,Ｏ－ビス（２－アミノプロピル）ポリプロピレングリコール－ブロック－ポリエチレングリコール－ブロック－ポリプロピレングリコール、１．６７ミリモル）を１０ｍｌジメチルホルムアミドに溶解した溶液を激しく攪拌しながら少量ずつ加える。反応混合液を室温で１時間攪拌し、そして６０℃で４時間攪拌する。得られた生成物はさらなる精製をすることなく直接アガロースに加えることができる。
【0157】
アミンアガロースへの結合
１０ｍｌのアミノトリアミンアガロース（実施例１）を１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、６００ｍｇのＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで６回洗浄する。
１０ｍｌのアミノトリアミンアガロース（実施例１）を１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、６００ｍｇのＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで６回洗浄する。
【0158】
実施例５：エチレンジアミン架橋したＥＤＴＡの合成と固相への結合による三量体ＥＤＴＡ鎖の形成
ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡの合成
８５３ｍｇのＥＤＴＡ二無水物（３．３３ミリモル）を１５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、１３３ｍｇのエチレンジアミン（２．２２ミリモル）を５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を激しく攪拌しながら少量ずつ加える。反応混合液を室温で１時間、そして６０℃で４時間攪拌する。得られた生成物はさらに精製することなく直接アガロースに加えることができる。
ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡの合成
８５３ｍｇのＥＤＴＡ二無水物（３．３３ミリモル）を１５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、１３３ｍｇのエチレンジアミン（２．２２ミリモル）を５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を激しく攪拌しながら少量ずつ加える。反応混合液を室温で１時間、そして６０℃で４時間攪拌する。得られた生成物はさらに精製することなく直接アガロースに加えることができる。
【0159】
アミンアガロースへの結合
１０ｍｌのアミノトリアミンアガロース（実施例１）を１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、６００ｍｇのＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで６回洗浄する。
１０ｍｌのアミノトリアミンアガロース（実施例１）を１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、６００ｍｇのＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで６回洗浄する。
【0160】
実施例６：ＤＴＰＡ、エチレンジアミン、ＤＴＰＡと順番に結合させることによる二量体ＤＴＰＡ鎖の形成
ＤＴＰＡ－アガロースの合成
１０ｍｌのトリアミンアガロース（実施例１）を１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、１５００ｍｇのＤＴＰＡ二無水物を１５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで６回洗浄する。
ＤＴＰＡ－アガロースの合成
１０ｍｌのトリアミンアガロース（実施例１）を１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、１５００ｍｇのＤＴＰＡ二無水物を１５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで６回洗浄する。
【0161】
ＤＴＰＡアガロースのエチレンジアミンでの修飾
１０ｍｌのＤＴＰＡアガロースを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、２ｍｌのエチレンジアミンを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。サーモシェイカで十分に混合した後、懸濁液を６５℃で６時間反応させる。その後、反応生成物を吸引ろ過し、ジメチルホルムアミドで６回洗浄し、ジメチルホルムアミドで再懸濁する。
１０ｍｌのＤＴＰＡアガロースを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、２ｍｌのエチレンジアミンを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。サーモシェイカで十分に混合した後、懸濁液を６５℃で６時間反応させる。その後、反応生成物を吸引ろ過し、ジメチルホルムアミドで６回洗浄し、ジメチルホルムアミドで再懸濁する。
【0162】
ＤＴＰＡ無水物との反応
１０ｍｌのＤＴＰＡ－ＥＤＡアガロースを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、５００ｍｇＤＴＰＡ二無水物を１０ｍｌジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで３回洗浄し、そして脱イオン蒸留水で３回洗浄し、リン酸バッファされた塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄し、もう一度脱イオン蒸留水で洗浄する。
１０ｍｌのＤＴＰＡ－ＥＤＡアガロースを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、５００ｍｇＤＴＰＡ二無水物を１０ｍｌジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで３回洗浄し、そして脱イオン蒸留水で３回洗浄し、リン酸バッファされた塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄し、もう一度脱イオン蒸留水で洗浄する。
【0163】
比較例１：アミノアガロースの生成、ＥＤＴＡのアンモニアとの反応、およびＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡのアガロースへの共有結合による新規キレートの合成
アミノアガロースの合成
１０ｍｌのアガロース粒子（ＷｏｒｋＢｅａｄｓ ４０ ＳＥＣ， ＢｉｏＷｏｒｋｓ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ）を１０ｍｌの１Ｍ苛性ソーダ溶液に再懸濁し、サーモシェイカで２時間保温する。その後、５ｍｌエピクロロヒドリンを加え、懸濁液を３０℃で４時間加熱する。懸濁液を吸引ろ過でろ過し、脱イオン蒸留水で６回洗浄する。その後、アガロースを２０ｍｌの５％ペンタエチレンヘキサアミン溶液（ｐＨ１０．５）に再懸濁し、６５℃で２０時間保温する。アガロースを吸引乾燥し、脱イオン蒸留水で４回、リン酸バッファした塩化ナトリウム水溶液で４回洗浄し、無水ジメチルホルムアミド内に保存する。
アミノアガロースの合成
１０ｍｌのアガロース粒子（ＷｏｒｋＢｅａｄｓ ４０ ＳＥＣ， ＢｉｏＷｏｒｋｓ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ）を１０ｍｌの１Ｍ苛性ソーダ溶液に再懸濁し、サーモシェイカで２時間保温する。その後、５ｍｌエピクロロヒドリンを加え、懸濁液を３０℃で４時間加熱する。懸濁液を吸引ろ過でろ過し、脱イオン蒸留水で６回洗浄する。その後、アガロースを２０ｍｌの５％ペンタエチレンヘキサアミン溶液（ｐＨ１０．５）に再懸濁し、６５℃で２０時間保温する。アガロースを吸引乾燥し、脱イオン蒸留水で４回、リン酸バッファした塩化ナトリウム水溶液で４回洗浄し、無水ジメチルホルムアミド内に保存する。
【0164】
ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡの合成
８５３ｍｇのＥＤＴＡ二無水物（３．３３モル）を１５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、１００ｍｇのエチレンジアミン（１．６７ミリモル）を５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を激しく攪拌しながら、少量ずつ添加する。反応混合液を室温で１時間攪拌し、そして６０℃で４時間攪拌する。得られた生成物をさらに精製せずに直接アガロースに加えることができる。
８５３ｍｇのＥＤＴＡ二無水物（３．３３モル）を１５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、１００ｍｇのエチレンジアミン（１．６７ミリモル）を５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を激しく攪拌しながら、少量ずつ添加する。反応混合液を室温で１時間攪拌し、そして６０℃で４時間攪拌する。得られた生成物をさらに精製せずに直接アガロースに加えることができる。
【0165】
アミノアガロースへの結合
１０ｍｌのアミノアガロースを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、６００ｍｇのＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで６回洗浄する。
１０ｍｌのアミノアガロースを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、６００ｍｇのＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、吸引乾燥する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで６回洗浄する。
【0166】
レジンの金属担持
１０ｍｌのキレート樹脂を吸引乾燥し、０．１Ｍ（６．０ｐＨ）の酢酸で３回洗浄し、脱イオン蒸留水で１回洗浄する。残留物を硫酸ニッケルの３％溶液に加え、攪拌しながら３時間維持する。この混合物を吸引乾燥し、脱イオン蒸留水で５回洗浄する。そして、微生物の増殖を防ぐため、３０％のエタノール中の低塩バッファ（ｐＨ６．０～７．０）に保存することができる。
１０ｍｌのキレート樹脂を吸引乾燥し、０．１Ｍ（６．０ｐＨ）の酢酸で３回洗浄し、脱イオン蒸留水で１回洗浄する。残留物を硫酸ニッケルの３％溶液に加え、攪拌しながら３時間維持する。この混合物を吸引乾燥し、脱イオン蒸留水で５回洗浄する。そして、微生物の増殖を防ぐため、３０％のエタノール中の低塩バッファ（ｐＨ６．０～７．０）に保存することができる。
【0167】
または、硫酸ニッケルの代わりに硫酸ニッケル、硫酸鉄、塩化アルミニウム、塩化亜鉛、硫酸銅、硫酸ユウロピウムなどで置き換えることで樹脂をコバルト、鉄、アルミニウム、亜鉛、銅、その他の遷移金属やランタニドを担持するように構成してもよい。
【0168】
水酸化ナトリウム処理後のアミノポリカルボン酸樹脂による６ｘＨｉｓ－ＧＦＰの精製
１００μｌの樹脂の５０％スラリーをカラムに充填し、上澄みを除去した。そして、各資料を４ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウムで２回洗浄し、５分間放置した後、上澄みを除去した。
１００μｌの樹脂の５０％スラリーをカラムに充填し、上澄みを除去した。そして、各資料を４ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウムで２回洗浄し、５分間放置した後、上澄みを除去した。
【0169】
各カラムを４ｍｌ結合バッファＮＰＩ－１０（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、５分間放置した。
【0170】
１０ｍｇのＨｉｓタグＧＦＰ（緑色の蛍光タンパク質）を溶解バッファＮＰＩ－１０（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．４）に加え、１００μｌの樹脂の５０％スラリーと共に３０分間放置した。
【0171】
放置後、樹脂を２．５ｍｌのＮＰＩ－２０（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、１ｍｌのＮＰＩ－２５０（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）で３回溶出した。溶出画分を合わせ、４８８ｎｍで測定し、収率を算出して表１にまとめた。溶出分のゲルの写真を図１に示す。キレート添加物（２０ｍＭのＥＤＴＡと１０ｍＭのＤＴＴ）をＮＰＩ－１０に加え、テスト対象の樹脂のキレート剤、還元剤、アルカリ溶液に対する耐性を確認した。
【0172】
【表1】
【0173】
結果：
本発明による物質の結合力は、比較例の物質の結合力の３倍以上である。キレート剤ＥＤＴＡや還元剤ＤＴＴが本発明による物質の高い結合力に何ら影響しないこと、０．５Ｍの水酸化ナトリウム溶液による処理の後でもこの樹脂は依然高いタンパク質結合力を示すことが示された。
本発明による物質の結合力は、比較例の物質の結合力の３倍以上である。キレート剤ＥＤＴＡや還元剤ＤＴＴが本発明による物質の高い結合力に何ら影響しないこと、０．５Ｍの水酸化ナトリウム溶液による処理の後でもこの樹脂は依然高いタンパク質結合力を示すことが示された。
【0174】
実施例７：ペンタエチレンヘキサアミンアガロースの生成、ＥＤＴＡとエチレンジアミンとの反応、ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡのデキストランチップへの共有結合による新規キレートの合成
デキストラン修飾された金（ＳＣＲ Ｄ２００Ｍ－５， Ｘａｎｔｅｃ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，デュッセルドルフ、ドイツ）を１０ｍｌの０．５Ｍ苛性ソーダ溶液に再懸濁し、サーモシェイカで２時間インキュベートする。そして、５ｍｌのエピクロロヒドリンを加え、懸濁液を３０℃で４時間加熱する。上澄みをデキャンティングで除去し、試料を脱イオン蒸留水で６回洗浄する。そして、チップを２０ｍｌの５％ペンタエチレンヘキサアミン溶液（ｐＨ１０．５）に再懸濁し、４５℃で２０時間保温する。上澄みをデキャンティングで除去し、脱イオン蒸留水で４回洗浄し、リン酸バッファされた塩化ナトリウム水溶液で４回洗浄して、無水ジメチルホルムアミドで保存する。
デキストラン修飾された金（ＳＣＲ Ｄ２００Ｍ－５， Ｘａｎｔｅｃ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，デュッセルドルフ、ドイツ）を１０ｍｌの０．５Ｍ苛性ソーダ溶液に再懸濁し、サーモシェイカで２時間インキュベートする。そして、５ｍｌのエピクロロヒドリンを加え、懸濁液を３０℃で４時間加熱する。上澄みをデキャンティングで除去し、試料を脱イオン蒸留水で６回洗浄する。そして、チップを２０ｍｌの５％ペンタエチレンヘキサアミン溶液（ｐＨ１０．５）に再懸濁し、４５℃で２０時間保温する。上澄みをデキャンティングで除去し、脱イオン蒸留水で４回洗浄し、リン酸バッファされた塩化ナトリウム水溶液で４回洗浄して、無水ジメチルホルムアミドで保存する。
【0175】
ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡキレートの合成
８５３ｍｇのＥＤＴＡ二無水物（３．３３モル）を１５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、１００ｍｇのエチレンジアミン（１．６７ミリモル）を５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を激しく攪拌しながら、少量ずつ添加する。反応混合液を室温で１時間攪拌し、そして６０℃で４時間攪拌する。得られた生成物をさらに精製せずに直接固相、例えば、デキストランチップに加えることができる。
８５３ｍｇのＥＤＴＡ二無水物（３．３３モル）を１５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、１００ｍｇのエチレンジアミン（１．６７ミリモル）を５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を激しく攪拌しながら、少量ずつ添加する。反応混合液を室温で１時間攪拌し、そして６０℃で４時間攪拌する。得られた生成物をさらに精製せずに直接固相、例えば、デキストランチップに加えることができる。
【0176】
へキサアミンデキストランチップへのキレート結合
上記ヘキサアミン修飾チップを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、６００ｍｇのＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、上澄みをデキャンティングで除去する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで６回洗浄し、脱イオン蒸留水で４回洗浄し、そしてリン酸バッファされた塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄する。
上記ヘキサアミン修飾チップを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁し、６００ｍｇのＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、上澄みをデキャンティングで除去する。ろ過後、生成物をジメチルホルムアミドで６回洗浄し、脱イオン蒸留水で４回洗浄し、そしてリン酸バッファされた塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄する。
【0177】
金属担持
上記チップを２％硫酸ニッケル溶液にてインキュベートし、サーモシェイカで２時間インキュベートする。そして、上澄みをデキャンティングで除去し、チップを脱イオン蒸留水で６回洗浄し、２０ｍＭ酢酸バッファ（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、そして１０ｍＭの酢酸（ｐＨ６．５）と２０％エタノールの溶液に保存する。
上記チップを２％硫酸ニッケル溶液にてインキュベートし、サーモシェイカで２時間インキュベートする。そして、上澄みをデキャンティングで除去し、チップを脱イオン蒸留水で６回洗浄し、２０ｍＭ酢酸バッファ（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、そして１０ｍＭの酢酸（ｐＨ６．５）と２０％エタノールの溶液に保存する。
【0178】
実施例８：ペンタエチレンヘキサアミンアガロースの生成、ＥＤＴＡとエチレンジアミンとの反応、ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡの磁性アガロースへの共有結合による新規キレートを有する磁性粒子の合成
ペンタエチレンヘキサアミン磁性ビーズの合成
１０ｍｌの磁性アガロース粒子（Ｃｕｂｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ, モンハイム、ドイツ）
１０ｍｌの１Ｍ苛性ソーダ溶液に再懸濁し、サーモシェイカで２時間インキュベートする。その後、５ｍｌのエピクロロヒドリンを加え、３０℃で４時間加熱した。上澄みを磁気分離で除き、磁性ビーズを脱イオン蒸留水で６回洗浄する。そして、磁性アガロースを２０ｍｌの５％ペンタエチレンヘキサアミン溶液（ｐＨ１０．５）に再懸濁し、６５℃で２０時間保温する。磁気分離で上澄みを除き、そして磁性ビーズを脱イオン蒸留水で４回洗浄し、リン酸バッファされた塩化ナトリウム水溶液で４回洗浄してから、無水ジメチルホルムアミドに保存する。
ペンタエチレンヘキサアミン磁性ビーズの合成
１０ｍｌの磁性アガロース粒子（Ｃｕｂｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ, モンハイム、ドイツ）
１０ｍｌの１Ｍ苛性ソーダ溶液に再懸濁し、サーモシェイカで２時間インキュベートする。その後、５ｍｌのエピクロロヒドリンを加え、３０℃で４時間加熱した。上澄みを磁気分離で除き、磁性ビーズを脱イオン蒸留水で６回洗浄する。そして、磁性アガロースを２０ｍｌの５％ペンタエチレンヘキサアミン溶液（ｐＨ１０．５）に再懸濁し、６５℃で２０時間保温する。磁気分離で上澄みを除き、そして磁性ビーズを脱イオン蒸留水で４回洗浄し、リン酸バッファされた塩化ナトリウム水溶液で４回洗浄してから、無水ジメチルホルムアミドに保存する。
【0179】
ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡキレートの合成
８５３ｍｇのＥＤＴＡ二無水物（３．３３モル）を１５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、１００ｍｇのエチレンジアミン（１．６７ミリモル）を５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を激しく攪拌しながら、少量ずつ添加する。反応混合液を室温で１時間攪拌し、そして６０℃で４時間攪拌する。得られた生成物をさらに精製せずに直接磁気アガロースに加えることができる。
８５３ｍｇのＥＤＴＡ二無水物（３．３３モル）を１５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、１００ｍｇのエチレンジアミン（１．６７ミリモル）を５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を激しく攪拌しながら、少量ずつ添加する。反応混合液を室温で１時間攪拌し、そして６０℃で４時間攪拌する。得られた生成物をさらに精製せずに直接磁気アガロースに加えることができる。
【0180】
ヘキサアミン磁性アガロースへのキレートの結合
１０ｍｌのヘキサアミン磁性ビーズを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁再懸濁し、６００ｍｇのＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、上澄みを磁気分離で除く。そして、生成物をジメチルホルムアミドで６回洗浄し、脱イオン蒸留水で４回洗浄する。
１０ｍｌのヘキサアミン磁性ビーズを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに再懸濁再懸濁し、６００ｍｇのＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡを１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を加える。反応混合液を６０℃で６時間保温し、上澄みを磁気分離で除く。そして、生成物をジメチルホルムアミドで６回洗浄し、脱イオン蒸留水で４回洗浄する。
【0181】
金属担持
１０ｍｌのキレート官能化磁性ビーズを２０ｍｌの２％硫酸ニッケル溶液に再懸濁し、サーモシェイカで２時間インキュベートする。そして、上澄みを磁気分離で除き、該チップを脱イオン蒸留水で６回洗浄し、２０ｍＭの酢酸バッファ（ｐＨ６．０）で３回洗浄してから、１０ｍＭ酢酸（ｐＨ６．５）と２０％エタノールの溶液に保存する。
１０ｍｌのキレート官能化磁性ビーズを２０ｍｌの２％硫酸ニッケル溶液に再懸濁し、サーモシェイカで２時間インキュベートする。そして、上澄みを磁気分離で除き、該チップを脱イオン蒸留水で６回洗浄し、２０ｍＭの酢酸バッファ（ｐＨ６．０）で３回洗浄してから、１０ｍＭ酢酸（ｐＨ６．５）と２０％エタノールの溶液に保存する。
【0182】
実施例９：ペンタエチレンヘキサアミンアガロースの生成、ＥＤＴＡとエチレンジアミンとの反応、ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡの磁性ビーズへの共有結合による新規キレートを塗布した膜の合成
ＣＩＭエポキシカラム（Ｂｉａ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，アイドフシュチナ、スロバニア）を、蠕動ポンプを用いて脱イオン蒸留水で１０分間パージする。その後、１ＭのＮａＯＨ８０ｍｌに２０ｍｌの溶液を３５℃まで加熱し、上記カラムを通して３時間パージする。
ＣＩＭエポキシカラム（Ｂｉａ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，アイドフシュチナ、スロバニア）を、蠕動ポンプを用いて脱イオン蒸留水で１０分間パージする。その後、１ＭのＮａＯＨ８０ｍｌに２０ｍｌの溶液を３５℃まで加熱し、上記カラムを通して３時間パージする。
【0183】
カラムを脱イオン蒸留水で２０分間洗浄し、脱イオン蒸留水との５％ペンタエチレンヘキサアミンの溶液（ｐＨ１０．５）を６０℃で１０時間カラムに通してパージした。
【0184】
脱イオン蒸留水での２０分間の洗浄とＤＭＦでの１０分間の洗浄の後、ポンプを使用してＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡ溶液（上記のように生成）を５０℃で８時間カラムを通す。次の工程では、脱イオン蒸留水、リン酸バッファ（ｐＨ
７．０）、そして脱イオン蒸留水を各１０分間カラムにポンプを使って通した。
７．０）、そして脱イオン蒸留水を各１０分間カラムにポンプを使って通した。
【0185】
そして、カラムを１％硫酸ニッケル溶液の中で１時間放置し、そして脱イオン蒸留水で繰り返し２０分間洗浄する。このカラムのタンパク質結合力は、Ｈｉｓ－ＧＦＰで測定して、２～５ｍｇであり、このカラムはアルカリ溶液やＥＤＴＡに対して安定である。
【0186】
実施例１０：ペンタエチレンヘキサアミンアガロースの生成、ＥＤＴＡとエチレンジアミンとの反応、ＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡの磁性ビーズへの共有結合による新規キレートを塗布した表面の合成
デキストラン修飾金に基づく、無水マレイン酸で活性化した８ウェルのストリップ（ＳＣＲ Ｐｉｅｒｃｅｔｍ Ｍａｌｅｉｃ Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ， Ｃｌｅａｒ, ８ウェルストリップ, カタログＮｏ． １５１００， Ｐｉｅｒｃｅ， ロックフォード、アメリカ）を各２００μｌで洗浄する。そして、脱イオン蒸留水による５％ペンタエチレンヘキサアミン（１０．５ｐＨ）を１００μｌ追加し、該プレートを３７℃で３時間シェーカで保温する。
デキストラン修飾金に基づく、無水マレイン酸で活性化した８ウェルのストリップ（ＳＣＲ Ｐｉｅｒｃｅｔｍ Ｍａｌｅｉｃ Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ， Ｃｌｅａｒ, ８ウェルストリップ, カタログＮｏ． １５１００， Ｐｉｅｒｃｅ， ロックフォード、アメリカ）を各２００μｌで洗浄する。そして、脱イオン蒸留水による５％ペンタエチレンヘキサアミン（１０．５ｐＨ）を１００μｌ追加し、該プレートを３７℃で３時間シェーカで保温する。
【0187】
アミン溶液を除き、ウェルを脱イオン蒸留水で６回洗浄し、そしてウェル
ルエーテルで４回洗浄する。そして、５ｍｇのＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡを１５０μｌのジエチルエーテルに懸濁した懸濁液を加え、プレートを室温でシェーカを用いて振動させる。
ルエーテルで４回洗浄する。そして、５ｍｇのＥＤＴＡ－ＥＤＡ－ＥＤＴＡを１５０μｌのジエチルエーテルに懸濁した懸濁液を加え、プレートを室温でシェーカを用いて振動させる。
【0188】
上記プレートを脱イオン蒸留水で３回、リン酸バッファ（ｐＨ７．０）で３回、そしてもう一度脱イオン蒸留水で洗浄する。次の工程で、１２５μｌの２％硫酸ニッケル溶液を加え、プレートを室温でシェーカを用いて２時間振動させる。脱イオン蒸留水で５回洗浄した後に、プレートをタンパク質生成に使用できる。
【0189】
結果：
表面プラズモン共鳴による親和性測定
キレート修飾チップを２ＳＰＲ表面プラズモン共鳴システム（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ, バッファロー, アメリカ）を用いて測定した。
この実験において、ラニングバッファとブランクバッファは５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）であり、イミダゾールバッファは５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣＩおよび６００ｍｌのイミダゾール（ｐＨ７．６）であった。使用されたタンパク質は、３ｍｇ／ｍｌの濃度のＳＭＯＸ（６２，６４ｋＤａ，Ｎ末端、Ｈｉｓタグ）
表面プラズモン共鳴による親和性測定
キレート修飾チップを２ＳＰＲ表面プラズモン共鳴システム（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ, バッファロー, アメリカ）を用いて測定した。
この実験において、ラニングバッファとブランクバッファは５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）であり、イミダゾールバッファは５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣＩおよび６００ｍｌのイミダゾール（ｐＨ７．６）であった。使用されたタンパク質は、３ｍｇ／ｍｌの濃度のＳＭＯＸ（６２，６４ｋＤａ，Ｎ末端、Ｈｉｓタグ）
【0190】
ラニングバッファを用いて、タンパク質濃度を２５μＭ、１２.５μＭ、６.２５μＭ、３.１２５μＭ、１.５６μＭ、０.７８μＭ、０.３９０μＭ、および０.１９５μＭに調整した。
【0191】
使用された流量は１５μｌ／分であり、以下の溶液を使用した。
【0192】
ラニングバッファを８分間の会合期間でタンパク質と会合させ、そして２０分間の解離期間ラニングバッファを注いだ。その後、イミダゾールバッファを４分間の会合期間と２分間の解離期間で使用した。
【0193】
信号強度と時間間の曲線を記録し、プロットした。
【0194】
比較例２として、ＮｉＨＣ １０００Ｍ（Ｘａｎｔｅｃ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，デュッセルドルフ）を同じタンパク質とバッファで処理した。
【0195】
結果、親和性が低いので、ラニングバッファによる解離期間ではタンパク質はＮｉ－ＮＴＡチップと解離し始めることが分かった。本発明によるキレート修飾チップは水平な線を示し、キレートの高い親和性により、ラニングバッファによるタンパク質の顕著な喪失がないことを示した。
【図1】
【図2】
【図3】
【国際調査報告】