特表 2022-509451 発現系、組み換え細胞及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-20

(54)【発明の名称】発現系、組み換え細胞及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/67 20060101AFI20220113BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20220113BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220113BHJP

   C12N 15/52 20060101ALI20220113BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20220113BHJP

【ＦＩ】

C12N15/67 Z

C12P21/02 C

C12N5/10

C12N15/52 Z

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021547967

(86)(22)【出願日】2019-10-23

(85)【翻訳文提出日】2021-06-22

(86)【国際出願番号】 IB2019059076

(87)【国際公開番号】W WO2020084528

(87)【国際公開日】2020-04-30

(31)【優先権主張番号】62/749,789

(32)【優先日】2018-10-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521177418

【氏名又は名称】セレキシス エスエー

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】プウルセル，ルシル

(72)【発明者】

【氏名】バーガー，オードリー

(72)【発明者】

【氏名】レ フォーン，ヴァレリー

(72)【発明者】

【氏名】ファゲテ，セヴェリン

(72)【発明者】

【氏名】カラブレーゼ，デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】レガメイ，アレクサンドレ

(72)【発明者】

【氏名】マーモッド，ニコラス

(72)【発明者】

【氏名】パラッゾリ，ファビエン

(72)【発明者】

【氏名】ジロ，ピエール－アライン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA26

4B065CA44

(57)【要約】

高産生クローンにおいて構成的に上方制御される遺伝子のトランスクリプトーム分析を、関心のあるタンパク質の産生増加能についてそれぞれ評価した。これらの遺伝子の生成物（代謝影響生成物（ＭＩＰ））、例えばアクチン、Ｅｒｐ２７、Ｅｒｐ５７、Ｆｏｘａ１、ＰＰＡＲ、Ｃａ３及びＴａｇａｐは、シグナル伝達、タンパク質フォールディング、細胞骨格組織化及び細胞生存などの異なる機能カテゴリーにサブ分類され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つの調節配列の制御下で少なくとも１つのＭＩＰをコードする少なくとも１つの核酸を含む少なくとも１つの代謝影響生成物（ＭＩＰ）発現ベクターを含む、真核発現系。

【請求項2】

コードされるＭＩＰが、
－少なくとも１つの転写因子、好ましくはＦｏｘａ１（フォークヘッドボックスタンパク質Ａ１）などのパイオニア転写因子又は少なくとも１つのＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体）などの脂肪酸代謝に関与する少なくとも１つの転写因子、
－例えばＣａｓｃ３などの、ＲＮＡ翻訳を調節する少なくとも１つの因子及び／又は
－アクチンなどの少なくとも１つの構造タンパク質及び／又はＥｒｐ２７（小胞体タンパク質２７）などのタンパク質フォールディングタンパク質、又はＥｒｐ５７（小胞体タンパク質５７）などの個々のタンパク質フォールディングタンパク質と相互作用するタンパク質、
－Ｔａｇａｐ（Ｔ細胞活性化ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質）、Ｒａｓｓｆ９（Ｒａｓ結合ドメインファミリーメンバー９）、及び／又はＣｌｓｔｎ３（カルシンテニン３）などのシグナル伝達、小胞輸送及び又は細胞接着活性に関与する少なくとも１つのタンパク質、
－ＣＤＫ１５（サイクリン依存性キナーゼ１５）又はＣａ３（炭酸脱水酵素３）などの細胞生存及び／又は増殖に関与する少なくとも１つのタンパク質、
－ＣＦＬＡＲ（ＣＡＳＰ８及びＦＡＤＤ様アポトーシス調節因子）又はＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）などのアポトーシスに関与する少なくとも１つのタンパク質、及び／又は
－ＧＣＬＭ（グルタミン酸－システインリガーゼ調整因子サブユニット）又はＧＧＣＴ（ガンマ－グルタミルシクロトランスフェラーゼ）などのグルタチオン異化反応に関与する少なくとも１つのタンパク質、
である、請求項１に記載の真核発現系。

【請求項3】

前記少なくとも１つのＭＩＰが、少なくとも１つのＰＰＡＲ、特にＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ／δ又はＰＰＡＲγを含む、請求項１又は２に記載の真核発現系。

【請求項4】

前記少なくとも１つのＭＩＰが、Ｃａ３、Ｒａｓｓｆ９、Ｔａｇａｐ又はそれらの組み合わせなどの、Ｆｏｘａ１及び／又はＦｏｘａ１の二次的ＭＩＰを含む、請求項１～３の何れか１項に記載の真核発現系。

【請求項5】

前記少なくとも１つのＭＩＰが、アクチンである、請求項１～４の何れか１項に記載の真核発現系。

【請求項6】

前記少なくとも１つのＭＩＰが、Ｅｒｐ２７及び任意選択的にＥｒｐ５７を含むタンパク質フォールディングタンパク質である、請求項１～５の何れか１項に記載の真核発現系。

【請求項7】

前記少なくとも１つの調節配列が、ＣＭＶ、ＥＦ１アルファ、ＣＭＶ／ＥＦ１アルファ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＰＧＫ及び、ＣＭＶ、ＥＦ１アルファ、ＣＭＶ／ＥＦ１アルファ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＰＧＫの発現レベルを有するプロモーター及びそれらの組み合わせの群から選択されるプロモーターである、請求項１～６の何れか１項に記載の真核発現系。

【請求項8】

前記少なくとも１つのＭＩＰが、少なくとも１つの一次ＭＩＰ及び一次若しくは二次ＭＩＰのどちらでもない少なくとも１つの、又は２つ又は３つのさらなるＭＩＰを含む、請求項１～７の何れか１項に記載の真核発現系。

【請求項9】

少なくとも２つ、３つ、４つ、５つの又はそれより多いＭＩＰを含む、請求項１～８の何れか１項に記載の真核発現系。

【請求項10】

前記ＭＩＰ発現ベクターが、前記ＭＩＰをコードする核酸の第１のＩＴＲ（反転された末端反復）上流及び第２のＩＴＲ下流をさらに含む、請求項１～９の何れか１項に記載の真核発現系。

【請求項11】

前記少なくとも１つの調節配列が、任意選択的に前記第１のＩＴＲと第２のＩＴＲの間に、特異なＭＡＲエレメント又はＭＡＲコンストラクトを含む、ＭＡＲ１－６８及び／又はＭＡＲ Ｘ－２９などの、ＭＡＲエレメント又はＭＡＲコンストラクトを含む、請求項１～１０の何れか１項に記載の真核発現系。

【請求項12】

前記ＭＩＰ発現ベクターが、トランスポゾンドナーベクターでありかつ前記発現系が、トランスポサーゼ発現ヘルパーベクター又はｍＲＮＡをさらに含む、請求項１～１１の何れか１項に記載の真核発現系。

【請求項13】

関心のあるタンパク質をコードする核酸の挿入に適応された少なくとも１つの制限酵素切断部位を含みかつナトリウム－マルチビタミン輸送体ＳＬＣ５Ａ６などの抗生物質耐性遺伝子及び／又はビタミン輸送タンパク質を任意選択的にさらに含む担体ベクターを含む、請求項１～１２の何れか１項に記載の真核発現系。

【請求項14】

前記トランスポサーゼ発現ヘルパーベクターが、上流及び下流で非翻訳末端領域（ＵＴＲ）に、任意選択的に隣接される、ＰＢトランスポサーゼをコードする配列を含む、請求項１２又は１３に記載の真核発現系。

【請求項15】

（ａ）請求項１～１４の何れか１項に記載の真核発現系の発現ベクターを細胞に遺伝子移入すること及び／又は
ＭＩＰを発現する遺伝子のタンパク質産物の少なくとも１つの活性化因子を前記真核細胞に添加すること、及び
（ｂ）関心のあるタンパク質を含む担体ベクターを前記細胞に遺伝子移入すること
を含む方法。

【請求項16】

前記真核細胞に添加される前記少なくとも１つの活性化因子が、ベザフィブラートなどの、少なくとも１つ、２つ又は全てのＰＰＡＲ特にＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ／δ又はＰＰＡＲγの活性化因子である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記関心のあるタンパク質のＭＡ／ＥＬ（最大の抑止される／発現レベル）が、１．５ｘのＭＬ（最大のレベル）を超える、２ｘのＭＬを超える又はさらには２．５ｘ若しくは３ｘのＭＬを超える、請求項１５又は１６に記載の方法。

【請求項18】

１つの容器中に、請求項１～１７の何れか１項に記載の真核発現系を、かつ第２の容器中に、前記系の使用方法の説明書を含む、キット。

【請求項19】

少なくとも１つのＭＩＰの少なくとも１つの活性化因子をさらに含み、前記ＭＩＰが好ましくは、少なくとも１つのＰＰＡＲ、特にＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ／δ又はＰＰＡＲγであり、かつ前記活性化因子が、ベザフィブラートなどの、少なくとも１つ、２つ又は全てのＰＰＡＲの活性化因子である、請求項１８に記載のキット。

【請求項20】

請求項１～１４の何れか１項に記載の真核発現系を含む組み換え真核細胞。

【請求項21】

前記細胞が、少なくとも１つのＭＩＰを含むＭＩＰ発現ベクター又はその一部で少なくとも安定に遺伝子移入され、かつ好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項２０に記載の組み換え真核細胞。

【請求項22】

ＣＭＶ、ＥＦ１アルファ、ＣＭＶ／ＥＦ１アルファ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＰＧＫ及び、ＣＭＶ、ＥＦ１アルファ、ＣＭＶ／ＥＦ１アルファ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＰＧＫの発現レベルを有する外因性又は組み換え内因性プロモーター及びその組み合わせの群から選択される少なくとも１つの外因性プロモーターの制御下の少なくとも１つの内因性ＭＩＰを含む、組み換え真核細胞。

【請求項23】

前記少なくとも１つのＭＩＰが、プロモーターラダーのプロモーターの組み合わせの制御下にある、請求項２２に記載の組み換え真核細胞。

【請求項24】

関心のあるタンパク質をコードする導入遺伝子を発現する組み換え真核細胞の産生のための請求項１～１４の何れか１項に記載の真核発現系の使用。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

組み換え導入遺伝子の発現の相当な向上は、組み換えタンパク質、特に組み換え治療用タンパク質を発現する細胞の産生能を着実に強化してきた（Ｆａｒｒｅｌｌ，ＭｃＬｏｕｇｈｌｉｎ，Ｍｉｌｎｅ，Ｍａｒｉｓｏｎ，＆ Ｂｏｎｅｓ，２０１４；Ｋｉｍ，Ｋｉｍ，＆ Ｌｅｅ，２０１２；Ｗｕｒｍ，２００４）。

【0002】

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、組み換え治療用タンパク質産生のための、広く使用される宿主細胞ファクトリーである。これらは、ヒト様翻訳後修飾の生成するそれらの能力及び化学的に定義される培地中にて浮遊状態で高密度に増殖するそれらの能力を含む、いくつかの長所を提供する。さらに、ＣＨＯ細胞は、組み換え治療用タンパク質の産生のための安全な宿主であると考えられる（Ｈａｎｓｅｎ，Ｐｒｉｓｔｏｖｓｅｋ，Ｋｉｌｄｅｇａａｒｄ，＆ Ｌｅｅ，２０１７）。

【0003】

細胞工学は現在までのところ、最大生存細胞密度を上昇させること及び培養持続時間を延長させることによって、生存可能な細胞濃度の時間積分を向上させること、並びにＣＨＯ細胞の比生産性を向上させることに主に焦点を当ててきたが、これは、両パラメーターが組み換え治療用タンパク質の容積産生能に対する決定要因であるからである（Ｆａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。これは特に、アポトーシス、代謝、細胞周期及び分泌などの様々な細胞機能に関与する遺伝子発現を調整することにより達成された（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｈａｎｄｒｉｃｋ，＆ Ｏｔｔｅ，２０１５）。

【0004】

しかし、いくつかの細胞プロセスは、ＣＨＯ細胞において最適ではないか、又は治療用タンパク質産生にとって限定的なままであり、従って、特異的な遺伝子の過剰発現、下方制御又はノックアウトにより改善され得るということは、このような集中的な研究の対象となっていない（Ｂａｅｋ，Ｋｉｍ，Ｐａｒｋ，＆ Ｌｅｅ，２０１５；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。

【0005】

小胞体（ＥＲ）におけるタンパク質フォールディングは特に、治療用タンパク質産生にとってきわめて重要な段階であり、それは従って広く研究されてきた（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は、ネイティブジスルフィド結合形成を触媒する酵素であり、従ってタンパク質フォールディングを促進する。ＰＤＩはまた、誤って形成されたジスルフィド結合の再編成にも関与する（Ｗａｎｇ，Ｗａｎｇ，＆ Ｗａｎｇ，２０１５）。いくつかの研究がＰＤＩ過剰発現におけるいくつかの治療用タンパク質の比生産性の上昇を報告した一方で、他の研究は、比生産性又はタンパク質タイターにおいて影響がないこと又はさらにはそれを低下させることを観察した（Ｂｏｒｔｈ，Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ，Ｋｕｎｅｒｔ，＆ Ｋａｔｉｎｇｅｒ，２００５；Ｄａｖｉｓ，Ｓｃｈｏｏｌｅｙ，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｔｈｏｍａｓ，＆ Ｒｅｄｄｙ，２０００；Ｈａｙｅｓ，Ｓｍａｌｅｓ，＆ Ｋｌａｐｐａ，２０１０；Ｊｏｈａｒｉ，Ｅｓｔｅｓ、Ａｌｖｅｓ，Ｓｉｎａｃｏｒｅ，＆ Ｊａｍｅｓ，２０１５；Ｍｏｈａｎ，Ｐａｒｋ，Ｃｈｕｎｇ，＆ Ｌｅｅ，２００７；Ｐｙｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＤＩファミリーの別のメンバーであるＥｒｐ５７も、治療用タンパク質産生の改善におけるその可能性について調べられた。Ｅｒｐ５７は、２つのＥＲレクチンシャペロンカルレティキュリン（ＣＲＴ）及びカルネキシン（ＣＮＸ）との相互作用を介してグリコシル化タンパク質のジスルフィド結合形成を誘発する。（Ｔａｎｎｏｕｓ，Ｐｉｓｏｎｉ，Ｈｅｂｅｒｔ，＆ Ｍｏｌｉｎａｒｉ，２０１５）。ＣＨＯ細胞由来のＥｒｐ５７の又はＣＮＸ及びＣＲＴの両方の上方制御は、ＣＨＯ細胞においてトロンボポエチンの比生産性を上昇させることが見出された（Ｃｈｕｎｇ，Ｌｉｍ，Ｈｏｎｇ，Ｈｗａｎｇ，＆ Ｌｅｅ，２００４；Ｈｗａｎｇ，Ｃｈｕｎｇ，＆ Ｌｅｅ，２００３）。しかし、Ｅｒｐ５７のマウスバージョンの発現は、α_１－アンチトリプシンの及びＣ１エステラーゼ阻害剤の比生産力を低下させた（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。これらの矛盾した影響は、個々の酵素発現レベル、起源並びに発現された治療用タンパク質によるものであり得る（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。

【0006】

治療用タンパク質産生をおそらく改善するためにその発現が調整され得る多量の遺伝子を考えて、より網羅的な工学的ストラテジーは、遺伝子発現の主要な調節因子として作用し得る転写因子の発現に焦点を合わせてきた（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。特に、ＥＲストレス関連転写因子、ｓＸＢＰ１、ｓＡＴＦ６、ＡＴＦ４及びＣＨＯＰの過剰発現は、様々な治療用タンパク質の比生産性及び／又はタイターをうまく向上させたが（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｆｌｏｒｉｎ，Ｐｆｉｚｅｎｍａｉｅｒ，＆ Ｋａｕｆｍａｎｎ，２００８；Ｃａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｇｕｌｉｓ，Ｓｉｍｉ，ｄｅ Ｔｏｌｅｄｏ，Ｍａｒａｎｈａｏ，＆ Ｂｒｉｇｉｄｏ，２０１４；Ｈａｒｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｋｕ，Ｎｇ，Ｙａｐ，＆ Ｃｈａｏ，２００８；Ｎｉｓｈｉｍｉｙａ，Ｍａｎｏ，Ｍｉｙａｄａｉ，Ｙｏｓｈｉｄａ，＆ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，２０１３；Ｏｈｙａ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｐｙｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｔｉｇｇｅｓ ＆ Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，２００６）、矛盾する結果がｓＸＢＰＩ過剰発現において得られた（Ｋｕ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｒａｈｉｍｐｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。さらに、多くの細胞プロセスに対し多面的な影響を有するジンクフィンガー転写因子であるＹＹ１の過剰発現は、ＣＨＯ細胞における抗体タイターの上昇をもたらした（Ｔａｓｔａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

【0007】

これらの進歩にもかかわらず、治療用タンパク質に関係なく、その上方又は下方制御が一致して好ましい効果をもたらし得るＣＨＯ細胞活性を同定することは、今までのところ困難である。さらに、わずかなチャイニーズハムスター遺伝子しか、治療用タンパク質産生を向上させるそれらの可能性について調べられていない。同時に、臨床及び治療での使用のために十分なタイターで発現させることが依然として困難である、ますます多くのキメラ又は改変治療用タンパク質がある（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。

【0008】

ビタミンＢ５輸送タンパク質用の発現ベクターの遺伝子移入と組み合わせた、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞培地中のビタミンＢ５の欠乏がどのように、「発現容易な」（ＥＴＥ）トラスツズマブ抗体、並びに他の状況では治療用タンパク質産生に十分なレベルで発現され得ない「発現困難な」（ＤＴＥ）タンパク質、例えばインフリキシマブを含む、組み換えタンパク質を非常に高レベルで発現できる細胞変異体の同定を可能にするかについては以前に記載された（国際公開第２０１６／１５６５７４号パンフレット、米国特許出願公開第２０１８００６６２６８号明細書）。

【0009】

しかし、これらの高生産性で高効率の細胞は依然として、全ての安定に遺伝子移入され、かつ選択される細胞の非常に小さい割合であり、従って同定及び単離することは今もなお難しい。本文書及び／又は添付の文献目録で言及される、特許及び特許出願公開を含む刊行物は、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。

【0010】

関心のある分子の産生において永久的により効果的である細胞株、特にＣＨＯ細胞株を構築するために、このような所望の産生特性を付与するこれらの高生産細胞の特定の改変を同定することが当技術分野で必要とされている。このような特性を有する発現系及び細胞を生成するために、高産生細胞において見出される特定の改変の知識を使用することも当技術分野で必要とされている。本明細書中に記載の発明は、これ及び他のニーズに取り組む。

【発明の概要】

【0011】

ＭＩＰ（即ち代謝に影響する生成物）を発現する発現ベクター／系の使用、特にＭＩＰ又はＭＩＰの組み合わせを発現するための、好ましくはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞の代謝を改善するための、より具体的には例えば関心のあるタンパク質、好ましくは治療用タンパク質の産生の増加を引き起こす哺乳動物細胞の代謝を改善するためのそれらの使用が、本明細書中で開示される。ＭＩＰを発現するために操作された細胞も本明細書中で開示される。ＭＩＰ候補は表１に列挙され、好ましくは図１Ｄに列挙される細胞機能に関係する。

【0012】

ＭＩＰは好ましくは、ｍＰＰＡＲα及び／又はＦｏｘａ１転写因子、ｍ（マウス）ＰＰＡＲα及び／又はＦｏｘａ１活性化ＣＨＯ細胞遺伝子又はヒトホモログなどのホモログ、アクチンなどの構造タンパク質、ｍＲＮＡ翻訳などの細胞の基礎代謝、Ｔａｇａｐ、Ｒａｓｓｆ９、Ｅｒｐ２７、Ｅｒｐ５７、Ｃｌｓｔｎ３などのシグナル伝達及び輸送活性に関与するタンパク質、細胞生存タンパク質ＣＤＫ１５及びＣａ３、ＣＦＬＡＲ又はＳＯＤ１などのアポトーシスに関与するタンパク質、ＧＣＬＭ又はＧＧＣＴなどのグルタチオン異化反応に関与するタンパク質、又はそれらの特異的な組み合わせを含む。本発明の細胞は、上記ＭＩＰ又はＭＩＰヒトホモログを過剰発現し、及び／又はベザフィブラートＰＰＡＲアゴニスト及び他の化学又は生物学的アゴニストなどの、上記ＭＩＰ活性を上昇させる化学物質で処理される。

【0013】

一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの調節配列の制御下で少なくとも１つのＭＩＰをコードする少なくとも１つの核酸を含む少なくとも１つの代謝影響生成物（ＭＩＰ）発現ベクターを含む真核発現系を対象とし、ここでＭＩＰは好ましくは表１の１つであり、特に：
－少なくとも１つの転写因子、より好ましくはパイオニア転写因子、例えばＦｏｘａ１（フォークヘッドボックスタンパク質Ａ１）又は脂肪酸代謝に関与する少なくとも１つの転写因子、例えば少なくとも１つのＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体）、
－ＲＮＡ翻訳を調節する少なくとも１つの因子、例えばＣａｓｃ３など、及び／又は
－少なくとも１つの構造タンパク質、例えばアクチン、及び／又はタンパク質フォールディングタンパク質、例えばＥｒｐ２７（小胞体タンパク質２７）、又は個々のタンパク質フォールディングタンパク質と相互作用するタンパク質、例えばＥｒｐ５７（小胞体タンパク質５７）、
－シグナル伝達、小胞輸送及び又は細胞接着活性に関与する少なくとも１つのタンパク質、例えばＴａｇａｐ（Ｔ細胞活性化ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質）、Ｒａｓｓｆ９（Ｒａｓ結合ドメインファミリーメンバー９）、及び／又はＣｌｓｔｎ３（カルシンテニン３）、
－細胞生存及び／又は増殖に関与する少なくとも１つのタンパク質、例えばＣＤＫ１５（サイクリン依存性キナーゼ１５）又はＣａ３（炭酸脱水酵素３）、
－アポトーシスに関与する少なくとも１つのタンパク質、例えばＣＦＬＡＲ（ＣＡＳＰ８及びＦＡＤＤ様アポトーシス調節因子）又はＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）及び／又は
－グルタチオン異化反応に関与する少なくとも１つのタンパク質、例えばＧＣＬＭ（グルタミン酸－システインリガーゼ調整因子サブユニット）又はＧＧＣＴ（ガンマ－グルタミルシクロトランスフェラーゼ）
である。

【0014】

少なくとも１つのＭＩＰは、少なくとも１つのＰＰＡＲ、特にＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ／δ又はＰＰＡＲγ及び／又はＦｏｘａ１、アクチン、任意選択的にＥｒｐ５７と組み合わせたＥｒｐ２７を含み得る。少なくとも１つの調節配列は、ＣＭＶ、ＥＦ１アルファ、ＣＭＶ／ＥＦ１アルファ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＰＧＫの群から選択されるプロモーター、ＣＭＶ、ＥＦ１アルファ、ＣＭＶ／ＥＦ１アルファ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＰＧＫの発現レベルを有するプロモーター及びそれらの組み合わせであり得る。

【0015】

少なくとも１つのＭＩＰは、少なくとも１つの（例えば２又は３つを含む）一次ＭＩＰ及び、一次ＭＩＰでも二次ＭＩＰでもない少なくとも１又は２又は３つのさらなるＭＩＰを含み得る。１つの真核発現系において、少なくとも２、３、４、５又はそれを超えるＭＩＰがあり得る。ＭＩＰ発現ベクターは、ＭＩＰをコードする核酸の第１のＩＴＲ（末端逆位配列）上流及び第２のＩＴＲ下流をさらに含み得る。少なくとも１つの調節配列は、任意選択的に第１のＩＴＲと第２のＩＴＲとの間に、特異なＭＡＲエレメント又はＭＡＲコンストラクトを含む、ＭＡＲ１－６８及び／又はＭＡＲＸ－２９などの、ＭＡＲエレメント又はＭＡＲコンストラクトを含み得る。ＭＩＰ発現ベクターはトランスポゾンドナーベクターであってよい。発現系は、トランスポサーゼ発現ヘルパーベクター又はｍＲＮＡをさらに含み得る。トランスポサーゼ発現ヘルパーベクターは、任意選択的に非翻訳末端領域（ＵＴＲ）が上流及び下流に隣接する、ＰＢ（ｐｉｇｇｙｂａｃ）トランスポサーゼコード配列を含み得る。

【0016】

真核発現系は、関心のあるタンパク質をコードする核酸の挿入に適応された少なくとも１つの制限酵素切断部位を含む担体ベクターをさらに含み得る。担体ベクターは、抗生物質耐性遺伝子及び／又はナトリウム－マルチビタミン輸送体ＳＬＣ５Ａ６などのビタミン輸送タンパク質をさらに含み得る。担体ベクターのエレメントは、発現系の別のベクターの一部でもあり得る。

【0017】

別の実施形態では、本発明は、
（ａ）本明細書中で開示される発現系の発現ベクターの何れか１つを細胞に遺伝子移入すること、及び／又は
ＭＩＰを発現する遺伝子のタンパク質産物の少なくとも１つの活性化因子を真核細胞に添加すること、及び
（ｂ）任意選択的に、関心のあるタンパク質を含む担体ベクターを細胞に遺伝子移入すること
を含む方法を対象とする。

【0018】

真核細胞に添加される少なくとも１つの活性化因子は、少なくとも１つ、２つ又は全てのＰＰＡＲ、特にＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ／δ又はＰＰＡＲγ、の活性化因子、例えばベザフィブラートであり得る。関心のあるタンパク質のＭＡ／ＥＬは、１．５ｘよりも大きい、２ｘＭＬよりも大きい、又はさらに２．５ｘ若しくは３ｘＭＬよりも大きくてよい。

【0019】

ある実施形態では、本発明は、１つの容器中に、先行する請求項の何れか１項に記載の上記真核発現系を含み、第２の容器中に、上記系を使用する方法の説明書を含むキットを対象とする。本キットは、少なくとも１つのＭＩＰの少なくとも１つの活性化因子をさらに含み得、ここでＭＩＰは、好ましくは少なくとも１つのＰＰＡＲ、特にＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ／δ又はＰＰＡＲγであり、活性化因子は、少なくとも１つ、２つ又は全てのＰＰＡＲの活性化因子、例えばベザフィブラートであり得る。

【0020】

本発明はまた、ある実施形態では、本明細書中で開示される真核発現系の何れかを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの、組み換え真核細胞も対象とする。細胞は、ＭＩＰ発現ベクター又は少なくとも１つ、少なくとも２つ、３つ又は４つのＭＩＰを含むその一部分を安定的に遺伝子移入され得る。

【0021】

本発明はまた、少なくとも１つの外因性プロモーターの制御下で少なくとも１つの内因性又は外因性ＭＩＰを含む真核細胞も対象とし、この外因性プロモーターは、プロモーターラダーの一部であり得、ＣＭＶ、ＥＦ１アルファ、ＣＭＶ／ＥＦ１アルファ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＰＧＫ及び、ＣＭＶ、ＥＦ１アルファ、ＣＭＶ／ＥＦ１アルファ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＰＧＫの発現レベルを有する外因性又は組み換え内因性プロモーター及びそれらの組み合わせの群から選択される。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】トランスクリプトーム分析を通じたＭＩＰの同定。 （Ａ）関心のある発現容易な（ＥＴＥ）又は発現困難な（ＤＴＥ）タンパク質を産生する、非選択、Ｂ５選択及び抗生物質選択細胞を比較する、ＲＮＡＳｅｑによるトランスクリプトーム分析の概説。（Ｂ）ここではＥＴＥ細胞における、選択されたＢ５標的遺伝子の２つの主要な発現パターンを表すグラフ。遺伝子発現は、ＲＮＡＳｅｑ分析からの遺伝子読み取りデータ数に相当する。（Ｃ）トラスツズマブ産生について、ＣＨＯ－Ｍ野生型（ＷＴ）細胞と比較して、及び細胞ポリクローナルと比較してトラスツズマブ高産生クローンで上方制御される転写物の同定。３２個の遺伝子によりコードされる５１個のｍＲＮＡを同定した。（Ｄ）トランスクリプトーム分析及び文献スクリーニングを通じて同定された候補遺伝子の機能クラス（表１参照）。

【図2】関心のある発現容易な（ＥＴＥ）のタンパク質に対する候補ＭＩＰの効果：トラスツズマブ産生。 （Ａ）クローンを、トランスクリプトーム分析に対して使用されるトラスツズマブポリクローナル集団から単離した（図１Ｃ参照）。流加培養法において速い細胞分裂速度を維持した中程度の産生クローンＴｒａｓ６及びＴｒａｓ１４を、次の実験で使用した。（Ｂ）Ｔｒａｓ１４クローンにおける候補ＭＩＰの安定過剰発現後の流加培養第６日（白色バー）、第９日（灰色バー）及び第１１日（黒色バー）での発現容易な（ＥＴＥ）トラスツズマブ抗体の産生。ＳＲＰ１４過剰発現を陽性対照として使用し（ＬｅＦｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、ＧＦＰを発現するか又は空のベクターを遺伝子移入した細胞を陰性対照として使用した。（Ｃ）流加培養第１１日でのトラスツズマブ抗体の産生。増加する量の特定のＭＩＰを発現する安定な細胞を、トラスツズマブクローンにおいて増加量のＭＩＰプラスミドを遺伝子移入することにより得た。（Ｄ）トラスツズマブクローンにおけるＦｏｘａ１の安定な過剰発現後の流加培養第１３日でのトラスツズマブ抗体の産生。（Ｅ）Ｆｏｘａ１一次ＭＩＰの過剰発現における、Ｃａ３及びＲａｓｓｆ９二次ＭＩＰの発現上昇を例示するための、Ｆｏｘａ１（白色バー）、ＧＦＰ（灰色バー）を安定に遺伝子移入された細胞における、及び非遺伝子移入細胞（黒色バー）における、Ｆｏｘａ１、Ｃａ３及びＲａｓｓｆ９の相対発現。ＲＮＡを、流加培養第８日に抽出した。

【図3】関心のある発現困難な（ＤＴＥ）タンパク質に対する候補ＭＩＰの効果：インフリキシマブ発現。 ＭＩＰを、発現困難な（ＤＴＥ）インフリキシマブ抗体を発現する組み換えクローンにおいて安定に過剰発現させた。（Ａ）候補遺伝子過剰発現後の、流加培養第９日（灰色バー）及び第１１日（黒色バー）でのインフリキシマブ抗体の産生。空ベクターを遺伝子移入した細胞を陰性対照として使用した。（Ｂ）流加培養第０日、（白色バー）、第６日（薄灰色バー）、第９日（黒色バー）及び第１１日（濃灰色バー）での、細胞の生存細胞密度。

【図4】ＰＰＡＲにより調節されることが分かったＢ５標的遺伝子を強調する概略図を提供する。

【図5】発現容易な（ＥＴＥ）細胞におけるＰＰＡＲ活性化試験：Ｂ５分泌細胞における内因性ＰＰＡＲアゴニスト。 プロモーターがＰＰＡＲ応答性エレメント（ＰＰＲＥ）を含有するＰＰＡＲ－レポーターＤｓＲｅｄ遺伝子を使用するＰＰＡＲ一過性活性化アッセイ。（Ａ）抗生物質（ＡＢ）選択ＥＴＥ細胞及びＢ５－選択ＥＴＥ（トラスツズマブ）細胞にペルオキシソーム増殖剤応答エレメント（ＰＰＲＥ）－ＤｓＲｅｄレポーターを一過性に遺伝子移入したか、又はＰＰＲＥレポーター及びマウスＰＰＡＲαを同時遺伝子移入した。ＤｓＲｅｄ活性をＢＦＰ２マーカーに対し標準化した（材料及び方法参照）。（Ｂ）ＰＰＡＲ一過性アッセイに対する陰性対照は、ＰＰＲＥレポーターなしのＤｓＲｅｄ活性に相当する。パネルＡ及びＢからのデータは、４回の独立した実験からの補正ＤｓＲｅｄ活性の平均蛍光±ＳＥを表す。統計：^＊Ｐ≦０．０５及び^＊＊Ｐ≦０．０２（片側ｔ検定；対応のある試料）。（Ｃ）一過性ＰＰＡＲα活性化データを説明する概略図。

【図6】発現容易な（ＥＴＥ）クローンでのＰＰＡＲ活性化試験：外因性汎ＰＰＡＲアゴニストの効果 （Ａ）流加培養（＋ベザフィブラート）３日後の、未処理（対照）又は１０ｍＭベザフィブラートＰＰＡＲαリガンドで処理したＥＴＥクローン（トラスツズマブ）。候補遺伝子発現を、ＲＴ－ｑＰＣＲにより第６日に定量した。（Ｂ）ＥＴＥ細胞を、１日流加培養後に１０ｍＭベザフィブラートで処理し、ＩｇＧタイターを１０日後に測定。データは、４回の独立した実験からの平均±ＳＥである。^＊Ｐ≦０．０５及び^＊＊Ｐ≦０．０２（ｔ検定；両側；独立試料、不等分散）。

【図7】発現困難な（ＤＴＥ）細胞でのＰＰＡＲα過剰発現 抗生物質選択ＤＴＥ（インフリキシマブ）細胞にマウスＰＰＡＲαを、又は空ベクターを安定に遺伝子移入した。遺伝子発現、ＩｇＧタイター及び細胞生存能の分析を、ＤＴＥクローンを空ベクター細胞及びＰＰＡＲα過剰発現細胞（ＰＰＡＲα＿ＯＥ）と比較して行った。（Ａ）未処理細胞又はベザフィブラート（ＢＥＺＡ）処理細胞でのＰＰＡＲα標的、ＰＰＡＲα及びＩｇＧ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）の遺伝子発現。ベザフィブラートを流加培養第１日に１０ｍＭで添加した。ＲＮＡを流加培養第６日に抽出した。非選択又はＢ５飢餓培地中でのインフリキシマブＩｇＧ比生産性（Ｂ）及び細胞生存能（Ｃ）を例示する。細胞を、非選択又はＢ５飢餓培地中で５日間、細胞２^＊１０^５個／ｍＬの出発量で、１２ウェルプレート中で培養し、次いで非選択培地に移した。ＩｇＧ比生産性（ＰＣＤ）を次に、非選択培地中での３日間の培養にわたり測定した。各測定は、３回の独立した培養の結果である。統計：^＊Ｐ≦０．０５及び^＊＊Ｐ≦０．０２（ｔ検定；片側；独立試料、不等分散）。

【図8】ＰＰＡＲα ＭＩＰを過剰発現するか又はしない抗生物質又はＢ５選択ＣＨＯ細胞の代謝分析。ビタミンＢ５（図８Ａ）、乳酸（図８Ｂ）、アセチルＣｏＡ（図８Ｃ）及びケトン（３－ヒドロキシ酪酸）（図８Ｄ）を、示されるように、ピューロマイシン又はＢ５選択ポリクローナル細胞プールにおいて、ＬＣ－ＨＲＭＳ（高解像度質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー）により定量した。データは、４回の独立した生物実験からの±ＳＥを示す。統計：^＊Ｐ≦０．０５及び^＊＊Ｐ≦０．０２（両側ｔ検定；対応試料）。これらの代謝物のレベルをまた、抗生物質選択ＤＴＥ（インフリキシマブ）細胞で、マウスＰＰＡＲα発現ベクター（ＰＰＡＲａ＿ＯＥ）又は空ベクターを安定に遺伝子移入したＤＴＥ細胞プールで定量した（図８Ｅ～８Ｈ）。データは、３回の技術的な独立実験からの±ＳＥを示す。統計：^＊Ｐ≦０．０５及び^＊＊Ｐ≦０．０２（両側ｔ検定；等分散）。

【図9】ＥＴＥ及びＤＴＥ ＣＨＯ細胞におけるＡＣＴＣ１過剰発現。 ＥＴＥ（トラスツズマブ、「ＴＲＡＳ」）及びＤＴＥ（Ｆｃ－融合タンパク質）細胞にアクチンをコードするチャイニーズハムスターＡＣＴＣ１ ｃＤＮＡ又は空ベクターを安定に遺伝子移入した。遺伝子発現及びＩｇＧタイターの分析を、ＥＴＥクローン（対照）を空ベクター細胞及びＡＣＴＣ１過剰発現細胞（ＡＣＴＣ１＿ＯＥ）と比較して行った。（Ａ）ＡＣＴＣ１、ＩｇＧ軽鎖（Ｌｃ）及び重鎖（Ｈｅ）遺伝子発現（ｑＲＴ－ＰＣＲ）。各測定は、２回の独立した培養の結果である。（Ｂ）ＩｇＧ比生産性（ＰＣＤ）、即ち分泌されるＩｇＧのピコグラム／細胞及び／日）を、非選択培地中での３日間の培養にわたり測定する。（Ｃ）ＤＴＥ Ｆｃ－融合タンパク質における産生（Ｃｔｒｌ＝対照、空ベクター）。

【図10】ＩｇＧ１－ベバシズマグ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｇ）発現ＣＨＯ－Ｍクローン、Ｆｃ－融合－発現ＣＨＯ－Ｍクローン及びＦａｂ－酵素融合発現クローンの分泌に対する、ＣＦＬＡＲ、ＧＣＬＭ及びＡＣＴＣ１の個々の発現又は合わせた発現の効果。 ベバシズマグ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｇ）発現クローン（図１０Ａ）、ｆｃ－融合発現クローン（図１０Ｂ）及びｆａｂ－酵素－融合発現クローン（ＤＴＥ）（図１０Ｃ）に、様々な個々の転位性ＣＦＬＡＲ（ＣＡＳＰ８及びＦＡＤＤ様アポトーシス調節因子）、ＧＣＬＭ（グルタミン酸－システインリガーゼ調節サブユニット）、ＡＣＴＣ１発現ベクター又はそれらの組み合わせを再遺伝子移入した。得られた細胞プールの比生産性を次に、３又は４日ごとに、調整されたバッチにおいてそれらの継代培養を通じて評価した。結果を、それらの個々のベバシズマブ－又はＦｃ－融合－対照細胞ＰＣＤ値（ｐｇ／細胞／日）の％として示した。

【図11】治療用タンパク質産生に対するＥｒｐ２７及び／又はＥｒｐ５７過剰発現の効果。 発現容易な又は発現困難な治療用タンパク質を産生するクローンにＥｒｐ２７又はＥｒｐ５７発現ベクターを安定に遺伝子移入したか、又はＥｒｐ２７及びＥｒｐ５７発現ベクターの両方を同時遺伝子移入した。遺伝子発現、細胞増殖、細胞生存能及びタンパク質産生を、安定なポリクローナル集団（パネルａ～ｅ）で、又はクローン（パネルｆ～ｈ）で、流加培養において評価した。（ａ）ｑＲＴ－ＰＣＲにより評価した、流加培養第０日及び第８日での非遺伝子移入親ＣＨＯ細胞におけるそれらのレベルに対する倍率変化として表した、Ｔｒａｓ産生クローンでのＥｒｐ２７及びＥｒｐ５７ｍＲＮＡレベルの定量。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝３、ｐ値を、独立した片側ｔ検定を使用して決定した。（ｂ）Ｔｒａｓ産生クローン（親Ｔｒａｓクローン）にＥｒｐ２７及び／又はＥｒｐ５７発現ベクターを安定に遺伝子移入し、分泌トラスツズマブ抗体のタイターを、流加培養終了時に、細胞培養上清から決定した。ＧＦＰ発現ベクターを遺伝子移入した細胞を、対照として使用した。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝３、独立した片側ｔ検定。（ｃ）親Ｔｒａｓクローンに、プラスミドの総量を一定に維持するための空ベクターとともに低下する量のＥｒｐ２７発現ベクターを安定に遺伝子移入した。空ベクタープラスミドを遺伝子移入した細胞を、対照として使用した。トラスツズマブタイターを、流加培養法の終了時に決定した。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝３、独立した片側ｔ検定。（ｄ）インフリキシマブ産生クローンを、示されるように、親クローン又はＥｒｐ２７及び／又はＥｒｐ５７の、又はＧＦＰ発現ベクターの遺伝子移入後に得られた派生細胞集団の何れかを使用して、流加培養中に得られた分泌モノクローナル抗体タイターについて特徴づけた。タイターを、中央値（中央のバー）及び２５～５０％及び５０～７５％四分位数（箱）とともにテューキー箱ひげ図として示す。ひげは、最小値及び最大値まで伸び、１．５倍四分位間範囲内に留まる。（ｅ）パネルｄで分析された流加培養法の生存細胞密度。エラーバーをＳＤとして示し、独立した片側ｔ検定（パネルｄ及びｅ、ｎ＞４）。（ｆ）エタネルセプト産生クローンにＥｒｐ２７及びＥｒｐ５７発現ベクターを、又は対照として空ベクターを安定に遺伝子移入した。細胞コロニーを、ＣｌｏｎｅＰｉｘ（登録商標）装置を使用して単離し、最大エタネルセプト分泌ハロを有するクローンを単離し、流加培養終了時にエタネルセプトタイターについて特徴づけた。対照細胞と比較したタイター倍率変化を、パネルｄについてテューキー箱ひげ図として例示する。（ｇ、ｈ）パネルｆで分析された流加培養の生存細胞密度及び細胞生存能。エラーバーはＳＥＭを示す、パネルｆ～ｈ（ｎ≧８）。

【図12】Ｔｒａｓ産生に対するＦｏｘａ１過剰発現の効果。 Ｔｒａｓ産生クローンにＦｏｘａ１又はＧＦＰ発現ベクターを安定に遺伝子移入した。トラスツズマブタイター（ａ）、生存細胞密度（ｂ）及び細胞生存能（ｃ）を、１０日間の流加培養中に評価した。ｎ＝５、独立した片側ｔ検定。タイターを、図２について記載されるようにテューキー箱ひげ図として例示し、一方でエラーバーをＳＤとして示す（パネルｂ、ｃ）。（ｄ）図１ｃで同定されたＦｏｘａ１標的遺伝子及び他の関連遺伝子のｍＲＮＡレベルのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を、流加培養法第８日にＦｏｘａ１過剰発現細胞、ＧＦＰ発現細胞又は親Ｔｒａｓクローンにおいて行った。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝３、対応のある片側ｔ検定。（ｅ）流加培養第０日での、Ｆｏｘａ１過剰発現細胞、ＧＦＰ発現細胞又は親Ｔｒａｓクローンにける、Ｆｏｘａ１、Ｃａ３、Ｒａｓｓｆ９及びＴａｇａｐ ｍＲＮＡレベルのＲＴ－ｑＰＣＲ定量。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝３、対応のある片側ｔ検定。（ｆ）流加培養第０、３、６、８及び９日での、Ｆｏｘａ１過剰発現細胞及び親Ｔｒａｓクローンでの、カルボキシ－Ｈ_２ＤＣＦＤＡを使用した細胞内ＲＯＳレベルの評価。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝３、独立した片側ｔ検定。

【図13】Ｔｒａｓ産生に対するＣａ３、Ｒａｓｓｆ９及びＴａｇａｐ過剰発現の効果。Ｔｒａｓ産生Ｔｒａｓ６クローンにＣａ３、Ｒａｓｓｆ９、Ｔａｇａｐ又はＧＦＰ発現ベクターを安定に遺伝子移入した。トラスツズマブタイター（ａ）、生存細胞密度（ｂ）及び細胞生存能（ｃ）を、１０日間の流加培養中に決定した。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝３、独立した両側ｔ検定。（ｄ）Ｃａ３－、Ｒａｓｓｆ９－又はＴａｇａｐ－発現安定集団におけるＲＴ－ｑＰＣＲ分析による候補遺伝子のｍＲＮＡレベルの定量。データを、対照ＧＦＰ発現細胞におけるｍＲＮＡレベルと比較して示す。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝３、対応のある両側ｔ検定。（ｅ）Ｔｒａｓクローンに、プラスミドの総量を一定に維持するための空ベクターと一緒に様々な量のＣａ３発現ベクターを安定に遺伝子移入した。これらの細胞から得られたトラスツズマブタイターを、流加培養終了時に評価した。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝３、独立した片側ｔ検定。

【図14】インフリキシマブ産生に対するＦｏｘａ１過剰発現の影響。 インフリキシマブ産生クローンにＦｏｘａ１又はＧＦＰ発現ベクターを安定に遺伝子移入し、インフリキシマブタイター（ａ）、生存細胞密度（ｂ）及び細胞生存能（ｃ）を、９日間の流加培養法中に評価した。ｎ＝５、独立した片側ｔ検定。タイターを、図２（パネルａ）について記載するように示し、一方でエラーバーをＳＤとして示す（パネルｂ、ｃ）。（ｄ）流加培養第３、６、７及び８日での、Ｆｏｘａ１過剰発現細胞についての、及び親インフリキシマブ産生クローンについての、カルボキシ－Ｈ_２ＤＣＦＤＡを使用した細胞内ＲＯＳレベルの評価。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝３、独立した片側ｔ検定。（ｅ）流加培養第６日での、Ｆｏｘａ１過剰発現細胞、ＧＦＰ発現細胞での、又は親インフリキシマブクローンでの、Ｆｏｘａ１、Ｃａ３、Ｒａｓｓｆ９及びＴａｇａｐ ｍＲＮＡレベルのＲＴ－ｑＰＣＲ定量。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝３、対応のある片側ｔ検定。

【図15】インフリキシマブ産生に対するＴａｇａｐ過剰発現の効果。 インフリキシマブ産生クローンにＴａｇａｐ又はＧＦＰ発現ベクターを安定に遺伝子移入し、インフリキシマブタイター（ａ）、生存細胞密度（ｂ）及び細胞生存能（ｃ）を、９日間の流加培養法中に評価した。ｎ＝４、独立した片側ｔ検定。タイターを、図２について記載するように示す。エラーバーを、パネルｂ、ｃについてＳＤとして示す。（ｄ）ＲＴ－ｑＰＣＲによる流加培養第６日での、Ｔａｇａｐ－過剰発現細胞、ＧＦＰ－発現細胞での、又は親クローンでの、Ｆｏｘａ１、Ｃａ３、Ｒａｓｓｆ９及びＴａｇａｐ ｍＲＮＡレベルのＲＴ－ｑＰＣＲ定量。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝３、対応のある両側ｔ検定。

【図16】ＲＮＡＳｅｑ分析から得られた、又はｑＰＣＲ分析を使用した、候補遺伝子のｍＲＮＡレベル。 親ＣＨＯ細胞、Ｔｒａｓポリクローナル細胞及びＴｒａｓ高産生（ＨＰ）クローンにおけるＥｒｐ２７（ａ）、Ｆｏｘａ１（ｂ）、Ｃａ３（ｃ）及びＴａｇａｐ（ｄ）のｍＲＮＡレベルをＲＮＡＳｅｑにより分析し、転写物／キロベースミリオン（ＴＢＭ）で示すか、又はＲＴ－ｑＰＣＲを使用して分析。データを、親ＣＨＯ細胞と比較して与える。エラーバーをＳＤとして示す。３つの生物学複製物をＴｒａｓ高産生クローンに対して使用し、一方で３つの技術的複製物を、親ＣＨＯ細胞に対して、及びＴｒａｓ産生ポリクローナル細胞集団に対して使用した。

【図17】発現容易な又は発現困難な治療用タンパク質を産生する及びＥｒｐ２７、Ｅｒｐ５７又はその両方を過剰発現する細胞の流加培養法分析及びｍＲＮＡレベル。 流加培養法中のＥｒｐ２７及び／又はＥｒｐ５７に対する発現ベクターを安定に遺伝子移入したトラスツズマブ産生クローンの生存細胞密度（ａ）及び細胞生存能（ｂ）。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝３、独立した片側ｔ検定。ｑＲＴ－ＰＣＲによる異なる細胞集団中でのＥｒｐ２７（ｃ）及びＥｒｐ５７（ｄ）ｍＲＮＡレベルの定量。データを、対照ＧＦＰ－発現細胞のｍＲＮＡレベルと比較して与える。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝３。（ｅ）プラスミドの総量を一定に維持するための空ベクターとともに漸減量のＥｒｐ２７発現ベクターを安定に遺伝子移入したＴｒａｓクローンにおけるｑＲＴ－ＰＣＲによるＥｒｐ２７ｍＲＮＡレベルの定量。データを、対照細胞におけるＥｒｐ２７ｍＲＮＡレベルと比較して与える。エラーバーをＳＤとして示す、ｎ＝２。（ｆ及びｇ）Ｅｒｐ２７及びＥｒｐ５７用の発現ベクターを安定に遺伝子移入したインフリキシマブ産生クローンにおけるＥｒｐ２７及びＥｒｐ５７ ｍＲＮＡレベルのｑＲＴ－ＰＣＲ定量。データを、対照細胞におけるｍＲＮＡレベルと比較して与える。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝２。（ｈ）流加培養中に分析した異なる細胞集団の細胞生存能。エラーバーをＳＤとして示し、独立した片側ｔ検定、ｎ≧４。

【図18】流加培養法中の候補遺伝子及びトラスツズマブＨＣ及びＬＣ導入遺伝子のｍＲＮＡレベル。 （ａ）トラスツズマブ（Ｔｒａｓ）産生クローンにおける流加培養法第０日及び第８日でのＦｏｘａ１、Ｒａｓｓｆ９、Ｃａ３及びＴａｇａｐ ｍＲＮＡレベルのＲＴ－ｑＰＣＲ定量。データをＣＨＯ細胞でのｍＲＮＡレベルと比較して与える。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝３。（ｂ）流加培養法第８日での、Ｆｏｘａ１過剰発現細胞、ＧＦＰ発現細胞における、又は親ＴｒａｓクローンにおけるＴｒａｓ重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）ｍＲＮＡレベルのＲＴ－ｑＰＣＲ定量。データを、対照ＧＦＰ－発現細胞でのｍＲＮＡレベルと比較して与える。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝３、対応のある片側ｔ検定。

【図19】トラスツズマブ及びＣａ３ ｍＲＮＡレベルの分析。 （ａ）Ｃａｓ３、Ｒａｓｓｆ９及びＴａｇａｐ過剰発現細胞におけるＴｒａｓ免疫グロブリン重及び軽鎖ｍＲＮＡレベルのＲＴ－ｑＰＣＲ定量。データを、対照ＧＦＰ発現細胞でのＴｒａｓ重鎖及び軽鎖ｍＲＮＡレベルと比較して与える。エラーバーをＳＤとして示し、ｎ＝３、対応のある片側ｔ検定。（ｂ）様々な量のＣａ３発現ベクター及びプラスミドの総量を一定に維持するための空ベクターを安定に遺伝子移入したＴｒａｓクローンでのＣａ３ ｍＲＮＡレベルのＲＴ－ｑＰＣＲ定量。データを、対照ＧＦＰ－発現細胞におけるＣａ３ ｍＲＮＡレベルと比較して与える。

【図20】ビタミンＢ５選択後のＡＣＴＣ１及びＴＡＧＡＰ遺伝子の発現。 （ａ）及び（ｂ）において、図は、非遺伝子移入非選択親対照細胞（Ｃ）を、抗生物質選択又Ｂ５選択に供され、かつトラスツズマブ（ＥＴＥ、パネルａ）及びインターフェロン－ベータ（ＤＴＥ、パネルｂ）を発現する遺伝子移入細胞と比較した、ＡＣＴＣ１及びＴＡＧＡＰ ｍＲＮＡレベルのトランスクリプトームＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）分析を示す。遺伝子移入細胞の選択後に、培養物を非選択完全培地中で増殖させ、トータルｍＲＮＡを単離し、ハイスループットシーケンシングに供してＢ５選択過程に供された細胞集団において上方制御される遺伝子を同定した。相対的ｍＲＮＡレベルは、ＲＮＡ－Ｓｅｑ分析からの正規化リードカウントに対応する。（ｃ）ＡＣＴＣ１及びＴＡＧＡＰ遺伝子発現に対するＳＬＣ５Ａ６過剰発現及びＢ５欠乏による選択の効果。細胞に、ＳＬＣ５Ａ６発現ベクターあり又はなしでＡＣＴＣ１又はＴＡＧＡＰ発現ベクター及びピューロマイシン耐性遺伝子を同時遺伝子移入し、その後培養物を、それぞれＢ５欠乏培地（Ｂ５欠乏）中又はピューロマイシン存在下（抗生物質選択）の何れかで選択した。選択した細胞を非選択培地に移し、続いてＲＴ－ｑＰＣＲによりＡＣＴＣ１及びＴＡＧＡＰ ｍＲＮＡの定量を行った。Ｂ５欠乏により選択された細胞のｍＲＮＡレベルを、抗生物質選択細胞のレベルに対して正規化した。（ｄ）パネルＣについて記載のように遺伝子移入し選択した細胞のビタミンＢ５含量を、バッチ培養６日後にＬＣ－ＭＳにより測定した。（ｅ）ＳＬＣ５Ａ６発現ベクターなし又はありで抗生物質耐性遺伝子を遺伝子移入し、抗生物質選択に供した細胞のＡＣＴＣ１及びＴＡＧＡＰ ｍＲＮＡレベルの比較。相対的ｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより決定し、抗生物質耐性細胞のレベルに対し正規化した。データは、３～５つの生物学的複製物の平均±ＳＥＭである。抗生物質選択に関して、^＊Ｐ≦０．０５；^＊＊Ｐ≦０．０２（ｔ検定；片側）。

【図21】ＴＡＧＡＰを過剰発現するＥＴＥ産生細胞におけるＡＣＴＣ１レベル。 トラスツズマブ抗体を発現するピューロマイシン選択クローンにＣＨＯ ＴＡＧＡＰ発現ベクター又は空ベクター及びブラスチシジン耐性遺伝子を安定に再遺伝子移入し、ブラスチシジン耐性で選択した。得られた安定なポリクローナル細胞プールを使用して、ＲＴ－ｑＰＣＲによるＴＡＧＡＰ相対ｍＲＮＡレベル（ａ）；及びＡＣＴＣ１タンパク質レベル（ｂ）を評価した。総タンパク質抽出物の免疫ブロットをＡＣＴＣ１又はＧＡＰＤＨマウス抗体により探索した。ＡＣＴＣ１シグナルの比率を、ＩｍａｇｅＪにより定量して、ＧＡＰＤＨに対し正規化した。データは３回の反復物の平均蛍光±ＳＥＭを表す。^＊＊空ベクターを遺伝子移入した細胞に対して、Ｐ≦０．０２（ｔ検定；両側）。

【図22】組み換えタンパク質産生細胞におけるＡＣＴＣ１の過剰発現 （ａ）インフリキシマブ抗体を発現するピューロマイシン選択クローンにＣＨＯ ＡＣＴＣ１発現ベクター又は空ベクター及びブラスチシジン耐性遺伝子を安定に再遺伝子移入し、ブラスチシジン耐性について選択した。得られた安定な細胞プールを使用して、ＲＴ－ｑＰＣＲによりＡＣＴＣ１の相対ｍＲＮＡレベルを定量した。（ｂ）パネルＢの細胞プールからの総タンパク質抽出物の免疫ブロットを、ＡＣＴＣ１又はＧＡＰＤＨマウス抗体で探索した。ＧＡＰＤＨと比較したＡＣＴＣ１に対するシグナルの比率を、ＩｍａｇｅＪを使用して定量した。（ｃ）パネルＣの免疫ブロット膜の総タンパク質のレッドポンソー染色。データは３回の反復物の平均値±ＳＥＭを示す。

【図23】ＡＣＴＣ１を過剰発現する細胞におけるＤＴＥ組み換えタンパク質産生。 （ａ）、（ｂ）及び（ｃ）において、図は、ＡＣＴＣ１又は空発現ベクターを安定に再遺伝子導入した、抗生物質選択免疫グロブリンガンマ（ＩｇＧ）発現クローンを示し、得られた安定細胞プールのＩｇＧ比生産性を、別の抗生物質に対する耐性についての選択後に測定した。エタネルセプトＦｃ－融合（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））（パネルＡ）、ベバシズマブｌｇＧ１（パネルＢ）及びインフリキシマブｌｇＧ１（パネルＣ）の比生産性を、３回の反復物の平均値±ＳＥＭとして、分泌されたＩｇＧのピコグラム／細胞及び／日として与える。（ｄ）パネルＣで分析した細胞のインフリキシマブＩｇＧのレベルを、非選択培地中で３日間にわたり、流加培養条件下で評価し、ここで細胞培養の培地中で放出されたＩｇＧのタイターは、３回の生物学的反復物の平均±ＳＥＭを表す。（ｅ）ＡＣＴＣ１発現又は空ベクターを遺伝子移入したインフリキシマブ発現細胞のプールの乳酸含量を、ＬＣ－ＭＳアッセイを使用して２つの独立した細胞プールからのバッチ培養の３日後に測定した。乳酸濃度は、３回の技術的反復からの平均値±ＳＥＭを表す。空ベクターに対して、^＊Ｐ≦０．０５及び^＊＊Ｐ≦０．０２（ｔ検定；両側）。

【図24】ＡＣＴＣ１過剰発現細胞の特徴評価 トラスツズマブ発現ＣＨＯ細胞クローンにＣＨＯ ＡＣＴＣ１発現ベクター又は空発現ベクターと一緒に抗生物質耐性プラスミドを安定に再遺伝子移入した。安定に遺伝子移入した抗生物質耐性細胞を次に選択し、そこからさらなる分析のためにクローンを単離した。（ａ）ＲＴ－ｑＰＣＲにより決定したＡＣＴＣ１相対的ｍＲＮＡレベルの定量。（ｂ）図２５ａの免疫ブロット膜の総タンパク質のレッドポンソー染色。（ｃ）図２５ｂで行われる、１０日間の流加培養にわたるクローンの生存細胞密度。

【図25】ＡＣＴＣ１過剰発現細胞の生産性の特徴評価 トラスツズマブ発現クローンにＣＨＯ ＡＣＴＣ１又は空の発現ベクターを安定に再遺伝子移入し、細胞クローンをさらなる分析のために単離した。（ａ）ＡＣＴＣ１又はＧＡＰＤＨマウス抗体で標識した総タンパク質抽出物の免疫ブロット。ヒストグラムは、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して評価した、ＧＡＰＤＨに対するＡＣＴＣ１シグナルの比を示す。ポンソーレッド染色膜を図２４ａで示す。（ｂ）培養上清中の分泌ＩｇＧタイターを,流加培養の１３日間にわたりダブルサンドイッチＥＬＩＳＡにより評価した。

【図26】ＥＴＥクローンにおけるアクチン重合化レベル。 （ａ）ＡＣＴＣ１を過剰発現する代表的なトラスツズマブクローン（ＡＣＴＣ１＿Ｃｌｏｎｅ２）からの、又は空の発現ベクターを遺伝子移入した対照クローン（Ｅｍｐｔｙ＿Ｃｌｏｎｅ２）からの細胞におけるＦ－アクチンの代表的なＳｉｒ－アクチン蛍光染色。未染色細胞を陰性対照として使用した。（ｂ）フローサイトメトリー分析からのＳｉｒ－アクチン染色の平均蛍光シグナル。 全部で２ｘ１０^４個の細胞を、１つの状態あたり分析した。グラフで例示されるデータは、４つの独立したクローンのアッセイからの平均±ＳＥＭを表す。^＊Ｐ＜０．０５（ｔ検定；両側；不等分散）。

【図27】ＥＴＥクローンにおけるアクチン重合化レベル。 フローサイトメトリーから得られた、試験した全てのトラスツズマブクローン、ＡＣＴＣ１を過剰発現するクローン（ＡＣＴＣ１＿クローン）からの又は空の発現ベクターを遺伝子移入した対照クローン（空＿クローン）からの細胞でのＦ－アクチンのＳｉｒ－アクチン蛍光ヒストグラム。未染色細胞を陰性対照として使用した。

【図28】それらのＦ－アクチン重合化レベルによる治療用タンパク質産生細胞プールの選別。 （ａ）ＳｉＲ－アクチン染色により処理したトラスツズマブ発現ポリクローナル集団のフローサイトメトリー分析の代表的なヒストグラム。未染色対照及び他の分析を図Ｓ４で示す。全部で５^＊１０個の細胞を、取得ごとに分析し、この中で、細胞０．４～１．４^＊１０個を、示されるように、それらの低、中又は高アクチン重合化（ｐｏｌ．）レベルに従いサイトフルオロメトリーにより選別した。（ｂ）選択した細胞を抗生物質含有培地に移し、続いて、免疫蛍光染色サイトフルオロメトリーによるＩｇＧ細胞表面提示の分析を行った。（ｃ）パネルＢの選別細胞のＩｇＧ分泌アッセイ。ヒストグラムは、６つの細胞プールからの平均値±ＳＥＭを表す。^＊＊低アクチン重合化カテゴリーと比較してＰ≦０．０２（ｔ検定；両側；対応あり）。

【図29】それらのアクチン重合化レベルに従うトラスツズマブ発現細胞プールの選別 図５のレジェンドに記載のとおりの、Ｓｉｒ－アクチン染色により処理したトラスツズマブポリクローナル集団のフローサイトメトリー分析の代表的ヒストグラム。上のヒストグラムは未染色対照細胞に相当し、下のものは、独立したＳｉｒ－アクチン染色細胞プールのサイトメトリー分析を表す。

【発明を実施するための形態】

【0023】

高産生細胞、従って関心のあるタンパク質を産生する細胞、例えば、標準的培地で増殖する対応する細胞よりも高レベルでのビタミン欠乏細胞、における特異的なオルタネーション（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）を同定した。特に、関心のあるタンパク質産生の所望のレベルを支持する代謝因子。代謝においてどのような変化が、ＣＨＯ細胞の稀なサブ集団における特異的なＣＨＯ細胞遺伝子の過剰発現からもたらされるか又はそれに関連付けられるかを調べた。このようにして、関心のあるタンパク質の高産生能に関連したＣＨＯタンパク質合成の増加と結びつけられるＣＨＯ細胞遺伝子発現の変化を同定した：生成物、特にその合成が高い組み換えタンパク質産生と関連したタンパク質を、代謝影響生成物（ＭＩＰ）、特にＲＮＡコードタンパク質と呼んだが、非コードＲＮＡとも呼ぶ。従って、ビタミンＢ５選択又は従来の手段の何れかを用いて選択した高産生ＣＨＯ細胞のｍＲＮＡレベルを比較して、高産生細胞の特異的なホールマークであるｍＲＮＡレベル変化を同定した。

【0024】

図１は、様々なタイプの選択された高産生細胞と対照細胞の間で行った細胞選択アプローチ及び比較を例示する。

【0025】

表１は、様々なアプローチにより同定された候補ＭＩＰコード遺伝子のリストを提供する。代謝関連ＭＩＰは、ＰＰＡＲ又はＦｏｘａ１のような転写因子などの調節タンパク質であり得ることに留意すべきであり、それらの上昇したｍＲＮＡ及びタンパク質レベルは、次に、脂質及び糖異化反応遺伝子又は例えばｍＲＮＡ翻訳機構の構成成分、アクチンなどの細胞の構造タンパク質又はＣａ３又はＣＤＫ１５などの細胞生存因子をコードする同化遺伝子などの、それらの標的遺伝子並びに代謝遺伝子そのものの発現を活性化し得る。

【0026】

実際に細胞代謝特性の向上を引き起こす遺伝子及びタンパク質を同定するために、候補ＭＩＰを、例えば治療用タンパク質を発現するＣＨＯ細胞において発現させて、その発現上昇が関心のあるタンパク質産生の向上を引き起こすか否かを決定した（図２～３）。他のＭＩＰ（例えば二次ＭＩＰ）の発現に対するＦｏｘａ１又はＰＰＡＲなどの過剰発現調節ＭＩＰ（例えば一次ＭＩＰ）の効果、及びそれらが、細胞代謝、例えば脂質、アセチルＣｏＡなどの脂質前駆体及び乳酸などの副産物の代謝を合わせて改善し、それにより細胞の代謝適応度をおそらく改善し、それが次に治療用ＩｇＧなどの関心のあるタンパク質の産生をさらに増加させ得るか否かを評価した。或いは、アクチンなどの過剰発現構造ＭＩＰが合成増加をもたらし、それにより関心のあるタンパク質の産生をもたらすか否かも試験した。これらの図は、一部であるが全てではないＭＩＰ候補が、発現容易な（ＥＴＥ）トラスツズマブ抗体及び／又は発現困難な（ＤＴＥ）インフリキシマブ抗体の産生を増加できることを例示する。ある特定のＭＩＰは、１つの、例えば治療用タンパク質の産生を改善するが、別の治療用タンパク質の産生は改善しないことが明らかにされ得た。

【0027】

本発明による、哺乳動物細胞、例えば組み換え哺乳動物細胞などを含む真核細胞は、細胞培養条件下で維持可能である。このタイプの細胞の非限定例は、ＮＳ０及びＳｐ２／０細胞を含む、ＨＥＫ２９３（ヒト胚性腎臓）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びマウス骨髄腫細胞である。ＣＨＯ細胞の修飾型はＣＨＯ－Ｋ１及びＣＨＯ ｐｒｏ－３を含む。好ましい一実施形態では、ＳＵＲＥ ＣＨＯ－Ｍ細胞（商標）株（ＳＥＬＥＸＩＳ ＳＡ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用する。これらの真核細胞の細胞性タンパク質は、真核細胞に遺伝子移入されている関心のあるタンパク質をコードする導入遺伝子の発現を支持する。これらの細胞性タンパク質は、とりわけ、脂質代謝、シグナル伝達、タンパク質輸送、転写及び翻訳、細胞輸送、タンパク質修復、タンパク質フォールディング及び細胞接着に関与し、これらは全て、関心のあるタンパク質をコードするこれらの導入遺伝子の発現のために必要とされ、他の種、例えばヒトなどにおいて、代謝影響生成物（ＭＩＰ）、特にタンパク質としてそれらの対応物であるものとみなされ、また表１で示されるもののような非コードＲＮＡともみなされる。これらのＭＩＰを発現する１つ以上の導入遺伝子（ＭＩＰ導入遺伝子）は、本明細書中に記載のＭＩＰ真核発現ベクターを介して細胞に付加され得る。或いは、又はさらに、内在性ＭＩＰ発現（即ち１つ以上のＭＩＰをコードする細胞のゲノムにおける核酸の発現）は、ＰＰＡＲアゴニストベザフィブラートなどの、ＭＩＰを発現する内在性遺伝子を含む、ＭＩＰの発現に直接又は間接的に影響を及ぼす１つ以上の物質の添加を介して、又はプロモーター交換を介して刺激されてよく、ここでこのような内在性ＭＩＰは異なる外因性プロモーター又は内在性プロモーターの調節下に置かれ、プロモーターのそれぞれがこのようなＭＩＰの特異的な発現レベルと関連し、従ってこのような内在性ＭＩＰの発現を変更するために使用され得る。好ましくは、本発明による選択されるＭＩＰは、その発現が、細胞が選択されるＭＩＰの１つ以上を含むベクターを遺伝子移入されていない場合の導入遺伝子の発現レベルを超えるレベルで発現される、関心のあるタンパク質をコードする導入遺伝子も有する（一般に、本明細書中で担体ベクターと呼ぶ、個々のベクター上であるが、必ずしもではない）細胞をもたらす、ＭＩＰである。ＭＩＰをコードする核酸は一般に、細胞又はヒト対応物のコード配列（ＣＤＳ）を含むか又はそれからなる。表１はいくつかのＭＩＰを示す。

【0028】

一次ＭＩＰは、それらの標的遺伝子の、及び二次ＭＩＰの発現を上昇させ、調節タンパク質、例えば次のものなどを含む：
Ｆｏｘａ１（フォークヘッドボックスタンパク質Ａ１）は、胚発生、分化した組織における組織特異的な遺伝子発現の確立及び遺伝子発現の調節に関与する転写因子であり、「パイオニア」因子として作用すると考えられ、それ故に他のタンパク質に対して凝縮クロマチンを開くと考えられ、Ｆｏｘａ１の場合は、ヌクレオソームコアヒストンとの相互作用を介し、それにより標的エンハンサー及び／又はプロモーター部位でリンカーヒストンを置き換えると考えられる。

【0029】

ＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体）は、リガンド活性化転写因子である。ＰＰＡＲは主に、３つのサブタイプ；α、β／δ及びγで存在し、これらのそれぞれは、多様な脂肪酸（ＦＡ）及びＦＡ由来分子の生理学的作用に介在し、ＦＡ代謝に関与する。ＰＰＡＲ－β／δの活性化は脂肪酸代謝を促進する。従って、ＰＰＡＲファミリーは、細胞におけるエネルギーホメオスタシス及び代謝機能において主要な調節の役割を果たす。全てのＰＰＡＲは、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロ二量体化し、標的遺伝子のＤＮＡ上の特異的な領域に結合する。これらのＤＮＡ配列は、ＰＰＲＥ（ペルオキシソーム増殖因子ホルモン反応エレメント）と呼ばれる。ＰＰＲＥのコンセンサス配列は、単一のヌクレオチドスペーサーと一方向的に並べられる２つのＡＧ－ＧＴＣＡ－様配列から構成される。一般に、この配列は、遺伝子のプロモーター領域で生じ、ＰＰＡＲがそのリガンドを結合するとき、標的遺伝子の転写が遺伝子に応じて増減する。ＰＰＲＥを伴うプロモーター領域、ＴＡＴＡボックス及び転写開始部位は、抑制的なクロマチン構造に位置し得る。ＰＰＡＲ／ＲＸＲ／コリプレッサー複合体へのリガンドの結合は、リガンド活性化ＰＰＡＲ／ＲＸＲ複合体からのコリプレッサーの放出を引き起こす。活性化ＰＰＡＲ／ＲＸＲ複合体は、ＰＰＲＥに結合し、クロマチンでの構造変化を誘発し、ヒストンＨ１が放出される。ＰＰＲＥ結合ＰＰＡＲ／ＲＸＲは、活性化補助因子－アセチルトランスフェラーゼ複合体をプロモーターへ標的化する。活性化補助因子－アセチルトランスフェラーゼ複合体は、ヒストン尾部をアセチル化し（Ａｃ）、それにより転写活性構造を生じさせる。さらなる転写因子（ＴＦ）及びＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ開始複合体が、到達可能なプロモーターに動員され、転写が開始される。図４は、ＰＰＡＲにより制御されると見出されたＢ５標的遺伝子を強調し、その殆どは脂質代謝へと最終的に供給される。

【0030】

ＰＰＡＲを活性化する内在性リガンド（内在性アゴニスト）は、遊離脂肪酸及びエイコサノイドを含む。ＰＰＡＲは、多くの薬物の分子標的でもある（外因性アゴニスト）。例えばフィブラート、例えばクロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート及びフェノフィブレートなどはＰＰＡＲαを活性化する。これらは、高トリグリセリドを特徴とするコレステロール障害に適応される。ベザフィブラートは、ＰＰＡＲβ／δ及びＰＰＡＲγである他のタイプのＰＰＡＲも活性化し、従って汎ＰＰＡＲ活性化因子とみなされる。抗糖尿病チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）はＰＰＡＲγを活性化し、糖尿病などインスリン抵抗性を特徴とする疾患に対して使用される。ＧＷ５０１５１６（ＧＷ－５０１、５１６、ＧＷ１５１６、ＧＳＫ－５１６としても知られる）はＰＰＡＲδ受容体アゴニストである。合成化学ペルフルオロオクタン酸はＰＰＡＲαを活性化し、一方で合成ペルフルオロノナン酸は、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγの両方を活性化する。

【0031】

二次ＭＩＰは、ＰＰＡＲ及び／又はＦｏｘａ１などの一次ＭＩＰの過剰発現の結果として発現されるＭＩＰである。本明細書中の他の箇所に記載のように、閾値レベルを超えて関心のあるタンパク質を発現する細胞は、閾値レベルを超えて関心のあるタンパク質を発現しなかった細胞で観察されないレベルでＰＰＡＲ及び無関係のＭＩＰを発現しただけでなく、その発現がＨｍｇｃｓ２、Ａｃｏｔ１及びＣｙｐ４ａ１４などのＰＰＡＲにより影響を受けることが知られているか又はそのように考えられたＭＩＰも発現した。Ｃａ３及びＲａｓｓｆ９は、Ｆｏｘａ１転写標的であり、従って二次ＭＩＰであり得る。以下で論じたＭＩＰは二次ＭＩＰであってもよいし又はそうでなくてもよい。

【0032】

構造ＭＩＰ
細胞骨格は、細胞形状及び機械的変形への抵抗性（Ｍａｙｓ，Ｂｅｃｋ，＆ Ｎｅｌｓｏｎ，１９９４）、タンパク質合成（Ｈｕｄｄｅｒ，Ｎａｔｈａｎｓｏｎ，＆ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，２００３）、タンパク質輸送及び分泌（Ｐａａｖｉｌａｉｎｅｎ，Ｂｅｒｔｌｉｎｇ，Ｆａｌｃｋ，＆ Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ，２００４；Ｓｔａｍｎｅｓ，２００２）、細胞成分の連結（Ｋｎｕｌｌ ＆ Ｗａｌｓｈ，１９９２）及び代謝チャネリング（Ａｏｎ ＆ Ｃｏｒｔａｓｓａ、２００２）などの、複数の細胞プロセスに必要とされるアクチン微小繊維、微小管及び中間径フィラメントのネットワークを含む。さらに、モノクローナル抗体産生の増加は、アクチン、チューブリン又はアクチニン結合コフィリンなどの細胞骨格タンパク質の顕著な増加と相関した（Ｄｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）。最近の試験は、アクチンフィラメント発現増加などの、細胞骨格の主要な変化に付随する細胞外付着マトリクスの破壊により、接着細胞から浮遊ＣＨＯ細胞が発生したことを示しており、これは、インテグリンとの適正な相互作用、ずり応力に対する抵抗性及び浮遊での細胞増殖に必要とされる（Ｗａｌｔｈｅｒ，Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，＆ Ｊａｍｅｓ，２０１６）。従って、アクチンフィラメントレベルの細胞骨格組織化及び調整は、ｍＲＮＡ翻訳からタンパク質分泌まで、浮遊細胞の適応性及び組み換えタンパク質発現に影響し得る。

【0033】

構造ＭＩＰは、細胞構造に直接寄与し、例えばアクチンを含む。アクチン単量体は重合化して、複数の多様な細胞プロセスでの基本的役割を有するダイナミックネットワークへと編成するフィラメントを形成する。アクチンネットワークの代謝回転は、細胞移動、細胞接着、細胞形態の変化、小胞輸送及び細胞質分裂を含む、複数の細胞プロセスを推進する。ＡＣＴＣ１は、心臓サルコメア細フィラメントの主要なタンパク質であり、これは心臓の筋収縮機能に寄与する。一致して、ＡＣＴＣ１欠乏は心疾患に主に関連付けられている（Ｄｅｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

【0034】

シグナル伝達、小胞輸送活性及び細胞接着に関与するＭＩＰは、例えばＴａｇａｐ（Ｔ細胞活性化ＧＴＰａｓｅ－活性化タンパク質）、Ｒａｓｓｆ９（Ｒａｓ結合ドメインファミリーメンバー９）を含む。

【0035】

Ｒａｓｓｆ９遺伝子によりコードされるタンパク質は核周囲エンドソームに局在する。このタンパク質は、ペプチジルグリシンアルファアミド化モノオキシゲナーゼと会合し、分泌又はエンドソーム経路を介してこの酵素の輸送に関与し得る。Ｃｌｓｔｎ３（カルシンテニン３）は、カルシウム介在性シナプス後シグナルを調整し得る。

【0036】

ＴＡＧＡＰは、シグナル伝達タンパク質であるだけでなく、細胞骨格組織化（上記ＡＣＴＣ１参照）にも関与する。このようにＴＡＧＡＰは、胸腺細胞の接着喪失及び胸腺細胞及びＴ細胞の細胞骨格再組織化に関与する（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｄｕｋｅ－Ｃｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＴＡＧＡＰ遺伝子の変更は、様々な自己免疫疾患と関連付けられている（Ｅｙｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0037】

ｍＲＮＡ翻訳などの細胞の基礎的代謝に関与するＭＩＰは、例えばアスパラギニル－ｔ－ＲＮＡシンテターゼを含む（さらなる例については表１参照）。

【0038】

タンパク質フォールディングに関与するタンパク質（タンパク質フォールディングタンパク質も）は、シャペロン活性を有すると考えられるＥｒｐ２７（小胞体タンパク質２７．７ｋＤａ）を含み、ＥＲｐ５７は、小胞体（ＥＲ）の内腔タンパク質及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）ファミリーのメンバーである。ＥＲＰ４４は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼでもあり、小胞体－ゴルジ界面でのタンパク質品質管理に関与する。

【0039】

細胞生存及び／又は増殖タンパク質は、細胞増殖、アポトーシス、細胞分化及び胚発生を調節するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼの大きなファミリーに属するＣＤＫ１５（サイクリン依存性キナーゼ１５）を含む。Ｃａ３（炭酸脱水酵素３）は、二酸化炭素の可逆的な水和に関与する。

【0040】

アポトーシスに関与するタンパク質は、ＣＦＬＡＲ（ＣＡＳＰ８及びＦＡＤＤ様アポトーシス調節因子）又はＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）を含む。

【0041】

グルタチオン異化反応に関与するタンパク質は、ＧＣＬＭ（グルタミン酸－システインリガーゼ修飾因子サブユニット）又はＧＧＣＴ（ガンマグルタミルシクロトランスフェラーゼ）を含む。

【0042】

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの真核細胞（本明細書中で真核宿主細胞又は単に宿主細胞とも呼ぶ）は、組み換え治療用タンパク質の産生のための工業的工程で広く使用されている。例えばＣＨＯ細胞、ＮＳＯ、ＢＨＫ及びヒト胚腎臓－２９３（ＨＥＫ－２９３）の生存能は、ビタミン取り込みに依存する。哺乳動物細胞は、それらを合成し得ず、従って哺乳動物はそれらを、その食事から得なければならない。ビタミンの主要な機能は、アセチル－ＣｏＡ生合成などの様々な酵素反応において補助因子又は補酵素として作用することである。流加培養バイオリアクター産生状態中のビタミン欠乏が、分泌された組み換え治療用タンパク質のタイターに関して、細胞クローンの生存能及びそれらの生産性を向上させるために使用され得ることが示された。これらの効果は、例えばＢ５又はＨビタミンのレベルを低下させることにより得られた。ビタミン代謝タンパク質は、細胞においてビタミン利用可能性を向上させ得、特にビタミン輸送タンパク質は選択可能マーカーとして働き得る。従って、その最も単純な形態で、あるビタミンが欠乏している培地中で、選択可能マーカーとしてそれぞれのビタミン輸送タンパク質を発現する組み換え真核細胞は、それぞれのビタミン輸送タンパク質を発現しない細胞よりも良好に増殖し得る。ナトリウム－マルチビタミン輸送体ＳＬＣ５Ａ６は、Ｂ５及びＨビタミンの両方に対する輸送タンパク質として特徴づけられている。ビタミン代謝タンパク質の他の例は、パントテン酸キナーゼ１、２又は３を含む。パントテン酸キナーゼは、補酵素Ａ（ＣｏＡ）の生合成における重要な調節酵素である。

【0043】

導入遺伝子は、本発明の状況で使用される場合、ある種のタンパク質をコードする単離デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）配列である。ＭＩＰの場合、導入遺伝子ＤＮＡ配列は、非コードＲＮＡもコードし得る。導入遺伝子という用語は、本発明の状況において、遺伝子移入を介して真核宿主細胞などの細胞に導入されるＤＮＡ配列を指す場合に使用される。従って、導入遺伝子は常に外因性であるが、異種であっても又は相同であってもよい。

【0044】

外因性核酸は、本明細書中で使用される場合、参照される核酸が宿主細胞に導入されることを意味する。外因性核酸の起源は、発現する相同の又は異種の核酸であり得る。対応して、内在性という用語は、遺伝子移入前に宿主細胞中に存在する核酸分子を指す。異種核酸という用語は、宿主細胞の種以外の起源に由来する核酸分子を指し、一方で相同核酸という用語は、宿主細胞と同じ種由来の核酸分子を指す。従って、本発明による外因性核酸は、異種の又は相同の核酸の何れか又は両方を利用し得る。例えば、ヒトインターフェロン遺伝子のｃＤＮＡは、ＣＨＯ細胞中で異種外因性核酸であるが、ＨｅＬａ細胞では相同外因性核酸である。同様に、表１で示されるＭＩＰをコードする遺伝子は、ＣＨＯ細胞にベクターを介して導入される場合、外因性核酸であり、このような外因性核酸は異種（例えばヒト、マウス、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））又は相同（例えばクリセチュラス・グリセウス（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ））である。

【0045】

ＭＩＰ導入遺伝子とは別に、本発明によるいくつかの導入遺伝子は、治療用タンパク質、従って免疫グロブリン（Ｉｇ）及びＦｃ融合タンパク質を含む治療活性があるタンパク質などの、関心のあるタンパク質をコードする導入遺伝子である。インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）又は第ＶＩＩＩ凝固因子などのある特定の免疫グロブリンは、細胞内のボトルネックの特徴が殆ど不明なため、発現させることが著しく困難である。本発明のＭＩＰ発現ベクター、組み換え真核細胞及び方法を活用して、これらのボトルネックが同定され得、及び／又は除かれ得る。

【0046】

関心のあるタンパク質などの導入遺伝子を発現するクローンの、ＩｇＧ生産性などの比生産性は、一般に第３日～第７日の産生相中に計算される積分生存細胞数（ＩＶＣＤ）に対するＩｇＧ濃度の勾配として決定され、ｐｇ／細胞及び／日（ｐｃｄ）として表される。

【0047】

発現容易な（ＥＴＥ）導入遺伝子、特に治療用タンパク質などの関心のあるタンパク質をコードする導入遺伝子は、１０ｐｃｄを上回るレベルでＣＨＯにおいて、標準培地中で発現される。ＥＴＥ導入遺伝子の例はトラスツズマブ抗体である。

【0048】

発現困難な（ＤＴＥ）導入遺伝子、特にタンパク質、特に治療用タンパク質などの関心のあるタンパク質をコードする導入遺伝子は、一般に１０ｐｃｄを下回るレベルでＣＨＯにおいて標準培地中で発現される。ＤＴＥ導入遺伝子の例は、インフリキシマブＩｇＧ１（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、エタネルセプトＦｃ－融合（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））又はベバシズマブ又は第ＶＩＩＩ凝固因子などの他の分泌タンパク質、並びにインターフェロンベータタンパク質をコードする導入遺伝子である。本明細書中で使用される場合、導入遺伝子という用語は、ＲＮＡ転写開始シグナル、ポリアデニル化付加部位、プロモーター又はエンハンサーなどの非転写隣接領域を含まない。

【0049】

本発明によるベクターは、別の核酸、例えばＭＩＰをコードする核酸などを細胞中に輸送できる核酸分子である。例えば、プラスミドは、あるタイプのベクターであり、レトロウイルス又はレンチウイルスは別のタイプのベクターである。ある実施形態では，ベクターは遺伝子移入前に直線化される。

【0050】

ＭＩＰ発現ベクターは、発現ベクターに組み込まれたＭＩＰの効率的な転写をもたらす、プロモーター、エンハンサー、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）、マトリクス付着領域（ＭＡＲｓ）、足場付着領域（ＳＡＲ）、インスレーターエレメント及び／又は核マトリクス付着ＤＮＡなどの調節配列を含む。これらの制御調節配列は常には外因性であり、しばしば異種である（以下参照）。

【0051】

プロモーターは、コード配列の発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は近位及びより離れた上流エレメントを含み、後者のエレメントはエンハンサーと呼ばれることが多い。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得、相同又は異種であり得る、ＤＮＡ配列である。

【0052】

ＭＩＰ発現ベクター、また本明細書中で開示される何らかの他のベクター又は組み換え細胞は、ＣＭＶ、ＥＦ１アルファ、ＣＭＶ／ＥＦ１アルファ融合プロモーター、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＰＧＫ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上のプロモーターを含み得、これは、例えばそれぞれのプロモーターに特異的な発現レベルでＭＩＰの何れか１つ又はその組み合わせを発現するために使用され得る。例えば、プロモーターＣＭＶ／ＥＦ１アルファ（一般に非常に強力なプロモーターと呼ばれる）は、ＣＭＶ／ＥＦ１アルファプロモーター）に特異的な第１の発現レベル（＝ＣＭＶ／ＥＦ１アルファプロモーター発現レベル＋／－５％又は１０％）でそれぞれの遺伝子を発現するために使用され得、一方でプロモーターＣＭＶ（一般に、全長である場合は強力なプロモーターと呼ばれ（本明細書中で以後、「ＣＭＶプロモーター」）は、発現低下のための修飾全長ＣＭＶプロモーターとして提供される場合は弱いプロモーターと呼ばれ（「最小ＣＭＶプロモーター」と呼ばれることがある）、第２の発現レベル（＝ＣＭＶプロモーター発現レベル＋／－５％又は１０％）でそれぞれの遺伝子を発現させるために使用され得、このとき、第１の発現レベルは、ＣＭＶプロモーターに特異的な第２の発現レベルを超える。発現させようとする関心のあるタンパク質のタイプに依存して、１つ又は他のプロモーターを使用し得る。これらのプロモーターは、ある特定の実施形態で誘導可能である。異なるプロモーターが、最低２つのプロモーターを含むプロモーターラダーの一部であり得る。

【0053】

１つ以上のプロモーターの導入及び／又は宿主細胞内の１つ以上のプロモーターの変異体の生成（本明細書中で「組み換えプロモーター」と呼ぶ）を含むプロモーター交換は、複数の発現レベル（例えばプロモーターラダー）、又は異なる調節特性（例えば選択遺伝子に対するより厳しい制御調節）を示し、例えば、ＣＨＯ細胞などの真核細胞（宿主細胞）にとって内在性であるＭＩＰの発現レベルを変化させるためにも使用され得る。

【0054】

プロモーターラダーは、プロモーター活性のレベルが異なる複数のプロモーターを含む。プロモーターラダーは、プロモーターの制御下で遺伝子の発現レベル、例えば第１の発現レベルを超える第２の発現レベル、を提供する活性とそれぞれ結び付けられる、２、３、４、５つ又はそれを超えるプロモーターを含み得る。プロモーターラダーは、内因性ＭＩＰの遺伝子と結びつけられ得るが、外因性対応物とも結びつけられ得る。ラダーは、ある特定のレベルで関心のある生成物を発現する導入遺伝子の発現のために必要とされるＭＩＰレベルに依存して、プロモーターの切り替えを可能にする。このようなラダーは、異なるタイプのこのような導入遺伝子の状況で使用される発現レベルを最適化するためにも使用され得る。

【0055】

本発明による担体ベクターは、関心のあるタンパク質を発現する導入遺伝子を細胞に輸送するように適応された発現ベクターである。これは、調節配列も含み一般に、関心のあるタンパク質をコードする核酸及び任意選択的に抗生物質耐性遺伝子及び／又はナトリウムーマルチビタミン輸送体ＳＬＣ５Ａ６などのビタミン輸送タンパク質の挿入に適応される少なくとも１つの制限酵素切断部位を有する。発現ベクターはまた、複製起点も含有し得る。当業者が容易に理解するであろうように、関心のあるタンパク質を発現する導入遺伝子もＭＩＰベクターに組み込まれ得る。

【0056】

トランスポゾンは、「カットアンドペースト」又は「コピーアンドペースト」機序を介してベクターと染色体の間で効率的に転位する、動く遺伝子エレメントである。転位中に、トランスポゾン系のトランスポサーゼ（例えばＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系のＰＢトランスポサーゼ）は、トランスポゾンの両端に位置するトランスポゾン特異的な末端逆位反復配列（ＩＴＲ）（何れかのトランスポゾン系に対して５’－及び３’ＩＴＲがある）を認識し、その含有物を元の部位から動かし、それらを染色体部位、例えばＴＴＡＡ染色体部位などに組み込む。例えばＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系の強力な活性は、２つのＩＴＲの間にある関心のある遺伝子が標的ゲノムに容易に移動することを可能にする。ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系は、例えば、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１５４０７０号明細書に記載される（米国特許出願公開第２０１５／０３６１４５１号明細書も参照）。非ウイルスベクターの中で、トランスポゾンは、宿主ゲノム内の複数の遺伝子座で高頻度にＤＮＡ配列のシングルコピーを組み込むそれらの能力のため、魅力的である。ウイルスベクターとは異なり、いくつかのトランスポゾンは、優先的に細胞性遺伝子の近くに組み込まないことが報告され、従ってこれらは有害な突然変異を導入する可能性がより低い。さらに、トランスポゾンは、容易に作製され、取り扱われ、逆方向反復配列に隣接するカーゴＤＮＡを含有するトランスポゾンドナーベクター／プラスミド（又は単に「トランスポゾンベクター」及びトランスポサーゼ－発現ヘルパーベクター／プラスミド（本明細書中で「トランスポサーゼ発現ベクター」とも呼ぶ。）又はｍＲＮＡから一般に構成される。いくつかのトランスポゾン系は、内因性トランスポゾンコピーを妨害することなく様々な細胞株でＤＮＡを移動させるように開発された。例えば、元来イラクサギンウワバ（ｃａｂｂａｇｅ ｌｏｏｐｅｒ ｍｏｔｈ）から単離されたＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンは、カーゴＤＮＡを様々な哺乳動物細胞中に効率的に転位させる。トランスポゾンドナープラスミドにおいて、エピジェネティック調節エレメントが、プラスミドベクター上で導入遺伝子の付近に置かれる場合に不要なエピジェネティック効果からカーゴＤＮＡを守るために使用され得る。例えば、ＭＡＲは、強力なヒトＭＡＲ１－６８及びＭＡＲ Ｘ－２９エレメントにより例示されるように、ヘテロクロマチン抑制を防ぎながら、カーゴＤＮＡゲノム組み込み及び転写を向上させ得る。これらは、インスレーターとしても作用し得、それにより近隣の細胞性遺伝子の活性化を防ぐ。ＭＡＲエレメントは従って、プラスミド又はウイルスベクターに関して、高く持続的な発現を媒介するために使用されてきた（その全体において参照により本明細書中に具体的に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０３６１４５１号明細書を参照）。

【0057】

ＭＡＲエレメント（ＭＡＲ配列又はＭＡＲとも呼ばれる）は、境界又はインスレーターエレメント、例えばｃＨＳ４、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）、安定化抗リプレッサー（ＳＴＡＲ）エレメント、ユビキタスに作用するクロマチンオープニング（ＵＣＯＥ）エレメントなど、又はヒストン修飾因子、例えばヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）も含む、エピジェネティック調節因子エレメントのより広い群に属する。

【0058】

ＭＡＲエレメントは、それらが主に基づく同定されたＭＡＲに基づき定められ得る：従ってＭＡＲコンストラクトは、そのヌクレオチドの大部分（５０％＋、好ましくは６０％、７０％又は８０％）がＭＡＲ Ｓ４に基づくＭＡＲエレメントである。Ａ及びＴ含量が高いなどのいくつかの単純な配列モチーフは、ＭＡＲＳ内で多く見出されてきた。一般的に見られる他のモチーフは、Ａ－ｂｏｘ、Ｔ－ｂｏｘ、ＤＮＡ巻き戻しモチーフ、ＳＡＴＢ１結合部位（Ｈ－ｂｏｘ、Ａ／Ｔ／Ｃ２５）及び脊椎動物又はショウジョウバエに対するコンセンサストポイソメラーゼＩＩ部位である。

【0059】

ＭＡＲは一般に、核マトリクスが付着する真核染色体のＤＮＡ中の配列として特徴づけられる。ＭＡＲの特性は、それらの一次構造によって部分的にのみ定められる。例えばＡＴリッチ領域などのＭＡＲエレメントで見られる典型的な一次構造は、三次構造、即ちＭＡＲの機能を定めるある特定の湾曲をもたらすことが知られている。従って、ＭＡＲは、それらの一次構造によってのみ定められるのではなく、それらの二次、三次構造、例えばそれらの湾曲の度合い及び／又は溶融温度などの物理的特性によっても定められることが多い。

【0060】

ＭＡＲエレメントでよく見られるようなＡＴ／ＴＡ－ジヌクレオチドに富む屈曲ＤＮＡ領域（本明細書中で以後、「ＡＴリッチ領域」と呼ぶ）は、多数のＡ及びＴを、特にジヌクレオチドＡＴ及びＴＡの形態で含む屈曲ＤＮＡ領域である。好ましい実施形態では、これは、屈曲した二次構造を有しながら、１００連続塩基対のストレッチ上で少なくとも１０％のジヌクレオチドＴＡ及び／又は少なくとも１２％のジヌクレオチドＡＴ、好ましくは１００連続塩基対のストレッチ上で（又はＡＴリッチ領域がより短い長さである場合、個々のより短いストレッチ上で）少なくとも３３％のジヌクレオチドＴＡ及び／又は少なくとも３３％のジヌクレオチドＡＴを含有する。しかし、「ＡＴリッチ領域」は、約３０ヌクレオチド以下くらい短くてよいが、好ましくは約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０又は約４００ヌクレオチド長またはそれより長い。

【0061】

いくつかの結合部位も、ＳＡＴＢ１結合部位（Ｈ－ｂｏｘ、Ａ／Ｔ／Ｃ２５）及び脊椎動物に対するコンセンサストポイソメラーゼＩＩ部位（ＲＮＹＮＮＣＮＮＧＹＮＧＫＴＮＹＮＹ）（配列番号１５４）又はショウジョウバエに対するもの（ＧＴＮＷＡＹＡＴＴＮＡＴＮＮＲ）（配列番号：１５５）など、比較的高いＡ及びＴ含量を有することが多い。しかし、結合部位のクラスターを含む、結合部位領域（モジュール）、特にＴＦＢＳ領域は、領域の屈曲パターンの比較により、Ａ及びＴ含量が高いＭＡＲエレメントからのＡＴ及びＴＡジヌクレオチドリッチ領域（「ＡＴリッチ領域」）とは容易に区別され得る。例えばヒトＭＡＲ１＿６８の場合、後者は約３．８又は約４．０を超える平均屈曲度を有し得、一方でＴＦＢＳ領域は、約３．５又は約３．３を下回る平均屈曲度を有し得る。同定されたＭＡＲの領域は、本明細書中の他の箇所に記載のような相対融解温度などであるが限定されない、代替的な手段によっても確認され得る。しかし、このような値は、種特異的であり、従って種間で変わり得、例えばより低いものであり得る。従って、それぞれのＡＴ及びＴＡジヌクレオチドリッチ領域は、約３．２～約３．４又は約３．４～約３．６又は約３．６～約３．８などの、より低い屈曲度を有し得、ＴＦＢＳ領域は、約２．７未満、約２．９未満、約３．１未満、約３．３未満などの、相対的により低い屈曲度を有し得る。ＳＭＡＲ ＳｃａｎＩＩにおいて、それぞれより低い領域サイズが、当業者により選択される。

【0062】

いくつかの好ましい同定されたＭＡＲエレメントとしては、これら及び他のＭＡＲエレメントの配列の開示に対して本願に参照により具体的に組み込まれる国際公開第２００５０４０３７７号パンフレット及び米国特許出願公開第２００７０１７８４６９号明細書で開示されるような全てのそれらの未熟型を含む、ＭＡＲ１＿６８、ＭＡＲ Ｘ＿２９、ＭＡＲ１＿６、ＭＡＲ Ｓ４、ＭＡＲ Ｓ４６が挙げられるが限定されない。ニワトリリゾチームＭＡＲも好ましい実施形態である（ＭＡＲエレメントのその開示に対して本明細書中にまた具体的に組み込まれる米国特許第７，１２９，０６２号明細書を参照）。

【0063】

ベクターが特異なＭＡＲを含むと言われる場合、これは、このベクターにおいて１つのＭＡＲがあり、このベクター内に同じ又は異なるタイプ又は構造の何れかの他のＭＡＲがないことを意味する。このような特異なＭＡＲは、ある実施形態では、例えば導入遺伝子組み込み部位と３’ＩＴＲの間に、例えば関心のあるタンパク質をコードする導入遺伝子の組み込み部位の下流に位置する。ある実施形態では、このような導入遺伝子は、ＭＩＰをコードするＣＤＳであり、５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの間に位置する。ＭＡＲは、ＭＩＰをコードするＣＤＳの３’末端でポリアデニル化シグナルに続き、ポリアデニル化部位と３’ＩＴＲの間に位置する。ＣＭＶプロモーター及び／又はＣＭＶ／ＥＦ１アルファ融合プロモーターなどのプロモーターは、５’ＩＴＲ及びＭＩＰをコードするＣＤＳに位置する。

【0064】

遺伝子移入は、本明細書中で使用される場合、裸の又は精製された核酸又は、細胞へ、特に哺乳動物細胞を含む真核細胞へ特異的な核酸を運ぶベクタ’ ’ーを含む、核酸の導入を指す。何らかの公知の遺伝子移入方法が、本発明の状況で使用され得る。これらの方法のいくつかは、細胞に核酸を持ち込むために生体膜の透過性を促進することを含む。突出した例は、エレクトロポレーション又はマイクロポレーションである。本方法は、それ自身により使用され得るか、又は、宿主細胞への核酸の流入率を選択的に促進するために、音波、電磁気及び熱エネルギー、化学的透過性促進因子、圧力などにより支持され得る。リポフェクション又はウイルス（形質導入とも呼ばれる）及び化学に基づく遺伝子移入を含む担体に基づく遺伝子移入などの、他の遺伝子移入方法も、本発明本発明の範囲内である。しかし、細胞の内部に核酸を持ち込むあらゆる方法を使用し得る。一過性遺伝子移入細胞は、短時間の期間、遺伝子移入ＲＮＡ／ＤＮＡを運び／発現し、それを伝えない。安定な遺伝子移入細胞は遺伝子移入ＤＮＡを継続的に発現し、それを伝え：外因性核酸は細胞のゲノムに組み込まれる。本発明による安定な遺伝子移入細胞は、例えば、その中でＭＩＰ導入遺伝子がトランスポゾンベクターでの遺伝子移入の後で細胞のゲノムの一部になる、細胞を含む。

【0065】

完全培地中で増殖する細胞は、標準的な濃度で利用可能な全てのビタミンを有する。標準的な濃度を、本明細書中で１Ｘと呼ぶ。Ｂ１、Ｂ５及びＨ（１Ｘ）について標準的濃度を、それぞれ７．５μＭ、２．５μＭ及び０．５μＭに設定した。Ｂ５は、ＣＨＯ細胞に対して１０^－４Ｘ～１０^－３Ｘ（０．２５～２．５ｎＭ）前後の増殖制限濃度範囲を有すると決定され、一方で１０^－２Ｘ以上の濃度は正常な培養物増殖を可能にした。Ｂ１の制限濃度は、ＣＨＯ細胞の場合１０^－５Ｘ（１５ｐＭ）～１０^－４Ｘ（１５０ｐＭ）であると決定され、一方でそれは、Ｈに対して１０^－５Ｘ（５ｐＭ）よりも低かった。

【0066】

上記ビタミンの制限濃度を有する培地（限定培地又は欠乏培地）中で、濃度は、完全培地（１Ｘ）中に存在する個々のビタミンの上記標準濃度に対して、１Ｘ未満、例えば１０^－１Ｘ、１０^－２Ｘ、１０^－３Ｘ、１０^－４Ｘ、１０^－５Ｘである。ビタミンの濃度は、濃度が標準参照培地中の濃度を超える場合、飽和しているとみなされる（本明細書中で「飽和培地」とも呼ばれる）（例えば完全培地中で見出される量の２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ又は１０Ｘ）。

【0067】

本発明は、とりわけ、制限培地中で細胞の増殖及び／又は分裂が抑止され得、かつ細胞が最大の抑止された／発現レベル（［ｇ／１］での「ＭＡ／ＥＬ」）で関心のあるタンパク質の産生を引き起こすＭＩＰを生成する、という事実を利用する。関心のあるタンパク質が、細胞抑止中に産生されるＭＩＰをコードする遺伝子の１つ以上とともに細胞に同時遺伝子移入される場合、関心のあるタンパク質は、１つ以上のＭＩＰが存在しないとき／細胞増殖及び／又は分裂が抑止されないとき、同じタイプの細胞により発現されるタンパク質の最大レベル（［ｇ／１］での「ＭＬ」）を超え得るＭＡ／ＥＬで産生され得る。ＭＡ／ＥＬは、１，５ｘＭＬよりも大きいか、２ｘＭＬよりも大きいか、又はさらに２．５ｘ若しくは３ｘＭＬよりも大きい。例えば、ＭＩＰと同時遺伝子移入されない組み換えＣＨＯ細胞などの、組み換え細胞により発現される、抗体などの関心のあるタンパク質のＭＬが約１ｇ／Ｌの抗体であり得る一方で、１つ以上のＭＩＰも発現する組み換え細胞により発現される抗体などの、関心のあるタンパク質のＭＡ／ＥＬは、約１．５ｇ／Ｌ又は２ｇ／Ｌの抗体又はそれを超え得る。

【0068】

発現系／ベクターは一般に、関心のあるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターで形質転換される真核細胞（宿主細胞、本明細書中で組み換え真核細胞とも呼ばれる）の選択を促進する、選択可能マーカー遺伝子を含有する。遺伝子により発現される選択可能なマーカー（又は「選択可能なタンパク質」）は、抗生物質耐性に基づくことが多い。例えばピューロマイシン耐性選択発現カセットは、ピューロマイシンの添加を介して、カセットで首尾よく形質転換されている細胞を同定するために使用され得る。しかし、抗生物質に対する耐性のない選択も可能である。本発明の状況において、ビタミン代謝タンパク質、特にビタミン輸送タンパク質は、単独又は他の選択可能マーカーとの組み合わせの何れかで選択可能マーカーとして働き得る。従って、その最も単純な形態で、Ｂ５（パントテン酸）、ビタミンＢ１（チアミン）及び／又はＨ（Ｂ８又はビオチン）などの１つのビタミンを欠く培地中で、選択可能マーカーとして個々のビタミン輸送タンパク質を発現する組み換え真核細胞は、個々のビタミン輸送タンパク質を発現しない細胞よりも良好に増殖し得る。しかし、本明細書中で論じられるように、標準的な培地中でさえも、ビタミン輸送タンパク質は、増殖の長所をもたらし、従って選択可能マーカーとして使用され得る。本発明の発現系は、例えば抗生物質耐性に基づく選択可能マーカー遺伝子に加えて、選択可能マーカーとして、ビタミン代謝タンパク質、特にビタミン輸送タンパク質、例えばナトリウム－マルチビタミン輸送体ＳＬＣ５Ａ６を含有し得る。

【0069】

本明細書中で開示されるポリヌクレオチド及びタンパク質配列と５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を超える配列同一性を有する核酸及びタンパク質もまた、単独で又は本明細書中で開示される何らかの系（例えばベクター及び細胞）、細胞、方法及びキットの一部としての何れかで、本発明の一部である。本発明の核酸は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９個の又はそれを超えるヌクレオチドだけ、何れかの野生型配列とは異なり得る。多くの例において、個々の遺伝子／ｃＤＮＡのＣＤＳから構成される核酸が好ましい。

【0070】

配列同一性という用語は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性の目安を指す。一般に、配列は、最大の一致が得られるように並べられる。「同一性」は、それ自体、当技術分野で認識される意味を有し、公開されている技術を用いて計算され得る（例えば：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１を参照）。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列間の同一性を測定するための多くの方法が存在する一方で、「同一性」という用語は当業者にとって周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８））。

【0071】

何らかの特定の核酸分子が、例えばＭＩＰをコードするある特定の核酸配列又はその一部と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるか否かは、最初の配列アライメントのためのＤＮＡｓｉｓソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｂｒｕｎｏ，Ｃａｌｉｆ．）など公知のコンピュータプログラム、続いて複数の配列アライメントのためのＥＳＥＥバージョン３．０ ＤＮＡ／タンパク質配列ソフトウェアを従来のように使用して決定し得る。

【0072】

アミノ酸配列が、例えばタンパク質の形態のＭＩＰ又はその一部と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるか否かは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）などの公知のコンピュータプログラムを従来のように使用して決定し得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、２つの配列間の相同性の最良のセグメントを見つけるために、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのローカル相同性アルゴリズム、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９（１９８１）を使用する。多くのＭＩＰは、よく研究されており、１つの、しかし多くは複数の保存領域を有する。当業者が認めるように、核酸／タンパク質配列の変化は好ましくは、排他的ではないが、個々のＭＩＰのこのような保存領域外であることが好ましい。

【0073】

特定の配列が本発明による参照配列と例えば９５％同一であるか否かを決定するために、ＤＮＡｓｉｓ、ＥＳＥＥ、ＢＥＳＴＦＩＴ又は何らかの他の配列アライメントプログラムを使用する場合、パラメーターは、同一性のパーセンテージが参照核酸又はアミノ酸配列の全長にわたり計算され、かつ参照配列でのヌクレオチド総数の最大５％の相同性におけるギャップが許可されるように、設定される。

【0074】

導入遺伝子発現に対する選択されたＭＩＰの影響
上記で論じられるように、Ｆｏｘａ１は一般に、過剰発現される場合、細胞生存能、生存細胞密度及び発現容易な及び発現困難な治療用タンパク質両方の産生を増加させる。この効果は、Ｆｏｘａ１介在性Ｔａｇａｐ上方制御に割り当てられ得る。実際に、過剰発現される場合、Ｔａｇａｐは生存細胞密度を一時的に上昇させ得、発現容易な及び発現困難な治療用タンパク質のタイターの上昇が観察された。

【0075】

Ｔａｇａｐは、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）ファミリーのシグナル伝達タンパク質メンバーである。胸腺細胞において、それは活性ＲｈｏＡの存在量を調節し、従って細胞骨格再構成及びβ１－インテグリン介在性接着の放出を促進し皮質から髄質への胸腺細胞の移動を可能にすることが示された（Ｄｕｋｅ－Ｃｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。さらに、Ｔａｇａｐ及び心筋アクチンアルファ（ＡＣＴＣ１）が、非常に高レベルで治療用タンパク質を産生するビタミンＢ５選択細胞において上方制御されることが分かり、Ｔａｇａｐ過剰発現がＡＣＴＣ１の発現を上昇させ、これが続いて様々な治療用タンパク質の産生を増加させることが示された。従って、ＣＨＯ浮遊細胞において、ＴＡＧＡＰは、細胞表面インテグリンへの細胞内細胞骨格シグナルに対する介在因子として機能し得、故に細胞増殖、生存能及び浮遊への適合を改善し得る。

【0076】

興味深いことに、球状のインテグリンクラスター化並びにアクチン含量の増加及び球状アクチン外筒の形成が、浮遊適応ＣＨＯ細胞において観察された（Ｗａｌｔｈｅｒ，Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，＆ Ｊａｍｅｓ，２０１６）。Ｔａｇａｐの発現上昇は従って、懸濁環境中のアクチン介在性の細胞適合を向上させることに寄与し得る。Ｔａｇａｐ上方制御は、アクチン細胞骨格が分泌経路の制御に関与するので、治療用タンパク質分泌の改善にも寄与し得る（Ｓｔａｍｎｅｓ，２００２）。特に、Ｔｒａｓ高産生クローンで上方制御される別の候補遺伝子、Ａｒｈｇａｐ４２（Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質４２）は、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質であり、それは、アクチンストレス繊維及び接着斑に局在しかつ細胞運動性を促進することが示された（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。さらに、Ａｒｈｇａｐ４２はＦｏｘａ１標的遺伝子でもある。従って、Ａｒｈｇａｐ４２発現は、好ましくはタイター及び生存細胞密度を上昇させるための、本発明の範囲内でもある。

【0077】

上記のように、ＡＣＴＣ１（アクチンアルファ心筋１）遺伝子は、心筋アルファアクチン合成に関与することが知られている。これは、ＣＨＯ細胞などの組み換え真核細胞によるＥＴＥ及びＤＴＥ治療用タンパク質の発現及び分泌を改善するためにも作用する。ＡＣＴＣ１レベルの上昇が全体的なアクチン重合化の低下を伴うことが観察され、細胞骨格の組織化が治療用タンパク質の発現又は分泌を制御するか又はこれに影響を与えることを示唆する。この観察を裏付けるために、自然に低下したアクチン重合化レベルを有するＣＨＯ細胞プールが、顕著により高いレベルの組み換えタンパク質を分泌することが示された。アクチン過剰発現細胞による治療用タンパク質の放出増大はＩｇＧ軽鎖及び重鎖ｍＲＮＡの増加を伴わなかったので（データは示さない）、このアクチンの影響は転写後であると結論づけられた。

【0078】

データは、ＡＣＴＣ１過剰発現が過剰なアクチン単量体を蓄積し、これがＧ／Ｆ－アクチンとの細胞内バランスを撹乱し得、それにより観察されたＦ－アクチン重合形態の減少を引き起こすことを裏付ける。アクチンダイナミクス及び遺伝子発現の相互関係は、哺乳動物細胞において既に提案されている。例えば、Ｆ－アクチン破壊を誘発する化学剤での初代マウス細胞の処理が、翻訳及びタンパク質合成の広い阻害を誘発したこと及びこれが細胞ストレス応答を活性化したことが分かった（Ｓｉｌｖａ，Ｓａｔｔｌｅｇｇｅｒ，＆ Ｃａｓｔｉｌｈｏ，２０１６）。ここで、自然発生的な又はＡＣＴＣ１過剰発現に誘発された何れかのアクチン重合化の減少は、ＣＨＯ細胞による組み換えタンパク質発現の上昇にむしろ介在したこと、及び細胞分裂又は生存能を損なわなかったことが示され得た。Ｆ－アクチン脱重合化は、小胞及びタンパク質輸送を促進し得るアクチンアセンブリーのターンオーバーを誘発し得ることが推測され得る。例えば、コリフィンは、アクチン再組織化を誘導するアクチン脱重合タンパク質であり、それにより低分子及び小胞輸送の開口分泌を促進する（Ｂｉｒｋｅｎｆｅｌｄ，Ｋａｒｔｍａｎｎ，Ｂｅｔｚ，＆ Ｒｏｔｈ，２００１）。同様に、より低いレベルの重合化アクチンについて選択されたＣＨＯ浮遊細胞は、より高い細胞骨格再組織化を示し得、これが次に組み換えタンパク質分泌を向上させ得る。しかし、及びＡＣＴＣ１過剰発現の別の好ましい効果は、早期解糖の細胞毒性乳酸副産物の蓄積を減少させることである。乳酸蓄積と細胞骨格の相互関係は、細胞骨格の撹乱が乳酸輸送体及び卵母細胞による移入を阻害できることを示す報告によって示唆され（Ｔｏｓｃｏ，Ｆａｅｌｌｉ，Ｇａｓｔａｌｄｉ，Ｐａｕｌｍｉｃｈｌ，＆ Ｏｒｓｅｎｉｇｏ，２００８）、ＣＨＯ細胞アクチン脱重合化が毒性の細胞内乳酸濃縮物の蓄積を防ぎ得ることを示唆する。

【0079】

全体的に見て、いくつかの機序は、ＣＨＯ細胞などの真核細胞によるタンパク質産生に対するアクチン過剰発現のポジティブな効果を説明し得、これは、これらの細胞の基礎的代謝及び解糖による、並びにタンパク質分泌の潜在的な活性化によるエネルギー産生の両方に関係し得る。要するに、ＡＣＴＣ１過剰発現及び／又はＳｉＲ－アクチン染色及び細胞選別を用いたＦ－アクチン重合化の自然発生的変化についてのアッセイは両方とも、安定な細胞プールからの高発現ＣＨＯ細胞の単離を促進するために使用し得ることが示され得る。

【0080】

細胞骨格タンパク質及び細胞骨格組織化の調整を、バイオテクノロジー的目的のためにタンパク質産生を向上させるために使用し得ることが示され得る。

【0081】

上で記載のように、Ｅｒｐ２７は、非フォールディングタンパク質に選択的に結合し、ＥＲにおいてジスルフィドイソメラーゼＥｒｐ５７と相互作用するタンパク質である（Ａｌａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｋｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。また上で記されるように、Ｆｏｘａ１は、様々な器官の発生に関与するパイオニア転写因子である（Ｚａｒｅｔ ＆ Ｃａｒｒｏｌｌ，２０１１）。これらのＭＩＰの特異的な組み合わせの発現は、流加培養における細胞密度及び生存能の上昇、発現容易な並びに発現困難な治療用タンパク質のより高い産生及び活性酸素種の低下を引き起こすことが示され得、高効率の治療用タンパク質産生に対する新しい道をもたらす。表２は、親ＣＨＯ細胞に対する、及びＴｒａｓポリクローナル細胞（ＰＣ）に対する、Ｔｒａｓ高産生クローン（ＨＰＣ）で上方制御される遺伝子を示す（図１１～１５）。

【0082】

ＥＲ局在タンパク質Ｅｒｐ２７は、発現容易な及び発現困難な治療用タンパク質の両方の高レベル産生に関与するものとして同定された。Ｅｒｐ２７はＰＤＩファミリーの酸化還元－不活性メンバーであるという事実にもかかわらず、それは非フォールディングタンパク質に選択的に結合しかつジスルフィドイソメラーゼＥｒｐ５７と相互作用するので、おそらくタンパク質フォールディングに寄与すると思われる（Ａｌａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｋｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。著しく発現困難なタンパク質は、ミスフォールディングする傾向があり、非フォールディングタンパク質応答（ＵＰＲ）は、発現困難なタンパク質の発現時に活性化されることが示された（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７で概説）。従って、Ｅｒｐ２７及びＥｒｐ５７過剰発現はおそらく、ミスフォールディングされた発現困難なタンパク質の蓄積を減少させることに直接寄与し、それによりＵＰＲ誘導性アポトーシスを防ぐか又は遅らせる。これは、発現困難なタンパク質を発現する細胞におけるＥｒｐ２７及びＥｒｐ５７同時過剰発現時の細胞生存能及び生存細胞密度の上昇をよく説明する。Ｅｒｐ２７及びＥｒｐ５７がＥＲストレス時に上方制御されることが示された一方で（Ｂａｒｇｓｔｅｄ，Ｈｅｔｚ，＆ Ｍａｔｕｓ，２０１６；Ｋｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、この上方制御は、大量のミスフォールディング組み換えタンパク質を取り扱うのに十分ではないかも知れない。治療用タンパク質の収量を向上させることに加えて、Ｅｒｐ２７及びＥｒｐ５７の過剰発現はまた、抗体品質が細胞生存能と一緒に低下することが分かったので、生成物の品質の問題も防ぎ得る。（Ｋａｎｅｋｏ，Ｓａｔｏ，＆ Ａｏｙａｇｉ，２０１０）。その一方で、トラスツズマブ抗体の高産生は、完全なＵＰＲ応答を惹起せず（Ｌｅ Ｆｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、これは、Ｅｒｐ５７と組み合わせた、又は組み合わせないＥｒｐ２７過剰発現が細胞生存能を向上させず、これらの状態では生存細胞密度に対し影響がなかったか又は殆どなかったという知見と一致する。それにもかかわらず、ＣＨＯ細胞のフォールディング能は、Ｅｒｐ２７の適度の過剰発現がトラスツズマブタイターを増加させたという事実により示されるように、依然としてこれらの状態におけるボトルネックに相当し得る。

【0083】

ＥＲにおけるタンパク質フォールディングがいくつかの治療用タンパク質の産生に対する制限段階であることが明らかにされた一方で、矛盾する結果が、治療用タンパク質産生に対するＰＤＩ及びＥｒｐ５７過剰発現の影響に関して発表された（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７で概説）。Ｃａ３上方制御が、発現容易な及び発現困難なタンパク質高産生クローンにおいて、並びにＦｏｘａ１過剰発現細胞において、及び比較的低い程度でＴａｇａｐ過剰発現細胞において観察された。特に、Ｃａ３は、Ｈ_２Ｏ_２誘導性アポトーシスを阻害すること及びＨ_２Ｏ_２誘導性ＲＯＳ活性を低下させることが示された（Ｒａｉｓａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。それは低酸素ストレスに対し細胞を保護することも示された（Ｄｉ Ｆｉｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８で概説）。重要なことに、ＲＯＳの蓄積が流加培養中に観察され、酸化ストレスが抗体の収率及びガラクトシル化に影響することが示された（Ｈａ，Ｈａｎｓｅｎ，Ｋｏｌ，Ｋｉｌｄｅｇａａｒｄ，＆ Ｌｅｅ，２０１８）。さらに、流加培養中の抗酸化剤バイカレイン又はＳ－スルホシステインの添加は、流加培養において細胞生存能及び抗体産生を改善した（Ｈａ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｈｅｃｋｌａｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。一致して、発明者らは、流加培養の最終日中のＦｏｘａ１過剰発現細胞中でのＲＯＳ蓄積の低下、及び細胞生存能上昇を発見した。対照的に、Ｃａ３過剰発現がＴｒａｓタイターの上昇をもたらした一方で、発明者らは、細胞生存能に対するポジティブ効果を全く観察しなかった。可能な説明は、Ｃａ３が適正なレベルで過剰発現されなかったということである。細胞生存能のＦｏｘａ１介在性の上昇は他の遺伝子の活性化を必要とするという可能性もある。可能な候補はＣＤＫ１５であり、それはＴｒａｓ高産生クローンにおいても上方制御され、かつアポトーシスから細胞を保護することが示されたが（Ｐａｒｋ，Ｋｉｍ，Ｋｉｍ，＆ Ｃｈｕｎｇ，２０１４）、ＣＤＫ１５がＦｏｘａ１標的遺伝子であるか否かはまだ調べられていない。

【0084】

最後に、Ｒａｓｓｆ９上方制御も、発現容易な及び発現困難な高産生クローンにおいて並びにＦｏｘａ１過剰発現細胞において観察された。Ｒａｓｓｆ９は、エンドソームのリサイクルと関連することが示され、複合的な膜タンパク質とのその相互作用を介して小胞輸送を調節することが提案された（Ｃｈｅｎ，Ｊｏｈｎｓｏｎ，＆ Ｍｉｌｇｒａｍ，１９９８）。その過剰発現はＴｒａｓ１４に対してのみ治療用タンパク質タイターの上昇をもたらし、Ｔｒａｓ６については上昇させないが、これが治療用タンパク質の分泌に関与するという可能性がある。

【0085】

全体的に見て、いくつかのＣＨＯ細胞遺伝子の上方制御が、様々な発現容易な及び発現困難な治療用タンパク質の産生収率の改善に寄与することが観察され得る。興味深いことに、これらのＣＨＯ遺伝子のいくつかは、Ｆｏｘａ１転写活性化因子により上方制御されると思われる。従って発明者らは、Ｆｏｘａ１発現上昇が高レベル治療用タンパク質産生に好ましい転写プログラムを誘発し得、かつこれが関心のある組み換えタンパク質の産生を改善するための好都合なアプローチを提供すると結論づける。本発明は非限定例により以下で説明する。

【0086】

実施例
ＭＩＰ候補選択
ＲＮＡ Ｓｅｑ概要
Ｂ５選択中に細胞で起こる遺伝的及び代謝的変化を解読した。そのようにするために、非選択細胞とＢ５、及び非選択細胞と抗生物質を比較して、ＲＮＡＳｅｑによるトランスクリプトーム分析（図１Ａ）を行った。その発現がＡＢ選択とＢ５選択の間で顕著に上方制御された遺伝子（Ｐ＞０．５で少なくとも１．５倍上昇）を同定し、ＥＴＥ及びＤＴＥ組み換え細胞株の両方で検出した。Ｂ５選択標的としての３１個の遺伝子候補を見出した（表１）。

【0087】

これらの遺伝子の発現パターンを２つのカテゴリーに分類し得る（図１Ｂ）。候補遺伝子の殆どを含んだ第１のカテゴリーは、抗生物質（ＡＢ）選択時に組み換えタンパク質を遺伝子移入した後、遺伝子発現低下を示した（上のグラフ）。しかし、遺伝子発現は、Ｂ５選択組み換え細胞において改善された。この発現パターンに対する仮説は、遺伝子転写が、高量で組み換えタンパク質を産生するための細胞機構に対する競合ゆえに困難であるということであった。それどころか、Ｂ５選択は全般的な細胞適応度及び代謝を改善し得、これは標的遺伝子発現の改善をもたらし得る。

【0088】

第２の発現パターン（図１Ｂ下のグラフ）について、標的遺伝子が、非遺伝子移入細胞と比較した場合、ＡＢ及びＢ５選択細胞の両方において誘導され、Ｂ５選択細胞において発現がより高かった。この場合、標的遺伝子は、組み換えタンパク質に応答して誘導され得、組み換えタンパク質産生及び細胞からの分泌の異なる段階の何れかに関与し得るか、又は炎症応答により引き起こされる解毒過程の一部であり得る。

【0089】

Ｂ５選択は、酵素及びトランスポーターなどの主に代謝遺伝子において変化を誘導した（９個／３１個の標的遺伝子）。Ｂ５選択はＢ５欠乏による一次代謝の変化に基づくので、相当な数の標的遺伝子が多様な細胞代謝の一部であることが予想された。

【0090】

驚くべきことに、これらの遺伝子の５個は脂質代謝に関与した。文献をより深く見ることにより、発明者らは、それらの３個、Ｈｍｇｃｓ２、Ａｃｏｔ１及びＣｙｐ４ａ１４が、共通の転写因子、ＰＰＡＲの標的であったことを見出した（Ｒａｋｈｓｈａｎｄｅｈｒｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0091】

ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡシンターゼ２（Ｈｍｇｃｓ２）は、アセチル－ＣｏＡをアセトアセチル－ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ－ＣｏＡを形成することによりケトン体生成の第１の反応を触媒する、ミトコンドリアのタンパク質をコードする。これは、飢餓動物の肝臓における脂肪酸の代謝運命を決定する（Ｖｉｌａ－Ｂｒａｕ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0092】

Ａｃｏｔ１は、遊離脂肪酸及び補酵素Ａ（ＣｏＡＳＨ）へのアシル－ＣｏＡの加水分解を触媒する、アシル－ＣｏＡチオエステラーゼをコードする。これは長鎖脂肪酸代謝に関与する。

【0093】

チトクロムＰ４５０であるＣｙｐ４ａ１４は、マウスにおいて肝臓損傷、炎症及び線維症に関与することが示されている（Ｚｈａｎｇ，２０１７）。

【0094】

ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）は、核ホルモン受容体のスーパーファミリーに属するリガンド活性化転写因子であり、栄養ホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす（Ｋｅｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。３つの異なるＰＰＡＲサブタイプ：ＰＰＡＲα、ＲＲＡＲβ／δ及びＰＰＡＲγが知られている。全てのＰＰＡＲが核内受容体ＲＸＲとヘテロ二量体を形成し、続いてその標的遺伝子のプロモーターに位置するＰＰＡＲ応答エレメント（ＰＰＲＥ）配列に結合する。ＰＰＡＲによる転写の活性化は、ＰＰＡＲへのリガンド結合、標的遺伝子へのＰＰＡＲの結合、コリプレッサーの除去及び活性化補助因子の動員、クロマチン構造のリモデリング及び最終的には遺伝子転写の促進を含む多くの異なる段階に依存する（Ｍｉｃｈａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＰＰＡＲは、脂質及び炭水化物代謝、血管生物学、組織修復、細胞増殖及び分化及び性差において機能する遺伝子発現を調節する（Ｗａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。従って、研究は、Ｂ５選択とＰＰＡＲ標的活性化をもたらすＰＰＡＲ活性化の間にリンクがあるか否かを調べるために、ＰＰＡＲ及びＰＰＡＲ標的に焦点を当てた。

【0095】

注目された別の標的遺伝子は、アクチン合成に関与するＡＣＴＣ１遺伝子であった。細胞骨格組織化は、タンパク質の合成及び分泌などの多くの細胞構成成分（Ｈｕｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）又は代謝ネットワークの安定性（Ａｏｎ及びＣｏｒｔａｓｓａ，２００２）にとって重要である。従って、組み換えタンパク質産生の増加は、分泌経路（ＥＲシャペロン）及び代謝機序（Ｄｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）の向上と一緒に細胞骨格の向上と相関し得る。最近の試験は、浮遊ＣＨＯ細胞が、それらの皮質下アクチン外筒を強化するために、それらの細胞骨格の再組織化により接着細胞から発達したことを示した（Ｗａｌｔｈｅｒ，２０１６）。従って、アクチン調整は、浮遊細胞適応度及び組み換えタンパク質産生に影響を有し得る。

【0096】

治療用タンパク質に対する高生産性と関連する遺伝子の同定
ＣＨＯ細胞による高レベルでの治療用タンパク質の産生に関連する発現変化を示す遺伝子を同定し、治療用タンパク質産生を改善するための新しい細胞操作候補として試験した。この目的のため、トランスクリプトーム分析を行って、３つの異なるタイプの細胞を比較した：高い細胞密度を維持し、細胞あたり及び１日あたり分泌されるＴｒａｓ １９．３ｐｇ（ｐｇ／細胞／日）の平均の比生産性及び細胞４３３０万個／ｍＬの平均最大生存細胞密度（ＶＣＤ）を示しながら高レベルで発現容易なトラスツズマブ（Ｔｒａｓ）抗体を産生するＣＨＯ細胞クローンを分析した。これらの細胞株を、導入遺伝子を安定に発現する細胞の抗生物質選択後に得られたＴｒａｓポリクローナル細胞集団（比生産性７．４ｐｇ／細胞／日、細胞３６３０万個／ｍＬの最大ＶＣＤ）と、及び非遺伝子移入親ＣＨＯ細胞と、比較した（図１ｃ）。

【0097】

候補遺伝子を、２つの基準に従い選択した：最初の１１３個のｍＲＮＡを選択し、それらは親ＣＨＯ細胞と比較した場合、Ｔｒａｓ高産生クローンで顕著に上方制御された（図１ｃ）。ポリクローナルＴｒａｓ発現細胞プールと比較した場合に高産生クローンで上方制御された１７７４個のｍＲＮＡも選択した。５１個のｍＲＮＡが、両基準と一致し、その上方制御された発現がＴｒａｓ高生産性と関連し得る３２個の遺伝子に対応することが分かった。（図１ｃ、表２）。候補遺伝子のｍＲＮＡレベルの変化を、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して異なる試料においてさらに確認した（図１６、データは示さない）。驚くべきことに、オントロジー分析は、候補タンパク質コード遺伝子がシグナル伝達及び細胞接着に大きく関連したことを示した（表２、図１ｄ）。タンパク質フォールディング（Ｅｒｐ２７）、細胞生存（Ｃａ３、Ｃｄｋ１５、Ｖｅｇｆｄ）、細胞増殖（Ｃｌｓｔｎ３）、小胞輸送（Ｒａｓｓｆ９、Ｃｌｓｔｎ３）及び細胞骨格組織化（Ｍｙｂｐｃ２、Ｔａｇａｐ、Ａｒｈｇａｐ４２）に関与する遺伝子も同定したが、これらは、治療用タンパク質産生に影響することが以前に提案された細胞機能である（表２、図１ｄ、Ｂａｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。興味深いことに、これらの候補遺伝子の殆どが、親ＣＨＯ細胞におけるそれらの発現と比較した場合、別の発現容易な抗体、ベバシズマブ及び発現困難なインターフェロンベータタンパク質を高レベルで産生するＣＨＯ細胞クローンにおいても上方制御された（データは示さない）。これは、候補遺伝子上方制御が高トラスツズマブ抗体生産性を示す細胞にのみ関連するのではないことを示し、従って、このような候補遺伝子が様々な発現容易及び発現困難治療用タンパク質の高レベル産生に関与し得ることを示唆した。

【0098】

ＥＴＥ及びＤＴＥ ＣＨＯ細胞株の産生に対する、ＰＰＡＲ、ＡＣＴＣ１のポジティブ効果及び様々な起源の他のＭＩＰ候補のポジティブ効果の概説を、図４～１０で例示する。

【0099】

図１及び表２は次のことを示す：
・トラスツズマブ高生産性と関連する遺伝子は、タンパク質フォールディング、細胞生存、小胞輸送及び細胞骨格リモデリングに関与する遺伝子を含む。
・パイオニア転写因子であるＦｏｘａ１は、トラスツズマブ高産生クローンにおいて上方制御され、治療用タンパク質産生に好都合である転写応答を活性化し得る。
・Ｂ５選択は、脂質代謝遺伝子における変化を誘導した。
・ＰＰＡＲ転写因子は、いくつかのＢ５標的脂質遺伝子の調節因子であると思われる。
・アクチン産生を通じた細胞骨格調節及び形態は、細胞適応度及び組み換えタンパク質産生に寄与し得る。

【0100】

コメント図１及び表１：
トランスクリプトーム分析を、トラスツズマブ高生産性と関連する遺伝子を同定するために行った。この分析において、ＣＨＯ－Ｍ ＷＴ細胞と比較してトラスツズマブ高産生クローンで上方制御された遺伝子を選択し、トラスツズマブ産生についてポリクローナルである細胞と比較した（図１Ｃ）。高生産性に関連する３２個の遺伝子を同定した（候補遺伝子、表１）。重要なことに、これらの遺伝子の発現はトラスツズマブ高生産性の原因又は結果であり得る。さらなる焦点を、それらの機能に基づいて治療用タンパク質生産性を改善し得る可能性のある候補遺伝子に当てた（図１Ｄ）。

【0101】

トラスツズマブ（ＥＴＥ）及びインフリキシマブ（ＤＴＥ）産生に対するこれらの異なるＭＩＰ Ｅｒｐ２７、Ｅｒｐ５７、Ｃａ３、ＣＤＫ１５、Ｒａｓｓｆ９、Ｃｌｓｔｎ３、Ｔａｇａｐ及びＦｏｘａ１）の影響の概要を、図２及び３で提供する。

【0102】

治療用タンパク質高産生クローンで見出されたＭＩＰ候補
候補遺伝子の過剰発現はトラスツズマブ産生を上昇させる（図２）：
図２Ａ～図２Ｅは、発現容易な（ＥＴＥ）抗体であるトラスツズマブ産生に対する候補ＭＩＰの影響を示す。この目的のために、速い細胞分裂を維持する２つのトラスツズマブ中産生クローンを、トランスクリプトーム分析のために使用したトラスツズマブポリクローナル集団から単離した。これらのクローンに、ＭＩＰ発現のためにプラスミドを安定に遺伝子移入した（Ｔａｇａｐ、Ｒａｓｓｆ９、Ｅｒｐ２７、Ｅｒｐ５７、Ｅｒｐ２７＋Ｅｒｐ５７、Ｃｌｓｔｎ３、ＣＤＫ１５、Ｃａ３及びＦｏｘａ１）。トラスツズマブ産生を、流加培養の様々な時間でこれらの安定集団において評価した。ＳＲＰ１４の過剰発現を陽性対照として使用し、ＧＦＰを発現するか又は空のベクターを遺伝子移入した細胞を陰性対照として使用した。Ｒａｓｓｆ９、Ｆｏｘａ１及びＣａ３の過剰発現はトラスツズマブ産生を上昇させた一方で、Ｅｒｐ５７、Ｃｌｓｔｎ３及びＣＤＫ１５過剰発現及びＥｒｐ２７及びＥｒｐ５７同時過剰発現はトラスツズマブ産生に影響しなかった。Ｔａｇａｐ過剰発現は、トラスツズマブ産生に対する可変であるが時にポジティブな効果を有した。強く過剰発現される場合、Ｅｒｐ２７はトラスツズマブ産生を低下させ、僅かに過剰発現される場合、それはトラスツズマブ産生を増加させた。データベースによれば、Ｃａ３及びＲａｓｓｆ９はＦｏｘａ１転写標的である。Ｃａ３及びＲａｓｓｆ９の過剰発現は実際に、Ｆｏｘａ１過剰発現細胞において見出された。これらの結果は、Ｆｏｘａ１過剰発現がトラスツズマブ産生を改善する遺伝子の転写を誘導することを強く示唆する。

【0103】

まとめると、以下のことが分かった：
・Ｒａｓｓｆ９、Ｃａ３及びＦｏｘａ１過剰発現は、トラスツズマブ産生を向上させる。
・強く過剰発現される場合、Ｅｒｐ２７はトラスツズマブ産生を低下させ、一方で僅かに過剰発現される場合、これはトラスツズマブ産生を上昇させる。
・Ｅｒｐ５７、Ｃｌｓｔｎ３及びＣＤＫ１５の過剰発現及びＥｒｐ２７及びＥｒｐ５７の同時過剰発現は、トラスツズマブ産生に影響しない。
・Ｆｏｘａ１転写応答はトラスツズマブ産生に対して好都合な環境を生じさせ得る。

【0104】

特異的な候補ＭＩＰの過剰発現は、発現困難な（ＤＴＥ）抗体である、インフリキシマブ産生を増加させる（図３）：
図３Ａ及び図３Ｂは、発現困難な（ＤＴＥ）抗体、インフリキシマブ産生に対する候補ＭＩＰの影響を示す。インフリキシマブ産生クローンに、ＭＩＰ発現のためにプラスミドを安定に遺伝子移入した。インフリキシマブの産生を、流加培養の異なる時間でこれらの安定集団において評価した。空ベクターを遺伝子移入した細胞を陰性対照として使用した。Ｅｒｐ２７又はＥｒｐ５７の発現はインフリキシマブ産生を増加させなかった一方で、Ｅｒｐ２７及びＥｒｐ５７の同時発現又はＴａｇａｐの発現は、インフリキシマブ産生を増加させた。生存細胞密度は、流加培養第９日及び第１１日でＴａｇａｐ及びＥｒｐ２７＋Ｅｒｐ５７を過剰発現する細胞についてより高かった。

【0105】

まとめると、Ｔａｇａｐの過剰発現及びＥｒｐ２７及びＥｒｐ５７の同時過剰発現は流加培養第６日及び第９日に生存細胞密度を上昇させ、インフリキシマブ産生を向上させることが分かった。

【0106】

Ｅｒｐ２７は、非フォールディングタンパク質に結合する、小胞体に存在するタンパク質である（Ｋｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）として最初に注解されたにもかかわらず、Ｅｒｐ２７は酸化還元活性が全くない。特に、Ｅｒｐ２７は、ＰＤＩの非触媒性ｂ及びｂ’ドメインを含有するが、これは、ジチオール－ジスルフィド交換を触媒するのに必要とされるＣＸＸＣ活性部位を欠く（Ａｌａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。それはしかし、ＰＤＩ Ｅｒｐ５７と相互作用することが知られており、これがジスルフィド結合形成を惹起する（Ａｌａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。Ｅｒｐ５７の発現上昇は特に、ＣＨＯ細胞においてトロンボポエチン生産性を上昇させることが見出された（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。

【0107】

単独で又はＥｒｐ５７とのＥｒｐ２７過剰発現は治療用タンパク質産生を改善する。
Ｅｒｐ２７がインビトロ及びインビボでジスルフィドイソメラーゼＥｒｐ５７に結合することが示されたので（Ａｌａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）、Ｅｒｐ２７－Ｅｒｐ５７複合体が治療用タンパク質フォールディングに関与し、産生の利点をもたらすという仮説が立てられた。

【0108】

この仮説を、トラスツズマブ分泌レベルに対するＥｒｐ２７及びＥｒｐ５７過剰発現の影響を評価することにより評価した。この目的のために、クローンを、トランスクリプトーム分析のために以前使用されたトラスツズマブポリクローナル集団から単離し、流加培養で速い細胞分裂速度を維持しながら高生産性（ポリクローナル集団の場合の１．８倍）を示すクローンを選択した。特に、このクローンのＥｒｐ２７ ｍＲＮＡレベルは、流加培養第０日又は第８日に親ＣＨＯ細胞と比較した場合、３～６倍上方制御されることが分かった（図１１ａ）。その一方、Ｅｒｐ５７ ｍＲＮＡレベルは、第０日でＣＨＯ親細胞及びＴｒａｓ産生クローンと同様であり、一方でクローンにおいて僅かな１．２倍の上方制御が、第８日に観察された。このクローンにＥｒｐ２７及び／又はＥｒｐ５７発現ベクター又は対照としてＧＦＰ発現ベクターを安定に遺伝子移入し、選択したＴｒａｓのレベルを、ポリクローナル集団の流加培養法中に評価した。

【0109】

Ｅｒｐ２７同時発現あり又はなしでのＥｒｐ５７過剰発現時に、生存細胞密度は流加培養法第６日に上昇し、一方で細胞生存能は第１０日に低下した（図１７ａ、ｂ）。全体的に、Ｅｒｐ５７過剰発現細胞のＴｒａｓタイターレベルは、対照細胞と同様であった（図１１ｂ）。その一方、流加培養中の増殖及び細胞生存能は、Ｅｒｐ２７過剰発現により影響されなかった（図１７ａ、ｂ）。しかし、Ｅｒｐ２７過剰発現は、Ｔｒａｓレベルの低下をもたらし、これはまたＥｒｐ５７同時発現時にも認められた（図１１ｂ）。Ｅｒｐ２７過剰発現はＴｒａｓ産生クローンと比較した場合Ｅｒｐ２７ ｍＲＮＡレベルの非常に大きな増加をもたらしたことが見出され（図１７ｃ～ｄ）、このような過剰発現レベルがこれらのタンパク質活性の代謝的な不均衡をもたらし、従ってＴｒａｓ発現をむしろ減少させることを示唆する。安定に遺伝子移入された細胞におけるＥｒｐ２７発現ベクターの量は、したがって漸減された。実際に、Ｔｒａｓレベルの１４％の上昇がＥｒｐ２７の過剰発現低下時に観察された（図１１ｃ及び図１７ｅ）。全体的に、この結果は、Ｅｒｐ２７の過剰発現を調整することがＴｒａｓ産生を増加させたことを示した。

【0110】

トランスクリプトーム分析は、Ｅｒｐ２７ｍＲＮＡ発現が高レベルで発現困難なインターフェロンベータを発現するクローンにおいても増加されたことが示したので（データは示さない）、発現困難な治療用タンパク質の産生に対するＥｒｐ２７及びＥｒｐ５７過剰発現の影響が何であるかをさらに評価した。インフリキシマブキメラ免疫グロブリン（Ｉｎｆｌｉ）及びエタネルセプトＦｃ－融合を、発現困難な治療用タンパク質の２つのさらなる例として使用した。Ｔｒａｓについて得られた結果と対照的に、ＩｎｆｌｉタイターはＥｒｐ２７過剰発現時に影響を受けず、むしろインフリキシマブ発現クローンでのＥｒｐ５７過剰発現時に低下した（図１１ｄ及び１７ｆ、ｇ）。しかし、Ｅｒｐ２７及びＥｒｐ５７の同時過剰発現は、それぞれ流加培養第９日及び第１１日に、ＧＦＰ発現対照細胞と比較して、インフリキシマブタイターの６１％及び７２％の上昇をもたらした（図２ｄ）。さらに、Ｅｒｐ２７及びＥｒｐ５７同時過剰発現は、流加培養第９日に生存細胞密度及び細胞生存能の上昇をもたらした（図１１ｅ及び１７ｈ）。

【0111】

エタネルセプト産生クローンにおけるＥｒｐ２７及びＥｒｐ５７同時過剰発現の効果も評価した。Ｅｒｐ２７及びＥｒｐ５７を同時発現する単一サブクローンを単離し、それらの生産を、ＣｌｏｎｅＰｉｘ（登録商標）細胞コロニーイメージング装置を使用して評価した。最も幅広いエタネルセプト分泌ハロを示す細胞コロニーを、Ｅｒｐ２７及びＥｒｐ５７過剰発現又は対照細胞集団から単離し、派生した細胞クローンを流加培養においてエタネルセプト産生について評価した。生存細胞密度及び細胞生存能はＥｒｐ２７及びＥｒｐ５７過剰発現時に促進され、生存細胞の平らな相が延長し、タイターが３７％上昇した（図１１ｆ～ｈ）。まとめると、これらの結果は、Ｅｒｐ２７の中程度の過剰発現が発現容易治療用タンパク質の産生を増加させること、及びＥｒｐ２７及びＥｒｐ５７の合わせた過剰発現が生存細胞密度、細胞生存能及び異なる発現困難な治療用タンパク質を産生する細胞のタイターを促進し得ることを裏付ける。

【0112】

Ｆｏｘａ１過剰発現は、トラスツズマブ産生を増加させ、酸化ストレスを低下させる。
驚くべきことに、トラスツズマブ高産生に関連する３２個の遺伝子の中で、Ｆｏｘａ１と呼ばれるパイオニア転写因子があることが分かった。Ｆｏｘａ１は、治療用タンパク質産生に好ましい転写応答を活性化し得る。Ｆｏｘａ１は抑制的なヘテロクロマチン構造に結合し得、ここでそれは他の転写因子と独立して遺伝子発現を動けるようにし得る（概説として、Ｚａｒｅｔ ＆ Ｃａｒｒｏｌｌ，２０１１を参照）。それは、肝臓、膵臓、肺及び前立腺などの異なる器官の発生に関与する（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ＆ Ｋａｅｓｔｎｅｒ，２００６）。従って、発明者らは、Ｆｏｘａ１がＴｒａｓなどの治療用タンパク質の産生に好都合な転写プログラムを活性化し得るという仮説を立てた。

【0113】

一致して、Ｆｏｘａ１ ｍＲＮＡ発現は、流加培養法の第０日及び第８日に親ＣＦＩＯ細胞と比較して、Ｔｒａｓクローンにおいて上昇し、それぞれ１．５及び２．１倍の上方制御があった（図１８ａ）。３倍の上方制御が、トランスクリプトーム分析において親ＣＦＩＯ細胞対照と比較してＴｒａｓ高産生クローンで観察され、従って、Ｆｏｘａ１発現がさらに上昇され得ることを示唆する（表２参照）。従ってＴｒａｓ産生クローンにＦｏｘａ１発現ベクターを安定に遺伝子移入した。強いＣＭＶ／ＥＦ１アルファプロモーター制御下でのＦｏｘａ１の安定な発現は、抗生物質介在選択中の細胞死の上昇をもたらした（データは示さない）。しかし、最小ＣＭＶプロモーターによるこの強いプロモーターの置換は、この不要な効果を抑止し、Ｆｏｘａ１過剰発現時に最終Ｔｒａｓタイターを５７％上昇させ（図１２ａ）、一方でＦｏｘａ１ ｍＲＮＡは、流加培養第０日及び第８日にそれぞれ４０倍及び１４倍上方制御された（図１２ｄ、ｅ）。流加培養における細胞増殖は、Ｆｏｘａ１過剰発現を対照細胞と比較した場合に、第６日まで同様であった一方で、Ｆｏｘａ１過剰発現細胞は、第９日まで分裂し続け、平均３１００万個／ｍＬの生存細胞密度に到達し、一方で対照細胞は第８日に細胞１９００万個／ｍＬでピークに達した（図１２ｂ）。さらに、Ｆｏｘａ１過剰発現細胞の生存能は、第９日まで９０％を上回ったままであり、一方で対照細胞生存能は第７日から低下し、第９日には７５％を下回った（図１２ｃ）。

【0114】

Ｃａ３、Ｒａｓｓｆ９及びＴａｇａｐは、Ｔｒａｓ産生クローンにおいてＦｏｘａ１過剰発現時に上方制御される。
いくつかの研究は、流加培養法において細胞生存を延長させることにより生産性が改善され得ることを明らかにした（概説についてはＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１２を参照）。同定された３２個の遺伝子の中で、Ｃａ３及びＣＤＫ１５（図２ｂ参照）は細胞生存を促進する。Ｃａ３は、酸化ストレスから細胞を保護することにおいて作用し（Ｄｉ Ｆｉｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、一方でＣＤＫ１５は、アポトーシスから細胞を保護する（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。これらのタンパク質の過剰発現は従って、流加培養において細胞の寿命を延長させ得、従って生産性を改善する。

【0115】

治療用タンパク質分泌におそらく関与し得る輸送小胞において見出された２つのタンパク質、Ｒａｓｓｆ９及びＣｌｓｔｎ３にさらなる焦点を当てた（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｒｉｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

【0116】

Ｔａｇａｐは、胸腺細胞の接着喪失及び胸腺細胞及びＴ細胞の細胞骨格再組織化に関与するシグナル伝達タンパク質である（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｄｕｋｅ－Ｃｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。同様に、アクチンに対して、Ｔａｇａｐ過剰発現は、浮遊に対する細胞適応を改善し得、細胞骨格再組織化を惹起し得、従って分泌を改善する。特に、ＴａｇａｐはＢ５選択細胞においても過剰発現された。

【0117】

Ｆｏｘａ１がパイオニア転写因子であるという事実は、それがトラスツズマブ重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）導入遺伝子の転写を直接上昇させ得ることを示唆した。しかし、トラスツズマブＨＣ及びＬＣ ｍＲＮＡレベルで顕著な変化はＦｏｘａ１過剰発現時に観察されなかった（図１８ｂ）。Ｆｏｘａ１が介在するトラスツズマブタイターの上昇が、Ｔｒａｓ高産生クローンにおいてまた上方制御されるＣＨＯ細胞遺伝子の転写活性化の結果によるものであることを確認すること（表２）。Ｈａｒｍｏｎｉｚｏｍｅ（登録商標）ウェブポータルを、可能性のあるＦｏｘａ１標的遺伝子を同定するために使用した（Ｒｏｕｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。従って、Ｔｒａｓ高産生クローンで上方制御されると同定された２５個のタンパク質コード遺伝子のうち１１個は、Ｆｏｘａ１遺伝子そのものを含み、Ｆｏｘａ１標的遺伝子であることが予想された（表２）。従って発明者らは、これらの遺伝子がトラスツズマブ産生クローンにおいてＦｏｘａ１過剰発現時に上方制御されたか否かを試験し、Ｃａ３及びＲａｓｓｆ９が流加培養第８日にＦｏｘａ１過剰発現時に高度に上方制御され、一方で他のＦｏｘａ１の可能性のある標的遺伝子の発現は顕著に変化しなかったことを明らかにした。（図１２）。さらに、Ｅｒｐ２７はＦｏｘａ１過剰発現細胞において上方制御されなかった一方で、Ｔａｇａｐ候補遺伝子の上方制御が観察され、これはまた非常に高レベルで治療用タンパク質を産生するビタミンＢ５選択細胞において上方制御されることも分かった。特に、流加培養第０日にＦｏｘａ１過剰発現細胞においてＲａｓｓｆ９、Ｃａ３及びＴａｇａｐ ｍＲＮＡ上方制御もあり、それらの上方制御がＦｏｘａ１過剰発現細胞において第８日に観察される高細胞増殖の結果ではなかったことを示唆する（図１２ｅ）。Ｃａ３は酸化ストレスから細胞を保護することが示されているので（Ｄｉ Ｆｉｏｒｅ，Ｍｏｎｔｉ，Ｓｃａｌｏｎｉ，Ｄｅ Ｓｉｍｏｎｅ，＆ Ｍｏｎｔｉ，２０１８で概説）、細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを、反応性蛍光色素カルボキシ－Ｈ_２ＤＣＦＤＡを使用して評価した。興味深いことに、第３日に、Ｆｏｘａ１過剰発現細胞においてＲＯＳレベルの僅かな上昇があった一方で、ＲＯＳレベルは第６、８及び９日にＦｏｘａ１過剰発現細胞で低下した（図１２ｆ）。

【0118】

Ｃａ３及びＴａｇａｐ過剰発現はトラスツズマブ産生を上昇させる。
Ｆｏｘａ１過剰発現に起因するＴｒａｓタイター上昇がＣａ３、Ｒａｓｓｆ９及び／又はＴａｇａｐ上方制御の結果であるか否かを試験するために、３つの候補遺伝子をＴｒａｓ産生クローンにおいて安定に過剰発現させ、流加培養から得られたＴｒａｓタイターを評価した。一致して、より高いＴｒａｓタイターがＴｒａｓ産生クローンにおいてＴａｇａｐ過剰発現時に得られ、一方でＣａ３又はＲａｓｓｆ９の過剰発現からは影響が検出されなかった（図１３ａ）。生存細胞密度の上昇が、Ｔａｇａｐ過剰発現時、培養第６及び第８日に観察され、最大生存細胞密度は第８日に細胞３１００万個／ｍＬであった（図１３ｂ）。しかし、細胞生存能は、第９日から始まって強く低下した（図１３ｃ）。Ｔａｇａｐ過剰発現時のＴｒａｓ産生の増加は、流加培養法延長時の細胞生存能低下がＴａｇａｐ過剰発現から観察されたにもかかわらず、Ｆｏｘａ１過剰発現時に得られたレベルと同様であり、タイターは１３３１μｇ／ｍＬであった（図１２ａ～ｃ及び１３ａ～ｃ）。Ｔｒａｓ ＨＣ及びＬＣの僅かな発現上昇（それぞれ１．６及び１．３）も、Ｔａｇａｐ過剰発現時に観察された（図１９ａ）。

【0119】

興味深いことに、Ｃａ３発現の１０倍の上昇もＴａｇａｐ過剰発現時に観察された（図１３ｄ）。Ｃａ３過剰発現単独の影響の欠如が好ましくない発現レベルに起因するものであり得るか否かを評価するために（図１３ａ～ｃ）、安定な細胞株を確立するために使用した発現ベクター量を滴定した。トラスツズマブタイターの僅かな上昇が、より高いＣａ３過剰発現レベル時に得られたが、一方で生存細胞密度及び生存能は影響されなかった（図１３ｅ及び図１９ｂ及びデータは示さない）。結論として、Ｔａｇａｐ過剰発現はＦｏｘａ１介在性のトラスツズマブタイター上昇を繰り返し、一時的に生存細胞密度を向上させ得る一方で、それは流加培養の終了時に細胞生存能をむしろ低下させた。従って、全体的に、培養中の細胞生存能及び細胞増殖に対する及びタンパク質タイターに対するＦｏｘａ１のポジティブ効果は、いくつかの標的遺伝子の発現に対するその影響に起因し得ると結論づけられた。

【0120】

Ｆｏｘａ１は発現困難な治療用タンパク質の産生も改善する。
発現困難なインフリキシマブの分泌に対するＦｏｘａ１過剰発現の影響をさらに評価した。印象的なことに、インフリキシマブ産生はＦｏｘａ１過剰発現時に２倍近くになり、Ｆｏｘａ１ ｍＲＮＡレベルが８．２倍上昇したときに、３７８μｇ／ｍＬの平均タイターが観察された（図１４ａ、ｅ）。特に、Ｆｏｘａ１過剰発現細胞は、第６日から始まる第９日までの生存細胞密度の顕著な上昇を示し、第７日に細胞１２２０万個／ｍＬの最大生存細胞密度に到達し、一方で対照細胞は、細胞８６０万個／ｍＬの生存細胞密度にしか達しなかった（図１４ｂ）。一致して、発明者らは、細胞生存能はＦｏｘａ１発現細胞において顕著に高いままであり、対照細胞で第７日から観察される細胞生存能の破壊を防いだことを認めた（図１４ｃ）。これにはＦｏｘａ１過剰発現細胞における第７及び８日でのＲＯＳ蓄積の低下が付随した（図１４ｄ）。Ｔｒａｓ産生クローンでのＦｏｘａ１過剰発現時に観察されたものと同様に、Ｃａ３、Ｒａｓｓｆ９及びＴａｇａｐ ｍＲＮＡレベルもＦｏｘａ１過剰発現時に上方制御された（図１４ｅ）。一致して、発明者らは、Ｔａｇａｐ過剰発現時にインフリキシマブ産生の４５％上昇を得、２８３μｇ／ｍＬの平均タイターをもたらした（図１５ａ）。従ってＴａｇａｐ過剰発現がＦｏｘａ１介在性のＴｒａｓタイター上昇を繰り返し得る一方で、それはＦｏｘａ１誘導性インフリキシマブタイター上昇を部分的にしか模倣しなかった。Ｔｒａｓ産生クローンについて観察されるように、Ｔａｇａｐ過剰発現は、インフリキシマブクローンに対する生存細胞密度の急激な上昇をもたらし、最大生存細胞密度は第６日で細胞１２００万個／ｍＬであった（図１５ｂ）。しかし、Ｆｏｘａ１過剰発現細胞とは対照的に、細胞生存能はＴａｇａｐ過剰発現時に殆ど不変のままであった（図１５ｃ）。特に、インフリキシマブ産生クローンにおけるＴａｇａｐ過剰発現は、Ｃａ３ ｍＲＮＡレベルの上方制御ももたらした（図１５ｄ）。まとめると、これらの結果は、Ｆｏｘａ１過剰発現がＣＨＯ細胞での発現困難並びに発現容易治療用タンパク質の産生レベルを上昇させるために使用され得ること、及びこの効果が一部にはＦｏｘａ１介在性のＴａｇａｐ発現レベル上昇に起因し得ることを示した。

【0121】

Ｂ５選択で見出されたＭＩＰ候補（ＰＰＡＲ）
図５Ａ及び図５Ｂは、ＰＰＲＥレポーター配列あり又はなしでのＡＢとＢ５選択細胞の間で観察されたＤｓＲｅｄ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．Ｒｅｄ）活性の顕著な上昇を示し、ＤｓＲｅｄ発現がＰＰＡＲ活性化から独立して誘導されることを示す。この誘導は、ＡＢ選択細胞を超えるＢ５の全体的な適応性向上により説明され得る。

【0122】

しかし、ｍＰＰＡＲαを外部から添加した場合、ＤｓＲｅｄ活性は、ＰＰＲＥレポーターの制御下にあるときのみＢ５選択細胞において顕著により高くなった。この結果は、Ｂ５選択が、細胞により飢餓ストレスとして感知され得るおそらくＢ５選択中に、未知のＰＰＡＲアゴニストを構成的に産生する安定な細胞を生じたことを示す。従って、外因性ＰＰＡＲαは、ＡＢ選択細胞と比較した場合、Ｂ５選択細胞でより大きく活性化された。

【0123】

要約：
・未同定ＰＰＡＲアゴニストが、Ｂ５飢餓選択中に蓄積した。
・Ｂ５選択細胞でのより良好な適応度は、抗生物質選択細胞と比較して、全体的に良好な遺伝子発現をもたらす。
・外因性ＰＰＡＲαの活性化は、Ｂ５選択細胞においてより高く、抗生物質選択細胞と比較してより高いＰＰＡＲ標的遺伝子発現をもたらす。

【0124】

図６Ａ及び図６Ｂは、ベザフィブラート（２－［４－［２－（４－クロロベンズアミド）エチル］フェノキシ］－２－メチルプロパン酸）の活性を示す。ベザフィブラートは、一般的なＰＰＡＲ汎アゴニストであることが報告されている（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００２）。

【0125】

それは既に、抗高脂血症薬として臨床で使用されている。３日間の流加培養後のＥＴＥへのベザフィブラート添加は、ＲＮＡ－Ｓｅｑスクリーニングで見出されたＰＰＡＲ標的遺伝子ＨｍｇＣｓ２及びＡｃｏｔ１並びに既知のＰＰＡＲ標的ＤＢＩ１、Ａｓｃｌ１（Ｒａｋｈｓｈａｎｄｅｈｒｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）及びＲＸＲ核内受容体を誘導する（図６Ａ）。Ｃｙｐ４ａ１４は、ベザフィブラート添加時に誘導されず、これは、他のアゴニスト又はＰＰＡＲを通じた他の調節がこの遺伝子の発現を制御している可能性があることを意味し得る。興味深いことに、Ｂ５標的Ｓｌｃ２２ａ１４は、ベザフィブラートに応答して活性化された。Ｓｌｃ２２ａ１４遺伝子は、マウス雄妊孕性に関与していることが示されている（Ｍａｒｕｙａｍａ，２０１６）が、ＰＰＡＲ応答と関連する機能は記載されていない。

【0126】

流加培養第３日でのベザフィブラートの添加は、流加培養過程中に飢餓ストレスに供する場合、細胞生存を顕著に改善したが（データは示さない）、ＩｇＧ産生の改善は、通常の流加培養の栄養条件において観察されなかった（流加培養についてはＭ＆Ｍ参照）。流加培養の第３日は細胞分裂の指数関数期に相当する。流加培養過程中のより早期（第１日）のベザフィブラートの添加は、流加培養終了時の組み換えタンパク質について有益であることが示された（図６Ｂ）。

【0127】

ＤＴＥ細胞でもベザフィブラートを試験した。しかし、同じ標的遺伝子が誘導されるにもかかわらず、細胞産生及び適応性は改善されなかった。従って、ベザフィブラートを通じたＰＰＡＲ活性化及び標的遺伝子誘導は、発現困難なタンパク質を合成する細胞のボトルネックを克服するには十分ではないと思われる。

【0128】

ベザフィブラートは、全てのＰＰＡＲ活性化に対し強く幅広い効果を有するため、高濃度で細胞分裂及び代謝を変化させ得るので、ＥＴＥ及びＤＴＥ細胞の両方でベザフィブラートを増量することは、細胞の分裂、生存能の両方及び組み換えタンパク質産生に対し何ら有益な効果を示さない（データは示さない）。

【0129】

まとめると次のことが分かった（図６参照）：
・Ｂ５選択により同定されたＰＰＡＲ標的は、ＣＨＯ細胞において化学的に誘導され得る。
・Ｂ５標的として強調されるＳｌｃ２２ａ１４輸送体は、新しいＰＰＡＲ標的であることが示される。
・この誘導は、ＥＴＥ細胞におけるより良好なＩｇＧ産生をもたらす。
・ＤＴＥタンパク質を発現する組み換え細胞は、ベザフィブラート誘導により影響されない。

【0130】

完全非ストレス培地中で増殖させる場合、ＰＰＡＲα過剰発現（例えばＰＰＡＲα＿ＯＥ）は、野生型及び空ベクター細胞と比較して、ＰＰＡＲ標的遺伝子発現及びＩｇＧ産生における差異を何ら示さなかった。しかし、ベザフィブラートを添加した場合、ＰＰＡＲα＿ＯＥ中に存在する外因性ＰＰＡＲαが活性化され、続いてＰＰＡＲ－標的遺伝子並びにＲＸＲ核因子及びＩｇＧ軽及び重鎖の転写を誘導した（図７Ａ）。この増加は、ＰＰＡＲα＿ＯＥ細胞のより高いＩｇＧ生産性をもたらした（図７Ｂ）。

【0131】

まとめると次のことが分かった（図７Ａ及びＢ）：
・外因性ＰＰＡＲの活性化は、改善された細胞適応性を有するＤＴＥ細胞を生成させ得、これはＤＴＥ治療用タンパク質産生向上をもたらす。

【0132】

まとめると次のことが分かった（図８Ａ～Ｄ）：
・乳酸は、Ｂ５選択細胞において減少する。
・ＰＰＡＲ過剰発現は、ＣＨＯ細胞において乳酸含量低下をもたらす。

【0133】

Ｂ５選択で見出されたＭＩＰ候補（アクチン）
図９は既に、アクチン遺伝子の過剰発現は、改善された治療用タンパク質産生を有するＥＴＥ細胞を生成したことを示す。Ｆｃ融合発現クローンに転位性ＡＣＴＣ１発現ベクターを再遺伝子移入した。得られた細胞プールの比生産性を次に、３又は４日ごとのバッチ条件でのそれらの継代培養を通じて評価した。結果を、Ｆｃ－融合－対照細胞ＰＣＤ値に対するＰＣＤの倍率変化として表した。この結果は、浮遊ＣＨＯ細胞におけるアクチン過剰発現は、細胞骨格組織化及び重合化を調整することにより治療用タンパク質産生及び分泌を改善し得ることを示唆する。

【0134】

さらなる実験において、ＣＨＯ細胞に、ビタミンＢ５輸送体ＳＬＣ５Ａ６と一緒に又は対照としての抗生物質耐性遺伝子と一緒に、「発現容易な」（ＥＴＥ）トラスツズマブ又は「発現困難な」（ＤＴＥ）インフリキシマブ又はエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））治療用タンパク質をコードする発現ベクターを同時細胞移入した。細胞を次に、それぞれ、Ｂ５欠乏培地中で生存するためのそれらの適性について又は抗生物質耐性について選択し、異なって発現される細胞性遺伝子を、ＲＮＡシーケンシングにより同定した。抗生物質選択後、ＡＣＴＣ１及びＴＡＧＡＰの両方の発現は非遺伝子移入細胞よりも低かったが、その一方でそれらはＢ５選択後に上昇した（図２０ａ及び２０ｂ）。ＳＬＣ５Ａ６発現及びビタミンＢ５飢餓後のＴＡＧＡＰ発現の上昇を、抗生物質又はＢ５選択の何れかを使用して単離された４個の独立したトラスツズマブ発現ＣＨＯ細胞株を使用して検証した（図２０ｃ）。

【0135】

Ｂ５選択後の遺伝子誘導は、以前の試験で見られるように、選択過程中に起こるＢ５飢餓（Ｐｏｕｒｃｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１９）により、ＳＬＣ５Ａ６が細胞へのより高いビタミンＢ５取り込みを媒介するので（図２０ｄ）、ＳＬＣ５Ａ６そのものの過剰発現により、又は両効果の組み合わせにより引き起こされ得る。Ｂ５は、中枢代謝及びエネルギー代謝における重要な要因であるアセチルＣｏＡに対する必須の補因子であり、これは細胞骨格制御に関連し得る。これらの可能性を区別するために、ＳＬＣ５Ａ６輸送体を過剰発現する細胞株をＢ５欠乏なしで作製し、それは、ＳＬＣ５Ａ６発現上昇はＡＣＴＣ１遺伝子を顕著に上方制御するために十分であることを示し、一方でＴＡＧＡＰ発現の有意でない上昇を認めた（図２０ｅ）。従って、Ｂ５選択過程は、ＳＬＣ５Ａ６過剰発現が介在するＢ５細胞内移入増加によりＡＣＴＣ１遺伝子発現を活性化し得、一方でＴＡＧＡＰ発現の顕著な増加は、ＳＬＣ５Ａ６過剰発現及びＢ５飢餓の両方の組み合わせを必要とした。ＴＡＧＡＰ過剰発現がＡＣＴＣ１ ｍＲＮＡ及びタンパク質蓄積を増加させたことも観察され（図２１）、Ｂ５選択過程に起因するＡＣＴＣ１発現上昇は部分的にＴＡＧＡＰの上方制御によるものであり得ることを示唆する。

【0136】

組み換えタンパク質発現に対するＡＣＴＣ１過剰発現の効果を、いくつかのＤＴＥタンパク質、例えばエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））Ｆｃ－融合又はベバシズマブ又はインフリキシマブＩｇＧ１などを発現する抗生物質選択細胞クローンにおいて、並びにＥＴＥトラスツズマブ免疫グロブリンを発現するクローンにおいて評価した。これらの細胞クローンに、別の抗生物質選択遺伝子と一緒にＡＣＴＣ１コード配列を再遺伝子移入し、続いてＡＣＴＣ１を過剰発現する抗生物質耐性細胞の選択を行った（図２２ａ～ｃ）。得られた細胞プールの比生産性を次に、３～４日後、バッチ培養条件で評価し、ＣＨＯ細胞によるＤＴＥタンパク質の産生に対するＡＣＴＣ１高レベル発現のポジティブ効果を示唆した（図２３ａ～ｃ）。インフリキシマブ産生ＡＣＴＣ１過剰発現細胞プールにおけるさらなる分析は、１０日間の流加培養後にＩｇＧタイターの顕著な上昇を示した（図２３ｄ）。

【0137】

次にＡＣＴＣ１を過剰発現する個々のクローンを分析した。そうするために、トラスツズマブ産生クローンにＡＣＴＣ１又は空の発現ベクターを再遺伝子移入し、単一コロニーを、Ｃｌｏｎｅｐｉｘ（登録商標）装置を使用して拾った。空ベクターが遺伝子移入された８個のクローン及び２４個のＡＣＴＣ１発現クローンを、ＡＣＴＣ１転写物蓄積について検証し、その中で４個の対照クローン及び４個のＡＣＴＣ１高発現クローンを、さらなる分析のために無作為に拾った（図２４ａ）。ＡＣＴＣ１タンパク質過剰発現を、ウエスタンブロットにより検証した（図２５ａ及び２４ｂ）。この４個のＡＣＴＣ１過剰発現クローンの中で、３個は、空ベクタークローンと比較した場合、流加培養法１３日後に最大ＩｇＧタイターを示した（図２５ｂ及び２４ｃ）。

【0138】

ＡＣＴＣ１過剰発現により誘発される治療用タンパク質分泌上昇が、細胞代謝の変化によるものであり得るか否かを決定するために、発明者らは、一次代謝マーカーを、ＡＣＴＣ１過剰発現細胞プールの質量分析により測定した。特に、発明者らは、治療用タンパク質産生に対するボトルネックとしてよく明らかにされている、解糖の早期の段階の毒性副産物である乳酸の蓄積を評価した（Ｌａｏ＆Ｔｏｔｈ，１９９７）。これは、対照細胞と比較した場合、バッチ培養において３日後にＡＣＴＣ１過剰発現細胞による乳酸蓄積の強い減少を明らかにした（図２ｅ）。全体的に、発明者らは従って、ＡＣＴＣ１遺伝子過剰発現が様々な治療用タンパク質の分泌を顕著に改善した、かつこの効果は毒性乳酸代謝副産物の蓄積の減少に関連し得る、と結論付けた。

【0139】

組み換えタンパク質の分泌におけるアクチン重合化レベルの意義
発明者らは次に、アクチン重合化状態がＡＣＴＣ１過剰発現により影響を受け得るか否かを評価した。そうするために、発明者らはＳｉＲ－アクチン染色を利用したが、これはＦ－アクチンに特異的に結合し（Ｌｕｋｉｎａｖｉｃｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、アクチン重合化に比例する染色細胞の蛍光レベルを生じる。対照クローンに対する、ＡＣＴＣ１及びトラスツズマブ発現クローンのＳｉＲ－アクチン－染色の比較は、ＡＣＴＣ１過剰発現クローンでよりも対照クローンでのより高い蛍光を明らかにし、アクチン重合化レベルがＡＣＴＣ１過剰発現により顕著に低下されたことを示す（図２６ａ、ｂ及び２７）。

【0140】

アクチン重合化が組み換えタンパク質発現に影響し得るか否かをさらに評価するために、トラスツズマブタンパク質を発現するが、ＡＣＴＣ１ベクター遺伝子移入に供されなかった２つの独立したＣＨＯ細胞ポリクローナル集団をＳｉＲ－アクチンで染色した。染色した細胞を次に、それらの低、中又は高蛍光レベルに従い３つの独立した細胞バッチにおいて、選別して、各蛍光レベルについて６個の細胞プールを得た（図２８ａ及び２９）。重合化アクチンの低、中及び高レベルを示す細胞のＩｇＧ分泌レベル及びＩｇＧ比生産性を次に、評価した（図２８ｂ、ｃ）。高ＳｉＲ－アクチン染色細胞は、低ＳｉＲ－アクチンを示す細胞よりも顕著に低いＩｇＧ発現レベルを示し、従って、アクチン重合化レベルが低い細胞ほど、ＡＣＴＣ１過剰発現なしでも、より高い組み換えタンパク質分泌を媒介するという結論を支持する。

【0141】

異なる治療用タンパク質発現ＣＨＯクローンの分泌に対するＭＩＰの個々の又は組み合わせた発現の効果
コメント図１０：
ベバシズマブ発現クローン（図１０Ａ）、ｆｃ－融合発現クローン（図１０Ｂ）及びｆａｂ－酵素－融合発現クローン（図１０Ｃ）に、様々な個々の転位性ＣＦＬＡＲ－、ＧＣＬＭ－、ＡＣＴＣ１－発現ベクター又はそれらの組み合わせを再遺伝子移入した。得られた細胞プールの比生産性を次に、３～４日ごとの調整したバッチでのそれらの継代培養を通じて評価した。結果を、それらの個々のベバシズマブ又Ｆｃ融合対照細胞ＰＣＤ値の％として表した（ｐｇ－１．細胞－１．日－１）。

【0142】

要約図１０：
・ＣＨＯ細胞による治療用タンパク質の分泌は、ＣＦＬＡＲ、ＧＣＬＭ、ＡＣＴＣ１発現ベクターなどのＭＩＰを発現するベクターの遺伝子移入後に増加した。

【表1】

【表2】

¹親CHO細胞と比較して、及びTrasポリクローナル細胞と比較して、Tras高産生細胞クローンで上方制御される遺伝子を、次の基準に従い選択した:log2倍率変化>0.5及びp値<0.05。

²Harmonizomeウェブポータル(Rouillard et al.,2016)を使用して得られた、ChIP-seqデータセット(ENCODE Transcription Factor Targetsデータセット)及び低又は高スループット転写因子機能試験(TRANSFAC Curated Transcription Factor Targets Dataset)に従いFoxa1標的遺伝子として列挙される遺伝子。

【表3】

【表4】

【0143】

材料及び方法
ＭＩＰ候補選択及び探索
候補遺伝子配列及びＤＮＡベクターコンストラクト
ＲＮＡｓｅｑ ＭＩＰ候補のゲノム及びｃＤＮＡ配列を、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェアを使用して、マウスにおける相同遺伝子のアライメント後に決定した。転写物配列及び対応する遺伝子の蓄積を、ＳＥＬＥＸＩＳ ＣＨＯ－Ｍ遺伝子発現データベースを使用して決定した。

【0144】

ＣＨＯ－Ｍ（ＳＵＲＥ ＣＨＯ－Ｍ細胞株（商標）（ＳＥＬＥＸＩＳ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＵＳＡ））、ｃＤＮＡライブラリを、ＧｏＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、１０^６個のＣＨＯ－Ｍ細胞から単離される１μｇトータルＲＮＡからの逆転写（Ｎｕｃｌｅｏ－Ｓｐｉｎ（商標）ＲＮＡキット；Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）により増幅した。

【0145】

ＭＩＰコード配列（ＣＤＳ）を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を切り出しそれをＭＩＰ ＣＤＳで置き換えることにより、ｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿ＢＴ＋＿ＥＧＦＰ＿Ｘ２９＿ＩＴＲベクター（ＳＥＬＥＸＩＳ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＵＳＡ）にクローニングした。

【0146】

ベクターを次のように構築した：ＣＤＳを、制限部位を有するプライマーを使用してＡＴＧから終止までＰＣＲ（ＰＨＵＳＩＯＮ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ，ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）によりＣＨＯ－Ｍ ｃＤＮＡライブラリから増幅した。次に、ｃＤＮＡ産物及びｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿ＢＴ＋＿ＥＧＦＰ＿Ｘ２９＿ＩＴＲベクターを、対応する制限酵素により二重消化した。最後に、ｃＤＮＡを、同じ制限酵素での消化後にＧＦＰ配列が切り出されたｐＢＳＫ＿ＪＴＲ＿ＢＴベクターにライゲーションした。

【0147】

ｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿ＢＴ＋＿ＥＧＦＰ＿Ｘ２９＿ＩＴＲベクターは、ＣＭＶ／ＥＦ１アルファプロモーター及びＢＧＨポリアデニル化シグナル、それに続くｈＭＡＲ Ｘ－２９から構成される発現カセットを含む。発現カセットには、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの逆末端配列が隣接する。

【0148】

ＧＦＰタンパク質を、コード配列上流のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー及びヒトグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、それに続くサルウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナル、ヒトガストリンターミネーター及びＳＶ４０エンハンサーから構成される真核発現カセットを使用して発現した（Ｌｅ Ｆｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ｐＳＧ５＿ＰＰＡＲαベクターを、Ｉｓｓｅｍａｎｎ及びＧｒｅｅｎ，１９９０から得た。

【0149】

ブラスチシジンベクター（ｐＢｌａｓｔ）は、ｐＲｃ／ＲＳＶプラスミドに由来するＳＶ４０プロモーター制御下でブラスチシジン耐性遺伝子を含有する（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ／ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）。

【0150】

ＲＮＡＳｅｑ分析
ＲＮＡＳｅｑ分析のために使用した細胞は次のとおりである：
－ＣＨＯ－Ｍ ＷＴ細胞
－ピューロマイシン及びＢ５で又はピューロマイシン単独で選択される、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ）Ｆｃ－融合（発現困難な）を発現するポリクローナル細胞集団。
－ピューロマイシン及びＢ５で又はピューロマイシン単独で選択される、トラスツズマブＩｇＧ（発現容易な）を発現するポリクローナル細胞集団。
－ピューロマイシンで選択される、トラスツズマブＩｇＧ（発現容易な）を発現するクローン。
－ピューロマイシンで選択される、ベバシズマブＩｇＧ（発現容易な）を発現するクローン。
－ピューロマイシンで選択される、インターフェロンベータ（発現困難な）を発現するクローン。

【0151】

これらの細胞を、抗生物質選択を行わずにスピンチューブ中で４日間増殖させた。トータルＲＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して細胞から単離した。ＲＮＡ品質を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して評価した。ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリ調製を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ－ｓｅｑ ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＩＬＬＵＭＩＮＡ）を使用して、全部ｃＤＮＡに逆転させた０．５μｇ～１μｇを使用して、達成した。ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリ１００ｎｔ対末端のシーケンシングを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００（登録商標）で行った。読み取りデータを、ＣＨＯ－Ｋ１トランスクリプトームにマッピングした（ＲｅｆＳｅｑ，２０１４）。

【0152】

細胞培養、安定な形質転換及び安定なポリクローナル株分析
浮遊チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ－Ｍ）を、加湿空気中、３７℃、５％ＣＯ２にてＬ－グルタミン（ＰＡＡ，Ａｕｓｔｒｉａ）及びＨＴサプリメント（ＧＩＢＣＯ，ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）を補給したＳＦＭ４ＣＨＯ Ｈｙｃｌｏｎｅ血清不含培地（ＳＦＭ，ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）中の浮遊培養において維持した。これらの実験のために使用される他の細胞培地は、ビタミンＢ１（チアミン塩酸塩；ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ）、ビタミンＢ５（ＤＬ－パントテン酸カルシウム；ＴＣＩ）及びビタミンＨ（ビオチン、ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ）を補給したＤｅｆｉｃｉｅｎｔ ＢａｌａｎＣＤ ＣＨＯ－Ｍ Ｇｒｏｗｔｈ Ａ（Ｂ－ＣＤｍｉｎ；Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。

【0153】

ＣＨＯ－Ｍ細胞に、製造者の推奨に従い、エレクトロポレーション（ＮＥＯＮＤＥＶＩＣＥＳ，ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）によりｐＢＳＫ－ＭＩＰ、ｐＢｌａｓｔ及びｐＣＳ２－Ｕ５－ＰＢＵ３ ＩｇＧ１－Ｈｃ又はＩｇＧ１－Ｌｃ発現ベクターを遺伝子移入した。安定な細胞株の産生を、３週間にわたり７．５μｇ／ｍＬのブラスチシジンを補完したＳＦＭ４ＣＨＯ培地を使用して達成した。

【0154】

ＧＦＰ又はＩｇＧを発現するＧＦＰ及びＩｇＧ１産生細胞ポリクローナル株を、次のようなさらなる実験のために選択した：ブラスチシジン選択の場合、細胞を、２週間にわたり１０ｍｇ／ｍＬブラスチシジンを補給したＳＦＭ培地中で播種し、次いでＳＦＭ培地が入ったウェルに５日間移し、次にＳＦＭ培地入りの５０ｍＬスピンチューブに移した。

【0155】

ピューロマイシン、次にＢ５での細胞の二重選択の場合、ポリクローナル安定細胞株を最初にピューロマイシンで選択し、次に細胞を、７日間にわたりＢ５選択培地中にて２４ウェルプレート中細胞２万個／ｍＬで播種し（Ｂ－ＣＤ完全培地を陰性対照として使用した）、次に７日間にわたりＳＦＭ完全培地ウェルに移し、次いでＳＦＭ培地が入ったピンチューブ（ｐｉｎ ｔｕｂｅ）に播種した。

【0156】

ＧＦＰ陽性細胞の蛍光細胞及び蛍光密度のパーセンテージを、ＣｙＡｎ ＡＤＰフローサイトメーター（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）を使用してフローサイトメトリー分析により決定した。細胞培養上清中の免疫グロブリン濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。ＧＦＰ、ＩｇＧ１Ｌｃ、ＩｇＧ１Ｈｃ及びＭＩＰ転写物蓄積を、分析前にＲＴ－定量ＰＣＲアッセイにより確認した。

【0157】

表面ＩｇＧ提示を、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（商標））を使用してＦＡＣＳ分析により評価した。ＩｇＧを発現する安定なクローンを、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ）上での細胞選別により得て、増殖させ、ＩｇＧ産生レベルについて分析した（サンドイッチＥＬＩＳＡ）。

【0158】

ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体反応エレメント（ＰＰＲＥ）及びＰＰＡＲ活性化の測定のための一過性アッセイ
一過性遺伝子移入アッセイを次のように行った：ＣＨＯ細胞に、ｐＳＧ５＿ＰＰＡＲαベクターなし又はありで、ＰＰＲＥ－ＴＫ－ＤｓＲｅｄ（Ｍｉｃｈａｌｉｋ ｌａｂ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌａｕｓａｎｎｅにより提供）又はＴＫ－ＤｓＲｅｄ（ＰＰＲＥ配列を前のベクターから切り出した）を遺伝子移入した。ｐＥ－ＢＦＰ２－Ｎｕｃ（２ｘＮＬＳ）を内部遺伝子移入対照として使用した。それは、最小ＣＭＶプロモーターの制御下のｅＢＦＰ２（高感度青色蛍光タンパク質２）コード配列及び核局在化配列ＮＬＳを含有する。細胞を、遺伝子移入後、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇａｌｌｉｏｓ Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）を使用してフローサイトメトリーにより４８時間観察し、シグナルを、Ｋａｌｕｚａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（登録商標）ソフトウェアにより分析した。ＤｓＲｅｄ活性（検出：６３８ｎｍ）を、ＢＦＰ２マーカー（検出４８８ｎｍ）に対し標準化した。

【0159】

流加培養性能評価
流加培養における増殖及びＩｇＧ分泌性能を、次の変更を行ってＬｅ Ｆｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３に従い行った：ＭＩＰの発現のために安定に遺伝子移入したＩｇＧ産生クローンを、５０ｍＬファルコンにおいて５ｍＬ培地中で細胞３０万個／ｍＬで播種した。生存細胞密度及びＩｇＧタイター（ｇ／Ｌ）を、３、６、８、９、１０及び１３日後に評価した。

【0160】

定量的ＰＣＲ分析
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析のために、トータルＲＮＡを１０^６個の細胞から抽出し、ＧｏＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。転写物蓄積を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ＩＩ機器（Ｒｏｃｈｅ）を使用してｑＰＣＲにより定量した。転写レベルをＳＤＨＡハウスキーピング遺伝子に対し正規化した。

【0161】

代謝産物分析（代謝産物抽出、試料量正規化）
代謝産物抽出
代謝産物定量のために、細胞ペレットを、最良の中間物として１０００μＬの予め冷却したＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ（４：１、ｖ／ｖ）溶媒混合物で抽出して、タンパク質を効率的に沈殿させ、代謝を不活性化し、幅広い範囲の極性代謝物を抽出した。試料を次に、プローブ超音波処理して（４パルスｘ５ｓｅｃ）、細胞を完全に溶解させ、代謝産物抽出を改善した。タンパク質沈殿を促進するために、試料を－２０℃で１時間温置し、続いて４℃にて１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。得られた上清を収集し、真空濃縮器（ＬＡＢＣＯＮＣＯ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳ）中で蒸発乾固した。次いで試料抽出物を、１００μＬのＭｅＯＨ：水（４：１）中で再構成し、ＬＣ－ＭＳ系に注入した。

【0162】

タンパク質定量
タンパク質ペレットを蒸発させ、短時間プローブ超音波（５パルスｘ５ｓｅｃ）を使用して、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４Ｍグアニジン塩酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣＩ、１ｍＭ Ｎａ_２ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭベータグリセロリン酸、１ｍＭ Ｎａ_３ＣＯ_４、１μｇ／ｍＬロイペプチン中で溶解させた。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，Ｍａｓｓｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳ）を使用して、総タンパク質濃度を測定した（Ａ５６２ｎｍ）（ＨＩＤＥＸ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）。

【0163】

データ取得－ＬＣ－ＨＲＭＳ
抽出試料を、７０，０００半値全幅（ＦＷＨＭ）の質量分解能で稼働するＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ（登録商標）機器（Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）質量分析装置）（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を使用して、負イオン化モードで高解像度質量分析（ＨＩＬＩＣ－ＨＲＭＳ）と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィーにより分析した。代謝産物を、ＺＩＣ ｐＨＩＬＩＣ（１００ｍｍ、２．１ｍｍ Ｉ．Ｄ．及び５μｍ粒径）カラムを使用してクロマトグラフィーで分離した。移動相は、Ａ＝ｐＨ９．３の水中２０ｍＭ酢酸アンモニウム及び２０ｍＭ ＮＨ_４ＯＨ及びＢ＝１００％ＡＣＮから構成された。９０％Ｂ（０～１．５分）から５０％Ｂに下げる直線的勾配溶出を適用し（１．５分～８分）、続いて均一濃度段階（８分～１１分）及び４５％Ｂへの直線的勾配（１１分～１２分）を適用した。これらの条件を３分間保持した。最後に、最初のクロマトグラフィー条件を、カラム再平衡化のための９分間の運転後の操作として確立した。流速は３００μＬ／ｍｉｎ、カラム温度３０℃及び試料注入体積２．５μＬであった。ＥＳＩソース条件を次のように設定した：プローブヒーター温度２００℃、シースガス６０ａ．ｕ．、補助ガス１５ａ．ｕ．、キャピラリー温度２８０℃及びＥＳＩスプレー電圧－３６００Ｖ。フルスキャンモードを収集モードとして使用して、乳酸、ピルビン酸、３－ヒドロキ酪酸及びパントテン酸を定量し、一方でアセチル－ＣｏＡを、衝突エネルギーとして３０ｅＶを用いて、並行反応モニタリング（ＰＲＭ）収集モードを使用して定量した。

【0164】

データ処理
生のＬＣ－ＨＲＭＳデータを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃソフトウェア（Ｘｃａｌｉｂｕｒ ４．０ ＱｕａｎＢｒｏｗｓｅｒ（登録商標）、ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を使用して処理した。代謝産物定量を、外部の較正曲線を使用して行った。

【0165】

統計学的分析
結果を、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）又は平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。統計学的分析を、片側又は両側スチューデントｔ検定を使用して行った。図パネル中の星印は、統計学的確率を指す。０．０５未満の統計学的確率値を有意とみなした。

【0166】

次のための、材料及び方法：
異なる治療用タンパク質発現ＣＨＯクローンの分泌に対するＭＩＰの個々の発現又はそれらの組み合わせの発現の効果の評価
ＣＦＬＡＲ、ＧＣＬＭ、ＡＣＴＣ１：
ＤＮＡベクターコンストラクト
ＰＢトランスポサーゼ発現ベクターｐＣＳ２＋Ｕ５Ｖ５ＰＢＵ３は、ゼノパス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）ベータグロブリン遺伝子の５’及び３’非翻訳末端領域（ＵＴＲ）に囲まれるＰＢトランスポサーゼコード配列を含有する。このプラスミドを、次のように構築した：ｐＢＳＳＫ／ＳＢ１０（Ｄｒ Ｓ．Ｉｖｉｅｓの厚意により提供）からの３’ＵＴＲ ３１７ｂｐ断片を、ｐＣＳ２＋Ｕ５（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ／ＬＩＦＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）に挿入して、ｐＣＳ２＋Ｕ５Ｕ３を得た。ＰＢトランスポサーゼコード配列（２０６７ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＦ５８７６９８）を、ＡＴＧ：生合成（Ｍｅｒｚｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成し、２個のＵＴＲの間でｐＣＳ２＋Ｕ５Ｕ３骨格にクローニングした。ＰＢ対照ベクターは、未修飾ｐＣＳ２＋Ｕ５プラスミドに対応する（図１０、左パネル）。異なるトランスポゾンベクターを、ＡＴＧ：生合成（Ｍｅｒｚｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成されたＰＢ２３５ｂｐ３’及び３１０ｂｐ５’末端逆位配列（ＩＴＲｓ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ－プラスミド（ｐＢＳＫ ＩＴＲ３’－ＩＴＲ５’、図１、右パネル）に導入することにより作製した。ｐＲｃ／ＲＳＶプラスミドからのＳＶ４０プロモーター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ／ＬＩＦＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）制御下のピューロマイシン耐性遺伝子（ＰｕｒｏＲ）を次に、２つのＩＴＲの間に挿入した。この試験で使用したＭＡＲ １－６８及びＭＡＲ Ｘ－２９エレメント、ピューロマイシン耐性及びＧＦＰ遺伝子は、前に記載のとおりであった。

【0167】

ＣＨＯ細胞株の細胞培養、安定な遺伝子移入及びサブクローニング
浮遊チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ－Ｋ１）を、加湿空気中、３７℃、５％ＣＯ２中でＬ－グルタミン（ＰＡＡ，Ａｕｓｔｒｉａ）及びＨＴサプリメント（ＧＩＢＣＯ，ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補給したＳＦＭ４ＣＨＯ Ｈｙｃｌｏｎｅ血清不含培地（ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）中で維持した。ＣＨＯ－Ｋ１細胞に、製造者の推奨に従い（Ｎｅｏｎ ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、エレクトロポレーションによりピューロマイシン耐性遺伝子を有する関心のある組み換えタンパク質発現ベクターを遺伝子移入した。２日後、細胞を、１０μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含有する培地中、Ｔ７５プレートに移し、細胞を２週間、選択下でさらに培養した。ベバシズマブＩｇＧ、Ｆｃ融合又は循環ホルモンを発現する安定な個々の細胞クローンを次に、限界希釈により作製し、増やし、増殖性能及び産生レベルについて分析した。最大タンパク質レベルを発現するベバシズマブＩｇＧ－、Ｆｃ－融合産生細胞クローンを、さらなる生化学実験のために選択した。循環ホルモン発現ＣＨＯＭクローンを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティングにより分析した。

【0168】

これらのクローンのいくつかに次に、以下に記載のようにエレクトロポレーションにより、様々な代謝改善タンパク質（ＭＩＰ）発現ベクター及びブラスチシジン耐性遺伝子を有するプラスミドを同時遺伝子移入した。細胞を次に、上記のように、２週間、１０μｇ／ｍＬのブラスチシジンを含有する培地中で培養した。安定なクローンを限界希釈により単離し、増殖及び産生について分析する前に、ｃｌｏｎｅｐｉｘ装置を使用してクローンを単離した。

【0169】

細胞培養及び遺伝子移入分析
ＣＨＯ－Ｍ細胞を、加湿空気中、３７℃、５％ＣＯ_２でＬ－グルタミン（ＰＡＡ，Ａｕｓｔｒｉａ）及びＨＴサプリメント（ＧＩＢＣＯ，ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補給したＳＦＭ４ＣＨＯ Ｈｙｃｌｏｎｅ血清不含培地（ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）中で、浮遊培養において維持した。これらの細胞に、製造者（Ｎｅｏｎ ｄｅｖｉｃｅｓ，ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）の推奨に従い、エレクトロポレーションによりトランスポゾンドナープラスミドを遺伝子移入した。組み換えタンパク質分泌レベルの定量を、前に記載のようなバッチ培養から行った（Ｌｅ Ｆｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３を参照）。簡潔に述べると、免疫グロブリンを発現する細胞集団を、７日間にわたり３７℃にて５％ＣＯ_２加湿インキュベーター中で、５０ｍＬミニバイオリアクターチューブ（ＴＰＰ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）へのバッチ培養において評価した。細胞培養上清中の免疫グロブリン濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。

【0170】

或いは、２個のクローンを、ＣｌｏｎｅＰｉｘ（登録商標）装置を使用して、３つのＩｇＧのそれぞれを発現する非選別及び非選択集団から単離した。簡潔に述べると、半固形培地を使用して単一細胞を固定し、高量のＩｇＧを分泌するコロニーを、埋め込みの１０日後に拾った。これらの細胞株を、１８０ｒｐｍでオービタル振盪しながら、３７℃及び５％ＣＯ_２で維持した加湿インキュベーターにおいて、ペプトン含有増殖培地（８ｍＭグルタミンを補給したＨｙｃｌｏｎｅ ＳＦＭ４ＣＨＯ）中で細胞３ｘ１０^５個／ｍＬの密度で、スピンチューブバイオリアクターにおいて３～４日ごとに継代した。

【0171】

ポリクローナル細胞集団を評価する場合に、ＩｇＧタイターを、細胞１ｘ１０^５個／ｍＬの細胞密度で播種し５０ｍＬスピンチューブバイオリアクターにおいて５ｍＬの完全培地中で６日間増殖させた細胞から決定した。或いは、クローン集団の振盪フラスコ培養物を、細胞３ｘ０５個／ｍＬの密度でＳＦＭ４ＣＨＯ培地に接種して流加培養産生過程を開始した。流加培養産生アッセイを、０ｒｐｍで振盪しながら３７℃及び５％ＣＯ_２で維持した加湿インキュベーターにおいて、１２５ｍＬ振盪フラスコ中、培養体積２５ｍＬで又は５０ｍＬ ＴＰＰ培養チューブ中で培養体積５ｍＬで行った（２５ｍＬ振盪フラスコ及びスピンチューブ）。産生を、第０日、３日及び６～８日に化学的に定義された濃縮フィード（ＨＹＣＬＯＮＥ、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ５、５２ｇ／Ｌ）の最初の培養体積の１６％を与えることにより１０日間行った。培養操作中はグルタミン及びグルコース供給を適用しなかった。培養物の生存能及び生存細胞密度（ＶＣＤ）を、ＧＵＡＶＡ（登録商標）機器（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を使用して毎日測定した。二重サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して、培地に分泌されたＭＡｂ濃度を決定した。

【0172】

バッチ及び流加培養
ベバシズマブＩｇＧ－、Ｆｃ－融合及び循環ホルモンを発現する個々のクローンの増殖及び産生性能を、７日間の、５％ＣＯ_２加湿インキュベーター中３７℃の５０ｍＬミニバイオリアクター（ＴＰＰ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）へのバッチ培養において評価した。細胞培養第３、第４及び第７日に、細胞密度及び生存能を、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ（登録商標）フローサイトメトリーシステム（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を使用して決定した。細胞培養上清中のＩｇＧタイターを、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。細胞密度（Ｃｖ．ｍＬ １）及びＩｇＧタイター値（ｐｇ．ｍＬ）を、指定の処理時間試料採取日にプロットした。

【0173】

組み換えタンパク質発現クローンのＩｇＧ比生産性を、第３～第７日（産生期）から計算した積分生存細胞数（ＩＶＣＤ）に対するＭＩＰ濃度の勾配として決定し、ｐｇ／細胞及び／日（ｐｃｄ）として表した。流加培養産生培養のために、細胞を、ＳＦＭ４ＣＨＯ Ｈｙｃｌｏｎｅ血清不含培地２５ｍＬ中、１２５ｍＬ振盪フラスコに０．３ｘ１０^６個／ｍＬで播種した。培養を、撹拌しながら３７℃及び５％ＣＯ_２で維持した。培養物に市販のＨｙｃｌｏｎｅ Ｆｅｅｄ（ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を毎日与えた。細胞密度及びＩｇＧ産生を毎日評価した。

【0174】

Ｅｒｐ２７及びＥｒｐ５７：
ＤＮＡベクターコンストラクト
候補遺伝子コード配列（ＣＤＳ）を得るために、トータルＲＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）ＲＮＡキット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ）を使用してＣＨＯ－Ｍ細胞（ＳＵＲＥ ＣＨＯ－Ｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ（商標），Ｓｅｌｅｘｉｓ ＳＡ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から単離した。逆転写を、ＧｏＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して行った。候補遺伝子ＣＤＳを、ｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿ＢＴ＋＿Ｘ２９＿ＩＴＲ（ｐＢＳＫ＿ＩＴＲ）又はｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿Ｂｌａｓｔベクターに挿入した。ｐＢＳＫ＿ＩＴＲベクターは、ＣＭＶ／ＥＦ１アルファプロモーター及びＢＧＨポリアデニル化シグナルとそれに続くｈＭＡＲ Ｘ－２９から構成される発現カセットを含む（Ｌｅ Ｆｏｕｒｎ，Ｇｉｒｏｄ，Ｂｕｃｅｔａ，Ｒｅｇａｍｅｙ，＆ Ｍｅｒｍｏｄ，２０１４）。発現カセットにはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの末端逆位配列が隣接する。ｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿Ｂｌａｓｔベクターにおいて、ＳＶ４０プロモーター制御下のブラスチシジン耐性遺伝子をｈＭＡＲ Ｘ－２９の後に挿入した。Ｅｒｐ２７及びＥｒｐ５７が発現困難なタンパク質発現細胞において又はＥｒｐ２７若しくはＣａ３過剰発現の滴定時に過剰発現された実験において、ｐＢＳＫ＿ＩＴＲプラスミドを使用し、細胞に、ＳＶ４０プロモーター制御下でブラスチシジン耐性を有するプラスミドを同時遺伝子移入した。他の実験において、ｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿Ｂｌａｓｔベクターを使用した。Ｆｏｘａ１が過剰発現された実験において、ＣＭＶ／ＥＦ１アルファプロモーターを、Ｆｏｘａ１及びＧＦＰ両方の発現のために最小ＣＭＶプロモーターにより置き換えた。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼ発現ベクター（ｐＣＳ２＋Ｕ５Ｖ５ＰＢＵ３）は、以前に記載された（Ｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0175】

活性酸素種分析
細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）レベルを、６－カルボキシ－２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタート（カルボキシ－Ｈ_２ＤＣＦＤＡ，ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を使用することにより検出した。流加培養の異なる日に、２００万個の細胞を３０分間、５０μＭカルボキシ－Ｈ_２ＤＣＦＤＡを含有するＰＢＳ中で温置した。細胞を次に、遠心分離し、１ｍＬ ＰＢＳ中で再懸濁し、ＤＡＰＩで染色して、死細胞を排除した。カルボキシ－Ｈ_２ＤＣＦＤＡ蛍光を、ＤＡＰＩ陰性細胞集団中でフローサイトメトリーにより分析した（Ｇａｌｌｉｏｓ（登録商標），ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）。

【0176】

細胞培養、安定な形質転換及び安定なポリクローナル株の分析
細胞を、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター中、３７℃で、５％ＨｙＣｌｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ５サプリメント（ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）、８ｍＭ Ｌ－グルタミン（ＰＡＡ，Ａｕｓｔｒｉａ）及び１Ｘ ＨＴサプリメント（ＧＩＢＣＯ）を補給したＳＦＭ４ＣＨＯ Ｈｙｃｌｏｎｅ血清不含培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中の浮遊培養で維持した。トラスツズマブ又はインフリキシマブ抗体を産生するポリクローナルＣＨＯ－Ｍ細胞を作製し、以前に記載のように特徴を評価した（Ｌｅ Ｆｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＩｇＧ発現安定クローンを、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（ＢＤ）での細胞選別により得て、増殖させ、サンドイッチＥＬＩＳＡによりＩｇＧ産生レベルについて分析した。候補遺伝子を過剰発現する安定な細胞株を、製造者のプロトコール（Ｎｅｏｎ（登録商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ １００μＬ Ｋｉｔ，ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に従いエレクトロポレーションを使用して、ｐＢＳＫ＿ＩＴＲ ＣＤＳ、ｐＢｌａｓｔ及びｐＣＳ２＋Ｕ５Ｖ５ＰＢＵ３を、又はｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿Ｂｌａｓｔ＿ＣＤＳ及びｐＣＳ２＋Ｕ５Ｖ５ＰＢＵ３をトラスツズマブ又はインフリキシマブ産生クローンに再遺伝子移入することにより得た。安定な挿入がある細胞を、３又は７．５μｇ／ｍＬのブラスチシジン（ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ）を使用して選択した。エタネルセプト産生クローンについて、Ｅｒｐ２７及びＥｒｐ５７を同時発現する単サブクローンを単離し、それらの産生を、ＣｌｏｎｅＰｉｘ細胞コロニーイメージング装置を使用して評価した。最も広いエタネルセプト分泌ハロを示す細胞コロニーを、Ｅｒｐ２７及びＥｒｐ５７過剰発現又は対照細胞集団から単離した。

【0177】

ＡＣＴＣ１及びＴＡＧＡＰ：
ＤＮＡベクターコンストラクト
ＡＣＴＣ１及びＴＡＧＡＰ遺伝子のゲノム及びｃＤＮＡ配列を、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェアを使用してマウスにおける相同遺伝子に対してアライメントした後で決定した。転写物配列ＲＮＡｓｅｑ分析を、Ｓｅｌｅｘｉｓ ＳＡ ＣＨＯ Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｍ）に対し行った。ｃＤＮＡライブラリを、ＧｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＭＥＧＡ）を使用して、１０^６個のＣＨＯ－Ｍ細胞から単離される１μｇトータルＲＮＡからの逆転写により作製した（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）ＲＮＡキット；ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ）。ＡＣＴＣ１及びＴＡＧＡＰコード配列（ＣＤＳ）をｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿ＢＴ＋＿ＥＧＦＰ＿Ｘ２９＿ＩＴＲ転位性発現ベクター（Ｌｅ Ｆｏｕｒｎ，Ｇｉｒｏｄ，Ｂｕｃｅｔａ，Ｒｅｇａｍｅｙ，＆ Ｍｅｒｍｏｄ，２０１４）にクローニングし、ｐＢＳＫ－ＡＣＴＣ１及びｐＢＳＫ－ＴＡＧＡＰ発現ベクターを得た。ｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿ＢＴ＋＿ＥＧＦＰ＿Ｘ２９＿ＩＴＲベクターは、ＣＭＶ／ＥＦ１アルファ融合プロモーター及びＢＧＨポリアデニル化シグナルとそれに続くｈＭＡＲ Ｘ－２９から構成される発現カセットを含む。発現カセットにはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの末端逆位配列が隣接する。ブラスチシジンベクター（ｐＢｌａｓｔ）は、ｐＲｃ／ＲＳＶプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を起源とするＳＶ４０プロモーターの制御下でブラスチシジン耐性遺伝子を含有する。

【0178】

細胞培養及び安定な遺伝子移入
ＣＨＯ Ｋ１細胞を、加湿空気中、３７℃、５％ＣＯ_２にてＬ－グルタミン（ＰＡＡ，Ａｕｓｔｒｉａ）及びＨＴサプリメント（ＧＩＢＣＯ，ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）を補給したＳＦＭ４ＣＨＯ Ｈｙｃｌｏｎｅ（登録商標）血清不含培地（ＳＦＭ，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））中での浮遊培養において維持した。これらの実験のために使用した他の細胞培地は、ビタミンＢ１（チアミン塩酸塩；ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ）、ビタミンＢ５（ＤＬ－パントテン酸カルシウム；ＴＣＩ）及びビタミンＨ（ビオチン、ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ）を補給したＤｅｆｉｃｉｅｎｔ ＢａｌａｎＣＤ ＣＨＯ Ｇｒｏｗｔｈ Ａ（Ｂ－ＣＤｍｉｎ（登録商標）；ＩＲＶＩＮＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）である。ＣＨＯ細胞に、製造者の推奨（ＮＥＯＮＤＥＶＩＣＥＳ，ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に従いエレクトロポレーションにより、ｐＢＳＫ－ＡＣＴＣ１又はＴＡＧＡＰ、ｐＢｌａｓｔ及びｐＣＳ２－Ｕ５－ＰＢＵ３ ＩｇＧ１－Ｈｃ又はＩｇＧ１－Ｌｃ発現ベクターを遺伝子移入した。安定な細胞株の産生を、３週間にわたり７．５μｇ／ｍＬのブラスチシジンを補完したＳＦＭ４ＣＨＯ培地中で遺伝子移入細胞を培養することにより達成した。ＩｇＧを発現するポリクローナル細胞集団を、次のようにさらなる実験のために選択した：ブラスチシジン選択のため、細胞を２週間にわたり１０μｇ／ｍＬブラスチシジンを補給したＳＦＭ４ＣＨＯ培地中で播種し、次に５日にわたり非補給培地を含有するウェルに培養し、次に５０ｍＬスピンチューブに移した。

【0179】

安定なポリクローナル及びモノクローナル株の分析
流加培養性能評価、ＩｇＧ細胞表面染色、ＩｇＧ細胞分泌アッセイ及びビタミンＢ５代謝産物定量を、前に記載のように（Ｐｏｕｒｃｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１９）行った。簡潔に述べると、流加培養におけるＩｇＧ分泌性能試験を、以前に報告されているように（Ｌｅ Ｆｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）行った。細胞表面ＩｇＧのアッセイは以前に報告されたとおりであり（Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２００３）、組み換えＩｇＧタンパク質を発現する細胞プールを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（登録商標）からのＣｌｏｎｅＰｉｘ（商標）ＦＬ Ｉｍａｇｅｒを使用してサブクローニングした。ビタミンＢ５代謝産物定量のために、細胞ペレットを１ｍＬの冷ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ（４：１、ｖ／ｖ）溶媒混合物で抽出し、次にプローブ超音波処理した。－２０℃で１時間の温置とそれに続く１５分間の４℃で１３，０００ｒｐｍの遠心分離後に得られた上清を収集し、蒸発乾固し、次いで１００μＬ ＭｅＯＨ：水（４：１）中で再構成し、ＬＣ－ＭＳシステムに注入した。タンパク質ペレットを蒸発させ、短時間のプローブ超音波処理を使用して２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４Ｍグアニジン塩酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭベータ－グリセロリン酸、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１μｇ／ｍＬロイペプチン中で溶解させた。抽出した試料を、７０，０００半値全幅の質量解像力で稼働するＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ（登録商標）機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））を使用する負イオン化モードにおいて、ＨＩＬＩＣ－ＨＲＭＳにより分析した。生のＬＣ－ＨＲＭＳデータを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）ソフトウェア（Ｘｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）４．０ＱｕａｎＢｒｏｗｓｅｒ（登録商標），ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＦＩＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を使用して処理した。代謝産物定量を、外部較正曲線を使用して行った。

【0180】

ＲＮＡ ＲＴ－ＰＣＲ及びシーケンシングＲＮＡ－ｓｅｑ分析
ＲＮＡ逆転写及びリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）分析のために、トータルＲＮＡを細胞１０^６個から抽出し、ポリＴプライマーを使用してｃＤＮＡに逆転写した。転写物蓄積を、ＥＵＲＯＧＥＮＴＥＣ Ｉｎｃ．からのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ－Ｔａｑポリメラーゼキット及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ＰＣＲ装置（ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を使用してｑＰＣＲにより定量した。転写物レベルをＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子に対し正規化した。Ｂ５選択及びピューロマイシン選択ＣＨＯ細胞のＲＮＡＳｅｑ分析は以前に記載のとおりであった（Ｐｏｕｒｃｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。

【0181】

簡潔に述べると、トータルＲＮＡを、ｉ）親ＣＨＯ細胞、ｉｉ）Ｂ５欠乏／ピューロマイシン選択又はピューロマイシン選択単独に供した、インターフェロンベータ及びＢ５輸送体ＳＬＣ５Ａ６発現ベクターを発現するＣＨＯ細胞クローン、ｉｉｉ）Ｂ５欠乏／ピューロマイシン選択又はピューロマイシン選択単独で前のように選択された、トラスツズマブ及びＳＬＣ５Ａ６発現ベクターを発現するＣＨＯ細胞プールから抽出した。ｃＤＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ－ｓｅｑ ｒｅａｇｅｎｔ（ＩＬＬＵＭＩＮＡ）を使用して、トータルＲＮＡ ０．５μｇ～１μｇから得た。ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリ１００ｎｔ対末端を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００（登録商標）でシーケンシングした。読み取りデータを、ＣＨＯ－Ｋ１トランスクリプトームに対しマッピングした（ＲｅｆＳｅｑ，２０１４）。

【0182】

タンパク質試料調製及び免疫ブロッティング
トータルアクチン含量を次のように評価した。タンパク質抽出を、ＰＢＳ中で洗浄した細胞１０^７個から行い、その後、細胞ペレットを、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（１５０Ｍｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１％ＮＰ－４０、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）中に再懸濁し、３０分間撹拌した。細胞残屑を、遠心分離（５分、１５．０００ｇ）によりペレット化し、上清を収集した。タンパク質試料の等体積を、６～１４％ＳＤＳ／Ｐａｇｅゲル、Ｍｉｎｉ－Ｐｒｏｔｅａｎ Ｔｅｔｒａ Ｇｅｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）及びＭｉｎｉ ｔｒａｎｓ Ｂｌｏｔ Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用する変性ゲル電気泳動及び免疫ブロッティング用に処理し、タンパク質を、ニトロセルロース膜上にブロッティングした。膜を室温で１時間、５％スキムミルク粉末入りのＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ ２０ｍＭ、ＮａＣｌ １３５ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％、ｐＨ７．６）中でブロッキング処理した。膜を次に、抗アルファ－心臓アクチンポリクローナル抗体（ＰＡ５－２１３９６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、希釈１：５００）又は抗ＧＡＰＤＨ（ｓｃ－３２２３３，ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、希釈１：５００）とともに一晩温置し、次にＨＲＰ結合二次抗体、抗マウス（Ｇ２１０４０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、希釈１：１０００）とともに１時間温置した。タンパク質バンドを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ（登録商標）（３４５８０，ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）及びＣｈｅｍｉＤｏｃ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を使用することにより可視化した。得られたタンパク質バンド強度を、ＩｍａｇｅＪ（登録商標）（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）のＦＩＪＩ分布により定量した。

【0183】

蛍光活性化細胞選別によるアクチン重合化の分析
重合化アクチン（Ｆ－アクチン）のレベルを、ＳＦＭ中で細胞２ｘ１０^５個／ｍＬを播種し、５％ＣＯ_２で３７℃にて３日間培養することにより開始した細胞培養において評価した。細胞１０^６個の３つのアリコートを各培養から収集し、細胞を、２００ｎＭのＳｉＲ－アクチン（ＣＹ－ＳＣ００１（登録商標），ＳＰＩＲＯＣＨＲＯＭＥ）を補給した新鮮培地中に再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間温置した。細胞を次に、ＦＡＣＳ（ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ，ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）により選別し、それらの蛍光レベルに依存して細胞を選別した（Ａｂｓ ６５２ｎｍ、Ｅｍ６７４ｎｍ；低、中及び高蛍光）。これらの細胞集団を増加させ、さらなる分析まで３７℃、５％ＣＯ_２で維持した。

【0184】

本発明の系（ベクター／細胞など）、方法及びキットは、様々な実施形態の形態で組み込まれ得、本明細書中で開示されるものはそのうちごく一部のみであることが認められよう。他の実施形態が存在し、本発明の精神から逸脱しないことが当業者により認められよう。従って、記載される実施形態は例示的であり、限定するものとして解釈されるべきではない。

【0185】

文献目録
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Ｃａｉｎ，Ｋ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｓ．，Ｈａｉｌｕ，Ｈ．，Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｂ．，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．，Ｈｅａｄｓ，Ｊ．，．．．Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ａ．（２０１３）．Ａ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ＸＢＰ１ ａｎｄ ＥＲ０１ －Ｌａｌｐｈａ ｈａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ，２９（３），６９７－７０６．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｔｐｒ．１６９３
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Ｃｏｎｎｅｌｌｙ ＴＭ，Ｂｅｒｇ ＡＳ，Ｈａｒｒｉｓ ＬＲ ３ｒｄ，Ｈｅｇａｒｔｙ ＪＰ，Ｒｕｇｇｉｅｒｏ ＦＭ，Ｄｅｉｌｉｎｇ ＳＭ，Ｂｒｉｎｔｏｎ ＤＬ，Ｋｏｌ－ｔｕｎ ＷＡ．Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖａｒｉｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｌｏｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｉｎ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ．２０１４ Ａｕｇ；１９０（２）：４５７－６４．
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Ｄｉｎｎｉｓ ＤＭ，Ｓｔａｎｓｆｉｅｌｄ ＳＨ，Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ Ｓ，Ｓｍａｌｅｓ ＣＭ，Ａｌｅｔｅ Ｄ，Ｂｉｒｃｈ ＪＲ，Ｒａｃｈｅｒ ＡＪ，Ｍａｒｓｈａｌｌ ＣＴ，Ｎｉｅｌｓｅｎ ＬＫ，Ｊａｍｅｓ ＤＣ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＧＳ－ＮＳ０ ｍｕｒｉｎｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｖａｒｙｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００６ Ａｕｇ ５；９４（５）：８３０－４１．
Ｄｕｋｅ－Ｃｏｈａｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．，Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ａ．，Ｃｈｏｉ，Ｙ．Ｉ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｎ．，Ａｃｕｔｏ，Ｏ．，．．．Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，Ｅ．Ｌ．（２０１８）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｂｙ Ｔａｇａｐ，ａ ＧＡＰ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｈｕｍａｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ，１１（５３４）．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｓｉｇｎａｌ．ａａｎ８７９９
Ｅｙｒｅ，Ｓ．，Ｈｉｎｋｓ，Ａ．，Ｂｏｗｅｓ，Ｊ．，Ｆｌｙｎｎ，Ｅ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ａ．Ｇ．，Ｂａｒｔｏｎ，Ａ．（２０１０）．Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｖａｒｉａｎｔｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｒｅｅ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ： ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ ｃｏｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ ｔｈｅｒａｐｙ，１２（５），Ｒ１７５．ｄｏｉ：１０．１ １８６／ａｒ３１３９
Ｆａｒｒｅｌｌ，Ａ．，ＭｃＬｏｕｇｈｌｉｎ，Ｎ．，Ｍｉｌｎｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｍａｒｉｓｏｎ，Ｉ．Ｗ．，＆ Ｂｏｎｅｓ，Ｊ．（２０１４）．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｏｍｉｃｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ，１３（７），３１４４－３１５９．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｐｒ５００２１９ｂ
Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．，Ｈａｎｄｒｉｃｋ，Ｒ．，＆ Ｏｔｔｅ，Ｋ．（２０１５）．Ｔｈｅ ａｒｔ ｏｆ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ，３３（８），１８７８－１８９６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｔｅｃｈａｄｖ．２０１５．１０．０１５
Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，＆ Ｋａｅｓｔｎｅｒ，Ｋ．Ｈ．（２００６）．Ｔｈｅ Ｆｏｘａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，６３（１９－２０），２３１７－２３２８．ｄｏｉ：１０．１００７／Ｓ０００１８－００６－６０９５－６
Ｇｕｌｉｓ，Ｇ．，Ｓｉｍｉ，Ｋ．Ｃ．，ｄｅ Ｔｏｌｅｄｏ，Ｒ．Ｒ．，Ｍａｒａｎｈａｏ，Ａ．Ｑ．，＆ Ｂｒｉｇｉｄｏ，Ｍ．Ｍ．（２０１４）．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｐｌｉｃｅｄ ｆｏｒｍ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｘ－ｂｏｘ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１４，２６．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２－６７５０－１４－２６
Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｍ．，Ｌａｔｏｒｒｅ，Ｙ．，Ｚｕｎｉｇａ，Ｒ．，Ａｇｕｉｌｌｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｍｏｌｉｎａ，Ｍ．Ｃ．，＆ Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ，Ｃ．（２０１９）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３９（５），６６５－６７９．ｄｏｉ：１０．１０８０／０７３８８５５１．２０１９．１６０５４９６
Ｈａ，Ｔ．Ｋ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ａ．Ｈ．，Ｋｏｌ，Ｓ．，Ｋｉｌｄｅｇａａｒｄ，Ｈ．Ｆ．，＆ Ｌｅｅ，Ｇ．Ｍ．（２０１８）．Ｂａｉｃａｌｅｉｎ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ＣＨＯ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ，１３（３），ｅ１７００４２５．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｏｔ．２０１７００４２５
Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｃ．Ｎ．，Ｌｕｎｄ，Ａ．Ｍ．，Ｋｏｌ，Ｓ．，Ｇｒａｖ，Ｌ．Ｍ．，Ｌｕｎｄｑｖｉｓｔ，Ｍ．，．．．Ｋｉｌｄｅｇａａｒｄ，Ｈ．Ｆ．（２０１５）．Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ，５，１８０１６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１８０１６
Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｐｒｉｓｔｏｖｓｅｋ，Ｎ．，Ｋｉｌｄｅｇａａｒｄ，Ｈ．Ｆ．，＆ Ｌｅｅ，Ｇ．Ｍ．（２０１７）．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｅｃｔｏｐｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｇｅｎｅｓ：Ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ，３５（１），６４－７６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｔｅｃｈａｄｖ．２０１６．１１．００８
Ｈａｒｅｄｙ，Ａ．Ｍ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ａ．，Ｈｏｎｄａ，Ｋ．，Ｏｈｙａ，Ｔ．，Ｏｈｔａｋｅ，Ｈ．，＆ Ｏｍａｓａ，Ｔ．（２０１３）．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＡＴＦ４ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６５（６），９９３－１００２．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０６１６－０１３－９６３１－ｘ
Ｈａｙｅｓ，Ｎ．Ｖ．，Ｓｍａｌｅｓ，Ｃ．Ｍ．，＆ Ｋｌａｐｐａ，Ｐ．（２０１０）．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＩｇＧ４ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１０５（４），７７０－７７９．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．２２５８７
Ｈｅｃｋｌａｕ，Ｃ．，Ｐｅｒｉｎｇ，Ｓ．，Ｓｅｉｂｅｌ，Ｒ．，Ｓｃｈｎｅｌｌｂａｅｃｈｅｒ，Ａ．，Ｗｅｈｓｌｉｎｇ，Ｍ．，Ｅｉｃｈｈｏｒｎ，Ｔ．，．．．Ｚｉｍｍｅｒ，Ａ．（２０１６）．Ｓ－Ｓｕｌｆｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｓ ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ＣＨＯ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｖｉａ ａｎｔｉ－ｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２１８，５３－６３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｔｅｃ．２０１５．１１．０２２
Ｈｕ，Ｑ．，Ｌｉｎ，Ｘ．，Ｄｉｎｇ，Ｌ．，Ｚｅｎｇ，Ｙ．，Ｐａｎｇ，Ｄ．，Ｏｕｙａｎｇ，Ｎ．，．．．Ｙａｏ，Ｈ．（２０１８）．ＡＲＨＧＡＰ４２ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄ，７（８），３８６２－３８７４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｃａｍ４．１５５２
Ｈｕｄｄｅｒ Ａ，Ｎａｔｈａｎｓｏｎ Ｌ，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ＭＰ．Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００３ Ｄｅｃ；２３（２４）：９３１８－２６．
Ｈｗａｎｇ，Ｓ．Ｏ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｊ．Ｙ．，＆ Ｌｅｅ，Ｇ．Ｍ．（２００３）．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＥＲｐ５７ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ，１９（１），１７９－１８４．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｐ０２５５７８ｍ
Ｉｎｏｕｅ Ｉ，Ｉｔｏｈ Ｆ，Ａｏｙａｇｉ Ｓ，Ｔａｚａｗａ Ｓ，Ｋｕｓａｍａ Ｈ，Ａｋａｈａｎｅ Ｍ，Ｍａｓｔｕｎａｇａ Ｔ，Ｈａｙａｓｈｉ Ｋ，Ａｗａｔａ Ｔ，Ｋｏｍｏｄａ Ｔ，Ｋａｔａｙａｍａ Ｓ．Ｆｉｂｒａｔｅ ａｎｄ ｓｔａｔｉｎ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＰＰＡＲａｌｐｈａ／ＲＸＲａｌｐｈａ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦｋａｐｐａＢ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００２ Ｊａｎ １１；２９０（１）：１３１－９．
Ｉｓｓｅｍａｎｎ Ｉ，Ｇｒｅｅｎ Ｓ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｅｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｂｙ ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９０ Ｏｃｔ １８；３４７（６２９４）：６４５－５０．
Ｊｏｈａｒｉ，Ｙ．Ｂ．，Ｅｓｔｅｓ，Ｓ．Ｄ．，Ａｌｖｅｓ，Ｃ．Ｓ．，Ｓｉｎａｃｏｒｅ，Ｍ．Ｓ．，＆ Ｊａｍｅｓ，Ｄ．Ｃ．（２０１５）．Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ”ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ－ｔｏ－ｅｘｐｒｅｓｓ” ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１１２（１２），２５２７－２５４２．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．２５６８７
Ｋａｎｅｋｏ，Ｙ．，Ｓａｔｏ，Ｒ．，＆ Ａｏｙａｇｉ，Ｈ．（２０１０）．Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅａｔｈ ｐｈａｓｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ，１０９（３），２８１－２８７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｓｃ．２００９．０９．０４３
Ｋｅｒｓｔｅｎ Ｓ，Ｄｅｓｖｅｒｇｎｅ Ｂ，Ｗａｈｌｉ Ｗ．Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＰＰＡＲｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ．２０００ Ｍａｙ ２５；４０５（６７８５）：４２１－４．
Ｋｉｍ，Ｊ．Ｙ．，Ｋｉｍ，Ｙ．Ｇ．，＆ Ｌｅｅ，Ｇ．Ｍ．（２０１２）．ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９３（３），９１７－９３０．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２５３－０１１－３７５８－５
Ｋｏｂｅｒ，Ｆ．Ｘ．，Ｋｏｅｌｍｅｌ，Ｗ．，Ｋｕｐｅｒ，Ｊ．，Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒ，Ｊ．，Ｍａｉｓ，Ｃ．，Ｈｅｒｍａｎｎｓ，Ｈ．Ｍ．，＆ Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ，Ｈ．（２０１３）．Ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ＥＲｐ２７ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｉｔｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８８（３），２０２９－２０３９．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．４１０５２２
Ｋｕ，Ｓ．Ｃ．，Ｎｇ，Ｄ．Ｔ．，Ｙａｐ，Ｍ．Ｇ．，＆ Ｃｈａｏ，Ｓ．Ｈ．（２００８）．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｘ－ｂｏｘ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｏｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ａｎｄ ＮＳ０ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，９９（１），１５５－１６４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．２１５６２
Ｋｎｕｌｌ，Ｈ．Ｒ．，＆ Ｗａｌｓｈ，Ｊ．Ｌ．（１９９２）．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，３３，１５－３０．
Ｌａｏ，Ｍ．Ｓ．，＆ Ｔｏｔｈ，Ｄ．（１９９７）．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｎｄ ｌａｃｔａｔｅ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓ，１３（５），６８８－６９１．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｐ９６０２３６０
Ｌｅ Ｆｏｕｒｎ，Ｖ．，Ｇｉｒｏｄ，Ｐ．Ａ．，Ｂｕｃｅｔａ，Ｍ．，Ｒｅｇａｍｅｙ，Ａ．，＆ Ｍｅｒｍｏｄ，Ｎ．（２０１４）．ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ，２１，９１－１０２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｂｅｎ．２０１２．１２．００３
Ｌｅｙ，Ｄ．，Ｈａｒｒａｇｈｙ，Ｎ．，Ｌｅ Ｆｏｕｒｎ，Ｖ．，Ｂｉｒｅ，Ｓ．，Ｇｉｒｏｄ，Ｐ．Ａ．，Ｒｅｇａｍｅｙ，Ａ．，．．．Ｍｅｒｍｏｄ，Ｎ．（２０１３）．ＭＡＲ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，８（４），ｅ６２７８４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６２７８４
Ｌｕｋｉｎａｖｉｃｉｕｓ，Ｇ．，Ｒｅｙｍｏｎｄ，Ｌ．，Ｄ’Ｅｓｔｅ，Ｅ．，Ｍａｓｈａｒｉｎａ，Ａ．，Ｇｏｔｔｆｅｒｔ，Ｆ．，Ｔａ，Ｈ．，Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｋ．（２０１４）．Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１，７３１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２９７２
Ｌｕｏ，Ｗ．，Ｊａｎｏｓｔｉａｋ，Ｒ．，Ｔｏｌｄｅ，Ｏ．，Ｒｙｚｈｏｖａ，Ｌ．Ｍ．，Ｋｏｕｄｅｌｋｏｖａ，Ｌ．，Ｄｉｂｕｓ，Ｍ．，．．．Ｒｏｓｅｌ，Ｄ．（２０１７）．ＡＲＨＧＡＰ４２ ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ Ｓｒｃ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｃｅｌｌ ｍｏｔｉｌｉｔｙ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，１３０（１４），２３８２－２３９３．ｄｏｉ：１０．１２４２／ｊｃｓ．１９７４３４
Ｍａｒｕｙａｍａ ＳＹ，Ｉｔｏ Ｍ，Ｉｋａｍｉ Ｙ，Ｏｋｉｔｓｕ Ｙ，Ｉｔｏ Ｃ，Ｔｏｓｈｉｍｏｒｉ Ｋ，Ｆｕｊｉｉ Ｗ，Ｙｏｇｏ Ｋ．Ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ２２ａ１４ ｉｎ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｍａｌｅ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１６ Ｎｏｖ ４；６：３６４６８．
Ｍａｙｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｂｅｃｋ，Ｋ．Ａ．，＆ Ｎｅｌｓｏｎ，Ｗ．Ｊ．（１９９４）．Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ｉｎ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ： ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｒｔｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６（１），１６－２４．
Ｍｉｃｈａｌｉｋ Ｌ，Ａｕｗｅｒｘ Ｊ，Ｂｅｒｇｅｒ ＪＰ，Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ＶＫ，Ｇｌａｓｓ ＣＫ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＦＪ，Ｇｒｉｍａｌｄｉ ＰＡ，Ｋａ－ ｄｏｗａｋｉ Ｔ，Ｌａｚａｒ ＭＡ，Ｏ’Ｒａｈｉｌｌｙ Ｓ，Ｐａｌｍｅｒ ＣＮ，Ｐｌｕｔｚｋｙ Ｊ，Ｒｅｄｄｙ ＪＫ，Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ ＢＭ，Ｓｔａｅｌｓ Ｂ，Ｗａｈｌｉ Ｗ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．ＬＸＩ．Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ．２００６ Ｄｅｃ；５８（４）：７２６－４１．
Ｍｏｈａｎ，Ｃ．，Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｈ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｊ．Ｙ．，＆ Ｌｅｅ，Ｇ．Ｍ．（２００７）．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ： ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，９８（３），６１１－６１５．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．２１４５３
Ｎｉｓｈｉｍｉｙａ，Ｄ．，Ｍａｎｏ，Ｔ．，Ｍｉｙａｄａｉ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．，＆ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．（２０１３）．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＨＯＰ ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ｉｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９７（６），２５３１－２５３９．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２５３－０１２－４３６５－９
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Ｚａｒｅｔ，Ｋ．Ｓ．，＆ Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｊ．Ｓ．（２０１１）．Ｐｉｏｎｅｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ：ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，２５（２１），２２２７－２２４１．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇａｄ．１７６８２６．１１１
Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｌｉ Ｓ，Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｓｕ Ｗ，Ｒｕａｎ Ｘ，Ｗａｎｇ Ｂ，Ｚｈｅｎｇ Ｆ，Ｗａｒｎｅｒ Ｍ，Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ＪＡ，Ｇｕａｎ Ｙ．Ａｂｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｏｍｅｇａ－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ４Ａ１４ ｇｅｎｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１７ Ｍａｒ ２１；１１４（１２）：３１８１－３１８５．

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【手続補正書】

【提出日】2021-09-03

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2022509451000001.app

【国際調査報告】