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特表2022-509615ネコインフルエンザの治療および／または予防において使用するためのスルホン化されたポリスチレン誘導体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-21
(54)【発明の名称】ネコインフルエンザの治療および／または予防において使用するためのスルホン化されたポリスチレン誘導体
(51)【国際特許分類】
A61K 31/795 20060101AFI20220114BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20220114BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20220114BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220114BHJP
A61K 31/522 20060101ALI20220114BHJP
【ＦＩ】
A61K31/795
A61P31/14
A61P31/22
A61P43/00 121
A61K31/522
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021527090
(86)(22)【出願日】2019-12-03
(85)【翻訳文提出日】2021-07-16
(86)【国際出願番号】 PL2019050071
(87)【国際公開番号】W WO2020117080
(87)【国際公開日】2020-06-11
(31)【優先権主張番号】P.428024
(32)【優先日】2018-12-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】PL
(31)【優先権主張番号】P.428583
(32)【優先日】2019-01-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】PL
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】512276474
【氏名又は名称】ユニベルシテット ヤギエロンスキ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＷＥＲＳＹＴＥＴ ＪＡＧＩＥＬＬＯＮＳＫＩ
【住所又は居所原語表記】ｕｌ． Ｇｏｌｅｂｉａ ２４， ＰＬ－３１－００７ Ｋｒａｋｏｗ， Ｐｏｌａｎｄ
(74)【代理人】
【識別番号】100091502
【弁理士】
【氏名又は名称】井出 正威
(72)【発明者】
【氏名】シノヴィエツ，アレクサンドラ
(72)【発明者】
【氏名】パショータ，マグダレナ
(72)【発明者】
【氏名】パイロク，クシシュトフ
(72)【発明者】
【氏名】ノワコウスカ，マリア
(72)【発明者】
【氏名】スズクズビアルカ，クシシュトフ
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB07
4C086FA04
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB33
4C086ZC61
4C086ZC75
(57)【要約】
本発明は、単独でまたは組み合わせ療法で、ネコインフルエンザ、特に、ネコカリシウイルスまたはネコヘルペスウイルスによって生じる感染症の治療および／または予防において使用するための、式Ｉのスルホン化されたポリスチレン誘導体に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ネコインフルエンザ、特に、ネコカリシウイルスまたはネコヘルペスウイルスによって生じる感染症の治療および／または予防において使用するための、式Ｉ：【化1】
のスルホン化されたポリスチレン誘導体（式Ｉ中、Ｍが金属陽イオンであり、ｚが１から３までの整数であり、ｎが７から６０００の範囲の整数である）。
【請求項2】
塩の形態であることを特徴とする、請求項１に記載のスルホン化されたポリスチレン誘導体。
【請求項3】
ナトリウム塩の形態であることを特徴とする、請求項２に記載のスルホン化されたポリスチレン誘導体。
【請求項4】
少なくとも１．５ｋＤａ、好ましくは少なくとも８ｋＤａの分子量を有することを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のスルホン化されたポリスチレン誘導体。
【請求項5】
８ｋＤａから１２００ｋＤａの範囲の分子量を有することを特徴とする、請求項４に記載のスルホン化されたポリスチレン誘導体。
【請求項6】
８ｋＤａ、１９．３ｋＤａ、３５ｋＤａ、４６ｋＤａ、９３．５ｋＤａ、２００ｋＤａ、４００ｋＤａ、７８０ｋＤａ、および１２００ｋＤａからなる群から選択される分子量を有することを特徴とする、請求項５に記載のスルホン化されたポリスチレン誘導体。
【請求項7】
９３．５ｋＤａまたは７８０ｋＤａの分子量を有することを特徴とする、請求項６に記載のスルホン化されたポリスチレン誘導体。
【請求項8】
ネコヘルペスウイルスがネコヘルペスウイルス１型（ＦＨＶ－１）であることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載のスルホン化されたポリスチレン誘導体。
【請求項9】
組み合わせ療法で使用するためのものであることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載のスルホン化されたポリスチレン誘導体。
【請求項10】
組み合わせ療法が、ネコインフルエンザ、特にネコカリシウイルスまたはネコヘルペスウイルスによって生じる感染症の治療のための別の作用物質の同時使用を伴うことを特徴とする、請求項９に記載のスルホン化されたポリスチレン誘導体。
【請求項11】
他の作用物質がヌクレオシド類似体であることを特徴とする、請求項１０に記載のスルホン化されたポリスチレン誘導体。
【請求項12】
ヌクレオシド類似体がアシクロビル（ＡＣＶ）および／またはペンシクロビル（ＰＣＶ）であることを特徴とする、請求項１１に記載のスルホン化されたポリスチレン誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、ネコインフルエンザ、特に、ネコカリシウイルスまたはネコヘルペスウイルスによって生じる感染症の治療および／または予防において使用するための、スルホン化されたポリスチレン誘導体、特にポリスチレンスルホン酸ナトリウムに関する。
【背景技術】
【0002】
「ネコインフルエンザ」と呼ばれるネコにおける上気道疾患（ＵＲＴＤ）は、一般的な疾患であり、その症候としては、咳、くしゃみ、鼻水、眼の発赤、発熱、または鼻および眼からの膿性分泌物の出現が含まれる［１、２］。この疾患は、動物シェルターおよび猫預かり所における主な死因の１つであると考えられている［３］。この疾患の主なウイルス性の病因的因子は、ネコヘルペスウイルス１型（ＦＨＶ－１、ＦｅＨｖ－１）およびネコカリシウイルス（ＦＣＶ）である［１、３～５］。
【0003】
ネコヘルペスウイルス１型（ＦＨＶ－１、ＦｅＨｖ－１）は、エンベロープを有するＤＮＡウイルスを包含するＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーである。ヘルペスウイルスは、ヒト、ならびに多くの動物種、すなわち哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類、および魚類に感染する病原体である［６］。ヒトで見られる最も一般的な病原体の１つは、主に顔面で生じる潰瘍の原因となる単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）であるが、身体の他の領域でも感染が可能である。ヘルペスウイルスによって生じる感染は、より重度の疾患または死亡の発生をもたらし得る［６、７］。ネコヘルペスウイルスはＨＳＶ－１に関連し、世界中でネコの集団に広がっている。ネコの集団の最大９０％がこの病原体について血清反応陽性であること、その一方で、ウイルスの８０％が潜伏状態で存在していることが推定されている［８、９］。ＦＨＶ－１感染は、上気道の炎症、粘膜の感染、ならびに眼の感染（角膜の潰瘍、急性結膜炎、および角膜炎）に主に関連しており、これらは失明をもたらし得る［１０～１３］。さらに、細菌の同時感染は命に関わる可能性があるため、子猫および免疫不全の個体にとって特に危険である。
【0004】
ネコヘルペスウイルスは主に上皮組織において複製し、急性炎症をもたらす［１３］。上皮細胞に感染した後、ウイルスは、逆行性経路によって感覚ニューロンの内部に、すなわち細胞体に向かって運ばれ、その後、潜伏状態に入る。潜在ウイルスはエピソーム形態で生じるが、これは再活性化され得、疾患は、宿主の免疫系が弱った場合に再発し得る［８、１４、１５］。
【0005】
ヒトにおけるヘルペスウイルス感染を処置するために、ヌクレオシド類似体が現在使用されている。アシクロビル、ペンシクロビル、イドクスウリジン、シドビル（ｃｉｄｏｖｉｒ）、およびビダラビンは、この群に属する。これらの分子は、ウイルスＤＮＡポリメラーゼの活性中心をブロックすることによって、ウイルスの複製を阻害する。ヌクレオシド類似体は不活性形態で細胞に送達され、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）によって行われるリン酸化の結果として活性化が生じる。次の段階では、分子の別の２つのリン酸化が、宿主のＧＭＰキナーゼによって生じる［１６、１７］。三リン酸化された化合物は、ウイルスＤＮＡポリメラーゼによって、ポリヌクレオチド鎖の伸長反応の際の基質として使用され得、誘導体がＤＮＡに組み込まれると、伸長は停止する。ヌクレオシド類似体は、宿主のポリメラーゼよりもウイルスのポリメラーゼに対して非常に高い親和性を有する［１８］。驚くべきことに、類似の疾患症候およびウイルスの系統発生学的類似性にもかかわらず、個々の薬剤の有効性プロファイルは、ヒトとネコとで異なっている。ヒトにおいて安全かつ効果的な一部の薬剤は、ネコに対して毒性である［１９～２１］。例えば、アシクロビル（ＡＣＶ）は、ヒトにおいてＨＳＶ－１ウイルスの複製の非常に効果的な阻害剤であるが、ネコにおいては、これは同様に高い活性は示さず、その生物学的利用能は低かった［２２］。バラシクロビル（ＶＣＶ）は、肝臓エステラーゼによってＡＣＶに変換される化合物であり、これもヘルペスウイルス感染を処置するためにヒトにおいて非常に多く使用されている［２３］。ＶＣＶはインビトロで抗ウイルス活性が高いにもかかわらず、この薬剤を摂取したネコは疾患の症候を改善させず、加えて、動物に死をもたらす骨髄抑制または肝臓および腎臓の壊死などの多くの副作用があった［２４］。しかし、別のアシクロビル誘導体であるペンシクロビル（ＰＣＶ）は、効果的かつ安全な解決策であると思われる［２０、２５、２６］。加えて、ＰＣＶの前駆体であるファムシクロビルが、ネコにおけるＦＨＶ感染の処置および予防において試験されており、安全であることが示されている［２７、２８］。ファムシクロビルは肝臓のアルデヒドオキシダーゼによってＰＣＶに変換され［２９、３０］、細胞に運ばれ、ＡＣＶと同様にウイルスのＴＫによってリン酸化される。次いで、別の２つのリン酸化が細胞の酵素によって行われ、ウイルスの遺伝物質のポリヌクレオチド鎖の伸長が阻害される［３１］。しかし、ネコにおけるＰＣＶの濃度は予想よりもはるかに低く、このことは、ネコにおける肝臓のアルデヒドオキシダーゼの活性が他の哺乳類におけるよりもはるかに低く、そのため、前駆体、すなわちファムシクロビルが、活性形態、すなわちＰＣＶに変換されないこととおそらく関係している［２６、２７、３２］。
【0006】
ＦＣＶは、正の極性を有する一本鎖ＲＮＡの形態の遺伝物質を含有する、エンベロープを有さないウイルスを含む、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーである。系統発生学的関係を理由として、カリシウイルスはこれまでのところ、Ｌａｇｏｖｉｒｕｓ、Ｎｅｂｏｖｉｒｕｓ、Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ、Ｓａｐｏｖｉｒｕｓ、およびＶｅｓｉｖｉｒｕｓという５つのタイプに分けられている［４５］が、２０１９年２月に、国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）は、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーの遺伝的多様性が大きいことを理由に、（前述の５つに加えて）Ｂａｖｏｖｉｒｕｓ、Ｍｉｎｏｖｉｒｕｓ、Ｎａｃｏｖｉｒｕｓ、Ｎｅｂｏｖｉｒｕｓ、Ｒｅｃｏｖｉｒｕｓ、およびＶａｌｏｖｉｒｕｓという６つの新たな属が分類されている新たな分類を定めた。この科のウイルスは、ヒトおよび動物の両方に感染することができる。この科の最も良く知られている代表的なウイルスの１つは、哺乳類において非細菌性の胃腸炎を生じさせるノロウイルスおよびサポウイルスである。ラゴウイルスは、ウサギにおいて致命的な出血熱を生じさせる。ネコにおいて、ＦＣＶは、免疫系が不全の個体にとって特に危険な上気道の炎症を生じさせることが多い［４６～４８］。ＦＣＶは、世界中のネコの集団において見られる病原体である［４５、４９］。これは通常、穏やかな結膜炎および上気道の炎症を生じさせるが、症候にはまた、潰瘍および慢性的な口内炎、流涎、ならびに稀に、急性滑膜炎を伴う跛行が含まれる［５０～５２］。ＦＣＶの遺伝物質は一本鎖ＲＮＡであり、高いゲノム多様性は、ウイルスが、変化する環境条件に非常に迅速に適応し得ることを意味する［５３］。ＦＣＶに対する比較的効果的なワクチンが存在し、感染が動物の生命を脅かすことは通常ないが、二次細菌感染は、ネコに大きな脅威を及ぼす［５４］。ここ数年、いわゆるＶＳ－ＦＣＶ（強毒全身性ＦＣＶ）に属するＦＣＶ株もネコの集団で発生していることが示されており、これらの株は、多臓器不全に関連して最大６０％の死亡率を伴う、エピデミックの原因である。文献によると、ある株は、出血熱の症候を生じさせた［４８、５５～５８］。ＦＣＶによって生じる感染の処置は、二次細菌感染を予防することを目的とした抗生物質療法にのみ基づく。現在、ＦＣＶに直接作用する治療物質は、獣医学用の医薬では使用されていない。重要なこととして、非常に高いインビトロでの抗ウイルス活性が、塩化リチウム［５９］およびメフロキン［６０］などの化合物について実証されている。残念ながら、ネコにおけるインビボでのこれらの化合物の有効性に対して、研究は行われていない［５９、６０］。さらに、インビトロでＦＣＶ感染を同様に阻害するリバビリンは、ネコに使用するには、経口投与後の毒性が強すぎる［６１］。
【0007】
上記の例は、ＦＨＶまたはＦＣＶなどのウイルスによって生じ得るネコにおける呼吸器症候群を処置および／または予防するための現在利用可能な作用物質が、効果が不十分であり、および／または毒性が強すぎることを示している。したがって、ネコにとって安全でありながら、両ウイルスの感染および伝染を効率的に低減させる、効果的な治療物質を見出すことが必要とされている。
【0008】
スルホン化されたポリスチレン誘導体が知られている。これらの抗微生物特性、特に抗ウイルス性も知られており、例えば高カリウム血症を処置するための医薬におけるこれらの使用も知られている。代表的な既知のスルホン化されたポリスチレン誘導体は、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ポリ（スチレンスルホン酸ナトリウム）、ＰＳＳＮａ）である。これは、その抗菌活性および抗ウイルス活性が知られている。これは、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを含む多くの病原体の複製を阻害することが示されている［３３～３７］。しかし、これまでのところ、ＦＣＶウイルスまたはＦＨＶ－１ウイルスによって生じる感染のケースでそれを使用できる可能性は実証されていない。ＨＳＶのケースでは、ＰＳＳＮａポリマーが、細胞表面へのビリオンの結合を防ぐことによって複製を阻害することが示されており、このことは、感染した細胞から健康な細胞へのウイルスの伝染を、より困難にする［３５］。提案された作用メカニズムが感染の初期段階における抗ウイルス活性を伴うことを考慮すると、ＰＳＳＮａがヘパラン硫酸（ＨＳ）模倣体であること、すなわち、ＰＳＳＮａが、ＨＳＶへの接着分子として機能する、感染した細胞の表面に存在するＨＳを、「模倣」し得ることを示唆している。加えて、フコサノイド（ｆｕｃｏｓａｎｏｉｄｓ）、硫酸デキストラン、および硫酸マンナンなどの他のヘパラン硫酸模倣体が、接着物質へのＨＳＶ－１ウイルスおよびＨＳＶ－２ウイルスの結合をブロックすることが示されている［３８～４１］。さらに、これもＨＳ模倣体であると考えられているＩＶ型λ－カラギーナンは、ＦＨＶ－１ウイルスに結合することができ、ＦＨＶ－１ウイルスと接着因子（ＨＳ）との相互作用がブロックされる。インビトロでのＩＶ型λ－カラギーナンの使用で得られた結果が有望なものであったという事実にもかかわらず、この化合物を含有する調製物をネコで投与した後に、健康状態の改善は見られなかった［４２］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
ネコヘルペスウイルスおよびカリシウイルス、特にＦＨＶ－１およびＦＣＶの複製の新規な阻害剤、特に、ネコヘルペスウイルスおよびネコカリシウイルスによって生じる感染症の治療および／または予防に現在利用可能なものと異なる作用メカニズムを有する、このタイプの感染のための組み合わせ療法にも適切な作用物質を得ることが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0010】
したがって、本特許出願において記載されている発明の目的は、ネコインフルエンザ、特に、ネコカリシウイルスまたはヘルペスウイルス、特にＦＨＶ－１によって生じる感染の処置および／または予防において使用するための、新規の効果的な作用物質を得ること、ネコインフルエンザ、特に、ネコカリシウイルスまたはヘルペスウイルスによって生じる感染の処置および／または予防において使用するための、このタイプの感染のための既に利用可能な治療法との組み合わせ療法において使用することができる、新規の効果的な作用物質を得ること、ならびに、このタイプの感染を処置するためのこのような調製物の使用の可能性を実証することである。
【0011】
これらの目的は、添付の特許請求の範囲で提示されている解決策で達成された。驚くべきことに、これらの目的は、スルホン化されたポリスチレン誘導体を使用して達成され得ることが分かった。
【0012】
本発明は、ネコインフルエンザ、特に、ネコカリシウイルスまたはネコヘルペスウイルスによって生じる感染症の治療および／または予防において使用するための、式Ｉ：
のスルホン化されたポリスチレン誘導体に関するものであり、式中、Ｍは金属陽イオンであり、ｚは１から３までの整数であり、ｎは７から６０００の範囲の整数である。
【化1】
のスルホン化されたポリスチレン誘導体に関するものであり、式中、Ｍは金属陽イオンであり、ｚは１から３までの整数であり、ｎは７から６０００の範囲の整数である。
【0013】
好ましくは、本発明に従って使用されるスルホン化されたポリスチレン誘導体は、塩の形態であり、さらに好ましくは、スルホン化されたポリスチレン誘導体は、ポリスチレンスルホン酸のナトリウム塩（ＰＳＳＮａ）である、ナトリウム塩の形態である。
【0014】
好ましくは、本発明に従って使用されるスルホン化されたポリスチレン誘導体は、少なくとも１．５ｋＤａ、さらに好ましくは少なくとも８ｋＤａの分子量を有する。
【0015】
さらに好ましくは、本発明に従って使用されるスルホン化されたポリスチレン誘導体は、８ｋＤａから１２００ｋＤａの範囲の分子量を有し、さらに好ましくは、当該誘導体は、８ｋＤａ、１９．３ｋＤａ、３５ｋＤａ、４６ｋＤａ、９３．５ｋＤａ、２００ｋＤａ、４００ｋＤａ、７８０ｋＤａ、および１２００ｋＤａからなる群から選択される分子量を有し、最も好ましくは、当該誘導体は、９３．５ｋＤａまたは７８０ｋＤａの分子量を有する。
【0016】
好ましくは、ネコヘルペスウイルスまたはネコカリシウイルスによって生じる感染は、ネコインフルエンザである。
【0017】
好ましくは、ネコヘルペスウイルスによって生じる感染は、ネコヘルペスウイルス１型（ＦＨＶ－１）によって生じる感染である。
【0018】
好ましくは、本発明に従うと、スルホン化されたポリスチレン誘導体は、ネコインフルエンザ、特にネコカリシウイルスまたはネコヘルペスウイルスによって生じる感染の処置のための別の作用物質の同時使用を好ましくは含む、組み合わせ療法における使用のためのものである。
【0019】
同時使用は、本明細書において、本発明の化合物を、１つの製剤または別個の製剤で、好ましくは、ネコインフルエンザ、特にネコカリシウイルスまたはネコヘルペスウイルスによって生じる感染の処置のための別の作用物質と同時に投与することを意味する。
【0020】
さらに好ましくは、ＦＨＶ－１感染を処置するためのこのような他の作用物質は、ヌクレオシド類似体、さらに好ましくは、アシクロビル（ＡＣＶ）および／またはペンシクロビル（ＰＣＶ）である。
【0021】
本発明に従ったスルホン化されたポリスチレン誘導体は、好ましくは塩の形態、特にナトリウム塩である。代表的なスルホン化されたポリスチレン誘導体は、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳＮａ）である。別のポリスチレンスルホン酸塩の例は、カルシウム塩またはカリウム塩であり得る。
【0022】
ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳＮａ）などのスルホン化されたポリスチレン誘導体は、当業者に知られている任意の方法によって調製することができる。これらの化合物は次いで、適切な薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、および／または基質と共に、医薬組成物に含まれ得る。このタイプの組成物は、例えば局所経路、鼻経路、または経口経路などの任意の投与経路による投与に適切な製剤の形態で調製することができる。このタイプの組成物は、例えば、局所製剤、例えば軟膏剤、または経口製剤、例えば溶液もしくは懸濁液の形態であり得る。
【0023】
本発明に従って使用するための化合物は、ネコインフルエンザ、特にネコカリシウイルスまたはネコヘルペスウイルスによって生じる感染の予防および／または処置を可能にし、二次感染のリスクを低減させる。本発明に従って使用するための化合物は、ネコインフルエンザ、特にネコカリシウイルスまたはネコヘルペスウイルスによって生じる感染の経過の軽減をさらに可能にする。本発明に従って使用するための化合物は、ネコインフルエンザの原因となるウイルスのインビトロでの複製をほぼ完全に阻害し、加えて、毒性が非常に低いかまたは検出不可能であるという点で、非常に効果的である。さらに、本発明に従って使用するための化合物は、ネコインフルエンザ、特にネコカリシウイルスまたはネコヘルペスウイルス、特にＦＨＶ－１によって生じる感染の組み合わせ療法において、スルホン化されたポリスチレン誘導体、特に、ポリスチレンスルホン酸のナトリウム塩と異なる作用メカニズムを特に有する、このタイプの感染を処置するために使用される少なくとも１つのさらなる作用物質と共に使用するのに適している。このタイプの感染を処置するために使用されるこのような他の作用物質の例は、ヌクレオシド類似体である。本発明に従って使用するための化合物は、ペンシクロビル（ＰＣＶ）と共に使用するのに特に適している。ポリスチレンのスルホン化誘導体およびヌクレオシド類似体のこの組み合わされた使用によって、インビボで非常に重要である相乗効果が可能となり、ＦＨＶ－１によって生じるネコインフルエンザ、特に、ネコヘルペスウイルスによって生じる感染の治療の有効性を増大させ、それにより、使用される治療物質の用量を低下させ、これらの治療物質の考えられる毒性および副作用を低減させることが可能となる。これによって、この目的のために使用される現在利用可能な治療物質に対して耐性のネコインフルエンザ、特にネコカリシウイルスによって生じる感染、またはネコヘルペスウイルスによって生じる感染を処置することも可能となる。
【0024】
本研究によって、スルホン化されたポリスチレン誘導体、好ましくはＰＳＳＮａが、感染した細胞には作用しないが、好ましくはＦＨＶ－１などのヘルペスウイルスに結合し、これによってこのウイルスの拡散をブロックし、このウイルスが原因となる感染を制限することが示された。このことから、このような誘導体は非常に効果的である。加えて、これは毒性が非常に低く、副作用を生じさせない。
【0025】
本研究はまた、ポリスチレンのスルホン化誘導体、好ましくはＰＳＳＮａが、現在市販されている作用物質と異なる抗ウイルス活性メカニズムを有することも示した。このことから、これは、相乗効果を達成するために、ネコヘルペスウイルスによって生じる感染のケースで使用される他の抗ウイルス薬との、好ましくはヌクレオシド類似体、特にアシクロビルおよび／またはペンシクロビルとの組み合わせ療法において、効果的に使用することができる。これによって、ネコヘルペスウイルスによって生じる感染のための治療の有効性を増大させること、使用される作用物質の用量を低減させること、および適切な治療的または予防的有効性を維持しながら毒性を低減させること、およびネコヘルペスウイルスの現在利用可能な治療に耐性な突然変異体によって生じる感染の効果的な処置が可能となる。
【0026】
ＦＣＶのための接着因子がシアル酸であり［６２］、その模倣体が研究対象のポリマーであるＨＳではないという事実にもかかわらず、本発明者らは、高分子量のポリスチレンスルホン酸のナトリウム塩が、Ｆ９実験株と６つの臨床株Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ５、Ｋ８、およびＫ１０との両方によって生じる、ＦＣＶによって誘発されるインビトロでの感染を効果的に阻害することを示した。阻害は感染の後期段階で主に見られるが、抗ウイルス活性は、感染の初期段階でも見られる。
【0027】
本研究はまた、使用するポリスチレンスルホン酸ナトリウムの分子量が大きいほど、ＦＣＶに対するその活性が高いことも示した。例えば、８ｋＤａの分子量を有するポリマーは、より小さい分子量を有するポリスチレンスルホン酸塩のポリマーと類似の抗ウイルス活性を有する。逆に、３５ｋＤａを超える分子量を有するポリスチレンスルホン酸塩ポリマーは、有意に高い抗ウイルス活性を示す。活性の差は、より高い分子量のＰＳＳＮａが、細胞表面へのウイルスの接着を阻害することによって、感染の初期段階においてもＦＣＶの感染プロセスを阻害するという事実に少なくとも部分的に起因する。
【0028】
本発明をここで、実施形態および図面によって説明するが、これらは、本発明の保護範囲を特許請求の範囲に規定されるものにいかなる点においても限定することを意図したものではない。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【0030】
【図2】ポリマーの分子量とＦＨＶ－１ウイルスに対するその活性との間の関係を示す図である。リアル・タイムＰＣＲを使用して、培地１ｍｌ中のウイルスＤＮＡのコピー数を決定し（図２Ａ）、その一方で、プラーク・アッセイによって、感染性ビリオンの数を決定することができた（図２Ｂ）。複製試験を、様々な分子量を有するポリマーを２０μｇ／ｍｌの濃度で使用して行った。比較群と未処置コントロールとの間の統計上有意な差の存在を判定するために、テューキーのポスト・ホック検定によってサポートされる一元配置ＡＮＯＶＡ分散分析を行った。ウイルスコントロールと統計上有意に異なっていた値には、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊：ｐ＜０．０１、＊：ｐ＜０．０５の印が付けられ、一方、統計的に異なっていなかった値には、「ｎｓ」と印が付けられた。結果は、平均±ＳＥＭで示されている。
【0031】
【0032】
【図4】ＰＳＳＮａポリマーの作用メカニズムについての研究の結果を示す図である。４つの機能試験を行って、ＰＳＳＮａポリマーによるＦＨＶ－１ウイルスの複製が阻害される段階を同定した。リアル・タイムＰＣＲを使用して、培地１ｍｌ中のウイルスＤＮＡのコピー数を決定し（図４Ａ）、その一方で、プラーク・アッセイによって、感染性ビリオンの数を決定することができた（図４Ｂ）。試験Ｉを、様々な濃度の９３．５ｋＤａの分子量を有するポリマー（図４Ｃ）および７８０ｋＤａの分子量を有するポリマー（図４Ｄ）を使用して行った。比較群と未処置ポリマーコントロールとの間の統計上有意な差の存在を判定するために、テューキーのポスト・ホック検定によってサポートされる一元配置ＡＮＯＶＡ分散分析を行った。ウイルスコントロールと統計上有意に異なっていた値には、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊：ｐ＜０．０１、＊：ｐ＜０．０５の印が付けられ、一方、統計的に異なっていなかった値には、「ｎｓ」と印が付けられた。結果は、平均±ＳＥＭで示されている。
【0033】
【図5】ＰＳＳＮａポリマーによるＣｒＦＫ細胞のＦＨＶ－１ウイルス感染の阻害の可視化を示す図である。個々のチャネルおよび３つのチャネルの組み合わせが個別に示されている。青のチャネルは細胞核を示し、赤のチャネルはＦ－アクチンであり、一方、緑のチャネルはＦＨＶ－１ビリオンである。この図は、コントロール細胞（ブランク）、ウイルスコントロール、９３．５ｋＤａのＰＳＳＮａで処置した細胞、および７８０ｋＤａのＰＳＳＮａで処置した細胞の可視化を示す。スケール・バーは１０μｍを示している。
【0034】
【図6】ＩｍａｇｅＪ ＦｉＪｉで作成された試験ＩＩ（図６Ａ）および試験ＩＩＩ（図６Ｂ）を行った後の共焦点顕微鏡で得られた画像の定量分析を示す図である。細胞当たりのウイルス量は、細胞当たりのカウント数（ウイルスコントロールについて得られた平均に対する％）として示されている。結果は、平均±ＳＥＭで示されている。データは、１０の異なる細胞の分析から得たものである。画像は、３つの独立した実験から得たものである。比較群間の統計上有意な差の存在を判定するために、テューキーのポスト・ホック検定によってサポートされる一元配置ＡＮＯＶＡ分散分析を行った。ウイルスコントロールと統計上有意に異なっていた値には、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１の印が付けられ、一方、統計的に異なっていなかった値には、「ｎｓ」と印が付けられた。結果は、平均±ＳＥＭで示されている。
【0035】
【図7】ポリマー濃度とＦＨＶ－１ Ｋ７臨床株に対するその活性との間の関係を示す図である。培養培地１ｍｌ当たりのウイルスＤＮＡの数における対数変化（図７Ａ）を、リアル・タイムＰＣＲによって決定し、その一方で、プラーク・アッセイによって、感染性ビリオンにおける対数変化を決定することができた（ＰＦＵ／ｍｌ）（図７Ｂ）。試験は、２つの異なる分子量（９３．５ｋＤａおよび７８０ｋＤａ）を有するＰＳＳＮａポリマーを３つの異なる濃度（２０、２００、および５００μｇ／ｍｌ）で使用して行った。値は、ウイルスコントロール、すなわち、ポリマーとインキュベートされていない感染細胞に対して正規化された。結果は、平均±ＳＥＭで示されている。
【0036】
【図8】共焦点面当たりのカウント（ビリオン）数として示されている、ＦＨＶ－１ウイルスに結合するＰＳＳＮａポリマーの能力の分析を示す図である。カウント数は、各サンプルについて１２の面から登録した。所与のデータがパラメトリック検定を使用するための要件を満たさなかったことを理由に、ダンのポスト・ホック検定によってサポートされる非パラメトリックなクラスカル・ウォリス検定を行った。ウイルスコントロールと統計上有意に異なっていた値には、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊：ｐ＜０．０１の印が付けられ、一方、統計的に異なっていなかった値には、「ｎｓ」と印が付けられた。結果は、中央値±四分位範囲で示された。
【0037】
【図9】ポリマーの分子量とその抗ＦＣＶ活性との間の関係を示す図である。リアル・タイムＲＴ－ｑＰＣＲ反応を使用して、培地１ｍｌ中のウイルスＲＮＡのコピー数を決定し（図９Ａ）、その一方で、プラーク・アッセイによって、感染性ビリオンの数を決定することができた（図９Ｂ）。試験は、様々な分子量を有するポリマーを２００μｇ／ｍｌの濃度で使用して行った。比較群と未処置ポリマーコントロールとの間の統計上有意な差の存在を判定するために、テューキーのポスト・ホック検定によってサポートされる一元配置ＡＮＯＶＡ分散分析を行った。互いのウイルスコントロールと統計上有意に異なっていた値には、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、＊＊：ｐ＜０．０１、＊：ｐ＜０．０５の印が付けられ、一方、統計的に異なっていなかった値には、「ｎｓ」と印が付けられた。結果は、平均±ＳＥＭで示されている。
【0038】
【0039】
【図11】ＰＳＳＮａポリマーの作用メカニズムについての試験の結果を示す図である。ＦＣＶ感染がＰＳＳＮａポリマーによって阻害される段階を同定するために、２００μｇ／ｍｌの濃度のポリマーを使用して、以下に記載する４つの機能試験を行った。リアル・タイムＲＴ－ｑＰＣＲ反応を使用して、培地１ｍｌ中のウイルスＲＮＡのコピー数を決定し（図１１Ａ）、その一方で、プラーク・アッセイによって、感染性ビリオンの数を決定することができた（図１１Ｂ）。試験ＩＩＩは、様々な濃度の９３．５ｋＤａの分子量を有するポリマー（図１１Ｃ）および７８０ｋＤａの分子量を有するポリマーを使用して行った（図１１Ｄ）。比較群と未処置ポリマーコントロールとの間の統計上有意な差の存在を判定するために、テューキーのポスト・ホック検定によってサポートされる一元配置ＡＮＯＶＡ分散分析を行った。ウイルスコントロールと統計上有意に異なっていた値には、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊：ｐ＜０．０１の印が付けられ、一方、統計的に異なっていなかった値には、「ｎｓ」と印が付けられた。結果は、平均±ＳＥＭで示されている。
【0040】
【図12】１０００μｇ／ｍｌの濃度のＰＳＳＮａポリマーによる、ＣｒＦＫ細胞のＦＣＶ感染の阻害の可視化を示す図である。個々のチャネルおよび３つのチャネルの組み合わせが個別に示されている。青のチャネルは細胞核を示し、赤のチャネルはＦ－アクチンであり、一方、緑のチャネルはＦＣＶビリオンである。この図は、コントロール細胞、ウイルスコントロール、９３．５ｋＤａの分子量を有するＰＳＳＮａで処置された細胞、および７８０ｋＤａの分子量を有するＰＳＳＮａで処置された細胞の可視化を示す。スケール・バーは１０μｍを示している。
【0041】
【図13】ＩｍａｇｅＪ ＦｉＪｉで作成された試験ＩＩ（Ａ）および試験ＩＩＩ（Ｂ）を行った後の共焦点顕微鏡で得られた画像の定量分析を示す図である。細胞当たりのウイルス量は、細胞当たりのカウント数（ウイルスコントロールについて得られた平均に対する％）として示されている。結果は、平均±ＳＥＭで示されている。データは、１０の異なる細胞の分析から得たものである。画像は、３つの独立した実験から得たものであった。比較群間の統計上有意な差の存在を判定するために、テューキーのポスト・ホック検定によってサポートされる一元配置ＡＮＯＶＡ分散分析を行った。ウイルスコントロールと統計上有意に異なっていた値には、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１の印が付けられ、一方、統計的に異なっていなかった値には、「ｎｓ」と印が付けられた。
【0042】
【図14】ポリマー濃度とＦＣＶ臨床株に対するその活性との間の関係を示す図である。リアル・タイムＲＴ－ｑＰＣＲ反応を使用して、培養培地１ｍｌ当たりのウイルスＲＮＡの数を決定し、一方、プラーク・アッセイによって、感染性ビリオンの数を決定することができた。試験は、２つの異なる分子量（９３．５ｋＤａおよび７８０ｋＤａ）を有するポリマーを３つの異なる濃度（２００、５００、および１０００μｇ／ｍｌ）で使用して行った。値は、ウイルスコントロール、すなわち、ポリマーとインキュベートされていない感染細胞に対して正規化された。結果は、平均±ＳＥＭで示されている。
【0043】
【図15】共焦点面当たりのカウント（ビリオン）数として示されている、ウイルスに結合するＰＳＳＮａポリマーの能力の分析を示す図である。カウントは、各サンプルについて１２の面から行われた。所与のデータがパラメトリック検定を使用するための要件を満たさなかったことを理由に、ダンのポスト・ホック検定によってサポートされる非パラメトリックなクラスカル・ウォリス検定を行った。ウイルスコントロールと統計上有意に異なっていた値には、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、＊＊：ｐ＜０．０１の印が付けられ、一方、統計的に異なっていなかった値には、「ｎｓ」と印が付けられた。結果は、中央値±四分位範囲で示された。
【0044】
【図16】ＰＳＳＮａ－ＰＥＧヒドロゲルの抗ウイルス活性のインビトロでの分析を示す図である。１００、５０、４０、３０、２５、２０、１５、および１０ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＥＧ４００の細胞傷害性を、ＸＴＴ試験によって判定した（Ａ）。結果は、１００％であるコントロール細胞（ポリマーで処置されていない）に対して正規化した。ウイルス複製アッセイを、ＦＨＶ－１（Ｂ、Ｃ）およびＦＣＶ（Ｄ、Ｅ）について、ＰＥＧ４００（３０ｍｇ／ｍｌ）およびＰＳＳＮａ１０００ｋＤａ（２００μｇ／ｍｌ）の存在下で、ＣｒＦＫ細胞を使用して行った。ウイルス感染の阻害はリアル・タイムＰＣＲによって判定し、１ミリリットル当たりのＤＮＡ（ＦＨＶ－１について）もしくはＲＮＡ（ＦＣＶについて）のコピー数における対数変化として示し（Ｂ、Ｄ）、またはプラーク・アッセイを使用して、ＰＦＵ／ｍｌの数値における対数変化として示した（Ｃ、Ｅ）。結果を、ウイルスコントロール、すなわち、ポリマーで処置されていない感染細胞に対して正規化し、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭで示した。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【0045】
以下に記載する全ての試験および実験手順は、別段のことが明らかに示されていない限り、市販されている試験キット、試薬、および器具を、使用されるキット、試薬、および器具の製造者の推奨に従って使用して行った。上記で示された試験パラメータは、本発明が属する技術分野において使用される標準的な一般的に知られている方法を使用して測定した。
【実施例1】
【0046】
ＣｒＦＫ細胞の生存に対する、様々な分子量のポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳＮａ）の効果
ポリマーの細胞傷害性を、ＸＴＴ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）を使用して決定したが、このキットは、代謝活性細胞の、基質をその着色された誘導体に変換する能力を定量するものである。許容状態のＣｒＦＫ細胞系（Ｃｒａｎｄｅｌｌ－Ｒｅｅｓネコ腎皮質、Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ、Ｃｒａｎｄｅｌｌ－Ｒｅｅｓ Ｆｅｌｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ Ｃｅｌｌｓ、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－９４（商標））を使用して、実験を行った。試験条件は標準的なものであった。細胞を、３％ＦＢＳ（熱不活化型ウシ胎児血清）、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、および様々な分子量を有するＰＳＳＮａポリマーを添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）培地において、４８時間培養した。図１は、２つの選択されたポリマー濃度：５００μｇ／ｍｌ（図１Ａ、試験した最高濃度）および２０μｇ／ｍｌ（図１Ｂ、高い抗ウイルス活性が示された濃度）についての結果を示す。簡潔に述べると、９６ウェル・プレートにおいてＣｒＦＫ細胞を２４時間培養した後、古い培地を除去し、選択されたポリマー濃度を含有する１００μｌの新鮮な培地を、プレートの各ウェルに添加した。コントロールサンプルは、培地中にポリマーを含有していなかった。ポリマー培地を次いで除去し、２０μｌの活性化型２，３－ビス－（２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルフェニル）－（２Ｈ）－テトラゾリンカルボキシアニリド（ＸＴＴ）を有する新鮮な培地１００μｌを、各ウェルに添加した。２時間インキュベートした後、上清を透明な９６ウェル・プレートに移し、４８０ｎｍでの吸光度を、分光光度計を使用して標準的な様式で測定した。得られた結果の値を、１００％生存値に指定されたコントロール細胞（ポリマーを有さない）について測定された吸光度に対して正規化した。様々な分子量を有する１１のＰＳＳＮａポリマーを試験した（１．５、５．４、８、１９．３、３５、４６、９３．５、２００、４００、７８０、および１２００ｋＤａ）。
ポリマーの細胞傷害性を、ＸＴＴ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）を使用して決定したが、このキットは、代謝活性細胞の、基質をその着色された誘導体に変換する能力を定量するものである。許容状態のＣｒＦＫ細胞系（Ｃｒａｎｄｅｌｌ－Ｒｅｅｓネコ腎皮質、Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ、Ｃｒａｎｄｅｌｌ－Ｒｅｅｓ Ｆｅｌｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ Ｃｅｌｌｓ、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－９４（商標））を使用して、実験を行った。試験条件は標準的なものであった。細胞を、３％ＦＢＳ（熱不活化型ウシ胎児血清）、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、および様々な分子量を有するＰＳＳＮａポリマーを添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）培地において、４８時間培養した。図１は、２つの選択されたポリマー濃度：５００μｇ／ｍｌ（図１Ａ、試験した最高濃度）および２０μｇ／ｍｌ（図１Ｂ、高い抗ウイルス活性が示された濃度）についての結果を示す。簡潔に述べると、９６ウェル・プレートにおいてＣｒＦＫ細胞を２４時間培養した後、古い培地を除去し、選択されたポリマー濃度を含有する１００μｌの新鮮な培地を、プレートの各ウェルに添加した。コントロールサンプルは、培地中にポリマーを含有していなかった。ポリマー培地を次いで除去し、２０μｌの活性化型２，３－ビス－（２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルフェニル）－（２Ｈ）－テトラゾリンカルボキシアニリド（ＸＴＴ）を有する新鮮な培地１００μｌを、各ウェルに添加した。２時間インキュベートした後、上清を透明な９６ウェル・プレートに移し、４８０ｎｍでの吸光度を、分光光度計を使用して標準的な様式で測定した。得られた結果の値を、１００％生存値に指定されたコントロール細胞（ポリマーを有さない）について測定された吸光度に対して正規化した。様々な分子量を有する１１のＰＳＳＮａポリマーを試験した（１．５、５．４、８、１９．３、３５、４６、９３．５、２００、４００、７８０、および１２００ｋＤａ）。
【0047】
得られた結果は、試験された分子量範囲および試験された濃度範囲、すなわち、２０μｇ／ｍｌから５００μｇ／ｍｌのポリマーにおいて細胞傷害性が著しく欠如していることを示している。
【実施例2】
【0048】
ネコヘルペスウイルス１型（ＦＨＶ－１）の複製に対するポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳＮａ）の効果
ネコヘルペスウイルス１型（株Ｃ－２７、ＡＴＣＣ：ＶＲ－６３６）に対するポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳＮａ）の活性を決定するために、ウイルス複製に対するこのポリマーの効果についての試験を行った。この実験において、ポリマーは、ウイルス複製の全ての段階、すなわち、感染の前、最中、および後で存在していた。簡潔に述べると、完全にコンフルエントなＣｒＦＫ細胞を、実験の２４時間前に、９６ウェル・プレートに播種した。次いで、培地を廃棄し、ポリマーを含有する２０μｌの新鮮な培地を添加した。プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、ポリマーを有する培地を廃棄し、ブランクまたはＴＣＩＤ５０力価（５０％組織培養感染量）＝４００／ｍｌのＦＨＶ－１ウイルス（株Ｃ－２７）を添加した、３％ＤＭＥＭ中のポリマー溶液、またはポリマーを有さない３％ＤＭＥＭ（コントロールサンプル）５０μｌを添加した。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、次いで、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄して、未結合のウイルス粒子を除去した。最後に、３％ＤＭＥＭ中のポリマー溶液１００μｌを各ウェルに添加し、細胞を４８時間インキュベートした。この時間の後、上清を回収して、以下の通りに、（ａ）定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）および（ｂ）プラーク・アッセイを使用して感染を定量した。
ネコヘルペスウイルス１型（株Ｃ－２７、ＡＴＣＣ：ＶＲ－６３６）に対するポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳＮａ）の活性を決定するために、ウイルス複製に対するこのポリマーの効果についての試験を行った。この実験において、ポリマーは、ウイルス複製の全ての段階、すなわち、感染の前、最中、および後で存在していた。簡潔に述べると、完全にコンフルエントなＣｒＦＫ細胞を、実験の２４時間前に、９６ウェル・プレートに播種した。次いで、培地を廃棄し、ポリマーを含有する２０μｌの新鮮な培地を添加した。プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、ポリマーを有する培地を廃棄し、ブランクまたはＴＣＩＤ５０力価（５０％組織培養感染量）＝４００／ｍｌのＦＨＶ－１ウイルス（株Ｃ－２７）を添加した、３％ＤＭＥＭ中のポリマー溶液、またはポリマーを有さない３％ＤＭＥＭ（コントロールサンプル）５０μｌを添加した。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、次いで、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄して、未結合のウイルス粒子を除去した。最後に、３％ＤＭＥＭ中のポリマー溶液１００μｌを各ウェルに添加し、細胞を４８時間インキュベートした。この時間の後、上清を回収して、以下の通りに、（ａ）定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）および（ｂ）プラーク・アッセイを使用して感染を定量した。
【0049】
（ａ）ｑＰＣＲ
ウイルスＤＮＡの単離を、製造者によって提供されるプロトコルに従って、Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａ＆Ａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ポーランド）での単離試験を使用して、感染の４８時間後に行った。こうして単離されたＤＮＡを、リアル・タイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行うための鋳型とした。糖タンパク質Ｂの遺伝子配列の保存された断片を増幅するための当技術分野において知られているプライマー、およびこの断片に相補的なプローブを使用した［４３］。使用したプライマーおよびプローブの配列を、表１に示す。
ウイルスＤＮＡの単離を、製造者によって提供されるプロトコルに従って、Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａ＆Ａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ポーランド）での単離試験を使用して、感染の４８時間後に行った。こうして単離されたＤＮＡを、リアル・タイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行うための鋳型とした。糖タンパク質Ｂの遺伝子配列の保存された断片を増幅するための当技術分野において知られているプライマー、およびこの断片に相補的なプローブを使用した［４３］。使用したプライマーおよびプローブの配列を、表１に示す。
【0050】
【表1】
【0051】
簡潔に述べると、ｑＰＣＲ反応を以下の通りに行った。２．５μｌの単離されたウイルスＤＮＡを、１×Ｋａｐａ Ｐｒｏｂｅ Ｆａｓｔ ｑＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ混合物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ポーランド）、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）および６－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）（５’－ＦＡＭ－ＴＡＴ ＡＴＧ ＴＧＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＣＴ ＴＣＡ ＧＧＡ ＴＣＴ ＡＣＴ ＧＴＣ ＧＴ－ＴＡＭＲＡ－３’）で標識された特異的プローブ１００ｎＭ、ならびに４５０ｎＭの各スターター（５’－ＡＧＡ ＧＧＣ ＴＡＡ ＣＧＧ ＡＣＣ ＡＴＣ ＧＡ－３’および５’－ＧＣＣ ＣＧＴ ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＣＴ ＡＡＡ Ｃ－３’）を含有する反応物１０μｌにおいて増幅した。上記の特異的プローブおよびプライマーでＦＨＶ－１糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）遺伝子の８１ｂｐの配列断片を増幅して、サンプル中のウイルスＤＮＡのコピー数を測定した［４３］。反応は、以下の条件下で、サーモサイクラー（ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｒｅａｌ－１９７ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において行った：９５℃で３分、次いで、９５℃で１５秒および５８℃で３０秒を３９サイクル。
【0052】
適切な標準を、サンプル中のウイルスＤＮＡのコピー数を評価するために調製した。ｇＢ配列断片を、上記のプライマーを使用して増幅した。こうして得られたＤＮＡを、ＩｎｓＴＡｃｌｏｎｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ポーランド）を使用して、ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔプラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ポーランド）にクローニングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０株（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ポーランド）の形質転換、およびプラスミドベクターの増殖を、標準的な様式で行った。プラスミドを次いで、ＧｅｎｅＪＥＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ポーランド）を使用して精製し、ＫｐｎＩ制限酵素での消化によって線状化した。線状化されたＤＮＡの濃度を分光光度測定によって評価し、培地１ｍｌ中のＤＮＡのコピー数を計算した。８回の連続的な１０倍連続希釈物を、リアル・タイムＰＣＲのための鋳型として使用した。ＦＨＶ－１ウイルスの複製を阻害するポリマーの能力を、培地１ｍｌ中のウイルスＤＮＡのコピー数の減少として決定した。
【0053】
ｂ）プラーク・アッセイ
感染性ＦＨＶ－１ビリオンの定量分析を、２４ウェル・プレートに播種したＣｒＦＫ細胞で行った。８０～９０％コンフルエントな細胞を、新鮮な、上清の１０倍連続希釈物を添加することによって、プレートに播種してから２４時間感染させ、その後、細胞を、５％ＣＯ２を含有する雰囲気下で、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄して、未結合のウイルス粒子を除去し、１０％熱不活化型ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ポーランド）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、および１％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ポーランド）を添加したＤＭＥＭ培地０．５ｍｌをアプライした。ＦＨＶ－１ウイルスがプラークを形成するまでにかかった時間は、約７２時間である。この時間の後、細胞を固定し、５０％（ｖ／ｖ）のメタノール：水に溶解した０．１％クリスタル・バイオレット溶液で染色した。プラークをカウントし、得られた値を、培地１ｍｌ当たりのＰＦＵ（プラーク形成単位）としてプロットした。
感染性ＦＨＶ－１ビリオンの定量分析を、２４ウェル・プレートに播種したＣｒＦＫ細胞で行った。８０～９０％コンフルエントな細胞を、新鮮な、上清の１０倍連続希釈物を添加することによって、プレートに播種してから２４時間感染させ、その後、細胞を、５％ＣＯ２を含有する雰囲気下で、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄して、未結合のウイルス粒子を除去し、１０％熱不活化型ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ポーランド）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、および１％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ポーランド）を添加したＤＭＥＭ培地０．５ｍｌをアプライした。ＦＨＶ－１ウイルスがプラークを形成するまでにかかった時間は、約７２時間である。この時間の後、細胞を固定し、５０％（ｖ／ｖ）のメタノール：水に溶解した０．１％クリスタル・バイオレット溶液で染色した。プラークをカウントし、得られた値を、培地１ｍｌ当たりのＰＦＵ（プラーク形成単位）としてプロットした。
【0054】
この方式で、ポリマーの分子量とＦＨＶ－１ウイルスに対するその活性との間の関係を調べた。培地１ｍｌ中のウイルスＤＮＡのコピー数を、定量リアル・タイムＰＣＲによって決定し、その一方で、プラーク・アッセイによって、感染性ビリオンの数を決定することができた。図２に示すように、複製試験は、異なる分子量および２０μｇ／ｍｌの濃度を有するポリマーを使用して行った。得られた数値結果を正規化し、ウイルスコントロールに対する対数変化として示した。
【0055】
行った研究は、試験されたポリマーが抗ウイルス活性を有し、ＦＨＶ－１ウイルスの複製を阻害することを示した。抗ウイルス活性とポリマーの分子量との間の相関はなかった。しかし、８ｋＤａを超える分子量を有するポリマーが最良の抗ウイルス活性を示したことが観察された。８ｋＤａ未満の分子量を有するポリマーは、より弱い抗ウイルス活性を示した。
【実施例3】
【0056】
ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳＮａ）の抗ウイルス活性と培地中のその濃度との間の関係
ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳＮａ）のＩＣ５０（５０％阻害濃度、ウイルス複製の５０％阻害）を決定するために、ウイルス複製に対する様々な濃度のこのポリマーの効果を試験した。この試験は、実施例２と類似の方法で行った。ポリマー濃度とＦＨＶ－１ウイルスに対するその活性との間の関係を調べた。
ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳＮａ）のＩＣ５０（５０％阻害濃度、ウイルス複製の５０％阻害）を決定するために、ウイルス複製に対する様々な濃度のこのポリマーの効果を試験した。この試験は、実施例２と類似の方法で行った。ポリマー濃度とＦＨＶ－１ウイルスに対するその活性との間の関係を調べた。
【0057】
簡潔に述べると、培地１ｍｌ中のウイルスＤＮＡのコピー数をリアル・タイムＰＣＲによって決定し（図３Ａ、図３Ｂ）、その一方で、プラーク試験によって、感染性ビリオンの数を決定することができた（図３Ｃ、図３Ｄ）。複製試験を、様々な濃度の９３．５ｋＤａの分子量（図３Ａ、図３Ｃ）および７８０ｋＤａの分子量（図３Ｂ、図３Ｄ）を有するポリマーを使用して行った。値は、ウイルスコントロールに対して正規化されている。
【0058】
計算されたＩＣ５０値を以下の表２に示す。
【0059】
【表2】
【0060】
試験されたポリマーは、特に、低い無毒の濃度で、ＦＨＶ－１ウイルスの複製を阻害することが示された。
【実施例4】
【0061】
ＰＳＳＮａポリマーの抗ウイルス作用のメカニズムの決定
ＰＳＳＮａポリマーの作用メカニズムを、以下の通りに研究した。ＦＨＶ－１ウイルスの複製がＰＳＳＮａポリマーによって阻害される段階を同定するために、以下に記載する４つの機能試験を行った。
ＰＳＳＮａポリマーの作用メカニズムを、以下の通りに研究した。ＦＨＶ－１ウイルスの複製がＰＳＳＮａポリマーによって阻害される段階を同定するために、以下に記載する４つの機能試験を行った。
【0062】
試験Ｉ（不活化試験）
濃縮ウイルス懸濁液をポリマーと２２℃で１時間、振とうしながらインキュベートし、次いで、サンプルを希釈して、ポリマー濃度を、それが活性であった濃度範囲下まで低減させ、ウイルスの力価を、プラーク・アッセイを使用して評価した。
濃縮ウイルス懸濁液をポリマーと２２℃で１時間、振とうしながらインキュベートし、次いで、サンプルを希釈して、ポリマー濃度を、それが活性であった濃度範囲下まで低減させ、ウイルスの力価を、プラーク・アッセイを使用して評価した。
【0063】
この試験によって、細胞の感染を予防する、ポリマーとウイルスとの間の相互作用を介して、阻害が生じるかどうかを判定することができる。換言すると、試験化合物がウイルスに対する直接的な効果を有するかどうかを判定することができる。
【0064】
試験ＩＩ（細胞防御試験）
実験の２４時間前に播種した細胞を、ポリマーの存在下または不存在下で、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを次いで１×ＰＢＳで２回洗浄して、未結合のポリマー粒子を除去し、その後、偽サンプルまたはウイルス（４００ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を有する新鮮な培地を等容積で各ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。プレートを次いで１×ＰＢＳで２回洗浄して、未結合のウイルス粒子を除去し、新鮮な培地を細胞にアプライし、３７℃で４８時間インキュベートした。最後に、上清を回収し、プラーク・アッセイおよびｑＰＣＲを使用してウイルス複製を定量した。
実験の２４時間前に播種した細胞を、ポリマーの存在下または不存在下で、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを次いで１×ＰＢＳで２回洗浄して、未結合のポリマー粒子を除去し、その後、偽サンプルまたはウイルス（４００ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を有する新鮮な培地を等容積で各ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。プレートを次いで１×ＰＢＳで２回洗浄して、未結合のウイルス粒子を除去し、新鮮な培地を細胞にアプライし、３７℃で４８時間インキュベートした。最後に、上清を回収し、プラーク・アッセイおよびｑＰＣＲを使用してウイルス複製を定量した。
【0065】
この試験は、ポリマーが、例えば細胞表面への結合によってエントリー受容体との相互作用を防ぐことで、細胞を感染から「防御」し得るかどうかを判定する。
【0066】
試験ＩＩＩ（接着試験）
この試験は、細胞内輸送が阻害される４℃で行った。簡潔に述べると、コンフルエントなＣｒＦＫ細胞を４℃で２０分間冷却した。次いで、ウイルス（４００ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を有するまたは有さない、およびポリマーを有するまたは有さない、冷たい新鮮な培地を、細胞にアプライした。プレートを４℃で１時間インキュベートした。細胞内輸送はこの温度で停止したが、細胞受容体へのウイルスの吸着は可能であった。インキュベーションした後、細胞を、氷冷した１×ＰＢＳで２回洗浄して、未結合のウイルス粒子および未結合のポリマーを除去し、新鮮な培地を添加し、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、上清を回収し、ｑＰＣＲおよびプラーク・アッセイを使用してウイルスを定量した。
この試験は、細胞内輸送が阻害される４℃で行った。簡潔に述べると、コンフルエントなＣｒＦＫ細胞を４℃で２０分間冷却した。次いで、ウイルス（４００ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を有するまたは有さない、およびポリマーを有するまたは有さない、冷たい新鮮な培地を、細胞にアプライした。プレートを４℃で１時間インキュベートした。細胞内輸送はこの温度で停止したが、細胞受容体へのウイルスの吸着は可能であった。インキュベーションした後、細胞を、氷冷した１×ＰＢＳで２回洗浄して、未結合のウイルス粒子および未結合のポリマーを除去し、新鮮な培地を添加し、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、上清を回収し、ｑＰＣＲおよびプラーク・アッセイを使用してウイルスを定量した。
【0067】
この試験によって、接着物質についてのポリマーとウイルスとの競合を介して阻害が生じるかどうか、および／または、接着物質と相互作用しているポリマーが、接着物質とウイルスとの相互作用を防ぐかどうかを判定することができる。
【0068】
試験ＩＶ（後期段階の試験：複製、アセンブリ、および放出）
この試験において、細胞をウイルスとインキュベートすることによって感染をまず生じさせ、次いで、インキュベーションの後、未結合のビリオンをＰＢＳ溶液で洗い流し、ポリマーをアプライした。簡潔に述べると、非感染性の偽サンプルまたはウイルスサンプル（４００ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を等容積で含有する新鮮な培地を、コンフルエントなＣｒＦＫ細胞にアプライし、次いで、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの後、ウェルを１×ＰＢＳで２回洗浄して、未結合のウイルス粒子を除去し、次いで、選択されたポリマー濃度を含有する新鮮な培地を、各ウェルに添加した。プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、上清を回収し、次いで、ＰＢＳを個別にウェルに添加し、細胞を２回の凍結融解サイクルにかけて細胞溶解物を得、プラーク・アッセイおよびｑＰＣＲを使用してウイルス複製を定量した。
この試験において、細胞をウイルスとインキュベートすることによって感染をまず生じさせ、次いで、インキュベーションの後、未結合のビリオンをＰＢＳ溶液で洗い流し、ポリマーをアプライした。簡潔に述べると、非感染性の偽サンプルまたはウイルスサンプル（４００ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を等容積で含有する新鮮な培地を、コンフルエントなＣｒＦＫ細胞にアプライし、次いで、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの後、ウェルを１×ＰＢＳで２回洗浄して、未結合のウイルス粒子を除去し、次いで、選択されたポリマー濃度を含有する新鮮な培地を、各ウェルに添加した。プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、上清を回収し、次いで、ＰＢＳを個別にウェルに添加し、細胞を２回の凍結融解サイクルにかけて細胞溶解物を得、プラーク・アッセイおよびｑＰＣＲを使用してウイルス複製を定量した。
【0069】
この試験は、ウイルスの複製の阻害が、感染の後期段階、例えば、複製、アセンブリ、放出の段階で生じるかどうかを示す。一方、上清および細胞溶解物におけるウイルス力価の個別の決定によって、阻害がウイルス複製の段階で生じるか感染性ビリオンの放出の段階で生じるかを判定することができる。
【0070】
上記の試験において、培地１ｍｌ中のウイルスＤＮＡのコピー数をリアル・タイムＰＣＲによって決定し（図４Ａ）、その一方で、プラーク・アッセイによって、ビリオンの数を決定することができた（図４Ｂ）。試験Ｉは、様々な濃度の９３．５ｋＤａのＰＳＳＮａ（図４Ｃ）および７８０ｋＤａのＰＳＳＮａ（図４Ｄ）を使用して行った。
【0071】
行った研究は、ポリマーがウイルスと直接相互作用することを示し、この相互作用によって、ＣｒＦＫ細胞へのウイルスの侵入が予防される。ポリマー濃度が高いほど、ＦＨＶ－１の結合におけるその有効性が大きいことも示された。非常に強力な感染阻害は接着段階でも見ることができるが、この試験の間にポリマーおよびウイルスが培養培地に同時に存在し、このことによって、ポリマーがウイルスに結合することができ、ウイルスの内在化する能力を阻害することは、注目に値する。抗ウイルス活性はまた、感染の後期段階でも見ることができるが、これは、培地中に存在する子孫ビリオンとポリマーとの相互作用に関連するものであり、第２の独立した作用メカニズムの可能性は、追加の実験によって排除された。
【実施例5】
【0072】
共焦点顕微鏡法による、２つの選択されたＰＳＳＮａポリマーによるネコヘルペスウイルス１型の複製の阻害の可視化
スライドを調製するために、ＣｒＦＫ細胞を、実験の２４時間前に、標準的な様式で顕微鏡スライドに播種した。細胞を次いで冷却し、４℃で１時間、標準的な様式で、ウイルスの存在下またはウイルスおよびポリマーの存在下でインキュベートした。所定のインキュベーション時間の後、未結合のウイルス粒子を洗い流し、調製物を固定し、標準的な様式で染色した。免疫蛍光染色のために、マウス抗ＦＨＶ－１一次抗体、および蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８にコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体を使用してビリオンを可視化し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートしたファロイジンを使用してＦ－アクチン・フィラメントを染色し、４’，６’－ジアミジン－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を使用して核ＤＮＡを染色した。最大の投影画が示されている。
スライドを調製するために、ＣｒＦＫ細胞を、実験の２４時間前に、標準的な様式で顕微鏡スライドに播種した。細胞を次いで冷却し、４℃で１時間、標準的な様式で、ウイルスの存在下またはウイルスおよびポリマーの存在下でインキュベートした。所定のインキュベーション時間の後、未結合のウイルス粒子を洗い流し、調製物を固定し、標準的な様式で染色した。免疫蛍光染色のために、マウス抗ＦＨＶ－１一次抗体、および蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８にコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体を使用してビリオンを可視化し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートしたファロイジンを使用してＦ－アクチン・フィラメントを染色し、４’，６’－ジアミジン－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を使用して核ＤＮＡを染色した。最大の投影画が示されている。
【0073】
図５は、ＰＳＳＮａポリマーによるＣｒＦＫ細胞のＦＨＶ－１ウイルス感染の阻害の可視化を示す。各々の色についてのシグナルが個別に（青、赤、および緑のチャネル）、ならびに３つ全ての色素についてのシグナルの組み合わせ（組み合わせチャネル）が示されている。細胞核は青で、Ｆ－アクチンは赤で、およびＦＨＶ－１ビリオンは緑で示されている。この図は、コントロール細胞（偽サンプル）、ウイルスコントロール、９３．５ｋＤａのＰＳＳＮａで処置した細胞、および７８０ｋＤａのＰＳＳＮａで処置した細胞の可視化を示している。スケール・バーは１０μｍに対応している。
【0074】
顕微鏡による可視化は、試験されたＰＳＳＮａポリマーの存在下での、ＣｒＦＫ細胞上のＦＨＶ－１ビリオンの数の有意な減少を示している。この研究によって、ネコヘルペスウイルスによって生じる感染に対するスルホン化されたポリスチレン誘導体の有効性が確認される。
【実施例6】
【0075】
スルホン化されたポリスチレン誘導体およびヌクレオシド類似体の相乗効果の評価
代表的なスルホン化されたポリスチレン誘導体であるＰＳＳＮａと、異なる抗ウイルス活性メカニズムを有する典型的なヌクレオシド類似体、すなわち、アシクロビル（ＡＣＶ）およびペンシクロビル（ＰＣＶ）との相乗効果は、既知の様式を一部変更して研究した［４４］。この実験は、２つの系で行った。１つの系は、一定濃度のＰＳＳＮａ（化合物ＩＩ）および様々な濃度の対応する試験用ヌクレオシド類似体（化合物Ｉ）を使用し、一方、他の系は、一定濃度の対応する試験用ヌクレオシド類似体（化合物ＩＩ）および様々な濃度のＰＳＳＮａ（化合物Ｉ）を使用した。簡潔に述べると、ＸＴＴ試験を上記のようにまず行って、薬物に関連する毒性を排除し、次いで、ウイルスの複製試験を上記のように行って、ＡＣＶおよびＰＣＶについての、４００ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＦＨＶ－１株Ｃ－２７に対するＩＣ５０値を決定する（ｑＰＣＲを使用する）。次いで、２つのタイプの連続希釈物を調製して、ＡＣＶ／ＰＣＶと７８０ｋＤａの分子量を有するＰＳＳＮａポリマー（ＰＳＳＮａ７８０）との相乗効果を評価した：（１）化合物ＩＩのＩＣ５０に等しい濃度の化合物ＩＩと混合した、化合物ＩのＩＣ５０に等しい濃度から開始した化合物Ｉの６回の２倍連続希釈物、（２）化合物ＩのＩＣ５０に等しい濃度の化合物Ｉと混合した、化合物ＩＩのＩＣ５０に等しい濃度で開始した化合物ＩＩの６回の２倍連続希釈物。両化合物の最大濃度は、したがって、それらのＩＣ５０の半分に等しかった。以前に記載されているように、ウイルス複製アッセイを、完全にコンフルエントなＣｒＦＫ細胞で行った。４８時間後、上清を回収し、ビリオンの数を、定量ｑＰＣＲ反応を標準的な様式で使用して評価した。
代表的なスルホン化されたポリスチレン誘導体であるＰＳＳＮａと、異なる抗ウイルス活性メカニズムを有する典型的なヌクレオシド類似体、すなわち、アシクロビル（ＡＣＶ）およびペンシクロビル（ＰＣＶ）との相乗効果は、既知の様式を一部変更して研究した［４４］。この実験は、２つの系で行った。１つの系は、一定濃度のＰＳＳＮａ（化合物ＩＩ）および様々な濃度の対応する試験用ヌクレオシド類似体（化合物Ｉ）を使用し、一方、他の系は、一定濃度の対応する試験用ヌクレオシド類似体（化合物ＩＩ）および様々な濃度のＰＳＳＮａ（化合物Ｉ）を使用した。簡潔に述べると、ＸＴＴ試験を上記のようにまず行って、薬物に関連する毒性を排除し、次いで、ウイルスの複製試験を上記のように行って、ＡＣＶおよびＰＣＶについての、４００ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＦＨＶ－１株Ｃ－２７に対するＩＣ５０値を決定する（ｑＰＣＲを使用する）。次いで、２つのタイプの連続希釈物を調製して、ＡＣＶ／ＰＣＶと７８０ｋＤａの分子量を有するＰＳＳＮａポリマー（ＰＳＳＮａ７８０）との相乗効果を評価した：（１）化合物ＩＩのＩＣ５０に等しい濃度の化合物ＩＩと混合した、化合物ＩのＩＣ５０に等しい濃度から開始した化合物Ｉの６回の２倍連続希釈物、（２）化合物ＩのＩＣ５０に等しい濃度の化合物Ｉと混合した、化合物ＩＩのＩＣ５０に等しい濃度で開始した化合物ＩＩの６回の２倍連続希釈物。両化合物の最大濃度は、したがって、それらのＩＣ５０の半分に等しかった。以前に記載されているように、ウイルス複製アッセイを、完全にコンフルエントなＣｒＦＫ細胞で行った。４８時間後、上清を回収し、ビリオンの数を、定量ｑＰＣＲ反応を標準的な様式で使用して評価した。
【0076】
相乗効果を、式：
【0077】
【数1】
に従った組み合わせ指標（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）（ＣＩ）を計算することによって評価し、
式中：
ｄ１は、ビリオン数を５０％減少させる、ＩＣ５０／２の化合物ＩＩの存在下での、化合物Ｉの濃度であり、
ｄ２は、ビリオン数を５０％減少させる、ＩＣ５０／２の化合物Ｉの存在下での、化合物ＩＩの濃度であり、
Ｄ１は、化合物ＩのＩＣ５０であり、
Ｄ２は、化合物ＩＩのＩＣ５０である。
【0078】
ＣＩが示すものとして、薬剤：ＣＩ＞１の相乗効果はアンタゴニスト効果を意味し、約１のＣＩは付加的効果を意味し、ＣＩ＜１は相乗効果を意味する。
【0079】
行った研究は、ＰＳＳＮａの作用メカニズムと異なる作用メカニズムを有する２つのヌクレオシド類似体、すなわち、アシクロビル（ＡＣＶ）およびペンシクロビル（ＰＣＶ）が、ポリスチレンスルホン酸のナトリウム塩（ＰＳＳＮａ）との相乗効果を示すことを示した。これらの化合物についての計算されたＣＩ値は、ＰＳＳＮａ７８０／ＡＣＶでは０．９２であり、ＰＳＳＮａ７８０／ＰＣＶでは０．４６であった。この相乗効果は、インビボでの臨床設定で特に関連がある。
【実施例7】
【0080】
９３．５ｋＤａおよび７８０ｋＤａの分子量を有するＰＳＳＮａポリマーを伴うまたは伴わないインキュベーションの後の細胞感染の初期段階の阻害の定量分析
実施例５で示した代表的な顕微鏡画像をＩｍａｇｅＪ ＦｉＪｉで定量し、細胞当たりのＦＨＶ－１ Ｃ－２７ビリオンの数、すなわち、内在化した粒子および細胞接着粒子の両方をカウントした。細胞当たりのウイルスカウント数のパーセンテージ分析を図６に示す。細胞防御試験（試験ＩＩ）の後、ＦＨＶビリオンの数はポリマーの存在下で減少しなかったことが示され、このことは、以前に得られた結果と一致している。接着試験（試験ＩＩＩ）を行った後、細胞当たりのウイルス量の統計上有意な減少が、９３．５ｋＤａの分子量を有するポリマーを使用した後、および７８０ｋＤａの分子量を有するポリマーを使用した後の両方で、ウイルスコントロールと比較して明らかであったことも確認された。系の各々についての結果は、１０個のＣｒＦＫ細胞の平均カウント数として示されている。顕微鏡画像の定量分析によって、ポリマーは、感染の初期段階において感染を阻害することが示された。細胞当たりのウイルスカウント数の得られたパーセンテージ分析は、顕微鏡による所見と一致している。
実施例５で示した代表的な顕微鏡画像をＩｍａｇｅＪ ＦｉＪｉで定量し、細胞当たりのＦＨＶ－１ Ｃ－２７ビリオンの数、すなわち、内在化した粒子および細胞接着粒子の両方をカウントした。細胞当たりのウイルスカウント数のパーセンテージ分析を図６に示す。細胞防御試験（試験ＩＩ）の後、ＦＨＶビリオンの数はポリマーの存在下で減少しなかったことが示され、このことは、以前に得られた結果と一致している。接着試験（試験ＩＩＩ）を行った後、細胞当たりのウイルス量の統計上有意な減少が、９３．５ｋＤａの分子量を有するポリマーを使用した後、および７８０ｋＤａの分子量を有するポリマーを使用した後の両方で、ウイルスコントロールと比較して明らかであったことも確認された。系の各々についての結果は、１０個のＣｒＦＫ細胞の平均カウント数として示されている。顕微鏡画像の定量分析によって、ポリマーは、感染の初期段階において感染を阻害することが示された。細胞当たりのウイルスカウント数の得られたパーセンテージ分析は、顕微鏡による所見と一致している。
【実施例8】
【0081】
ＦＨＶ－１ Ｋ７臨床株の感染性に対するポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳＮａ）の効果
獣医学的株を、クラクフにあるホームレス・アニマル・シェルター（Ｈｏｍｅｌｅｓｓ Ａｎｉｍａｌ Ｓｈｅｌｔｅｒ）の獣医師の厚意により入手し、これらの獣医師が、上気道感染の症候を示すネコからスワブを採取した。スワブは、ウイルスの臨床サンプルを運ぶための特別なスワブスティックを使用して、喉および鼻腔から採取した。細菌および真菌の感染の可能性を排除するために、ＦＨＶビリオンに対する障壁とはならない、孔の直径が０．２μｍの無菌の使い捨てフィルターを使用して、サンプルを濾過した。濾過された輸送用培地を、コンフルエントなＣｒＦＫ細胞を有する１２ウェル・プレートに移した。プレートを最大９６時間インキュベートし、ウェルを１日に２回モニタリングした。細胞変性効果（ＣＰＥ）が確認できたら、上清を回収し、プラーク・アッセイ（実施例１０ｂにおいて記載されている手順）にかけた。４８時間後、単一の目立つプラークを選択し、無菌のピペットチップを用いてこの部位で寒天に穴をあけた。次いでチップを移し、完全にコンフルエントなＣｒＦＫ細胞を含有する新たな１２ウェル・プレート上で培地をチップと接触させた。細胞変性効果が生じたら、上清を新たな凍結用チューブに移して等しく分け、－８０℃で保管した。各株の種の所属を、ＴＫチミジンキナーゼの配列断片のシーケンシングによって確認した。ＦＨＶ－１ Ｋ７臨床株の供給源の特徴を、表３に記載する。
獣医学的株を、クラクフにあるホームレス・アニマル・シェルター（Ｈｏｍｅｌｅｓｓ Ａｎｉｍａｌ Ｓｈｅｌｔｅｒ）の獣医師の厚意により入手し、これらの獣医師が、上気道感染の症候を示すネコからスワブを採取した。スワブは、ウイルスの臨床サンプルを運ぶための特別なスワブスティックを使用して、喉および鼻腔から採取した。細菌および真菌の感染の可能性を排除するために、ＦＨＶビリオンに対する障壁とはならない、孔の直径が０．２μｍの無菌の使い捨てフィルターを使用して、サンプルを濾過した。濾過された輸送用培地を、コンフルエントなＣｒＦＫ細胞を有する１２ウェル・プレートに移した。プレートを最大９６時間インキュベートし、ウェルを１日に２回モニタリングした。細胞変性効果（ＣＰＥ）が確認できたら、上清を回収し、プラーク・アッセイ（実施例１０ｂにおいて記載されている手順）にかけた。４８時間後、単一の目立つプラークを選択し、無菌のピペットチップを用いてこの部位で寒天に穴をあけた。次いでチップを移し、完全にコンフルエントなＣｒＦＫ細胞を含有する新たな１２ウェル・プレート上で培地をチップと接触させた。細胞変性効果が生じたら、上清を新たな凍結用チューブに移して等しく分け、－８０℃で保管した。各株の種の所属を、ＴＫチミジンキナーゼの配列断片のシーケンシングによって確認した。ＦＨＶ－１ Ｋ７臨床株の供給源の特徴を、表３に記載する。
【0082】
【表3】
【0083】
単離された臨床株ＦＨＶ－１ Ｋ７に対するポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳＮａ）の抗ウイルス活性を決定するために、ウイルス感染に対する、２つの選択された分子量（９３．５ｋＤａおよび７８０ｋＤａ）を有する様々な濃度のこのポリマーの効果を試験した。ウイルス複製試験は、実施例２と類似の方法で行った。簡潔に述べると、単離された感染物質１ｍｌ当たりのウイルスＤＮＡのコピー数における対数変化を、リアル・タイム定量ＰＣＲによって決定し（図７Ａ）、その一方で、プラーク・アッセイによって、感染性ビリオンの数における対数変化を決定することができた（図７Ｂ）。値は、ウイルスコントロール、すなわち、ポリマーとインキュベートされていない感染細胞に対して正規化された。
【0084】
この試験によって、試験されたポリマーが、低い無毒の濃度で臨床株ＦＨＶに対しても抗ウイルス活性を有することが確認された。このポリマーはウイルス複製を完全に阻害し、ウイルスＤＮＡのコピー数と感染性ビリオンの数との両方が、検出閾値を下回っていた。
【実施例9】
【0085】
相互作用試験：ＰＳＳＮａポリマーでコーティングされた表面へのＦＨＶ－１ウイルスの結合能力の分析、直接的なウイルス－ポリマー相互作用の分析
相互作用試験によって、阻害剤とウイルスとの間の直接的な相互作用が存在するかどうかを判定することができる。無菌のカバー・スリップを１２ウェル・プレートの内部に置いた。カバー・スリップの負の電荷を相殺するために、カバー・スリップを３％ＦＢＳまたはＰＢＳ中のウシコラーゲン（Ｐｕｒｅｃｏｌ）と３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳ中でインキュベートしたスライドをコントロールとした。スライドを次いでＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ溶液とインキュベートしたか、または、２０μｇ／ｍｌの濃度のポリマーをウェル当たり１ｍｌの量で添加した。サンプルを、３７℃で２時間インキュベートした。このステップは、スライドを、負に荷電したポリマーで被覆するためのものである。次いで、未結合のポリマー粒子をＰＢＳ溶液で洗い流した。次のステップは、スライドと、ＴＣＩＤ５０が６３００万／ｍｌに等しいウイルス懸濁液またはコントロールとの、３７℃で２時間のインキュベーションであった。ポリマーとウイルスとの間の直接的な相互作用が存在すれば、ビリオンが、ポリマーで被覆された表面に結合することが推測された。未結合の粒子をＰＢＳ溶液で洗い流し、材料を共焦点顕微鏡イメージングのために調製した。免疫蛍光染色を行い、調製物を可視化し、次いで、共焦点面当たりのウイルス粒子の数をＩｍａｇｅＪ ＦｉＪｉでカウントした。定量分析を図８に示す。
相互作用試験によって、阻害剤とウイルスとの間の直接的な相互作用が存在するかどうかを判定することができる。無菌のカバー・スリップを１２ウェル・プレートの内部に置いた。カバー・スリップの負の電荷を相殺するために、カバー・スリップを３％ＦＢＳまたはＰＢＳ中のウシコラーゲン（Ｐｕｒｅｃｏｌ）と３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳ中でインキュベートしたスライドをコントロールとした。スライドを次いでＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ溶液とインキュベートしたか、または、２０μｇ／ｍｌの濃度のポリマーをウェル当たり１ｍｌの量で添加した。サンプルを、３７℃で２時間インキュベートした。このステップは、スライドを、負に荷電したポリマーで被覆するためのものである。次いで、未結合のポリマー粒子をＰＢＳ溶液で洗い流した。次のステップは、スライドと、ＴＣＩＤ５０が６３００万／ｍｌに等しいウイルス懸濁液またはコントロールとの、３７℃で２時間のインキュベーションであった。ポリマーとウイルスとの間の直接的な相互作用が存在すれば、ビリオンが、ポリマーで被覆された表面に結合することが推測された。未結合の粒子をＰＢＳ溶液で洗い流し、材料を共焦点顕微鏡イメージングのために調製した。免疫蛍光染色を行い、調製物を可視化し、次いで、共焦点面当たりのウイルス粒子の数をＩｍａｇｅＪ ＦｉＪｉでカウントした。定量分析を図８に示す。
【実施例10】
【0086】
ＦＣＶ感染に対するポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳＮａ）の効果
ＦＣＶ（Ｆ－９、ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－７８２（商標）株）に対するポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳＮａ）の抗ウイルス活性を決定するために、ウイルス感染に対する化合物の効果についての試験を行った。この実験において、ポリマーは、ウイルス感染の全ての段階で存在した。この実験において、完全にコンフルエントなＣｒＦＫ細胞を、９６ウェル・プレートへの播種から２４時間後に使用した。培地を除去し、ポリマーを含有する新鮮な培地２０μｌを添加した。プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、ポリマーを有する培地を除去し、ウイルスを有さない（コントロールサンプル）またはＴＣＩＤ５０力価が４００／ｍｌのＦＣＶを有する、３％ＤＭＥＭ中のポリマー溶液、またはポリマーを有さない３％ＤＭＥＭ（コントロールサンプル）５０μｌを添加した。プレートを３７℃で１．５時間インキュベートし、次いで、細胞をＰＢＳ溶液で２回洗浄して、未結合のウイルス粒子を除去した。最後に、３％ＤＭＥＭ中のポリマー溶液１００μｌを各ウェルに添加し、細胞を１８時間インキュベートした。この時間の後、上清を回収して、以下の通りに、（ａ）定量ＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）および（ｂ）プラーク・アッセイを使用してウイルスの数を評価した。
ＦＣＶ（Ｆ－９、ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－７８２（商標）株）に対するポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳＮａ）の抗ウイルス活性を決定するために、ウイルス感染に対する化合物の効果についての試験を行った。この実験において、ポリマーは、ウイルス感染の全ての段階で存在した。この実験において、完全にコンフルエントなＣｒＦＫ細胞を、９６ウェル・プレートへの播種から２４時間後に使用した。培地を除去し、ポリマーを含有する新鮮な培地２０μｌを添加した。プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、ポリマーを有する培地を除去し、ウイルスを有さない（コントロールサンプル）またはＴＣＩＤ５０力価が４００／ｍｌのＦＣＶを有する、３％ＤＭＥＭ中のポリマー溶液、またはポリマーを有さない３％ＤＭＥＭ（コントロールサンプル）５０μｌを添加した。プレートを３７℃で１．５時間インキュベートし、次いで、細胞をＰＢＳ溶液で２回洗浄して、未結合のウイルス粒子を除去した。最後に、３％ＤＭＥＭ中のポリマー溶液１００μｌを各ウェルに添加し、細胞を１８時間インキュベートした。この時間の後、上清を回収して、以下の通りに、（ａ）定量ＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）および（ｂ）プラーク・アッセイを使用してウイルスの数を評価した。
【0087】
ａ）ＲＴ－ｑＰＣＲ
ウイルスＲＮＡの単離を、製造者によって提供されるプロトコルに従って、市販されているＲＮＡ単離キット（Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ａ＆Ａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ポーランド）を使用して、標準的な様式で行った。単離されたＲＮＡを、市販されているキット（Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ポーランド）を使用して逆転写（ＲＴ）した。こうして得られたｃＤＮＡを、定量リアル・タイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行うための鋳型とした。ＦＣＶゲノム配列の保存的な断片を増幅するための当技術分野において知られているプライマー、およびこの断片に相補的なプローブを使用した［６３］。使用したプライマーおよびプローブの配列を、表４に示す。
ウイルスＲＮＡの単離を、製造者によって提供されるプロトコルに従って、市販されているＲＮＡ単離キット（Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ａ＆Ａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ポーランド）を使用して、標準的な様式で行った。単離されたＲＮＡを、市販されているキット（Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ポーランド）を使用して逆転写（ＲＴ）した。こうして得られたｃＤＮＡを、定量リアル・タイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行うための鋳型とした。ＦＣＶゲノム配列の保存的な断片を増幅するための当技術分野において知られているプライマー、およびこの断片に相補的なプローブを使用した［６３］。使用したプライマーおよびプローブの配列を、表４に示す。
【0088】
【表4】
【0089】
簡潔に述べると、ｑＰＣＲ反応を以下の通りに行った。２．５μｌの単離されたウイルスＤＮＡを、１×Ｋａｐａ Ｐｒｏｂｅ Ｆａｓｔ ｑＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ混合物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ポーランド）、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）および６－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）（５’－ＦＡＭ－ＣＴＴ ＡＡＡ ＴＡＹ ＴＡＴ ＧＡＴ ＴＧＧ ＧＡＹ ＣＣＣ ＣＡ－ＴＡＭＲＡ－３’）で標識された特異的プローブ１００ｎＭ、ならびに４５０ｎＭの各スターター（５’－ＣＡＡ ＣＣＴ ＧＣＧ ＣＴＡ ＡＣＧ－３’および５’－ＴＣＣ ＣＡＹ ＡＣＡ ＧＴＴ ＣＣＡ ＡＡＴ Ｔ－３’）を含有する反応物１０μｌにおいて増幅した。前述の特異的プローブおよびプライマーを使用して、ＦＣＶゲノムに由来する１５１ｂｐの配列断片を増幅して、サンプル中のウイルスＲＮＡのコピー数を測定した［６３］。反応は、以下の条件下で、サーモサイクラー（ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｒｅａｌ－１９７ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において行った：９５℃で３分、次いで、９５℃で１５秒および５１℃で３０秒を３９サイクル。
【0090】
適切な標準を、サンプル中のウイルスＲＮＡ分子の初期数を評価するために調製した。ｃＤＮＡ転写された配列断片を、上記のプライマーを使用して増幅した。こうして得られたＤＮＡを、ＩｎｓＴＡｃｌｏｎｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ポーランド）を使用して、ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔプラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ポーランド）にクローニングした。大腸菌ＴＯＰ１０株（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ポーランド）の形質転換、およびプラスミドベクターの増殖を、標準的な様式で行った。プラスミドを次いで、ＧｅｎｅＪＥＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ポーランド）を使用して精製し、ＫｐｎＩ制限酵素での消化によって線状化した。線状化されたＤＮＡの濃度を分光光度測定によって評価し、１ミリリットル当たりのコピー数を計算した。８回の１０倍連続希釈物を、リアル・タイムＰＣＲのための鋳型として使用した。ＦＣＶの複製を阻害するポリマーの能力を、培地１ミリリットル当たりの、対数関数としてのウイルスＲＮＡのコピー数の減少として決定した。
【0091】
ｂ）プラーク・アッセイ
ＦＣＶの感染性ビリオンの定量分析を、低融点アガロースを使用して、プラーク・アッセイによって行った。回収された上清の１０倍連続希釈物を調製し、次いで細胞にアプライし、１時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、ＤＭＥＭ培養培地と混合した０．６％液体アガロースを細胞にアプライした。プレートを室温で約２０分間インキュベートし、次いで、プレートをインキュベーターに移した。プラークが形成されるために必要な時間は、約２４時間であった。この時間の後、細胞を最低でも１２時間（アガロースに浸透するために必要な時間）、４％ホルムアルデヒドの溶液で固定し、次いで、５０％（ｖ／ｖ）のメタノール：水に溶解した０．１％クリスタル・バイオレット溶液で染色した。プラークをカウントし、１ｍｌ当たりのＰＦＵ（プラーク形成単位）数としてプロットした。
ＦＣＶの感染性ビリオンの定量分析を、低融点アガロースを使用して、プラーク・アッセイによって行った。回収された上清の１０倍連続希釈物を調製し、次いで細胞にアプライし、１時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、ＤＭＥＭ培養培地と混合した０．６％液体アガロースを細胞にアプライした。プレートを室温で約２０分間インキュベートし、次いで、プレートをインキュベーターに移した。プラークが形成されるために必要な時間は、約２４時間であった。この時間の後、細胞を最低でも１２時間（アガロースに浸透するために必要な時間）、４％ホルムアルデヒドの溶液で固定し、次いで、５０％（ｖ／ｖ）のメタノール：水に溶解した０．１％クリスタル・バイオレット溶液で染色した。プラークをカウントし、１ｍｌ当たりのＰＦＵ（プラーク形成単位）数としてプロットした。
【0092】
行った研究は、試験されたポリマーが抗ウイルス活性を示し、ＦＣＶの複製を阻害することを示した。抗ウイルス活性とポリマー分子量との間の正の関係が実証された。結果を図９にまとめる。
【実施例11】
【0093】
ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳＮａ）の抗ウイルス活性と培地中のその濃度との間の関係
ポリスチレンスルホン酸のナトリウム塩（ＰＳＳＮａ）のＩＣ５０を決定するために、ウイルス感染に対する様々な濃度のこのポリマーの効果を試験した。この試験は、実施例１０と類似の方法で行った。ポリマー濃度とＦＣＶに対するその活性との間の関係を調べた。簡潔に述べると、１ｍｌ当たりのウイルスＲＮＡのコピー数を、ＲＴ－ｑＰＣＲによって決定し（図１０Ａ、図１０Ｂ）、その一方で、プラーク・アッセイによって、感染性ビリオンの数を決定することができた（図１０Ｃ、図１０Ｄ）。試験は、様々な濃度の９３．５ｋＤａ（図１０Ａ、図１０Ｃ）および７８０ｋＤａ（図１０Ｂ、図１０Ｄ）の分子量を有するポリマーを使用して行った。値は、ウイルスコントロールに対して正規化されている。
ポリスチレンスルホン酸のナトリウム塩（ＰＳＳＮａ）のＩＣ５０を決定するために、ウイルス感染に対する様々な濃度のこのポリマーの効果を試験した。この試験は、実施例１０と類似の方法で行った。ポリマー濃度とＦＣＶに対するその活性との間の関係を調べた。簡潔に述べると、１ｍｌ当たりのウイルスＲＮＡのコピー数を、ＲＴ－ｑＰＣＲによって決定し（図１０Ａ、図１０Ｂ）、その一方で、プラーク・アッセイによって、感染性ビリオンの数を決定することができた（図１０Ｃ、図１０Ｄ）。試験は、様々な濃度の９３．５ｋＤａ（図１０Ａ、図１０Ｃ）および７８０ｋＤａ（図１０Ｂ、図１０Ｄ）の分子量を有するポリマーを使用して行った。値は、ウイルスコントロールに対して正規化されている。
【0094】
計算されたＩＣ５０値を以下の表５に示す。
【0095】
【表5】
【0096】
行った研究は、試験されたポリマーが抗ウイルス活性を有し、低い無毒の濃度でＦＣＶの複製を阻害することを示した。
【実施例12】
【0097】
ＰＳＳＮａポリマーの抗ウイルス作用メカニズムの決定
ＰＳＳＮａポリマーの作用メカニズムを決定するため、およびＰＳＳＮａがＦＣＶによって誘発される細胞感染を阻害する段階を同定するため、以下に記載する４つの機能試験を、２００μｇ／ｍｌのポリマー濃度で行った。
ＰＳＳＮａポリマーの作用メカニズムを決定するため、およびＰＳＳＮａがＦＣＶによって誘発される細胞感染を阻害する段階を同定するため、以下に記載する４つの機能試験を、２００μｇ／ｍｌのポリマー濃度で行った。
【0098】
試験Ｉ（不活化試験）
濃縮ウイルス懸濁液をポリマーと２２℃で１時間、振とうしながらインキュベートし、次いで、サンプルを希釈して、ポリマー濃度を、それが活性である濃度範囲下まで低減させた。ウイルス力価を、プラーク・アッセイを使用して評価した。
濃縮ウイルス懸濁液をポリマーと２２℃で１時間、振とうしながらインキュベートし、次いで、サンプルを希釈して、ポリマー濃度を、それが活性である濃度範囲下まで低減させた。ウイルス力価を、プラーク・アッセイを使用して評価した。
【0099】
試験Ｉによって、ポリマーとウイルスとの間の相互作用を介して阻害が生じるかどうかを判定することができ、言い換えると、試験化合物がウイルスに対して直接的な効果を有するかどうかを判定することができる。
【0100】
試験ＩＩ（細胞防御試験）
完全にコンフルエントなＣｒＦＫ細胞を、ポリマーの存在下または不存在下で、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを次いで１×ＰＢＳで２回洗浄して、未結合のポリマー粒子を除去し、その後、ウイルスを有さない（コントロールサンプル）またはウイルスを有する（４００ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）新鮮な培地を等容積で各ウェルに添加し、３７℃で１．５時間インキュベートした。プレートを次いで１×ＰＢＳで２回洗浄して、未結合のウイルス粒子を除去した。新鮮な培地を細胞にアプライし、これを３７℃で１８時間インキュベートした。最後に、培養上清を回収して、感染性ウイルス粒子の数およびウイルスＲＮＡのコピー数を、それぞれプラーク・アッセイおよびＲＴ－ｑＰＣＲ反応を使用して定量することによって、複製効率を評価した。
完全にコンフルエントなＣｒＦＫ細胞を、ポリマーの存在下または不存在下で、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを次いで１×ＰＢＳで２回洗浄して、未結合のポリマー粒子を除去し、その後、ウイルスを有さない（コントロールサンプル）またはウイルスを有する（４００ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）新鮮な培地を等容積で各ウェルに添加し、３７℃で１．５時間インキュベートした。プレートを次いで１×ＰＢＳで２回洗浄して、未結合のウイルス粒子を除去した。新鮮な培地を細胞にアプライし、これを３７℃で１８時間インキュベートした。最後に、培養上清を回収して、感染性ウイルス粒子の数およびウイルスＲＮＡのコピー数を、それぞれプラーク・アッセイおよびＲＴ－ｑＰＣＲ反応を使用して定量することによって、複製効率を評価した。
【0101】
この試験は、ポリマーが、例えば細胞表面への結合によってエントリー受容体との相互作用を防ぐことで細胞を感染から「防御」し得るかどうかを判定する。
【0102】
試験ＩＩＩ（接着試験）
この試験は、細胞内輸送が阻害される４℃で行った。簡潔に述べると、完全にコンフルエントなＣｒＦＫ細胞を４℃で２０分間冷却した。次いで、ポリマーを有するまたは有さない、ウイルスを有さない（コントロールサンプル）またはウイルスを有する（４００ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）新鮮な培地を、細胞にアプライした。プレートを４℃で１時間インキュベートした。細胞内輸送はこの温度で停止したが、細胞受容体へのウイルスの吸着は可能であった。インキュベーションした後、細胞を、氷冷した１×ＰＢＳで２回洗浄して、未結合のウイルス粒子および未結合のポリマーを除去し、新鮮な培地を添加し、細胞を３７℃で１８時間インキュベートした。１８時間後、上清を回収し、ＲＴ－ｑＰＣＲおよびプラーク・アッセイを使用してウイルス粒子の数を定量した。
この試験は、細胞内輸送が阻害される４℃で行った。簡潔に述べると、完全にコンフルエントなＣｒＦＫ細胞を４℃で２０分間冷却した。次いで、ポリマーを有するまたは有さない、ウイルスを有さない（コントロールサンプル）またはウイルスを有する（４００ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）新鮮な培地を、細胞にアプライした。プレートを４℃で１時間インキュベートした。細胞内輸送はこの温度で停止したが、細胞受容体へのウイルスの吸着は可能であった。インキュベーションした後、細胞を、氷冷した１×ＰＢＳで２回洗浄して、未結合のウイルス粒子および未結合のポリマーを除去し、新鮮な培地を添加し、細胞を３７℃で１８時間インキュベートした。１８時間後、上清を回収し、ＲＴ－ｑＰＣＲおよびプラーク・アッセイを使用してウイルス粒子の数を定量した。
【0103】
この試験によって、接着物質についてのポリマーとウイルスとの競合を介して阻害が生じるかどうか、および／または、接着物質と相互作用しているポリマーが、接着物質とウイルスとの相互作用を防ぐかどうかを判定することができる。
【0104】
試験ＩＶ（後期段階：複製、アセンブリ、および放出）
この試験において、細胞をウイルスとインキュベートすることによって感染をまず生じさせ、感染後にのみ、ポリマーをアプライした。非感染性のサンプルまたはウイルスサンプル（４００ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を含有する新鮮な培地を、コンフルエントなＣｒＦＫ細胞にアプライし、次いで、プレートを３７℃で１．５時間インキュベートした。インキュベーションの後、ウェルをＰＢＳで２回洗浄して、未結合のウイルス粒子を除去し、次いで、選択されたポリマー濃度を含有する新鮮な培地を、各ウェルに添加した。プレートを、３７℃で１８時間インキュベートした。１８時間後、上清を回収し、次いで、ＰＢＳを個別にウェルに添加し、細胞を２回の凍結融解サイクルにかけて細胞溶解物を得、次いで、プラーク・アッセイおよびＲＴ－ｑＰＣＲを使用してウイルス複製を定量した。
この試験において、細胞をウイルスとインキュベートすることによって感染をまず生じさせ、感染後にのみ、ポリマーをアプライした。非感染性のサンプルまたはウイルスサンプル（４００ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を含有する新鮮な培地を、コンフルエントなＣｒＦＫ細胞にアプライし、次いで、プレートを３７℃で１．５時間インキュベートした。インキュベーションの後、ウェルをＰＢＳで２回洗浄して、未結合のウイルス粒子を除去し、次いで、選択されたポリマー濃度を含有する新鮮な培地を、各ウェルに添加した。プレートを、３７℃で１８時間インキュベートした。１８時間後、上清を回収し、次いで、ＰＢＳを個別にウェルに添加し、細胞を２回の凍結融解サイクルにかけて細胞溶解物を得、次いで、プラーク・アッセイおよびＲＴ－ｑＰＣＲを使用してウイルス複製を定量した。
【0105】
この試験によって、ウイルスの拡散の阻害が、感染の後期段階、例えば、複製、アセンブリ、または放出の段階で生じるかどうかを判定することができる。
【0106】
各機能試験を行った後、細胞を３７℃で１８時間インキュベートした。この時間の後、上清（および試験ＩＶのケースでは細胞溶解物）を回収し、プラーク試験およびＲＴ－ｑＰＣＲ試験をリアル・タイムで行って、感染が阻害される段階を同定した。例外として、試験Ｉでは、技術的理由からプラーク試験のみを行うことができた。
【0107】
上記の試験において、培地１ｍｌ中のウイルスＲＮＡのコピー数をリアル・タイムＲＴ－ｑＰＣＲによって決定し（図１１Ａ）、その一方で、プラーク・アッセイによって、サンプル中の感染性ビリオンの数を決定することができた（図１１Ｂ）。試験は、様々な濃度の９３．５ｋＤａ（図１１Ｃ）および７８０ｋＤａ（図１１Ｄ）の分子量を有するポリマーを使用して行った。
【0108】
研究の結果として、ＰＳＳＮａポリマーが感染の後期段階（ＩＶ試験）で、おそらくウイルス複製の段階で、抗ウイルス活性を示すことが分かった。感染の後期段階における、９３．５ｋＤａおよび７８０ｋＤａの分子量を有するポリマーの抗ウイルス性の有効性は同様であり、一方、一般試験における高分子量のポリマー（図１１）はより効果的であり、このことは、その作用にさらなるメカニズムが存在する可能性を示している。この所見は試験ＩＩＩの結果と一致しており、このことは、高分子量のポリマーは、感染の初期段階の、ウイルスが細胞表面に接着する段階にもウイルス感染を阻害するが、一方で、分子量がより低いポリマーはこの段階でウイルスを阻害する能力は有していなかったことを示している（図１１Ｃ、図１１Ｄ）。
【実施例13】
【0109】
共焦点顕微鏡法による、９３．５ｋＤａおよび７８０ｋＤａの分子量を有するＰＳ ＳＮａポリマーによるＦＣＶによる初期段階の細胞感染の阻害の可視化
共焦点顕微鏡を使用したイメージングのための準備を行うために、ＣｒＦＫ細胞を実験の２４時間前に顕微鏡スライドに播種した。細胞を次いで冷却し、４℃で１時間、標準的な様式で、ウイルスの存在下またはウイルスおよびポリマーの存在下でインキュベートした。所定のインキュベーション時間の後、未結合のウイルス粒子を洗い流し、調製物を固定し、標準的な様式で染色した。免疫蛍光染色のために、ＦＣＶカプシドタンパク質に対する一次抗体（カタログ番号：ｓｃ－８０７８５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＣＡ、ＵＳＡ）を使用し、その後、ビリオンを可視化するためのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ポーランド）とコンジュゲートした二次抗体、Ｆ－アクチンを染色するためのＡｌｅｘａにコンジュゲートしたファロイジンＦｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ポーランド）、および核ＤＮＡを染色するためのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ポーランド）を使用した。最大の投影画が示されている。
共焦点顕微鏡を使用したイメージングのための準備を行うために、ＣｒＦＫ細胞を実験の２４時間前に顕微鏡スライドに播種した。細胞を次いで冷却し、４℃で１時間、標準的な様式で、ウイルスの存在下またはウイルスおよびポリマーの存在下でインキュベートした。所定のインキュベーション時間の後、未結合のウイルス粒子を洗い流し、調製物を固定し、標準的な様式で染色した。免疫蛍光染色のために、ＦＣＶカプシドタンパク質に対する一次抗体（カタログ番号：ｓｃ－８０７８５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＣＡ、ＵＳＡ）を使用し、その後、ビリオンを可視化するためのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ポーランド）とコンジュゲートした二次抗体、Ｆ－アクチンを染色するためのＡｌｅｘａにコンジュゲートしたファロイジンＦｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ポーランド）、および核ＤＮＡを染色するためのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ポーランド）を使用した。最大の投影画が示されている。
【0110】
図１２は、ＰＳＳＮａポリマーによる、ＦＣＶによって誘発されるＣｒＦＫ細胞感染の阻害の可視化を示す。各々の色についてのシグナル（青、赤、および緑のチャネル）、ならびに３つ全ての色素からのシグナルの組み合わせ（組み合わせチャネル）が個別に示されている。細胞核（核ＤＮＡ）は青で示されており、Ｆ－アクチンは赤で示されており、ＦＣＶビリオンは緑で示されている。この図は、未感染コントロール細胞、ウイルスコントロール、１０００μｇ／ｍｌのＰＳＳＮａ９３．５で処置した細胞、および１０００μｇ／ｍｌのＰＳＳＮａ７８０で処置した細胞の可視化を示している。スケール・バーは１０μｍに対応している。
【0111】
顕微鏡による可視化は、７８０ｋＤａという高分子量のＰＳＳＮａポリマーの存在下での、ＣｒＦＫ細胞中に存在するＦＣＶビリオンの数の有意な減少を示しており、一方、９３．５ｋＤａの分子量を有するポリマーを使用した後のＦＣＶビリオンの数の減少は顕著ではない。この研究によって、特に高分子量のスルホン化されたポリスチレン誘導体が、ＦＣＶによって誘発される感染を感染の初期段階でも有効に阻害することが確認される。
【実施例14】
【0112】
９３．５ｋＤａおよび７８０ｋＤａの分子量を有するＰＳＳＮａポリマーを伴うまたは伴わないインキュベーションの後の細胞感染の初期段階の阻害の定量分析
実施例１３における代表的な顕微鏡画像をＩｍａｇｅＪ ＦｉＪｉで定量し、細胞当たりのＦＣＶ Ｆ９ビリオンの数、すなわち、内在化した粒子および細胞表面接着粒子の両方をカウントした。細胞防御試験（試験ＩＩ）の後、ＦＣＶ Ｆ９ビリオンの数はポリマーの存在下で減少しなかったことが示され、このことは、以前に得られた結果と一致している。接着試験（試験ＩＩＩ）を行った後、細胞当たりのウイルス数の統計上有意な減少がウイルスコントロールと比較して顕著であったことも確認されたが、これは、高分子量のポリマーのケースにおいてのみであった。系の各々についての結果は、１０個のＣｒＦＫ細胞の平均カウント数として示されている。顕微鏡画像の定量分析によって、７８０ｋＤａの分子量を有するポリマーは、感染の初期段階においても感染を阻害することが示された。９３．５ｋＤａの分子量を有するポリマーでは、コントロール細胞と、阻害剤とインキュベートされた細胞との間に統計上有意な差はなかった。細胞当たりのウイルスカウント数の得られたパーセンテージ分析は、顕微鏡による所見と一致している。
実施例１３における代表的な顕微鏡画像をＩｍａｇｅＪ ＦｉＪｉで定量し、細胞当たりのＦＣＶ Ｆ９ビリオンの数、すなわち、内在化した粒子および細胞表面接着粒子の両方をカウントした。細胞防御試験（試験ＩＩ）の後、ＦＣＶ Ｆ９ビリオンの数はポリマーの存在下で減少しなかったことが示され、このことは、以前に得られた結果と一致している。接着試験（試験ＩＩＩ）を行った後、細胞当たりのウイルス数の統計上有意な減少がウイルスコントロールと比較して顕著であったことも確認されたが、これは、高分子量のポリマーのケースにおいてのみであった。系の各々についての結果は、１０個のＣｒＦＫ細胞の平均カウント数として示されている。顕微鏡画像の定量分析によって、７８０ｋＤａの分子量を有するポリマーは、感染の初期段階においても感染を阻害することが示された。９３．５ｋＤａの分子量を有するポリマーでは、コントロール細胞と、阻害剤とインキュベートされた細胞との間に統計上有意な差はなかった。細胞当たりのウイルスカウント数の得られたパーセンテージ分析は、顕微鏡による所見と一致している。
【実施例15】
【0113】
ＦＣＶ臨床株の感染性に対するポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳＮａ）の効果
獣医学的株を、「Ａｍｂｕｖｅｔ」動物病院およびクラクフにあるホームレス・アニマル・シェルターの獣医師の厚意により入手し、これらの獣医師が、上気道感染の症候を示すネコからスワブを採取した。スワブは、ウイルスの臨床サンプルを運ぶための特別なスワブスティックを使用して、喉および鼻腔から採取した。細菌および真菌の感染の可能性を排除するために、約３５ｎｍの直径を有するカリシウイルスに対する障壁とはならない、孔の直径が０．２μｍの無菌の使い捨てフィルターを使用して、サンプルを濾過した。濾過された輸送用培地を、コンフルエントなＣｒＦＫ細胞を有する１２ウェル・プレートに移した。プレートを最大９６時間インキュベートし、ウェルを１日に２回モニタリングした。細胞変性効果（ＣＰＥ）が確認できたら、上清をプラーク・アッセイ（実施例１０ｂにおいて記載されている手順）のために採取した。２４時間後、単一の目立つプラークを選択し、無菌のピペットチップを用いてこの部位で寒天に穴をあけた。次いでチップを移し、完全にコンフルエントなＣｒＦＫ細胞を含有する新たな１２ウェル・プレート上で培地をチップと接触させた。細胞変性効果が生じたら、上清を新たな凍結用チューブに移して等しく分け、－８０℃で保管した。各株の種の所属を、主なＶＰ１カプシドタンパク質の配列断片のシーケンシングによって確認した。６つの獣医学的株（ＦＣＶ Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ５、Ｋ８、およびＫ１０）の供給源の特徴を、表６に記載する。
獣医学的株を、「Ａｍｂｕｖｅｔ」動物病院およびクラクフにあるホームレス・アニマル・シェルターの獣医師の厚意により入手し、これらの獣医師が、上気道感染の症候を示すネコからスワブを採取した。スワブは、ウイルスの臨床サンプルを運ぶための特別なスワブスティックを使用して、喉および鼻腔から採取した。細菌および真菌の感染の可能性を排除するために、約３５ｎｍの直径を有するカリシウイルスに対する障壁とはならない、孔の直径が０．２μｍの無菌の使い捨てフィルターを使用して、サンプルを濾過した。濾過された輸送用培地を、コンフルエントなＣｒＦＫ細胞を有する１２ウェル・プレートに移した。プレートを最大９６時間インキュベートし、ウェルを１日に２回モニタリングした。細胞変性効果（ＣＰＥ）が確認できたら、上清をプラーク・アッセイ（実施例１０ｂにおいて記載されている手順）のために採取した。２４時間後、単一の目立つプラークを選択し、無菌のピペットチップを用いてこの部位で寒天に穴をあけた。次いでチップを移し、完全にコンフルエントなＣｒＦＫ細胞を含有する新たな１２ウェル・プレート上で培地をチップと接触させた。細胞変性効果が生じたら、上清を新たな凍結用チューブに移して等しく分け、－８０℃で保管した。各株の種の所属を、主なＶＰ１カプシドタンパク質の配列断片のシーケンシングによって確認した。６つの獣医学的株（ＦＣＶ Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ５、Ｋ８、およびＫ１０）の供給源の特徴を、表６に記載する。
【0114】
【表6】
【0115】
単離されたＦＣＶ臨床株に対するポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳＮａ）の抗ウイルス活性を決定するために、ウイルス感染に対する、２つの選択された分子量（９３．５ｋＤａおよび７８０ｋＤａ）を有する様々な濃度のこのポリマーの効果を試験した。ウイルス複製アッセイは、実施例９と同様の方法で行った。簡潔に述べると、１ｍｌ当たりのウイルスＲＮＡコピーを、逆転写およびリアル・タイム定量ＰＣＲによって決定し、その一方で、プラーク・アッセイによって、感染性ビリオンの数を決定することができた（図１４）。値は、ウイルスコントロール、すなわち、ポリマーとインキュベートされていない感染細胞に対して正規化された。
【0116】
行った研究によって、試験されたポリマーが、低い無毒の濃度で全ての単離されたＦＣＶ臨床株に対して抗ウイルス活性を有することが確認された。臨床株の各々の複製は少なくとも２０倍低減し（ＦＣＶ Ｋ１株）、一方で、２つの株（ＦＣＶ Ｋ５およびＫ１０）のケースでは、感染は完全に阻害された。その結果が実施例１０に示されているＦＣＶ Ｆ９実験株のものと同様の、抗ウイルス活性と分子量との間の正の関係が実証された。
【実施例16】
【0117】
相互作用試験：ＰＳＳＮａポリマーでコーティングされた表面へのＦＣＶウイルスの結合能力の分析、直接的なウイルス－ポリマー相互作用の分析
相互作用試験によって、阻害剤とウイルスとの間の直接的な相互作用が存在するかどうかを決定することができる。無菌のカバー・スリップを１２ウェル・プレートの内部に置いた。カバー・スリップの負の電荷を相殺するために、カバー・スリップを３％ＦＢＳまたはＰＢＳ中のウシコラーゲン（Ｐｕｒｅｃｏｌ）と３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳ中でインキュベートしたスライドをコントロールとした。スライドを次いでＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ溶液または２０μｇ／ｍｌの濃度のポリマーを、ウェル当たり１ｍｌの量で添加した。サンプルを、３７℃で２時間インキュベートした。このステップは、スライドを、負に荷電したポリマーで被覆するためのものである。次いで、未結合のポリマー粒子をＰＢＳ溶液で洗い流した。次のステップは、スライドと、ＴＣＩＤ５０が１３，０００，０００／ｍｌに等しいウイルス懸濁液またはコントロールとの、３７℃で２時間のインキュベーションであった。ポリマーとウイルスとの間での直接的な相互作用が存在すれば、ビリオンが、ポリマーで被覆された表面に結合することが推測された。未結合の粒子をＰＢＳ溶液で洗い流し、材料を共焦点顕微鏡イメージングのために調製した。免疫蛍光染色を行い、調製物を可視化し、次いで、共焦点面当たりのウイルス粒子の数をＩｍａｇｅＪ ＦｉＪｉでカウントした。
相互作用試験によって、阻害剤とウイルスとの間の直接的な相互作用が存在するかどうかを決定することができる。無菌のカバー・スリップを１２ウェル・プレートの内部に置いた。カバー・スリップの負の電荷を相殺するために、カバー・スリップを３％ＦＢＳまたはＰＢＳ中のウシコラーゲン（Ｐｕｒｅｃｏｌ）と３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳ中でインキュベートしたスライドをコントロールとした。スライドを次いでＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ溶液または２０μｇ／ｍｌの濃度のポリマーを、ウェル当たり１ｍｌの量で添加した。サンプルを、３７℃で２時間インキュベートした。このステップは、スライドを、負に荷電したポリマーで被覆するためのものである。次いで、未結合のポリマー粒子をＰＢＳ溶液で洗い流した。次のステップは、スライドと、ＴＣＩＤ５０が１３，０００，０００／ｍｌに等しいウイルス懸濁液またはコントロールとの、３７℃で２時間のインキュベーションであった。ポリマーとウイルスとの間での直接的な相互作用が存在すれば、ビリオンが、ポリマーで被覆された表面に結合することが推測された。未結合の粒子をＰＢＳ溶液で洗い流し、材料を共焦点顕微鏡イメージングのために調製した。免疫蛍光染色を行い、調製物を可視化し、次いで、共焦点面当たりのウイルス粒子の数をＩｍａｇｅＪ ＦｉＪｉでカウントした。
【0118】
ＰＳＳＮａ ７８０ｋＤａでコーティングしたスライドでは、ビリオンの数は、ポリマーでコーティングしていないスライドまたはＰＳＳＮａ ９３．５ｋＤａでコーティングしたスライドよりもはるかに大きかった。ＦＢＳでコーティングしたスライドおよびＰＳＳＮａ９３．５でコーティングしたスライドで、共焦点面当たりのビリオン数の統計上有意な増大が同様に示されたことは注目に値するが、この増大は、ＰＳＳＮａ７８０のケースよりもはるかに小さかった。上記の結果は、ＰＳＳＮａ ７８０ｋＤａがウイルス粒子と直接相互作用することを示しているが、ＦＣＶの感染性に対するこの相互作用の効果は未知である。
【実施例17】
【0119】
ＰＥＧ－ＰＳＳＮａヒドロゲルのインビトロでの抗ウイルス活性の判定
この研究の目的は、動物の皮膚に塗布することができるＰＳＳＮａを含有する製剤を決定し、次いで、感染プロセスに対するこの製剤の効果およびこの製剤の経皮毒性を判定することであった。
この研究の目的は、動物の皮膚に塗布することができるＰＳＳＮａを含有する製剤を決定し、次いで、感染プロセスに対するこの製剤の効果およびこの製剤の経皮毒性を判定することであった。
【0120】
第１の段階では、ＣｒＦＫ細胞系を使用するインビトロでの実験に使用することができる、４００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールの最も高い無毒濃度を決定した（ＰＥＧ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ポーランド、Ｍｗ＝４００）（ＰＥＧ４００）。この目的で、１００、５０、４０、３０、２５、２０、１５、および１０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する８つのＰＥＧポリマー溶液を調製した。細胞を、特定の濃度のポリマーと４８時間インキュベートし、その後、先の実施例と類似のＸＴＴアッセイを行った。３０ｍｇ／ｍｌを超える濃度はＣｒＦＫ細胞に対して毒性であることが示されており、さらなる実験に使用することはできない。したがって、その後の試験において、最も高い無毒のＰＥＧ４００濃度である３０ｍｇ／ｍｌを使用することが決定された。コントロール（ポリマーで未処置の細胞）に対して正規化された細胞傷害性の結果を、図１６Ａに示す。
【0121】
ＰＳＳＮａ－ＰＥＧヒドロゲルを調製するために、１０００ｋＤａのＰＳＳＮａ（ＰＳＳＮａ１０００ｋＤａ）を水に溶解し、次いで、ＤＭＥＭ培養培地に希釈したＰＥＧ４００溶液を滴下して添加した。溶液中のＰＳＳＮａ１０００ｋＤａの最終濃度は２００μｇ／ｍｌであったが、一方、ＰＥＧ４００の濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。
【0122】
ヒドロゲル単独が活性物質ＰＳＳＮａの抗ウイルス活性に影響しないことを確認するために、ウイルス複製試験を行った。簡潔に述べると、ＣｒＦＫ細胞を、感染の前、最中、および後のヒドロゲルの存在下で感染させた。実験は、先の実施例において記載されているものと類似の方法で行った。細胞を１８時間（ＦＣＶ感染）または４８時間（ＦＨＶ－１感染）インキュベートした。この時間の後、上清を回収し、その後リアル・タイムＰＣＲを行い、ウイルス力価をプラーク・アッセイによってチェックした。得られた結果を、ＦＨＶ－１ウイルス（Ｂ、Ｃ）についておよびＦＣＶウイルス（Ｄ、Ｅ）について図１６に示す。
【0123】
ヒドロゲルの組成物が毒性ではなく、ポリスチレンスルホン酸ナトリウムの抗ウイルス活性に影響しないことが実証された。
【実施例18】
【0124】
マウスモデルにおけるポリスチレンスルホン酸ナトリウムの真皮に対する毒性の判定
この実験の目的は、マウスモデルにおけるポリスチレンスルホン酸ナトリウムの最大の無毒の真皮用量を決定することであった。試験材料は、ビャウィストクのＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手したＢＡＬＢ／ｃ系統の６週齢のメスマウスであった。実験番号２８１／２０１８についての同意は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｉｓｈ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの、２ｎｄ Ｌｏｃａｌ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｋｒａｋｏｗから得た。動物は５日間にわたり検疫した。検疫の後、一般的な医学的および獣医学的調査を行った。
この実験の目的は、マウスモデルにおけるポリスチレンスルホン酸ナトリウムの最大の無毒の真皮用量を決定することであった。試験材料は、ビャウィストクのＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手したＢＡＬＢ／ｃ系統の６週齢のメスマウスであった。実験番号２８１／２０１８についての同意は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｉｓｈ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの、２ｎｄ Ｌｏｃａｌ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｋｒａｋｏｗから得た。動物は５日間にわたり検疫した。検疫の後、一般的な医学的および獣医学的調査を行った。
【0125】
検疫および実験の間、動物は、以下の制御されたパラメータを有する室内で維持した：温度２２℃±２℃、湿度５５％±５％、および照明：人工光、光周期：１２時間の明期／１２時間の暗期。Ａｌｔｒｏｍｉｎの維持試料を使用した。ランダムに選択された健康な個体のみが、実験に適しているとされた。動物を群に分け、各実験において、群は５頭の個体を含んでいた：コントロール群－生理食塩水、実験群－５０ｍｇ／ｍｌのＰＳＳＮａ、実験群－７５ｍｇ／ｍｌのＰＳＳＮａ、実験群－１００ｍｇ／ｍｌのＰＳＳＮａ。
【0126】
試験材料を、剃毛した背部の皮膚に、１００μｌ／マウスの容積で１日に１回、７日間、直接塗布した。詳細な臨床的観察を、化合物を投与した日から毎日行った。試験材料を投与する前および観察の間毎日、動物の体重の測定を行った。実験の終わりに動物を安楽死させた。剖検を行い、血液を生化学的分析のために回収した。
【0127】
ＰＳＳＮａ－ＰＥＧヒドロゲルを、４００Ｄａの分子量を有するＰＥＧと水とを混合することによって（９：１比で、容積／容積）調製した。ＰＳＳＮａを水に溶解し、次いでＰＥＧ溶液に滴下して添加した。真皮に対する毒性の分析を、５０、７５、および１００ｍｇ／ｍｌのＰＳＳＮａ濃度を有するヒドロゲルを使用して行った。検疫の５日後、マウスの背部側面を剃毛し、次いで、１００μｌのヒドロゲルまたは生理食塩水を、剃毛した皮膚に塗布した。実験は７日間継続し、ヒドロゲルを毎日塗布した。マウスは毎日秤量し、モニタリングした（毎日の体重測定値を表７ａ～ｂに示す）。７日後、残っているマウスを頚部脱臼によって安楽死させた。ヒドロゲル注射した部位の皮膚を、発赤、潰瘍、または他の皮膚病変について毎日、以下の健康スケールに従って、念入りにモニタリングした：
０－健康状態良好、明らかな症候なし
１－アパシー、毛の逆立ち
２－背中の曲がった輪郭、わずかな体重減少
３－食欲不振、呼吸努力の増大、およびさらなる体重減少
４－苦痛
５－死亡
０－健康状態良好、明らかな症候なし
１－アパシー、毛の逆立ち
２－背中の曲がった輪郭、わずかな体重減少
３－食欲不振、呼吸努力の増大、およびさらなる体重減少
４－苦痛
５－死亡
【0128】
健康の結果を表８ａ～ｂに示す。
【0129】
動物を安楽死させた後、血液、肝臓、腎臓、および脾臓を、さらなる分析のために回収した。生化学的分析には、ＧＬＵ（ｍｇ／ｄｌ）、ＢＵＮ（ｍｇ／ｄｌ）、ＡＬＰ（ＩＵ／Ｌ）、ＴＰ（ｇ／ｄｌ）、ＧＰＴ（ＩＵ／Ｌ）、およびＣＲＥ（ｍｇ／ｄｌ）が含まれた。生化学的分析の結果を表９ａ～ｂに示す。
【0130】
動物の研究において、ポリスチレンスルホン酸塩は、５０、７５、および１００ｍｇ／ｍｌで皮膚に直接投与した後に臨床的症候を生じさせなかった。臨床的症候は、動物における生化学的試験および体重測定の最中には見られなかった。剖検した後、臓器における変化は肉眼では見られなかった。
【0131】
５０、７５、および１００ｍｇ／ｍｌの用量でＰＥＧポリマーと共にヒドロゲルの形態で皮膚に７日間投与されたポリスチレンスルホン酸ナトリウムは、動物に対して毒性ではなく、動物における抗ウイルス活性試験に、将来的に使用することができる。
【0132】
【表7】
【0133】
【表8】
【0134】
【表9】
【0135】
【表10】
【0136】
【表11】
【0137】
【表12】
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0138】
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出願人：ユニベルシテット ヤギエロンスキ
代理人：
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出願人：ユニベルシテット ヤギエロンスキ
代理人：
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
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【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【国際調査報告】