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特表2022-509930抗ＣＤ７３抗体、その抗原結合フラグメントおよびそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-25
(54)【発明の名称】抗ＣＤ７３抗体、その抗原結合フラグメントおよびそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220118BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220118BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20220118BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220118BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220118BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220118BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220118BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220118BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20220118BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220118BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220118BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220118BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C12P21/08
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K16/46
A61P35/00
A61K39/395 T
G01N33/53 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021525680
(86)(22)【出願日】2019-11-11
(85)【翻訳文提出日】2021-07-02
(86)【国際出願番号】 CN2019117114
(87)【国際公開番号】W WO2020098599
(87)【国際公開日】2020-05-22
(31)【優先権主張番号】201811337068.3
(32)【優先日】2018-11-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】516174219
【氏名又は名称】江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司
(71)【出願人】
【識別番号】516174208
【氏名又は名称】上海恒瑞医薬有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＨＥＮＧＲＵＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】ＮＯ． ２７９ ＷＥＮＪＩＮＧ ＲＯＡＤ， ＭＩＮＨＡＮＧ ＤＩＳＴＲＩＣＴ， ＳＨＡＮＧＨＡＩ ２００２４５， ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(74)【代理人】
【識別番号】100165892
【弁理士】
【氏名又は名称】坂田 啓司
(72)【発明者】
【氏名】曹 卓暁
(72)【発明者】
【氏名】付 雅媛
(72)【発明者】
【氏名】許 志賓
(72)【発明者】
【氏名】張 利敏
(72)【発明者】
【氏名】胡 斉悦
(72)【発明者】
【氏名】陶 維康
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG26
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA83X
4B065AA87X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C085AA14
4C085BB12
4C085CC23
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
抗ＣＤ７３抗体、その抗原結合フラグメントおよびその使用を提供する。具体的には、特定のＣＤＲ領域を有するマウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗ＣＤ７３抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。また、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、ならびにＣＤ７３関連疾患の診断薬および治療薬としての使用も提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＣＤ７３に特異的に結合する抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ここで、該抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントが軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が、配列番号２７、２８および２９にそれぞれ示される軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むか、または配列番号２７、２８および２９にそれぞれ示される配列に対して３個以下のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ変異体を含み、かつ該重鎖可変領域が、i) 配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３または配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示される配列に対して３個以下のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ変異体；
ii) 配列番号１６、１７および１８にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３または配列番号１６、１７および１８にそれぞれ示される配列に対して３個以下のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ変異体；あるいは、
iii) 配列番号２２、６７および２４にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３または配列番号２２、６７および２４にそれぞれ示される配列に対して３個以下のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ変異体
を含む、ヒトＣＤ７３に特異的に結合する抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項2】
１０－９Ｍ以下の解離平衡定数でヒトＣＤ７３に結合する、請求項１に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項3】
iv) 配列番号１０、１１、１２、１３、１４および１５にそれぞれ示す、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；v) 配列番号１６、１７、１８、１９、２０および２１にそれぞれ示す、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；あるいは
vi) 配列番号２３、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５または７６に示すＨＣＤＲ２ならびに配列番号２２、２４、２５、１４および２６にそれぞれ示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３
を含む、請求項１または２に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項4】
抗体が、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項5】
マウス抗体またはキメラ抗体もしくはそれらの抗原結合フラグメントが、次の(A)から(C)：(A) 配列番号４に示す重鎖可変領域および配列番号５に示す軽鎖可変領域を含む、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント；
(B) 配列番号６に示す重鎖可変領域および配列番号７に示す軽鎖可変領域を含む、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント；ならびに
(C) 配列番号８に示す重鎖可変領域および配列番号９に示す軽鎖可変領域を含む、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント
からなる群より選択される何れか１つである、請求項４に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項6】
抗体がヒト化抗体であり、該抗体の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）および重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）がそれぞれ、ヒト生殖系列の軽鎖および重鎖またはそれらの変異体配列に由来する；好ましくは、ヒト化抗体が、次の（D)から(F）：(D) 配列番号１０、１１、１２、１３、１４および１５にそれぞれ示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに重鎖フレームワーク領域および軽鎖フレームワーク領域であって、ここで該重鎖フレームワーク領域が、６Ｑ、１０Ｇ、３０Ｋ、３７Ｖ、４４Ｇ、４９Ｇおよび９４Ｇからなる群より選択される１以上の復帰突然変異を含み、該軽鎖フレームワーク領域が、３６Ｌ、４２Ｇ、４４Ｉ、６０Ｋ、６９Ｓ、７１Ｙおよび８５Ｄからなる群より選択される１以上の復帰突然変異を含む；
(E) 配列番号１６、１７、１８、１９、２０および２１にそれぞれ示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに重鎖フレームワーク領域および軽鎖フレームワーク領域であって、ここで、該重鎖フレームワーク領域が、３８Ｋ、４４Ｇ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、６９Ｌおよび７１Ａからなる群より選択される１以上の復帰突然変異を含み、該軽鎖フレームワーク領域が、３６Ｌ、４２Ｇ、４４Ｉ、６６Ｒ、７１Ｙおよび８５Ｄからなる群より選択される１以上の復帰突然変異を含む；ならびに、
(F) 配列番号２３、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５または７６に示されるＨＣＤＲ２、ならびに配列番号２２、２４、２５、１４および２６にそれぞれ示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに重鎖フレームワーク領域および軽鎖フレームワーク領域であって、ここで、該重鎖フレームワーク領域が、３８Ｍ、４４Ｓ、４８Ｉ、６７Ａ、６９Ｌ、７１Ｖ、７３Ｋ、８２Ａ Ｒおよび９４Ｔからなる群より選択される１以上の復帰突然変異を含み、該軽鎖フレームワーク領域が、３６Ｌ、４２Ｇ、４４Ｌ、６９Ｓ、７０Ｄおよび７１Ｙからなる群より選択される１以上の復帰突然変異を含む、
からなる群より選択される何れか１つを含む、
ここで、該復帰突然変異部位が、Kabat番号付け基準に従って番号付けされる、
請求項４に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項7】
ヒト化抗体が、配列番号３０、４１または４９に示す重鎖可変領域またはその変異体を含む、請求項６に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項8】
重鎖可変領域変異体が、配列番号３０、４１または４９に示す重鎖可変領域のＦＲ領域内に１－１０個のアミノ酸復帰突然変異を含む；好ましくは、重鎖可変領域変異体が、次の(G)から(I)：(G) 配列番号３０に示す重鎖可変領域のＦＲ領域内におけるＥ６Ｑ、Ｖ１０Ｇ、Ｓ３０Ｋ、Ｉ３７Ｖ、Ｌ４４Ｇ、Ａ４９ＧおよびＲ９４Ｇからなる群より選択される１以上の復帰突然変異を有する重鎖可変領域変異体；
(H) 配列番号４１に示す重鎖可変領域のＦＲ領域内におけるＲ３８Ｋ、Ｒ４４Ｇ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６６Ｋ、Ｖ６７Ａ、Ｉ６９ＬおよびＲ７１Ａからなる群より選択される１以上の復帰突然変異を有する重鎖可変領域変異体；ならびに
(I) 配列番号４９に示す重鎖可変領域のＦＲ領域内におけるＲ３８Ｍ、Ｇ４４Ｓ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６７Ａ、Ｍ６９Ｌ、Ｒ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ、Ｓ８２Ａ ＲおよびＲ９４Ｔからなる群より選択される１以上の復帰突然変異を有する重鎖可変領域変異体、
からなる群より選択される何れか１つである、
請求項７に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項9】
抗体が、次の(J)から(L)：(J) 配列番号３０、３７、３８、３９または４０に示す重鎖可変領域；
(K) 配列番号４１、４５、４６、４７または４８に示す重鎖可変領域；および
(L) 配列番号４９、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５または６６に示す重鎖可変領域
からなる群より選択される何れか１つの重鎖可変領域を含む、
請求項６から８のいずれか一項に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項10】
抗体が、配列番号３１、４２または５０に示す軽鎖可変領域もしくはその変異体を含む、請求項６に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項11】
軽鎖可変領域変異体が、配列番号３１、４２または５０に示す軽鎖可変領域のＦＲ領域内に１－１０個のアミノ酸復帰突然変異を有する；好ましくは、軽鎖可変領域変異体が、次の(M)から(O)：(M) 配列番号３１に示す軽鎖可変領域のＦＲ領域内におけるＹ３６Ｌ、Ｋ４２Ｇ、Ｐ４４Ｉ、Ｓ６０Ｋ、Ｔ６９Ｓ、Ｆ７１ＹおよびＴ８５Ｄからなる群より選択される１以上の復帰突然変異を有する軽鎖可変領域変異体；
(N) 配列番号４２に示す軽鎖可変領域のＦＲ領域内におけるＹ３６Ｌ、Ｋ４２Ｇ、Ｐ４４Ｉ、Ｇ６６Ｒ、Ｆ７１ＹおよびＴ８５Ｄからなる群より選択される１以上の復帰突然変異を有する軽鎖可変領域変異体；および
(O) 配列番号５０に示す軽鎖可変領域のＦＲ領域内におけるＹ３６Ｌ、Ｋ４２Ｇ、Ｐ４４Ｌ、Ｔ６９Ｓ、Ｅ７０ＤおよびＦ７１Ｙからなる群より選択される１以上の復帰突然変異を有する軽鎖可変領域変異体
からなる群より選択される何れか１つである、
請求項１０に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項12】
抗体が、次の(P)から(R)：(P) 配列番号３１、３２、３３、３４、３５または３６に示す軽鎖可変領域；
(Q) 配列番号４２、４３または４４に示す軽鎖可変領域；および
(R) 配列番号５０、５１、５２または５３に示す軽鎖可変領域
からなる群より選択される何れか１つの軽鎖可変領域
を含む、請求項６、１０および１１のいずれか一項に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項13】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、次の(S)から(U）：(S) 配列番号３０、３７、３８、３９もしくは４０に示すアミノ酸配列を有するか、または配列番号３０、３７、３８、３９もしくは４０に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号３１、３２、３３、３４、３５もしくは３６に示すアミノ酸配列を有するか、または配列番号３１、３２、３３、３４、３５もしくは３６に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を有する軽鎖可変領域；
(T) 配列番号４１、４５、４６、４７もしくは４８に示すアミノ酸配列を有するか、または配列番号４１、４５、４６、４７もしくは４８に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号４２、４３もしくは４４に示すアミノ酸配列を有するか、または配列番号４２、４３もしくは４４に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を有する軽鎖可変領域；ならびに
(U) 配列番号４９、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５もしくは６６に示すアミノ酸配列を有するか、または配列番号４９、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５もしくは６６に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号５０、５１、５２もしくは５３に示すアミノ酸配列を有するか、または配列番号５０、５１、５２もしくは５３に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を有する軽鎖可変領域
からなる群より選択される何れか１つの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む；好ましくは、該抗体またはその抗原結合フラグメントが、次の(V)から(X)：
(V) 配列番号３９に示す重鎖可変領域および配列番号３６に示す軽鎖可変領域；
(W) 配列番号４１に示す重鎖可変領域および配列番号４３に示す軽鎖可変領域；ならびに
(X) 配列番号６１に示す重鎖可変領域および配列番号５２に示す軽鎖可変領域
からなる群より選択される何れか１つを含む、
請求項６から１２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項14】
抗体が、定常領域を含む；好ましくは、該抗体の重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の変異配列に由来し、該抗体の軽鎖定常領域が、ヒトκ鎖、λ鎖またはそれらの変異配列に由来する；より好ましくは、該抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列が配列番号７７に示されるか、または配列番号７７と少なくとも８５％の配列同一性を有し、かつ該抗体の軽鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号７８に示されるか、または配列番号７８と少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項15】
抗体が、次のiv)からvi)：iv) 配列番号７９に示す配列を有するか、または配列番号７９と少なくとも８５％同一の配列を有する重鎖、ならびに配列番号８０に示す配列を有するか、または配列番号８０と少なくとも８５％同一の配列を有する軽鎖を含む、抗ＣＤ７３抗体；
v) 配列番号８１に示す配列を有するか、または配列番号８１と少なくとも８５％同一の配列を有する重鎖、ならびに配列番号８２に示す配列を有するか、または配列番号８２と少なくとも８５％同一の配列を有する軽鎖を含む、抗ＣＤ７３抗体；ならびに
vi) 配列番号８３に示す配列を有するか、または配列番号８３と少なくとも８５％同一の配列を有する重鎖ならびに配列番号８４に示す配列を有するか、または配列番号８４と少なくとも８５％同一の配列を有する軽鎖を含む、抗ＣＤ７３抗体；
からなる群より選択される何れか１つである、請求項１４に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項16】
抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体およびｄｓＦｖからなる群より選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項17】
ヒトＣＤ７３への結合について、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントと競合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項18】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子。
【請求項19】
請求項１８に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項20】
請求項１９に記載のベクターで形質転換することにより得られる宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞が、原核細胞および真核細胞からなる群より選択され、好ましくは真核細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞である、宿主細胞。
【請求項21】
増殖に適する条件下で適切な培地中で請求項２０に記載の宿主細胞を培養すること、該培地から該宿主細胞により発現される抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントを回収し、精製することを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントの作製方法。
【請求項22】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ７３抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項１８に記載の核酸分子、および１以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項23】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ７３抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項２２に記載の医薬組成物を、試験すべきサンプルと接触させて、試験すべきサンプル中のヒトＣＤ７３の存在またはレベルを判定すること
を含む、試験すべきサンプル中のヒトＣＤ７３を検出するためのインビトロの方法。
【請求項24】
疾患または障害の処置または予防のための医薬の製造を目的とする、請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント、または請求項１８に記載の核酸分子、または請求項２２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項25】
疾患または障害がヒトＣＤ７３に関連する、請求項２４に記載の使用。
【請求項26】
疾患または障害が、腫瘍である、好ましくは乳癌、神経膠腫、膀胱癌、結腸癌、黒色腫、卵巣癌、甲状癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、リンパ腫、前立腺癌または胃癌である、請求項２４または２５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野に属する。より具体的には、本発明は、抗ＣＤ７３抗体およびその使用に関する。
本発明は、バイオテクノロジーの分野に属する。より具体的には、本発明は、抗ＣＤ７３抗体およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
本発明は、本明細書の記載に関係する背景情報を提供するが、必ずしも先行技術を構成するものではない。
本発明は、本明細書の記載に関係する背景情報を提供するが、必ずしも先行技術を構成するものではない。
【0003】
細胞外－５’－ヌクレオチダーゼ（エクト－５’－ヌクレオチダーゼ、EC3.1.3.5、エクト－５’－ＮＴ）としても知られるＣＤ７３は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を介して膜に固定された糖タンパク質である。ＣＤ７３は、内皮細胞、リンパ球、Ｔｒｅｇなど、ヒト身体のさまざまな組織および細胞の表面に広く発現されている。最近の研究では、ＣＤ７３が様々な腫瘍で高発現していることが分かっている。多くの研究により、ＣＤ７３が腫瘍の発生および発達に密接に関係していることが確認されている。
【0004】
ヒトＣＤ７３をコードする遺伝子は、第６ｑ１４－ｑ２１染色体上に位置している。ＣＤ７３の進化は比較的保守的であり、ヒトＣＤ７３をコードするＤＮＡ配列は、マウスＤＮＡ配列と８６％の相同性を有する。ＣＤ７３遺伝子は５７ｋｂｐからなり、コード領域の長さは１，７２５ｂｐである。ＣＤ７３ゲノムのプロモーター領域配列のＧ＋Ｃ比は比較的高く、ＣＤ７３ゲノムは、１つのｃＡＭＰ応答要素（ｅＲＥ）、５つのＳｐ－１結合部位、２つのＡｐ－２結合部位、１つの低酸素応答要素（ＨＲＥ）および１つのＴＣＦ／ＬＥＦ結合部位を含む、多くの転写因子の結合部位を含む。プロモーターの上流領域には、３つのＧＡＴＡボックス、２つのＭｙｏＤ部位、ＩｇＨおよびＮＦ－κｂ結合部位ならびに３つのＣ－ＥＢＰ部位が存在する。ヒトＣＤ７３前駆体タンパク質は５７４個のアミノ酸残基からなる。ＣＤ７３分子のＮ末端のアミノ酸残基１－２６およびＣ末端のアミノ酸残基５５０－５７４を切除後、アミノ酸残基２７－５４９は成熟ＣＤ７３を構成し、分子量約７０ＫＤのサブユニットを形成する。２つのサブユニットが生物学的活性を有するホモダイマーを構成する。成熟ＣＤ７３は、５つのＮ－結合型グリコシル化部位を含み、Ｃ末端のアミノ酸配列はＧＰＩアンカー配列であり、ここで、５２３位のセリンがアンカー部位として機能し、ＧＰＩを介して細胞の外膜に固定されている。ＣＤ７３は、内因性のホスホリパーゼＣによるＧＰＩの加水分解により、細胞膜表面から脱落し、アデノシンの産生を減少させることができる。
【0005】
ＣＤ７３は、ヒト内皮細胞などの組織細胞およびリンパ球の表面に広く発現している。ＣＤ７３は細胞外ヌクレオチダーゼ活性を有し、ＡＭＰを加水分解してアデノシンを生成し、免疫抑制効果を発揮する。アデノシンが受容体に結合することで、血管形成の促進、組織の虚血再灌流障害を防ぎ、炎症と免疫応答を阻害することができる。最近、アデノシンがヒト血管内皮細胞の炎症反応を抑制することが発見されている。また、ＣＤ７３は非加水分解活性を有し、細胞接着およびシグナル伝達に関与している。
【0006】
ＣＤ７３は、腫瘍の発生および発達に重要な役割を果たしている。ＣＤ７３は、腫瘍血管形成に関与している。関連研究では、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を有するＣ５７ＢＬ/６マウスにおいて、ＣＤ７３がインビボでの新生血管形成を促進することが示されている。ＣＤ７３の薬理学的阻害により、新生血管の数を減らし、新生血管の成熟を妨げることができ、それにより黒色腫の血管形成を減らすことができる。また、別の研究では、腫瘍を有するマウスを抗ＣＤ７３モノクローナル抗体で処置すると、腫瘍の血管形成を低減できることがわかっている。ＣＤ７３はまた、その酵素的機能および非酵素的機能に基づき、微小血管内皮細胞の遊走を促進して管状構造を形成することもできる。ＣＤ７３は、細胞増殖タンパク質Ｄ１を上方制御することで、上皮細胞の増殖を誘導する。また、ＣＤ７３が産生するアデノシンは、Ａ２Ａ受容体による組織の低酸素化を介して、ＶＥＧＦの産生および放出を促進し、新生血管形成を補助することができる。
【0007】
次に、ＣＤ７３が腫瘍細胞の増殖を促進できることが、インビボおよびインビトロの研究で示されている。ZHIらの研究結果（Cancer Sci, 2010, 101(12): 2561-2569）では、ＣＤ７３の発現をｓｉＲＮＡで阻害することで、細胞周期およびアポトーシスを阻害し、それにより乳癌細胞の増殖および分化を抑制できることが示されている。ＣＤ７３酵素活性の特異的阻害剤である５’－α,β－メチレン－アデノシン二リン酸（ＡＰＣＰ）の使用はまた、用量依存的に腫瘍細胞の増殖を阻害することができる。ＣＤ７３をトランスフェクトした乳癌細胞におけるＣＤ７３の過剰発現は、細胞の生存率を高め、細胞周期を促進した。ある研究者は、ＡＰＣＰが神経膠腫細胞の増殖を３０％減少させることができるのに対し、アデノシンは細胞増殖を３５％増加させることができることを見出した。Stagg Jら（PNAS, 2010, 107(4):1547-1552）は、悪性度の高い膀胱癌細胞ではＣＤ７３の活性が有意に上昇していることを発見し、プリンシグナル伝達経路が膀胱腫瘍の形成を促進することを確認している。さらに、ＣＤ７３は、結腸癌細胞、黒色腫細胞およびリンパ腫細胞の増殖を促進することもできる。最近の研究では、上方制御されたＣＤ７３発現を有する白血病Ｔリンパ球が、ＴＲＡＩＬにより誘導されるアポトーシスを特異的に阻害し、細胞内に複数の薬剤に対する耐性を誘導することで、腫瘍細胞の生存を促進することがわかっている。
【0008】
さらに、腫瘍細胞の表面に発現する腫瘍由来のＣＤ７３は、腫瘍の免疫回避の重要な理由となっている。RYZHOVら（J Immunol, 2011, 187(11):6120-6129）もまた、腫瘍内のＣＤ７３がＭＤＳＣ（骨髄由来免疫抑制細胞）の侵襲および凝集に関連しているが、一方、ＭＤＳＣはＴ細胞の活性化を阻害する未熟な骨髄細胞であることも見出した。腫瘍微小環境中のアデノシンはまた、Ｔｒｅｇが免疫活動を抑制するのにも役立つ。従って、ＣＤ７３は免疫応答を抑制することにより、間接的に腫瘍の進行を促進することができる。
【0009】
腫瘍における上記の役割に加えて、ＣＤ７３は腫瘍の転移にも密接に関連していることがわかっている。腫瘍の転移に必要な第一条件は、腫瘍細胞の移動能力を高めるために攻撃的な表現型を獲得することを意味する。ＣＤ７３と転移関連マーカーとの関連性が発見されている。ＣＤ７３レベルは、非転移性前立腺癌と比較して、リンパ転移性前立腺癌の患者で有意に高く、このことはＣＤ７３が腫瘍細胞の転移プロセスにおいて重要な役割を果たしている可能性を示している。XIONGら（Cell Tissue Res, 2014, 355(2):365-374）は、ＣＤ７３が腫瘍細胞の間葉系形質転換を誘導することで、転移および侵襲を促進できることを示している。STAGGとWangら（Cancer Res, 2011, 71(8): 2892-2900; J Cancer Res Clin Oncol, 2008, 134(3): 365-372）は、ＣＤ７３欠損マウスがＢ１６Ｆ１０黒色腫を静脈注射した後の肺転移腫瘍の発生にインビボで抵抗性を示し、ＣＤ７３欠損宿主が腫瘍Ｔ細胞特異的抗原の腫瘍内へのホーミングを増強できることを見出した。腫瘍患者における臨床治験ではまた、腫瘍におけるＣＤ７３の過剰発現が、胃癌、前立腺癌および悪性黒色腫の転移と関連していることを明らかにした。以上の結果から、宿主ＣＤ７３および腫瘍ＣＤ７３の両方が腫瘍の転移を顕著に促進できることが証明され、一方で、ＣＤ７３欠損宿主における腫瘍転移に対する抵抗性は、内因性の抗腫瘍免疫の増強に関係している。
【0010】
現在、ＣＤ７３関連抗体は、ＵＳ９９３８３５６、ＵＳ９６０５０８０、ＷＯ２０１６０７５０９９、ＷＯ２０１７１５２０８５、ＷＯ２０１７０６４０４３およびＷＯ２０１８０１３６１１などの特許出願に記載されている。
【発明の概要】
【0011】
発明の概要
本発明者らは、多数の試験を経て、新規な抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントを開発した。
本発明者らは、多数の試験を経て、新規な抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントを開発した。
【0012】
ある態様において、本明細書は、ヒトＣＤ７３に特異的に結合する抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントを開示しており、ここで、該抗体は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域は、配列番号２７、２８および２９にそれぞれ示される軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むか、または配列番号２７、２８および２９にそれぞれ示される配列に対して３個以下のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ変異体を含み、かつ
その重鎖可変領域は、
i) 配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３または配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示される配列に対して３個以下のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ変異体；
ii) 配列番号１６、１７および１８にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３または配列番号１６、１７および１８にそれぞれ示される配列に対して３個以下のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ変異体；あるいは、
iii) 配列番号２２、６７および２４にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３または配列番号２２、６７および２４にそれぞれ示される配列に対して３個以下のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ変異体
を含む。
該軽鎖可変領域は、配列番号２７、２８および２９にそれぞれ示される軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むか、または配列番号２７、２８および２９にそれぞれ示される配列に対して３個以下のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ変異体を含み、かつ
その重鎖可変領域は、
i) 配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３または配列番号１０、１１および１２にそれぞれ示される配列に対して３個以下のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ変異体；
ii) 配列番号１６、１７および１８にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３または配列番号１６、１７および１８にそれぞれ示される配列に対して３個以下のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ変異体；あるいは、
iii) 配列番号２２、６７および２４にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３または配列番号２２、６７および２４にそれぞれ示される配列に対して３個以下のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ変異体
を含む。
【0013】
ある態様において、上記の“３個以下のアミノ酸変異”とは、３個、２個、１個または０個のアミノ酸変異を意味する。
【0014】
ある態様において、本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントは、１０－７Ｍに等しいかまたはそれ以下の解離平衡定数でヒトＣＤ７３に結合する。ある態様において、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍまたは１０－１１Ｍに等しいかまたはそれ以下の解離平衡定数でヒトＣＤ７３に結合する。
【0015】
ある態様において、本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントは、
iv) 配列番号１０、１１、１２、１３、１４および１５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；
v) 配列番号１６、１７、１８、１９、２０および２１にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；あるいは
vi)配列番号２３、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５または７６に示されるＨＣＤＲ２ならびに配列番号２２、２４、２５、１４および２６にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３
を含む。
iv) 配列番号１０、１１、１２、１３、１４および１５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；
v) 配列番号１６、１７、１８、１９、２０および２１にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；あるいは
vi)配列番号２３、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５または７６に示されるＨＣＤＲ２ならびに配列番号２２、２４、２５、１４および２６にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３
を含む。
【0016】
ある態様において、本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントは、
vii) 配列番号２２、２３、２４、２５、１４および２６にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；
viii)配列番号２２、７１、２４、２５、１４および２６にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；あるいは
ix) 配列番号２２、７６、２４、２５、１４および２６にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３
を含む。
vii) 配列番号２２、２３、２４、２５、１４および２６にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；
viii)配列番号２２、７１、２４、２５、１４および２６にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；あるいは
ix) 配列番号２２、７６、２４、２５、１４および２６にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３
を含む。
【0017】
ある態様において、本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントは、組換え抗体、好ましくはマウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。
【0018】
ある態様において、本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントは、次の（Ａ）から（Ｃ）：
（Ａ）配列番号４に示される重鎖可変領域および配列番号５に示される軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント；
（Ｂ）配列番号６に示される重鎖可変領域および配列番号７に示される軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント；ならびに
（Ｃ）配列番号８に示される重鎖可変領域および配列番号９に示される軽鎖可変領域抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント
に定義される何れかの抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントから選択されるマウス抗体またはキメラ抗体である。
（Ａ）配列番号４に示される重鎖可変領域および配列番号５に示される軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント；
（Ｂ）配列番号６に示される重鎖可変領域および配列番号７に示される軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント；ならびに
（Ｃ）配列番号８に示される重鎖可変領域および配列番号９に示される軽鎖可変領域抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント
に定義される何れかの抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントから選択されるマウス抗体またはキメラ抗体である。
【0019】
本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントのある態様において、抗体はヒト化抗体であり、該抗体の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）および重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）はそれぞれ、ヒト生殖細胞由来の軽鎖および重鎖またはその変異配列（複数可）に由来している。好ましくは、該ヒト化抗体は、次の（Ｄ）から（Ｆ）：
（Ｄ）配列番号１０、１１、１２、１３、１４および１５のそれぞれに示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに重鎖フレームワーク領域（複数可）および軽鎖フレームワーク領域（複数可）であって、ここで、該重鎖フレームワーク領域（複数可）は、６Ｑ、１０Ｇ、３０Ｋ、３７Ｖ、４４Ｇ、４９Ｇおよび９４Ｇからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を含み、該軽鎖フレームワーク領域（複数可）は、３６Ｌ、４２Ｇ、４４Ｉ、６０Ｋ、６９Ｓ、７１Ｙおよび８５Ｄからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を含む；
（Ｅ）配列番号１６、１７、１８、１９、２０および２１にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに重鎖フレームワーク領域（複数可）および軽鎖フレームワーク領域（複数可）であって、ここで、該重鎖フレームワーク領域（複数可）は、３８Ｋ、４４Ｇ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、６９Ｌおよび７１Ａからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を含み、該軽鎖フレームワーク領域（複数可）は、３６Ｌ、４２Ｇ、４４Ｉ、６６Ｒ、７１Ｙおよび８５Ｄからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を含む；
（Ｆ）配列番号２３、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５または７６に示されるＨＣＤＲ２、ならびに配列番号２２、２４、２５、１４および２６にそれぞれ示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに重鎖フレームワーク領域（複数可）および軽鎖フレームワーク領域（複数可）であって、該重鎖フレームワーク領域（複数可）は、３８Ｍ、４４Ｓ、４８Ｉ、６７Ａ、６９Ｌ、７１Ｖ、７３Ｋ、８２Ａ Ｒおよび９４Ｔからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を含み、該軽鎖フレームワーク領域（複数可）は、３６Ｌ、４２Ｇ、４４Ｌ、６９Ｓ、７０Ｄおよび７１Ｙからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を含む；ここで、復帰突然変異の位置は、Kabatの番号付け基準に従って番号付けされる、
からなる群より選択される何れか１つを含む。本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントのある態様において、抗体は、配列番号３０、４１もしくは４９に示される重鎖可変領域またはその変異体（複数可）を含む。
（Ｄ）配列番号１０、１１、１２、１３、１４および１５のそれぞれに示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに重鎖フレームワーク領域（複数可）および軽鎖フレームワーク領域（複数可）であって、ここで、該重鎖フレームワーク領域（複数可）は、６Ｑ、１０Ｇ、３０Ｋ、３７Ｖ、４４Ｇ、４９Ｇおよび９４Ｇからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を含み、該軽鎖フレームワーク領域（複数可）は、３６Ｌ、４２Ｇ、４４Ｉ、６０Ｋ、６９Ｓ、７１Ｙおよび８５Ｄからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を含む；
（Ｅ）配列番号１６、１７、１８、１９、２０および２１にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに重鎖フレームワーク領域（複数可）および軽鎖フレームワーク領域（複数可）であって、ここで、該重鎖フレームワーク領域（複数可）は、３８Ｋ、４４Ｇ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、６９Ｌおよび７１Ａからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を含み、該軽鎖フレームワーク領域（複数可）は、３６Ｌ、４２Ｇ、４４Ｉ、６６Ｒ、７１Ｙおよび８５Ｄからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を含む；
（Ｆ）配列番号２３、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５または７６に示されるＨＣＤＲ２、ならびに配列番号２２、２４、２５、１４および２６にそれぞれ示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに重鎖フレームワーク領域（複数可）および軽鎖フレームワーク領域（複数可）であって、該重鎖フレームワーク領域（複数可）は、３８Ｍ、４４Ｓ、４８Ｉ、６７Ａ、６９Ｌ、７１Ｖ、７３Ｋ、８２Ａ Ｒおよび９４Ｔからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を含み、該軽鎖フレームワーク領域（複数可）は、３６Ｌ、４２Ｇ、４４Ｌ、６９Ｓ、７０Ｄおよび７１Ｙからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を含む；ここで、復帰突然変異の位置は、Kabatの番号付け基準に従って番号付けされる、
からなる群より選択される何れか１つを含む。本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントのある態様において、抗体は、配列番号３０、４１もしくは４９に示される重鎖可変領域またはその変異体（複数可）を含む。
【0020】
本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントのある態様において、重鎖可変領域変異体は、配列番号３０、４１または４９に示される重鎖可変領域のＦＲ領域（複数可）上に１～１０個のアミノ酸復帰突然変異（複数可）を有する。
【0021】
ある態様において、本発明の重鎖可変領域変異体は、次の（Ｇ）－（Ｉ）：
（Ｇ）配列番号３０に示される重鎖可変領域のＦＲ領域上のＥ６Ｑ、Ｖ１０Ｇ、Ｓ３０Ｋ、Ｉ３７Ｖ、Ｌ４４Ｇ、Ａ４９ＧおよびＲ９４Ｇからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を有する重鎖可変領域変異体；
（Ｈ）配列番号４１に示される重鎖可変領域のＦＲ領域上のＲ３８Ｋ、Ｒ４４Ｇ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６６Ｋ、Ｖ６７Ａ、Ｉ６９ＬおよびＲ７１Ａからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を有する重鎖可変領域変異体；ならびに
（Ｉ）配列番号４９に示される重鎖可変領域のＦＲ領域（複数可）上のＲ３８Ｍ、Ｇ４４Ｓ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６７Ａ、Ｍ６９Ｌ、Ｒ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ、Ｓ８２ＡＲおよびＲ９４Ｔからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を有する重鎖可変領域変異体
からなる群より選択される何れか１つである。
（Ｇ）配列番号３０に示される重鎖可変領域のＦＲ領域上のＥ６Ｑ、Ｖ１０Ｇ、Ｓ３０Ｋ、Ｉ３７Ｖ、Ｌ４４Ｇ、Ａ４９ＧおよびＲ９４Ｇからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を有する重鎖可変領域変異体；
（Ｈ）配列番号４１に示される重鎖可変領域のＦＲ領域上のＲ３８Ｋ、Ｒ４４Ｇ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６６Ｋ、Ｖ６７Ａ、Ｉ６９ＬおよびＲ７１Ａからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を有する重鎖可変領域変異体；ならびに
（Ｉ）配列番号４９に示される重鎖可変領域のＦＲ領域（複数可）上のＲ３８Ｍ、Ｇ４４Ｓ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６７Ａ、Ｍ６９Ｌ、Ｒ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ、Ｓ８２ＡＲおよびＲ９４Ｔからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を有する重鎖可変領域変異体
からなる群より選択される何れか１つである。
【0022】
ある態様において、本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントは、次の（Ｊ）－（Ｌ）：
（Ｊ）配列番号３０、３７、３８、３９または４０に示される重鎖可変領域；
（Ｋ）配列番号４１、４５、４６、４７または４８に示される重鎖可変領域；および
（Ｌ）配列番号４９、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５または６６に示される重鎖可変領域
からなる群より選択される何れか１つの重鎖可変領域を含む。
（Ｊ）配列番号３０、３７、３８、３９または４０に示される重鎖可変領域；
（Ｋ）配列番号４１、４５、４６、４７または４８に示される重鎖可変領域；および
（Ｌ）配列番号４９、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５または６６に示される重鎖可変領域
からなる群より選択される何れか１つの重鎖可変領域を含む。
【0023】
本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントのある態様において、抗体は、配列番号３１、４１もしくは５０に示される軽鎖可変領域またはその変異体（複数可）を含む。
【0024】
本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントのある態様において、軽鎖可変領域変異体は、配列番号３１、４１または５０に示される軽鎖可変領域のＦＲ領域（複数可）上に１～１０個のアミノ酸復帰突然変異（複数可）を有する。
【0025】
ある態様において、本明細書に記載の軽鎖可変領域変異体は、次の（Ｍ）－（Ｏ）：
（Ｍ）配列番号３１に示される軽鎖可変領域のＦＲ領域（複数可）上の３６Ｌ、４２Ｇ、４４Ｉ、６０Ｋ、６９Ｓ、Ｆ７１ＹおよびＴ８５Ｄからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を有する軽鎖可変領域変異体；
（Ｎ）配列番号４２に示される軽鎖可変領域のＦＲ領域（複数可）上のＹ３６Ｌ、Ｋ４２Ｇ、Ｐ４４Ｉ、Ｇ６６Ｒ、Ｆ７１ＹおよびＴ８５Ｄからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を有する軽鎖可変領域変異体；ならびに
（Ｏ）配列番号５０に示される軽鎖可変領域のＦＲ領域（複数可）上のＹ３６Ｌ、Ｋ４２Ｇ、Ｐ４４Ｌ、Ｔ６９Ｓ、Ｅ７０ＤおよびＦ７１Ｙからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を有する軽鎖可変領域変異体
からなる群より選択される何れか１つである。
（Ｍ）配列番号３１に示される軽鎖可変領域のＦＲ領域（複数可）上の３６Ｌ、４２Ｇ、４４Ｉ、６０Ｋ、６９Ｓ、Ｆ７１ＹおよびＴ８５Ｄからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を有する軽鎖可変領域変異体；
（Ｎ）配列番号４２に示される軽鎖可変領域のＦＲ領域（複数可）上のＹ３６Ｌ、Ｋ４２Ｇ、Ｐ４４Ｉ、Ｇ６６Ｒ、Ｆ７１ＹおよびＴ８５Ｄからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を有する軽鎖可変領域変異体；ならびに
（Ｏ）配列番号５０に示される軽鎖可変領域のＦＲ領域（複数可）上のＹ３６Ｌ、Ｋ４２Ｇ、Ｐ４４Ｌ、Ｔ６９Ｓ、Ｅ７０ＤおよびＦ７１Ｙからなる群より選択される１以上の復帰突然変異（複数可）を有する軽鎖可変領域変異体
からなる群より選択される何れか１つである。
【0026】
ある態様において、本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントは、次の（Ｐ）－（Ｒ）：
（Ｐ）配列番号３１、３２、３３、３４、３５または３６に示される軽鎖可変領域；
（Ｑ）配列番号４２、４３または４４に示される軽鎖可変領域；および
（Ｒ）配列番号５０、５１、５２または５３に示される軽鎖可変領域
からなる群より選択される何れか１つの軽鎖可変領域を含む。
（Ｐ）配列番号３１、３２、３３、３４、３５または３６に示される軽鎖可変領域；
（Ｑ）配列番号４２、４３または４４に示される軽鎖可変領域；および
（Ｒ）配列番号５０、５１、５２または５３に示される軽鎖可変領域
からなる群より選択される何れか１つの軽鎖可変領域を含む。
【0027】
ある態様において、本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントは、次の（Ｓ）－（Ｕ）：
（Ｓ）配列番号３０、３７、３８、３９もしくは４０のアミノ酸配列に示されるか、または配列番号４１、４５、４６、４７もしくは４８と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および配列番号３１、３２、３３、３４、３５もしくは３６のアミノ酸配列に示されるか、または配列番号４２、４３もしくは４４と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域；
（Ｔ）配列番号４１、４５、４６、４７もしくは４８のアミノ酸配列に示されるか、または配列番号４１、４５、４６、４７もしくは４８と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および配列番号４２、４３もしくは４４のアミノ酸配列に示されるか、または配列番号４２、４３もしくは４４と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域；ならびに
（Ｕ）配列番号４９、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５もしくは６６のアミノ酸配列に示されるか、または配列番号４９、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５もしくは６６と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および配列番号５０、５１、５２もしくは５３のアミノ酸配列に示されるか、または配列番号５０、５１、５２もしくは５３と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域
からなる群より選択される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
（Ｓ）配列番号３０、３７、３８、３９もしくは４０のアミノ酸配列に示されるか、または配列番号４１、４５、４６、４７もしくは４８と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および配列番号３１、３２、３３、３４、３５もしくは３６のアミノ酸配列に示されるか、または配列番号４２、４３もしくは４４と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域；
（Ｔ）配列番号４１、４５、４６、４７もしくは４８のアミノ酸配列に示されるか、または配列番号４１、４５、４６、４７もしくは４８と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および配列番号４２、４３もしくは４４のアミノ酸配列に示されるか、または配列番号４２、４３もしくは４４と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域；ならびに
（Ｕ）配列番号４９、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５もしくは６６のアミノ酸配列に示されるか、または配列番号４９、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５もしくは６６と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および配列番号５０、５１、５２もしくは５３のアミノ酸配列に示されるか、または配列番号５０、５１、５２もしくは５３と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域
からなる群より選択される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
【0028】
ある態様において、本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントは、次の（Ｖ）－（Ｘ）：
（Ｖ）配列番号３９に示される重鎖可変領域および配列番号３６に示される軽鎖可変領域；
（Ｗ）配列番号４１に示される重鎖可変領域および配列番号４３に示される軽鎖可変領域；ならびに
（Ｘ）配列番号６１に示される重鎖可変領域および配列番号５２に示される軽鎖可変領域
からなる群より選択される何れか１つを含む。
（Ｖ）配列番号３９に示される重鎖可変領域および配列番号３６に示される軽鎖可変領域；
（Ｗ）配列番号４１に示される重鎖可変領域および配列番号４３に示される軽鎖可変領域；ならびに
（Ｘ）配列番号６１に示される重鎖可変領域および配列番号５２に示される軽鎖可変領域
からなる群より選択される何れか１つを含む。
【0029】
ある態様において、本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントは、定常領域（複数可）を含む。
【0030】
ある態様において、本発明の抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であって、その重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の変異配列（複数可）に由来し、そして軽鎖定常領域は、ヒトκ鎖、λ鎖もしくはその変異配列（複数可）に由来する。
【0031】
ある態様において、本発明の抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号７７に示されるか、または配列番号７７と少なくとも８５％の配列同一性を有し、そして軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号７８に示されるか、または配列番号７８と少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【0032】
ある態様において、少なくとも８５％の配列同一性を有する上記のアミノ酸配列は、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を意味する。
【0033】
ある態様において、少なくとも８５％の配列同一性を有する上記のアミノ酸配列は、１以上のアミノ酸（複数可）の欠失、挿入または置換変異により得られるものを含む。
【0034】
本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントのある態様において、抗体は、次のiv)～vi)：
iv) 配列番号７９に示されるか、または配列番号７９と少なくとも８５％の配列同一性を有する重鎖および配列番号８０に示されるか、または配列番号８０と少なくとも８５％の配列同一性を有する軽鎖を含む抗ＣＤ７３抗体；
v) 配列番号８１に示されるか、または配列番号８１と少なくとも８５％の配列同一性を有する重鎖および配列番号８２に示されるか、または配列番号８２と少なくとも８５％の配列同一性を有する軽鎖を含む抗ＣＤ７３抗体；ならびに
vi) 配列番号８３に示されるか、または配列番号８３と少なくとも８５％の配列同一性を有する重鎖および配列番号８４に示されるか、または配列番号８４と少なくとも８５％の配列同一性を有する軽鎖を含む抗ＣＤ７３抗体
からなる群より選択される何れか１つである。
iv) 配列番号７９に示されるか、または配列番号７９と少なくとも８５％の配列同一性を有する重鎖および配列番号８０に示されるか、または配列番号８０と少なくとも８５％の配列同一性を有する軽鎖を含む抗ＣＤ７３抗体；
v) 配列番号８１に示されるか、または配列番号８１と少なくとも８５％の配列同一性を有する重鎖および配列番号８２に示されるか、または配列番号８２と少なくとも８５％の配列同一性を有する軽鎖を含む抗ＣＤ７３抗体；ならびに
vi) 配列番号８３に示されるか、または配列番号８３と少なくとも８５％の配列同一性を有する重鎖および配列番号８４に示されるか、または配列番号８４と少なくとも８５％の配列同一性を有する軽鎖を含む抗ＣＤ７３抗体
からなる群より選択される何れか１つである。
【0035】
本発明のある態様において、少なくとも８５％の配列同一性を有する上記のアミノ酸配列は、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を意味する。
【0036】
ある特定の態様において、少なくとも８５％の配列同一性を有する上記のアミノ酸配列は、１以上のアミノ酸（複数可）の欠失、挿入または置換変異により得られるものを含む。ある特定の態様において、少なくとも８５％の配列同一性を有する上記のアミノ酸配列は、抗体の軽鎖または重鎖アミノ酸配列（複数可）のフレームワーク領域（複数可）または定常領域（複数可）中における１以上のアミノ酸（複数可）の欠失、挿入または置換変異により得られる。
【0037】
本発明の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントのある態様において、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体およびｄｓＦｖからなる群より選択される。
【0038】
ある態様において、本明細書は、ヒトＣＤ７３への結合について上記の抗体または抗原結合フラグメントの何れかと競合するか、あるいは上記の抗体または抗原結合フラグメントの何れかと同じヒトＣＤ７３エピトープおよび／またはサルＣＤ７３エピトープに結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを記載する。
【0039】
ある態様において、本明細書は、上記の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントの何れか１つをコードする核酸分子を記載する。
【0040】
ある態様において、本明細書は、上記の核酸分子を含むベクターを記載する。
【0041】
ある態様において、本明細書は、上記の組換えベクターを形質転換することにより得られる宿主細胞を記載する。この宿主細胞は、原核細胞および真核細胞からなる群より選択される。ある態様において、宿主細胞は真核細胞である。ある態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。宿主細胞は、ヒト胚性幹細胞、受精卵および生殖細胞など、完全な個体に発達することができるヒト細胞を含まない。
【0042】
ある態様において、本明細書は、上記の何れかの抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントを作製する方法であって、増殖に適する条件下、適切な培地中で上記の宿主細胞を培養し、その培地から抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントを回収および精製する工程を含む方法を記載する。
【0043】
ある態様において、本明細書は、上記の宿主細胞の何れか１つにより発現される抗ＣＤ７３抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは核酸分子、および１以上の薬学的に許容される担体（複数可）、賦形剤（複数可）または希釈剤（複数可）を含む医薬組成物を記載する。
【0044】
ある態様において、該医薬組成物は、単位用量で０．０１重量％～９９重量％の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントを含み得る。ある態様において、該医薬組成物は、単位用量で０．１－２０００ｍｇのモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。他の態様において、該医薬組成物は、単位用量で１－１０００ｍｇのモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【0045】
ある態様において、本明細書は、試験すべきサンプル中のヒトＣＤ７３を検出するためのインビトロの方法であって、上記の試験すべきサンプルを抗ＣＤ７３抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは医薬組成物の何れかと接触させること;および
試験すべきサンプル中のヒトＣＤ７３の存在またはレベルを判定する工程
を含む方法を記載する。
試験すべきサンプル中のヒトＣＤ７３の存在またはレベルを判定する工程
を含む方法を記載する。
【0046】
ある態様において、本明細書は、疾患または障害の処置または予防のための医薬の製造における上記の抗ＣＤ７３抗体もしくは抗原結合フラグメント、核酸分子または医薬組成物の何れかの使用を記載する。ある態様において、記載の疾患または障害は、ＣＤ７３関連疾患または障害である。
【0047】
ある態様において、ＣＤ７３関連疾患または障害は、細胞増殖性疾患であり、ある態様において、該細胞増殖性疾患は腫瘍である。
【0048】
ある態様において、腫瘍は、乳癌、神経膠腫、膀胱癌、結腸癌、黒色腫、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、リンパ腫、前立腺癌および胃癌からなる群より選択される。ある態様において、腫瘍は、転移性腫瘍である。
【0049】
ある態様において、本明細書は、ＣＤ７３関連疾患または障害の処置または予防のための方法であって、対象に治療的有効量の上記の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメント、それをコードする核酸分子、あるいはそれを含む医薬組成物を投与することを含む方法を記載する。ある態様において、該疾患は細胞増殖性疾患である。ある態様において、該細胞増殖性疾患は腫瘍である。ある態様において、該腫瘍は、乳癌、神経膠腫、膀胱癌、結腸癌、黒色腫、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、リンパ腫、前立腺癌および胃癌からなる群より選択される。ある態様において、該腫瘍は転移性腫瘍である。
【0050】
ある態様において、本明細書は、疾患（細胞増殖性疾患など）の処置または予防のための、抗ＣＤ７３抗体もしくはその抗原結合フラグメント、それを含む医薬組成物、またはそれをコードする核酸分子を記載する。該処置または予防は、薬学的に有効量の上記の抗ＣＤ７３抗体もしくはその抗原結合フラグメント、医薬組成物または核酸分子を対象に投与することを含む。ある態様において、細胞増殖性疾患は腫瘍である。ある態様において、腫瘍は、乳癌、神経膠腫、膀胱癌、結腸癌、黒色腫、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、リンパ腫、前立腺癌および胃癌からなる群より選択される。ある態様において、腫瘍は転移性腫瘍である。
【0051】
ある態様において、本明細書は、医薬として用いるための、上記の抗ＣＤ７３抗体もしくはその抗原結合フラグメント、それをコードする核酸分子、またはそれを含む医薬組成物を記載する。好ましくは、該医薬は、ヒトＣＤ７３関連疾患または障害の処置または予防に使用できる。より好ましくは、該医薬は、細胞増殖性疾患、好ましくは腫瘍、より好ましくは乳癌、神経膠腫、膀胱癌、結腸癌、黒色腫、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、リンパ腫、前立腺癌または胃癌の処置に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【発明を実施するための形態】
【0053】
詳細な説明
抗ＣＤ７３抗体については関連文献に記載されているが、臨床用途のために市販されているＣＤ７３抗体製品は存在しない。本発明者らは、多数の実験後、良好な生物学的活性を有する新規な抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントを開発した。
抗ＣＤ７３抗体については関連文献に記載されているが、臨床用途のために市販されているＣＤ７３抗体製品は存在しない。本発明者らは、多数の実験後、良好な生物学的活性を有する新規な抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントを開発した。
【0054】
本発明をより理解しやすくするために、特定の技術用語および科学用語を次に具体的に定義する。本明細書で明示的に定義されない限り、本明細書で用いる全ての他の技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【0055】
本明細書で用いるアミノ酸の３文字コードおよび１文字コードは、J. biol. chem, 243, p3558(1968)に記載されている通りである。
【0056】
本明細書で用いる“抗体”とは、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖が鎖間ジスルフィド結合で結合した４つのペプチド鎖構造を形成する免疫グロブリンを意味する。免疫グロブリンの重鎖定常領域は、異なるアミノ酸組成および配列を有しているため、異なる抗原性を示す。従って、免疫グロブリンは、重鎖μ、δ、γ、αおよびεにそれぞれに対応する、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥの５つのタイプまたは免疫グロブリンアイソタイプに分類できる。ヒンジ領域のアミノ酸組成や重鎖ジスルフィド結合の数および位置に応じて、同じタイプのＩｇはさらに異なるサブタイプに分けることができ、例えば、ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けられる。軽鎖は、異なる定常領域に基づいてκ鎖またはλ鎖に分けられる。５種類のＩｇのそれぞれは、κ鎖またはλ鎖を有し得る。
【0057】
本明細書中、本明細書に記載の抗体軽鎖は、軽鎖定常領域をさらに含んでいてよく、該軽鎖定常領域は、ヒトまたはマウスのκ鎖、λ鎖またはそれらの変異体（複数可）を含む。
【0058】
本明細書中、本明細書に記載の抗体重鎖は、重鎖定常領域をさらに含んでいてよく、該重鎖定常領域は、ヒトまたはマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらの変異体（複数可）を含む。
【0059】
抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端に隣接する約１１０個のアミノ酸配列は、可変領域（Ｆｖ領域）と呼ばれる高度に可変な領域であり、Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列は、定常領域と呼ばれる比較的安定した領域である。可変領域には、３つの超可変領域（ＨＶＲ）および比較的保守的な配列を有する４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が含まれる。抗体の特異性を決定する３つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても知られている。軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）のそれぞれは、３つのＣＤＲ領域と４つのＦＲ領域からなり、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置されている。軽鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を意味し、重鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を意味する。本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントのＬＣＶＲ領域およびＨＣＶＲ領域のＣＤＲアミノ酸残基の数および位置は、既知のKabatの番号付け基準に従う（ＬＣＤＲ１－３、ＨＣＤＲ１－３）。
【0060】
用語“相補性決定領域”、“ＣＤＲ”または“超可変領域”とは、主に抗原結合に寄与する、抗体の可変ドメインに存在する６つの超可変領域の１つを意味する。一般的に、各重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、各軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。ＣＤＲのアミノ酸配列の境界は、“Kabat”の番号付け基準（Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD参照）、“Chothia”の番号付け基準（Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273:927-948参照）およびImmunoGenTics (IMGT)の番号付け基準（Lefranc MP, Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, MP, etc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003), etc）を含む、種々の周知の方法で決定することができる。例えば、古典的なフォーマットの場合、Kabat基準に従うと、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基は、３１－３５（ＨＣＤＲ１）、５０－６５（ＨＣＤＲ２）および９５－１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基は、２４－３４（ＬＣＤＲ１）、５０－５６（ＬＣＤＲ２）および８９－９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされる。Chothia基準に従うと、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基は、２６－３２（ＨＣＤＲ１）、５２－５６（ＨＣＤＲ２）および９５－１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、ＶＬのアミノ酸残基は、２６－３２（ＬＣＤＲ１）、５０－５２（ＬＣＤＲ２）および９１－９６（ＬＣＤＲ３）と番号付けされる。KabatとChothiaの両方を組み合わせてＣＤＲを定義すると、ＣＤＲは、ヒトＶＨのアミノ酸残基２６－３５（ＨＣＤＲ１）、５０－６５（ＨＣＤＲ２）および９５－１０２（ＨＣＤＲ３）およびヒトＶＬのアミノ酸残基２４－３４（ＬＣＤＲ１）、５０－５６（ＬＣＤＲ２）および８９－９７（ＬＣＤＲ３）からなる。ＩＭＧＴ基準に従うと、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基は、通常、２６－３５（ＣＤＲ１）、５１－５７（ＣＤＲ２）および９３－１０２（ＣＤＲ３）と番号付けされ、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基は、通常、２７－３２（ＣＤＲ１）、５０－５２（ＣＤＲ２）および８９－９７（ＣＤＲ３）と番号付けされる。ＩＭＧＴ基準に従うと、抗体のＣＤＲ領域を、IMGT/DomainGap Align Programを用いて決定することができる。
【0061】
本発明の抗体としては、マウス抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体が挙げられ、好ましくはヒト化抗体である。
【0062】
本明細書で用いる用語“マウス抗体”とは、当技術分野の知識および技術に従って調製された、例えば、抗ヒトＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体を意味する。調製の際には、対象にＣＤ７３抗原を注射し、その後、所望の配列または機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを分離する。本発明の好ましい態様において、マウスＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスκ鎖、λ鎖もしくはその変異体(複数可)の軽鎖定常領域をさらに含むか、またはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４もしくはその変異体(複数可)の重鎖定常領域をさらに含む。
【0063】
用語“キメラ抗体”とは、ある種（例えば、マウスなど）の抗体可変領域(複数可)と他の種（例えば、ヒトなど）の抗体定常領域(複数可)とを融合して形成された抗体であり、このキメラ抗体は、マウス抗体による免疫反応を軽減することができる。キメラ抗体を作製するには、まず、特異的なマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを樹立し、そのマウスハイブリドーマから可変領域遺伝子をクローニングした後、必要に応じてヒト抗体から定常領域遺伝子をクローニングする。マウス可変領域遺伝子とヒト定常領域遺伝子を連結させてキメラ遺伝子を形成し、これを発現ベクターに挿入する。最終的に、キメラ抗体分子は、真核生物系または原核生物系で発現される。本発明の好ましい態様において、ＣＤ７３キメラ抗体の抗体軽鎖は、ヒトκ鎖、λ鎖またはその変異体（複数可）の軽鎖定常領域をさらに含む。ＣＤ７３キメラ抗体の抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体（複数可）の重鎖定常領域をさらに含む。好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４、またはアミノ酸変異（複数可）（ＹＴＥやＳ２２８Ｐなど）を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４の変異体（複数可）の重鎖定常領域を含む。
【0064】
ＣＤＲ移植抗体を含む、用語“ヒト化抗体”とは、ヒト抗体可変領域フレームワーク中にマウスＣＤＲ配列を移植して作製された抗体、すなわち、異なるタイプのヒト生殖細胞系抗体フレームワーク配列で作製された抗体を意味する。ヒト化抗体は、多数のマウスタンパク質成分を含むキメラ抗体によって引き起こされる異種反応を回避することができる。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系の抗体遺伝子配列を網羅した公的なＤＮＡデータベースや、公開されている文献から入手することができる。例えば、ヒト重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞ＤＮＡ配列は、“ＶＢａｓｅ”ヒト生殖細胞配列データベース（www.mrccpe.com.ac.uk/vbaseで利用可能）、ならびにKabat, EA, et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunoligocal Interest, 5th Edに見出され得る。免疫原性の低下による活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域のフレームワーク配列は、活性を維持するために最小限の逆変異（reverse mutation）(複数可）または復帰突然変異（back mutation）(複数可)を受け得る。本発明のヒト化抗体はまた、ファージディスプレイによりＣＤＲ親和性成熟が行われたヒト化抗体も意味する。免疫原性の低下による活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域は、活性を維持するために最小限の逆変異(複数可)または復帰突然変異(複数可)を受けることができ、これは、ヒト抗体に由来するＦＲ領域上のアミノ酸残基(複数可)が、対応する位置の元の抗体のアミノ酸残基(複数可)に変異することを意味する。
【0065】
ＣＤＲの移植は、フレームワーク残基が抗原と接触することにより、ＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントの抗原に対する親和性の低下をもたらし得る。かかる相互作用は、高度な体細胞変異に起因する可能性がある。従って、ドナーフレームワークのアミノ酸をヒト化抗体フレームワークに移植することが必要な場合もある。非ヒトＣＤ７３抗体またはその抗原結合フラグメントに由来する抗原結合に関与するアミノ酸残基は、マウスモノクローナル抗体の可変領域の配列および構造を確認することで同定することができる。ドナーＣＤＲフレームワークと生殖細胞系との間で異なるアミノ酸残基は、関連性があると考えられる。最も近縁の生殖細胞系を決定できない場合は、サブタイプにより共有される共通配列に整列させるか、または高い類似性を有するマウス配列の共通配列に整列させることができる。希少なフレームワーク残基は、体細胞での高い変異の結果であると考えられ、結合に重要な役割を果たしている。
【0066】
用語“アミノ酸変異”とは、元のタンパク質またはポリペプチドと比較した時、タンパク質またはポリペプチド変異体におけるアミノ酸変化または変異を意味し、これらには元のタンパク質またはポリペプチドを基準にした１以上のアミノ酸挿入、欠失または置換が含まれる。例えば、“３個以下のアミノ酸変異を有する変異体”とは、元のタンパク質またはポリペプチドと比較した時、３個、２個、１個または０個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を意味する。
【0067】
用語、抗体の“抗原結合フラグメント”または“機能的フラグメント”とは、抗原（例えば、ＣＤ７３）に特異的に結合する能力を有する抗体の１以上のフラグメントを意味する。完全長抗体のフラグメントは、特定の抗原に結合する機能を達成するために使用できることが示されている。抗体の“抗原結合フラグメント”に含まれる結合フラグメントの例としては、（i）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメントであるＦａｂフラグメント、（ii）２つのＦａｂフラグメントがヒンジ領域にてジスルフィド架橋で結合した２価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２断片、（iii）抗体の１つのアームのＶＨドメインおよびＶＬドメインからなるＦｖフラグメント、（iv）ＶＨドメイン(複数可)からなる、単一ドメインまたはｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature341: 544-546)、(v) 鎖間ジスルフィド結合を介してＶＨとＶＬから形成された安定な抗原結合フラグメントであるｄｓＦｖ、(vi)ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびＦａｂなどのフラグメントを含むダイアボディ、二重特異性抗体および多重特異性抗体、が挙げられる。さらに、ＦｖフラグメントのＶＬドメインおよびＶＨドメインは２つの別個の遺伝子にコードされており、それらが組換え法を用いて合成リンカーで連結されることにより、ＶＬドメインおよびＶＨドメインが対になって一価の分子が形成された単一タンパク質鎖を生成することができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と称される；例えば、Birdら (1988) Science 242:423-426；および、Hustonら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883参照）。かかる一本鎖抗体も、用語、抗体の“抗原結合フラグメント”に包含されることが意図される。このような抗体は、当技術分野で知られている常套技術を用いて得られ、無傷の抗体の場合と同様の方法を用いて機能的フラグメントをスクリーニングする。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術により、または無傷の免疫グロブリンを酵素的もしくは化学的に破壊することによって製造することができる。抗体は、異なるアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体の形態であり得る。
【0068】
本発明の抗原結合フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（二重特異性抗体）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）等が挙げられる。
【0069】
Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体分子をパパイン（Ｈ鎖２２４位のアミノ酸残基を切断する）で処理して得られる抗体フラグメントである。得られたフラグメントは、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した、分子量約５０，０００の抗原結合活性を有する抗体フラグメントである。
【0070】
本発明のＦａｂは、本発明のモノクローナル抗体（ヒトＣＤ７３を特異的に認識し、その細胞外領域アミノ酸配列または立体構造に結合する）をパパインで処理することにより作製できる。さらに、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物の発現ベクターまたは真核生物の発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物に導入してＦａｂを発現させることにより製造することができる。
【0071】
“Ｆ（ａｂ’）２”とは、ＩｇＧのヒンジ領域にある２つのジスルフィド結合の下流部分をペプシンで消化して得られる、分子量約１００，０００の抗原結合活性を有する抗体フラグメントを意味する。Ｆ（ａｂ’）２は、ヒンジ領域で連結された２つのＦａｂを含む。
【0072】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、本発明のモノクローナル抗体（ヒトＣＤ７３を特異的に認識し、その細胞外領域アミノ酸配列または立体構造に結合する）をパパインで処理することにより作製できる。また、Ｆ（ａｂ’）２は、次に記載のＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合を介して結合させることにより作製できる。
【0073】
Ｆａｂ’は、分子量が約５０，０００の抗原結合活性を有する抗体フラグメントであり、これは、上記のＦ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断して得られる。本発明のＦａｂ’は、ＣＤ７３を特異的に認識し、その細胞外領域アミノ酸配列または立体構造に結合する本発明のＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理することにより作製できる。
【0074】
さらに、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを原核生物の発現ベクターまたは真核生物の発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物に導入してＦａｂ’を発現させることにより作製することができる。
【0075】
“一本鎖抗体”、“一本鎖Ｆｖ”、“ｓｃＦｖ”とは、抗体重鎖可変ドメイン（または領域；ＶＨ）と抗体軽鎖可変ドメイン（または領域；ＶＬ）がリンカーで連結された分子を意味する。このようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨまたはＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨの一般的な構造を有する。先行技術における適当なリンカーは、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはその変異体（複数可）、例えば、１～４反復を有する変異体（Holligerら（1993）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448）からなる。本発明で用いることができる他のリンカーは、Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731、Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106、Hu et al. (1996)、Cancer Res. 56:3055-3061、Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 およびRoovers et al. (2001), Cancer Immunolに記載されている。
【0076】
本発明のｓｃＦｖは、次の工程により作製できる：ヒトＣＤ７３を特異的に認識し、その細胞外領域または立体構造に結合する本発明のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを得て、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、次いで、該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入してｓｃＦｖを発現させる。
【0077】
ダイアボディ（Diabody）は、ｓｃＦｖが２量体化した抗体フラグメントであり、２価の抗原結合活性を有する抗体フラグメントである。２価の抗原結合活性において、２つの抗原は同じであっても異なっていてもよい。
【0078】
本発明のダイアボディは、次の工程により作製できる：ヒトＣＤ７３を特異的に認識し、その細胞外領域または立体構造に結合する本発明のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、リンカーペプチドの長さが８アミノ酸残基以下となるようにｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入した後、該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入して、ダイアボディを発現させる。
【0079】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬのそれぞれの１つのアミノ酸残基をシステイン残基で置換した後、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合を介して置換されたポリペプチドを結合させることによって得られる。システイン残基で置換されるアミノ酸残基は、公知の方法(Protein Engineering, 7, 697 (1994))に従い抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
【0080】
本発明のｄｓＦｖは、次の工程により作製できる：ヒトＣＤ７３を特異的に認識し、その細胞外領域または立体構造に結合する本発明のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを得て、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入した後、該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入してｄｓＦｖを発現させる。
【0081】
本開示のＣＤＲ含有ペプチドは、次の工程により作製できる：ヒトＣＤ７３を特異的に認識し、その細胞外領域アミノ酸配列またはその立体構造に結合する本発明のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入した後、該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入してペプチドを発現させる。ＣＤＲ含有ペプチドはまた、Ｆｍｏｃ法やｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
【0082】
本明細書で用いる用語“抗体フレームワーク（ＦＲ）”とは、ＶＬまたはＶＨの何れかの可変ドメインの一部を意味し、この可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）の主鎖（scaffold）として機能する。基本的に、ＦＲはＣＤＲのない可変ドメインである。
【0083】
用語“エピトープ”または“抗原決定基”とは、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位（例えば、ＣＤ７３分子上の特異的な部位）を意味する。エピトープは、一般的には、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１５個の連続した、または連続していないアミノ酸を含み、独特の空間的構造を有する。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996)参照。
【0084】
用語“特異的に結合する(specifically bind to)”、“選択的に結合する(selectively bind to)”、“選択的に結合する(selectively binds to)”または“特異的に結合する(specifically binds to)”とは、抗体が抗原上の所定のエピトープに結合することを意味する。一般的には、抗体は、約１０－７Ｍ未満、例えば、約１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、または１０－１１Ｍ、あるいはそれ以下の親和性（ＫＤ）で結合する。
【0085】
用語“ＫＤ”または“Ｋｄ”は、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を意味する。一般的には、本発明の抗体は、Biacore装置の表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定される、例えば、約１０－７Ｍ未満、例えば、約１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍあるいはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）でヒトＣＤ７３に結合する。
【0086】
用語“競合”が、同じエピトープに対して競合する抗原結合タンパク質（例えば、中和抗原結合タンパク質または中和抗体）が用いられる場合、抗原結合タンパク質間で競合が起こることを意味し、これは、試験される抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的機能的フラグメント）が、対照抗原結合タンパク質（例えば、リガンドまたは対照抗体）の共通抗原（例えば、ＣＤ７３抗原またはそのフラグメント）に対する特異的結合を阻止または阻害（例えば、低減）するアッセイによって決定されることを意味する。ある抗原結合タンパク質が別の抗原結合タンパク質と競合するかどうかを決定するために、多種の競合結合アッセイが利用可能である。これらのアッセイは、例えば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Stahli et al, 1983, Methods in Enzymology 9: 242-253参照）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Kirkland et al, 1986, J. Immunol. 137: 3614-3619; Cheung, et al, 1990, Virology176: 546-552参照）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press参照）、Ｉ－１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Morel et al, 1988, Molec. Immunol. 25: 7-15参照）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Cheung, et al, 1990, Virology 176: 546-552参照）；および、直接標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al, 1990, Scand. J. Immunol. 32: 77-82）が挙げられる。一般的には、このアッセイは、非標識の試験抗原結合タンパク質および標識された対照抗原結合タンパク質の両方に結合することができる精製抗原の使用を伴う（抗原は固相表面または細胞表面にある）。競合阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固相表面または細胞表面に結合したラベルの量を測定することによって決定される。通常、試験抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク質（抗原結合タンパク質と競合する）には、次のものが含まれる：対照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質；および、対照抗原結合タンパク質が結合するエピトープに十分に近いエピトープに結合する抗原結合タンパク質であって、２つのエピトープが空間的に干渉して結合を妨げる抗原結合タンパク質。競合結合を決定する方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例に記載されている。一般的には、競合抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、対照抗原結合タンパク質の共通抗原に対する特異的結合のうち、少なくとも４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、またはそれ以上を阻害（例えば、減少）する。いくつか場合、結合は、少なくとも８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、またはそれ以上阻害される。
【0087】
本明細書で用いる用語“核酸分子”とは、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を意味する。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれたとき、“作動可能に連結”されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コーディング配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作動可能に連結されていると考えられる。
【0088】
用語“ベクター”とは、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。一態様において、ベクターは“プラスミド”であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る円形の二本鎖ＤＮＡループを意味する。別の態様において、ベクターはウイルスベクターであり、ここで、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得る。本明細書に記載のベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自己複製することが可能であり（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳動物ベクター）、または宿主細胞への導入時に該宿主細胞のゲノムに統合され、それによって宿主ゲノムとともに複製されてもよい（例えば、非エピソーマル哺乳動物ベクター）。
【0089】
抗体および抗原結合フラグメントを作製および精製する方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, chapters 5-8 and 15などに記載されている。例えば、マウスにヒトＣＤ７３またはそのフラグメントを免疫し、得られた抗体を、当技術分野でよく知られている常套法を用いて、再変性、精製およびアミノ酸配列の解析を行うことができる。また、抗原結合フラグメントも常套法で調製することができる。本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、非ヒト抗体由来のＣＤＲ領域に１以上のヒトフレームワーク領域を組み込むように設計されている。ヒトＦＲ生殖細胞配列は、ImMunoGeneTics（IMGT）からそのウェブサイトhttp://imgt.cines.frを介して、またはＭＯＥソフトウェアを用いてＩＭＧＴヒト抗体可変生殖細胞遺伝子データベースに対して整列させることにより、The Immunoglobulin Facts, 2001, ISBN012441351から得ることができる。
【0090】
用語“宿主細胞”とは、発現ベクターが導入された細胞を意味する。宿主細胞は、細菌、微生物、植物または動物の細胞を含み得る。形質転換されやすい細菌としては、大腸菌やサルモネラ菌などの腸内細菌科のメンバー、枯草菌などのバシラス科のメンバー、肺炎球菌、連鎖球菌、インフルエンザ菌などが挙げられる。適当な微生物としては、Saccharomyces cerevisiaeおよびPichia pastorisが挙げられる。適当な動物宿主細胞株としては、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）およびＮＳ０細胞が挙げられる。
【0091】
本発明の人工抗体または抗原結合フラグメントは、公知の方法で調製および精製することができる。例えば、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングし、ＧＳ発現ベクターに改変することができる。組換え免疫グロブリンを発現するベクターは、その後、ＣＨＯ細胞に安定的にトランスフェクションされ得る。より推奨される先行技術として、哺乳動物発現系は、特にＦｃ領域の高度に保存されたＮ末端部位において、抗体のグリコシル化をもたらし得る。ヒトＣＤ７３に特異的に結合する抗体を発現させることで、安定したクローンが得られた。陽性クローンは、抗体生産用のバイオリアクターにおいて、無血清の培養液で増殖させることができる。抗体が分泌された培養液は、通常の方法で精製することができる。例えば、バッファーで改変したプロテインＡまたはＧセファロース ＦＦカラムで精製してもよい。非特異的結合成分は洗い流される。結合した抗体をｐＨ勾配で溶出し、抗体フラグメントをＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出した後、プールする。抗体は、一般的な技術を用いてろ過し、濃縮してもよい。可溶性の混合物および凝集物は、サイズ排除またはイオン交換などの一般的な技術を用いて効果的に除去してもよい。その後、得られた製品を直ちに、例えば、－７０℃で凍結させるか、または凍結乾燥してもよい。
【0092】
動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器または生物学的液体に用いられる“投与”および“処置”とは、外因性医薬、治療薬、診断薬または組成物を動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器または生物学的液体と接触させることを意味する。“投与”および“処置”は、例えば、治療法、薬物動態法、診断法、研究法および実験法などを意味し得る。細胞の処置には、試薬と細胞を接触させること、ならびに試薬と細胞液を接触させることが含まれ、該細胞液は細胞と接触している。“投与”および“処置”とはまた、例えば、細胞の、試薬、診断薬、結合組成物または他の細胞とのインビトロまたはエクスビボでの処置を意味する。“処置”とは、ヒト、動物または研究対象に用いられる場合、治療的処置、予防的または防止的処置、研究用途および診断用途を意味する。
【0093】
本明細書で用いる“処置する”とは、本発明の結合化合物の何れかを含む組成物などの治療剤を、その治療剤が既知の治療活性を有する１以上の疾患症状を有する患者に体内又は体外に投与することを意味する。一般的には、治療剤は、臨床的に測定可能な程度で１以上の疾患症状の緩解を誘発するか、またはそのような症状の進行を阻害することによって、処置される患者または集団のかかる症状を軽減するために有効な量で投与される。特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療薬の量（“治療的有効量”とも呼ばれる）は、患者の病状、年齢および体重などの種々の要因や、患者に所望の応答を誘発する薬剤の能力に応じて変化し得る。疾患症状が軽減されたかどうかは、その症状の重篤度または進行状況を評価するために医師または他の医療提供者によって通常使用される何れかの臨床測定によって評価することができる。本発明の一態様（例えば、治療方法または製造品）は、すべての対象において標的疾患症状(複数可)を緩和するのに有効ではないかもしれないが、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、ＭａｎｎおよびＷｈｉｔｎｅｙによるＵ検定、Kruskal-Wallis検定（Ｈ検定）、Jonckheere-Terpstra検定ならびにWilcoxon検定などの当技術分野で知られている何らかの統計的検定によって決定される、統計的に有意な数の対象において標的疾患症状を軽減するはずである。
【0094】
“保存的修飾”または“保存的置換もしくは置換”とは、タンパク質のアミノ酸を、タンパク質の生物学的活性を変えることなく頻繁に改変できるように、類似の特性（例えば、電荷、側鎖のサイズ、疎水性／親水性、主鎖の立体構造および剛性など）を有する他のアミノ酸で置換することを意味する。当業者は、一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が、生物学的活性を実質的に変化させないことを認識している（例えば、Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)参照）。さらに、構造的または機能的に類似のアミノ酸との置換は、生物学的活性を破壊する可能性が低い。例示的な保存的置換を次の表に示す。
【0095】
【表1】
【0096】
“有効量”には、病状の症状または兆候を改善または予防するのに十分な量を意味する。また、有効量とは、診断を可能にする、または診断を容易にするのに十分な量を意味する。特定の患者または動物対象に対する有効量は、処置すべき状態、患者の全体的な健康状態、投与経路および投与量ならびに副作用の重篤度などの要因に応じて変わり得る。有効量とは、重大な副作用または毒性作用を回避する最大用量または投与プロトコルのことである。
【0097】
“外因性物質”とは、状況に応じて生物、細胞またはヒトの外部で生成される物質を意味する。“内因性物質”とは、状況に応じて細胞、生物またはヒト体内で生成される物質を意味する。
【0098】
本明細書に記載の“変異配列”とは、本発明のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を適当な置換、挿入または欠失により改変した後、本発明のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と種々の割合の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を意味する。本明細書に記載の配列同一性は、少なくとも８５％、９０％または９５％であり得て、限定されない例としては、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％が挙げられる。
【0099】
用語“相同性”、“同一性”および“一致性”は、本明細書中で互換的に用いられ、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の配列類似性を意味する。比較すべき２つの配列の両方において、ある位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置が同じ塩基によって占められている場合、その分子はその位置において相同であると見なされる。２つの配列間の相同性パーセントは、２つの配列が共有する一致または相同な位置の数を、比較対象となるすべての位置の数で割って、１００を掛けた関数である。例えば、２つの配列が最適にアラインメントされているとき、２つの配列の１０個の位置のうち６個が一致または相同であれば、この２つの配列は６０％相同であり、２つの配列の１００個の位置のうち９５個が一致または相同であれば、この２つの配列は９５％相同であると考えられる。一般的に、比較は、２つの配列がアライメントされて最大パーセントの相同性が得られるよう行われる。本発明のある特定の態様において、抗体配列は、少なくとも８５％の配列同一性を有する。他の特定の態様において、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。他の特定の態様において、９０％、９５％または９９％あるいはそれ以上の配列同一性を有する。他の特定の態様において、少なくとも９５％の配列同一性を有する。特定の配列同一性を有する上記のアミノ酸配列は、１以上のアミノ酸の欠失、挿入または置換から得ることができる。
【0100】
本明細書で用いる表現“細胞”、“細胞株”および“細胞培養物”は、本明細書中で互換的に用いられ、全てのそのような表記はすべてその子孫を含む。従って、用語“形質転換体”および“形質転換細胞”には、継代数に関わらず、初代対象細胞およびそれに由来する培養物が含まれる。また、また、意図的または意図的でない突然変異により、すべての子孫がＤＮＡ含有量において正確に同一ではない可能性があることも理解されるべきである。このようにしてスクリーニングされた、最初に形質転換された細胞と同じ機能的活性または生物学的活性を有する変異体の子孫は、この用語の範囲内に包含される。別々の表記が意図されている場合、それは文脈から明確に理解され得る。
【0101】
本明細書で用いる“ポリメラーゼ連鎖反応”または“ＰＣＲ”は、例えば米国特許第４，６８３，１９５号に記載されているように、核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定の部分を微量に増幅する手順または技術を意味する。一般的に、目的の領域の末端またはそれを超える部分の配列情報は、オリゴヌクレオチドプライマーが設計できるように利用可能であり、これらのプライマーは、増幅されるテンプレートの反対側の鎖と同一または類似の配列となる。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅される物質の末端と同一である。ＰＣＲは、特定のＲＮＡ配列、全ゲノムからの特定のＤＮＡ配列および全細胞ＲＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列などから転写されたｃＤＮＡを増幅するために用いることができる。一般的には、Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, NY)参照。本発明で用いられるＰＣＲは、試験核酸サンプルを増幅するポリメラーゼ反応法の一例であるが、唯一の例ではないと考えられる。この方法は、核酸の特定の部分を増幅または生成するために、核酸ポリメラーゼと共にプライマーとして機能する既知の核酸配列を用いることを含む。
【0102】
“何れかの”または“要すれば”とは、後に続く事象または状況が発生し得るが、必ずしも生じないことを意味し、この記述には、その事象または状況が発生し得るが、発生しない場合が含まれる。例えば、“要すれば、１～３個の抗体重鎖可変領域を含んでいてよい”は、特定の配列を有する抗体重鎖可変領域が存在し得るが、存在しない場合を含むことを意味する。
【0103】
“医薬組成物”とは、本発明の１以上の抗体またはその抗原結合フラグメントと、生理学的／薬学的に許容される担体(複数可）および賦形剤(複数可）などの他の化学成分とを含む混合物を意味する。本発明の医薬組成物は、生物への投与を促進し、活性成分の吸収を容易にし、それによって生物学的効果を発揮することを目的とする。
【0104】
本明細書で用いる“予防”には、疾患関連症状(複数可)の発症を遅らせること、および／または疾患が発症する、もしくは発症が予想されるこれらの症状の重篤度を軽減させることが含まれる。この用語にはまた、また、既存の症状(複数可)の緩和、さらなる症状の予防、およびこれらの症状の原因となる要因の緩和もしくは予防も含まれる。従って、この用語は、疾病に罹患している脊椎動物対象に有益な結果が得られたことを意味する。
【0105】
さらに、本発明は、ＣＤ７３関連疾患を処置するための薬剤を含み、この薬剤は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体フラグメントを有効成分として含む。
【0106】
ＣＤ７３関連疾患とは、ＣＤ７３に関連する疾患（例えば、ＣＤ７３を発現する細胞に起因する疾患、またはＣＤ７３の異常発現に起因する疾患）であれば特に限定されず、例えば、ヒトＣＤ７３に結合する本発明の分子によって抑制可能な細胞増殖性疾患などが挙げられる。ある態様において、細胞増殖性疾患は腫瘍である。ある態様において、腫瘍は、乳癌、神経膠腫、膀胱癌、結腸癌、黒色腫、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、リンパ腫、前立腺癌または胃癌である。ある態様において、腫瘍は、転移性腫瘍である。
【0107】
さらに、本発明は、ヒトＣＤ７３を特異的に認識する本発明の抗体または抗体フラグメントを有効成分とする、ＣＤ７３の免疫検出法または判定方法、ＣＤ７３の免疫検出用または判定用試薬、ＣＤ７３発現細胞の免疫検出法または判定方法、およびＣＤ７３に関連する疾患を診断するための診断薬に関する。
【0108】
本発明において、ＣＤ７３の量を検出または測定する方法は、何れかの公知の方法であってよい。例えば、イムノアッセイ法または免疫検出法が挙げられる。
【0109】
イムノアッセイ法または免疫検出法とは、標識抗原または標識抗体を用いて、抗体または抗原の量を検出または測定する方法である。イムノアッセイ法または免疫検出法の例としては、放射性物質で標識した免疫－抗体法（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイ法（ＦＩＡ）、発光イムノアッセイ法、ウェスタンブロッティング法、物理化学的方法などが挙げられる。
【0110】
本発明の抗体または抗体フラグメントを用いてＣＤ７３発現細胞を検出または測定することにより、上記のＣＤ７３関連疾患を診断することができる。
【0111】
本発明のポリペプチドを発現する細胞は、公知の免疫検出法、例えば、免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織染色法などにより検出することができる。さらに、FMAT8100HTSシステム(Applied Biosystem)を用いた蛍光抗体染色法などの方法を用いることもできる。
【0112】
本発明において、ＣＤ７３を検出または測定されるサンプルは、ＣＤ７３を発現する細胞を含むことが可能なものであれば特に限定されず、例えば、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、便、組織液、培養液などが挙げられる。
【0113】
必要な診断方法に応じて、本発明の抗体またはその抗体フラグメントを含む診断薬はまた、抗原－抗体反応を行うための試薬または反応を検出するための試薬を含んでいてよい。抗原－抗体反応を行うための試薬としては、緩衝液、塩類などが挙げられる。検出用の試薬としては、イムノアッセイ法または免疫検出法に一般的に用いられる薬剤、例えば、モノクローナル抗体、抗体フラグメントまたはその複合体を認識する標識二次抗体、ならびに標識に対応する基質などが挙げられる。
【0114】
本明細書の実施例で提供される抗ＣＤ７３抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＤ７３に特異的であり、ヒトＣＤ７３と高い親和性を有し、ここで、ヒト化抗ＣＤ７３抗体または抗原結合フラグメントは、大幅に低減された免疫原性を示し、マウス抗体の特異性を完全に維持し、より高い親和性を有し、優れたインビボおよびインビトロ活性を有している。
【0115】
本明細書の実施例で提供される抗ＣＤ７３抗体または抗原結合フラグメントは、好ましい代謝動態特性およびバイオアベイラビリティを有する。
【0116】
発明の詳細な説明
次の実施例は、本発明をさらに説明するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書の実施例において特定の条件が示されていない実験方法は、一般的に従来の条件に従って行われ、例えば、Sambrook et al., Antibodies: Laboratory Manual、Molecular Cloning、Cold Spring Harborに記載の条件、あるいは材料または製品の製造者が推奨する条件に従って行われる。出典が特に示されていない試薬は、市販の試薬である。
次の実施例は、本発明をさらに説明するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書の実施例において特定の条件が示されていない実験方法は、一般的に従来の条件に従って行われ、例えば、Sambrook et al., Antibodies: Laboratory Manual、Molecular Cloning、Cold Spring Harborに記載の条件、あるいは材料または製品の製造者が推奨する条件に従って行われる。出典が特に示されていない試薬は、市販の試薬である。
【実施例】
【0117】
実施例１．ＣＤ７３抗原の調製
Ｉ．抗原のデザインおよび発現
ヒトＣＤ７３タンパク質（Uniprot番号：Ｐ２１５８９）を本発明のＣＤ７３のテンプレートとして用いて、本発明に関わる抗原および検出タンパク質のアミノ酸配列を設計した。要すれば、ＣＤ７３タンパク質を種々のタグと融合させ、ｐＴＴ５ベクターまたはｐＴａｒｇｅｔベクターに別個にクローニングし、そして２９３細胞で一過性に発現させるか、またはＣＨＯ細胞で安定的に発現させることで、本発明の抗原および検出タンパク質が得られた。以下のＣＤ７３抗原は、他に特記しない限り、ヒトＣＤ７３を意味する。
Ｉ．抗原のデザインおよび発現
ヒトＣＤ７３タンパク質（Uniprot番号：Ｐ２１５８９）を本発明のＣＤ７３のテンプレートとして用いて、本発明に関わる抗原および検出タンパク質のアミノ酸配列を設計した。要すれば、ＣＤ７３タンパク質を種々のタグと融合させ、ｐＴＴ５ベクターまたはｐＴａｒｇｅｔベクターに別個にクローニングし、そして２９３細胞で一過性に発現させるか、またはＣＨＯ細胞で安定的に発現させることで、本発明の抗原および検出タンパク質が得られた。以下のＣＤ７３抗原は、他に特記しない限り、ヒトＣＤ７３を意味する。
【0118】
ヒトＣＤ７３の全長配列は、免疫および検出のためのＣＤ７３過剰発現細胞株を構築するために用いることができ、その具体的な配列は、配列番号１に示すとおりである：
(特記：下線部はシグナルペプチド、イタリック部はヒトＣＤ７３の細胞外領域、および二重下線部はプロペプチドを表す)
【表2】
(特記：下線部はシグナルペプチド、イタリック部はヒトＣＤ７３の細胞外領域、および二重下線部はプロペプチドを表す)
【0119】
ＣＤ７３－３フラグ（ＣＤ７３成熟タンパク質の細胞外ドメインと３つのフラグタグの融合タンパク質）は、免疫化に用いることができ、その具体的な配列は配列番号２に示すとおりである。
(特記：下線部はシグナルペプチド、イタリック部はヒトＣＤ７３の細胞外領域、および二重下線部は３つのＦｌａｇタグを表す)
【表3】
(特記：下線部はシグナルペプチド、イタリック部はヒトＣＤ７３の細胞外領域、および二重下線部は３つのＦｌａｇタグを表す)
【0120】
ＣＤ７３－Ｍｙｃ－Ｈｉｓ（ＣＤ７３成熟タンパク質の細胞外ドメインとＭｙｃタグおよびＨｉｓタグの融合タンパク質）は、検出に用いることができ、その具体的な配列は配列番号３に示す通りである：
(特記：下線部はシグナルペプチド、イタリック部はヒトＣＤ７３の細胞外領域、および二重下線部はＭｙｃ－Ｈｉｓタグを表す)
【表4】
(特記：下線部はシグナルペプチド、イタリック部はヒトＣＤ７３の細胞外領域、および二重下線部はＭｙｃ－Ｈｉｓタグを表す)
【0121】
さらに、カニクイザルＣＤ７３／ＮＴ５Ｅタンパク質（Ｈｉｓタグ）は、Sino Biological(カタログ番号90192-C08H-50）から購入した。
【0122】
ＩＩ．ＣＤ７３関連組換えタンパク質の精製ならびに抗ヒトＣＤ７３ハイブリドーマ抗体および組換え抗体の精製
１．プロテインＧ親和性クロマトグラフィーによるハイブリドーマ上清の分離および精製
マウスハイブリドーマ上清の精製は、プロテインＧ親和性クロマトグラフィーで行うのが好ましい。培養ハイブリドーマを遠心分離して上清を集め、上清の体積を基準にして１０－１５％（体積比）の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０－８．５）を該上清に添加してｐＨを中性に調整した。プロテインＧカラムを３－５ ｘ カラム容量の６Ｍ塩酸グアニジンで洗浄し、次いで３－５ ｘ カラム容量の純水で洗浄した。該カラムを、３－５ ｘ カラム容量の、１×ＰＢＳ (ｐＨ７．４)緩衝液系などの平衡化バッファー（equilibrium buffer）で洗浄した。細胞上清を結合のために低流速で添加し、該流速は、保持時間が約１分またはそれ以上になるように制御された。ＵＶ吸収がベースラインに低下するまで、３－５ ｘ カラム容量の１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でカラムを洗浄した。サンプルを０．１Ｍ 酢酸／酢酸ナトリウム(ｐＨ３．０)緩衝液で溶出させ、溶出ピークをＵＶ検出に応じてプールした。１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）でｐＨを５～６に調整した後、溶出物を後の使用のために保存した。溶出物には、当業者に周知の方法に従って溶媒置換を行うことができ、例えば、限外濾過管を用いた限外濾過濃縮によって溶液を所望の緩衝系に置換したり、Ｇ－２５脱塩カラムなどの分子排除カラムを用いて溶液を所望の緩衝系に置換したり、または高分解能の分子排除カラム（Superdex 200など）を用いて溶出物から凝集成分を除去してサンプルの純度を向上させたりすることができる。
１．プロテインＧ親和性クロマトグラフィーによるハイブリドーマ上清の分離および精製
マウスハイブリドーマ上清の精製は、プロテインＧ親和性クロマトグラフィーで行うのが好ましい。培養ハイブリドーマを遠心分離して上清を集め、上清の体積を基準にして１０－１５％（体積比）の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０－８．５）を該上清に添加してｐＨを中性に調整した。プロテインＧカラムを３－５ ｘ カラム容量の６Ｍ塩酸グアニジンで洗浄し、次いで３－５ ｘ カラム容量の純水で洗浄した。該カラムを、３－５ ｘ カラム容量の、１×ＰＢＳ (ｐＨ７．４)緩衝液系などの平衡化バッファー（equilibrium buffer）で洗浄した。細胞上清を結合のために低流速で添加し、該流速は、保持時間が約１分またはそれ以上になるように制御された。ＵＶ吸収がベースラインに低下するまで、３－５ ｘ カラム容量の１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でカラムを洗浄した。サンプルを０．１Ｍ 酢酸／酢酸ナトリウム(ｐＨ３．０)緩衝液で溶出させ、溶出ピークをＵＶ検出に応じてプールした。１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）でｐＨを５～６に調整した後、溶出物を後の使用のために保存した。溶出物には、当業者に周知の方法に従って溶媒置換を行うことができ、例えば、限外濾過管を用いた限外濾過濃縮によって溶液を所望の緩衝系に置換したり、Ｇ－２５脱塩カラムなどの分子排除カラムを用いて溶液を所望の緩衝系に置換したり、または高分解能の分子排除カラム（Superdex 200など）を用いて溶出物から凝集成分を除去してサンプルの純度を向上させたりすることができる。
【0123】
２．プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる抗体の精製
初めに、抗体を発現させた細胞培養上清を高速で遠心分離し、上清を回収した。プロテインＡ親和性カラムを３－５ ｘ カラム容量の６Ｍ塩酸グアニジンで洗浄した後、３－５ ｘ カラム容量の純水で洗浄した。カラムを３－５ ｘ カラム容量の１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）緩衝系を平衡バッファーとして用いて平衡化した。細胞上清を低流速で添加し、保持時間が約１分またはそれ以上になるように流速を制御した。結合終了後、ＵＶ吸収がベースラインに低下するまで、３－５ ｘ カラム容量の１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でカラムを洗浄した。サンプルを０．１Ｍ酢酸／酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０－３．５）緩衝液で溶出させ、ＵＶ検出に応じて溶出ピークをプールした。溶出物を、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）でｐＨを５－６に調整した後、後で使用するために保存した。溶出物には、当業者に周知の方法に従って溶液置換を行うことができ、例えば、限外濾過管を用いた限外濾過濃縮により溶液を所望の緩衝系に置換したり、Ｇ－２５脱塩カラムなどの分子排除カラムを用いて溶液を所望の緩衝系に置換したり、または高分解能の分子排除カラム（Superdex200など）を用いて溶出物から凝集成分を除去してサンプルの純度を向上させたりすることができる。
初めに、抗体を発現させた細胞培養上清を高速で遠心分離し、上清を回収した。プロテインＡ親和性カラムを３－５ ｘ カラム容量の６Ｍ塩酸グアニジンで洗浄した後、３－５ ｘ カラム容量の純水で洗浄した。カラムを３－５ ｘ カラム容量の１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）緩衝系を平衡バッファーとして用いて平衡化した。細胞上清を低流速で添加し、保持時間が約１分またはそれ以上になるように流速を制御した。結合終了後、ＵＶ吸収がベースラインに低下するまで、３－５ ｘ カラム容量の１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でカラムを洗浄した。サンプルを０．１Ｍ酢酸／酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０－３．５）緩衝液で溶出させ、ＵＶ検出に応じて溶出ピークをプールした。溶出物を、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）でｐＨを５－６に調整した後、後で使用するために保存した。溶出物には、当業者に周知の方法に従って溶液置換を行うことができ、例えば、限外濾過管を用いた限外濾過濃縮により溶液を所望の緩衝系に置換したり、Ｇ－２５脱塩カラムなどの分子排除カラムを用いて溶液を所望の緩衝系に置換したり、または高分解能の分子排除カラム（Superdex200など）を用いて溶出物から凝集成分を除去してサンプルの純度を向上させたりすることができる。
【0124】
３．ニッケルカラムによる、ヒトＣＤ７３、ＣＤ７３－Ｍｙｃ－Ｈｉｓ、ＣＤ７３－３Ｆｌａｇおよび他のＣＤ７３関連組み換えタンパク質の精製
細胞発現上清サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去した後、緩衝液をＰＢＳに置き換えて、イミダゾールを終濃度５ｍＭになるように添加した。５ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳ溶液でニッケルカラムを平衡化し、２～５×カラム容量で洗浄した。交換後の上清サンプルをカラムに添加して結合させ、選択した媒体は異なる会社のニッケルカラムであってよい。Ａ２８０の読み取り値がベースラインに下がるまで、５ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ溶液でカラムを洗浄した。クロマトグラフィーカラムをＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾールで濯いで、非特異的に結合したタンパク質を除去し、溶出液を回収した。３００ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ溶液で目的タンパク質を溶出させ、溶出ピークを回収した。
細胞発現上清サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去した後、緩衝液をＰＢＳに置き換えて、イミダゾールを終濃度５ｍＭになるように添加した。５ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳ溶液でニッケルカラムを平衡化し、２～５×カラム容量で洗浄した。交換後の上清サンプルをカラムに添加して結合させ、選択した媒体は異なる会社のニッケルカラムであってよい。Ａ２８０の読み取り値がベースラインに下がるまで、５ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ溶液でカラムを洗浄した。クロマトグラフィーカラムをＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾールで濯いで、非特異的に結合したタンパク質を除去し、溶出液を回収した。３００ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ溶液で目的タンパク質を溶出させ、溶出ピークを回収した。
【0125】
回収した溶出物を、濃縮後、ゲルクロマトグラフィーSuperdex200（GE）でさらに精製し、ＰＢＳを移動相とし、凝集体および不純物タンパク質のピークを除去し、目的物の溶出ピークを回収した。得られたタンパク質を、電気泳動、ペプチドマッピングおよびＬＣ－ＭＳで同定し、確認したタンパク質を使用のためにアリコート化した。
【0126】
実施例２．抗ヒトＣＤ７３モノクローナル抗体の調製
Ｉ. 免疫化
抗ヒトＣＤ７３モノクローナル抗体を、マウスを免疫化して調製した。実験にはＳＪＬ白色マウス（雌、６～８週齢）を用いた（Beijing Charles River Laboratory animal Technology Co., Ltd., animal production license number: SCXK (Beijing) 2012-0001)。飼育環境はＳＰＦレベルである。購入後、マウスを、実験室環境で１週間、１２／１２時間の明暗サイクル、温度２０－２５℃、湿度４０－６０％で飼育した。その後、環境に適応したマウスを次のスキームで免疫した。免疫抗原は、ＣＤ７３（配列番号１）を過剰発現させたＣＨＯ細胞とした。
Ｉ. 免疫化
抗ヒトＣＤ７３モノクローナル抗体を、マウスを免疫化して調製した。実験にはＳＪＬ白色マウス（雌、６～８週齢）を用いた（Beijing Charles River Laboratory animal Technology Co., Ltd., animal production license number: SCXK (Beijing) 2012-0001)。飼育環境はＳＰＦレベルである。購入後、マウスを、実験室環境で１週間、１２／１２時間の明暗サイクル、温度２０－２５℃、湿度４０－６０％で飼育した。その後、環境に適応したマウスを次のスキームで免疫した。免疫抗原は、ＣＤ７３（配列番号１）を過剰発現させたＣＨＯ細胞とした。
【0127】
免疫化プロトコル：マウスにＣＤ７３を過剰発現させたＣＨＯ細胞株を１×１０７細胞／マウス／回で腹腔内注射により免疫した。細胞を回収し、ＰＢＳで１×１０８／ｍｌに希釈して、０日目に１００μｌ／マウスを腹腔内（ＩＰ）注射し、その後１４日毎にブースター免疫を行った。２１日目、３５日目、４９日目および６３日目に血液サンプルを集め、マウス血清中の抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定した。７～９回の免疫後、高い血清抗体価がプラトーに達したマウスを、脾臓細胞融合（splenocyte fusion）のために選択した。脾臓細胞融合の３日前に、生理食塩水で調製したＣＤ７３－３Ｆｌａｇ抗原溶液を５０μg／マウスで腹腔内注射（ＩＰ）し、ブースター免疫を行った。
【0128】
ＩＩ．脾臓細胞融合（Spleen cell fusion）
脾臓リンパ球と骨髄腫Ｓｐ２／０（ATCC(登録商標) CRL-8287(商標)）を、最適化されたＰＥＧが介在する融合手順で融合させてハイブリドーマ細胞を得た。融合したハイブリドーマ細胞を、完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴ、１×ＯＰＩを含むＤＭＥＭ培地）に０．５－１×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで播種し、３７℃および５％ＣＯ２にて３－４日間培養した後、１００μｌ／ウェルのＨＡＴ完全培地を補い、ピンポイント様のクローン（pinpoint-like clone）が形成されるまで３－４日間培養を継続した。上清を除去し、２００μｌ／ウェルのＨＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＴおよび１×ＯＰＩを含むＲＰＭＩ－１６４０培地）を添加し、３７℃および５％ＣＯ２にて３日間培養した後、ＥＬＩＳＡによる検出を行った。
脾臓リンパ球と骨髄腫Ｓｐ２／０（ATCC(登録商標) CRL-8287(商標)）を、最適化されたＰＥＧが介在する融合手順で融合させてハイブリドーマ細胞を得た。融合したハイブリドーマ細胞を、完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴ、１×ＯＰＩを含むＤＭＥＭ培地）に０．５－１×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで播種し、３７℃および５％ＣＯ２にて３－４日間培養した後、１００μｌ／ウェルのＨＡＴ完全培地を補い、ピンポイント様のクローン（pinpoint-like clone）が形成されるまで３－４日間培養を継続した。上清を除去し、２００μｌ／ウェルのＨＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＴおよび１×ＯＰＩを含むＲＰＭＩ－１６４０培地）を添加し、３７℃および５％ＣＯ２にて３日間培養した後、ＥＬＩＳＡによる検出を行った。
【0129】
ＩＩＩ．ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
ハイブリドーマ細胞の増殖密度に応じて、ハイブリドーマ培養上清を結合ＥＬＩＳＡ法で検出した（実施例３参照）。結合ＥＬＩＳＡアッセイで検出された陽性ウェルから採取した細胞上清に対して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞結合アッセイおよび細胞酵素活性阻害アッセイを行った（実施例４参照）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞結合アッセイおよび細胞酵素活性阻害アッセイの両方に陽性の細胞の一部を適時に増殖させて凍結保存した。他の細胞は、単一細胞クローンが得られるまで２～３回サブクローニングした。
ハイブリドーマ細胞の増殖密度に応じて、ハイブリドーマ培養上清を結合ＥＬＩＳＡ法で検出した（実施例３参照）。結合ＥＬＩＳＡアッセイで検出された陽性ウェルから採取した細胞上清に対して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞結合アッセイおよび細胞酵素活性阻害アッセイを行った（実施例４参照）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞結合アッセイおよび細胞酵素活性阻害アッセイの両方に陽性の細胞の一部を適時に増殖させて凍結保存した。他の細胞は、単一細胞クローンが得られるまで２～３回サブクローニングした。
【0130】
ＣＤ７３結合ＥＬＩＳＡ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞結合アッセイ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞酵素活性阻害アッセイはまた、それぞれのサブクローニングごとに行う必要があった。ハイブリドーマクローンを、上記アッセイによるスクリーニングによって得た。さらに、無血清細胞培養を用いる方法で抗体を作製した。この抗体を精製例（Purification Example）にしたがって精製し、試験例（Test Example）に用いた。
【0131】
ＩＶ．陽性ハイブリドーマクローンの配列決定
陽性ハイブリドーマから配列をクローニングする方法は次の通りである。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を回収した。ＲＮＡをTrizol（Invitrogen, カタログ番号15596-018）を用いてキットの指示書に従って抽出し、PrimeScript(商標) Reverse Transcription kit（Takara, カタログ番号2680A）を用いて逆転写した。逆転写の結果得られたｃＤＮＡを、マウスIg-Primer Set（Novagen, TB326 Rev. B 0503）を用いてＰＣＲ増幅させ、増幅産物を業者に送って塩基配列を決定した。配列決定後、マウス抗ＣＤ７３抗体ｍａｂ１０８、ｍａｂ１１０およびｍａｂ１２７を得た。可変領域のアミノ酸配列は次の通りである。
陽性ハイブリドーマから配列をクローニングする方法は次の通りである。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を回収した。ＲＮＡをTrizol（Invitrogen, カタログ番号15596-018）を用いてキットの指示書に従って抽出し、PrimeScript(商標) Reverse Transcription kit（Takara, カタログ番号2680A）を用いて逆転写した。逆転写の結果得られたｃＤＮＡを、マウスIg-Primer Set（Novagen, TB326 Rev. B 0503）を用いてＰＣＲ増幅させ、増幅産物を業者に送って塩基配列を決定した。配列決定後、マウス抗ＣＤ７３抗体ｍａｂ１０８、ｍａｂ１１０およびｍａｂ１２７を得た。可変領域のアミノ酸配列は次の通りである。
【表5】
【0132】
上記のｍａｂ１０８抗体可変領域配列、ｍａｂ１１０抗体可変領域配列およびｍａｂ１２７抗体可変領域配列において、ＦＲ配列はイタリック体、下線はＫａｂａｔの番号付け基準に従って決定されたＣＤＲ配列であり、配列順はＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。
【0133】
【表6】
【0134】
このようにして得られた本発明の抗体ｍａｂ１０８、ｍａｂ１１０およびｍａｂ１２７は、数個のアミノ酸の違いを有するのみで、高度に類似した軽鎖ＣＤＲ領域を有する。これらの軽鎖ＣＤＲ領域は、次の一般式で表すことができる：抗体軽鎖ＬＣＤＲ１は、配列番号２７に示す：ＲＡＳＱＤＩＧＸ１Ｘ２ＬＮであり、ここで、Ｘ１はＤまたはＮから選択され、Ｘ２はＲまたはＳから選択される；ＬＣＤＲ２は、配列番号２８に示す：ＡＴＸ３Ｘ４ＬＤＳであり、ここでＸ３はＦまたはＳから選択され、Ｘ４はＲまたはＳから選択される；ＬＣＤＲ３は、配列番号２９に示す：Ｘ５ＱＹＡＸ６Ｘ７Ｘ８ＷＴであり、ここでＸ５はＬまたはＱから選択され、Ｘ６はＳまたはＧから選択され、Ｘ７はＦまたは不存在から選択され、Ｘ８はＳまたはＰから選択される。
【0135】
Ｖ．ヒトＩｇＧ１キメラ抗体の作製
ハイブリドーマスクリーニングで得られた上記候補分子ｍａｂ１０８、ｍａｂ１１０およびｍａｂ１２７を増幅させ、塩基配列を決定して可変領域をコードする塩基配列を得た。配列決定により得られた配列をもとにフォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計し、配列決定される遺伝子をテンプレートとして、ＰＣＲにより各抗体のＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントを構築した。次いで、相同組換えを介して発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよびｈＩｇＧ１／ｈｋａｐｐａ定常領域遺伝子（ＣＨ１－Ｆｃ／ＣＬ）フラグメントを含む）に挿入して、組換えキメラ抗体ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ｐＨｒ／ＶＬ－ＣＬ－ｐＨｒの全長の発現プラスミドを構築し、３種のキメラ抗体ＣＨ１０８、ＣＨ１１０およびＣＨ１２７を得た。
ハイブリドーマスクリーニングで得られた上記候補分子ｍａｂ１０８、ｍａｂ１１０およびｍａｂ１２７を増幅させ、塩基配列を決定して可変領域をコードする塩基配列を得た。配列決定により得られた配列をもとにフォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計し、配列決定される遺伝子をテンプレートとして、ＰＣＲにより各抗体のＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントを構築した。次いで、相同組換えを介して発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよびｈＩｇＧ１／ｈｋａｐｐａ定常領域遺伝子（ＣＨ１－Ｆｃ／ＣＬ）フラグメントを含む）に挿入して、組換えキメラ抗体ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ｐＨｒ／ＶＬ－ＣＬ－ｐＨｒの全長の発現プラスミドを構築し、３種のキメラ抗体ＣＨ１０８、ＣＨ１１０およびＣＨ１２７を得た。
【0136】
ＶＩ．マウス抗ヒトＣＤ７３抗体のヒト化
ＭＯＥソフトウェア（Molecular Operating Environment）を用いてＩＭＧＴ（http://imgt.cines.fr）のヒト抗体可変生殖細胞系遺伝子データベースと照合し、マウス抗体と高い相同性を有するヒト生殖細胞系重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変領域遺伝子をテンプレートとして選択した。ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順に、マウス抗体ＣＤＲを対応するヒトテンプレートに移植して可変領域配列を形成した。必要に応じて、フレームワーク配列中のアミノ酸(複数可)をマウス抗体に対応するアミノ酸に逆変異させ、ヒト化抗ＣＤ７３モノクローナル抗体を得た。
ＭＯＥソフトウェア（Molecular Operating Environment）を用いてＩＭＧＴ（http://imgt.cines.fr）のヒト抗体可変生殖細胞系遺伝子データベースと照合し、マウス抗体と高い相同性を有するヒト生殖細胞系重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変領域遺伝子をテンプレートとして選択した。ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順に、マウス抗体ＣＤＲを対応するヒトテンプレートに移植して可変領域配列を形成した。必要に応じて、フレームワーク配列中のアミノ酸(複数可)をマウス抗体に対応するアミノ酸に逆変異させ、ヒト化抗ＣＤ７３モノクローナル抗体を得た。
【0137】
１．ｍａｂ１０８のヒト化
１．１ ｍａｂ１０８フレームワークの選択
マウス抗体ｍａｂ１０８では、ヒト化のための軽鎖テンプレートは、ＩＧＫＶ１－１７＊０１およびｈｊｋ４．１であり、ヒト化のための重鎖テンプレートは、ＩＧＨＶ２－２６＊０１およびｈｊｈ４．１であった。それぞれのマウス抗体ｍａｂ１０８ＣＤＲをヒトテンプレートに移植し、ｍａｂ１０８のヒト化抗体であるＨａｂ１０８を得た。その可変領域配列は次の通りである。
特記：上記のＨａｂ１０８抗体配列中、イタリック体はＦＲ配列を示し、下線部はＫａｂａｔの番号付け基準に従って決定されたＣＤＲ配列を示し、そして配列順はＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。
１．１ ｍａｂ１０８フレームワークの選択
マウス抗体ｍａｂ１０８では、ヒト化のための軽鎖テンプレートは、ＩＧＫＶ１－１７＊０１およびｈｊｋ４．１であり、ヒト化のための重鎖テンプレートは、ＩＧＨＶ２－２６＊０１およびｈｊｈ４．１であった。それぞれのマウス抗体ｍａｂ１０８ＣＤＲをヒトテンプレートに移植し、ｍａｂ１０８のヒト化抗体であるＨａｂ１０８を得た。その可変領域配列は次の通りである。
【表7】
特記：上記のＨａｂ１０８抗体配列中、イタリック体はＦＲ配列を示し、下線部はＫａｂａｔの番号付け基準に従って決定されたＣＤＲ配列を示し、そして配列順はＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。
【0138】
１．２ ｍａｂ１０８のヒト化抗体用の復帰突然変異デザイン：
必要に応じて、ｍａｂ１０８のヒト化抗体ＦＲ領域配列中のアミノ酸を、マウス抗体に対応するアミノ酸に復帰突然変異させた。具体的に設計した復帰突然変異を表２に示す。
特記：“移植”とは、マウス抗体のＣＤＲをヒト生殖細胞系のＦＲ領域の配列に移植したことを表し、Ｙ３６Ｌは“移植”の３６位のＹがＬに復帰突然変異されたことを表し、その他も同様に解釈できる。
必要に応じて、ｍａｂ１０８のヒト化抗体ＦＲ領域配列中のアミノ酸を、マウス抗体に対応するアミノ酸に復帰突然変異させた。具体的に設計した復帰突然変異を表２に示す。
【表8】
特記：“移植”とは、マウス抗体のＣＤＲをヒト生殖細胞系のＦＲ領域の配列に移植したことを表し、Ｙ３６Ｌは“移植”の３６位のＹがＬに復帰突然変異されたことを表し、その他も同様に解釈できる。
【0139】
１．３ ｍＡｂ１０８のヒト化抗体：
表２に示すように、ｍａｂ１０８のヒト化抗体を復帰突然変異させると可変領域が得られた。可変領域の組合せにより、種々のｍａｂ１０８のヒト化抗体が最終的に得られた。各抗体の可変領域のアミノ酸配列は次の通りである：
特記：Ｈａｂ１０８．６４は、ｍａｂ１０８のヒト化抗体を表し、Ｈａｂ１０８．６４は、Ｈａｂ１０８.ＶＬ６に示される軽鎖可変領域と、Ｈａｂ１０８.ＶＨ４に示される重鎖可変領域を有する。その他も同様に解釈できる。
表２に示すように、ｍａｂ１０８のヒト化抗体を復帰突然変異させると可変領域が得られた。可変領域の組合せにより、種々のｍａｂ１０８のヒト化抗体が最終的に得られた。各抗体の可変領域のアミノ酸配列は次の通りである：
【表9】
特記：Ｈａｂ１０８．６４は、ｍａｂ１０８のヒト化抗体を表し、Ｈａｂ１０８．６４は、Ｈａｂ１０８.ＶＬ６に示される軽鎖可変領域と、Ｈａｂ１０８.ＶＨ４に示される重鎖可変領域を有する。その他も同様に解釈できる。
【0140】
ｍＡｂ１０８のヒト化抗体の特定の可変領域配列は次の通りである：
【表10】
【0141】
２．ｍａｂ１１０のヒト化
２．１ ｍａｂ１１０フレームワークの選択
マウス抗体ｍａｂ１１０について、ヒト化のための軽鎖テンプレートは、ＩＧＫＶ１－１７＊０１およびｈｊｋ４．１であり、かつヒト化のための重鎖テンプレートは、ＩＧＨＶ１－３＊０１およびｈｊｈ６．１であった。マウス抗体ｍａｂ１１０ ＣＤＲのそれぞれをヒトテンプレートに移植し、ｍａｂ１１０のヒト化抗体であるＨａｂ１１０を得た。その可変領域配列は次の通りである。
特記：上記のＨａｂ１１０抗体配列において、イタリック体はＦＲ配列を示し、下線部はＣＤＲ配列を示し、そして配列順はＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。
２．１ ｍａｂ１１０フレームワークの選択
マウス抗体ｍａｂ１１０について、ヒト化のための軽鎖テンプレートは、ＩＧＫＶ１－１７＊０１およびｈｊｋ４．１であり、かつヒト化のための重鎖テンプレートは、ＩＧＨＶ１－３＊０１およびｈｊｈ６．１であった。マウス抗体ｍａｂ１１０ ＣＤＲのそれぞれをヒトテンプレートに移植し、ｍａｂ１１０のヒト化抗体であるＨａｂ１１０を得た。その可変領域配列は次の通りである。
【表11】
特記：上記のＨａｂ１１０抗体配列において、イタリック体はＦＲ配列を示し、下線部はＣＤＲ配列を示し、そして配列順はＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。
【0142】
２．２ ｍａｂ１１０用の復帰突然変異デザイン：
必要に応じて、ｍａｂ１１０のヒト化抗体ＦＲ領域配列中のアミノ酸を、マウス抗体に対応するアミノ酸に復帰突然変異させた。具体的に設計した復帰突然変異を表４に示す。
特記：“移植”とは、マウス抗体のＣＤＲをヒト生殖細胞系のＦＲ領域の配列に移植したことを表し、Ｙ３６Ｌは“移植”の３６位のＹがＬに復帰突然変異されたことを表し、その他も同様に解釈できる。
必要に応じて、ｍａｂ１１０のヒト化抗体ＦＲ領域配列中のアミノ酸を、マウス抗体に対応するアミノ酸に復帰突然変異させた。具体的に設計した復帰突然変異を表４に示す。
【表12】
特記：“移植”とは、マウス抗体のＣＤＲをヒト生殖細胞系のＦＲ領域の配列に移植したことを表し、Ｙ３６Ｌは“移植”の３６位のＹがＬに復帰突然変異されたことを表し、その他も同様に解釈できる。
【0143】
２．３ ｍＡｂ１１０のヒト化抗体：
表４に示すｍａｂ１１０のヒト化抗体のために設計された復帰突然変異を組み合わせ、次いで、さらにヒト重鎖定常領域および軽鎖定常領域と再結合させた。ｍａｂ１１０の種々のヒト化抗体が最終的に得られ、そしてその可変領域アミノ酸配列を次に示す：
特記：Ｈａｂ１１０．２１は、ｍａｂ１１０のヒト化抗体を表し、Ｈａｂ１１０．２１は、Ｈａｂ１１０.ＶＬ２に示される軽鎖可変領域と、Ｈａｂ１１０.ＶＨ１に示される重鎖可変領域を有する。その他も同様に解釈できる。
表４に示すｍａｂ１１０のヒト化抗体のために設計された復帰突然変異を組み合わせ、次いで、さらにヒト重鎖定常領域および軽鎖定常領域と再結合させた。ｍａｂ１１０の種々のヒト化抗体が最終的に得られ、そしてその可変領域アミノ酸配列を次に示す：
【表13】
特記：Ｈａｂ１１０．２１は、ｍａｂ１１０のヒト化抗体を表し、Ｈａｂ１１０．２１は、Ｈａｂ１１０.ＶＬ２に示される軽鎖可変領域と、Ｈａｂ１１０.ＶＨ１に示される重鎖可変領域を有する。その他も同様に解釈できる。
【0144】
ｍＡｂ１１０のヒト化抗体の特定の可変領域配列は次の通りである：
【表14】
【0145】
３．ｍａｂ１２７のヒト化
３.１ ｍａｂ１２７フレームワークの選択
マウス抗体ｍａｂ１２７について、ヒト化のための軽鎖テンプレートは、ＩＧＫＶ１－１７＊０１およびｈｊｋ４．１であり、かつヒト化のための重鎖テンプレートは、ＩＧＨＶ１－４６＊０１およびｈｊｈ６．１であった。マウス抗体ｍａｂ１２７ ＣＤＲのそれぞれをヒトテンプレートに移植し、ｍａｂ１２７のヒト化抗体であるＨａｂ１２７を得た。その可変領域配列は次の通りである。
特記：上記のＨａｂ１２７抗体配列において、イタリック体はＦＲ配列を示し、下線部はＣＤＲ配列（Kabatの番号付け基準に従って決定され、注釈を付けたもの）を示し、そして配列順はＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。
３.１ ｍａｂ１２７フレームワークの選択
マウス抗体ｍａｂ１２７について、ヒト化のための軽鎖テンプレートは、ＩＧＫＶ１－１７＊０１およびｈｊｋ４．１であり、かつヒト化のための重鎖テンプレートは、ＩＧＨＶ１－４６＊０１およびｈｊｈ６．１であった。マウス抗体ｍａｂ１２７ ＣＤＲのそれぞれをヒトテンプレートに移植し、ｍａｂ１２７のヒト化抗体であるＨａｂ１２７を得た。その可変領域配列は次の通りである。
【表15】
特記：上記のＨａｂ１２７抗体配列において、イタリック体はＦＲ配列を示し、下線部はＣＤＲ配列（Kabatの番号付け基準に従って決定され、注釈を付けたもの）を示し、そして配列順はＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。
【0146】
３．２ ｍａｂ１２７用の復帰突然変異デザイン：
必要に応じて、ｍａｂ１２７のヒト化抗体ＦＲ領域配列中のアミノ酸を、マウス抗体に対応するアミノ酸に復帰突然変異させた。具体的に設計した復帰突然変異を表６に示す。
特記：“移植”とは、マウス抗体のＣＤＲをヒト生殖細胞系のＦＲ領域の配列に移植したことを表し、Ｙ３６Ｌは“移植”の３６位のＹがＬに復帰突然変異されたことを表し、その他も同様に解釈できる。
必要に応じて、ｍａｂ１２７のヒト化抗体ＦＲ領域配列中のアミノ酸を、マウス抗体に対応するアミノ酸に復帰突然変異させた。具体的に設計した復帰突然変異を表６に示す。
【表16】
特記：“移植”とは、マウス抗体のＣＤＲをヒト生殖細胞系のＦＲ領域の配列に移植したことを表し、Ｙ３６Ｌは“移植”の３６位のＹがＬに復帰突然変異されたことを表し、その他も同様に解釈できる。
【0147】
３．３ ｍＡｂ１２７のヒト化抗体：
表６に示すｍａｂ１２７のヒト化抗体のために設計された復帰突然変異を組み合わせ、次いで、さらにヒト重鎖定常領域および軽鎖定常領域と再結合させた。ｍａｂ１２７の種々のヒト化抗体が最終的に得られ、そしてその可変領域アミノ酸配列を次に示す。
特記：Ｈａｂ１２７．１１は、ｍａｂ１２７のヒト化抗体を表し、Ｈａｂ１２７．１１は、Ｈａｂ１２７.ＶＬ１に示される軽鎖可変領域と、Ｈａｂ１２７.ＶＨ１に示される重鎖可変領域を有する。その他も同様に解釈できる。
表６に示すｍａｂ１２７のヒト化抗体のために設計された復帰突然変異を組み合わせ、次いで、さらにヒト重鎖定常領域および軽鎖定常領域と再結合させた。ｍａｂ１２７の種々のヒト化抗体が最終的に得られ、そしてその可変領域アミノ酸配列を次に示す。
【表17】
特記：Ｈａｂ１２７．１１は、ｍａｂ１２７のヒト化抗体を表し、Ｈａｂ１２７．１１は、Ｈａｂ１２７.ＶＬ１に示される軽鎖可変領域と、Ｈａｂ１２７.ＶＨ１に示される重鎖可変領域を有する。その他も同様に解釈できる。
【0148】
ｍＡｂ１２７のヒト化抗体の特定の可変領域配列は次の通りである。
【表18】
【0149】
３.４ ｍａｂ１２７のヒト化抗体のホットスポット変異：
ｍａｂ１２７重鎖ＨＣＤＲ２の抗体構造に基づくＮＮＧに対して、コンピュータシミュレーション法によりアミノ酸変異を行った。好ましい態様の１つでは、Ｈａｂ１２７.ＶＨ１ ＨＣＤＲ２のＮＮＧに対してアミノ酸変異を行った。変異後のＨａｂ１２７.ＶＨ１の配列は次の通りである。
ｍａｂ１２７重鎖ＨＣＤＲ２の抗体構造に基づくＮＮＧに対して、コンピュータシミュレーション法によりアミノ酸変異を行った。好ましい態様の１つでは、Ｈａｂ１２７.ＶＨ１ ＨＣＤＲ２のＮＮＧに対してアミノ酸変異を行った。変異後のＨａｂ１２７.ＶＨ１の配列は次の通りである。
【表19】
【0150】
ホットスポット変異後のｍａｂ１２７のヒト化抗体ＨＣＤＲ２アミノ酸配列の一般式は、配列番号６７に示す通りである：ＲＩＹＨ Ｘ９ Ｘ１０Ｘ１１ＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ、ここで、Ｘ９はＮ、Ｑ、ＬまたはＨから選択され、Ｘ１０はＮ、Ｑ、Ｌ、Ｔ、Ｋ、ＥまたはＨから選択され、Ｘ１１はＶまたはＧから選択される。好ましくは、ホットスポット変異後のｍａｂ１２７のヒト化抗体ＨＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号６８～７６に示す通りである：
配列番号６８：ＲＩＹＨＮＱＧＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ；
配列番号６９：ＲＩＹＨＮＬＧＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ；
配列番号７０：ＲＩＹＨＮＴＧＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ；
配列番号７１：ＲＩＹＨＮＫＧＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ；
配列番号７２：ＲＩＹＨＮＥＧＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ；
配列番号７３：ＲＩＹＨＮＨＧＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ；
配列番号７４：ＲＩＹＨＱＮＶＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ；
配列番号７５：ＲＩＹＨＬＮＶＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ；
配列番号７６：ＲＩＹＨＨＮＶＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ。
配列番号６８：ＲＩＹＨＮＱＧＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ；
配列番号６９：ＲＩＹＨＮＬＧＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ；
配列番号７０：ＲＩＹＨＮＴＧＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ；
配列番号７１：ＲＩＹＨＮＫＧＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ；
配列番号７２：ＲＩＹＨＮＥＧＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ；
配列番号７３：ＲＩＹＨＮＨＧＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ；
配列番号７４：ＲＩＹＨＱＮＶＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ；
配列番号７５：ＲＩＹＨＬＮＶＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ；
配列番号７６：ＲＩＹＨＨＮＶＤＴＦＹＳＱＫＦＫＧ。
【0151】
【表20】
特記：Ｈａｂ１２７．３１ｄは、ｍａｂ１２７のヒト化抗体を表し、Ｈａｂ１２７．３１ｄは、Ｈａｂ１２７.ＶＬ３に示される軽鎖可変領域と、Ｈａｂ１２７.ＶＨ１ｄに示される重鎖可変領域を有する。その他も同様に解釈できる。
【0152】
４．抗ヒトＣＤ７３ヒト化抗体の構築および発現
プライマーを設計し、各ヒト化抗体のＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントをＰＣＲで構築した後、相同組換えにより発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１－Ｆｃ／ＣＬ）フラグメントを有する）に挿入し、完全長抗体ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ｐＨｒ／ＶＫ－ＣＬ－ｐＨｒの発現ベクターを構築した。ヒト化抗体の場合、定常領域は、ヒトκ鎖、λ鎖またはその変異体の軽鎖定常領域から選択することができ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体の重鎖定常領域から選択することができる。限定されない例としては、抗体の機能を向上させるために、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の定常領域を最適化することが挙げられる。例えば、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５ＡまたはＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅなどの定常領域の点変異により、抗体のＡＤＣＣを低下させることができ、Ｐ３３１Ｓまたはその近傍の変異、ならびにＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａなどの定常領域の変異により、抗体のＣＤＣを低下させることができる。
プライマーを設計し、各ヒト化抗体のＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントをＰＣＲで構築した後、相同組換えにより発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１－Ｆｃ／ＣＬ）フラグメントを有する）に挿入し、完全長抗体ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ｐＨｒ／ＶＫ－ＣＬ－ｐＨｒの発現ベクターを構築した。ヒト化抗体の場合、定常領域は、ヒトκ鎖、λ鎖またはその変異体の軽鎖定常領域から選択することができ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体の重鎖定常領域から選択することができる。限定されない例としては、抗体の機能を向上させるために、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の定常領域を最適化することが挙げられる。例えば、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５ＡまたはＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅなどの定常領域の点変異により、抗体のＡＤＣＣを低下させることができ、Ｐ３３１Ｓまたはその近傍の変異、ならびにＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａなどの定常領域の変異により、抗体のＣＤＣを低下させることができる。
【0153】
例示的な抗ヒトＣＤ７３ヒト化抗体定常領域の配列は次の通りである：
重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号７７に示す通りである：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
抗ヒトＣＤ７３ ヒト化抗体の軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号７８に示す通りである：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号７７に示す通りである：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
抗ヒトＣＤ７３ ヒト化抗体の軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号７８に示す通りである：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
【0154】
例示的な抗ヒトＣＤ７３ ヒト化抗体完全長アミノ酸配列は、次の通りである：
Hab108.64 抗体重鎖アミノ酸配列は、配列番号７９に示す通りである:
EVTLKQSGPGLVKPTETLTLTCTVSGFSLSSYGIQWVRQPPGKGLEWLGVIWSGGSADYNAAFISRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCAGQYGSVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Hab108.64 抗体軽鎖アミノ酸配列は、配列番号８０に示す通りである:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGDRLNWLQQKPGGAIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYCLQYAGSWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
Hab110.21 抗体重鎖アミノ酸配列は、配列番号８１に示す通りである:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGQRLEWMGYINPNSFYIEYNQKFKDRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYDLFYDMDNWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Hab110.21 抗体軽鎖アミノ酸配列は、配列番号８２に示す通りである:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGNSLNWLQQKPGKAIKRLIYATFRLDSGVPSRFSGSRSGTEYTLTISSLQPEDFATYYCQQYASFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
Hab127.31d 抗体重鎖アミノ酸配列は、配列番号８３に示す通りである:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTAYFMNWVRQAPGQGLEWMGRIYHNKGDTFYSQKFKGRVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCATSYVGDWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Hab127. 31d 抗体軽鎖アミノ酸配列は、配列番号８４に示す通りである:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGDSLNWLQQKPGGALKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYCLQYASFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
Hab108.64 抗体重鎖アミノ酸配列は、配列番号７９に示す通りである:
EVTLKQSGPGLVKPTETLTLTCTVSGFSLSSYGIQWVRQPPGKGLEWLGVIWSGGSADYNAAFISRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCAGQYGSVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Hab108.64 抗体軽鎖アミノ酸配列は、配列番号８０に示す通りである:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGDRLNWLQQKPGGAIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYCLQYAGSWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
Hab110.21 抗体重鎖アミノ酸配列は、配列番号８１に示す通りである:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGQRLEWMGYINPNSFYIEYNQKFKDRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYDLFYDMDNWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Hab110.21 抗体軽鎖アミノ酸配列は、配列番号８２に示す通りである:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGNSLNWLQQKPGKAIKRLIYATFRLDSGVPSRFSGSRSGTEYTLTISSLQPEDFATYYCQQYASFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
Hab127.31d 抗体重鎖アミノ酸配列は、配列番号８３に示す通りである:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTAYFMNWVRQAPGQGLEWMGRIYHNKGDTFYSQKFKGRVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCATSYVGDWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Hab127. 31d 抗体軽鎖アミノ酸配列は、配列番号８４に示す通りである:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGDSLNWLQQKPGGALKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYCLQYASFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
【0155】
実施例３．抗ＣＤ７３抗体の結合活性の検出
１．抗ＣＤ７３抗体のヒトＣＤ７３タンパク質への結合のＥＬＩＳＡアッセイ；
抗ＣＤ７３抗体のヒトＣＤ７３タンパク質への結合を、ＥＬＩＳＡアッセイで試験した。ビオチン化したＣＤ７３融合タンパク質を、９６ウェルマイクロタイタープレート上にコーティングされたストレプトアビジンと結合することで、該マイクロタイタープレート上に固定化した。抗体を添加した後のシグナル強度を用いて、ＣＤ７３に対する抗体の結合活性を測定した。具体的な試験手順は次の通りである：
１．抗ＣＤ７３抗体のヒトＣＤ７３タンパク質への結合のＥＬＩＳＡアッセイ；
抗ＣＤ７３抗体のヒトＣＤ７３タンパク質への結合を、ＥＬＩＳＡアッセイで試験した。ビオチン化したＣＤ７３融合タンパク質を、９６ウェルマイクロタイタープレート上にコーティングされたストレプトアビジンと結合することで、該マイクロタイタープレート上に固定化した。抗体を添加した後のシグナル強度を用いて、ＣＤ７３に対する抗体の結合活性を測定した。具体的な試験手順は次の通りである：
【0156】
ストレプトアビジン（Sigma, カタログ番号S4762-5MG）をＰＢＳ、ｐＨ７．４（Shanghai BasalMedia, カタログ番号B320）緩衝液で３μg／ｍｌの濃度に希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレート（Corning, カタログ番号CLS3590-100EA）に５０μl／ウェルずつ添加し、３７℃のインキュベーターで２時間培養した。液体を捨て、２５０μｌ／ウェルのブロッキング液（５％スキムミルク（BD skim milk, カタログ番号232100）をＰＢＳで希釈したもの）を加え、３７℃のインキュベーターで３時間、または４℃にて一晩（１６－１８時間）インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキング後、ブロッキング液を捨て、プレートをＰＢＳＴ緩衝液（０．０５％ tween-20を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルの０．５μｇ／ｍｌビオチン化ＣＤ７３－ｍｙｃ－ｈｉｓ融合タンパク質（Tojin Chemical、カタログ番号LK03、ビオチン化方法はキットの指示書に従う）をサンプル希釈液（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ, ｐＨ７．４）で希釈して加え、３７℃にて１時間または４℃にて一晩、インキュベーター内で培養した。培養終了後、反応液をマイクロタイタープレートから取り出し、ＰＢＳＴで５回洗浄した後、種々の濃度の各試験抗体（精製ハイブリドーマ抗体またはヒト化抗体、サンプル希釈液で希釈）を５０μｌ／ウェルで添加し、３７℃のインキュベーターで１時間培養した。培養終了後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、サンプル希釈液で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウス２次抗体（Jackson Immuno Research, カタログ番号115-035-003）またはヤギ抗ヒト２次抗体（Jackson Immuno Research, カタログ番号109-035-003）を５０μｌ／ウェル添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ発色基質（KPL, カタログ番号52-00-03）を加え、室温で５－１０分インキュベートし、５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（Molecular Devices, VERSA max）を用いて波長４５０ｎｍの吸光度値を読み取り、GraphPad Prism 5でデータを解析した。ヒトＣＤ７３タンパク質に対する抗ＣＤ７３抗体の結合度をＥＣ５０値として算出した。試験結果を図１および表９に示す。
【0157】
【表21】
【0158】
試験結果は、本発明の抗ＣＤ７３抗体Ｈａｂ１１０．２１、Ｈａｂ１２７．３１ｄおよびＨａｂ１０８．６４が、何れもヒトＣＤ７３タンパク質に対して良好な結合活性を有しており、３つの抗ＣＤ７３抗体のヒトＣＤ７３タンパク質に対するＥＣ５０値は、何れも陽性対照抗体ＣＰＸ００６（特許出願ＷＯ２０１８０１３６１１に開示されている抗体ＣＰＸ－００６）のＥＣ５０値よりも低いことを示す。
【0159】
２．抗ＣＤ７３抗体のカニクイザルＣＤ７３タンパク質への結合を示すＥＬＩＳＡアッセイ
カニクイザルＣＤ７３タンパク質に対する抗ＣＤ７３抗体の交差結合活性をＥＬＩＳＡアッセイで試験した。カニクイザルＣＤ７３融合タンパク質を９６ウェルのマイクロタイタープレートに直接コーティングした。抗体を添加した後のシグナル強度を用いて、カニクイザルＣＤ７３に対する抗体の結合活性を測定した。具体的な試験手順は次の通りである：
カニクイザルＣＤ７３タンパク質に対する抗ＣＤ７３抗体の交差結合活性をＥＬＩＳＡアッセイで試験した。カニクイザルＣＤ７３融合タンパク質を９６ウェルのマイクロタイタープレートに直接コーティングした。抗体を添加した後のシグナル強度を用いて、カニクイザルＣＤ７３に対する抗体の結合活性を測定した。具体的な試験手順は次の通りである：
【0160】
カニクイザルＣＤ７３（Sino Biological, カタログ番号90192-C08H）をＰＢＳ、ｐＨ７．４（Shanghai BasalMedia, カタログ番号B320）緩衝液で２μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートに５０μｌ／ウェルで添加し、３７℃のインキュベーターで２時間培養した。液体を捨て、２５０μｌ／ウェルのブロッキング液（５％スキムミルクをＰＢＳで希釈したもの）を加え、３７℃のインキュベーターで３時間、または４℃にて一晩（１６－１８時間）培養してブロッキングを行った。ブロッキング終了後、ブロッキング液を捨て、ＰＢＳＴ緩衝液でプレートを５回洗浄した後、種々の濃度の各試験抗体（精製ハイブリドーマ抗体またはヒト化抗体をサンプル希釈液で希釈したもの）を５０μｌ／ウェル添加し、３７℃のインキュベーターで１時間インキュベートした。培養終了後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、サンプル希釈液で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウス２次抗体（Jackson Immuno Research, カタログ番号115-035-003）またはヤギ抗ヒト２次抗体（Jackson Immuno Research, カタログ番号109-035-003）を５０μｌ／ウェル添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ発色基質（KPL, カタログ番号52-00-03）を加え、室温で５－１０分インキュベートし、５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（Molecular Devices, VERSA max）を用いて波長４５０ｎｍの吸光度値を読み取り、GraphPad Prism 5でデータを解析した。抗ＣＤ７３抗体のサルＣＤ７３に対する結合性をＥＣ５０値として算出した。試験結果を図２および表１０に示す。
【0161】
【表22】
【0162】
試験結果は、本発明の抗ＣＤ７３抗体Ｈａｂ１１０．２１、Ｈａｂ１２７．３１ｄおよびＨａｂ１０８．６４が、何れもサルＣＤ７３タンパク質に対して良好な結合作用を有することを示す。
【0163】
３．抗ＣＤ７３抗体のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への結合アッセイ
抗ＣＤ７３抗体の、ヒトＣＤ７３を高度に発現する腫瘍細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１への結合を、ＥＬＩＳＡアッセイで試験した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を９６ウェルのマイクロタイタープレートに直接コーティングした。抗体添加後のシグナル強度を用いて、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対する抗体の結合活性を判定した。具体的な試験手順は次の通りである：
抗ＣＤ７３抗体の、ヒトＣＤ７３を高度に発現する腫瘍細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１への結合を、ＥＬＩＳＡアッセイで試験した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を９６ウェルのマイクロタイタープレートに直接コーティングした。抗体添加後のシグナル強度を用いて、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対する抗体の結合活性を判定した。具体的な試験手順は次の通りである：
【0164】
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（ATCC, カタログ番号HTB-26）を９６ウェルプレート（Corning, カタログ番号CLS3599-100EA）に６×１０５／ｍｌ、１００μｌ／ウェルの密度で播種し、一晩培養した。上清を捨て、プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、１００μｌ／ウェルlの細胞免疫固定液（Beyotime, カタログ番号P0098）を加え、室温で３０分間固定した後、プレートをＰＢＳで４回洗浄した。液体を捨て、２５０μｌ／ウェルのブロッキング液（５％スキムミルクをＰＢＳで希釈したもの）を加え、３７℃のインキュベーターで３時間培養した。ブロッキング終了後、ブロッキング液を捨て、ＰＢＳＴ緩衝液でプレートを５回洗浄し、種々の濃度の各試験抗体を５０μｌ／ウェル添加し、３７℃のインキュベーターで１時間インキュベートした。培養終了後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、サンプル希釈液で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウス２次抗体（Jackson Immuno Research, カタログ番号115-035-003）またはヤギ抗ヒト２次抗体（Jackson Immuno Research, カタログ番号109-035-003）を５０μｌ／ウェル加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ発色基質（KPL, Cat No.52-00-03）を加え、室温で５－１５分インキュベートし、５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（Molecular Devices, VERSA max）で波長４５０ｎｍの吸光度値を読み取り、GraphPad Prism 5でデータを解析した。ＣＤ７３を過剰発現させたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対する抗ＣＤ７３抗体の結合性をＥＣ５０値として算出した。試験結果を図３および表１１に示す。
【0165】
【表23】
【0166】
試験結果は、本発明の抗ＣＤ７３抗体Ｈａｂ１１０．２１、Ｈａｂ１２７．３１ｄおよびＨａｂ１０８．６４が、何れも腫瘍細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対して良好な結合作用を有することを示す。
【0167】
４．抗ＣＤ７３抗体のBiacore検出
この試験において、Biacore装置を用いて、ヒト化抗ＣＤ７３抗体のヒトＣＤ７３（ｈｕＣＤ７３）およびサルＣＤ７３（ｃｙｎｏＣＤ７３）に対する親和性を調べた。
この試験において、Biacore装置を用いて、ヒト化抗ＣＤ７３抗体のヒトＣＤ７３（ｈｕＣＤ７３）およびサルＣＤ７３（ｃｙｎｏＣＤ７３）に対する親和性を調べた。
【0168】
一定量の試験抗体をプロテインＡバイオセンシングチップ（カタログ番号29127556, GE）で親和性捕捉した後、一定濃度のヒトまたはサルのＣＤ７３抗原をチップ表面に添加した。反応シグナルをBiacore装置（Biacore T200, GE）でリアルタイムに検出し、結合および解離曲線を作成した。各サイクルの最後に、解離が完了した後、バイオセンサーチップを洗浄し、グリシン－ＨＣｌ、ｐＨ１．５（カタログ番号BR-1003-54, GE）で再生させた。アッセイのための泳動バッファーは、１×ＨＢＳ－ＥＰバッファー溶液（カタログ番号BR-1001-88, GE）であった。
【0169】
試験で得られたデータを、GE Biacore T200 Evaluation version 3.0ソフトウェアを用いて（1：1）Langmuirモデルに当てはめ、親和性の値を得た。詳細を表１２および表１３に示す。
【0170】
【表24】
【表25】
【0171】
【表26】
【0172】
試験結果は、本発明の抗ＣＤ７３抗体Ｈａｂ１１０．２１、Ｈａｂ１２７．３１ｄおよびＨａｂ１０８．６４が何れも、ヒトＣＤ７３およびサルＣＤ７３に高親和性で結合することを示す。
【0173】
実施例４．酵素活性の阻害における抗ＣＤ７３抗体の活性の試験
抗ＣＤ７３抗体の酵素活性阻害効果を化学発光法を用いて測定し、この方法は、ヒトＣＤ７３を高度に発現しているＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、抗体の酵素活性阻害活性を検出するために用いた。抗体をＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に添加し、ＣＤ７３酵素活性に対する阻害効果を、ＣＤ７３酵素の活性基質の残存量を測定することにより判定した。具体的な試験手順は次の通りである。
抗ＣＤ７３抗体の酵素活性阻害効果を化学発光法を用いて測定し、この方法は、ヒトＣＤ７３を高度に発現しているＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、抗体の酵素活性阻害活性を検出するために用いた。抗体をＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に添加し、ＣＤ７３酵素活性に対する阻害効果を、ＣＤ７３酵素の活性基質の残存量を測定することにより判定した。具体的な試験手順は次の通りである。
【0174】
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（ATCC, HTB-26）を９６ウェルプレートに２×１０５／ｍｌの密度で１００μｌ／ウェルずつ播種し、一晩培養した。上清を捨て、プレートをＰＢＳで１回洗浄した後、様々な濃度の各試験抗体（精製ハイブリドーマ抗体またはヒト化抗体、細胞培養液（RPMI-1640、Hyclone社、カタログ番号SH30809.01）で希釈したもの）を５０μｌ／ウェル添加し、３７℃のインキュベーターで０．５時間培養した。その後、アデノシン－５’－一リン酸（Sigma, カタログ番号A1752-5MG, 細胞培養液で希釈）を５０μｌ／ウェル添加し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃にて３時間培養した。インキュベーション終了後、反応液２５μｌ／ウェルを新しい９６ウェルプレート（PerkinElmer, カタログ番号6005290）に移し、５’－アデノシン三リン酸（Sigma, カタログ番号A7699-5MG, 細胞培養液で希釈したもの）を２５μｌ／ウェル添加し、最後にCellTiter Glo（Promega, カタログ番号G7573）を５０μｌ／ウェル添加した。化学発光値をCytation5（Biotek社）で読み取り、データをGraphPad Prism5で解析し、抗ＣＤ７３抗体によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の酵素活性の阻害をＩＣ５０値として算出した。
【0175】
【表27】
【0176】
試験結果は、本発明の抗ＣＤ７３抗体Ｈａｂ１１０．２１、Ｈａｂ１２７．３１ｄおよびＨａｂ１０８．６４が何れも、ＣＤ７３（腫瘍細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１で発現される）のその基質に対する酵素活性を顕著に阻害し得ることを示し、酵素活性に対する最大阻害効果は、陽性対照抗体であるＭＥＤＩ９４４７（特許出願ＷＯ２０１６０７５０９９に開示されている抗体ＭＥＤＩ９４４７を参照）よりも高いことを示す（図４参照）。酵素加水分解のＩＣ５０値は、陽性対照抗体であるＣＰＸ００６よりも顕著に低く（表１４参照）、このことは、本発明の抗ＣＤ７３抗体が、２つの陽性対照抗体であるＭＥＤＩ９４４７およびＣＰＸ００６よりもＣＤ７３酵素活性を阻害する能力が高いことを示している。
【0177】
実施例５．抗ＣＤ７３抗体により誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞増殖のインビトロ試験
ＣＤ４マイクロビーズ（CD4 microspheres, Miltenyi Biotec, カタログ番号130-045-101）を用いて、ヒト全血から調製したＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔ細胞を分離および精製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をCell Proliferation Dye eFluor(商標) 670 (Invitrogen, カタログ番号65-0840)で染色した。染色したＣＤ４＋Ｔ細胞にHuman CD3/CD28 Dynabeads (CD3/CD28 immunomagnetic beads, Gibco, カタログ番号11131D)および１５０Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２ (PeproTech, カタログ番号200-02)を添加して活性化した後、丸底９６ウェルプレートに１ウェルあたり５０，０００個（１ウェルあたり８０μl）の細胞を添加し、３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターにて１時間インキュベートした。次に、ＣＤ７３抗体または対照分子（MEDI9447、CPX006陽性対照、培地ブランク対照、アイソタイプヒトＩｇＧ陰性対照を含む）を１０μｌずつ各ウェルに加え、終濃度を１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０.１ｎｇ／ｍｌとし、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで１時間プレインキュベートした後、後にＡＭＰ（アデノシン－５’－一リン酸ナトリウム、SIGMA、カタログ番号A1752-1G）を終濃度４００μＭとなるように各ウェルに１０μｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで４日間培養した。ＣＤ４＋Ｔ細胞の培養に用いた培地は、X-VIVO(商標) １５無血清培地（Lonza社、カタログ番号04-418QCN）であった。４日後、フロー緩衝液（２．５％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で細胞を洗浄し、フローサイトメトリーで細胞を検出してＡＰＣ蛍光値を求めた。
ＣＤ４マイクロビーズ（CD4 microspheres, Miltenyi Biotec, カタログ番号130-045-101）を用いて、ヒト全血から調製したＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔ細胞を分離および精製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をCell Proliferation Dye eFluor(商標) 670 (Invitrogen, カタログ番号65-0840)で染色した。染色したＣＤ４＋Ｔ細胞にHuman CD3/CD28 Dynabeads (CD3/CD28 immunomagnetic beads, Gibco, カタログ番号11131D)および１５０Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２ (PeproTech, カタログ番号200-02)を添加して活性化した後、丸底９６ウェルプレートに１ウェルあたり５０，０００個（１ウェルあたり８０μl）の細胞を添加し、３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターにて１時間インキュベートした。次に、ＣＤ７３抗体または対照分子（MEDI9447、CPX006陽性対照、培地ブランク対照、アイソタイプヒトＩｇＧ陰性対照を含む）を１０μｌずつ各ウェルに加え、終濃度を１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０.１ｎｇ／ｍｌとし、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで１時間プレインキュベートした後、後にＡＭＰ（アデノシン－５’－一リン酸ナトリウム、SIGMA、カタログ番号A1752-1G）を終濃度４００μＭとなるように各ウェルに１０μｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで４日間培養した。ＣＤ４＋Ｔ細胞の培養に用いた培地は、X-VIVO(商標) １５無血清培地（Lonza社、カタログ番号04-418QCN）であった。４日後、フロー緩衝液（２．５％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で細胞を洗浄し、フローサイトメトリーで細胞を検出してＡＰＣ蛍光値を求めた。
【0178】
試験結果を図５に示す。この結果は、非活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は増殖しないことを示す。活性化細胞については、ブランク対照ウェル（培地のみ）では約８０％のＣＤ４＋Ｔ細胞が増殖するのに対し、４００μＭ ＡＭＰはＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を顕著に阻害し、約５％の細胞しか増殖しない。抗ＣＤ７３抗体Ｈａｂ１１０．２１、Ｈａｂ１２７．３１ｄおよびＨａｂ１０８．６４は、程度の差こそあれ、ＡＭＰによるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖阻害効果を逆転させることができる。
【0179】
実施例６：動物における抗ＣＤ７３抗体のインビボ生物活性
１．抗ＣＤ７３抗体によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１皮下異種移植腫瘍の阻害試験
試験方法：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ATCCバンク）細胞１００μｌ（２．０×１０６個）を５０匹のＮＳＧマウス（B-NDG(登録商標)マウス、Beijing Biocytogene Biotechnology Co., Ltd.より購入）の右脇腹に皮下接種した。腫瘍発生後（～１６０ｍｍ３）、体重または腫瘍体積が大きすぎたり小さすぎたりするマウスは除外した。残ったマウスを、表１５に示すように、腫瘍量に基づいて６群に無作為に分けた（１群当たり６匹）。２人のボランティアの血液からＰＢＭＣ（Peripheral Blood Mononuclear Cells）を分離し、刺激を与えずに１：１の割合で混合した。０．７１５×１０７／１００μｌをマウスの腹腔内に注射した。翌日から、本発明の抗ＣＤ７３抗体および対照分子（アイソタイプヒトＩｇＧブランク対照、ＭＥＤＩ９４４７陽性対照、CPX006陽性対照を含む）を、週２回、合計３週間、腹腔内に注射した。週に２回、腫瘍量および体重を測定し、データを記録した。グループ分けおよび投与量を表１５に示す。
１．抗ＣＤ７３抗体によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１皮下異種移植腫瘍の阻害試験
試験方法：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ATCCバンク）細胞１００μｌ（２．０×１０６個）を５０匹のＮＳＧマウス（B-NDG(登録商標)マウス、Beijing Biocytogene Biotechnology Co., Ltd.より購入）の右脇腹に皮下接種した。腫瘍発生後（～１６０ｍｍ３）、体重または腫瘍体積が大きすぎたり小さすぎたりするマウスは除外した。残ったマウスを、表１５に示すように、腫瘍量に基づいて６群に無作為に分けた（１群当たり６匹）。２人のボランティアの血液からＰＢＭＣ（Peripheral Blood Mononuclear Cells）を分離し、刺激を与えずに１：１の割合で混合した。０．７１５×１０７／１００μｌをマウスの腹腔内に注射した。翌日から、本発明の抗ＣＤ７３抗体および対照分子（アイソタイプヒトＩｇＧブランク対照、ＭＥＤＩ９４４７陽性対照、CPX006陽性対照を含む）を、週２回、合計３週間、腹腔内に注射した。週に２回、腫瘍量および体重を測定し、データを記録した。グループ分けおよび投与量を表１５に示す。
【0180】
【表28】
特記： i.p．は、腹腔内注射を意味する。
Excel統計ソフトウェアを用いた：平均値はavg（Average）として計算した；SD（標準偏差）値はＳＴＤＥＶとして計算した；ＳＥＭ（Standard Error of Mean）値はSTDEV/SQRT（Square root）（各群の動物数）として計算した；グラフ作成にはGraphPad Prismソフトウェアを用いた；データの統計分析にはTwo-way ANOVA（二元配置分散分析）またはOne-way ANOVA（一元配置分散分析）を用いた。
【0181】
腫瘍体積（Ｖ）は、次の式に従って算出した：V=1/2×Llong×Lshort
2
相対体積（RTV）=ＶT/Ｖ0
腫瘍抑制率(％)=(C RTV -T RTV)/CRTV(％）
式中、Ｖ０およびＶＴは、それぞれ試験開始時と終了時の腫瘍体積を表す。ＣＲＴＶおよびＴＲＴＶは、それぞれ試験終了時のブランク対照群（ビークル）および試験群の相対的な腫瘍体積を表す。
相対体積（RTV）=ＶT/Ｖ0
腫瘍抑制率(％)=(C RTV -T RTV)/CRTV(％）
式中、Ｖ０およびＶＴは、それぞれ試験開始時と終了時の腫瘍体積を表す。ＣＲＴＶおよびＴＲＴＶは、それぞれ試験終了時のブランク対照群（ビークル）および試験群の相対的な腫瘍体積を表す。
【0182】
試験結果は次の通りである。
Ｄ１からＤ２０まで、１週間に２回皮下注射を行い、抗ＣＤ７３抗体のＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍に対する増殖阻害効果を検出した。その試験結果を表１６および図６に示す。各群のマウスの体重は大きく変化しなかった。アイソタイプのヒトＩｇＧブランク対照群と比較すると、ＭＥＤＩ９４４７群、ＣＰＸ００６群、Ｈａｂ１１０．２１群、Ｈａｂ１２７．３１ｄ群、Ｈａｂ１０８．６４群の腫瘍阻害率は、それぞれ１６％、１８％、３６％、３３％、２５％であった。Ｈａｂ１１０．２１群、Ｈａｂ１２７．３１ｄ群、Ｈａｂ１０８．６４群は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍の増殖を有意に抑制することができる（ｐ＜０．０１）。
Ｄ１からＤ２０まで、１週間に２回皮下注射を行い、抗ＣＤ７３抗体のＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍に対する増殖阻害効果を検出した。その試験結果を表１６および図６に示す。各群のマウスの体重は大きく変化しなかった。アイソタイプのヒトＩｇＧブランク対照群と比較すると、ＭＥＤＩ９４４７群、ＣＰＸ００６群、Ｈａｂ１１０．２１群、Ｈａｂ１２７．３１ｄ群、Ｈａｂ１０８．６４群の腫瘍阻害率は、それぞれ１６％、１８％、３６％、３３％、２５％であった。Ｈａｂ１１０．２１群、Ｈａｂ１２７．３１ｄ群、Ｈａｂ１０８．６４群は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍の増殖を有意に抑制することができる（ｐ＜０．０１）。
【0183】
【表29】
【0184】
２．抗ＣＤ７３抗体による肺転移性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｌｕｃの阻害試験
試験方法：
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＬＵＣ細胞(Caliper、USA)を培養し、接種前にヒトアイソタイプＩｇＧまたはＣＤ７３抗体と共に２時間インキュベートし、抗体の終濃度を１０μｇ／ｍｌとした後、２００μｌ（２．５×１０５細胞）をＮＳＧマウスの各尾静脈に注入した。表１７に示すように、マウスを４グループに分け、１グループあたり５～７匹のマウスを用いた。２人のボランティアの血液からＰＢＭＣ（Peripheral Blood Mononuclear Cells）を分離し、刺激を与えずに１：１の割合で混合した。０．５７×１０７／１００μｌをマウスの腹腔内に注射した。翌日から、週２回、計３週間、腹腔内に抗体を注射した。週に２回、インビボで生物発光値を測定し、体重を測定し、データを記録した。グループ分けおよび投与量を表１７に示す。
試験方法：
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＬＵＣ細胞(Caliper、USA)を培養し、接種前にヒトアイソタイプＩｇＧまたはＣＤ７３抗体と共に２時間インキュベートし、抗体の終濃度を１０μｇ／ｍｌとした後、２００μｌ（２．５×１０５細胞）をＮＳＧマウスの各尾静脈に注入した。表１７に示すように、マウスを４グループに分け、１グループあたり５～７匹のマウスを用いた。２人のボランティアの血液からＰＢＭＣ（Peripheral Blood Mononuclear Cells）を分離し、刺激を与えずに１：１の割合で混合した。０．５７×１０７／１００μｌをマウスの腹腔内に注射した。翌日から、週２回、計３週間、腹腔内に抗体を注射した。週に２回、インビボで生物発光値を測定し、体重を測定し、データを記録した。グループ分けおよび投与量を表１７に示す。
【0185】
【表30】
特記: i.p．は、腹腔内投与を意味する。
【0186】
Excel統計ソフトを用いた：各動物群の体重と腫瘍の生物発光量ＲＯＩ値（対象領域（region of interest）；単位p/s（photons per second、単位時間当たりに動物の体表から放出される光子の数））を両方とも、平均±ＳＥＭで表した。グラフ作成にはGraphPad Prismソフトウェアを使用し、データは２方向ＡＮＯＶＡで統計的に分析した。
【0187】
相対的肺生物発光値：相対的ＲＯＩ(R-ROI)=ROIT/ROI0、ROITは試験終了時の肺の生物発光値、ROI0は試験開始時の肺の生物発光値。
腫瘍阻害率(％)=(T R-ROI -C R-ROI)/C R-ROI (％)
式中、TR-ROIおよびCR-ROIは、それぞれ試験終了時の投与群および対照群の相対的な肺の生物発光値である。
腫瘍阻害率(％)=(T R-ROI -C R-ROI)/C R-ROI (％)
式中、TR-ROIおよびCR-ROIは、それぞれ試験終了時の投与群および対照群の相対的な肺の生物発光値である。
【0188】
試験結果：
Ｄ１からＤ１８まで、週に２回皮下注射を行い、抗ＣＤ７３抗体の肺転移ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｌｕｃの阻害効果を検出した。試験結果を表１８、図７および図８に示す。ヒトイソタイプＩｇＧブランク対照群と比較すると、Ｈａｂ１１０．２１群、Ｈａｂ１２７．３１ｄ群およびＨａｂ１０８．６４群の腫瘍阻害率は、それぞれ６１％（p＜0.001）、６０％（p＜0.001）および７８％（p＜0.001）であった。何れの群も、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＬＵＣ細胞の肺転移および増殖を有意に阻害することができる。
Ｄ１からＤ１８まで、週に２回皮下注射を行い、抗ＣＤ７３抗体の肺転移ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｌｕｃの阻害効果を検出した。試験結果を表１８、図７および図８に示す。ヒトイソタイプＩｇＧブランク対照群と比較すると、Ｈａｂ１１０．２１群、Ｈａｂ１２７．３１ｄ群およびＨａｂ１０８．６４群の腫瘍阻害率は、それぞれ６１％（p＜0.001）、６０％（p＜0.001）および７８％（p＜0.001）であった。何れの群も、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＬＵＣ細胞の肺転移および増殖を有意に阻害することができる。
【0189】
【表31】
【0190】
実施例７：マウスにおける抗ＣＤ７３抗体のインビボ薬物動態試験
１８匹のＣ５７マウス（雌）をSippr-BK Lab Animal Co.Ltd.から購入した。実験室の環境に４日間順応させ、餌と水を自由に摂取させ、１２時間／１２時間の明暗サイクルで、温度１６～２６℃、相対湿度４０～７０％の環境下に置き、体重が１８ｇ～２２ｇになった時点で投与を開始した。試験日に、マウスを６群に等分し、３群には尾静脈（IV）から試験薬（Ｈａｂ１０８．６４、Ｈａｂ１１０．２１、Ｈａｂ１２７．３１ｄ）を注射し、残りの３群には試験薬（Ｈａｂ１０８．６４、Ｈａｂ１１０．２１、Ｈａｂ１２７．３１ｄ）を皮下注射（SC）した。投与量は３ｍｇ／ｋｇとし、投与体積は１０ｍＬ／ｋｇとした。
１８匹のＣ５７マウス（雌）をSippr-BK Lab Animal Co.Ltd.から購入した。実験室の環境に４日間順応させ、餌と水を自由に摂取させ、１２時間／１２時間の明暗サイクルで、温度１６～２６℃、相対湿度４０～７０％の環境下に置き、体重が１８ｇ～２２ｇになった時点で投与を開始した。試験日に、マウスを６群に等分し、３群には尾静脈（IV）から試験薬（Ｈａｂ１０８．６４、Ｈａｂ１１０．２１、Ｈａｂ１２７．３１ｄ）を注射し、残りの３群には試験薬（Ｈａｂ１０８．６４、Ｈａｂ１１０．２１、Ｈａｂ１２７．３１ｄ）を皮下注射（SC）した。投与量は３ｍｇ／ｋｇとし、投与体積は１０ｍＬ／ｋｇとした。
【0191】
投与前、および投与後５分、８時間、１日、２日、４日、７日、１０日、１４日、２１日および２８日の各時点で採血した。各動物から、抗凝固剤を加えずに約０．１ｍｌの全血を採取した。採血した血液を４℃で３０分置き、１０００gで１５分間遠心した後、上清をＥＰチューブに移し、－８０℃で保存した。
【0192】
血清中の抗体濃度をＥＬＩＳＡ法で検出し、試験薬の薬物動態パラメータをWinnolinソフトウェアで算出した。試験結果を表１９に示す。この結果から、本発明のＨａｂ１０８．６４、Ｈａｂ１１０．２１およびＨａｂ１２７．３１ｄは、良好なインビボ安定性および高いバイオアベイラビリティを有し、皮下注射に適していることがわかった。
【0193】
【表32】
特記: 用量（Dose：投与量）、Cmax（最高血中濃度）、AUC 0-∞（薬物－時間曲線下面積）、Bioavailability（バイオアベイラビリティ）、t1/2(h)：半減期（時間単位）、T1/2(d)：半減期（日単位）、RSD（相対標準偏差）、IV（静脈内注射）、Sc（皮下注射）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】