特表 2022-510388 タンパク質結晶の高コントラストイメージングのための携帯型ＵＶホログラフィック顕微鏡

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-26

(54)【発明の名称】タンパク質結晶の高コントラストイメージングのための携帯型ＵＶホログラフィック顕微鏡

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/17 20060101AFI20220119BHJP

   G03H 1/22 20060101ALI20220119BHJP

   G03H 1/04 20060101ALI20220119BHJP

【ＦＩ】

G01N21/17 A

G03H1/22

G03H1/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021531559

(86)(22)【出願日】2019-12-03

(85)【翻訳文提出日】2021-07-30

(86)【国際出願番号】 US2019064321

(87)【国際公開番号】W WO2020117864

(87)【国際公開日】2020-06-11

(31)【優先権主張番号】62/775,005

(32)【優先日】2018-12-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ

２．ｉＰａｄ

(71)【出願人】

【識別番号】592110646

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

(74)【代理人】

【識別番号】110001302

【氏名又は名称】特許業務法人北青山インターナショナル

(72)【発明者】

【氏名】オズキャン，アイドガン

(72)【発明者】

【氏名】ライ，アニルッドハ

(72)【発明者】

【氏名】ダログリュー，ムスタファ

【テーマコード（参考）】

2G059

2K008

【Ｆターム（参考）】

2G059AA05

2G059BB12

2G059CC16

2G059EE01

2G059FF01

2G059GG02

2G059GG03

2G059HH03

2G059JJ02

2G059KK04

2G059MM01

2K008AA06

2K008BB04

2K008CC03

2K008HH01

2K008HH28

(57)【要約】

ＵＶホログラフィックイメージングデバイスは、高価で嵩張る光学部品を必要とせずに、タンパク質結晶をイメージングして塩結晶と区別するための低コストで携帯型の堅牢な手法を提供する。この「オンチップ」デバイスは、ＵＶ ＬＥＤと、キャップを外してプロセッサまたはマイクロコントローラに接続された消費者用のＣＭＯＳイメージセンサとを使用し、センサのアクティブ領域のすぐ近くに置かれた結晶サンプルからの情報は、インラインホログラムの形態でキャプチャされ、デジタル逆伝播によって抽出される。それらのホログラムの振幅および／または位相の再構成では、タンパク質結晶が、塩結晶とは異なり、強いＵＶ吸収により背景に比べて著しく暗く見え、タンパク質結晶と塩結晶を明確に区別することが可能である。このように、オンチップＵＶホログラフィック顕微鏡は、タンパク質結晶学で使用される従来のレンズベースのＵＶ顕微鏡に代わる、低コストで高感度かつ堅牢な代替手段として機能する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

結晶を含むサンプルをイメージングする方法であって、
携帯型ホログラフィック顕微鏡を提供するステップであって、前記携帯型ホログラフィック顕微鏡が、紫外線（ＵＶ）を発する１または複数の光源と、ＵＶバンドパスフィルタと、イメージセンサと、前記イメージセンサと動作可能に通信するマイクロコントローラまたはオンボードプロセッサとを備える、ステップと、
結晶を含むサンプルを前記携帯型ホログラフィック顕微鏡内に挿入し、前記１または複数の光源からのフィルタリングされた光でサンプルを照射するステップと、
前記イメージセンサにより、結晶を含むサンプルの１または複数の生のホログラム画像をキャプチャするステップと、
コンピューティングデバイスを使用して実行される画像処理ソフトウェアを用いて、前記１または複数の生のホログラム画像をデジタル逆伝播して、サンプルの１または複数の振幅および／または位相画像を取得するステップとを備えることを特徴とする方法。

【請求項2】

請求項１に記載の方法において、
前記結晶の少なくとも一部が、タンパク質結晶を含むことを特徴とする方法。

【請求項3】

請求項１に記載の方法において、
前記サンプルが、タンパク質結晶と塩結晶の混合物を含むことを特徴とする方法。

【請求項4】

請求項１に記載の方法において、
前記１または複数の生のホログラム画像が、前記マイクロコントローラまたはオンボードプロセッサに一時的に保存され、前記画像処理ソフトウェアを含む第２のコンピューティングデバイスに転送されることを特徴とする方法。

【請求項5】

請求項１に記載の方法において、
前記イメージセンサが、カラーイメージセンサを含むことを特徴とする方法。

【請求項6】

請求項１に記載の方法において、
イメージセンサが、モノクロイメージセンサを含むことを特徴とする方法。

【請求項7】

請求項１に記載の方法において、
前記１または複数の光源が、１または複数のＵＶ発光ダイオード（ＬＥＤ）を含むことを特徴とする方法。

【請求項8】

請求項１に記載の方法において、
前記サンプルが、前記携帯型ホログラフィック顕微鏡内に挿入される別個の光透過性のサンプルホルダに含まれていることを特徴とする方法。

【請求項9】

請求項８に記載の方法において、
前記サンプルホルダが、結晶を含む液体サンプルを保持するための３次元ボリュームを規定することを特徴とする方法。

【請求項10】

請求項１に記載の方法において、
前記サンプルの１または複数の振幅および／または位相画像が、オンボードコンピューティングデバイスまたは別のコンピューティングデバイスに付随するディスプレイに表示されることを特徴とする方法。

【請求項11】

請求項１に記載の方法において、
前記マイクロコントローラまたはオンボードプロセッサが、前記画像処理ソフトウェアを実行することを特徴とする方法。

【請求項12】

請求項１に記載の方法において、
前記画像処理ソフトウェアが、前記１または複数の振幅および／または位相画像において識別される結晶の測定したコントラストに少なくとも部分的に基づいて、非タンパク質結晶からタンパク質結晶を識別するように構成されていることを特徴とする方法。

【請求項13】

請求項１２に記載の方法において、
前記画像処理ソフトウェアが、前記１または複数の振幅および／または位相画像において識別される結晶の測定したコントラストが閾値を超えるか否かに基づいて、タンパク質結晶を識別するように構成されていることを特徴とする方法。

【請求項14】

請求項１に記載の方法において、
前記デジタル逆伝播が、角度スペクトル法またはフレネル伝播法を使用して実行されることを特徴とする方法。

【請求項15】

請求項１に記載の方法において、
複数の光源を順次照明して、対応するサブピクセルシフトした生のホログラム画像を得て、これにピクセル超解像プロセスを適用して、前記画像処理ソフトウェアにより、より高い空間解像度、より高いコントラストおよび／またはより高い信号対雑音比のうちの１または複数を有する１または複数のホログラム画像を生成することを特徴とする方法。

【請求項16】

携帯型ホログラフィック顕微鏡であって、
携帯型ハウジングを備え、この携帯型ハウジングが、
紫外線（ＵＶ）光を照射する１または複数の光源と、
ＵＶバンドパスフィルタと、
結晶を含むサンプルを中に保持または受け入れるように構成されたサンプルホルダと、
イメージセンサと、
前記１または複数の光源を制御するとともに、前記イメージセンサから得られたサンプルの１または複数の画像を受信するように構成されたプロセッサおよび／またはマイクロコントローラとを備えることを特徴とする携帯型ホログラフィック顕微鏡。

【請求項17】

請求項１６に記載の携帯型ホログラフィック顕微鏡において、
前記携帯型ハウジングのプロセッサまたはマイクロコントローラと通信する第２のコンピューティングデバイスをさらに備え、前記第２のコンピューティングデバイスが、前記第２のコンピューティングデバイス上で実行される画像処理ソフトウェアを有し、この画像処理ソフトウェアが、前記サンプルの１または複数の画像を、前記サンプルの対応する１または複数の振幅および／または位相画像に逆伝播するように構成されていることを特徴とする携帯型ホログラフィック顕微鏡。

【請求項18】

請求項１７に記載の携帯型ホログラフィック顕微鏡において、
前記第２のコンピューティングデバイスが、ローカルコンピューティングデバイスを含むことを特徴とする携帯型ホログラフィック顕微鏡。

【請求項19】

請求項１７に記載の携帯型ホログラフィック顕微鏡において、
前記第２のコンピューティングデバイスが、リモートコンピューティングデバイスを含むことを特徴とする携帯型ホログラフィック顕微鏡。

【請求項20】

請求項１６に記載の携帯型ホログラフィック顕微鏡において、
ある体積のサンプルを保持するように構成されたサンプルチャンバをさらに備えることを特徴とする携帯型ホログラフィック顕微鏡。

【請求項21】

請求項１６に記載の携帯型ホログラフィック顕微鏡において、
可視光を発する１または複数の光源をさらに備えることを特徴とする携帯型ホログラフィック顕微鏡。

【請求項22】

請求項１７に記載の携帯型ホログラフィック顕微鏡において、
前記携帯型ハウジングが、対応するサブピクセルシフトされた生のホログラム画像を得るために順次照射される複数の光源を含み、前記画像処理ソフトウェアが、より高い空間解像度、より高いコントラストおよび／またはより高い信号対雑音比のうちの１または複数を有する１または複数のピクセル超解像ホログラム画像を生成するように構成されていることを特徴とする携帯型ホログラフィック顕微鏡。

【請求項23】

携帯型ホログラフィック顕微鏡システムであって、
ハウジング内に光軸に沿って紫外線（ＵＶ）光を発する１または複数の光源を含む携帯型ハウジングと、
前記ハウジング内に光軸に沿って配置されたＵＶバンドパスフィルタと、
前記ハウジング内に光軸に沿って配置されたイメージセンサと、
前記１または複数の光源を制御するとともに、前記イメージセンサから得られたサンプルの１または複数の画像を受信するように構成されたプロセッサおよび／またはマイクロコントローラと、
結晶を含むサンプルを中に保持または受け入れるように構成されたサンプルホルダであって、光軸に沿って位置しかつ前記イメージセンサに隣接するよう前記にハウジング内に挿入可能なサンプルホルダと、
前記携帯型ハウジングのプロセッサまたはマイクロコントローラと通信する別のコンピューティングデバイスであって、この別のコンピューティングデバイス上で実行される画像処理ソフトウェアを有し、この画像処理ソフトウェアが、前記結晶を含むサンプルの１または複数の画像を、前記サンプルの対応する１または複数の振幅および／または位相画像に逆伝播するように構成されている、別のコンピューティングデバイスとを備えることを特徴とするシステム。

【請求項24】

請求項２３に記載のシステムにおいて、
前記サンプルの対応する１または複数の振幅および／または位相画像を表示するように構成されたディスプレイをさらに備えることを特徴とするシステム。

【請求項25】

請求項２４に記載のシステムにおいて、
前記画像処理ソフトウェアが、前記サンプルの１または複数の振幅および／または位相画像において識別される結晶の測定したコントラストに少なくとも部分的に基づいて、非タンパク質結晶からタンパク質結晶を識別するように構成されていることを特徴とするシステム。

【請求項26】

請求項２５に記載のシステムにおいて、
前記画像処理ソフトウェアが、前記サンプルの１または複数の振幅および／または位相画像において識別される結晶のコントラストの測定値が閾値を超えるか否かに基づいて、タンパク質結晶を識別するように構成されていることを特徴とするシステム。

【請求項27】

請求項２３に記載のシステムにおいて、
可視光を発する１または複数の光源をさらに備えることを特徴とするシステム。

【請求項28】

請求項２３に記載の携帯型ホログラフィック顕微鏡において、
前記携帯型ハウジングが、対応するサブピクセルシフトされた生のホログラム画像を得るために順次照射される複数の光源を含み、前記画像処理ソフトウェアが、より高い空間解像度、より高いコントラストおよび／またはより高い信号対雑音比のうちの１または複数を有する１または複数のピクセル超解像ホログラム画像を生成するように構成されていることを特徴とする携帯型ホログラフィック顕微鏡。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本技術分野は、概してホログラフィック顕微鏡デバイスおよび方法に関する。より詳細には、本技術分野は、結晶をイメージングするために使用される紫外線（ＵＶ）ホログラフィック顕微鏡デバイスに関する。ＵＶホログラフィック顕微鏡デバイスは、ユーザがタンパク質結晶と塩結晶とを区別することを可能にする。

【0002】

［関連出願］
本出願は、２０１８年１２月４日に出願された米国仮特許出願第６２／７７５，００５号の優先権を主張するものであり、この仮特許出願は、その全体が引用により本明細書に援用されるものとする。優先権は、米国特許法第１１９条および他の該当する法令に従って主張する。

【背景技術】

【0003】

タンパク質結晶学者は、明視野モードおよび紫外線（ＵＶ）誘起蛍光モードを有するデュアルモード光学顕微鏡を使用して、タンパク質結晶をイメージングするとともに、それらを結晶化プロセス中に形成される塩結晶と区別している。この区別は、主にＵＶ照射に対する反応に基づくものであり、殆どのタンパク質結晶は、塩結晶とは異なり、ＵＶ光を吸収して、トリプトファン残基を介して蛍光を発する。ＵＶ蛍光に加えて、有機材料内でのＵＶ光の強い吸収は、組織サンプル、細胞、細胞内の核酸やタンパク質、ウイルスやタンパク質凝集体をイメージングする際の固有の造影剤として利用されており、ＵＶ顕微鏡は研究者にとって重要なツールとなっている。しかしながら、従来のレンズベースのＵＶ顕微鏡は、比較的高価なイメージングモダリティであり、明視野イメージングのためのＵＶ光源やＵＶ感度の高いカメラに加えて、ＵＶ波長用に特別に設計された比較的嵩張る光学部品を使用する必要があり、かなりの費用（例えば、３５，０００ドル～２００，０００ドル）がかかる。例えば、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ａｓ ａ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌｓ」，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈ．Ｓｅｃｔ．Ｆ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔ．Ｃｏｍｍｕｎ，６６，３６４－３７２（２０１０）を参照されたい。さらに、レンズベースの顕微鏡の固有の限界は、従来のＵＶ顕微鏡にも当てはまり、視野（ＦＯＶ）と解像度との間のトレードオフにより、イメージングできるサンプルの総面積が制限されてしまう。このため、従来のＵＶベースの顕微鏡は、嵩張り高価であるだけでなく、多くの場合、比較的大きなＦＯＶしかイメージングすることができない。それには、かなり広い範囲でサンプルをスキャンする必要があり、時間と手間がかかる。したがって、そのような課題を解決するための代替的なＵＶベースの顕微鏡が必要とされている。

【発明の概要】

【0004】

一実施形態では、携帯型ホログラフィックイメージングプラットフォームまたはシステムが提供される。このプラットフォームまたはシステムは、光路に沿って光を発する紫外線（ＵＶ）光を発する１または複数の光源を含むハウジングまたはエンクロージャを含む、小型の携帯型ホログラフィックイメージングデバイスを含む。ＵＶバンドパスフィルタは、任意選択的には、側波帯を遮断し、実質的に純粋なＵＶ光をサンプルに向けて照射するために、光路に沿ってハウジングまたはエンクロージャに配置されている。一実施形態では、光の波長が約２８０ｎｍ、バンド幅が約１０ｎｍである。イメージセンサ（例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサ）は、光路に沿ってハウジングまたはエンクロージャ内に配置されており、サンプルホルダに含まれる結晶の生のインラインホログラム画像をキャプチャするために使用され、サンプルホルダは、光路に沿ってサンプルを配置するためにハウジングまたはエンクロージャ内に挿入される。サンプルホルダは、通常、イメージセンサに非常に近い位置（例えば、イメージセンサの活性面から数十～数百マイクロメートル離れた位置）に設置されるが、１または複数の光源は、サンプルホルダからさらに離れた位置（例えば、数センチメートル）に設置される。ターゲット結晶からの散乱光と背景照明との干渉により、インラインホログラムが形成され、イメージセンサによってデジタル化／記録される。携帯型イメージャデバイスは、１または複数の光源を制御し、いくつかの実施形態では、イメージセンサから得られたサンプルの１または複数の画像を受信するように構成されたコンピューティングデバイス、デジタル回路および／またはマイクロコントローラを含む。いくつかの実施形態では、複数の光源を使用して、個々の光源が順次作動されるときにイメージセンサによって得られる個々の低解像度の画像と比較して、より高い空間解像度、より高いコントラストおよび／またはより高い信号対雑音比を有する結晶のピクセル超解像ホログラム画像を合成または生成することができる。

【0005】

その後、イメージセンサによって取得または獲得された画像は、コンピューティングデバイス上で実行される画像処理ソフトウェアによる処理を受けて、結晶を含むサンプルの画像が、サンプルの対応する振幅および／または位相画像にデジタル的に逆伝播される。いくつかの実施形態では、画像処理ソフトウェアを実行するコンピューティングデバイスが、携帯型イメージングデバイスの一部であってもよい。他の実施形態では、画像処理ソフトウェアを実行するコンピューティングデバイスが、携帯型イメージングデバイスとは別個のものであり、有線または無線の接続を介してそれに接続される。例えば、携帯型ホログラフィックイメージングデバイスで得られた画像は、処理のために、パーソナルコンピュータ、ラップトップ、タブレットＰＣ、サーバ、仮想サーバなどのコンピュータに転送されるものであってもよい。

【0006】

サンプル中に存在するタンパク質ベースの結晶は暗く見えるが、塩ベースの結晶など他の非タンパク質結晶は同じ暗い外観を示さない。タンパク質結晶によって示される非常に大きなコントラストは、タンパク質結晶と非タンパク質結晶とを識別および区別するために使用される。サンプルおよび結晶の振幅および／または位相画像は、表示および／または分析のためにディスプレイ上でユーザに提示されるものであってもよい。いくつかの実施形態において、画像処理ソフトウェアは、サンプル中の結晶がタンパク質結晶であることを自動的に識別することができる。これは、画像化された結晶の相対的なコントラストレベルを閾値と比較することによって行うことができる。例えば、特定のレベルを超えるＵＶコントラストレベルを示す結晶は、タンパク質結晶として特徴付けることができる。また、画像処理ソフトウェアは、サンプル中のタンパク質結晶の数および／または濃度をカウントまたは定量化することができる。本デバイスでキャプチャされる画像は、イメージセンサのアクティブ領域によってのみ制限される大きなＦＯＶ（例えば、＞１０ｍｍ^２）を有する。

【0007】

一実施形態では、結晶を含むサンプルをイメージングする方法が、携帯型ホログラフィック顕微鏡を提供する操作を含み、携帯型ホログラフィック顕微鏡が、紫外線（ＵＶ）光を放出する１または複数の光源と、任意選択的なＵＶバンドパスフィルタと、イメージセンサと、イメージセンサと動作可能に通信するマイクロコントローラまたはオンボードプロセッサとを備える。結晶を含むサンプルは、携帯型ホログラフィック顕微鏡内に挿入され、サンプルが、１または複数の光源からのフィルタリングされた光（例えば、フィルタが使用されている場合）で照らされる。結晶を含むサンプルの１または複数の生のホログラム画像は、イメージセンサでキャプチャされる。ある特定の実施形態では、単一の生のホログラム画像のみが得られる（例えば、シングルショット動作モード）。１または複数の生のホログラム画像は、コンピューティングデバイスを用いて実行される画像処理ソフトウェアを使用して、デジタル逆伝播を受け、それによりサンプルの１または複数の振幅および／または位相画像が得られる。サンプルの１または複数の振幅および／または位相画像は、表示および／または分析のためにユーザに提示されるようにしてもよい。

【0008】

別の実施形態では、携帯型ホログラフィック顕微鏡が携帯型ハウジングまたはエンクロージャを含み、携帯型ハウジングまたはエンクロージャが、紫外線（ＵＶ）光を放出する１または複数の光源と、任意選択的なＵＶバンドパスフィルタと、結晶を含むサンプルを中に保持または受け入れるように構成されたサンプルホルダと、イメージセンサとを含む。携帯型ホログラフィック顕微鏡は、１または複数の光源を制御するとともに、イメージセンサから得られたサンプルの１または複数の画像を受信するように構成されたプロセッサおよび／またはマイクロコントローラを含む。

【0009】

別の実施形態では、携帯型ホログラフィック顕微鏡システムが、ハウジング内に光軸に沿って紫外線（ＵＶ）光を放出する１または複数の光源を有する携帯型ハウジングまたはエンクロージャを含む。任意選択的なＵＶバンドパスフィルタは、ハウジング内に光軸に沿って配置される。イメージセンサは、ハウジング内に光軸に沿って配置されている。携帯型ホログラフィック顕微鏡は、１または複数の光源を制御するとともに、イメージセンサから得られたサンプルの１または複数の画像を受信するように構成されたプロセッサおよび／またはマイクロコントローラを含む。サンプルホルダは、結晶を含むサンプルを中に保持または受け入れるように構成されており、光軸に沿って位置しかつイメージセンサに隣接するようにハウジング内に挿入可能である。サンプルホルダは、ハウジングまたはエンクロージャの一部であってもよいし、ハウジングまたはエンクロージャ内に挿入可能な別のコンポーネントやデバイスであってもよい。本システムは、携帯型ハウジングのプロセッサまたはマイクロコントローラと通信する別のコンピューティングデバイスを含み、別のコンピューティングデバイスは、この別のコンピューティングデバイス上で実行される画像処理ソフトウェアを有し、画像処理ソフトウェアが、結晶を含むサンプルの１または複数の画像を、サンプルの対応する１または複数の振幅および／または位相の画像に逆伝播するように構成されている。その後、サンプルの１または複数の振幅および／または位相画像が、別のコンピューティングデバイスのディスプレイまたは別のディスプレイ（例えば、携帯型電子デバイスまたは他のコンピューティングデバイスのディスプレイ）上でユーザに表示されるようにしてもよい。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は、結晶を含むサンプルの対応する１または複数の振幅および／または位相画像を生成するために画像処理（例えば、逆伝播）を受ける、結晶を含むサンプルの１または複数の生のホログラム画像を取得および／または獲得するために使用される携帯型ホログラフィック顕微鏡デバイスを含むシステムを示している。

【図2】図２は、一実施形態に係る図１の携帯型ホログラフィック顕微鏡デバイス／システムを操作するために使用される一連の動作を示している。

【図3】図３は、一実施形態に係るサンプルホルダの一実施形態を示している。

【図4】図４Ａは、ＵＶベースのホログラフィック顕微鏡の写真画像を示している。ＵＶ ＬＥＤは、側波帯をブロックするためにバンドパスフィルタを使用してスペクトルフィルタリングされ、２８０ｎｍのピーク波長と１０ｎｍの帯域幅を有する純粋なＵＶ光を、イメージセンサの非常に近く（約３００～４００μｍ）に配置されたサンプルに向けて透過させ、イメージングＦＯＶとして全アクティブ領域（＞１０ｍｍ^２）を利用する。図４Ｂは、携帯型ホログラフィック顕微鏡の簡略化された概略図の一部を切り取ったものである。

【図5】図５Ａは、プロテイナーゼＫ、塩化ナトリウムおよび硫酸アンモニウムの結晶の明視野顕微鏡画像を示している。図５Ｂは、図５Ａの同じＦＯＶの振幅再構成を示しており、プロテイナーゼＫの結晶が、著しく暗く見える。図５Ｃは、プロテイナーゼＫ、塩化ナトリウムおよび硫酸アンモニウムの結晶サンプルからのＸ線回折データを示しており、最大間隔値がそれぞれ３０A、３．２５A、３．２５Aである。

【図6】図６Ａは、携帯型ホログラフィック顕微鏡システム（図１、図４Ａ、図４Ｂ）によりキャプチャされた全ＦＯＶ（＞１０ｍｍ^２）画像を示しており、矩形が、５倍の対物レンズを有するレンズベースのＵＶ顕微鏡を使用して可能な典型的なＦＯＶを示している。図６Ｂは、レンズベースのＵＶ顕微鏡で明視野およびＵＶ蛍光の両方のモードでイメージングした、同じチャンバ内にプロテイナーゼＫと塩の結晶（酢酸リチウムおよび硫酸リチウム）を含むサンプルを示している。プロテイナーゼＫの結晶は２８０ｎｍのＵＶ光を強く吸収して蛍光を発するが、塩の結晶はそうではない。図６Ｃは、携帯型ホログラフィック顕微鏡システムによってキャプチャされた同じＦＯＶの対応する振幅再構成を示している。図６Ｂで蛍光を発した同じ結晶は、より強い吸収により、背景と比較して著しく暗く見え、一方、蛍光を発しなかった結晶（すなわち、塩結晶）は、振幅再構成において著しいコントラストを示していない。図６Ｄは、タンパク質結晶が塩結晶に比べて非常に強いＵＶコントラストを示している様子（ｐ＜０．０２）を示すグラフである。標準偏差バーは、ターゲットオブジェクトの平均コントラストを計算するために使用される矩形領域内のコントラストのバラツキを表している。

【図7】図７Ａは、レンズベースのＵＶ顕微鏡（明視野およびＵＶ蛍光）で得られたタンパク質結晶（ＲＩＮＧ１Ｂ複合体およびマルトース結合タンパク質結晶）の画像を、本明細書に記載の携帯型ホログラフィック顕微鏡で得られた再構成ＵＶ画像とともに示している。対照として、酢酸リチウム結晶（例えば、塩結晶）を用いた。タンパク質結晶は、レンズベースのＵＶイメージングプラットフォームでイメージングしたときに蛍光を示したが、塩結晶は僅かな蛍光しか示さなかった。同様に、タンパク質結晶からの振幅再構成では、著しいコントラストが見られたが、塩結晶では見られなかった。図７Ｂは、タンパク質結晶（ＲＩＮＧ１Ｂ複合体およびマルトース結合タンパク質の結晶）および塩結晶（酢酸リチウム）のＵＶコントラストを示すグラフである。この有意なコントラストの差（ｐ＜０．００３）は、タンパク質結晶と塩結晶を区別する上での携帯型ホログラフィック顕微鏡システムの有効性を明確に示している。標準偏差のバーは、ターゲットオブジェクトの平均コントラストを算出するために使用した矩形領域内のコントラストのバラツキを表している。

【発明を実施するための形態】

【0011】

図１は、結晶を含むサンプル１２の１または複数の生のホログラム画像４４を取得および／または獲得するために使用される携帯型ホログラフィック顕微鏡デバイス１０を含むシステム２を示しており、ホログラム画像は、その後、結晶を含むサンプル１２の対応する１または複数の振幅および／または位相画像６０を生成するために画像処理（例えば、本明細書で述べる逆伝播）を受ける。出力または生成された１または複数の振幅および／または位相画像６０は、高度なコントラストを有するタンパク質結晶１６を表示する（すなわち、それらは１または複数の振幅画像６０において暗く見える）。対照的に、非タンパク質結晶１８は、高度なコントラストを有さず、１または複数の振幅画像６０において明るく見える。他の実施形態では、位相画像６０が、特定の結晶に関して高度なコントラストを表示することができ、１または複数の振幅画像６０の代わりに、または１または複数の振幅画像と組み合わせて生成されるものであってもよい。システム２は、サンプル１２の複数の生のホログラム画像４４が得られることを想定しているが、単一の生のホログラム画像４４のみが必要であることを理解されたい。このため、一実施形態では、システム２が、携帯型ホログラフィック顕微鏡デバイス１０によって得られた「シングルショット」の生のホログラム画像４４に対して操作する。

【0012】

携帯型ホログラフィック顕微鏡デバイス１０は、ホログラフィック顕微鏡デバイス１０のコンポーネントを保持するハウジングまたはエンクロージャ２０を含む。携帯型ホログラフィック顕微鏡デバイス１０は、小型軽量であり、人が持ち運んで容易に移動することができ、従来の顕微鏡のように指定されたベンチエリアを必要としない。ハウジングまたはエンクロージャ２０は、様々な光学部品を保持し、外部の周囲光が入るのを遮断する内部部分２２を含む。ハウジングまたはエンクロージャ２０は、ポリマーまたはプラスチックのような軽量の材料から形成することができるが、他の材料を使用することもできる。図１を参照すると、ハウジングまたはエンクロージャ２０は、サンプル１２に紫外線（ＵＶ）光を照射するために使用される１または複数の光源２４を含む。１または複数の光源２４は、ＵＶ範囲の光を発する１または複数の発光ダイオード（ＬＥＤ）またはレーザダイオードを含むことができる。一実施形態では、１または複数の光源２４が、約２８０ｎｍのピーク波長で動作する単一の深紫外線ＬＥＤを含む。１または複数の光源２４は、ＵＶ範囲内の波長の範囲内で動作することができるが、必ずしも単一の波長で動作する必要はないことを理解されたい。約２８０ｎｍのピーク波長が使用される理由は、タンパク質結晶１６が、アミノ酸、トリプトファン、チロシンおよびシステインの存在により、この波長のＵＶ光を強く吸収するためである。塩の結晶１８は、この波長の紫外線を吸収しない。複数の光源２４が使用される場合、イメージセンサ３６へのシャドーイング効果を避けるために、複数の光源２４に隣接して（例えば、光源２４とＵＶバンドパスフィルタ３０との間に）、開口または穴２５が設けられる。ただし、開口または穴２５は任意であり、例えば、単一の光源２４を使用する場合には必要ない。

【0013】

さらに、別の代替的な実施形態では、サンプル１２を照射するために使用される複数の光源２４を有する。複数の光源２４は、光軸または光路３１に概ね直交するアレイに配置することができる。複数の光源２４は、任意選択的には、それぞれの光ファイバに結合されるようにしてもよく、それら光ファイバは、複数の光源２４の各々によって順次照射されるファイバのアレイまたはパターン（例えば、横列および縦列または他の２次元パターン）で終端となる。１または複数の別個の生のホログラフィック画像４４は、複数の光源２４の各々について、イメージセンサ３６でキャプチャされる。その後、横方向に（ｘ，ｙ平面において）オフセットされた光源２４は、ピクセル超解像プロセスで使用することができ、低解像度のシフトされたホログラフィック画像４４は、より高い空間解像度、より高いコントラストおよび／またはより高い信号対雑音比（ｓｎｒ）を有するホログラフィック画像４４を生成するために、ピクセル超解像プロセスを受ける。その後、それらの高解像度画像４４は、デジタル的に逆伝播されて、図２の内容に関連して記載および説明するように、振幅および／または位相画像６０が生成される。ピクセル超解像は、同じシーンまたはオブジェクトのサブピクセルシフトされた低解像度画像のセットから、より高い解像度の画像を合成する計算方法である。相対的なシフトは、低解像度ホログラム画像４４とともに、高解像度（超解像）ホログラムを推定するための最小二乗最適化問題の入力として提供される。ピクセル超解像に関する詳細は、例えば、Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，「Ｆｉｅｌｄ－Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｉｘｅｌ Ｓｕｐｅｒ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｏｌｏｕｒ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（９）：ｅ７６４７５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００７６４７５（２０１３）、並びに、Ｂｉｓｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｐｉｘｅｌ ｓｕｐｅｒ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｒｔａｂｌｅ ｌｅｎｓｌｅｓｓ ｏｎ－ｃｈｉｐ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｆｉｂｅｒ－ｏｐｔｉｃ ａｒｒａｙ」，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １１：１２７６－１２７９（２０１１）に記載されており、それらは引用により本明細書に援用されるものとする。

【0014】

ＬＥＤドライバ回路２６は、１または複数の光源２４を駆動するために使用することができるが、そのような回路は、後述するように、プリント回路基板（ＰＣＢ）３８上に配置されたマイクロコントローラまたはプロセッサ４０に組み込まれるものであってもよい。また、ＬＥＤドライバ回路２６を完全に省略し、ＬＥＤ光源２４を直接駆動するようにしてもよい。１または複数の光源２４は、携帯型ホログラフィック顕微鏡デバイス１０に付随する１または複数のバッテリなどの電源２８を用いて電力を供給するようにしてもよい。また、専用の電源コードを介して、またはデータ／画像の転送にも使用される通信ケーブル（例えば、ＵＳＢケーブル）を介して電力を供給するようにしてもよい。

【0015】

携帯型ホログラフィック顕微鏡デバイス１０は、１または複数の光源２４からの側波帯放射を遮断するために使用される任意選択的なＵＶバンドパスフィルタ３０を含む。ＵＶバンドパスフィルタ３０は、１または複数の光源２４から、ハウジングまたはエンクロージャ２０の内部２２を通って延びる光軸または光路３１に沿って配置されている。図１に示すように、サンプル１２を含むサンプルホルダ３２は、光軸または光路３１に挿入され、フィルタリングされたＵＶ光を受ける。サンプルホルダ３２は、結晶を含む液体を保持する３次元のボリュームを含むことができる。サンプルホルダ３２は、結晶サンプルを保持するために使用されるキュベット、チューブ、キャピラリ、チャンバ、ウェルまたはスライドベースのサンプルホルダ３２を含むことができる。例えば、一実施形態では、３次元サンプルチャンバが、ＵＶ溶融シリカスライドと、ウェルを含む標準的なポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、例えばＡＣＬＡＲ（登録商標）カバーとの間に形成される。サンプルホルダ３２は、ＵＶフィルタリングされた光がサンプル１２を照らすことができるように、ＵＶ放射に対して光学的に透明であることが好ましい。サンプルホルダ３２は、いくつかの実施形態では、サンプル３２をハウジングまたはエンクロージャ２０に出し入れすることができるトレイまたは支持体３４上に配置されるようにしてもよい。

【0016】

図３は、サンプルホルダ３２の一実施形態を示しており、このサンプルホルダは、サンプル１２を保持するためにその中に形成されたウェルまたはチャンバ３５を含む下部基板３３ａを有する。上部基板３３ｂは、下部基板３３ａの上に配置され、流体サンプル１２をウェルまたはチャンバ３５の内部に維持する。下部基板３３ａおよび上部基板３３ｂはともに、ＵＶ光に対して実質的に光学的に透明である。例えば、下部基板３３ａはＰＣＴＦＥから形成され、上部基板３３ｂはスライドガラスまたはカバースリップであってもよい。そして、サンプルホルダ３２は、携帯型ホログラフィック顕微鏡デバイス１０のハウジングまたはエンクロージャ２０内に、直接またはトレイまたは支持体３４を用いて挿入可能である。

【0017】

図１に示すように、イメージセンサ３６は、ハウジングまたはエンクロージャ２０の内部２２に配置され、サンプル１２を含むサンプルホルダ３２と光軸または光路３１において位置合わせされ、サンプルホルダが、イメージセンサ３６と１または複数の光源２４との間に介在している。イメージセンサ３６は、一実施形態では、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサ３６を含むことができる。イメージセンサ３６は、モノクロまたはカラーのイメージセンサ３６を含むことができる。イメージセンサ３６は、カラーイメージセンサ３６を含むことができるが、画像処理のためにピクセル値の１色（例えば、緑）のみが保持されている。サンプル１２を有するサンプルホルダ３２の位置は、イメージセンサ３６のアクティブ領域に隣接または近接して配置されている。典型的には、サンプル１２は、イメージセンサ３６のアクティブ領域から数十～数百ミクロン（例えば、２００～６００μｍ）離れた位置に配置されている。一方、１または複数の光源２４は、サンプルホルダ３２およびサンプル１２から遥かに離れた位置に配置されている。典型的には、１または複数の光源２４（および任意選択的な開口または穴２５）は、サンプルホルダ３２およびサンプル１２から数センチメートル離れた位置に配置されている。この構成では、イメージセンサ３６のアクティブ領域がイメージングＦＯＶとして完全に利用され（例えば、＞１０ｍｍ^２）、フィルタリングされたＵＶ光がサンプル１２を通って散乱され、イメージセンサ３６によりキャプチャされる背景光との干渉によってインラインホログラムが生成される。次いで、それらの生のホログラフィック画像４４がデジタル的に処理されて、サンプル１２内のオブジェクト（例えば、結晶１６、１８）から干渉パターンに符号化された振幅および／または位相情報が抽出される。

【0018】

さらに図１を参照すると、イメージセンサ３６が、プリント回路基板（ＰＣＢ）３８または他の基板上に配置されている。また、ＰＣＢ３８は、携帯型ホログラフィック顕微鏡１０の電子機器を動作させるために使用されるマイクロコントローラまたは１または複数のプロセッサ４０も保持することができる。これには、１または複数の光源２４およびイメージセンサ３６を動作させることが含まれる。マイクロコントローラまたは１または複数のプロセッサ４０は、イメージセンサ３６によって得られた生のホログラフィック画像４４を格納するためにも使用される。それらは、マイクロコントローラまたは１または複数のプロセッサ４０に関連付けられたメモリ（図示せず）に格納されるようにしてもよい。マイクロコントローラまたは１または複数のプロセッサ４０は、本明細書でより詳細に説明するように、生のホログラフィック画像４４の別のコンピューティングデバイス５０への転送を制御するためにも使用される。携帯型ホログラフィック顕微鏡１０との間で画像／データを転送するために、１または複数の通信ポート４２（例えば、ＬＡＮまたはＵＳＢポート）をＰＣＢ３８に設けることができる。代替的には、マイクロコントローラまたは１または複数のプロセッサ４０は、画像ファイル４４およびデータを別のコンピューティングデバイス５０にワイヤレスで転送することができるように、ワイヤレス機能（例えば、Ｗｉ－Ｆｉ、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈなど）を含むことができる。

【0019】

図１に示すように、別のコンピューティングデバイス５０は、パーソナルコンピュータ、ラップトップ、サーバ、仮想サーバ、またはスマートフォンなどの携帯型電子デバイスを含むことができる。コンピューティングデバイス５０は、１または複数のプロセッサ５６を含み、さらに、いくつかの実施形態では、１または複数の任意選択的なグラフィックス処理ユニット（ＧＰＵ）を含む。別のコンピューティングデバイス５０は、携帯型ホログラフィック顕微鏡１０と同じ場所に配置することができ、あるいは携帯型ホログラフィック顕微鏡１０から離れた場所に配置することができる（例えば、異なる地理的領域に配置されたサーバとすることができる）。コンピューティングデバイス５０は、１または複数の入力デバイス５２と、サンプル１６の逆伝播された振幅および／または位相画像６０を表示するためのディスプレイ５４（いくつかの実施形態では入力デバイス５２にある）とを有することができる。ディスプレイ５４は、別個のディスプレイであってもよいし、コンピューティングデバイス５０（例えば、スマートフォン、タブレットＰＣ、ｉＰａｄなどの画面）に組み込まれていてもよい。コンピューティングデバイス５０は、１または複数のプロセッサ５６と、１または複数のプロセッサ５６を用いて実行される画像処理ソフトウェア５８とを含む。一実施形態では、画像処理ソフトウェア５８は、１または複数の生のホログラフィック画像４４を入力として受け取り、ホログラフィック画像をサンプル１２内の平面（またはサンプル１２内のオブジェクト）に逆伝播して、振幅および／または位相画像６０を出力するように構成されている。逆伝播された振幅および／または位相画像６０は、その後、図１に示すようなディスプレイ５４に表示されるようにしてもよい。振幅および／または位相画像６０は、タンパク質ベースの結晶１６を暗く表示する一方で、非タンパク質結晶（例えば、塩の結晶）１８は暗くならない。

【0020】

画像処理ソフトウェア５８は、任意の数の言語またはプログラムで実装することができる。本明細書に記載の例では、ＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、ミシガン州、米国）を利用したが、他の言語やプログラムを利用することができることを理解されたい。例えば、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｃ＋＋などが挙げられる。一実施形態では、画像処理ソフトウェア５８が、サンプル１２の１または複数の振幅および／または位相画像６０において識別された結晶の測定されたコントラストに少なくとも部分的に基づいて、非タンパク質結晶からタンパク質結晶１６を自動的に識別するように構成されている。例えば、振幅および／または位相画像６０内の異なる結晶１６、１８は、画像処理ソフトウェア５８を用いてセグメント化され、その後、それぞれのコントラスト値（セグメント化された領域内またはその一部におけるコントラスト値）が測定され、閾値と比較されるものであってもよい。閾値は、システム２で分析されているタンパク質系結晶１６および非タンパク質系結晶１８を有する既知のサンプルに基づいて、経験的に設定することができる。振幅および／または位相画像６０内において、この閾値を超える平均ＵＶコントラスト値、中間ＵＶコントラスト値等を有するそれらの結晶は、タンパク質系結晶１６として識別することができ、一方、閾値を超えないものは、非タンパク質系結晶１８として識別することができる。

【0021】

図２は、一実施形態に係る、結晶１６、１８を含むサンプル１２をイメージングする方法を示している。操作１００では、結晶１６、１８を含むサンプル１２がサンプルホルダ３２内に装填される。サンプル１２は、生体液やその抽出物などの生体サンプルを含むことができる。また、サンプル１２は、例えば結晶学的合成や研究用途に用いられる、１または複数の緩衝液に含まれる。また、サンプル１２は、環境サンプルや、反応生成物またはプロセスのサンプルを含むことができる。サンプル１２は、典型的には、水性ベースの流体に含まれており、その中に結晶１６、１８を含む。このため、結晶１６、１８は、キャリア流体に含まれるものであってもよい。キャリア流体は、従来の緩衝液、水溶液、あるいは生物学的流体を含むことができる。サンプルホルダ３２は、携帯型ホログラフィック顕微鏡１０のハウジングまたはエンクロージャ２０内に挿入される。これは、サンプルホルダ３２をハウジングまたはエンクロージャ２０内に直接挿入することによって行われるものであってもよい。代替的には、サンプルホルダ３２を移動可能なトレイまたは支持体３４に装填し、その上にサンプルホルダ３２を置き、ハウジングまたはエンクロージャ２０内の光路に移動させるようにしてもよい。その後、操作１１０に見られるように、サンプル１２が、１または複数の光源２４からのＵＶ光で照射される。これは、フィルタリングされたＵＶ光であってもよいし、フィルタリングされていないＵＶ光であってもよい。次に、操作１２０において、イメージセンサ３６が、１または複数の生のホログラム画像４４を取得または獲得する。これらの画像４４は、携帯型ホログラフィック顕微鏡１０にローカルに一時的に保存された後に、別のコンピューティングデバイス５０に転送されるか、または別のコンピューティングデバイス５０に直ちに転送される。代替的には、別の実施形態では、画像４４が、可搬型ホログラフィック顕微鏡１０のマイクロコントローラまたは１または複数のプロセッサ４０を使用して逆伝播され、よって、１または複数の生のホログラム画像４４を別のコンピューティングデバイス５０に転送する必要がなくなる。

【0022】

コンピューティングデバイス５０では（またはマイクロコントローラまたは１または複数のプロセッサ４０を使用して）、１または複数の生のホログラム画像４４は、操作１３０に見られるように、デジタル逆伝播の対象となり、ここでは、画像処理ソフトウェア５８が１または複数の生のホログラム画像４４を１または複数の振幅および／または位相画像６０にデジタル的に逆伝播する。角度スペクトル法は、波動場の伝播をモデル化するための手法であり、複素波動場を無限の平面波の合計に拡張することを伴う。ホログラムは、先ず、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を用いて、空間周波数領域に変換される。次に、波長、伝播距離、媒質の屈折率の関数である位相因子を角度スペクトルに掛け合わせる。最後に、それを空間領域に逆フーリエ変換して、サンプル１２の逆伝播画像を得る。その後、図１の操作１４０に見られるように、オブジェクト平面（すなわち、サンプル１２内）における逆伝播された振幅および／または位相画像６０を表示および／または分析する。分析は、サンプル１２内のタンパク質結晶１６および／または非タンパク質結晶１８を自動的に識別することを含むことができる。また、分析は、サンプル１２内のタンパク質結晶１６（または非タンパク質結晶１８）の数または量をカウントまたは定量化することも含むことができる。代替的には、単一のＦＦＴを用いた逆伝播にフレネル伝播法を用いることもできるが、フレネル近似に基づいているため、解像度が制限される。例えば、Ｇｏｒｏｃｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｏｎ－Ｃｈｉｐ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ」，ＩＥＥＥ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．６，ｐｐ．２９－４６（２０１２）を参照されたい。この文献は引用により本明細書に援用されるものとする。

【0023】

別の実施形態では、電磁スペクトルの可視部分の光を放出する１または複数の追加の光源２４が、携帯型ホログラフィック顕微鏡１０に含まれるようにしてもよい。これらの１または複数の追加の光源２４は、任意選択的なバンドパスフィルタ３０の後に配置され、様々なチャネル（例えば、青色、赤色または緑色の光）からのサンプル１２に関する追加の情報を提供するために使用され、それは、コントラストの変化などを評価して、結晶評価のための別の次元を提供するために、ＵＶ画像６０とともに使用され得る。

【0024】

実験
テストされた携帯型ホログラフィック顕微鏡１０（図１、図４Ａ、図４Ｂ）は、汎用性の高いＲａｓｐｂｅｒｒｙ Ｐｉ ３ボード／マイクロコントローラ４０に基づいて構築されるとともに、容易に入手可能な８メガピクセルのＣＭＯＳカメラを有し、それらはすべて、３Ｄプリントされたカスタム設計のハウジングまたはエンクロージャ２０内に収容され、ハウジングまたはエンクロージャは、側波帯放射を遮断するためのバンドパスフィルタ３０とともに、２８０ｎｍのピーク波長で動作するＵＶ ＬＥＤ光源２４も保持している。なお、Ｒａｓｐｂｅｒｒｙ Ｐｉ ３は単なる一例であり、他のマイクロコントローラ／プロセッサ４０または制御回路を使用して、光源２４やイメージセンサ３６に電力を供給したり制御したりすることも可能である。Ｒａｓｐｂｅｒｒｙ Ｐｉ ３ボード／マイクロコントローラ４０を使用する特定の実施形態では、ＣＭＯＳカメラのキャップを外してレンズモジュールを取り外し、イメージングＦＯＶとして完全に利用されるイメージセンサ３６のアクティブ領域（＞１０ｍｍ^２、図６Ａ）に非常に近い位置（約３００～４００μｍ）にサンプルを配置する。フィルタリングされたＵＶ光は、サンプル１２を通って散乱し、イメージセンサ３６により捕捉される背景光との干渉によってインラインホログラムを生成する。これらのホログラフィック画像４４は、次に、サンプル１２内のターゲットオブジェクトから干渉パターンに符号化された振幅および／または位相情報を抽出するためにデジタル処理され、振幅および／または位相画像６０が生成される。

【0025】

携帯型ホログラフィック顕微鏡１０は、振幅再構成における強いＵＶ吸収の影響を検証するためにテストされ、タンパク質結晶をイメージングした（図５Ｂ）。サンプル１２は、ＵＶ溶融シリカガラススライドおよびＡＣＬＡＲ（登録商標）タンパク質結晶化カバー（タンパク質結晶学者によって使用される標準的なＵＶ透過性の材料）片を用いてイメージングチャンバ３２を構築することにより準備した。ホログラフィーのようなコヒーレントイメージングモダリティのための材料の透過性については、材料ボリュームの不規則性が強い背景歪みを引き起こす可能性があるため、さらに考慮する必要があることに注意することが重要である。タンパク質結晶学者により使用される標準的なＵＶ透過性のＡＣＬＡＲ（登録商標）は、ホログラフィックイメージングに適しており、イメージング品質に影響を与えない、背景にかすかな変調が生じるのみである（図５Ｂ）。

【0026】

イメージングプラットフォーム（図１、図４Ａ、図４Ｂ）は、先ず、２８０ｎｍの光で励起されると蛍光を発する芳香族アミノ酸を含む、結晶化に容易に利用可能なセリンプロテアーゼであるプロテイナーゼＫを有するサンプル、および２種類の塩結晶サンプル（塩化ナトリウムおよび硫酸アンモニウム）（図５Ａおよび図５Ｂ）を準備することによってテストされ、それぞれのＸ線回折データが図５Ｃに示されている。個々の結晶を、約１μＬの溶液とともに、（粘着性のある面を上に向けた）ＡＣＬＡＲ（登録商標）片上にピペットで移し、ＵＶ溶融シリカを用いて液滴をチャンバ３２内に封入した。ホログラム４４の振幅再構成６０は、塩結晶とは異なり、タンパク質結晶が背景に比べて遥かに濃く見えることを明確に示している（図５Ｂ）。図５Ｂに示す振幅再構成画像６０は、二重像アーチファクトを緩和するために追加の位相回復手法を用いてさらに改善することができるが、これは追加の計算および／またはホログラフィック測定を犠牲する可能性がある。本明細書で画像化された特定の結晶は、振幅再構成画像６０を使用したが、他の結晶サンプルは、位相再構成画像６０、または振幅再構成画像と位相再構成画像６０の両方の組合せを使用できることを理解されたい。

【0027】

携帯型ホログラフィックイメージングシステム２をさらに評価するために、同じＦＯＶ内でタンパク質（プロテイナーゼＫ）と塩（酢酸リチウムおよび硫酸リチウム）の結晶の両方を含む混合サンプルを画像化した（図６Ａ～図６Ｄ）。このサンプルは、結晶を含む約１μＬの緩衝液の液滴をＵＶ溶融シリカスライドとＡＣＬＡＲ（登録商標）シート片との間に挟むことによって用意した。結晶は、それぞれの緩衝液中で成長させた後、マイクロループで個別に採取し、液滴の中に沈めてから封入した。レンズベースの顕微鏡（図６Ｂ）で最初に画像化したサンプル１２は、タンパク質結晶の蛍光によってタンパク質結晶と塩結晶を区別することができ、タンパク質結晶が蛍光を発しているのに対し、塩結晶は暗いままであることが観察される。次に、このサンプルを携帯型ホログラフィック顕微鏡で画像化したところ（図６Ａ、図６Ｃ）、プロテイナーゼＫの結晶は、塩結晶に比べて非常に強いコントラスト（ｐ＜０．０２）を示した（図６Ｃ、図６Ｄ）。ＵＶホログラフィック振幅再構成におけるコントラスト（Ｃ）は、以下のように、平均バックグラウンド信号値（Ｓ_ｂ）からターゲット結晶の平均振幅信号（Ｓ_ｃ）を差し引き、この差を平均バックグラウンド信号値で割ることにより算出した。

【0028】

ここで、Ｓ_ｃは、ターゲット結晶の内側に収まる最大の矩形領域内で計算され、Ｓ_ｂは、オブジェクトを含まないＦＯＶの透明領域内で計算される。

【0029】

タンパク質結晶化のための携帯型ホログラフィック顕微鏡１０のイメージング機能をさらにテストするために、（１）核膜に関連し、ヒトのヒストンのユビキチン化に関与するＲＩＮＧ１Ｂ複合体と、（２）大腸菌のマルトデキストリンを分解し、ＵＶ活性結晶を形成するマルトース結合タンパク質とを用いて、追加の実験を行った（図７Ａおよび図７Ｂ）。テスト対象のサンプルはすべて、最初にレンズベースのＵＶ顕微鏡で画像化し（図７Ａの左２列）、次にＵＶベースの携帯型ホログラフィック顕微鏡１０で画像化した（図７Ａの右列および図７Ｂ）。タンパク質結晶と塩結晶を区別する携帯型ＵＶイメージングプラットフォームの機能は、それらの異なるタイプのタンパク質でさらに検証され、塩結晶（酢酸リチウム）と比較して、非常に高いコントラスト（ｐ＜０．００３）を示した（図７Ｂ）。

【0030】

本明細書に開示の携帯型ホログラフィック顕微鏡１０およびシステム２は、タンパク質結晶学者により使用される高価で嵩張るデュアルモードＵＶ顕微鏡の代替手段である。携帯型ホログラフィック顕微鏡システム２は、センサ統合時間の短縮を可能にする深紫外線ＬＥＤの電力出力効率を改善するとともに、シングルボードコンピュータの１または複数のプロセッサ５６としての組み込みグラフィックス処理ユニット（ＧＰＵ）の利用可能性を向上させることによって、ほぼリアルタイムのイメージング機能をさらに強化することができる。

【0031】

さらに、生のホログラフィック画像４４は、画像処理ソフトウェア５８による逆伝播のために別のコンピューティングデバイス５０にオフロードされたが、他の実施形態では、逆伝播が、携帯型ホログラフィック顕微鏡１０とともにローカルに存在するマイクロコントローラまたは１または複数のプロセッサ４０上で行われ得ることを理解されたい。例えば、逆伝播は、マイクロコントローラまたは１または複数のプロセッサ４０によってオンボードで実行されるＰｙｔｈｏｎで実装されるようにしてもよく、それにより、画像処理のために生のホログラフィック画像４４を別のコンピューティングデバイス５０にオフロードまたは転送する必要性を回避することができる。

【0032】

ＵＶオンチップイメージングプラットフォーム
携帯型ホログラフィック顕微鏡１０（図１、図４Ａ、図４Ｂ）は、Ｒａｓｐｂｅｒｒｙ Ｐｉ ３Ｂシングルボードコンピュータ（マイコン／プロセッサ４０）に接続された、キャップを外された８メガピクセル（水平３２８０×垂直２４６４、アクティブ領域が約１０．１４ｍｍ^２）のピクセルピッチ１．１２μｍのＣＭＯＳイメージセンサ（ＩＭＸ２１９、Ｓｏｎｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、東京都、日本）と、ピーク波長２８０ｎｍで動作する深紫外線ＬＥＤ光源２４（ＴＨ－ＵＶ２８０Ｊ９－Ｃ－Ｈ－Ｂ、Ｔｉａｎｈｕｉ Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ、中国）と、紫外線ＬＥＤ光源２４からの側波帯放射を遮断する、中心波長２８０ｎｍ、帯域幅１０ｎｍのＵＶバンドパスフィルタ（ＦＦ０１－２８０／１０－２５、Ｓｅｍｒｏｃｋ、ニューヨーク州、米国）とにより構成されている。これらコンポーネントはすべて、３Ｄプリントされたアクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）（Ｓｔｒａｔａｓｙｓ、Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ Ｅｌｉｔｅ）のカスタム設計のハウジングまたはエンクロージャ２０内に収められている。カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、イメージセンサ３６からＲａｓｐｂｅｒｒｙ Ｐｉ ３Ｂのオンボードストレージに生のフレーム／ホログラム４４を捕捉、抽出、保存した。

【0033】

データ処理
イメージセンサ３６の緑のピクセルがＵＶ照明に最も反応したため、生のホログラフィック画像フレーム４４の赤と青のピクセルの値は、それらの隣接する緑のピクセルの平均値で置き換えた。次に、ホログラフィック投影を含む画像フレーム４４を、角度スペクトルアプローチを使用してデジタル的に逆伝播し、ホログラムのフーリエ変換と波動伝播の伝達関数を乗算することによってレイリー・ゾンマーフェルト積分を数値的に解き、サンプル１２の振幅および／または位相画像６０を生成した。完全なデータ処理には、ＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、ミシガン州、米国）が動作する標準的なデスクトップコンピュータ５０（Ｄｅｌｌ Ｏｐｔｉｐｌｅｘ ９０１０、Ｉｎｔｅｌ ｉ７、３２ＧＢ ＲＡＭ）を使用して約１分かかる。塩結晶と比較したタンパク質結晶の振幅再構成におけるコントラストの増加の統計的有意性は、プロテイナーゼＫについての２つの別々の実験（図６Ｄ）、およびＲＩＮＧ１Ｂ複合体およびマルトース結合タンパク質を含む追加のタンパク質のセットについての３つの別々の実験（図７Ａ）によりｔ検定を用いて検証した。

【0034】

サンプルの準備
ＵＶ溶融シリカスライド（１０ｍｍ×１０ｍｍ、厚さ０．２ｍｍ、ＭＴＩ Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州、米国）およびポリクロロトリフルオロエチレン（Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ－Ｌａｂｓ ＰｒｏＣｒｙｓｔａｌ Ｃｏｖｅｒ ８７５２３８、オレゴン州、米国）からなるＡＣＬＡＲ（登録商標）から形成された標準的なタンパク質結晶化カバー片を含むＵＶ適合性材料を使用して、結晶サンプル１２を保持するサンプルチャンバ３２を構築した。結晶および対応する緩衝液を含む０．８～１μＬの液滴を、粘着性のある面を上に向けた１つのウェルを含むＡＣＬＡＲ（登録商標）片上に付着させた。その後、ＵＶ溶融シリカスライドを使って静かにウェルを覆い、液滴をサンプルホルダ３２に封じ込めた。注目すべきは、ＡＣＬＡＲ（登録商標）の標準的なタンパク質結晶化用カバー材がコヒーレントイメージングに適しており、画質には影響を与えないかすかな背景変調（図５Ｂ）が生じるのみであったことである。

【0035】

タンパク質および塩の結晶化
ＴＴＰ ＬａｂＴｅｃｈ Ｍｏｓｑｕｉｔｏ（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州、米国）を使用して、９６ウェルの吊り下げ式ドロップ結晶化セットアップを生成した。すべてのタンパク質結晶を、蒸気拡散を用いて数日間で成長させた。プロテイナーゼＫ（ＶＷＲカタログ番号９７０６２－２３８、ペンシルベニア州、米国）は、凍結乾燥した粉末を水に溶かして結晶化し、５０ｍｇ／ｍｌのストックを得た。このストック溶液を、１．５Ｍの硫酸アンモニウムおよび０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５と１：１で混合した。２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０および５０ｍＭのＮａＣｌ中のマルトース結合タンパク質８０ｍｇ／ｍｌを、０．２Ｍの塩化マグネシウム六水和物、０．１ＭのＭＥＳ ｐＨ６．０および２０％ｗ／ｖのＰＥＧ６０００と１：１で混合して結晶化させた。ＲＩＮＧ１Ｂ、ＰＣＧＦ４、ＣＢＸ８およびＰＨＣ１のオリゴマー化領域は、ＵＣＬＡのＣｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔから提供された。このサンプルを、０．７Ｍのギ酸ナトリウム ｐＨ７．０および２０％ｗ／ｖのＰＥＧ３３５０と１：１で混合した。３００ｎＬの液滴はすべて、１００μＬの対応する結晶化溶液で平衡化した。１．０Ｍの塩化ナトリウム、２．０Ｍの硫酸アンモニウム、１．０Ｍの酢酸リチウムおよび１．０の硫酸リチウムを、μＬマイクロリットルのアリコートで分注し、立体顕微鏡で観察しながら空気中で蒸発させた。水溶液中での脱水により形成された結晶は、５０ミクロンのマイクロループ（Ｍｉｔｅｇｅｎ Ｍ５－Ｌ１８ＳＰ－５０ＬＤ、ニューヨーク州、米国）を用いて手動で採取し、１μＬのストック塩溶液に入れた。結晶を含むそれらの溶液は、イメージングのためにピペットでＡＣＬＡＲ（登録商標）表面に移した。

【0036】

レンズベースのＵＶ顕微鏡
携帯型ホログラフィックイメージングシステム２との比較のために、デュアルモードＵＶ顕微鏡（Ｋｏｒｉｍａ ＰＲＳ－１０００、カリフォルニア州、米国）を使用した。サンプルは、最初にＵＶ顕微鏡で画像化し、その後、携帯型ホログラフィック顕微鏡１０でホログラフ的に画像化した。結晶を２８０ｎｍの光に５秒以内で露光し、撮影した画像を対応する再構成ホログラフィック画像と比較した（図７Ａ）。

【0037】

Ｘ線回折
タンパク質結晶と塩をさらに区別するために、回折画像を撮影した。ターゲットサンプルから個々の結晶を採取し、結晶水の形成を防ぐために３３％のグリコールを加えた母液に入れた。Ｘ線データの収集には、回転陽極発生器（Ｒｉｇａｋｕ ＦＲＥ＋、東京都、日本）およびイメージングプレート検出器（Ｒｉｇａｋｕ ＨＴＣ、東京都、日本）を使用した。高分子結晶は、結晶の対称要素間の間隔が大きくなることで発生する低解像度の反射によって、塩結晶と区別することができる（図５Ｃ）。

【0038】

タンパク質結晶の高コントラストイメージングのために、２８０ｎｍの深紫外線波長で動作する低コストで携帯型ホログラフィック顕微鏡１０を設計および構築した。本システム２は、高感度で嵩張る高価なコンポーネントを必要とせずに、タンパク質結晶をイメージングして塩結晶と区別するために、タンパク質結晶学者が日常的に使用している明視野モードと紫外線（ＵＶ）誘導蛍光モードからなるデュアルモード光学顕微鏡に代わる、低コスト、高スループットかつ堅牢な代替手段を提供するものである。携帯型ホログラフィック顕微鏡１０は、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、酢酸リチウムおよび硫酸リチウムを含む複数の異なる塩結晶と比較して、プロテイナーゼＫ、マルトース結合タンパク質、ＲＩＮＧ１Ｂ複合体などの様々なタンパク質結晶をイメージングすることによりテストした。タンパク質結晶の振幅再構成画像６０は、背景に比べて遥かに暗く見えるが、塩結晶はコントラストを示すことなく、２種類の結晶を明確に区別している。携帯型ホログラフィック顕微鏡１０は、タンパク質結晶をイメージングして塩結晶と区別するための低コストで堅牢な代替的なプラットフォームとして、タンパク質結晶学者などを支援することができる。

【0039】

本発明の実施形態を開示および説明してきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えることが可能である。よって、本発明は、以下の特許請求の範囲およびその均等物を除いて、限定されるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【国際調査報告】