▶ コンステレーション・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-26
(54)【発明の名称】ＴＲＥＸ１のモジュレータ
(51)【国際特許分類】
C07D 413/12 20060101AFI20220119BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220119BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220119BHJP
A61K 31/506 20060101ALI20220119BHJP
C07D 413/14 20060101ALI20220119BHJP
A61K 31/5377 20060101ALI20220119BHJP
A61K 31/551 20060101ALI20220119BHJP
【ＦＩ】
C07D413/12 CSP
A61P43/00 111
A61P35/00
A61K31/506
C07D413/14
A61K31/5377
A61K31/551
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021531909
(86)(22)【出願日】2019-12-06
(85)【翻訳文提出日】2021-07-05
(86)【国際出願番号】 US2019064825
(87)【国際公開番号】W WO2020118133
(87)【国際公開日】2020-06-11
(31)【優先権主張番号】62/776,031
(32)【優先日】2018-12-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】513137422
【氏名又は名称】コンステレーション・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＮＳＴＥＬＬＡＴＩＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100157923
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴喰 寿孝
(72)【発明者】
【氏名】ガードバーグ，アンナ
(72)【発明者】
【氏名】ゲーリング，ビクター・エス
(72)【発明者】
【氏名】カンナ，アビナッシュ
(72)【発明者】
【氏名】レベル，ジュリアン・アール
(72)【発明者】
【氏名】ウィルソン，ジョナサン・イー
(72)【発明者】
【氏名】タベラス，ケネディ
【テーマコード（参考）】
4C063
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C063AA01
4C063AA03
4C063AA05
4C063BB09
4C063CC51
4C063CC78
4C063DD29
4C063EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086BC67
4C086BC73
4C086GA07
4C086GA08
4C086GA09
4C086GA12
4C086GA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZC41
(57)【要約】
式（Ｉ）：
の化合物ならびにその薬剤的に許容される塩及び組成物が提供され、これらは、ＴＲＥＸ１に関連する様々な状態を治療するために有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉ：【化1】
（式中：
Ｒ１は、水素、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、３～４員シクロアルキル、－ＯＲｆ、－ＳＲｆ、又は－ＮＲｅＲｆである；
Ｒ２は、水素、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、又は３～４員シクロアルキルである；
Ｘは、結合、ＮＲ３、Ｏ、Ｓ、又は（Ｃ１－Ｃ４）アルキレンであり、前記（Ｃ１－Ｃ４）アルキレンは、任意選択的に、Ｒ４から選択される１又は２個の基で置換されていてもよい；
Ｒ３は、水素、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、又は－Ｃ（Ｓ）Ｒｄである；
Ｒ４は、ハロ、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、フェニル、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、－ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲａ、－Ｃ（Ｏ）Ｒｂ，－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲｇ、－ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨＲｇ、－ＮＨＳ（Ｏ）２ＮＨＲｇ、－Ｃ（Ｓ）Ｒｂ、Ｓ（Ｏ）２Ｒｃ、Ｓ（Ｏ）Ｒｃ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｓ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｅ、－Ｃ（Ｓ）ＮＨＲｅ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｒｄ、－ＯＲｅ、－ＳＲｅ、－Ｏ（Ｃ１－Ｃ４）アルキルＯＲｅ、又は－ＮＲｅＲｆであり、Ｒ４の前記フェニルは、任意選択的に、ハロ、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、及びハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシから選択される１又は２個の基で置換されていてもよい；
環Ａは、フェニル、５～６員ヘテロアリール、４～７員ヘテロシクリル、又は３～７員シクロアルキルであり、その各々は任意選択的かつ独立して、Ｒ５から選択される１又は２個の基で置換されていてもよい；
Ｒ５は、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、ハロ、フェニル、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、－ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲａ、－Ｃ（Ｏ）Ｒｂ，－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲｇ、－ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨＲｇ、－ＮＨＳ（Ｏ）２ＮＨＲｇ、－Ｃ（Ｓ）Ｒｂ、Ｓ（Ｏ）２Ｒｃ、Ｓ（Ｏ）Ｒｃ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｓ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－Ｃ（Ｓ）ＮＨＲｅ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｒｄ、－ＯＲｅ、－ＳＲｅ、－Ｏ（Ｃ１－Ｃ４）アルキルＯＲｅ、－ＮＲｅＲｆ、４～６員ヘテロアリール、又は４～７員ヘテロシクリルであり、Ｒ５の前記フェニルは、任意選択的に、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、Ｒ５の前記（Ｃ１－Ｃ４）アルキルは、任意選択的に、ＯＲｈ、－ＮＲｊＲｋ、フェニル、及び５～６員ヘテロアリールから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、前記４～７員ヘテロシクリル及び４～６員ヘテロアリールは、各々任意選択的かつ独立して、Ｒｍから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、そしてＲ５中の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルについて列挙した任意の置換基の前記フェニル及び５～６員ヘテロアリールは、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよい；
Ｒｇ、Ｒｈ、Ｒｊ、Ｒｋ、及びＲｍは、各々独立して、水素、ハロ、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、フェニル、－（Ｃ１－Ｃ４）アルキルフェニル、３～４員シクロアルキル、４～６員ヘテロアリール、又は４～７員ヘテロシクリルであり、そしてＲｇ、Ｒｈ、Ｒｊ及びＲｋの前記４～７員ヘテロシクリルは、さらに任意選択的に、＝Ｏで置換されていてもよい。
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ及びＲｆは、各々独立して、水素、ハロ、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、フェニル、３～４員シクロアルキル、４～６員ヘテロアリール、又は４～７員ヘテロシクリルであり、ｉ）Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ及びＲｆの前記（Ｃ１－Ｃ４）アルキルは、任意選択的に、フェニル、－ＯＲｈ、－ＮＲｊＲｋから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、ｉｉ）Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、及びＲｆの前記フェニル、４～６員ヘテロアリール、及び４～７員ヘテロシクリルは、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、そしてｉｉｉ）Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、及びＲｆの前記４～７員ヘテロシクリルは、さらに任意選択的に、＝Ｏで置換されていてもよい）。
【請求項2】
前記化合物が、式ＩＩ：【化2】
【請求項3】
Ｒ２が（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項4】
前記化合物が、式ＩＩＩ：【化3】
【請求項5】
環Ａがフェニル、ピリジル、ピラゾリル、シクロプロピル、シクロブチル、アゼチジニル、又はピペリジニルであり、その各々は、任意選択的かつ独立して、１又は２個のＲ５で置換されていてもよい、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項6】
環Ａがトリアゾリル、ピロリジニル、ジアゼパニル、又はピペラジニルであり、その各々は、任意選択的かつ独立して、１又は２個のＲ５で置換されていてもよい、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項7】
Ｒ５が、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、ハロ、フェニル、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、－Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、Ｓ（Ｏ）２Ｒｃ、Ｓ（Ｏ）Ｒｃ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄ、－ＯＲｅ、－Ｏ（Ｃ１－Ｃ４）アルキルＯＲｅ、－ＮＲｅＲｆ、４～６員ヘテロアリール、又は４～７員ヘテロシクリルであり、Ｒ５の前記フェニルが、任意選択的に、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、Ｒ５の前記（Ｃ１－Ｃ４）アルキルが、任意選択的に、－ＯＲｈ、－ＮＲｊＲｋ、フェニル、及び５～６員ヘテロアリールから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、前記４～６員ヘテロアリール及び４～７員ヘテロシクリルが、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｍから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、そしてＲ５中の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルについて列挙した任意の置換基の前記フェニル及び５～６員ヘテロアリールが、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよい；Ｒａが、任意選択的にフェニルで置換されていてもよい（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである；
Ｒｂが、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、フェニル、５～６員ヘテロアリール又は４～７員ヘテロシクリルであり、前記（Ｃ１－Ｃ４）アルキルが、任意選択的に、フェニル、－ＯＲｈ、及び－ＮＲｊＲｋから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、前記フェニル、５～６員ヘテロアリール、及び４～７員ヘテロシクリルが、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、前記４～７員ヘテロシクリルがさらに、任意選択的に＝Ｏで置換されていてもよい；
各Ｒｃが、独立して、フェニル又は（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである；
各Ｒｄが、水素又は（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである；
各Ｒｅが、独立して、水素、又は任意選択的にＯＲｈで置換されていてもよい（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである；
各Ｒｆが、独立して、水素、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、フェニル３～４員シクロアルキル、４～６員ヘテロアリール、又は５～６員ヘテロシクリルであり、前記フェニル、３～４員シクロアルキル、４～６員ヘテロアリール、及び５～６員ヘテロシクリルは、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｇで置換されていてもよい；
各Ｒｇは、独立して、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、又はハロである；
各Ｒｈは、水素、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、又は－（Ｃ１－Ｃ４）アルキルフェニルである；
各Ｒｊが、独立して、水素又は（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである；
各Ｒｋは、独立して、水素、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、又は３～４員シクロアルキルである；そして
各Ｒｍが、（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである、
請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項8】
Ｒ５が、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ、フェニル、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、－Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、Ｓ（Ｏ）２Ｒｃ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄ、－Ｏ（Ｃ１－Ｃ４）アルキルＯＲｅ、－ＮＲｅＲｆ、４～６員ヘテロアリール、又は５～６員ヘテロシクリルであり、Ｒ５の前記（Ｃ１－Ｃ４）アルキルが、任意選択的に、－ＯＲｈ、フェニル、又は５～６員ヘテロアリールで置換されていてもよく、前記４～６員ヘテロアリール及び５～６員ヘテロシクリルが、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｍから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、Ｒ５中の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルについて列挙した任意の置換基の前記フェニル及び５～６員ヘテロアリールが、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよい、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項9】
Ｒ５が、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ、フェニル、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、－Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、Ｓ（Ｏ）２Ｒｃ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄ、又は－Ｏ（Ｃ１－Ｃ４）アルキルＯＲｅ、－ＮＲｅＲｆ、モルホリニル、ピペラジニル、又はピラゾリルであり、前記モルホリニル、ピペラジニル、及びピラゾリルは、各々任意選択的に、Ｒｍから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、Ｒ５の前記（Ｃ１－Ｃ４）アルキルが、任意選択的に、－ＯＲｈ、フェニル、ピラゾリル、ピリミジニル、又はピリジニルで置換されていてもよく、Ｒ５中の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルについて列挙した任意の置換基の前記フェニル、ピラゾリル、ピリミジニル、及びピリジニルが、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよい、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項10】
各Ｒｆが、独立して、水素、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、フェニルピラゾリル、ピリジニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニルであり、前記フェニルピラゾリル、ピリジニル、テトラヒドロピラニル、及びピペリジニルが、各々、任意選択的かつ独立して、（Ｃ１－Ｃ４）アルキルで置換されていてもよい、請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項11】
各Ｒｇが、独立して、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、又はハロである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項12】
Ｒｂが、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、フェニル、５～６員ヘテロアリール又は４～７員ヘテロシクリルであり、Ｒｂの前記フェニル及び５～６員ヘテロアリールが、各々、任意選択的かつ独立して、ハロ及び（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、Ｒｂの前記４～７員ヘテロシクリルが、任意選択的に、＝Ｏで置換されていてもよく、Ｒｂの前記（Ｃ１－Ｃ４）アルキルが、任意選択的に、フェニル、－ＯＲｈ、及び－ＮＲｊＲｋから選択される１又は２個の基で置換されていてもよい、請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項13】
各Ｒｋが、独立して、水素又は（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項14】
Ｒｂが（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、フェニル、ピリジニル、ピラゾリル、ピリミジニル、又はピペリジニルであり、Ｒｂの前記フェニル、ピリジニル、ピラゾリル、及びピリミジニルが、各々、任意選択的かつ独立して、ハロ及び（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、Ｒｂの前記（Ｃ１－Ｃ４）アルキルが、任意選択的に、フェニル、ＯＨ、及びＮＭｅ２から選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、Ｒｂの前記ピペリジニルが、任意選択的に、＝Ｏで置換されていてもよい、請求項１～１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項15】
Ｒ３が水素である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項16】
Ｘが非置換（Ｃ１－Ｃ４）アルキレンである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項17】
Ｒ４が、フェニル又は－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項18】
Ｘが結合又はＣＨ２である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項19】
請求項１～１８のいずれか一項に記載の化合物、又はその薬剤的に許容される塩と、薬剤的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項20】
対象におけるＴＲＥＸ１の阻害に応答する疾患を治療する方法であって、前記対象に対して、請求項１～１８のいずれか一項に記載の化合物、若しくはその薬剤的に許容される塩、又は請求項１７に記載の組成物の治療上有効な量を投与することを含む、方法。
【請求項21】
前記疾患ががんである、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本願は、２０１８年１２月６日に出願された米国特許仮出願第６２／７７６，３０１号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書中に組み込まれる。
本願は、２０１８年１２月６日に出願された米国特許仮出願第６２／７７６，３０１号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
非自己の自然免疫系認識に関連するがんにとって、そして潜在的な危険性を検出し、それから保護するために、潜在的な免疫療法が必要である。がん細胞は、それらの正常なカウンターパートとは抗原的に異なり、ウイルス感染と同様に、危険シグナルを発出して免疫系に警告する。損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）及び病原体傷関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を含むこれらのシグナルは、自然免疫系をさらに活性化し、結果として、様々な脅威から宿主を保護する（Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２，２，１６８）。
【0003】
異所的に発現した一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）及び二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は公知ＰＡＭＰ及び／又はＤＡＭＰであり、これらは核酸センサーであるサイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）によって認識される（Ｎａｔｕｒｅ ２０１１，４７８，５１５－５１８）。サイトゾルＤＮＡを感知すると、ｃＧＡＳは、インターフェロン遺伝子のＥＲ膜貫通アダプタータンパク質刺激因子（ＳＴＩＮＧ）の強力な第二のメッセンジャー及びアクチベータである環状ジヌクレオチド２’，３’－ｃＧＡＭＰの生成を触媒する（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１３，３，１３５５－１３６１）。ＳＴＩＮＧ活性化は、ＴＢＫ１によりＩＲＦ３のリン酸化を引き起こし、これは次にＩ型インターフェロンの産生及びインターフェロン刺激因子（ＩＳＧ）の活性化；自然免疫の活性化及び適応免疫の開始の前提条件をもたらす。したがって、Ｉ型インターフェロンの産生は、自然免疫と適応免疫との間の重要な架け橋となる（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３，３４１，９０３－９０６）。
【0004】
過剰なＩ型ＩＦＮは宿主にとって有害であり得、また自己免疫を誘発し得るので、Ｉ型ＩＦＮを介した免疫活性化を抑制する負のフィードバックメカニズムが存在する。３プライム修復エキソヌクレアーゼＩ（ＴＲＥＸ１）は、異所的に発現したｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡの除去に関与する３’－５’ＤＮＡエキソヌクレアーゼであり、したがって、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路の重要なリプレッサである（ＰＮＡＳ ２０１５，１１２，５１１７－５１２２）。
【0005】
Ｉ型インターフェロン及び下流の炎症誘発性サイトカイン応答は、免疫応答の発生及びそれらの有効性にとって重要である。Ｉ型インターフェロンは、樹状細胞及びマクロファージが、抗原を取り込み、処理し、Ｔ細胞に対して提示し、交差提示する能力と、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６などの共刺激分子の上方調節を誘発することによってＴ細胞を刺激する能力との両方を増強する（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１１，２０８，２００５－２０１６）。Ｉ型インターフェロンはまた、それら自身の受容体に結合し、適応免疫に関与する細胞の活性化に寄与するインターフェロン応答性遺伝子を活性化する（ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．２０１５，１６，２０２－２１２）。
【0006】
治療の観点から、Ｉ型インターフェロン及びＩ型インターフェロン産生を誘導することができる化合物は、ヒトがんの治療で使用することができる（Ｎａｔ．Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５，１５，４０５－４１４）。インターフェロンはヒト腫瘍細胞増殖を直接阻害することができる。さらに、Ｉ型インターフェロンは、自然免疫系及び適応免疫系の両方からの細胞の活性化を引き起こすことによって抗腫瘍免疫を増強することができる。重要なことに、ＰＤ－１遮断の抗腫瘍活性は、既存の腫瘍内Ｔ細胞を必要とする。冷たい腫瘍を熱い腫瘍に変え、それによって自発的な抗腫瘍免疫を誘発することにより、Ｉ型ＩＦＮ誘導療法は、抗ＰＤ－１療法に反応する患者のプールを拡大することができ、また抗ＰＤ１療法の有効性を増強することができる。
【0007】
強力なＩ型インターフェロン応答を誘導する現在開発中の療法は、許容可能な治療指数を達成するための局所的又は腫瘍内投与を必要とする。したがって、周辺に治療にアクセス可能な病変のない患者にＩ型ＩＦＮ誘導療法の利益を拡大するために、全身送達で毒性の低い新規薬剤が依然として必要とされている。ヒトおよびマウスの遺伝学的研究により、ＴＲＥＸ１阻害が全身送達経路に適する可能性があり、したがってＴＲＥＸ１阻害化合物が抗腫瘍療法の展望において重要な役割を果たす可能性があることが示唆される。ＴＲＥＸ１は、放射線治療に反応するがん細胞の限定された免疫原性の重要な決定因子である［Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２０１７，２７（８），５４３－４；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１７，８，１５６１８］。ＴＲＥＸ１は遺伝子毒性ストレスによって誘発され、神経膠腫および黒色腫細胞の抗がん剤に対する保護に関与する［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２０１３，１８３３，１８３２－４３］。ＳＴＡＣＴ－ＴＲＥＸ１療法は、複数のマウスがんモデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示す［Ｇｌｉｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｏｓｔｅｒ Ｐ２３５，３３ｒｄ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，Ｎｏｖ．７－１１，２０１８］。
【発明の概要】
【0008】
本明細書に記載の実施形態は、概して、ＴＲＥＸ１阻害剤に応答する疾患を治療するための薬剤、化合物、組成物、および方法に関する。本発明では、ＴＲＥＸ２阻害剤よりも選択的なＴＲＥＸ１阻害剤の合成に成功した。
【0009】
本明細書中で提供するのは、式Ｉ：
を有する化合物並びにそれらの薬剤的に許容される塩及び組成物であり、式中、Ａ、Ｒ１、Ｒ２及びｎは本明細書中で記載する通りである。開示する化合物及び組成物はＴＲＥＸ１を調節し、例えば、がんの治療においてなど、様々な治療用途で有用である。
【化1】
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】図１Ａは、ＣＲＩＳＰＲを使用したＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞におけるＴＲＥＸ１のノックダウン実験の結果を示す。図１Ｂは、ＴＲＥＸ１が、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞におけるｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路の活性化を減弱することを示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
１．化合物の概要
第一の実施形態において、式Ｉ：
の化合物又はその薬剤的に許容される塩が提供され、式中：
Ｒ１は、水素、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、３～４員シクロアルキル、－ＯＲｆ、－ＳＲｆ、又は－ＮＲｅＲｆである；
Ｒ２は、水素、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、又は３～４員シクロアルキルである；
Ｘは、結合、ＮＲ３、Ｏ、Ｓ、又は（Ｃ１－Ｃ４）アルキレンであり、前述の（Ｃ１－Ｃ４）アルキレンは、任意選択的に、Ｒ４から選択される１又は２個の基で置換されていてもよい；
Ｒ３は、水素、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、又は－Ｃ（Ｓ）Ｒｄである；
Ｒ４は、ハロ、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、フェニル、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、－ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲａ、－Ｃ（Ｏ）Ｒｂ，－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲｇ、－ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨＲｇ、－ＮＨＳ（Ｏ）２ＮＨＲｇ、－Ｃ（Ｓ）Ｒｂ、Ｓ（Ｏ）２Ｒｃ、Ｓ（Ｏ）Ｒｃ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｓ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｅ、－Ｃ（Ｓ）ＮＨＲｅ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｒｄ、－ＯＲｅ、－ＳＲｅ、－Ｏ（Ｃ１－Ｃ４）アルキルＯＲｅ、又は－ＮＲｅＲｆであり、Ｒ４の前述のフェニルは、任意選択的に、ハロ、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、及びハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシから選択される１又は２個の基で置換されていてもよい；
環Ａは、フェニル、５～６員ヘテロアリール、４～７員ヘテロシクリル、又は３～７員シクロアルキルであり、その各々は任意選択的かつ独立して、Ｒ５から選択される１又は２個の基で置換されていてもよい；
Ｒ５は、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、ハロ、フェニル、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、－ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲａ、－Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲｇ、－ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨＲｇ、－ＮＨＳ（Ｏ）２ＮＨＲｇ、－Ｃ（Ｓ）Ｒｂ、Ｓ（Ｏ）２Ｒｃ、Ｓ（Ｏ）Ｒｃ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｓ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－Ｃ（Ｓ）ＮＨＲｅ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｒｄ、－ＯＲｅ、－ＳＲｅ、－Ｏ（Ｃ１－Ｃ４）アルキルＯＲｅ、－ＮＲｅＲｆ、４～６員ヘテロアリール、又は４～７員ヘテロシクリルであり、Ｒ５の前述のフェニルは、任意選択的に、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、Ｒ５の前述の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルは、任意選択的に、ＯＲｈ、－ＮＲｊＲｋ、フェニル、及び５～６員ヘテロアリールから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、前述の４～７員ヘテロシクリル及び４～６員ヘテロアリールは、各々任意選択的かつ独立して、Ｒｍから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、そしてＲ５中の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルについて列挙した任意の置換基の前述のフェニル及び５～６員ヘテロアリールは、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよい；
Ｒｇ、Ｒｈ、Ｒｊ、Ｒｋ、及びＲｍは、各々独立して、水素、ハロ、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、フェニル、－（Ｃ１－Ｃ４）アルキルフェニル、３～４員シクロアルキル、４～６員ヘテロアリール、又は４～７員ヘテロシクリルであり、そしてＲｇ、Ｒｈ、Ｒｊ及びＲｋの前述の４～７員ヘテロシクリルは、さらに任意選択的に、＝Ｏで置換されていてもよい。
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ及びＲｆは、各々独立して、水素、ハロ、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、フェニル、３～４員シクロアルキル、４～６員ヘテロアリール、又は４～７員ヘテロシクリルであり、ｉ）Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ及びＲｆの前述の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルは、任意選択的に、フェニル、－ＯＲｈ、－ＮＲｊＲｋから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく；ｉｉ）Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、及びＲｆの前述のフェニル、４～６員ヘテロアリール、及び４～７員ヘテロシクリルは、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、そしてｉｉｉ）Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、及びＲｆの前述の４～７員ヘテロシクリルは、さらに任意選択的に、＝Ｏで置換されていてもよい。
第一の実施形態において、式Ｉ：
【化2】
Ｒ１は、水素、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、３～４員シクロアルキル、－ＯＲｆ、－ＳＲｆ、又は－ＮＲｅＲｆである；
Ｒ２は、水素、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、又は３～４員シクロアルキルである；
Ｘは、結合、ＮＲ３、Ｏ、Ｓ、又は（Ｃ１－Ｃ４）アルキレンであり、前述の（Ｃ１－Ｃ４）アルキレンは、任意選択的に、Ｒ４から選択される１又は２個の基で置換されていてもよい；
Ｒ３は、水素、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、又は－Ｃ（Ｓ）Ｒｄである；
Ｒ４は、ハロ、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、フェニル、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、－ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲａ、－Ｃ（Ｏ）Ｒｂ，－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲｇ、－ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨＲｇ、－ＮＨＳ（Ｏ）２ＮＨＲｇ、－Ｃ（Ｓ）Ｒｂ、Ｓ（Ｏ）２Ｒｃ、Ｓ（Ｏ）Ｒｃ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｓ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｅ、－Ｃ（Ｓ）ＮＨＲｅ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｒｄ、－ＯＲｅ、－ＳＲｅ、－Ｏ（Ｃ１－Ｃ４）アルキルＯＲｅ、又は－ＮＲｅＲｆであり、Ｒ４の前述のフェニルは、任意選択的に、ハロ、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、及びハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシから選択される１又は２個の基で置換されていてもよい；
環Ａは、フェニル、５～６員ヘテロアリール、４～７員ヘテロシクリル、又は３～７員シクロアルキルであり、その各々は任意選択的かつ独立して、Ｒ５から選択される１又は２個の基で置換されていてもよい；
Ｒ５は、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、ハロ、フェニル、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、－ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲａ、－Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲｇ、－ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨＲｇ、－ＮＨＳ（Ｏ）２ＮＨＲｇ、－Ｃ（Ｓ）Ｒｂ、Ｓ（Ｏ）２Ｒｃ、Ｓ（Ｏ）Ｒｃ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｓ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－Ｃ（Ｓ）ＮＨＲｅ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｒｄ、－ＯＲｅ、－ＳＲｅ、－Ｏ（Ｃ１－Ｃ４）アルキルＯＲｅ、－ＮＲｅＲｆ、４～６員ヘテロアリール、又は４～７員ヘテロシクリルであり、Ｒ５の前述のフェニルは、任意選択的に、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、Ｒ５の前述の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルは、任意選択的に、ＯＲｈ、－ＮＲｊＲｋ、フェニル、及び５～６員ヘテロアリールから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、前述の４～７員ヘテロシクリル及び４～６員ヘテロアリールは、各々任意選択的かつ独立して、Ｒｍから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、そしてＲ５中の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルについて列挙した任意の置換基の前述のフェニル及び５～６員ヘテロアリールは、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよい；
Ｒｇ、Ｒｈ、Ｒｊ、Ｒｋ、及びＲｍは、各々独立して、水素、ハロ、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、フェニル、－（Ｃ１－Ｃ４）アルキルフェニル、３～４員シクロアルキル、４～６員ヘテロアリール、又は４～７員ヘテロシクリルであり、そしてＲｇ、Ｒｈ、Ｒｊ及びＲｋの前述の４～７員ヘテロシクリルは、さらに任意選択的に、＝Ｏで置換されていてもよい。
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ及びＲｆは、各々独立して、水素、ハロ、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、フェニル、３～４員シクロアルキル、４～６員ヘテロアリール、又は４～７員ヘテロシクリルであり、ｉ）Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ及びＲｆの前述の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルは、任意選択的に、フェニル、－ＯＲｈ、－ＮＲｊＲｋから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく；ｉｉ）Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、及びＲｆの前述のフェニル、４～６員ヘテロアリール、及び４～７員ヘテロシクリルは、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、そしてｉｉｉ）Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、及びＲｆの前述の４～７員ヘテロシクリルは、さらに任意選択的に、＝Ｏで置換されていてもよい。
【0012】
２．定義
複数の結合点を有し得る化学基を記載するために組み合わせて使用する場合、ハイフン（－）は、それが規定される変数の基の結合点を示す。例えば、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ及び－ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲａは、この基の結合点が窒素原子上に存在することを意味する。
複数の結合点を有し得る化学基を記載するために組み合わせて使用する場合、ハイフン（－）は、それが規定される変数の基の結合点を示す。例えば、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ及び－ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲａは、この基の結合点が窒素原子上に存在することを意味する。
【0013】
「ハロ」及び「ハロゲン」という語は、フッ素（フルオロ、－Ｆ）、塩素（クロロ、－Ｃｌ）、臭素（ブロモ、－Ｂｒ）、及びヨウ素（ヨード、－Ｉ）から選択される原子を指す。
【0014】
「アルキル」という語は、単独又は「ハロアルキル」などのより大きな部分の一部として使用される場合、飽和直鎖又は分岐一価炭化水素ラジカルを意味する。特に指定のない限り、アルキル基は、典型的には、１～４個の炭素原子を有し、すなわち（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである。
【0015】
「アルキレン」という語は、二価飽和炭化水素を指す。
【0016】
「アルコキシ」は、－Ｏ－アルキルで表される、酸素連結原子を介して結合したアルキルラジカルを意味する。例えば、「（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ」には、メトキシ、エトキシ、プロプロキシ（ｐｒｏｐｒｏｘｙ）、及びブトキシが含まれる。
【0017】
「ハロアルキル」という語には、モノ、ポリ、及びパーハロアルキル基が含まれ、ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から独立して選択される。
【0018】
「ハロアルコキシ」は、例えば、限定されるものではないが、－ＯＣＨＣＦ２又は－ＯＣＦ３などの、酸素原子を介して別の部分に結合したハロアルキル基である。
【0019】
単独又はより大きな部分の一部として用いられる「ヘテロアリール」という語は、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１～４個のヘテロ原子を含む５～６員芳香族ラジカルを指す。ヘテロアリールとしては、例えば、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニルなどが挙げられる。指定されている場合、ヘテロアリール基上の任意の置換基は、任意の置換可能な位置上に存在し得ることが理解されるであろう。
【0020】
「ヘテロシクリル」という語は、Ｎ、Ｏ、及びＳから独立して選択される１～４個のヘテロ原子を含む４～７員飽和又は部分不飽和複素環を意味する。ヘテロシクリル環は、安定な構造をもたらす任意のヘテロ原子又は炭素原子でそのペンダント基に結合できる。そのような飽和又は部分不飽和複素環式ラジカルの例としては、限定されることなく、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テラヒドロピラニル（ｔｅｒａｈｙｄｒｏｐｙｒａｎｙｌ）、ピロリジニル、ピリジノニル、ピロリドニル、ピペリジニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、モルホリニル、ジヒドロフラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロピリジニル、テトラヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、オキセタニル、アゼチジニル及びテトラヒドロピリミジニルが挙げられる。指定されている場合、ヘテロシクリル基上の任意の置換基が任意の置換可能な位置上に存在してもよく、例えば、ヘテロシクリルが結合する位置（例えば、任意選択的に置換されていてもよいヘテロシクリル又は任意選択的に置換されていてもよいヘテロシクリルの場合）が含まれることも理解されるであろう。
【0021】
「シクロアルキル」という語は、特に指定のない限り、３～１０個の炭素環原子を有する環状炭化水素を指す。単環式シクロアルキル基としては、限定されることなく、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロへキセニル、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、及びシクロオクチルが挙げられる。指定されている場合、シクロアルキル又は脂環式基上の任意の置換基は、任意の置換可能な位置に存在していてもよく、例えば、シクロアルキル又は脂環式基が結合する位置が含まれると理解されるであろう。
【0022】
「ＴＲＥＸ１」という語は、３プライム修復エキソヌクレアーゼ１又はＤＮＡ修復エキソヌクレアーゼ１を指し、これは、ヒトにおいては、ＴＲＥＸ１遺伝子によってコード化される酵素である。Ｍａｚｕｒ ＤＪ，Ｐｅｒｒｉｎｏ ＦＷ（Ａｕｇ １９９９）．“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＴＲＥＸ１ ａｎｄ ＴＲＥＸ２ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ３’－－＞５’ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ”．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７４（２８）：１９６５５－６０．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．２７４．２８．１９６５５．ＰＭＩＤ １０３９１９０４；Ｈｏｓｓ Ｍ，Ｒｏｂｉｎｓ Ｐ，Ｎａｖｅｎ ＴＪ，Ｐａｐｐｉｎ ＤＪ，Ｓｇｏｕｒｏｓ Ｊ，Ｌｉｎｄａｈｌ Ｔ（Ａｕｇ １９９９）．“Ａ ｈｕｍａｎ ＤＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤｎａＱ／ＭｕｔＤ ｐｒｏｔｅｉｎ”．ＥＭＢＯ Ｊ．１８（１３）：３８６８－７５．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｅｍｂｏｊ／１８．１３．３８６８．ＰＭＣ １１７１４６３．ＰＭＩＤ１０３９３２０１。この遺伝子は、ヒト細胞における主要な３’－＞５’ＤＮＡエキソヌクレアーゼをコード化する。このタンパク質は、ヒトＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディング機能を果たし得る非プロセッシブエキソヌクレアーゼである。ＳＥＴ複合体の成分でもあり、グランザイムＡで誘導される細胞死の際にニックＤＮＡの３’末端を急速に分解する働きをする。機能的ＴＲＥＸ１が欠損した細胞は、慢性ＤＮＡ損傷チェックポイント活性化と、内因性一本鎖ＤＮＡ基質の核外蓄積とを示す。ＴＲＥＸ１タンパク質は、通常、異常な複製中間体を処理することから生じる一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド種に対して作用するようである。ＴＲＥＸ１のこの作用は、ＤＮＡ損傷チェックポイントシグナリングを減弱し、病的免疫活性化を防止する。ＴＲＥＸ１は、細胞固有の抗ウイルス監視機能として内因性レトロエレメントの逆転写された一本鎖ＤＮＡを代謝し、結果として強力なＩ型ＩＦＮ応答をもたらす。ＴＲＥＸ１は、細胞質におけるウイルスｃＤＮＡを分解することにより、ＨＩＶ－１がサイトゾルセンシングを逃れるのを助ける。
【0023】
「ＴＲＥＸ２」という語は、３プライム修復エキソヌクレアーゼ２を指し、これは、ヒトにおいてはＴＲＥＸ２遺伝子によってコード化される酵素である。この遺伝子は、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有する核タンパク質をコード化する。コード化されたタンパク質は、二本鎖ＤＮＡ切断修復に関与し、ＤＮＡポリメラーゼデルタと相互作用する場合がある。この活性を有する酵素は、ＤＮＡ複製、修復、及び組換えに関与する。ＴＲＥＸ２は、主にケラチノサイトで発現され、ＵＶＢで誘導されるＤＮＡ損傷に対する表皮応答に寄与する３′－エキソヌクレアーゼである。ＴＲＥＸ２の生化学的及び構造的特性はＴＲＥＸ１と類似しているが、同じではない。２つのタンパク質は二量体構造を共有し、インビトロでｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ基質をほぼ同じｋｃａｔ値でプロセッシングすることができる。しかしながら、酵素動力学、構造的ドメイン、及び細胞内分布に関連するいくつかの特徴により、ＴＲＥＸ２とＴＲＥＸ１とが区別される。ＴＲＥＸ２は、ＴＲＥＸ１と比べて、インビトロでＤＮＡ基質に対して１０倍低い親和性を提示する。ＴＲＥＸ１とは対照的に、ＴＲＥＸ２には、タンパク質間相互作用を媒介できるＣＯＯＨ末端ドメインがない。ＴＲＥＸ２は、細胞質及び核の両方に局在するが、ＴＲＥＸ１は、小胞体で見られ、グランザイムＡで誘導される細胞死の際、又はＤＮＡ損傷後に核に動員される。
【0024】
「対象」及び「患者」という語は、交換可能に使用することができ、治療を必要とする哺乳動物、例えば、ペット（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギなど）及び実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）を意味する。典型的には、対象は治療を必要とするヒトである。
【0025】
「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔ、ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、又はｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）という語は、生物学的活性又は過程の基本的活性における減少を含む。
【0026】
本明細書中で使用する場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、ｔｒｅａｔ、及びｔｒｅａｔｉｎｇ）」という語は、本明細書中で記載するように、疾患若しくは障害、又はその一つ以上の症状を逆転する、軽減する、その開始を遅らせる、またはその進行を阻害することを指す。いくつかの態様において、治療は、一つ以上の症状が発現した後に施すことができ、すなわち、治療的処置であり得る。他の態様において、治療は、症状の非存在下で施すことができる。例えば、治療は、症状の開始前に（例えば、症状の履歴に照らして、及び／又は特定の生物への曝露、又は他の感受性因子に照らして）感受性個体に施すことができ、すなわち、予防的処置である。治療は、例えば、再発を遅らせるために、症状が解消した後も続けてもよい。
【0027】
「薬剤的に許容される担体」という語は、処方される化合物の薬理活性を損なわない非毒性担体、アジュバント、又はビヒクルを指す。本明細書中で記載する組成物で使用することができる薬剤的に許容される担体、アジュバント又はビヒクルとしては、限定されるものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂が挙げられる。
【0028】
薬剤での使用に関して、本明細書中で記載する化合物の塩とは、非毒性の「薬剤的に許容される塩」を指す。薬剤的に許容される塩形態としては、薬剤的に許容される酸性／アニオン性又は塩基性／カチオン性塩が挙げられる。本明細書中で記載する化合物の好適な薬剤的に許容される酸付加塩には、例えば、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、および硫酸）の塩並びに有機酸（例えば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、及びｐ－トルエンスルホン酸）の塩が含まれる。カルボン酸などの酸性基を有する本教示の化合物は、薬剤的に許容される塩基（複数可）と薬剤的に許容される塩を形成することができる。好適な薬剤的に許容される塩基性塩としては、例えば、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム及びカリウム塩）並びにアルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム及びカルシウム塩）が挙げられる。第四級アンモニウム基を有する化合物はまた、例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、過塩素酸塩などのカウンターアニオンも含む。かかる塩の他の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、安息香酸塩及びグルタミン酸などのアミノ酸との塩が挙げられる。
【0029】
「有効量」又は「治療上有効な量」という語は、対象の所望又は有益な生物学的又は医学的応答を誘発する本明細書中で記載する化合物の量、例えば、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与量を指す。
【0030】
３．化合物
第二の実施形態において、式ＩＩ：
の化合物又はその薬剤的に許容される塩が提供され、式中、変数は第一の実施形態において上記の通りである。
第二の実施形態において、式ＩＩ：
【化3】
【0031】
第三の実施形態において、Ｒ２は、式Ｉ又はＩＩの化合物中、（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである。
【0032】
第四の実施形態において、式ＩＩＩ：
の化合物又はその薬剤的に許容される塩が提供され、式中、変数は、第一、第二、又は第三の実施形態において上記の通りである。
【化4】
【0033】
第五の実施形態において、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの化合物中の環Ａは、フェニル、ピリジル、ピラゾリル、シクロプロピル、シクロブチル、アゼチジニル、又はピペリジニルであり、その各々は任意選択的かつ独立して１又は２個のＲ５で置換されていてもよく、残りの変数は、第一、第二、第三又は第四の実施形態について上記のとおりである。あるいは、第五の実施形態の一部として、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの化合物中の環Ａは、トリアゾリル、ピロリジニル、ジアゼパニル、又はピペラジニルであり、その各々は、任意選択的かつ独立して、１又は２個のＲ５で置換されていてもよく、残りの変数は、第一、第二、第三又は第四の実施形態について上記のとおりである。
【0034】
第六の実施形態において、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの化合物中のＲ５は、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、ハロ、フェニル、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、－Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、Ｓ（Ｏ）２Ｒｃ、Ｓ（Ｏ）Ｒｃ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄ、－ＯＲｅ、－Ｏ（Ｃ１－Ｃ４）アルキルＯＲｅ、－ＮＲｅＲｆ、４～６員ヘテロアリール、又は４～７員ヘテロシクリルであり、Ｒ５の前述のフェニルは、任意選択的に、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、Ｒ５の前述の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルは、任意選択的に、－ＯＲｈ、－ＮＲｊＲｋ、フェニル、及び５～６員ヘテロアリールから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、前述の４～６員ヘテロアリール及び４～７員ヘテロシクリルは、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｍから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、そしてＲ５中の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルについて列挙した任意の置換基の前述のフェニル及び５～６員ヘテロアリールは、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよい；Ｒａは、任意選択的にフェニルで置換されていてもよい（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである；Ｒｂは、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、フェニル、５～６員ヘテロアリール又は４～７員ヘテロシクリルであり、前述の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルは、任意選択的に、フェニル、－ＯＲｈ、及び－ＮＲｊＲｋから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、前述のフェニル、５～６員ヘテロアリール、及び４～７員ヘテロシクリルは、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、前述の４～７員ヘテロシクリルはさらに、任意選択的に＝Ｏで置換されていてもよい；各Ｒｃは、独立して、フェニル又は（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである；各Ｒｄは、水素又は（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである；各Ｒｅは、独立して、水素、又は任意選択的にＯＲｈで置換されていてもよい（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである；各Ｒｆは、独立して、水素、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、フェニル３～４員シクロアルキル、４～６員ヘテロアリール、又は５～６員ヘテロシクリルであり、前述のフェニル、３～４員シクロアルキル、４～６員ヘテロアリール、及び５～６員ヘテロシクリルは、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｇで置換されていてもよい；各Ｒｇは、独立して、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、又はハロである；各Ｒｈは、水素、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、又は－（Ｃ１－Ｃ４）アルキルフェニルである；各Ｒｊは、独立して、水素又は（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである；各Ｒｋは、独立して、水素、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、又は３～４員シクロアルキルである；そして各Ｒｍは（Ｃ１－Ｃ４）アルキルであり、残りの変数は、第一、第二、第三、第四又は第五の実施形態について上記のとおりである。
【0035】
第七の実施形態において、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの化合物中のＲ５は、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ、フェニル、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、－Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、Ｓ（Ｏ）２Ｒｃ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄ、－Ｏ（Ｃ１－Ｃ４）アルキルＯＲｅ、－ＮＲｅＲｆ、４～６員ヘテロアリール、又は５～６員ヘテロシクリルであり、Ｒ５の前述の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルは、任意選択的に、－ＯＲｈ、フェニル、又は５～６員ヘテロアリールで置換されていてもよく、前述の４～６員ヘテロアリール及び５～６員ヘテロシクリルは、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｍから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、Ｒ５中の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルについて列挙された任意の置換基の前述のフェニル及び５～６員ヘテロアリールは、各々任意選択的かつ独立して、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、残りの変数は、第一、第二、第三、第四、第五又は第六の実施形態について上記のとおりである。
【0036】
第八の実施形態において、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの化合物中のＲ５は、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、ハロ、フェニル、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、－Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、Ｓ（Ｏ）２Ｒｃ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲｄ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄ、又は－Ｏ（Ｃ１－Ｃ４）アルキルＯＲｅ、－ＮＲｅＲｆ、モルホリニル、ピペラジニル、又はピラゾリルであり、前述のモルホリニル、ピペラジニル、及びピラゾリルは、各々、任意選択的に、Ｒｍから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、Ｒ５の前述の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルは、任意選択的に、－ＯＲｈ、フェニル、ピラゾリル、ピリミジニル、又はピリジニルで置換されていてもよく、Ｒ５中の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルについて列挙した任意の置換基の前述のフェニル、ピラゾリル、ピリミジニル、及びピリジニルは、各々、任意選択的かつ独立して、Ｒｇから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、残りの変数は、第一、第二、第三、第四、第五、第六、又は第七の実施形態について上記のとおりである。
【0037】
第九の実施形態において、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの化合物中の各Ｒｆは、独立して、水素、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、フェニルピラゾリル、ピリジニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニルであり、前述のフェニルピラゾリル、ピリジニル、テトラヒドロピラニル、及びピペリジニルは、各々、任意選択的かつ独立して、（Ｃ１－Ｃ４）アルキルで置換されていてもよく、残りの変数は、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、又は第八の実施形態について上記のとおりである。
【0038】
第１０の実施形態において、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの化合物中の各Ｒｇは独立して、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、又はハロであり、残りの変数は、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、又は第九の実施形態について上記のとおりである。
【0039】
第１１の実施形態において、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの化合物中のＲｂは、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、フェニル、５～６員ヘテロアリール又は４～７員ヘテロシクリルであり、Ｒｂの前述のフェニル及び５～６員ヘテロアリールは、各々、任意選択的かつ独立して、ハロ及び（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、Ｒｂの前述の４～７員ヘテロシクリルは、任意選択的に、＝Ｏで置換されていてもよく、Ｒｂの前述の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルは、任意選択的に、フェニル、－ＯＲｈ、及び－ＮＲｊＲｋから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、残りの変数は、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、又は第十の実施形態について上記の通りである。
【0040】
第十二の実施形態において、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの化合物中の各Ｒｋは、独立して、水素又は（Ｃ１－Ｃ４）アルキルであり、残りの変数は、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、又は第十一の実施形態について上記のとおりである。
【0041】
第十三の実施形態において、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの化合物中のＲｂは、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、フェニル、ピリジニル、ピラゾリル、ピリミジニル、又はピペリジニルであり、Ｒｂの前述のフェニル、ピリジニル、ピラゾリル、及びピリミジニルは、各々、任意選択的かつ独立して、ハロ及び（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシから選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、Ｒｂの前述の（Ｃ１－Ｃ４）アルキルは、任意選択的に、フェニル、ＯＨ、及びＮＭｅ２から選択される１又は２個の基で置換されていてもよく、Ｒｂの前述のピペリジニルは、任意選択的に、＝Ｏで置換されていてもよく、残りの変数は、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、又は第十二の実施形態について上記のとおりである。
【0042】
第十四の実施形態において、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの化合物中のＲ３は水素であり、残りの変数は、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、又は第十三の実施形態について上記のとおりである。
【0043】
第十五の実施形態において、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの化合物中のＲ４は、フェニル又は－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａであり、残りの変数は、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、又は第十四の実施形態について上記のとおりである。
【0044】
第十六の実施形態において、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの化合物中のＸは、結合又はＣＨ２であり、残りの変数は、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、又は第十三の実施形態について上記のとおりである
【0045】
１）式Ｉ：
を有する化合物又はその薬剤的に許容される塩（式中、変数は、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十又は第十一の実施形態について上記の通りである）；及び２）薬剤的に許容される担体を含む医薬組成物も提供される。
【化5】
【0046】
式Ｉを有する化合物を例示でさらに開示し、これらは本開示に含まれる。その薬剤的に許容される塩並びに中性形態も含まれる。
４．使用、処方及び投与
４．使用、処方及び投与
【0047】
本明細書中で記載する化合物及び組成物は、概して、ＴＲＥＸ１の活性を調節するために有用である。いくつかの態様において、本明細書中で記載する化合物及び医薬組成物は活性ＴＲＥＸ１を阻害する。
【0048】
いくつかの態様において、本明細書中で記載する化合物及び医薬組成物は、ＴＲＥＸ１機能に関連する障害の治療で有用である。したがって、本明細書中で提供するのは、ＴＲＥＸ１機能に関連する障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に対して、本明細書中で記載する化合物、若しくはその薬剤的に許容される塩、又は開示された化合物若しくはその薬剤的に許容される塩を含む医薬組成物の治療上有効な量を投与することを含む方法である。ＴＲＥＸ１機能に関連する障害の治療用医薬を製造するための、本明細書中で記載する化合物、又はその薬剤的に許容される塩、又は開示された化合物若しくはその薬剤的に許容される塩を含む医薬組成物の使用も提供される。ＴＲＥＸ１に関連する障害の治療に使用するための、本明細書中で記載する化合物、若しくはその薬剤的に許容される塩、又は開示された化合物若しくはその薬剤的に許容される塩を含む医薬組成物も提供される。
【0049】
いくつかの態様において、本明細書中で記載する化合物及び医薬組成物は、がんの治療で有用である。
【0050】
いくつかの態様において、本明細書中で記載する化合物及び医薬組成物で治療されるがんは、結腸がん、胃がん、甲状腺がん、肺がん、白血病、膵臓がん、黒色腫、多発性黒色腫、脳がん、ＣＮＳがん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、白血病、及び乳がんから選択される。
【0051】
いくつかの態様において、本明細書中で記載する化合物及び医薬組成物で治療されるがんは、肺がん、乳がん、膵臓がん、大腸がん、及び黒色腫から選択される。
【0052】
ある特定の態様において、本明細書中で記載する医薬組成物は、そのような組成物を必要とする患者への投与用に処方される。本明細書中で記載する医薬組成物は、経口、非経口、吸入スプレー、局所、直腸、鼻、頬側、膣、又は移植されたレザバーを介して投与することができる。「非経口」という語は、本明細書中で使用する場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、クモ膜下、肝内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入技術を包含する。いくつかの実施形態において、組成物は、経口、腹腔内又は静脈内投与される。本明細書中で記載する医薬組成物の滅菌注射形態は、水性又は油性懸濁液であってよい。これらの懸濁液は、好適な分散又は湿潤剤及び懸濁化剤を用いて当該技術分野で公知の技術にしたがって処方することができる。
【0053】
いくつかの態様では、医薬組成物を経口投与する。
【0054】
任意の特定の患者の具体的な投与量及び治療レジメンは、用いる特定の化合物の活性、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食事、投与時間、排出率、薬物の組み合わせ、並びに治療する医師の判断及び治療される特定の疾患の重篤度をはじめとする様々な因子に左右される。組成物中の本明細書で記載した化合物の量はまた、医薬組成物中の特定の化合物に左右される。
【0055】
例示
化学合成
以下の代表的実施例は、本開示の説明を助けることを意図し、本発明の範囲を限定することを意図するものではないし、そのように解釈されるべきでもない。
一般的合成スキーム
化学合成
以下の代表的実施例は、本開示の説明を助けることを意図し、本発明の範囲を限定することを意図するものではないし、そのように解釈されるべきでもない。
一般的合成スキーム
【化6】
【0056】
２－（３－ブロモ－５－メチルフェニル）－５－ヒドロキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド
【化7】
【0057】
ステップ１：３－（３－ブロモ－５－メチルフェニル）－５－（２－メトキシ－２－オキソエチル）－２－メチル－２，５－ジヒドロ－１，２，４－オキサジアゾール－５－カルボン酸メチルの合成
【化8】
【0058】
ＳＭ（５．１６ｇ、２６．３４１ミリモル、２当量）、Ｎ－メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（１．１０ｇ、１３．１７０ミリモル、１．００当量）のＨ２Ｏ（２５．００ｍＬ）、ＥｔＯＨ（２５．００ｍＬ）中撹拌溶液に、Ｎａ２ＣＯ３（０．８３７ｇ、７．９０２ミリモル、０．６当量）を数回に分けて室温で添加した。結果として得られた溶液を２時間８０℃にて撹拌した。反応混合物が室温に冷却されるまで、ブト－２－イン二酸１，４－ジメチル（２．０６ｇ、１４．４８８ミリモル、１．１当量）を滴下した。次いで、反応混合物を０．５時間室温で撹拌した。結果として得られた溶液を３×３０ｍＬの酢酸エチルで抽出し、合した有機層を塩水で洗浄し、真空下で濃縮した。残留物は、酢酸エチル／石油エーテル（１：５）を使用したシリカゲルカラムにかけた。この結果、１．３ｇのＡ１（収率２５％）を明黄色油として得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝３８５．０［Ｍ＋Ｈ］＋。ＭＷ計算値：３８４．０。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ７．６７（ｔ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｓ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），３．４５（ｄ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ，１Ｈ），３．１９（ｓ，３Ｈ），３．０７（ｄ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ，１Ｈ），２．３８（ｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ，３Ｈ）．
【0059】
以下の中間体は、上記ステップで記載したものと同様の条件を適切な出発物質とともに使用して合成した。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0060】
ステップ２：２－（３－ブロモ－５－メチルフェニル）－５－ヒドロキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸メチルＢ１の合成
【化9】
【0061】
１００ｍＬの丸底フラスコ中に、３－（３－ブロモ－５－メチルフェニル）－５－（２－メトキシ－２－オキソエチル）－２－メチル－２，５－ジヒドロ－１，２，４－オキサジアゾール－５－カルボン酸メチル（１．００ｇ、２．５９６ミリモル、１．００当量）、キシレン（２０．００ｍＬ）を入れた。結果として得られた溶液を５時間１４５℃にて撹拌した。反応混合物を室温まで冷却した。固体をろ過により集め、ヘキサンで洗浄した。固体を減圧下で乾燥させた。この結果、２１０ｍｇの２－（３－ブロモ－５－メチルフェニル）－５－ヒドロキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸メチル（収率２２％）を白色固体として得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝３５３．０［Ｍ＋Ｈ］＋。ＭＷ計算値：３５２．０
【0062】
以下の中間体は、上記ステップで記載したものと同様の条件を適切な出発物質とともに使用して合成した。
【表2-1】
【表2-2】
【0063】
ステップ３：２－（３－ブロモ－５－メチルフェニル）－５－ヒドロキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド（実施例１）の合成
【化10】
【0064】
８ｍＬの密封管中に、２－（３－ブロモ－５－メチルフェニル）－５－ヒドロキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸メチル（１００．００ｍｇ、０．２８３ミリモル、１．００当量）、ＴＨＦ（２．５０ｍＬ）、１，２－オキサゾール－４－アミン（７１．４２ｍｇ、０．８４９ミリモル、３．００当量）を入れた。これに続いて、ｉＰｒＭｇＣｌの溶液（２Ｍ、０．６４ｍＬ、４．５０当量）を－７０℃で撹拌しながら滴下した。結果として得られた溶液を１時間室温で撹拌した。次に、２ｍＬの飽和ＮＨ４Ｃｌ（水性）の添加によって反応をクエンチした。溶液のｐＨ値をＨＣｌ（４Ｍ）で３に調節した。結果として得られた溶液を３×５ｍＬのジクロロメタンで抽出し、有機層を合し、真空下で濃縮した。粗生成物をＰｒｅｐ－ＨＰＬＣ（ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＦＡ）により精製した。この結果、３２．９ｍｇの２－（３－ブロモ－５－メチルフェニル）－５－ヒドロキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド（収率２８％）を白色固体として得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝４０５．０［Ｍ＋Ｈ］＋。ＭＷ計算値：４０４．０。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．８２（ｓ，１Ｈ），１０．９５（ｓ，１Ｈ），９．３１（ｓ，１Ｈ），８．８７（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｓ，１Ｈ），７．６２（ｓ，１Ｈ），７．４８（ｓ，１Ｈ），３．３０（ｓ，３Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ）．
【0065】
以下の実施例は、上記ステップで記載したものと同様の条件を適切な出発物質とともに使用して合成した。
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【0066】
５－ヒドロキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－２－フェニル－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド（実施例８）の合成。
【化11】
【0067】
５－ヒドロキシ－１－メチル－６－オキソ－２－フェニル－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸メチル（２００ｍｇ、０．７７ミリモル、１当量）及びイソキサゾール－４－アミン（０．０９６ｇ、１．１５ミリモル、１．５当量）をトルエン（１ｍＬ）中に溶解させ、混合物を０℃に冷却した。これに、トルエン中２Ｍトリメチルアルミニウム（０．７６８ｍＬ、１．５３ミリモル、２．０当量）を０℃で滴下した。反応混合物を次いで１００℃にて２時間加熱し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（０．２ｍＬ）でクエンチし、これに酢酸エチル（１０ｍＬ）を添加した。反応混合物を次いで無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過して除去した。固体を酢酸エチルで洗浄し（３×１０ｍＬ）、そして合した有機層を減圧下で濃縮した。粗生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製して、５－ヒドロキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－２－フェニル－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド、８（２５ｍｇ、１５％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝３１３．２［Ｍ＋Ｈ］＋。ＭＷ計算値：３１２．２９。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ９．１３（ｓ，１Ｈ），８．７８（ｓ，１Ｈ），７．４２－７．５０（ｍ，５Ｈ），３．２２（ｓ，３Ｈ）．
【0068】
スキーム：２－クロロ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－５－メトキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド（Ｃ）の合成
【化12】
【0069】
ステップ１：２－メトキシ－３－オキソブタン二酸１，４－ジエチル（１）の合成
【化13】
【0070】
窒素の不活性雰囲気でパージし、維持した１０００ｍＬの３口丸底フラスコ中に、エタノール（６００．０ｍＬ）、ナトリウムエタノレート（３１．７ｇ、０．４７０ミリモル、１．１０当量）を入れ、シュウ酸エチル（６８．００ｇ、４６５．６ミリモル、１．１０当量）を室温で添加した。これに続いて、２－メトキシ酢酸エチル（５０．００ｇ、４２３．３ミリモル、１．００当量）を室温で撹拌しながら滴下した。結果として得られた溶液を一晩３５℃で撹拌した。結果として得られた混合物を真空下で濃縮して、エタノールの大部分を除去した。溶液のｐＨ値を塩化水素（１ｍｏｌ／Ｌ）で０℃にて３に調節した。結果として得られた溶液を４ｘ５００ｍＬの酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で濃縮した。この結果、９０ｇ（粗製）の２－メトキシ－３－オキソブタン二酸１，４－ジエチル（１）を褐色油として得た。
【0071】
ステップ２：２－メトキシ－２－［（４Ｅ）－１－メチル－２，５－ジオキソイミダゾリジン－４－イリデン］酢酸エチル（２）の合成
【化14】
【0072】
２０００ｍＬの丸底フラスコ中に、２－メトキシ－３－オキソブタン二酸１，４－ジエチル（１）（９０．００ｇ、４１２．５ミリモル、１．００当量）、メチル尿素（３０．６０ｇ、４１２．５ミリモル、１．００当量）、酢酸（１２００．０ｍＬ）、塩化水素（４００．０ｍＬ、気体、ジオキサン中４モル）を入れた。結果として得られた溶液を３時間１０５℃で撹拌した。結果として得られた混合物を真空下で濃縮した。結果として得られた混合物を１×５００ｍＬのヘキサンで洗浄した。この結果、９０ｇ（粗製）の２－メトキシ－２－［（４Ｅ）－１－メチル－２，５－ジオキソイミダゾリジン－４－イリデン］酢酸エチル（２）を褐色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ８．７５（ｓ，１Ｈ），７．４７（ｓ，０．４Ｈ），５．０９（ｓ，２Ｈ），４．５１－４．３０（ｍ，３Ｈ），３．８５（ｓ，１Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．１２（ｓ，３Ｈ），３．０７（ｓ，１Ｈ），２．１４（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），１．４５－１．４２（ｍ，２Ｈ），１．４２－１．３７（ｍ，３Ｈ）．
【0073】
ステップ３．２－ヒドロキシ－５－メトキシ－１－メチル－６－オキソピリミジン－４－カルボン酸（３）の合成
【化15】
【0074】
２０００ｍＬの丸底フラスコ中に、２－メトキシ－２－［（４Ｅ）－１－メチル－２，５－ジオキソイミダゾリジン－４－イリデン］酢酸エチル（２）（８０．００ｇ、３５０．６ミリモル、１．００当量）、水酸化カリウム（水中１Ｍ）（１４００．０ｍＬ）を入れた。結果として得られた溶液を３時間１０５℃で撹拌した。反応混合物を水／氷浴で０℃に冷却した。溶液のｐＨ値を０℃にて塩化水素（１２ｍｏｌ／Ｌ）で３に調節し、固体をろ過により集め、沈殿を真空中で乾燥させた。この結果、４０ｇの２－ヒドロキシ－５－メトキシ－１－メチル－６－オキソピリミジン－４－カルボン酸（３）（収率５７％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １４．３５（ｓ，１Ｈ），１０．９１（ｓ，１Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），３．１４（ｓ，３Ｈ）．
【0075】
ステップ４．２－ヒドロキシ－５－メトキシ－１－メチル－６－オキソピリミジン－４－カルボン酸エチル（４）の合成
【化16】
【0076】
アルゴンの不活性雰囲気でパージし、維持した１０００ｍＬの３口丸底フラスコ中に、２－ヒドロキシ－５－メトキシ－１－メチル－６－オキソピリミジン－４－カルボン酸（３）（２０ｇ、０．１０ミリモル、１．００当量）、エタノール（４００．０ｍＬ）を入れた。これに続いて塩化アセチル（１１７．７ｇ、１．５００ミリモル、１５．００当量）を０℃で撹拌しながら滴下した。結果として得られた溶液を一晩還流加熱した。反応混合物を水／氷浴で冷却した。固体をろ過により集めた。この結果、１６ｇの２－ヒドロキシ－５－メトキシ－１－メチル－６－オキソピリミジン－４－カルボン酸エチル（４）（収率：７０％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．０８（ｓ，１Ｈ），４．３２（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），３．１５（ｓ，３Ｈ），１．３１（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）．
【0077】
ステップ５．２－クロロ－５－メトキシ－１－メチル－６－オキソピリミジン－４－カルボン酸エチル（５）の合成
【化17】
【0078】
アルゴンの不活性雰囲気でパージし、維持した１Ｌの３口丸底フラスコ中に、２－ヒドロキシ－５－メトキシ－１－メチル－６－オキソピリミジン－４－カルボン酸エチル（４）（１６．０ｇ、７０．１ミリモル、１．００当量）、ジメチルアニリン（１．２０ｇ、９８．２ミリモル、１．４０当量）、三塩化ホスホリル（３２０．０ｍＬ）を入れた。結果として得られた溶液を一晩１００℃で撹拌した。結果として得られた混合物を真空下で濃縮した。酢酸エチル／石油エーテル（１／１０－１／４）を用いたシリカゲルカラムに残留物をかけた。この結果、１３．３ｇの２－クロロ－５－メトキシ－１－メチル－６－オキソピリミジン－４－カルボン酸エチル（５）（収率７７．０％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ４．３２（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．５４（ｓ，３Ｈ），１．３０（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）．
【0079】
ステップ６．２－クロロ－５－メトキシ－１－メチル－Ｎ－（１，２－オキサゾール－４－イル）－６－オキソピリミジン－４－カルボキサミド（６）の合成
【化18】
【0080】
２－クロロ－５－メトキシ－１－メチル－６－オキソピリミジン－４－カルボン酸エチル（５）（１．００ｇ、４．０５ミリモル、１．００当量）及び１，２－オキサゾール－４－アミン（３４０．９ｍｇ、４．０５０ミリモル、１．００当量）のトルエン（１５．０ｍＬ）中撹拌溶液に、トリメチルアルミニウム（トルエン中２モル）（４．１ｍＬ、８．１０ミリモル、２．００当量）を室温にてアルゴン雰囲気下で添加した。結果として得られた溶液を、マイクロ波照射しながら１５分間８０℃で撹拌した。反応混合物を水／氷で０℃にてクエンチした。結果として得られた溶液を３×４０ｍＬの酢酸エチルで抽出し、合した有機層を塩水（１×３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で濃縮した。酢酸エチル／石油エーテル（１／１０－１／１）を用いたシリカゲルカラム上に残留物をかけた。この結果、６５０ｍｇの２－クロロ－５－メトキシ－１－メチル－Ｎ－（１，２－オキサゾール－４－イル）－６－オキソピリミジン－４－カルボキサミド（６）（収率 ５３．０％）を明黄色固体として得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝２８５．２［Ｍ＋Ｈ］＋。ＭＷ計算値：２８４．２ １Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １０．８４（ｓ，１Ｈ），９．２８（ｓ，１Ｈ），８．７８（ｓ，１Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ）．
【0081】
以下の実施例及び中間体は、上記ステップで記載したものと同様の条件を適切な出発物質と共に使用して合成した。
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【0082】
以下の中間体は、上記のものと類似した条件を適切な出発物質と共に使用して合成した。
【表5】
【0083】
２－（３－ブロモ－２－（２－ヒドロキシエトキシ）フェニル）－５－ヒドロキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド（実施例１５）の合成
【化19】
【0084】
４０ｍＬバイアル中に、２－（３－ブロモ－２－（２－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）エトキシ）フェニル）－５－ヒドロキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド（３００ｍｇ、０．５３１ミリモル、１．０当量）及びＴＨＦ（６．０ｍＬ）を室温で添加した。上記混合物に、ＴＢＡＦ（１Ｍ）／ＣＨ３ＣＯＯＨ＝１：１（１．２０ｍＬ、２．０当量）を０℃で２分にわたって滴下した。結果として得られた混合物を室温でさらに５時間撹拌した。結果として得られた混合物を酢酸エチルで抽出した（１×１２ｍＬ）。水相を酢酸エチルでさらに抽出した（３×１０ｍＬ）。合した有機層を塩水で洗浄し（２×７ｍＬ）、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。ろ過後、ろ液を減圧下で濃縮した。粗生成物（３００ｍｇ）をＰｒｅｐ－ＨＰＬＣ（アセトニトリル／ギ酸／水）により精製して、７０ｍｇの２－（３－ブロモ－２－（２－ヒドロキシエトキシ）フェニル）－５－ヒドロキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド１５を収率２９％で白色固体として得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝４５１．０［Ｍ＋Ｈ］＋。ＭＷ計算値：４５０．０。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．８７（ｓ，１Ｈ），１０．９９（ｓ，１Ｈ），９．２９（ｓ，１Ｈ），８．８６（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．２８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．６３（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．０１－３．９７（ｍ，１Ｈ），３．７６－３．７０（ｍ，１Ｈ），３．５２－３．３９（ｍ，２Ｈ），３．２３（ｓ，３Ｈ）．
【0085】
以下の実施例及び中間体は、上記ステップで記載したものと同様の条件を適切な出発物質と共に使用して合成した。
【表6-1】
【表6-2】
【表6-3】
【表6-4】
【表6-5】
【表6-6】
【表6-7】
【表6-8】
【表6-9】
【表6-10】
【表6-11】
【表6-12】
【表6-13】
【表6-14】
【0086】
ｔｅｒｔ－ブチル－３－（５－エトキシ－４－（イソキサゾール－４－イルカルバモイル）－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－２－イル）ピペリジン－１－カルボキシレート（異性体Ａ１）の合成：
【化20】
【0087】
ステップ－１：２－（１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－１，２，５，６－テトラヒドロピリジン－３－イル）－５－エトキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸エチル：
【0088】
ジオキサン／水の溶液（４：１、５０ｍＬ）中２－クロロ－５－エトキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸エチル（２ｇ、７．６７ミリモル）、５－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－３，６－ジヒドロピリジン－１（２Ｈ）－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル（２．９６ｇ、９．５９ミリモル）及び炭酸ナトリウム（１．６２ｇ、１５．３４ミリモル）の混合物を２０分間、アルゴンガスを用いて脱気した。ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）（０．５６１ｇ、０．７６ミリモル）を添加し、脱気をさらに１０分間続けた。反応混合物を９０℃で４時間加熱した。反応が完了した後、反応混合物を水（１００ｍＬ）中に溶かし、酢酸エチルで抽出した（２×５０ｍＬ）。合した有機層を塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（２．５７ｇ、８２％）を固体として得た。ＬＣＭＳ：計算値４０８．３；ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝４０８．６１［Ｍ＋Ｈ］＋１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １．２３－１．３１（ｍ，６Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ），２．２５－２．４０（ｍ，２Ｈ），３．４４（ｓ，３Ｈ），３．４５－３．５０（ｍ，２Ｈ），４．０５－４．１０（ｍ，２Ｈ），４．１６（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．３１（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），６．２６（ｂｓ，１Ｈ ）．
【0089】
ステップ－２：エチル－２－（１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ピペリジン－３－イル）－５－エトキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキシレート：
【0090】
メタノール：酢酸エチルの溶液（１：３、５４ｍＬ）中に溶かし、撹拌した２－（１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－１，２，５，６－テトラヒドロピリジン－３－イル）－５－エトキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸エチル（２．５７ｇ、６．３０ミリモル）の混合物に１０％Ｐｄ／Ｃ（０．６７ｇ、５０％水分を含む）を添加した。反応物を室温にて水素ガス雰囲気下で３．５時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をセライト床でろ過し、酢酸エチルで洗浄した（２×５０ｍＬ）。ろ液を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（２．３５ｇ、９１％）を得た。ＬＣＭＳ：計算値４０９．３，ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝４１０．４［Ｍ＋Ｈ］＋
【0091】
ステップ－３：２－（１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ピペリジン－３－イル）－５－エトキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸：
【0092】
メタノール：ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（１：１：１、３０ｍＬ）の混合物中エチル－２－（１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ピペリジン－３－イル）－５－エトキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキシレート（１．９ｇ、４．６４ミリモル）の撹拌溶液に、ＮａＯＨ（０．２２２ｇ、５．５６ミリモル）を室温で添加した。結果として得られた反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応が完了した後、反応物を真空下で濃縮した。反応混合物を水（１０ｍＬ）中に溶解させ、１Ｎ ＨＣｌ（ｐＨ－６）で酸性化した。生成物をジクロロメタン中１０％メタノール（２×３０ｍＬ）で抽出した。合した有機層を塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、真空下で蒸発させて、粗製の表題化合物（１．６７ｇ、９４％）を得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ：計算値３８１．３；ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝３８２．５［Ｍ＋Ｈ］＋
【0093】
ステップ－４：ｔｅｒｔ－ブチル－３－（５－エトキシ－４－（イソキサゾール－４－イルカルバモイル）－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－２－イル）ピペリジン－１－カルボキシレート：
【0094】
２－（１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ピペリジン－３－イル）－５－エトキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸（１．６７ｇ、４．３７ミリモル）の乾燥ＤＭＦ（１６ｍＬ）中撹拌溶液に、ＨＡＴＵ（２．４９ｇ、６．５６ミリモル）を０℃で添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）及びＤＩＰＥＡ（１．５ｍＬ、８．７５ミリモル）中イソキサゾール－４－アミン（０．４４１ｇ、５．２５ミリモル）を室温で添加し、反応混合物を３時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を水（２０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチルで抽出した（２×３０ｍＬ）。合した有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗生成物をＣｏｍｂｉｆｌａｓｈカラムクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（１．６７ｇ、８５％）をラセミ混合物として得た。純粋なラセミ化合物（１．２ｇ）のキラル分割は、キラル分取ＨＰＬＣを用いて実施して、それぞれ５００ｍｇのエナンチオマーを得た。ＬＣＭＳ：計算値４４７．３；ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝４４８．６０［Ｍ＋Ｈ］＋ キラルＨＰＬＣ：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ－Ｈ；液体ＣＯ２中３０％メタノール＋０．１％ＤＥＡ。ＦＲ－１（異性体－Ａ１）：ＲＴ＝７．６６分；ＦＲ－２（異性体－Ａ２）：ＲＴ＝８．８１分；Ａ１：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １．２１－１．２５（ｍ，３Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ），１．４６－１．５７（ｍ，２Ｈ），１．７１－１．７４（ｍ，２Ｈ），２．０２－２．０４（ｍ，１Ｈ），２．７６－２．９８（ｍ，２Ｈ），２．９９－３．１５（ｍ，１Ｈ），３．５７（ｓ，３Ｈ），３．８５－４．１５（ｍ，１Ｈ），４．１０－４．１５（ｍ，２Ｈ），８．７８（ｓ，１Ｈ），９．２９（ｓ，１Ｈ），１０．５６（ｓ，１Ｈ）． Ａ２：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １．２１－１．２９（ｍ，３Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ），１．４６－１．５７（ｍ，２Ｈ），１．７１－１．７４（ｍ，２Ｈ），２．０２－２．０４（ｍ，１Ｈ），２．７８－２．９８（ｍ，２Ｈ），２．９９－３．１５（ｍ，１Ｈ），３．５７（ｓ，３Ｈ），３．８５－４．１５（ｍ，１Ｈ），４．１０－４．１５（ｍ，２Ｈ），８．７８（ｓ，１Ｈ），９．２９（ｓ，１Ｈ），１０．５７（ｓ，１Ｈ）．
【0095】
１－（（２－（（Ｒ）－１－（３，４－ジクロロベンゾイル）ピペリジン－３－イル）－４－（イソキサゾール－４－イルカルバモイル）－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－５－イル）オキシ）エチル炭酸エチル（実施例１３１）の合成
【化21】
【0096】
ステップ－１：（Ｒ）－５－エトキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－２－（ピペリジン－３－イル）－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド塩酸塩：
【0097】
（Ｒ）－３－（５－エトキシ－４－（イソキサゾール－４－イルカルバモイル）－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－２－イル）ピペリジン－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．２０ｇ、０．４４ミリモル）のジクロロメタン（１．３２ｍＬ）とメタノール（０．６６ｍＬ）との混合物中撹拌溶液に、ジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（１ｍＬ）を０℃で滴下した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、４０℃まで１０分間温めた。反応混合物を濃縮乾固し、メタノールと２回共沸させて、表題化合物（０．１７ｇ、９９％）を固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ：計算値３４７．３、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝３４８．４８［Ｍ＋Ｈ］＋
【0098】
ステップ－２：（Ｒ）－２－（１－（３，４－ジクロロベンゾイル）ピペリジン－３－イル）－５－エトキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド：
【0099】
３，４－ジクロロ安息香酸（０．１０１ｇ、０．５３ミリモル）の乾燥ＤＭＦ（１．７ｍＬ）中撹拌溶液に、ＨＡＴＵ（０．２５２ｇ、０．６６ミリモル）を０℃で添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、（Ｒ）－５－エトキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－２－（ピペリジン－３－イル）－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド塩酸塩（０．１７０ｇ、０．４４ミリモル）及びＤＩＰＥＡ（０．２５ｍＬ、１．３３ミリモル）を室温で添加し、反応混合物を３時間撹拌した。完了したら、反応物を水（１５ｍＬ）で希釈し、そして酢酸エチルで抽出した（２×２０ｍＬ）。合した有機層を冷飽和重炭酸ナトリウム（２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（０．２１ｇ、８９％）を固体として得た。ＬＣＭＳ：計算値５１９．３，ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝５２０．２７［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １．１８－１．３２（ｍ，３Ｈ），１．５５－１．７０（ｍ，２Ｈ），１．７２－１．８５（ｍ，２Ｈ），２．０７－２．１０（ｍ，１Ｈ），３．１５－３．２５（ｍ，２Ｈ），３．５８（ｓ，３Ｈ），３．６６－３．７０（ｍ，１Ｈ），４．０７－４．１２（ｍ，２Ｈ），４．４７－４．４９（ｍ，１Ｈ），７．４０－７．４２（ｍ，１Ｈ），７．７０－７．７３（ｍ，２Ｈ），８．７４（ｓ，１Ｈ，），９．２７（ｓ，１Ｈ），１０．５２（ｓ，１Ｈ）．
【0100】
ステップ－３：（Ｒ）－２－（１－（３，４－ジクロロベンゾイル）ピペリジン－３－イル）－５－ヒドロキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド：
【0101】
（Ｒ）－２－（１－（３，４－ジクロロベンゾイル）ピペリジン－３－イル）－５－エトキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド（０．６０８ｇ、１．１６ミリモル）の撹拌溶液をジクロロメタン（３６ｍＬ）中に溶解させた。結果として得られた溶液を０℃に冷却し、ジクロロメタン中１Ｍ ＢＢｒ３（４．６７ｍＬ、４．６７ミリモル）を滴下した。反応混合物を室温まで温め、５時間撹拌した。完了したら、反応混合物を濃縮し、ジクロロメタン（２×６ｍＬ）と共沸させた。残留物を０℃に冷却し、メタノール（５ｍＬ）をゆっくりと添加した。反応混合物を真空下で濃縮乾固させた。残留物をメタノール（２×６ｍＬ）と共沸させて、粗化合物を得た。粗化合物をセライト上にロードし、アセトニトリル及び０．１％水中ギ酸を用いて逆相カラムクロマトグラフィーにより精製して、実施例１３１（０．２４６ｇ、４２％）を得た。ＬＣＭＳ：計算値４９１．３、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝４９２．３［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １．４４－１．６２（ｍ，２Ｈ），１．８０－１．９５（ｍ，２Ｈ），２．０７－２．１０（ｍ，１Ｈ），３．１５－３．２５（ｍ，２Ｈ），３．５７（ｓ，３Ｈ），３．６０－３．７０（ｍ，１Ｈ），４．３４－４．５２（ｍ，１Ｈ），７．４０－７．４２（ｍ，１Ｈ），７．７０－７．７４（ｍ，２Ｈ），８．８４－８．９０（ｍ，１Ｈ，），９．３０（ｓ，１Ｈ），１０．４２－１０．５５（ｍ，１Ｈ），１１．４８（ｓ，１Ｈ）．
【0102】
以下の実施例及び中間体は、上記ステップで記載したものと同様の条件を適切な出発物質と共に使用して合成した。
【表7-1】
【表7-2】
【表7-3】
【0103】
２－（１－（３，４－ジクロロベンゾイル）－３－メチルピペリジン－３－イル）－５－ヒドロキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド（実施例１３０）の合成
【化22】
【0104】
ステップ－１：３－シアノ－３－メチルピペリジン－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル：
【0105】
３－シアノピペリジン－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル（５．０ｇ、２４ミリモル）の乾燥ＴＨＦ（１００ｍＬ）中撹拌溶液に、ＬｉＨＭＤＳ（３０．９ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ、３０．９ミリモル）を－７８℃で添加した。反応混合物を－７８℃で３０分間撹拌した。次いで、ＭｅＩ（２．２２ｍＬ、３５．７ミリモル）を同じ温度で添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を氷冷水の混合物（１００ｍＬ）中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した（２×１５０ｍＬ）。合した有機層を塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。結果として得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、純粋な表題化合物（３．５ｇ、６５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １．３５（ｓ，３Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ），１．６６－１．７０（ｍ，１Ｈ），１．７８－１．８１（ｍ，２Ｈ），１．８７－２．１０（ｍ，１Ｈ），２．８０（ｓ，２Ｈ），３．９０－４．２０（ｍ，２Ｈ）．
【0106】
ステップ－２：３－メチルピペリジン－３－カルボニトリルＴＦＡ塩。
【0107】
３－シアノ－３－メチルピペリジン－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル（３．５ｇ、１５．６ミリモル）のジクロロメタン（７０ｍＬ）中撹拌溶液に、ＴＦＡ（１２．７ｍＬ）を０℃で滴下した。結果として得られた混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗化合物を得た。粗化合物をジエチルエーテルで摩砕して、表題化合物（３．０ｇ、８１％）をＴＦＡ塩として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １．４０（ｓ，３Ｈ），１．６３－１．６９（ｍ，２Ｈ），１．７６－１．８１（ｍ，１Ｈ），１．９１－２．０６（ｍ，１Ｈ），２．８２－２．８９（ｍ，１Ｈ），３．０１－３．０９（ｍ，１Ｈ），３．１９－３．２２（ｍ，１Ｈ），３．５６－３．５９（ｍ，１Ｈ），９．２０（ｂｓ，１Ｈ）．
【0108】
ステップ－３：１－（３，４－ジクロロベンゾイル）－３－メチルピペリジン－３－カルボニトリル。
【0109】
３，４－ジクロロ安息香酸（２．８８ｇ、１５．１ミリモル）の乾燥ＤＭＦ（１５ｍＬ）中撹拌溶液に、ＨＡＴＵ（７．１８ｇ、１８．９ミリモル）を室温で添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。ＤＩＰＥＡ（７ｍＬ、３８ミリモル）を滴下し、続いて３－メチルピペリジン－３－カルボニトリルＴＦＡ塩（３．０ｇ、１２．６ミリモル）を室温で添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を水（３０ｍＬ）で希釈し、水層を酢酸エチルで抽出した（２×２００ｍＬ）。合した有機層を塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。結果として得られた残留物をカラムクロマトグラフィーにより精製して、純粋な表題化合物（２．８ｇ、５６％）を得た。ＬＣＭＳ：計算値２９６．３、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝２９７．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0110】
ステップ－４：１－（３，４－ジクロロベンゾイル）－Ｎ－ヒドロキシ－３－メチルピペリジン－３－カルボキシイミドアミド：
【0111】
１－（３，４－ジクロロベンゾイル）－３－メチルピペリジン－３－カルボニトリル（４ｇ、１３．５ミリモル）、ヒドロキシルアミン塩酸塩（２．８０ｇ、４０．４ミリモル）のエタノール（１００ｍＬ）中混合物にトリエチルアミン（５．８ｍＬ、４０．４ミリモル）に０℃をゆっくりと添加した。結果として得られた反応混合物を７０℃で１６時間加熱し、次いで濃縮し、水（１００ｍＬ）で希釈し、ジクロロメタン中１０％メタノール（２×１５０ｍＬ）で抽出した。合した有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、表題化合物（５．０ｇ、６９％）を固体として得た。粗生成物をさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ：計算値３２９．３、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝３３０．４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0112】
ステップ－５：２－（（Ｅ）－１－（３，４－ジクロロベンゾイル）－Ｎ’－ヒドロキシ－３－メチルピペリジン－３－カルボキシイミドアミド）マレイン酸ジメチル：
【0113】
１－（３，４－ジクロロベンゾイル）－Ｎ－ヒドロキシ－３－メチルピペリジン－３－カルボキシイミドアミド（５．０ｇ、１５ミリモル）のクロロホルム（１００ｍＬ）中撹拌溶液に、アセチレンジカルボン酸ジメチル（３．３２ｇ、２３．４ミリモル）を０℃で滴下し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応をＴＬＣによりモニタリングし、次いで濃縮して、粗生成物を得、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な表題化合物（２．４ｇ、３３％）を固体として得た。ＬＣＭＳ：計算値４７１．２、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝４７２．３［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0114】
ステップ－６：２－（１－（３，４－ジクロロベンゾイル）－３－メチルピペリジン－３－イル）－５－ヒドロキシ－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸メチル。
【0115】
２－（（Ｅ）－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ’－ヒドロキシピペリジン－３－カルボキシイミドアミド）マレイン酸ジメチル（２．０ｇ、４．２ミリモル）のキシレン（１５ｍＬ）中溶液をマイクロ波中、１６０℃で１０分間加熱した。反応混合物を濃縮し、ジエチルエーテル及びヘキサンで摩砕して、固体を得た。粗残留物をセライト上にロードし、アセトニトリル及び０．１％水中ギ酸を使用して逆相カラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な表題化合物（０．４０ｇ、２１％）を得た。ＬＣＭＳ：ＬＣＭＳ：計算値４３９．４、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝４４０．５［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １．１０（ｓ，２Ｈ），１．２７（ｓ，３Ｈ），１．５８－１．７５（ｍ，３Ｈ），２．００－２．１６（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．６０－３．６４（ｍ，１Ｈ），４．０１（ｂｓ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝８．４，１Ｈ），７．５４（ｓ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），１０．３６（ｓ，１Ｈ），１２．４０－１２．６５（ｍ，１Ｈ）．
【0116】
ステップ－７：２－（１－（３，４－ジクロロベンゾイル）－３－メチルピペリジン－３－イル）－５－ヒドロキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸メチル。
【0117】
２－（１－（３，４－ジクロロベンゾイル）－３－メチルピペリジン－３－イル）－５－ヒドロキシ－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸メチルの混合物（０．２００ｇ、０．４５４ミリモル）をＤＭＳＯ（５０ｍＬ）中に溶解させ、０℃に冷却した。これに、マグネシウムメトキシド溶液（１．３０ｍＬ、０．９０８ミリモル、メタノール中６～１０％）を０℃で滴下した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を濃縮して過剰のメタノールを除去した。反応混合物を０℃に冷却し、ＭｅＩ（０．１１６ｍＬ、１．８１ミリモル）を滴下した。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、次いで１０℃に冷却し、１Ｎ ＨＣｌでゆっくりとクエンチした。生成物を酢酸エチルで抽出した（２×２００ｍＬ）。合した有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗残留物をセライト上にロードし、アセトニトリル及び０．１％水中ギ酸を使用して逆相カラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な表題化合物（０．２０ｇ、９７％）を得た。ＬＣＭＳ：計算値４５３．４、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝４５４．２［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １．３９（ｓ，３Ｈ），１．５９（ｂｓ，１Ｈ），１．７５（ｂｓ，１Ｈ），２．０１－２．０７（ｍ，２Ｈ），３．１５－３．２５（ｍ，１Ｈ），３．３２－３．５２（ｍ，１Ｈ），３．６３（ｓ，３Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．８３－３．８６（ｍ，１Ｈ），３．９９－４．０２（ｍ，１Ｈ），７．３０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｓ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），１０．３２（ｓ，１Ｈ）．
【0118】
ステップ－８：２－（１－（３，４－ジクロロベンゾイル）－３－メチルピペリジン－３－イル）－５－メトキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸メチル：
【0119】
２－（１－（３，４－ジクロロベンゾイル）－３－メチルピペリジン－３－イル）－５－ヒドロキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸メチル（０．２０ｇ、０．４４ミリモル）のＤＭＦ（１ｍＬ）中撹拌溶液に、Ｋ２ＣＯ３（０．１２１ｇ、０．８７５ミリモル）を添加し、続いてＭｅＩ（０．０４２ｍＬ、０．６６０ミリモル）を室温で添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌した。反応が完了した後、水（２０ｍＬ）で希釈し、水層を酢酸エチルで抽出した（２×２０ｍＬ）。合した有機層を塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。結果として得られた残留物をカラムクロマトグラフィーにより精製して、純粋な表題化合物（０．１４ｇ、６７％）を得た。ＬＣＭＳ：計算値４６７．４、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝４６８．３［Ｍ＋Ｈ］＋
【0120】
ステップ－９：２－（１－（３，４－ジクロロベンゾイル）－３－メチルピペリジン－３－イル）－５－メトキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸：
【0121】
メタノール：ＴＨＦ：水の混合物（１：１：１、６ｍＬ）中２－（１－（３，４－ジクロロベンゾイル）－３－メチルピペリジン－３－イル）－５－メトキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸メチル（０．１４０ｇ、０．２９８ミリモル）の撹拌溶液に、ＮａＯＨ（０．０１４ｇ、０．３６ミリモル）を室温で添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を減圧下で濃縮し、氷冷水（１０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチルで抽出した（２×１０ｍＬ）。合した水層を１Ｎ ＨＣｌで０℃にて酸性化し、ジクロロメタン中１０％メタノール（２×３０ｍＬ）で抽出した。合した有機層を塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗製の表題化合物（０．１３０ｇ、９６％）を得た。ＬＣＭＳ：計算値４５５．２、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝４５６．６［Ｍ＋Ｈ］＋
【0122】
ステップ－１０：２－（１－（３，４－ジクロロベンゾイル）－３－メチルピペリジン－３－イル）－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－５－メトキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド。
【0123】
２－（１－（３，４－ジクロロベンゾイル）－３－メチルピペリジン－３－イル）－５－メトキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸（０．１４０ｇ、０．３０８ミリモル）の乾燥ＤＭＦ（１．４ｍＬ）中撹拌溶液に、ＨＡＴＵ（０．１７６ｇ、０．４６２ミリモル）を室温で添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、ＤＩＰＥＡ（０．１７ｍＬ、０．９９ミリモル）及びイソキサゾール－４－アミン（０．０３８ｇ、０．４６ミリモル）を室温で添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、次いで水（２０ｍＬ）で希釈し、そして酢酸エチルで抽出した（２×２０ｍＬ）。合した有機層を塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。結果として得られた残留物をカラムクロマトグラフィーにより精製して、純粋な表題化合物（０．１３５ｇ、８４％）を固体として得た。ＬＣＭＳ：計算値５１９．２、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝５２０．４［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １．１６－１．１９（ｍ，３Ｈ），１．１９－１．２３（ｍ，２Ｈ），１．４２－１．５６（ｍ，２Ｈ），３．３２－３．５２（ｍ，２Ｈ）３．６２（ｓ，３Ｈ），４．０１－４．０２（ｍ，１Ｈ），４．０３（ｓ，３Ｈ），４．７０－４．７７（ｍ，１Ｈ），７．２５－７．２７（ｍ，１Ｈ），７．５９－７．６７（ｍ，２Ｈ），８．７４（ｓ，１Ｈ），９．２７（ｓ，１Ｈ），１０．５８（ｂｓ，１Ｈ）．Ｃｈｉｒａｌ ＨＰＬＣ：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ－Ｈ；３０％（ＭＥＯＨ）ｉｎ 液体ＣＯ２＋０．１％ ＤＥＡ：ＦＲ－１（異性体－１）：ＲＴ＝９．３９；ＦＲ－２（異性体－２）：ＲＴ＝１４．８２．
【0124】
ステップ－１１：２－（１－（３，４－ジクロロベンゾイル）－３－メチルピペリジン－３－イル）－５－ヒドロキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド。
【0125】
ジクロロメタン（２ｍＬ）中に溶解させた２－（１－（３，４－ジクロロベンゾイル）－３－メチルピペリジン－３－イル）－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－５－メトキシ－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミドＦＲ－１（０．０３０ｇ、０．０５７ミリモル）の撹拌溶液を０℃に冷却し、ジクロロメタン中１Ｍ ＢＢｒ３（０．２８ｍＬ、０．２９ミリモル）を滴下した。反応混合物を次いで室温で３時間撹拌した。反応が完了した後、真空下で濃縮した。メタノール（１ｍＬ）を添加し、３０分間撹拌し、蒸発させた。残留物をメタノール（２×１ｍＬ）と共沸させて、粗化合物（１２０ｍｇ）を得た。粗残留物をセライト上にロードし、アセトニトリル及び０．１％水中ギ酸を使用して逆相カラムクロマトグラフィーによって精製して、実施例１３０（０．０１５ｇ、５１％）を得た。ＬＣＭＳ：計算値５０５．２、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝５０６．３［Ｍ＋Ｈ］＋。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １．３５－１．４５（ｍ，３Ｈ），１．４６－１．６０（ｍ，２Ｈ），１．７０－１．８０（ｍ，２Ｈ），３．１５－３．１８（ｍ，２Ｈ），３．３８－３．４４（ｍ，２Ｈ），３．６１（ｓ，３Ｈ），７．２２－７．２４（ｍ，１Ｈ），７．５９－７．６４（ｍ，２Ｈ），８．７３（ｓ，１Ｈ），９．２３（ｓ，１Ｈ），１０．７５（ｂｓ，１Ｈ），１１．５８（ｂｓ，１Ｈ）．
【0126】
５－ヒドロキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－２－（１－フェネチルピペリジン－３－イル）－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド（実施例１２９）の合成
【化23】
【0127】
ステップ－１：５－エトキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－２－（ピペリジン－３－イル）－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド塩酸塩：
【0128】
３－（５－エトキシ－４－（イソキサゾール－４－イルカルバモイル）－１－メチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリミジン－２－イル）ピペリジン－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチル［Ａ１の合成から得る］（０．３５ｇ、０．７８ミリモル）のジクロロメタン（３ｍＬ）とメタノール（０．５ｍＬ）との混合物中撹拌溶液に、ジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（３ｍＬ）を０℃で滴下した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、４０℃に１０分間温めた。反応混合物を濃縮乾固し、メタノールと２回共沸させて、表題化合物を固体（０．２９０ｇ、９７％）として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ：計算値３４７．５；ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝３４８．５［Ｍ＋Ｈ］＋
【0129】
ステップ－２：５－エトキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－２－（１－フェネチルピペリジン－３－イル）－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド：
【0130】
５－エトキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－２－（ピペリジン－３－イル）－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド塩酸塩（０．０５０ｇ、０．１３０ミリモル）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）中撹拌溶液に、トリエチルアミン（０．０５５ｍＬ、０．３９１ミリモル）を添加し、室温で３０分間撹拌した。（２－ブロモエチル）ベンゼン（０．０２４ｇ、０．１３０ミリモル）を添加し、反応混合物を室温で４時間撹拌し、次いで濃縮した。得られた粗生成物をヘキサン（５ｍＬ）で摩砕し、真空下で乾燥して、表題化合物（０．０５０ｇ）を得た。粗製の表題化合物をさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ：計算値４５１．３；ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝４５２．４［Ｍ＋Ｈ］＋
【0131】
ステップ－３：５－ヒドロキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－２－（１－フェネチルピペリジン－３－イル）－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド：
【0132】
５－エトキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－２－（１－フェネチルピペリジン－３－イル）－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド（０．０５ｇ、０．１１０ミリモル）の混合物をジクロロメタン（１ｍＬ）中に溶解させた。結果として得られた溶液を０℃に冷却し、ジクロロメタン中１Ｍ ＢＢｒ３（０．２２ｍＬ、０．２２ミリモル）を滴下した。反応混合物を室温で５時間撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム（０．５ｍＬ）を添加し、ジクロロメタン中１０％メタノールでさらに希釈した。残留物をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮乾固した。粗残留物をセライト上にロードし、アセトニトリル及び０．１％水中ギ酸を用いて逆相カラムクロマトグラフィーにより精製して、純粋な表題化合物（０．０１ｇ、２１％）を得た。ＬＣＭＳ：計算値４２３．４：ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝４２４．５［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １．６０－１．８０（ｍ，４Ｈ），１．８５－１．９５（ｍ，１Ｈ），２．６６－２．７０（ｍ，２Ｈ），２．７０－３．０２（ｍ，６Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），７．１８－７．２８（ｍ，５Ｈ），８．７７（ｓ，１Ｈ，），９．１３（ｓ，１Ｈ），１０．２５（ｂｓ，１Ｈ），１１．５０（ｂｓ，１Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １．６０－１．８０（ｍ，４Ｈ），１．８５－１．９５（ｍ，１Ｈ），２．６６－２．７０（ｍ，２Ｈ），２．７０－３．０２（ｍ，６Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），７．１８－７．２８（ｍ，５Ｈ），８．７７（ｓ，１Ｈ，），９．１３（ｓ，１Ｈ），１０．２５（ｂｓ，１Ｈ），１１．５０（ｂｓ，１Ｈ）．
【0133】
以下の実施例及び中間体は、上記ステップで記載したものと同様の条件を適切な出発物質と共に使用して合成した。
【表8】
【0134】
５－ヒドロキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－２－（ピペリジン－１－イル）－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド（実施例２８）の合成
【化24】
【0135】
ステップ－１：
Ｃ６（２００ｍｇ、０．７６９ミリモル）、ピペリジン（０．７６ｍＬ、７．６９ミリモル）及びＤＭＳＯの混合物を１１０℃で１時間加熱した。反応の進行をＴＬＣによってモニタリングし、Ｃ６が消費されたら室温に冷却した。反応混合物を氷水の混合物（２５ｍＬ）中に注ぎ、１５分間よく撹拌した。固体物質をろ過で除去し、水で洗浄し（３×１０ｍＬ）、真空下でよく乾燥させて、純粋な生成物を固体（１７２ｍｇ、７２％）として得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝３１０．３８［Ｍ＋Ｈ］＋ ＭＷ計算値：３０９．３７１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ４．００（ｑ，２Ｈ），４．２６（ｑ，２Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．０４－３．０６（ｍ，４Ｈ），１．５７－１．６２（ｍ，６Ｈ），１．２０－１．３０（ｍ，６Ｈ）．
Ｃ６（２００ｍｇ、０．７６９ミリモル）、ピペリジン（０．７６ｍＬ、７．６９ミリモル）及びＤＭＳＯの混合物を１１０℃で１時間加熱した。反応の進行をＴＬＣによってモニタリングし、Ｃ６が消費されたら室温に冷却した。反応混合物を氷水の混合物（２５ｍＬ）中に注ぎ、１５分間よく撹拌した。固体物質をろ過で除去し、水で洗浄し（３×１０ｍＬ）、真空下でよく乾燥させて、純粋な生成物を固体（１７２ｍｇ、７２％）として得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝３１０．３８［Ｍ＋Ｈ］＋ ＭＷ計算値：３０９．３７１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ４．００（ｑ，２Ｈ），４．２６（ｑ，２Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．０４－３．０６（ｍ，４Ｈ），１．５７－１．６２（ｍ，６Ｈ），１．２０－１．３０（ｍ，６Ｈ）．
【0136】
ステップ－２：５－エトキシ－１－メチル－６－オキソ－２－（ピペリジン－１－イル）－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボン酸エチル（１００ｍｇ、０．３２ミリモル）、イソキサゾール－４－アミン（３５．３ｍｇ、０．４２ミリモル）のトルエン（１ｍＬ）中撹拌溶液に、２Ｍのトルエン中トリメチルアルミニウム（０．６ｍＬ、０．６４ミリモル）を０℃で添加した。反応混合物を８０℃にて３０分間マイクロ波照射下で加熱した。反応の完了をＴＬＣにより確認し、反応物を氷冷水の混合物中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した（２×１０ｍＬ）。有機層を塩水で洗浄した（２×１０ｍＬ）。合した有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空下で蒸発させて、粗化合物を明褐色として得た（１０４ｍｇ）。粗物質を精製することなく次のステップで使用した。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝３４８．５［Ｍ＋Ｈ］＋ ＭＷ計算値：３４７．３
【0137】
ステップ－３：５－エトキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－２－（ピペリジン－１－イル）－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド（１００ｍｇ、０．２８ミリモル）をジクロロメタン（１ｍＬ）中に溶解させた。結果として得られた溶液を０℃に冷却し、ジクロロメタン中１Ｍ ＢＢｒ３（０．５ｍＬ、０．５７ミリモル）を滴下した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応をＴＬＣ（ジクロロメタン中１０％メタノール）によりモニタリングした。完了したら、溶媒を真空下で除去した。氷冷水を残留物に添加し、そして固体をろ過して粗生成物（８３ｍｇ）を得た。粗生成物をＲＰ－ＨＰＬＣによりさらに精製して、実施例２８、５－ヒドロキシ－Ｎ－（イソキサゾール－４－イル）－１－メチル－６－オキソ－２－（ピペリジン－１－イル）－１，６－ジヒドロピリミジン－４－カルボキサミド生成物（１０ｍｇ、０．０３２ミリモル、１１％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ＝３２０．３［Ｍ＋Ｈ］＋ＭＷ計算値：３１９．３ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ １１．１９（ｓ，１Ｈ），１０．５４（ｓ，１Ｈ），９．３１（ｓ，１Ｈ），８．９２（ｓ，１Ｈ），３．４３（ｓ，３Ｈ），３．０８（ｓ，４Ｈ），１．５９－１．６７（ｍ，６Ｈ）．
【0138】
以下の実施例及び中間体は、上記ステップで記載したものと同様の条件を適切な出発物質と共に使用して合成した。
【表9-1】
【表9-2】
【表9-3】
【表9-4】
【表9-5】
【0139】
生化学アッセイ
１．腫瘍細胞におけるＴＲＥＸ１のサイレンシング
サイトゾルＤＮＡのセンシングに際してのｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路の活性化と、それに続くＩ型ＩＦＮ産生は、腫瘍細胞及び自然免疫細胞の両方、特に樹状細胞で起こり得る。ＳＴＩＮＧアゴニストによるＩ型ＩＦＮの活性化に際して免疫介在性拒絶反応を受ける、充分に説明された低温同系腫瘍モデルによって、ＴＲＥＸ１がＩ型ＩＦＮの産生を抑制するか否かを評価するために、ＣＲＩＳＰＲを使用してＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞においてＴＲＥＸ１をノックダウンした（図１Ａ）。腫瘍細胞のＤＮＡトランスフェクションを介したサイトゾルＤＮＡの蓄積は、親腫瘍細胞と比較してＴＲＥＸ１ノックアウトＢ１６Ｆ１０細胞によるＩＦＮβ産生の約５倍増加をもたらし、ＴＲＥＸ１がＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞におけるｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路の活性化を減弱したことを示す（図１Ｂ）。
２．インビボでのＴＲＥＸ１コンピテント及びＴＲＥＸ１欠損Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞の成長
１．腫瘍細胞におけるＴＲＥＸ１のサイレンシング
サイトゾルＤＮＡのセンシングに際してのｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路の活性化と、それに続くＩ型ＩＦＮ産生は、腫瘍細胞及び自然免疫細胞の両方、特に樹状細胞で起こり得る。ＳＴＩＮＧアゴニストによるＩ型ＩＦＮの活性化に際して免疫介在性拒絶反応を受ける、充分に説明された低温同系腫瘍モデルによって、ＴＲＥＸ１がＩ型ＩＦＮの産生を抑制するか否かを評価するために、ＣＲＩＳＰＲを使用してＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞においてＴＲＥＸ１をノックダウンした（図１Ａ）。腫瘍細胞のＤＮＡトランスフェクションを介したサイトゾルＤＮＡの蓄積は、親腫瘍細胞と比較してＴＲＥＸ１ノックアウトＢ１６Ｆ１０細胞によるＩＦＮβ産生の約５倍増加をもたらし、ＴＲＥＸ１がＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞におけるｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路の活性化を減弱したことを示す（図１Ｂ）。
２．インビボでのＴＲＥＸ１コンピテント及びＴＲＥＸ１欠損Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞の成長
【0140】
インビボでのＴＲＥＸ１コンピテント及びＴＲＥＸ１欠損Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞の成長を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右脇腹に３００，０００の親又はＴＲＥＸ１ノックアウトＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍が測定可能になったときから始めて、研究の残りの期間中、体重を週に２回収集し、腫瘍測定値を週に２～３回収集した。ＴＲＥＸ１がサイレンシングされた腫瘍は、親Ｂ１６Ｆ１０腫瘍よりも著しく小さい体積を提示した（図２）。
【0141】
腫瘍は、第１９日、研究の終了時に収集し、単細胞浮遊液に消化して、腫瘍浸潤免疫集団のフローサイトメトリー定量化を可能にした。ＴＲＥＸ１ノックアウトＢ１６Ｆ１０腫瘍は、免疫細胞全体で有意な増加を示すことが判明し、これは、腫瘍浸潤ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の数並びに形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の増加を反映していた（図３）。ｐＤＣは、抗原特異的抗腫瘍免疫応答の誘導において中心的役割を果たすことが知られており、一方、Ｔ細胞は、マウス及びヒトにおいて抗腫瘍活性の主なエフェクタであることが知られている。したがって、ＴＲＥＸ１が欠損した腫瘍の免疫浸潤における大きな変化は、後者の腫瘍の成長の阻害が、少なくとも部分的に免疫介在性であることを示唆する。
【0142】
ＴＲＥＸ１生化学アッセイ
化合物の効力は、反対方向の鎖上にフルオロフォア－クエンチャ―対を有するカスタムｄｓＤＮＡ基質の分解を測定する蛍光アッセイによって評価した。ｄｓＤＮＡの分解により、遊離フルオロフォアが放出され、蛍光シグナルが生じる。具体的には、反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０及び１００ｍＭ ＭｇＣｌ２）中７．５μＬのＮ末端Ｈｉｓ－Ｔｅｖタグ付完全長ヒトＴＲＥＸ１（Ｅ．ｃｏｌｉで発現され、社内で精製されたもの）を、ＤＭＳＯ中１０点用量－応答として様々な濃度の化合物（１５０ｎＬ）をすでに含んでいる３８４ウェルＢｌａｃｋ ＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に添加した。これに、反応緩衝液中７．５μＬのｄｓＤＮＡ基質（鎖Ａ：５’ＴＥＸ６１５／ＧＣＴ ＡＧＧ ＣＡＧ ３’；鎖Ｂ：５’ＣＴＧ ＣＣＴ ＡＧＣ／ＩＡｂＲＱＳｐ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を添加した。最終濃度は、１．０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含む反応緩衝液中、１５０ｐＭ ＴＲＥＸ１、６０ｎＭ ｄｓＤＮＡ基質であった。室温で２５分後、５μＬの停止緩衝液（反応緩衝液＋２００ｍＭ ＥＤＴＡと同じ）の添加により反応をクエンチした。クエンチされた反応物における最終濃度は、２０μＬの体積で、１１２．５ｐＭ ＴＲＥＸ１、４５ｎＭ ＤＮＡ及び５０ｍＭ ＥＤＴＡであった。室温で５分のインキュベーション後、レーザー光源のＥｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）でプレートを読み取り、５７０ｎｍ光で励起した後、６１５ｎｍの蛍光を測定した。ＩＣ５０値は、非線形最小二乗４パラメータフィット及びＧｅｎｅｄａｔａ又はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍのいずれか（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、停止緩衝液（１００％阻害）及び阻害剤なし（０％阻害）対照であらかじめクエンチした対照ウェルと比べて、６１５ｎｍ比で測定された蛍光を比較することによって算出した。
化合物の効力は、反対方向の鎖上にフルオロフォア－クエンチャ―対を有するカスタムｄｓＤＮＡ基質の分解を測定する蛍光アッセイによって評価した。ｄｓＤＮＡの分解により、遊離フルオロフォアが放出され、蛍光シグナルが生じる。具体的には、反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０及び１００ｍＭ ＭｇＣｌ２）中７．５μＬのＮ末端Ｈｉｓ－Ｔｅｖタグ付完全長ヒトＴＲＥＸ１（Ｅ．ｃｏｌｉで発現され、社内で精製されたもの）を、ＤＭＳＯ中１０点用量－応答として様々な濃度の化合物（１５０ｎＬ）をすでに含んでいる３８４ウェルＢｌａｃｋ ＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に添加した。これに、反応緩衝液中７．５μＬのｄｓＤＮＡ基質（鎖Ａ：５’ＴＥＸ６１５／ＧＣＴ ＡＧＧ ＣＡＧ ３’；鎖Ｂ：５’ＣＴＧ ＣＣＴ ＡＧＣ／ＩＡｂＲＱＳｐ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を添加した。最終濃度は、１．０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含む反応緩衝液中、１５０ｐＭ ＴＲＥＸ１、６０ｎＭ ｄｓＤＮＡ基質であった。室温で２５分後、５μＬの停止緩衝液（反応緩衝液＋２００ｍＭ ＥＤＴＡと同じ）の添加により反応をクエンチした。クエンチされた反応物における最終濃度は、２０μＬの体積で、１１２．５ｐＭ ＴＲＥＸ１、４５ｎＭ ＤＮＡ及び５０ｍＭ ＥＤＴＡであった。室温で５分のインキュベーション後、レーザー光源のＥｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）でプレートを読み取り、５７０ｎｍ光で励起した後、６１５ｎｍの蛍光を測定した。ＩＣ５０値は、非線形最小二乗４パラメータフィット及びＧｅｎｅｄａｔａ又はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍのいずれか（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、停止緩衝液（１００％阻害）及び阻害剤なし（０％阻害）対照であらかじめクエンチした対照ウェルと比べて、６１５ｎｍ比で測定された蛍光を比較することによって算出した。
【0143】
ＴＲＥＸ２生化学アッセイ
化合物の効力は、反対方向の鎖上にフルオロフォア－クエンチャ―対を有するカスタムｄｓＤＮＡ基質の分解を測定する蛍光アッセイによって評価した。ｄｓＤＮＡの分解により、遊離フルオロフォアが放出され、蛍光シグナルが生じる。具体的には、反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０及び１００ｍＭ ＭｇＣｌ２中７．５μＬのＮ末端Ｈｉｓ－Ｔｅｖタグ付ヒトＴＲＥＸ２（Ｅ．ｃｏｌｉで発現され、社内で精製された残留Ｍ４４－Ａ２７９）を、ＤＭＳＯ中１０点用量応答として様々な濃度の化合物（１５０ｎＬ）をすでに含んでいる３８４ウェルＢｌａｃｋ ＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に添加した。これに、反応緩衝液中７．５μＬのｄｓＤＮＡ基質（鎖Ａ：５’ＴＥＸ６１５／ＧＣＴ ＡＧＧ ＣＡＧ ３’；鎖Ｂ：５’ＣＴＧ ＣＣＴ ＡＧＣ／ＩＡｂＲＱＳｐ（ＩＤＴ））を添加した。最終濃度は、１．０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含む反応緩衝液中、２．５ｎＭ ＴＲＥＸ２、６０ｎＭ ｄｓＤＮＡ基質であった。室温で２５分後、５μＬの停止緩衝液（反応緩衝液＋２００ｍＭ ＥＤＴＡと同じ）の添加により反応をクエンチした。クエンチされた反応混合物における最終濃度は、２０μＬの体積で、１．８７５ｐＭ ＴＲＥＸ２、４５ｎＭ ＤＮＡ及び５０ｍＭ ＥＤＴＡであった。室温で５分のインキュベーション後、レーザー光源のＥｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）でプレートを読み取り、５７０ｎｍ光で励起した後、６１５ｎｍの蛍光を測定した。ＩＣ５０値は、非線形最小二乗４パラメータフィット及びＧｅｎｅｄａｔａ又はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍのいずれか（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、停止緩衝液（１００％阻害）及び阻害剤なし（０％阻害）対照であらかじめクエンチした対照ウェルと比べて、６１５ｎｍ比で測定された蛍光を比較することによって算出した。
化合物の効力は、反対方向の鎖上にフルオロフォア－クエンチャ―対を有するカスタムｄｓＤＮＡ基質の分解を測定する蛍光アッセイによって評価した。ｄｓＤＮＡの分解により、遊離フルオロフォアが放出され、蛍光シグナルが生じる。具体的には、反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０及び１００ｍＭ ＭｇＣｌ２中７．５μＬのＮ末端Ｈｉｓ－Ｔｅｖタグ付ヒトＴＲＥＸ２（Ｅ．ｃｏｌｉで発現され、社内で精製された残留Ｍ４４－Ａ２７９）を、ＤＭＳＯ中１０点用量応答として様々な濃度の化合物（１５０ｎＬ）をすでに含んでいる３８４ウェルＢｌａｃｋ ＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に添加した。これに、反応緩衝液中７．５μＬのｄｓＤＮＡ基質（鎖Ａ：５’ＴＥＸ６１５／ＧＣＴ ＡＧＧ ＣＡＧ ３’；鎖Ｂ：５’ＣＴＧ ＣＣＴ ＡＧＣ／ＩＡｂＲＱＳｐ（ＩＤＴ））を添加した。最終濃度は、１．０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含む反応緩衝液中、２．５ｎＭ ＴＲＥＸ２、６０ｎＭ ｄｓＤＮＡ基質であった。室温で２５分後、５μＬの停止緩衝液（反応緩衝液＋２００ｍＭ ＥＤＴＡと同じ）の添加により反応をクエンチした。クエンチされた反応混合物における最終濃度は、２０μＬの体積で、１．８７５ｐＭ ＴＲＥＸ２、４５ｎＭ ＤＮＡ及び５０ｍＭ ＥＤＴＡであった。室温で５分のインキュベーション後、レーザー光源のＥｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）でプレートを読み取り、５７０ｎｍ光で励起した後、６１５ｎｍの蛍光を測定した。ＩＣ５０値は、非線形最小二乗４パラメータフィット及びＧｅｎｅｄａｔａ又はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍのいずれか（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、停止緩衝液（１００％阻害）及び阻害剤なし（０％阻害）対照であらかじめクエンチした対照ウェルと比べて、６１５ｎｍ比で測定された蛍光を比較することによって算出した。
【0144】
結果を表１に示す。ＴＲＥＸ１ ＩＣ５０：Ａ＝＜０．１μＭ；Ｂ＝０．１～１μＭ；Ｃ＝１～１０μＭ；Ｄ＝＞１０μＭ。ＴＲＥＸ２ ＩＣ５０：Ａ＝＜１μＭ、Ｂ＝１～１０μＭ、Ｃ＝１０～１００μＭ、Ｄ＝＞１００μＭ。
【表10-1】
【表10-2】
【0145】
ＨＣＴ１１６細胞アッセイ
ＨＣＴ１１６二重細胞（ｄｕａｌ ｃｅｌｌ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）はヒトＨＣＴ１１６大腸がん細胞株由来である。細胞は、ＳＥＡＰ及びルシフェラーゼレポーター遺伝子の安定な組込みについて選択され、この発現は、それぞれ、ＮＦ－ＫＢ／ＡＰ１及びＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ２の５つのタンデム応答エレメントの制御下にある。細胞株を使用して、培地中に分泌されたＬｕｃｉａルシフェラーゼの活性を測定することにより、Ｉ型インターフェロン誘導と、その後のシグナリングをモニタリングした。
ＨＣＴ１１６二重細胞（ｄｕａｌ ｃｅｌｌ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）はヒトＨＣＴ１１６大腸がん細胞株由来である。細胞は、ＳＥＡＰ及びルシフェラーゼレポーター遺伝子の安定な組込みについて選択され、この発現は、それぞれ、ＮＦ－ＫＢ／ＡＰ１及びＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ２の５つのタンデム応答エレメントの制御下にある。細胞株を使用して、培地中に分泌されたＬｕｃｉａルシフェラーゼの活性を測定することにより、Ｉ型インターフェロン誘導と、その後のシグナリングをモニタリングした。
【0146】
ＨＣＴ１１６細胞を、１０％ＦＢＳ及び２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．２～７．５）を追加した１００ｕＬのＤＭＥＭ中、４０，０００細胞／ウェルで、９６ウェルプレート（複数可）に播種した。一晩沈降させた後、細胞をＴＲＥＸ１ｉで４時間（最大ＤＭＳＯフラクションは０．１％であった）で処理した後、１ｕｇ／ｍＬのｐＢＲ３２２／ＢｓｔＮＩ制限消化物（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）で、製品マニュアルの推奨にしたがってトランスフェクトした。簡単に説明すると、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（０．３５ｕＬ／ウェル）をＯｐｔｉＭＥＭ（５ｕＬ／ウェル）中に希釈した。ｐＢＲ３２２／ＢｓｔＮＩ（１００ｎｇ／ウェル）をＯｐｔｉＭＥＭ（５ｕＬ／ウェル）中に希釈した後、Ｐｌｕｓ試薬（０．１ｕＬ／１００ｎｇ ＤＮＡ）を添加した。室温で５分間インキュベーションした後、ＤＮＡ混合物に、希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸを滴下して混合した。さらに１０分間インキュベーションした後、トランスフェクションミックス（１０ｕＬ／ウェル）を細胞に添加した。細胞を３７℃で４８時間維持した後、細胞培地からのＬｕｃｉａルシフェラーゼ活性をモニタリングした。
【0147】
いくつかの実施形態を説明してきたが、我々の基本的な実施例を変更して、本発明の化合物及び方法を利用する他の実施形態を提供できることは明らかである。したがって、本発明の範囲は、例として提示した具体的な実施形態によってではなく、添付の実施形態によって規定されると理解されるであろう。
【0148】
本願全体を通して引用されるすべての文献（参考文献、発行された特許、公開された特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む）の内容は、参照によりその全体が本明細書中に明示的に組み込まれる。別段の定めのない限り、本明細書中で使用するすべての科学技術用語は当業者に通常知られている意味である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【国際調査報告】