特表 2022-510972 エンドセリン－１の分泌、幹細胞因子の合成、及びタンパク質のカルボニル化を減少させるための白マツの樹皮抽出物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-28

(54)【発明の名称】エンドセリン－１の分泌、幹細胞因子の合成、及びタンパク質のカルボニル化を減少させるための白マツの樹皮抽出物

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/9767 20170101AFI20220121BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20220121BHJP

   A61K 8/49 20060101ALI20220121BHJP

   A61K 8/34 20060101ALI20220121BHJP

【ＦＩ】

A61K8/9767

A61Q19/00

A61K8/49

A61K8/34

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021531220

(86)(22)【出願日】2019-11-26

(85)【翻訳文提出日】2021-05-31

(86)【国際出願番号】 US2019063183

(87)【国際公開番号】W WO2020117550

(87)【国際公開日】2020-06-11

(31)【優先権主張番号】62/774,669

(32)【優先日】2018-12-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】502451731

【氏名又は名称】インターナショナル フレーバーズ アンド フラグランシズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(72)【発明者】

【氏名】ロアン エステル

(72)【発明者】

【氏名】アッティア－ヴィニョー ジョアン

(72)【発明者】

【氏名】ロイヤー マリアナ

【テーマコード（参考）】

4C083

【Ｆターム（参考）】

4C083AA111

4C083AA112

4C083AC172

4C083AC422

4C083AC471

4C083AC482

4C083AC841

4C083AD092

4C083AD572

4C083CC04

4C083CC05

4C083CC22

4C083CC23

4C083CC24

4C083DD22

4C083DD23

4C083DD27

4C083DD31

4C083DD41

4C083EE16

4C083FF01

(57)【要約】

ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮の水性抽出物を使用する、ケラチノサイト中でのエンドセリン－１の分泌、幹細胞因子の合成、及び／又はタンパク質のカルボニル化を減少させる方法が提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ケラチノサイト中でのエンドセリン－１の分泌、幹細胞因子の合成、又はタンパク質のカルボニル化を減少させる方法であって、ケラチノサイトと、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮の水性抽出物の有効量とを接触させ、それにより前記ケラチノサイト中でのエンドセリン－１の分泌、幹細胞因子の合成、又はタンパク質のカルボニル化を減少させることを含む方法。

【請求項2】

エンドセリン－１の分泌は、少なくとも３０％減少する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

幹細胞因子の合成は、少なくとも５０％減少する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

タンパク質のカルボニル化は、少なくとも１０％減少する、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮の水性抽出物は、約４％のフラボノイド、１５％のポリフェノール、０．１％のトランス－レスベラトロール、及び０．１％のカテキンを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮の水性抽出物は、クリーム、軟膏、フォーム、ローション、硬膏、ゲル、溶液、又は乳濁液の形態である、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

定義上のメラニン形成とは、メラノサイトと呼ばれる細胞によるメラニン色素の産生のことである。皮膚中のメラノサイトは、ケラチノサイトに囲まれており（１個のメラノサイトは、約３６個のケラチノサイトに囲まれており）、メラノサイトは、そのメラニン色素をこれらのケラチノサイトに移す。メラノサイト及びケラチノサイトは、外因性の刺激（例えば、紫外線照射（ＵＶＲ）及び薬物）又は内因性の刺激（例えば、ケラチノサイト及び線維芽細胞、内分泌細胞、炎症細胞、並びに神経細胞）の後に、広範囲にわたり互いに相互作用する。ＵＶＲに反応して、ケラチノサイトは、メラノサイトへのパラクリン作用と共に、いくつかの因子を産生する。より具体的には、ケラチノサイト由来のサイトカイン（例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子、エンドセリン－１、α－メラノサイト刺激ホルモン（α－ＭＳＨ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及び一酸化窒素）は、ＵＶＢ照射後のこのサイトカインの産生及び分泌／放出が上方制御されることが分かっており、且つマイトジェン及び／又はメラノゲンとして作用してヒトメラノサイトの増殖及びメラニン形成を促進させ得る。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0002】

ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の抽出物と関連するＵＶ保護及び美白活性が示唆されている（大韓民国特許第１００８６０６０４号明細書及び米国特許出願公開第２０１０／０１２９３０４号明細書）。しかしながら、これらの文書は、ケラチノサイトへの効果を全く示唆していない。

【課題を解決するための手段】

【0003】

本発明は、ケラチノサイトと、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮の水性抽出物の有効量とを接触させることによる、ケラチノサイト中でのエンドセリン－１の分泌、幹細胞因子の合成、及び／又はタンパク質のカルボニル化を減少させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、エンドセリン－１の分泌は、少なくとも３０％減少し；幹細胞因子の合成は、少なくとも５０％減少し；タンパク質のカルボニル化は、少なくとも１０％減少する。ある特定の実施形態では、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮の水性抽出物は、約４％のフラボノイド、１５％のポリフェノール、０．１％のトランス－レスベラトロール、及び０．１％のカテキンを含む。他の実施形態では、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮の水性抽出物は、クリーム、軟膏、フォーム、ローション、硬膏、ゲル、溶液、又は乳濁液の形態である。

【図面の簡単な説明】

【0004】

【図1】ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物が、α－ＭＳＨ刺激後に、ネズミのメラノサイト中でのメラニン合成を調節することを示す。

【図2】ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物が、ヒトのケラチノサイト中でのエンドセリン－１合成を阻害することを示す。処理（マツ属（Ｐｉｎｕｓ）の樹皮抽出物）なしのケラチノサイト細胞培養物が、コントロールとしての役割を果たした。^***ｐ＜０．００１。

【図3】ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物が、ヒトのケラチノサイト中での幹細胞因子（ＳＣＦ）合成を阻害することを示す。処理（マツ属（Ｐｉｎｕｓ）の樹皮抽出物）なしのケラチノサイト細胞培養物が、コントロールとしての役割を果たした。^***ｐ＜０．００１。

【図4】ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物が、ヒトのケラチノサイト中でのタンパク質のカルボニル化を阻害することを示す。ＨＮＥ（４－ヒドロキシノネナール）を、２０μＭでのタンパク質のカルボニル化の基準活性化因子として使用した。ＤＮＰＨ（２，４－ジニトロフェニルヒドラジン）を、カルボニル化の検出器として使用した（０．５μｇ／タンパク質μｌの場合に１μＬ）。^*、ｐ＜０．０５；^**、ｐ＜０．０１。

【図5】再構築されたヒト表皮（ＲＨＥ）を使用する、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物によるメラニン合成阻害を実証するためのエクスビボでのプロトコルデザインの概要である。

【図6】ヒトの肌のエクスビボモデルにおいて、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物が肌の色素沈着を阻害することを示す。プラセボ処方（マツ属（Ｐｉｎｕｓ）の樹皮抽出物を含まない処方）で処理されたエクスビボでの培養物を、コントロールとして使用した。^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１。

【発明を実施するための形態】

【0005】

本発明では、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮の水性抽出物が、ヒトのメラノサイトの増殖及びメラニン形成に関与するケラチノサイト由来のサイトカインを調節することが発見されている。特に、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物は、ケラチノサイト中でのエンドセリン－１の分泌、幹細胞因子の合成、及び／又はタンパク質のカルボニル化を減少させる。従って、本発明は、ケラチノサイトと、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮の水性抽出物の有効量とを接触させることによる、ケラチノサイト中でのエンドセリン－１の分泌、幹細胞因子の合成、又はタンパク質のカルボニル化を減少させる方法を提供する。これらの活性を考慮して、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物は、肌の恒常性の維持で有用であり、且つより輝きのある肌をもたらすための、美白、不透明さ、及び赤みを改善することによる肌の色の調節で有用である。

【0006】

本明細書で使用される場合、「ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮の水性抽出物」及び「ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物」という用語は、水によりストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮から抽出されている物質を指すために互換的に使用される。ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）（一般的には白マツと称される）の乾燥樹皮を０．５ｍｍ未満の粒径まで粉砕し、この粉砕物を熱水抽出に供することにより、本発明のストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物を得ることができる。粉砕された樹皮を、植物原料１部対水５～２０部のｗ／ｗ比（より好ましくは１：１６の比）で、水により抽出し得る。最初に、粉砕された樹皮に添加される水は、７０℃、７５℃、又は８０℃超の温度であり、好ましくは８５℃である。実際に、７０℃未満の温度及び９０℃超の温度は、桑の実からのケルセチン及びケンフェロールの抽出に悪影響を及ぼすことが分かっている（Ｔｃｈａｂｏ，ｅｔａｌ．（２０１８）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｐｅｒ．２１（１）：７１７－７３２）。さらに、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮からのプロアントシアニジンの水抽出は、温度に顕著に依存しており、８０℃で最大値が達成されることが分かっている（Ｋｕ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｆｏｒｅｓｔ Ｐｒｏｄ． Ｊ． ６１（４）：３２１－５）。

【0007】

理想的には、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の抽出を、撹拌しつつ且つ追加で加熱することなく、約０．５～５時間（好ましくは約１時間）進行させることができる。粒子状の樹皮物質を（例えば、ろ過及び／又は遠心分離により）除去すると、水性抽出物を乾燥させる。乾燥方法として、噴霧乾燥、凍結乾燥、及び同類のものが挙げられ得るが、これらに限定されない。この抽出物を、乾燥した状態で使用して化粧品製剤に直接組み込み得るが、理想的には、この抽出物を、水とグリセリンとの混合物（例えば、６０～９０％のグリセリン溶液、より好ましくは７０～８０％のグリセリン溶液）に溶解させる。具体的には、２．５％の抽出物（固形分）を、２０％の水及び７７．５％のグリセリンに溶解させる。

【0008】

ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物の活性を、本明細書で例示されているように、ケラトサイト細胞培養物又は再構築されたヒト表皮を使用して評価し得る。ケラトサイト細胞系統及び再構築されたヒト表皮は、当該技術分野で公知であり、商業的供給源から入手可能である。例えば、再構築されたヒト色素沈着表皮（ＲＨＰＥ、肌タイプＩＶ）を、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）から得ることができる。このＲＨＰＥは、気液界面が許容する０．４μＭ ＴＲＡＮＳＷＥＬＬチャンバ上に配置された、包皮からの３Ｄケラチノサイト及びメラノサイト培養物として特徴付けられる。

【0009】

本発明によれば、ケラチノサイト中でのエンドセリン－１の分泌、幹細胞因子の合成、及び／又はタンパク質のカルボニル化の減少という所望の活性を示す、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物は、この抽出物の固形分に基づいて、約４％（及び８％以下）のフラボノイド、１５％（及び３０％以下）のポリフェノール、０．１％のトランス－レスベラトロール、並びに０．１％のカテキンで構成されている。ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物の化学組成を、本明細書で説明されているように決定し得るか、又は任意の他の従来の方法論を使用して決定し得る。例えば、総フラボノイド含有量を、基準化合物としてカテキンを使用するフラボノイド－塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ₃）複合体形成に基づいて、分光光度法を使用して評価し得る（Ｚｈｉｓｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．６４：５５５－５５９；ｄａ Ｓｉｌｖａ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｇｎ．Ｍａｇ．１１（４１）：９６－１０１）。ポリフェノールの定量には、総ポリフェノールの決定にＦｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ法（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９６５）Ａｍ．Ｊ．Ｅｎｏｌ．Ｖｉｔｉｃ．１６：１４４－１５８）及びＰｒｕｓｓｉａｎ－Ｂｌｕｅ法（Ｂｕｄｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２８（６）：１２３６－８）等の比色法を用い得る。同様に、ポリフェノールの推定を、例えば、核磁気共鳴、近赤外反射分光法、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）、質量分析を伴う液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳ）、高性能キャピラリー電気泳動法（ＨＰＣＥ）、及び高速液体クロマトグラフィー、又はこれらの組み合わせにより行ない得る。トランス－レスベラトロールのレベルを、例えば、直接注入アイソクラチックＵＶ－ＨＰＬＣ法（ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ＵＶ－ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ）（Ａｒｓｌａｎ ＆ Ｙｉｌｍａｚ（２０１３）Ａｓｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．２５（３）：１２２５－８）又は電気化学的測定（Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ａｎａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｈｅｍ．２０１７：５７４９０２５）を使用して測定し得る。本抽出物中に存在するカテキンの量を、ＵＶ－ＨＰＬＣ（Ｒａｊｕ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｉｎｔ．Ｓｃｈ．Ｒｅｓ．Ｎｏｔｉｃｅｓ ２０１４：６２８１９６）、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、又はこれらの組み合わせ（Ｓｕｓａｎｔｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａｓ．Ｐａｃ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｂｉｏｍｅｄ．５（１２）：１０４６－５０）により評価し得る。

【0010】

本明細書で示すように、本発明は、ケラチノサイト中でのエンドセリン－１の分泌、幹細胞因子の合成、及び／又はタンパク質のカルボニル化を減少させる方法を提供する。この方法は、ケラチノサイトと、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮の水性抽出物、又は任意選択的な、この水性抽出物を含む製剤とを接触させることを含む。理想的には、この抽出物を、典型的には、ケラチノサイトへの望ましい効果を有するように肌に塗布する。本発明の方法によれば、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物の有効量を投与することにより、ケラチノサイトによるエンドセリン－１の分泌、幹細胞因子の合成、及び／又はタンパク質のカルボニル化が測定可能に減少する。特定の実施形態では、エンドセリン－１の分泌は、少なくとも３０％、４０％、５０％、又は６０％減少する。他の実施形態では、幹細胞因子の合成は、少なくとも５０％又は６０％減少する。さらなる実施形態では、タンパク質のカルボニル化は、少なくとも１０％又は１５％減少する。

【0011】

本明細書の実施例で開示されている方法に加えて、任意の従来の方法を使用して、ケラチノサイトへのストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物の効果を評価し得る。例えば、ケラチノサイトにより分泌されたエンドセリン－１の濃度を、ラジオイムノアッセイ（Ａｎｄｏ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２４５：１６４－６）又は酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ；Ｋｕｒｉｔａ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．４０９（１）：１０３－７）を使用して測定し得る。幹細胞因子の合成を、ウエスタンブロット分析又はＥＬＩＳＡ（Ｇｒａｂｂｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０７：２１９－２２４）により測定し得る。タンパク質のカルボニル化分析を、最も一般的にはジニトロフェノールヒドラジンによるカルボニル基の誘導体化、及びイムノアッセイによるジニトロフェノールヒドラジン（ＤＮＰ）付加物の定量により実行し得る（Ａｌａｍｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｆｒｅｅ Ｒａｄ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３９（１０）：１３６２－７；Ｂｕｓｓ ＆ Ｗｉｎｔｅｒｂｏｕｒｎ（２００２）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：１２３－８）。標識フリー技術によるか、又は同位体で標識された誘導体化試薬を使用することによる、カルボニル化したペプチドの同定及び相対的な定量に、質量分光光度法も使用し得る。

【0012】

肌へのストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物の塗布を容易にするために、本発明はまた、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物を含む調製物又は製剤も提供する。そのような組成物は、様々な形態で調製され得、且つ望ましくは、肌への局所塗布を容易にする形態で調製される。従って、調製物の適切な形態として、クリーム、軟膏、フォーム、ローション、硬膏、ゲル、溶液、及び乳濁液が挙げられる。そのような組成物の局所塗布の頻度は、エンドセリン－１の分泌、幹細胞因子の合成、及び／又はタンパク質のカルボニル化の所望の抑制レベル等のいくつかの因子に依存し得る。本発明の組成物を、望ましくは１日２回で肌に塗布し得、特に望ましくは朝１回及び夜１回で塗布し得る。

【0013】

製剤中に存在するストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物の量は、所望の活性レベル、特定の抽出物に関する特定の調製物の容量、及び他の因子等のいくつかの因子に依存するだろう。（例えば、グリセリン溶液に溶解された）液体として使用される場合には、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物は、全組成物の約０．０１％～約５０％（ｗｔ／ｗｔ）である。より望ましくは、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物は、全組成物の約０．１０～約２５％（ｗｔ／ｗｔ）である。さらにより望ましくは、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物は、全組成物の約０．２５～約１０％（ｗｔ／ｗｔ）である。固体として使用される場合には、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物は、全組成物の約０．００１％～１０％（ｗｔ／ｗｔ）である。より望ましくは、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物は、全組成物の約０．００２％～１％（ｗｔ／ｗｔ）である。さらにより望ましくは、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物は、全組成物の約０．００５％～０．５％（ｗｔ／ｗｔ）である。

【0014】

本発明の製剤は、局所塗布に及びヒトの肌への使用に特に適している。従って、本発明はまた、本発明に係る製剤の化粧的使用も含む。具体的には、本発明は、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮の熱水（即ち７０～８５℃）抽出により得られたストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物を含む組成物の化粧的使用を含む。

【0015】

ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物を含む製剤は、粘性又は半粘性の液体であってもよいし、例えばスプレー又はエアロゾルで使用される可能性がある粘性が低い液体であってもよい。この製剤は、溶液、懸濁液、又は乳濁液の形態を取ってもよい。この製剤は、粉末又は顆粒等の固体の形態を取ってもよく、この固体は、使用前に液体（例えば水）に添加されるように設計されている場合がある。いくつかの実施形態では、この製剤は、この製剤の塗布を容易にするために、スポンジ、綿棒、ブラシ、パッド、ティッシュ、布、ワイプ、皮膚パッチ、又は手当て用品（例えば、包帯、絆創膏、皮膚接着剤、又は組織表面への塗布用に設計されている他の物質）等のキャリアに塗布されているか、又はこのキャリアに塗布され得る。

【0016】

本発明に係る製剤は、局所製剤での使用が知られている賦形剤及び他の添加剤を含み得る。局所塗布用に設計されている製剤での使用に適した賦形剤は、当業者に公知であるだろう。含まれるものは、本製剤の意図された塗布様式及び塗布部位に依存する。肌への局所塗布用の製剤の文脈において、例は、例えばＷｉｌｌｉａｍｓ’ Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｔｏｐｉｃａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２００３）及び他の類似の参考図書で見出され得る。局所送達戦略の総説に関して、Ｄａｔｅ，ｅｔ ａｌ．（（２００６）Ｓｋｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９（１）：２－１６）も参照されたく、Ｓｋｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（（２００６）Ｊｏｈｎ Ｊ Ｗｉｌｌｅ，Ｅｄ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）も参照されたい。

【0017】

本製剤が、肌の局所塗布を意図されている場合には、適切な添加剤の例として、皮膚軟化薬、保湿剤、香料、抗酸化剤、保存料、安定剤、ゲル化剤、及び界面活性剤が挙げられ、他のものは、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｔｏｐｉｃａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（上記参照）で見出され得る。本組成物で使用されるあらゆる追加の添加剤は、刺激性であってはならず、且つケラチノサイト中でのエンドセリン－１の分泌、幹細胞因子の合成、及び／又はタンパク質のカルボニル化の減少という所望の活性に悪影響を及ぼすべきではない。

【0018】

ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物を、独立して使用してもよいし、１種又は複数種の追加の有効成分と組み合わせて使用してもよく、この有効成分として下記が挙げられる：抗菌剤、抗炎症剤（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）、抗ニキビ剤、角質溶解薬、コメド溶解剤、ケラチノサイト及び／又は脂腺細胞の機能を正常化し得る薬剤、抗炎症剤（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）、抗増殖剤、抗アンドロゲン剤、皮脂抑制（ｓｅｂｏｓｔａｔｉｃ）／皮脂抑制（ｓｅｂｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ）剤、鎮痒薬、免疫調節剤、抗刺激剤、創傷治癒を促進する薬剤、日焼け止め剤、肌美白剤、老化防止剤、及びこれらの混合物。

【0019】

本発明の方法で有用な製剤は、化粧品；スキンケア調製物（例えば、皮膚清拭剤、化粧液、又は保湿剤）；クレンジング調製物（例えば、洗顔料又はスクラブ洗顔料）；コスメシューティカル調製物；トイレタリー製品（例えば、バス用の又はシャワー用の添加剤又は石鹸）に組み込まれ得、そのためにこれらの形態で塗布され得る。この製剤は、皮膚清拭剤等の洗い落とす肌処置製品、又は特にリーブオン（ｌｅａｖｅ－ｏｎ）肌製品であってもよいし、これらに組み込まれてもよい。

【0020】

本発明は、下記の非限定的な実施例により、より詳細に説明される。

【実施例】

【0021】

実施例１：ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物の抽出及び化学組成
ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）。この抽出物を、カナダの林業で残余のストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮のみを使用して調製した。この樹皮を集め、次いで１０％未満の含水率まで乾燥させた。乾燥すると、最初のハンマーミルで２ｍｍまで粉砕し、次いで再度粉砕し、０．５ｍｍまで篩いにかけた。次いで、均一の樹皮原料を、指定された一連のパラメータに従う熱水中での解離により抽出した。より具体的には、この植物材料を、最初に、１：１６の重量比で水と混合した。この混合物を８５℃にし、熱を取り除き、混合物を、撹拌下で丸１時間にわたり放置した。抽出が完了した後、連続遠心分離機により固体及び液体の最初の分離を行ない、続いてプレスフィルタを使用して微粒子を除去した。得られた透明な抽出物を、真空及び低熱下で濃縮し、続いてフラッシュ低温細菌した。濃縮された抽出物を、何時間にもわたり真空及び低熱下に置いて水を完全に蒸発させて、乾燥粉末を得た。その後、純粋な抽出物と見なされる粉末を、数時間にわたり強い撹拌及び適度な熱の下で、水及びグリセリンの混合物に溶解させた。この混合物を、その後の分析及び最終製品の調製で使用した。

【0022】

化学組成。このストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の抽出物を、その品質及び有用性を評価するために、調製中に及び調製後に、この調製物の化学的性質に関してモニタリングした。化学的性質には、ポリフェノール、フラボノイド、カテキン、及びトランス－レスベラトロールの量が含まれた。これらの特性を使用して、バッチ間の再現性を確保し、且つ製品の、全体的な定量可能な品質を提供した。当該技術分野では慣例であるように、総フラボノイド含有量の濃度を、校正プロット（５～２００μｇ／ｍＬケルセチン）から算出し、ケルセチン当量として表した。同様に、フェノール含有量を、没食子酸の標準曲線（５～５００ｍｇ／Ｌ）に基づいて、没食子酸当量として算出した。例えば、Ｃｈａｎｄｒａ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｎｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．２０１４，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ２５３８７５を参照されたい。このストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の抽出物の化学組成分析は、この抽出物が、４％のフラボノイド（ケルセチン当量）、１５％のポリフェノール（没食子酸当量）、０．１％のトランス－レスベラトロール、及び０．１％のカテキンを含むことを示した。

【0023】

実施例２：メラニン合成へのストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物の効果
肌の色素沈着は、メラニン形成を介したメラノサイトによるメラニン合成の結果である。合成されると、メラニンは、ケラチノサイトを介して、メラノソームと呼ばれる小胞中に移動する。次いで、表皮のターンオーバーにより、メラニン色素が表面に出てきて、肌の色素沈着が現れる。肌の色素沈着へのストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物の生理活性を調べるために、Ｂ１６－Ｆ１細胞培養物を使用して、この抽出物のメラニン産生を減少させる能力を評価した。

【0024】

Ｂ１６－Ｆ１細胞（マウスのメラノサイト細胞系統）を、５％ のＣＯ₂及び９５％の湿度の下で３７℃にて、１０％のウシ胎仔血清、１％の抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）、及び１％のＬ－グルタミンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中で維持した。Ｂ１６－Ｆ１細胞を、１．５×１０⁴個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、２０ｎｇ／ｍｌのα－ＭＳＨを添加して、メラニン形成を誘発した。同時に、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物（０．００６２５ｇ／Ｌ、０．０１２５ｇ／Ｌ、０．０２５ｇ／Ｌ、及び０．０５ｇ／Ｌ）を添加し、細胞外培地中でのメラニンの放出に基づいて、メラニン形成合成を測定した。４０５ｎｍで分光光度計を使用してメラニン濃度を測定し、結果を、α－ＭＳＨによるメラニン合成の活性化率として示す。全ての実験条件を、ｎ＝３で実施した。この分析は、α－ＭＳＨ刺激の４日後に、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物がメラニン合成を用量依存的に減少させることを示した（図１）。

【0025】

実施例３：エンドセリン－１合成へのストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物の効果
メラニン形成は、内皮細胞により分泌されるパラクリン因子により誘発される。ケラチノサイトにより合成されるタンパク質であるエンドセリン－１は、メラノサイト膜上の特異的エンドセリンＢ（ＥＴ_B）に結合し、メラニン産生を誘発する（Ｉｍｏｋａｗａ ＆ Ｉｓｈｉｄａ（２０１４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１５：８２９３－８３１５）。従って、ヒトのケラチノサイトによるエンドセリン－１合成へのストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物の効果を評価した。

【0026】

正常ヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）を、３７℃、５％のＣＯ₂、及び９５％の湿度にて、ＣａＣｌ₂が補充されたＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持して培養した。ＮＨＥＫ細胞を、２４時間にわたり、２×１０⁴個の細胞／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートに播種した。１日後、この培地を取り除き、さらなる２４時間にわたり、細胞を、様々な濃度のストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物（０．０１２５ｇ／Ｌ、０．０２５ｇ／Ｌ、及び０．０５ｇ／Ｌ）で処理した。その後、上清を回収し、製造業者のプロトコルに従ってＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎ Ｐａｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用することにより、ケラチノサイトからのエンドセリン－１の放出を決定した。

【0027】

結果を、エンドセリン－１の分泌の割合として表し（図２）、この結果は、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物がエンドセリン－１合成の用量依存的な阻害を示すことを示す。

【0028】

実施例４：幹細胞因子の合成へのストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物の効果
エンドセリンと同様に、幹細胞因子（ＳＣＦ）は、パラクリン因子により誘発され、且つケラチノサイトにより分泌される。ＳＣＦは、メラノサイト膜上のｃ－Ｋｉｔ受容体に結合し、メラニン産生を誘発する（ｄｏｓ Ｓａｎｔｏｓ Ｖｉｄｅｉｒａ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｎ．Ｂｒａｓ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｅ ８８（１）：７６－８３）。従って、ヒトのケラチノサイトによるＳＣＦの合成へのストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物の効果を評価した。

【0029】

ＮＨＥＫ細胞を、３７℃、５％のＣＯ₂、及び９５％の湿度にて、ＣａＣｌ₂が補充されたＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持して培養した。ＮＨＥＫ細胞を、２４時間にわたり、２×１０⁴個の細胞／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートに播種した。１日後、この培地を交換し、細胞を、６時間にわたり増殖させた。その後、さらなる２４時間にわたり、細胞を、様々な濃度のストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物（０．０２５ｇ／Ｌ及び０．０５ｇ／Ｌ）で処理した。上清を回収し、製造業者のプロトコルに従ってＨｕｍａｎ ＳＣＦ ＥＬＩＳＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔキット（ＰｒｏｍｏＫｉｎｅ）を使用して、ＳＣＦの放出を決定した。

【0030】

この分析は、０．０５ｇ／Ｌのストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物がＳＣＦの合成を５６％阻害することを示した（図３）。

【0031】

実施例４：タンパク質のカルボニル化へのストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物の効果
タンパク質のカルボニル化は、真皮細胞中における酸化ストレスのバイオマーカーである。外的ストレスに曝露された角質層（ＳＣ）中で検出されると、タンパク質のカルボニル化は、水分保持力の変化を誘発し、肌の透明感に影響を及ぼすＳＣの光学的特性の変化も誘発する（Ｉｗａｉ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｓｃｉ．３０（１）：４１－４６）。さらに、光で老化した肌の分析は、黄色がかった色とカルボニル化修飾との間に相関関係を示す（Ｏｇｕｒａ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．６４（１）：４５－５２）。特に、２，４－ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）によるカルボニル基の誘導体化、その後の分光光度測定又はゲルでの若しくはＥＬＩＳＡアッセイでのＤＮＰＨ特異的抗体による免疫検出を使用して、タンパク質及びタンパク質混合物においてグローバルなレベルでカルボニル化を検出して定量し得る（Ｒｏｇｏｗｋａ－Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋａ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｆｒｅｅ Ｒａｄ．Ｒｅｓ．４８（１０）：１１４５－６２）。従って、ＤＮＰＨを使用して、ヒトのケラチノサイト中でのタンパク質のカルボニル化へのストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物の効果を評価した。

【0032】

ＮＨＥＫ細胞を、３７℃、５％のＣＯ₂、及び９５％の湿度にて、ＣａＣｌ₂が補充されたＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持して培養した。ＮＨＥＫ細胞を、３×１０⁵個の細胞／ｍｌの濃度で６ウェルプレートに播種した。７０～８０％の培養密度で、細胞を、様々な濃度（０．０２５ｇ／Ｌ及び０．０５ｇ／Ｌ）のストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物で処理した。２４時間後、培地を取り除き、さらなる２４時間にわたり、細胞を、２０μＭの４－ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ；タンパク質のカルボニル化の既知の活性因子）で処理した。インキュベーションの終了時に、細胞をすすぎ、溶解させてタンパク質を抽出して定量した（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。タンパク質のカルボニル化を、ＤＮＰＨ（０．５μｇ／μＬのタンパク質当たりＤＮＰＨ １μＬ）を含むＯｘｙｂｌｏｔ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して決定した。ＤＮＰ誘導体化タンパク質を、抗ＤＮＰ一次抗体及びＨＲＰコンジュゲート二次抗体を使用して検出した。抗体の結合を、タンパク質濃度に対して正規化された化学発光強度に基づいて、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアで定量した。全ての実験条件を、ｎ＝３で実施した。

【0033】

この分析は、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物が、タンパク質のカルボニル化を有意に少なくとも１１％阻害することを示した（図４）。この結果を考慮して、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物は、肌の色の改善で有用である。

【0034】

実施例５：エクスビボでの肌モデルにおけるメラニンの合成の評価
ケラチノサイトにより分泌されるパラクリン因子は、メラノサイト上の特定のメラニン形成受容体を活性化し、それによりメラニンの産生を調節することが分かっている。ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物がメラニン合成を阻害することを実証するために、製剤中でのこの抽出物の効果を、色素沈着した再構築表皮で分析した。

【0035】

１：２０のメラノサイト：ケラチノサイト比で、１ｃｍ²当たり４×１０⁵個の細胞で死滅した真皮の表皮側上に設置したインキュベーションチャンバー中でヒトのメラノサイト及びケラチノサイトを播種することにより、色素沈着していない再構築ヒト表皮（ＲＨＥ）及び色素沈着したＲＨＥフォトタイプＩＶを調製した。２４時間後、このインキュベーションチャンバーを取り外し、死滅した真皮を３日にわたり浸した。死滅した真皮を、処理前に、８日にわたり気液界面に移した。この気液界面への曝露の８日後、色素沈着したＲＨＥ及び色素沈着していないＲＨＥと、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物、プラセボ、陰性コントロール（処理なし）、又は陽性コントロール（コウジ酸）とを接触させた。これは、１日当たり２回の塗布で３日にわたる各製剤の局所塗布を含んだ（図５を参照されたい）。３日後、色素沈着したＲＨＥを、新鮮な培地と、色素沈着していないＲＨＥからの条件付き培地との１：１混合物の存在下で、３日にわたりインキュベートした。

【0036】

この製剤は、表１に列挙する量で、Ｈｅｌｉｏｇｅｌ（商標）（アクリル酸ナトリウムコポリマー、水添ポリイソブテン、リン脂質、ステアリン酸ポリグリセリル－１０、ヒマワリ種子油；Ｌｕｃａｓ Ｍｅｙｅｒ Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ）、Ｓａｂｏｄｅｒｍ ＴＣＣ（カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド；ＳＡＢＯ，Ｓ．ｐ．Ａ）、及びＤｅｋａｂｅｎ Ｃ（フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン、イソブチルパラベン、プロピルパラベン；Ｊａｎ Ｄｅｋｋｅｒ ＢＶ）を含んだ。

【0037】

【表1】

【0038】

色素沈着を、Ｆｏｎｔａｎａ－Ｍａｓｓｏｎ染色により評価した。ＲＨＥ切片を光学顕微鏡でも調べた。高濃度のメラニン領域は高強度の暗信号を生成することから、輝度の増加はメラニン含有量の減少を示す。

【0039】

この分析は、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物による色素沈着したＲＨＥの局所処置によりメラニンの合成が有意に減少し（１１．２％）、２倍の用量でコウジ酸によりもたらされるもの（８．１％）を上回ることを示した（図６）。色素沈着していないＲＨＥの上清で処理された色素沈着したＲＨＥも、色素沈着していないＲＨＥがストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物で処理された場合に、メラニン合成を有意に減少させた（７．２％）。このことは、ストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）の樹皮抽出物がケラチノサイトに直接作用し、メラニン形成に必要な調節分子の分泌を調節することを示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【国際調査報告】